DE60215627T2

DE60215627T2 - Impfstoff zur modulation zwischen t1 und t2 immunantworten

Info

Publication number: DE60215627T2
Application number: DE60215627T
Authority: DE
Inventors: A. Wladyslaw Edmonton BUDZYNSKI; R. Rao Edmonton KOGANTY; Mark Edmonton KRANTZ; Michael Edmonton LONGENECKER
Original assignee: Biomira Inc
Current assignee: Cascadian Therapeutics Inc
Priority date: 2001-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2022-03-28
Also published as: CA2441809C; JP2004533421A; EP1377275B1; ATE343375T1; JP2011105720A; WO2002076485A2; US8552145B2; ES2424131T3; US20120269884A1; US20120269885A1; JP5519477B2; AU2002309141B2; US8198400B2; US20030157160A1; WO2002076485A3; DE60215627D1; EP1377275A2; CA2441809A1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/278,698 mit dem Titel "Vaccine For Modulating Between T1 And T2 Immune Responses", eingereicht am 27. März 2001.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert liposomale Impfstoffe, die die Immunantwort in vivo, insbesondere die zelluläre Immunantwort modulieren können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Um Erkrankungen wirkungsvoll zu bekämpfen, sollte ein Impfstoff idealerweise mehrere immunologische Reaktionen, wie beispielsweise die Produktion von Antikörpern (humorale Immunität) und die Mobilisierung von immunologischen Zellen (zelluläre Immunität), stimulieren.
Eine zelluläre Immunantwort bringt eine Proliferation und Stimulation von T-Lymphozyten, wie zytotoxischen T-Zellen und T-Zellen mit verzögerter Hypersensitivität (DTH), mit sich, die daraufhin Makrophagen aktivieren und die Verbreitung von Pathogenen behindern. Die Induktion einer humoralen Antwort veranlaßt die B-Zellen des Körpers zur Bildung von Antikörpern gegen das angreifende Pathogen. Einige intrazelluläre Pathogene und Retroviren überleben jedoch und sind extrem resistent gegen humorale Immunantworten und erfordern die Stimulation von zytotoxischen T-Zellen, um solche biologischen Eindringlinge zu vernichten.
Synthetische Peptide werden oft als antigene Epitope verwendet und können unter Verwendung standardmäßiger Peptidsynthesetechniken maßgeschneidert werden, so daß sie nur minimale Nebenwirkungen hervorrufen. Solche Peptide rufen jedoch typischerweise nur eine relativ schwache immunogene Antwort hervor.
Nichtsdestotrotz kann die Immunogenität verstärkt werden, indem man ein Lipid an das synthetische Peptid anhängt. Beispielsweise wurde gezeigt, daß die Lipidierung synthetischer Peptidantigene zur Induktion einer starken T-Zell-Proliferation, CTL, und Antikörperreaktionen in immunisierten Mäusen, Schimpansen oder Menschen führt (BenMohamed et al., Vaccine, 18, 2843-2855 (2000), Gahery-Segard et al., J. Virology, 74, 1694-1703 (2000), Seth et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 16, 337-343 (2000), Tsunoda et al., Vaccine, 17, 675-685 (1999), BenMohamed et al., Eur. J. Immunol., 27, 1242-1253 (1997), Vitiello et al., J. Clin. Invest., 95, 341-349 (1995)).
Ein Präparat aus solchen Antigenen kann unter Verwendung eines Impfstoff-"Trägers" in vivo verabreicht werden, jedoch kann der Träger selbst zum Ziel der humoralen Immunantwort des Wirts werden. Somit wirken die Antikörper des Wirts gegen den Impfstoffträger und nicht gegen das antigene Epitop, was zu einer raschen Beseitigung des Impfstoffs durch gegen den Träger gerichtete Antikörper führen kann und die Nützlichkeit des tatsächlichen Impfstoffs zunichte macht.
Die Aufnahme des Lipidrests eines Lipopeptids in ein Liposom jedoch erwies sich als eine überaus nützliche Weise zur Zuführung eines Antigens in vivo, ohne eine Immunantwort gegen den Träger auszulösen. Keiner dieser Ansätze unterstützt jedoch die Modulation einer Immunantwort gegenüber einer anderen. Das heißt, bislang wurde nicht gezeigt, daß ein liposomal gebundenes Lipopeptid zelluläre und humorale Immunantworten auslösen kann, indem die Anzahl an Lipiden, die an ein einziges Peptid angehängt sind, verändert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert jedoch eine neue Möglichkeit zum Hervorrufen und Modulieren der zellulären Immunantwort unter Verwendung eines einzigen antigenen Peptids und eines Trägers, der keine humoralen Antworten gegen sich selbst stimuliert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Formulierung von Liposomen, die immunogene Monolipopeptide enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verabreichung solcher Liposome in Formulierungen, die Immunantworten in einem Individuum sowohl auslösen als auch modulieren können.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Produzieren immunogener Liposome, bestehend aus selbstorganisierenden Lipiden, einschließlich Lipidderivaten von immunogenen Peptiden. Die liposomale Formulierung enthält und verabreicht Monolipopeptide, um eine zelluläre Immunantwort auszulösen und dadurch zu modulieren. Das Peptid ist eine immunogene Sequenz von Aminosäuren, die ein Epitop oder ein ähnliches Merkmal antigener Natur repräsentiert.
Die Erfindung liefert eine Zusammensetzung, die eine Immunantwort stimulieren und modulieren kann. Eine solche Zusammensetzung umfaßt ein liposomales Vesikel, wobei die Lipiddoppelschicht des liposomalen Vesikels wenigstens ein immunogenes Monolipopeptid umfaßt.
In einem Aspekt wird eine liposomale Zusammensetzung bereitgestellt, welche folgendes umfaßt:

(a) selbstorganisierende Lipide, die ein Liposom bilden,
(b) ein immunogenes Monolipopeptid, wobei: (i) der Peptidteil des Monolipopeptids wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren des Krebsproteins MUC-1 umfaßt, (ii) das immunogene Peptid über eine in dem Peptid vorliegende Aminosäure an wenigstens ein Lipid angehängt ist und (iii) das immunogene Peptid liposomal gebunden ist, was bedeutet, daß das Monolipopeptid in die Liposome aufgenommen ist, weil der Lipidteil des Peptids sich spontan in die Lipiddoppelschicht des Liposoms integriert, und
(c) IL-2 als ein Adjuvans.

In einem weiteren Aspekt wird eine liposomale Zusammensetzung bereitgestellt, welche folgendes umfaßt:

(a) selbstorganisierende Lipide, die ein Liposom bilden, und
(b) ein immunogenes Monolipopeptid, wobei: (i) der Peptidteil des Monolipopeptids wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren aus einem Protein umfaßt, welches mit einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tuberkulose und Malaria, in Verbindung gebracht wird, (ii) das immunogene Peptid über eine in dem Peptid vorliegende Aminosäure an wenigstens ein Lipid angehängt ist, und (iii) das immunogene Peptid liposomal gebunden ist, was bedeutet, daß das Monolipopeptid in die Liposome aufgenommen ist, weil der Lipidteil des Peptids sich spontan in die Lipiddoppelschicht des Liposoms integriert.

