DK166155B - Immunologisk aktive peptider, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel indeholdende disse, anvendelse deraf til fremstilling af et malariaimmuniserende middel, en dna-sekvens, der koder for peptiderne, en dna-kloningsbaerer der omfatter dna-sekvensen samt en e. coli-organisme, der indeholder dna-sekvensen - Google Patents
Immunologisk aktive peptider, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel indeholdende disse, anvendelse deraf til fremstilling af et malariaimmuniserende middel, en dna-sekvens, der koder for peptiderne, en dna-kloningsbaerer der omfatter dna-sekvensen samt en e. coli-organisme, der indeholder dna-sekvensen Download PDFInfo
- Publication number
- DK166155B DK166155B DK191991A DK191991A DK166155B DK 166155 B DK166155 B DK 166155B DK 191991 A DK191991 A DK 191991A DK 191991 A DK191991 A DK 191991A DK 166155 B DK166155 B DK 166155B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- asn
- protein
- peptide
- pro
- sequence
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 127
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 31
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 147
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 108
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 105
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 57
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 25
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 3
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 2
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 2
- 241000223806 Plasmodium lophurae Species 0.000 description 2
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000005489 dwarf bean Nutrition 0.000 description 2
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100185024 Mus musculus Mslnl gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 240000009188 Phyllostachys vivax Species 0.000 description 1
- 241000224028 Plasmodium cynomolgi Species 0.000 description 1
- 241000578450 Plasmodium falciparum 7G8 Species 0.000 description 1
- 241000223819 Plasmodium fragile Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000724762 Salmonella phage 5 Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710152205 Sporozoite antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 108091006374 cAMP receptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- SNVLJLYUUXKWOJ-UHFFFAOYSA-N methylidenecarbene Chemical group C=[C] SNVLJLYUUXKWOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical class [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
- C07K16/205—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/29—Polyamino acid or polypeptide with an uninterrupted series of peptide repeating units
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i
DK 166155B
Den foreliggende opfindelse angår et immunologisk aktivt i alt væsentligt rent syntetisk peptid, der er i stand til hos et menneske at fremkalde en immunreaktion, og som er krydsreaktiv med og beskyttende mod infektioner af en malariaparasit, et 5 malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, anvendelse af peptidet til fremstilling af et middel til at fremkalde immunisering mod malaria, en i alt væsentlig ren DNA-sekvens, der koder for peptidet, en rekombinant DNA-kloningsbærer, der omfatter DNA-sekvensen samt en E. coli-organisme, der indehol-10 der DNA-sekvensen.
Opfindelsen angår således immunplogisk aktive midler, der er i stand til at fremkalde immunreaktioner i mennesker og andre dyr, hvilket resulterer i beskyttelse mod infektioner med ma-15 lariaparasitter og nærmere bestemt beskyttelsen af mennesker mod human malariaparasitten Plasmodium falciparum.
Der er helt klart behov for vacciner til at afhjælpe den nuværende globale genopblussen af malaria. Fordi immunitet mod malaria 20 er stadiumspecifik, er der blevet udviklet vacciner mod hvert stadium i malarialivscyklen: sporozoiter, myggestadiet, som initierer infektion hos mennesker; asexuelle erythrocyt-para-sitter, stadiet, som fremkalder sygdommen, samt gameter, stadiet, som overfører infektionerne til myg. Et område af inte-25 resse er en sporozoitvaccine, som, hvis den er effektiv, ville påvirke immunsystemet til at dræbe sporozoiter, der er innoku-leret af myggen og således hindre de efterfølgende stadier, der er ansvarlige for sygdommen, i overførsel af infektionen til andre.
30
Dyr og mennesker er tidligere blevet beskyttet ved injektion af bestrålede sporozoiter. Vaccination med bestrålede sporozoiter er imidlertid upraktisk på grund af den begrænsede tilførsel og instabilitet af sporozoiter. Anvendelsen af mono-35 klone antistoffer førte til opdagelsen af det vigtigste overfladeprotein på sporozoiter af Plasmodium berghei, en gnavermalaria (N. Yoshida, R. S. Nussenzweig, P. Potocnjak et al.,
DK 166155B
2
Science 207, 71 (1980)). Dette protein dækker overfladen af sporozoiten og betegnes som circumsporozoit (CS)-proteinet. Injektion af monoklone antistoffer mod CS-proteinet af P. berghei beskyttede mus fuldstændigt mod angreb af infice-5 rede myg (P. Potocnjak, R. S. Nussenzweig, V. Nussenzweig, J. Exp. Med. 151, 1504 (1980)). Analoge CS-proteiner er blevet identificeret til arter af abe- og human-malaria, herunder p. falciparum, den vigtigste malaria hos mennesker (F. Santoro et. al., J. B i o1. Chem. 258, 3341 (1983); E. H. Nardin et al., 10 J. Exp. Med. 156, 20 (1982)), selv om strukturen af P. falci-parum-proteinet ikke kendtes forud for den foreliggende opfindelse. Genet for CS-proteinet af abe-mal arien, P.kleave, blev klonet først på grund af tilgængeligheden af store antal af P. kleave sporozoiter i inficerede myg til fremstillingen 15 af et cDNA-bibliotek J. Ellis (L. S. Ozaki, R. W. Gwadz et al, Nature 302, 536 (1983); G. N. Godson, J. Ellis, P. Svee et al., Nature 305, 29 (1983)). Dette gen kodede for et protein med en gentagende aminosyresekvens (12 aminosyrer gentaget 12 gange), som indeholdt den epitop, som binder de beskyttende 20 monoklone antistoffer. Denne gentagende epitop var det væsentligste immunogen på proteinet, da monoklone antistoffer blokerede adgang for polyklone anti-sporozoit-sera til "Triton X-100" opløseliggjort protein i den immunoradiometriske prøve (F. Zavala, A. H. Cochrane, E. H. Nardin et al., J. Exp. Med.
25 157, 1947 (1983)).
Der er imidlertid fortsat behov for et antigent stof, der er beslægtet med CS-proteinet af en human-malariaparasit, da antistoffer, der tidligere er blevet fremstillet mod denne gen-30 tagende epitop fra abeparasitter, ikke kan reagere med human-malari aparasitter.
Det er derfor formålet med opfindelsen at tilvejebringe en syntetisk peptidsekvens, der er i stand til at fremkalde en 35 mod malariainfektion beskyttende immunreaktion i mennesker.
Det er et andet formål med opfindelsen at tilvejebringe en DNA-sekvens, der er i stand til at udtrykke antigent stof med -iff'
DK 166155 B
3 sådanne egenskaber.
Disse og andre formål med opfindelsen er, som det vil fremgå tydeligere af det følgende, blevet opfyldt ved tilvejebrin-5 gelse af et immunologisk aktivt, i alt væsentligt rent, syntetisk peptid, som i et menneske er i stand til at fremkalde en immunreaktion enten alene eller når det er bundet til et bæremolekyle, og som er krydsreaktiv med og beskyttende mod infektioner med en malariaparasit, hvilket peptid er ejendommeligt 10 ved, at det indeholder en sekvens med formlen Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly, hvori Z er Ser eller Thr, eller formlen Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro, hvori S er Lys eller Asn, T er His eller Glu, U er Gly eller Asn, V er Asp eller Glu, og W er Asn eller Gin.
15
Opfindelsen angår også et malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, der er ejendommeligt ved, at det omfatter et peptid ifølge opfindelsen bundet til en immunogen bærer.
20 Opfindelsen angår endvidere anvendelse af et peptid ifølge opfindelsen til fremstilling af et middel til at fremkalde immunisering mod malaria.
Opfindelsen angår desuden en i alt væsentligt ren DNA-sekvens, 25 der koder for peptidet ifølge opfindelsen.
Desuden angår opfindelsen en rekombinant DNA-kloningsbærer, der er ejendommelig ved, at den omfatter nævnte DNA-sekvens.
30 Endelig angår opfindelsen en E. coli-organisme, der indeholder den nævnte DNA-sekvens, og som er ejendommelig ved, at DNA-se-kvensen er blevet kunstigt indført i organismen, og at organismen er i stand til at udtrykke et immunologisk aktivt peptid, der er i stand til hos et menneske at fremkalde en immun-35 reaktion, som er krydsreaktiv med og beskyttende mod en malariaparasit.
DK 166155B
4
Nature bind 289 (1981), side 301 -303 beskriver antigener fra Plasmodium falciparum, der kan påvises af monoklonale antistoffer, som hindrer vækst af Plasmodium falciparum. Artiklen anviser immunisering af mus med de naturligt forekommende P.
5 falciparum-antigener udvundet fra en patient med malaria. Chemical -Abstracts bind 99 (1983) nr. 51557p beskriver circumspo-rozoit-proteiner af Plasmodium falciparum. Disse proteiner er multivalente med hensyn til en enkelt epitop, idet monomerer af proteinerne kan binde to eller flere molekyler af det sam-10 me antistof. Referencen angiver imidlertid tydeligt, at stør stedelen af den immunogene aktivitet hos P. falciparum, P. vi-vax og P. knowlesi er placeret i CS-proteinet. Begge de nævnte referencer anviser imidlertid alene naturligt forekommende CS-proteiner som antigener og beskæftiger sig således ikke med 15 syntetiske proteiner. Det har nu vist sig, at hele CS-protein- strukturen ikke er nødvendig til opnåelse af antigenisk aktivitet, idet der kan fremstilles specifikke sekvenser syntetisk, hvilke sekvenser er dem, der er af vigtig betydning til at fremkalde immunisering mod malaria. Kendskabet til, hvorle-20 des disse syntetiske peptider skal være sammensat er af særlig nytte, idet sådanne let kan fremstilles ved genteknologi. Dette giver mulighed for at fremstille store mængder af det immunogene protein og gør det således let af fremstille store mængder af malariavaccine. Da de nævnte referencer ikke anvi-25 ser hvilke sekvenser, der er betydningsfulde for immunreakti onen, kan man ikke på samme lette måde fremstille malariavaccine på bais af de anvisninger, der fremgår af ovennævnte referencer fra Nature og Chemical Abstracts.
30 En nærmere forståelse af opfindelsen og mange af de heraf følg ende fordele vil let kunne forstås efter gennemgang af den følgende detaljerede beskrivelse i forbindelse med tegningerne, hvori 35 fig. 1 viser et skematisk restriktionskort og sekventerings- strategi for klon AmPfl. Positionerne af restriktionsenzym-kløvningsstederne, der er vist i figuren, blev bestemt ud fra
DK 166155B
5 sekvensen og bekræftet ved digestion: A. Avail; Ac. Accl; B. Bstnl; D. Dral; Dd. Odel; F. Fokl; N. Ndel; R. Rsal; S. Stul; T. TthIII; Tq. TaqI; X. XhoII. Pile viser udgangspunktet, retningen og omfanget af de bestemte sekvenser. Den CS-protein-5 kodende region er vist ved en optrukket linie.
