DE69635077T2

DE69635077T2 - Gegen malaria polypeptidische molekulen von vorerythrozytären stadium

Info

Publication number: DE69635077T2
Application number: DE69635077T
Authority: DE
Inventors: Pierre Druilhe; Pierre Daubersies
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2016-06-13
Also published as: EP0833917A2; FR2735478A1; JP2009000104A; JPH11508130A; CA2221029A1; FR2735478B1; WO1996041877A2; ATE302276T1; DK0833917T3; WO1996041877A3; EP1621547A1; PT833917E; US20020155441A1; DE69635077D1; DK1621547T3; AU719163B2; EP0833917B1; ATE458002T1; EP1621547B1; DE69638127D1

Description

Die beim Menschen für Malaria verantwortlichen Parasiten weisen im menschlichen Wirt verschiedene Morphologien auf und exprimieren verschiedene Antigene abhängig von ihrer Lokalisation im Organismus. Die morphologischen und antigenen Unterschiede dieser Parasiten im Laufe ihrer Lebenszyklen im Menschen erlauben es, verschiedene Entwicklungsstadien in der Leber und im Blut zu definieren: Der Sporozoit, eine infektiöse Form, die durch die Überträgermücke injiziert wird, wandelt sich schnell zum Schizonten in den Hepatozyten des Wirtes, um anschließend die Erythrozyten zu infizieren. Die intra-hepatische Lokalisation von P. falciparum äußert sich durch die Expression einer Gruppe von Antigenen, die spezifisch für dieses Stadium der Entwicklung und sehr immunogen unter den natürlichen Expositionsbedingungen dieser Krankheit sind. Diese Phase, klinisch ruhig, ist zurzeit die einzige, gegen die man experimentell beim Menschen eine sehr starke, sterilisierende Immunität hervorrufen kann, durch Injektion von bestrahlten Sporozoiten, die fähig sind, in den Hepatozyten einzudringen und sich dort zu entwickeln, aber ohne in das Blutstadium der Krankheit weitergelangen zu können. Daher haben die Erfinder den Hauptteil ihrer Anstrengungen auf diese zwei präerythrozytären Stadien konzentriert. Diese Stadien sind aber auch die am schwierigsten zu untersuchenden, und daher die am wenigsten bekannten, da der Erhalt von biologischem Material schwer, ja sogar unmöglich ist, da das einzige in vitro-Untersuchungsmodell schlechte Ausbeuten hat und da das beste Tiermodell der Schimpanse bleibt, dessen Verwendung begrenzt und kostspielig ist.
Um Zugang zu Antigenen der präerythrozytären Stadien zu erhalten, haben die Erfinder Seren von Individuen verwendet, die seit 25 Jahren im endemischen Gebiet, aber unter permanenter Chloroquin-Prophylaxe, wohnen. Diese Individuen waren regelmäßig infektiösen Mückenstichen ausgesetzt, aber entwickelten niemals eine vollständige Infektion des Blutes. Ihr Serum enthielt daher Antikörper, die im Wesentlichen gegen die präerythrozytären Stadien gerichtet waren, was durch Immunfluoreszenz und Western Blots gegen die drei Stadien des Parasiten verifiziert wurde.
Die Verwendung dieser Seren zum Durchsuchen einer genomischen DNA-Datenbank des parasitären Klons von P. falciparum, zusammengestellt in Expressionsvektoren in einem Lambda-Phagen gt11 (V. Rosario, Science 212, 1981, 1037–1038; und Thaithong et al., Transactions of Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1984, 78, 242–275), führte zum Nachweis von Polypeptiden des präerythrozytären Stadiums, besonders der Polypeptide SALSA (für Sporozoit-Leberstadium-Antigen), beschrieben in EP A-0407230 und das LSA-1 (für Leberstadium-Antigen), beschrieben in WO 92/13884. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Polypeptidmoleküle, die spezifisch für das präerythrozytäre Stadium sind, und ihre Verwendung als aktives Prinzip des Anti-Malariaimpfstoffs, oder in Diagnoseverfahren der Krankheit.
Die Erfindung führt zum Nachweis durch die Erfinder von speziellen Eigenschaften eines speziellen Antigens, genannt LSA-3, und seiner Fragmente, die als Kandidaten mit sehr starkem Potenzial erscheinen, einen Anti-Malariaimpfstoff zu verwirklichen, und dieses aus folgenden Gründen:

a) Wenn eine Fraktion von LSA-3 in Kombination mit einem anderen Antigen desselben Entwicklungsstadiums des Parasiten verwendet wurde, wie das LSA-1, um Schimpansen zu immunisieren, zeigt das Tier, das auf beide Moleküle oder nur auf LSA-3 antwortet, das Erscheinungsbild, keine Parasiten im Blut zu haben, eine beträchtliche Verminderung von Parasiten in der Leber zu haben, und eine beträchtliche Rekrutierung von mononukleären Zellen zu zeigen, die eine zelluläre Immunantwort anzeigen;
b) im endemischen Gebiet beobachtet man eine sehr deutliche Korrelation zwischen dem Schutz der Individuen gegen die natürliche Infektion durch Sporozoiten und ihrer Antikörperantworten gegen LSA-3;
c) bei 8 menschlichen durch Injektion von bestrahlten Sporozoiten immunisierten Freiwilligen wurden Antikörper gerichtet gegen LSA-3 bei jedem der 4 gegen eine Infektion durch Sporozoiten resistenten Individuen gefunden, und bei keinem der 4 anderen Freiwilligen, die eine Blutinfektion entwickelt hatten;
d) Antikörper, die gegen das Peptid DG729 erhalten wurden, schon beschrieben in WO 92/13884, zeigen eine Kreuzreaktion mit den Sporozoitenstadien und Leberstadien des Mäuseparasiten P. voelii, die eine bedeutsame Nutzung des Mausmodells erlaubt. In vitro sind gegen DG729 immuno-gereinigte menschliche Antikörper fähig, selbst in sehr geringen Konzentrationen das Eindringen von Sporozoiten von P. voelii in Mäusehepatozyten zu verhindern. In vivo sind durch DG729 immunisierte Mäuse völlig oder teilweise geschützt gegen Infektionen durch die Sporozoiten von P. voelii;
e) schließlich stimulieren bestimmte Epitope, besonders gegen die nicht-repetitiven Teile des Moleküls, die Sekretion von Interferon-γ durch Monozyten, wobei dieser Botenstoff erlaubt, die intra-hepatische Entwicklung des Parasiten zu inhibieren (S. Mellouk et al., The Jour of Immunol 139, 4192–4195, 1987).
f) die Sequenz der Region von LSA-3, die einem (Lipo-)Peptid NR2 entspricht, wurde in 27 Proben analysiert: 4 Laborstämme (NF54, K1, Palo Alto, T9/96), 3 madegassische Isolate, 3 birmesische Isolate, 5 brasilianische Isolate, 7 Isolate von der Elfenbeinküste und 5 thailändische Isolate. Keine Mutation wurde in 300 analysierten Basenpaaren beobachtet, das heißt 100% Konservierung in dieser immunologisch wichtigen Region, die eines oder mehrere B, Th und CTL Epitope enthält.
g) Informationen über die Struktur des Antigens, und insbesondere eines Peptids RE, und noch spezieller über die zentrale repetitive Region, aus der das Peptid RE entworfen wurde, und die ein oder mehrere B-Hauptepitope beinhaltet, wurden erhalten aus dem Hydrophobic Cluster Plot der Sequenz, verfügbar im Klon T9/96 (630 Aminosäuren), (Gaboriot et al., (1987): Hydrophobic cluster analysis: an efficient way to compare and analyse amino acid sequences, FEBS Letters, 224: 149–155); dieses Verfahren sagt eine sehr starke Neigung zur α-Helixbildung voraus. Die repetitive Region weist eine außergewöhnliche Regelmäßigkeit im Abstand der Valin- und Isoleucin-Reste auf, die sich abwechseln mit sauren Resten oder Prolin. Die Anordnung von hydrophoben Gruppierungen auf der Oberfläche dieser Helix ruft eine hydrophobe Grenze hervor, die sich schrittweise von einer Seite der Helix zur anderen verlagert, und einer generellen konstanten Orientierung der Länge des Moleküls nach folgt, und sich vermutlich in Beziehung mit einer Struktur oder einer „coiled coil"-Packung befindet, wie die in 4b erscheinende, und die den HCP (Hydrophobic Cluster Plot) der Peptidsequenz von Klon DG729 darstellt.
h) Nachdem wir bewiesen hatten, dass ein sehr großer Bereich von Immunantworten gegen das Antigen LSA-3 bestand, haben wir die Fähigkeiten der antwortenden Zellen analysiert, sich um Parasiten in der Leber lokalisieren. Bei den durch rekombinante Antigene immunisierten Mäusen erlaubt die Injektion auf dem Pfortaderweg von jedem der auf Polystyrenkugeln von 10 μm absorbierten Peptide, nach 48 Stunden einen Zustrom von Lymphozyten um das Antigen (das den Parasiten nachahmt) zu visualisieren, dann am 5. Tag eine bedeutende Rekrutierung von Zellen, die zur Nachkommenschaft von Makrophagen gehören.

Alle diese Eigenschaften, von denen bestimmte im Detail bewiesen werden in den weiter hinten beschriebenen Experimenten, zeigen, dass das Antigen LSA-3 sowohl eine gute Antigenizität als auch eine gute Immunogenizität aufweist.
Die Erfinder konnten die Spezifität der Expressionsstadien des Moleküls bestätigen und präzisieren; auf der Stufe der Sporozoiten wurde diese Expression durch Oberflächen-Immunfluoreszenz mehrerer Stämme und Isolate bestätigt. In Analysen durch „Western-Blot" (oder Immunabdruck) erschien das Molekül LSA-3 als ein Protein mit einem Molekulargewicht von 200.000 Dalton. Da die Messenger-RNA-Moleküle von Sporozoiten nicht in ausreichender Menge für eine „Northern-Blot"-Analyse erhalten werden konnten, bestätigten Experimente mit inverser PCR die Expression von LSA-3 in diesem Stadium. Auf der Stufe von infizierten Hepatozyten wird LSA-3 in der parasitophoren Vakuole des Parasiten durch Immunofluoreszenz beobachtet mithilfe von Antikörpern gegen die repetitiven und nicht-repetitiven Regionen des Proteins, sowie durch Elektronenmikroskopie.
Ein Fragment von LSA-3, genannt 729S, sowie drei Peptide, genannt NRI und NRII, die im nicht-repetitiven Anteil enthalten sind, und 729R, das im repetitiven Teil enthalten ist, wurden in der Anmeldung WO 92/13884 beschrieben. Jedoch erwähnt dieses Dokument weder die weiter oben beschriebenen speziellen Eigenschaften noch andere Fragmente von LSA-3, die entweder länger oder kürzer sein könnten, enthalten oder kombiniert mit den Fragmenten, die besonders interessante Eigenschaften zum Gebrauch in Impfstoffen zeigen könnten.
Der Gegenstand der Erfindung sind Polypeptidmoleküle, die mindestens zehn aufeinander folgende Aminosäuren enthalten aus den Aminosäuresequenzen gezeigt in 2 und genannt SEQ ID Nr. 2, und die LSA-3 darstellen, wobei die folgenden Polypeptide ausgeschlossen sind:
Andere Moleküle gemäß der Erfindung enthalten mindestens 20 aufeinander folgende Aminosäuren oder mindestens 50.
Die Gesamtheit dieser Polypeptide und das Molekül LSA-3 werden desweiteren „Polypeptide der Erfindung" genannt.
Die experimentellen Ergebnisse und die Vergleiche von nicht-repetitiven Sequenzen zwischen verschiedenen Isolaten von P. falciparum zeigen das Vorhandensein einer Homologie von mindestens 70% zwischen Antigenen entsprechend dem Leberstadium des Parasiten. Auch sind alle Peptidmoleküle, die mindestens 70% Homologie mit einem beliebigen der weiter oben definierten Moleküle aufweisen, Teil der Erfindung, sowie die, die 70% Homologie mit der folgenden Sequenz zeigen:
Leu Leu Ser Asn Ile Glu Glu Pro Lys Glu Asn Ile Ile Asp Asn Leu Leu Asn Asn Ile (CT1)
enthalten zwischen den Aminosäuren 140–159 von K1 oder 23–42 von T9/96.
Gleichermaßen sind die Polypeptidmoleküle Teil der Erfindung, die mindestens 70 % Homologie aufweisen mit der Sequenz, die in 3 dargestellt wird, die einen Teil von LSA-3 in T9/96 darstellt: Die DNA dieses Isolates von P. falciparum war durch Restriktionsenzyme verdaut und dann in lambda gt11 kloniert worden und erlaubte folglich, die Genbank dieses schon weiter oben beschriebenen Isolats zu bilden.
Konjugate bestehend aus einem aus LSA-3 stammenden Polypeptids, gebunden in kovalenter Weise durch eine Lysinbrücke an gesättigte oder ungesättigte Lipidreste, sind gleichermaßen ein Teil der Erfindung, im besonderen, wenn der Lipidrest ein Palmitoyl oder ein Palmityl oder ein Oleyl ist. Reste von C16 oder C18 waren so schon durch eine Lysinbrücke an die Peptide NRI, NRII, 729RE und CT1, die schon weiter oben dargestellt wurden, gebunden worden. Das Syntheseverfahren, die für diese Konjugate benutzt wurde, ist beschrieben in Bourgault, Journal of Immunology, 149, 3416 (1992) und Rouaix, Vaccine, 12, 1209 (1994).
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf immunogene Stoffgemische, die mindestens ein oben beschriebenes Polypeptidmolekül oder Konjugat enthalten, sowie Impfstoffe, die diese immunogenen Stoffgemische enthalten. Andere immunogene Epitope, insbesondere LSA-1, SALSA, STARP, wurden schon in EPA-0407230 und in WO 92/13884 beschrieben. Die Impfstoffgemische gemäß der Erfindung können in einer vorteilhaften Weise eine Mischung von immunogenen Peptiden enthalten, die aus LSA-3 stammen und Peptide oder Antigene, die aus LSA-1, SALSA oder STARP stammen; eine ganz besonders interessante Mischung könnte die sein, die zum einen aus NRI, NRII oder dem ganzen LSA-3 gebildet wird, gebunden oder nicht gebunden an einen Lipidrest, und zum anderen Teil aus den Peptiden SALSA-1 oder SALSA-2 oder dem Antigen SALSA, gebunden oder nicht gebunden an einen Lipidrest.
Alle Polypeptidmoleküle, auf die die obige Definition zutrifft, und die mindestens 70 % Homologie mit den Polypeptiden LSA-3, CT1, NRI, NRII oder 729RE aufweisen, können in homologer oder heterologer Weise mit anderen Peptidsequenzen oder Sequenzen kombiniert werden, die aus einem anderen Antigen von verschiedenen Stadien von P. falciparum stammen.
Unter 70 % Homologie der Sequenzen wird verstanden, dass es sich um eine Sequenzhomologie handelt im Vergleich mit einem beliebigen der Isolate, deren Sequenz bekannt oder geeignet ist, bekannt zu sein, und nicht insgesamt mit der Gesamtheit der Isolate. Tatsächlich weist die repetitive Zentralregion von LSA-3 (Abschnitt 2 von 4) eine variable Zahl von repetitiven Sequenzen auf, die für eine Variabilität von einem Isolat zum anderen verantwortlich sind, wie dies schon anderweitig die Darstellung der 4 zeigt, in der die Längendifferenz zwischen den repetitiven Teilen von Abschnitt 2 der Isolate T9/96 und K1 offensichtlich ist, obwohl die Tetrapeptide, die diese repetitive Region bilden (VEES, VEEN, VEEI, VAPS, VAPT, etc....) sehr stark konserviert sind. Dagegen sind die repetitiven Sequenzen von Abschnitt 1 perfekt zwischen den beiden Isolaten konserviert. Auch wenn die intrinsische Variabilität dieses zweiten Abschnitts von einem Isolat zum anderen berücksichtigt wird, versteht sich die Definition von 70 % Homologie für das Antigen LSA-3 der verschiedenen Isolate unter Ausschluss der repetitiven Sequenzen von Abschnitt 2.
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf polyklonale oder monoklonale Antikörper, die die Polypeptidmoleküle der Erfindung spezifisch erkennen.
Diese Moleküle der Erfindung können für den Einsatz von Diagnostizierverfahren und der Herstellung von Zusammensetzungen („trousses") benutzt werden, die das Vorhandensein einer Infektion mit P. falciparum nachzuweisen erlauben; dieses Verfahren kann entweder eine Dosierung („dosage") von spezifischen zirkulierenden Antikörpern durch den Einsatz von klassischen serologischen Verfahren durch den Kontakt eines der oben genannten Antigene mit einer biologischen Flüssigkeit des fraglichen Individuums sein, oder Verfahren zur Antigen-Dosierungen („dosage") durch die Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, erhalten durch klassische Verfahren zum Erhalt solcher Antikörper durch die korrespondierenden Antigene. In den diagnostischen Vorrichtungen oder Kits der Erfindung sind Reagenzien vorhanden, die den Nachweis von auftretenden Antigen/Antikörper-Komplexen erlauben, und gleichermaßen einen Marker tragen oder fähig sein können, ihrerseits durch ein markiertes Reagenz erkannt zu werden. Soweit man wünscht, einen Antigentest oder einen serologischen Test durchzuführen, umfasst der Kit sowohl die Antikörper als auch die Antigene der Erfindung.
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf alle Nukleotidsequenzen, die für ein Polypeptid der Erfindung kodieren, sowie auf alle rekombinanten Nukleinsäuren, die mindestens eine Nukleotidsequenz der Erfindung enthalten, inseriert in eine gegenüber der besagten Nukleotidsequenz heterologe Nukleinsäure.
Teil der Erfindung sind die Nukleinsäuresequenzen, die für LSA-3 oder seine immunogenen Fragmente kodieren, und unter eine der folgenden Definitionen fallen:

(a) die Abfolge der Nukleotide so wie dargestellt in SEQ ID Nr. 1 von 1, oder
(b) die Abfolge der Nukleotide dargestellt in SEQ ID Nr. 2 von 2,
(c) eine Abfolge, die mindestens 70 % Homologie mit der von 1 oder der von 2 aufweist, oder
(d) eine Abfolge von Nukleotiden komplementär zu denen dargestellt in (a), (b) oder (c).

Unter kodierend für LSA-3 versteht man sowohl das Gen dargestellt in SEQ ID Nr. 1 von 1 als auch die cDNA dargestellt in SEQ ID Nr. 2 von 2.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante Nukleinsäure, in der der Nukleotidsequenz der Erfindung ein Promotor vorausgeht (insbesondere ein induzierbarer Promotor), unter dessen Kontrolle die Transkription der besagten Sequenz ausgeführt werden kann und der gegebenenfalls eine für Terminationssignale der Transkription kodierende Sequenz folgt.
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf die aus Klon T9/96 stammende kodierende Sequenz, dargestellt in 3 durch SEQ ID Nr. 3.
In dieser Sequenz ist das Fragment CT1 enthalten zwischen den Nukleotiden 67 und 126, das Fragment 679 beginnt bei Nukleotid 206 und das Fragment 729RE ist enthalten zwischen den Nukleotiden 547 und 630.
Die Erfindung erstreckt sich schließlich auf jeden rekombinanten Vektor, benutzt besonders für die Klonierung einer Nukleotidsequenz der Erfindung, und/oder für die Expression des durch diese Sequenz kodierten Polypeptids, und gekennzeichnet dadurch, dass er eine rekombinante Nukleinsäure enthält, wie weiter oben definiert, in einer seiner für seine Replikation nicht essentiellen Stellen.
Als Beispiel eines solchen oben erwähnten Vektors werden Plasmide, Cosmide, Phagen oder Viren angeführt.
Diesbezüglich betrifft die Erfindung insbesondere das Plasmid pK1.2., das bei der CNCM [Collection Nationale De Culture De Microorganismes, Institut Pasteur, Paris] unter der Nummer I-1573 hinterlegt wurde.
Ziel der Erfindung ist gleichermaßen ein Herstellungsverfahren für ein Polypeptid der Erfindung durch Transformation eines zellulären Wirts mithilfe eines rekombinanten Vektors des oben angegebenen Typs, gefolgt von der Kultivierung des solchermaßen transformierten zellulären Wirts, und der Gewinnung des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Auf diese Weise betrifft die Erfindung alle zellulären Wirte, die durch einen solchen wie den oben definierten rekombinanten Vektor transformiert wurden, und der Regulationselemente enthält, die die Expression der für ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodierenden Nukleotidsequenz erlauben.
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf Primer aus DNA (oder aus RNA), die im Rahmen der Synthese von Nukleotidsequenzen und/oder Polypeptidsequenzen der Erfindung benützt werden können, durch die PCR-Technik (Polymerase-Kettenreaktion) oder jede andere heutzutage bekannte Methode, um Nukleinsäuren zu amplifzieren, so wie LCR, CPR, ERA, SPA, NASBA, etc....
Die Erfindung betrifft jeden Primer aus DNA oder RNA, gekennzeichnet dadurch, dass er aus etwa 10 bis 25 Nukleotiden gebildet ist, identisch oder komplementär zu den ersten 10 bis 25 Nukleotiden der für eine Peptidsequenz gemäß der Erfindung kodierenden Nukleotidsequenz, oder identisch zu den 10 bis 25 letzten Nukleotiden der besagten Sequenz.
Auf diese Weise erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Herstellungsverfahren eines Polypeptids der Erfindung, das die folgenden Schritte umfasst: Gegebenenfalls die vorherige Amplifikation durch klassische Techniken der Menge an Nukleotidsequenzen, die für das besagte Polypeptid kodieren, mithilfe von zwei DNA-Primern, die auf geeignete Weise ausgewählt wurden,

– Kultivieren, in einem geeigneten Kulturmedium, eines zellulären Wirts, der vorher durch einen Vektor transformiert wurde, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung enthält, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für das besagte Polypeptid kodiert, und
– Gewinnen, ausgehend von oben genanntem Kulturmedium, des durch den besagten transformierten zellulären Wirt hergestellten Polypeptids.

Als Beispiele für DNA- oder RNA-Primer gemäß der Erfindung werden die folgenden Sequenzpaare angeführt:
S1: GTGATGAACTTTTTAATGAATTATTAAA (SEQ ID Nr. 4)
S2: TGTTGTTCTTGTTGAACACTTTTTACTAA (SEQ ID Nr. 5)
von denen die jeweiligen Positionen auf dem Gen LSA-3/K1 dargestellt in 1 von 695 bis 722 und von 829 bis 799 sind (in umgekehrter Leserichtung), oder das Paar:
6.1: GGTATCGAAACTGAGGAAATAAAGG (SEQ ID Nr. 6)
6.2: CATAGCAGGAACATCAACATCCAC (SEQ ID Nr. 7)
von denen die jeweiligen Positionen 2668 bis 2692 sind für 6.1. und 3456 bis 3433 für 6.2. (umgekehrte Leserichtung).
Die Informationen über die Sequenzen ID-Nr. 4, ID-Nr. 5, ID-Nr. 6 und ID-Nr. 7 sind am Ende der Beschreibung genauer ausgeführt.
Die Peptide der Erfindung können gleichermaßen durch klassische Peptidsynthese-Techniken hergestellt werden. Diese Synthese kann in homogener Lösung oder an der Festphase durchgeführt werden. Zum Beispiel kann auf die Technik der Synthese in homogener Lösung zurückgegriffen werden, die durch HOUBENWEYL beschrieben wird in dem Werk betitelt „Methode der organischen Chemie" (herausgegeben durch E. Wunsch, Bd. 15-I und II. THIEME, Stuttgart 1974, oder der beschrieben durch R.D. MERRIFIELD in dem Artikel mit dem Titel „Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45 2149–2154).
Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf wasserlösliche Oligomere der oben gezeigten Peptidmonomere.
Die Oligomerisierung kann eine Zunahme der Immunogenizität der Peptidmonomere gemäß der Erfindung hervorrufen. Ohne dass eine solche Zahlenangabe als limitierend betrachtet werden soll, wird dennoch erwähnt, dass solche Oligomere zum Beispiel 2 bis 10 Monomereinheiten enthalten können.
Um die Oligomerisierung durchzuführen, kann man auf jede geläufige Polymerisationstechnik zurückgreifen, die auf dem Gebiet der Peptide benutzt wird, diese Polymerisation wird durchgeführt bis zum Erhalt eines Oligomers oder Polymers, das die Zahl der Monomermotive enthält, die für den Erhalt der gewünschten Immunogenizität erforderlich ist.
Ein Verfahren zur Oligomerisierung oder der Polymerisierung eines Monomers besteht aus der Reaktion desselben mit einem Agens zur Vernetzung wie zum Beispiel Glutaraldehyd.
Man kann gleichermaßen auf andere Oligomisierungsverfahren oder Kopplungsverfahren zurückgreifen, z.B. auf solche, die aufeinander folgende Kopplungen von Monomereinheiten verwenden, durch die Vermittlung ihrer terminalen Carboxyl- und Aminogruppen in Gegenwart eines homo- oder heterobifunktionellen Kupplungsreagenz.
Die Erfindung betrifft auch Konjugate, die durch kovalente Kupplung der Peptide gemäß der Erfindung (oder der oben genannten Oligomere) an Trägermoleküle erhalten werden, die insbesondere erlauben, die (natürliche oder synthetische) Immunogenizität zu erhöhen, auf physiologisch verträgliche und nicht toxische Weise, durch die Vermittlung von komplementären reaktiven Gruppen, die vom Trägermolekül beziehungsweise dem Peptid getragen werden. Als Beispiel für Trägermoleküle oder makromolekulare Trägerstoffe, die in der Zusammensetzung der Konjugate gemäß der Erfindung beteiligt sind, werden natürliche Proteine erwähnt, solche wie das Tetanusanatoxin, Ovalbumin, Serumalbumine, Hämozyamine, das PPD von Tuberkulinen (PPD: „Gereinigtes Proteinderivat"), etc....
Als synthetische makromolekulare Trägerstoffe werden zum Beispiel Polylysine oder Poly(D-L-Alanin)-Poly(L-Lysine) genannt.
Als Kohlenwasserstoff- oder Lipidträgermaterialien werden gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, und bevorzugt diese mit C 16 oder C 18 vom Oleyl- oder Palmitoleyltyp, genannt.
Schließlich, und ohne einschränkend zu sein, können die Antigene oder Peptide gemäß der Erfindung an klassische Trägerstoffe gekoppelt oder an solche Trägersubstanzen adsorbiert sein, insbesondere Mikrosphären oder Latexkugeln oder Polystyrenkugeln, oder inkorporiert in Tyl-Teilchen.
Um die Konjugate gemäß der Erfindung zu synthetisieren, kann man auf für sich bekannte Verfahren zurückgreifen, solche wie das durch Frantz und Robertson in Infect. and Immunity, 33, 193–198 (1981) beschriebene, oder wie das beschrieben in Applied and Environmental Microbiology, (Oktober 1981), vol. 42, Nr. 4, 611–614 durch P.E. Kauffman, in dem man das Peptid und ein geeignetes Trägermolekül benutzt.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können entweder durch ein chemisches Verfahren oder durch andere Verfahren hergestellt werden.
Ein geeigneter Herstellungsweg von Nukleinsäuren der Erfindung, die maximal 200 Nukleotide (oder 200 bp, wenn es sich um doppelsträngige Nukleinsäuren handelt) enthalten, umfasst die folgenden Schritte:

– DNA-Synthese unter Verwendung des automatisierten Verfahrens von β-Cyanethylphosphoramidit, beschrieben in Bioorganic Chemistry 4; 274–325 (1986),
– Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor und die Gewinnung der Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.

Eine Herstellungsweise, auf chemischem Weg, von Nukleinsäuren einer Länge von größer als 200 Nukleotiden wurde schon in WO 92/13884 beschrieben.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen diagnostische Zusammensetzungen („trousses"), die einen oder mehrere Primer zur spezifischen Amplifikation des Gens LSA-3 enthalten und erlauben, die Gegenwart des Gens oder der mRNA bei einem Individuum, das empfänglich ist, von P. falciparum infiziert zu werden, zu detektieren.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf pharmazeutische- oder Impfstoffzusammensetzungen, in denen sich mindestens eines der Produkte gemäß der Erfindung befindet, assoziiert an pharmazeutisch geeignete Hilfsstoffe, fest oder flüssig, angepasst zur Herstellung von Oralen-, Augen- oder Nasen-Verabreichungsformen, oder an Hilfsstoffe, die zur Herstellung von einer rektalen Verabreichungsform angepasst wurden, oder weiter mit gelatinösen Hilfsstoffen für die vaginale Verabreichung. Sie betrifft auch flüssige isotonische Zusammensetzungen, die mindestens eines der Konjugate gemäß der Erfindung enthalten, angepasst zur Verabreichung auf die Schleimhaut insbesondere der Augen oder Nasen oder Lungen.
Vorteilhafterweise enthalten die Impfstoffzusammensetzungen gemäß der Erfindung darüber hinaus einen Träger so wie Polyvinyl-Pyrrolidon, das die Verabreichung des Impfstoffes erleichtert. Anstelle von Polyvinyl-Pyrrolidon kann man jeglichen anderen Typ von Adjuvans im klassischen Sinne, den dieser Ausdruck früher hatte, benutzen, das heißt eine Substanz, die die erleichterte Absorption eines Medikaments erlaubt oder seine Wirkung im Organismus erleichtert. Als Beispiel für weitere Adjuvantien dieses letzteren Typs werden noch einmal Carboxymethyl-Zellulose, Hydroxide und Alluminiumphosphate, Saponine oder jegliche andere Adjuvantien dieses Typs erwähnt, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Schließlich enthalten sie bei Bedarf ein immunologisches Adjuvans, besonders vom Typ des Muramylpeptids.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktive Substanz mindestens einen der vorher definierten polyklonalen oder monoklonahlen Antikörper enthalten, in Assoziation an einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums, das empfänglich dafür ist, durch P.falciparum infiziert zu werden, durch Injektion eines peptidischen oder oligomerischen Moleküls so wie vorangehend beschrieben, allein oder in Assoziation mit anderen Molekültypen, die geeignet sind, das besagte Individuum gegen eine zukünftige Infektion zu schützen, das polypeptidische oder antigenische Molekül oder die natürlichen oder rekombinanten Lipopeptide werden entweder allein benutzt oder absorbiert oder gekoppelt an Mikrosphären oder Kugeln aus Latex oder Polystyren.
Zusätzliche Eigenschaften der Erfindung werden noch in den Beispielen erscheinen, illustriert durch die Zeichnungen, die folgen und die speziellen Eigenschaften der Moleküle der Erfindung im Vergleich zu anderen Antigenen des präerythrozytären Parasitenstadiums zeigen.
1 zeigt die Sequenz ID Nr. 1 der genomischen DNA der 6152 Basenpaaren des Gens LSA-3, sie wurde erhalten aus Klon K1.2, der selbst aus einem thailändischen Isolat erhalten wurde.
2 zeigt die Sequenz ID Nr. 2 der cDNA und die Polypeptidsequenz des Antigens LSA-3. Die DNA-Sequenz zeigt 5361 Basenpaare.
3 zeigt die Sequenz ID Nr. 3 des sequenzierten Teils im Parasitenklon T9/96 (1890 Basenpaare), die obere Zeile ist die Nukleotidsequenz und die untere Zeile die Peptidsequenz. In diesem Klon ist die Sequenz CT1 enthalten zwischen den Nukleotiden 67 und 126, das Fragment DG 679 beginnt genauer gesagt bei Nukleotid 207. Das Fragment 729 RE ist enthalten zwischen den Nukleotiden 547 und 629.
4a zeigt schematisch die relativen Positionen der repetitiven und nicht-repetitiven Sequenzen, der Introns und der Exons in den Stämmen K1 und T9/96, die Klone 679 und 729 waren aus dem letzteren hervorgegangen.
4b zeigt den HCP (Hydrophobic Cluster Plot) der Peptidsequenz von Klon DG729.
5 zeigt die Mengen an Immunglobulinen, die im Serum des Schimpansen Nuria erzeugt wurden, vor und nach der Immunisierung durch verschiedene Peptide von LSA-3.
6 zeigt den spezifischen Antikörpertiter von verschiedenen Mäusestämmen, die entweder mit einem Peptid oder mit einem korrespondierenden Lipopeptid immunisiert wurden.
7 zeigt die Hemmung der Invasion von Leberzellen durch Sporozoiten durch hyperimmune Seren, die nach Immunisierung durch verschiedene, gegen ganzes LSA-3 immuno-gereinigte Peptide erhalten wurden.
8 zeigt den Vergleich eines aus LSA-3 hervorgegangen Antigens mit zwei anderen Antigenen über die Immunität des Typs T.
9 zeigt die Induktion von Inteferon-γ bei den Schimpansen Gerda und Dirk durch Peptide hervorgegangen aus dem Molekül LSA-3.
10 zeigt die Ergebnisse der Lymphoproliferation des PBMC eines Individuums, das durch Injektion von bestrahlten Sporozoiten gegen Peptide, hervorgegangen aus den Antigenen LSA-1 und LSA-3, geschützt war.
Beispiel 1: Klonierung und Sequenzierung des Gens LSA-3
1) Sequenzierung
Das anfängliche Durchsuchen der Genbibliothek, die aus dem Parasitenklon T9/96 hervorgegangen war, mit dem Serum eines Missionars, der dauerhaft mit Prophylaxe behandelt worden war, erlaubte uns, 120 Klone zu isolieren, die verschiedenen, im Sporozoitenstadium und/oder Leberstadium des Zyklus von P. falciparum exprimierten Molekülen entsprachen. Der Klon 7295 war als Sonde verwendet worden, um eine Genbibliothek des schon weiter oben zitierten thailändischen Stamms K1 zu durchsuchen, die große Eco-R1-Fragmente in den Phagen Lambda gt10 kloniert enthält. Ein Insert von 6,85 Kilobasen, das das ganze Gen enthält, wurde aus dieser Genbibliothek gereinigt und zur Sequenzierung und Charakterisierung in ein pUC18-Plasmid weiter kloniert. Bei P. falciparum, bei dem das Genom sehr reich an den Basen A:T (80 %) ist, wird dieses Vorgehen oft durch die Seltenheit von verwendbaren Schnittstellen erschwert und durch die Instabilität oder sogar Unmöglichkeit, bestimmte Fragmente zu klonieren, wenn sie in Plasmidvektoren inseriert sind.
Die Struktur des Gens wird gezeigt in 4 und zeigt die folgenden Eigenschaften:

a) ein Mini-Exon 1, das an seinem 3'-Ende für ein hydrophobes Signalpeptid kodiert;
b) ein kurzes Intron (168 Basenpaare), enthalten zwischen Consensus-Stellen von Splicing-Donoren und Akzeptoren;
c) ein zweites Exon von fünf Kilobasen, das für eine organisierte Region von 1,8 Kilobasen kodiert und aus einer Anordnung von 7 Abschnitten aus 4 Aminosäuren zusammengesetzt ist, und einer hydrophoben Region im 3', die einem Anker vom Glucosyl-Phosphatidyl-Inositol-Typ (GPI) entsprechen könnte.

Eine genauere Untersuchung des Polymorphismus von LSA-3 wurde durch die Sequenzierung des Klons 679 durchgeführt, der den Hauptteil der repetitiven Sequenzen des Gens LSA-3 enthält, und einen Teil von einer Kilobase des nicht-repetitiven Anteils im 3', die Sequenz dieses Fragments wird gezeigt in der 3 zwischen den Nukleotiden 207 und 1890.
Die Wiederholungen im Stamm K1 sind die folgenden:
Die Wiederholungen im Klon T9/96, so wie sie in der Patentanmeldung Nr. FR 9101286 vom 5. Februar 1991 bestimmt wurden, sind die folgenden:
Das Exon 2 des Gens LSA-3 enthält zwei repetitive Regionen, die in drei Abschnitte aufgeteilt werden können wie in 4 gezeigt:

– Abschnitt 1, der für eine Abfolge von 14 Tetrapeptiden kodiert. Dieser Abschnitt ist zu 100 % in Aminosäuren und in Nukleinsäuren zwischen T9/96 und K1 konserviert. Einzig die Tetrapeptide VEES und VEEN finden sich in Abschnitt 2 wieder.
– Abschnitt 2 kodiert in K1 für 127 Tetrapeptide, die einer Abfolge von verschiedenen Octapeptiden entsprechen, diese selbst gebildet durch Kombination von zwei der sieben Tetrapeptide oder Basismotive (VEES, VVES, VEEN, VEEI, VAEN, VAPS, VAPT). Die Zahl der Wiederholungen und die Anordnung dieser Octapeptide variieren je nach Motiv und scheinen spezifisch für den Klon K1.2 zu sein. Tatsächlich entspricht im Klon T9/96 der Abschnitt 2 (53 Tetrapeptide) gleichermaßen einer Abfolge von Octapeptiden, die aus den 7 gleichen Basis-Tetrapeptiden gebildet werden (und aus einem 8. Motiv VVPS, das nicht in K1 existiert), aber mit einer unterschiedlichen Anzahl und Anordnung dieser Wiederholungen.
– Abschnitt 3 besteht aus einer Abfolge von 10 degenerierten Tetrapeptiden und verschieden von denen der Abschnitte 1 und 2. Dieser Abschnitt wurde einzig im Stamm K1 sequenziert. Allerdings zeigen vorläufige Ergebnisse, die durch PCR mit dem Klon T9/96 erhalten wurden, und mehrere andere Laborstämme, dass es keinen Größenpolymorphismus in dieser Region gibt.

Die nicht-repetitiven Regionen des Exons 2 sind besonders gut konserviert. Tatsächlich konnte der Sequenzvergleich zwischen T9/96 und K1 zwischen 315 bp im 5' von Abschnitt 1 und zwischen 763 bp im 3' von Abschnitt 2 gemacht werden. Die Homologie ist 99,4 % in Nukleinsäuren und 98,6 % in Aminosäuren.
Der Vergleich der Sequenzen des Klons 679, der aus dem Klon P. falcinarum T9/96 hervorgegangen ist, und der entsprechenden Sequenz von LSA-3, hervorgegangen aus dem Isolat K1, zeigt, dass das Gen stark konserviert ist, wobei die deutlichsten Unterschiede in der repetitiven Region beobachtet werden, wo die Abschnitte der vier Aminosäuren stark konserviert sind, aber in ihrer Zahl und ihrer Organisation variieren.
Im Gegensatz dazu erscheinen die nicht-repetitiven 5'- und 3'-Teile als besonders stark konserviert, wobei sie bis zu 100 % Homologie in der 5'-Region zeigen, wo schon B-Epitope und T-Epitope identifiziert wurden.
DNA-Amplifikationen, insbesondere durch PCR von verschiedenen Stämmen von P. falciparum mit 8 über das gesamte Gen LSA-3 verteilten Primer-Paaren, konnten zeigen, dass ausgenommen mit denen, die die repetitiven Regionen umgeben, das ganze Genom PCR-Produkte einer ähnlichen Größe ergibt, was andeutet, dass das Antigen LSA-3 stark konserviert ist.
Verschiedene in den repetitiven und nicht-repetitiven Regionen ausgesuchte LSA-3-Sonden wurden mit schwacher Stringenz mit DNA von verschiedenen Spezies von Plasmodium hybridisiert, und erlaubten es nicht, ein homologes Gen zu LSA-3 zu identifizieren, außer beim Schimpansenparasiten P.reichenowi, was die nahe Verwandtschaft dieser Spezies mit P.falciparum bestätigt.
Auf überraschende Weise scheint das zu LSA-3 analoge, in P.voelii gefundene Antigen, das klar Kreuzreaktionen an der Oberfläche des Sporozoiten mit Antikörpern gegen das Fragment 7295 ergibt, nicht auf der Stufe der Nukleotidsequenz konserviert zu sein. Schließlich offenbarte der Vergleich der LSA-3 Sequenzen mit Datenbanken keine Homologie mit bekannten Molekülen, mit Ausnahme der repetitiven Region, in der bestimmte Motive eine starke Analogie mit Repetitionen eines Gens von Staphilococus xylosis zeigen, aber auch mit zwei Antigenen von P.falciparum, RESA und Pf11.1, alle beide im Laufe des Blutstadiums des Parasiten exprimiert. Diese Homologie ist im Wesentlichen durch den Reichtum an "glu-glu"-Sequenzen dieser Antigene und der Repetitionen von LSA-3 begründet.
2) Klonierung:
Das Insert DG729 und andere Regionen des Exons 2 des Stamms K1 wurden in einen prokaryotischen Expressionsvektor pGEX kloniert, ein Vektor, der durch die Firma In Vitrogene Corp (San Diego USA) verkauft wird. Dieser Vektor erzeugt eine Proteinfusion mit Glutathion-S-Transferase (GST) von Schistosoma mansoni, und erlaubt eine leichte Reinigung von rekombinanten Proteinen durch Affinität an Glutathion-Agarosekugeln. Die Peptide der Expression ausgehend aus diesen Vektoren werden genannt:

– für das gesamte Protein LSA-3: Protein REC,
– oder für das Fragment 729S: 729PGEX

Die Klonierungsversuche von anderen Fragmenten, insbesondere dem Fragment 1–5 3NSREP, 3NFREP, 5NR und 5SNREP ergaben Schwierigkeiten bezüglich entweder der Klonierung oder der Herstellung und Reinigung der Proteine in für Immunisationsexperimente ausreichender Menge.
Allein die Fragmente 729, NN und 3PC erlaubten, die betreffenden rekombinanten Polypeptide in ausreichender Menge zur Analyse der Antigenizität des Moleküls herzustellen und zu reinigen.
Beispiel 2: Schutz von immunisierten Schimpansen gegen Probeninjektionen mit schwacher oder starker Dosis:

2.1. Ein Schimpanse Dirk, vorher immunisiert durch eine Fraktion von LSA-3 in Kombination mit einem anderen Antigen desselben Entwicklungsstadiums des Parasiten, und der die weiter oben unter Punkt a) beschriebenen Wirkungen zeigt, wurde einige Jahre später reimmunisiert durch Peptide und rekombinante Proteine, die derselben Kombination von Antigenen entsprachen. Dieser Schimpanse erwies sich aufs neue geschützt gegen eine Infektion durch eine Probe mit schwacher Dosis (2.10⁴ Sporozoiten), dann gegen eine Infektion mit einer Probe von starker Dosis (5.10⁶ Sporozoiten). Wie im Lauf der ersten Challenge beobachtet man eine bedeutende Erniedrigung der Zahl der Schizonten, die in der Leber nach der Challenge mit starker Dosis nachgewiesen werden, sowie ein lympho-monozytäres Infiltrat um die wenigen nachweisbaren Schizonten herum (Zeugnis einer lokalen Abwehr).
2.2. Teilweiser Schutz des Schimpansen Gerda: ein anderer Schimpanse wurde einzig durch das Antigen LSA-3 immunisiert (das in den nachfolgenden Beispielen 7 und 8 beschriebene Tier), nämlich das Lipopeptid NR2, dann die rekombinanten Proteine (GST-729, GST-NN, GST-3PC), die zu dritt 95% des Moleküls LSA-3 abdecken, und an Latex-Mikrosphären adsorbiert sind. Dieses Tier erweist sich als teilweise geschützt gegen eine Infektion mit einer Probe von starker Dosis (8.10⁶ Sporozoiten), da es eine sehr schwache Blutparasitämie zeigt und eine Erniedrigung der Zahl der Leberschizonten von 90% im Vergleich mit der im Anschluss an die Infektion der Probe folgenden Kontrolle.
2.3. Teilweiser Schutz des Schimpansen Nuria: ein Schimpanse, der durch eine Fraktion des Antigens LSA-3 alleine immunisiert wurde, nämlich einer Kombination von Peptiden, Lipopeptiden und dann rekombinanten Proteinen entsprechend 95% des Moleküls LSA-3 und in einer Emulsion in Monatid ISA-51 (SEPPIC, 75 Quai d'Orsay, Frankreich), erwies sich als teilweise geschützt gegen eine Infektion mit einer Probe von mittlerer Dosis (1.10⁵ Sporozoiten). Tatsächlich zeigt dieses Tier eine signifikante Verzögerung des Erscheinens der Parasiten im Blut im Vergleich mit vier Vergleichen (durch die prä-erythrocytären Antigene LSA-1, SALSA oder STARP immunisierte Schimpansen, und einem nicht-immunisierten Vergleichstier), eine schwächere maximale Blutparasitämie und einen schnelleren Abfall der Parasitämie (24 Stunden statt 3 Tage), Ergebnisse, die eine starke Erniedrigung der Zahl der Leberformen anzeigen, die bei diesem Tier durch Probeninfektion induziert wurden und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen sind, die bei Gerda erhalten wurden. In diesem Fall wurde eine Untersuchung der Leberformen nicht durchgeführt.
2.4. Immunogenizität B, T bei den Schimpansen Demi, Karlien und Iris: drei durch die Peptide LSA-3-NR1 und -RE und die Lipopeptide NR2 und -CT1, sowie durch Peptide, die bei jedem Tier einem anderen prä-erythrocytären Antigen entsprachen (LSA-1, SALSA oder STARP), immunisierte Schimpansen, zeigen alle drei: – erhöhte humorale Antworten gegen die B-Epitope, die auf den Peptiden NR1, NR2 und RE vorhanden sind. Die Antikörper erkennen nicht nur die Peptide und die Rekombinanten, sondern sind auch stark positiv gegen native Moleküle des Parasiten, was durch Immunfluoreszenz gegen die Sporozoiten und die Leberstadien von Plasmodium falciparum beurteilt wird (aber negativ gegenüber erythrocytären Stadien); – erhöhte lymphoproliferative und spezifische Antworten gegen die 4 Peptide LSA-3, sowie die nativen T-Epitope, die auf der Oberfläche der Sporozoiten von Plasmodium falciparum und von Plasmodium voelii vorhanden sind, bei dem LSA-3 ein Homolog besitzt (noch nicht charakterisiert). Die B-und T-Antworten gegenüber den nativen Antigenen sind ein wichtiger Punkt, da: a) sie die gute Beispielhaftigkeit der synthetischen Moleküle beweisen; b) sie zeigen, dass es im Moment der Infektion gute Chancen gibt, eine sekundäre anamnetische Antwort zu erhalten; dies ist eine Tatsache, die beim Schimpansen Nuria im Moment der Challenge beobachtet wurde. Die Bedeutung dieser Beobachtung wird bestärkt durch die Tatsache, dass dieselbe sekundäre Antwort nicht gegenüber anderen Antigenen, wie LSA-1 und STARP erhalten wurde.
2.5. Immunogenizität beim Aotus: ein Nachtaffe (Aotus trivirgatus), immunisiert durch die 2 Peptide LSA-3-NR1 und -RE und die 2 Lipopeptide -NR2 und -CT1, dann nochmals stimuliert durch die rekombinanten Proteine, die 95% des Moleküls LSA-3 entsprechen und wie weiter oben beschrieben an Mikrosphären adsorbiert sind, zeigt erhöhte lymphoproliferative und spezifische Antworten gegen die T-Epitope, die auf denselben Peptiden vorhanden sind. Was die in vivo Antwort der verschiedenen so prä-immunisierten Schimpansen betrifft, unterstreichen die Ergebnisse die herausragende Immunogenizität (B und T) von LSA-3, in Peptidform, Lipopeptidform und rekombinanter Form, und in allen Tiermodellen, die bis jetzt getestet wurden, sowohl 6/6 Schimpansen (outbred), 1/1 Aotus, und bei allen immunisierten Mäusen (>20). Wir bemerken, dass die Ergebnisse der lipopeptidischen Formulierungen (die beim Menschen benutzt werden können) durch subkutane Injektionen in Abwesenheit jegliches Adjuvans erhalten wurden.

Beispiel 3: Identifizierung des CTL Epitops
Die Methode, die benutzt wurde, um die CTL zu identifizieren, ist die, die in Fidock et al. (1994), J. Immunol. 153: 190 oder in Bottius et al., (1996), J. Immunol 156: 2874–2884 beschrieben wurde.
CTL-Epitope (für cytotoxische T-Lymphozyten) wurden in den Peptiden NR2, RE und CT1 identifiziert, dank Cytotoxizitätstests, die ausgehend von den PBMC der weiter oben beschriebenen Schimpansen Dirk, Gerda, Nuria, Demi, Karlien und Iris ausgeführt wurden.
Beim Menschen konnten 8 zusätzliche CTL Epitope nachgewiesen werden, davon 7 in der nicht-repetitiven 3'-Region gelegen, ausgehend von den PBMC von Individuen, die zu 3 verschiedenen Haplotypen gehören (MHC-Klasse 1-A2, -B8 und -B53) und die im endemischen Gebiet (Gambia) leben (nicht publizierte Ergebnisse). Zusätzlich bewies die Sequenzierung von 2 durch B53 begrenzten CTL-Epitopen eine perfekte Konservierung ihrer Nukleotid- und Peptidsequenzen in verschiedenen Stämmen aus Kenia und Gambia.
Insgesamt haben wir 11 CTL-Epitope im Molekül LSA-3 identifiziert, was beträchtlich ist. Außerdem haben 5 Schimpansen/6 CTL-Antworten gegen das Peptid NR2 nach Immunisation durch das Lipopeptid NR2 ohne Adjuvans entwickelt, was ein bemerkenswertes Ergebnis für nicht-blutsverwandte Tiere ist. Auf der anderen Seite kann man vermuten, sofern die Antikörper, die durch Nuria entwickelt wurden, keine inhibitorische Aktivität gegen die Invasion von Sporozoiten von Plasmodium falciparum zeigten, dass der beobachtete Schutz von zellulären Antworten, insbesondere von den CTL, abhing.
Beispiel 4: Vergleich der Antikörpertiter vor oder nach Immunisierung durch verschiedene Peptide

4.1 Vergleich der durch verschiedene Peptide hervorgerufenen Antikörperantworten in verschiedenen immunisierten Tieren. Das verwendete Verfahren ist das in Behr et al., (1992), J. Immunol. 149: 3321 beschriebene. Die Reaktivität wird ausgedrückt als Elisa-Verhältnis, d.h. die optische Dichte des Serums gemessen bei 496 Nanometern nach der Immunisierung verglichen mit der optischen Dichte desselben Serums vor der Immunisierung. Die erste Spalte zeigt das immunisierte Tier, die zweite Spalte das Immunogen, das das Tier erhielt, die dritte Spalte zeigt die Zahl der durchgeführten Injektionen, sowie das Trägermaterial, das das injizierte Peptid begleitet: RP bedeutet rekombinantes Protein, RP/B bedeutet rekombinantes Protein adsorbiert an Latexkugeln, P bedeutet Peptid und LP Lipopeptid. Man muss des Weiteren genauer ausführen, dass die Lipopeptide in physiologischem Serum injiziert wurden, die Peptide und die rekombinanten Proteine adsorbiert an Latexkugeln oder in einer Emulsion mit einem Montanide ISA-51-Adjuvans.
4.2. Erhaltene Antikörpertiter: Tabelle 2 zeigt die Antikörpertiter der bei den Schimpansen erhaltenen Seren durch Immunfluoreszenz gegen die nativen Antigene, die auf der Oberfläche der verschiedenen Stadien (Sporozoiten, Leber und Blut) von P. falciparum, P. voelii und P. berghei vorhanden sind.
4.3. Lymphoproliferative Antwort der PBMC der verschiedenen Schimpansen nach in vitro-Stimulation entweder durch verschiedene Peptide oder durch auf der Oberfläche der Sporozoiten vorhandene native Antigene. Diese Antwort wurde durch Inkorporation von Tritium-markiertem Thymidin in die PBMC (periphere Blutzellen) gemessen, entweder nach Stimulation durch die LSA-3 Peptide (Tabelle III) oder nach in vitro Stimulation mit Sporozoiten (Tabelle IV).

Die lymphoproliferativen Antworten werden als Differenz in der Anzahl der Ereignisse pro Minute (Δ CPM) zwischen der Zahl der erhaltenen Ereignisse in Gegenwart des Antigens, verringert um die Zahl der Ereignisse in Abwesenheit des Antigens, angezeigt. Die Zahlen in Klammern zeigen die Stimulationsindizes, d.h. das Verhältnis der Zahl der erhaltenen Ereignisse in Gegenwart von Antigenen geteilt durch die Zahl der erhaltenen Ereignisse in Abwesenheit von Antigenen. Die Ergebnisse werden als positiv angesehen, wenn der Δ CPM größer als 1000 ist und wenn der Stimulationsindex größer als 3 ist.
4.4. Vergleich der Antikörperantworten des Schimpansen Nuria vor und nach Immunisierung durch verschiedene Peptide. 5 zeigt die Mengen an Immunglobulinen, die im Serum der Schimpansen Nuria vor und nach Immunisierung durch die Peptide 729NR1 und 729RE und die Lipopeptide 729NR2 und CT1 vorhanden sind. Dieses Experiment zeigt die Überlegenheit des Antigens R bezüglich der B-Immunität, vor Allem, wenn es an einen Lipidrest konjugiert ist. 6 zeigt, dass der Spiegel an spezifischen durch Elisa gemessenen Antikörpern gegen das Peptid 729NR2 in entweder mit dem Peptid 729 NRII oder dem Lipopeptid 729NRII immunisierten Mäusen klar erhöht ist, wenn das Lipopeptid verwendet wird, egal bei welcher Art von Mäusen.

Beispiel 5: Lymphoproliferation der PBMC eines Individuums das durch Infektion von bestrahlten Sporozoiten gegen aus den Antigenen LSA-1 und LSA-3 hervorgegangene Peptide geschützt wurde.
Bei acht menschlichen durch Injektion von bestrahlten Sporozoiten immunisierten Freiwilligen, wurden anti-LSA-3-Antikörper bei jedem der vier Individuen gefunden, die gegen eine Infektion durch Sporozoiten resistent waren; keine bei den vier anderen Freiwilligen, die eine Blutinfektion entwickelt hatten.
Zusätzlich wurden beim einzigen dieser vier geschützten Individuen, bei dem die Zellen zugänglich waren, die PBMC sechs Monate nach Infektion der Probe entnommen und in Gegenwart von aus den Antigenen LSA-1 und LSA-3 hervorgegangenen Peptiden, inkubiert.
10 zeigt die Ergebnisse der Lymphoproliferationen der PBMC eines durch Injektion von bestrahlten Sporozoiten geschützten Individuums gegen aus den Antigenen LSA-1 und LSA-3 hervorgegangene Peptide.
Beträchtliche Lymphoproliferationen wurden mit jedem der drei Peptide LSA-3 (NR1, NR2 und RE) beobachtet, aber mit keinem der Peptide LSA-1. Es bestand ein besonders erhöhter Sekretionsgrad von IFN-γ (100 IE/ml) nach Stimulation durch das Peptid NR1 und, in geringerem Ausmaß, durch das Peptid NR2 (IFN-γ: das Cytokin, das die stärkste hemmende Wirkung gegen Leberschizogonie besitzt).
Beispiel 6: Wirkung der Antikörper gegen die Peptide von LSA-3 auf die Hemmung des Eindringens der Sporozoiten bei der Maus.
Die Techniken, die verwendet wurden, um Hepatozyten-Primärkulturen herzustellen, die Sporozoiten, die Antikörper und der indirekte Fluoreszenztest sind im Detail durch S.MELLOUK et al., Bulleting of the World Health Organization, 68: 52–59, 1990 beschrieben. Die nachfolgende Tabelle V vergleicht die erhaltenen Ergebnisse als Immunfluoreszenz entweder durch Antikörper gegen das Fragment 679 oder durch gegen aus anderen Peptiden stammenden Fragmente erhaltene Antikörper. Die linke Spalte zeigt die Zahl der Schizonten, nachgewiesen nach 48h Kultur in Hepatozyten der durch P.voelii infizierten Maus Balb c, und die rechte Spalte zeigt dieselben Meßgrößen nach Infektion durch P.Berghei.
Tabelle V:
Es ist deutlich gezeigt, dass der Antikörper gegen das Peptid 679 eine fast vollständige Inhibitorwirkung gegen die Zahl dessen hat, was sie bei 48h in den Leberzellen beobachteten. Auf die selbe Weise zeigt 7 die Hemmung der Invasion von Leberzellen durch Sporozoiten durch hyper-immune Seren, erhalten nach Immunisierung durch verschiedene Peptide und immunogereinigt gegen das ganze LSA-3.
Was den Schutz von Mäusen betrifft, wurden die besten Ergebnisse durch Immunisierung mit den Rekombinanten oder erfindungsgemäß hergestellten Antigenen erhalten, adsorbiert an Latex- oder Polystyren- Mikrosphären eines Durchmessers von 0,5 μm:

– 3/3 der Mäuse sind gegen eine Verabreichung von 10-mal der minimalen infektiösen Dosis geschützt
– 3/3 der Mäuse sind gegen die zweite Challenge geschützt
– 2/3 der Mäuse sind gegen die dritte Challenge geschützt.

Die benutzten Mikrosphären sind die Polybead © Polystyren-Mikrosphären (Polysciences, Inc.) mit einem Durchmesser von 0,5 μm (Ref. 07307), auf denen die Rekombinanten oder die Peptide passiv adsorbiert sind. Praktisch werden bei der Maus für eine Injektion 50 μg Antigen mit 50 μl Mikrokugeln in Kontakt gebracht; die genaue Menge an adsorbierten Antigenen wird nicht bestimmt. Beim Schimpansen wird dasselbe Verfahren mit 200 μg Antigen und 200 μl Kugeln durchgeführt.
Außerdem erlaubte kürzlich die Immunisierung von Mäusen durch das rekombinante GST-3PC (entsprechend der nicht-repetitiven 3'-Region von Aminosäure Nr. 869 bis zum Stopkodon am 3'), Seren zu erhalten, die sehr stark in der Immunfluoreszenz gegen die Sporozoiten von Plasmodium falciparum reagieren. Dieses Ergebnis ist der erste Nachweis des Vorhandenseins eines oder mehrerer B-Epitope in dieser Region des Moleküls.
Beispiel 7: Cytotoxizitätstest gegen das Peptid 729 NRII beim Schimpansen Gerda
Der Schimpanse Gerda wurde auf intravenösem Weg mit dem aus dem Antigen LSA-3 hervorgegangen Lipopeptid 729NRII immunisiert. Das Blut wurde 9 Tage nach der vierten Injektion entnommen. Die PBMC wurden in vitro mit 5 μg/ml des Peptid 729NRII (Zusatz von rekombinantem IL2, 10 U/ml am dritten Tag) inkubiert. Am 15. Tag wurde die cytotoxische Aktivität gegen die autologen Blasten untersucht, die durch PHA von 0,5 μg/ml erzeugt wurden. Die Blasten wurden die Nacht über mit 5 μg/ml des Peptids 729NRII und mit einem Kontrollpeptid vorinkubiert: das RESA, oder ohne Peptid. Die Peptide werden nicht während des Tests (8 Stunden) zugesetzt. Die Anzahl der Ziele pro Loch ist 5000.
Die PMBC von Gerda, die während derselben Zeitspanne mit 5 μg/ml eines Kontrollpeptids oder dem Peptid 729NRI inkubiert wurden (hervorgegangen aus demselben Antigen), verursachten keine Lyse der autologen Blasten, die mit den oben genannten Peptiden vorinkubiert oder nicht vorinkubiert wurden.
8 zeigt die Ergebnisse, die für ein Verhältnis E/C (Effektor durch Ziel), variierend von 12 bis 0,03 erhalten wurden. Man sieht, dass die durch das Peptid 729NRII präsensibilisierten Zielzellen in Gegenwart von Effektorzellen lysiert werden, was eine für dieses Antigen spezifische cytotoxische Immunantwort vom T-Typ anzeigt.
Das Lipopeptid NRII, injiziert auf intravenösem Weg, ist fähig, ohne Adjuvans eine spezifische cytotoxische Antwort zu induzieren.
Beispiel 8: Wirkung des Peptids NRI auf die Herstellung von Interferon γ.
Es war gezeigt worden, dass die Interferone eine Inhibitorwirkung in der Entwicklung von P.falciparum in menschlichen Hepatozyten in Kultur hatten (Sylvie Mellouk et al., The Journal of Immunology, vol 139 Nr. 12: 41–92, 41–95, 1987). Die mit den Peptiden der Erfindung erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:
Der Schimpanse Gerda, immunisiert durch das Polypeptid NR2 und geboostet durch das rekombinante DG729, trägt PBMC, die fähig sind, erhöhte Raten an IFN-γ in Gegenwart der Peptide LSA-3, im besonderen des Peptids 729 NR1, zu sekretieren. Das Ergebnis wurde beim Schimpansen Dirk bestätigt, der durch dasselbe Protein immunisiert wurde. Der Schimpanse BRAM, nicht immunisierte Kontrolle, zeigt kein Blutinterferon gegen die Peptide LSA-3.

Claims

Polpeptidmoleküle, enthaltend wenigstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren der in der 2 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die folgenden Polypeptide ausgenommen sind:
Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens 20 aufeinander folgende Aminosäuren der besagten Sequenz enthalten.
Moleküle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens 50 aufeinander folgende Aminosäuren der besagten Sequenz enthalten.
Polypeptidmolekül, das wenigstens 70 % Homologie mit einem der Moleküle eines beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 aufweist.
Polypeptidmolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens 70 % Homologie mit der folgenden Sequenz aufweist: Leu Leu Ser Asn Ile Glu Glu Pro Lys Glu Asn Ile Ile Asp Asn Leu Leu Asn Asn Ile (CT1).
Polypeptidmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens 70 % Homologie mit der in der 3 dargestellten Sequenz aufweist.
Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ein Polypeptidmolekül nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 und wenigstens einen pharmazeutischen Träger enthält.
Anti-Malaria-Impfstoffzusammensetzung, enthaltend unter anderen immunogenen Wirkstoffen ein Polypeptidmolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter anderem ein Molekül enthält, das wenigstens ein Epitop enthält und von der aus den Molekülen LSA-1, SALSA oder STARP bestehenden Gruppe abstammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens zwei Immunogene enthält, das erste, das unter den folgenden Polypeptiden ausgewählt ist: – dem der 2, – NRI, – NRII, und das zweite, das aus der Gruppe, bestehend aus SALSA, SALSA 1 und SALSA 2, ausgewählt ist.
Anti-Malaria-Impfstoffzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens zwei Immunogene enthält, das erste, das unter den folgenden Polypeptiden ausgewählt ist: – dem der 2, – NRI, – NRII, und das zweite, das aus der Gruppe, bestehend aus SALSA, SALSA 1 und SALSA 2, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polypeptid der 2 enthält.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch die Polypeptidmoleküle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 erkennen.
Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Malaria bei einem Individuum, das empfänglich dafür ist, von P. falciparum infiziert zu werden, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines Gewebes oder einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Individuum entnommen wurden, mit einem Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unter Bedingungen, die eine Immunreaktion zwischen dem besagten Polypeptidmolekül und den möglicherweise in dem Gewebe oder der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Antikörpern erlauben, und den in-vitro-Nachweis von möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexen.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe oder die biologische Flüssigkeit mit einem Gemisch von Polypeptidmolekülen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und anderen Molekülen, die von Antigenen des Sporozoitenstadium, die LSA-1, SALSA oder STARP sind, abstammen, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Malaria bei einem Individuum, das empfänglich dafür ist, von P. falciparum infiziert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass es das In-Kontakt-Bringen eines Gewebes oder einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Individuum entnommen wurden, mit Antikörpern gemäß Anspruch 13 unter Bedingungen, die eine Immunreaktion in-vitro zwischen den besagten Antikörpern und den möglicherweise in dem biologischen Gewebe vorhandenen, für P. falciparum spezifischen Proteinen erlauben, und den in-vitro-Nachweis von möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexen umfasst.
Kit für die in-vitro-Diagnose von Malaria nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eines oder mehrere Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die Reagenzien für die Bildung des günstigen Milieus für die Reaktion, die Reagenzien, die den Nachweis von durch die Immunreaktion gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexen erlauben, umfasst, wobei diese Reagenzien in gleicher Weise eine Markierung tragen oder geeignet sein können, ihrerseits von einem markierten Reagens erkannt zu werden, insbesondere falls das oben genannte Polypeptidmolekül nicht markiert ist.
Kit für die in-vitro-Diagnose von Malaria, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Antikörper nach Anspruch 13, – die Reagenzien für die Bildung des günstigen Milieus für die Durchführung der Immunreaktion, – die Reagenzien, die den Nachweis von durch die Immunreaktion gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexen erlauben, wobei diese Reagenzien in gleicher Weise eine Markierung tragen oder geeignet sein können, ihrerseits von einem markierten Reagens erkannt zu werden, insbesondere falls die oben genannten Antikörper nicht markiert sind.
Verwendung eines Polypeptidmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Anti-Malaria-Impfstoffs.
Verwendung eines oder mehrerer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13 für die Herstellung eines zur Behandlung der Malaria bestimmten Medikaments.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als aktive Substanz einen oder mehrere polyklonale oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 13 gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium.
Nukleinsäuresequenz, gekennzeichnet durch eine der folgenden Sequenzen: (a) die wie in SEQ ID NR. 1 der 1 gezeigte Nukleotidkette, oder (b) die in SEQ ID NR. 2 der 2 gezeigte Nukleotidkette, (c) eine Kette, die wenigstens 70 % Homologie mit derjenigen der 1 oder der 2 zeigt, oder (d) eine Kette komplementärer Nukleotide zu den in (a), (b) oder (c) dargestellten.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, enthaltend eine für ein Polypeptidmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodierende Sequenz.
Rekombinanter Vektor für das Klonieren einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 22 oder 23 und/oder die Expression eines von der oben genannten Sequenz kodierten Polypeptids, der die besagte Sequenz in einer der für seine Replikation nicht essentiellen Stellen enthält, wobei der besagte Vektor insbesondere vom Typ Plasmid, Cosmid oder Phage ist.
Vektor nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass er ein bei der CNCM unter der Nr. I-1573 hinterlegtes und mit pK1.2 bezeichnetes Plasmid ist.
Konjugate, bestehend aus Polypeptidmolekülen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 und einem Träger, auf dem die besagten Moleküle adsorbiert sind.
Konjugate nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus Mikrosphären oder Kügelchen aus Latex oder aus Polystyrol besteht.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 26 oder 27 für die Herstellung einer für die Immunisierung von Individuen, die mit Malaria infiziert sind oder empfänglich dafür sind, mit Malaria infiziert zu werden, bestimmten Zusammensetzung.