KR101035111B1

KR101035111B1 - 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 면역학적 측정방법 및이에 사용되는 측정 수단

Info

Publication number: KR101035111B1
Application number: KR1020040049985A
Authority: KR
Inventors: 손미진; 유승범; 김연철; 오재훈; 김은경; 추승호
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2011-05-19
Also published as: BRPI0511454A; AU2005260377A1; CN101014858A; KR20060000985A; WO2006004332A1; ZA200608959B; US20090197347A1

Abstract

본 발명은 말라리아 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 면역학적 측정방법 및 이에 사용되는 측정수단에 관한 것으로, 말라리아 원충 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)의 특이 항원과 항체를 함께 고정체에 고정시키고, 대상 객체로부터 얻은 검체를 상기 고정체에 가하여 항원과 이에 특이적인 항체반응을 유도한 후, 별도로 준비한 상기 항원과 표지체의 접합체 및 상기 항체와 표지체의 접합체를 첨가하여, 상기 접합체들 중의 적어도 하나의 결합을 유도함으로써, 상기 검체 중의 상기 특이 항원 및/또는 항체에 결합된 접합체 중의 표지체에 의해, 상기 특이 항원 및/또는 항체의 존재 유무를 측정하는 방법, 및 상기 고정체와 접합체들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 측정수단을 제공한다.

본 발명에 따르면, 말라리아 현증 환자뿐만 아니라 보균자까지도 특이적으로 검출할 수 있고, 종래의 기술로는 검출하기 힘든 감염 초기의 검체에 대해서도 매우 효율적으로 사용될 수 있다. 또한, 전혈이 아닌 혈청, 혈장 등을 사용할 수 있으므로, 혈액 스크리닝과 같은 대량 검사에도 매우 적합한 형태로 사용될 수 있다.

Description

말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 면역학적 측정방법 및 이에 사용되는 측정 수단 {Immunoassay for Plasmodium falciparum and means used therefor}

도 1a 및 1b는 pET15fx-HSP70의 플라스미드 지도 및 HSP70의 아미노산 서열이다;

도 2a 및 2b는 pET15fx-MSP19의 플라스미드 지도 및 MSP19의 아미노산 서열이다;

도 3a 및 3b는 pET15fx-GBP130의 플라스미드 지도 및 GBP130의 아미노산 서열이다;

도 4a 및 4b는 pET15fx-HRPⅡ의 플라스미드 지도 및 HRPⅡ의 아미노산 서열이다;

도 5는 실험예 1에서 정상인과 말라리아 플라스모듐 팔시파룸 환자 검체에 대해 본 발명에 따른 방법으로 말라리아 플라스모듐 팔리파룸의 특이 항체 및 항원을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다;

도 6은 비교예 1에서 정상인과 말라리아 플라스모듐 팔시파룸 환자 검체에 대해 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항체를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다;

도 7은 비교예 2에서 정상인과 말라리아 플라스모듐 팔시파룸 환자 검체에 대해 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 말라리아 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 면역학적 측정방법 및 이에 사용되는 측정수단에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 열자극 단백질 70(Heat-shock protein 70), 메로조이트 표면 단백질(Merozoit surface protein), 글리코포린 결합 단백질 130(Glycophorin binding protein 130) 등의 말라리아 원충 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과, 히스티딘 풍부 단백질 Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ) 등을 항원으로 하여 제조한 특이 항체를 함께 고정체에 고정시키고, 대상 객체로부터 얻은 검체를 상기 고정체에 가하여 항원과 이에 특이적인 항체반응을 유도한 후, 별도로 준비한 상기 항원과 표지체의 접합체 및 상기 항체와 표지체의 접합체를 첨가하여, 상기 접합체들 중의 적어도 하나의 결합을 유도함으로써, 상기 검체 중의 상기 특이 항원 및/또는 항체에 결합된 접합체 중의 표지체에 의해, 상기 특이 항원 및/또는 항체의 존재 유무를 측정하는 방법, 및 상기 고정체와 접합체들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 측정수단을 제공한다.

말라리아는 모기를 매개로 하여 말라리아의 원충이 인간의 적혈구 내에 감염되어 발생하는 질병으로서, 전세계 10 억명의 인구가 말라리아 위험지역에 거주하고 있으며, 매년 5 억명 이상이 말라리아에 감염되고 2 백만명 이상이 목숨을 잃는 심각한 질병중의 하나이다. 말라리아는 전 세계적인 분포를 보이고 있으나, 일부 지역에서는 효과적인 방제로 인하여 1960년대 이후 발생이 중지되거나 감소되었다. 그러나, 최근의 엘리뇨 현상과 같은 이상 기온 및 약제 내성 균주의 증가, 살충제에 대한 저항성 증가 등으로 인해 전 세계적으로 다시 확산되고 있는 추세이다.

말라리아 포자낭충에는 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아(Plasmodium malariae) 및 플라스모듐 오발(Plasmodium ovale) 등 4 종류가 알려져 있다. 그 중, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)은 가장 독성이 강해 감염된 환자들 중 상당수가 사망하게 되는 무서운 병원체이다. 그럼에도 불구하고, 현재까지 민감도와 특이도가 좋고 혈액 스크리닝에 적합한 진단시약이 개발되지 못하고 있고, 따라서 현미경 관찰에 의한 혈액도말법이 많이 사용되고 있는 실정이다.

현재 개발된 플라스모듐 팔시파룸의 진단시약 중, 항원 진단시약은 HRPⅡ(Histidine-rich protein Ⅱ)나 LDH(Lactate Dehydrogenase)에 대한 항체를 이용하여 말라리아 특이 항원을 측정하는 효소면역학적 측정이다. 이 방법은 말라리아 원충을 직접 검사할 수 있다는 장점이 있지만, 민감도가 혈액도말법보다 좋지않아 원충 수가 적은 상태의 환자나 잠복기에 있는 환자를 효과적으로 검출하지 못 하는 단점이 있다. 또한, 현재 사용되고 있는 항원 진단시약 중, 일부는 적혈구 내의 원충을 검출하도록 되어있어 검체로서 혈청이나 혈장을 사용할 수 없다. 따라서, 별도로 적혈구를 파괴시키는 단계가 포함되어야 하므로, 혈액 스크리닝 등의 검사에 적합하지 못한 단점을 가지고 있다.