Bevorzugt umfaßt die Zusammensetzung ein Adjuvans. Am meisten bevorzugt ist das Adjuvans aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Lipid A und IL-2.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei die selbstorganisierenden Lipide Liposome bilden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus multilamellaren Vesikeln (MLV), oligolamellaren Vesikeln (OLV), unilamellaren Vesikeln (UV), kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV), mittelgroßen unilamellaren Vesikeln (MUV), großen unilamellaren Vesikeln (LUV), riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV), multivesikulären Vesikeln (MW), durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (REV) hergestellten einzelnen oder oligolamellaren Vesikeln, durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren hergestellten multilamellaren Vesikeln (MLV-REV), stabilen plurilamellaren Vesikeln (SPLV), eingefrorenen und aufgetauten MLV (FATMLV), durch Extrusionsverfahren hergestellten Vesikeln (VET), mittels French-Press hergestellten Vesikeln (FPV), durch Fusionieren hergestellten Vesikeln (FUV), Dehydratisierung/Rehydratisierung-Vesikeln (DRV) und Bubblesome (BSV).
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Stimulieren einer zellulären Immunantwort, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge wenigstens eines Monolipopeptids an einen Patienten umfaßt, wobei das Monolipopeptid mit dem liposomalen Vesikel verknüpft ist. Der Prozentanteil des verabreichten Monolipopeptids kann mehr als etwa 50% betragen. Der Prozentanteil des Monolipopeptids kann auch mehr als etwa 70% oder mehr als etwa 90% betragen.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Stimulieren einer zellulären Immunantwort, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge wenigstens eines Monolipopeptids an einen Patienten umfaßt, wobei das Monolipopeptid mit einem liposomalen Vesikel verknüpft ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Zusammensetzungen, wobei der Peptidanteil des Monolipopeptids von einem Protein abgeleitet ist, das mit einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tuberkulose, Malaria und Krebs, in Verbindung gebracht wird. Das Peptid umfaßt wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren aus einer immunogenen Region des Proteins. Es wird ein Monolipopeptid bereitgestellt, welches aus wenigstens fünf zusammenhängenden Aminosäuren aus dem Krebsprotein aufgebaut ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das MUC I-Lipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren mit der Sequenz GVTSAPDTRPAPGSTA. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Monolipopeptid aus einem Tuberkulose-Lipopeptid aufgebaut, welches wenigstens 5 zusammenhängende Amino säuren mit der Sequenz DQVHFQPLPPAWKLSDALIK umfaßt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein antigenes MUC I-Peptid der vorliegenden Erfindung unter wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäuren mit der Sequenz SGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVSSL (SEQ ID NO:1) ausgewählt werden.
Hier wird ein Monolipopeptid beschreiben, welches aus einem Tuberkulosepeptid aufgebaut ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Tuberkulosepeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren mit der Sequenz DQVHFQPLPPAWKLSDALIK (SEQ ID NO:2).
Ein Malariapeptid kann so modifiziert werden, daß es Lipide enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Malariapeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren mit der Sequenz VTHESYQELVKKLEALEDAVK (SEQ ID NO:4).
Somit liefert die vorliegende Erfindung eine liposomale Zusammensetzung, welche wenigstens ein Liposom umfaßt, das wenigstens ein Monolipopeptid umfaßt.
Das Monolipopeptid ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus MUC I-, Tuberkulose- und Malariapeptiden.
Der Prozentanteil des in das Liposom aufgenommenen Monolipopeptids kann von etwa 50 bis etwa 99% betragen.
Die liposomale Formulierung enthält wenigstens ein Monolipopeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus MUC I-, Tuberkulose- und Malariapeptiden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge wenigstens eines Monolipopeptids an einen Patienten umfaßt. In noch einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Behandeln eines Individuums, um die Immunantwort des Individuums auf ein immunogenes Peptid zu regulieren, bereitgestellt, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge wenigstens eines Monolipopeptids an das Individuum umfaßt. Das Monolipopeptid ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus MUC I-, Tuberkulose- und Malariapeptiden. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Monolipopeptid irgendeine vollständige Sequenz oder wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren aus einer Sequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, 2 oder 4.
Das Monolipopeptid kann mit einem Dilipopeptid in ein Liposom aufgenommen werden, wobei der Prozentanteil des Monolipopeptids von mehr als 0 bis zu weniger als etwa 100% variiert und wobei der Prozentanteil des Dilipopeptids von mehr als 0 bis zu weniger als 100% variiert, basierend auf allen in das Liposom aufgenommenen Lipopeptiden. Der Prozentanteil des Monolipopeptids und der Prozentanteil des Dilipopeptids, die in das Liposom aufgenommen sind, kann etwa 50% betragen. Der Prozentanteil des Monolipopeptids kann von etwa 50 bis etwa 99% betragen. Der Prozentanteil des Dilipopeptids kann von etwa 50 bis etwa 99% betragen.
Das Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort führt zur Stimulation einer zellulären Antwort. Die Modulation kann ebenso zu einer Steigerung der Intensität einer zellulären Antwort führen.
Das Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort umfaßt weiterhin die gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans mit dem Monolipopeptid. Vorzugsweise ist das Adjuvans Lipid A.
Das Monolipopeptid ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus MUC I-, Tuberkulose- und Malariapeptiden. Vorzugsweise ist das Monolipopeptid irgendeine vollständige Sequenz oder wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer Sequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, 2 oder 4.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort, welches die Verabreichung wenigstens eines im wesentlichen aus einem Monolipopeptid bestehenden Liposoms an ein Individuum umfaßt. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort, welches die Verabreichung wenigstens eines aus einem Monolipopeptid bestehenden Liposoms an ein Individuum umfaßt. Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort, welches die Verabreichung wenigstens eines ein Monolipopeptid umfassenden Liposoms an ein Individuum umfaßt. Die Verfahren zum Modulieren einer Immunantwort umfassen weiterhin die gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans. Vorzugsweise ist das Adjuvans Lipid A.
Das Monolipopeptid ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus MUC I-, Tuberkulose- und Malariapeptiden. In einer weiteren Ausführungsform ist das Monolipopeptid irgendeine vollständige Sequenz oder wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer Sequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, 2 oder 4.
Die vorliegende Erfindung liefert auch lipidierte antigene Peptide. In einer Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine MUC I-Peptidzusammensetzung, welche ein Lipid umfaßt, das an eine Aminosäure von wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäuren des MUC I-Peptids angehängt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das MUC I-Peptid die vollständige Sequenz oder wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz von SEQ ID NO:1. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das MUC I-Peptid wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz SGVTSAPDTRPAPGSTA oder STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP.
Die MUC I-Peptidzusammensetzung kann weiterhin ein zweites Lipid umfassen, welches ebenfalls an eine Aminosäure des MUC I-Peptids angehängt ist. Jedes Lipid kann an verschiedene Aminosäuren angehängt sein. In einer Ausführungsform ist das Lipid entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des MUC I-Peptids positioniert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Tuberkulosepeptidzusammensetzung, welche ein Lipid umfaßt, das an eine Aminosäure des Tuberkulosepeptids angehängt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Tuberkulosepeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz DQVHFQPLPPAWKLSDALIK. In einer weiteren Ausführungsform ist das Lipid entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des Tuberkulosepeptids positioniert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Malariapeptidzusammensetzung, welche ein Lipid umfaßt, das an eine Aminosäure des Malariapeptids angehängt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Malariapeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz VTHESYQELVKKLEALEDAVK. In einer weiteren Ausführungsform ist das Lipid entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des Malariapeptids positioniert.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Lipid aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Myristyl, Palmitoyl und Lauryl.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Liposom, in welches ein Monolipopeptid eines antigenen Peptids aufgenommen ist, als einen Impfstoff zum Modulieren der Immunantwort auf das Peptid umfaßt
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende kurze Beschreibung der Zeichnung und die ausführliche Beschreibung sind beispielhaft und erläuternd und sollen eine weitere Erläuterung der beanspruchten Erfindung liefern. Weitere Ziele, Vorteile und neue Merkmale werden für Fachleute auf dem Gebiet aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt die Niveaus der T-Zell-Proliferation und von IFN-γ in C57BI/6-Mäusen, die zweimal mit MUC1-Dilipo- oder -Monolipopeptiden in Liposomen immunisiert wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Induktion von Immunantworten in vivo kann durch Verabreichung von liposomal gebundenen Peptiden, die eine Lipidkette umfassen, und liposomal gebundenen Peptiden, die wenigstens zwei Lipidketten umfassen, nacheinander oder in Kombination moduliert werden.