Fig. 2 viser nucleotidsekvensen af CS-proteingenet fra P. falciparum. Nucleotidsekvensen af CS-proteingenet i AmPfl er vist. Det indsatte stykke EcoRl i XmPfl blev subklonet i pUC8 10 og derpå sekventeret. Sekvensen af begge DNA-strenge blev be stemt for 100% af den CS-proteinkodende region og over 70% af de flankerende regioner. De indsatte stykker af kloner AmPf5, 8, 13 og 15 blev også subklonet i pUC8 og enderne sekventeret. Den første base af hver klon 5' til den CS-proteinkodende re-15 gion er anbragt til højre for pilene. EcoRl-koblerne (GGAATTCC), der er ligeret i begge ender af de indsatte stykker, er ikke vist som en del af sekvensen. Den udledte aminosyresekvens af CS-proteinet er givet nedenfor nucleotidsekvensen. To regioner af proteinet fra P. falciparum-homologe til P. Knowlesi 20 CS-proteinet er mærket region I og region II. Gentagelsesenhederne er understreget, og de afvigende aminosyrer i enhederne er i kasser. Den gule terminatorkodon i sekvensen er angivet med stjerner.
25 Fig. 3 viser i grafisk form data, som viser inhibering af binding af monoklont anti-CS-proteinantistof, 2F1.1, ved hjælp af syntetiske peptider af den dominerende gentagende aminosyresekvens. Syntetiske peptider, der indeholder voksende længder af den dominerende gentagelsessekvens, blev fremstil-30 let og anvendt til at inhibere binding af 2F1.1 til et lysat af AmPfl, der vokser i Y1089. Dataene er angivet som middeltallet ± SE af tre replikationer. De syntetiske sekvenser, der blev undersøgt, var Asn-Pro-Asn-Ala (_),
Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala (o_o), 35 Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala (Δ_Δ),
Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala (X-X), og et ubeslægtet decapeptid (·_·).
DK 166155B
6
Fig. 4 viser formler af homologiregioner mellem CS-proteinerne P. falciparum og P. knowlesi. Region I ender to aminosyrer fra gentagelsesdelen af proteinet i P. falciparum. I P. Knowlesi er mindst 3 aminosyrer af denne region en del af protei-5 nets gentagelsesdel.
Den foreliggende opfindelse opstod delvis ud fra opdagelsen af egenskaberne og strukturen af de immunologisk aktive segmenter af CS-proteinet fra P. falciparum. Opfinderne har bekræftet, 10 at monoklone antistoffer, der kan reagere med CS-proteinet af P. falciparum, er rettet mod gentagelsesenheder, der findes i proteinet. Nu hvor disse gentagelsesenheder (og andre regioner af CS-proteinet, som viser sig at være invariante regioner, der findes i adskillige plasmodium-arter) er blevet identifi-15 ceret, er det muligt ved hjælp af enten syntetisk-kemiske midler eller ad biologisk vej at fremstille peptider, der indeholder disse immunodominantregioner, som udgør grundlaget for vacciner.
20 Den foreliggende opfindelse omfatter følgelig et immunologisk aktivt, i alt væsentligt rent, syntetisk peptid, der er i stand til i et menneske at fremkalde en immunreaktion enten alene eller bundet til et bæremolekyle, som er krydsreaktivt med og beskyttende mod infektion med en malariaparasit, hvorhos pep-25 tidet indeholder.en sekvens med formlen Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-
Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly, hvori Z er Ser eller Thr, eller formlen Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-U-V-Gly-W-Pro, hvori S er Lys eller Asn, T er His eller Glu, U er Gly eller Asn, V er Asp eller Glu, og W er Asn eller Gin. En tilsvarende virk-30 ning har et peptid, der indeholder mindst to på hinanden føl gende gentagelser af en sekvens Asn-X-Y-Pro, hvor X er Ala eller Val, og Y er Asn eller Asp. Sidstnævnte peptid er beskrevet i DK patentansøgning nr. 2891/85. Der er følgelig mindst tre variationer af peptider, som har den ønskede immu-35 nologiske karakter: (1) et peptid, som indeholder gentagelses enhederne, men ikke de længere sekvenser; (2) et peptid, som indeholder et eller begge de to længere sekvenser (heri ofte
DK 166155 B
7 benævnt som region I og region II), og (3) et peptid, der indeholder både gentagelsesenhederne og en af eller begge sekvenserne, der er identificeret som region I og region II.
5 Udtrykket "syntetisk" anvendes heri til at betegne, at det tidligere kendte CS-protein fra P. falciparum er specielt ude-1ukket fra peptider ifølge opfindelsen, når det foreligger i laturlig tilstand. Den foreliggende opfindelse bygger delvis p> opdagelsen af strukturen af epitoperne af CS-proteinet og 10 på den evne, som antistofferne mod disse epitoper har til at frembringe immunitet mod malaria. Da epitopens struktur blev kendt, blev det muligt at konstruere syntetiske peptider, der er nyttige som vacciner. Syntetisk udelukker imidlertid ikke her produktionen ved hjælp af biologiske metoder, hvori men-15 nesker har interveneret, f.eks. ved anvendelse af genteknik.
En afgørende egenskab hos alle peptider ifølge opfindelsen er, at de er immunologisk aktive og i stand til at fremkalde en human reaktion, som er krydsreaktiv overfor infektion med en 20 mal ar i aparasit enten alene eller bundet til et bæremolekyle.
Det er derfor nødvendigt at i det mindste en del af de opregnede sekvenser findes på en immunogent tilgængelig overflade af et peptid, der indeholder en eller flere af disse sekvenser. Der findes flere metoder til opbygning af et peptid med 25 disse egenskaber.
For det første er det muligt kemisk eller biokemisk at syntetisere et peptid, hvori peptiderne består i alt væsentligt af de opregnede sekvenser. Sådanne peptider plejer at indeholde 30 mindst 10¾ af deres aminosyrer i de opregnede sekvenser, fortrinsvis mindst 40%, og især mindst 60%, og særligt fordelagtigt mindst 80%. Især foretrækkes peptider, som består fuldstændigt af de opregnede sekvenser (sammen med peptider, der kan betragtes som bestående af den opregnede gentagelsesse-35 kvens, hvori 1-3 terminalaminosyrer af peptidet mangler fra den ene eller begge ender af peptidet).
DK 166155B
8
Det er også muligt at konstruere peptider, hvori de opregnede sekvenser af aminosyrer findes på overfladen af slutpeptidet. Dette kan ske f.eks. ved at vedhæfte en eller flere af de opregnede sekvenser til en overflade af et forud fremstillet 5 peptid ved hjælp af en peptidbinding.
Selv i det tilfælde, hvor en eller flere af de opregnede sekvenser er indeholdt i det indre af aminosyresekvensen af et større syntetisk peptid eller protein, kan fagfolk på immuno-10 logiområdet let bestemme, om peptidet falder inden for den fo religgende opfindelses omfang. Kun de peptider, som kan reagere med antistoffer, der er fremkaldt mod CS-proteiner, antages at falde indenfor den foreliggende opfindelses omfang. Fagfolk på området kan derfor let syntetisere et peptid som 15 indeholder en af sekvenserne ifølge den foreliggende opfindel se og derpå rutinemæssigt bestemme, hvorvidt det færdige produkt falder indenfor den foreliggende opfindelses omfang eller ej ved omsætning af proteinet med et antistof (fortrinsvis et monoklont antistof) fremkaldt mod et CS-protein, fortrinsvis 20 et CS-protein af P. falciparum, eller mod et peptid, som be står i alt væsentligt eller fuldstændigt af én af de sekvenser, som specielt er angivet i den foreliggende tekst. Hvis der foregår en positiv immunologisk reaktion, falder proteinet indenfor den foreliggende opfindelses omfang. Antistoffer, der 25 kan reagere med CS-proteinet af P. falciparum, er offentligt og let tilgængelige, idet de f.eks. produceres ved hjælp af deponeret hybridoma-cellelinie ATCC HB8583, som danner antistoffet, der heri er identificeret som 49.2F1.1.
30 Der er ikke nogen øvre grænse for størrelsen af molekyler ifølge opfindelsen, bortset fra de grænser, som udgøres af evnen til at syntetisere store peptidmolekyler. Molekyler ifølge opfindelsen kan være enten opløselige eller uopløselige i vandige opløsninger. I virkeligheden omfatter en foretrukket ud-35 førelsesform for opfindelsen syntesen af højmolekylære, uop løselige peptider, der kan formales og injiceres som en vandig suspension for at fremkalde immunologisk beskyttelse. Mindre
DK 166155B
9 molekyler er ikke desto mindre også velegnede til gennemførelse af opfindelsen. Molekyler, der indeholder 100, 200, 400 eller endog 1.000 gentagelsesenheder er velegnede til udøvelse af den foreliggende opfindelse. Der synes imidlertid ikke at 5 være behov for syntetisering af peptider, der indeholder flere end 50 gentagelsesenheder, da peptider, der indeholder indtil 50 gentagelsesenheder, vil være tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede immunologiske effekt og er lettere at syntetisere. Molekyler med 20 - 50 gentagelsesenheder foretrækkes især.
10 Peptider, som indeholder indtil 50 gentagelsesenheder, hvori gentagelsesenhederne udgør mindst 40% og især 80% af hele pep-tidet, foretrækkes. Af de mulige gentagelsesenheder fortrækkes især Asn-Ala-Asn-Pro, medens gentagelsesenheden Asn-Val-Asp-Pro er den dernæst mest foretrukne sekvens. Peptider, hvori 15 mindst 80% af gentagelsesenhederne er Asn-Ala-Asn-Pro, idet resten er Asn-Val-Asp-Pro, foretrækkes især.
En særligt foretrukket peptidsekvens til peptider, der indeholder gentagelsesenhederne, er et peptid, som består i alt væ-20 sentligt af sekvensen A-B-A-B-A-B(A)15-B-(A)x, hvori A bete gner Asn-Ala-Asn-Pro, B betegner Asn-Val-Asp-Pro, og x er 0-30, fortrinsvis 15-25, og særligt fordelagtigt 20.
Når et peptid ifølge opfindelsen indeholder en af sekvenserne, 25 der ikke specielt er angivet som en krævet gentagelsesenhed (selv om disse sekvenser naturligvis kan gentages om ønsket) foretrækkes peptider, hvori Z er Ser, S er Lys, T er His, U er 61y, V er Asp, og W er Asn. Af de to opregnede længere sekvenser foretrækkes peptider, der indeholder sekvensen Thr-Glu-30 Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly (dvs. region II).
Når der syntetiseres et peptid ifølge opfindelsen, som indeholder både gentagelsessekvenserne og en eller flere af peptidsekvenserne, der er identificeret som region I eller region 35 II, indeholder de peptider, som foretrækkes, fra 2 til 50 af gentagelsesenhederne efterfulgt af en peptidsekvens, der indeholder region Il-sekvensen og har forud en peptidsekvens,
DK 166155B
10 der indeholder region l-sekvensen. Et særligt foretrukket peptid indeholder en sekvens med formlen Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-5 Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-
Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-10 Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-
Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Lys-Asn-Asn-Gln-15 Gly-Asn-Gly-Gln-Gly-His-Asn-Met-Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-
Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Asn-Ala-Asn-Asn-Ala-Val-Lys-Asn-Asn-Asn-Asn-Glu-Glu-Pro-Ser-Asp-Lys-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Ser-Thr-Glu-Trp-Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly.
20
Den foretrukne fremgangsmåde til syntetisering af peptider ifølge opfindelsen, der indeholder gentagelsesenheder, er dannelsen af en eller flere tetramerer med den ønskede struktur efterfulgt af polymerisation af tetramererne til dannelse af 25 slutproduktet. Meget store peptider kan fremstilles på denne måde. Sådan kemisk syntese foretrækkes også, når en lang gentagelsessekvens findes som en del af et større molekyle. Gentagelsessekvensen og de kortere variable sekvenser kan syntetiseres uafhængigt og derpå sammenføjes til dannelse af de 30 ønskede slutprodukter. Sådanne teknikker er velkendte for fag folk med kendskab til peptidsyntese. I US-patentskrift nr. 4.132.746 beskrives f.eks. syntesen af peptidtetramerer og polymerisationen af tetramererne til dannelse af større molekyler. Den deri beskrevne fremgangsmåde kan let tilpasses til den fo-35 religgende opfindelse ved valg af de heri beskrevne aminosyrer i stedet for de i patentskriftet anførte aminosyrer.
DK 166155B
11
Med fremkomsten af moderne peptidsyntetiseringsmidler (hvoraf mange er kommercielt tilgængelige) er det naturligvis i voksende grad blevet lettere at syntetisere enten komplette store peptidmolekyler eller at syntetisere store fragmenter, som S derpå kan sammenknyttes.
For en beskrivelse af de genetiske (biologiske) metoder til syntetisering af peptider ifølge opfindelsen vil det være nyttigt at betragte en foretrukket udførelsesform for opfindel-10 sen, hvori evnen af peptiderne ifølge opfindelsen til at fremkalde immunologisk reaktion forøges ved binding af et eller flere af peptiderne ifølge opfindelsen til en immunogen bærer. Det resulterende produkt med forøget immunogenicitet betegnes heri som et antimalaria-immunogent stimuleringsmiddel.
15
Anvendelsen af immunogene bærere til at forøge immunogenicite-ten af små molekyler er velkendt. Bærere deles principielt i to klasser, nemlig opløselige molekyler og partikler. Typiske eksempler på opløselige molekyler er proteiner og polysaccha-20 rider. Typiske eksempler på partikler er liposomer og bakte rieceller eller dele deraf, såsom membraner. Hele celler dræbes almindeligvis eller deres reproduktion hindres for at undgå problemer i forbindelse med infektion.
25 I alle tilfælde er den faktiske struktur af bæreren uden be tydning, da det er bærerens størrelse, der bevirker forøgelse af den immunogene reaktion. Når opløselige makromolekyler, såsom proteiner og polysaccharider, anvendes som bærere, foretrækkes molekylvægte i intervallet fra 10.000 til 1.000.000.
$0 Hvis størrelsen er tilstrækkelig stor, kan protein- eller polysaccharidebæreren være uopløselig og således betragtes som et partikelformet stof.
Fremgangsmåden til vedhæftning af et peptid til bæreren er for-$5 holdsvis uinteressant, når blot peptidets immunogene specifi citet bevares i det mindste delvis. En foretrukket metode til opnåelse af dette resultat er at hæfte et peptid til bæreren
DK 166155B
12 ved hjælp af en amidbinding, dannet mellem en carboxylsyre eller aminogruppe fra bæreren og en amino- eller carboxylsy-regruppe a peptidet, især en fri carboxylsyre- eller aminoter-minalgruppe af peptidet. En anden foretrukket bindingsmetode 5 er dannelsen af en esterbinding mellem en carboxylsyre- eller hydroxygruppe fra bæreren og en hydroxy- eller carboxylsyre-gruppe fra peptidet, fortrinsvis en terminalcarboxylsyregruppe fra peptidet. Bindingsgrupper, f.eks. terminal di aminer med 1 -10 methylencarbonatomer, som forbinder aminerne, kan anvendes 10 om ønsket.
Når der anvendes en bærer, kan immunreaktionen forøges ved at binde flere peptider til bærerens overflade. Der kan f.eks. bindes fra 1 til 100.000 peptider til et protein eller et po-15 lysaccharid, idet 100 - 10.000 foretrækkes. Når proteiner an vendes som bærer, foretrækkes amfotere proteiner. Sådanne proteiner har en lipofil del og en hydrofil del. I sådanne proteiner foretrækkes det at binde peptider ifølge opfindelsen til den hydrofile del og derved udsætte dem for det humorale 20 miljø, når den lipofile del bliver indlejret i forskellige membraner.
Et foretrukket protein til anvendelse som bærer er tetanus-toxoid, en rutinemæssigt anvendt vaccine, som er et stof som 25 tidligere er blevet foreslået til anvendelse som immunogen bærer.
Den foretrukne udførelsesform, som er angivet ovenfor til brug med makromolekylebærere, egner sig også til brug i forbindelse 30 med partikelformede bærere bortset fra, at den øvre grænse for peptider pr. bærer er ca. 1015, fortrinsvis lo*0. Bakterieceller (dræbte eller på anden måde hindret i at reproducere) er de foretrukne partikelformede stoffer.
35 Når peptider, som nøje ligner det naturlige CS-protein fra P.
falciparum, ønskes, foretrækkes det at syntetisere peptidet biologisk under anvendelse af et gen, der er forbundet med el-
DK 166155 B
13 ler afledt af CS-proteingenet af P. falciparum. De resulterende genprodukter kan derpå modificeres, f.eks. ved kløvning af terminalaminosyrer.
5 Fremkomsten af rekombinant DNA-teknologien har i den senere tid ført til en hurtig forøgelse af antallet af teknikker, som er tilgængelige til fremstilling af klonede genprodukter. Eksempler på nyere amerikanske patentskrifter, hvori der er beskrevet metoder, som er velegnede til produktion af klonede ge-10 ner, der er velegnede til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter US-patentskrifterne nr.
4.419.450, 4.418.194, 4.414.150, 4.399.216, 4.394.443, 4.356.270, 4.351.901 og 4.237.224. Det er naturligvis også muligt at modificere de deri beskrevne teknikker ved syntetise-15 ring af DNA-sekvenser, som er i stand til at udtrykke det ønskede peptidprodukt og indføre dem i egnede kloningsvektorer, som beskrevet i US-patentskrifterne nr. 4.273.875, 4.304.863, 4.332.901, 4.403.036, 4.363.877 og 4.349.629. I det følgende beskrives generelt metoder, der involverer genetisk 20 manipulation og som er velegnet til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse.
Genetisk information indkodes på dobbelt-strenget deoxyribo-nucleinsyre ("DNA" eller "gener") i form af den rækkefølge, 25 hvori den DNA-kodende streng præsenterer de karakteristiske baser i dens gentagende nucleotidkomponenter. "Ekspression" af den indkodede information til dannelse af polypeptider omfatter en totrinsproces.
30 i overensstemmelse med visse kontrolregioners ("reguloner"), diktater i genet, kan RNA-polymerase bringes til at bevæge sig langs den kodende streng under dannelse af messenger-RNA (ri-bonucleinsyre) i en proces, der kaldes "transcription". I et efterfølgende translationstrin omdanner cellens ribosomer 35 sammen med transfer-RNA mRNA-"meddelelsen" til polypepti der. I den information, mRNA transcriberer fra DNA, er signaler for starten og termi ner i ngen af ribosomal translation såvel
DK 166155B
14 som identiteten og sekvensen af de aminosyrer, som udgør poly-peptidet. Den DNA-kodende streng omfatter lange sekvenser af nucleotid-tripletter, kaldet "codoner", fordi de karakteristiske baser af nucleotiderne i hver triplet-codon indkoder 5 specifikke inforraationsstykker. Tre nucleotider, der læses som ATG (adenin-thymin-guanin), resulterer f.eks. i et mRNA-signal, der fortolkes som "start translation" -, medens termi-neringscodoner TAG, TAA og TGA fortolkes som "stop translation". Mellem start- og stop-codonerne ligger det såkaldte 10 strukturelle gen, hvis codoner definerer aminosyresekvensen, der translateres i sidste instans. Denne definition forløber i overensstemmelse med den veletablerede "genetiske kode" (f.eks. J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin Inc., N.Y., 3. udgave (1976)) som beskriver codonerne 15 for de forskellige aminosyrer. Den genetiske kode er degenere ret i den forstand, at forskellige codoner kan give den samme aminosyre, men nøjagtig ved, at der for hver aminosyre er én eller flere codoner for denne og ingen anden. F.eks koder.alle codonerne TTT, TTC, TTA og TTG når de læses som sådanne, 20 således for serin og ingen anden aminosyre. Under translation skal den passende læsefase eller læseramme opretholdes. Overvej f.eks. hvad der sker, når ribosomet læser forskellige baser som begyndelsen af en codon (understreget) i sekvensen 25 . . . GCTGGTTGTAAG...:
...GCT GGT TGT AAG ...---...Ala-Gly-Cys-Lys... G CTG
30 GTT GTA AG ...---...Leu-Va1-Leu...
...GC TGG TTG TAA A ...---...Trp-Leu-(STOP).
Det til sidst dannede polypeptid afhænger således vitalt af den 35 rumlige sammenhæng af det strukturelle gen med hensyn til regulonen.
DK 166155Β 15 ψ
En bedre forståelse af fremgangsmåden ti] genetisk ekspression kommer, når man definerer visse komponenter af gener:
Operon: Et gen, der omfatter et eller flere strukturelle gener 5 til polypeptidekspression og kontrol regionen (''regulon"), som regulerer denne ekspression.
Promotor: Et gen i regulonen, hvortil RNA-polymerase skal binde til transcriptionsinitiering.
10
Operator: Et gen, hvortil repressorprotein kan binde, hvorved hindres RNA-polymerasebinding på den nærliggende promotor.
Inducer: Et stof, som deaktiverer repressorprotein, frigør 15 operatoren og lader RNA-polymerase binde til promotoren og begynde transcription.
Katabolit-aktivator-protein ("CAP") bindingssted: Et gen, som binder cyklisk adenosinmonophosphat (”cAMP)-formidlet CAP, 20 også almindeligt krævet til transcriptionsinitiering. CAP-bindingsstedet kan i særlige tilfælde være unødvendigt. En promotormutation i 1actose-operonen af phagenX plak UV5 eliminerer f.eks. kravet for cAMP- og CAP-ekspression. J. Beckwith et al., J. Mol. B i 01. 69, ISS160 (1972).
25
Promotor-operator-system: Betyder heri en operabel kontrolregion af et operon, med eller uden hensyn til dets inklusion af et CAP-bindingssted eller evne til at kode for repressor-pro-tein-ekspression.
30
Til definition og anvendelse ved den følgende diskussion af rekombinant-DNA defineres desuden følgende:
Kloningsbærer: Ikke-kromosomal, dobbeltstrenget DNA, der omfat-35 ter et intakt "replikon", således at bæreren replikeres, når den anbringes i en encellet organisme ("mikrobe") ved hjælp af en "transformations"-proces. En således transformeret organisme kaldes en "transformant".
DK 166155B
16
Plasmid: I det foreliggende tilfælde en kloningsbærer afledt af vira eller bakterier, idet sidstnævnte er "bakterielle plasmider".
