JP2561238B2 - 免疫的活性ペプチドおよび抗マラリア免疫原性刺激剤 - Google Patents

免疫的活性ペプチドおよび抗マラリア免疫原性刺激剤

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JP2561238B2 JP60140108A JP14010885A JP2561238B2 JP 2561238 B2 JP2561238 B2 JP 2561238B2 JP 60140108 A JP60140108 A JP 60140108A JP 14010885 A JP14010885 A JP 14010885A JP 2561238 B2 JP2561238 B2 JP 2561238B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ヒトおよび他の動物に免疫応答を誘導
し、その結果マラリア病原虫による感染を防ぐ免疫的に
活性のある試薬に関し、特にはヒトのマラリア病原虫P.
ファルシパルムに対してヒトを守ることに関する。
［従来技術とその問題点］ 最近の全世界的なマラリアの伝播を防ぐためにワクチ
ンが必要なことは明らかである。マラリアに対する免疫
は段階的な特徴があるため、ワクチンはマラリアの生活
環の各段階に対して開発されなければならない。すなわ
ち生活環の各段階とは、スポロゾイト（ヒトに感染を引
き起こす蚊の段階）、赤血球に侵入した無性生殖の病原
虫（病気を引起こす段階）、および生殖体（蚊に感染性
を媒介する段階）である。興味の対象の１つはスポロゾ
イトに対するワクチンである。それは効果があれば、免
疫系を刺激して蚊によって媒介されたスポロゾイトを殺
し、他人に感染して病気の原因となる次の段階を食止め
ることができよう。
以前は動物やヒトは、放射線照射したスポロゾイトを
注射することで病気から守られてきた。しかしながら、
放射線照射したスポロゾイトでワクチンを接種すること
は、その供給が限られておりスポロゾイトが不安定であ
るため、実際に向いていない。モノクローナル抗体の使
用がきっかけとなって、齧歯類のマラリアであるプラス
モディウム・ベルグヘイ（Plasmodium berghei）のスポ
ロゾイト上の主要表面タンパクが発見された［N.ヨシ
ダ,R.S.ヌッセンツワイク,P.ポトクニャーク等，サイエ
ンス（Science），207,71（1980）］。このタンパクは
スポロゾイトの表面を覆っていて、周囲スポロゾイト
（CS）タンパクと称されている。P.ベルグヘイのCSタン
パクに対するモノクローナル抗体を投与すれば、感染力
をもった蚊の伝播からマウスを完全に保護することがで
きる［R.S.ヌッセンツワイク,P.ポトクニャーク,V.ヌッ
センツワイク，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル
・メディスン（J.Exp.Med.），151,1504（1980）］。ヒ
トの主なマラリアであるP.ファルシパルム（Plasmodium
falciparum）を含めてサルおよびヒトのマラリア種に
関する同様のCSタンパクが同定されてきた［F.サント
ロ，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem），258,3341（1983）;E.H.ナルディン
等，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディス
ン（J.Exp.Med.），156,20（1982）］。しかしながら、
この発明以前にP.ファルシパルムのタンパクの構造は知
られていなかった。サルのマラリアであるP.クリーブ
（Kleave）のCSタンパクに対する遺伝子は最初にクロー
ニングされた。というのは、cDNAライブラリーを調製す
る際に感染力をもった蚊のP.クリーブを大量に利用でき
たからである［L.S.オザキ,R.W.クワッツ等，ネイチャ
ー（Nature），302,536（1983）;G.N.ゴードソン,J.エ
リス,P.スビー等，ネイチャー（Nature），305,29（198
3）］。この遺伝子は、感染防御のモノクローナル抗体
に結合しているエピトープを含む、アミノ酸の反復配列
をもったタンパク（12分子のアミノ酸が12回反復する）
をコードしていた。モノクローナル抗体は、免疫放射線
検定においてポリクローナル抗スポロゾイト血清がトリ
トンＸ−100で可溶化したタンパクに接近するのを遮断
したので、この繰返し構造のエピトープはそのタンパク
上の主要な免疫原であった［F.ツアバラ,A.H.コクレー
ン,E.H.ナルディン等，ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディスン（J.Exp.Med.），157,1947（198
3）］。しかしながら、以前サルの病原虫からこの繰返
し構造のエピトープに対して調製された抗体はヒトの病
原虫とは反応しないので、ヒトマラリア病原虫のCSタン
パクに関連した抗原物質が必要とされている。
［問題点を解決する手段］ 従って、この発明の目的は、ヒトに対して防御免疫応
答を誘導し得る、ヒトマラリア抗原に類似のペプチド配
列を提供することである。この発明のもう１つの目的
は、そのような特性を有する抗原物質を発現し得るDNA
配列を提供することである。
これらの目的は添って以下の物質を提供することによ
り達成される。すなわち、単独でまたは担体分子と結合
されたときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原
虫と交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗
性を示す実質的に精製された免疫的に活性な合成ペプチ
ドであって、該ペプチドがAsn−Ｘ−Ｔ−Pro（ここで、
ＸはAraまたはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされ
るアミノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を
含むことを特徴とする免疫的活性ペプチドである。同様
の防御は、そのペプチドが以下の配列式を含む場合も達
成し得る。すなわち、アミノ酸配列式Thr−Glu−Trp−
Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Gly
（ここで、ＺはSerまたはThr）、またはアミノ酸配列式
Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys−Leu−Lys−Gln−Pro−Ｕ
−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここで、ＳはLysまたはAsn、Ｔは
HisまたはGlu、ＵはGlyまたはAsn、ＶはAspまたはGlu、
およびＷはAsnまたはGlnを示す）である。
また、この発明は生体系でそのようなペプチドの産生
に有用な遺伝物質、例えば目的のペプチドのコードする
DNA配列をも含む。
この発明は、P.ファルシパルムからのCSタンパクの免
疫的活性断片の特性および構造の発見からされたとも
いえる。発明者等は、P.ファルシパルムのCSタンパクに
反応するモノクローナル抗体はタンパク中に見出される
反復単位を標的としていることを確認している。これら
の反復単位（およびプラスモディウム属の数種に見出さ
れる不変領域と見られるCSタンパクの他の領域）が同定
されたので、化学的合成の手法を取ろうと生物学的手法
を取ろうと、ワクチンの基礎となるこれらの免疫的活性
領域を含むペプチドを生産することが可能となる。
従って、この発明は単独でまたは担体分子と結合され
たときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と
交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗性を
示す実質的に精製された免疫的に活性な合成ペプチドを
含む。該ペプチドがAsn−Ｘ−Ｔ−Pro（ここで、ＸはAr
aまたはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされるアミ
ノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を含むこ
とを特徴とする免疫的活性ペプチドである。同様にこの
発明は、該ペプチドがアミノ酸配列式Thr−Glu−Trp−
Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Gly
（ここで、ＺはSerまたはThr）、またはアミノ酸配列式
Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys−Leu−Lys−Gln−Pro−Ｕ
−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここで、ＳはLysまたはAsn、Ｔは
HisまたはGlu、ＵはGlyまたはAsn、ＶはAspまたはGlu、
およびＷはAsnまたはGlnを示す）で示される免疫的に活
性な合成ペプチドを含む。したがって、望ましい免疫学
的特徴を有するペプチドには少なくとも次の３つの変形
例がある。（１）前記反復単位を含むが前記長い配列は
含まないペプチド；（２）前記２つの長い配列（以後し
ばしば、領域Ｉおよび領域IIと称する）を含むペプチ
ド；および（３）前記の反復単位と前記の領域Ｉおよび
領域IIと同定された配列の一方が両方を含むペプチド。
この明細書で用いられる「合成」という用語は、天然
状態のこの発明のペプチドから、以前から知られている
P.ファルシパルムのCSタンパクを特に除去したという意
味である。この発明は、CSタンパクのエピトープの構造
およびこれらのエピトープに対する抗体のマラリアに対
する免疫能の発見によりされたともいえる。ひとたび
エピトープの構造が解明されると、ワクチンとして有効
な合成ペプチドを調製することが可能となった。しか
し、ここでの合成とは、例えば遺伝子工学的にヒトが介
在する生物学的方法による産生をも含む。
この発明のすべてのペプチドに関する１つの重要な特
徴は、それらのペプチドが免疫的活性を示し、単独でま
たは担体分子と結合されたときヒトにマラリア病原虫と
交差反応性の免疫応答を誘導し得るということである。
従って、上に列挙した配列の少なくとも一部が、１つ以
上のこれらの配列を含むペプチドの免疫的に利用可能な
表面に存在することが必要である。これらの特徴を有す
るペプチドを調製できるいくつかの方法がある。
まず初めに、上に述べた配列から実質的に成るペプチ
ドを化学的または生化学的に合成することができる。そ
の様なペプチドは、上に述べた配列中のアミノ酸を少な
くとも10％、好ましくは少なくとも40％、さらに好まし
くは少なくとも60％、もっとも好ましくは少なくとも80
％含むであろう。最も好ましいペプチドは、全体が上に
述べた配列（そのペプチドの１ないし３分子の末端アミ
ノ酸がそのペプチドの一端または両端から欠損している
前記反復配列から成ると考えられるペプチドと一緒に）
から成る。
また、前記アミノ酸配列の配列が最終的なペプチドの
表面に見出されるように調製することも可能である。例
えば、これはペプチド結合により１つ以上の前記配列
を、前もって調製したペプチドの表面に結合させること
により行なうことができる。
しかしながら、１つ以上の前記配列が長い合成ペプチ
ドまたはタンパクのアミノ酸配列の内部に含まれる場合
でさえ、免疫学の専門家であればこのペプチドがこの発
明の範囲に入るかどうか容易に知り得る。CSタンパクを
免疫して得られる抗体と反応するペプチドのみが、この
発明の範囲に入ると考えられる。従って、当該分野の専
門家は、この発明の配列の１つを含むペプチドを容易に
合成することができるし、日常的な試験により最終生成
物がこの発明の範囲にはいるかどうか分る。これは、そ
のタンパクとCSタンパク、好ましくはP.ファルシパルム
のCSタンパクを免疫して得られる抗体、または前記配列
の１つから実質的にまたは全体として成立つペプチドを
免疫して得られる抗体（好ましくは、モノクローナル抗
体）とを反応させることにより測定することができる。
免疫反応が陽性であれば、このタンパクはこの発明の範
囲にはいる。P.ファルシパルムのCSタンパクと反応する
抗体は、一般的に知られており容易に入手し得る。例え
ば、それは寄託されたハイブリドーマ細胞系ATCC HB85
83により産生される。その細胞は、ここで49.2F1.1と同
定された抗体を産生する。
この発明の分子の大きさに関して、上限はない。た
だ、長いペプチド分子を合成し得る技術力が問題であ
る。この発明の分子は、水性溶媒に溶けることも溶けな
いことも有り得る。事実、この発明の１つの好ましい態
様として、高分子量で不溶性のペプチドを合成すること
が挙げられる。そのペプチドは、免疫的防御力を誘導す
るため分解され水溶性懸濁液として投与することができ
る。とはいえ、小さな分子も同様にこの発明を実施する
ために適している。反復単位100、200、400または1000
を含む分子が、この発明を実施するために適している。
しかしながら、50を越える反復単位を含むペプチドを合
成する必要はないようである。というのは、50までの反
復単位を含むペプチドは所望の免疫効果を充分誘導する
であろうし、合成が容易であるからである。20ないし50
の反復単位の分子が特に好ましい。反復単位がペプチド
全体の少なくとも40％、更に好ましくは80％から成る50
までの反復単位を含むペプチドが望ましい。可能な反復
単位の中で、Asn−Ala−Asn−Proが最も望ましいが、As
n−Val−Asp−Proの反復単位が次に望ましい。反復単位
の少なくとも80％がAsn−Ala−Asn−Proで、残りがAsn
−Val−Asp−Proであるペプチドが特に望ましい。
反復単位を含むペプチドに関してペプチド配列が、実
質的に配列Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−（Ａ）15−Ｂ−
（Ａ）ｘ［ここでは、ＡはAsn−Ala−Asn−Pro、ＢはAs
n−Val−Asp−Proを示し、およびｘは０ないし30、好ま
しくは15ないし25、最も好ましくは20である］から成る
１つのペプチドが特に好ましい。
この発明のペプチドが、要求される反復配列（もちろ
ん所望ならばこれらの配列が反復していてもよい）とし
て特に取上げない配列の１つを含むならば、ＺはSer、
ＳはLys、ＴはHis、ＵはGly、ＶはAsp、およびＷはAsn
であるペプチドが望ましい。列挙した２つの長い配列の
うち、アミノ酸配列式Thr−Glu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−S
er−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Gly（すなわち領域II）
を含むペプチドが好ましい。
前記の反復単位と前記の領域Ｉおよび領域IIと同定さ
れた配列の一方か両方を含むペプチドが合成された場
合、このましいペプチドは２ないし50の反復単位を含
む。それらには、領域IIの配列を含むペプチド配列が続
き、領域Ｉの配列を含むペプチド配列が先行する。特に
好ましいペプチドは次の配列式を含む。Lys−Pro−Lys
−His−Lys−Lys−Leu−Lys−Gln−Pro−Gly−Asp−Gly
−Asn−Pro−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val
−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val−Asp−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val−Asp−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val
−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala
−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro
−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Lys
−Asn−Asn−Gln−Gly−Asn−Gly−Gln−Gly−His−Asn
−Met−Pro−Asn−Asp−Pro−Asn−Arg−Asn−Val−Asp
−Glu−Asn−Ala−Asn−Ala−Asn−Asn−Ala−Val−Lys
−Asn−Asn−Asn−Asn−Glu−Glu−Pro−Ser−Asp−Lys
−His−Ile−Glu−Gln−Tyr−Leu−Lys−Lys−Ile−Lys
−Asn−Ser−Ile−Ser−Thr−Glu−Trp−Ser−Pro−Cys
−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Gly。
この発明のペプチドの合成法としては、望ましい構造
を有する１つ以上の４量体を形成することが望ましい。
続いてその４量体を重合し最終生成物を調製する。この
方法により非常に長いペプチドが調製できる。このよう
な化学合成は、長い反復配列が大きな分子の一部として
存在する場合でも同様に望ましい。この反復配列および
より短い配列を独立に合成することができ、続いてそれ
らを結合させて最終生成物を調製する。その様な手法
は、ペプチド合成の専門家に良く知られている。例え
ば、米国特許第4132746号にペプチド４量体の合成法お
よびより大きな分子を形成させるためにその４量体の重
合法が記載されている。そこで記載されている方法を、
その特許に挙げられているアミノ酸の代わりにこの発明
で用いられるアミノ酸を選ぶことにより、この発明に応
用することができる。もちろん、近代的なペプチド合成
装置（その多くは市販されており、それにより大きな完
全ペプチド分子を合成し若しくは大きな断片を合成しそ
れを順次結合させることが極めて容易になった）も出現
している。
この発明の遺伝学的（生物学的）ペプチド合成法を記
載するに先立ち、この発明の好ましい態様を考慮してお
くことが必要であろう。そこでは、この発明のペプチド
の免疫応答を誘導する能力が、この発明の１つ以上のペ
プチドを免疫担体に結合させることにより高められる。
その結果として得られる生成物は、高い免疫能を有して
いるので、ここでは抗マラリア免疫刺激剤と称すること
とする。低分子の免疫能を高めるために、免疫担体を使
用することはよく知られている。担体は基本的に２つの
クラス、すなわち可溶性分子および粒子に分けられる。
可溶性分子の典型例は、タンパクおよび多糖である。粒
子の典型例は、リポソームおよび細菌細胞または膜のよ
うなその一部である。完全な細胞は一般的に殺して、感
染に繋がる問題を防ぐために分裂しないようにしてお
く。
あらゆる場合、免疫応答の増幅は担体の大きさに依存
しているため、担体の実際の構造は重要ではない。タン
パクおよび多糖のような可溶性高分子を担体として用い
る場合10000ないし1000000の範囲の分子量が望ましい。
それが非常に大きいと、タンパクおよび多糖の担体は不
溶性と成り、従って微粒子と考えられる。
ペプチドを担体に結合させる方法は、ペプチドの免疫
的特異性の少なくとも一部が保持される限り、余り問題
ではない。この結果を得るための方法は、次のような手
段によりペプチドを担体に結合させることが好ましい。
担体のカルボキシル基またはアミノ基とペプチドのアミ
ノ基またはカルボキシル基（好ましくはペプチドの遊離
カルボキシル基または末端アミノ基）との間でアミド結
合を形成させる。もう１つの結合方法は、担体のカルボ
キシル基または水酸基とペプチドの水酸基またはカルボ
キシル基（好ましくはペプチドの末端カルボキシル基）
との間でエステル結合を形成させる方法である。必要な
らば、ペプチドと担体とを結合させるために例えばアミ
ンに結合している１ないし10個のメチレン炭素を有する
末端ジアミンを用いてもよい。
担体が用いられる場合、多数のペプチドを担体表面に
結合させることにより免疫的応答を高めることができ
る。例えば、１ないし100000分子のペプチドをタンパク
または多糖に結合し得るが、100ないし10000分子を結合
させると好ましい。担体としてタンパクが用いられる場
合、両性タンパクが望ましい。その様なタンパクは親水
部分および疎水部分を有する。その様なタンパクにおい
て、この発明のペプチドの親水部分に結合させることが
望ましい。それによって、疎水性部分が様々な膜に埋め
込まれると、親水性部分が体液環境にさらされる。
担体として用いて好ましいタンパクの１つは破傷風ト
キソイドであり、これは免疫担体として用いることが以
前から示唆されている物質であるふつうに用いられてい
るワクチンである。
高分子担体の使用について上記に挙げた望ましい態様
は、同様に微粒子担体の使用についても当はまる。但
し、担体当りペプチドの上限は約1015、好ましくは1010
である。細菌細胞（殺されているかまたは他の方法によ
り分裂が妨げられている）が好ましい微粒子として挙げ
られる。
P.ファルシパルムからの天然CSタンパクに極めて類似
しているペプチドが望まれる場合、P.ファルシパルムに
関連した遺伝子またはP.ファルシパルムのCSタンパク遺
伝子由来の遺伝子を使って、生物学的にそのペプチドを
合成することが好ましい。続いて、その結果得られた遺
伝子産物を例えば末端アミノ基の開裂により修飾するこ
とができる。
組換えDNA技術が出現して、クローニング遺伝子の産
物を得るための手法が最近急速に増えた。この発明に使
用するに値するクローニング遺伝子を調製するに適した
方法を記載している最近の米国特許の例として、米国特
許第4419450、4418194、4414150、4399216、4394443、4
356270、4351901、および4327224号が挙げられる。もち
ろん、そこに記載された技術を改良して次のような手法
を用いることができる。所望のペプチド産物を発現し得
るDNA配列を合成する。米国特許第4273875、4304863、4
332901、4403036、4363877および4349629号に記載され
ている適切なクローニングベクターの中にそれらのDNA
を挿入させる。次に、この発明に適した一般的な遺伝子
工学的手法を述べる。
遺伝情報は、二重鎖のデオキシリボ核酸（DNAすなわ
ち遺伝子）上にコードされている。それは、ヌクレオチ
ド成分が繰返しているとしても、DNAコドンが固有の塩
基を指定している順序に従っている。コードされた遺伝
情報が「発現」してポリペプチドを産生する過程は、２
段階から成っている。遺伝子中のある調節遺伝子（「レ
ギュロン」）の指令に従って、RNAポリメラーゼがDNA鎖
に沿って移動し、「転写」と呼ばれる過程でメッセンジ
ャーRNA（リボ核酸）が合成される。続く「翻訳」の段
階で、細胞のリボソームがトランスファーRNAを結合さ
せて、mRNAの「メッセイジ」をポリペプチドに転換す
る。DNAから転写されたmRNAの情報には、リボソームが
翻訳を開始するおよび終結するシグナルが含まれてい
る。同様に、ポリペプチドを形成するアミノ酸の同定お
よび配列のシグナルが含まれている。DNA鎖は「コド
ン」呼ばれるヌクレオチドからなるトリプレットの長い
配列を含み、各トリプレットコドン中のヌクレオチドの
特異的塩基により情報の特異的断片がコードされてい
る。例えば、ATG（アデニン−チミン−グアニン）と読
まれる３ヌクレオチドは、「翻訳開始」と判断されるmR
NAのシグナルである。一方終止コドンTAG、TAAおよびTG
Aは、「翻訳終止」と解釈される。開始と終止との間の
コドンには、いわゆる構造遺伝子が存在する。そのコド
ンは、最終的に翻訳されるアミノ酸配列を規定してい
る。この定義は、確立している用語「遺伝子コドン」
［例えば、J.D.ワトソン，遺伝子の分子生物学，第３版
（1976）,W.A.ベンジャミン出版］に従った。その本に
は、様々なアミノ酸のコドンが記載されている。遺伝子
コドンは、様々なコドンが同一のアミノ酸を生産すると
いう意味において縮退している。しかし、各アミノ酸に
対して１つ以上のコドンがあるが、他のアミノ酸をを定
しないという点では厳密である。例えば、TTT、TTC、TT
A、およびTTGのコドン全ては、セリンをコードしている
が、他のアミノ酸はコードしない。翻訳中、適切な解読
フェイズすなわち解読フレイムが保持されなければなら
ない。例えば、リボソームが塩基配列中の様々なコドン
を開始コドン（下線部）として読んだ場合何が起こるか
考えてみよう。
・・GCTGGTTGTAAG・・の塩基配列において、 ・・GCT GGT TGT AAG・・は ・・Ala−Gly−Cys−Lys・・、 ・・Ｇ CTG GTT GTA AG・・は ・・Leu−Val−Leu・・、 ・・GC TGG TTG TAA Ｇ・・は ・・Trp−Leu−（終止）となる。
従って、最終的に生産されるポリペプチドは、レギュ
ロンと構造遺伝子との立体的関係に極めて依存してい
る。
遺伝的発現の過程をより詳しく理解するために、一度
遺伝子の成分を次のように定義しておく必要がある。
・オペロン：ポリペプチド発現のための構造遺伝子およ
び発現を制御する調節領域（「レギュロン」）を含む遺
伝子。
・プロモーター：転写を開始するためにRNAポリメラー
ゼが結合しなければならないレキュロン内に存在する遺
伝子。
・オペレータ：リプレッサータンパクが結合し得る遺伝
子で、RNAポリメラーゼの結合が隣接するプロモーター
に結合することを阻止する。
・インデューサー：リプレッサータンパクを不活化する
物質で、オペレーターを解放しRNAポリメラーゼをプロ
モーターに結合させ転写を開始させる。
・カタボライト活性化タンパク（「CAP」）結合部位：
サイクリックアデノシン−リン酸（「cAMP」）が仲介す
るCAPに結合する遺伝子で、通常転写の開始のためにも
必要とされる。CAP結合部位は特別の場合不必要である
こともある。例えば、λファージのラクトースオペロン
中のプロモーター突然変異は、cAMPおよびCAP発現を必
要としない。J.ベックウイッス等，ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー,69,ISS160（1972）］参
照。
・プロモーター−オペレーター系：この明細書で用いら
れているように、CAP結合部位またはリプレッサータン
パクをコードする能力を含むか含まないかに係わらず、
オペロンの操作可能な調節領域。
更に、以降組換えDNAについて議論する際に使用する
用語として、以下にそれを定義しておく。
・クローニングベクター：「形質転換」の過程で単細胞
生物（「微生物」）に導入されたとき、ベクターが複製
されるような完全な「レプリコン」を含む非染色体の二
重鎖DNA。このように形質転換される生物を「トランス
フォーマント」と呼ぶ。
・プラスミド：この発明の目的には、ウイルスまたは細
菌に由来するクローニングベクターを意味する。後者は
「細菌プラスミド」である。
・相補性：二重鎖DNAのそれぞれの鎖上で相補的塩基間
に水素結合を介して二重鎖DNAを形成させる単鎖DNAの塩
基配列に付与される性質。アデニン（Ａ）はチミン
（Ｔ）に相補し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）に相
補する。
最近の生化学の進歩により、「組換体」クローニング
ベクターを調製し得るようになった。それにおいて、例
えばプラスミドをある外来性のDNAに組み込める。特殊
な例において、その組換は「異質」DNAを含むことがあ
る。それは、組換体ベクターによって形質転換されやす
い微生物により通常生産されないポリペプチドをコード
するDNAを意味する。プラスミドは開裂して、連結反応
性末端を有する直鎖DNAとなる。これを連結反応性末端
を有する外来性DNAと結合させると、完全なレプリコン
および所望の表現形質を有する生物学的機能のある分子
が生じる。組換体DNAは、形質転換により微生物の中に
導入され、そしてトランスフォーマントは、新しい遺伝
情報を発現し得る大量の細胞を得る目的をもって単離さ
れクローニングされる。組換体クローニングベクターを
形成する方法、およびそれらを有する形質転換細胞を得
る手段は、広く文献に記載されている。例えば、H.L.ハ
イネッカー等，ネイチャー（Nature），263,748−752
（1976）；コーエン等，プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミック・サイエンス（Proc.Nat.Acad.Sc
i.），米国，69,2110（1972）；同書，70,1293（197
3）；同書，70,3240（1973）；同書，71,1030（197
4）；モロー等，プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミック・サイエンス（Proc.Nat.Acad.Sci.），
米国，71,1743（1974）；およびジャクソン等，プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエ
ンス（Proc.Nat.Acad.Sci.），米国，69,1904（1972）
参照。この主題の一般的議論は、S.コーエン，サイエン
ティフィック・アメリカン（Scientific American），2
33,24（1975）に見られる。
様々な技術により、DNAの組換えが可能になった。そ
れによると、別々のDNA断片の連結を容易にするなんら
かの方法により末端を切断しておく。この連結とは（ほ
とんどの場合T4 DNAリガーゼを介して）、隣接するヌ
クレオチド間にホスホジエステル結合を形成させること
である。このようにして平滑末端を直接連結させること
ができる。また、隣接末端に相補的な単一鎖を含む断片
は、各末端に位置する水素結合により連結が容易にな
る。そのような単一鎖は、接着末端と呼ばれているが、
ターミナルトランスフェラーゼを使ってヌクレオチドを
平滑末端に付加えることにより形成され得る。また、し
ばしば単にλエキソヌクレアーゼのような酵素を使って
平滑末端の単一鎖を切ることによっても形成され得る。
更に、長さ約４ないし６塩基対のユニーク配列近辺のフ
ォスフォジエステル結合を切断する制限エンドヌクレア
ーゼを用いることがしばしば行われている。多くの制限
エンドヌクレアーゼおよびその認識部位が知られてい
る。いわゆるEcoR Iというエンドヌクレアーゼが全も広
く使われている。回転対称な「パリンドローム」の二重
鎖DNAを切断する制限エンドヌクレアーゼは接着末端を
残す。このように、プラスミドまたは他のクローニング
ベクターは切断され、各末端は制限エンドヌクレアーゼ
認識部位の一方を含むようになる。外来性のDNAの切断
産物には、この様なプラスミド末端と相補性を示す末端
が存在する。また以下に開示するように、接着末端を含
む合成DNAは外来性DNAの挿入を妨げるので、アルカリフ
ォスファターゼで末端を切断しておくとよい。そうする
と、外来性DNA断片を取り込めるベクターを選択するこ
とができる。DNA断片の末端が２つの異なった制限エン
ドヌクレアーゼで切断されたDNAベクターと相補性を示
せば、そしてそれ自身が２つの異なった制限エンドヌク
レアーゼが認識する配列を構成する末端をそれぞれ含め
ば、ベクターの構造に対して正しい方向を有するDNA断
片の取込みが高まるであろう。
全CSタンパクを産生するための１つの方法は、以下の
一般的な方法の中で記載する。この方法において、遺伝
子の５′および３′末端を優先的に切断できるホルムア
ミド濃度および温度条件を調節して、ヤエナリのヌクレ
アーゼを使用する。この様な方法で得られるDNA断片
を、λgt11ベクターのような様々な発現ベクターの中に
クローニングできる。例えば、クローニングベクターで
形質転換して得られるクローンは、発現しているかどう
かを調べるために、CSタンパクに対する抗体を用いるス
クリーニングに掛けられる。従って、この発明は前記の
ペプチドをコードする実質的に純粋なDNA配列を含む。
この様なDNA配列は、今や市販されている自動装置を使
って容易に合成できる。実際のDNA配列は、前もって得
られるアミノ酸配列から容易に算出できる。特に好まし
いDNA配列は、第２図に示されたDNA配列由来の断片を含
む。第２図に従うと、前記したアミノ酸に対応するDNA
配列が特に好ましい。
これらのDNA配列の１つを含む組換対クローニングベ
クターも、この発明の範囲に含まれる。このクローニン
グベクターには、微生物若しくは酵母のプラスミドまた
はバクテリオファージが挙げられる。特に好ましいクロ
ーニングベクターはλgt11である。従って、DNA配列が
人工的に単細胞生物に導入されたならば、ヒトに免疫反
応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマラリア
病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に精製さ
れた免疫的に活性なペプチドを発現し得る上記のDNA配
列を含む単細胞生物は、この発明の発明の範囲に含まれ
る。E.Coliが好ましい宿主である。
この発明では、ATCCに寄託されたいくつかの例を挙げ
る。λmPf1、λmPf3、λmPf5、λmPf8、λmPf11、およ
びλmPf13の同定された微生物の寄託番号は、それぞれ
以下の通りである。すなわち、39738、39739、39740、3
9741、39742、39743、および39744である。
この発明を実施する上で使用する遺伝物質は、上記の
通りに合成され得るが、既知の手法を用いて原生動物で
あるP.ファルシパルムから直接適当な遺伝物質を取出す
こともできる。一般的に入手し得る原生動物であるP.フ
ァルシパルムの中には、7G8と同定されたものがある。
それは、寄託番号40123としてATCCに寄託されている。
マラリアに対する免疫能を誘導するために、この発明
のペプチドの免疫的有効量をヒトに投与する。治療面で
の有効投与量は、当該分野の専門家には容易に決定でき
る。一般的には、体重に対して約0.01μg/kgないし100
μg/kgの範囲である。好ましくは、約0.1μg/kgないし
1.0μg/kgの範囲である。
この発明のペプチドの投与形態は、免疫系にこのペプ
チドを伝達できるいかなる経路もとり得る。この発明の
目的を達成するためには、このペプチドを筋肉内、静脈
内または活性成分をリンパ球に伝達でき免疫応答を誘導
できるいかなる方法によっても投与できる。この発明の
ペプチドは、免疫応答を誘導するに適した形態で、活性
成分を含む薬剤組成物中に配合して調製できる。容易に
注射できる形態で、活性成分を含む懸濁液または水溶液
が好ましい。必要があれば、免疫応答を高めるためにア
ジュバントを使用することができる。
薬剤調製物の形にする場合、この発明のペプチドを単
位投与形態にしておくことが望ましい。ヒトに使用する
場合、これらの量は、体重70kgのヒトに予め与えた投与
量から容易に計算することができる。従って、薬剤調製
物を含む好ましい単位投与量は、活性成分約７ないし70
μｇを含むことになろう。しかし、いかなる特定の患者
に対する一定投与レベルは、使用される特定化合物の活
性を含んだ様々な要因（例えば、年齢、健康状態、性、
患者の摂取している食事、投与時間、投与経路、排泄
率、投与される他のいかなる薬剤との共働作用、および
必要とされる抵抗力の度合い）に依存することは言うま
でもない。
この明細書願では、ペプチドおよびDNA配列に関して
標準的な命名法および略記法を使用している。この明細
書で用いた標準的な命名法を記載した出版物の一例とし
て、レーニンジャーの生化学（iochemistry）［ウオー
ス出版，ニューヨーク（1970）第４章および５章（ペプ
チド）および第12章（DNA）］が挙げられる。
［実施例］ ゲノムDNA発現用ベクターを用いたライブラリーからの
クローン 発現ベクターλgt11［R.A.ヤングおよびR.W.デイビ
ス，プロシーティング・オブ・ナショナル・アカデミッ
ク・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）米国，80,1194
（1983）］中のP.ファルシパルムゲノムDNAライブラリ
ーは、次のように調製された。発現ライブラリーは、ブ
ラジルのP.ファルシパルムのIMTM22株から選択された一
般的に入手し得るクローン7G8のDNAから調製された。P.
ファルシパアルム7G8クローンからのゲノムDNAのアリコ
ート10μｇを、35または40％のホルムアミドを含む緩衝
液（0.2M NaCl,1mM ZnSO4,30mM酢酸ナトリウム,pH4.6）
100μ中で50℃にて30分間ヤエナリのヌクレアーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカル）20単位を用いて分解した。続
いて、その溶液を次の処理に移る前に、0.01M EDTA溶
液で４倍に希釈し、フェノールで抽出し、そしてエタノ
ール沈澱させた。この処理からDNAを集め、λgt11に連
結するための断片源として用いた。そのDNAを一定の条
件［T.マニアチス,E.F.フリッシュ，およびJ.サングロ
ーク著、「分子クローニング：実験質指針」コールド・
スプリング・ハーバー研究所刊、N.Y.、1982年、394頁
に記載］の下にクレノー断片（BRL）で処理し、その平
滑末端を有する処理断片にEcoR Iリンカー（BRL）を連
結した。そのDNAを過剰のEcoR Iで２回分解し、各分解
後セファロース4Bを詰めた1.5cm×20cmのカラム上で遊
離リンカーから分離した。λgt11は自己結合するが、Ec
oR Iで分解した。P.ファルシパルムDNA断片230ngを、調
製したλgt11DNA500ngに供給者の勧める条件下でT4 DN
Aリガーゼ（IBI）を用いて４℃にて一晩かけて連結させ
た。連結反応生成物の半分を、生体外の感染ファージ
（プロメガ バイオテク）にパッケイジングした。Xgal
およびIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を補った
LB寒天上で生育しているRY1091細胞上でλgt11のβカラ
クトシダーゼ遺伝子中に介在断片があるかどうか調べた
ところ、400000個のファージが検出された。
そのライブラリーを、150mmのプレート27枚に１枚の
プレート当りプラーク濃度25000として蒔いた。プラー
クを移したニトロセルロースを、R.A.ヤングおよびR.W.
デイビス，サイエンス（Science），222,778（1983）に
記載されているように調製した。
P.ファルシパルム7G8 CSタンパクに対する５種のモ
ノクローナル抗体（第１表）のプールを、1/10,000の希
釈で、スクリーニングに用いた。
＋λmPfは、λgt11中のP.ファルシパルムCSタンパク遺
伝子。λgt11に挿入されたP.ファルシパルムDNAの大き
さを括弧内に示す。全ての細菌はIPTGで誘導された。
＋＋データは、エリザ（ELISA）法で３回別個に測定し
た414nmにおける吸光度の平均値として示されている。
第１表に掲げられた細菌は、以下のスクリーニング工
程により同定された。５つのハイブリドーマ系腹水を、
0.05％ツイーン20および３％BSA（ウシ血清アルブミ
ン）を含むpH7.5の0.15M NaCl,0.05Mトリス緩衝液（TB
S）で10000倍に希釈した。そして、E.Coliおよびラムダ
に対する抗体を除くために、ニトロセルロースフィルタ
ー上で空気乾燥したλgt11が感染したRY1090細胞の濃縮
溶解物で何回か吸収した。P.ファルシパルムライブラリ
ーからのプラークを移したニトロセルロースプラーク
を、0.3％ツイーン20、３％BSA、5mM MgCl2および５μ/
mlのDNAseを含むTBS500mlで室温にて30分間洗った。そ
のプラークを移したニトロセルロースを、吸収したモノ
クローナル抗体で４℃にて一晩インキュベートした。更
に、全ての操作は室温で実施した。これらの操作の後、
移したプラークを、TBS＋0.05％ツイーン20、TBS＋１％
トリトンＸ−100、およびTBS＋0.5％ツイーン20の各溶
液で30分間順次洗浄した。マウスモノクローナル抗体の
シグナルは、そのフィルターをウサギの抗マウスIgG
（カペル）中で１時間インキュベートすることによって
増幅された。その抗体は、0.05％ツイーン20および３％
BSAを含むTBS中に溶かしたトリトンＸ−500溶液で希釈
しておき、腹水液のときのように前もって吸収しておい
た。プラークを移したニトロセルロースに結合した抗体
を、0.05％ツイーン20および125Iで標識したタンパクＡ
（アメラハム）１μCiを含むTBS30ml中でインキュベー
トした。続いて、洗浄し、オートラジオグラフィーにか
けた。
最初のスクリーニングで48時間のオートラジオグラフ
ィー後、35個の陽性クローンが得られた。17個を85mmの
プレート当り100ないし800の濃度で再スクリーニングし
た。そのクローンの内11個が、２回目のスクリーニング
で陽性プラークを形成した。これらを、50より少ないの
プラークを含む85mmのプレートから免疫的スクリーニン
グを行わずにクローニングした。11個のクローンの内10
個が、スクリーニングにより免疫的活性を示した。
10個のクローンに挿入された断片は、次の大きさのク
ラスに属す。３個（λmPf1、λmPf3、λmPf11）は2.3k
b。３個（λmPf5、λmPf8、λmPf13）は2.3kb。λmPf15
は1.35kb。λmPf6は1.0kb。λmPf9は0.5kb。クローンλ
mPf18は、２つの挿入断片を含むが、それ以上調べては
いない。クローンλmPf1、３、５、８、11、13および15
の挿入断片は、交差ハイブリド形成する。λmPf6および
９は、交差ハイブリド形成しなかった。このことは、こ
の２つの小さな挿入断片は、５つのモノクローナル抗体
の混合物により選択されるが、2.3kb断片以外のゲノム
の一部から由来することを示している。
クローンλmPf5は、ニックトランスレートされたが、
サザン法［E.M.サザン，ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,98,503（1975）］に
よりヒトおよびP.ファルシパルムのHind III分解物を調
べるために用いられた。ハイブリド形成した単一バンド
は、P.ファルシパルム帯において14kbのところに現われ
た（データは示さない）。このプローブはヒトのDNAと
はハイブリド形成しなかった。
E.Coli中でのCSタンパクの発現 λgt11中のクローンは、E.ColiのY1089株にライソゲ
ンとしてして導入された。ライソゲンを生産するため
に、バクテリオファージを含む溶液（1010/ml）10μ
を、50μg/mlのアンピシリンおよび0.2％のマルトース
を含む培地中で生育させたE.ColiのY1089株（108/ml）1
00μと混合し、ペレットにし10m MgSO4中に再懸濁さ
せた。室温にて20分間放置した後、細胞を希釈し50μg/
mlのアンピリシンを含むプレート上に蒔いた。そして32
℃にて生育させた。各コロニーを、42℃にて生育可能か
どうかによって溶原性を調べた。溶原菌を、50μg/mlの
アンピシリンを含む培地中にて、550nmでの吸光度が0.4
ないし0.8なるまで生育させた。培養物を44℃にて20分
間軽く振盪した。IPTGを最終濃度2mMになるように加
え、更に１時間37℃にて振盪した。ファージを44℃にて
導入し、βガラクトシダーゼと融合するタンパクの発現
を高めるために培地に加えた。エリザ法にて、DNAが導
入された細菌の溶解物と５種のモノクローナル抗体のそ
れぞれとの反応性を解析した。前記の通り生育させ誘導
させた培養物50mlから細胞を、550nmで吸光度0.6となる
ように、0.2mMフッ化フェニルメチルスルフォニルを含
むpH8.0の150m NaCl,50mトリス塩酸緩衝液1.0mlに再懸
濁させた。懸濁物をドライアイスとエタノールの入った
浴槽中で素早く凍結させ、PBSで希釈する前に２回解凍
した。クローンの溶解物をPBS（10mMリン酸ナトリウ
ム、150mM NaCl）で100倍に希釈した。アリコート50μ
をポリ塩化ビニル製のプレート（ダイナテク・ラボラ
トリーズ社，バージニア州，アレキサンドリア）の穴に
ピペットで加え、室温に保った。約18時間後、穴をPBS
中にウシ血清アルブミン0.1％を加えた溶液（PBS−BS
A）で洗い、続いて１％PBS−BSAで満たし、室温で１時
間放置した。５種のモノクローナル抗体の１つからの腹
水50μをPBSで500倍に希釈し、適当な穴に加え、室温
で１時間放置した。これら５種のモノクローナル抗体か
らの腹水は、P.ファルシパルムスポロゾイトに対する免
疫蛍光抗体検定（IFA）および周囲スポロゾイト沈澱（C
SP）反応が陽性であった。穴を上記の通り洗い、PBSで2
00倍に希釈したパーオキシダーゼが結合している抗マウ
ス抗体ヤギ（キルケガード＆ペリーラボラトリーズ社，
メリーランド州，ゲセルバーグ）を加え、室温で１時間
放置した。各穴をPBS−BSAで洗い、基質150μを加え
た。基質はpH4の0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液1ml当り1m
gの2,2′−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン
スルホン酸）からなっている。使用直前に0.003％の
過酸化水素を加える。414nmでの吸光度を１時間後タイ
ターテックマルチスキャンプレイトリーダー（フローラ
ボラトリーズ社、バーナジア州、マクレーン）を使って
測定した。６種のクローンが５種のモノクローナル抗体
全てに結合した（第１票）。クローンλmPf13の吸光度
は、上記の対照ほど顕著ではなかった。クローンλmPf9
は、５種のモノクローナル抗体のうちの１種すなわち4D
11.6のみに結合した（データは示さない）。クローンλ
mPf9は、CSタンパクを含むλmPf1とハイブリド形成しな
かった（以下参照）ので、このモノクローナル抗体は、
CSタンパクの遺伝子とは無関係な遺伝子と同定された。
λmPf9によって発現されるタンパクは、この１種のモノ
クローナル抗体とエピトープ交差反応をする。ホープ等
は、P.ファルシパルムの表面抗原と交差反応するP.ファ
ルシファルムの侵入した性に関係しない赤血球抗原に対
するモノクローナル抗体を同定した。I.A.ホープ,R.ハ
ル,D.Z.シモンズ等，ネイチャー（Nature），308,191
（1984）参照。λmPf9が、ホープ等の記載するタンパク
または他の交差反応をするタンパクをコードする遺伝子
を含んでいるとしても、タンパクはまだ決定されていな
い。
また、エリザ法に使われる溶解物を、SDS−ポリアク
リルアミドゲル（SDS−PAGE）上で電気泳動に掛け、ニ
トロセルロース上に電気泳動で染みこませた。各ライソ
ゲン培養物1mlからのペレット化した細胞を、SDSゲル試
料用緩衝液（３％SDS、10％グリセロール、10mジチオス
レイトール、62mトリス−塩酸、pH6.8）200μに溶解
し、95℃にて５分間加熱した。P.ファルシパルムのスポ
ロゾイトをAn.フリーボルニ（freeborni）蚊の唾液腺か
ら単離し、ペレットとして0.2％卵白アルブミンを含むP
BS中にて−80℃で保存した。抗原抽出においては、新規
に調製した抽出緩衝液（0.5％Np40、2m PMSF、33μg/ml
ライペプシン、33μg/mlアンチパイン、２μg/ml BSAを
含むPBS）450μを4.5×105スポロゾイトのペレットに
加えた。その混合物を、10分毎に15ないし30秒間激しく
振りながら室温にて１時間インキュベートした。抽出し
たスポロゾイトを２分間13000gで遠心してペレット化し
た。その上清を、電気泳動に掛けるためSDSゲル試料用
緩衝液に入れた。
トウビン等の方法［プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミック・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.），米国，79,4350（1979）］を改良してウエスター
ン法による解析を実施した。タンパクをレムリーの方法
［ネイチャー（Nature），277,680（1970）］に基づい
てSDS−PAGにより分離した。その際、4.5％重層ゲルお
よび８ないし12％の勾配ゲルを用いた。ゲルをトウビン
の緩衝液200mlで30分間２回洗った。SDS−PAGEで分離し
たタンパクを、４℃にて電場８ボルト/cmで14ないし16
時間かけて0.22μｍのニトロセルロースフィルター上に
移動させた。ニトロセルロースフィルター上で未反応結
合部位は、0.05％ツイーン20を含むPBSに溶かした５％B
SAでフィルターを処理して遮断した。続いてそのニトロ
セルロースフィルターを、0.05％ツイーン20を含むPBS1
00mlで４回洗った。そのニトロセルロースフィルター
を、５つのモノクローナル抗体のプール（2E6.4、2F1.
1、4D9.1、4D11.6および5G5.3）で90分間反応させた。
モノクローナル抗体のプールは、各抗体の腹水を0.05％
ツイーン20および20％ウシ胎児血清を含むPBSで1:10000
00に希釈して調製した（総腹水の希釈率1:20000）。そ
のニトロセルロースフィルターを前の４回洗い、続いて
マウス抗体に対して調製した125Iで標識したヒツジ抗血
清で処理した。125Iで標識したヒツジ抗血清を、0.05％
ツイーン20および20％ウシ胎児血清を含むPBSで2X105cp
m/mlとなるように希釈した。そのニトロセルロースフィ
ルターを前の通り４回洗い、乾燥させた。コダックXAR
−２フィルムを用いて−80℃にてオートラジオグラフィ
ーを実施した。そのニトロセルロースフィルター上のタ
ンパクを、抗スポロゾイトモノクローナル抗体により同
定した。λmPf1、３、５、８、11、および13のタンパク
に対する抗スポロゾイトモノクローナル抗体は、λmPf1
3に対する強度は非常に減少していたものの、分子量Mr6
0000/57000および53000/51000の２つの二重線に結合し
た（データーは示さない）。挿入DNAをもたないλgt11
ベクターには結合しなかった。モノクローナル抗体は、
分子量Mr60000、53000および51000の位置でスポロゾイ
トからのタンパクに結合した。このようにλgt11中でCS
タンパクをコードしている全てのスポロゾイト遺伝子
は、スポロゾイト自身により合成される操作されていな
いCSタンパク（分子量Mr60000）に対して移動度の小さ
いタンパクを産生した。IPTGで誘導すると、λgt11の場
合注目すべきことであるが、分子量M116000のβガラク
トシダーゼが著しく発現した。λmPf9の場合注目すべき
ことは、βガラクトシダーゼに結合した分子量Mr131000
の融合タンパクが発現した（データーは示さない）。CS
タンパクタンパク遺伝子をもったクローンは、弱いβガ
ラクトシダーゼ帯だけを示したが、融合タンパクは見ら
れなかった（データーは示さない）。更に、βガラクト
シダーゼに対する抗体は、分子量Mr60000のCSタンパク
に結合しなかった。このことは、このタンパクがβガラ
クトシダーゼの断片を含んでいないことを示唆している
（データーは示さない）。
λgt11ゲクターは、IPTGを用いた誘導によりβガラク
トシダーゼに融合したタンパクとしてのDNA挿入断片を
発現できるように設計されたものである。従って、CSタ
ンパクを発現するどのクローンも融合タンパクではない
とは予期されていなかった。このことは、λmPf1、５、
８および15に関して当はまる。というのもこれらのDNA
挿入断片が、それらの転写の方向がβガラクトシダーゼ
のそれと反対になるように配向されているからである。
Stu I、Kpn I、およびStu I＋Kpn Iを使って決定された
ファージDNA制限酵素切断地図によれば、挿入部分の非
対称Stu I部位（第１図）は、それぞれの場合左端から1
8.58kbのλgt11中のKpn I部位から約1.1kbに位置してい
ることが示された。λmPf1およびλmPf15クローン中の
コード配列に対してP.ファルシパルムDNAの５′末端
が、E.ColiRNAポリメラーゼによりプロモーターとして
認識される配列を含むかどうか疑問ではあるが、細菌の
リボソームに対する結合部位は存在していないことは明
らかである（第２図）、λmPf5およびλmPf8クローン
は、その遺伝子に先行する11bpから始まる。従って、こ
れらのクローン中のCSタンパクは、終わりに近いラムダ
のプロモーターから発現される可能性がある。同じよう
な現象は、酵母DNA挿入断片に関してλgt11系で観察さ
れた。T.ゴローおよびJ.C.ワング，セル（Cell），36,1
073（1984）参照。
制限酵素切断地図によれば、λmPf13に挿入されたDNA
断片はβガラクトシダーゼ遺伝子に対して正しい方向を
向いていることが示唆される。しかし、それはβガラク
トシダーゼと融合したタンパクを産生するフレーム中の
１つの塩基である（第２図）。ウエスターン法で検出さ
れるようにこのクローンにより産生されるCSタンパクの
レベルが低くかつエリザ法により著しい違いのあるデー
ターが得られなかった（第１表）のは、その構造的観点
から理解できる。逆向き接続またはフレイム挿入の性質
をもったクローンから示唆し得ることは、恐らくEcoR I
のCSタンパクの毒性効果の為に、発現する融合タンパク
の選択が行われている（例えば、正しい方向にあるλmP
f5および８）ということである。
CSタンパクタンパクをコードしているP.ファルシパルム
遺伝子の構造 P.ファルシパルムをコードしている遺伝子を含むβmP
f1中にクローニングされた2.3kbのDNA断片のヌクレオチ
ド配列を第２図に示す。λmPf1クローンの制限酵素切断
地図および配列決定の手法を第１図に示す。この配列
は、78番目のATG開始コドンで始まり1316番目のTAG終止
コドンで終わる大きな塩基の読み取り枠を含んでいる。
複数の終止コドンは、他の５つの読み取り枠の中に見出
だされる。塩基の読み取り枠が第１図に示されるような
ものであれば、分子量約44000ダルトンで421分子のアミ
ノ酸からなるポリペプチドもコードし得るであろう。P.
ノウレシのCSタンパクで観察されたように、SDS−PAGE
によるP.ファルシパルムのCSタンパクの分子量（約6000
0）は、推定分子量（44000）とは異なっていた。
このタンパクの最も重要な構造上の特徴は、４つのペ
プチドからなる41回の直列反復が存在することである。
最初の繰返し単位はAsn−Ala−Asn−Proであり、37回繰
返す。もう一方はAsn−Val−Asp−Proであり、２、４、
６および22番目に現われる。Ala−AsnがVal−Aspに変わ
っているのは、アラニンコドンの２番目の塩基がＣから
Ｔに置き代わり、アスパラギンコドンの１番目の塩基が
ＡからＧに置き代わっている理由による。これらの繰返
しをコードしている核酸の塩基配列は、アミノ酸配列を
ただ単に一定に保っている訳ではない。41単位を有する
繰返し領域は、11の異なったヌクレオチド配列から成り
立っている。その単位の内18配列はAATGCAAACCCAであ
る。反復単位の７配列はこの配列の１つの位置だけが異
なっており、12配列は２つの位置が、２配列は３つの位
置が、１配列は４つの位置が、そして１配列は５つの位
置が異なっている。この様な配列の異なりは、ゲノムDN
A内の反復を組換えによる塩基の切断や入替えから守り
安定化させている。タンパクのアミノ末端では、16分子
のアミノ酸の鎖が恐らくシグナル配列を構成している
（第２図）。シグナル配列と反復領域との間には、塩基
性および酸性アミノ酸が存在するために非常に電荷を帯
びた領域が生じる。例えば、66番目から118番目のアミ
ノ酸の内27分子が電荷を帯びたアミノ酸である。
その繰返し領域に続いて、他の２つの断片が電荷を帯
びたアミノ酸を非常に多く含んでいる。これらの領域
は、324番目から339番目のアミノ酸領域および360番目
から388番目のアミノ酸領域に存在する。それらの領域
は、それぞれ50％および48％の電荷を帯びたアミノ酸を
含む。このタンパクのカルボキシ末端には、膜内在性タ
ンパクのアンカー配列を表わす21分子の疎水性アミノ酸
が存在する。
合成ペプチドと抗体との免疫活性 P.ファルシパルムスポロゾイト遺伝子のヌクレオチド
単位が正しい配列であるかどうか最終的な証明をするた
めに、ペプチドを合成した。そのペプチドは、ベックマ
ン990アミノ酸合成機を使って固相法［R.B.メリフィー
ルドおよびA.マーグリン，アニュアル・レビュー・オブ
・バイオケミストリー（Annu.Rev.Biochem.）,39,841−
866（1970）］により調製した。合成ペプチドを、液体H
Fにより固体の支持体から遊離させた［J.P.タム,W.F.ヒ
ースおよびR.B.メリフィールド，ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイアティー（J.Am.Chem.Soc
i.），105,6442（1970）］。遊離ペプチドを、バイオゲ
ルＰ−２またはＰ−４上でゲル濾過により脱塩した。単
離したペプチドの純度を、逆相HPLCおよびアミノ分析機
により確めた。また、15残基のペプチドに関してはアミ
ノ酸配列を決定した。
続いて、上記のエリザ法を改良して、これらのペプチ
ドがモノクローナル抗体2F1,1のλmPf1への結合を阻害
するかどうかを調べた。合成ペプチドに関して、次のよ
うな試験を実施した。pH7.4の0.01Mリン酸塩、0.15M Na
Clの緩衝液（PBS）で100倍に希釈したλmPf1の溶解物の
アリコート50μをポリ塩化ビニル製のプレート（ダイ
ナテク・ラボラトリーズ社，バージニア州，アレキサン
ドリア）の穴にピペットで加え、一晩室温で放置した。
約18時間後、穴をPBS−0.05％ツイーン20（PBS−YW）で
４回洗い、PBS−TW中にウシ血清アルブミン（BSA）0.1
％を加えた溶液で満たし、室温で１時間放置した。蒸溜
水に溶かした合成ペプチドの貯蔵液（５×10−2M）を、
PBS中にBSA1％を溶かした液で10倍に希釈した。そして
アリコート100μを、1.5mlの小遠心管中でセイヨウワ
サビのペルオキシダーゼに結合させたモノクローナル抗
体30μと混合し、室温で１時間放置した。プレートの
穴を空にし、各穴にペプチド−モノクローナル抗体混合
物を入れ、室温で１時間放置した。穴を再び上記の通り
洗い、前記のように基質150μを加えた［P.K.ナカネ
およびA.カウザオジ，ジャーナル・オブ・ヒストロジカ
ル・サイトケミストリー（J.Hist.Cytochem.）,11,1084
（1974）］。
第３図に示された結果から、7,11および15の残基を有
するペプチドは、2F1.1のλmPf1への結合を著しく阻害
することが分る。15残基のペプチドでは、５×10-7Mの
濃度で結合が明らかに阻害された。７残基のペプチド
も、モノクローナル抗体2F1,1のλmPf1と置き変わった
スポロゾイト抗原への結合を阻害した。更に、合成ペプ
チドは他の４つのモノクローナル抗体のλmPf1への結合
を阻害した。このデーターは、反復単位の配列が正しい
ことを示している。11および15残基を有するペプチドに
関して結合の阻害が高まっていることが観察されたが、
このことは２次構造の変化に起因すると思われる。
P.ファルシパルムおよびP.ノウレシのCSタンパク間の相
同領域 P.ファルシパルムのCSタンパクおよびサルのマラリア
病原虫であるP.ノウレシのCSタンパクは、全体的には同
じような構造を有しているが、相同性のある２箇所だけ
の短い領域を有している。両タンパクは、次の点で主要
な特徴が同じようである。すなわち、それらはタンパク
の中央部分に繰返し領域を有し、アミノ末端にシグナル
配列として電荷を帯びたアミノ酸がたくさん存在する多
重領域を有し、およびカルボキシル末端に疎水性のアン
カー配列を有する点である。アミノ酸配列の相同性をコ
ンピューターで解析した（25,kタップルサイズ1,ウイン
ドウサイズ20,ギャップペナルティ１）ところ、タンパ
クのほとんどに渡って配列の相同性が限定されているこ
とが分かった。反復配列から断片における２種のタンパ
ク間の平均的な相同性は37％である。すなわち、102分
子のアミノ酸の内37分子が一致していた。12分子のアミ
ノ酸毎にPro1分子およびAla1分子が入っているので、反
復配列の相同性は16％である。反復配列から後の断片に
おける２種のタンパク間の平均的な相同性は42％であ
る。すなわち、119分子のアミノ酸の内50分子が一致し
ていた。これらのタンパクの２次および３次構造は明ら
かでないが、１次構造に差があるにもかかわらずこれら
のタンパクには構造上および機能上の類似性がある。CS
タンパクの反復配列により、免疫活性のあるスポロゾイ
トのワクチンを生産することが可能になる。
非常に相同性のある２箇所の領域は、反復領域のどち
らかに見出された。22分子のペプチドに相同領域が入っ
ている場合、３分子のプロリンが入っている箇所は明ら
かであり、および５つの連続したアミノ酸（Lys−Leu−
Lys−Gln−Pro）は一致する（第2,図および第４図の領
域Ｉ）。
相同性のある第２の領域（第２図および第４図の領域
II）は、13分子のアミノ酸を含み、そのうち12分子は一
致している。一致していない只１分子のアミノ酸は、P.
ノウレシのアミノ酸配列中の第４番目でセリンがスレオ
ニンに置き変わっている。この領域には、分子内ループ
形成に関してオザキ等［L.S.オザキ,P.スベク,R.S.ヌッ
センツワイク等，セル（Cell），34,815（1983）］が初
期の頃主張した２つのシステイン残基を含む。
P.ファルシパルムのCSタンパクをコードしている核酸
の配列の、領域IIを除いたP.ノウレシの遺伝子との相同
性にも制限がある。タンパクの領域IIをコードしている
遺伝子の特定の部分において、２箇所だけP.ノウレシに
相当する配列とは異なる27塩基配列が存在する。これの
一定配列は、他のプラスモディウム種のCSタンパクをコ
ードしている遺伝子をクローニングするためのプローブ
とし有益となろう。
P.ファルシパルムとP.ノウレシとの間のアミノ酸の２
つの領域の相同性を考慮してみると、進化の過程で大き
く分離した微生物の塩基配列が保存されているというこ
とが言える。以前、霊長類のマラリアは霊長類と並行し
て進化してきたとする仮説があった。しかし最近では、
P.ファルシパルムのDNAは鳥および齧歯類のマラリアのD
NAと類似しているという報告、およびこれらのDNA構造
は霊長類のマラリア［P.ノウレシ、P.フラジレ（fragil
e）、P.ビバックス（vivax）、およびP.シノモルジ（cy
nomolgi）］のそれとは異なるという報告がなされてき
た。P.ファルシパルム、P.ロフラエ（lophurae）および
P.ベルグヘイ（berghei）のDNA塩基のＧ＋Ｃ顔料は、P.
ノウレシを含めた霊長類のマラリアのそれよりも低かっ
た。更に、P.ファルシパルム、P.ロフラエ（lophurae）
およびP.ベルグヘイ（berghei）のDNAとハイブリドを形
成する遺伝子プローブは、霊長類のマラリアとハイブリ
ドを形成しなかった。また、霊長類のマラリアとハイブ
リドを形成するプローブは、P.ファルシパルム、P.ロフ
ラエ（lophurae）およびP.ベルグヘイ（berghei）のDNA
とハイブリドを形成しなかった。P.ファルシパルムとP.
ノウレシ間のこの相同領域は、細胞へ侵入するための受
容体のようなタンパクの重要な機能として保存されてい
るのかもしれない。P.ファルシパルムとP.ノウレシ病原
虫双方は、ヒトの肝臓に感染し得るということに注目す
べきである。
タンパク間でエピトープを共有してしまうという散在
的な問題があるにも係わらず、かなりの数の事実がスポ
ロゾイト遺伝子がクローニングされてきたということを
示している。先ず初めにP.ファルシパルムのCSタンパク
とP.ノウレシのCSタンパク間には甚だしい類似性があ
る。双方の大きさは、P.ファルシパルムおよびP.ノウレ
シの計算分子量がそれぞれ44426および36792であるよう
にほぼ同じである。また双方には、シグナル配列、電荷
を帯びた領域、タンパクの中央に存在する反復ペプチド
の領域、およびアンカー配列を含む類似した領域があ
る。第２には、２種のタンパク間にはアミノ酸の配列の
相同領域が２つある（第４図）。第３には、P.ファルシ
パルム病原虫の表面抗原と反応する５種のモノクローナ
ル抗体は、細菌の中で合成されたタンパクを認識する。
λmPf9クローンからの交差反応性タンパクのみが、これ
らのモノクローナル抗体の１種と反応する。第４には、
SDS−PAGEによると、細菌の中で合成されたタンパクの
大きさはP.ファルシパルム病原虫から得られるタンパク
のそれとほぼ同じであった。第５には、反復配列を有す
る合成ペプチドは、エリザ法においてモノクローナル抗
体のスポロゾイトタンパクへの結合を阻害した。
この遺伝子は、シグナル配列、電荷を帯びた領域、４
分子のアミノからなる単位（反復）が41個所現われる中
央の領域、シスチンのループ、およびアンカー配列から
成立つ412分子のアミノ酸からなるタンパクをコードし
ている。中央領域の反復配列の37箇所は同一であり（As
n−Ala−Asn−Pro）、４箇所の配列はAsn−Val−Asp−P
roである。
CSタンパクに類似している一連の抗原は、今日まで研
究されてきたプラスモディウムの全ての種のスポロゾイ
ト上に見出だされる。CSタンパクのモノクローナル抗体
は、生体に防御力を付与し、生体外ではスポロゾイトの
感染力を中和する。A.H.コクレーン,F.サントロ,V.ヌッ
センワイツ等，プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミック・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）米
国，79,5651（1982）参照。
モノクローナル抗体は、霊長類のマラリアの種間で交
差反応を引起こすことがあるが、免疫能を仲介する抗体
は種特異性を有するようであり、P.ノウレシの場合防御
力をもったモノクローナル抗体は反復構造のエピトープ
を標的としている。１つ以上のエピトープを必要とする
検定においてモノクローナル抗体はスポロゾイトを反応
するというデータや知見から、ザバラ等によりCSタンパ
クに対するモノクローナル抗体を反復エピトープを有す
る免疫活性領域と反応させる方法が開発された。この仮
説は、P.ファルシパルムのCSタンパクに対する５種のモ
ノクローナル抗体がタンパク中の反復単位（Asn−Ala−
Asn−Pro）を標的としている点から確固としたものにな
った。
進化の途上２つの異なった様式で分離していったマラ
リア病原虫（P.ファルシパルムおとびP.ノウレシのDNA
配列の領域IIが実に良く相同していることが暗示するも
のは、スポロゾイトが病原虫の肝臓への侵入に対して受
容体としての機能もつためにその塩基配列が保存されて
きたということである。この領域がヒトマラリアの中で
保存され、免疫系にさらされるならば、P.ファルシパル
ムのこの領域で免疫とすることはヒトマラリアの他の種
に対しても抵抗力を付与し得るであろう。もしこの相同
領域が病原虫の肝臓への侵入に対して受容体としての意
味をもつならば、マラリア病原虫のこの領域の塩基配列
は極端な変化をし得ないであろう。
以上，この発明を図面を参照しつつ説明したが，第１
図に示される制限酵素による切断部位は、塩基配列から
決定され、次の制限酵素の分解により確められた。Ａは
Ava II、AcはAcc I、ＢはBstn I、ＤはDra I、DdはDde
I、ＦはFok I、ＮはNde I、ＲはRsa I、ＳはStu I、Ｔ
はTth III、TqはTaq I、ＸはXho IIを示す。矢印は、決
定された塩基配列の開始点、方向および範囲を示す。CS
タンパクをコードしている領域は、太い線で示されてい
る。第２図には，λmPf1中におけるCSタンパクの遺伝子
に対するヌクレオチド配列が示されている。λmPf1に挿
入したEcoR IのDNA断片は、pUC8中にサブクローニング
され、塩基配列が決定された。二重差DNA配列に関し
て、CSタンパクをコードしている領域の100％が決定さ
れ、近接領域の70％が決定された。クローンλmPf5、λ
mPf8、λmPf13およびλmPf15の挿入部分もまたpUC8中に
サブクローニングされ、末端の配列が決定された。CSタ
ンパクをコードしている領域の５′末端の最初の塩基
を、矢印の右側に示す。挿入断片の両末端に結合してい
るEcoR Iリンカー（GGAATTCC）は、配列の一部として示
していない。CSタンパクの推定されたアミノ酸配列を、
ヌクレオチド配列の下に示す。P.ノウレシのCSタンパク
に相同のタンパク領域を、領域ＩおよびIIと記した。反
復単位に下線を敷き、変異したアミノ酸を線で囲った。
配列中のアンバー末端コドンに星印を付した。また、第
３図には，最もよくみられる反復アミノ酸配列の伸長し
ている長さを含む合成ペプチドが調製され、Y1089中で
増殖しているλmPf1の溶解物に対する、2F1.1の結合を
阻害するために利用された。データは、３回の平均±SE
として表わされている。試験に用いられた合成配列は、
Asn−Pro−Asn−Ala Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
Ala Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
Ala−Asn−Pro−Asn−Ala および10分子のアミノ酸からなる無関係のペプチド であった。
また、第４図において、領域Ｉは、P.ファルシパルム
のタンパクの反復部分にアミノ酸２分子に付いて終わっ
ている。P.ノウレシにおいては、この領域の最後の３分
子のアミノ酸は、タンパクの反復配列部分の一部であ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、制限酵素切断図およびクローンλmPf1の塩基
配列決定における手法を示す図、第２図はP.ファルシパ
ルムのCSタンパクの遺伝子に対するヌクレオチド配列を
示す図、第３図は、最もよくみられる反復アミノ酸配列
の合成ペプチドによる、抗CSタンパクモノクローナル抗
体（2F1.1）結合の阻害を表わすデータを示すグラフ
図、第４図は、P.ファルシパルムおよびP.ノウレシのCS
タンパク間の相同領域を表わす式を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジヤツキー・エル・ウイリアムス アメリカ合衆国，テキサス州 78234, エフテイー・サム・ヒユーストン，バー クヘツド171 (72)発明者 イモージン・シユナイダー アメリカ合衆国，メリーランド州 20879，ゲイザースバーグ，ケイプハー ト・ドライブ 19046

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単独でまたは担体分子と結合されたときヒ
    トに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応
    し、マラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実
    質的に精製された免疫的に活性な合成ペプチドであっ
    て、該ペプチドが、ａ）Asn−Ｘ−Ｙ−Pro（ＸはAlaま
    たはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされるアミノ
    酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位、ｂ）アミ
    ノ酸配列式Thr−Glu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−T
    hr−Cys−Gly−Asn−Gly（ここで、ＺはSerまたはThr）
    およびｃ）アミノ酸配列式Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys
    −Leu−Lys−Gln−Pro−Ｕ−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここ
    で、ＳはLysまたはAsn、ＴはHisまたはGlu、ＵはGlyま
    たはAsn、ＶはAspまたはGlu、およびＷはAsnまたはGln
    を示す）からなる群より選ばれる少なくとも１つの配列
    を含み、かつ該ペプチドの配列がCSタンパクの全アミノ
    酸配列とは一致しないことを特徴とする免疫的活性ペプ
    チド。
  2. 【請求項２】前記ペプチドがAsn−Ｘ−Ｙ−Pro（ＸはAl
    aまたはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされるアミ
    ノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
  3. 【請求項３】前記繰返し単位が前記ペプチドの少なくと
    も10％を構成する特許請求の範囲第２項記載のペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】前記ペプチドが前記配列の1000回以下の繰
    返し単位を含む特許請求の範囲第３項記載のペプチド。
  5. 【請求項５】前記繰返し単位が前記ペプチドの少なくと
    も40％を構成する特許請求の範囲第４項記載のペプチ
    ド。
  6. 【請求項６】前記ペプチドが前記配列の50ないし1000回
    の繰返し単位を含む特許請求の範囲第２項記載のペプチ
    ド。
  7. 【請求項７】前記ペプチドがアミノ酸配列Ａ−Ｂ−Ａ−
    Ｂ−Ａ−Ｂ−（Ａ）15−Ｂ−（Ａ）20（ＡはAsn−Ala−
    Asn−Proを示し、およびＢはAsn−Val−Asp−Proを示
    す）を含む特許請求の範囲第５項または第６項記載のペ
    プチド。
  8. 【請求項８】前記アミノ酸配列に、アミノ酸配列式Thr
    −Glu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly
    −Asn−Gly（ここで、ＺはSerまたはThr）を含むペプチ
    ド断片が続き、またはアミノ酸配列式Lys−Pro−Ｓ−Ｔ
    −Ｓ−Lys−Leu−Lys−Gln−Pro−Ｕ−Ｖ−Gly−Ｗ−Pr
    o（ここでＳはLysまたはAsn、ＴはHisまたGlu、ＵはGly
    またはAsn、ＶはAspまたはGlu、およびＷはAsnまたはGl
    nを示す）を含むペプチド断片が先行する特許請求の範
    囲第７項記載のペプチド。
  9. 【請求項９】前記ペプチドが、アミノ酸配列Lys−Pro−
    Lys−His−Lys−Lys−Leu−Lys−Gln−Pro−Gly−Asp−
    Gly−Asn−Pro−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Val−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val−Asp−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Val−Asp−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Val−Asp−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−
    Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−Ala−Asn−Pro−Asn−
    Lys−Asn−Asn−Gln−Gly−Asn−Gly−Gln−Gly−His−
    Asn−Met−Pro−Asn−Asp−Pro−Asn−Arg−Asn−Val−
    Asp−Glu−Asn−Ala−Asn−Ala−Asn−Asn−Ala−Val−
    Lys−Asn−Asn−Asn−Asn−Glu−Glu−Pro−Ser−Asp−
    Lys−His−Ile−Glu−Gln−Tyr−Leu−Lys−Lys−Ile−
    Lys−Asn−Ser−Ile−Ser−Thr−Glu−Trp−Ser−Pro−
    Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Glyを含む特許請
    求の範囲第８項記載のペプチド。
  10. 【請求項１０】前記ペプチドが、アミノ酸配列式Thr−G
    lu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−As
    n−Gly（ここで、ＺはSerまたはThr）、またはアミノ酸
    配列式Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys−Leu−Lys−Gln−Pr
    o−Ｕ−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここで、ＳはLysまたはAs
    n、ＴはHisまたはGlu、ＵはGlyまたはAsn、ＶはAspまた
    はGlu、およびＷはAsnまたはGlnを示す）を含むことを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
  11. 【請求項１１】前記アミノ酸配列が、前記ペプチドの少
    なくとも10％を構成する特許請求の範囲第10項記載のペ
    プチド。
  12. 【請求項１２】前記ペプチドが、前記２つのアミノ酸配
    列の一方かまたは両方から実質的になる特許請求の範囲
    第11項記載のペプチド。
  13. 【請求項１３】前記アミノ酸配列式が、Thr−Glu−Trp
    −Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−Asn−Gly
    である特許請求の範囲第11項記載のペプチド。
  14. 【請求項１４】ＺがSerである特許請求の範囲第13項記
    載のペプチド。
  15. 【請求項１５】単独でまたは担体分子と結合されたとき
    ヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反
    応し、マラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す
    実質的に精製された免疫的に活性な合成ペプチドであっ
    て、該ペプチドが、ａ）Asn−Ｘ−Ｙ−Pro（ＸはAlaま
    たはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされるアミノ
    酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位、ｂ）アミ
    ノ酸配列式Thr−Glu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−T
    hr−Cys−Gly−Asn−Gly（ここで、ＺはSerまたはThr）
    およびｃ）アミノ酸配列式Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys
    −Leu−Lys−Gln−Pro−Ｕ−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここ
    で、ＳはLysまたはAsn、ＴはHisまたはGlu、ＵはGlyま
    たはAsn、ＶはAspまたはGlu、およびＷはAsnまたはGln
    を示す）からなる群より選ばれる少なくとも１つの配列
    を含む免疫的活性ペプチドと、これを結合した免疫原性
    を有する担体とからなる抗マラリア免疫原性刺激剤。
  16. 【請求項１６】前記ペプチドがAsn−Ｘ−Ｙ−Pro（Ｘは
    AlaまたはValおよびＹはAsnまたはAsp）で表わされるア
    ミノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を含む
    ことを特徴とする特許請求の範囲第15項記載の免疫原性
    刺激剤。
  17. 【請求項１７】前記担体が、該担体のカルボキシル基ま
    たはアミノ基と前記ペプチドのアミノ基またはカルボキ
    シル基との間で形成されるアミド結合により、または該
    担体のカルボキシル基または水酸基と前記ペプチドの水
    酸基またはカルボキシル基間で形成されるエステル結合
    により、前記ペプチドに結合されている特許請求の範囲
    第16項記載の刺激剤。
  18. 【請求項１８】前記担体が、タンパクまたは多糖である
    特許請求の範囲第16項記載の刺激剤。
  19. 【請求項１９】前記担体の分子量が、10000ないし10000
    00である特許請求の範囲第16項記載の刺激剤。
  20. 【請求項２０】前記担体が、１ないし100000分子の前記
    ペプチドを結合している特許請求の範囲第18項記載の刺
    激剤。
  21. 【請求項２１】前記担体が両性タンパクであり、前記ペ
    プチドが該タンパクの親水性部分に結合している特許請
    求の範囲第18項記載の刺激剤。
  22. 【請求項２２】前記担体が、細菌細胞またはリポソーム
    である特許請求の範囲第16項記載の刺激剤。
  23. 【請求項２３】前記担体が、105ないし1015分子の前記
    ペプチドを結合している特許請求の範囲第22項記載の刺
    激剤。
  24. 【請求項２４】前記ペプチドが、アミノ酸配列式Thr−G
    lu−Trp−Ｚ−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−As
    n−Gly（ここで、ＺはSerまたはThr）、またはアミノ酸
    配列式Lys−Pro−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Lys−Leu−Lys−Gln−Pr
    o−Ｕ−Ｖ−Gly−Ｗ−Pro（ここで、ＳはLysまたはAs
    n、ＴはHisまたはGlu、ＵはGlyまたはAsn、ＶはAspまた
    はGlu、およびＷはAsnまたはGlnを示す）を含むことを
    特徴とする特許請求の範囲第15項記載の免疫原性刺激
    剤。
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