Der Begriff "modulieren" bedeutet eine Veränderung, Einstellung oder Anpassung auf einen bestimmten Anteil. So kann eine Immunantwort durch stimulierende Faktoren moduliert werden, die eine Veränderung der immunologischen Aktivität mit sich bringen. Die Intensität einer Immunantwort kann ebenfalls moduliert werden. Beispielsweise kann die Intensität oder das Niveau der T-Zell-Proliferation nach Verabreichung von Faktoren, die die Modulation bewirken, gesteigert oder verringert werden. Diese Faktoren können liposomal gebundene Lipopeptide sein.
Ein Peptid mit einer Lipidkette kann eine starke zelluläre Immunantwort (d.h. eine "T1"-Immunantwort) auslösen, wenn es in eine liposomale Formulierung aufgenommen wird, löst jedoch nur eine minimale oder keine humorale Antwort aus. Das gleiche Peptid kann jedoch bei Aufnahme in ein Liposom dazu gebracht werden, eine starke humorale Antwort (d.h. eine "T2"-Antwort), die mit entweder einer minimalen oder einer massiven zellulären Antwort einhergeht, auszulösen, wenn zwei Lipide an seine Oberfläche angehängt werden. Der Bereich der bei einem Lipopeptid beobachteten zellulären Antwort variiert in Abhängigkeit von der Identität des Lipopeptids. Das Vorliegen eines oder zweier Lipide oder von mehr als zwei Lipiden auf einem antigenen Peptid kann auch die Intensität, mit der eine Immunantwort ausgelöst wird, steigern oder verringern. Die Intensität einer Immunantwort und die Art der Immunantwort, die stimuliert wird, kann ebenfalls moduliert werden, indem die Anzahl an Aminosäureresten zwischen zwei Lipiden auf einem antigenen Peptid variiert wird.
Das Anhängen mehr als einer Lipidkette an ein Peptid, welches an eine liposomale Doppelschicht gebunden ist, stimuliert eine größtenteils humorale Immunantwort, zusammen mit einer va riablen zellulären Aktivität im Bereich zwischen minimal und massiv. Das Anhängen eines zweiten Lipids an ein antigenes Peptid steigert das Niveau der T-Zell-Proliferation und induziert die Produktion von Antikörpern im Vergleich zu dem Monolipidderivat. Der Begriff "Derivat" bedeutet eine Verbindung, die von einer anderen, die wesentliche Bestandteile der Elternsubstanz enthält, abgeleitet oder erhalten wurde. Somit bezieht sich das Lipidderivat eines Antigens auf ein Peptid, an das wenigstens ein Lipid angehängt ist. Daher ist es möglich, eine wirksame Menge einer liposomalen Formulierung, die nur Dilipopeptide enthält, zu verabreichen, um die Antikörperproduktion und die zelluläre Aktivität zu stimulieren. Eine "wirksame Menge" der liposomal gebundenen Lipopeptidformulierung bezieht sich auf eine empirisch bestimmte Menge desjenigen Lipopeptids, welches eine Immunantwort moduliert.
Für einige Antigene löst eine liposomale Dilipopeptidformulierung zusätzlich zu einer starken humoralen Antwort eine massive zelluläre Antwort aus.
Insbesondere zeigen die Beispiele, daß für MUC-1-, Tuberkulose- und Hepatitis B-Peptide liposomale Formulierungen mit einem Monolipopeptid größtenteils zelluläre Antworten und minimale humorale Antworten induzierten und daß liposomale Formulierungen mit einem Dilipopeptid größtenteils humorale Antworten und minimale zelluläre Antworten induzierten. Die Verabreichung einer Kombination aus einem Di- und einem Monolipopeptid führte zu besseren zellulären und humoralen Antworten.
Verschiedene Lipopeptide können in ein Liposom aufgenommen und somit gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen zum Immunsystem transportiert und diesem präsentiert werden. So ist es möglich, in einem Individuum mehrere Immunantworten zu induzieren, indem man dieses Individuum mit einem Liposom behandelt, welches ein T1-induzierendes Monolipopeptid und ein T2-induzierendes Dilipopeptid enthält. Alternativ kann auch ein Gemisch aus liposomal gebundenen Monolipopeptiden und liposomal gebundenen Dilipopeptiden verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Immunantworten zu stimulieren.
Eine Immunantwort sowie auch die Intensität der Immunantwort können moduliert werden, indem man zwei oder mehrere Lipide zu einem antigenen Peptid hinzufügt. Weiterhin kann die Intensität einer Immunantwort moduliert werden, indem man die Anordnung von Aminosäuren zwischen Lipiden variiert.
Eine Immunantwort kann auch ausgelöst werden, indem man einem Patienten vorstimulierte Antigen-präsentierende Zellen oder T-Zellen injiziert. Diese Technik, die als "adoptive Immuntherapie" bekannt ist, erzeugt in vitro eine erweiterte Population antigenspezifischer Zellen, die so eingerichtet sind, daß sie das verursachende Mittel bekämpfen, sobald sie wieder in den Körper eingebracht werden. Im wesentlichen werden Zellen aus dem Patienten entnommen, in vitro stimuliert und wieder in den Blutstrom des Patienten zurückinjiziert. Insbesondere Peripherblut-Lymphozyten, wie Antigen-präsentierende Zellen, werden isoliert und dann "beladen", indem die Zellen in vitro Antigenen ausgesetzt werden. Das Antigen wird durch eine Antigen-präsentierende Zelle Endozytose unterzogen, woraufhin es mit einem großen Histokompatibilitätskomplex verknüpft und anschließend auf der äußeren Oberfläche der Zelle präsentiert wird. Diese Population eingerichteter Zellen kann dann in den Patienten zurück injiziert werden. Vor dem Beladen kann auch eine Fraktionierung der Peripherblut-Lymphozyten in Dendritenzellen und/oder Makrophagen durchgeführt werden.
Somit kann eine liposomale Formulierung der vorliegenden Erfindung, die membrangebundene antigene Monolipopeptide umfaßt, in vitro zu den isolierten Antigen-präsentierenden Zellen zugegeben werden, um sie zu "beladen". Beispielsweise kann eine liposomale Formulierung, die ein Monolipo-MUC I-Peptid umfaßt, verwendet werden, um Peripherblut-Lymphozyten zu beladen, die dann als zellulärer Impfstoff in den Patienten zurück injiziert werden.
Alternativ kann eine "adoptive T-Zell-Transfertherapie" durchgeführt werden. Diese umfaßt das Inkubieren der T-Zellen eines Patienten mit zuvor beladenen Antigen-präsentierenden Zellen in vitro. Die T-Zellen werden aktiviert und wieder in einen Patienten, der beispielsweise an einem Adenokarzinom leidet, eingebracht. Für eine Beschreibung der auf dem Gebiet anerkannten Techniken für die adoptive T-Zell-Transfertherapie siehe Bartels et al., Annals of Surgical Oncology, 3(1): 67 (1996), was durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. So wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein lipidiertes antigenes Peptid ausgewählt, in ein Liposom aufgenommen und dazu verwendet, Peripherblut-Lymphozyten zu stimulieren, die dann entweder in den Patienten zurückinjiziert oder selbst zur Aktivierung isolierter T-Zellen verwendet werden können. Ein Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen ist auch geeignet, um die Antworten von zytotoxischen und Helfer-T-Zellen auf Antigene, die an verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Krebs, Tumoren, Virusinfektionen und bakteriellen Infektionen, beteiligt sind, zu erzeugen.
Liposome
Liposome sind mikroskopisch kleine Vesikel, die aus einer oder mehreren Lipiddoppelschichten bestehen, die wäßrige Kompartimente umgeben. Siehe z.B. Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Erg. 1): S61 (1993) und Kim, Drugs, 46: 618 (1993). Da Liposome mit großen Lipidmolekülen formuliert werden können, die auch in natürlichen Zellmembranen zu finden sind, können Liposome im allgemeinen sicher verabreicht werden und sind biologisch abbaubar.
In Abhängigkeit von dem Herstellungsverfahren können Liposome unilamellar oder multilamellar sein, und ihre Größe kann mit Durchmessern im Bereich von etwa 0,02 um bis zu mehr als etwa 10 μm variieren. Eine Vielzahl von Mitteln kann in Liposome eingekapselt sein. Hydrophobe Mittel verteilen sich in den Doppelschichten und hydrophile Mittel verteilen sich im wäßrigen Innenraum (den wäßrigen Innenräumen). Siehe z.B. Machy et al., LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY (John Libbey, 1987) und Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989).
Liposome können an praktisch jeden Zelltyp adsorbieren und setzen dann ein darin aufgenommenes Mittel frei. Alternativ kann das Liposom mit der Zielzelle fusionieren, wodurch der Inhalt des Liposoms sich in die Zielzelle entleert. Alternativ kann ein Liposom durch phagozytische Zellen Endozytose unterzogen werden. Auf die Endozytose folgen der intralysosomale Abbau liposomaler Lipide und die Freisetzung der eingekapselten Mittel. Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 446: 368 (1985).
Weitere geeignete Liposome, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfassen multilamellare Vesikel (MLV), oligolamellare Vesikel (OLV), unilamellare Vesikel (UV), kleine unilamellare Vesikel (SUV), mittelgroße unilamellare Vesikel (MUV), große unilamellare Vesikel (LUV), riesige unilamellare Vesikel (GUV), multivesikuläre Vesikel (MW), durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (REV) hergestellte einzelne oder oligolamellare Vesikel, durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren hergestellte multilamellare Vesikel (MLV-REV), stabile plurilamellare Vesikel (SPLV), eingefrorene und aufgetaute MLV (FATMLV), durch Extrusionsverfahren hergestellte Vesikel (VET), mittels French-Press hergestellte Vesikel (FPV), durch Fusionieren hergestellte Vesikel (FUV), Dehydratisierung/Rehydratisierung-Vesikel (DRV) und Bubblesome (BSV). Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß die Techniken zur Herstellung dieser Liposome auf dem Gebiet gut bekannt sind. Siehe COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, Band 66 (J. Kreuter, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., 1994).