5 Komplementaritet: En egenskab, der overføres af basesekvenserne af enkeltstrenget DNA, som tillader dannelsen af dobbeltstrenget DNA gennem hydrogenbinding mellem komplementære baser på de respektive strenge. Adenin (A) komplementerer thymin (T), medens guanin (G) komplementerer cytosin (C).
10
Fremskridt på det biokemiske område i de seneste år har ført til konstruktionen af "rekombinant"-kloningsbærere, hvori f.eks. plasmider laves til et bestemt eksogent DNA. 1 særlige tilfælde kan rekombinanten omfatte "heterologt" DNA, hvormed 15 menes DNA, som koder for polypepti der, som ikke normalt dannes af den organisme, som er modtagelig for transformation af den re-kombinante bærer. Plasmider kløves således til dannelse af lineær DNA med ender, der kan ligeres. Disse bindes til et eksogent gen med ligerbare ender til dannelse af en biologisk 20 funktionel del med et intakt replikon og en ønsket phenotypee-genskab, Rekombinantdelen indsættes i en mikroorganisme ved transformation, og transformanter isoleres og klones med henblik på opnåelse af store populationer, der er i stand til at udtrykke den nye genetiske information. Metoder og midler til 25 dannelse af rekorabinantkloningsbærere og transformering af organismer hermed er beskrevet indgående i litteraturen. Se f.eks. H.L. Heynecker et al., Nature 263, 748-752 (1976); Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70, 1293 (1973), ibid, 70, 3240 (1973), ibid, 71, 1030 (1974); 30 Morrow et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 1743 (1974) og Jackson et al., ibid, 69, 2904 (1972). En almen diskussion af emnet findes i S. Cohen, Scientific American 233,24 (1975). Disse og andre publikationer som omtales heri skal anses for inkorporeret i den foreliggende tekst ved henvisningen dertil.
Der er en række teknikker til rådighed for DNA-rekombiriation, ved hjælp af hvilke tilstødende ender af særskilte DNA-frag- 35
DK 166155 B
17 menter skræddersys på den ene måde eller den anden for at lette ligering. Sidstnævnte udtryk refererer til dannelsen af phosphodiesterbindinger mellem tilstødende nucleotider, oftes ved hjælp af enzymet T4 DNA-ligase. Stumpe ender kan således 5 ligeres direkte. Fragmenter, som indeholder komplementære enkeltstrenge ved deres tilstødende ender, fremmes alternativt ved hydrogenbinding, der bringer de respektive ender i stilling til efterfølgende ligering. Sådanne enkeltstrenge, der betegnes som cohæsive termini, kan dannes ved addition af nuc-10 leotider til stumpe ender under anvendelse af terminal transferase og under tiden simpelt hen ved at tilbagetygge en streng af en stump ende med et enzym, såsom λ-exonuclease. Igen kan man, mest almindeligt, gribe til restriktionsendonuc-leaser, som kløver phosphodiesterbindinger i og omkring un-15 nikke sekvenser af nucleotider med en længde på ca. 4-6 basepar. Mange restriktionsendonucleaser og deres genkendelsessteder kendes, idet den såkaldte Eco RI-endonuclease anvendes i størst omfang. Restriktionsendonucleaser, som kløver dobbeltstrenget DNA ved rotationssymmetriske "palindromer" efte-20 rlader cohæsive termini. Et plasmid eller anden kloningsbærer kan således kløves og efterlader termini, der hver omfatter halvdelen af restriktionsendonucleasegenkendelsesstedet. Et kløvningsprodukt af eksogent DNA vil have ender, der er komplementære med enderne af plasmidtermini. Som beskrevet neden-25 for kan alternativt termini i det syntetiske ONA, der omfatter cohæsive termini, baseret på indføjelse af eksogent DNA, blive digesteret med alkalisk phosphatase under tilvejebringelse af molekylær selektion til lukninger, der inkorporerer det eksogene fragment. Inkorporering af et fragment med passende orie-30 ntering i forhold til andre træk ved bæreren kan forøges, når fragmentet erstatter bærer-DNA, udskåret af to forskellige restriktionsendonucleaser og selv omfatter termini henholdsvis udgør halvdelen af genkendelsessekvensen af de forskellige en-donucleaser.
En fremgangsmåde til dannelse af hele CS-proteinet er beskrevet i den følgende almene metode. Denne metode byg- 35
DK 166155 B
18 ger på anvendelsen af havebønnenuclease under regulerede for-mamidkoncentrationsbetingelser og temperaturbetingelser til fortrinsvis kløvning af 5'- og 3'-enden af gener. DNA-frag-menter, der er opnået på denne måde, kan klones i forskellige 5 ekspressionsvektorer, såsom vektoren Xgtll- Kloner, der er dannet f.eks. ved transformation med en kloningsbærer, screenes for ekspression med antistof mod CS-proteinet. Den foreliggende opfindelse omfatter følgelig en i alt væsentligt ren DNA-sekvens, der koder for et peptid, som tidligere er blevet bes-10 krevet. Sådanne DNA-sekvenser kan let syntetiseres under anvendelse af et automatiseret udstyr som nu er på markede. Den aktuelle DNA-sekvens kan let beregnes ud fra de tidligere givne aminosyresekvenser. Særligt foretrukne DNA-sekvenser omfatter fragmenter, der er afledt af den DNA-sekvens, der er an-15 givet i fig. 2. De DNA-sekvenser, som i overensstemmelse med sammenhængen, der er vist i fig. 2, svarer til aminosyresek-venserne, som tidligere er blevet beskrevet heri som foretrukne, foretrækkes især.
20 En rekombinant kloningsbærer, som indeholder en af disse DNA-sekvenser, falder også inden for den foreliggende opfindelses omfang. Denne kloningsbærer kan være et mikrobielt plasmid eller gærplasmid eller en bakteriophag. En særligt foretrukket klonings-bærer er Xgtll. En éncellet organisme, der indeholder 25 en DNA-sekvens, som beskrevet ovenfor, der er i stand til at udtrykke et immunologisk aktivt peptid, der er i stand til i et menneske at fremkalde en immunreaktion, som krydsreageres med og er beskyttende mod en malariaparasit, falder følgelig indenfor den foreliggende opfindelses omfang, når DNA-sekven 30 sen er blevet kunstigt indført i den encellede organisme. E. coli er den foretrukne vært.
Opfindelsen eksemplificeres ved hjælp af adskillige deponeringer, som er sket ved the American Type Culture Collection, 35 Rockville, Maryland. Mikroorganismerne, der er identificeret som X- mPfl, 3, 5, 8, 11 og 13 er henholdsvis identificeret ved hjælp af følgende ATCC-deponeringsnumre 39738, 39739, 39740, 39741, 39742, 39743 og 39744.
DK 166155B
19
Selv om genetisk materiale til brug ved udøvelse af opfindelsen kan fremstilles syntetisk som beskrevet ovenfor, er det også muligt at opnå egnet genetisk materiale direkte fra P. falciparum protozoer under anvendelse af kendte teknikker.
5 Blandt de offentligt tilgængelige P. falciparum protozoer er der én, der er identificeret som 7G8, som er deponeret ved the American Type Culture Collection under deponeringsmummer ATCC 40123.
10 Med opfindelsen muliggøres en fremgangsmåde til fremkaldelse af immunisering mod malaria, ved hvilken fremgangsmåde en immunologisk effektiv mængde af et peptid ifølge opfindelsen gives til et menneske. Den passende, terapeutisk effektive dosis kan let bestemmes af fagfolk på området og vil sædvanligvis 15 ligge i intervallet fra ca. 0,01 pg/kg til ca. 100 pg/kg legemsvægt. Dosen er særligt fordelagtigt i intervallet fra ca. 0,1 til ca. 1,0 pg/kg.
Måden til indgift af peptider ifølge opfindelsen kan være en 20 hvilken som helst egnet vej, som leverer peptidet til det immunologiske system. Peptidet kan indgives intramuskulært, inter-venøst, eller ved hjælp af en hvilken som helst anden metode, som gør det muligt at den aktive bestanddel når lymfocytter og fremkalder en immunreaktion, 25
Peptider ifølge opfindelsen kan formuleres til farmaceutiske midler, der indeholder den aktive bestanddel i en form, som er velegnet til fremkaldelse af en immunreaktion. Vandige suspensioner eller opløsninger, der indeholder det aktive stof i en 30 form, som er klar til injektion, foretrækkes. Hjælpestoffer kan anvendes til at forøge immunreaktionen om ønsket.
Det foretrækkes, at peptiderne ifølge opfindelsen, når de indgår i farmaceutiske præparater, foreligger i enhedsdosisfor-35 mer. Til anvendelse til mennesker kan disse mængder let beregnes ud fra de dosismængder, som tidligere er angivet, ved forudsætning af en legemsvægt på 70 kg. En foretrukket enheds-
DK 166155B
20 dosis, der indeholder det farmaceutiske præparat, vil derfor indeholde fra ca. 7 til ca. 70 Mg aktiv bestanddel. Det må imidlertid forstås, at den specifikke dosismængde til en bestemt patient vil afhænge af en række faktorer, herunder akti-5 viteten af den specifikke forbindelse, der anvendes, alderen, den almene helbredelsestilstand, kønnet og patientens kost, indg iftstidspunktet, indgiftsvejen, udskillelseshastigheden, mulige synergistiske virkninger med andre lægemidler, der indgives, og den tilstræbte beskyttelsesgrad.
10 I den foreliggende tekst anvendes standardnomenklatur og biokemiforkortelser for peptid- og DNA-sekvenser. Et eksempel på en publikation, som indeholder den anvendte standardnomenklatur vedrørende peptid- og DNA-sekvenser, er Lehninger, Bioche-15 mistry. Worth publishers, New York (1970), kapitlerne 4 og 5 (peptider) og 12 (DNA).
Opfindelsen, som nu er beskrevet generelt, vil kunne forstås bedre ved henvisning til visse specifikke eksempler, som ude-20 lukkende er medtaget til belysning af opfindelsen.
Eksempel.
Kloner fra det genome DNA-ekspressionsbib1iotek.
25 P. falciparum genom-DNA-biblioteket i ekspressionsvektoren Xgtll (R.A. Young og R.W. Davis, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80, 1194 (1983)) blev fremstillet på følgende måde. Ekspressionsbiblioteket blev lavet ud fra DNA fra den offentligt 30 tilgængelige 7G8-klon af IMTM22-isolatet af P. falciparum fra Brasilien.
To 10 Mg prøver af genomt DNA fra Plasmodium falciparum klon 768 blev digesteret med 20 enheder havebønnenuclease (P-L Bio-35 chemicals) i 30 minutter ved 50eC i 100 pi puffer (0,2M NaCl, 1 mM ZnS04, 30 mM natriumacetat, pH 4,6) indeholdende enten 35 eller 40¾ formamid. Opløsningen blev derpå fortyndet 4 gange DK 166155 Β 21 med Ο,ΟΙΜ EDTA, ekstraheret med phenol og ethanol udfældet før efterfølgende behandling. DNA fra reaktionerne blev kombineret og anvendt som kilde for fragmenter til ligering i Xgtll. DNA blev behandlet med Klenow-fragment (BRL) under be-5 skrevne reaktionsbetingelser (T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982, side 394) og EcoRl-koblere (BRL) blev stump-endeligeret til de behandlede fragmenter. DNA blev digesteret to gange med et overskud af EcoRl og blev se-10 pareret fra fire koblere efter hver digestion på en 1,5 cm x 20 cm "Sepharose 4B"-kolonne. Xgtll blev selv-ligeret og digesteret med EcoRl. 230 ng af P. falciparum DNA-fragmenterne blev ligeret til 500 ng af det fremstillede Xgtll-DNA natten over ved 4eC med T4 DNA-ligase (IBI) under de af leverandøren anbe-15 falede betingelser. Halvdelen af ligeringsreaktionsprodukterne blev emballeret i infektiøs phag in vitro (Promega Biotec). 400.000 emballeringstilfælde blev målt ved påviselig afbrydelse af B-alactosidasegenet af Xgtll på RY1090, der gror på LB-agar, der er suppleret med Xgal og IPTG.
20
Bibliotektet blev udpladet ved en densitet på 25.000 plak pr. 150 mm plade på 27 plader. Nitrocelluloseplak-lifts blev fremstillet som beskrevet tidligere (R.A. Young og R.W. Davis Science 222, 778, 1983). En samling af 5 monoklone antistof-25 fer, der er rettet mod P. falciparum 7G8 CS-protein (tabel 1), blev anvendt ved en fortynding på 1/10.000 til screening.
30 35
DK 166155B
22
Tabel l. Reaktion af monoklone anti-CS-protein-antistoffer med lysater af bakterier, der udtrykker klonet CS-proteingen.
5 Antiaen _Monoklonal antistof_ 2E 6.4 2F 1.1 4D 9.1 4D 11.6 5G 5.3 >mPfl (2.3 kg)+ 1»2++ 1,3 1,7 1,5 1,9
JniPf3 (2.3 kg) 1,3 1,1 h9 1>4 1»8' 10 >iriPf5 (1.3 kb) 1,1 0,9 1,5 1,2 1,4
JrnPf8 (1.3 kb) 1,2 0,9 1,6 1,2 1,4
JiriPfll (2.3 kb) 1,1 0,9 1,6 1,3 1,4
JttnPfl3 (1.3 te>) 0,6 0,5 0,5 0,7 0,6 *nPfl5 (1.35 te>) 1,1 h1 >2?° 1>7 >2»° 15 Xgtll, IPTG induceret 0,5 0,5 0,4 0,6 0,4
Xgtll, ikke induceret 0,5 0,4 0,4 0,6 0,4 Y1089 0,4 0,5 0,3 0,6 0,3 20 + XmPf, P. falciparum CS-proteingener i Xgtll. Størrelsen af det indsatte stykke P. falciparum DNA i Xgtll er i parenteser. Alle bakterier blev induceret med IPTG.
++ Dataene er udtrykt som middel-absorbans ved 414 nm for tre 25 uafhængige bestemmelser af ELISA.
Bakterier, der er angivet i tabel 1, blev identificeret ved hjælp af den følgende screeningsmetode. En blanding af asci-tesvæsker fra fem hybridomaer blev fortyndet 1/10.000 i 0,15 m 30 NaCl, 0,05M Tris, pH 7,5 (TBS), der indeholder 0,05% Tween 20 og 3% BSA, og blev absorberet flere gange med et koncentreret lysat af Xgtll-inficerede RY1090-celler, lufttørret på nitrocellulose-filtre til fjernelse af antistoffer til E. coli og lambda. Nitrocelluloseplak-lifts fra P. falciparum-biblioteket 35 blev vasket i 500 ml TBS indeholdende 0,3% Tween 20, 3% bovin serumalbumin, 5 mM MgCl2 og 5 μ/ml DNAse I ved stuetemperatur i 30 minutter. Nitrocelluloseplak-lifts blev inkuberet med den
DK 166155B
23 absorberede blanding af monoklone antistoffer natten over ved 4eC. Alle yderligere manipulationer skete ved stuetemperatur. Efter dette og hvert af de efterfølgende to trin blev plakliftene vasket successivt i TBS + 0,05% Tween-20, i TBS + 1% 5 Tritron X-100 og ln TBS + 0,5% Tween i 30 minutter i hver opløsning. Signalet for de monoklone museantistoffer blev forstærket ved inkubering af filtrene i 1 time i kanin-anti-muse-IgG (Cappel), som var blevet fortyndet 500 gange i TBS, der indeholder 0,05% Tween og 3% BSA, og forud absorberet som 10 beskrevet ovenfori forbindelse med ascitesvæsken. Antistoffer, der er bundet til plak-liftene, blev påvist ved inkubering af indtil 5 filtre i 30 ml TBS, der indeholder 0,05%
Tween-20 og 1 pCi af l25I-mærket protein A (Ameraham), efterfulgt af vask og autoradiografi.
15 35 positive kloner blev opnået ved den første screening efter 48 timers autoradiografi. 17 blev screenet igen ved en densitet på 100-800 plak pr. 85 mm plade. 11 af klonerne gav positive plak i den anden screening. Disse blev klonet uden immu- 20 noscreening fra 85 mm plader, der indeholdt færre end 50 plak.
10 af de 11 kloner var immunoreaktive, da de blev screenet.
Indsatte stykker i de ti kloner faldt inden for de følgende størrelsesklasser: 3 (AmPfl, 3,11) var 2,3 kb, 3 (AmPf5, 8,13) 25 var 2,3 kb, AmPfl5 var 1,35 kb, AraPf6 var 1,0 kb og AmPfO var O, 5 kb. Klon AmPfl8 indeholdt to indsatte stykker og blev ikke studeret nærmere. De indsatte stykker af kloner AmPfl, 3, 5, 8, 11, 13 og 15 kryds-hybridiserede. AmPf6 og 9 kryds-hybri-diserede ikke, hvilket tyder på at de to mindre indsatte styk- 30 ker, selv om de er valgt fra blandingen af 5 monoklone antistoffer, kom fra en del af genomet uden for 2,3 kb-fragmentet.
Klon AraPf5 blev nick-translateret og anvendt som sonde til at undersøge en Southern-plet (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 35 503 (1975)) af Hindlll-digestioner af humant og P. falciparum genomt DNA. Et enkelt hybridiseringsbånd fandtes ved 14 kb i P. falciparum-banen (data ikke vist). Sonden hybridiserede ikke til humant DNA.
DK 166155B
24
Ekspression af CS-proteinet i E. coli.
Klonerne i Xgtll blev indført som lysogener i E. coli-stamme Y1089. Til dannelse af lysogener blev 10 μΐ bakteriophag 5 (10l°/ml) blandet med 100 μΐ E. coli Y1089 (108/mi) dyrket, i medier, der indeholder 50 pg/ml ampicillin og 0,2% maltose, pelleteret og suspenderet igen i 10 mM MgS04. Efter 20 minutter ved stuetemperatur blev cellerne fortyndet og fordelt på plader, der indeholdt 50 pg/ml ampicillin og dyrket ved 32°C.
10 Individuelle kolonier blev undersøgt for lysogeni ved deres evne til at vokse ved 42°C. Lysogener blev dyrket i medier, der indeholdt 50 pg/ml ampicillin ved 32eC, indtil absorbansen ved 550 nm var 0,4-0,8. Kulturerne blev derpå rystet forsigtigt ved 44°C i 20 minutter. IPTG blev derpå tilsat til en 15 slutkoncentration på 2 mM, og kulturen blev rystet i yderligere 1 time ved 37°C. Phagen blev indført ved 44°C, og isopropyl- thiogalactosid (IPTG) blev derpå sat til medierne for at forøge ekspressionen af Ø-galactosidase og eventuel let fusionsproteiner. Lysater af de inducerede bakterier blev analyseret 20 for reaktivitet over for hvert af de 5 monoklone antistoffer ved hjælp af den enzymbundne immunosorbentprøve (ELISA). Celler fra 50 kulturer, som blev dyrket og induceret som beskrevet ovenfor, blev suspenderet igen i 1,0 ml 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 mM phenyImethylsulfony1fluorid pr. 0,6 25 absorbans ved 550 nm. Suspensioner blev hurtigt frosset i et tøris/ethanol-bad og tøet 2 gange før fortynding med PBS. Lysater af kloner blev fortyndet 1/100 med phosphatpufret saltvand (PBS, 10 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl). 50 μΐ prøver blev pipetteret i brønde i en polyvinylchloridmikrotitre-30 ringsplade (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) og holdt ved stuetemperatur. Ca. 18 timer senere blev brøndene vasket 4 gange med 0,1% (vægt/volumen) bovin serumalbumin i PBS (PBS-BSA). Brøndene blev derpå flydt med 1% PBS-BSA og holdt i 1 time ved stuetemperatur. 50 μΐ ascitesvæske fra §n 35 af fem særskilte monoklone antistoffer blev fortyndet 1/500 med PBS, sat til den passende brønd og holdt i 1 time ved stuetemperatur. Ascitesvæsker fra disse fem monoklone anti-
DK 166155B
25 stoffer var positive i immunof1uorescent antistof (IFA) og circumsporozoitudfældnings-(CSP) reaktioner for P. falciparum sporozoiter. Brønde blev igen vasket som ovenfor, og 50 μΐ peroxidase-konjugeret gedeanti-muse-antistof (Kirkegård & Per-5 ry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) fortyndet 1/200 med PBS, blev sat til hver brønd og holdt ved stuetemperatur i 1 time. Brønde blev vasket med PBS-BSA, og 150 μ1 substrat blev sat til hverbrønd. Substratet bestod af 1 mg 2,21 -azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsyre) pr. ml af 0,1M citrat-phosphat-10 puffer, pH 4,0, med 0,003¾ hydrogenperoxid, tilsat umiddelbart før brug. Absorbans ved 414 nm blev bestemt ved 1 time med en "Titertek Multiskan"-pladelæser (Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). Seks kloner bandt alle fem monoklone antistoffer (tabel 1). Absorbansværdierne for klon XmPfl3 var ikke signi-15 fikant over kontrollerne. Klon XmPf9 bandt kun ét af de fem monoklone antistoffer, 4011.6 (data ikke vist). Da klon XmPf9 ikke hybridiserede med XmPfl, som indeholder genet for CS-proteinet (se nedenfor), har dette monoklone antistof identificeret et gen, som ikke er beslægtet med genet for CS-prote-20 inet. Proteinet, der er udtrykt ved XmPf9, har en epitop, der krydsreagerer med dette ene monoklone antistof. Hope et al. identificerede et monoklont antistof til et asexuelt, erythro-cytisk antigen af P. falciparum som kryds-reagerede med et antigen på overfladen af P. falciparum sporozoiter. I.A. Hope, 25 R. Hall, D.Z. Simmons, et al.. Nature, 308, 191 (1984). Hvorvidt XmPf9 indeholder et gen, der koder for proteinet, der er beskrevet af Hope et al, eller et andet kryds-reaktivt protein, mangler endnu at blive bestemt.
30 Lysaterne, der blev anvendt til ELISA, blev også underkastet elektroforese på SDS-polyacrylamidgel SDS-PAGE) og elek-troblottet på nitrocellulose. Pelleterede celler fra 1 ml af hver lysogen kultur (se note 14) blev opløst i 200 μΐ SOS gel-prøvepuffer (3¾ SOS, 10¾ glycerol, 10 mM dithiothrei tol, 35 62 mM tris-HCl, pH 6,8) og opvarmet til 95eC i 5 minutter.
Plasmodium falciparum sporozoiter blev isoleret fra spytkirtlerne af An. freeborni myg og konserveret som pellets ved
DK 166155B
26 .80°C i PBS, der indeholdt 0,2% ovalbumin. Til antigenekstraktion blev 450 μΐ frisk fremstillet ekstraktionspuffer (0,5% NP40, 2 mM PMSF, 33 pg/ml leupeptin, 33 pg/ml antipain og 2 mg/ml bovin serumalbumin i PBS) sat til en pellet af 4,5 x 105 5 sporozoiter. Stoffet blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med kraftig omhvirvling i 15-30 sekunder hvert 10 minut.
De ekstraherede sporozoiter blev pelleteret ved centrifugering ved 13.000 g i 2 minutter. Supernatanten blev anbragt i SDS-prøvepuffer til elektroforese.
10
Western plet-analyse blev gennemført under anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Towbin et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4350, (1979)). Proteiner blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) i overens-15 stemmelse med metoden ifølge Laemmli (Nature, 277, 680, (1970)) under anvendelse af en 4,5% stabelgel og en 8-12% gradientgel. Gelerne blev vasket to gange med 200 ml Towbin's puffer i 30 minutter pr. vask. Proteinerne, der blev adskilt på SDS-PAGE, blev som pletter afsat på et 0,22 pm nitrocellulosefilter ved 20 en feltstyrke på 8 volt pr cm i 14-16 timer ved 4°C. Uomsatte bindingssteder på nitrocellulosen blev blokeret ved behandling af filteret med 5% BSA i PBS, der indeholder 0,05% Tween 20. Pletten blev derpå vasket 4 gange med 100 ml PBS, der indeholder 0,05% Tween, 20 minutter pr. vask. Filteret blev omsat med 25 en blanding af 5 monoklone antistoffer (2E6,4, 2F1,1, 4D9,1, 4D11,6 og 5G5,3) i 90 minutter. Blandingen af monoklone antistoffer blev fremstillet ved at fortynde ascitesvæsker for hvert antistof 1:100.000 med PBS, der indeholder 0,05% Tween 20 og 20% føtal kalveserum (fortynding af samlet mængde 30 ascitesvæske, 1:20.000). Pletterne blev vasket 4 gange som før og derpå behandlet med l25i-mærket fåreantiserum, fremstillet mod helt museantistof. Antiserummet, der var behandlet med radioaktivt jod, blev fortyndet til 2 x 105 CPM/ml med PBS, der indeholder 0,05% Tween 20 og 20% føtal kalveserum. Filtrene 35 blev derpå vasket 4 gange som før og tørret. Autoradiografi blev gennemført under anvendelse af Kodak XAR-2 film ved -80°C.
27
Ulv I OO IDO D
Proteinerne på nitrocellulosepapiret blev identificeret ved hjælp af monoklone anti-sporozoit-antistoffer. De monoklone anti-sporozoit-antistoffer mod proteinpletterne af XmPfl, 3, 5, 8, 11 og 13, bandt til to dubletter af Mr 60.000/57.000 5 og 53.000/51.000 (ikke vist) selv om intensiteten for XmPfl3 blev reduceret kraftigt. Der optrådte ingen binding til Xgtll-vektoren uden et indsat stykke. Monoklone antistoffer, bandt til proteiner fra sporozoiter ved Mr 60.000, 53.000 og 51.000. Alle sporozoitgenerne for CS-proteinet i Xgtll dannede således 10 et protein af lignende mobilitet som det ubehandlede CS-prote-in, der blev syntetiseret ved hjælp af sporozoiten selv (Mr 60.000).
Ved induktion med IPTG blev der konstateret en udpræget for-15 øgelse i ekspression af Ø-galactosidase Mr på 116.000 for Xgtll, og et fusionsprotein ved Mr 131.000 med ø-galactosidase blev konstateret for XmPf9 (data ikke vist). Klonerne med CS-proteingenet gav kun svage Ø-galactosidasebånd ved indføring. Der sås ingen fusionsproteiner (data ikke vist). Desuden bandt 20 anti-Ø-galactosidase ikke til Mr 60.000 CA-proteinet, hvilket antyder, at dette protein ikke indeholder Ø-galactosidasefragmenter (data ikke vist).
Xgtll-vektoren er konstrueret til at udtrykke indsatte stykker 25 som Ø-galactosidasefusionsproteiner ved induktion med IPTG. Det var således uventet, at ingen af klonerne, der udtrykker CS-proteinet, viste sig at være fusionsproteiner. Dette er forklaret for XmPfl, 5, 8 og 15 på grund af, at de indsatte stykker er således orienterede, at deres transcriptionsretning 30 er modsat Ø-galactosidases. Restriktionskortlægning af phag-DNA'et under anvendelse af Stul, Kpnl og Stul + Kpnl viser at det asymmetriske Stul-sted i det indsatte stykke (fig. 1) i hvert tilfælde er anbragt ~1,1 kb fra KpnI-stedet i Xgtll ved 18,58 kb fra den venstre ende. Det vides ikke, hvorvidt P.
35 falciparum DNA 5' til den kodende sekvens i kloner XmPfl og 15 indeholder sekvenser, der kan anvendes som promotorer af E. coli RNA-polymerasen, men der eksisterer ingen indlysende
DK 166155 B
28 bindingssteder for bakterielle ribosomer (fig. 2). Kloner AmPf5 og 8 begynder kun 11 bp før genet. Det er således sandsynligt, at ekspression af CS-proteinet i disse kloner er fra en sen lambdapromotor. Et lignende fænomen blev observeret i 5 Agtll-systemet med et indsat stykke gær-DNA. T. Goro og J.C. Wang, Cell, 36, 1073 (1984).
Restriktionskortlægning viser, at det indsatte stykke i AmPfl3 er orienteret korrekt med β-galactosidasegenet. Det er imid-10 lertid 1 base ud af ramme til dannelse af et fusionsprotein med β-galactosidase (fig. 2). De lave mængder cs-protein, der dannes ved hjælp af denne klon, hvilket påvises ved Western-pletning, og dets manglende evne til at give signifikante data i ELISA (tabel 1) kan forstås, når henses til denne konstruk-16 tion. Skråsnittet (eng.: bias) blandt klonerne for enten om vendt orientering eller indsatte stykker uden for rammen antyder, at der er selektion mod de forventede fusionsproteiner (f.eks. AmPf5 og 8 i den korrekte orientering), måske på grund af en toksisk virkning af CS-proteinet på E. coli.
20
Struktur af P. falciparumqenet for circumsporozoitproteinet.
Nucleotidsekvensen af 2,3 kb DNA-fragmentet, der er klonet i /SmPfl, som indeholder genet, der koder for CS-proteinet af P.
25 falciparum, er angivet i fig. 2. Den påviste aminosyresekvens for proteinet er vist nedenfor nucleotidsekvensen. Et restriktionskort over AmPfl^-klonen og sekventeringsstrategien er beskrevet i fig. 1. Denne sekvens indeholder en stor åben læseramme, som begynder med en ATG-initeringscodon i stilling 78 og 30 slutter med en TAG-codon i stilling 1316. Multiple terminator-codoner blev set i de andre 5 læserammer. Den åbne læseramme, der er vist i fig. 1, kan kode for et polypeptid af 412 aminosyrer med en omtrentlig molekylmasse på 44.000 daltons. Som observeret for CS-proteinet af P. knowlesi afviger molekyl-35 vægten for CS-proteinet af P.falciparum ved SDS-PAGE ( 60.000) fra den beregnede molekylvægt (44.000).
DK 166155 B
29
Et vigtigt strukturelt træk ved dette protein er nærværelsen af 41 tandem-gentagelser af tetrapeptider. Den primære gentagelsesenhed er Asn-Ala-Asn-Pro, som optræder 37 gange. En anden form er Asn-Val-Asp-Pro, som optræder ved enhederne 2, 4, 5 6 og 22. Ændringen fra Ala-Asn til Val-Asp skyldes punktmuta tioner, hvor C er erstattet med T i den anden stilling af ala-nincodonen, og hvor A er erstattet med G i den første stilling af aspargincodonen.
10 Nucleinsyresekvensen, der koder for gentagelserne, er ikke så velkonserverede som aminosyresekvensen. Den gentagne region, som har 41 enheder, er sammensat af 11 forskellige nucleotid-sekvenskombinationer. 18 af enhederne er én type (AATGCAAACCCA).
7 af gentagelserne afviger kun fra denne sekvens i én stil-15 ling, 12 afviger i to stillinger, to afviger i tre stillinger, 1 afviger i fire stillinger, og 1 afviger i fem stillinger. Ændringen i sekvensen kan stabilisere gentagelsen i det genome DNA fra at blive elimineret eller ommøbleret igen ved rekombination.
20
Ved proteinets aminoterminalende udgør en strækning på 16 aminosyrer en mulig signalsekvens (f i g. 2). Mellem denne signalsekvens og den gentagende region optræder en kraftigt ladet region, som er karakteriseret ved nærværelsen af både basiske 25 og sure aminosyrer. 27 af 53 aminosyrer fra aminosyre 66 til aminosyre 118 er således ladede aminosyrer.
Efter gentagelsesregionen indeholder to andre segmenter af proteinet en stor mængde ladede aminosyrer. Disse regioner 30 findes mellem aminosyre 324 og 339 og mellem aminosyre 360 og 388. De indeholder henholdsvis 50% og 48% ladede aminosyrer.
Ved carboxylterminalenden har proteinet en sekvens på 21 hydrofobe aminosyrer, som repræsenterer en ankersekvens for et integralt membranprotein.
35
DK 166155B
30
Immunoreaktivitet af syntetiske peptider med antistoffer til gentage1sessekvensen.
For afgørende at bevise at den beslægtede nucleotidenhed af P.
5 falciparum sporozoitgenet var korrekt, blev der syntetiseret peptider. Peptiderne blev fremstillet ved hjælp af peptidsyn-tese-fastfasemetoden (R.B. Merrifield og A. Marglin (1970)) Annu. Rey. Biochem., 39, 841-866) under anvendelse af et Beckman 990 peptidsyntetiseringsapparat. Oe syntetiske peptider 10 blev kløvet fra den faste bærer med flydende HF (J.P. Tam, W.F. Heath og R. B. Merrifield, J. Am.Chem.Soc., 105, 6442 (1983)). De kløvede peptider blev afsaltet ved gelfiltrering på Bio Gel P-2 eller P-4. De isolerede peptiders renhed blev godtgjort ved omvendt fase HPLC, aminosyreanalyse og for 15 15 restpeptidet, aminosyresekvensanalyse.
