DE3586853T2 - Immunologisch aktive Peptide, geeignet zur Einführung von Immunisierung gegen Malaria und deren Kodierung von Genen. - Google Patents
Immunologisch aktive Peptide, geeignet zur Einführung von Immunisierung gegen Malaria und deren Kodierung von Genen.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft immunologisch aktive Mittel, die fähig sind, bei Menschen und anderen Tieren Immunantworten gegen Infektion durch Malaria-Erreger bzw. -Parasiten und insbesondere gegen den Menschen-Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum auszulösen bzw. zu induzieren.
- Es ist klar, daß Impfstoffe zum Abschwächen des gegenwärtigen weltweiten Wiederauflebens der Malaria notwendig sind. Weil Immunität bei Malaria stadiumspezifisch ist, werden gegen jedes Stadium im Lebenszyklus des Malariaerregers, und zwar gegen Sporozoiten, das Stadium in der Stechmücke, das die Infektion beim Menschen auslöst; gegen ungeschlechtliche Parasiten, die die roten Blutkörperchen befallen, das Stadium, das die Krankheit verursacht; und gegen Gameten, das Stadium, das die Infektion auf Steckmücken überträgt; Impfstoffe entwickelt. Ein Interessengebiet ist ein Sporozoiten-Impfstoff, der, wenn er wirksam ist, das Immunsystem darauf vorbereiten würde, die Sporozoiten zu töten, die durch die Stechmücke /eingeimpft. werden, und auf diese Weise die nachfolgenden Stadien zu verhindern, die für die Krankheit und die Übertragung der Infektion auf andere verantwortlich sind.
- Tiere und Mensch sind früher durch Injektion bestrahlter Sporozoiten geschützt worden. Die Impfung mit bestrahlten Sporozoiten ist jedoch wegen des beschränkten Vorrats und der Instabilität von Sporozoiten unzweckmäßig. Die Verwendung monoklonaler Antikörper führte zur Entdeckung des Hauptoberflächenproteins an Sporozoiten von Plasmodium berghei, einem Nagetier-Malariaerreger [N. Yoshida, R.S. Nussenzweig, P. Potocnjak u. a., Science 207, 71 (1980)]. Dieses Protein bedeckt die Oberfläche des Sporozoiten und wird als Circumsporozoit-(CS-)Protein bezeichnet. Die Injektion monoklonaler Antikörper auf das CS-Protein von P. berghei schützte Mäuse vollkommen gegen eine Herausforderung durch infizierte Stechmücken [P. Potocnjak, R.S. Nussenzweig, V. Nussenzweig, J. Exp. Med. 151, 1504 (1980)]. Analoge CS-Proteine sind für Arten von Affen- und Menschen-Malariaerregern einschließlich P. falciparum, des hauptsächlichen Menschen-Malariaerregers, identifiziert worden [F. Santoro u. a., J. Biol. Chem. 258, 3341 (1983); E.H. Nardin u. a., J. Exp. Med. 156, 20 (1982)], obwohl die Struktur des P.-falciparum-Proteins vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt war. Das Gen für das CS-Protein des Affen-Malariaerregers, P. kleave, wurde wegen der Verfügbarkeit großer Zahlen von P.-kleave-Sporozoiten in infizierten Stechmücken für die Herstellung einer cDNA-Genbank zuerst kloniert [J. Ellis, L.S. Ozaki, R.W. Gwadz u. a., Nature 302, 536 (1983); G.N. Godson, J. Ellis, P. Svee u. a., Nature 305, 29 (1983)]. Dieses Gen codierte für ein Protein mit einer sich wiederholenden Aminosäuresequenz (12 Aminosäuren 12- mal wiederholt), die das Epitop enthielt, das die schützenden monoklonalen Antikörper band. Dieses sich wiederholende Epitop war das Hauptimmunogen an dem Protein, da monoklonale Antikörper bei dem immunradiometrischen Test den Zugang von polyklonalen Anti-Sporozoit-Seren zu mit Triton X-100 löslich gemachtem Protein blockierten [F. Zavala, A.H. Cochrane, E.H. Nardin u. a., J. Exp. Med. 157, 1947 (1983)].
- Eine antigene Substanz, die mit dem CS-Protein eines Menschen- Malaria-Parasiten verwandt ist, ist jedoch weiterhin nötig, weil Antikörper, die früher gegen dieses sich wiederholende Epitop von Affen-Parasiten hergestellt wurden, mit Menschen-Malaria-Parasiten nicht reaktiv sind.
- Es ist folglich eine Aufgabe dieser Erfindung, eine mit einem Menschen-Malariaerreger-Antigen assoziierte Peptidsequenz bereitzustellen, die fähig ist, in einem Menschen eine schützende Immunantwort auszulösen.
- Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, eine DNA-Sequenz bereitzustellen, die fähig ist, eine antigene Substanz mit solchen Eigenschaften zu exprimieren.
- Wie nachstehend klarer werden wird, sind diese und andere Aufgaben der Erfindung durch Bereitstellung eines immunologisch aktiven, im wesentlichen reinen Peptids gelöst worden, das entweder allein oder in dem Fall, daß es an einem Trägermolekül anhängt, fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort auszulösen, die mit Infektion durch einen Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist, wobei das erwähnte Peptid mindestens 2 aufeinanderfolgende Wiederholungen einer Sequenz Asn-X-Y-Pro enthält, worin X Ala oder Val ist und Y Asn oder Asp ist. Eine ähnliche Kreuzreaktion kann bemerkt werden, wenn das Peptid eine Sequenz der Formel Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly, worin Z Ser oder Thr ist, oder der Formel Lys-Pro-S-T-S-Lys- Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro, worin S Lys oder Asn ist, T His oder Glu ist, U Gly oder Asn ist, V Asp oder Glu ist und W Asn oder Gln ist, enthält.
- Die Erfindung schließt auch genetische Materialien ein, die zur Herstellung solcher Peptide in biologischen Systemen brauchbar sind wie z. B. die DNA-Sequenzen, die für die zu erzielenden Peptide codieren.
- Eine vollständigeres Verstehen der Erfindung und vieler der damit verbundenen Vorteile wird leicht erreicht werden, indem auf die folgende nähere Beschreibung Bezug genommen wird, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen in Betracht gezogen wird:
- Fig. 1 zeigt eine schematische Restriktionskarte und Sequenzierungsstrategie des Klons λmPf1. Die Positionen der in der Figur gezeigten Restriktionsschnittstellen wurden aus der Sequenz ermittelt und durch Abbau bzw. Verdauung bestätigt: A, AvaII; Ac, AccI; B, BstnI; D, DraI; Dd, DdeI; F, FokI; N, NdeI; R, RsaI; S, StuI; T, TthIII; Tq, TaqI; X, XhoII. Pfeile zeigen den Ausgangs- bzw. Startpunkt, die Richtung und die Länge bzw. Ausdehnung der ermittelten Sequenzen. Die CS-Protein- Codierungsregion ist bei einer dicken Linie gezeigt.
- Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz des CS-Protein-Gens von P. falciparum. Es ist die Nucleotidsequenz des CS-Protein-Gens in λmPf 1 gezeigt. Das EcoR1-Insert in λmPf1 wurde in pUC8 subkloniert und dann sequenziert. Die Sequenz beider DNA-Stränge wurde für 100% der CS-Protein-Codierungsregion und mehr als 70% der flankierenden Regionen ermittelt. Die Inserts der Klone λmPf5, 8, 13 und 15 wurden auch in pUC8 subkloniert und die Enden sequenziert. Die erste Base jedes Klons in 5'-Position zu der CS-Protein-Codierungsregion ist rechts von den Pfeilen angeordnet. Die EcoR1-Linker (GGAATTCC), die an beiden Enden der Inserts ligiert sind, sind nicht als Teil der Sequenz gezeigt. Die hergeleitete Aminosäuresequenz des CS-Proteins ist unterhalb der Nucleotidsequenz angegeben. Zwei Regionen des Proteins von P. falciparum, die dem P.-knowlesi-CS-Protein homolog sind, sind mit Region I und Region II bezeichnet. Die Repetier- bzw. Wiederholungseinheiten sind unterstrichen, und die abweichenden Aminosäuren in den Einheiten befinden sich in umrandeten Feldern. Das Amber-Codon in der Sequenz ist mit Sternen bezeichnet.
- Fig. 3 stellt in graphischer Form Daten dar, die die Hemmung der Bindung des gegen CS-Protein gerichteten monoklonalen Antikörpers, 2F1.1, durch synthetische Peptide der vorherrschenden sich wiederholenden Aminosäuresequenz zeigen. Synthetische Peptide, die zunehmende Längen der vorherrschenden Wiederholungssequenz enthielten, wurden hergestellt und verwendet, um die Bindung von 2F1.1 an ein Lyseprodukt von λmPf1, das in Y1089 wuchs, zu hemmen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung von drei Replikaten angegeben. Die geprüften synthetischen Sequenzen waren Asn-Pro-Asn-Ala ( ), Pro-Asn-Ala- Asn-Pro-Asn-Ala ( ) Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro- Asn-Ala ( ), Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala- Asn-Pro-Asn-Ala ( ) und ein nicht verwandtes Decapeptid ( ).
- Fig. 4 zeigt Formeln von Regionen der Homologie zwischen den CS-Proteinen von P. falciparum und P. knowlesi. Das Ende der Region I ist zwei Aminosäuren von der Wiederholungsregion des Proteins in P. falciparum entfernt. In P. knowlesi sind die letzten 3 Aminosäuren dieser Region Teil der Wiederholungsregion des Proteins.
- Die vorliegende Erfindung ergab sich zum Teil aus dem Herausfinden der Eigenschaften und der Struktur der immunologisch aktiven Segmente des CS-Proteins von P. falciparum. Die Erfinder haben bestätigt, daß monoklonale Antikörper, die mit dem CS- Protein von P. falciparum reaktiv sind, gegen sich wiederholende Einheiten gerichtet sind, die in dem Protein gefunden werden. Nun, da diese sich wiederholenden Einheiten (und andere Regionen des CS-Proteins, die gleichbleibende Regionen zu sein scheinen, die man bei mehreren Plasmodiumarten findet) identifiziert worden sind, ist es möglich, entweder auf dem Wege der chemischen Synthese oder auf biologischem Wege Peptide herzustellen, die diese immunodominanten Regionen enthalten und die die Grundlage für Impfstoffe bilden.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt folglich ein immunologisch aktives, im wesentlichen reines synthetisches Peptid, das entweder allein oder in dem Fall, daß es an einem Trägermolekül anhängt, fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort auszulösen, die mit einem Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist und gegen Infektion durch einen Malaria-Parasiten schützt, wobei das erwähnte Peptid mindestens 2 aufeinanderfolgende Wiederholungen einer Sequenz Asn-X-Y-Pro, worin X Ala oder Val ist und Y Asn oder Asp ist, oder eine Sequenz der Formel Thr-Glu-Trp-Z-Pro- Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly, worin Z Ser oder Thr ist, oder der Formel Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro, worin S Lys oder Asn ist, T His oder Glu ist, U Gly oder Asn ist, V Asp oder Glu ist und W Asn oder Gln ist, enthält. Demnach gibt es mindestens drei Variationen von Peptiden, die den gewünschten immunologischen Charakter haben: (1) ein Peptid, das die sich wiederholenden Einheiten, jedoch nicht die längeren Sequenzen enthält; (2) ein Peptid, das eine oder beide der zwei längeren Sequenzen (hier in dieser Anmeldung oft als Region I bzw. Region II bezeichnet) enthält; und (3) ein Peptid, das sowohl die sich wiederholenden Einheiten als auch eine oder beide der Sequenzen enthält, die als Region I und Region II bezeichnet werden.