Lipide
Ein "Lipid" kann ein Myristyl-, Palmitoyl- oder ein Laurylmolekül sein, welches an Aminosäuren angehängt werden kann, die funktionelle Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelgruppen enthalten. Solche Aminosäuren umfassen beispielsweise die Aminosäuren Threonin, Serin, Lysin, Arginin und Cystein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Ein "Monolipopeptid" ist ein Peptid, an das nur eine Lipidkette angehängt ist. In ähnlicher Weise ist ein "Dilipopeptid" ein Peptid, an das zwei Lipidketten an einer oder zwei Aminosäuren angehängt sind. Wenn die beiden Lipidketten an zwei Aminosäurereste angehängt sind, können diese Reste um irgendeine Anzahl von Aminosäuren beabstandet angeordnet sein.
Eine "liposomale Formulierung" beschreibt in vitro erzeugte Lipidvesikel, in die Mono- und/oder Dilipopeptide aufgenommen werden können. Somit bezieht sich "liposomal gebunden" auf ein Peptid, welches teilweise in ein Liposom aufgenommen oder an dieses angehängt ist. Eine liposomale Formulierung kann auch als ein "liposomaler Impfstoff" bezeichnet werden. Eine liposomale Formulierung kann zwei Arten von Liposomen umfassen: eine, in welcher die meisten, wenn nicht alle Monolipopeptide in der Struktur aufgenommen sind, und eine zweite, in welcher die meisten, wenn nicht alle Dilipopeptide in der Struktur aufgenommen sind. Einzelne Präparate von "Mono-" und "Di-" Liposomen können zusammen verabreicht werden, um eine Immunantwort zu modulieren, obwohl das Monolipopeptid und das Dilipopeptid nicht auf einem Liposom vorliegen.
Wenn sie in ein Liposom aufgenommen werden, können das Monolipopeptid und das Dilipopeptid Peptide sein, die das gleiche antigene Epitop sind. Alternativ kann die Peptidsequenz für jedes Lipopeptid verschiedene Epitope umfassen. Die Lipopeptide können Antigene sein, die mit dem gleichen Protein oder mit verschiedenen Proteinen assoziiert sind.
Ein Lipopeptid kann in Liposome aufgenommen werden, weil sich der Lipidteil des peptidischen Moleküls spontan in die Lipiddoppelschicht integriert. So kann ein Lipopeptid auf der "Oberfläche" eines Liposoms präsentiert werden. Alternativ kann ein Peptid in einem Liposom eingekap selt sein. Techniken zur Herstellung von Liposomen und zu deren Formulierung mit Molekülen, wie Peptiden, sind dem Fachmann gut bekannt.
Beispielhafte Adjuvanzien
Die vorliegenden liposomalen Impfstoffe können auch in vorteilhafter Weise mit einem Adjuvans formuliert werden. Wie es auf dem Gebiet üblicherweise bekannt ist, sind Adjuvanzien Substanzen, die zusammen mit spezifischen antigenen Stimuli wirken, um die spezifische Antwort auf das Antigen zu verstärken. Monophosphoryllipid A (MPLA) beispielsweise ist ein wirkungsvolles Adjuvans, welches zu einer gesteigerten Präsentation von liposomalem Antigen an spezifische T-Lymphozyten führt. Alving, C.R., Immunobiol., 187: 430-446 (1993). Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß lipidbasierende Adjuvanzien, wie Lipid A und Derivate davon, ebenfalls geeignet sind. Es wurde auch gezeigt, daß ein Muramyldipeptid (MDP) bei Aufnahme in Liposome die Wirkung als Adjuvans steigert (Gupta, R.K. et al., Adjuvants-A balance between toxicity and adjuvancity", Vaccine, 11, 293-306 (1993)).
Eine weitere Klasse von Adjuvanzien umfaßt stimulatorische Zytokine, wie IL-2. So können für eine optimale antigene Antwort die vorliegenden liposomalen Impfstoffe mit IL-2 formuliert werden oder IL-2 kann separat verabreicht werden. IL-2 wird in vorteilhafter Weise mit Liposomen formuliert.
Beispielhafte Impfstoff-Formulierungen
Impfstoffe können auch mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff formuliert werden. Solche Hilfsstoffe sind auf dem Gebiet gut bekannt, sollten jedoch typischerweise physiologisch verträglich und im Hinblick auf die Impfstoffeigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen inert sein oder verstärkend wirken. Beispiele umfassen flüssige Vehikel, wie sterile physiologische Kochsalzlösung. Ein Hilfsstoff kann während der Formulierung eines liposomalen Impfstoffs jederzeit zugegeben werden, oder er kann mit der fertigen Impfstoffzusammensetzung gemischt werden.
Impfstoffe können für verschiedene Verabreichungswege formuliert werden. Besonders bevorzugte Verabreichungswege umfassen die intramuskuläre, subkutane oder intradermale Injektion, die Verabreichung als Aerosol oder oral oder die Verabreichung durch eine Kombination dieser Wege, auf einmal oder in mehreren Dosierungseinheiten. Die Verabreichung von Impfstoffen ist gut bekannt und ist letztendlich von der betreffenden Formulierung und dem Urteil des behandelnden Arztes abhängig. Impfstofformulierungen können als eine Suspension gehalten werden oder sie können lyophilisiert und später hydratisiert werden, um einen verwendbaren Impfstoff zu erzeugen.
Um eine größere Spezifität bereitzustellen und dadurch das Risiko toxischer oder anderer unerwünschter Effekte während der Verabreichung in vivo zu reduzieren, ist es vorteilhaft, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf die Zellen zu richten, über die sie ausgestaltungsgemäß wirken sollen, nämlich die Antigen-präsentierenden Zellen. Dies kann in geeigneter Weise unter Verwendung konventioneller Ausrichtungstechniken zum Richten eines Liposoms, welches ein im munogenes Peptid enthält, auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Körpers bewerkstelligt werden. Um auf Antigen-präsentierende Zellen zu zielen, können beispielsweise Mannose und der Fc-Teil von Antikörpern chemisch an ein antigenes Peptid konjugiert werden, oder das Zielpeptid kann mit dem immunogenen Lipopeptid rekombinant fusioniert werden. Weitere ähnliche Strategien sind einem Arzt bekannt.
Beispielhafte Mengen von Lipopeptiden und liposomalen Formulierungen
Das Verhältnis von antigenen Monolipopeptiden und Dilipopeptiden innerhalb eines Liposoms kann so variiert werden, daß eine Immunantwort auf verschiedene Intensitätsgrade moduliert wird. Beispielsweise kann das Erhöhen der Menge an Dilipopeptid, das in ein Liposom aufgenommen ist, relativ zu der Menge an Monolipopeptid bewirken, daß die resultierende Formulierung eine mehr humorale Antwort induziert. Natürlich sind aufgrund verschiedener Ausmaße der Antworten auf verschiedene Antigene möglicherweise unterschiedliche Verhältnisse notwendig, um das gewünschte Gleichgewicht von humoraler und zellulärer Antwort zu erzielen.
Beispielsweise kann der Fachmann Liposome erzeugen, die aus einem Anteil kovalent verknüpfter immunogener Monolipopeptide und Dilipopeptide bestehen, wobei der Prozentanteil des Monolipopeptids von mehr als etwa 0 bis zu weniger als etwa 100% des Liposoms variiert. In ähnlicher Weise kann das Dilipopeptid in der liposomalen Membran als ein Prozentanteil von mehr als etwa 0 bis zu weniger als etwa 100% vorliegen. Beispielsweise kann ein Liposom, welches aus 75% Monolipopeptid und 25% Dilipopeptid besteht, in hohem Maße eine T1-Immunantwort mit etwas T2-Aktivität erzeugen. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zum Erzeugen eines Liposoms, welches etwa 1 bis etwa 30% Monolipopeptid, etwa 30 bis etwa 50% Monolipopeptid oder etwa 50 bis etwa 99% Monolipopeptid umfaßt. In ähnlicher Weise kann auch ein Liposom erzeugt werden, welches etwa 1 bis etwa 30% Dilipopeptid, etwa 30 bis etwa 50% Dilipopeptid oder etwa 50 bis etwa 99% Dilipopeptid umfaßt. Somit ermöglicht die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Liposomen, die beispielsweise Monolipopeptid : Dilipopeptid in Verhältnissen von beispielsweise etwa 10% etwa 90%, etwa 30% : etwa 70%, etwa 50% : etwa 50%, etwa 70% : etwa 30%, etwa 90% : etwa 10% und etwa 99% : etwa 1 % enthalten. Die Bestimmung der relativen Antigenität liegt innerhalb des Kenntnisbereichs eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der Immunologie.
Eine wirksame Menge einer liposomalen Formulierung, die wenigstens ein Monolipopeptid und wenigstens ein Dilipopeptid enthält, kann an einen Patienten verabreicht werden, wobei das Monolipopeptid und das Dilipopeptid entweder mit dem gleichen oder mit verschiedenen liposomalen Vesikeln assoziiert sind. So kann eine einzige liposomale Formulierung, die ein Verhältnis oder Verhältnisse eines Monolipopeptids und eines Dilipopeptids umfaßt, an einen Patienten verabreicht werden, um eine gewünschte Immunantwort auszulösen; alternativ können Kombinationen von wenigstens zwei liposomalen Formulierungen, die verschiedene Verhältnisse eines Monolipopeptids und eines Dilipopeptids umfassen, an einen Patienten verabreicht werden, um eine ähnliche oder eine andere Immunantwort auszulösen.
"Behandeln" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen in Bezug auf die vorliegende Erfindung betrifft das Verhindern, Heilen, Umkehren, Abschwächen, Lindern, Minimieren, Unterdrücken oder Stoppen der nachteiligen Auswirkungen eines Erkrankungszustands, eines Fortschreitens der Erkrankung, des die Krankheit verursachenden Mittels oder eines anderen abnormalen Zustands.
Beispielhafte immunogene Peptide
Jedes peptidische Antigen oder Epitop kann lipidiert und in ein Liposom aufgenommen werden, um Immunantworten in vivo zu induzieren oder zu modulieren. Ein Lipid, zwei oder mehr als zwei Lipide können zu jedem Teil eines Peptids hinzugefügt werden. Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß das antigene Peptid auf Basis der Art der Erkrankung, an der das Individuum leidet, ausgewählt wird. Beispielsweise ist ein "MUC-1"-Antigen geeignet für die Herstellung von antigenspezifischen T-Zellen, die bei der Behandlung von Adenokarzinom verwendet werden können. In ähnlicher Weise können auch ein Tuberkulosepeptid oder ein Malariapeptid gemäß der vorliegenden Erfindung lipidiert und dazu verwendet werden, eine zelluläre Immunität auszulösen, wie es gewünscht ist, um die spezifischen Erkrankungen, mit denen die Peptide in Verbindung gebracht werden, zu behandeln. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung von MUC-1, Tuberkulose- oder Malariapeptiden als liposomal gebundene lipopeptidische Impfstoffe beschränkt.