플라스모듐 팔시파룸 항체 진단시약의 경우, 말라리아 원충이 아닌 항체를 검출하는 방법이므로 원충 수가 매우 적은 잠복기 상태의 환자도 검출할 수 있다는 장점이 있으나, 감염 후 항체가 생성되기 이전의 윈도우 기간이 존재하여 감염 초기 환자에 대한 정확한 진단이 어렵다는 단점이 있다. 또한 현재 개발된 플라스모듐 팔시파룸 항체 진단시약은 주로 원충 배양을 통해 얻어진 세포 파쇄액을 그대로 사용하여 간접효소면역학적 측정방법(indirect enzyme immunoassay)을 사용하여 특이도 및 민감도가 좋지 않다고 알려져 있다(Vox Sanguinis, 1999;77:237-238). 한편, 플라스모듐 팔시파룸에 대한 항체 진단을 위한 마커 개발에 많은 노력을 하고 있으나, 아직까지 항체 진단에 유용한 표지 항원들이 많이 알려져 있지 않은 실정이다.

따라서, 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 목적은, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 특이 항원과 특이 항체를 동시에 사용하여 대상 객체로부터 얻은 혈 장, 혈청, 체액 등의 검체에 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원 및/또는 특이 항체의 존재 여부를 측정하는 면역학적 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 측정방법은 종래의 측정방법에 비하여 민감도 및 특이도가 높아 말라리아 환자 뿐만 아니라 말라리아 보균자의 진단이 가능하며, 혈장, 혈청 등의 검체를 사용하므로 혈액 스크리닝을 포함한 말라리아 플라스모듐 팔시파룸 진단에 매우 유용하게 응용될 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 면역학적 측정방법에 사용될 수 있는 측정 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 측정 수단은 간단한 구성에도 불구하고 플라스모듐 팔시파룸의 감염 여부를 확인하기 위한 진단 시약, 진단 키트 등으로 구현될 수 있다.

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 면역학적 측정방법은, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원 및 항체를 함께 고정체에 고정시키고, 대상 객체로부터 얻은 검체를 상기 고정체에 가하여 항원과 이에 특이적인 항체반응을 유도한 후, 별도로 준비한 상기 항원과 표지체의 접합체("항원-표지체 접합체") 및 상기 항체와 표지체의 접합체("항체-표지체 접합체")를 첨가하여, 상기 접합체들 중의 적어도 하나의 결합을 유도함으로써, 상기 검체 중의 상기 특이 항원 및/또는 항체에 결합된 접합체 중의 표지체에 의해, 상기 특이 항원 및/또는 항체의 존재 유무를 측정하는 것을 포함하는 것으로 구성되어 있다.

따라서, 본 발명은 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과 항체를 함께 사용하여 검체에 항원만이 존재하거나 또는 항체만이 존재하더라도 그것을 확인할 수 있다. 이러한 방법은 종래기술에는 전혀 개시 내지 제안되지 않은 신규한 방법으로서, 특이 항원만을 사용하는 방법과 특이 항체만을 사용하는 방법의 단순한 조합을 넘어서 당업자가 예측하지 못한 상승적인 효과를 제공하고 있음이 본 발명자들에 의해 수행된 실험 등을 통해 확인되었다. 그에 관한 구체적인 내용은 이후 실시예(실험예 및 비교예 포함)에서 설명한다.

말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 상기 특이 항원은, 바람직하게는, 플라스모듐 팔시파룸의 열자극 단백질 70(Heat-shock protein 70, HSP 70), 메로조이트 표면 단백질(Merozoit surface protein, MSP), 및 글리코포린 결합 단백질 130(Glycophorin binding protein 130, GBP 130)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 항원일 수 있다.

플라스모듐 팔시파룸의 상기 특이 항체는, 바람직하게는, 항-히스티딘 풍부 단백질 Ⅱ(Anti-Histidine-rich protein Ⅱ, Anti-HRPⅡ)일 수 있으며, 이는 예를 들어 동물에서 유래된 다클론 항체 또는 단클론 항체나 유전자 재조합 방법으로부터 유래되는 항체일 수 있다.

특히 바람직하게는, 상기 특이 항원으로서 HSP 70, MSP 및 GBP 130을 함께 사용하고 상기 특이 항체로서 Anti-HRP Ⅱ를 사용하다.

본 발명에서는, 하기의 실시예에서, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 환자의 적혈구에서 RNA를 분리한 후 유전자 재조합 기술을 이용하여 HSP 70, MSP, GBP 130 및 HRPⅡ 항원의 cDNA를 각각 제작하고 이를 형질전환된 대장균에서 배양 및 분리, 정제하여 상기 항원들을 얻었다. 또한, 상기 HRPⅡ에 특이적으로 반응하는 항체인Anti-HRPⅡ은 상기 항원을 면역 보조제와 함께 토끼에 주사하여 항 HRPⅡ 혈청인 다클론 항체를 분리하였고 이를 정제하여 순수 항체 부분만을 분리하여 상기 Anti-HRPⅡ를 얻었다. 그러나, 이는 본 발명의 하나의 예시적인 방법이며, 기타 다양한 방법에 의해 상기 항원 및 항체들을 준비할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과 특이 항체를 각각 고정체에 고정하는 방법은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있는데, 예를 들어, 이들 특이 항원 및 항체를 고정체에 가하여 부착시킨 다음, 소 혈청 알부민을 포함하는 블록킹제(blocking agent)를 재차 가하여 고정을 행할 수 있다.

본 발명의 측정방법에 사용되는 고정체는, 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과 특이 항체가 안정적으로 고정될 수 있으면서 동시에 기타 부반응을 유발하지 않는 고형 물질로서, 예를 들어, 유리, 합성수지, 반합성수지 또는 금속 소재의 용기, 맴브레인, 입상물 등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 폴리스티렌 재질의 합성수지 웰 플레이트, 니트로셀룰로우즈 또는 나일론 재질의 맴브레인, 유리, 금 입자가 증착된 입상형태 등을 들 수 있다.

항원-표지체 접합체와 항체-표지체 접합체 중의 표지체는 검체 중에 존재하는 항원 및/또는 항체와 결합한 상기 접합체의 존재를 확인할 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase: HRP), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 항원-표지제 접합체와 항체-표지체 접합체를 제조하는 하나의 예가 하기의 실시예에 기재되어 있지만, 당업자라면 그 이외에 다양한 제조방법을 또한 인식할 수 있을 것이다.

상기 접합체가 대상 검체 중의 항원 및/또는 항체와 결합하였는지 여부는, 예를 들어, 상기 접합체 중의 표지체에 의한 분해되는 기질을 첨가하여 상기 기질의 분해 여부를 측정하는 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 발색을 유도하는 크로마젠(chromagen)으로 사용될 수 있는 효소인 HRP(horseradish peroxidase) 등이 항원 또는 항체에 결합되어(labeled) 있는 형태의 결합제가 사용되는 경우에, 상기 HRP에 의해 분해되는 기질을 첨가하여 HRP에 의해 분해되는 기질의 발색에 의해 상기 접합체가 대상 검체 중의 항체 및/또는 항원과 결합하였는지 여부를 확인할 수 있다. 그러한 분해 기질의 예로는 테트라메틸 벤지딘(tetrametyl benzidine) 등을 들 수 있지만, 그것만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 측정방법에서의 상기 검체는, 검사 대상 객체가 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 의해 감염되었을 때, 그것의 특이 항원 및/또는 항체가 존재할 수 있는 것으로서, 예를 들어, 혈액, 분뇨 및/또는 타액으로부터 분리한 혈청, 혈장 및 체액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 그 중 바람직하게는 혈청 또는 혈장이 사용된다.

본 발명은 또한 상기 방법을 수행할 수 있는 측정 수단에 관한 것으로서, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과 특이 항체를 표면에 고정시킨 고정체, 및 항원-표지체 접합체와 항체-표지체 접합체를 포함하는 것으로 구성되어 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "측정 수단"은, 앞서 설명한 바와 같이, 대상 객체로부터 얻은 검체내에 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원 및/또는 항체가 존재하는지 여부를 확인할 수 있는 측정용(또는 진단용) 키트, 시약 등의 함축적인 표현이다. 따라서, 본 발명의 측정 수단은 필요에 따라 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 진단 키트, 진단 시약 등으로 달리 표현될 수도 있다.

경우에 따라서는, 상기 접합체 중의 표지체가 HRP(horseradish peroxidase) 등인 경우에 상기 HRP에 의해 분해되는 테트라메틸 벤지딘 등의 발색제를 더 포함할 수 있다. 또한, HRP에 의해 분해된 발색제를 확인할 수 있는 흡광기와 같은 측정기기를 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상술하지만, 본 발명의 범주가 그것으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 재조합 말라리아 항원의 제작 및 발현

말라리아 플라스모듐 팔시파룸 양성혈액에서 RNA를 분리하기 위하여 TRI reagent^TM(Sigma, Cat. No. T9424)를 사용하였다. 분리 방법은 시약 제작사가 제시 하는 방법을 사용하였으며, 하기와 같은 방법으로 진행하였다.

말라리아 양성 혈액 0.1 ㎖에 TRI reagent^TM(Sigma, Cat. No. T9424) 0.1 ㎖을 혼합하고, 상온에서 5 분간 반응시켰다. 상기 용액에 BCP(1-bromo-3-chloropropane) 20 ㎕를 혼합하고 상온에서 5 분간 반응시킨 후, 4℃/12,000 rpm 조건에서 15 분간 원심분리를 하였다. 원심분리하면 3개의 층이 형성되는데, 이 중 RNA를 포함하고 있는 상층의 용액을 새 튜브로 옮기고, 여기에 이소프로판올 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 5 분간 방치하였다. 4℃/12,000 rpm 조건에서 10 분간 원심분리하고 상층액은 버렸다. 침전물은 75% 에탄올로 씻은 후 증류수 20 ㎕에 녹여서 사용하였다.

상기에서 정제한 RNA 9 ㎕와 제작한 N6 random primer(Genotech) 1 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5 분간 반응시킨 뒤 얼음으로 옮겼다. 위 용액에 RT buffer 4 ㎕, 0.1 M DTT 2 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, Rtase(Gibco) 1 ㎕, RT inhibitor(Promega) 1 ㎕, 및 D.W. 1 ㎕를 넣고, 42℃에서 1 시간 동안 반응시킨 뒤, 70℃에서 10 분간 반응시켜 cDNA를 만들었다.

cDNA 합성은 ThermoScript^TM RT-PCR System(Invitrogen, Cat No. 11146-024)를 사용하였다. 위에서 정제한 RNA 5 ㎕, random-hexamer 1 ㎕, 10 mM dNTP mix 2 ㎕, 및 DEPC-treated water 4 ㎕를 혼합하여, 65℃에서 5 분간 반응시킨 뒤 얼음으로 옮겼다. 상기 용액에 5x cDNA synthesis Buffer 4 ㎕, 0.1M DTT 1 ㎕, RNaseOUT^TM 1 ㎕, DEPC-treated water 1 ㎕, 및 ThermoScript^TM RT 1 ㎕를 넣고, 25 ℃에서 10 분 반응시킨 후, 50℃에서 50 분간 반응시킨 다음, 85℃에서 5 분간 방치하여 반응을 종료시켰다. 그런 다음, 1 ㎕의 RNase H를 넣고, 37℃에서 20 분간 방치하여 반응되지 않은 RNA를 제거하였다. 이렇게 합성된 cDNA는 -20℃에 보관하여 필요시 사용하였다.

또한, PCR을 수행하기 위하여 하기 4 개의 항원들에 대해 다음과 같이 primer를 제작하였다.

(1) HSP 70

Pf-HSP70-NdeI (forward):

5'-GGATCCCATATGGCTAGTGCAAAAGGTTC-3' (SEQ ID NO: 1)

Pf-HSP70-XhoI (reverse):

5'-GGATCCCTCGAGTTAATCAACTTCTTCAACTGTTGG-3' (SEQ ID NO: 2)

HSP70-SphI-5' (forward):

5'-AATGGTAAAGAAGCATGCAGATCAATTAAC-3' (SEQ ID NO: 3)

HSP70-SphI-3' (reverse):

5'-GTTAATTGATCTGCATGCTTCTTTACCATT-3' (SEQ ID NO: 4)

(2) GBP130

Pf-GBP130-NdeI (forward):

5'-GATTATCATATGAGAGAAAGCAGAATTTTAGC-3' (SEQ ID NO: 5)

Pf-G130BamHI-5' (forward):

5'-AGAGAATATGCCGCGGATCCAGAATATCGT-3' (SEQ ID NO: 6)

Pf-G130BamHI-3' (reverse):

5'-ACGATATTCTGGATCCGCGGCATATTCTCT-3' (SEQ ID NO: 7)

Pf-GBP130-XhoI (reverse):

5'-GGATCCCTCGAGTTATGCTTCGTTATTATCAGC-3' (SEQ ID NO: 8)

(3) MSP

Pf-MSP19-NdeI (forward):

5'-GCAACACATATGGCAGTAACTCCTTCCGTAATTGA-3' (SEQ ID NO: 9)

Pf-MSP19-XhoI (reverse):

5'-GTGTTGCTCGAGTTATAACATACCTTGCAAGTTTCC-3' (SEQ ID NO: 10)

(4) HRPⅡ

Pf-HRPⅡ-NdeI (forward):

5'-TTGTTACATATGAGCAAAAATGCAAAAGGACTT-3' (SEQ ID NO: 11)

Pf-HRPⅡ-XhoI (reverse):

5'-ATAAATCTCGAGTTAATGGCGTAGGCAATGTGT-3' (SEQ ID NO: 12)

합성한 cDNA를 주형으로 하고 상기의 primer를 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 Thermopol buffer 10 ㎕, 10 mM dNTP 2 ㎕, 5 primer 2 ㎕, 3 primer 2 ㎕, DNA template 2 ㎕, D.W. 81 ㎕, Vent DNA Polymerase (NEB, Cat. No. M0254L) 1 ㎕를 넣고 95℃에서 2 분 방치 후, 95℃ 40 초, 55℃ 30 초, 72℃ 2 분의 반응을 40 회(cycle) 반복한 뒤, 72℃에서 10 분간 방치하는 것으로 수행하였다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel에서 전기 영동을 실시하여 확인하였다.

PCR 반응물을 Power Gel Extraction Kit(BioProgen, Cat. No. 23103)를 이용하여 분리한 후, 아미노기 말단 DNA 절편을 EcoR V 제한효소로 자른 pBluescript Ⅱ KS+(Stratagene, Cat. No. 212207)에 T4 DNA ligase 를 이용하여 ligation하고 이를 E. coli HB101에 형질전환시켰다. 카르복실기 말단의 경우에는 PCR 반응물을 정제 후 중합효소인 Taq polymerase를 넣고 72℃에서 10 분간 반응시킨 후, 이를 Power Gel Extraction Kit를 이용하여 분리하고, 이를 pGEM-T Easy vector(Promega, Cat. No. A1360)에 ligation 하여 이를 E. coli HB101에 형질전환시켰다. 각각의 Vector와 insert를 제한효소 Sph I과 Xho I를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 자른 후, 이 둘을 T4 DNA ligase를 이용하여 ligation하여 E. coli HB101에 형질전환시켰다. 이것을 히스티딘 아미노산 서열이 반복적으로(conserved Histidine residues) tagging 되어있는 pET-15b(Novagen, Cat. No. 69661-1)를 변형시킨 pET15fx에 제한효소인 Nde I과 Sal I으로 자른 후, T4 DNA ligase를 이용하여 ligation 시킨 재조합 발현 벡터를 얻었다. 제조된 발현벡터를 염화칼슘 방법으로 대장균 BL21(DE3)(Novagen, Cat. No. 69387-3)에 형질전환시켰다. 이들 유전자를 함유한 발현 벡터들은 각각 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4와 같은 아미노산 서열(SEQ ID NOS: 13 ~ 16)을 가지고 있다.

실시예 2: 대장균 형질전환체로부터 발현된 말라리아 항원의 정제

실시예 1에서 제조된 형질전환체 대장균을 항생제인 암피실린(100 ㎍/㎖)과 클로람페니콜(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액 50 ㎖을 다시 1 L LB 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 정도 배양한 후, OD 600에서 0.3의 흡광을 나타낼 때까지 배양시키고, 최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside)를 첨가하고 7 시간 더 배양하였다. 배양한 배양액을 원심분리하여 세포만을 분리한 후, 분리된 세포를 인산염 완충용액 30 ㎖에 현탁시켜 초음파 파쇄기(Sonicator; Sonifier 450, Branson)를 사용하여 파쇄한 다음, 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 대장균 형질전환체로부터 발현된 HSP 70 단백질의 일부는 상등액에, 나머지는 원심분리한 침전물에 각각 존재하므로, 상등액과 침전물을 따로 모은 후 전기영동을 통하여 희망 단백질의 위치를 확인하고, 그 중 침전물은 8 M 요소(Urea) 완충용액(10 mM 트리스 pH 8.0, 0.5 M 염화나트륨, 8 M 요소)에 완전히 현탁시킨 후, 다시 원심분리하여 상등액만을 모았다.

대장균 형질전환체로부터 발현된 HSP 70, MSP, GBP 130 및 HRPⅡ를 정제하기 위하여, 상기 단백질의 N-말단에 표지된 히스티딘 잔기를 이용하여 프로본드 칼럼(Invitrogen)에 흡착시켰다. 최초의 세포 파쇄액의 상등액에 대해서는 평형완충용액으로 10 mM 트리스(pH 7.5), 0.5 M 염화나트륨, 및 5 mM 이미다졸(imidazole)을 사용하였고, 8 M 요소에 용해시킨 두번째 상등액에 대해서 는 6 M 요소가 추가된 평형완충용액을 사용하여 칼럼에 흡착시켰고 흡착되지 않은 불순물은 20 mM 이미다졸이 포함된 완충용액으로 제거하였다. 칼럼에 흡착되어있는 표면 단백질은 최초 상등액에 대해서 1M 이미다졸이 포함된 평형완충용액과 8M 요소로 용해시킨 상등액에 대해 0.3 M 이미다졸이 용해된 평형완충용액으로 용출(elution)시켜 분리하였다.

실시예 3: Anti-HRPⅡ 항체의 생산 및 정제

실시예 2에서 정제된 항원 HRPⅡ와 면역보조제 혼합액(Sigma사, Complete Freund Adjuvant)을 3 주 간격으로 3 회씩 토끼에 근육주사 한 후, 토끼로부터 혈액을 모아 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청에 45% 황산암모늄을 가하여 항체를 침전시킨 후 12,000 rpm에서 40 분간 원심분리하였다. 침전물을 인산염 완충용액으로 용해시킨 후 Protein G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

실시예 4: 항원 및 항체 접합체의 제조

실시예 1의 방법에 의해 분리ㅇ정제된 재조합 MSP, HSP 70 및 GBP 130 항원을 각각 4℃에서 1 : 200 이상의 부피비가 되도록 1 L의 0.01 M 탄산 소다 완충용액(sodium carbonate buffer, pH 9.6)을 사용하여 2 일간 상기 완충용액을 3 회 교환해 주면서 투석하였다. 또한, 상기 MSP, HSP 70, GBP 130 및 Anti-HRPⅡ에 접합될 HRP(horseradish peroxidase)의 활성화를 위해 2 ㎖의 증류수에 2 ㎎ HRP를 용 해시킨 후, 100 ㎕의 42 ㎎/㎖ 요오드산 나트륨(NaIO₄)을 상기 HRP 용액에 첨가하여 호일로 튜브를 감싼 상태에서 상온에서 30 분간 흔들면서 반응시켜 HRP를 산화시켰다. HRP가 충분히 산화되었을 때, 1 M 글리세롤 60 ㎕를 상기 반응용액에 첨가한 후 튜브를 호일로 감싼 상태에서 상온에서 30 분간 흔들면서 반응시켜 산화반응을 종결시켰다.

HRP와 각각의 MSP, HSP 70, GBP 130, 및 Anti-HRPⅡ의 접합반응을 위하여, 상기 HRP 반응용액을 0.01 M 탄산소다 완충용액(pH 9.6)에 대해 투석시켜 염을 제거하였다. 이렇게 산화된 HRP 반응용액 0.5 ㎖에 상기의 MSP, HSP 70, GBP 130, 및 Anti-HRPⅡ 용액을 각각 첨가한 후, 튜브를 호일로 감싼 상태에서 상온에서 하룻밤 동안 흔들면서 반응시켜 MSP-HRP, HSP 70-HRP, GBP 130-HRP 및 Anti-HRPⅡ-HRP 접합체를 각각 제조하였다. HRP와 각 항원 및 항체와의 접합반응이 종결된 후 항원 및 항체-HRP 접합체를 안정화시키기 위하여, 40.8 ㎕의 4 ㎎/㎖ NaBH₄를 첨가하여 튜브를 호일로 감싼 상태에서 4 ℃에서 2 시간 동안 흔들면서 반응시킨 후, 1 : 200 이상의 부피비가 되도록 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충용액에 대해 3 회 투석시켰다.

실험예 1: 본 발명에 따른 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항체 및 항원의 동시검출

본 발명에 따른 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 항원/항체 동시 검출에 의 한 감염 여부의 확인을 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

각각 0.1 - 1.0 ㎍/㎖의 농도의 MSP, HSP 70과 GBP 130 용액과 실시예 3에서 제조된 토끼유래 Anti-HRPⅡ를 5 - 10 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M 탄산염 완충용액(pH 9.5)에 희석하여 100 ㎕ 씩 분주한 후, 웰에 분주된 항원이 웰 플레이트에 부착되도록 플레이트를 밀봉하여 상온에서 18시간 동안 방치하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 용액을 제거한 후, 0.5% 소 혈청 알부민을 함유한 인산염 완충용액을 웰 당 300 ㎕ 씩 분주하여 상온에서 6 시간 동안 방치하였다. 웰에 남은 용액을 제거하고 건조시킨 후, 제습제와 함께 밀봉용기에 넣어 4℃ 저온 냉장고에 보관하였다.

코팅된 플레이트의 각 웰에 1% 소 혈청 알부민, 인산염 완충용액 및 트리톤 X-100을 포함하는 검체 희석액 100 ㎕를 첨가하고 검체 50 ㎕ 씩 첨가하여 잘 혼합한 후, 37℃의 반응기에 넣고 60 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.05% 트윈 20(Tween 20)을 함유한 인산염 완충용액(300 ㎕)을 사용하여 웰 플레이트를 5 회에 걸쳐 세척하였다.

실시예 4에서 제조된 항원-HRP 접합체들과 Anti-HRPⅡ-HRP 접합체는 트윈 20이 포함된 카제인/인산염 완충용액 희석액을 사용하여 희석한 후 100 ㎕ 씩 상기 웰에 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 웰 플레이트를 0.05% 트윈 20/인산염 완충용액으로 5회 세척하고, 테트라메틸 벤지딘(tetrametyl benzidine) 100 ㎍/㎖, 과산화수소(hydrogen peroxide) 0.006% 및 구연산 인산염 완충용액(pH 4.5)을 포함하는 기질용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 30 분간 암소에서 발 색시켰다. 반응정지액(1N 황산용액) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 발색반응을 종료시킨 후, 96 웰 플레이트 판독기(Molecular Devices)로 650 nm를 보조(reference) 파장으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질용액 내 발색제인 테트라메틸 벤지딘은 항체에 결합된 HRP접합체에 의해 분해되어 발색반응을 유발하므로, 그 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 말라리아 특이 항원 및 항체의 존재 유무와 항원 및 항체의 강도를 검출하였다. 상기의 실험에서 사용된 검체들은 하기와 같다.

(1) 정상인의 혈청 264 개의 검체

(2) 말라리아 위험 지역인 인도의 말라리아 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 감염된 환자의 혈청 21 개의 검체

(3) 말라리아 위험지역을 방문하여 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 국내 환자의 혈청 20 개의 검체

양성 판정 수치(Cut-off)는 음성 평균에 0.3을 더한 값으로 설정하였다. 실험 결과, 정상인의 혈청 264개의 검체에 대한 검사에서는 정상인의 혈청 모두 음성으로 나타났으며, 인도의 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 환자 21개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 20 개의 검체(95% 민감도)가, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 국내 환자 20 개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 18 개의 검체(90% 민감도)에 대해 양성으로 판정되었다. 그 결과가 도 5의 그래프에 개시되어 있다.

비교예 1: 효소 면역학적 측정방법을 통한 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항체의 검출

본 발명에 따른 방법과의 비교를 위해, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항체만을 효소면역학적으로 측정하는 방법에 대해 하기와 같은 실험을 행하였다.

MSP, HSP 70과 GBP 130 용액을 각각 0.1 - 1.0 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M 탄산염 완충용액(pH 9.5)에 희석하여 100 ㎕ 씩 분주한 후, 웰에 분주된 항원이 웰 플레이트에 부착되도록 플레이트를 밀봉하여 상온에서 18 시간 동안 방치하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 용액을 제거한 후 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 인산염 완충용액을 웰 당 300 ㎕ 씩 분주하여 상온에서 6시간 동안 방치하였다. 웰에 남아있는 용액을 제거하고 건조시킨 후, 제습제와 함께 밀봉용기에 넣어 4℃ 저온 냉장고에 보관하였다.

코팅된 플레이트의 각 웰에 1% 소 혈청 알부민, 인산염 완충용액 및 트리톤 X-100을 포함하는 검체 희석액 100 ㎕를 첨가하고 검체 50 ㎕ 씩 첨가하여 잘 혼합한 후, 37℃의 반응기에 넣고 60 분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% 트윈 20(Tween 20)을 함유한 인산염 완충용액(300 ㎕)을 사용하여 웰 플레이트를 5 회에 걸쳐 세척하였다.

실시예 4에서 제조된 항원-HRP 접합체는 트윈 20이 포함된 카제인/인산염 완충용액 희석액을 사용하여 희석한 후, 100 ㎕ 씩을 상기 웰에 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 웰 플레이트를 0.05% 트윈 20/인산염 완충용액으로 5 회 세척하고, 테트라메틸 벤지딘 100 ㎍/㎖, 과산화수소 0.006% 및 구연산 인산염 완충용액(pH 4.5)을 포함하는 기질용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 30 분간 암소에서 발색시켰다. 반응정지액(1N 황산용액) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 발색반응을 종료시킨 후, 96 웰 플레이트 판독기로 650 nm를 보조 파장으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질용액 내 발색제인 테트라메틸 벤지딘은 항체에 결합된 HRP접합체에 의해 분해되어 발색반응을 일으키므로, 그 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 말라리아 특이 항체의 존재 유무 및 존재강도를 검출하였다. 상기의 실험에서 사용된 검체들은 실험예 1에서 동일하다.

실험예 1에서와 동일한 조건으로 판정한 결과, 정상인의 혈청 264개의 검체에 대한 검사에서 정상인의 혈청은 모두 음성으로 나타났으며, 인도의 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 환자들의 21 개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 17 개의 검체(81% 민감도)가, 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 국내 환자 20 개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 11 개의 검체(55% 민감도)에 대해 양성으로 판정되었다. 그 결과가 도 6의 그래프에 개시되어 있다.

본 발명의 방법에 따른 항원/항체의 동시 검출 결과를 보여주는 도 5(실험예 1)와 항체만의 검출 결과를 보여주는 도 6(비교예 1)을 비교하여 보면, 본 발명의 방법은 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 감염 판단에 있어서 높은 민감도와 특이도를 나타냄을 알 수 있다.

비교예 2: 효소 면역학적 측정방법을 통한 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원의 검출

본 발명에 따른 방법과의 비교를 위해, 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원만을 효소면역학적으로 측정하는 방법에 대해 하기와 같은 실험을 행하였다.

실시예 3에서 제조된 토끼유래 Anti-HRPⅡ를 5 - 10 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M 탄산염 완충용액(pH 9.5)에 희석하여 100 ㎕ 씩 분주한 후, 웰에 분주된 항원이 웰 플레이트에 부착되도록 플레이트를 밀봉하여 상온에서 18시간 동안 방치하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 용액을 제거한 후 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 인산염 완충용액을 웰 당 300 ㎕ 씩 분주하여 상온에서 6시간 동안 방치하였다. 웰에 남아있는 용액을 제거하고 건조시킨 후, 제습제와 함께 밀봉용기에 넣어 4℃ 저온 냉장고에 보관하였다.

실시예 4에서 제조된 Anti-HRPⅡ 접합체는 트윈 20이 포함된 카제인/인산염 완충용액 희석액을 사용하여 희석한 후, 100 ㎕ 씩을 상기 웰에 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 웰 플레이트를 0.05% 트윈 20/인산염 완 충용액으로 5 회 세척하고, 테트라메틸 벤지딘 100 ㎍/㎖, 과산화수소 0.006% 및 구연산 인산염 완충용액(pH 4.5)을 포함하는 기질용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 30 분간 암소에서 발색시켰다. 반응정지액(1N 황산용액) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 발색반응을 종료시킨 후, 96 웰 플레이트 판독기로 650 nm를 보조 파장으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질용액 내 발색제인 테트라메틸 벤지딘은 항체에 결합된 HRP접합체에 의해 분해되어 발색반응을 일으키므로, 그 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 말라리아 특이 항체의 존재 유무 및 존재강도를 검출하였다. 상기의 실험에서 사용된 검체들은 실험예 1에서 동일하다.

실험예 1에서와 동일한 조건으로 판정한 결과, 정상인의 혈청 264개의 검체에 대한 검사에서 정상인의 혈청은 모두 음성으로 나타났으며, 인도의 말라리아 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 환자들의 21 개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 18 개의 검체(86% 민감도)가, 플라스모듐 팔시파룸에 감염된 국내 환자 20 개의 검체에 대한 검사에서는 그 중 15 개의 검체(75% 민감도)에 대해 양성으로 판정되었다. 그 결과가 도 7의 그래프에 개시되어 있다.

본 발명의 방법에 따른 항원/항체의 동시 검출 결과를 보여주는 도 5(실험예 1)와 항원만의 검출 결과를 보여주는 도 7(비교예 2)을 비교하여 보면, 본 발명의 방법은 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 감염 판단에 있어서 높은 민감도와 특이도를 나타냄을 알 수 있다.

더욱이, 항체만을 검출하는 방법(비교예 1)과 항원만을 검출하는 방법(비교예 2)에 의해서는 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 감염이 확인되지 않았거나 이를 확신할 수 없었던 검체들이, 본 발명의 방법에 따른 항원/항체의 동시 검출에 의해 감염 사실이 명료하게 확인됨으로써, 본 발명의 방법은 이들 선행기술들의 조합 이상의 현저한 효과를 발휘함이 입증되었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기의 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

본 발명의 면역학적 측정방법 및 측정 수단에 따르면, 말라리아에 특이적인 항원 및 항체를 동시에 검출할 수 있기 때문에, 말라리아 현증 환자뿐만 아니라 보균자까지도 특이적으로 검출할 수 있고, 정상인에게는 말라리아 특이 항체가 검출되지 않아 특이도와 민감도에 있어 매우 우수하며, 종래의 기술로는 검출하기 힘든 감염 초기의 검체에 대해서도 매우 효율적으로 사용될 수 있다. 또한, 전혈이 아닌 혈청, 혈장 등을 사용할 수 있으므로, 혈액 스크리닝과 같은 대량 검사에도 매우 적합한 형태로 사용될 수 있다.

<110> LG Life Sciences Ltd. <120> Immunoassay for Plasmodium falciparum and means used therefor <130> LLO4KR003P <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-HSP70-NdeI (Primer) <400> 1 ggatcccata tggctagtgc aaaaggttc 29 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-HSP70-XhoI (Primer) <400> 2 ggatccctcg agttaatcaa cttcttcaac tgttgg 36 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70-SphI-5' (Primer) <400> 3 aatggtaaag aagcatgcag atcaattaac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70-SphI-3' (Primer) <400> 4 gttaattgat ctgcatgctt ctttaccatt 30 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-GBP130-NdeI (Primer) <400> 5 gattatcata tgagagaaag cagaatttta gc 32 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-G130BamHI-5' (Primer) <400> 6 agagaatatg ccgcggatcc agaatatcgt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-G130BamHI-3' (Primer) <400> 7 acgatattct ggatccgcgg catattctct 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-GBP130-XhoI (Primer) <400> 8 ggatccctcg agttatgctt cgttattatc agc 33 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-MSP19-NdeI (Primer) <400> 9 gcaacacata tggcagtaac tccttccgta attga 35 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-MSP19-XhoI (Primer) <400> 10 gtgttgctcg agttataaca taccttgcaa gtttcc 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-HRP II-NdeI (Primer) <400> 11 ttgttacata tgagcaaaaa tgcaaaagga ctt 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf-HRP II-XhoI (Primer) <400> 12 ataaatctcg agttaatggc gtaggcaatg tgt 33 <210> 13 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium falciparum's agtigen (Heat-shock protein 70) <400> 13 Met Ala Ser Ala Lys Gly Ser Lys Pro Asn Leu Pro Glu Ser Asn Ile 1 5 10 15 Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Trp 20 25 30 Arg Asn Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr 35 40 45 Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp 50 55 60 Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Arg Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp 65 70 75 80 Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Thr Glu Ser Ser Val Gln Ser 85 90 95 Asp Met Lys His Trp Pro Phe Thr Val Lys Ser Gly Val Asp Asp Lys 100 105 110 Pro Met Ile Glu Val Thr Tyr Gln Gly Glu Lys Lys Leu Phe His Pro 115 120 125 Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Gln Lys Met Lys Glu Asn Ala Glu 130 135 140 Ala Phe Leu Gly Lys Ser Ile Lys Asn Ala Val Ile Thr Val Pro Ala 145 150 155 160 Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile 165 170 175 Ala Gly Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala 180 185 190 Ile Ala Tyr Gly Leu His Lys Lys Gly Lys Gly Glu Lys Asn Ile Leu 195 200 205 Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile 210 215 220 Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly Asp Thr His Leu 225 230 235 240 Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn Phe Cys Val Glu Asp 245 250 255 Phe Lys Arg Lys Asn Arg Gly Lys Asp Leu Ser Lys Asn Ser Arg Ala 260 265 270 Leu Arg Arg Leu Arg Thr Gln Cys Glu Arg Ala Lys Arg Thr Leu Ser 275 280 285 Ser Ser Thr Gln Ala Thr Ile Glu Ile Asp Ser Leu Phe Glu Gly Ile 290 295 300 Asp Tyr Ser Val Thr Val Ser Arg Ala Arg Phe Glu Glu Leu Cys Ile 305 310 315 320 Asp Tyr Phe Arg Asp Thr Leu Ile Pro Val Glu Lys Val Leu Lys Asp 325 330 335 Ala Met Met Asp Lys Lys Ser Val His Glu Val Val Leu Val Gly Gly 340 345 350 Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Thr Leu Ile Lys Glu Phe Phe Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Ala Cys Arg Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr 370 375 380 Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Asp Gln Ser Asn Ala 385 390 395 400 Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Cys Ser Leu Ser Leu Gly Leu 405 410 415 Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr 420 425 430 Ile Pro Ala Lys Lys Ser Gln Ile Phe Thr Thr Tyr Ala Asp Asn Gln 435 440 445 Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala Leu Thr Lys 450 455 460 Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe His Leu Asp Gly Ile Pro Pro Ala 465 470 475 480 Pro Arg Lys Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn 485 490 495 Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Val Glu Lys Ser Thr Gly Lys Gln Asn 500 505 510 His Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Gln Asp Glu Ile 515 520 525 Asp Arg Met Val Asn Asp Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu Asp Glu Glu 530 535 540 Asn Arg Lys Arg Ile Glu Ala Arg Asn Ser Leu Glu Asn Tyr Cys Tyr 545 550 555 560 Gly Val Lys Ser Ser Leu Val Asp Gln Lys Ile Lys Glu Lys Leu Gln 565 570 575 Pro Ala Glu Ile Glu Thr Cys Met Lys Thr Ile Thr Thr Ile Leu Glu 580 585 590 Trp Leu Glu Lys Asn Gln Leu Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Glu Ala Lys 595 600 605 Gln Lys Glu Ala Glu Ser Val Cys Ala Pro Ile Met Ser Lys Ile Tyr 610 615 620 Gln Asp Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Gly 625 630 635 640 Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Asn Phe 645 650 655 Pro Gly Gly Met Pro Gly Ala Gly Met Pro Gly Asn Ala Pro Ala Gly 660 665 670 Ser Gly Pro Thr Val Glu Glu Val Asp 675 680 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium falciparum's agtigen (Merozoit surface protein) <400> 14 His His His His His His Ser Thr Gly Met Val Phe Glu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Val Leu Ser Asn Leu Leu Asp Gly Asn Leu Gln Gly Met Leu 20 25 30 Asn Ile Ser Gln His Gln Cys Val Lys Lys Gln Cys Pro Gln Asn Ser 35 40 45 Gly Cys Phe Arg His Leu Asp Glu Arg Glu Glu Cys Lys Cys Leu Leu 50 55 60 Asn Tyr Lys Gln Glu Gly Asp Lys Cys Val Glu Asn Pro Asn Pro Thr 65 70 75 80 Cys Asn Glu Asn Asn Gly Gly Cys Asp Ala Asp Ala Lys Cys Thr Glu 85 90 95 Glu Asp Ser Gly Ser Asn Gly Lys Lys Ile Thr Cys Glu Cys Thr Lys 100 105 110 Pro Asp Ser Tyr Pro Leu Phe Asp Gly Ile Phe Cys Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium falciparum's agtigen (Glycophorin binding protein 130) <400> 15 His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His 1 5 10 15 Met Glu Thr Arg Glu Ser Arg Ile Leu Ala Glu Gly Glu Asp Thr Cys 20 25 30 Ala Arg Lys Glu Lys Thr Thr Leu Arg Lys Ser Lys Gln Lys Thr Ser 35 40 45 Thr Arg Thr Val Ala Thr Gln Thr Lys Lys Asp Glu Glu Asn Lys Ser 50 55 60 Val Val Thr Glu Glu Gln Lys Val Glu Ser Asp Ser Glu Lys Gln Lys 65 70 75 80 Arg Thr Lys Lys Val Val Lys Lys Gln Ile Asn Ile Gly Asp Thr Glu 85 90 95 Asn Gln Lys Glu Gly Lys Asn Val Lys Lys Val Ile Lys Lys Glu Lys 100 105 110 Lys Lys Glu Glu Ser Gly Lys Pro Glu Glu Asn Lys His Ala Asn Glu 115 120 125 Ala Ser Lys Lys Gln Glu Pro Lys Ala Ser Lys Val Ser Gln Lys Pro 130 135 140 Ser Thr Ser Thr Arg Ser Asn Asn Glu Val Lys Ile Arg Ala Ala Ser 145 150 155 160 Asn Gln Glu Thr Leu Thr Ser Ala Asp Pro Glu Gly Gln Ile Met Glu 165 170 175 Thr Arg Glu Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Tyr Arg Lys His Leu Glu Val 180 185 190 Phe His Lys Ile Leu Thr Asn Thr Asp Pro Asn Asp Glu Val Glu Arg 195 200 205 Gln Asn Ala Asp Asn Asn Glu Ala Ser Thr Pro 210 215 <210> 16 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium falciparum's agtigen (Histidine rich protein II) <400> 16 Asp Ala His His Ala His His Val Ala Asp Ala His His Ala His His 1 5 10 15 Val Ala Asp Ala His His Ala His His Val Ala Asp Ala His His Ala 20 25 30 His His Val Ala Asp Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala His 35 40 45 His Ala His His Ala Ala Tyr Ala His His Ala His His Ala Ala Asp 50 55 60 Ala His His Ala Thr Asp Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala 65 70 75 80 Ala Asp Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala His His Ala Ala 85 90 95 Asp Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala His His 100 105 110 Ala Ala Asp Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala 115 120 125 His His Ala Ala Asp Ala His His Ala His His Ala Ala Tyr Ala His 130 135 140 His Ala His His Ala Ser Asp Ala His His Ala His His Ala Ala Asp 145 150 155 160 Ala His His Ala Ala Tyr Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala 165 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Claims

말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원 및 항체를 함께 고정체에 고정시키고, 대상 객체의 검체를 가하여 항원과 이에 특이적인 항체반응을 유도한 후, 별도로 준비한 상기 항원과 표지체의 접합체("항원-표지체 접합체") 및 상기 항체와 표지체의 접합체("항체-표지체 접합체")를 첨가하여 상기 접합체들 중의 적어도 하나의 결합을 유도함으로써, 상기 검체 중의 상기 특이 항원 및/또는 항체에 결합된 접합체 중의 표지체에 의해, 상기 특이 항원 및/또는 항체의 존재 유무를 확인하는 면역학적 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 특이 항원은 플라스모듐 팔시파룸의 열자극 단백질 70(Heat-shock protein 70, HSP 70), 메로조이트 표면 단백질(Merozoit surface protein, MSP), 및 글리코포린 결합 단백질 130(Glycophorin binding protein 130, GBP 130)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 특이 항체는, 항-히스티딘 풍부 단백질 Ⅱ(Anti-Histidine-rich protein Ⅱ, Anti-HRPⅡ)로서, 동물에서 유래된 다클론 항체 또는 단클론 항체, 또는 유전자 재조합 방법으로부터 유래되는 항체인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 특이 항원으로서 HSP 70, MSP 및 GBP 130을 함께 사용하고 상기 특이 항체로서 Anti-HRPⅡ를 사용하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 표지체는 고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase: HRP), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 접합체가 대상 검체 중의 항체 및/또는 항원과 결합하였는지 여부는, 상기 접합체 중의 표지체에 의해 분해되는 기질을 첨가하여 상기 기질의 분해 여부를 확인함으로써 행하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 검체는 검사 대상 객체의 혈액, 분뇨 및/또는 타액으로부터 분리한 혈청, 혈장, 및 체액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 상기 고정체는 유리, 합성수지, 반합성수지 또는 금속 소재의 용기, 입상물 또는 맴브레인인 것을 특징으로 하는 측정방법.
말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 특이 항원과 특이 항체를 표면에 함께 고정시킨 고정체, 및 상기 항원과 표지체의 접합체("항원-표지체 접합체")와 상기 항체와 표지체의 접합체("항체-표지체 접합체")를 포함하는 것으로 구성된, 제 1 항에 따른 방법을 수행하기 위한 측정 수단.