- Ein Schlüsselmerkmal aller Peptide der Erfindung ist, daß sie entweder allein oder in dem Fall, daß sie an einem Trägermolekül anhängen, immunologisch aktiv und fähig sind, eine menschliche Immunantwort auszulösen, die gegen Infektion durch einen Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist. Es ist infolgedessen notwendig, daß mindestens ein Teil der aufgeführten Sequenzen an einer immunogen verfügbaren Oberfläche eines Peptids, das eine oder mehr als eine dieser Sequenzen enthält, vorhanden ist. Zum Aufbau eines Peptids, das diese Merkmale hat, stehen mehrere Verfahren zur Verfügung.
- Erstens ist es möglich, auf chemischem oder biochemischem Wege ein Peptid zu synthetisieren, bei dem die Peptide im wesentlichen aus den aufgeführten Sequenzen bestehen. Solche Peptide würden in den aufgeführten Sequenzen mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 40%, insbesondere mindestens 60% und besonders mindestens 80% ihrer Aminosäuren enthalten. Am meisten werden Peptide bevorzugt, die vollständig aus den aufgeführten Sequenzen bestehen (zusammen mit Peptiden, die als aus der aufgeführten Wiederholungssequenz bestehend angesehen werden können, bei denen an einem Ende oder an beiden Enden des Peptids 1 bis 3 terminale Aminosäuren des Peptids fehlen).
- Es ist auch möglich, Peptide aufzubauen, bei denen die aufgeführten Sequenzen von Aminosäuren an der Oberfläche des fertigen Peptids gefunden werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß eine oder mehr als eine der aufgeführten Sequenzen mittels einer Peptidbindung an eine Oberfläche eines zuvor hergestellten Peptids angeheftet wird.
- Die Fachleute auf dem Gebiet der Immunologie können jedoch auch in dem Fall, daß eine oder mehr als eine der aufgeführten Sequenzen im Inneren der Aminosäuresequenz eines größeren synthetischen Peptids oder Proteins enthalten ist, leicht ermitteln, ob das Peptid in dem Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung liegt. Nur die Peptide, die mit Antikörpern reaktiv sind, die gegen CS-Proteine produziert werden, werden als im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Ein Fachmann kann folglich leicht ein Peptid, das eine der Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthält, synthetisieren und dann durch Routineprüfung ermitteln, ob das fertige Produkt im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung liegt oder nicht, indem er das Protein mit einem Antikörper (vorzugsweise einem monoklonalen Antikörper) reagieren läßt, der gegen ein CS-Protein, vorzugsweise ein CS-Protein von P. falciparum, oder gegen ein Peptid, das im wesentlichen oder vollständig aus einer der in dieser Anmeldung ausdrücklich erwähnten Sequenzen besteht, produziert wird. Wenn eine positive immunologische Reaktion stattfindet, liegt das Protein im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung. Antikörper, die mit dem CS-Protein von P. falciparum reaktiv sind, sind allgemein bekannt und leicht erhältlich; sie werden beispielsweise durch die hinterlegte Hybridoma-Zellinie ATCC HB8583 hergestellt, die den Antikörper produziert, der hierin als 49.2F1.1 bezeichnet wird und der der Gegenstand der Ausscheidungsanmeldung Nr. . . . ist.
- Für die Größe von Molekülen der Erfindung gibt es keine Obergrenze außer den Grenzen, die durch die Fähigkeit zum Synthetisieren großer Peptidmoleküle festgelegt werden. Moleküle der Erfindung können in wäßrigen Lösungen entweder löslich oder unlöslich sein. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft nämlich die Synthese unlöslicher Peptide mit hoher Molmasse, die zerkleinert bzw. gemahlen und zum Induzieren eines immunologischen Schutzes in Form einer wäßrigen Suspension injiziert werden können. Trotzdem sind zur Ausführung der Erfindung auch kleinere Moleküle geeignet. Für die Praxis der vorliegenden Erfindung sind Moleküle geeignet, die 100, 200, 400 oder sogar 1000 Wiederholungseinheiten enthalten. Es scheint jedoch nicht notwendig zu sein, Peptide zu synthetisieren, die mehr als fünfzig Wiederholungseinheiten enthalten, da Peptide, die bis zu fünfzig Wiederholungseinheiten enthalten, zum Induzieren der gewünschten immunologischen Wirkung ausreichen und leichter zu synthetisieren sind. Moleküle mit 20 bis 50 Wiederholungseinheiten werden besonders bevorzugt. Peptide, die bis zu 50 Wiederholungseinheiten enthalten, bei denen die Wiederholungseinheiten mindestens 40%, insbesondere 80%, des gesamten Peptids bilden, werden bevorzugt. Von den möglichen Wiederholungseinheiten wird Asn-Ala-Asn-Pro am meisten bevorzugt, während die Wiederholungseinheit Asn-Val-Asp-Pro die am zweitmeisten bevorzugte Sequenz ist. Peptide, bei denen mindestens 80% der Wiederholungseinheiten Asn-Ala-Asn-Pro sind, während der Rest Asn-Val-Asp-Pro ist, werden besonders bevorzugt.
- Eine besonders bevorzugte Peptidsequenz für Peptide, die die Wiederholungseinheiten enthalten, ist ein Peptid, das im wesentlichen aus der Sequenz A-B-A-B-A-B-(A)&sub1;&sub5;-B-(A)x besteht, worin A Asn-Ala-Asn-Pro bedeutet, B Asn-Val-Asp-Pro bedeutet und x 0 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25 und insbesondere 20 ist.
- Wenn ein Peptid der Erfindung eine der Sequenzen enthält, die nicht ausdrücklich als erforderliche sich wiederholende Sequenz aufgeführt wurden (obwohl sich diese Sequenzen natürlich gewünschtenfalls wiederholen können), werden Peptide bevorzugt, bei denen Z Ser ist, S Lys ist, T His ist, U Gly ist, V Asp ist und W Asn ist. Von den zwei aufgeführten längeren Sequenzen werden Peptide, die die Sequenz Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val- Thr-Cys-Gly-Asn-Gly (d. h. die Region II) enthalten, bevorzugt.
- Wenn ein Peptid der Erfindung synthetisiert wird, das sowohl die Wiederholungssequenzen als auch eine oder mehr als eine der Peptidsequenzen enthält, die als Region I oder Region II bezeichnet werden, enthalten die Peptide, die bevorzugt werden, 2 bis 50 der sich wiederholenden Einheiten, auf die eine Peptidsequenz folgt, die die Sequenz der Region II enthält, und der eine Peptidsequenz vorangeht, die die Sequenz der Region I enthält. Ein besonders bevorzugtes Peptid enthält eine Sequenz der Formel Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn- Pro-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro- Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn- Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala- Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn- Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro- Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp- Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Al a- Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn- Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro- Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn- Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-As n-Ala- Asn-Pro-Asn-Lys-Asn-Asn-Gln-Gly-Asn-Gly-Gln-Gly-His-Asn-Met- Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Asn-Ala-Asn- Asn-Ala-Val-Lys-Asn-Asn-Asn-Asn-Glu-Glu-Pro-Ser-Asp-Lys-His- Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Se r-Thr-Glu- Trp-Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly.
- Das bevorzugte Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden der Erfindung, die Wiederholungseinheiten enthalten, ist die Bildung eines oder mehr als eines Tetramers der gewünschten Struktur, auf die die Polymerisation der Tetramere zur Herstellung des fertigen Produkts folgt. Auf diese Weise können sehr große Peptide hergestellt werden. Solch eine chemische Synthese wird auch bevorzugt, wenn als Teil eines größeren Moleküls eine lange Wiederholungssequenz vorhanden ist. Die sich wiederholende Sequenz und die kürzeren, abweichenden Sequenzen können unabhängig synthetisiert und dann zur Herstellung der gewünschten fertigen Produkte verbunden werden. Solche Verfahren gehören durchaus zur Fachkenntnis derer, die in der Peptidsynthese bewandert sind. Die Synthese von Peptidtetrameren und die Polymerisation der Tetramere zur Bildung größerer Moleküle sind beispielsweise in der US-Patentschrift 4 132 746 beschrieben. Das darin beschriebene Verfahren kann leicht an die vorliegende Erfindung angepaßt werden, indem anstelle der in der Patentschrift aufgeführten Aminosäuren die hierin beschriebenen Aminosäuren gewählt werden.
- Durch das Aufkommen moderner Peptid-Synthesizer (von denen viele im Handel erhältlich sind) ist es natürlich zunehmend leichter geworden, entweder fertige große Peptidmoleküle zu synthetisieren oder große Fragmente zu synthetisieren, die dann der Reihe nach verbunden werden können.
- Bevor eine Beschreibung der genetischen (biologischen) Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden der Erfindung gegeben wird, wird es nützlich sein, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zu betrachten, bei der die Fähigkeit von Peptiden der Erfindung zum Auslösen bzw. Induzieren einer Immunantwort durch Binden von einem oder mehr als einem der Peptide der Erfindung an einen immunogenen Träger verbessert wird. Das resultierende Produkt, das eine verbesserte Immunogenität hat, wird hierin als immunogenes Stimulans gegen Malaria bezeichnet.
- Die Verwendung immunogener Träger zur Verbesserung der Immunogenität kleiner Moleküle ist bekannt. Träger werden im wesentlichen in zwei Gruppen, lösliche Moleküle und Teilchen, eingeteilt. Typische Beispiele für lösliche Moleküle sind Proteine und Polysaccharide. Typische Beispiele für Teilchen sind Liposomen und Bakterienzellen oder Teile davon wie z. B. Membranen. Ganze Zellen werden im allgemeinen getötet oder ihre Fortpflanzung wird behindert, um Probleme zu vermeiden, die mit einer Infektion assoziiert sind.