Eine Vielzahl immunogener Peptide kann lipidiert und in liposomale Membranen aufgenommen werden, um eine Anzahl verschiedener immunogener spezifischer Impfstoffe zu erzeugen. Hier wird beispielsweise die immunogene Wirkung der Lipidierung auf ein von Mucin abgeleitetes Peptid beschrieben. MUC I-Mucine sind makromolekulare Glycoproteine, die in allen Epithelzellen gesunder Individuen exprimiert werden. Die Kernpeptidsequenz von MUC I umfaßt 20 Aminosäurereste, die sich in dem gesamten Protein 60- bis 120-mal wiederholen. Die wiederholte Sequenz, GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH, weist fünf potentielle Glycosylierungsstellen (fettgedrucktes S, Serin, und T, Threonin) und ein immunogenes "DTR"-Epitop (unterstrichen) auf.
Im allgemeinen sind Kohlenhydrate mit einem oder mehreren der Serin- oder Threoninreste als O-verknüpfte Strukturen verknüpft, und wenn alle fünf Stellen glycosyliert sind, ist das Epitop verdeckt. In Krebszellen wird die Glycosylierungsstufe jedoch vorzeitig beendet, so daß die resultierenden Kohlehydrate verkürzt sind. Folglich liegt das DTR-Epitop frei und die Kernpeptidsequenz und das Kohlehydrat werden immunogen. So ist diese Peptidsequenz ein Beispiel eines Epitops, welches im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um eine Immunantwort zu induzieren und zu modulieren. Beispielsweise kann ein antigenes MUC I-Peptid der vorliegenden Erfindung unter wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäureresten der Sequenz SGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVSSL (SEQ ID NO:1) ausgewählt und lipidiert werden.
Die Größe eines immunogenen Peptids unterliegt auch Variationen. Lipidierte MUC-I-Peptidmoleküle mit einer Größe im Bereich von 16 (1882 Dalton) bis 40 (5050 Dalton) Aminosäuren lösen beispielsweise Immunantworten aus, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind.
Solche immunogenen Peptide sind jedoch nicht durch ihre Größe beschränkt und können ein Teil des gewünschten Immunogens oder sogar das gesamte gewünschte Immunogen sein. Typischerweise sind kleine Peptidantigene aufgrund der einfachen Herstellung und der größeren Spezifität bevorzugt. Somit sind SGVTSAPDTRPAPGSTA und STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP kleinere MUC I-Peptide, als sie gemäß der vorliegenden Erfindung lipidiert werden können. Dementsprechend umfassen die meisten Antigene, wenn sie nicht multimer sind (d.h. mehrere Kopien des gleichen Epitops enthalten), von etwa 9 bis etwa 100 Aminosäuren. Spezieller können Antigene mit einer Größe von etwa 9 bis etwa 20, von etwa 20 bis etwa 40, von etwa 40 bis etwa 60, von etwa 60 bis etwa 80 und von etwa 80 bis etwa 100 Aminosäuren lipidiert und in Liposome aufgenommen werden, wie es beschrieben ist. Fragmente von Proteinantigenen können durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt und getestet werden, um bestimmte Epitope zu identifizieren. Vorzugsweise werden kleine Peptide durch Syntheseverfahren in vitro hergestellt und getestet. So kann jede Antigensequenz vollständig oder teilweise in lipidierter Form verwendet werden. "Vollständig" oder "teilweise" bedeutet, daß entweder das gesamte antigene Peptid oder irgendein kleineres, von dem größeren abgeleitetes Peptid lipidiert werden kann. Ein "kleineres Peptid" kann ein Fragment eines größeren Peptidantigens sein, oder es kann rekombinant oder chemisch synthetisiert werden.
Weitere veranschaulichende Beispiele von Peptiden, die synthetisiert, lipidiert und in liposomal hergestellten Impfstoffen verwendet werden können, umfassen an Tuberkulose, Hepatitis B, Malaria und Krebserkrankungen beteiligte Peptide, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Das Tuberkulosepeptid DQVHFQPLPPAWKLSDALIK (SEQ ID NO:2), welches ursprünglich aus einem 38 kDa großen sekretorischen Protein von Mycobacterium tuberculosis stammt, kann mit einem oder zwei Lipiden hergestellt und in liposomale Formulierungen formuliert werden, wie es oben beschrieben ist.
In ähnlicher Weise wird ein Hepatitis B-Antigenpeptid durch die Aminosäuresequenz IRTPPAYRPPNAPILK (SEQ ID NO:3) repräsentiert. Gleichermaßen kann auch das Malariapeptid VTHESYQELVKKLEALEDAVK (SEQ ID NO:4) in einen liposomalen Impfstoff formuliert werden.
Eine Aminosäure, wie Threonin, Serin, Lysin, Arginin oder Cystein, die in der natürlichen Sequenz eines antigenen Peptids vorkommt, kann eine geeignete Stelle sein, mit der ein Lipid verknüpft werden kann. Alternativ kann irgendeine dieser Aminosäuren zu jedem Ende oder innerhalb einer Peptidsequenz hinzugefügt werden, um die Verknüpfung eines Lipidrests zu vereinfachen. So kann ein Antigenpeptid so ausgestaltet werden, daß es zwei Lysinreste an seinem Carboxylterminus enthält, um die Verknüpfung zweier Lipide zu vereinfachen. Mit "ausgestaltet" zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung konventioneller Peptidsyntheseverfahren in Betracht, um eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren in eine Peptidsequenz einzubringen. Es können jedoch auch rekombinante Verfahren verwendet werden, um Polynukleotide auszugestalten, die die gewünschte Aminosäuresequenz codieren. Somit zieht die vorliegende Erfindung die chemische und die rekombinante Synthese von antigenen Peptiden, die für eine Lipidierung empfänglich sind, in Erwägung.
Die untenstehenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und nicht beschränken. Obwohl sie für diejenigen, die verwendet werden können, typisch sind, können auch andere Verfahren verwendet werden, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
BEISPIEL 1
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Antwort der T-Zell-Proliferation und die Mengen der Anti-MUC-1-Antikörper in Reaktion auf die Verabreichung eines liposomalen MUC-1-Antigen-Impfstoffs zu bestimmen.
ZUSAMMENFASSUNG DER VERWENDETEN VERFAHREN
(i) Immunisierung
MUC1-basierende liposomale Impfstoffe ("liposomale BLP25-Impfstoffe") wurden in einer Dosis von 100 μg (250 μl) in zweiwöchigen Intervallen zwei-, drei- oder viermal subkutan in die rechte und die linke Leistengegend (125 μl für jede Stelle) injiziert.
(ii) T-Zell-Proliferationstest
Neun Tage nach der letzten Immunisierung mit liposomalem BLP25-Impfstoff wurden alle Mäuse getötet, und die Lymphknoten wurden chirurgisch entfernt. Mit Nylonwolle gereinigte T-Zellen aus den Lymphknoten wurden dann mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), die aus der Milz unveränderter Mäuse des gleichen Stamms erhalten wurden, kultiviert und mit Mitomycin C behandelt. Diese gemischten Kulturen wurden für vier Tage mit von MUC1 abgeleitetem synthetischem Lipopeptid (BP1-148) und Kontrollpeptid (BP1-72) gepulst. Nach dem vierten Tag wurden einige Überstände für den IFN-g-Test gesammelt, und dann wurden die Kulturen mit einem frischen Medium, welches ein mit Tritium markiertes Thymidin enthielt, gepulst. Nach weiteren 18-20 Stunden wurde die Aufnahmemenge von in die DNA aufgenommenem Tritium in einem Flüssigszintillationszähler gezählt.
(iii) IFN-Gamma-Test
Die Menge an IFN-γ in den gesammelten Überständen wurden durch einen spezifischen ELISA unter Verwendung einer Sandwich-Technik bestimmt. Kurz gefaßt wurden 96-Well-Maxisorp-Platten mit flachem Boden (Nuno, Dänemark) mit 50 μl monoklonalem Einfang-Antikörper R4.6A2 (Biomira, Charge # IM98A20A) für 35 Min, bei 37°C, 5% CO₂, beschichtet. Die Platten wurden dann gewaschen und für 45 Minuten mit Testproben und mit einer Positivstandard-Zytokinprobe (Pharmingen, Charge # M031554) inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen wurde der zweite biotinylierte Antikörper zugegeben: XMG1.2 (Biomira Charge # BG98G02B). Nach dem Waschen wurde mit Peroxidase konjugiertes Streptavidin (Jackson ImmunoResearch, Charge # 42350) zugegeben und erneut für 30 Minuten inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden 100 μl HRPO-Substratlösung: 1 μl 30% H₂O₂, verdünnt in 10 ml 1 mg/ml ABTS (Aldrich, Charge # 01328ES), gepuffert mit Zitronensäure und Na₂HPO₄·7 H₂O, unmittelbar vor der Verwendung hergestellt und zu jedem Well zugegeben. Die optimale Dichte wurde mit einem Thermomax ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 405 nm im kinetischen Modus für 10 Minuten gemessen. Die Mengen an Zytokin in der Testprobe wurden durch Vergleich mit Referenzstandards bestimmt.
(iv) Anti-MUC1-Antikörper-Mengen
96-Well-Mlkrotiterplatten wurden mit BP1-151HSA-Konjugat (24 Aminosäuren großes MUC1-Peptid, konjugiert an HSA) oder mit Blend C (Blend C ist ein natürliches menschliches MUC1-Mucin, welches aus Eierstockkrebs-Aszites gereinigt wurde) beschichtet. Reihenverdünnungen von Serum wurden auf den mit Antigen beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert, woraufhin die Wells gründlich gewaschen wurden. Mit Peroxidase markierter IgG-spezifischer Ziege-Anti-Maus-Antikörper wurde zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Jede Platte wurde dann gewaschen, und ABTS-Substrat wurde zugegeben. Nach 15 Min, wurde die Absorption bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
BEISPIEL 2
MONO- UND DILIPIDIERTE ANTIGENE MUC I-PEPTIDE
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, zu zeigen, daß ein liposomal gebundenes MUC I-Peptid mit zwei Lipidketten die Produktion von Anti-MUC I-Antikörpern in immunisierten Mäusen im Vergleich zu einem MUC I-Peptid mit einem Lipid drastisch steigert.
MUC I-Peptide wurden chemisch so synthetisiert, daß sie ein oder zwei Lipide enthielten. "BP1-217" enthält zwei Liposerinreste, die an den Carboxyterminus der Kernpeptidsequenz angehängt sind, und "BP1-228" enthält nur ein Liposerin, das an den Carboxyterminus angehängt ist. Das Monolipopeptid und das Dilipopeptid wurden separat in Liposome aufgenommen, und die resultierenden liposomalen Formulierungen wurden als Impfstoffe beurteilt.

BP1-217: GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)S(Myristyl)L
BP1-228: GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)L

Nach wenigstens zwei subkutanen Immunisierungen von C57BI/6-Mäusen mit dem liposomalen Dilipopeptidimpfstoff induzierte BP1-217 die humorale T2-Antwort und produzierte sehr große Mengen an Anti-MUC I-Immunglobulin G (IgG). Im Gegensatz dazu wurde in Mäusen, die zweimal mit dem Monolipopeptid, BP1-228, immunisiert worden waren, eine zelluläre Antwort mit sehr geringen Mengen an IgG ausgelöst. Beispielsweise erzeugte BP1-217 Anti-MUC I-IgG-Titer im Bereich von 1/72.000 bis 1/218.700 auf einer festen Phase von BP1-151 HSA und 1/100 bis 1/2700 Titer auf einer festen Phase von Blend C, wohingegen BP1-228 nur geringe Titer von IgG-Antikörpern auf fester Phase von BP1-151 HSA produzierte und auf der festen Phase von Blend C keine Antikörper detektiert wurden. Siehe Tabelle 1 unten.
BP1-228 oder BLP-25 als Monolipopeptide produzierten sehr geringe Mengen an Antikörpern oder überhaupt keine Antikörper im Vergleich zu irgendeinem MUC1-Peptid mit zwei Lipidketten. Alle getesteten Formulierungen sind liposomal und enthalten Lipid A als Adjuvans.
Irgendeine Menge im Bereich von 40-100 μg an MUC1-Lipopeptid pro Immunisierung kann verwendet werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf diese Mengen beschränkt ist, die auch entsprechend dem spezifischen verwendeten Peptid variieren können. 5 μg MUC1-Peptid in Liposomen löste eine starke T1-Immunantwort, jedoch keine Antikörperproduktion aus. In klinischen Versuchen wurde herausgefunden, daß eine Dosis von 1000 μg BLP25, die Patienten injiziert wurde, beim Auslösen einer spezifischen T-Zell-Proliferation sehr effektiv war.
Es wird auch gezeigt, daß eher quantitative als qualitative Unterschiede zwischen Lipidketten bei der Auslösung von T1- oder T2-Antworten von Bedeutung sind. Das heißt, eine humorale Immunantwort kann ausgelöst werden, ganz gleich welche Art von Lipidkette an das Peptid angehängt ist. Beispielsweise wurde auch gezeigt, daß ein MUC I-Peptid, "BP1-132", bei dem zwei lipophile Aminosäurereste von Palmitoyl-Lysin an zwei benachbarte Lysinreste angehängt sind, humorale Immunität induziert. Siehe Tabelle 2.

BP1-132: TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPK(Palmitat)K(Palmitat)G

Mäuse, die zweimal mit liposomalen Formulierungen, die BP1-132 enthielten, immunisiert worden waren, riefen die Produktion von Anti-MUC I-Antikörpern mit Titern (IgG 1/218.700 und IgM 1/8100 bis 1/72.900) ähnlich denjenigen, wie sie für BP1-217 aufgezeichnet wurden, hervor. Tabelle 1: Protokoll I346 Zusammenfassung der Daten zu IgG-Antikörper-Titer

C57BI/6-Mäuse wurden zweimal mit liposomaler Formulierung immunisiert: BLP16 Dilipo, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-217) und Lipid A, oder BLP16 Monolipo, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-228) und Lipid A, oder BLP25, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-148) und Lipid A
BP1-217 GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)S(Myristyl)L
BP1-228 GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)L
BP1-148 STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-Lys(Palmitoyl)

Zwei Immunisierungen mit Dilipo-MUC I-Peptidliposomen stimulierten am meisten die humorale T2-Immunantwort, obwohl eine gewisse Aktivität des zellulären Immunsystems verbleibt, wie es durch T-Zell-Proliferation und IFN-γ-Produktion zu erkennen ist. Nichtsdestotrotz zeigt die Erfindung, daß die liposomale Verabreichung eines MUC I-Peptids mit zwei angehängten Lipidketten (z.B. entweder Palmitoyl-Lysin- oder Myristyl-Serin-Lipidketten) eine drastische Steigerung der Antikörperproduktion und der Stimulation des humoralen Immunsystems liefert.
Dieses Ergebnis wurde zuvor in keinem Säugermodell beobachtet. Tabelle 2: Protokoll I350B (2 × Immunisierung Daten zu IgM- und IgG-Antikörper-Titer

C57BI/6-Mäuse wurden zweimal mit liposomaler Formulierung immunisiert: BLP24-Dilipo, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-132) und Lipid A BLP25, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-148) und Lipid A BP1-132 TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPK(Palmitoyl)K(Palmitoyl)L

Um das beobachtete Phänomen weiter zu charakterisieren, wurden transgene MUC I-Mäuse mit MUC I-basierenden liposomalen Formulierungen, die Mono- oder Dilipopeptide enthielten, immunisiert. Wie es in Tabelle 3 gezeigt ist, wurde bei Immunisierung mit dem Dilipopeptid (BP1-217) erneut eine starke IgG-Antikörperantwort beobachtet, jedoch erst nach vier Immunisierungen. Dies zeigt, daß transgene C57BI/6-MUC I-Mäuse, die für MUC I-Antigen tolerogen sind, mehr Immunisierungen benötigen als normale C57BI/6-Mäuse, um diese Toleranz zu durchbrechen und hohe Niveaus an Anti-MUC I-IgG zu induzieren. Mäuse, die nur mit dem Monolipopeptid immunisiert worden waren (z.B. BP1-228), zeigten jedoch sehr geringe Titer von IgG.
Somit stimuliert die Verabreichung einer liposomalen Formulierung, die Monolipo-MUC I-Peptid enthält, eine zelluläre Antwort. Die Immunisierung mit einer liposomalen Formulierung, die Dilipo-MUC I-Peptid enthält, induziert eine humorale Antwort. Die Erzeugung eines Liposoms, welches Monolipo-MUC I und Dilipo-MUC I enthält, löst bei Immunisierung sowohl zelluläre als auch humorale Antworten aus. Somit kann die Modulation der Immunantwort durch selektives Verabreichen einer bestimmten liposomalen Formulierung in einer bestimmten Reihenfolge erzielt werden. Tabelle 3: Protokoll I347C – Daten zum IgG-Antikörper-Titer von transgenen MUC1-Mäusen (4 Immunisierungen)

Transgene C57BI/6-MUC1-Mäuse wurden viermal mit liposomaler Formulierung immunisiert: BLP16-Dilipo, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-217) und Lipid A, oder BLP16-Monolipo, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-228) und Lipid A, oder BLP25, enthaltend MUC1-basierendes Lipopeptid (BP1-148) und Lipid A
BP1-217 GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)S(Myristyl)L
BP1-228 GVTSAPDTRPAPGSTAS(Myristyl)L
BP1-148 STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-Lys(Palmitoyl)

BEISPIEL 3
MONO- UND DILIPIDIERTE TUBERKULOSEPEPTIDE
Wie es für MUC I-Monolipo- und Dilipopeptide beobachtet wurde, steigerte die Immunisierung mit Dilipo-Tuberkulosepeptid die Antikörperproduktion drastisch. Siehe Tabelle 4. Tabelle 4: Immunantworten in C57BI/6-Mäusen, die zweimal mit Tuberkulose-Lipopeptidbasierenden liposomalen Impfstoffen immunisiert wurden

* TB-Dilipopeptid DQVHFQPLPPAWKLSDALIK wurde als Festphase im ELISA-Test verwendet

Zwei Immunisierungen mit Dilipo-Tuberkulosepeptid steigerten die Menge der IgG-Titer im Vergleich zu den Titern, die nach Immunisierung mit Monolipo-Tuberkulosepeptid induziert wurden, drastisch. Die Ergebnisse zeigen, daß das Vorhandensein zweier Lipide den Titer, der einer humoralen Antwort entspricht, fast um das 10-fache steigert.
[LEDIGLICH ZU INFORMATIONSZWECKEN]
MONO- UND DILIPIDIERTE HEPATITIS B-PEPTIDE
Tabelle 5: Protokoll I368B Immunantworten in Mäusen, die zweimal mit liposomalem Hepatitis B-Mono- oder -Dilipopeptid-Impfstoff immunisiert wurden

* Hepatitis B-Dilipopeptid IRTPPAYRPPNAPILK(Palmitat)K(Palmitat)G wurde als Festphase im ELISA-Test verwendet

Zwei Immunisierungen mit Dilipo-Hepatitis B-Peptid steigerten die Menge der IgG-Titer im Vergleich zu den Titern, die nach den Immunisierungen mit Monolipo-Hepatitis B-Peptid induziert wurden, drastisch. In ähnlicher Weise ist die Menge der IgM-Antikörper größer, nachdem die Dilipopeptid enthaltende liposomale Formulierung für das Immunisierungsverfahren verwendet wurde.
BEISPIEL 5
MONO- UND DILIPIDIERTE MALARIAPEPTIDE
Tabelle 6: Protokoll I368B Immunantworten in Mäusen, die zweimal mit liposomalem, Mono- oder Dilipopeptid enthaltendem Malaria-Impfstoff immunisiert wurden

* Malaria-Dilipopeptid VTHESYQELVKKLEALEDAVK(Palmitat)K(Palmitat)G wurde als Festphase im ELISA-Test verwendet

Zwei Immunisierungen mit Dilipo-Malariapeptid steigerten die Mengen sowohl des IgG- als auch des IgM-Titers im Vergleich zu den Titern, die nach Immunisierungen mit Monolipo-Malariapeptid induziert wurden. In diesem Fall induzierte der Malaria-Impfstoff mit Dilipopeptid im Vergleich zu dem Impfstoff mit Monolipopeptid eine stärkere Zellproliferation und größere Mengen an IFN-γ. Dies zeigt, daß die Intensität einer Immunantwort, d.h. die zelluläre Immunantwort, durch Variieren der Anzahl von an das Antigen angehängten Lipiden moduliert werden kann.
BEISPIEL 6
VARIIEREN DES VERHÄLTNISSES VON MONO- UND DILIPOPEPTIDEN IN EINEM LIPOSOM
Durch Aufnahme verschiedener Verhältnisse von Mono- und Dilipopeptiden in Liposome ist es möglich, das Niveau und die Intensität von humoralen Antworten zu modulieren. Tabelle 7 faßt die IgM-Titer in C57BI/6-Mäusen nach zwei Immunisierungen mit verschiedenen liposomalen Konstrukten zusammen. Wie erwartet, produzierten Mäuse, die mit BLP25-Monolipopeptid oder Kochsalzlösung immunisiert worden waren (Gruppen 5 und 6), keine detektierbaren IgM-Titer. Alle liposomalen Formulierungen erzeugten jedoch eine vergleichbare zelluläre Immunantwort (Daten nicht gezeigt).
Das Gemisch aus Mono- bzw. Dilipopeptiden im Verhältnis 3:1 verbesserte die Antikörpertiter nicht signifikant (Gruppe 1), es kam jedoch zu einer Zunahme der Antikörpertiter im Vergleich zu Gruppe 1, wenn Mono- und Dilipopeptide in einem Verhältnis von 1:1 in Liposome aufgenommen wurden. Die stärkste Antikörperantwort wurde in den Mäusen beobachtet, die mit einer liposomalen Formulierung inkubiert worden waren, welche MUC1-Mono- und -Dilipopeptide im Verhältnis von 1:3 enthielt (Gruppe 3).
Durch Aufnahme von Mono- und Dilipopeptiden in verschiedenen Verhältnissen in Liposome ist es daher möglich, das Niveau der humoralen Antworten zu modulieren.
Tabelle 7: Protokoll 1399B (2 × Immunisierung) Daten zu IgM-Antikörpertiter
[NUR ZUR HINTERGRUNDINFORMATION]
AUSWIRKUNG DER POSITION DER LIPIDKETTE IN MUC1-LIPOPEPTID AUF DIE HUMORALE IMMUNANTWORT
Die Demonstration einer starken Antikörperantwort nach Immunisierung von Mäusen mit MUC1-Lipopeptid mit zwei am Carboxyterminus angehängten Liposerinresten wirft die Frage auf, ob diese starke Antikörperantwort aufrechterhalten werden kann, wenn die Position oder die Anzahl der Liposerinreste verändert wird.
Um diese Frage zu beantworten, wurden mehrere MUC1-Lipopeptidkonstrukte mit verschiedenen Plazierungen der Liposerinreste synthetisiert. Die in Tabelle 8 aufgelisteten Daten zeigen, daß nur Formulierung #5 mit drei Liposerinresten am Carboxyterminus eine starke Anti-MUC1-IgG-Antwort erzeugen konnte. Die Insertion eines drei Serine großen Abstandshalters zwischen den beiden Lipidketten (Formulierung #4) führte zu einer Abnahme des Niveaus der Antikörperantworten.
In ähnlicher Weise zeigte Formulierung #2, bei der nur eine Lipidkette in der Mitte des MUC1-Peptids eingefügt wurde, einige niedrige Antikörpertiter, doch waren diese Titer viel höher, wenn zwei Liposerinreste in die Mittelposition des MUC1-Moleküls eingesetzt wurden (Formulierung #1). Einige niedrige Antikörpertiter wurden beobachtet, wenn die Liposerinreste in extremen Positionen angeordnet wurden: einer am Carboxyterminus und einer am Aminoterminus (Formulierung #2).
Die stärksten Antikörperantworten konnten erzeugt werden, wenn zwei oder drei Liposerinreste am Carboxyterminus angeordnet wurden. Die Veränderung der Position der Liposerinreste erhält noch immer einige Antikörpertiter aufrecht, die höher sind als der von BLP25 oder Kochsalzlösung (Gruppen 6 und 7), jedoch bedeutend niedriger im Vergleich zur Anordnung am Carboxyterminus. TABELLE 8: PROTOKOLL 1405 DATEN ZU IgG-ANTIKÖRPERTITER

[BP1-265: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVS(Lipo)S(Lipo)L]
[BP1-271: TSAPDTRPAPGSS(Lipo)S(Lipo)STSAPDTRPAPGS]
[BP1-272: TSAPDTRPAPGSS(Lipo)STSAPDTRPAPGS]
[BP1-273: S(Lipo)GVTSAPDTRPAPGSAS(Lipo)L]
[BP1-274: GVTSAPDTRPAPGSTAS(Lipo)SSSS(Lipo)L]
(BP1-275: GVTSAPDTRPAPGSTAS(Lipo)S(Lipo)S(Lipo)L]
[BP1-148: STAPDAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-Lys(Palmitoyl)]

Claims

Liposomale Zusammensetzung, welche folgendes umfaßt: (a) selbstorganisierende Lipide, die ein Liposom bilden, (b) ein immunogenes Monolipopeptid, wobei: (i) der Peptidteil des Monolipopeptids wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren des Krebsproteins MUC-1 umfaßt, (ii) das immunogene Peptid über eine in dem Peptid vorliegende Aminosäure an wenigstens ein Lipid angehängt ist und (iii) das immunogene Peptid liposomal gebunden ist, was bedeutet, daß das Monolipopeptid in die Liposome aufgenommen ist, weil der Lipidteil des Peptids sich spontan in die Lipiddoppelschicht des Liposoms integriert, und (c) IL-2 als ein Adjuvans.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin Lipid A umfaßt.
Liposomale Zusammensetzung, welche folgendes umfaßt: (a) selbstorganisierende Lipide, die ein Liposom bilden, und (b) ein immunogenes Monolipopeptid, wobei: (i) der Peptidteil des Monolipopeptids wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren aus einem Protein umfaßt, welches mit einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tuberkulose und Malaria, in Verbindung gebracht wird, (i) das immunogene Peptid über eine in dem Peptid vorliegende Aminosäure an wenigstens ein Lipid angehängt ist, und (iii) das immunogene Peptid liposomal gebunden ist, was bedeutet, daß das Monolipopeptid in die Liposome aufgenommen ist, weil der Lipidteil des Peptids sich spontan in die Lipiddoppelschicht des Liposoms integriert.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, welche weiterhin ein Adjuvans umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Adjuvans aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lipid A und IL-2.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die selbstorganisierenden Lipide Liposome bilden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus multilamellaren Vesikeln (MLV), oligolamellaren Vesikeln (OLV), unilamellaren Vesikeln (UV), kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV), mittelgroßen unilamellaren Vesikeln (MUV), großen unilamellaren Vesikeln (LUV), riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV), multivesikulären Vesikeln (MW), einzelnen durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (REV) hergestellten Vesikeln, durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (REV) hergestellten oligolamellaren Vesikeln, durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (REV) hergestellten multilamellaren Vesikeln, stabilen plurilamellaren Vesikeln (SPLV), eingefrorenen und aufgetauten MLV (FATMLV), durch Extrusionsverfahren hergestellten Vesikeln (VET), mittels French-Press hergestellten Vesikeln (FPV), durch Fusionieren hergestellten Vesikeln (FUV), Dehydratisierung/Rehydratisierung-Vesikeln (DRV) und Bubblesome (BSV).
Zusammensetzung nach einem der Anspruche 1 bis 6, wobei das an das immunogene Peptid angehängte Lipid entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des immunogenen Peptids angehängt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das an das immunogene Peptid angehängte Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Myristyl, Palmitoyl und Lauryl.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Monolipopeptid etwa 9 bis etwa 100 Aminosäuren umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6 bis 9, wobei das MUC I-Lipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz GVTSAPDTRPAPGSTA umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6 bis 9, wobei das MUC I-Lipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz SGVTSAPDTRPAPGSTA umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6 bis 9, wobei das MUC I-Lipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6 bis 9, wobei das MUC I-Lipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz SGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVSSL (SEQ ID NO:1) umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Monolipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Tuberkulose-Peptidsequenz DQVHFQPLPPAWKLSDALIK (SEQ ID NO:2) umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Monolipopeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der Malaria-Peptidsequenz VTHESYQELVKKLEALEDAVK (SEQ ID NO:4) umfaßt.
Impfstoff, welcher die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 umfaßt.
Verwendung eines Impfstoffs nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikaments.