DE69636453T2

DE69636453T2 - Modulation der aktivität des cholesteryl-ester-transfer-proteins (cetp)

Info

Publication number: DE69636453T2
Application number: DE69636453T
Authority: DE
Inventors: W. Charles Malden RITTERSHAUS; J. Lawrence Worcester THOMAS
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 1995-05-01
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2016-05-02
Also published as: US7078036B2; US20020042364A1; AU707752B2; CA2219795C; CA2219795A1; US20040087481A1; PT827509E; US20030108559A1; US6555113B1; JPH11504635A; ES2271952T3; DE69636453D1; US6410022B1; JP3839483B2; EP0827509B1; AU5636096A; WO1996034888A1; ATE336510T1; EP0827509A1; DK0827509T3

Description

Das ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung der United States Patentanmeldung Nr. 08/432 483, angemeldet am 1. Mai 1995.
Allgemeines Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von Impfstoffen auf Peptidbasis zur Steuerung, Behandlung oder Risikoverminderung einer atherogenen Aktivität im Kreislaufsystem von Menschen und anderen Tieren. Insbesondere stellt diese Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln bereit, um die Aktivität des endogenen Cholesterylesterase-Transferproteins (CETP) zu inhibieren, um eine kardiovaskuläre Erkrankung prophylaktisch oder therapeutisch zu behandeln oder um die relativen Spiegel von Lipoproteinen zu modulieren, so dass ein Zustand hergestellt wird, der mit einem verminderten Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung, wie beispielsweise Atherosklerose, korreliert ist.
Hintergrund der Erfindung
Cholesterin zirkuliert im Körper vorwiegend als Bestandteil von Lipoproteinpartikeln (Lipoproteinen), die zusammengesetzt sind aus einem Proteinteil, der Apolipoprotein (Apo) genannt wird, sowie verschiedenen Lipiden, einschließlich Phospholipiden, Triglyceriden, Cholesterin und Cholesterylestern. Es gibt zehn Hauptklassen von Apolipoproteinen: Apo A-I, Apo A-II, Apo-IV, Apo B-48, Apo B-100, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D und Apo E. Lipoproteine werden anhand ihrer Dichte und Zusammensetzung klassifiziert. Beispielsweise weisen Lipoproteine hohe Dichte (HDL), die unter anderem die Funktion haben, den Transport von Cholesterin aus dem peripheren Gewebe zur Leber zu vermitteln, eine Dichte auf, die üblicherweise im Bereich von etwa 1,063-1,21 g/ml liegt. HDL enthalten unterschiedliche Mengen an Apo A-I, Apo A-II, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D, Apo E sowie unterschiedliche Mengen an Lipiden, wie beispielsweise Cholesterin, Cholesterylestern, Phopsholipiden und Triglyceriden.
Im Gegensatz zu HDL enthalten Lipoproteine niedriger Dichte (LDL), die im Allgemeinen eine Dichte von 1,019-1,063 g/ml aufweisen, Apo B-100 in Assoziation mit unterschiedlichen Lipiden. Insbesondere sind die Mengen der Lipide Cholesterin und Cholesterylester in LDL erheblich höher als in HDL, und zwar bei einer Messung als Prozentsatz der Trockenmasse. LDL sind besonders wichtig für den Transport von Cholesterin in die peripheren Gewebe.
Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL) weisen eine Dichte von etwa 0,95-1,006 g/ml auf und unterscheiden sich ebenfalls in ihrer Zusammensetzung von anderen Lipoproteinklassen, sowohl beim Protein- als auch beim Lipidgehalt. VLDL enthalten im Allgemeinen eine sehr viel höhere Menge an Triglyceriden als HDL oder LDL und sind besonders wichtig für die Überführung von endogen erzeugten Triglyceriden aus der Leber zum Fettgewebe und anderen Geweben. Die Merkmale und Funktionen von unterschiedlichen Lipoproteinen wurden in Reviews behandelt (vgl. beispielsweise Mathews, C.K. und van Holde, K.E., Biochemistry, Seiten 574-576, 626-630 (The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City, California, 1990); Havel, R.J., et al., "Introduction: Structure and metabolism of plasma lipoproteins", In The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed., Seiten 1129-1138 (Scriver, C.R., et al., eds.) (McGraw-Hill, Inc., New York, 1989); Zannis, V.I. et al., "Genetic mutations affecting human lipoproteins, their receptors, and their enzymes", In Advances in Human Genetics, Vol. 21, Seiten 145-319 (Plenum Press, New York, 1993)).
Eine verringerte Neigung zur Ausbildung einer kardiovaskulären Erkrankung wie beispielsweise Atherosklerose wird im Allgemeinen mit erhöhten Absolutspiegeln an zirkulierenden HDL sowie außerdem erhöhten Spiegeln an HDL relativ zum Spiegel an zirkulierenden Lipoproteinen niedriger Dichte wie VLDL und LDL korreliert (vgl. z.B. Gordon, D.J., et al., N. Engl. J. Med. 321:1311-1316 (1989); Castelli, W.P., et al., J. Am. Med. Assoc., 256:2835-2838 (1986); Miller, N.E., et al., Am. Heart J., 113:589-597 (1987); Tall, A.R.., J. Clin. Invest., 89:379-384 (1990); Tall, A.R., J. Internal Med., 237:5-12 (1995)).
Cholesterylester-Transportprotein (CETP) vermittelt den Transfer von Cholesterylestern von HDL zu TG-reichen Lipoproteinen wie VLDL und LDL, sowie auch den reziproken Austausch von TG von VLDL zu HDL (Tall, A.R., J. Internal Med., 237:5-12 (1995); Tall, A.R., J. Lipid Res., 34:1255-1274 (1993); Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 262:2275-2282 (1987); Quig, D.W., et al., Ann. Rev. Nutr., 10:169-193 (1990)). CETP kann eine Rolle spielen bei der Modulation der Spiegel von Cholesterylestern und Triglycerid, die mit unterschiedlichen Klassen von Lipoproteinen assoziiert sind. Eine hohe CETP-Cholesterylester-Transferaktivität wurde mit erhöhten Spiegeln an LDL-assoziiertem Cholesterin und VLDL-assoziiertem Cholesterin korreliert, was seinerseits mit einem erhöhten Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung korreliert wurde (vgl. z.B., Tato, F., et al., Arterioscler. Thromb. Vascular Biol., 15:112-120 (1995)).
Nachfolgend wird LDL-C verwendet, um das gesamte Cholesterin zu bezeichnen, einschließlich Cholesterylester und/oder nichtverestertem Cholesterin, das mit Lipoprotein niedriger Dichte assoziiert ist. VLDL-C wird verwendet, um das gesamte Cholesterin zu bezeichnen, einschließlich Cholesterylester und/oder nichtverestertem Cholesterin, das mit Lipoprotein sehr niedriger Dichte assoziiert ist. HDL-C wird verwendet, um das gesamte Cholesterin zu bezeichnen, einschließlich Cholesterylester und/oder nichtverestertem Cholesterin, das mit Lipoprotein hoher Dichte assoziiert ist.
Aus humanem Plasma isoliertes CETP ist ein hydrophobes Glycoprotein mit 476 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 66.000 bis 74.000 Dalton auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelen (Albers, J.J., et al., Arteriosclerosis, 4:49-58 (1984); Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 262:2275-2282 (1987); Jarnagin, S.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1854-1857 (1987)). Eine cDNA, die für humanes CETP kodiert, wurde kloniert und sequenziert (Drayna, D., et al., Nature, 327:632-634 (1987)). Kürzlich wurde von einem Polymorphismus bei humanem CETP berichtet, und dieser kann mit einer Erkrankung im Lipidstoffwechsel assoziiert sein (Fumeron et al., J. Clin. Invest., 96:1664-1671 (1995)); Juvonen et al., J. Lipid Res., 36:804-812 (1995)). Es wurde gezeigt, dass CETP an CE, TG, Phospholipide (Barter, P.J. et al., J. Lipid Res., 21:238-249 (1980)) und Lipoproteine bindet (vgl. z.B., Swenson, T.L., et al., J. Biol. Chem., 264:14318-14326 (1989)). In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass der Abschnitt des CETP, der durch die carboxyterminalen 26 Aminosäuren, und insbesondere durch die Aminosäuren 470 bis 475 gebildet wird, besonders wichtig ist für die Neutrallipid-Bindung, die am Neutrallipid-Transfer beteiligt ist (Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 263:5020-5023 (1988)), jedoch nicht für die Phospholipid-Bindung (vgl. Wang, S., et al., J. Biol.. Chem., 267:17487-17490 (1992)); Wang, S., et al., J. Biol. Chem., 270:-612-618 (1995)).
Ein monoklonaler Antikörper (Mab), TP2 (der früher in der Literatur als 5C7 bezeichnet wurde), wurde hergestellt, der die Cholesterylester- und Triglycerid-Transferaktivität von CETP völlig inhibiert, und zu einem geringeren Grade auch die Phospholipid-Transferaktivität (Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 263:5020-5023 (1988)). Das Epitop für TP2 wurde auf den carboxyterminalen 26 Aminosäuren lokalisiert, d.h. den Aminosäuren von Arginin-451 bis Serin-476, des humanan, 74.000 Dalton CETP-Moleküls (vgl. Hesler, C.B., et al., (1988)). Es wurde berichtet, dass TP2 sowohl die humane als auch die Kaninchen-CETP-Aktivität in vitro und Kaninchen-CETP in vivo inhibiert (Yen, F.T., et al., J. Clin. Invest., 83:2018-2024 (1989) (Reaktion von TP2 mit humanem CETP); Whitlock et al., J. Clin. Invest., 84:129-137 (1989) (Reaktion von TP2 mit Kaninchen-CETP)). Eine weitere Analyse des Abschnitts des CETP, an den TP2 bindet, zeigte, dass Aminosäuren zwischen Phenylalanin-463 und Leucin-475 für die TP2-Bindung und für die Neutrallipid (z.B. Cholesterylester-)-Transferaktivität notwendig sind (vgl. Wang, S., et al., 1992).
Eine Anzahl von in vivo Untersuchungen unter Verwendung von Tiermodellen oder Menschen haben gezeigt, dass die CETP-Aktivität den Spiegel der zirkulierenden cholesterinhaltigen HDL beeinflussen kann. Eine erhöhte CETP-Cholesterylester-Transferaktivität kann eine Abnahme bei den HDL-C-Spiegeln relativ zu LDL-C und/oder VLDL-C-Spiegeln erzeugen, was seinerseits mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Atherosklerose korreliert. Die Injektion, eines teilweise gereinigten humanen CETP in Ratten (denen normalerweise eine CETP-Aktivität fehlt) führte zu einem Shift von Cholesterylester von HDL auf VLDL, was konsistent ist mit den CETP-unterstützten Transfer von Cholesterylester von HDL auf VLDL (Ha, Y.C., et al., Biochem. Biophys. Acta, 833:203-211 (1985); Ha, Y.C., et al., Comp. Biochem. Physiol., 83B:463-466 (1986); Gavish, D., et al., J. Lipid Res., 28:257-267 (1987)). Es wurde berichtet, dass transgene Mäuse, die humanes CETP exprimieren, eine signifikante Verminderung der Spiegel für das mit HDL assoziierte Cholesterin zeigen (vgl. z.B. Hayek, T., et al., J. Clin. Invest., 90:505-510 (1992); Breslow, J.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8314-8318 (1993)). Außerdem wurde berichtet, dass, während Wildtyp-Mäuse normalerweise gegenüber Atherosklerose hochresistent sind (Breslow, J.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 90:8314-8318 (1993)), transgene Mäuse, die ein Affen-CETP exprimieren, eine veränderte Verteilung von mit Lipoproteinen assoziiertem Cholesterin aufweisen, nämlich erhöhte Spiegel an LDL-C und VLDL-C und verminderte Spiegel an HDL-C (Marotti, K.R., et al., Nature, 364:73-75 (1993)). Transgene Mäuse, die Affen-CETP exprimierten, waren auch im Hinblick auf eine diätinduzierte schwere Atherosklerose empfindlicher, verglichen mit nicht-exprimierenden Kontrollmäusen, und sie entwickelten atherosklerotische Läsionen in ihren Aorten in signifikant größeren Flächenbereichen als demjenigen, der in Kontrolltieren gefunden wird, und diese weisen ein ausgedehntes herdartiges Aussehen auf, das stärker für solche typisch ist, wie sie bei atherosklerotischen Läsionen bei Menschen gefunden werden (Marotti et al., id.). Eine intravenöse Infusion von monoklonalen anti-human CETP-Antikörpern (Mab) in Hamster und Kaninchen inhibierte die CETP-Aktivität in vivo und führte zu signifikant erhöhten Werten für die HDL-C-Spiegel, erniedrigten Spiegeln für HDL-Triglycerid und zu einer gesteigerten HDL-Größe; was wiederum eine kritische Rolle von CETP bei der Verteilung von Cholesterin bei den zirkulierenden Lipoproteinen impliziert (Gaynor, B.J., et al., Atherosclerosis, 110:101-109 (1994) (Hamster); Whitlock, M.E., et al., J. Clin. Invest., 84:129-137 (1989) Kaninchen)).
Ein CETP-Mangel wurde auch bei Menschen untersucht. Beispielsweise wiesen, bei bestimmten Familienuntersuchungen in Japan, Geschwister, die bezüglich nicht-funktioneller Allele des CETP-Gens homozygot waren, keine nachweisbare CETP-Aktivität auf. Diese Personen zeigten im Wesentlichen keinerlei atherosklerotische Plaques, und sie zeigten auch einen Trend zur Langlebigkeit in ihren Familien (vgl. z.B. Brown, M.L., et al., Nature, 342:448-451 (1989); Inazu, A., et al., N. Engl. J. Med., 323:1234-1238 (1990); Bisgaier, C.L., et al., J. Lipid Res., 32:21-23 (1991)). Für derartige homozygote Personen mit CETP-Mangel wurde ferner gezeigt, dass sie ein anti-atherogenes Lipoproteinprofil aufweisen, und zwar belegt durch erhöhte Spiegel an zirkulieren HDL, die reich an Cholesterylester waren, sowie insgesamt erhöhten Spiegeln an HDL, sowie außergewöhnlich großes HDL, d.h. bis zum Vier- bis Sechsfachen der Größe von normalem HDL (Brown, M.L., et al., 1989, Seite 451). Die Häufigkeit dieser Mutation ist in Japan relativ hoch, und sie kann für einen erhöhten Anteil an HDL in einem signifikanten Bruchteil der japanischen Bevölkerung verantwortlich sein.
Die obigen Untersuchungen zeigen, dass CETP eine wesentliche Rolle bei der Übertragung von Cholesterylester von HDL auf VLDL und LDL spielt, und dadurch das relative Profil von zirkulierenden Lipoproteinen in Richtung eines solchen verändert, das mit einem erhöhten Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung assoziiert ist (z.B. verminderten Spiegeln an HDL-C und erhöhten Spiegeln an VLDL-C und LDL-C). Marotti et al. (oben) interpretierten ihre Daten als Hinweis darauf, dass eine CETP-induzierte Veränderung der Cholesterinverteilung der Hauptgrund dafür war, dass sich arterielle Läsionen rascher in transgenen, CETP-exprimierenden Mäusen entwickelten als in nicht-transgenen Kontrollmäusen, wenn an beide Gruppen eine atherogene Diät verfüttert wurde. Zusammengenommen deuten die derzeitigen Beweise darauf hin, dass eine erhöhte CETP-Aktivität für ein erhöhtes Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung voraussagekräftig ist. Eine Modulierung oder Inhibierung der endogenen CETP-Aktivität stellt daher ein attraktives therapeutisches Verfahren zur Modulierung der relativen Spiegel von Lipoproteinen dar, um den Fortschritt von kartiovaskulären Erkrankungen, wie beispielsweise Atherosklerose, zu vermindern oder zu verhindern oder eine Regression einzuleiten.
Es wäre daher vorteilhaft, Verbindungen und Verfahren zur Kontrolle der CETP-Aktivität zu entdecken, die für die Prävention oder Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung hilfreich sein könnten. Um ein wirksames pharmakologisches Therapeutikum zu sein, sollte eine Verbindung bei ihrer Verabreichung an eine signifikante überwiegende Menge von Empfängern idealerweise keine Immunreaktion auslösen, die die vorteilhafte Aktivität oder die Wirkung der therapeutischen Verbindung neutralisiert, dürfte sie keinen Hyperempfindlichkeitszustand bei der Person auslösen, die die therapeutische Verbindung erhält, und dürfte sie keine unzweckmäßige Nebenwirkungen auslösen. Es wäre auch vorteilhaft, wenn derartige Verbindungen und Verfahren die Notwendigkeit kontinuierlich und häufig wiederholter Behandlungen vermeiden könnten.
Kurzdarstellung der Erfindung
Diese Erfindung stellt Verbindungen und Verfahren bereit, die für die Modulation oder Inhibierung der Aktivität des Cholesterinester-Transferprotein (CETP) nützlich sind. Insbesondere werden Impfstoff-Peptide beschrieben, die, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden, eine Antikörperreaktion gegen das eigene endogene CETP des Säugetiers auslösen, wodurch sie einen prophylaktischen oder therapeutischen Effekt gegen eine Kardiovaskulärerkrankung, wie beispielsweise Atherosklerose, fördern. Derartige Impfstoff-Peptide umfassen einen Helfer-T-Zell-Epitop-Teil, der ein immunogenes "universelles" oder "Breitband"-T-Helferzell-Epitop umfasst, der, vorzugsweise kovalent, mit einem B-Zell-Epitop-Teil verknüpft ist, der eines oder mehrere B-Zell-Epitope von CETP aufweist, wie sie im carboxyterminalen Teil des humanen CETP gefunden werden, der an der Neutrallipid-Bindung oder -Transferaktivität von CETP beteiligt ist. Es können auch andere B-Zell-Epitope von CETP verwendet werden. Vorzugsweise induzieren die B-Zell-Epitope von CETP, die im B-Zell-Epitop-Teil der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Antikörper gegen endogenes CETP (autoreaktive Antikörper), die entweder die CETP-Funktion blockieren oder zu einer Entfernung von zirkulierendem CETP aus dem Blut führen. Zusätzlich weisen die B-Zell-Epitope, die in den Impfstoff-Peptiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht gleichzeitig ein T-Zell-Epitop von CETP auf, so dass die Möglichkeit eines T-Zell-vermittelten Autoimmunitäts-Leberschadens vermieden wird.
Die Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung schließen verschiedene "multivalente" Ausführungsformen ein. Beispielsweise multivalente Peptide, die in dem Immunsystem vorhanden sind, mit mehr als einem einzigen universellen oder Breitband-Helfer-T-Zell- oder B-Zell-Epitop. Derartige multivalente Impfstoff-Peptide schließen diejenigen ein, die mehrfache (zwei oder mehr) Kopien gleicher oder unterschiedlicher immunogener universeller oder Breitband-Helfer-T-Zell-Epitope aufweisen und/oder Mehrfachkopien des gleichen oder unterschiedlichen B-Zell-Epitops aus dem CETP-Protein. Diejenigen Proteine, die mehr als ein einzigartiges B-Zell-Epitop aufweisen, an das unterschiedliche Antikörper binden können, können die Bildung von Immunkomplexen fördern, um in wirksamer Weise CETP aus dem Kreislaufsystem zu entfernen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform leitet sich der Helfer-T-Zell-Epitop-Teil eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung von einer Aminosäuresequenz eines immunogenen universellen (Breitband-) Helfer-B-Zell-Epitops ab, wie beispielsweise denjenigen, die in Tetanus- und Diphterie-Toxoiden gefunden werden, oder in antigenen Peptiden, die bekannt sind aus dem Pertussis-Impfstoff, dem Bazillus Calmett-Guerin (BCG), dem Polio-Impfstoff, dem Masern-Impfstoff, dem Mumps-Impfstoff, dem Rubella-Impfstoff, dem gereinigten Proteinderivat (PPD) von Tuberculin, Mycobacterium tuberculosis hsp-70, sowie Keyhole-Limpet-Hämocyanin. Darüber hinaus können verschiedene universelle (oder Breitband-) Helfer-T-Zell-Epitope miteinander verknüpft werden, um mehrfache (d.h. multivalente) universelle antigene Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitte der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung ist ein aminoterminaler Cysteinrest kovalent mit einer Aminosäuresequenz eines antigenen Breitband- oder universellen Helfer-T-Zell-Epitops von Tetanustoxoid verknüpft, das die Sequenz C Q Y I K A N S K F I G I T E (Aminosäuren 1 bis 15 von SEQ ID NO:2) bildet, die kovalent mit einem B-Zell-Epitop-Abschnitt eines Impfstoff-Peptids verknüpft ist, das die carboxyterminale CETP-Aminosäuresequenz F G F P E H L L V D F L Q S L S (Aminosäuren 16 bis 31 von SEQ ID NO:2) aufweist.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein multivalentes Impfstoff-Peptid eine Aminosäuresequenz eines antigenen Breitband- oder universellen Helfer-T-Zell-Epitops von Tetanus-Toxoid, das seinerseits kovalent mit einem B-Zell-Epitop-Abschnitt verknüpft ist, der aus zwei B-Zell-Epitopen von CETP besteht. Bei einer derartigen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung weist das multivalente Impfstoff-Peptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:8 auf : C Q Y I K A N S K F I G I T E L F P R P D Q Q H S V A Y T F E E D I F G F P E H L L V D F L Q S L S auf, in der ein aminoterminales Cystein mit einem T-Zell-Epitop aus Tetanus-Toxoid (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:8) verknüpft ist, das seinerseits mit einer Aminosäuresequenz, die zwei B-Zell Epitope von humanem CETP enthält, d.h. Aminosäuren 349 bis 367 und Aminosäuren 461 bis 476 der Aminosäuresequenz für reifes humanes CETP (SEQ ID NO:4). Bei einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält ein multivalentes Impfstoff-Peptid der vorliegenden Erfindung B-Zell-Epitope aus den homologen Regionen des Kaninchen-CETP (d.h., Aminosäuren 350 bis 368 und 481 bis 496 von SEQ ID NO:6) und hat die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:9: M Q Y I K A N S K F I G I T E R F P R P D G R E A V A Y R F E E D I F G F P K H L L V D F L Q S L S, bei der ein aminoterminales Methionin mit einem T-Zell-Epitop aus Tetanus-Toxoid verknüpft ist (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:8), das mit einer Aminosäuresequenz verknüpft ist, die die beiden B-Zell-Epitope aus Kaninchen-CETP enthält.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch mittels eines bifunktionellen Verknüpfermoleküls oder mittels eines Peptid-Verknüpfermoleküls mit einer minimalen oder keiner Immunogenität miteinander verknüpft sein. Zusätzlich können die Peptide mit einem üblichen Molekül verknüpft sein, um Peptidanordnungen zu bilden, in denen zahlreiche Kopien der Peptide in naher Nachbarschaft angeordnet sind. Derartige Mehrkopien-(multivalente) Peptidanordnungen können stärker immunogen sein, d.h. eine wirksamere Immunreaktion gegenüber endogenem CETP hervorrufen, als Impfstoffe, die nicht assoziierte individuelle Peptide umfassen.
Die Impfstoffverbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans verwendet werden.
Die immunogenen Impfstoff-Peptide dieser Erfindung lösen die Produktion von Antikörpern aus, die mit endogenem CETP reaktiv sind oder dieses erkennen. Die Verabreichung von Impfstoff-Peptiden an Testtiere führte zu einer Abnahme der relativen Spiegel von Gesamtcholesterin und HDL-C und führte zu einer Abnahme der Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen. Die erzeugten Antikörper gegen endogenes CETP fördern somit einen physiologischen Zustand, der mit einem verminderten Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung korreliert, und sie scheinen eine direkte Wirkung auf die Verhinderung oder Abnahme der Bildung von atherosklerotischen Plaques aufzuweisen Beschreibung der Zeichnungen
1. Fließbild des Protokolls für die Verabreichung eines Impfstoff-Peptids an (für die Impfung von) Kaninchen sowie die Abnahme von Blutproben zur Analyse der Impfstoffwirksamkeit. Ein Kontrollkaninchen erhielt kein Impfstoff-Peptid.
2. Optische Dichte (O.D.) bei 450 nm gegen die Plasmaverdünnung, basierend auf einem ELISA zur anti-CETP-Antikörper-Bindung an rekombinantes CETP in verdünnten Plasmaproben, die am Tag 70 von Kaninchen genommen wurden (rb#1-#4). Ein offenes Quadrat (Kaninchen rb#4) bezieht sich auf das Plasma eines Kaninchens, dem das Impfstoff-Peptid nicht verabreicht wurde (Kontrolle). Ein volles Quadrat, ein voller Kreis und eine volle Raute beziehen sich auf die Kaninchen rb#1, #2 bzw. #3, denen ein Impfstoff-Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 verabreicht wurde.
3. Die optische Dichte (O.D.) bei 450 nm gegen die Plasmaverdünnung für Blutplasmaproben aus Kaninchen (rb#1 – #4, vergleiche Beschreibung von 2, oben), basierend auf einem kompetitiven ELISA zur Inhibierung der Bindung eines monoklonalen Antikörpers (Mab) TP2 an rekombinantes humanes CETP durch einen anti-CETP-Antikörper in verdünnten Kaninchenblut-Plasmaproben, genommen am Tag 70.
4. Konzentration von Gesamtcholesterin (mg/dl) in Plasmaproben von Kaninchen (rb#1 – #4, vgl. Beschreibung von 2, oben) gegen die Zeit (Tage) im Impfprotokoll.
5. Konzentration von HDL-C (mg/dl) in Plasmaproben von Kaninchen (rb#1 – # 4, vgl. Beschreibung von 2, oben) gegen die Zeit (Tage) im Impfprotokoll.
6. Verhältnis Non-HDL/HDL in weißen New Zealand-Kaninchen am Tag 70. Kontrolle war ein nicht geimpftes Kaninchen (N=1) rb#4 (ausgefüllter Balken); Durchschnitt (N=3) von geimpften Kaninchen rb#1, 2 und 3 (schraffiert).
7. Optische Dichte (O.D.) bei 450 nm gegen die Plasmaverdünnung (halb-logarithmischer Graph), basierend auf einem ELISA für die anti-CETP-Antikörperbindung an rekombinantes CETP in verdünnten Plasmaproben, die von humanes CETP-exprimierenden transgenen Mäusen am Tag 70 des Impfprotokolls genommen wurden. Die Angaben für jede Maus, der ein Impfstoff-Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 verabreicht wurde, sind durch "+" und eine ausgefüllte Linie gezeigt. Angaben zu jeder Kontrollmaus werden angezeigt durch "x" und eine unterbrochene Linie. Die Plasmaverdünnungen überspannten einen Bereich von 1:10 bis 1:1.000.000 (1E+1 bis 1E+6).
8A und 8B. Typische Plots für die Hydrophilie, die Oberflächenwahrscheinlichkeit, den antigenen Index und die amphiphile Helix (8A) und Amphiphilie Sheets und die Sekundärstruktur (8B9 für reifes humanes CETP.
9. Titer von Antikörpern gegen rekombinantes humanes CETP aus den Gruppen I und II des Atherosklerose-Modells, basierend auf ELISA. O.D. bei 405 nm gegen die Verdünnung des Kaninchenplasmas.
10A und 10B. Titer von Kaninchen-Plasma-Antikörpern gegen Kaninchen-CETP im Atherosklerose-Modell auf der Basis von ELISA. Plasma vor der Impfung (10A). Plasma nach der Impfung (10B). OD bei 405 nm gegen die Verdünnung des Kaninchen-Plasmas.
11. Gesamtcholesterin in Tieren vor der Impfung und nach der Impfung im Atherosklerose-Modell. Gesamtcholesterin (mg/dl) gegen Tag und Gruppe.
12. HDL-C in Tieren vor der Impfung und nach der Impfung im Atherosklerose-Modell. HDL-C (mg/dl) gegen den Tag und die Gruppe.
13. Balkendarstellungen des mittleren prozentualen Anteils der Gesamtfläche der Aorta, die von atherosklerotischen Läsionen bedeckt ist, bei geimpften und Kontroll-Kaninchen auf Cholesterin ergänzter Diät. Individuelle Datenpunkte (Rauten), durchschnittlicher Prozentsatz der Aortafläche, die durch Läsionen bedeckt ist (schraffierter Balken), Standardabweichung von Datenpunkten (offener Balken), p<0,01 bedeutet eine statistische Signifikanz zwischen Balken-Graphen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben bemerkt wurde, wurde ein vermindertes Aterhoskleroserisiko mit relativ niedrigen zirkulierenden Spiegeln von LDL und VLDL korreliert sowie relativ hohen Spiegeln an HDL. Die Spiegel derartiger zirkulierender Lipoproteine werden direkt beeinflusst, wenigstens teilweise, durch die endogenen Spiegel der CETP-Aktivität. Insbesondere fördert eine hohe CETP-Aktivität die Übertragung von Neutrallipiden, wie beispielsweise Cholesterylestern, von HDL auf VLDL und LDL. Demgemäß ist CETP ein relativ präzises Target bei Menschen und anderen Tieren zur Veränderung der relativen Spiegel von LDL, VLDL und HDL im Kreislaufsystem (vgl. z.B. Tato, F., et al., Arteriosclero. Thromb. Vascular Biol., 15:112-120 (1995); Tall, A.R., J. Internal Med., 237:5-12 (1995)). Diese Erfindung zielt ab auf die Kontrolle der endogenen CETP-Aktivität dadurch, dass man CETP-Impfstoff-Peptide bereitstellt, die nützlich sind im Hinblick auf eine Förderung einer Immunreaktion in Personen gegen ihr endogenes CETP, wodurch ein physiologischer Zustand gefördert wird, z.B. erhöhte Spiegel an HDL und verminderte Spiegel LDL, der mit einem verminderten Risiko einer Atherosklerose korreliert. Zusätzlich kann die Förderung einer Immunreaktion gegen endogenes CETP unter Verwendung der erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptide die Progression von Läsionen in Gewebe, das gegenüber Atherosklerose empfindlich ist, erzeugen, verhindern oder inhibieren.
Peptide und Zusammensetzung zur Modulation der CETP-Aktivität
Bei der Verwendung hierin ist ein CETP-Impfstoff-Peptid ein Peptid, das einen Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt, der eine Aminosäuresequenz eines antigenen universellen (d.h. Breitband-) Helfer-T-Zell-Epitops aufweist, sowie einen B-Zell-Epitop-Abschnitt umfasst, der eine Aminosäuresequenz eines B-Zell-Epitops von CETP umfasst, wie beispielsweise den carboxyterminalen Abschnitt von CETP, der an der Neutrallipid-Bindung und/oder an der Neutral-lipid-Transferaktivität beteiligt ist. Derartige CETP-Impfstoff-Peptide sind antigen, d.h., sie lösen die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen das Peptid aus, die endogenes CETP binden. Somit sind die CETP-Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung immunogene Einheiten, die die Fähigkeiten aufweisen, die Bildung von Antikörpern zu stimulieren, die spezifisch endogenes CETP binden und die endogene CETP-Aktivität inhibieren.
A. Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide
Peptide, die in Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen einen Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt und einen B-Zell-Epitop-Abschnitt. Der Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt (oder einfach, "T-Zell-Epitop-Abschnitt") weist eine Aminosäuresequenz auf, die sich von wenigstens einem antigenen universellen (oder immunogenen iniversellen oder Breitband-)-Helfer-T-Zell-Epitop ableitet (das auch als immunogenes Trägerpeptid bezeichnet wird), das als Peptid definiert ist, oder dessen Derivat, das von zahlreichen Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Haplotypen präsentiert werden kann und dadurch Helfer-T-Zellen aktiviert, die ihrerseits das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen stimulieren. wie weiter unten diskutiert wird, weist der B-Zell-Epitop-Abschnitt (auch als CETP-bezogener Peptid-Abschnitt bezeichnet) der hierin beschriebenen Impfstoff-Peptide eine Aminosäuresequenz auf, die ein B-Zell-Epitop des CETP-Proteins umfasst, wie beispielsweise einen Abschnitt des carboxyterminalen Abschnitts des Enzyms CETP, der an der Neutrallipid-Bindung und/oder am Neutrallipid-Transfer beteiligt ist.
Beispiele dafür, was als antigenen "universelle" oder "Breitband-" Helfer-T-Zell-Epitope bezeichnet wird, die als immunogene Träger-Peptide für die menschliche Impfung verwendet wurden, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Sie schließen beispielsweise ein Epitope vom Tetanus-Toxoid (tt) und Diphterie-Toxoid (dt) (vgl. z.B. Panina-Bordignon, P., et al., Eur. J. Immunol., 19:2237-2242 (1989) (Charakterisierung von universellen Tetanus-Toxoid-Helfer-T-Zell-Epitop-Peptiden); Etlinger, H., Immunol. Today, 13:52-55 (1992); Valmori, D., et al., J. Immunol., 149:717-721 (1992) (Verwendung von universellen tt-Epitopen in anti-Malaria-Impfstoffkandidaten); Talwar, G.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536 (1994) (Verwendung von tt und dt als universelle Epitope in einem Impfstoff gegen humanes chorionales Gonadotropin); Talwar, G.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536 (1994)). Zusätzlich zu tt und dt schließen andere Helfer-T-Zell-Epitop-Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, diejenigen ein, die sich von antigenen Peptiden ableiten, die bekannt sind aus dem Pertussis-Impfstoff, Bazillus Calmett-Guerin (BCG), dem Polio-Impfstoff, dem Masern-Impfstoff, dem Mumps-Impfstoff, dem Rubella-Impfstoff und dem gereinigten Proteinderivat (PPD) von Tuberculin (vgl. z.B. Etlinger, H., Immunol. Today, 13:52-55 (1992)); die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden). Darüber hinaus können zwei oder mehr Kopien der gleichen oder unterschiedlicher verschiedener antigener universeller Helfer-T-Zell-Epitope miteinander verknüpft werden, um multiple oder multivalente Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitte der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung zu bilden. Beispielsweise kann ein Impfstoff-Peptid der vorliegenden Erfindung synthetisiert werden, das einen multiplen oder multivalenten Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt enthält, der eine Aminosäuresequenz eines tt-Helfer-T-Zell-Epitops und eines dt-Helfer-T-Zell-Epitops umfasst.
Zusätzlich kann die Immunogenität eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung weiter dadurch verstärkt werden, dass man den Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt mit einer Peptid-Sequenz eines xenogenen CETP oder eines verwandten Proteinhomologen zu CETP verknüpft. Ein derartiger Ansatz wurde bereits bei einem Humanimpfstoff gegen humanes chorionales Gonadotropin angewandt (vgl. Talwar, G.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:8532-8536 (1994); Heterospezies-Dimeres, gebildet zwischen einer Aminosequenz aus der β-Untereinheit von humanem chorionalem Gonadotropin und einer Aminosäuresequenz einer α-Untereinheit von ovinem luteinisierendem Hormon). Beispiele für Proteine, die mit CETP verwandt sind, die gemäß diesem Ansatz verwendet werden können, schließen beispielsweise ein Phospholipid-Transferprotein und neutrophiles bakterizides Protein (vgl. Day, J.R., et al., J. Biol. Chem., 269:9388-91 (1994); Gray, P.W., et al., J. Biol. Chem. 264:9505-9509 (1989)).
Andere immunogene Trägermoleküle wie Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) können ebenfalls allein oder in Kombination mit anderen antigenen universellen Helfer-T-Zell-Epitopen verwendet werden. Beispielsweise enthält KLH multiple Lysinreste in seiner Aminosäuresequenz. Jedes dieser Lysine ist eine potentielle Stelle, an die ein Impfstoff-Peptid, wie es hierin beschrieben wird, angefügt werden könnte (beispielsweise Maleimid-aktiviertes KLH, Katalog-Nr. 77106, Pierce, Rockford, IL). Eine derartige Anordnung ist eine Impfstoff-Peptideinheit, die extensiv multivalent für die beiden Helfer-T-Zell-Epitope ist (d.h. die Helfer-T-Zell-Epitope der KLH-Aminosäure-Sequenz in Kombination mit den Helfer-T-Zell-Epitopen der Mehrfachkopien der angefügten Impfstoff-Peptide) sowie die B-Zell-Epitope von CETP (d.h. die B-Zell-Epitope von CETP in Mehrfachkopien der Impfstoff-Peptide, die an die KLH-Aminosäure-Sequenz angefügt sind).
In jüngerer Zeit wurde ein weiteres immunogenes Trägermolekül, hsp 70 aus Mycobacterium tuberculosis, gefunden, für das gezeigt wurde, dass es ein besonders wirksames Antigen darstellt, dass zahlreiche B- und T-Zell-Epitope enthält (Suzue und Young, J. Immunol., 156:873-879 (1996)). Das hsp 70-Protein kann mit Hilfe von Standardverknüpfungsmitteln mit den Impfstoff-Peptiden der vorliegenden Erfindung verknüpft werden, um die Immunogenität zu erhöhen. Alternativ können Nucleinsäure-Moleküle, die für Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren, in einen Expressionsvektor inseriert werden, der die Expression eines rekombinanten Proteins ermöglicht, das aus dem Impfstoff Peptid, fusioniert an den Aminoterminus von hsp70, besteht. Vorzugsweise umfasst der Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung ein universelles antigenes tt- oder dt-Helfer-T-Zell-Epitop. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform nutzen die Peptide der vorliegenden Anmeldung antigene tt-Helfer-T-Zell-Epitope mit den Aminosequenzen Q Y I K A N S K F I G I T E (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:2) und F N N F T V S F W L R V P K V S A S H L E (SEQ ID NO:3).
Besonders bevorzugt nutzen die Peptide der vorliegenden Erfindung das universelle antigene tt-Helfer-T-Zell-Epitop mit der Aminosäuresequenz Q Y I K A N S K F I G I T E (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:2).
Zusätzlich zu den verschiedenen Beispielen für Helfer-T-Zell-Epitope, die oben diskutiert wurden, kann festgestellt werden, ob ein anderes Peptid oder Protein als ein Helfer-T-Zell-Epitop für den T-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung nützlich ist, indem man einen Standardprofilerationsassay für Klasse II (Helfer-)T-Zell-Epitope verwendet (vgl. beispielsweise Seiten 3.12.9-3.12.14, In Current Protocols in Immunology, Vol. 1 (Coligan et al., eds.) (John Wiley & Sons, Inc., New York, New York, 1994)).
B. B-Zell-Epitop (CETP-bezogener) Abschnitt von Impfstoff-Peptiden
Der B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide, die hierin beschrieben werden, umfasst eines oder mehrere B-Zell-Epitope des CETP-Proteins, das für das geimpfte Säugetier endogen ist, oder eines oder mehrere B-Zell-Epitope eines CETP, das sich von dem endogenen CETP unterscheidet, das jedoch mit dem endogenen CETP immunologisch (antikörpermäßig) kreuzreagiert.
Der B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegende Erfindung kann ein oder mehrere B-Zell-Epitope des endogenen CETP der zu impfenden Person aufweisen, um Antikörper zu erzeugen, die die endogene CETP-Aktivität inhibieren. Es liegt jedoch ebenfalls im Bereich dieser Erfindung, dass der B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung B-Zell-Epitope von CETP-Molekülen aufweist, die dem endogenen CETP der zu impfenden Person ähnlich sind, die jedoch nicht identisch sind. Bestimmte B-Zell-Epitope von derartigen ähnlichen, jedoch nicht identischen CETP-Proteinen können Epitope enthalten, die die Immunreaktion in der geimpften Person verstärken. Im Allgemeinen können CETP-Moleküle, die Aminosequenzen aufweisen, die wenigstens zu etwa 80 Prozent homolog zu dem endogenen CETP sind, als eine Quelle für B-Zell-Epitope im B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als ein Beispiel weisen die Kaninchen und Menschen CETP-Proteine eine Aminosäuresequenzhomologie von 80 Prozent auf. Das reife Kaninchen. CETP weist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 auf, und das reife humane CETP aus der Leber weist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 auf. Demgemäß umfasst, in einem Beispiel für eine derartige Ausführungsform der erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptide, der B-Zell-Epitop-Abschnitt ein oder mehrere B-Zell-Epitope eines Kaninchen- und/oder Menschen-CETP, wobei ein derartiges Impfstoff-Peptid entweder bei Kaninchen oder bei Menschen dazu verwendet werden kann, die endogene CETP-Aktivität zu inhibieren.
Zusätzlich umfasst der B-Zell-Epitop-Abschnitt der erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptide einen Abschnitt der Aminosäuresequenz des reifen CETP-Proteins (SEQ ID NO:4), der aus einer Länge von wenigstens 6 Aminosäuresequenzen aufweist und der nicht nennenswert, wenn überhaupt, in vitro eine T-Zell-Proliferation stimuliert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung multivalente B-Zell-Epitop-Abschnitte von Impfstoff-Peptiden der vorliegenden Erfindung auf, die zwei oder mehr unterschiedliche B-Zell-Epitope von CETP umfassen. Derartige multivalente Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitte sind besonders bevorzugt, da sie multiple Zielorte darstellen, die eine Bildung von Antikörpern auslösen, die an endogenes CETP binden können, wodurch eine umfangreichere Immunkomplexbildung und/oder die Wahrscheinlichkeit der Inhibierung der CETP-Cholesteryl-Transferaktivität gefördert wird.
Zusätzlich ist es bevorzugt, dass ein B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide kein B-Zell-Epitop umfassen sollte, das auch ein T-Zell-Epitop umfasst, das von endogenen MCH-Klasse I-Molekülen präsentiert werden kann. Derartige T-Zell-Epitope von CETP könnten im Kontext von MHC Klasse I an der Oberflächen von Hepatocyten präsentiert werden und eine cytotoxische T-Zell-Reaktion auslösen und dadurch Lebergewebe schädigen. Ob ein spezielles CETP-B-Zell-Epitop ein T-Zell-Epitop der Klasse I aufweist, kann unter Anwendung eines Standardassays für cytotoxische T-Zellen bestimmt werden (vgl. z.B. Seiten 3.11.4-3.11.7, In Current Protocols in Immunology, Vol. I (John Wiley & Sons, Inc., New York; New York, 1994)).
Gemäß einer anderen Ausführungsform weist der B-Zell-Epitop-Abschnitt der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung die carboxyterminalen 26 Aminosäuren von humanen CETP (vgl. SEQ ID NO:1) oder Fragmente davon auf, die eine Konformation oder Aktivität des carboxyterminalen 26 Aminosäureabschnitts von CETP beibehalten, z.B. Fragmente des CETP-Carboxy-Terminus, die eine Länge von wenigstens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweisen und die an einer spezifischen Neutrallipid-Bindung oder an einer spezifischen Neutrallipid-Transferaktivität von CETP beteiligt sind. Stärker bevorzugt weist der B-Zell-Epitop (oder CETP-bezogene) Abschnitt der Impfstoff-Peptide dieser Erfindung irgendein Fragment des carboxyterminalen Abschnitts von CETP auf, das eine Länge von wenigstens 11 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweist, der die Konformation des carboxyterminalen 26 Aminosäuren-Abschnitts von CETP beibehält, der an der Neutrallipid-Bindung und/oder -Transferaktivität von CETP beteiligt ist und der einer Antikörperbindung zugänglich ist (vgl. z.B. Wang, S., et al., J. Biol. Chem., 267:17487-17490 (1992); Wang, S., et al., J. Biol. Chem., 268:1955-1959 (1993)). Zusätzlich wurden verschiedene Mabs gegen diesen Abschnitt erzeugt, einschließlich des Mab TP2, die die Funktion von humanem CETP und auch Kaninchen CETP blockieren, was impliziert, dass dieses Epitop in humanen und Kaninchen-CETP-Proteinen konserviert ist (Whitlock et al., J. Clin. Invest., 84:129-137 (1989)). Das wird bestätigt durch die Tatsache, dass die carboxyterminalen 22 Aminosäuren von humanem und Kaninchen-CETP sich nur in einer Position unterscheiden, d.h. der Glutaminsäurerest in Position 465 in der Aminosäuresequenz des humanen CETP in SEQ ID NO:4 ist in der homologen Position (Position 485) in der Kaninchensequenz durch ein Lysin ersetzt (SEQ ID NO:6; vgl. auch Nagashima et al., J. Lipid Res., 29:1643-1649 (1988)).
Alternativ weist der B-Zell-Epitop-Abschnitt ein Derivat des carboxyterminalen 26 Aminosäureabschnitts von CETP auf, das Aminosäureveränderungen (Deletionen, Additionen oder Substitutionen) enthält, die die Neutrallipid-Bindung oder Transferaktivität von CETP nicht nennenswert verändern oder zerstören (vgl. Wang et al., id., (1992); Wang et al., id., (1993)). Derartige Veränderungen der Aminosäuresequenz eines endogenen Ziel-CETP schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, was im Allgemeinen als konservative Aminosäuresubstitutionen bekannt ist, wie beispielsweise die Substitution einer Aminosäure der CETP-Sequenz durch eine andere mit einer ähnlichen Struktur, Ladung oder Hydrophobie. Irgendeine Addition oder Substitution in der CETP-Sequenz, die die Neutrallipid-Bindung und/oder -Transferaktivität beibehält, jedoch die Stabilität in vivo oder in situ verbessert, die Reinigung verbessert oder Vernetzungsstellen bereitstellt (z.B. durch eine Cystein-Cystein-Disulfid-Bindungsbildung) ist ebenfalls nützlich bei der Konstruktion eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung.
Da der CETP-vermittelte Transfer von Neutrallipiden notwendigerweise eine Bindung des Neutrallipids (z.B. von Triglyceriden, Cholesterinester) erfordert, sind Abschnitte der Aminosäuresequenz des CETP, die an der Neutrallipid-Bindung beteiligt sind, ebenfalls von Nutzen, um die Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. Einige Abschnitte der Aminosäure-Sequenz von CETP, die zur Konstruktion der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können sowohl an der Neutrallipid-Bindung beteiligt sein, als auch an der tatsächlichen katalytischen Neutrallipid-Transferstelle von CETP. Jüngere Hinweise deuten darauf hin, dass CETP unterschiedliche Bindungsstellen für Cholesterylester und Triglyceride enthält (Melchior, G.W., et. al., J. Biol. Chem., 270:21068-21074 (1995)). Demgemäß kann die Einarbeitung der Aminosäuresequenz für eine spezifische Lipid-Bindungsstelle in ein Impfstoff-Peptid ein Mittel darstellen, CETP-Wechselwirkungen mit diesem spezifischen Lipid zu modulieren, wodurch ein anti-atherogenes Profil gefördert wird, obwohl die erzeugten Antikörper gegen CETP nicht zu einer Entfernung (Verminderung der Halbwärtszeit im Serum) von zirkulierendem CETP führen. Beispielsweise könnte zur Modulierung des Triglyceridgehalts von HDL auf spezifische Weise ein B-Zell-Epitop, das sich von dem Triglycerid-bindenden Abschnitt von CETP ableitet, in den B-Zell-Epitop-Abschnitt eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung eingebaut werden. Ähnlich könnte, zur Modulierung des Cholesterylestergehalts von HDL auf spezifische Weise, ein B-Zell-Epitop, das sich von dem Cholesterylester-bindenden Abschnitt von CETP ableitet, in die Konstruktion eines Impfstoff-Peptids der vorliegenden Erfindung eingebaut werden. Derartige Peptide sind daher so konstruiert, dass sie Antikörper bilden, die spezifische Lipid-bindende Stellen am CETP blockieren und auf diese Weise das spezifische Lipid beeinflussen, das zwischen HDL und CETP übertragen wird.
Ferner sind auch Aminosäuresequenzen von CETP von Nutzen, die eine Länge von wenigstens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweisen, die Mindestgröße für ein Epitop in einem Protein (vgl. z.B. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, Seite 836 (The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA, 1987)) und stärker bevorzugt eine Länge von wenigstens elf aufeinanderfolgenden Aminosäuren des carboxyterminalen 26 Aminosäureabschnitts von CETP aufweisen, für den irgendein natürlich auftretender Polymophismus des CETP-Gens kodiert.
CETP-Moleküle mit bekannter Aminosäuresequenz können im Hinblick auf die Lokalisierung von B-Zell-Epitopen unter Verwendung von Algorithmen analysiert werden, die potentielle antigene Motive in der Aminosäuresequenz identifizieren können. Indem man beispielsweise die Analysen von Plots für die Hydrophilie, die Oberflächenwahrscheinlichkeit, die amphiphile Helix, amphiphile Sheets und die Sekundärstruktur kombiniert (8A und 8B), kann ein antigener Index (vgl. 8A) für die Aminosäuresequenz des Gesamtproteins abgeleitet werden, was zur Identifikation von B-Zell-Epitopen führt, die in den Impfstoff-Peptiden der vorliegenden Erfindung potentiell nützlich sind.
Verfahren zum Testen von CETP-Molekülen auf Neutrallipid-Bindung oder ihren Effekt auf die Neutrallipid-Transferaktivität sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (vgl. z.B. Swenson, T.L., et al., J. Biol. Chem., 263:5150-5157 (1988) (Assay auf Lipidbindung); Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 262:2275-2282 (1987) (Assay auf Lipidtransfer), Bisgaier, C.L., et al., J. Lipid Res., 34:1625-1634 (1993) (Verwendung von fluoreszierenden Cholesterylester-Mikroemulsionen in einem Assay zur CETP-vermittelten Cholesteryl-Transferaktivität); Gaynor, B.J., et al., Atherosclerosis, 110:101-109 (1994) (Assay auf CETP-Lipid-Transfer); Wang et al. (1992) (Untersuchung von Deletionsmutanten von CETP auf Transferaktivität); Wang et al., (1993) (Untersuchung von einaminosäuren-mutanten Formen von CETP); hierin aufgenommen durch Bezugnahme). Assays auf die Transferaktivität von CETP sind auch kommerziell erhältlich (z.B. CETP functional Assay von Diagnescent Technologies, Yonkers, New York).
Vorzugsweise weist der B-Zell-Epitop-Abschnitt der CETP-Impfstoff-Peptide dieser Erfindung die Aminosäuresequenz L F P R P D Q Q H S V A Y T F E E D I (Aminosäuren 16 bis 34 von SEQ ID NO:8) und/oder die Amonosäuresequenz F G F P E H L L V D F L Q S L S (Aminosäuren 35 bis 50 von SEQ ID NO:8) auf.
C. Herstellung von Impfstoff-Peptid
Die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop (CETP-bezogenen) Abschnitte der CETP-Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung sind miteinander verknüpft, um immunogene Einheiten zu bilden. Die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte können kovalent verknüpft sein, direkt (z.B. über eine Peptid-Bindung) oder über ein vernetzendes Molekül. Wenn vernetzende Moleküle verwendet werden, müssen sie die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte des Impfstoff-Peptids miteinander verknüpfen, ohne die Peptide toxisch zu machen oder die Immunogenität der Impfstoff-Peptide nennenswert zu stören oder insgesamt zu vermindern. Geeignete vernetzende Moleküle schließen ein Aminosäuren, beispielsweise die Verwendung von einem oder mehreren Glycinresten, um eine "Glycinbrücke" zwischen den Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitten der Impfstoff-Peptide dieser Erfindung zu bilden. Auch die Bildung von Disulfid-Bindungen zwischen Cysteinresten, die an die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte angefügt wurden, oder die Verwendung von vernetzenden Molekülen wie Glutaraldehyd (Korn, A.H., et al., J. Mol. Biol., 65:525-529 (1972)) und EDC (Pierce, Rockford, IL) oder von anderen bifunktionellen Vernetzer-Molekülen zur Verknüpfung eines Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitts mit einem B-Zell-Epitop-Abschnitt wird in Betracht gezogen. Bifunktionelle Vernetzermoleküle weisen zwei unterschiedliche reaktive Stellen auf; eine der reaktiven Stellen kann mit einer funktionellen Gruppe an dem Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt reagieren, um eine kovalente Bindung zu bilden, und die andere reaktive Stelle kann mit einer funktionellen Gruppe an einem B-Zell-Epitop-Abschnitt reagieren, um eine weitere kovalente Bindung auszubilden, wodurch die beiden Abschnitte miteinander verbunden werden. Allgemeine Verfahren zum Vernetzen von Molekülen werden im Review von Means and Feeney behandelt (Bioconjugate Chem., 1:2-12 (1990)).
Homobifunktionelle Vernetzer-Moleküle weisen zwei reaktive Stellen auf, die chemisch identisch sind. Beispiele für homobifunktionelle Vernetzermoleküle schließen ein Glutaraldehyd, N,N'-Bis(3-maleimidopropionyl)-2-hydroxy-1,3-propandiol (einen Sulfhydryl-spezifischen homobifunktionellen Vernetzer); bestimmte N-Succinimidester, wie beispielsweise Disuccinimidylsuberat und Dithio-bis-(succinimidylpropionat) und deren lösliche Bisulfonsäuren und Salze (z.B. wie sie erhältlich sind von Pierce Chemicals, Rockford, Illinois; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Bei dieser Ausführungsform sollten die relativen Konzentrationen an Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitten so eingestellt werden, dass die Zahl von Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-EpitopAbschnitten, die miteinander verknüpft werden, maximal wird, und eine Verknüpfung von identischen Epitop-Abschnitten miteinander minimal gehalten wird (um beispielsweise eine Homodimerbildung Helfer-T-Zell/Epitop-Helfer-T-Zell-Epitop oder B-Zell-Epitop/B-Zell-Epitop zu vermeiden).
Vorzugsweise ist das bifunktionelle Vernetzermolekül ein heterobifunktionelles Vernetzermolekül, was bedeutet, dass das Vernetzermolekül wenigstens zwei reaktive Stellen aufweist, die getrennt voneinander kovalent an ein T-Zell-Epitop und ein B-Zell-Epitop angefügt werden können. Die Verwendung derartiger heterobifunktioneller Verknüpfermoleküle gestattet eine chemisch separate und stufenweise Anfügung (vektorielle Konjugation) einer jeden der reaktiven Stellen des Vernetzermoleküls an die Helfer-T-Zell- und B-Zell-Epitop-Abschnitte des Impfstoff-Peptids. Heterobifunktionelle Vernetzermoleküle, die verwendet werden können, um Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte miteinander zu verknüpfen, schließen ein m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester (Siehe Green, N., et al., Cell, 28:477-487 (1982); Palker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2479-2483 (1987)); m-Maleimido-benzoylsulfosuccinimidester; n-Maleimidobuttersäure-N-hydroxysuccinimidester; und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (vgl. Carlsson, J., et al., Biochem. J., 173:723-737 (1978); Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri).
Außerdem können die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop- Abschnitte mit einem gemeinsamen Trägermolekül verknüpft werden, wie beispielsweise mit Serumalbumin oder einem Harz- oder Polymerkügelchen. Die Verknüpfung von Helfer-T-Zell- und B-Zell-Epitop-Abschnitten mit einem gemeinsamen Träger kann dadurch erreicht werden, dass man ein Vernetzermolekül wie Glutaraldehyd oder ein anderes bifunktionelles Vernetzermolekül (siehe oben) verwendet. Bei dieser Ausführungsform sollten die relativen Konzentrationen von Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitten, B-Zell-Epitop-Abschnitt und des gemeinsamen Trägermoleküls so eingestellt werden, dass die Zahl an Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitten, die mit dem gemeinsamen Träger verknüpft werden, maximal wird, und eine Verknüpfung von identischen Molekülen miteinander (d.h. eine Homodimerbildung) und die Verknüpfung von Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitten miteinander (d.h. Heterodimerbildung) minimal wird. Die Verknüpfung der Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte mit einem weiteren Molekül oder einer Oberfläche (z.B. der Oberfläche eines Harz- oder Polymerkügelchens) sollte die immunogenen Eigenschaften des antigenen universellen Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitts oder der B-Zell-Epitop (CEPT-bezogenen) Abschnitt-Sequenzen nicht signifikant zerstören oder vermindern. Die Nettowirkung der Verwendung derartiger bifunktioneller Vernetzermoleküle ist, dass zahlreiche Kopien von Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitten eines Impfstoff-Peptids an einen gemeinsamen Träger gebunden werden, was eine Immunreaktion verstärken kann und auch die Herstellung von Antikörpern, die an endogenes CETP binden.
Es wurde ferner gezeigt, dass multiple antigene Peptidanordnungen (MAP) hochwirksame Antigene und Immunogene sind (vgl. z.B. Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413 (1988); Wang, C.Y., et al., Science, 254:285-288 (1991); Marguerite, M., et al., Mol. Immunol., 29:793-800 (1992)). Eine derartige MAP-Technologie, gemäß der die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte der hierin beschriebenen Impfstoff-Peptide an ein gemeinsames Kernmolekül angefügt sind, stellt einen weiteren Weg dar, um multivalente Peptidanordnungen herzustellen, die Antikörper gegen endogenes CETP erzeugen können.
Vorzugsweise sind die Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop-Abschnitte der Impfstoff-Peptide dieser Erfindung kovalent Ende-an-Ende verknüpft, um ein kontinuierliches Peptid zu bilden. Am stärksten bevorzugt bildet ein ausgewählter antigener univer seller Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt den aminoterminalen Abschnitt des Impfstoff-Peptids, wobei dessen carboxyterminaler Aminosäurerest kovalent über eine Peptidbindung mit der aminoterminalen Aminosäure einer ausgewählten CETP-bezogenen Aminosäuresequenz (B-Zell-Epitop-Abschnitt) des Impfstoff-Peptids verknüpft ist. Die umgekehrte Anordnung kann jedoch auch angewandt werden, d.h. die CETP-bezogene Aminosäuresequenz (B-Zell-Epitop-Abschnitt) der Impfstoff-Peptide dieser Erfindung kann so angeordnet sein, dass der aminoterminale Abschnitt eines Impfstoff-Peptids gebildet wird, und ein antigenes universelles Helfer-T-Zell-Epitop oder eine immunogene Träger-Aminosäure-Sequenz kann den carboxyterminalen Abschnitt des Impfstoff-Peptids umfassen.
Die Impfstoff-Peptide dieser Erfindung können dadurch stärker immunogen gemacht werden, dass man sie an multiple Kopien des C3d (Dempsey et al., Science, 271:348-350 (1996)) bindet. Alternativ können die Impfstoff-Peptide mit Kohlenhydratstrukturen derivatisiert werden, die komplementaktivierend sind und kovalent mit C3d verknüpft werden (Fearon et al. Science, 272:50-54 (1996)). Beispielsweise können Proteine, die in bestimmten mutierten Wirtszellen aus dem Ovarium des chinesischen Hamsters exprimiert werden, mit spezifischen Kohlenhydratstrukturen glycosyliert werden (Stanley, Mol. Cell. Biol., 9:377-383 (1989)). Hinweise aus jüngerer Zeit zeigen, dass C3d die Erkennung von Antigenen durch das betreffende Immunsystem fördert, was zu einer heftigen Immunreaktion führt (Dempsey et al., 1996).
Die Peptide der vorliegenden Erfindungen können nach irgendeinem zur Verfügung stehenden Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden, um Peptide mit einer definierten Aminosäuresequenz herzustellen. Beispielsweise ist eine automatisierte Peptidsynthese für den Fachmann unter Verwendung von automatisierten Peptid-Synthesevorrichtungen verfügbar (z.B. Synergy^TMPeptide Synthesizer von Applied Biosystems; AMS 422 von Abimed, Langenfeld, Deutschland). Eine Synthese derartiger Peptide auf Bestellung wird auch als kommerzielle Dienstleistung von vielen kommerziellen, Peptid synthetisierenden Dienstleistungsunternehmen durchgeführt, z.B. Quality Controlled Biochemicals, Inc., (Hopkinton, Massachusetts); Chiron Mimotopes Peptide Systems (San Diego, California); Bachem Bioscience, Inc. (Philadelphia, Pennsylvania); Severn Biotech Ltd. (Kiddeminster, England).
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Peptide hergestellt werden unter Anwendung einer synthetischen und rekombinan ten Nucleinsäuretechnologie. Beispielsweise kann ein Durchschnittsfachmann anhand des bekannten genetischen Codes eine 5'- zu 3'-Nucleinsäuresequenz konstruieren, die für ein Peptid dieser Erfindung kodiert. Die Aminosäure-Sequenz für ein reifes CETP aus einer menschlichen Leber ist bekannt (SEQ ID NO:4), wie auch ihre entsprechende DNA-Sequenz (SEQ ID NO:5) (vgl. Drayna et al., Nature, 327:632-634 (1987)). Darüber hinaus sind die Aminosäuresequenzen für eine Vielzahl von Breitband- oder "universellen" T-Zell-Epitopen bekannt (vgl. beispielsweise Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19:2232-2242 (1989), Etlinger et al. (1990), Pillai et al., Infect. Immun., 63:1535-1540 (1995)).
Ein DNA-Molekül, das die kodierenden Sequenzen eines Helfer-T-Zell-Epitops und eines oder mehrerer ausgewählter B-Zell-Epitop-Abschnitte enthält (sowie irgendeines Verknüpfungs-Peptids, wie beispielsweise Polyglycin, oder anderer zusätzlicher Reste wie für ein amino- und/oder carboxyterminales Cystein, wenn gewünscht), kann leicht synthetisiert werden, wobei man entweder eine automatisierte DNA-Synthesevorrichtung (z.B. Olio 1000 DNA Synthesizer, Beckman Corp.) verwendet oder einen Auftrag an einen kommerziell DNA-synthetisierenden Dienstleister vergibt (z.B. Genset Corp., La Jolla, Kalifornien). Das synthetisierte DNA-Molekül kann dann in irgendeines von einer Vielzahl von zur Verfügung stehenden Genexpressionssystemen inseriert werden (z.B. bakterielle Plasmide; Bakteriophagen-Expressionsvektoren, retrovirale Expressionsvektoren, baculovirale Expressionsvektoren), wobei man Standardverfahren einsetzt, die dem Fachmann zur Verfügung stehen (z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3 (Cold Spring Harbor Labroatory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)) und/oder wie sie vom Hersteller eines speziellen kommerziell erhältlichen Genexpressionssystems angegeben werden (z.B. pPROEX^TM-1 Bakterienzellen-Expressionssystem, SFV-Eukaryontenzell-Expressionssystem; BAC-TO-BAC^TM Baculovirus-Expressionssystem, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland). Das exprimierte Peptid wird dann aus dem Expressionssystem isoliert, wobei man Standardverfahren zur Reinigung von Peptiden anwendet. Die Reinigung der Peptide dieser Erfindung kann beschleunigt werden, indem man eine Affinitätschromatographie oder eine Immunopräzipitation anwendet, auf der Basis einer Verwendung von Antikörpern gegen die spezielle Helfer-T-Zell-Epitop- oder B-Zell-Epitop- (CETP-bezogener Abschnitt) Aminosäuresequenz eines Impfstoff-Peptids dieser Erfindung. Beispielsweise bindet der Mab TP2 an die carboxyterminalen 26 Aminosäuren von humanem CETP und kann auf diese Weise in einem oder mehrere Immunoaffinitätsschritten eines Reinigungsschemas nützlich sein (Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 263:5020-5023 (1988)).
Wenn natürlich DNA-Moleküle zur Verfügung stehen, die für jedes der T-Zell- und B-Zell-Epitope für ein spezielles Impfstoff-Peptid kodieren, können Standardverfahrensweisen für rekombinante Nucleinsäuren, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden, um rekombinante Nucleinsäure-Moleküle herzustellen, die für die Peptide kodieren. Derartige rekombinante Nucleinsäure-Moleküle können in irgendeinen aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren inseriert werden, mit denen geeignete Wirtszellen transfiziert oder transformiert werden können, so dass sie das Impfstoff-Peptid in Kultur exprimieren (vgl. z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vols. 1-3 (Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, New York, 1989)). Beispielsweise weist die DNA-Sequenz, die für das reife menschliche CETP aus der Leber kodiert, die Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO:5 auf, und die DNA-Sequenz, die für das reife Kaninchen-CETP kodiert, weist die Nucleotid Sequenz SEQ ID NO:7 auf. Spezielle Sequenzen, die für verschiedene B-Zell-Epitope eines jeden dieser CETP-Proteine kodieren, können mit Nucleotid-Sequenzen rekombiniert werden, die für ausgewählte T-Zell-Epitope kodieren, und in einen Expressionsvektor zur Expression in einer geeigneten Wirtszelle inseriert werden.
Ein Beispiel für ein rekombinantes Plasmid, das zur Herstellung eines Impfstoff-Peptids verwendet werden kann, ist das Plasmid pCMV-CETP/TT, in dem der CMV-Promotor die Transkription einer Sequenz festlegt, die für ein Impfstoff-Peptid kodiert, die die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:9 aufweist: M Q Y I K A N S K F I G I T E R F P R P D G R E A V A Y R F E E D I F G F P K H L L V D F L Q S L S, wobei ein aminoterminales Methionin an ein Tetanustoxoid-T-Zell-Epitop (Aminosäure 2 bis 15 von SEQ ID NO:2) und zwei B-Zell-Epitope aus Kaninchen-CETP (Aminosäuren 350 bis 368 und 481 bis 496 von SEQ ID NO:6) angefügt ist. Das Plasmid pCMV-CETP/TT wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) hinterlegt und hat die Zugangs-Nummer 98038 erhalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßes Peptid auch einen aminoterminalen Cysteinrest, oder einen anderen Rest, der kovalent mit der aminoterminalen Aminosäure des Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitts des erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptids verknüpft ist, um das Peptid mit sich selbst zu koppeln oder zu verknüpfen, um Dimere von Impfstoff-Peptiden zu bilden, oder an andere Moleküle, wie beispielsweise Träger- oder Vernetzungsmoleküle. Stärker bevorzugt weist das Impfstoff-Peptid dieser Erfindung die Aminosäuresequenz auf C Q Y I K A N S K F I G I T E F G F P E H L L V D F L Q S L S (SEQ ID NO:2). Noch stärker bevorzugt ist es, dass ein Impfstoff-Peptid der vorliegenden Erfindung wenigstens zwei B-Zell-Epitope von CETP aufweist. Ein Beispiel für ein derartiges Impfstoff-Peptid weist die Sequenz auf C Q Y I K A N S K F I G I T E L F P R P D Q Q H S V A Y T F E E D I F G F P E H L L V D F L Q S L S (SEQ ID NO:8).
D. Herstellung eines Impfstoffs
Die Peptide dieser Erfindung werden dazu verwendet, Impfstoffe herzustellen, die die Produktion von endogenen Antikörpern auslösen, die spezifisch an CETP binden und die endogene CETP-Aktivität modulieren (d.h. vermindern oder inhibieren). Die anti-CETP-Impfstoffe dieser Erfindung können eines oder mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Peptide enthalten. Beispielsweise können Peptide mit unterschiedlichen Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitten (z.B. unterschiedlichen universellen Helfer-T-Zell-Epitopen) und/oder unterschiedlichen B-Zell-Epitop-Abschnitten (z.B. unterschiedlichen CETP-bezogenen Portionen aus den carboxyterminalen 26 Aminosäuren von CETP) kombiniert werden und als eine einzige Impfstoffzusammensetzung verabreicht werden.
Pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien, wie beispielsweise Alum, können mit den hierin beschriebenen Impfstoff-Peptiden vermischt werden, um erfindungsgemäße Impfstoffe herzustellen. Alum ist das einzige Adjuvans, das gegenwärtig für eine Verwendung in Impfstoff für Menschen zugelassen ist (vgl. Eldrige, J.H., et al., In Immunobiolgy of Proteins and Peptides V; Vaccines; Mechanismus Design, and Applications, Atassi, M.Z., ed. (Plenum Press, New York, 1989) Seite 192). In jüngerer Zeit wurde Alum in Kombination mit einem Natriumphthalylderivat von Lipopolysaccharid verwendet, um einen Impfstoff an Menschen zu verabreichen, für den gezeigt wurde, dass er gegen humanes chorionales Gonadotropin wirksam ist (vgl. Tawar, G.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536 (1994)).
Es können auch weitere herkömmliche Adjuvantien verwendet werden, soweit sie für eine spezielle Verwendung zugelassen sind.
Beispielsweise wurden biologisch abbaubare Mikrokügelchen aus Poly(DL-lactid-co-glycolid) als Adjuvantien für eine orale oder parenterale Verabreichung von Impfstoff untersucht (Eldridge, J.H., et al., In Immunobiology of Proteins and Peptides V: Vaccines; Mechanismus, Design, and Applications, Atassi, M.Z., ed. (Plenum Press, New York, 1989), Seiten 191-202).
Andere Adjuvantien wurden zur Verabreichung von Impfstoffen an nicht-humanen Säugetiere verwendet. Beispielsweise sind Freund's Complete Adjuvant (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), Freund's Incomplete Adjuvant (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) und das RIBI^TM Adjuvantien System (RAS; RIBI ImmunoChem Research, Incl., Hamiliton, Montana) gut bekannte Adjuvantien, die routinemäßig für die Verabreichung von Antigenen an nicht-menschliche Tiere verwendet werden. Zusätzlich können Adjuvantienstrukturen mit Peptiden der vorliegenden Erfindung ' vermischt oder vorzugsweise kovalent in diese Peptide eingearbeitet werden, beispielsweise an amino- oder carboxyterminale Aminosäurereste der Peptide angefügt werden. Derartige inkorporierte Adjuvantien schließen ein lipophiles N-Palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-propyl)]-Cystein ("Pam₃-Cys-OH") am Aminoterminus der erfindungsgemäßen Peptide, amphiphile, wasserlösliche Lipopeptide wie Pam₃-Cys-Ser-Lys₄ und Pam₃-Cys-Ser-Glu₄; Glycopeptide, wie beispielsweise N-Acetyl-glucosaminyl-N-acetylmuramyl-alanyl-D-isoglutamin ("GMDP"), Muramyldipeptide, und Alanyl-N-adamantyl-D-glutamin; sowie Adjuvantien auf Polyamidgelbasis, die leicht während ihrer chemischen in vitro-Synthese an Peptide angefügt werden können (vgl. Synthetic Vaccines, Nicholson, B.H., ed. (Blackwell Scientific Publications, Cambridge, Massachusetts, 1994), Seiten 236-238).
Außerdem können die Impfstoff-Peptide dieser Erfindung mit anderen Molekülen verknüpft werden, die die Immunogenität der Peptide verstärken können. Beispielsweise kann die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Peptide mit der Oberfläche eines größeren Moleküls, beispielsweise Serumalbumin, die Immunogenität verstärken, da die Epitope der Impfstoff-Peptide dem Immunsystem einer Person als benachbarte multiple wiederholte Kopien präsentiert werden (vgl. z.B. Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413 (1988): Wang, C.Y., et al, Science, 254:285-288 (1991); Marguerite, M., et al., Mol. Immunol., 29:793-800 (1992)). Derartige "mutiple" oder "multivalente" Anordnungen der erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptide können unter Verwendung von Vernetzermo lekülen erzeugt werden (siehe oben). Beispielsweise, wie oben bemerkt wurde, weisen bifunktionelle Vernetzermoleküle zwei reaktive Stellen auf, wobei eine dieser Stellen eine Verbindung des Verknüpfers mit einem Impfstoff-Peptid der Erfindung herstellen kann, und die andere Stelle zur Verfügung steht für eine Reaktion mit einem unterschiedlichen Molekül, z.B. einem größeren Protein, wie Serumalbumin oder einem Harz- oder Polymerkügelchen. Somit können kovalente Vernetzermoleküle dazu verwendet werden, Impfstoff-Peptide mit anderen Proteinen oder Substraten zu verknüpfen, um Mehrkopien-Anordnungen von Peptiden zu bilden (Multikopien-Peptidanordnungen).
Die Verknüpfung von Impfstoff-Peptiden der vorliegenden Erfindung mit einem anderen Molekül oder einer Oberfläche sollte so durchgeführt werden, dass die immunogenen Eigenschaften der verknüpften Helfer-T-Zell-Epitop- und B-Zell-Epitop (CETP-bezogenen) Abschnitte der Impfstoff-Peptide nicht nennenswert zerstört oder vermindert werden. Vorzugsweise verstärkt die Verwendung derartiger Verknüpfermoleküle die Immunogenität der Impfstoff-Peptide der vorliegenden Erfindung, wie sich beispielweise anhand eines schnelleren Anstiegs der anti-CETP-Antikörpertiter zeigt und/oder anhand der Produktion von höheraffininen anti-CETP-Antikörpern als in einem Falle, wenn an Personen Impfstoff-Peptide verabreicht werden, die nicht verknüpft sind. Derartige Vernetzermoleküle können auch dazu verwendet werden, ein erfindungsgemäßes Peptid mit einem "immunogenen Verstärker"-Molekül zu verknüpfen, wie beispielsweise dem Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), für den gezeigt wurde, dass er als ein wirksamer immunogener Verstärker bei der Auslösung der Produktion von spezifischen Antitumor-Antikörpern dienen kann (z. B. Tao, M.H., et al., Nature, 362:755-758 (1993)). Ein weiterer derartiger immunogener Verstärker ist Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) (vgl. Ada, G.L., In Fundamental Immunology, third edition, W.E. Paul, ed. (Raven Press Ltd., New York, 1993), Seiten 1309-1352) Wie oben bemerkt wurde, ist ein Beispiel für eine multivalente Anordnung unter Verwendung von KLH die Anfügung von Impfstoff-Peptiden an irgendeinen von verschieden Cysteinresten des KLH-Moleküls über eine Disulfid-Bindungsbildung.
2. Verwendung von Impfstoff-Peptiden
Allgemeine Verfahren zur Verabreichung und Testung von Impfstoffen sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. z.B. Talwar, G.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536 (1994)). Die erfindungsgemäßen Peptiden sind speziell so konstruiert, dass sie entweder allein oder in Assoziation mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Adjuvantien als ein Impfstoff verabreicht werden können, der eine Antikörperreaktion gegen endogenes CETP des Impfstoffempfängers auslöst. Bei einigen Ausführungsformen dieser Erfindung können die Impfstoff-Peptide auch mit Impfstoffen für andere Erkrankungen oder Störungen kombiniert und verabreicht werden.
Die Immunreaktion gegen endogenes CETP sollte die CETP-Aktivität signifikant inhibieren, die Serums-Halbwertszeit von CETP verändern, eine Entfernung von CETP über die Bildung von Immunkomplexen bewirken, den Transport von HDL-Cholesterin verändern, das Gleichgewicht des Cholesteringehalts von Liproproteinen verschieben, den Cholesterinkatabolismus verändern und/oder die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen vermindern. Die Steuerung von LDL, VLDL und/oder HDL-Spiegeln ist ein akzeptierter Indikator oder Endpunkt bei der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung, da diese Spiegel mit einem verminderten Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung oder einem weiteren Fortschritt einer solchen Erkrankung korrelieren (Mader, S.S., In Human Biology, 4th ed., Seiten 83, 102 (Wm. C. Brown Publishers, Dubuque, Iowa, 1995)). Demgemäß zeigt sich der erwünschte prophylaktische und therapeutische Effekt gemäß der vorliegenden Erfindung an der Auslösung der Erzeugung von Antikörpern bei einer Person, die an CETP binden und/oder die CETP-Aktivität inhibieren, oder anhand einer relativen Verminderung der LDL- und/oder VLDL-Spiegel im Vergleich mit den HDL-Spiegeln, da der Titer von Antikörpern, die gegen endogenes CETP gerichtet sind, ansteigt, oder an einer Erhöhung der Absolutspiegel von zirkulierendem HDL mit der Erzeugung von anti-CETP-Antikörpern, oder als Inhibierung oder Abnahme der Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen in Kardiovaskulärgeweben.
Wie hierin gezeigt wird, führte die Verabreichung von Impfstoff-Peptiden in einem Kaninchenmodell für die Atherosklerose zu einer signifikanten Verminderung der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques in Tieren, an die eine Cholesterin ergänzte Diät verfüttert wurde. Dieser Beweis zeigt, dass die Impfung zur Auslösung der Antikörper-Produktion gegen endogenes CETP ein nützliches Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Atherosklerose sein kann. Das ist der erste Beweis dafür, dass die Auslösung einer Immunreaktion gegen CETP die Entwicklung von Athe rosklerose inhibieren kann.
Derartige endogen erzeugte Antikörper gegen das eigene CETP einer Person sind vorteilhaft gegenüber anderen möglichen therapeutischen Ansätzen. Beispielsweise ist es bei einer Verwendung von Polypeptidinhibitoren von CETP, wie sie in jüngerer Zeit aus Pavianen isoliert wurden (vgl. z.B. WO 93/11782; Kushwaha, R.S., et al., J. Lipid Res. 34:1285-1297 (1993); Genetic Engineering News, 14:44 (1994); Science, 262:1974-1975 (1993)), oder bei Infusion von exogen hergestellten (fremden) anti-CETP-Antikörpern, die die CETP-Aktivität inhibieren, wahrscheinlich, dass sie eine Immunreaktion auslösen, die sich gegen derartige fremde CETP-inhibierende Moleküle richtet. Eine derartige Immunreaktion könnte den exogen zugeführten CETP-Inhibotor rasch inaktivieren und/oder aus dem Körper entfernen. Theoretisch könnte eine derartige Immunreaktion gegen den exogen zugeführten CETP-Inhibitor vermieden werden, indem man zunehmende Dosen des Inhibitors verabreicht. Die mehrfache Verabreichung von Dosen eines fremden CETP-Inhibitors, insbesondere von zahlreichen Dosen in jeweils zunehmenden Mengen von derartigen fremden Molekülen, eröffnet die Möglichkeit für eine Überempfindlichkeitsreaktion, die die Gesundheit der behandelnden Person gefährdet. Derartige Probleme, die mit einer Verwendung von exogen hergestellten CETP-Inhibitoren verknüpft sind, werden dadurch vermieden, dass man die erfindungsgemäßen Impfstoffe auf Peptibasis verwendet, die im eigenen Immunsystem einer Person Antikörper rekrutieren, um endogenes CETP spezifisch zu inhibieren. Eine wiederholte Dosierung, eine abgestufte Dosierung und unerwünschte Nebenwirkungen (wie beispielsweise eine humane Reaktion gegen Maus-Antikörper (HAMA)) werden dadurch vermieden, dass man den hierin beschriebenen anti-CETP-Impfstoffansatz verfolgt.
Die CETP-Impfstoffzusammensetzungen dieser Erfindung können auf irgendeinem zur Impfung verwendeten Weg verabreicht werden, wozu gehören: parenteral, wie beispielsweise intraperitoneal, interperitonal, intradermal (subkutan), intramuskulär, intravenös oder oral. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Impfstoff parenteral verabreicht, z.B. intraperitoneal, interperitoneal, intradermal, intramuskulär oder intravenös. Wenn eine orale Verabreicherung eines Impstoff-Peptids gewünscht wird, kann irgendein pharmazeutisch annehmbarer oraler Hilfsstoff mit den erfindungsgemäßen Impfstoff-Peptiden vermischt werden, beispielsweise Lösungen, wie sie für eine Verwendung in dem oralen Polio-Impf stoff von Sabin zugelassen sind. Wie im Falle verschiedener anderer Impfstoffe, wie beispielsweise gegen Tetanus, kann eine gelegentliche Auffrischungs-Verabreichung der CETP-Impfstoff-Peptidzusammensetzungen erforderlich sein, um das erwünschte Ausmaß an Modulation oder Inhibierung des endogenen CETP aufrechtzuerhalten. Wie oben erwähnt wurde, wurde für biologisch abbaubaure Mikrokügelchen, wie z.B. für diejenigen, die aus Poly(DLlactid-co-glycolid) zusammengesetzt sind, gezeigt, dass sie für eine wirksame Impfstoffzufuhr und Immunisierung auf oralem oder parenteralem Wege nützlich sind (Eldridge, J.H., et al., In Immunobiology of Proteins and Peptides V: Vaccines: Mechanisms, Design, and Applications, Atassi, M.Z., ed. (Plenum Press, New York, 1989), Seiten 191-202)).
Geeignete Dosierungen von erfindungsgemäßen Peptid-Impfstoffen werden nach allgemeinen Impfstoff-Methoden festgelegt, wie sie auf dem Fachgebiet angewandt werden, und zwar auf der Basis von messbaren Parametern, die von dem Impfstoff beeinflusst werden sollen, einschließlich der Überwachung auf potentielle Gegenanzeigen, wie Überempfindlichkeitsreaktionen, Erythem, Induatin, Erweichung (vgl. z.B. Physician's Desk Reference, 49th ed., (Medical Economics Data Production Co., Mont Vale, New Jersey, 1995), Seiten 1628, 2371 (bezüglich Hepatitis B-Impfstoff), Seiten 1501, 1573, 1575 (bezüglich Masern-, Mumps- und/oder Rubella-Impfstoff), Seiten 904, 919, 1247, 1257, 1289, 1293, 2363 (bezüglich Diphtherie-, Tetanus- und/oder Pertussis-Impfstoff)); Talwar, G.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536 (1994)). Ein üblicher und herkömmlicher Ansatz zur Impfung von Menschen ist die Verabreichung einer Anfangsdosis eines speziellen Impfstoffs, um das Immunsystem zu sensibilisieren, und dann eine Nachimpfung mit einer oder mehreren "Booser"-Dosen des Impfstoffs, um eine Gedächtnisreaktion durch das Immunsystem hervorzurufen, das durch die erste Verabreichung des Impfstoffs sensibilisiert worden war (Impfung). Eine derartige "Primär- und Booster"-Verabreichungsprozedur ist gut bekannt und wird auf dem Fachgebiet üblicherweise angewandt, beispielsweise bei der Entwicklung und Verwendung von Masern-, Polio-, Tetanus-, Diphtherie- und Hepatitis B-Impfstoffen.
Anfangs kann die Menge eines an eine Person verabreichten Impfstoff-Peptids diejenige sein, die erforderlich ist, eine Antikörperreaktion auszulösen, die im Hinblick auf eine Neutralisierung des ungefähren Grads an endogener CETP-Aktivität, die vor der Impfung bei der Person vorhanden ist, erforderlich ist, was durch Messung der CETP-Aktivität in Serum- oder Plasmaproben der Person bestimmt werden kann, beispielsweise durch Bestimmung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen CETP-Assays (z.B. Diagnescent Technologies, Inc., Yonkers, New York). Plasma- oder Serumproben einer geimpften Person können auch überwacht werden, um festzustellen, ob nach der Verabreichung des Impfstoff-Peptids eine messbare Zunahme der Spiegel an Gesamt-HDL oder HDL-C zu erkennen ist, und zwar unter Verwendung kommerziell erhältlicher Assays (z.B. erhältlich von Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia). Ein Anstieg der Konzentration (des Titers) von zirkulierenden anti-CETP-Antikörpern kann in Plasma- oder Serumproben gemessen werden, beispielweise unter Verwendung eines ELISA-Assays (vgl. z.B. Beispiel 3). Es ist somit möglich und wird empfohlen, dass zuerst festgestellt wird, ob ein Anstieg an anti-CETP-Antikörper mit einem Anstieg des Spiegels an HDL oder HDL-C korreliert, oder mit einer Abnahme der CETP-Aktivität. Danach muss man nur noch einen Anstieg des Titers an anti-CETP-Antikörper überwachen, um zu bestimmen, ob eine ausreichende Dosis an Impfstoff-Peptid verabreicht wurde, oder ob eine "Booster"-Dosis angezeigt ist, um einen erhöhten Spiegel an anti-CETP-Antikörper zu erzeugen. Das ist die übliche Prozedur bei verschiedenen etablierten Impfungen, wie beispielsweise einer Impfung gegen den Hepatitis-B-Virus.
Dreidimensionale Verfahren zur bildlichen Darstellung der Arterien sind gegenwärtig verfügbar, die dazu verwendet werden können, arterielle Läsionen zu identifizieren und deren Entwicklung oder Regression bei einer Person zu überwachen (vgl. beispielsweise McPherson, Scientific American Science & Medicine, Seiten 22-31, (März/April, 1996)). Somit können derartige bildgebende Verfahren verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Impfung mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung zu überwachen. Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile kann aus den nachfolgenden nicht-einschränkenden Beispielen erhalten werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 Konstruktion und Synthese eines anti-CETP-Impfstoff-Peptids.
Um die Möglichkeit der Auslösung einer Antikörperreaktion gegen endogenes CETP zu untersuchen, wurde ein Peptid hergestellt, das einen Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt aufwies, der ein universelles Toxoid Helfer-T-Zell-Epitop aufwies sowie einen B-Zell-Epitop-Abschnitt, der einen carboxyterminalen Abschnitt von humanem CETP aufwies. Es wurde ein Peptid von 31 Aminosäuren konstruiert mit der Aminosäuresequenz C Q Y I K A N S K F I G I T E F G F P E H L L V D F L Q S L S (SEQ ID NO:2), in der Q Y I K A N S K F I G I T E (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:2) die gleiche Aminosäuresequenz bilden wie die Aminosäuren 830 bis 843 des Tetanustoxoid-Proteins, F G F P E H L L V D F L Q S L S (Aminsosäuren 16 bis 31 von SEQ ID NO:2) die gleiche Aminosäuresequenz bilden wie die Aminosäuren 461 bis 476 von SEQ ID NO:4, die die Neutrallipid-Transferdomäne von humanem CETP enthält und für die bekannt ist, dass sie vom anti-Human-CETP Mab TP2 erkannt wird (Wang, S., et al., J. Biol. Chem., 267:17487-174990 (1992); Wang, S., et al., J. Biol. Chem., 268:1955-1959 (1993)), und in der der aminoterminale Cystein(C)-Rest vorhanden ist, um das Peptid mit sich selbst oder anderen Molekülen zu verknüpfen, wenn das gewünscht wird. Der CETP-bezogene Abschnitt dieses synthetischen Peptids unterscheidet sich von dem entsprechenden Abschnitt der Kaninchen-CETP-Aminosäuresequenz nur beim Glutaminsäure(E)-Rest (vgl. Nagashima, M., et al., J. Lipid Res., 29:1643-6149 (1988) (Klonieren des Kaninchen-CETP-Gens)). Eine vorhergehende Untersuchung hat jedoch gezeigt, dass anti-Human-CETP Mabs diesen entsprechenden Abschnitt von Kaninchen-CETP erkennen können (vgl. Heller, C.B., et al., J. Biol. Chem., 263:5020-5023 (1988)). Das Peptid wurde ordnungsgemäß synthetisiert unter Anwendung von Standard-Peptidsynthese-Verfahren von Quality Controlled Biochemicals, Inc. (Hopkinton, Massachusetts).
BEISPIEL 2 Immunisierung von Kaninchen gegen endogenes CETP
Das synthetische Impfstoff-Peptid (SEQ ID NO:2) von Beispiel 1 weiter oben wurde in New Zealand White Rabbits injiziert, um die Fähigkeit des Impfstoff-Peptids zu testen, eine Immunreaktion gegen endogenes Kaninchen-CETP auszulösen. Gruppe I enthielt drei Kaninchen (rb#1 bis #3), von denen jedes einem Protokoll zur Verabreichung des Impfstoff-Peptids ausgesetzt wurde. Gruppe II enthielt ein Kaninchen (rb#4) als Kontrolle, das nicht behandelt wurde.
Das allgemeine Protokoll zum Testen des Impfstoff-Peptids in den Kaninchen ist in 1 gezeigt. Am Tag 1 wurde Peptid (100μg) in dem RIBI^TM-Adjuvantiensystem (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana) nach den Herstelleranweisungen auf ein End volumen von 1000 μl suspendiert, und jedes Kaninchen der Gruppe I wurde an zwei Stellen intramuskulär (250 μl pro Stelle), subkutan an zwei Stellen (100 μl pro Stelle), und an sechs Stellen intradermal (50 μl pro Stelle) geimpft. Am Tag 28 wurde, wie am Tag 1, eine Auffrischungsimpfung (Boost) (100 μg Peptid im RIBI^TM-Adjuvantiensystem) verabreicht. Am Tag 56 wurde eine weitere Auffrischungsimpfung (100 μg Peptid in RIBI^TM-Adjuvantiensystem) wie am Tag 1 verabreicht.
Blutproben (etwa 1-5 ml) wurden aus dem Ohr eines jeden Kaninchens vor jeder Erstinjektion abgezogen ("Vorblut") sowie an den Tagen 42, 70 und 108, außer dass kein Vorblut für das Kontrollkaninchen rb#4 gewonnen wurde. Blutplasmaproben wurden nach Standardzentrifugationsverfahren hergestellt, um zelluläre Komponenten vom Plasma zu separieren. Plasmaproben wurden bei –70 °C gelagert. Plasmaproben sowohl von den Gruppen I als auch II wurden auf die Anwesenheit sowie einen Titeranstieg von anti-CETP-Antikörpern untersucht sowie auf Gesamt-Plasmacholesterin und Plasma-HDL-C-Spiegel.
BEISPIEL 3. Erzeugung von anti-CETP-Antikörper in geimpften Kaninchen
Direkt-ELISA zur Titerbestimmung von anti-CETP-Antikörpern
Ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) vom Sandwich-Typ wurde dazu verwendet, um einen Titer in Plasmaproben, die anti-CETP-Antikörper enthielten, zu bestimmen. Bei dieser Anordnung wurde humanes CETP (Human rCETP, erhalten aus einer rekombinanten CHO-Zelllinie CHO(AT), lizensiert von The Trustees of Columbia University, New York, New York) an den Vertiefungen einer Mikrotiterplatter absorbiert, und verschiedene Verdünnungen von Kaninchenplasma aus den Kaninchen der Gruppen I und II wurde jeder Vertiefung zugegeben. Jede Vertiefung einer NUNC Maxisorb 96-Vertiefungs-Platte wurde durch Übernachtbehandlung bei 4 °C mit 100 μl einer 1 μg/ml Lösung von human rCETP in PBS beschichtet. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Zugabe einer 1 %igen Lösung von BSA in PBS und 0,05 % Tween zu jeder Vertiefung sowie eine Inkubierung für 2 Stunden bei Raumtemperatur (20-22 °C) auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min blockiert. Die Vertiefungen wurden dann viermal mit ELISA-Waschpuffer (PBS + 0,05 Tween) gewaschen. Plasmaproben wurden dann 1:10 in Verdünnungspuffer (1 % BSA in PBS) verdünnt, gefolgt von 6 zweifachen seriellen Verdünnungen im gleichen Puffer. Verdünnte Proben (100 μl) wurden zu den Vertiefungen zugesetzt, 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min inkubiert, und dann viermal mit ELISA-Waschpuffer (PBS + 0,05 % Tween) gewaschen. Um gebundene anti-CETP-Antikörper nachzuweisen, wurden 1200 ml einer 1:10.000 Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP)-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Immunoglobulin (Southern Biotechology Associates, Inc.; Birmingham, Alabama) in einem Verdünnungspuffer zugesetzt, und die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann viermal mit ELISA-Waschpuffer (vgl. oben) gewaschen, es wurde das Peroxidase-Substrat TMB (TMB-Peroxidase-Substrat, Kirkegaad & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) zugesetzt, und die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Veränderung der optischen Dichte wurde spektrophotometrisch bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts überwacht (z.B. E-max, Molecular Device Corp., Menlo Park, California). Bei diesem Assay waren die O.D. direkt proportional zur Menge an anti-CETP-Antikörpern, die in den Plasmaproben vorhanden waren. Die Ergebnisse zeigen, dass alle Kaninchen (rb#1 – rb#3) der Gruppe I anti-CETP-Antikörper produzierten, der für rekombinantes humanes CETP spezifisch war. Kein anti-CETP-Antikörper wurde in dem unbehandelten Kontroll-Kaninchen (rb#4) von Gruppe I in Beispiel 2 produziert. Vergleiche 2.
Kompetitiver ELISA zum Nachweis von anti-CETP-Antikörper
Dieser Assay war dazu bestimmt, festzustellen, ob geimpfte Kaninchen Antikörper entwickelt hatten, die an das gleiche Epitop binden wie der anti-CETP Mab TP2 (lizenziert von The Trustees of Columbia University, New York, New York). Es wurde ein Standardkompetitiver ELISA angepasst, um die Anwesenheit von anti-CETP-Antikörpern in Kaninchenplasma festzustellen. Bei diesem Assay wurde Meerrettich-Peroxidase (HRP) an den anti-CETP Mab TP2 konjugiert, der spezifisch an das 26 Aminosäuren aufweisende carboxyterminale Fragment von humanem CETP bindet (Wang et al., J. Biol. Chem., 267:17487-17490 (1992); Wang et al., J. Biol. Chem., 268:1955-1959 (1993)).
Das folgende Verfahren wurde angewandt, um HRP mit dem Antikörper zu konjugieren. Der Antikörper wurde gegen Na₂CO₃ (50 mM, pH 9,5) dialysiert. Der dialysierte Antikörper lag in einer Konzentration von 2 bis 5 mg/ml vor. HRP (Boehringer-Mannheim) wurde in Natriumacetatpuffer (1,0 mM, pH 4,4) bis zu einer Konzentration von 6 mg/ml gelöst. Die HRP wurde dann dadurch aktiviert, dass man 0,2 ml Natriumperiodat (21,4 mg/ml Acetatpuffer, direkt vor der Verwendung hergestellt) zu jeder 1 ml HRP-Lösung zusetzte, und die Aktivierungsmischung wurde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler für 20 Minuten inkubiert. Die aktivierte HRP wurde dann über eine G25-Kolonne geleitet, die mit Acetat-Puffer äquilibriert worden war, um die aktivierte HRP zu entsalzen. Eine optische Dichte (O.D.) bei 403 nm entspricht etwa 1 mg HRP/ml. Die entsalzte, aktivierte HRP wurde dann zu dem dialysierten Antikörper in einer Menge zugesetzt, die einer Hälfte der Antikörpermenge entsprach (in Gewicht, beispielsweise für jedes 1 mg IgG werden 0,5 mg aktivierte HRP zugesetzt), und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert, um die Konjugation von HRP an die Antikörpermoleküle zu ermöglichen. Die Konjugationsreaktion wurde durch Zugabe von 20 μl Natriumborhydrid (10 mg/ml) zu je 1 ml der HRP-Antikörper-Konjugationsmischung gestoppt, und die Mischung wurde dann auf Eis 30 Minuten inkubiert. Die Mischung von HRP-konjugiertem Antikörper wurde über Nacht gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert und dann zentrifugiert (Airfuge) für 15 Minuten bei 30 psi. Dem Überstand (HRP-konjugierten Antikörper) wurde Thimerosal bis zu 0,5 % zugesetzt, und es wurde Rinder-Serumalbumin bis zu 1 zugesetzt. Die Präparationen des HRP-konjugierten Antikörpers wurde bei 4 °C und vor Licht geschützt gelagert.
Die Vertiefungen einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte wurden mit CETP dadurch beschichtet, dass man in jeder Vertiefung 100 μl einer 300 ng/ml Lösung von rekombinantem humanen CETP (erhalten aus der rekombinanten CHO-Zelllinie CHO(AT), lizenziert von The Trustees of Columbia University, New York, New York) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) inkubierte. Die Vertiefungen wurden abgegossen, und die Vertiefungen wurden mit einer 1 %igen (Gewicht/Gewicht) Lösung von Rinder-Serumalbumin (BSA) in PBS und 0,05 % (Vol/Vol) Tween (Sigman Chemical Co., St. Louis, Missouri) befüllt und 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler (etwa 150 U/min) inkubiert, um eine nicht-spezifische Bindung zu blockieren. Die Vertiefungen wurden viermal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen (PBS + 0,05 % Tween), und 100 μl von Plasmaproben, verdünnt in Verdünnungspuffer (1 % BSA in PBS), wurden zugesetzt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler wie oben inkubiert, und dann viermal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden als Nächstes 100 μl einer 1:100.000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase konjugiertem (markiertem) Mab TP2 in Verdünnungspuffer zugesetzt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur wie oben auf einem rotierenden Schüttler inkubiert, dann viermal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen. Das Meerrettich-Peroxidasesubstrat (z.B. TBM-Peroxidasesubstrat, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) wurde jeder Vertiefung zugesetzt, und eine Veränderung der optischen Dichte (O.D.) bei 450 nm wurde spektrophotometrisch verfolgt, unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes (z.B. E-max, Molecular Devices Corp., Menlo Park, California). Wenn ein Antikörper gegen den CETP-bezogenen Abschnitt des Impfstoff-Peptids erzeugt worden war, kompetieren bei diesem Assay derartige unmarkierte anti-CETP-Antikörpermoleküle, die in den Plasmaproben vorhanden sind, mit dem markierten TP2 Mab um die Bindung an das CETP, das an den Wänden der Vertiefungen adsorbiert ist, und eine Inhibierung der Farbentwicklung wird beobachtet, wenn die Konzentration der Plasmaprobe zunimmt (d.h. O.D. ist invers proportional zur Menge an anti-CETP-Antikörper, der in jeder Plasmaprobe vorhanden ist).
Wie in 3 gezeigt ist, wurde eine derartige Inhibierung der TP2-Bindung an CETP in Plasmaproben von zwei der drei Kaninchen beobachtet, denen das Impfstoff-Peptid verabreicht worden war, wodurch die Produktion von CETP-spezifischem Antikörper angezeigt wurde (vgl. die Kurven für die Kaninchenseren rb#2 und rb#3 mit dem Plasma des unbehandelten Kontrollkaninchens #4 in 3). Die stärkste Inhibierung der TP2-Bindung an CETP zeigte sich im Plasma des Kaninchens rb#3 (vgl. 3).
BEISPIEL 4. Cholesterin- und HDL-Spiegel in Plasmaproben von geimpften Kaninchen
Die zu verschiedenen Zeitpunkten (Tagen) im Impfprotokoll genommenen Plasmaproben der Kaninchen der Gruppen I und II in Beispiel 2 wurden auch auf die Konzentration von Gesamtcholesterin (4) und HDL-C (5) untersucht. Die Gesamt-Plasmacholesterin- und HDL-C-Spiegel wurden unter Verwendung von kommerziellen Standardassays bestimmt (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia). Die Plasmaproben von zwei Kaninchen (rb#2 und rb#3), die die höchsten anti-CETP-Antikörpertiter aufwiesen, zeigten eine 2- bis 5-fache Zunahme der HDL-C-Konzentrationen am Tag 70, verglichen mit den Vorblut-Plasmaproben. Die Kaninchen #2 und #3 zeigten auch zunehmende Plasma-HDL-Konzentrationen über die Zeit, verglichen mit dem Kontrollkaninchen (rb#4) sowie dem Kaninchen mit dem niedrigsten Antikörpertiter (rb#1), die beide über die Zeit abnehmende HDL-Konzentrationen zeigten (5).
6 zeigt das Verhältnis von Nicht-HDL-Cholesterin (Non-HDL) zu HDL-Cholesterin (DHL) am Tag 70 nach der Impfung. Die Daten zeigen einen Trend in Richtung eines anti-atherogenen Profils bei der geimpften Kaninchengruppe (schraffiert), verglichen mit dem nicht geimpften (vollen) Kaninchen. Obwohl kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das Gesamtcholesterin in den Plasmaproben beobachtet wurde, nahm das Verhältnis von Nicht-HDL/HDL im Allgemeinen mit einem Anstieg der anti-CETP-Antikörper bei den geimpften Kaninchen der Gruppe I ab.
BEISPIEL 5. Verabreichung an transgene Mäuse, die humanes CETP exprimieren
Ein Stamm von transgenen Mäusen, der humanes CETP exprimiert, wurde kürzlich kommerziell verfügbar (Biodigm^TM-CETP-Mäuse; Pharmakon USA, Waverly, Pennsylvania). Derartige Mäuse exprimieren humanes CETP in ihren Lebern und es wird berichtet, dass sie etwa 50 % niedrigere Pegel für HDL-assoziiertes Cholesterin aufweisen als nicht-transgene Mäuse des gleichen Wurfs, wenn sie mit einem normalen Futter gefüttert wurden. Derartige transgene Tiere dienen als zusätzliches experimentelles Modell, um die Impfstoff-Peptide dieser Erfindung zusätzlich zu testen.
Zwei Gruppen, die aus sechs transgenen CETP-exprimierenden Mäusen bestanden, wurden dazu verwendet, das gleiche Impfstoff-Peptid zu testen, das in den Beispielen 1 bis 4 weiter oben verwendet worden war. Jede Maus der Gruppe I erhielt Primärinjektionen des Impfstoff-Peptids, gelöst in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und emulgiert mit dem kompletten Freund's-Adjuvans (1:1), um eine Endkonzentration von 100 μg/100 μl zu erhalten. Jeder Maus wurde die Impfstoff-Peptidmischung in einer 50 μl Dosis (50 μg) an jeweils zwei subkutanen Stellen verabreicht. Am Tag 28 sowie noch einmal am Tag 56 erhielten die Tiere auf ähnliche Weise Auffrischungsimpfungen mit dem Peptid-Impfstoff (100 μg) in PBS verabreicht, außer dass das Impfstoff-Peptid mit unvollständigem Freund s-Adjuvans emulgiert worden war. Am Tag 42 und Tag 63 wurden Blutproben abgenommen. Die Mäuse der Kontrollgruppe II erhielten primäre und Auffrischungsinjektionen von PBS, emulgiert mit Adjuvans, jedoch ohne Impfstoff-Peptid, auf die gleiche Weise wie die Mäusegruppe I. Plasmaproben wurden wie weiter oben für die Kaninchen-Plasmaproben beschrieben, hergestellt.
Alle Mäuse der Gruppe I wiesen erhebliche Titer an anti-CETP-Antikörper auf, und zwar gemessen über einen weiten Bereich von Plasmaverdünnungen (1:10 bis 1:1.000.000) und zwar anhand des direkten ELISA, wie er oben beschrieben wurde (vgl. 7). Ferner wurde gezeigt, dass drei der sechs Mäuse aus Gruppe I anti-CETP-Antikörper aufwiesen, die mit Mab TP2 um die Bindung an rekombinantes humanes CETP kompetierten (wie im Falle der Kaninchen rb#2 und rb#3 in Beispiel 3 oben gefunden worden war).
BEISPIEL 6. Immunisierung von Kaninchen gegen endogenes CETP in einem Cholesterin-gefütterten Modell für Atherosklerose
Das synthetische Impfstoff-Peptid (SEQ ID NO:2) von Beispiel 1 weiter oben wurde in New Zealand White Rabbits injiziert, um die Fähigkeit des Impfstoff-Peptids zu testen, eine Immunreaktion gegen endogenes Kaninchen-CET hervorzurufen und gegen eine Entwicklung von Atherosklerose zu schützen oder diese zu vermindern. Gruppe I enthielt sechs Kaninchen (rb#1 bis #6), von denen jedes einem Protokoll zur Verabreichung des Impfstoff-Peptids unterzogen war. Kontrollgruppe II enthielt sechs Kaninchen (rb-7 – 12), die geimpft wurden, die jedoch nicht mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden. Die Kontrollgruppe III enthielt sechs Kaninchen (rb#13 – 18), die nicht geimpft wurden und an die keine cholesterinreiche Diät verfüttert wurde. Kontrollgruppe IV enthielt sechs Kaninchen (rb#19 – 24), die nicht geimpft wurden, an die jedoch eine cholesterinreiche Diät verfüttert wurde. Die cholesterinreiche Diät wurde beginnend vier Wochen nach einer abschließenden Auffrischungsimpfung mit dem Impfstoff gegeben und setzte sich für eine Gesamtzeit von 17 Wochen fort.
Das allgemeine Protokoll zum Testen des Impfstoff-Peptids bei den Kaninchen ist in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt. Am Tag 0 wurde Peptid (100 μg) in dem RIBI^TM-Adjuvanssystem (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana) nach den Anweisungen des Herstellers auf ein Endvolumen von 1000 μl suspendiert, und jedes Kaninchen der Gruppe I und II wurde an zwei Stellen intramuskulär (250 μl pro Stelle), an zwei Stellen subkutan (100 μl pro Stelle) und an sechs Stellen intradermal (50 μl pro Stelle) geimpft. Am Tag 28 wurde eine Auffrischungsimpfung (100 μg Peptid in RIBI^TM-Adjuvantiensystem) wie am Tag 0 verabreicht. Am Tag 49 wurde eine weitere Auffrischungsimpfung (100 μg Peptid in RIBI^TM-Adjuvanssystem) wie am Tag 0 verabreicht. Am Tag 77 wurden an die Gruppen I und IV mit 0,25 % (Gewicht/Gewicht) Cholesterin angereicherte Diäten verfüttert (Kaninchen-Futter, ergänzt mit Cholesterin (Farmer's Exchange, Framingham, MA). Den Gruppen II und III wurde das gleiche Kaninchen-Futter verfüttert, das jedoch nicht mit Cholesterin angereichert war (Farmer's Exchange, Framingham, MA).
Blutproben (etwa 1-5 ml) wurden dem Ohr eines jeden Kaninchens vor jeder ersten Injektion ("Vorblut") abgenommen sowie routinemäßig etwa alle zwei Wochen danach. Blutplasmaproben wurden nach Standard-Zentrifugationsmethoden hergestellt, um Zellkomponenten von dem Plasma abzutrennen. Die Plasmaproben wurden bei –70 °C gelagert. Die Plasmaproben aller Gruppen wurden auf die Anwesenheit und einen Anstieg der Titer von anti-CETP-Antikörpern sowie auf die Gesamt-Plasma-Cholesterin- und Plasma-HDL-C-Spiegel analysiert.
BEISPIEL 7 Erzeugung von anti-CETP-Antikörper in geimpften Kaninchen in einem Atherosklerose (Hypercholesterinämie)-Modell Direkt-ELISA-Titerbestimmung von Antikörpern gegen rekombinantes humanes CETP
Ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) vom Sandwich-Typ wurde dazu verwendet, eine Titerbestimmung in Plasmaproben durchzuführen, die anti-CETP-Antikörper enthielten. Bei dieser Anordnung wurde rekombinantes humanes CETP (human rCETP, erhalten aus einer rekombinanten CHO-Zelllinie CHO(AT), lizenziert von The Trustees of Columbia University, New York, New York) an Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert, und es wurden unterschiedliche Verdünnungen an Kaninchen-Plasma von den Kaninchen der Gruppen I – IV zu jeder Vertiefung zugesetzt. Jede Vertiefung einer NUNC Maxisorb 96-Vertiefungs-Platte wurde durch Übernacht-Einwirkung bei 4 °C von 100 μl einer 1 μg/ml Lösung von humanem rCETP in PBS beschichtet. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Zugabe einer 1 %igen Lösung von BSA in PBS und 0,05 % Tween zu jeder Vertiefung und Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur (20 – 22 °C) auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min blockiert. Die Vertiefungen wurden dann viermal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen (PBS + 0,05 Tween). Plasmaproben wurden dann 1:10 in Verdünnungspuffer (1 % BSA in PBS) verdünnt, gefolgt von 6 zweifachen seriellen Verdünnungen im gleichen Puffer. Verdünnte Proben (100 μl) wurden dann zu den Vertiefungen zugesetzt, 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min inkubiert, und dann viermal mit ELISA-Waschpuffer (PBS + 0,05 Tween) gewaschen. Um gebundene anti-CETP-Antikörper nachzuweisen, wurden 100 μl einer 1:10.000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP)-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulin (Southern Biotechnology Associates, Inc.; Birmingham, Alabama) in Verdünnungspuffer zugesetzt, und die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler bei 150 U/min inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann viermal mit ELISA-Waschpuffer (siehe oben) gewaschen, und es wurde Peroxidase-Substrat TMB (TMB-Peroxidasesubstrat, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, Maryland) zugesetzt, und die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Veränderung der optischen Dichte wurde spektrophotometrisch bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts überwacht (z.B. E-max, Molecular Device Corp., Menlo Park, California). Bei diesem Assay war die O.D. direkt proportional zur Menge an anti-CETP-Antikörpern, die in den Plasmaproben vorhanden waren. Die Ergebnisse zeigten, dass fünf der zwölf geimpften Kaninchen (Gruppen I und II) anti-CETP-Antikörper produzierten, der für rekombinantes humanes CETP spezifisch war (vgl. 9). Bei den unbehandelten Kontrollgruppen III und IV wurde kein Antikörper gegen rekombinantes humanes CETP produziert.
Direkt-ELISA zur Titerbestimmung von autoreaktiven Antikörpern gegen (endogenes) Kaninchen-CETP
Ein Peptid (Kaninchen-Peptid), das eine Aminosäuresequenz des endogenen Kaninchen-CETP enthielt, wurde auf Bestellung synthetisiert, indem von Quality Controlled Biochemicals Inc. (Hopkinton, Massachusetts) Standardverfahren für die Peptidsynthese angewandt wurden, wobei das Peptid die Sequenz von SEQ ID NO: 7 aufwies : L Q M D F G F P K H L L V D F L Q S L S, die den Aminosäuren 457 bis 476 des carboxyterminalen Abschnitts der humanen CETP-Sequenz entspricht, die in SEQ ID NO:4 gezeigt ist. Dieser Abschnitt der Kaninchen-CETP-Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der humanen CETP-Sequenz dadurch, dass der Glutaminsäurerest in Position 465 der humanen Sequenz (SEQ ID NO:4) durch einen Lysinrest ersetzt ist (vgl. Aminosäure 9 in SEQ ID NO:4). Für die Zwecke dieser Untersuchung wurde das Kaninchen-Peptid als ein biotinyliertes Derivat erworben (Biotin kovalent an den aminoterminalen Leucinrest gebunden).
Vorblockierte, mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten wurden wie folgt hergestellt. 100 μl von 5 μg/ml Streptavidin (Katalog #43-4302, Zymed Laboratories, Inc., S. San Francisco, CA) in PBS wurden in jede Vertiefung von 96-Vertiefungs-Mikroplatten mit entfernbaren Streifen (Katalog #950-2950-00P, LabSystems, Needham, MA) gegeben, verschlossen und bei Raumtemperatur über Nach inkubiert. Nach dem Absaugen des Inhalts einer jeden Vertiefung wurden die Platten gewaschen und dann mit 300 μl PBS blockiert, das 1 % BSA, 5 % Saccharose, 0,05 % Tween 20 und 0,1 % Gentamicinsulfat enthielt, und zwar über Nacht bei Raumtemperatur. Am nachfolgenden Tag wurden die Vertiefungen geleert und man ließ sie über Nacht trocknen, bevor sie gelagert wurden, wurden mit einem Trocknungsmittel verschlossen, und zwar bei 4 °C, bis zur Verwendung. Kaninchen-Peptid wurde dann einer jeden Vertiefung zugesetzt (100 μl von 1 μg/ml Lösung in PBS (GIBCO BRL), ergänzt mit 10 % (Gewicht/Volumen) Rinder-Serumalbumin (BSA)) und 1 Stunde unter Schütteln bei 150 U/min bei Raumtemperatur (22 °C) inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit Wasch puffer (PBS ergänzt mit 0,05 % Tween-20) gewaschen, um ungebundenes Peptid zu entfernen. Kaninchen-Plasmaproben wurden verdünnt (anfangs 1:40, dann seriell um die Hälfte danach) in PBS, das mit 5 % BSA und 1 % Gelatine ergänzt war, und 100 μl einer jeden Verdünnung wurden 90 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 150 U/min inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Ziegen-anti-Kaninchen IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase (Southern Biotechnolgy Associates, Inc., Birmingham, AL), wurden 1:5000 in Waschpuffer verdünnt, und es wurden 100 μl zu jeder Vertiefung zugesetzt, die dann 90 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 150 U/min inkubiert wurden. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und dann mit zugesetztem Peroxidase-Substrat TMB (TMB-Peroxidase-Substrat, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) inkubiert, und die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Veränderung der optischen Dichte wurde spektrophotometrisch bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts überwacht (z.B. E-max, Molecular Device Corp., Menlo Park, California). Bei diesem Assay war die O.D. direkt proportional zu der Menge an anti-Kaninchen-CETP-Antikörpern, die in den Plasmaproben vorhanden waren.
Die Ergebnisse zeigen, dass drei Wochen nach der abschließenden Auffrischungsimpfung (und vor der Verabreichung der Cholesterin-ergänzten Diät an die Gruppen I und IV) sechs der zwölf geimpften Tiere (drei aus jeder der Gruppen I und II) Antikörper erzeugten, die mit dem Peptid reagierten, das sich von der endogenen Kaninchen-CETP-Sequenz ableitet (vgl. 10A und 10B).
Die Daten zeigten, dass das Impfstoff-Peptid in der Lage war, die Bildung von autoreaktiven Antikörpern gegen endogenes Kaninchen-CETP auszulösen. Das zeigt, dass die Kombination des Tetanustoxoid-T-Zell-Epitops und des B-Zell-Epitops des carboxyterminalen Abschnitts von CETP in der Lage ist, die Toleranz gegen ein spezifisches Eigenprotein zu brechen, d.h. in diesem Falle endogenes Kaninchen-CETP.
BEISPIEL 9. Cholesterin- und HDL-Spiegel in Plasmaproben von geimpften Kaninchen im Atherosklerose-Modell
Die von Kaninchen der Gruppen in Beispiel 6 zu unterschiedlichen Zeiten (Tagen) im Impfprotokoll genommenen Plasmaproben wurden auch auf die Konzentration von Gesamt-Cholesterin ( 11) und HDL-C (12) untersucht. Die Gesamt-Plasma-Cholesterin- und HDL-C-Spiegel wurden bestimmt unter Verwendung von kommerziellen Standard-Assays (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia).
Die Plasmaproben der Gruppen I (geimpft) und IV (nichtgeimpft) zeigten eine Zunahme ((Hypercholesterinämie) beim Gesamtcholesterin aufgrund der Verabreichung der mit Cholesterin ergänzten Diät (11). Die Gruppen II (geimpft) und III (nichtgeimpft) zeigten keine Diät-induzierte Hypercholesterinämie (11).
In ähnlicher Weise zeigten die Gruppen I und IV, an die die mit Cholesterin ergänzte Diät verfüttert worden war, eine Zunahme an HDL-C (12). Eine vorläufige Analyse der Daten für Gruppe II zeigte, dass die drei Tiere mit den höchsten anti-CETP-Antikörpertitern auch eine Zunahme bezüglich ihrer HDL-C-Spiegel zeigten, und zwar verglichen mit ihren Spiegeln vor der Impfung. Die vorläufige Analyse zeigte auch, dass bei drei der fünf Tiere in Gruppe III keine signifikante Veränderung der HDL-C-Spiegel beobachtet wurde, verglichen mit den Spiegeln vor der Impfung.
BEISPIEL 10 Messung von atherosklerotischen Aorta-Läsionen bei Kaninchen in einem cholesteringefütterten Atherosklerose-Modell
Allen überlebenden Kaninchen (vier in den Gruppen I und IV, fünf in Gruppe II, sechs in Gruppe III) wurden nach 17 Wochen (Tag 196 nach der primären Impfung) auf Cholesterin-ergänzte Diät bei den Gruppen I und IV und auf Kontrolldiät (keine Cholesterinergänzung) in den Gruppen II und III die Aorten entfernt. Durch Nekrop sie wurde gezeigt, dass der Tod der nicht-überlebenden Kaninchen eine Folge von Haarbällen war und daher nicht des Versuchsaufbaus. Jede Aorta wurde für eine Frontbetrachtung geöffnet, um sie auf atherosklerotische Läsionen zu überprüfen. Die gesamte Länge der Aorta, d.h. vom Aortabogen im Herz bis zur Verzweigung im Unterbauch, wurde mit Oil Red O angefärbt, um Läsionen zu erkennen. Die Läsionen wurden gemessen, und die Daten unter Verwendung eines Computerprogramms quantifiziert (The Morphometer, Woods Hole Educational Associated, Woods Hole, MA).
Die Ergebnisse in 13 dieser Analyse zeigten eine statistisch signifikante Verminderung der Größe der Läsionen bei den Tieren der Gruppe I (geimpft, Cholesterin-ergänzte Diät) im Vergleich mit der Größe der Läsionen bei den Tieren der Gruppe IV (nicht-geimpft, Cholesterin-ergänzte Diät). Die Ergebnisse zeigten, dass der Peptid-Impfstoff in der Lage war, die Fläche atherosklerotischer Läsionen in Tieren zu vermindern, an die eine mit Cholesterin angereicherte (hypercholesterinämische) Diät ver füttert wurde, und zwar um mehr als 50 %. Nicht-geimpfte Tiere (Gruppe IV) wiesen Läsionen auf, die im Mittel 45 % der Gesamtfläche der Aorta bedeckten, wohingegen geimpfte Tiere (Gruppe I) Läsionen aufwiesen, die im Mittel 19 % der Gesamtfläche der Aorta bedeckten. SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Isoliertes antigenes Peptid, das einen T-Helferzellepitop-Abschnitt aufweist, der mit einem B-Zell-Epitop-Abschnitt verknüpft ist, wobei der T-Helferzellepitop-Abschnitt ein Breitband-T-Helferzellepitop aufweist und der B-Zell-Epitop-Abschnitt ein B-Zell-Epitop des Cholesterinestertransferproteins (CETP) aufweist, und wobei das antigene Peptid bei einem Säugetierindividuum die Produktion von Autoantikörpern auslöst, die das endogene CETP des Individuums, dem das Peptid verabreicht wurde, binden, und wobei die Autoantikörper die Aktivität des endogenen CETP des Individuums, dem das Peptid verabreicht wurde, modulieren.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das CETP humanes CETP ist.
Peptid nach Anspruch 2, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt einen Abschnitt des humanen CETP aufweist, der aus wenigstens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID NO:4 besteht, die von B-Zellen oder Antikörpern erkannt werden.
Peptid nach Anspruch 2, wobei das B-Zell-Epitop des CETP aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus der Aminosäuresequenz, die definiert wird durch die Aminosäuren 349 bis 367 von SEQ ID NO:4, durch die Aminosäuren 461 bis 476 von SEQ ID NO:4; Aminosäuresequenzen, die durch antigene Epitope identifizierende Algorithmen identifiziert werden, einem Abschnitt, der an der neutralen Lipidbindung beteiligt ist, oder einem Abschnitt, der an der neutralen Lipidtransferaktivität beteiligt ist.
Peptid nach Anspruch 3, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt ein Peptid ist, das aus zwischen sechs und 26 auf einanderfolgenden Aminosäuren der carboxyterminalen 26 Aminosäuren von humanem CETP (SEQ ID NO:1) besteht.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt ein Derivat des carboxyterminalen 26 Aminosäure-Abschnitts von CETP ist, der Aminosäuredeletionen, -additionen oder -substitutionen aufweist, die die neutrale Lipidbindung oder die neutrale Lipidtransferaktivität des CETP nicht signifikant verändern oder zerstören.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der T-Helferzellepitop-Abschnitt ein T-Helferzellepitop aufweist, das sich von einem antigenen Peptid ableitet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid, Keuchhustenimpfstoff, Bazillus Calmett-Guerin (BCG), Kinderlähmungsimpfstoff, Masernimpfstoff, Mumpsimpfstoff, Rubella-Impfstoff, einem gereinigten Proteinderivat von Tuberculin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, hsp70 und Kombinationen davon.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der T-Helferzellepitop-Abschnitt die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 830 bis 843 des Tetanustoxin-Proteins (Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO:2), die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 947 bis 967 des Tetanustoxin-Proteins (SEQ ID NO:3) und Kombinationen davon umfasst.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, das einen terminalen Cysteinrest aufweist.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist.
Peptid nach Anspruch 10, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt kovalent mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist.
Peptid nach Anspruch 11, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt kovalent über eine Peptidbindung oder eine Disulfidbindung mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist.
Peptid nach Anspruch 10, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt über ein Vernetzermolekül mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist.
Peptid nach Anspruch 10, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt über eine Brücke aus Aminosäuren mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist.
Peptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 aufweist.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt und der T-Helferzellepitop-Abschnitt mit einem gemeinsamen Trägermolekül verknüpft sind.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, das kovalent mit mehreren Kopien von Komplementprotein C3d verknüpft ist.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, das mit Kohlenhydratstrukturen derivatisiert ist, die in vivo kovalent mit Komplementprotein C3d verknüpft werden.
Peptid nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, das mehr als einen T-Helferzellepitop-Abschnitt und/oder mehr als einen B-Zell-Epitop-Abschnitt aufweist.
Impfstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Adjuvans und einem oder mehreren Peptiden, die aus den Peptiden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 ausgewählt sind.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 zur Verwendung als Medikament.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung zur Auslösung der Produktion von Anti-CETP-Antikörpern bei einem Menschen oder Tier.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung bei der Erhöhung des Verhältnisses von zirkulierendem HDL zu zirkulierendem LDL, VLDL oder Gesamtcholesterin bei einem Menschen oder einem anderen Tier.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung zur Verminderung des Ausmaßes der endogenen CETP-Aktivität bei einem Menschen oder anderen Tier.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung zur Veränderung des Katabolismus von HDL-Cholesterin, um die Entwicklung von atherosklerotischen Schädigungen bei einem Menschen oder anderen Tier zu vermindern.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Atherosklerose bei einem Menschen oder anderen Tier.
Verfahren zur Herstellung eines Anti-CETP-Impfstoffs zur Modulierung der endogenen CETP-Aktivität oder zur Behandlung oder Prävention von Atherosklerose, das umfasst: Auswahl eines B-Zell-Epitop-Abschnitts von CETP, wobei das B-Zell-Epitop kein T-Helferzellepitop der Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse I beinhaltet, Auswahl eines T-Helferzellepitop-Abschnitts, der sich von einem antigenen Peptid ableitet, das sich nicht von CETP ableitet; und Verknüpfen des B-Zell-Epitop-Abschnitts von CETP mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt zur Bildung einer antigenen Einheit, wobei die antigene Einheit bei einem Säugetierindividuum die Produktion von Autoantikörpern auslöst, die das endogene CETP des Individuums, dem der Impfstoff verabreicht wird, binden, und wobei die Autoantikörper die Aktivität des endogenen CETP des Individuums, dem das Peptid verabreicht wird, modulieren.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt von CETP einer ist, wie er in irgendeinem der Ansprüche 3 bis 6 definiert wird, und der T-Helferzellepitop-Abschnitt einer ist, wie er in Anspruch 7 oder 8 definiert wird.
Verfahren nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt so mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt verknüpft ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 11 bis 16 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, wobei der B-Zell-Epitop-Abschnitt mit dem T-Helferzellepitop-Abschnitt unter Bildung eines Impfstoff-Peptids verknüpft wird und das außerdem die Stufe des Verknüpfens des Impfstoffpeptids mit einem herkömmlichen Trägermolekül umfassst.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder eines Impfstoffs nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Auslösung der Produktion von Anti-Endogen-CETP-Antikörpern bei einem Menschen oder einem Tier.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder eines Impfstoffs nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Atherosklerose.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder Impfstoff nach Anspruch 20 zur Verwendung als Medikament.
Peptid oder Impfstoff nach Anspruch 33 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Atherosklerose.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder eines Impfstoffs nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung des Verhältnisses von zirkulierendem HDL zu zirkulierendem LDL, VLDL oder Gesamtcholesterin bei einem Menschen oder Tier.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder eines Impfstoffs nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Verminderung des Ausmaßes der endogenen CETP-Aktivität bei einem Menschen oder anderen Tier.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 oder eines Impfstoffs nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung des Spiegels von zirkulierendem HDL bei einem Menschen oder Tier.