- Die tatsächliche Struktur des Trägers ist in allen Fällen unwichtig, weil es die Größe des Trägers ist, die für die Verstärkung der Immunantwort wirksam ist. Wenn als Träger lösliche Makromoleküle wie z. B. Proteine und Polysaccharide verwendet werden, werden Molmassen bevorzugt, die in dem Bereich von 10.000 bis 1.000.000 liegen. Wenn der Protein- oder Polysaccharid-Träger ausreichend groß ist, kann er unlöslich sein und somit als teilchenförmiges Material angesehen werden.
- Das Verfahren rum Anheften eines Peptids an den Träger ist unter der Voraussetzung, daß die spezifische immunogene Wirksamkeit des Peptids mindestens zum Teil beibehalten wird, verhältnismäßig unwichtig. Ein bevorzugtes Verfahren zum Erzielen dieses Ergebnisses ist das Anheften eines Peptids an den Träger mittels einer Amidbindung, die zwischen einer Carboxyl- oder Aminogruppe des Trägers und einer Amino- oder Carboxylgruppe des Peptids, insbesondere einer freien Carboxyl- oder terminalen Aminogruppe des Peptids, gebildet wird. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zum Binden ist die Bildung einer Esterbindung zwischen einer Carboxyl- oder Hydroxylgruppe des Trägers und einer Hydroxyl- oder Carboxylgruppe des Peptids, vorzugsweise einer terminalen Carboxylgruppe des Peptids. Gewünschtenfalls können Kopplungs- bzw. Verbindungsgruppen, z. B. terminale Diamine mit 1 bis 10 Methylenkohlenstoffen, die die Amine verbinden, verwendet werden.
- Wenn ein Träger verwendet wird, kann die Immunantwort verstärkt werden, indem multiple Peptide an die Oberfläche des Trägers gebunden werden. An ein Protein oder Polysaccharid können beispielsweise 1 bis 100.000 Peptide gebunden werden, wobei 100 bis 10.000 bevorzugt werden. Wenn Proteine als Träger verwendet werden, werden amphotere Proteine bevorzugt. Solche Proteine haben einen lipophilen Teil und einen hydrophilen Teil. Es wird bei solchen Proteinen bevorzugt, Peptide der Erfindung an den hydrophilen Bereich anzuheften, wodurch sie der humoralen Umgebung ausgesetzt werden, wenn der lipophile Bereich in verschiedene Membranen eingebettet wird.
- Ein bevorzugtes Protein für die Verwendung als Träger ist Tetanus-Toxoid, ein routinemäßig verwendeter Impfstoff, der eine Substanz ist, die früher für die Verwendung als immunogener Träger vorgeschlagen wurde.
- Die bevorzugte Ausführungsform, die vorstehend für die Verwendung mit makromolekularen Trägern aufgeführt wurde, gilt auch für die Verwendung mit teilchenförmigen Trägern, außer daß die Obergrenze pro Träger etwa 10¹&sup5; und vorzugsweise 10¹&sup0; beträgt.
- Bakterienzellen (getötet oder anders bei der Fortpflanzung behindert) sind die bevorzugten teilchenförmigen Substanzen.
- Wenn Peptide gewünscht werden, die dem nativen CS-Protein von P. falciparum sehr ähnlich sind, ist es vorzuziehen, das Peptid auf biologischem Wege unter Verwendung eines Gens zu synthetisieren, das mit dem CS-Protein-Gen von P. falciparum assoziiert oder ein Abkömmling davon ist. Die resultierenden Genprodukte können dann modifiziert werden, beispielsweise durch Abspaltung terminaler Aminosäuren.
- Das Aufkommen der DNA-Rekombinationstechnik hat zu einer seit kurzem eingetretenen schnellen Zunahme der Zahl der Verfahren geführt, die für die Herstellung von klonierten Genprodukten zur Verfügung stehen. Beispiele für jüngere US-Patentschriften, die Verfahren beschreiben, die sich zur Herstellung klonierter Gene eignen, die für die Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen die US-Patentschriften 4 419 450, 4 418 194, 4 414 150, 4 399 216, 4 394 443, 4 356 270, 4 351 901 und 4 237 224 ein. Es ist natürlich auch möglich, die darin beschriebenen Verfahren zu modifizieren, indem man DNA-Sequenzen synthetisiert, die fähig sind, das gewünschte Peptidprodukt zu exprimieren, und sie in geeignete Klonierungsvektoren einfügt, wie es in den US-Patentschriften 4 273 875, 4 304 863, 4 332 901, 4 403 036, 4 363 877 und 4 349 629 beschrieben ist. Die folgende Beschreibung beschreibt gentechnische Verfahren im allgemeinen, die für die Anwendung bei dieser Erfindung geeignet sind.
- Genetische Information ist an doppelsträngiger Desoxyribonucleinsäure ("DNA" oder "Gene") entsprechend der Reihenfolge codiert, in der der codierende DNA-Strang die charakteristischen Basen in seinen sich wiederholenden Nucleotidkomponenten zeigt. Die "Expression" der codierten Information zur Bildung von Polypeptiden umfaßt einen zweiteiligen Prozeß.
- Entsprechend den Befehlen bestimmter Kontroll- bzw. Regulationsregionen ("Regulone") in dem Gen kann bewirkt werden, daß sich RNA-Polymerase entlang dem codierenden Strang bewegt und in einem "Transkription" genannten Prozeß Boten- bzw. Messenger-RNA (-Ribonucleinsäure) bildet. In einem nachfolgenden "Translations"-Schritt wandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit Transfer-RNA die "Botschaft" der mRNA in Polypeptide um. In die Information, die mRNA von DNA transkribiert, sind Signale für den Start und die Termination der ribosomalen Translation sowie die Identität und die Folge bzw. Sequenz der Aminosäuren, die das Polypeptid bilden, eingeschlossen. Der codierende DNA-Strang weist lange Sequenzen von Nucleotidtripletts auf, die als "Codons" bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide in jedem Triplettcodon bestimmte Informationsbits codieren. 3 Nucleotide, die als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) gelesen werden, führen beispielsweise zu einem mRNA-Signal, das als "Translation initiieren" interpretiert wird, während Stopcodons TAG, TAA und TGA als "Translation beenden" interpretiert werden. Zwischen dem Start- bzw. Initiationscodon und dem Stopcodon liegt das sogenannte Strukturgen, dessen Codons die Aminosäuresequenz festlegen, die schließlich translatiert wird. Diese Festlegung verläuft entsprechend dem anerkannten "genetischen Code" [z. B. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., N.Y., 3. Aufl. (1976)], der die Codons für die verschiedenen Aminosäuren beschreibt. Der genetische Code ist in dem Sinne degeneriert, daß verschiedene Codons dieselbe Aminosäure liefern können, jedoch in dem Sinne genau, daß es für jede Aminosäure ein oder mehr als ein Codon für sie und für keine andere gibt. So codieren beispielsweise alle Codons TTT, TTC, TTA und TTG, wenn sie als solche gelesen werden, für Serin und für keine andere Aminosäure. Während der Translation muß die richtige Lesephase oder das richtige Leseraster beibehalten werden. Man überlege beispielsweise, was geschieht, wenn das Ribosom als Beginn eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz . . .GCTGGTTGTAAG. . . verschiedene Basen liest: . . .GCT GGT TGT AAG. . . → . . .Ala-Gly- Cys-Lys. . .; . . .G CTG GTT GTA AG. . . → . . .Leu-Val-Leu. . .; . . .GC TGG TTG TAA A. . . → . . .Trp-Leu-(STOP). Das Polypeptid, das schließlich erzeugt wird, hängt also entscheidend von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.
- Ein klareres Verständnis des Prozesses der Genexpression wird sich ergeben, sobald bestimmte Komponenten der Gene definiert sind:
- Operon - ein Gen, das ein Strukturgen (Strukturgene) für Polypeptidexpression und die Kontroll- bzw. Regulationsregion ("Regulon") aufweist, die diese Expression reguliert;
- Promotor - ein Gen innerhalb des Regulons, an das sich RNA-Polymerase zum Initiieren der Transkription binden muß;
- Operator - ein Gen, an das sich Repressorprotein binden kann, so daß die Bindung von RNA-Polymerase an den benachbarten Promotor verhindert wird;
- Induktor - eine Substanz, die Repressorprotein desaktiviert, den Operator befreit und erlaubt, daß sich RNA-Polymerase an den Promotor bindet und mit der Transkription beginnt;
- "CAP"-Bindungsstelle (CAP = katabolisches Genaktivierungsprotein) - ein Gen, das durch cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zwischengeschaltetes CAP bindet, das auch im allgemeinen für die Initiierung der Transkription erforderlich ist. Die CAP- Bindungsstelle kann in besonderen Fällen unnötig sein. Eine Promotormutation im Lactoseoperon des Phagen λ plac UV5 beseitigt beispielsweise die Notwendigkeit einer cAMP- und CAP-Expression; J. Beckwith u. a., J. Mol. Biol. 69, Seiten 155-160 (1972);
- Promotor-Operator-System - in dem hierin angewandten Sinne eine arbeitsfähige Kontroll- bzw. Regulationsregion eines Operons mit oder ohne Bezug auf eine darin enthaltene CAP-Bindungsstelle oder auf die Fähigkeit, für die Expression von Repressorprotein zu codieren.
- Zur Definition und zur Anwendung bei der folgenden Erörterung der rekombinanten DNA definieren wir ferner folgendes:
- Klonierungshilfsmittel - nichtchromosomale, doppelsträngige DNA, die ein intaktes "Replicon" aufweist, so daß das Hilfsmittel repliziert wird, wenn es durch einen Prozeß der "Transformation" in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") eingebracht worden ist. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird als "Transformant" bezeichnet;
- Plasmid - für die vorliegenden Zwecke ein Klonierungshilfsmittel, das aus Viren oder Bakterien gewonnen wurde, wobei die letzteren "bakterielle Plasmide" sind;
- Komplementarität - eine Eigenschaft, die durch die Basensequenzen von einzelsträngiger DNA verliehen wird, die die Bildung von doppelsträngiger DNA durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basen an den einzelnen Strängen erlaubt. Adenin (A) ergänzt Thymin (T), während Guanin (G) Cytosin (C) ergänzt.
- Fortschritte in der Biochemie in den letzten Jahren haben zum Aufbau von "rekombinanten" Klonierungshilfsmitteln geführt, bei dem beispielsweise Plasmide zu einer bestimmten exogenen DNA hergestellt werden bzw. bewirkt wird, daß Plasmide exogene DNA enthalten. In besonderen Fällen kann das rekombinante Produkt "heterologe" DNA enthalten, womit DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert, die durch den Organismus, der einer Transformation durch das rekombinante Hilfsmittel zugänglich ist, gewöhnlich nicht erzeugt werden. So werden Plasmide gespalten, um lineare DNA mit ligierbaren Enden zu erhalten. Diese werden an ein exogenes Gen mit ligierbaren Enden gebunden, um eine biologisch funktionelle Komponente mit einem intakten Replicon und einer gewünschten phänotypischen Eigenschaft zu erhalten. Die rekombinante Komponente wird durch Transformation in einen Mikroorganismus eingefügt, und Transformanten werden mit dem Ziel, große Populationen zu erhalten, die fähig sind, die neue genetische Information zu exprimieren, isoliert und kloniert. Über Verfahren und Mittel zur Bildung von rekombinanten Klonierungshilfsmitteln und zur Transformation von Organismen mit ihnen ist in der Literatur umfassend berichtet worden; siehe z. B. H.L. Heynecker u. a., Nature 263, 748-752 (1976); Cohen u. a., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972); ebenda, 70, 1293 (1973); ebenda, 70, 3240 (1973); ebenda, 71, 1030 (1974); Morrow u. a., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 1743 (1974) und Jackson u. a., ebenda, 69, 2904 (1972). Eine verallgemeinerte Erörterung des Themas erscheint in S. Cohen, Scientific American 233, 24 (1975). Diese und andere Veröffentlichungen, auf die hierin hingedeutet wird, sind durch ihre Erwähnung in die Beschreibung aufgenommen.
- Für die DNA-Rekombination stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, denen zufolge benachbarte Enden separater DNA-Fragmente auf irgendeine Art und Weise gezielt aufgebaut werden, um die Ligation zu erleichtern. Der letztere Ausdruck bezieht sich auf die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten Nucleotiden, und zwar meistens durch das Enzym T4-DNA-Ligase. So können stumpfe Enden direkt ligiert werden. Alternativ wird Fragmenten, die an ihren benachbarten Enden komplementäre Einzelstränge enthalten, durch eine Wasserstoffbrückenbindung, die die einzelnen Enden für eine nachfolgende Ligation positioniert, ein Vorteil gegeben. Solche Einzelstränge, die als klebrige bzw. kohäsive Enden bezeichnet werden, können dadurch gebildet werden, daß Nucleotide unter Verwendung von terminaler Transferase an stumpfe Enden angelagert werden, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang mit einem stumpfen Ende mit einem Enzym wie z. B. λ-Exonuclease vom Ende her abgebaut wird. Außerdem - und am häufigsten - können Restriktionsendonucleasen zu Hilfe genommen werden, die Phosphodiesterbindungen in einmalig vorhandenen Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren und in ihrer Nähe spalten. Viele Restriktionsendonucleasen und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die sogenannte Eco-RI-Endonuclease am häufigsten verwendet wird. Restriktionsendonucleasen, die doppelsträngige DNA bei rotationssymmetrischen "Palindromen" spalten, lassen kohäsive Enden zurück. Auf diese Weise kann ein Plasmid oder ein anderes Klonierungshilfsmittel derart gespalten werden, daß Enden zurückbleiben, die jeweils eine Hälfte der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuclease enthalten. Ein Spaltungsprodukt von exogener hat Enden, die zu denen der Plasmidenden komplementär sind. Da synthetische DNA bis zur Insertion von exogener DNA kohäsive Enden aufweist, können, wie nachstehend offenbart ist, die Enden alternativ mit alkalischer Phosphatase abgebaut werden, wodurch eine molekulare Selektion für Abschlüsse bzw. Enden, in die das exogene Fragment eingebaut ist, erzielt wird. Der Einbau eines Fragments, das die geeignete Orientierung bezüglich anderer Lagen bzw. Seiten des Hilfsmittels hat, kann verbessert werden, wenn das Fragment Hilfsmittel-DNA ersetzt, die durch zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten wird, und selbst Enden aufweist, die jeweils eine Hälfte der Erkennungssequenz der verschiedenen Endonucleasen bilden.
- Ein Verfahren zur Herstellung des gesamten CS-Proteins ist in dem folgenden allgemeinen Verfahren beschrieben. Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Mungobohnen-Nuclease unter gesteuerten Bedingungen der Formamidkonzentration und der Temperatur zum bevorzugten Schneiden des 5'- und 3'-Endes von Genen. Auf diese Weise erhaltene DNA-Fragmente können unter Erzielung verschiedener Expressionsvektoren -wie z. B. des Vektors gt11 kloniert werden. Klone, die beispielsweise durch Transformation mit einem Klonierungshilfsmittel erzeugt wurden, werden auf Expression mit Antikörper gegen das CS-Protein geprüft. Die vorliegende Erfindung schließt folglich eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz ein, die für ein Peptid codiert, das vorher beschrieben worden ist. Solche DNA-Sequenzen können unter Anwendung eines automatisierten Geräts, das nun im Handel erhältlich ist, leicht synthetisiert werden. Die tatsächliche DNA-Sequenz kann leicht aus den vorher angegebenen Aminosäuresequenzen berechnet werden. Besonders bevorzugte DNA-Sequenzen enthalten Fragmente, die von der in Fig. 2 aufgeführten DNA- Sequenz abgeleitet sind. Besonders bevorzugt werden die DNA-Sequenzen, die gemäß der in Fig. 2 gezeigten Übereinstimmung den Aminosäuresequenzen entsprechen, die hierin vorher als bevorzugt beschrieben worden sind.
- In den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung ist auch ein rekombinantes Klonierungshilfsmittel, das eine dieser DNA-Sequenzen enthält, eingeschlossen. Dieses Klonierungshilfsmittel kann ein Mikroben- oder Hefeplasmid oder ein Bakteriophage sein. λgt11 ist ein besonders bevorzugtes Klonierungshilfsmittel. Ein einzelliger Organismus, der eine DNA-Sequenz enthält, wie sie vorstehend erörtert wurde, und der fähig ist, ein immunologisch aktives Peptid zu exprimieren, das fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort auszulösen, die mit einem Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist und gegen ihn schützt, ist folglich in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, wenn die DNA-Sequenz künstlich in den einzelligen Organismus eingeführt worden ist. E. Coli sind bevorzugte Wirte.
- Als Beispiele für diese Erfindung dienen verschiedene Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Die Mikroorganismen, die mit Lambda-mPf1, 3, 5, 8, 11 und 13 bezeichnet werden, werden mit den folgenden ATCC-Hinterlegungsnummern bezeichnet: 39738, 39739, 39740, 39741, 39742, 39743 bzw. 39744.
- Obwohl genetisches Material für die Verwendung in der Praxis dieser Erfindung synthetisch erzeugt werden kann, wie es vorstehend erörtert wurde, ist es unter Anwendung bekannter Verfahren auch möglich, geeignetes genetisches Material direkt aus P.-falciparum-Protozoen zu gewinnen. Zu den öffentlich verfügbaren P.-falciparum-Protozoen gehören die, die mit 7G8 bezeichnet werden und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40123 hinterlegt sind und die der Gegenstand der Ausscheidungsanmeldung Nr. . . . sind.
- Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Auslösen bzw. Induzieren einer Immunisierung gegen Malaria ein, bei dem einem Menschen eine immunologisch wirksame Menge eines Peptids der Erfindung verabreicht wird. Die geeignete therapeutisch wirksame Dosis kann durch die Fachleute leicht ermittelt werden und liegt im allgemeinen in dem Bereich von etwa 0,01 ug/kg bis etwa 100 ug/kg Körpermasse. Die Dosis liegt vorzugsweise in dem Bereich von 0,1 bis etwa 1,0 ug/kg.
- Die Verabreichung von Peptiden der Erfindung kann auf irgendeinem geeigneten Wege erfolgen, der das Peptid dem immunologischen System zuführt. Zum Zweck dieser Erfindung kann das Peptid intramuskulär, intravenös oder durch irgendein anderes Verfahren verabreicht werden, das der Wirksubstanz ermöglicht, Lymphocyten zu erreichen und eine Immunantwort auszulösen.
- Aus Peptiden der Erfindung können Arzneimittel hergestellt werden, die die Wirksubstanz in einer zum Auslösen einer Immunantwort geeigneten Form enthalten. Wäßrige Suspensionen oder Lösungen, die die Wirksubstanz in einer injektionsbereiten Form enthalten, werden bevorzugt. Zum Verstärken der Immunantwort können gewünschtenfalls Hilfsstoffe verwendet werden.
- Es wird bevorzugt, daß die Peptide der Erfindung, wenn sie in Form von Arzneimitteln vorhanden sind, in Form von Einheitsdosen vorliegen. Wenn sie für die Verwendung beim Menschen bestimmt sind, können diese Mengen unter Annahme einer Körpermasse von 70 kg leicht aus den vorher angegebenen Dosisraten berechnet werden. Eine bevorzugtes Arzneimittel, das eine Einheitsdosis enthält, würde infolgedessen etwa 7 bis etwa 70 ug der Wirksubstanz enthalten. Es versteht sich jedoch, daß die spezifische Dosishöhe für irgendeinen bestimmten Patienten von verschiedenen Einflußgrößen einschließlich der Aktivität der speziellen Verbindung, die verwendet wird; des Alters, des allgemeinen Gesundheitszustandes, des Geschlechts und der Ernährung bzw. Diät des Patienten; der Verabreichungsdauer; des Verabreichungsweges; der Ausscheidungsrate; möglicher synergistischer Wirkungen mit etwaigen anderen Arzneimitteln, die verabreicht werden; und des begehrten Schutzgrades abhängt.
- In dieser Anmeldung werden die Standardnomenklatur und die Standardabkürzungen der Biochemie für Peptid- und DNA-Sequenzen verwendet. Ein Beispiel für eine Veröffentlichung, in der die Standardnomenklatur dargelegt wird, die in dieser Anmeldung für Peptid- und DNA-Sequenzen verwendet wird, ist Lehninger, Biochemistry, Worth publishers, New York (1970), Kapitel 4 und 5 (Peptide) und 12 (DNA).
- Da die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird dieselbe unter Bezugnahme auf bestimmte spezielle Beispiele, die hierin nur zur Erläuterung enthalten sind und, wenn nicht anders angegeben, nicht dafür bestimmt sind, die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform davon einzuschränken, besser verstanden werden.
- Die genomische DNA-Genbank von P. falciparum in dem Expressionsvektor λgt11 [R.A. Young und R.W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194 (1983)] wurde wie folgt angelegt. Die Expressions-Genbank wurde aus der DNA des öffentlich zugänglichen 7G8-Klons aus dem IMTM22-Isolierungsprodukt (-Isolat) von P. falciparum aus Brasilien hergestellt.
- Zwei aliquote Teile (10 ug) genomischer DNA aus dem Plasmodiumfalciparum-Klon 7G8 wurden 30 min lang bei 50ºC mit 20 Einheiten Mungobohnen-Nuclease (P-L Biochemicals) in 100 ul eines Puffers (0,2 m NaCl, 1·10&supmin;³ m ZnSO&sub4;, 30·10&supmin;³ m Natriumacetat, pH 4,6), der entweder 35 oder 40% Formamid enthielt, abgebaut. Die Lösung wurde dann 4fach mit 0,01 m EDTA verdünnt, mit Phenol extrahiert und vor der nachfolgenden Behandlung mit Ethanol gefällt. Die DNA aus den Reaktionen wurden vereinigt und als Quelle von Fragmenten zum Ligieren in λgt11 verwendet. Die DNA wurde mit Klenow-Fragmenten (BRL) unter beschriebenen Reaktionsbedingungen (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982, S. 394) behandelt, und EcoR1-Linker (BRL) wurden mit stumpfen Enden an die behandelten Fragmente anligiert. Die DNA wurde zweimal mit einem Überschuß von EcoR1 abgebaut und wurde nach jedem Abbau mit einer Sepharose-4B-Säule (1,5 cm·20 cm) von freien Linkern getrennt. λgt11 wurde einer Selbstligation unterzogen und mit EcoR1 abgebaut. Zweihundertdreißig ng der P.-falciparum-DNA-Fragmente wurden über Nacht bei 4ºC mit T4-DNA-Ligase (IBI) unter den von der Lieferfirma empfohlenen Bedingungen an 500 ng der hergestellten λgt11-DNA anligiert. Die Hälfte der Ligationsreaktionsprodukte wurde in infektiöse Phagen in vitro verpackt (Promega Biotec). Durch nachweisbare Unterbrechung des B-Alactosidase-Gens von λgt11 an RY1090, das sich auf LB-Agar, dem Xgal und IPTG zugesetzt waren, vermehrte, wurden vierhunderttausend Verpackungsvorgänge gezählt.
- Die Genbank wurde in einer Dichte von 25.000 Plaques pro 150- mm-Platte auf 27 Platten ausplattiert; Plaque-lift-Nitrocellulosefilter wurden wie früher beschrieben (R.A. Young und R.W. Davis, Science 222, 778, 1983) hergestellt. Ein Pool von fünf monoklonalen Antikörpern, die gegen das P.-falciparum-7G8-CS- Protein gerichtet waren (Tabelle 1), wurde in einer Verdünnung von 1/10.000 zum Screening verwendet. Tabelle 1 Reaktion von gegen CS-Protein gerichteten monoklonalen Antikörpern mit Lyseprodukten von Bakterien, die kloniertes CS-Protein-Gen exprimieren Antigen Monoklonaler Antikörper λgt11, mit IPTG induziert λgt11, nicht induziert
- + λmPf, P.-falciparum-CS-Protein-Gene in λgt11. Die Größe des P.-falciparum-DNA-Inserts in λgt11 ist eingeklammert. Alle Bakterien wurden mit IPTG induziert.
- ++ Die Daten sind als mittleres dekadisches Absorptionsvermögen bei 414 nm für drei unabhängige Bestimmungen durch Enzymimmunoassay (ELISA) ausgedrückt.
- In Tabelle 1 aufgeführte Bakterien wurden durch das folgende Screening-Verfahren identifiziert. Gepoolte bzw. gesammelte Ascites-Flüssigkeiten von fünf Hybridomas wurden in einem Verhältnis von 1/10.000 in 0,15 m NaCl, 0,05 m Tris, pH 7,5 (TBS), das 0,05% Tween 20 und 3% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, verdünnt und wurden mehrmals mit einem konzentrierten Lyseprodukt von λgt11-infizierten RY1090-Zellen absorbiert, das an der Luft auf Nitrocellulosefilter aufgetrocknet worden war, um Antikörper für E. coli und Lambda zu entfernen. Plaque-lift-Nitrocellulosefilter von der P.-falciparum-Genbank wurden 30 min lang bei Raumtemperatur in 500 ml TBS gewaschen, das 0,3 % Tween-20, 3% Rinderserumalbumin, 5·10&supmin;³ m MgCl&sub2; und 5 u/ml DNAse I enthielt. Die Plaque-lift-Nitrocellulosefilter wurden über Nacht bei 4ºC mit dem absorbierten Pool von monoklonalen Antikörpern inkubiert. Alle weiteren Manipulationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach diesem Schritt und jedem der nächsten zwei Schritte wurden die Plaque-lift-Filter nacheinander in TBS+0,05% Tween-20, in TBS+1% Tritron X-100 und in TBS+0,5% Tween - 30 min lang in jeder Lösung - gewaschen. Das Signal der monoklonalen Mäuse-Antikörper wurde verstärkt, indem die Filter 1 h lang in Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG (Cappel) inkubiert wurden, das in TBS, das 0,05% Tween und 3% BSA enthielt, auf das 500fache verdünnt und wie vorstehend für die Ascites-Flüssigkeit beschrieben vorabsorbiert worden war. Antikörper, die an die Plaque-lift-Filter gebunden waren, wurden ermittelt, indem bis zu fünf Filter in 30 ml TBS inkubiert wurden, das 0,05% Tween-20 und 1 uCi ¹²&sup5;I-markiertes Protein A (Ameraham) enthielt, worauf Waschen und Autoradiographie folgten.
- Beim anfänglichen Screening nach 48 h Autoradiographie wurden fünfunddreißig positive Klone erhalten. Siebzehn wurden erneut in einer Dichte von 100 bis 800 Plaques pro 85-mm-Platte gescreent. Elf der Klone lieferten beim zweiten Screening positive Plaques. Diese wurden ohne Immunoscreening von 85-mm-Platten kloniert, die weniger als 50 Plaques enthielten; zehn der 11 Klone waren immunologisch reaktiv, als sie gescreent wurden.
- Inserts in den zehn Klonen lagen in den folgenden Größengruppen: drei (λmPf1, 3, 11) hatten eine Größe von 2,3 kb; drei (λmPf5, 8, 13) hatten eine Größe von 2,3 kb; λmpf15 hatte eine Größe von 1,35 kb; λmPf6 hatte eine Größe von 1,0 kb; und λmPf9 hatte eine Größe von 0,5 kb. Der Klon λmPf18 enthielt zwei Inserts und wurde nicht weiter untersucht. Die Inserts der Klone λmPf1, 3, 5, 8, 11, 13 und 15 kreuzhybridisierten. λmPf6 und 9 kreuzhybridisierten nicht, wodurch gezeigt wird, daß die zwei kleineren Inserts, obwohl sie durch die Mischung von fünf monoklonalen Antikörpern ausgewählt wurden, aus einem außerhalb des 2,3-kb-Fragments befindlichen Teil des Genoms kamen.
- Der Klon λmPf5 wurde durch Nick-Translation markiert und als Sonde bei einem Southern-Blot [E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)] von Hind-III-Abbauprodukten genomischer Menschen- und P.-falciparum-DNA verwendet. In der P.-falciparum-Spur war bei 14 kb eine einzige Hybridisierungsbande vorhanden (Daten nicht gezeigt). Die Sonde hybridisierte nicht zu Menschen-DNA.
- Die Klone in λgt11 wurden als Lysogene in den E.-coli-Stamm Y1089 eingeführt. Zur Erzeugung von Lysogenen wurden 10 ul Bakteriophage (10¹&sup0;/ml) mit 100 ul E. coli Y1089 (10&sup8;/ml), die in Medien, die 50 ug/ml Ampicillin und 0,2% Maltose enthielten, vermehrt worden waren, vermischt, pelletiert und in 10·10&supmin;³ m MgSO&sub4; wieder suspendiert. Nach 20 min bei Raumtemperatur wurden die Zellen verdünnt und auf Platten ausgebreitet, die 50 ug/ml Ampicillin enthielten, und bei 32º vermehrt. Eine Prüfung der Einzelkolonien auf Lysogenie wurde gemäß ihrer Unfähigkeit zur Vermehrung bei 42º durchgeführt. Lysogene wurden bei 32º in Medien, die 50 ug/ml Ampicillin enthielten, vermehrt, bis das dekadische Absorptionsvermögen bei 550 nm 0,4 bis 0,8 betrug. Die Kulturen wurden dann 20 min lang bei 44 sachte geschüttelt. Dann wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2·10&supmin;³ m zugesetzt, und die Kultur wurde 1 h lang bei 37º weiter geschüttelt. Die Phagen wurde bei 44ºC eingeführt, und dann wurde den Medien Isopropylthiogalactosid (IPTG) zugesetzt, um die Expression von β-Galactosidase und möglicher Fusionsproteine zu verstärken. Lyseprodukte der induzierten Bakterien wurden durch Enzymimmunoassay (ELISA) auf Reaktivität mit jedem der fünf monoklonalen Antikörper analysiert. Zellen aus 50-ml-Kulturen, die wie vorstehend beschrieben vermehrt und induziert worden waren, wurden in 1,0 ml 150·10&supmin;³ m NaCl, 50·10&supmin;³ m Tris-HCl, pH 8,0, 0,2·10&supmin;³ m Phenylmethylsulfonylfluorid wieder suspendiert, als das dekadische Absorptionsvermögen bei 550 nm 0,6 betrug. Die Suspensionen wurden in einem Trockeneis-Ethanol-Bad schnell gefrieren gelassen und vor dem Verdünnen mit PBS zweimal aufgetaut. Lyseprodukte der Klone wurden in einem Verhältnis von 1/100 mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, 10·10&supmin;³ m Natriumphosphat, 150·10&supmin;³ m NaCl) verdünnt. Aliquote Teile (50 ul) wurden in Vertiefungen einer Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) einpipettiert und bei Raumtemperatur gehalten. Etwa 18 Stunden später wurden die Vertiefungen viermal mit 0,1%igem (Masse/Vol.) Rinderserumalbumin in PBS (PBS-BSA) gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit 1%igem PBSBSA gefüllt und 1 h lang bei Raumtemperatur gehalten. Fünfzig ul Ascites-Flüssigkeit von einem von fünf separaten monoklonalen Antikörpern wurde in einem Verhältnis von 1/500 mit PBS verdünnt, der passenden Vertiefung zugesetzt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Ascites-Flüssigkeiten von diesen fünf monoklonalen Antikörpern waren bei der Immunofluoreszenz-Antikörper-(IFA-) und der Circumsporozoit-Fällungs-(CSP-)Reaktion für P.-falciparum- Sporozoiten positiv. Die Vertiefungen wurden wieder wie vorstehend gewaschen, und 50 ul Peroxidase-konjugierter Ziegen-Anti-Mäuse-Antikörper (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), der in einem Verhältnis von 1/200 mit PBS verdünnt war, wurden jeder Vertiefung zugesetzt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Vertiefungen wurden mit PBS- BSA gewaschen, und jeder Vertiefung wurden 150 ul Substrat zugesetzt. Das Substrat bestand aus 1 mg 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) pro ml 0,1 m Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,0, wobei unmittelbar vor der Verwendung 0,003% Wasserstoffperoxid zugesetzt wurden. Das dekadische Absorptionsvermögen bei 414 nm wurde nach 1 Stunde mit einem Titertek-Multiskan-Plattenlesegerät (Flow Laboratories, Inc., McLean, VA) ermittelt. Sechs Klone banden alle fünf monoklonalen Antikörper (Tabelle 1). Die Werte des dekadischen Absorptionsvermögens für den Klon λmPf13 lagen nicht signifikant über den Kontrollwerten. Der Klon λmPf9 band nur einen der fünf monoklonalen Antikörper, 4D11.6 (Daten nicht gezeigt). Da der Klon λmPf9 mit λmPf1, der das Gen für das CS-Protein enthält (siehe nachstehend), nicht hybridisierte, hat dieser monoklonale Antikörper ein Gen identifiziert, das mit dem Gen für das CS-Protein nicht verwandt ist. Das Protein, das durch λmPf9 exprimiert wird, hat ein Epitop, das mit diesem einen monoklonalen Antikörper kreuzreaktiv ist. Hope u. a. identifizierten einen monoklonalen Antikörper für ein ungeschlechtliches Erythrocyten-Antigen von P. falciparum, der mit einem Antigen an der Oberfläche von P.-falciparum-Sporozoiten kreuzreaktiv war: I.A. Hope, R. Hall, D.Z. Simmons u. a., Nature 308, 191 (1984). Es ist noch zu ermitteln, ob λmPf9 ein Gen enthält, das für das von Hope u. a. beschriebene Protein oder ein anderes kreuzreaktives Protein codiert.
- Die Lyseprodukte, die für ELISA verwendet wurden, wurden auch einer Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) unterzogen und durch Elektro-Blotting auf Nitrocellulose übertragen. Pelletierte Zellen aus 1 ml jeder Lysogen-Kultur (siehe Anmerkung 14) wurden in 200 ul SDS-Gel-Probenpuffer (3% SDS, 10% Glycerin, 10·10&supmin;³ m Dithiothreit, 62·10&supmin;³ m Tris-HCl, pH 6,8) gelöst und 5 min lang bei 95ºC erhitzt. Plasmodium-falciparum- Sporozoiten wurden aus den Speicheldrüsen von An.-freeborni- Stechmücken isoliert und als Pellets bei -80ºC in PBS, die 0,2% Ovalbumin enthielt, konserviert. Zur Antigen-Extraktion wurden einem Pellet aus 4,5·10&sup5; Sporozoiten 450 ul frisch hergestellter Extraktionspuffer (0,5% NP40, 2·10&supmin;³ in PMSF, 33 ug/ml Leupeptin, 33 ug/ml Antipain und 2 mg/ml Rinderserumalbumin in PBS) zugesetzt. Das Material wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert, wobei alle 10 min 15 bis 30 s lang für eine heftige Verwirbelung bzw. Wirbelbildung gesorgt wurde. Die extrahierten Sporozoiten wurden pelletiert, indem 2 min lang mit 13.000 g zentrifugiert wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur Elektrophorese in SDS-Probenpuffer gebracht.
- Unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens von Towbin u. a. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4350 (1979)] wurde eine Protein-Blot- bzw. Western-Blot-Analyse durchgeführt. Proteine wurden nach dem Verfahren von Laemmli [Nature, 277, 680 (1970)] durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung eines 4,5%igen Sammelgels und eines 8- bis 12%igen Gradientengels getrennt. Die Gele wurden zweimal mit 200 ml Towbins Puffer gewaschen, wobei jeder Waschvorgang 30 min dauerte. Die durch SDS-PAGE getrennten Proteine wurden 14 bis 16 Stunden lang bei 4ºC mit einer Feldstärke von 8 Volt pro cm auf ein 0,22-um-Nitrocellulosefilter geblottet. Bindungsstellen auf der Nitrocellulose, die nicht reagiert hatten, wurden durch Behandlung des Filters mit 5%igem BSA in PBS, die 0,05% Tween 20 enthielt, blockiert. Das Blot-Filter wurde dann viermal mit 100 ml PBS, die 0,05% Tween enthielt, gewaschen, wobei jeder Waschvorgang 20 min dauerte. Das Filter wurde mit einem Pool von fünf monoklonalen Antikörpern (2E6.4, 2F1.1, 4D9.1, 4D11.6 und 5G5.3) 90 min lang zur Reaktion gebracht. Der Pool von monoklonalen Antikörpern wurde hergestellt, indem Ascites-Flüssigkeiten für jeden Antikörper im Verhältnis von 1:100.000 mit PBS, die 0,05% Tween 20 und 20% fötales Kälberserum enthielt, verdünnt wurden (Verdünnung der gesamten Ascites-Flüssigkeit 1: 20.000). Die Blot-Filter wurden viermal wie vorstehend gewaschen und dann mit ¹²&sup5;I-markiertem Schafs-Antiserum, das gegen Ganz-Mäuse-Antikörper hergestellt worden war, behandelt. Das radio-iodierte Antiserum wurde mit PBS, die 0,05% Tween 20 und 20% fötales Kälberserum enthielt, auf 2·10&sup5; Zählpulse pro min/ ml verdünnt. Die Filter wurden dann viermal wie vorstehend gewaschen und getrocknet. Die Autoradiographie wurde unter Verwendung eines Kodak-XAR-2-Films bei -80ºC durchgeführt.
- Die Proteine auf dem Nitrocellulosepapier wurden durch monoklonale Anti-Sporozoit-Antikörper identifiziert. Die monoklonalen Anti-Sporozoit-Antikörper gegen die Protein-Blots von λmPf1, 3, 5, 8, 11 und 13 banden sich an zwei Dubletts bei Mr 60.000/ 57.000 und 53.000/51.000 (nicht gezeigt), obwohl die Intensität für λmPf13 stark vermindert war. An den λgt11-Vektor ohne Insert trat keine Bindung ein. Monoklonale Antikörper banden sich an Proteine aus Sporozoiten bei Mr 60.000, 53.000 und 51.000. Somit erzeugten alle Sporozoit-Gene für CS-Protein in λgt11 ein Protein, das eine ähnliche Beweglichkeit hatte wie das unbehandelte CS-Protein, das durch den Sporozoiten selbst synthetisiert wird ( Mr 60.000).
- Bei der Induktion mit IPTG wurde für λgt11 bei Mr 116.000 eine deutliche Zunahme der Expression von β-Galactosidase bemerkt und wurde für λmPf9 bei Mr 131.000 ein Fusionsprotein mit β-Galactosidase bemerkt (Daten nicht gezeigt). Die Klone mit dem CS-Protein-Gen lieferten bei der Einführung nur schwache β-Galactosidase-Banden; es wurden keine Fusionsproteine beobachtet (Daten nicht gezeigt). Außerdem band sich Anti-β-Galactosidase nicht an das CS-Protein bei Mr 60.000, was darauf hindeutet, daß dieses Protein keine Fragmente von β-Galactosidase enthielt (Daten nicht gezeigt).
- Der λgt11-Vektor ist dafür bestimmt, bei der Induktion mit IPTG Inserts als β-Galactosidase-Fusionsproteine zu exprimieren. Es war somit unerwartet, daß keiner der Klone, die das CS-Protein exprimieren, ein Fusionsprotein zu sein schien. Dies wird für λmPf1, 5, 8 und 15 dadurch erklärt, daß die Inserts so orientiert sind, daß ihre Transkriptionsrichtung der von β-Galactosidase entgegengesetzt ist. Eine Restriktionskartierung der Phagen-DNA unter Verwendung von StuI, KpnI und StuI+KpnI zeigt, daß die asymmetrische StuI-Stelle in dem Insert (Fig. 1) in jedem Fall 1,1 kb von der KpnI-Stelle in λgt11, deren Entfernung vom linken Ende 18,58 kb beträgt, entfernt ist. Es ist nicht bekannt, ob die P.-falciparum-DNA in 5'-Position zu der Codierungssequenz in den Klonen λmPf1 und 15 Sequenzen enthält, die durch die E.-coli-RNA-Polymerase als Promotoren verwendet werden können, jedoch sind für bakterielle Ribosomen keine eindeutigen Bindungsstellen vorhanden (Fig. 2). Die Klone λmPf5 und 8 beginnen erst 11 bp vor dem Gen. Es ist somit wahrscheinlich, daß die Expression des CS-Proteins in diesen Klonen von einem späten Lamda-Promotor ausgeht. Ein ähnliches Phänomen wurde bei dem λgt11-System mit einem Hefe-DNA-Insert beobachtet: T. Goro und J.C. Wang, Cell, 36, 1073 (1984).
- Die Restriktionskartierung zeigt, daß das Insert in λmPf13 die richtige Orientierung in bezug auf das β-Galactosidase-Gen hat. Es befindet sich jedoch um eine Base außerhalb des Rasters, so daß es mit β-Galactosidase kein Fusionsprotein erzeugen kann (Fig. 2). Die bei dem Protein-Blot-Verfahren ermittelten niedrigen Anteile des durch diesen Klon erzeugten CS-Proteins und seine Unfähigkeit, bei ELISA signifikante Daten zu liefern (Tabelle 1), sind angesichts dieses Aufbaus verständlich. Die Neigung bei den Klonen zu Inserts, die entweder eine umgekehrte Orientierung haben oder außerhalb des Rasters liegen, deutet darauf hin, daß eine Selektion gegen die erwarteten Fusionsproteine (z. B. λmPf5 und 8 in der richtigen Orientierung) vorhanden ist, die möglicherweise auf eine toxische Wirkung des CS- Proteins auf E. coli zurückzuführen ist.
- Die Nucleotidsequenz des in βmPf1 klonierten 2,3-kb-DNA-Fragments, die das Gen enthält, das für das CS-Protein von P. falciparum codiert, ist in Fig. 2 gezeigt. Die hergeleitete Aminosäuresequenz für das Protein ist unterhalb der Nucleotidsequenz gezeigt. Eine Restriktionskarte des λmPf1-Klons und die Sequenzierungsstrategie sind in Fig. 1 beschrieben. Diese Sequenz enthält ein großes offenes Leseraster, das mit einem ATG- Startcodon in der Position 78 beginnt und mit einem TAG-Codon in der Position 1316 endet. In den anderen fünf Leserastern wurden multiple Stopcodons beobachtet. Das in Fig. 1 gezeigte offene Leseraster könnte für ein Polypeptid aus 412 Aminosäuren mit einer ungefähren Molmasse von 44.000 Dalton codieren. Wie bei dem CS-Protein von P. knowlesi beobachtet wurde, war die durch SDS-PAGE ermittelte Molmasse ( 60.000) des CS-Proteins von P. falciparum von der hergeleiteten Molmasse (44.000) verschieden.
- Ein wichtiges Strukturmerkmal dieses Proteins ist das Vorhandensein von 41 Tandemwiederholungen aus Tetrapeptiden. Die primäre sich wiederholende Einheit ist Asn-Ala-Asn-Pro, die 37mal vorkommt; eine alternative Form ist Asn-Val-Asp-Pro, die in den Einheiten 2, 4, 6 und 22 vorkommt. Der Wechsel von Ala-Asn zu Val-Asp resultiert aus Punktmutationen, wo C in der zweiten Position des Alanin-Codons durch T ersetzt wird und wo A in der ersten Position des Asparagin-Codons durch G ersetzt wird.
- Die Nucleinsäuresequenz, die für die Wiederholungen codiert, wird nicht so gut aufrechterhalten wie die Aminosäuresequenz. Die wiederholte Region, die 41 Einheiten hat, besteht aus 11 verschiedenen Nucleotidsequenz-Kombinationen. Achtzehn der Einheiten sind von einem Typ (AATGCAAACCCA). Sieben der Wiederholungen unterscheiden sich in nur einer Position von dieser Sequenz; 12 unterscheiden sich in zwei Positionen; zwei unterscheiden sich in drei Positionen; eine unterscheidet sich in vier Positionen, und eine unterscheidet sich in fünf Positionen. Die Änderung in der Sequenz kann die Wiederholung innerhalb der genomischen DNA dagegen stabilisieren, eliminiert oder durch Rekombination umgebildet zu werden.
- Am Amino-terminalen Ende des Proteins bildet ein Stück aus 16 Aminosäuren eine wahrscheinliche Signalsequenz (Fig. 2). Zwischen dieser Signalsequenz und der wiederholten Region tritt eine hochgeladene Region auf, die durch das Vorhandensein basischer und saurer Aminosäuren gekennzeichnet ist. So sind 27 der 53 Aminosäuren von der Aminosäure 66 bis zur Aminosäure 118 geladene Aminosäuren.
- Auf die Wiederholungsregion folgen zwei andere Segmente des Proteins, die einen hohen Anteil geladener Aminosäuren enthalten. Diese Regionen treten zwischen den Aminosäuren 324 und 339 und zwischen den Aminosäuren 360 und 388 auf; sie enthalten 50% bzw. 48% geladene Aminosäuren. Am Carboxyl-terminalen Ende hat das Protein eine Sequenz von 21 hydrophoben Aminosäuren, die eine Verankerungs- bzw. Haftsequenz für ein integrales Membranprotein darstellen.
- Um endgültig zu beweisen, daß die diesbezügliche Nucleotideinheit des P.-falciparum-Sporozoit-Gens richtig war, wurden Peptide synthetisiert. Die Peptide wurden durch das Festphasen- Verfahren der Peptidsynthese [R.B. Merrifield und A. Marglin (1970): Annu. Rev. Biochem., 39, 841 bis 866] unter Anwendung eines Beckman-990-Peptid-Synthesizers hergestellt. Die synthetischen Peptide wurden mit flüssigem HF von dem festen Träger abgespalten [J.P. Tam, W.F. Heath und R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)]. Die abgespaltenen Peptide wurden durch Gelfiltration an Bio Gel P-2 oder P-4 entsalzt. Die Reinheit der isolierten Peptide wurde durch Umkehrphasen-HPLC, Aminosäureanalyse und - für das Peptid mit fünfzehn Resten - Aminosäure-Sequenzanalyse bestätigt.
- Diese Peptide wurden dann bei einer Modifikation des vorstehend beschriebenen ELISA-Tests verwendet, um zu ermitteln, ob sie die Bindung des monoklonalen Antikörpers 2F1.1 an λmPf1 hemmen würden. Die Synthesepeptide wurden wie folgt getestet. Aliquote Teile (fünfzig ul) des λmPf1-Lyseprodukts (14), das im Verhältnis 1/100 mit 0,01 m Phosphat in 0,15 m NaC4, pH 7,4 (PBS) verdünnt war, wurden in Vertiefungen einer Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) einpipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Etwa 18 Stunden später wurden die Vertiefungen viermal mit PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW) gewaschen, mit 1,0%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-TW gefüllt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Vorratslösungen synthetischer Peptide, die in destilliertem Wasser gelöst waren (5·10&supmin;² m), wurden im Verhältnis 1/10 mit 1%igem BSA in PBS verdünnt, und aliquote Teile (100 ul) wurden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 ul des an Meerrettich-Peroxidase konjugierten monoklonalen Antikörpers 2F1.1 vermischt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden geleert, und 30 ul der Mischung aus Peptid und monoklonalem Antikörper wurden in jede Vertiefung eingefüllt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Vertiefungen wurden wieder wie vorstehend gewaschen, und 150 ul Substrat wurden wie früher beschrieben zugesetzt [P.K. Nakane und A. Kawzaoi, J. Hist. Cytochem., 11, 1084 (1974)].
- Die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse beweisen, daß die Peptide mit 7, 11 und 15 Resten die Bindung von 2F1.1 an λmPf1 in signifikantem Maße hemmen. Die Hemmung der Bindung war bei dem Peptid mit 15 Resten bei 5·10&supmin;&sup7; m offensichtlich. Das Peptid mit 7 Resten hemmte auch die Bindung des monoklonalen Antikörpers 2F1.1 an das Sporozoit-Antigen, das als Ersatz für λmPf1 verwendet wurde (Daten nicht gezeigt). Das synthetische Peptid hemmte ferner die Bindung der anderen vier monoklonalen Antikörper an λmPf1. Diese Daten zeigen, daß die Sequenz der sich wiederholenden Einheit richtig ist. Es ist möglich, daß die verstärkte Hemmung der Bindung, die bei den Peptiden mit 11 und 15 Resten beobachtet wird, sekundäre Konformationsänderungen widerspiegelt. Die Daten deuten nicht darauf hin, daß sie zwei Epitope enthalten, weil bei einem Zweiseitentest mit 2F1.1 keines der beiden festgestellt werden konnte (Daten nicht gezeigt).
- Das CS-Protein von P. falciparum und das CS-Protein eines Affen-Malariaerregers, P. knowlesi, haben eine ähnliche Gesamtstruktur, weisen jedoch nur zwei kurze Regionen der Homologie auf. Beide Proteine scheinen insofern dieselben Hauptmerkmale zu enthalten, als sie in der Mitte des Proteins eine wiederholte Region; mehrere Regionen mit einer hohen Dichte geladener Aminosäuren; am Amino-terminalen Ende eine Signalsequenz und am Carboxy-terminalen Ende eine hydrophobe Verankerungs- bzw. Haftsequenz haben. Bei einer Computeranalyse auf die Aminosäuresequenz-Homologie (25, K-fache Größe von 1, Fenstergröße von 20, Lückenstrafe bzw. -nachteil von 1) wurde jedoch über den größten Teil des Proteins eine begrenzte Sequenz-Homologie gefunden. Die durchschnittliche Homologie zwischen den zwei Proteinen beträgt in dem Segment vor der Wiederholung 37%; 37 von 102 möglichen Aminosäuren stimmen überein. Die Wiederholungen haben eine Homologie von 16%, da alle 12 Aminosäuren ein Pro und ein Ala aufeinander ausgerichtet sind. Die durchschnittliche Homologie zwischen den Segmenten der zwei Proteine beträgt nach den Wiederholungen 42%; 50 von 119 möglichen Aminosäuren stimmen überein. Da die Sekundär- und die Tertiärstruktur dieser Proteine unbekannt sind, können sie trotz des Unterschiedes in der Primärsequenz strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten haben. Wiederholungen in CS-Proteinen sind beispielsweise im Anschluß an eine Impfung mit Sporozoiten immunodominant.
- Die zwei Regionen mit der größten Sequenz-Homologie wurden an beiden Seiten der wiederholten Regionen beobachtet. Wenn die zwei Peptide zueinander ausgerichtet werden, zeigt sich eine Region der Homologie, wo drei Proline zueinander ausgerichtet sind und eine perfekte Übereinstimmung von fünf benachbarten Aminosäuren (Lys-Leu-Lys-Gln-Pro) auftritt (Region I, Fig. 2 und 4).
- Die zweite Region der Homologie (Region II, Fig. 2 und 4) enthält 13 Aminosäuren, von denen 12 aufrechterhalten werden. Die einzige Aminosäure, die nicht identisch war, war Serin als Ersatz des Threonins bei dem vierten Rest in der P.-knowlesi- Sequenz. Diese Region enthält zwei Cysteinreste, die früher von Ozaki u. a.: L.S. Ozaki, P. Svec, R.S. Nussenzweig u. a., Cell 34, 815 (1983), aus der Bildung einer intramolekularen Schleife gefolgert wurden.
- Die Nucleinsäuresequenz, die für das CS-Protein von P. falciparum codiert, zeigt außer in der Region II auch eine begrenzte Homologie mit dem P.-knowlesi-Gen. In dem Teil des Gens, der für die Region II des Proteins codiert, ist eine 27-Basen-Sequenz vorhanden, die sich nur in zwei Positionen von der vergleichbaren Sequenz in P. knowlesi unterscheidet. Diese aufrechterhaltene Sequenz kann als Sonde zum Klonieren der Gene, die für die CS-Proteine der anderen Plasmodium-Arten codieren, brauchbar sein.
- Diese zwei Regionen der Homologie der Aminosäuresequenz zwischen P. falciparum und P. knowlesi zeigen die Aufrechterhaltung einer Sequenz für Organismen, die sich bei der Evolution weit voneinander getrennt haben. Ursprünglich wurde angenommen, daß sich die Primaten-Malariaerreger parallel zu der Entwicklung der Primaten entwickelt haben. Vor kurzem ist jedoch gezeigt worden, daß die DNA von P. falciparum der DNA von Vögel- und Nagetier-Malariaerregern ähnlich ist und daß diese eine andere DNA-Struktur hatten als die Primaten-Malariaerreger (P. knowlesi, P. fragile. P. vivax und P. cynomolgi); P. falciparum, P. lophurae und P. berghei hatten einen niedrigeren Gehalt an G + C als die Primaten-Malariaerreger einschließlich P. knowlesi. Außerdem hybridisierten Gensonden, die zu P.-falciparum-, P.-lophurae- und P.-berghei-DNAs hybridisierten, nicht zu den Primaten-Malariaerregern, und Sonden, die zu den Primaten- Malariaerregern hybridisierten, hybridisierten nicht zu P. falciparum, P. lophurae und P. berghei. Es ist möglich, daß diese Region der Homologie zwischen P. falciparum und P. knowlesi für eine wichtige Funktion des Proteins wie z. B. Bereitschaft zur Zellinvasion aufrechterhalten worden ist. Es sollte jedoch beachtet werden, daß sowohl P.-falciparum- als auch P.-knowlesi- Sporozoiten die menschliche Leber infizieren können.
- Trotz des möglichen Problems, daß Proteine Epitope gemeinsam haben, gibt es erhebliche Anhaltspunkte dafür, daß das Sporozoit-Gen kloniert worden ist. Erstens ist die Ähnlichkeit zwischen diesem Protein von P. falciparum und dem CS-Protein von P. knowlesi auffallend. Beide sind von ähnlicher Größe mit berechneten Molmassen von 44.426 und 36.792 für P. falciparum bzw. P. knowlesi. Beide haben analoge Regionen, die eine Signalsequenz, eine geladene Region, eine Region aus sich wiederholenden Peptiden in der Mitte des Proteins und eine Verankerungs- bzw. Haftsequenz einschließen. Zweitens sind zwei Regionen der Aminosäure-Homologie zwischen den zwei Proteinen vorhanden (Fig. 4). Drittens erkannten fünf monoklonale Antikörper, von denen bekannt ist, daß sie mit der Oberfläche von P.falciparum-Sporozoiten reagieren (11), das in den Bakterien synthetisierte Protein. Das kreuzreaktive Protein aus dem Klon λmPf9 reagierte nur mit einem dieser monoklonalen Antikörper. Viertens war das in den Bakterien synthetisierte Protein bei SDS-PAGE von ähnlicher Größe wie das Protein aus P.-falciparum- Sporozoiten. Fünftens blockierten synthetische Peptide mit der Wiederholung bei einem ELISA-Test die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an das Sporozoit-Protein.
- Das Gen codiert für ein Protein aus 412 Aminosäuren, das aus einer Signalsequenz, einer geladenen Region, einer zentralen Region aus 41 Einheiten mit vier Aminosäuren (Wiederholungen), zwei anderen geladenen Regionen, einer wahrscheinlichen Cystinschleife und einer Verankerungs- bzw. Haftsequenz besteht. Siebenunddreißig der Wiederholungen in der zentralen Region sind identisch (Asn-Ala-Asn-Pro); vier haben eine alternative Sequenz (Asn-Val-Asp-Pro).
- Eine analoge Gruppe von CS-Proteinen wird an den Sporozoiten aller bisher untersuchten Plasmodium-Arten gefunden. Monoklonale Antikörper für CS-Proteine verleihen in vivo Schutz oder neutralisieren in vitro die Ansteckungsfähigkeit von Sporozoiten: A.H. Cochrane, F. Santoro, V. Nussenzweig u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5651 (1982). Obwohl monoklonale Antikörper bei Arten von Primaten-Malariaerregern kreuzreaktiv sein können, scheint durch Antikörper herbeigeführte Immunität artspezifisch zu sein, und schützende monoklonale Antikörper sind im Fall von P. knowlesi gegen das sich wiederholende Epitop gerichtet. Diese Daten und die Feststellung, daß monoklonale Antikörper für Sporozoiten bei einem Test reagieren, der zwei oder mehr Epitope erfordert, führten Zavala u. a. zu der Annahme, daß monoklonale Antikörper für CS-Proteine mit einer immunodominanten Region reagieren, die ein sich wiederholendes Epitop hat. Diese Hypothese ist insofern bestätigt worden, als die fünf monoklonalen Antikörper für das CS-Protein von P. falciparum gegen sich wiederholende Einheiten, (Asn-Ala-Asn-Pro), in dem Protein gerichtet sind.
- Die auffallende Homologie der Region II zwischen zwei Malaria- Parasiten, P. falciparum und P. knowlesi, die im übrigen in bezug auf die Evolution voneinander abweichen, deuten auf die Aufrechterhaltung einer Sporozoit-Funktion wie z. B. die Bereitschaft zur Leberinvasion hin. Wenn diese Region in anderen Menschen-Malariaerregern aufrechterhalten worden ist und dem Immunsystem ausgesetzt wird, kann eine Immunisierung mit dieser Region von P. falciparum einen Schutz gegen andere Arten von Menschen-Malariaerreger bieten. Wenn diese homologe Region an der Bereitschaft zur Leberinvasion beteiligt ist, ist es ferner möglich, daß der Malaria-Parasit unfähig ist, die Sequenz in dieser Region zu verändern.
Claims (28)
1. Fragment des CS-Proteins von Plasmodium falciparum, das
entweder allein oder in dem Fall, daß es an einem Trägermolekül
anhängt, fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort
auszulösen, die mit Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist, wobei das
erwähnte Peptid mindestens 2 aufeinanderfolgende Wiederholungen
einer Sequenz Asn-X-Y-Pro enthält, worin X Ala oder Val ist und
Y Asn oder Asp ist.
2. Peptid nach Anspruch 1, bei dem die erwähnten Wiederholungen
mindestens 10% des erwähnten Peptids bilden.
3. Peptid nach Anspruch 2, bei dem das erwähnte Peptid nicht
mehr als 1000 Wiederholungen der erwähnten Sequenz enthält.
4. Peptid nach Anspruch 3, bei dem die erwähnten Wiederholungen
mindestens 40% des erwähnten Peptids bilden.
5. Peptid nach Anspruch 4, bei dem das erwähnte Peptid eine
Sequenz A-B-A-B-A-B-(A)&sub1;&sub5;-B-(A)&sub2;&sub0; enthält, worin A Asn-Ala-Asn-
Pro bedeutet und B Asn-Val-Asp-Pro bedeutet.
6. Peptid nach Anspruch 5, bei dem auf die erwähnte Sequenz ein
Peptidsegment folgt, das eine Sequenz der Formel Thr-Glu-Trp-Z-
Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly enthält, worin Z Ser oder
Thr ist, oder ihr ein Peptidsegment vorangeht, das eine Sequenz
der Formel Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro
enthält, worin S Lys oder Asn ist, T His oder Glu ist, U Gly oder
Asn ist, V Asp oder Glu ist und W Asn oder Gln ist.
7. Peptid nach Anspruch 6, wobei das erwähnte Peptid eine
Sequenz der Formel Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-
Asp-Gly-Asn-Pro-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-
Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-
Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-
Pro-Asn-AlaAsn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-
Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-
Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-
Asn-Val-Asp-PrO-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-
Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Al a-
Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-
Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-
Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-
Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Lys-Asn-Asn-Gln-Gly-Asn-Gly-Gl n-Gly-
His-Asn-Met-Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-
Asn-Ala-Asn-Asn-Ala-Val-Lys-Asn-Asn-Asn-Asn-Glu-Glu-Pro-Ser-
Asp-Lys-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-
Ser-Thr-Glu-Trp-Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-As n-Gly
enthält.
8. Immunologisch aktives, im wesentlichen reines Peptid, das
fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort auszulösen, die
mit einem Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist, wobei das
erwähnte Peptid eine Sequenz der Formel Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-
Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly, worin Z Ser oder Thr ist, oder der
Formel Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro, worin S
Lys oder Asn ist, T His oder Glu ist, U Gly oder Asn ist, V Asp
oder Glu ist und W Asn oder Gln ist, enthält.
9. Peptid nach Anspruch 8, bei dem eine Sequenz der erwähnten
Formeln mindestens 10% des erwähnten Peptids bildet.
10. Peptid nach Anspruch 9, bei dem das erwähnte Peptid im
wesentlichen aus einer oder beiden der erwähnten Formeln besteht.
11. Peptid nach Anspruch 9, bei dem die erwähnte Sequenz Thr-
Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly ist.
12. Peptid nach Anspruch 11, bei dem Z Ser ist.
13. Immunogenes Stimulans gegen Malaria, das ein an einen
immunogenen Träger gebundenes Peptid nach Anspruch 1 enthält.
14. Stimulans nach Anspruch 13, bei dem der erwähnte Träger
durch eine Amidbindung, die zwischen einer Carboxyl- oder
Aminogruppe des erwähnten Trägers und einer Amino- oder
Carboxylgruppe des erwähnten Peptids gebildet ist, oder eine
Esterbindung, die zwischen einer Carboxyl- oder Hydroxylgruppe des
erwähnten Trägers und einer Hydroxyl- oder Carboxylgruppe des
erwähnten Peptids gebildet ist, an das erwähnte Peptid gebunden
ist.
15. Stimulans nach Anspruch 13, bei dem der erwähnte Träger ein
Protein oder ein Polysaccharid ist.
16. Stimulans nach Anspruch 15, bei dem der erwähnte Trager ein
Molekulargewicht von 10.000 bis 1.000.000 hat.
17. Stimulans nach Anspruch 15, bei dem der erwähnte Träger an
1 bis 100.000 der erwähnten Peptide gebunden ist.
18. Stimulans nach Anspruch 15, bei dem der erwähnte Träger ein
amphoteres Protein ist und das erwähnte Peptid an den
hydrophilen Teil des erwähnten Proteins gebunden ist.
19. Stimulans nach Anspruch 13, bei dem der erwähnte Träger
eine Bakterienzelle oder ein Liposom ist.
20. Stimulans nach Anspruch 19, bei dem jeder Träger an 10&sup5; bis
10¹&sup5; der erwähnten Peptide gebunden ist.
21. Immunogenes Stimulans gegen Malaria, das ein an einen
immunogenen Träger gebundenes Peptid nach Anspruch 8 enthält.
22. Peptid nach Anspruch 1 oder 8 für die Verwendung in einem
Verfahren zum Auslösen einer Immunisierung gegen Malaria, bei
dem einem Menschen eine immunologisch wirksame Menge eines
Peptids nach Anspruch 1 oder 8 oder eines Stimulans nach Anspruch
13 oder 21 verabreicht wird.
23. Im wesentlichen reine DNA-Sequenz, die für das Peptid nach
Anspruch 1 oder 8 codiert.
24. Rekombinantes DNA-Klonierungshilfsmittel, das die
DNA-Sequenz nach Anspruch 23 enthält.
25. Klonierungshilfsmittel nach Anspruch 24, bei dem das
erwähnte Hilfsmittel ein Mikroben- oder Hefeplasmid oder ein
Bakteriophage ist.
26. Klonierungshilfsmittel nach Anspruch 25, bei dem das
erwähnte Hilfsmittel λgt11 ist.
27. Einzelliger Organismus, der die DNA-Sequenz nach Anspruch
23 enthält, bei dem die erwähnte DNA-Sequenz künstlich in den
erwähnten Organismus eingeführt worden ist und der erwähnte
Organismus fähig ist, ein immunologisch aktives Peptid zu
exprimieren, das fähig ist, in einem Menschen eine Immunantwort
auszulösen, die mit einem Malaria-Parasiten kreuzreaktiv ist und
gegen ihn schützt.
28. Organismus nach Anspruch 27, wobei der erwähnte Organismus
von ATTC 39738, ATTC 39739, ATTC 39740, ATTC 39741, ATTC 39742,
ATTC 39743 oder ATTC 39744 abstammt.
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