Disse peptider blev så anvendt i en modificeret version af ELISA-prøven, der er beskrevet ovenfor, til bestemmelse af, hvorvidt de ville inhibere binding af det monoklone antistof 20 2F1,1 til XmPfl. Syntesepeptiderne blev afprøvet på følgende måde. 50 μΐ prøver af XmPf1-lysatet (14) fortyndet 1/100 med 0,01M phosphat i 0,15M NaCl, pH 7,4 (PBS), blev pipetteret i brønde i en polyvinylchloridmikrotitreringsplade (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) og holdt natten over ved 25 stuetemperatur. . Ca. 18 timer senere· blev brøndene vasket 4 gange med PBS-0,05% Tween-20 (PBS-TW), fyldt med 1,0% bovinse-rumalbumin (BSA) i PBS-TW og holdt i 1 time ved stuetemperatur. Lageropløsninger af syntetiske peptider, opløst i destilleret vand (5 x 10-2M), blev fortyndet 1/10 med 1% BSA i 30 PBS og 100 μΐ prøver, blandet med 30 μΐ monoklont antistof 2F1,1 konjugeret til radiseperoxidase i 1,5 ml mikrocentri-fugerør og holdt i 1 time ved stuetemperatur. Brønde fra mi-krotitreringspladen blev tømt og 30 μΐ af blandingen af peptid og monoklont antistof blev anbragt i hver brønd og holdt i 1 35 time ved stuetemperatur. Brøndene blev vasket igen som beskrevet ovenfor og 150 μΐ substrat tilsat som tidligere beskrevet (P.K. Nakane og A. Kawzaoi, J. Hist. Cytochera., 11, 1084, (1974)).
DK 166155B
31
Resultaterne, der er vist i fig. 3 viser, at 7, 11 og 15 rest-peptiderne signifikant inhiberer binding af 2F1,1 til XmPfl. Inhibering af binding var helt klar ved 5 x 10“7μ med 15 rest-peptidet. 7 rest-peptidet inhibrede også binding af mono-5 klont antistof 2F1,1 til sporozoitantigenet, der anvendes i stedet for λπιΡΙ,Ι (data ikke vist). Desuden inhiberede det syntetiske peptid binding af de andre fire monoklone antistoffer til AmPfl. Disse data indicerer, at sekvensen af gentagelsesenheden er korrekt. Den forøgede inhibering af bindingen, der 10 ses med 11 og 15 rest-peptiderne, kan afspejle sekundære konformationsændringer. Dataene antyder ikke, at de indeholder to epitoper, da ingen kunne påvises i en dobbeltsidet prøve med 2F1,1 (data ikke vist).
15 Homoloqiregioner mellem CS-proteiner af P. falciparum og P, knowlesi.
CS-proteinet af P. falciparum og CS-proteinet af abemalaria, P. knowlesi, har en lignende samlet struktur, men har kun to 20 korte horaologiregioner. Begge proteiner viser sig at indeholde de samme hovedtræk ved at de har en gentagelsesregion midt i proteinet, flere regioner med en høj tæthed af ladede aminosyrer, en signal sekvens ved aminoterminalenden, og en hydrofob ankersekvens ved carboxylterminalenden. EDB-analyser for ami-25 nosyresekvenshomologien (25, K tuplestørrelse på 1. vinduestørrelse på 20, gap penalty på 1) viste begrænset sekvenshomologi over størstedelen af proteinet. Den gennemsnitlige homologi mellem de to proteiner i segmentet før gentagelsen er 37%; 37 af mulige 102 aminosyrer passer sammen. Gentagelserne deler 30 16% homologi, da én Pro og ét Ala står overfor hinanden ved hver 12 aminosyrer. Den gennemsnitlige homologi mellem segmenterne af de to proteiner efter gentagelserne er 42%; 50 af mulige 119 aminosyrer passer sammen. Da den sekundære og tertiære struktur af disse proteiner er ukendt, kan de have 35 strukturelle og funktionelle ligheder til trods for forskellen i primærsekvens. Gentagelser i CS-proteiner er f.eks. immuno-dominerende efter vaccination med sporozoiter.
DK 166155B
32
De to områder eller regioner med størst sekvenshomologi sås på hver side af gentagelsesregionerne. Når de to peptider er bragt på linie ses en homologi region, hvor tre proliner er bragt på linie og fem sammenhængende aminosyrer (Lys-Leu-Lys-Gln-Pro) 5 viser sig at passe perfekt sammen (region I, fig. 2 og 4).
Den anden homologiregion (region II, fig. 2 og 4) indeholder 13 aminosyrer, af hvilke 12 er konserveret. Den eneste aminosyre, som ikke var identisk, var erstatningen af serin med th-10 reonin ved den fjerdre rest i P. knowlesi-sekvensen. Denne region indeholder to cysteinrester, som blev inddraget tidligere af Ozaki et al., L.S.Ozaki, P. Svec, R.S. Nussenzweig et al., Cell 34, 815 (1983) ved dannelsen af en intramolekylær løkke.
15 Nucleinsyresekvensen, der indkoder CS-proteinet af P. falciparum har også begrænset homologi med P. knowlesi-genet undtaget i region II. I delen af genet, der indkoder region II af proteinet, findes en 27 basesekvens, som kun afviger fra den sammenlignelige sekvens i P. knowlesi, i to positioner. Denne 20 konserverede sekvens kan være nyttig som en sonde til klone gelerne, der indkoder CS-proteinerne af de andre plasmodi umarter.
Disse to aminosyresekvenshomologiregioner mellem P. falciparum 25 og P. knowlesi indicerer sekvenskonservering for organismer som afviger meget med hensyn til evolution. Det antoges oprindeligt, at primat-malariaerne havde udviklet sig parallelt med evolutionen af primater. For nylig er det imidlertid blevet påvist, at DNA'et af P. falciparum ligner DNA’et af fugle- og 30 gnaver-malaria, og at disse havde en anden DNA-struktur end primat malarierne (P. knowlesi, P. fragile, P. vivax og P. cynomolgi); P. falciparum, P. lophurae og P. berghei havde et lavere G+C-indhold end primat malariaerne inklusive P. knowlesi. Gensonderne, som hybridiserede til P. falciparum, P. lop-35 hurae, og P. berghei-DNA'er hybridiserede ikke til primat malariaerne og sonder, som hybridiserede til primat malarierne, hybridiserede ikke til P. falciparum, P. lophurae og P. berg-
DK 166155 B
33 hei. Denne homologiregion mellem P. falciparum og P. knowlesi kan,konserveres til en vigtig proteinfunktion, såsom modtagelse for celleinvasion. Det skal bemærkes, at både P. falciparum- og P. knowlesi-sporozoiter kan inficere leveren hos men-5 nesker.
Til trods for mulige problemer med fælles epitoper blandt proteiner, er der væsentlige beviser på, at sporozoitgenet er blevet klonet. Ligheden mellem dette protein af P. falciparum 10 og CS-proteinet af P. knowlesi er for det første slående. Begge har samme størrelse med begrenede molekylvægte på 44.426 og 36.792 for henholdsvis P. falciparum og P. knowlesi. Begge har analoge regioner, som omfatter en signalsekvens, ladet region, en regi on med gentagelsespeptider i midten af proteinet og en 15 ankersekvens. Der er for det andet to regioner med aminosyre-homologi mellem de to proteiner (fig. 4). Fem monoklone antistoffer, der vides at reagere med overfladen af P. falciparum sporozoiter (11) genkendte for det tredje det i bakterien syntetiserede protein. Det krydsreaktive protein fra klon XmPf9 20 reagerede kun med et af disse monoklone antistoffer. Proteinet, der blev syntetiseret i bakterien, var for det fjerde af lignende størrelse i SDS-PAGE, som proteinet fra P. falciparum sporozoiter. Syntetiske peptider fra denne gentagelse blokerede for det femte binding af et monoklont antistof til spo-25 rozoitproteinet i en ELISA.
Genet indkoder et protein med 412 aminosyrer, som består af en signalsekvens, en ladet region, en central region med 41 af fire aminosyrer baserende enheder (eng.: fourth amino acid 30 units) (gentagelser) to andre ladede regioner, en sandsynlig cysteinløkke og en ankersekvens. 37 af gentagelserne i den centrale region er identiske (Asn-Ala-Asn-Pro); fire har en anden sekvens (Asn-Val-Asp-Pro).
35 Et analogt sæt af CS-proteiner findes på sporozoiter af alle Plasmodium-arter, der er studeret indtil dato. Monoklone antistoffer til CS-proteiner giver beskyttelse in vivo eller neu-
Claims (8)
- 2. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sekvensen er Thr-Glu-Trp-Z-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-Asn-Gly.
- 3. Peptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at Z er Ser.
- 4. Malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, kendetegnet ved, at det omfatter et peptid ifølge krav 1 10 bundet til en immunogen bærer.
- 5. Anvendelse af et peptid ifølge krav 1 til fremstilling af et middel til at fremkalde immunisering mod malaria.
- 6. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at peptidet er bundet til en immunogen bærer.
- 7. En i alt væsentligt ren DNA-sekvens, der koder for peptidet ifølge krav 1. 20
- 8. Rekombinant DNA-kloningsbærer, kendetegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 7.
- 9. E. coli organisme, der indeholder DNA-sekvensen ifølge krav 25 8, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen er blevet kunstigt indført i organismen, og at organismen er i stand til at udtrykke et immunologisk aktivt peptid, der er i stand til hos et menneske at fremkalde en immunreaktion, som er krydsreaktiv med og beskyttende mod en malariaparasit. 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/624,564 US4707357A (en) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| US62456484 | 1984-06-26 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK191991D0 DK191991D0 (da) | 1991-11-26 |
| DK191991A DK191991A (da) | 1991-11-26 |
| DK166155B true DK166155B (da) | 1993-03-15 |
| DK166155C DK166155C (da) | 1993-08-09 |
Family
ID=24502471
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK289185A DK166284C (da) | 1984-06-26 | 1985-06-26 | Immunologisk aktivt peptid, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, der indeholder peptidet, anvendelse af peptidet til fremstilling af et saadant middel, en dna-sekvens, der koder for peptidet, en rekombinant dna-kloningsbaerer, der omfatter dna-sekvensen samt e. coli, der indeholder kloningsbaereren |
| DK191991A DK166155C (da) | 1984-06-26 | 1991-11-26 | Immunologisk aktive peptider, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel indeholdende disse, anvendelse deraf til fremstilling af et malariaimmuniserende middel, en dna-sekvens, der koder for peptiderne, en dna-kloningsbaerer der omfatter dna-sekvensen samt en e. coli-organisme, der indeholder dna-sekvensen |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK289185A DK166284C (da) | 1984-06-26 | 1985-06-26 | Immunologisk aktivt peptid, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, der indeholder peptidet, anvendelse af peptidet til fremstilling af et saadant middel, en dna-sekvens, der koder for peptidet, en rekombinant dna-kloningsbaerer, der omfatter dna-sekvensen samt e. coli, der indeholder kloningsbaereren |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4707357A (da) |
| EP (1) | EP0166410B1 (da) |
| JP (4) | JP2561238B2 (da) |
| AU (1) | AU596561B2 (da) |
| CA (1) | CA1340431C (da) |
| DE (1) | DE3586853T2 (da) |
| DK (2) | DK166284C (da) |
| HK (1) | HK1001823A1 (da) |
| ZA (1) | ZA854697B (da) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2566780B1 (fr) * | 1984-07-02 | 1987-02-06 | Pasteur Institut | Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un epitope caracteristique d'une proteine produite par des cellules infectees par les parasites du paludisme et compositions les contenant |
| ZA855232B (en) * | 1984-07-23 | 1986-02-26 | Univ New York | Protective peptide antigen corresponding to plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| CN86100979A (zh) * | 1985-02-07 | 1986-12-17 | 史密丝克莱恩贝克曼公司 | 疟疾疫苗的制备方法 |
| DE3686178T2 (de) * | 1985-02-07 | 1993-03-11 | Smithkline Beckman Corp | Malaria-impfstoff. |
| ES8800273A1 (es) * | 1985-03-28 | 1987-11-01 | Univ New York | Perfeccionamientos en la fabricacion de conjugados de proteinas portadores de antigenos inmunogenicos para vacunas contra la malaria |
| EP0217877A4 (en) * | 1985-04-11 | 1988-03-30 | Inst Medical W & E Hall | VERY REPEATABLE ANTIGENS FROM PLASMODIUM FALCIPARUM. |
| US4957869A (en) * | 1985-07-12 | 1990-09-18 | New York University | Immunogenic peptide corresponding to P. vivax CS protein |
| EP0229829B1 (en) * | 1985-07-12 | 1995-02-22 | New York University | Immunogenic peptide antigen corresponding to plasmodium vivax circumsporozoite protein |
| IT1187710B (it) * | 1985-07-25 | 1987-12-23 | Eniricerche Spa | Composizione peptidica utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di kit diagnostici per la determinazione di affezioni malariche |
| EP0254862A1 (en) * | 1986-06-26 | 1988-02-03 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Vaccines against protozoan parasites |
| US5019384A (en) * | 1986-06-30 | 1991-05-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunonodulating compositions and their use |
| US5225530A (en) * | 1986-07-16 | 1993-07-06 | Eniricerche S.P.A. | Polypeptide useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of malarial affections |
| IT1196501B (it) * | 1986-07-16 | 1988-11-16 | Eniricerche Spa | Polipeptide utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di kits diagnostici per la determinazione di affezioni malariche |
| IT1198225B (it) * | 1986-12-04 | 1988-12-21 | Eniricerche Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoita |
| IT1198233B (it) * | 1986-12-23 | 1988-12-21 | Eniricerche Spa | Metodo per la determinazione di anticorpi antisporozoita di p. falciparum nel sangue umano |
| US4957738A (en) * | 1987-01-14 | 1990-09-18 | Patarroyo Manuel E | Protein copolymer malaria vaccine |
| CA1329124C (en) * | 1987-02-02 | 1994-05-03 | Jerald C. Sadoff | Conjugate malaria vaccine |
| FR2610631B1 (fr) * | 1987-02-09 | 1989-11-24 | Pasteur Institut | Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un ou plusieurs, epitope caracteristique d'une proteine produite par p. falciparum dans les hepatocytes, et leurs utilisations, notamment pour le diagnostic du paludisme ou dans des compositions de vaccins contre le paludisme |
| IL85905A0 (en) * | 1987-03-30 | 1988-09-30 | Univ New York | Immunogenic recombinant yeast expression product and method for purifying it |
| US5229490A (en) * | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
| ATE118822T1 (de) * | 1987-06-26 | 1995-03-15 | Syntro Corp | Rekombinanter, fremde gene enthaltender menschlicher cytomegalovirus und seine verwendung. |
| US5273876A (en) * | 1987-06-26 | 1993-12-28 | Syntro Corporation | Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene |
| IT1223301B (it) * | 1987-09-11 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Polipeptidi sequenziali immunologicamente attivi |
| AT388934B (de) * | 1987-11-13 | 1989-09-25 | Wellcome Found | Rekombinationskonjugatprotein und neue vakzinen |
| IT1233419B (it) * | 1987-12-11 | 1992-03-31 | Eniricerche Spa | Peptidi sintetici immunologicamente attivi utili per la preparazione di un vaccino antimalaria |
| EP0418310B1 (en) * | 1988-05-02 | 1996-06-19 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Gene for encoding a human malaria vaccine antigen |
| US5028425A (en) * | 1988-07-07 | 1991-07-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Synthetic vaccine against P. falciparum malaria |
| GB8819209D0 (en) * | 1988-08-12 | 1988-09-14 | Research Corp Ltd | Polypeptide & dna encoding same |
| US5231168A (en) * | 1988-09-16 | 1993-07-27 | Statens Seruminstitut | Malaria antigen |
| KR910700352A (ko) * | 1988-12-21 | 1991-03-14 | 스미스클라인 바이올로지칼즈(s.a.) | 곤충 세포내에서 플라스모듐 서컴스포로 조이트 단백질의 발현 |
| ES2055785T3 (es) * | 1989-01-17 | 1994-09-01 | Eniricerche Spa | Peptidos sinteticos y su uso como vehiculos universales para la preparacion de conjugados inmunogenos aptos para el desarrollo de vacunas sinteticas. |
| NZ233255A (en) * | 1989-04-11 | 1993-02-25 | Chiron Corp | Plasmodium cs protein analogues lacking one or more of the repeat epitopes, and containing at least one nonrepeat flanking epitope |
| AU5649290A (en) * | 1989-04-12 | 1990-11-05 | New York University | Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine |
| CA2015722A1 (en) * | 1989-05-03 | 1990-11-03 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| IT1237764B (it) * | 1989-11-10 | 1993-06-17 | Eniricerche Spa | Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici. |
| AU7163091A (en) * | 1989-12-12 | 1991-07-18 | Biomedical Research Institute | Novel malarial sporozoite peptide antigens |
| US5695957A (en) * | 1990-02-05 | 1997-12-09 | Imperial Exploitation Limited | Polypeptides and DNA encoding same, associated with human malaria parasites |
| CA2076035A1 (en) * | 1990-02-22 | 1991-08-23 | Andrew P. Waters | Antigenic proteins of plasmodium |
| GB9015888D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Smithkline Biolog | Vectors |
| US5095093A (en) * | 1990-11-06 | 1992-03-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Protective four amino acid epitope against Plasmodium vivax malaria |
| US6566121B1 (en) | 1991-06-13 | 2003-05-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
| US5786214A (en) * | 1994-12-15 | 1998-07-28 | Spinal Cord Society | pH-sensitive immunoliposomes and method of gene delivery to the mammalian central nervous system |
| NO986133D0 (no) * | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Preben Lexow | FremgangsmÕte for DNA-sekvensering |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3033776A1 (de) * | 1980-09-09 | 1982-04-22 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur vermehrung von protozoen |
| US4554101A (en) * | 1981-01-09 | 1985-11-19 | New York Blood Center, Inc. | Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity |
| US4466917A (en) * | 1981-02-12 | 1984-08-21 | New York University | Malaria vaccine |
| GB2145092B (en) * | 1983-01-28 | 1988-04-07 | Univ New York | Protective peptide antigen |
| US4767622A (en) * | 1983-08-19 | 1988-08-30 | University Of Illinois | Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection |
| ZA855232B (en) * | 1984-07-23 | 1986-02-26 | Univ New York | Protective peptide antigen corresponding to plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| EP0175261B1 (en) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| DE3686178T2 (de) * | 1985-02-07 | 1993-03-11 | Smithkline Beckman Corp | Malaria-impfstoff. |
-
1984
- 1984-06-26 US US06/624,564 patent/US4707357A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-06-21 ZA ZA854697A patent/ZA854697B/xx unknown
- 1985-06-24 AU AU43990/85A patent/AU596561B2/en not_active Expired
- 1985-06-24 DE DE85107794T patent/DE3586853T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-24 EP EP85107794A patent/EP0166410B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 CA CA000485166A patent/CA1340431C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-26 JP JP60140108A patent/JP2561238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-26 DK DK289185A patent/DK166284C/da not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-11-26 DK DK191991A patent/DK166155C/da not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-09-30 JP JP5268294A patent/JPH07110876B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-28 JP JP7040692A patent/JP2537028B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-28 JP JP7040679A patent/JP2537027B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-25 HK HK97102238A patent/HK1001823A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2561238B2 (ja) | 1996-12-04 |
| AU4399085A (en) | 1986-01-02 |
| JP2537027B2 (ja) | 1996-09-25 |
| EP0166410A2 (en) | 1986-01-02 |
| EP0166410B1 (en) | 1992-11-25 |
| HK1001823A1 (en) | 1998-07-10 |
| DK166284B (da) | 1993-03-29 |
| JPH06225768A (ja) | 1994-08-16 |
| ZA854697B (en) | 1986-02-26 |
| DE3586853T2 (de) | 1993-10-07 |
| JPS61149093A (ja) | 1986-07-07 |
| CA1340431C (en) | 1999-03-16 |
| US4707357A (en) | 1987-11-17 |
| JPH07110876B2 (ja) | 1995-11-29 |
| DK166284C (da) | 1993-08-23 |
| DK191991D0 (da) | 1991-11-26 |
| JPH07265087A (ja) | 1995-10-17 |
| JPH07265086A (ja) | 1995-10-17 |
| DK289185A (da) | 1985-12-27 |
| JP2537028B2 (ja) | 1996-09-25 |
| DK191991A (da) | 1991-11-26 |
| DK289185D0 (da) | 1985-06-26 |
| EP0166410A3 (en) | 1987-11-25 |
| AU596561B2 (en) | 1990-05-10 |
| DE3586853D1 (de) | 1993-01-07 |
| DK166155C (da) | 1993-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK166155B (da) | Immunologisk aktive peptider, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel indeholdende disse, anvendelse deraf til fremstilling af et malariaimmuniserende middel, en dna-sekvens, der koder for peptiderne, en dna-kloningsbaerer der omfatter dna-sekvensen samt en e. coli-organisme, der indeholder dna-sekvensen | |
| AU653387B2 (en) | Antigen-presenting chimaeric protein | |
| Crane et al. | Cross-protection against four species of chicken coccidia with a single recombinant antigen | |
| US6017538A (en) | Plasmodium falciparum antigens inducing protective antibodies | |
| US5231168A (en) | Malaria antigen | |
| US5602033A (en) | Coccidiosis vaccine | |
| US5677438A (en) | Coccidiosis vaccine | |
| JP3450018B2 (ja) | コクシジウム症ワクチン | |
| US4693994A (en) | Protective synthetic peptide against malaria and encoding gene | |
| AU626366B2 (en) | Eimeria tenella vaccine | |
| Búa et al. | Trypanosoma cruzi: cellular and antibody response against the parasite in mice immunized with a 19-amino acid synthetic peptide | |
| JPS62502933A (ja) | 分子量１３０，０００ダルトンと１５５，０００ダルトンを持つプラスモディウム・ファルシパルムのグリコホリン結合蛋白に対するｃＤＮＡのコ−ド付け | |
| FI99144C (fi) | Menetelmä Plasmodium falciparum -proteiinien valmistamiseksi geeniteknisesti ja siinä käyttökelpoisia tuotteita | |
| PT97117A (pt) | Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem | |
| JP2004520277A (ja) | 胞子虫網（ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ）寄生虫からの細胞侵入因子に基づくワクチン | |
| Hansen et al. | Isolation of a gene segment expressed by mature schizonts of Plasmodium knowlesi | |
| WO1990002811A1 (en) | A malaria antigen | |
| PT100757A (pt) | Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |