DE69333468T2

DE69333468T2 - Schützende antikörper induzierende antigene aus plasmodium falciparum

Info

Publication number: DE69333468T2
Application number: DE69333468T
Authority: DE
Inventors: Pierre Druilhe; Hasnaq Bouharoun-Tayoun; Claude Oeuvray
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1992-10-19
Filing date: 1993-10-18
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2013-10-19
Also published as: EP1471150A2; EP0666916A1; FR2697022A1; DK0666916T3; US6949627B2; ATE263243T1; US7211256B2; DE69333468D1; US20050266017A1; EP0666916B1; WO1994009140A1; US6017538A; EP1471150A3; PT666916E; US20040096466A1; ES2218520T3; US6472519B1; FR2697022B1

Description

Die vorliegende Erfindung hat neue Präparate für einen antiplasmodialen Breitspektrumimpfstoff zum Gegenstand.
Die Erfindung hat gleichermaßen ein Impfstoffantigen von Plasmodium falciparum zum Gegenstand, das in der Lage ist, eine Resistenz gegen den Parasiten zu induzieren, welche Resistenz jene wiedergibt, die im Schutzmechanismus der Immunität oder Präimmunität gefunden wird.
Die Erfindung hat gleichermaßen Präparate von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern zum Gegenstand, oder von Fragmenten oder Chimären, die ausgehend von diesen spezifischen Antikörpern dieser Antigene erhalten wurden, und die in eine Zusammensetzung für passive Immuntherapie eingehen können.
Schließlich hat die Erfindung ein Kit oder einen Kasten zum Gegenstand, der die Diagnose einer Infektion einer Person in vitro mit einem breiten Spektrum von Plasmodiumstämmen ermöglicht.
Die für Malaria (Sumpffieber) beim Menschen verantwortlichen Parasiten, darunter insbesondere Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax, um nur die wichtigsten unter ihnen zu nennen, zeigen beim menschlichen Wirt unterschiedliche Morphologien und exprimieren unterschiedliche Antigene in Abhängigkeit von ihre Lage im Organismus des infizierten Wirts. Die Unterschiede bei den Morphologien und Antigenen dieser Parasiten im Verlaufe ihres Lebenszyklus beim Menschen ermöglichen, mindestens vier unterscheidbare Entwicklungsstadien zu definieren.
Das allererste Entwicklungsstadium des Parasiten beim Menschen entspricht der Sporozoitenform, die durch Stiche von Insekten, die den Pa rasiten tragen, ins Blut des Wirts eingebracht wurde. Das zweite Stadium entspricht der Wanderung des Parasiten in die Leber und die Infektion von Leberzellen, in denen die Parasiten sich entwickeln, so dass sich Schizonten der Leber bilden, die wenn sie reif sind (zum Beispiel bei P. falciparum am 6. Tag nach Eindringen der Sporozoiten), durch Platzen Merozoiten der Leber freisetzen. Das dritte Stadium ist gekennzeichnet durch die Infektion von Erythrocyten des Bluts durch geschlechtslose Formen (Merozoiten) des Parasiten; dieses Erythrocytenstadium der Entwicklung entspricht der pathogenen Phase der Krankheit. Das vierte Stadium entspricht der Bildung von potenziell geschlechtlichen Formen (oder Gametocyten), die extrazelluläre Geschlechts- oder Gametenformen bei der Stechmücke werden.
Es ist bekannt, dass zahlreiche Studien unternommen wurden, um ausgehend von bei einem menschlichen Wirt infektiösen Parasitenstämmen Polypeptidfraktionen zu isolieren, um einerseits die Diagnose von Malaria in vitro durch Erfassung entsprechender Antikörper zu gewährleisten, und andererseits gegen Malaria impfen zu können.
Im Jahre 1976 wurde die (lang erwartete) Erhaltung von P. falciparum in kontinuierlicher Kultur in GR des Menschen erreicht (Trager und Jensen, Science 1976, 193: 673; Haynes et al. 1976). Diese Leistung hat den Zugang zum Parasiten beträchtlich erleichtert und die Forschung angeregt, die seither einen beträchtlichen Fortschritt erfahren hat. Die Unternehmungen sind prinzipiell auf die Bereitstellung eines Impfstoffs gerichtet, der nun notwendig ist, um die Malaria zu bekämpfen, deren Auftreten sich verstärkt hat, da sich die Resistenz der Parasiten gegen Wirkstoffe sich in verschiedenen Teilen der Welt ausbreitet.
Bei der Forschung nach einem Impfstoff gegen den Erreger der Malaria sind die Biologen mit verschiedenen Problemen konfrontiert, die bei anderen Infektionserregern, wie Viren oder Bakterien nicht beobachtet wurden. Von diesen besonderen Schwierigkeiten mit dem Parasiten werden prinzipiell genannt:

– Die Komplexität des biologischen Zyklus des Plasmodiums, der in zwei unterschiedlichen Wirten abläuft, der Stechmücke und dem Menschen, wobei beim einen eine geschlechtliche Fortpflanzung erfolgt und beim anderen 2 verschiedene Phasen der geschlechtslosen Vermehrung. So treten beim Menschen zwei Stadien auf, die sich durch ihren Entwicklungsort unterscheiden (die Leber und der Blutkreislauf) und durch ihre Antigenmerkmale.
– Die Antigenvielfalt des Parasiten. Seit 1983 wurden die Plasmodiumantigene geklont, ihre Nukleotidsequenzen und Proteinsequenzen analysiert. Diese ausführliche Untersuchung hat ergeben, dass mehr als 50% der bekannten Antigene ein hohes Maß an Polymorphie von einem Stamm zum anderen zeigen.
– Auf der immunologischen Ebene ist das Verhältnis von Wirt zu Parasit sehr subtil. Wie schon erwähnt wurde ist sie für einen bestimmten Parasiten je nach dem Wirt, in dem er entstanden ist, sehr unterschiedlich. Dies zieht eine Schwierigkeit bei der Interpretation von mit experimentellen Modellen erhaltenen Ergebnissen nach sich.

Bei natürlicher Infektion sieht man übrigens niemals sterilisierende Immunität, wie sie zum Beispiel bei Viren beobachtet wird. Trotzdem gibt es unzweifelhaft eine erworbene Immunität, aber sie ist partiell und labil.
Daher sind die Komplexität und die Vielfalt des Parasiten sowie die Einzigartigkeit der Immunantwort, die er hervorruft, die Hauptgründe, dass es bis heute keinen Antimalariaimpfstoff gibt.
Der am häufigsten eingeschlagene Weg der Forschung zur Erarbeitung eines Impfstoffs gegen Malaria durch P. falciparum besteht daher in der Identifizierung (auf Grundlage der oben genannten Mittel) eines potenziellen Kandidaten und dann Ermittlung seines Nutzens entweder in vitro durch Testen der spezifischen Antikörper zur Inhibierung des Wachstums des Parasiten oder bestimmter seiner Eigenschaften (Zellanhaftung, Rosettenbildung ...), oder in vivo durch Immunisierung von Affen oft mit Freund-Adjuvans. Die aktuelle Situation lässt sich so zusammenfassen, dass es eine große Zahl von potenziellen Kandidaten gibt, die durch ihre biochemischen Eigenschaften, ihre Nukleotid- und Proteinsequenzen, ihren Grad an Polymorphie, ihre Lage auf dem Parasiten usw. gekennzeichnet sind. Trotzdem verfügen die Forscher über begrenzte Mittel zur Bewertung des Nutzens ihrer Kandidaten: 1) in vitro Tests, die sich an die Wirkungsmechanismen der Antikörper richten, die bezüglich ihrer Gültigkeit in vivo wenig dokumentiert sind, 2) Impfungen von Primaten, die keine Menschen sind, und damit Bewertung der Wirkung eines Impfstoffs bei einer experimentellen Infektion, deren klinische und parasitologische Parameter und vor allem die Art der Immunität, die induziert werden kann, sehr verschieden sind von denen einer natürlichen Infektion beim Menschen.
Die enge Spezifität der Beziehung Wirt-Parasit führt unter natürlichen Bedingungen, im Gegensatz zu dem, was an Tiermodellen zu beobachten ist, zu einem Gleichgewicht, wo der Parasit überlebt, wobei er bei seinem natürlichen Wirt eine nicht sterilisierende Immunität induziert. Dieser Zeitablauf der parasitären Infektion legt nahe, dass die Mehrheit der Molekularbestandteile des Parasiten so ausgewählt sind, dass sie den Mikroorganismus gegen die Immunabwehr des infizierten Lebewesens schützt, und dies mit sehr diversen aber an den natürlichen Wirt spezifisch angepassten Hemmungsmitteln. Beim experimentellen Wirt wehren sich die schlecht angepassten Parasiten weniger gut gegen das Immunsystem und der Schutz gegen eine einzige behandelte Infektion ist einfach zu erreichen, und die Impfung ist vielleicht noch leichter zu erreichen.
Gordon-Thomson, Immunity in Malaria, Trans. Roy. So. Trop. Med. Hyg. XXVI(6), 483–514) kommt zu dem deutlichen Schluss, dass die Immunität gegen P. falciparum nur in Regionen erworben werden kann, wo die Übertragung alle Jahre quasi kontinuierlich erfolgt. Diese „Toleranz" gegen den Parasitenangriff erfordert, auf individuellem Niveau, eine ununterbrochene Infektion über ungefähr 15 Jahre, manchmal 20 oder bis zu 26 Jahren wie in einer Untersuchung in Panama gefunden wurde. Daraus resultiert eine mit einer latenten Infektion in Zusammenhang stehende Immunität, die zum Erhalt des Schutzes notwendig ist. Sergent (1935) schlägt die Bezeichnung „Präimmunität" vor, um diesen „besonderen Resistenzzustand, der zugleich mit der Infektion auftritt und mit ihr endet" zu definieren.
Auf diese Weise ist die erworbene Immunität (oder Präimmunität) gegen P. falciparum beim Menschen der holo- oder hyperendemischen Zone gekennzeichnet durch:

– eine sehr lange Frist vor ihrer Ausbildung (15 bis 20 Jahre Infektion),
– ihre Unfähigkeit, die Infektion zu beenden, es handelt sich um eine nicht sterilisierende Immunität,
– ihre Labilität. Bei Fehlen jeglicher Reinfektion (über mehr als ein Jahr), geht die Präimmunität verloren und die Person wird wieder anfällig für die Krankheit bei einer neuen Infektion.

Die Anzeichen für die humorale Immunität beim erworbenen Schutz gegen Malaria kamen von ersten Versuchen zur passiven Übertragung eines Serums von einer Person in „chronischer" Phase, die einen Präimmunitätszustand erreicht hat (das heißt, in geringer Zahl zirkulierende Parasiten ohne klinische Manifestation aufweist), auf eine Person in akuter Phase. Der Zustand der letztgenannten hat sich nach dieser passiven Übertragung verbessert (Sotiriades 1917, Essais de sérothérapie dans la malaria Grece Med. XIX: 27–28).
Die Rolle der Antikörper bei der Präimmunität wurde durch zahlreiche passive Übertragungsversuche demonstriert, die zu Beginn der 60er Jahre vorgenommen wurden. Die Übertragung von gereinigten IgG aus Serum von hyperimmunen erwachsenen Afrikanern heilte Kinder, die Opfer einer akuten Infektion waren, indem ihre Parasitämie beträchtllich reduziert wurde (Cohen et al. 1971, Trans Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 65(2): 125–135; McGregor et al. 1964, the passive transfert of human material immunity, Am. J. Trop. Med. Hyg. 13: 237–239). Die Neugeborenen sind bis zum dritten Lebensmonat mit mütterlichen Antikörpern präimmunisiert, was durch den vorteilhaften Effekt der IgG der Nabelschnur bewiesen ist, die auf Kinder übertragen wurden, die an einem akuten Angriff von P. falciparum leiden (Edozien et al. 1962).
Die Entwicklung der Immunität und ihre Wirksamkeit beim Schutz des Menschen gegen P. falciparum beweist trotzdem das Vorhandensein von Parasitenmolekülen, die Ziel einer wirksamen Immunabwehr sind.
Die jüngsten Versuche habe zeigen können, dass

a) die Immunglobuline G (IgG) von immunen erwachsenen Afrikanern durch passive Übertragung bei ungeschützten Menschen Schutz bieten (Sabchareon et al. Amer. J. of Trop. Med. and Hyg. Bd. 45, Nr. 3, Sept. 1991, 297–308),
b) dass die Antikörper im Gegensatz zu den etablierten Ansichten, nicht in der Lage sind, die Invasion von roten Blutkörperchen durch die Parasiten direkt zu inhibieren; im Gegenzug wirken sie durch einen untergeordneten Zellinhibitionsmechanismus von Antikörpern (ADCI), bei dem die Monocyten die Rolle der Wirkzelle spielen (Bouharoun-Tayoun et al., J. exp. Med., Bd. 172, Dez. 1990 S. 1633–1641; S. Khusmith et al. 1983, Inf. Imm. 41(1): 219 und F. Lunel et al., 1989 Inf. Imm. 57: 2043),
c) der Mechanismus notwendigerweise cytophile Antikörper impliziert, das heißt, die in der Lage sind, sich durch ihren FC-Rezeptor mit dem Monocyten zu verbinden; in der Tat wurde beobachtet, dass im Serum von geschützten Personen eine Prevalenz von cytophilen Isotypen, IgG1 und IgG3 auftritt, und bei nicht geschützten Personen ein Überwiegen von nicht cytophilen Klassen, IgG2 und/oder IgM (H. BOUHAROUN-TAYOUN et al., 1992, Infection and Immunity, S. 1473–1481).

Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist, Polypeptide für die Impfung des Menschen gegen Malaria zur Verfügung zu stellen, welche Polypeptide ein Ziel der Abwehrmechanismen sind, die bei Personen vorherrschen, die durch langdauernde Exposition gegen den Parasiten eine Immunität erworben haben, und ihre Verwendung in einem Impfstoff, um den selben Zustand der Resistenz zu reproduzieren, durch den selben Mechanismus wie er bei der Ausbildung der schützenden Immunität beobachtet wird.
Die Erfindung hat gleichermaßen die Verwendung dieser Polypeptide in einem Kit zur Diagnose der Infektion beim Menschen in vitro mit einem breiten Spektrum von Plasmodiumstämmen zum Gegenstand.
Die Erfindung betrifft insbesondere Moleküle oder Zusammensetzungen von Peptiden oder Polypeptiden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in ihrer Struktur eine oder mehrere Peptidsequenzen vorhanden sind, die ein oder mehrere Epitope tragen, die für ein Protein charakteristisch sind, das von cytophilen Antikörpern erkannt wird, das heißt, in der Lage sind, sich auf FcR-Rezeptoren von Monocyten durch ihre Region Fc festzulegen, und von nicht cytophilen Antikörpern nicht erkannt werden und einen untergeordneten Cytotoxizität-Antikörper-Mechanismus (ADCI) zu fördern.
Ein erfindungsgemäßes Protein ist ein Oberflächenprotein des Merozoiten mit einem Molekulargewicht von 48000 (48 Kd), das die unten angegebenen Merkmale zeigt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide wurden erhalten durch

– Identifikation eines Teils dieses Proteins mit Molekulargewicht von 48000 (48 Kd) der Oberfläche des Merozoiten, dessen Identifizierung unten beschrieben wird,
– die biochemische und immunologische Charakterisierung dieses 48 Kd Proteins,
– das Screening einer Genombank des Plasmodiums auf seine Fähigkeit zur Inhibierung der Kopplung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers vom Typ IgM, der als besonderes Merkmal die Reaktion vom Typ ADCI („antibody dependent cellular inhibition", antikörperabhängige Zellinhibierung) aufweist, die durch spezifische IgG des Plasmas von geschützten Personen induziert wird,
– Charakterisierung von durch ausgewählte Klone synthetisierten Proteinen,
– Sequenzierung des Einsatzes (Insert) des ausgewählten Klons,
– Untersuchung des funktionellen Effekts des diesem Protein entsprechenden Antikörpers in den beschriebenen Tests.

Der Nutzen der Proteine und Peptide der Erfindung und ihre Gewinnungsstrategie werden in der folgenden Beschreibung erläutert.
Strategie zur Auswahl von Proteinen und Peptiden

1 – In Infection and Immunity (S. 1473–1481, April 1992), haben die Autoren die Isotypenverteilung von mit dem Plasmodium infizierten Personen untersucht, die verschiedene immunologische Zustände zeigen. Es wurde auf diese Weise gezeigt, dass die nicht geschützten Personen eine Zusammensetzung von plasmatischen Antikörpern gegen Plasmodium sehr zu Gunsten der nicht cytophilen Isotypen, insbesondere der IgG2 und IgM aufweisen. In bestimmten Fällen betrifft dieses Gleichgewicht die Antikörper gegen alle Polypeptide der Malaria, die im Western Blott erfassbar sind (Technik in Molecular Cloning, 1989, Sambrook et al. beschrieben) während in anderen Fällen spezifische IgG2 eines bestimmten Polypeptids nachgewiesen werden konnten, oft ein Polypeptid von 48 Kd, das in manchen Isolaten in Form einer Doublette erscheint oder ein Polypeptid von 80–100 Kd. Im Gegenzug wird bei Erwachsenen, die eine Resistenz gegen die Krankheit erworben haben oder einen Präimmunitätszustand, das Polypeptid von 48 Kd immer von den cytophilen Isotypen IgG1 und IgG3 erkannt.
2 – Es wurde in Vergleichsversuchen oft beobachtet, dass die vollständig gereinigten Ig von nicht geschützten Personen die ADCI-Reaktion blockieren (siehe Beschreibung oben), die durch die IgG von resistenten Personen induziert wird. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die nicht geschützten Personen gegen die selben Epitope gerichtete Antikörper entwickelt haben, wie die, die von den Schutzantikörpern erkannt werden, aber aufgrund des nicht cytophilen Charakters der von nicht geschützten Personen gebildeten IgG2 oder der IgM, sind diese Antikörper nicht in der Lage, den Zerstörungseffekt von Monocyten durchzuführen, sind dagegen aber in der Lage, mit den bei ADCI wirksamen Antikörpern in Konkurrenz zu treten. Wenn ein solcher Konkurrenzeffekt unter Verwendung von menschlichem Serum, in dem die Antikörper gegen das Protein 48 Kd überwiegend vom Isotyp IgG2 sind, identifiziert ist, wird dadurch der Nutzen dieses Proteins 48 Kd klar nachgewiesen.

Der ADCI-Test wurde schon in der oben genannten Veröffentlichung beschreiben (H. BOUHAROUN-TAYOUN et al., Kusmith et al., Lunel et al.). Kurz gesagt handelt es sich um einen Test zur Inhibierung des Wachstums des Parasiten durch IgG in Gegenwart von Monocyten. Die Monocyten werden durch Anhaften auf Kunststoff (in einer 96-Lochplatte) ausgehend von einer mononuklealen Zellfraktion von Blut eines normalen Spenders isoliert. Eine synchrone Kultur von P. falciparum mit 0,5% Parasitämie in reifer Form wird den Monocyten in einem Verhältnis Monocyten/rote Blutkörperchen von ungefähr 1/200 hinzuge fügt. Der Hämatokrit beträgt 2%, das Milieu ist mit dem zu prüfenden Serum oder den IgG versehen. Referenzkulturen bestehen aus Parasiten in Gegenwart von normalen IgG, Parasiten in Gegenwart von Monocyten und normalen IgG, Parasiten in Gegenwart der zu prüfenden IgG.
Je nach Fall wird die Kultur nach 24, 48, 72 oder 96 Stunden gestoppt. In den beiden letzten Fällen werden 50 Mikroliter Kulturmilieu hinzugefügt. Die endgültige Parasitämie in jeder der Vertiefungen wird durch Auszählen der roten Blutkörperchen in angefärbten Präparaten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Form eines spezifischen Index der Wachstumsinhibierung (IS) dargestellt, die als Prozentsatz ausgedrückt ist und wie folgt berechnet wurde, wobei der eventuelle Inhibierungseffekt auf die Monocytenkultur und/oder die Antikörper allein berücksichtigt wird:
Diese Auswahlstrategie für ein potenzielles Impfstoffprotein von 48 Kd gemäß den Kriterien der Erkennung durch die cytophilen Antikörper bei geschützten Personen und nicht cytophilen bei nicht geschützten Personen sowie ihre Fähigkeit, Antikörper zu induzieren, die mit den Monocyten bei ADCI kooperieren können, hat dazu geführt, dieses Protein 48 Kd oder Peptide, die Epitopenbereiche dieses Proteins zeigen, als potenziell sehr interessante Kandidaten auszuwählen, um den immunologischen Schutzeffekt gegen Infektionen von P. falciparum bei Patienten zu induzieren.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen insbesondere Moleküle oder Zusammensetzungen von Peptiden oder Polypeptiden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in ihrer Struktur eine oder mehrere Peptidse quenzen vorhanden sind, die eines oder mehrere Epitope tragen, die für das Protein charakteristisch sind und drei Kriterien erfüllen:

– Erkennen durch Antikörper der cytophilen Klasse bei geschützten Personen und nicht cytophilen bei nicht geschützten Personen,
– Fähigkeit zum Induzieren von Antikörpern, die mit den Monocyten bei ADCI kooperieren können,
– nicht oder wenig polymorpher Charakter, so dass die Schutzimmunität sich in Hinblick auf eine große Zahl von Stämmen entfalten kann.

Die Moleküle der Erfindung sind alle die Epitope tragenden Moleküle, die von Antikörpern erkannt werden, die Epitope erkennen, die vom Protein 48 Kd der Oberfläche von Merozoiten getragen sind.
Eine Polypeptidzusammensetzung gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz von 64 Aminosäuren oder eine abgeleitete Sequenz enthält, die die selben Antigeneigenschaften besitzt, und wovon ein Beispiel in der folgenden Formel I gegeben ist:
Die Erfindung betrifft in erster Linie synthetische monomere Peptide, die eine einzelne Peptidsequenz von 64 Aminosäuren umfasst, die der oben genannten Formel entsprechen, und deren terminale Aminosäuren entsprechende freie Amine oder Carboxyle besitzen oder Oligomere, die insbesondere mehrfache irgendeiner der oben genannten Peptidsequenzen enthalten.
Selbstverständlich können die freien reaktiven Funktionen, die bestimmte Aminosäuren besitzen können, die in die Konstitution der erfindungsgemäßen Moleküle eintreten, insbesondere freie Carboxylgruppen, die von den Gruppen Glu getragen sind und der C-terminalen Aminosäure einerseits und/oder den von der N-terminalen Aminosäure getragenen freien Gruppen oder den Aminosäuren im Inneren der Peptidkette, zum Beispiel Lys, andererseits modifiziert sein, infolgedessen diese Modifikation keine Modifikation der antigenen, gegebenenfalls immunogenen Eigenschaften des ganzen Moleküls nach sich zieht. Die auf diese Weise modifizierten Moleküle treten natürlich in den Rahmen des Schutzumfangs ein, der durch die Ansprüche der Erfindung gegeben ist. Diese Carboxylfunktionen sind eventuell acyliert oder verestert.
Andere Modifikationen liegen gleichermaßen im Rahmen der Erfindung. Insbesondere Amin- oder Esterfunktionen oder beide gleichzeitig der terminalen Aminosäuren können selbst an Bindungen mit anderen Aminosäuren beteiligt sein. Zum Beispiel kann die N-terminale Säure mit einer Sequenz verknüpft sein, die 1 bis mehrere Aminosäuren umfasst, die einem Teil der C-terminalen Region eines anderen Peptids entspricht, das der oben angegebenen Definition folgt oder umgekehrt.
Selbstverständlich kann jede modifizierte Peptidsequenz durch Substitution und/oder durch Addition und/oder Suppression einer oder mehrerer Aminosäuren der Peptidsequenz von 64 Aminosäuren im Rahmen des durch die Ansprüche der Erfindung gegebenen Schutzumfangs liegt, infolgedessen diese Modifikation die antigenen oder immunogenen Eigenschaften des Polypeptids nicht verändert, insbesondere wenn diese immunogenen Eigenschaften in geeigneter Weise verstärkt sind, zum Beispiel durch Kombination dieses Polypeptids mit einem geeigneten immunologischen Adjuvans (zum Beispiel einem Muramylpeptid) oder durch Kupplung mit einem Trägermolekül von höherem Molekularge wicht (zum Beispiel einem Serumalbumin oder einem Polylysin) oder einem Toxin vom Tetanustyp oder einem anderen Antigen von P. falci parum.
Die Erfindung betrifft allgemein jedes Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in seiner Struktur eine oder mehrere Peptidsequenzen vorhanden sind, die immunologische Kreuzreaktionen mit der Peptidsequenz der vorstehenden Formel gegenüber durch die letzteren in vivo induzierbaren Antikörpern eingehen.
Die Erfindung betrifft auch jedes Peptid, dessen Struktur sich aus dem Vorstehenden ergibt und insbesondere eines der drei Peptide der Formel II, III, IV
Wie im Falle des ersten oben definierten Peptids, können die verschiedenen genannten Peptide modifiziert sein, ohne jedoch den Rahmen der Erfindung zu verlassen, infolgedessen diese Modifikationen der Struktur keine tiefen Umwandlungen ihrer antigenen Eigenschaften nach sich ziehen.
Die Peptide gemäß der Erfindung können nach klassischen Techniken im Bereich der Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Synthese kann in homogener Lösung oder in Feststoffphase vorgenommen werden.
Zum Beispiel kann die Synthesetechnik in homogener Lösung angewendet werden, die von HOBENWEYL in „Methoden der Organischen Chemie" herausgegeben von E. Wunsch, Band 15-I und II, THIEME, Stuttgart 1974 beschrieben ist.
Dieses Syntheseverfahren besteht im nacheinander Kondensieren von jeweils zwei aufeinanderfolgenden Aminoacylen in der erforderlichen Reihenfolge oder im Auswählen von zuvor gebildeten Aminoacylen und Fragmenten, die schon mehrere Aminoacyle in der geeigneten Folge enthalten, oder noch mehrere auf diese Weise zuvor hergestellte Fragmente, wobei es sich versteht, dass man Sorge tragen muss, zuvor alle reaktiven Funktionen, die die Aminoacyle oder Fragmente tragen, zu schützen, mit Ausnahme der Aminfunktionen einerseits und der Carboxyle andererseits oder umgekehrt, die normalerweise bei der Ausbildung von Peptidbindungen beteiligt sein sollen, insbesondere nach Aktivierung der Carboxylfunktion nach bei der Peptidsynthese bekannten Methoden. In einer Variante können Kupplungsreaktionen angewendet werden, die klassische Kupplungsreagenzien vom Carboimidtyp einsetzen, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid. Wenn das verwendete Aminoacyl eine zusätzliche Säurefunktion besitzt (insbesondere im Falle der Glutaminsäure), werden diese Funktionen geschützt, zum Beispiel durch t-Butylestergruppen.
Im Falle der progressiven Synthese von Aminosäure mit Aminosäure beginnt die Synthese bevorzugt mit der Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die dem benachbarten Aminoacyl der gewünschten Sequenz entspricht, und so weiter und so fort, bis zur N-terminalen Aminosäure. Gemäß einer anderen bevorzugten Technik der Erfindung wird die von R. D. MERRIFIELD im Aufsatz mit dem Titel „Solid phase peptidique synthesis" (J. Am. Soc. 45, 2149–2154) beschriebene angewendet.
Um eine Peptidkette gemäß dem Verfahren von MERRIFIELD herzustellen, wird ein sehr poröses Polymerharz eingesetzt, auf dem die erste C-terminale Aminosäure der Kette fixiert wird. Diese Aminosäure wird auf dem Harz mittels ihrer Carboxylgruppe fixiert und ihre Aminfunktion ist geschützt, zum Beispiel durch die t-Butyloxycarbonylgruppe.
Wenn die erste C-terminale Aminosäure auf diese Weise auf dem Harz fixiert ist, wird die Schutzgruppe der Aminfunktion durch Waschen des Harzes mit einer Säure entfernt.
Im Falle wo die Schutzgruppe der Aminfunktion die t-Butyloxycarbonylgruppe ist, kann sie durch Behandlung des Harzes mit Trifluoressigsäure eliminiert werden.
Dann wird die zweite Aminosäure angekuppelt, die das zweite Aminoacyl der gesuchten Sequenz liefert, ausgehend vom C-terminalen Aminoacylrest auf der nicht mehr geschützten Aminfunktion der ersten auf der Kette fixierten C-terminalen Aminosäure. Bevorzugt ist die Carboxylfunktion der zweiten Aminosäure aktiviert, zum Beispiel durch Dicyclohexylcarbodiimid und die Aminfunktion ist geschützt, zum Beispiel durch t-Butyloxycarbonyl.
Auf diese Weise wird der erste Teil der gesuchten Peptidkette erhalten, die zwei Aminosäuren umfasst und deren terminale Aminfunktion geschützt ist. Wie zuvor wird die Schutzgruppe der Aminfunktion entfernt und man kann dann zur Fixierung des dritten Aminoacyls unter analogen Bedingungen wie bei der Addition der zweiten C-terminalen Aminosäure vorgehen.
Auf diese Weise werden eine nach der anderen die Aminosäuren, die die Peptidkette bilden, auf der Aminogruppe fixiert, die jedes Mal zuvor von der Schutzgruppe des schon gebildeten Peptidkettenteils befreit wird und erneut am Harz befestigt wird.
Wenn die ganze gewünschte Peptidkette gebildet ist, werden die Schutzgruppen der verschiedenen Aminosäuren, die die Peptidkette bilden, eliminiert und das Peptid wird vom Harz gelöst, zum Beispiel mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen wasserlösliche Oligomere von oben genannten Peptidmonomeren. Die Oligomerisation kann ein Anwachsen der Immunogenität der monomeren Peptide gemäß der Erfindung hervorrufen. Ohne dass eine solche in Zahlen ausgedrückte Angabe als Einschränkung betrachtet werden kann, wird trotzdem angegeben, dass diese Oligomere zum Beispiel 2 bis 10 Monomereinheiten enthalten können.
Die dieses Oligomer bildenden Monomereinheiten sind alle durch das Polypeptid der Sequenz I oder durch das Polypeptid der Sequenz II, III oder IV dargestellt.
Zur Durchführung der Oligomerisierung kann jede Polymerisationstechnik angewendet werden, die derzeit im Bereich der Peptide verwendet wird, wobei diese Polymerisierung durchgeführt wird, bis ein Oligomer oder Polymer erhalten ist, das die zum Erreichen der gewünschten Immunogenität erforderliche Anzahl von Monomerstruktureinheiten enthält.
Ein Verfahren zur Oligomerisierung oder Polymerisierung des Monomers besteht in seiner Umsetzung mit einem Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd.
Gleichermaßen können andere Oligomerisationsverfahren oder Kupplungsverfahren angewendet werden, zum Beispiel die mit aufeinanderfolgender Kupplung von Monomereinheiten über ihre terminalen Carboxyl- und Aminfunktionen in Gegenwart von homo- oder heterobifunktionellen Kupplungsreagenzien.
Gleichermaßen kann man zur Herstellung von Molekülen, die eine oder mehrere Struktureinheiten der 64 Aminosäuren umfassen, wie sie oben definiert sind, Techniken der Genetik anwenden, die transformierte Mikroorganismen einsetzen mit einer bestimmten Nukleinsäure, die die entsprechenden geeigneten Nukleotidsequenzen umfassen.
Zu diesem Zweck betrifft die Erfindung gleichermaßen Nukleinsäuren, die eine oder mehrere der Sequenzen enthalten, die jede 64 Tripletts der oben genannten Art umfassen.
Die Erfindung betrifft ferner durch kovalente Kupplung erhaltene Verbindungen von erfindungsgemäßen Peptiden (oder der genannten Oligomere) mit Trägermolekülen (natürlich oder synthetisch), die physiologisch akzeptabel und nicht toxisch sind, mit komplementären reaktiven Gruppierungen, die entsprechend vom Trägermolekül und dem Peptid getragen sind. Beispiele von geeigneten Gruppierungen sind im Folgenden dargestellt:
Als Beispiel von Trägermolekülen oder makromolekularen Trägern, die die Konstitution der Verbindungen gemäß der Erfindung bilden, sind natürliche Proteine, wie Tetanusanatoxin, Ovalbumin, Serumalbumine, Hämocyamine usw. ... zu nennen.
Als makromolekulare synthetische Träger sind zum Beispiel Polylysine oder Poly(D-L-alanin)-poly(L-Lysin) zu nennen.
Die Literatur nennt andere Arten von makromolekularen Trägern, die verwendet werden können, welche im Allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als 20000 aufweisen.
Zum Synthetisieren der erfindungsgemäßen Verbindungen kann man an sich bekannte Verfahren anwenden, wie sie von FRANTS et ROBERTSON in Infect. and Immunity, 33, 193–198 (1981) beschrieben sind, oder wie in Applied and Environmental Microbiology (Okt. 1981), Bd. 42, Nr. 4, 611–614 von P. E. KAUFFMAN beschrieben ist, wobei das Peptid und das geeignete Trägermolekül verwendet werden.
In der Praxis werden als Kupplungsreagens mit Vorteil die folgenden Verbindungen verwendet, die ohne einschränkend zu sein umfassen: Glutaraldehyd, Ethylchloroformiat, wasserlösliche Carbodiimide [N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, HCl], Diisocyanate, Bisdiazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Cyanogenbromide sowie Kupplungsreagenzien, die in Scand. J. Immunol. (1978), Bd. 8, 7–23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON) genannt sind.
Es kann jedes Kupplungsverfahren angewendet werden, das einerseits eine oder mehrere reaktive Funktionen des Peptides und andererseits eine oder mehrere reaktive Funktionen des Trägermoleküls teilnehmen lässt. Mit Vorteil handelt es sich um Carboxyl- und Aminfunktionen, welche eine Kupplungsreaktion stattfinden lassen in Gegenwart eines Kupplungsmittels von der Art wie sie bei der Proteinsynthese verwendet werden, zum Beispiel 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, N-Hydroxybenzotriazol usw. ... Es kann auch Glutaraldehyd verwendet werden, insbesondere wenn es sich darum handelt, Aminogruppen miteinander zu verknüpfen, die jeweils vom Peptid und dem Trägermolekül getragen sind.
Eine gemäß der Erfindung bevorzugte Gruppe von Molekülen ist durch jene gebildet, die eine α-Helixkonformation besitzen, wobei die letztere die antigenen und immunogenen Eigenschaften der genannten Moleküle verstärkt. Solche Moleküle mit einer α-Helixkonformation wurden durch zirkularen Dichroismus in Trifluorethanol oder in wässriger Lösung nachgewiesen.
Die erfindungsgemäßen Moleküle besitzen charakteristische Antigeneigenschaften des Antigens 48 Kd des spezifischen Merozoiten des Erythrocytenstadiums der Entwicklung von P. falciparum, und zeigen die besonderen Charakteristiken wie sie oben beschrieben sind.
In der Tat reagieren die Moleküle gemäß der Erfindung, wie besonders mit Hilfe von Beispielen der erfindungsgemäßen Moleküle in der folgenden ausführlichen Beschreibung beschrieben wird, spezifisch mit den Antiprotein-Antikörpern 48 Kd des Hauptisotyps IgG2 oder IgM bei für die Infektion empfindlichen Patienten und dem Hauptisotyp IgG1 oder IgG3 bei geschützten Personen.
Diese erfindungsgemäßen Moleküle sind in der Lage, in vivo die Synthese von spezifischen Immunoglobulinen auszulösen, und können in vivo die Neutralisation des im Blut vorhandenen Merozoiten induzieren, seinen Prozess in den Monocyten und die Inaktivierung der intraerythrocytären Entwicklung des P. falciparum als Folge der Wechselwirkung zwischen den Monocyten und den freien extraerythrocytären Parasiten oder Merozoiten mittels eines cytophilen Antikörpers durch Verbindung des Fragments Fc des Immunoglobulins mit dem Rezeptor des Monocyten.
1 entspricht dem Nachweis des Parasitenproteins von 48000 (durch Pfeile angegeben) im Immunoblot. Die Reaktivität des Serums von Mäusen, die mit DG210 immunisiert wurden, wird im Immunotrans fer auf Antigenen der Blutstadien von P. falciparum untersucht, die in SDS (ser anti-R210) oder Triton-X114 Tensidphase (A) und wässriger Phase (B) extrahiert sind. Die Reaktivität von menschlichem Serum wird auf SDS-Extrakten untersucht, die die Isotypen IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3) und IgG4 (4) zeigen. SHI: hyperimmunes Serum.
Im folgenden Beispiel sind, wie in allen in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Versuchen, die Immunoglobuline von menschlichem Plasma durch das von A. SABCHAREON et al., J. Trop. Med. Hyg. 1991, 45(3): 297 beschriebene Verfahren erhalten. Der ADCI-Test ist oben beschrieben.
Im folgenden Beispiel werden die spezifischen Inhibierungsindices (I. S.) verglichen, die mit Serum von Mäusen erhalten wurden, die mit Peptid III immunisiert sind, sowie mit Antikörpern immuner Menschen des Peptids III, die mit Hilfe einer Affinitätsträgersäule gereinigt wurden (Technik in OKAZI et al. beschrieben). Beide sind in der Lage, das Protein 48 Kd zu erkennen, bei indirekter Immunofluoreszenz ebenso wie in Western Blott Tests, und dies unter den selben Bedingungen wie zuvor (IgG2 von empfindlichen Patienten und IgG1 und IgG3 von geschützten Patienten). Schließlich bestätigen die immunogereinigten Antikörper wie die durch Injektion des Peptids III in Mäuse induzieren Antikörper, geprüft in ADCI-Tests, dass sie in der Lage sind, die Inaktivierung des Parasiten mittels Monocyten zu induzieren.
Die folgende Tabelle I fasst die Ergebnisse der Beobachtungen zusammen
Tabelle 1
Darin stellt Pshi ein hyperimmune Serumprobe dar, shi 1 und 2 hyperimmune Seren von zwei verschiedenen Spendern, spi und anti-βgal, Referenzen erhalten aus Serum nach einer ersten Invasion und eine Referenz anti-βgal; anti-DG210 sind gereinigte Antikörper gegen Peptid I, anti-210B (1) sind gereinigte menschliche Antikörper gegen Peptid III, anti-210B (2) sind bei der Maus induzierte Antikörper und anti-R328 und R414 sind gereinigte Antikörper gegen von anderen Klonen stammende Peptide.
Der spezifische Index der Inhibierung ist nach der ADCI-Technik gemessen.
Die erfindungsgemäßen Moleküle sind also in der Lage, die Synthese von Antikörpern einer Klasse zu induzieren, die in der Lage sind, mit Monocyten zusammenzuwirken.
Die Proteine und Peptide der Erfindung sind nicht auf diejenigen beschränkt, die hier besonders beschrieben sind.
Die Erfindung zielt auf alle natürlichen, genetisch rekombinierten oder synthetischen Peptide oder Polypeptide ab, die die selben Eigenschaften aufweisen und die Mechanismen der Immunabwehr induzieren können, die bei gegen Malaria geschützten Personen entwickelt und charakteristisch sind.
In diesem Aspekt zielt die Erfindung insbesondere auf Epitope des Proteins 48 Kd, die sich von den obigen Polypeptiden II, III und IV unterscheiden. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Immunoglobuline von bestimmten Personen mit einem Epitop des Proteins 48 Kd im Western Blott reagieren, während die selben Immunoglobuline das vom Klon DG210 exprimierte Antigen nicht erkannten.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen polyklonale oder monoklonale Antikörper, die das Merkmal aufweisen, dass sie Moleküle der Erfindung erkennen und mit den Monocyten zusammenwirken, und in pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Schutz von Personen, die infiziert sind und Symptome der Krankheit zeigen oder zeigen können, durch passive Immuntherapie verwendet werden können.
Die monoklonalen Antikörper können nach klassischen Techniken durch Hybridomtechnik hergestellt werden, umfassend:

– Fusion einer myelomatösen Zelle mit Milzzellen eines Tieres, das zuvor mit einem der erfindungsgemäßen Antigene immunisiert wurde,
– Kultur der zuvor durch Fusion der Zellen gebildeten Hybridome und
– Auswahl der Hybridome, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu bilden, die das zur Immunisierung der Tiere verwendete Antigen erkennen.

Die zur Immunisierung gewählten Tiere können zum Beispiel Mäuse sein.
Unter den monoklonalen Antikörpern werden mit Vorteil die cytophilen monoklonalen Antikörper ausgewählt, das heißt diejenigen, deren Fragment Fc in der Lage ist, sich auf den Rezeptor Fc der menschlichen Monocyten zu fixieren.
Eine andere Technik zur Herstellung von Antikörpern kann ermöglichen, monoklonale humane Antikörper in vitro darzustellen. Um dieses zu erreichen, werden immortalisierte B-Lymphocyten verwendet, zum Beispiel mit dem Epstein-Barr-Virus. Diese Lymphocyten können bei einer Person entnommen werden, die durch P. falciparum infiziert wurde. In diesem Fall ermöglichen sie die Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen zahlreiche Antigene, ohne dass eine Stimulation in vitro durch neue Antigene erforderlich ist.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, auf die oben beschriebene Weise immortalisierte B-Lymphocyten mit Lymphocyten B des Menschen zu fusionieren, die zuvor in vitro mit einem erfindungsgemäßen Antigen stimuliert wurden, gegen das man monoklonale Antikörper zu bilden sucht, wobei die Kulturbedingungen die Stimulatin der Lymphocyten erlauben.
Mit Vorteil verwendet man die von Desgranges C et al. (1987, J. of Virological Methods, Bd. 16, S. 281–292) beschriebene Technik für die Herstellung von monoklonalen humanen Antikörpern der Erfindung.
Es ist im Rahmen der Erfindung gleichermaßen vorgesehen, humane monoklonale Antikörper durch genetische Rekombination herzustellen, wobei eine Transfektion in vitro des für den variablen Teil des Antikör pers kodierenden Gens vorgenommen wird, in Bakterien infizierenden Vektoren unter Bedingungen, die die Expression eines menschlichen Immunoglobulins ermöglichen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung jede Art von Chimären und Hybriden von monoklonalen Antikörpern und auch jedes Fragment von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern des Typs Fab oder Fab'2, und die den selben Affinitätsmerkmalen für die Epitope des Proteins 48 Kd oder der Peptide I, II und III, IV entsprechen.
Gemäß der Erfindung bevorzugte monoklonale Antikörper sind die humanen Antikörper der Klasse IgG1 oder IgG3, oder beim Tier erhaltene Antikörper, die beim Menschen cytophile Eigenschaften aufweisen, die gegen eines oder mehrere der Antigene gerichtet sind, deren Sequenz oben beschrieben wurde.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zur Durchführung der Impfung eines Patienten gegen die Infektion gegen P. falciparum, ausgehend von einer biologischen Probe wie Blut, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– in Kontakt bringen einer biologischen Probe, die Schutzantikörper gegen P. falciparum enthalten kann, mit mindestens einem Antigen gemäß der Erfindung,
– Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion.

Zur Durchführung dieses Nachweisverfahrens in vitro werden die erfindungsgemäßen Antigene mit Vorteil mit Hilfe eines radioaktiven Markers, enzymatischen Markers oder fluoreszierenden Markers oder auch mit einem Marker vom Typ eines physikalischen Markers markiert.
Die Erfindung zielt gleichermaßen auf Kits zum in vitro Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen An tigene gerichtet sind, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie enthalten:

– eine Antigenzusammensetzung, die mindestens ein Antigen gemäß der Erfindung enthält,
– Reagenzien, die für die Durchführung der immunologischen Reaktion zwischen den genannten Antigenen und den eventuell in der biologischen Probe vorhandenen Antikörpern notwendig sind,
– Reagenzien, die den Nachweis des durch die immunologische Reaktion gebildeten Komplexes ermöglichen.

Diese Reagenzien sind zum Beispiel Träger eines Markers oder können durch ein markiertes Reagens erkannt werden.
II – Isolierung des Klons DG210
a) Aufbau der Bank
Es wurde eine Bank der genomischen DNA (DNS) im Bakteriophagen der Expression λgt11 konstruiert, wobei die genomische DNA des Klons Tak 9-96 von P. falciparum verwendet wurde (siehe clone Tak 9-96: Science 212, 137; 1981), wobei das ausführlich in der EP-Patentanmeldung vom 9. Februar 1987 veröffentlicht unter Nummer 034186 beschriebene Protokoll verfolgt wurde.
Kurz gesagt, die DNA wurde in Gegenwart von Mn²⁺-Ionen durch DNAase I abgetrennt, durch Methylase EcoRI methyliert, um die natürlichen EcoRI-Stellen zu schützen, dann mit der DNA-Polymerase des Bakteriophasen T4 und der DNA-Ligase von EcoRI repariert. Es wurden synthetische oligomere „Linker" EcoRI mit Fragmenten der DNA von P. falciparum verknüpft und die so eingefügten künstlichen Stellen durch Abtrennen mit dem Enzym EcoRI freigesetzt. Die Fragmente wurden auf Sucrosegradient gereinigt und mit auf geeignete Weise hergestellter DNA des Vektors λgt11 verknüpft (das heißt mit EcoRI abgetrennt und dephosphoryliert – vertrieben von Promega Biotec). Die DNA wurde in vitro in Viruspartikel eingekapselt. Die nach dieser Verfahrensweise erhaltenen Bakteriophagen bilden die genomische DNA-Bank.
b) Immunologisches Screening der Bank
Die technischen Details des Screening sind im Text der Patentanmeldung 0343186 angegeben. In einer Serie von früher verwendeten monoklonalen Antikörpern (AcM), ist AcM 245 (Soulier et al., Revue Francaise de Transfusion et Immunohematologie, Band XXV, Nr. 4, 1982, Seite 373) der Klasse IgM, eine Klasse von Antikörpern, die nicht in der Lage ist mit den Monocyten zusammenzuwirken, der einzige, der sich im ADCI-Test als fähig erwiesen hat, mit den aktiven polyklonalen Antikörpern der immunen Person in Konkurrenz zu treten, das heißt, den Inhibierungseffekt dieser Antikörper im ADCI merklich zu reduzieren, was nahe legt, dass das Zielepitop der Antikörper, die mit den Monocyten zusammenwirken können, und das von AcM 245 identisch ist. Dieser Antikörper wurde für die Isolierung des Gens durch Screening einer im Expressionsvektor λgt11 geklonten genomischen DNA-Bande verwendet.
Ein direktes Screening durch Antigen/Antikörper-Reaktion der Bank hat sich als fruchtlos erweisen. Inwieweit dieses AcM in der Lage ist, mit anderen Antikörpern für ein Epitop in Konkurrenz zu treten, das vom Parasitenprotein getragen ist, wurde ein anderes Screeningverfahren verwendet.
Die rekombinanten Antigene wurden durch einen Konkurrenztest mit indirekter Immunfluoreszenz gescreent. Der monoklonale Antikörper AcM 243 wurde ein Gegenwart des Merozoiten mit jedem der rekombinanten Antigene inkubiert (Überstand der verschiedenen Klone der Genomban de) und die Inhibierung der Fixierung des Antikörpers auf dem Parasiten wurde durch indirekte Immunfluoreszenz gemessen (Technik beschrieben in H. BOUHAROUN-TAYOUN et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1633–1641).
Sechs Antigene haben sich als positiv erwiesen, das heißt blockierend, und wurden im Detail untersucht. Diese so ausgewählten sechs Antigenproteine wurden auf Harzen fixiert, um Reinigungen durch Affinität der polyklonalen Antikörper aus Seren immuner Menschen, gemäß der von OKAZI et al. beschriebenen Technik durchzuführen. Die so gereinigten Immunglobuline wurden untersucht. Darunter erkennt eines, das durch Fixierung auf dem durch den Klon DG210 synthetisierten Protein erhalten ist, im Western Blott die Doublette von 48 Kd, deren Doublette identisch zu sein scheint zu der, die von den cytophilen Klassen der IgG erkannt wurde, die bei Erwachsenen in einem klinischen Resistenzzustand gegen die Krankheit gefunden wurden und von den nicht cytophilen Klassen von empfindlichen Personen. Im Gegenzug unterscheidet es sich vom Antigen MSA2, einem Antigen der Oberfläche des Merozoiten, das auf dem selben Gen erscheint wie ein Polypeptid mit einem höheren Molekulargewicht (Figuren). Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, dass die durch Immunaffinität isolierten Antikörper auf dem vom Klon DG210 ausgeschiedenen Protein in der Lage sind, in vitro den Inhibierungseffekt des Wachstums des Trophozoiten zu bewirken, induziert durch die Monocyten nach der ADCI-Technik.
Der Klon DG210 wurde bei der CNCM am 19. Oktober 1992 unter der Nummer I-1270 hinterlegt.
Charakterisierung des vom Klon DG210 synthetisierten Proteins
Die auf diesem Protein immunabsorbierten humanen Antikörper sowie jene, die von der Maus durch Immunisierung mit dem Klon DG210 pro duziert wurden, zeigen bei indirekter Immunfluoreszenz ein knäuelförmiges Bild, das den Umkreis der Merozoiten nachzeichnet, inmitten von reifen intra-erythrocytären Schizonten. Dieser Hinweis, dass das Molekül auf Höhe der Membran der Merozoiten gelegen ist, wurde einerseits bestätigt durch Extraktion mit einem nichtionischen Tensid, dem Triton X 114, ausgehend von gereinigten Merozoiten und Nachweis des Proteins in der löslichen „Tensidphase"; andererseits durch Wirkung der Phospholipase C von Bacillus aureus, wobei dieses Enzym das Protein ausgehend von einem Präparat gereinigter Merozoiten freisetzt, was auf diese Weise anzeigt, dass dieses durch eine Phosphatidylinositolgruppierung verankert ist; schließlich durch Darstellung der Lage von Antikörpern im Elektronenmikroskop mit Hilfe eines zweiten mit kolloidalem Gold markiertem Antikörper: Diese Antikörper sind prinzipiell gegen ein Ag gerichtet, das auf der Oberfläche der Merozoiten von P. falciparum gelegen ist.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass das zum Stimulieren des untergeordneten Cytotoxizitätsmechanismus von Antikörpern (ADCI) fähige Antigen auf der Oberfläche der extrazellulären Form des Parasiten gelegen ist, dem Merozoiten. Außerdem weisen die durch Immunoaffinität auf dem rekombinanten Produkt des Klons DG210 erhaltenen Antikörper im ADCI-Test eine sehr starke Inhibierungswirkung auf das Wachstum von P. falciparum auf, während die selben Antikörper keinerlei Wirkung auf die Infektion der roten Blutkörperchen durch den Merozoiten aufweisen. Die auf die selbe Weise hergestellten Kontrollantikörper mit anderen Kontrollrekombinationsproteinen wie MSA2 und RESA weisen keinerlei Inhibierungseffekt auf, weder direkt noch in ADCI-Versuchen (Figur). Die Ergebnisse finden sich in drei getrennten Experimenten, die drei verschiedene Antikörperisolate einsetzen. Zwei dieser Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Diese Ergebnisse sind durch komplementäre Beobachtungen bestätigt. Die Isotypenverteilung der gegen das rekombinante Protein gerichteten Antikörper vom Klon DG210 weist die folgenden Merkmale auf. Isotypen IgG2 werden viel häufiger bei nicht geschützten Patienten angetroffen, während das Protein bevorzugt durch die cytophilen IgG1 und IgG3 im Blut von geschützten Personen erkannt wird. Daher weisen die im rekombinanten Protein des Klons DG210 enthaltenen Epitope alle die gesuchten Merkmale für ein Protein mit Impfstoffwirkung auf, insbesondere weil sie in vivo nicht cytophile Antikörper bei nicht geschützten Personen induzieren können, die hingegen bei geschützten Personen cytophil sind und daher in der Lage sind, die ADCI-Reaktion in vivo zu induzieren.
Schließlich zeigt die Untersuchung der Lymphoproliferationsreaktion von 70 Personen, die Malaria ausgesetzt sind (im Senegal und in Madagaskar), dass die Peptide II, III und IV Epitope definieren, die von T-Lymphocyten erkannt werden.
Bei der Krankheit ausgesetzten Personen wurde ein starkes Vorherrschen von lymphoproliferativen Reaktionen (> 50% der Untersuchung) beobachtet.
Sequenzierung und Charakterisierung des Genoms vom Klon DG210
Das Genom des Klons DG210 besitzt eine Länge von 1300 Basenpaaren. Die Größe konnte durch Durchführung des von McCutchans beschriebenen Verfahrens bestimmt werden (McCutchan et al. (1984), Science 225: 625–627). Kurz gesagt, das Genom wurde nach den Fachleuten bekannten Techniken durch Endonuklease der Bohne (Mung-Bohne) digeriert, die Restriktionsfragmente anschließend mit der mit Phosphor 32 markierten Sonde DG210 hybridisiert und durch Autoradiographie nachgewiesen.
Die Untersuchung dieser Fragmente im „Northern Blott" und mit Nachweis durch die selbe radioaktive Sonde hat bestätigt, dass das Gen in der Erythrocytenphase des Parasitenzyklus exprimiert wird.
Die Analyse der Sequenz der 192 Basenpaare des Inserts wurde nach dem Verfahren von Sanger et al. (PNAS, 74: 5463, 1977) vorgenommen, die als „2-Desoxyterminierung" bezeichnet wird.
Die Erfindung betrifft ferner rekombinanten Nukleinsäuren, die mindestens eine der Polypeptidsequenzen I, II, III oder IV enthalten, sowie die Mikroorganismen, insbesondere die Bakterien E. coli, die durch diese rekombinanten Nukleinsäuren transformiert sind und in der Lage sind, die Polypeptide zu exprimieren.
Die Erfindung betrifft diese Nukleinsäuresequenzen oder äquivalente Sequenzen, die synthetisiert werden können und die für die selben Aminosäuren kodieren.
Für die Fachleute ist unmittelbar ersichtlich, dass in diesen Sequenzen bestimmte Nukleotide auf Grund der Degeneration des genetischen Kodes durch andere ersetzt sein können, ohne dass deshalb die kodierten Peptide modifiziert sind. Alle diese Nukleotidsequenzen sowie jene, die für die Polypeptide kodieren, die sich von den vorherigen durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden, ohne dass ihre immunogene Aktivität auf merkliche Weise modifiziert wird, sind Teil der Erfindung. Daraus ergeben sich auch Nukleotidsequenzen, die rekonstituiert sein können und die in der Lage sind, für Oligomere zu kodieren, wie sie oben definiert sind. Die Monomerenstruktureinheiten sind ohne Einfluss auf die immunogenen Eigenschaften der so gebildeten Oligomere direkt oder durch Vermittlung von Peptidsequenzen verknüpft.
Schließlich betrifft die Erfindung durch diese Sequenzen modifizierte Vektoren, wobei diese Vektoren natürlich mit Regulation und Terminierung versehen sind, die den oben genannte Nukleinsequenzen voranstehen oder folgen, die die Expression dieser Nukleinsequenzen in kompetenten Zellorganismen erlauben.
Unter den Nukleotidsequenzen, die für die charakteristischen Peptide kodieren, die oben definiert wurden, werden jene genannt, die für die folgenden Triplettsequenzen charakteristisch sind, wobei von diesen Sequenzen insbesondere die erste dem Peptid I entspricht, und die drei folgenden den Peptiden II, III und IV, deren Formeln zuvor angegeben wurden.
Bakterien, die die oben genannten Klone DG210 beherbergen, wurden bei der Collection Nationale des Cultures de Microorganismes des Institut Pasteur de Paris (CNCM) am 19. Oktober 1992 unter der Nummer I-1270 hinterlegt.
Die Erfindung hat auch Abschnitte von DNA oder RNA zum Gegenstand, die zum Beispiel im Rahmen der Synthese von Nukleotidsequenzen verwendbar sind, eventuell gefolgt von der Polypeptidsynthese gemäß der Erfindung nach der PCR-Technik (Polymerase Chain Reaction. Polymerasekettenreaktion, wie sie in den amerikanischen Patenten Nr. 4683212 und 4683195 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 200362 beschrieben sind. Eine Beschreibung des hier verwendeten Verfahren findet sich in der PCT-Patentanmeldung Nr. FR 91/00639 auf den Seiten 28 bis 30.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch nach klassischen Techniken aus dem Bereich der Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Synthese kann in homogener Lösung oder in Feststoffphase durchgeführt werden, wie es oben bei der Technik von HOBENWEYL oder MERRYFIELD beschrieben ist.
III Untersuchung des Polymorphismus des Gens und der durch den Klon DG210 definierten Epitope
Ein Haupthindernis bei der Ausbildung eines wirksamen Impfstoffs ist, neben der Komplexität des Zyklus des Parasiten, seine antigene Vielfalt, und des hohe Maß an Polymorphismus von einem Stamm zum anderen.
Die Konservierung des Gens und der definierten Epitope im Klon DG210 wurde nach zahlreichen Techniken in einer Reihe von Plasmodienisolaten untersucht.
Unter Verwendung der folgenden Nukleotide als Abschnitt:
GAA AGG GCA AAA AAT GCT TAT (5)
oder TAA AAG GAA TCT ATA TAA AAG (6)
konnten die DNA-Fragmente von zwei Kulturen aus kultivierten Stämmen von afrikanischen P. falciparum aus 4 Thai-Isolaten und 29 Afrika-Isolaten nach der PCR-Technik amplifiziert werden.
Das entsprechende Gen war überall vorhanden, ohne erkennbare Polymorphie in der Größe, während ähnliche Versuche nach der selben PCR-Technik mit Abschnitten der Regionen MSA1 und MSA2 dieses Ergebnis nicht bestätigen konnten.
Gleichermaßen hat Screening von Proteinen und Peptiden nach Western Blott, hergestellt ausgehend von 6 Thai-Isolaten oder afrikanischen Isolaten mit durch eine Affinitätskolonne mit dem Peptid 210 als Ligand gereinigten Antikörpern, ermöglicht, die Doublette bei 48 kD in allen Varianten, ohne Modifikation des Molekulargewichts von einem Isolat zum anderen nachzuweisen.
Schließlich wurden 10 Kongo-Isolate durch indirekte Immunfluoreszenz nach der selben Technik wie oben untersucht und waren alle positiv und alle Parasiten in jedem der Isolate wurden durch nach Affinität gereinigten Antikörpern markiert.
Alles scheint das Fehlen eines antigenen Polymorphismus anzuzeigen, mindestens in dem Bereich des Moleküls, das das Epitop B trägt, ebenso wie die Konservierung der Größe dieses Proteins von einem Isolat zum anderen.
Diese Ergebnisse bestätigen die bei ADCI und insbesondere in den Konkurrenztests erhaltenen, in denen die nicht cytophilen Antikörper, die nach einem primären Angriff durch den Parasiten erhalten sind, ausgezeichnete Konkurrenten der cytophilen Antikörper von präimmunisierten Erwachsenen sind.
In dem Maß wie die nicht cytophilen Antikörper, die nach einem primären Angriff erhalten sind, einem einzigen Isolat entsprechen, und die präimmunisierten Erwachsenen gegen die Infektion einer großen Zahl von polymorphen Isolaten geschützt sind (die außerdem in Konkurrenzversuchen isoliert wurden) kann mit Recht geschlossen werden, dass die betreffenden Epitope in den Konkurrenzversuchen für nicht polymorphe, konservierte Regionen repräsentativ sind.
Die Polypeptide und Proteine der Erfindung sind damit durch ein großes Wirkungsspektrum als Impfstoffzusammensetzung gekennzeichnet.

Claims

Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Oberflächenprotein des Merozoiten von Plasmodium falciparum mit einem Molekulargewicht von 48000 ± 10% Dalton handelt, und dass es prinzipiell von cytophilen Antikörpern von Patienten erkannt wird, die gegen Infektion durch Plasmodien geschützt sind und von nicht cytophilen Antikörpern von Patienten erkannt werden, die für eine Infektion durch Plasmodien empfänglich sind.
Molekül, Peptid oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass sie spezifisch von Antikörpern erkannt werden, die spezifisch Epitope erkennen, die vom Oberflächenprotein des Merozoiten von Plasmodium falciparum gemäß Anspruch 1 getragen sind, und dass sie prinzipiell von cytophilen Antikörpern von Patienten erkannt werden, die gegen Infektion durch Plasmodien geschützt sind und von nicht cytophilen Antikörpern von Patienten erkannt werden, die für eine Infektion durch Plasmodien empfänglich sind.
Peptid gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die durch die Formel I dargestellte Peptidsequenz umfasst:
oder jede Sequenz, die mindestens 80% Homologie mit diesem Peptid aufweist.
Peptide gemäß Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie vom Peptid der Formel I abgeleitet sind und dass ihre Sequenzen insbesondere unter den Peptiden der folgenden Formel II, III oder IV gewählt sein können:
Moleküle, Proteine oder Peptide gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer großen Anzahl von Isolaten von Plasmodien nachweisbar sind.
Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Oligomer mit einer oder mehreren der obigen Sequenzen I bis IV oder einer Kombination dieser Sequenzen gebildet ist.
Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es auf einem Träger fixiert ist.
Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie spezifisch mit den Antikörpern reagieren, die gegen das Oberflächenprotein des Merozoiten mit einem Molekulargewicht von 48000 Dalton gerichtet sind, welche Antikörper bevorzugt einen nicht cytophilen Charakter aufweisen bei Patienten, die für eine Infektion durch Plasmodien empfänglich sind, und bevorzugt einen cytophilen Charakter aufweisen bei Patienten, die gegen Infektion durch diesen Parasiten geschützt sind.
Immunogene Zusammensetzung, gekennzeichnet durch Assoziation eines Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem pharmazeutisch akzeptablen Schlepper.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Synthese von Antikörpern mit cytophilem Charakter gegen das Immunogen induziert, welche Antikörper in der Lage sind, eine cytotoxische Reaktion gegen Erythrocytenstadien des Parasiten oder einen seiner Vorläufer zu induzieren.
Impfstoffzusammensetzung gegen Malaria umfassend unter anderem Immunogenprinzipien, ein Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass sie Moleküle, Proteine oder Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erkennen.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie geeignet sind, eine cytotoxische Reaktion gegen Erythrocytenstadien des Parasiten oder einen seiner Vorläufer zu induzieren.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese Reaktion durch Monocyten oder Macrophagen vermittelt ist.
Hybride Antikörper oder Antikörperchimären nach einem der Ansprüche 12 bis 14 und mit denselben Merkmalen wie diese Antikörper, insbesondere zum Induzieren einer cytotoxischen Reaktion gegen Erythrocytenstadien des Parasiten oder einen seiner Vorläufer.
Zusammensetzung gekennzeichnet durch Assoziation von Antikörpern nach den Ansprüchen 12 bis 15 mit einem pharmazeutisch akzeptablen Schlepper.
Zusammensetzung zur passiven Immuntherapie von Patienten, die für eine Infektion durch einen Parasiten der Familie der Plasmodien empfänglich sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie Antikörper nach einem der Ansprüche 12 bis 16 enthält.
Diagnoseverfahren auf Malaria in vitro bei einer Person, die von einem Plasmodium infiziert werden kann, das umfasst: in Kontakt bringen eines biologischen Gewebes oder Fluids, das von einer Person entnommen wurde, mit einer Polypeptidzusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 8 unter Bedingungen, die eine immunologische Reaktion in vitro zwischen der Polypeptidzusammensetzung und den eventuell vorhandenen Antikörpern im biologischen Gewebe oder Fluid ermöglichen, und die Erfassung des eventuell gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes in vitro.
Diagnoseverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es auf die Diagnose eines weiten Spektrums von Infektionen durch ein Plasmodium anwendbar ist.
Kasten oder Kit zur Diagnose auf Malaria in vitro bei einer Person, die von einem Plasmodium infiziert werden kann, das umfasst: – eine Polypeptidzusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 8, – Reagenzien für die Herstellung eines Milieus, das die Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion begünstigt, – Reagenzien, die den Nachweis des gebildeten Komplexes ermöglichen; wobei diese Reagenzien auch einen Marker tragen können oder geeignet sind, dass sie selbst von einem markierten Reagenz erkannt werden, insbesondere im Falle, wo die oben genannte Polypeptidzusammensetzung nicht markiert ist.
Kasten oder Kit zur Diagnose auf Malaria in vitro bei einer Person, die von einem Plasmodium infiziert werden kann, das umfasst: – eine Antikörperzusammensetzung nach den Ansprüchen 12 bis 15, – Reagenzien für die Herstellung eines Milieus, das die Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion begünstigt, – Reagenzien, die den Nachweis des gebildeten Komplexes ermöglichen; wobei diese Reagenzien einen Marker tragen können oder geeignet sind, dass sie selbst von einem markierten Reagenz erkannt werden, insbesondere im Falle, wo die oben genannte Polypeptidzusammensetzung nicht markiert ist.
DNA-Moleküle, die für die Moleküle, Proteine oder Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodieren.
Rekombinante DNA-Moleküle, die mindestens eine der DNAs des Anspruch 22 enthalten.
Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Sequenz nach den Ansprüchen 22 und 23 enthalten ist und dass sie durch die Formel dargestellt ist:

oder jede Formel, die mindestens 80% Homologie mit der Formel (1) aufweist.
Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Sequenz nach den Ansprüchen 22 bis 24 enthalten ist, geeignet ist, die Peptidsynthese zu induzieren, die eine antigene Kreuzreaktion mit dem Protein mit 48000 Dalton der Merozoiten von Plasmodium falciparum darstellt, und dadurch, dass sie insbesondere durch eine der folgenden Formeln dargestellt ist:
Rekombinante Vektoren zum Klonen und/oder zur Expression, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 22 bis 25 umfassen, gegebenenfalls unter Kontrolle eines Promotors und von Regulationselementen, die zum Wirt homolog oder heterolog sind, zur Expression in einem bestimmten Zellwirt.
Rekombinanter Zellwirt, dadurch gekennzeichnet, dass er von einem Vektor nach Anspruch 26 transformiert wird, unter Bedingungen, die die Expression der Sequenz von P. falciparum nach einem der Ansprüche 22 bis 25 ermöglicht, und dadurch, dass es sich insbesondere um ein Bakterium wie E. coli, eine Hefe, eine Insektenzelle oder um eine Säugerzelle wie CHO handelt.
Rekombinanter Zellwirt nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um dem Stamm DG210 handelt, der am 19. Oktober 1992 unter der Nummer I-1270 bei der CNCM deponiert wurde.