JPH0317099A - マラリアワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はプラスモジウム（　Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｌＴ
ｌ）属の寄生虫による感染に拮抗するワクチン、さらに
詳しくは、その中央の繰返しドメインの側面にあるプラ
スモジウム表面蛋白の領域からの免疫原決定因子を含有
し、該繰返しドメインからの繰返し免疫原決定因子の全
てより少ない因子を含有するポリペプチドであってマラ
リア寄生虫による感染を抑制する治療剤として有用なポ
リペプチド；これらのポリペプチドを精製する方法；こ
れらのポリペプチドをコードする発現ベクター；および
マラリア感染からヒトを治療する方法に関する。

（従来の技術および課題） マラリアは重度の広範な疾患であってそれに関する長午
の多大な努力にもかかわらず、ワクチンが開発されてい
ない。例えば、サイエンス（　Ｓ　ｃ　ｉｅｎｃｅ）　
，第２２６巻，６７９頁（１９８４午ｌ１月９日）参照
。実験的に、ヒトを包含する補乳動物が、照射スポロゾ
イトでのワクチン接種によって、マラリア、すなわちプ
ラスモジウム病因剤による感染から保護されている。ク
リドら（Ｃ　ｌｙｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）ｎアメリカン・
ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・アンド・
ハイジーン（Ａｍ．Ｊ　．　Ｔ　ｒｏｐ．Ｍｅｄ．　Ｈ
　ｙｇ．）ｎ第２４巻，３９７頁（ｌ９７５）８よびリ
ークマンら（Ｒ　ｉｅｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．）ｎプ
ル・ダブリュ・エッチ・オー（Ｂｕｌｌ，ＷＨＯ）ｎ第
５７巻（Ｓｕｐｐ．　１）ｎ　２　６　１頁（１９７９
）ｎヨシダら（Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．）ｎサイ
エンス，第２０７巻．７１頁（１９８０）は、かかる保
護が、少なくとも、スポロゾイト表面の蛋白、サーカム
スボロゾイト（ＣＳ）蛋白に拮抗する抗体によって部分
的に媒介され；ＣＳ蛋白に対して出現したモノクローナ
ル抗体がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける感染性を中和し、ｉ
ｎ　ｖｉｖｏにて動物を保護することを報告している。

該ＣＳ蛋白は種内にて大いに展開的に保護されるが、種
を越えて全く異なることは明らかである。

４種のプラスモジウムが、ヒトに感染することが知られ
ている。これらはピー、ファルシパラム（　Ｐ　．ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）、ビー●ビバックス（　Ｐ　．ｖｉ
ｖａｘ）、ビー・オベール（　Ｐ　．ｏｖａｌｅ）およ
びピー・マラリアエ（　Ｐ　．ｍａｌａｒｉａｅ）であ
り、後者の２種は非常に低頻度ｌ；て発生ずる。科学的
に興味のある他の種はビー・バージエイ（　Ｐ　．ｂｅ
ｒｇｈｅｉ）およびビー・クノウレシ（　Ｐ　．ｋｎｏ
ｖｌｅｓｉ）であり、これらの種のホストは、各々、誓
歯動物およびサルである。

ケンプら（Ｋｅ＋＋＋ｐ　ｅｔ　８１．）は、Ｗ０．８
　４−０　２９１７−Ａにおいて、イー・コリにおける
ビー・７アルシバラムｃＤＮＡのクローニングおよび発
現を開示している。

デイムら（Ｄａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．．）は、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻，５９３頁（１９８４
）において、イー・コロにおけるピー・７アルシパラム
のＣＳ蛋白のクローニングおよび発現を報告している。

該蛋白は分子量約４４０００で約４１２個のアミノ酸か
らなると記載されている。それはテトラベプチドの４１
のタンデム繰返し、ＣＳ蛋白に対して出現したモノクロ
ーナル抗体に結合した繰返し領域から誘導された合或７
−、１１−および１５一残基ペプチドからなる。

ピー、ファルシパラムのＣＳ蛋白の繰返しテトラペブチ
ドに基づく抗スポロゾイトワクチンは、個々においては
ほとんど免疫性を付与せず、その免疫性は短期間であっ
て戊功していない。サイエンス，１土上：　５２２　（
１　９８８）。従って、マラリア寄生虫に対する効果的
なワクチンについての要求は、なお満たされていないま
まである。

（課題を解決するだめの手段） 本発明は、一般的に、プラスモジウム表面蛋白の中央の
繰返しドメインの側面にある第１の領域からの１以上の
免疫原決定因子と、該繰返しドメインの側面にある第２
の領域からの１以上の免疫原決定因子とを含有し、かつ
、中央の繰返しドメインからの繰返し免疫原決定因子の
全てより少ない因子を含有するか、全く欠くポリペプチ
ドに関する。

一具体例において、本発明は、プラスモジウム表面蛋白
繰返しドメインの少なくとも１つはあるが、全てより少
ない繰返し免疫原決定因子と、該繰返しドメインの側面
にあるプラスモジウム表面蛋白の領域からの１以上の免
疫原決定因子とを含有するりペプチドに関する。

本発明のもう一つの具体例においては、該ポリペプチド
は、実質的に、中央の繰返しドメインの側面にある領域
からのすべての免疫原決定因子を含有し、中央の繰返し
ドメインからの免疫原決定因子を欠いている。また、さ
らにはフランキング領域からの実質的に全ての免疫原決
定因子からなるポリペプチドは、中央の繰返しドメイン
からの少なくとも１つはあるが、全てより少ない免疫原
決定因子を含有する。

本発明のポリペプチドにおいて有用な免疫原決定因子は
、好ましくは、プラスモジウム・７アルシパラム、ビー
・ピバックス、ピー・マラリアエおよびビー・オベール
の表面蛋白にて存するものを包含する。

本発明のさらに別の具体例において、該ポリペプチドは
、遺伝学的に、キャリア蛋白、好ましくは、ポリペプチ
ドの発現を強化するか、またはポリペプチドの免疫原性
を強化する、またはその両？であるキャリア蛋白に融合
している。

好ましい具体例において、本発明のポリペプチドは、免
疫原キャリア蛋白、例えば、ＣＳ蛋白の第２のフランキ
ング領域に融合しているプラスモジウム・サーカムスポ
ロドイト（Ｃ　Ｓ）蛋白の第１のフランキング領域に、
合戊リンカーを介して融合したインフルエンザウイルス
非構造蛋白ｌの８１Ｎ−末端アミノ酸（ＮＳＩ■）から
なる。

かかるポリペプチドは、さらに、ＣＳ蛋白中央の繰返し
ドメインから１以上であるが、全てより少ない免疫原決
定因子、例えば、 アミノ酸配列：　（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）［ＸはＡ
ｌａまたはＶ８１，　ＹはＡｓｎまたはＡｓｐを意味す
る］ で示されるテトラベプチドからなる繰返しドメインから
の免疫原決定因子を含有していてもよい。

中央の繰返しドメインからの免疫原決定因子は、例えば
、キャリア蛋白と第１のフランキング領域の間に、また
は第１のフランキング領域と第２のフランキング領域の
間に位置してもよい。

もう一つの態様において、本発明は、該ポリペプチドを
コードする発現ベクター、該ポリペプチドからなるワク
チン、該ポリペプチドを精製する方法および該ポリペプ
チドを用いてマラリアによる感染からヒトを治療する方
法を包含する。

本発明の他の態様および利点を、以下の詳細な記載に開
示する。

図面の簡単な記載 第１図（ａ）および第１図（ｂ）は、２つの群のＣ３Ｈ
／ＨＥＮマウス、すなわち、ＮＳｌｍ＋ＲＬｆΔ９で免
疫化した１群とＲ　３　２　ｔ６Ｌｘｚで免疫化した他
の群のＣ３Ｈ／ＨＥＮマウスの抗体応答を説明するグラ
フ形のＥＬＩＳＡデータを示す。

第２図（ａ）および第２図（ｂ）は、２つの群のＣ　５
　７　Ｂ　Ｌ／６マウス、すなわち、ＮＳ１ａ＋−ＲＬ
ｆΔ９で免疫化した１詳とＲ　３　２　ｔｅｔ３ｚで免
疫化した他の群のＣ５７ＢＬ／６マウスの抗体応答を説
明するグラ７形のＥＬ　Ｉ　ＳＡデータを示す。

第３図（ａ）および第３図（ｂ）は、２つの群のＢ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス、すなわち、ＮＳＩＩ，ＲＬｆΔ９
で免疫化した１群とＲ　３　２　ｔｅｔ，，で免疫化し
た他の群のＢＡＬＢ／Ｃマウスの抗体応答を説明するグ
ラ７形のＥＬＩＳＡデータを示す。

好ましい具体例の記載 原生動物のマラリア寄生虫であるプラスモジウムは、そ
の外部細胞表面に存する多くの発生期特異的蛋白を有す
る。これらの表面蛋白は、共通して３つの領域、すなわ
ち、中央の繰返しエビトープ領域またはドメインと、対
をなすフランキング領域を有することが判明した。該対
の第１のフランキング領域は中央の繰返しドメインのカ
ルポキシー末端に融合し、該対の第２のフランキング領
域は該中央の繰返しドメインのアミノ末端に融合してい
る。

本発明のポリペプチドは、第１および第２のフランキン
グ領域の間の中央の繰返しドメインの全てより少ない免
疫原決定因子を含有するか、または全く有さないプラス
モジウム表面蛋白の一部から誘導され、マラリア寄生虫
による感染を抑制するだめの治療剤としての用途にて十
分な量を発現する。

換言すれば、本発明のポリペプチドは、野生型の繰返し
領域にて存在するよりも、第１と第２のフランキング領
域の間に、より少数の縦列繰返しを有している。すなわ
ち、ピー・７アルシバラムによる感染からヒトを保護す
るポリペプチドにおいては、該ポリペプチドは、無傷の
第１のフランキング領域、すなわち、ビー・ファルシパ
ラム・サーカムスポロゾイト蛋白（ＰｆＣＳＰ）のＮ一
末端フランキング領域と、無傷の第２のフランキング領
域、すなわち、ＰｆＣＳＰからのＣ一末端フランキング
領域と、第１と第２のフランキング領域の間にて、ｐｒ
ｃｓｐからの４１以下の縦列繰返し、すなわち、４１以
下の式： Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ ［式中、ＸはＡｌａまたはＶａｌ、ＹはＡｓｐまたはＡ
ｓｎを意味する１ で示されるテトラペブチドとからなっていてもよい。

野生型のプラスモジウム表面蛋白において、該繰返し領
域は免疫優性である。本発明のポリペプチドにおいて、
縦列繰返しまたは繰返し単位の数および位置は、第１８
よび第２のフランキング領域に対する免疫応答をマスキ
ングしないように選択される。好ましくは、本発明のポ
リペプチドにおける繰返し数は、野生型蛋白にて存在す
る繰返し数のわずか半分である。さらに好ましくは、本
発明のポリペプチドにおける繰返し数は、野生型蛋白に
て存在する繰返し数のわずか約４分の１である。

４種のプラスモジウムがヒトに感染すると知られており
、最も流行しているのはピー・７アルシパラム、つづい
てビー・ビバックスであり、より低度にてピー・マラリ
アエおよびビー・オベールである。

プラスモジウム・ファルシパラム・スボロゾイト期サー
カムスボロゾイト（Ｃ　Ｓ）蛋白の中央の繰返しドメイ
ンは、４１個の縦列の繰返しテトラペプチドからなり、
そのうち３１個はアミノ酸配列（アスパラギン（Ａｓｎ
）一アラニン（Ａｌａ）−Ａｓｎ−プロリン（　Ｐ　ｒ
ｏ））を有し、そのうち４個は配列（Ａｓｎ−バリン（
Ｖａｌ）一アスパルテート（　Ａ　ｓｐ）−　Ｐ　ｒｏ
）を有する。該中央の繰返しドメインの両側は、領域工
および領域■を含む、いわゆるフランキング領域であり
、該ｃｓｉ白の２つの領域は、ビー・クノウレシ（　Ｐ
　．ｋｎｏｖｌｅｓｉ）　　（サルのマラリア）ＣＳ蛋
白の対応する領域のアミノ酸配列とほとんど同一である
（デイムら（Ｄａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．）ｎサイエンス．
２２５　：　５９３　（１９８４））。

ビー・７アルシバラム血液期（ｂｌｏｏｄ　ｓｔａｇｅ
）の種々の表面蛋白もまた、繰返しエピトープ、例えば
、Ｓ抗１［　（　Ｐ　ｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ−Ａ　
Ｉａ−　Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）　　；　ＲＥＳＡ抗原（Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａ１〜Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ）　　；１１ＲＡ抗原（Ｖａ１〜Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｇ　ｌｕ−Ｐ　ｒｏ）；およびＰＦ−１　１抗
Ｋ　（　Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｖａ１〜Ｖａ１〜Ｇ　ｌ
ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｖ８１−Ｖａ１〜Ｐ　ｒｏ）を有してい
る。

ピー・ビバックスのサーカムスポロゾイト蛋白は繰返し
エビトープ（Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）を有し、ピー
・マラリアエのサーカムスボロゾイト蛋白は繰返しエビ
トーゾ（Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｙ）および
（Ａｓｎ−ＡｌａＡ　ｌａ−Ｇ　ｌｙ）を有する。

本発明のポリペプチドは、プラスモジウム表面蛋白の中
央の繰返しドメインの側面にある第１の領域からの１以
上の免疫原決定因子と、該繰返しドメインの側面にある
第２の領域からのｌ以上の免疫原決定因子とを含有し、
かつ、該中央の繰返しドメインからの繰返し免疫原決定
因子の全てより少ない因子を含有するか、全く欠いてい
る。

免疫原決定因子は、Ｂ細胞またはＴ細胞応答を誘発する
アミノ酸配列である。免疫原決定因子は、一般に、少な
くとも６個のアミノ酸からなる。蛋白内の免疫原決定因
子の正確な同定は、モノクローナル抗体マッピングおよ
び／またはアミノ酸の欠失、その後の活性検定を包含す
る標準方法により行なうことができる。好ましくは、本
発明のポリペプチドは、第１および第２のフランキング
領域の各々から少なくとも約ｌ５個のアミノ酸、さらに
好ましくは、少なくとも約３０個、最も好ましくはシグ
ナル配列を減じた無傷の第１および第２のフランキング
領域からなる。

一つの具体例において、本発明のポリペプチドは、プラ
スモジウム表面蛋白の中央の繰返しドメインからの繰返
し免疫原決定因子のうち、少なくとも１個はあるが、全
てより少ない免疫原決定因子と、該繰返しドメインの側
面にある表面蛋白の領域からの１以上の免疫原決定因子
を含有する。

もう一つの具体例において、本発明のポリペプチドは、
中央の繰返しドメインの側面にある領域からの実質的に
すべての免疫原決定因子を含有し、中央の繰返しドメイ
ンからの免疫原決定因子を欠いているか、または、中央
の繰返しドメインからの繰返し免疫原決定因子のうち、
少なくとも１個はあるが、全てより少ない免疫原決定因
子を含有する。「実質的にすべて」とは、実質的に、シ
グナル配列を減じた無傷の第１および第２のフランキン
グ領域を用いることを意味し、わずか約２０個のアミノ
酸を各領域から欠いていることが好ましく、シグナル配
列を減じた無傷の第１および第２のフランキング領域を
用いることがさらに好ましい。

好ましくは、本発明のポリペプチドはハイブリッドポリ
ペプチド、すなわち、表面蛋白の一部とキャリア蛋白の
間の遺伝的融合からなる蛋白である。

中央の繰返しドメインを構戊する繰返しテトラベブチド
の全部よりも少ないか、または欠いているプラスモジウ
ム・７アルシパラム・サーカムスポロゾイト（ＣＳ）蛋
白の一部に遺伝学的に融合したキャリア蛋白からなるハ
イブリッドボリペブチドがより好ましい。

キャリア蛋白がポリペプチドの免疫原性を強化するだけ
でなく、形質転換体によるポリペプチドの発現を強化す
るハイブリッドポリペプチドであることが特に好ましい
。かかるキャリア蛋白の他の望ましい特性として、ポリ
ペプチドの精製または処方強化が挙げられる。かかるキ
ャリア蛋白の例は、ＮＳｌ。（インフルエンザウイルス
（Ａ／ＰＲ／８／３４）非構造蛋白ｌの８１Ｎ−末端ア
ミノ酸）（バエツら（Ｂａｅｚ　８１　ａｌ．）ｎヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
ｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）ｎ　８　：　５８４５　（１
９８０））；Ｒ３２（［（Ａｓｎ−Ａ　ｌａ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ）＋ａ−（Ａｓｎ−Ｖ８１−ＡｓｐＰｒｏ）］！
）　（ヤングら（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）ｎサイエ
ンス．２２８　：９５８　（１９８５））；およびｇａ
ｌＫを包含する。

本発明のポリペプチドの個々の具体型は：ＮＳｌａ＋　
　ＲＬｆΔ９，インフルエンザウイルス非構造蛋白１の
８１Ｎ一末端アミノ酸（ＮＳ１ａ＋）と、シグナル配列
（１　８Ｎ一末端アミノ酸）を減じたビー・ファルシパ
ラムＣＳ蛋白の領域Ｉ含有のフランキング領域およびそ
の最初の９Ｎ−末端アミノ酸を減じた領域■含有のフラ
ンキング領域（ＲＬｆΔ９）とからなる融合ポリペプチ
ド。

Ｎ’Ｓ１ｇ．のＲＬｆΔ９への融合は、−Ａｓｐ−Ｈｉ
ｓＭｅｔ−Ｌａｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−をコードする合或
ＤＮＡリンカー配列を介して促進される； ＮＳ　１ａ＋　　ＲＬｆＡｕＬｈ，ＮＳ　ｌ８１と、シ
グナル配列を減じたピー、ファルシパラムＣＳ蛋白の領
域■含有のフランキング領域および無傷の領域■含有の
フランキング領域（ＲＬｆＡｕｔｈ）とからなる融合ポ
リペプチド： ？Ｓｌ８１一ぐＡｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）ｎ−　Ｒ　Ｌ
ｆＡｕｔｈ．ＮＳｌａ＋と、ＲＬｆＡｕｔ．ｈと、（Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）とからなり、ＸがＡｌａまたは
ＶａｌおよびＹがＡｓｎまたはＡｓｐであり、ｎが１以
上であって１００以下、好ましくは５０以下の整数であ
り、さらには該（　Ａ　ｓｎ−Ｘ　−Ｙ　−　Ｐ　ｒｏ
）がＮＳｌ８１とＲＬｆＡｕｔｈの間に■置する融合ポ
リペプチド；およびＮ　Ｓ　ｌ　ｓｒＲ　ＬｆＡｕｔｈ
＋　（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）ｎ，ＮＳｌａ、と、Ｒ
ＬｆＡｕｔｈと、（Ａ１９ｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）とから
なり、ＸおよびＹが前記と同じであって、ｎが＜４１で
あり、さらには（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）がピー・フ
ァルシパラムＣＳ蛋白の領域Ｉ含有のフランキング領域
と領域■含有のフランキング領域の間、すなわち、先に
中央の繰返しドメインにより占有されている領域に位置
する融合ポリペプチドを包含する。

しかしながら、かかるポリペプチド類は例示にすぎない
。ここに挙げた開示に基づき、当業者であれば、本発明
の範囲内にある他のポリペプチド、例えば、ピー・ファ
ルシパラム以外の種々のマラリア寄生虫のサーカムスボ
ロゾイト蛋白を含む、表面蛋白からの配列からなるポリ
ペプチド、該表面蛋白からより多くのまたはより少ない
アミノ酸からなるポリペプチド、化学的に修飾されてい
るポリペプチド、および他のもしくは付加アミノ酸また
は蛋白配列に融合するポリペプチドをいかにして構築し
、試験するか解るであろう。かかるポリペプチドは、遺
伝工学および／または蛋白合戊の標準技法により容易に
構築され、実質的に以下の記載に従って動物実験にて試
験することができる。例えば、本発明の蛋白は、欧州特
許出願ＥＰ２７８９４０号に記載のハイブリッドＨＢｓ
Ａｇ粒子を形戊しうる融合蛋白において、Ｂ型肝炎ウィ
ルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に融合した中央の繰返し
ドメインを欠いている実質的に無傷のサーカムスポロゾ
イト蛋白のような表面蛋白のフランキング領域からのア
ミノ酸配列からなっていてもよい。

表面蛋白フランキング領域、テトラペプチド、合戊Ｄ　
Ｎ　Ａリンカー配列およびキャリア蛋白についての遺伝
的コーディング配列は、当業者であれば公知技法を用い
ることによって容易に得ることができる。これらは、好
ましくは、メッセンジャーＲＮＡの逆転写による、また
はゲノムＤＮＡからの無傷の遺伝子の直接クローニング
による合戊を包含する。ピー・ファルシパラム・メッセ
ンジャーＲＮＡの逆転写法が、エリスら（Ｅｌｌｉｓ　
　ｅｔ８１．）ｎネイチャー（Ｎ８１ｕｒｅ）ｎ　　３
　０　２　：　５　３　６　（１９６３）に記載されて
いる。ピー・７アルシパラム・ゲノムＤＮＡからの無傷
の遺伝子の直接クロニング法が、デイムら（前掲）にお
いて記載されている。繰返し単位含有ポリペプチドのク
ローニングおよび発現が、特許出願番号第０　７／２　
５６２２９号に記載されている。

プラスモジウムＤＮＡの全部または一部をクローンした
場合、表面蛋白の全部または一部をコードするそのフラ
グメントを公知技法により製造することができる。

ＤＮＡを合戊する方法はよく知られており、商業上利用
できるＤＮＡシンセサイザーを用いて実施してもよい。

ポリペプチドのコーディング配列をイー・コリ発現ベク
ターに挿入してもよく、そのうち多くは公知であり、容
易に利用することができる。本発明をイー・コリを用い
て実施するにおいて、本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列は、イー・コリにおける形質転換用のＤＮ
Ａベクター内の調節因子に機能的に結合する。かかる調
節因子からなる多数のダラム陰性菌発現ベクターが利用
可能である。該調節因子は、ＲＮＡボリメラーゼ結合お
よび転写をもたらすプロモーターからなる。

調節可能な、すなわち、誘発可能なまたは抑制解除しう
るプロモーターが好ましい。種々の有用なプロモーター
が、イー・コリにおける異種ポリペプチドの発現にて利
用可能である。これらは、ｔｒｐプロモーターおよびＡ
ＰＬプロモーターを包含する（例えば、米国特許第４５
７８３５５号およびコート二一ら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　
８１　８１．）ｎネイチャー？１３：１４９　（１９８
５））。以下においてさらに詳細に記載されているよう
に、本発明のポリペプチドをコードするコーディング配
列は、イー・コリ発現ベクターｐＭＧ−１によって、特
に良好に発現されることが見いだされた。ＮＳＩ■以外
のキャリア蛋白、例えば、Ｒ３２およびｇａｌＫをコー
ドするｐＭＧ−Ｉｍｌ！導体もまた有利に用いることが
できる。

本発明をストレブトミセス（　Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）にて実施するにおいて、本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡコーディング配列は、ストレプトミセ
スの形質転換用のＤＮＡベクター内の調節因子に機能的
に結合する。該調節因子は、ＲＮＡポリメラーゼ結合お
よび転写をもたらすプロモーターからなる。調節可能な
、すなわち、誘発可能なまたは抑制解除しうるプロモー
ターが好ましい。

種々の有用なプロモーターが、ストレブトミセスの異響
ポリペプチドの発現にて利用可能である。

例えば、ストレプトミセス・ガラクトース・オペロンの
ガラクトースー誘発プロモーター（ホーンワルドら（Ｆ
ｏｒｎｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ．）ｎプロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス
＠　ユ−＠１ス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎ８１ｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）ｎ８土：２１３０　（１９８７））
、エス・りヴイダンス（　Ｓ　．　ｌｉｖｉｄａｎｓ）
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（エックハードら（Ｅｃｋ
ｈａｒｄｔ　ｅｔ　８１．）ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー，１６９：４２４９　（１９８７）；ブロウ
ナーら（　Ｂ　ｒａｗｎｅｒｅｔ　ａｌ．）ｎ米国特許
第４７１７６６６号）およびエス・ロンギスポラス（Ｓ
．ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）　トリブシンインヒビター
遺伝子（欧州特許出願第８７３０７２６０．７）の構戊
プロモーター、またはエム−エチノスボルサ（Ｍ　．ｅ
ｃｈｉｎｏｓｐｏｒｓａ）にて報告されているような時
間的調節プロモーター（バウムら（Ｂａｕｍ　ｅｔ　ａ
ｌ．）ｎジャーナル・オブ・バタテリオロジー，１７０
：７１　（１９８８））が挙げられる。ストレプトミセ
スにおける転写終止領域は、各ストレプトミセス遺伝子
の３′末端、例えば、ストレブトミセスガラクトースオ
ペロンの末端での終止シグナルから誘導されるか、また
はエス・フラジアエ（　Ｓ　．　ｆｒａｄｉａｅ）ネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の末端でみも
れる（トンプソンおよびグレイ（　Ｔ　ｈｏｍｐｓｏｎ
およびＧ　ｒａｙ）　，ブロシーデインダス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・ユー・エ
ス・エー．ＳＯ：５　１　９０　（１　９８３）　）。

ストレプトミセスの蛋白エクスボート配列は、エス・り
ヴイダンスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、エス・りヴイ
ダンスＬＥＰ−１０遺伝子（欧州特許出願第８７３０７
２６０．７）およびエス・ロンギスボラス・トリブシン
・インヒビター遺伝子から単離されるものを包含する。

本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、遺伝的選
択マーカー系からなるラージＤＮＡ分子に組み入れる。

該選択マーカー系は、マーカー遺伝子が形質転換細胞に
選択可能な新たな表現型を付与する多くの公知マーカー
系のいずれかとすることができる。例えば、チオストレ
ブトン耐性リボソームメチラーゼ（ｔｈｉｏｓｔｒｓｐ
ｔｏｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｍ
ｅｔｈｙｌａｓｅ）（　｝冫プソンら（　Ｔ　ｈｏｍｐ
ｓｏｎ）　，ジン（Ｇｅｎｅ）ｎ２０：５１　（１９８
２））ｎネオマイシンホスホトランス７エラーゼ（ｎｅ
ｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
　　（　ｈンプソンら．ｉＩｉＩ掲）およびエリスロマ
イシン（ｅｒｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）耐性リポソームメチ
ラーゼ（トンプソンら，前掲）のようなストレブトミセ
ス薬剤耐性遺伝子が挙げられる。

該ＤＮＡ分子はまた、ｐｌＪ１０１誘導体くキーサーら
（Ｋｅｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）ｎモレキュラー・アン
ド・ジエネラル・ジネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）ｎ１８５：２２３　（１９８２））のよう
なストレブトミセスにおける自律複製用配列またはＳＬ
Ｐ　１誘導ベクター（ビブら（Ｂ　ｉｂｂ　ｅｔ　ａ１
〜）＋モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジネティッ
クス，１８４　：２３０　（１９８１））を有していて
もよい。

該ＤＮＡ分子はまた、遺伝子を増幅させるマーカーを有
していてもよい。ストレプトミセスにおける遺伝子コピ
ー数の増幅に供するかかるマーカーは、スペクチノマイ
シン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）耐性（ホルネマン
ら（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ　ｅｔ　８１−：Ｌ　ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー．１６９：２３６０　（１
９８７））およびアルギニン栄養要求性（アルテンバッ
チナーら（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ　８１　ａｌ．）
ｎモレキュラー・アンド・ジェ不ラル・ジネティノクス
，１９５：１３４　（１９８４））の遺伝子を包含する
。

本発明を酵母にて実施するにおいて、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡコーディング配列は、酵母の形
質転換用ＤＮＡベクター内の調節因子に機能的に結合す
る。形質転換、クローニングおよび発現系が利用可能で
あるいずれの酵母ホストも用いることができる。代表例
は、ハンセヌラ（　｝ｉ　２１５−ｅｎｕｌａ）、ビチ
ア（　Ｐ　ｉｃｈｉａ）、タルベロミセス（　Ｋ　ｌｕ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）およびサツ力ロミセス（　Ｓ　ａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を包含する。好ましい酵母ホス
トはサツ力ロミセス●セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

調節因子はＲＮＡボリメラーゼ結合および転写をもたら
すプロモーターからなる。調節可能な、すなわち、誘発
可能なまたは抑制解除しうるプロモーターが好ましい。

種々の有用なプロモーターを、酵母における異種ポリペ
プチドの発現に利用しうる。これらは、銅誘発メタロチ
オニン遺伝子（ＣＵＰＩ）プロモーターおよび解糖遺伝
子グリセルアルデヒド＝３　ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ（ＴＤＨ３）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（
ＡＤＨ）の構或プロモーターを包含する。酵母における
転写終止領域は、各酵母遺伝子、例えば、イソ−１−チ
トクロームＣ　（ＣＹＣ　１）用遺伝子のいずれかの３
′末端から誘導される。

本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、遺伝的選
択マーカー系からなるラージＤＮＡ分子に組み入れる。

該選択マーカー系は、マーカー遺伝子が形質転換細胞に
選択可能な新たな表現型を付与するような多くの公知マ
ーカー系のいずれかとすることができる。例えば、ホス
ホーリポシル・アントラニレート・インメラーゼ（ＴＲ
ＰＩ）または才ロチジン−５′−ホスフエート・デカル
ポキシラーゼ（ＵＲＡ３）のような生合或酵素用酵母遣
伝子またはＧ４１８耐性またはベノミル・アントラニレ
ート・インメラーゼ（ＴＲＰＩ）またはベノミル耐性の
ような異種薬剤耐性遺伝子が挙げられる。該ＤＮＡ分子
はまた、酵母２−ミクロンーサークル複製開始点領域の
ような酵母における自律複製配列、またはＡＲＳＩのよ
うな染色体自律複製領域（ＡＲＳ）およびＣＥＮ３のよ
うな酵母動原体（Ｃ　Ｅ　Ｎ）を有していてもよく、ブ
ラスミドの自律複製が可能となる。

さらにまた別の発現系も知られており、容易に利用する
ことできる。例えば、種々の昆虫細胞およびその発現系
を、鱗翅目細胞の異種蛋白発現における用途として、バ
キュロウイルス発現系のような異種蛋白の発現に利用す
ることができる。真核性発現系において発現をもたらす
ことが必要な場合、表面蛋白のカルボキシ末端アンカー
領域を欠失させる必要があるかもしれない。例えば、ア
ミノ９３９２〜４１２、ピー・７アルシバラム力ルボキ
シ末端アンカー領域を含む領域の欠失を必要とするかも
しれない。（米国特許出願番号第Ｏ７／２　８　７　９
　３　４号参照）。

もう一つの典型的な発現系は米国特許出願番号第０　７
／２　２　２　２　０　２号に開示されている系であり
、その開示は、イー・コリのプロモーター配列に機能的
に結合した選択異種遺伝子で形質転換されたサルモネラ
（　Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ）菌株に関し、該形質転
換体は異種遺伝子の産物を構戊的に発現する能力を有す
る。

かかるように発現させたポリペプチドを、その多くが当
業者に周知の標準的蛋白単離技法を用いて産生細胞培養
から単離して精製する。典型的で、有用な精製法は、（
１）細菌細胞を分断し、（２）細胞デブリを清浄化し、
（３）本発明のポリペプチドを浄化細胞エキスにおいて
存在する他のポリペプチドから分離し、および（４）残
存ポリペプチド、炭水化物、核酸、リポ多糖類およびエ
ンドトキシンを包含する残存不純物を除去して最終的に
精製することからなる。

本発明のワクチンにおいて、好ましくは、生理学的ｐＨ
に緩衝させたポリペプチド水溶液を直接用いることがで
きる。また、該ポリペプチドは、多くの公知アジュバン
トのいずれかと混合し、または吸収させることができる
。かかるアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム
、ムラミル・ジペブチドおよびタイルＡ　（Ｑｕｉｔ　
Ａ）のようなサポノンス（　ｓａｐｏｎｏｎｓ　）を包
含する。さらには、該ポリペプチドをリポソームのよう
な極微粒子中ｌこてカプセル化してもよい。さらには、
本発明のポリペプチドを、死菌ポルデテラ（　Ｂ　ｏｒ
ｄｅｔｅｌｌａ．）のような免疫刺激巨大分子または破
傷風トキソイドに接合してもよい。

ワクチン調製法は、一般に、米国、メリーランド州，ボ
ルティモア，ユニバーシティー・パーク・プレス編，ポ
ラーら（Ｖｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）ｎ　ｒワクチン
の新たな傾向および開発Ｊ（１９７８）に記載されてい
る。リポソーム中でのカプセル化は、例えば、７ラート
ン（　Ｆ　ｕｌｌｅｒｔｏｎ）の米国特許第４２３５８
７７号に記載されている。蛋白の巨大分子への接合は、
リハイト（　Ｌ　ｉｋｈｉｔｅ）の米国特許第４３７２
９４５号およびアルマーら（　Ａ　ｒｍｏｒｅｔ　８１
．）の米国特許第４４７４７５７号に開示されている。

クイルＡの使用は、例えば、ダルスルガードら（Ｄａｌ
ｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）ｎアクタ・ベテリナリア
・スカンジナビ力（Ａｃｔａ　Ｖｅｔ．Ｓｃａｎｄ．）
ｎ１８　：　３４９　（１９７７）に開示されている。

各ワクチン中に存するポリペプチドの量は、有意な好ま
しくない副作用を伴うことなく、免疫保護応答を誘発す
る量である。かかる量は用いられる個々のポリペプチド
により変化する。一般的に、各用量は１〜１０００ｐｇ
、好ましくは、ｌＯ〜２００μｇのポリペプチドからな
ると思われる。

個々のワクチンについての最適用量は、患者の抗体価の
観察および他の応答を含む、標準的研究により確認する
ことができる。最初のワクチン接種から、約４週間でブ
ーストを患者Ｉこ投与し、つづいて感染の危険がある期
間中、６ケ月毎に付加ブーストを投与することが好まし
い。

一般的には、筋肉内、皮下内または静脈内投与が好まし
いが、ある場合には、他の経路が有用であるかもしれな
い。例えば、組換え型サルモネラを用いる場合、好まし
い投与経路は経口投与であるかもしれない。

以下の実施例は例示であって、本発明を限定するもので
はない。ＣＳ蛋白コーディング配列は、ジェームス◆ウ
エバー（　Ｊ　ａｍｅｓ　Ｗｅｂｅｒ）ｎウ才ノレター
・リード・アーミイ・インスティテユート・フォアかレ
サーチ（Ｗａｉｔｅｒ　Ｒｅｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅｆｏｒ　Ｒ　ｅｓｅａｒｃｈ）により、ｐＵ
ｃ８、標準イー・コリ・クローニングベクター（例えば
、メリーランド州、ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ）ｎベテスダ・リサーチ・ラボラトリース・
インコーポレイテ４　’７　ド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒ８１ｏｒｉｅｓ，ｒｎ
ｃ．）から入手可能）のＥｃｏＲＩ部位におけるλｍＰ
Ｆｌの２３３７塩基対ＥｃｏＲＩ７ラグメント（デイム
ら（Ｄａｍｅ　ｅｔａｌ．）ｎサイエンス，２２５　：
　５９３　（１　９８４））として供給された。

実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例ｌ ？Ｎｓ１■ＲＬｒΔ９の構築 簡単に要約すれば、ｐＮｓ１■ＲＬｆΔ９の構築は以下
のように行なった。後記の第１のｐＣ　Ｓ　Ｐ、ビー・
７アルシバラム・サーカムスボロゾイト（ＣＳ）蛋白の
最初のｌ８アミノ酸を除き、すべてをコードする１２１
６塩基対フラグメントを有するイー・コリ発現ベクター
を制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩで消化し、末端充填
（クレノー（Ｋ　ｌｅｎｏｗ）フラグメント）シ、制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨｌで消化した。ＣＳ蛋白の
アミノ酸１９（Ｌｅｕ）〜１２３（Ｐｒｏ）をコードす
る得られた３１８塩基対フラグメントを電気溶離法（ｅ
ｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）により回収した。

第２のｐＣＳＰを制限エンドヌクレアーゼＴｔｈｌｌｌ
Ｉで消化し、末端充填し、制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｉ！で消化した。ＣＳ蛋白のアミノｉ！２２　９　７　
（Ｇｌｙ）　−４　１　２　（Ａｓｎ）をコードする得
られた６５５塩基対フラグメントを電気溶離法により回
収した。（この配列は、領域■含有のフランキング領域
の９Ｎ一末端アミノ酸、２８８（Ｐｒｏ）　−２　９　
６　（Ｇｉｎ）を欠いている。）３１８塩基対および６
５５塩基対ＣＳ蛋白遺伝子フラグメントを、予め制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ８よびＳａｌＩで消化した
後記イー・コリ発現ベクターｐｔＪｃｌ８に連結した。

得られたベクターをｐＬＩｃＲＬｆΔ９と称した。

ｐＵＣＲＬｆΔ９を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
で消化し、末端充填し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ
Ｉで消化した。ＣＳ蛋白アミノ酸１９〜１２３および２
９７〜４１２をコードする得られた１０３５塩基対７ラ
グメントを電気溶離法により回収した。

インフルエンザウイルス非構造蛋白ｌのＮ一末端アミノ
酸１　　（Ｍｅｔ）　−８　１　　（Ｍｅｔ）をコード
するＤＮＡフラグメントおよび合＋ｆｆｉＤＮＡリンカ
ー配列を有する後記の発現ベクターｐＭＧ−１を、制限
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し
た。ついで、予めｐ［ＪｃＲＬｆΔ９から単離したｌ０
３５塩基対７ラグメントをｐＭＧ＝１に連結した。得ら
れた発現ベクター、ｐＮ３１ｓｔＲＬｆΔ９は、以下の
配列二 Ｎ　Ｓ　１　８１−Ａ！３ｐ−Ｈ　ｉＳ−Ｍｅｔ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏＣ　Ｓ　ＩＩ−１２３−
Ｃ　Ｓ　２＊ｙ−。２を有する蛋白をコードする。

ｐＮｓ１ａ＋ＲＬｆΔ９の構築を以下に詳説する。

Ａ．ｐＣＳＰの構築 精製したｐＵＣ８クローンｌプラスミドＤＮＡ（４０ｚ
ｌｇ）を、４００μＱの中塩濃度の緩衝液（５０ｍＭｈ
リス、５０ｍＭＮａＣＱ，１ｍＭジチオスレイトール（
ＤＴＴ）およびｌ　Ｏ　ｍＭＭｇｃ　Ｑ，からなる、ｐ
Ｈ７．５）中、３７゜Ｃにて１．５時間、制限エンドヌ
クレアーゼＳ　Ｌｕ　ＩおよびＲｓａｌ（各酵素１００
単位）で消化した。サーカムスポロゾイト（ＣＳ）蛋白
の（ＣＳ蛋白シグナル配列をコードすると考えられてい
る）最初の１８アミノ酸を除いたすべてをコードする、
得られた１２１６塩基対フラグメン１・を、６％ポリア
クリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）での電気泳動法により単
離し、電気溶離法により回収した。

１０μｇの発現ベクターｐＡｓＩ（ＡＴＣＣ３９２６２
、エム・ローゼンバーグ（Ｍ　．　Ｒ　ｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ）の米国特許第４５７８３５５号にてさらに詳しく記
載されている）を、前記の中塩濃度の緩衝液２００μＱ
中、３７°Ｃにて１．５時間、制限エンドヌタレアーゼ
ＢａｍＨ　Ｉ　（２　５単位）で消化した。ついで該切
断プラスミドを、２５℃にて１５分間、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ１ラージ・フラグメント（　Ｌ　ａｒｇｅＦ　ｒ
ａｇｍｅｎｔＸ該ＢａｍＨ１部位を末端充填するため、
２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、７ｍＭＭｇＣＱ２、
６０ｍＭＮａＣＱ，６ｍＭ２一メルカプトエタノールお
よび０．２５ｍＭ各４デオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート中、クレノー７ラグメント５単位）で処理した。

ついで、サーカムスポロゾイト蛋白遺伝子フラグメント
（ｌμｇ）を、ｌ単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇ
ａｓｅ）を加えｔ；リガーゼ緩衝液３０ｌｌＱ（５０ｍ
Ｍトリス、ｌｍＭＤＴＴ％　１　０ｍＭＭｇＣＱ，、１
００μＭｒＡＴＰからなる、ｐＨ７．５）中、４℃にて
１６時間、このベクター１００ｎｇに連結した。

該連結混合物をイー・コリ株ＭＭ２９４ＣＩ＋に形質転
換した。アンビンリン耐性コロー−ｔ−得、ＣＳ遺伝子
フラグメントのｐＡｓｌへの挿入用にスクリーンに付し
た。適当な構築を有するプラスミド（ｐＣＳＰ）を同定
した。

Ｂ．ｐＵＣＲＬｆΔ９の構築 晴裏したｐＣＳＰプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）を、
前記の中塩濃度の緩衝液４００μＱ中、３７０Ｃにて３
時間、制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ（１００単位）
で消化した。その後、該ブラスミドを前記のＤＮＡポリ
メラーゼＩ１ラージ・フラグメントで処理し、Ｆ　ｏｋ
　Ｉ部位を末端充填した。つぎに該ブラスミドを、前記
の中塩濃度の緩衝液４００μα中、３７゜Ｃにて３時間
、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ　Ｉ（ｌ　Ｏ　Ｏ単
位）で消化した。ＣＳ蛋白のアミノ酸１９〜１２３をコ
ードする得られた３１８塩基対７ラグメントを６％ポリ
アクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）における電気泳動法に
より単離し、電気溶離法により回収した。

別のｐｃｓｐｔｏｏμｇ部を、前記の中塩濃度の緩衝液
４００μＱ中、６５℃にて３時間、制限工ンドヌクレア
ーゼＴｔｈｌｌｌ　Ｉ　（　ｌ　Ｏ　Ｏ単位）で消化し
た。その後、該プラスミドを前記のＤＮＡポリメラーゼ
エ、ラージ・フラグメントで処理し、ＴｔｈｌｌｌＩ部
位を充填した。つぎに該プラスミドを、中塩濃度の緩衝
液４００μα中、３７゜Ｃにて３時間、制限エンドヌク
レアーゼＳａｌＩ（１００単位）で消化し、ＣＳ蛋白の
アミノ酸２９７〜４１２をコードする得られた６５５塩
基対フラグメントを６％ポリアクリルアミドゲルにおけ
る電気泳動法により単離し、電気溶離法により回収した
。

ＩＯμｇの発現ベクターｐＵｃＩ８（ヤニシューバー口
冫ら（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）ｎ
ジン，３３：１０３（１９８５））、標準イー・コリ・
クローニングベクター（例えば、メリーランド州、ガイ
ザースバーグ、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース・
インコーボレイティッドから入手可能）を、前記の中塩
濃度の緩衝液２００μＱ中、３７゜Ｃにて２時間、制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（各２０
単位）で消化した。ついで、末端充填した３１８塩基対
ＢａｍＨＩ／ＦｏｋＩフラグメント（ｌμｇ）と末端充
填した６５５塩基対ＴｔｈＮＩＩ／Ｓａｉｌフラグメン
ト（１ｐｇ）を、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた
前記リガーゼ緩衝液３０μＱ中、４゜Ｃにて１６時間、
ｐＵｃｌｇに連結した。

適当な構築を有するブラスミド（ｐＵ　Ｃ　Ｒ　Ｌ　ｆ
Δ９）を同定した。

Ｃ．ｐＭＧ−１の構築 １０μｇの発現ベクターｐＭＧ２７Ｎ−（エム・グロス
ら（Ｍ．Ｇｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．）ｎモレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃ　ａｌｌ
．　Ｂ　ｉｏｌ．）ｎ　５　：１０１５（１９８５））
を、前記の中塩濃度の緩衝液２　０　０　ｐｒｌ中、３
７℃にて３時間、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩｊ
；よびＳ　ａ．ｃ　Ｉ　（各５０単位）で消化した。

インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）非構造
蛋白１（ＮＳＩ）コーディング領域（バエズら（Ｂａｅ
ｚ　ｅｔ　ａｌ．）ｎヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
ｎ　８　：　５　８　４　５（１９８０））を有する発
現ベクターｐＡＰＲ８０１（ヤングら（Ｙｏｕｎｇ　ｅ
ｔ　ａｌ．）ｎプロシーデインダス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシスＵ　Ｓ　Ａ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎ８１ｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ）ｎ　８
　０　：６　１０５（１　９８３））Ｉ　Ｏμｇを、高
塩濃度の緩衝液（５０ｍＭｈリス塩酸、ｌｍＭＤＴＴ，
１０ｍＭＭｇＣＩ２，およびｌ　０　０’ｍＭＮａＣｌ
２，ｐＨ７．５）２　００，ｌ７Ｑ中、３７゜Ｃにて２
時間、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＢａｍＨ
Ｉ（各２０単位）で消化した。ＮＳＩの最初の８１Ｎ＝
末端アミノ酸をコードする得られた２３０塩基対ソラグ
メントを、６％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電
気泳動法により単離し、電気溶離法により回収した。

４０ｎｇの前記ＢａｍＨ　Ｉ　／　Ｓａｃ　Ｉ一切断ｐ
ＭＧ２７−を、２３０塩基対Ｎｅｏ　Ｉ　／　ＢａｍＨ
　Ｉ　Ｎ　Ｓ　１　ｍ＋−コード７ラグメント８０ｎｇ
と、以下の配列：を有する合戊リンカー８０ｎｇと連結
した。

得られたブラスミド、ｐＭＧ−１を、ｐＭＧ２７Ｎ一の
ＢａｍＨＩ部位に連結した配列をコードする？Ｓｌ８１
のＢａｍＨ１部位：合成リンカーのＮｃｏＩ部位に連結
した配列をコードするＮＳｌａ＋のＮｃｏ■：およびｐ
ＭＧ２７Ｎ−のＳａｃＩ部位に連結した合戊リンカーの
Ｓａｃｌ部位で同定した。このベクターは、独特制限部
位を取り入れ、３つの解読フレームのいずれかにおいて
ＤＮＡフラグメン１・の挿入を容易にし、ｃＩ　Ｉリポ
ソーム結合部位のＡＴＧ開始コドンの下流の３つのすべ
ての解読フレームにおけるＴＧＡ終止コドンの挿入をも
たらし、発現した場合、３つのすべての解読フレームか
らＮＳＩ■融合蛋白をもたらす。制限エンドヌクレアー
ゼＮｄｅｌでｐＭＧ−１を消化し、その後に前記のベク
ターを連結することにより、非融合（すなわち、ＮＳｌ
■に融合していない）蛋白の発現が得られる。

Ｄ．ｐＮＳ　ｌ．，ＲＬｆＡ９の構築 発現ベクターｐＵＣＲＬｆ（１　００／７ｇ）を、前記
の高塩濃度の緩衝液４００μＱ中、３７゜Ｃにて３時間
、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ　Ｉ（１　０　０単
位）で消化した。その後、該切断ブラスミドを、前記の
ＤＮＡポリメラーゼ■、ラージ・フラグメントで処理し
、ＢａｍＨＩ部位を末端充填した。つぎに、該ブラスミ
ドを、前記の中塩濃度の緩衝液４００μＱ中、３７゜Ｃ
にて３時間、制限エンドヌクレアーゼＳａｉｌ（２０単
位）で消化した。得られたｌ０３５塩基対フラグメンｌ
・を６％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）での電気
泳動法により単離し、電気溶離法により回収した。

発現ベクターｐＭＧ−１（ＩＱμｇ）を、前記の中塩濃
度の緩衝液４００μＱ中、３７゜Ｃにて３時間、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶおよびＸｈｏｌ（各２５単
位）で消化した。ついで、ｐＵｃＲＩＪからの末端充填
した１０３５塩基対ＢａｍＨ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ（４
００μｇ）フラグメントを、１単位のＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼを加えた前記リガーゼ緩衝液３０μＱ中、４゜Ｃに
て１６時間、このベクター１００ｎｇに連結した。

該連結混合物をイー・コリ株ＭＭ２９４（１＋に形質転
換した。アンビシリン耐性コロニーが得られ、正しく配
向した挿入遺伝子を有するクローン？にスクリーンに付
した。適当な構築を有するブラスミド（ｐＮＳ１ａ＋Ｒ
ＬｆΔ９）を同定し、イー・コリ株ＡＲ　５　８（Ｃ　
Ｉ　ｔｓ８　５　７）に形質転換し、ｐＭＧ−１発現ベ
クターに連結した合戊リンカーから誘導される６アミノ
酸（Ａｓｐ−Ｈ　ｉｓ−ＭｅＬ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ）を介して、インフルエンザ非構造蛋白ｌ１すなわち
、ＮＳＩ。の８１Ｎ一末端アミノ酸に融合した、最初の
１８Ｎ−末端アミノ酸（ＣＳ＋−＋ｓ）、中央の繰返し
ドメインおよび領域■含有のフランキング領域の９Ｎ−
末端アミノ酸（Ｃ　Ｓ　ｚｓｍ−２ｅｍ）を欠いている
サーカムスボロゾイト蛋白遺伝子産物（ＲＬｆΔ９）の
発現について試験した。

ＮＳ　Ｌ■ＲＬｆΔ９は、以下： Ｎ　Ｓ　ｌ　８１−Ａｓｐ−Ｈ　ｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌａｕ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳＩラー＋ｚ３−ｃ　Ｓ
　！１７−４１に示される配列を有する。

（合戊リンカーのＣ宋端からの）ＡｓｐをＲＬｆΔ９（
ＣＳ＋ｓ−＋。一ＣＳ　２！７−４　１）から分離して
いるプロリンは、ｐＣＳＰのＢａｍＨ　Ｉ　／Ｆｏｋｌ
　７ラグメントの充填ＢａｍＨＩ部位のアーチファクト
であ細胞ヲルリアーベルタニ・ブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂ
ｅｒｔａｎｉ　　Ｂｒｏｔｈ）　（Ｌ　Ｂ）中、３２°
０，６５０ｎｍ（Ａ，，。）にて吸光度０　６まで、か
つ温度を４２゜Ｃまで３時間誘溝して３時間増殖させ、
発現プラスミドのＰＬプロモーターの転写、つづいてＮ
Ｓｌｓｌｃｓｉ白誘導体の翻訳金開始させた。細胞をｌ
ｍＱ部サンプリングし、ベレントに付し、溶解緩衝液（
１０ｍＭ｝リス塩酸、ｐＨ７．８、２５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ）グリセロール、２％２−メルカプトエタノール、
２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％プロ
モフエニルブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ　ｂｌｕｅ
）に再懸濁させ、１０５゜Ｃの加熱ブロノクにおいて５
分間インキユベーションした。

蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１．３％アクリルアミド、３
０：０．８のアクリルアミド：ビスアクリルアミド比）
により分離した。蛋白をニトロセルロースに移し、イー
・コリにて産生されたＮＳｌ８１ＲＬｆΔ９蛋白を、領
域■と称されるＣＳ蛋白ドメインと反応するポリタロー
ナル抗体（デイムら、サイｘンス　２２５：５９３（１
　９８４））ならびニＮｓｈ１Ｎ白と反応するポリクロ
ーナル抗体を用いるウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ　Ｂ　ｌｏｔ）分析１こより検出した。イー・コリ産
生ＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９蛋白はまた、ピー・７アルシバ
ラムｃＳ蛋白のテトラペプチド繰返しドメインと関連す
る５モノクローナル抗体と非反応的であることが示され
た。

実施例２ ｐＮ　Ｓ　ｌ　．Ｒ　Ｌ　ｆＡｕｔｈの構築前記のイー
・コリ発現ベ−クタ−ｐｃ　Ｓ　Ｐを、中塩濃度のＩｌ
ｋ衝液中、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ工とＦｏｋ
Ｉで消化した。最初の１８Ｎ−末端アミノ酸を減じた領
域■含有のフランキング領域をコードする得られたＤＮ
Ａフラグメントを電気溶離法により回収した。

第２のｐｃｓｐ部を中塩濃度の緩衝液中、制限エンドヌ
クレアーゼＴｔｈｌｌｌｌおよびＳａｌＩで消化した。

最初の９Ｎ−末端アミノ酸を減じた領域■含有のフラン
キング領域をコードする得られたＤＮＡ７ラグメントを
電気溶離法により回収した。

？記イー・コリ発現ベクターｐＵｃｌ８を、中塩濃度の
緩衝液中、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉで消化した。

ＣＳ′？Ｊｒ白の中央の繰返しドメインのＣ一末端フラ
ンクの領域『を含有する領域の９Ｎ一末端アミノ酸（　
Ｃ　Ｓ　Ｚ■，，．）を回復するため、そのアミノ酸は
制限エンドヌクレアーゼ”ｌｈｌｌｉｌでのｐＣＳＰの
消化において失われたものであるが、ＦｏｋＩ末端およ
びＴｔｈｌｌｌＩ末端を有し、以下の配列ヲ有する合戊
ＤＮＡフラグメントを製造しｌ：。

ＢａｍＨ　Ｉ／ＦｏｋＩフラグメント、ＴｔｈｌｌｌＩ
／Ｓａｉｌフラグメントおよび合戊フラグメントを、Ｂ
ａｍＨ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ消化ｐＵｃ１８に連結した
。

得られたブラスミド、ｐｌＪ　Ｃ　Ｒ　Ｌ　ｆＡｕＬｈ
を、中塩濃度の緩衝液中、制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨ　Ｉで消化し、末端充填し、制限エンドヌクレアー
ゼＳａｌＩで消化した。最初の１８Ｎ−末端アミ？酸お
よび中央の繰返しドメインを欠いているサーカムスポロ
ゾイト蛋白をコードする得られたＤＮＡ７ラグメントを
電気溶離法により回収した。

ついで、単離し、末端充填したＢａｍＨＩ／Ｓ８１Ｉ７
ラグメントを、予め制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ
およびＸｈｏＩで消化された前記ＮＳ　ｉｇコードイー
・コリ発現ベクター、ｐＭＧ−１に連結した。得られた
発現ベクター、ｐＮ　Ｓ　Ｉ■ＲＬｆＡｕＬｈは、以下
の配列を有する蛋白を発現する。

Ｎ　Ｓ　ｌ　ａ，−Ａｓｐ−Ｈ　ｉｓ−Ｍ８１−Ｌｅｕ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ１９−＋。〜Ｇ　Ｉｙ
−Ｃ　Ｓ　２。−。，（領域Ｉおよび領域■を含有する
ＣＳフランキング領域（Ｃ　Ｓ　１９−＋ｚｓおよびＣ
　Ｓ　２８８−４１２）を分離しているグリシンは、合
或ＦｏｋＩ　／Ｔｔｈｌｌｌ　Ｉ　ＤＮＡリンカー配列
のアーチ７アクトである。）Ｎ　Ｓ　１　８１Ｒ　Ｌ　
Ｉ’Ａｕｔｈの完全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
以下に示す： 実施例３ Ｉ）ＮＳ　ｌａ＋ＲＬｆＡｕｔｈ＋（ＮＡＮＰ）２の構
築前記のｐＮ　Ｓ　ｌ　８１　Ｒ　Ｌ　ｆＡｕｔｈを、
中塩濃度の緩衝液（前に記載されており、ＫＣｆｆを含
有している）中、２５゜Ｃにて３時間、制限エンドヌク
レアーゼＳｍａＩで消化した。

以下の配列： を有する合成リンカーを、該Ｓｍａｌ消化のｐＮＳｌｃ
＋ＲＬｆＡｕｔｈに連結しｔ；。該合戊ＤＮＡリンカー
は、（ＮＡＮＰ）ｚ（個々の文字はアミノ酸を示す、Ｎ
はアスパラギン（Ａｓｎ）ｎ　Ａはアラニン（Ａｌａ）
、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ））　、Ｃ　Ｓ蛋白の免疫優性
繰返しドメインのいわゆるコンセンサス配列からなるテ
トラペブチドをコードする。ｐＮ　Ｓ　ｌ＊＋ＲＬｆＡ
ｕｔｈの制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩでの消化は、
合成ＤＮＡリンカーによりコードされたかなり多数の繰
返しテトラベブチドの、免疫優性？返しドメインによっ
て前に領有されているＣＳ蛋白の領域への連結を可能と
する。付加的テトラベプチドーコードＤＮＡ７ラグメン
トは、同様にベクターに連結されるかもしれない。得ら
れたプラスミド、ｐＮ　Ｓ　ｌ　ｓ　＋　Ｒ　Ｌ　ｆ　
Ａｕｔｈ　十（Ｎ　Ａ　Ｎ　’Ｐ　）！は、以下の配列
を有する蛋白をコードする：Ｎ　Ｓ　１　８１−Ａｓｐ
−Ｈ　ｒｓ−ＭａＬ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−Ｃ　Ｓ　ｒ＊−＋■３−（Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｐ　）ｚ−Ｇ
　ｌｙ−Ｃ　Ｓ　ｚｓａ−＋　＋　ｔ実施例４ ｐＮＳ　ｌ８１（ＮＡＮＰ）＊ＲＬｒＡｕＬｈの構築前
記の発現ベクターｐＵｃＲＬｆＡｕｔｈを、制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化した，　　（ＮＡＮＦ’
）４をコードする合或ＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ
ｒ消化ｐＵｃＲＬｆに連結した。該合成ＤＮＡフラグメ
ントは以下の配列を有しｔ；：得られたプラスミドをｐ
ＵＣ　１　８（ＮＡＮＰ）４ＲＬｆＡｕＬｈと称しｔ；
。

？現ベクターｐ　Ｕ　Ｃ　ｌ　８　（　Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｐ
　）　ｉ　Ｒ　Ｌ　ｆ　Ａ　ｕ　ｔｈヲ、制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩで消化し、末端充填（クレノーフ
ラグメント）し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消
化して得られたＤＮＡ塩基対７ラグメントを電気溶離法
により回収した。

末端充填したＢａｍＨ／Ｓ８１Ｉ　７ラグメントを、予
め制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶおよびＸｈｏ工で
消化した前記ＮＳ１ａ１−コード発現ベクターｐＭＧ１
に連結した。得られたプラスミドをｐＮＳｌ８１（ＮＡ
ＮＰ）＋ＲＬｆＡｕｔｈと称し、それは合或ＤＮＡ７ラ
グメントによりコードされた繰返しテトラペプチドがＮ
ＳＩ■のアミノ酸（Ｍｅｔ）とＮｃｏ１／ＳａｃＩ合戊
ＤＮＡリンカーのＮ一末端Ａｓｐの間に挿入されている
蛋白をコードする：Ｎ　Ｓ　ｌ　ｉｔ−（Ｎ　Ａ　Ｎ　
Ｐ　）ｎ−Ａｓｐ−Ｈ　ｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌ　６ｕ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏ−Ｃ　Ｓ　ＩＩ−１２３−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｃ　Ｓ　＊ｓ＊−４ｒｚ実施例５ ｐＮｓ　１８＋（ＮＶＤＰ）４ＲＬｆＡｕｔｈの構築ｐ
ＮＳ　１ｓｔ（ＮＶＤＰ）ｎＲＬｆＡｕｔｈの構築は、
（ＮＶＤＰ）４（ＣＳ蛋白の中央の繰返しドメインの種
々のテトラペプチド配列）をコードする合成ＤＮＡ！，
ｌンカーが以下の配列を有する以外、前記ｐＮ　３　１
　ｓｔ（Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｐ　）４Ｒ　Ｌ　ｆＡｕｔｈの記
載と同じであった。

得られたプラスミドは以下の配列を有する蛋白をコード
する。

Ｎ　Ｓ　ｌ　ｍ＋（Ｎ　Ｖ　Ｄ　Ｐ　）ｎ−Ａｓｐ−Ｈ
　ｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏ
−Ｃ　Ｓ　ＩＳ−口！−Ｇ　ｌｙ−Ｃ　Ｓ’ｚａｓ−４
＋ｚ実施例６ Ｎ　Ｓ　１　．ｌＲ　Ｌ　ｆΔ９のイー・コリからの単
離温度感受性λ溶［（Ｃ　Ｉ　ｔｓ８　５　７　）にて
ＮＳＩ１９＋ＲＬｆΔ９の合或を誘導した後、遠心分離
により細菌細胞を収集し、得られたペレットを−７０°
Ｃにて冷凍した。該濃縮、冷凍細胞約１２ｇを、５Ｑｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ
）、ｌｏｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
、５％グリセロールおよびｌＱｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を有する溶解緩衝液（ｐＨ８）１２０−中に
て希釈することにより解氷した。リソチーム（ミズリー
州、セントルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー　（
Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．））を、希釈細胞
１　ｍＱ当たり、０．２ｍｇの最終濃度まで加え、該溶
液を４゜Ｃにて３０分間撹拌した。該溶液が液化したと
思えるまで、該細胞をブランゾン佛ソニケーター（　Ｂ
　ｒａｎｓｏｎ　ｓｏｎｉｃａＬｏｒ）を用いて音波処
理に付した。ｌＯ％デオキシコレ−ト溶液を最終濃度０
．１％（Ｖ／Ｖ）まで加え、該溶液をソーバル・アール
・シー・５Ｂ遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ　　５　Ｂ
　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）（デュポン社）において、１
５６００Ｘｇで４℃にて３０分間遠心分離に付した。

上澄液を捨て、残っている蛋白含有のペレットを、５０
ｍＭグリシン、２ｍＭＥＤＴＡおよび５％グリセロール
を有する緩衝溶液（ｐＨ　ｌ　Ｏ）　Ｉ．　００−に懸
濁させた。該懸濁液を前記と同様に音波処理に付し、ト
リトン＠Ｘ−１００（：／グマ）を最終濃度ｌ％（Ｖ／
Ｖ）まで加えた。該音波処理溶液を４゜Ｃにて３０分間
撹拌し、前記と同様に遠心分離に付した。

尿素を該蛋白含有上｝登液に最終尿素濃度８Ｍまで加え
、該試料を５０％酢酸溶液でｐＨ５．５に滴定した。該
試料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｌ％トリトンＸ−１
００および８Ｍ尿素含有の緩衝溶液（ｐＨ５．５）で予
め平衡にしたＱＡＥセファロース■ファースト・フロー
（　Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ＠Ｆ　ｌｏｗ）（　フ７　−
　７シア（　Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ））の２５ｍＱ力ラ
ム上、３００ｃｍ／時間の流速にてクロマトグラフィー
に付した。蛋白は非結合フラクション中にあり、１２０
ｃｍ／時間の流速にて、２０ｍＭ酢酸ナ１・リウムおよ
び８Ｍ尿素含有の緩衝溶液（ｐＨ５．５）で予め平衡に
したＳＰセファロース■ファースト・フロー（ファーマ
シア）の１０ｍｆ２カラムに（史用した。

溶出液を２８０ｒ＋＋ｙ＋にて吸光度についてモニター
規察した。蛋白は、１００ｍＭトリスおよび８Ｍ尿素を
含有する緩衝液（ｐＨ８）でこのカラムから溶出した。

得られた産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４０００ＯｋＤの
見掛け分子量で主バンドおよび約８０％純度を示した。

該精製方法により、蛋白１．ｍｇ当たり、約１４のエン
ドトキシン単位を含有する蛋白１２ｍｇが得られた。

実施例７ Ｎ　Ｓ　ｌ　ａ　ｒ　Ｒ　Ｌ　ｆΔ９のイー・コリから
の単離温度感受性λ溶原にてＮＳＩａ．ＲＬｆΔ９の合
戊を誘導した後、遠心分離により細菌細胞を収集し、得
られたベレットを−７０°Ｃにて冷凍した。

該濃縮、冷凍細胞約６３６ｇを、６０ｍＭ｝リス、１２
ｍＭＥＤＴＡ，６％グリセロールおよび１２ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を有する緩衝溶液（ｐＨ８）２
２００ｍｆ２中にて希釈することにより解氷した。該解
氷細胞を、６０００〜７００Ｑｐｓｉにて、マントン・
ガウリン・ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ　Ｇａｕｌｉ
ｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）に２回通した。

１０％デオキシコレート溶液を最終濃度０．１％（Ｖ／
Ｖ）まで加え、該溶解産物を４゜Ｃにて３０分間撹拌し
、ソーバル・アール・シー・５Ｅ遠心機（デュポン社）
を用い、ｌｏｏ００Ｘｇで４℃にて６０分間遠心分離に
付した。

ベレットを捨て、１０５０または２１００バイオクリル
（　Ｂ　ｉｏｃｒｙｌ）ビーズ混合物（スベルコ）（Ｓ
ｕｐｅｌｅｏ）　２　５　ｐＱを蛋白含有の上澄液１ｍ
ｌ２に加えた。該溶液を撹拌し、航記のように遠心分離
に付した。

ベレットを捨て、固体硫酸アンモニウムを残りの蛋白含
有上澄液に、２０％飽和濃度まで５分間にわたって加え
た。

試料を撹拌し、前記と同様に遠心分離に付した。

該ベレットを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｌ％トリトン
■Ｘ−１００および８Ｍ尿素含有の緩衝溶液（ｐＨ　５
．５）　４　０　０ｎＩ１２に懸濁させた。この懸濁液
を遠心分離に付し、上澄液を１００ｍＭトリスおよび８
Ｍ尿素を含有する緩衝溶液（ｐＨ８．０）に対して透析
した。該リテンテートをｐＨ５．５に調整し、２０＋ｙ
＋Ｍ酢酸ナトリウム、１％トリトン■Ｘ−１００および
８Ｍ尿素を含有する緩衝溶液（ｐＨ５．５）で予め平衡
にしたＳＰセファロース［相］ファースト・フロー（フ
ァーマシア）の１００ｄ２カラム上、ｌＯｍｌ２／分の
流速にてクロマトグラ７イーに付した。該カラムを平衡
緩衝液、つづいて０．Ｉ　Ｍ　１〜　ＩＪスおよび８Ｍ
尿素含有の緩衝液、ｐＨ８にて洗浄した。該カラムを，
Ｏ．ｌＭｈリスおよび８ＭＲ．素を含有する緩衝液（ｐ
Ｈ　８　）中にて調製した０．０〜０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムの線状グラジエント５００ｍｌ２で溶出した。

蛋白は０．３Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。該産物を含
有するフラクションをプールし、ＹＭＩＯ膜を用いるア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ）撹拌セル中にて濃縮し、２０ｍ
Ｍトリスを有する緩衝溶液（ｐＨ８．０）に対して透析
し、つづいてリン酸塩緩衝セライン（ｐＨ７．０）に対
して透析した。

得られｔ；産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、４００００
ｋＤの見掛け分子量で主バンドおよび一連の少量の戊分
を示した。該精製方法により、蛋白ｌｍｇ当たり、１４
４のエンドトキシン単位を含有する蛋白２５ｍｇが得ら
れた。

実施例８ Ｒ　１　６ＣＳＰのイー・コリからの単離イー・コリに
て発現させたＲ　１　６ＣＳＰは、灯記のｐＵｃ８クロ
ーンｉから単離し，たＸｈｏＩＩフラグメントを、予め
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｌで消化した前記のｐ
ＣＳＩ）に連結することにより調製した。実施例９にて
、ＥＬＩＳＡ捕獲抗原として用いられるＲｌ６ＣＳＰを
以下のように精製した。

イー・コリにてＲｌ６ＣＳＰのき戊を誘導した後、遠心
分離により細菌細胞を収集し、得られたべレソトを−２
０’Ｃ！にて冷凍した。該濃縮、冷凍細胞約３７３ｇを
、５０ｍＭトリス、ｌＯｍＭＥＤＴＡ，５％グリセロー
ルおよび１０ｍＭジチオスレイトールを有する緩衝液（
ｐＨ　３．０）　　１　．４　３Ｑ中にて解氷した。１
０％デオキンコレート（Ｗ／■）溶液を最終濃度０．１
％（／Ｖ）まで加え、その後、該細胞を．７０００ｐｓ
ｉにて、マントン・ガウリン・ホモジナイザーに２回通
した。０．５Ｍトリス、ｐＨ８．０緩衝液（Ｗ／ｖ）中
、ポリエチレンイミン（Ｂ　Ｒ　Ｌ）のｌＯ％溶液を、
該ホモジネートに最終濃度０．５％まで加えた。該溶液
を４゜Ｃにて１時間撹拌し、ソーバル・アール・シー・
２Ｂ遠心機（デュポン社）を用い、１３０００ｘｇで４
゜Ｃにて４５分間遠心分離に付した。

ペレットを捨て、固体硫酸アンモニウムを該上澄液に、
３５％飽和濃度まで５分間にわたって加えた。該溶液を
撹拌し、前記と同様に遠心分離に付した。

該ベレットを、３００−の２０ｍＭ｝リスおよび１０ｍ
ＭＥＤＴＡを有する緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた
。８Ｍ尿素３００＋ｎＱ、ｌ，ＱｍＭ酢酸ナトリウム２
．７Ｑおよび４Ｍ尿素を含有する溶液を加え、ｐＨを直
ちに４．０に調整した。試料を前記と同様に遠心分離に
付した。

該上澄液を、２３ｍＭ酢酸ナトリウムおよび４Ｍ尿素を
含有する緩衝液（ｐＨ４．０）にて平衡にしたＳＰセフ
ァロース［株］７ア−スト・フロー（７アーマシア）の
５０一カラムに用いた。該カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムを有する緩衝液（ｐＨ　５　．０）で洗浄し、洗浄
緩衝液中に０．０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する
線状グラジエント２５０一で溶出した。産物は約０．３
Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。

イオン交換生或物５〇一部を１０％トリ７ルオロ酢酸（
ＴＦＡＸＶ／Ｖ）でｐＨ２．３に調整し、０．１％ＴＦ
Ａにて平衡にしたＣ４逆相カラム（ビダソク（Ｖｙｄａ
ｃ）　　ｌ　Ｘ　２　５　ｃｍ）上のクロマトグラフィ
ーに付した。０．１％ＴＦＡ中、０〜６０％アセトニト
リル（ＡＣＮ）の線状グラジエントを４５分間にわたっ
て操作し、産物は約６０％ＡＣＮで溶出した。該逆相産
物は、ＩＭ炭酸水素アンモニウムｌｍｌ当たり２５μα
の添加により中和しｔこ。

逆相産物約４５ｍｌ２を、２Ｍグアニジン塩酸塩を含有
する緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析し、ＹＭ３　０
ｖ（アミコン）上にて２０−に濃縮した。

１０＋ｎｌ２部を、２．０Ｍグアニジン塩酸塩を有する
緩衝Ｍ（ｐＨ５．０）にて平衡にしたスベロース■（Ｓ
ｕｐｅｒｏｓｅ＠　）　　１　２　（７　７−マシア）
２．５Ｘ５０ｃｍカラムでクロマトグラフィーｌご付し
た。３５８ｋＤの見掛けＭｒで溶出した蛋白を２０ｍＭ
酢？ナトリウム含有の緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透
析した。

スベロース産物のクマンー（　Ｃ　ｏｏｍａｓｓｉｅ）
染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、７２ｋＤおよび７０ｋＤの見
掛け分子量で２つの主バンドを示した。最終産物のアミ
ノ酸分析およびＮ一末端塩基配列決定は予想値の１５％
以内であった。

実施例９ マウスのＮＳＩ■ＲＬｆΔ９に対する抗体応答その免疫
原性を測定するに、精製したＮＳ１■ＲＬｆΔ９抗原を
、３種のマウス系、すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６　（｝ｔ
−２’）　、ＢＡＬＢ／Ｃ　（Ｈ−２４）およびＣ３Ｈ
／ｌ｛ＥＮ　（Ｈ−２つに接種した。これらのマウスの
うちＨ−２５ハブロタイプだけが、ビー・７アルシパラ
ム・サーカムスポロゾイト蛋白の反復エビトープに対す
る抗体を産土することが知られている。該抗原を７口イ
ントアジュバント（　Ｆ　ｒｅｕｎｄ’　ｓ　ａｄｊｕ
ｖａｎｔ）と一緒に注射し、免疫動物からの血清試料を
固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にてスクリーンした
。対照動物は、？３２ｔｅｔ３２，ＣＳ蛋白の繰返しテ
トラベプチドを含有する抗原で免疫処理した。３種すべ
てのマウス系のＮＳ１８１ＲＬｒΔ９での接種は、サー
カムスポロゾイト蛋白のリピートレス（フランキング）
領域との抗体反応性をもたらした。免疫原性検定の詳細
および結果を以下に示す。

各３種のマウス系を、各群４〜５匹の動物からなる２群
に分けた。第１群の動物はＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９で免疫
処理し、第２群はＲ３２ｔｅｔ３２で免疫処理した（ジ
ェイ・ヤングらＯ　．Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）ｎサ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　．　２２８　：　９５８
　（１９８　５））ｎ　Ｒ　３　２ｔｅｔ３　２は２つ
のＸｈｏＩ［フラグメントを有し、各７ラグメントは配
列［（Ａｓｎ−ＡｌａＡｓｎ−Ｐｒｏ）ｎ，（Ａｓｎ−
Ｖ８１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）］　．を有するベブチドをコ
ードする。ｔｅｔ３２は、テトラサイクリン耐性遺伝子
によりコードされた３２アミノ酸ベブチドである。

実施例６の記載に従って精製されたＮＳＩ■ＲＬｆΔ９
抗原を、投与直前に完全フロイントアジュバントと混合
した。マウス（６〜８週齢）を、各？、抗［５０μｇで
皮下的に免疫処理し、右後馬蹄側壁に２００μα量投与
した。マウスを２回、最初は、完全フロイントアジュバ
ント中、抗ｌ１ｉ［５０μｇ含有の単２００μα量で免
疫処理した。抗原を不完全７口イントアジュバントに乳
化さセ６以外、最初の注射に用いられたと同様のプロト
コルに従って、４週間後にブースター注射を行なつｔこ
。

動物を第２の免疫処理から７日後に放血させた。

群内のすべての動物からの全血液をプールし、４℃にて
一夜凝固させ、遠心分離に付して血清を分離し、ついで
それを−７０゜Ｃにて貯蔵した。ＥＬＩＳＡ法を用い、
プールした血清を、Ｒ　３　２ｔｅｔ３２、ＮＳＩ■Ｒ
ＬｆΔ９またはＲｌ６ＣＳＰに対して産生される抗体に
ついて試験した。

（Ｒ１６ＣＳＰを調製し、前記の記載に従って精製した
。） 「サンドイッチＪＥＬＩＳＡ法は、マイクロタイトレー
ションプレートのウエル壁に吸着した捕獲抗原としてＲ
３２ｔｅｔ３２、Ｒ１６ＣＳＰ８よ？ＮＳＩ■ＲＬｆΔ
９を取り入れた。

捕獲抗原は、捕獲抗原０．７５μｇ８よびポイルカゼイ
ン（Ｃａｓｅｉｎ）　０　．２　ｐ　ｇを含有するＰＢ
Ｓ溶液５０μＱをウェルに添加することにより、マイク
ロタイトレーションプレートのウエル壁に吸着させた。

この溶液は、ズルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）リン酸
塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（０．８％ＮａＣｆ２；０．２
１７％Ｎａ２ＨＰＯ．−７Ｈ■０　；　０．０２％ＫＨ
２ＰＯ．；および０．０２％ＫＣＣからなる、ｐＨ７．
４の水溶液）５ｍｆｌに対して、後記の０．５％ボイル
カゼイン溶液４μＱからなる溶液２．５−に、捕獲抗原
８μＱＣ３．７６μｇ）を加えることにより調製した。

一夜室温にてインキユベーションした後、ウェル内容物
を吸出し、プレート上の残っている活性結合部位を、ポ
イル［１５％カゼイン溶液（５ｇ／Ｑカゼイン（ジエイ
・ティー・ベーカー・ケミカル・カンパニー（Ｊ　．Ｔ
．Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）；　０．ｌ
　ｇ／Ｑチメルソール（Ｔｈｉｍｓｒｓｏｌ）　　（シ
グマ・ケミカル・カンパニー）　　；　０．０　２　ｇ
／１２７エノール・レッド（シグマ・ケミカル・カンパ
ニー）ｎＰＢ３９００ｍｌ２、ｐＨ７．４；および０．
ＩＮＮａＯＨＩＯＱｍｉ２：ｌ：１％ツウィーン２０（
ポリオキシエチレンソノレヒ′タン申モノラウレート、
シグマ・ケミカノレ・カンパニー）との混合物（９９：
１）でフロックし　ｔこ。

マウスの血清試料を、０．０２５％ツウィーン２０含有
の０．５％ボイル・カゼイン溶液中、１：１００：１：
１０００；ｌ：１００００；ｌ：１ｏｏｏｏｏおよびｌ
　：　１００００００に希釈した。

ついで試験血清をウエルに加え、２時間インキユベーシ
ョンした後、血清を取り出し、該ウエルを０．０５％ツ
ウィーン２０含有のＰＢＳ溶液で２回洗浄した。ついで
、血清に用いたと同様の希釈剤で１　：　２０００に希
釈した、ベルオキンダーゼに接合した抗マウスＩｇＧＡ
ｂを該ウエルに加えた。１時間インキユベーションした
後、該ウエル内容物を吸出し、０．０５％ツウイーン２
０含有のＰＢＳ溶液で３回洗浄し、純粋なベルオキシダ
ーゼ基質溶液（キルケガード＆ぺり一 （　Ｋ　ｉｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｐ　ｅｒｒｙ）　、製
造者の指示に従って製造）を加えた。ベルオキシダーゼ
を基質と反応させ、暗緑色産物を形戊させ、その色相強
度は血清試料中Ｉこ存在する抗体量に比例する。結果を
、１５分後、ＥＬＩＳＡプレート・リーダーを用いて４
０５〜４１４ｎｍで読み取り、光学濃度（０．Ｄ．）単
位にて記録した。

結果を第１図（ａ）および第１図（ｂ）（ｃＨ３／ＨＥ
Ｎにおける抗体応答）、第２図（ａ）および第２図（ｂ
）（Ｃ５７ＢＬ／６における抗体応答）および第３図（
ａ）および第３図（ｂ）（ＢＡＬＢ／Ｃにおける抗体応
答）にて示す。

すべての３種のマウス系、ＣＨ３／ＨＥＮ　（Ｈ−２ｋ
）ｎＢＡＬＢ／Ｃ　（Ｈ−２つむよびＣ５７ＢＬ／６　
（Ｈ−２つをＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９抗原で接種し、ザー
カムスボロゾイト蛋白のリピートレス領域に強く反応す
る抗体を形成させた。ＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９捕獲抗原に
対する反応性は、Ｒｌ６ＣＳＰに対する反応性よりもほ
んのわずかに大きいだけである。（Ｒｌ６ＣＳＰ捕獲抗
原はＣＳ蛋白のリビートレス部に対する抗体のみを検出
するのに対して、ＮＳＩ，，ＲＬ．ｆΔ９捕獲抗原は抗
一ＮＳ１　８１および抗−ＲＬｆΔ９抗体の両方の検出
が可能である）。予想したとおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スが抗体応答を有するのに対して、ＣＨ３／ＨＥＮマウ
スはＲ　３　２　Ｌｅｔ３２に対する抗体応答を有さな
かった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにて観察された抗体応答
よりも明らかに低＜（ｌｌｏｇの差）、ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスのＲ　３　２　Ｌｅｔ３２に対する応答は予想され
ないが、（ＮＡＮＰ）ｎ。に対するこのハブ口タイプの
マウスに関して文献中に報告されている否定的な応答と
は異なる（デル・ギウディスら（Ｄｅｌ　Ｇｉｕｄｉｃ
ａ　ｅｔ　８１．）は、ジャーナル・オブ・イムノロジ
−（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）ｎ１　３７　：　２９５２
（１９８６）に８いて、キャリア蛋白のない（ＮＡＮＰ
）４。で免疫処理した、ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２つを包含
する９種の異なるＨ−２ハブ口タイプを有する１４系の
マウスのうち、Ｈ−２′マウスだけが、（ＮＡＮＰ）４
。に対する抗体応答を有した。Ｈ−２４マウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）は全く応？しなかった。キャリア蛋白としてキ
ーホールリンペットヘモシアニンに結合させた（ＮＡＮ
Ｐ）ｎ。

で免疫処理したＢＡＬＢ／Ｃは抗−（ＮＡＮＰ）４。

抗体を生じた。） 実施例ｌＯ スボロゾイト侵入の抑制（Ｉ　Ｓ　Ｉ）この研究におい
ては、ＮＳ　ｌａ＋ＲＬｆΔ９で免疫処理したウサギの
血清を、ビー・ファルシパラム・スポロゾイトの肝細胞
への侵入、スポロゾイト発生部■および赤血球外期への
戊熟を抑制するその能力について試験した。

３種のマウス系、ＢＡＬＢ／Ｃ，Ｃ５７ＢＬ／６および
Ａ／ＪをＮＳ　ｌａｌＲＬｆＡ９で免疫化し、完全フロ
イントアジュバントまたは水酸化アルミニウムのいずれ
かを投与し、ＣＳ蛋白のリピートレス領域に対する高抗
体価を生じさせた。しかしながら、ホリンデール・エム
・アールら（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ，Ｍ．Ｒ．　ｅｔ
　ａｌ．）ｎジャーナル・オブ・イムノロジー，１３２
（７）：９０９　（１９８４）に記載のスボロゾイト侵
入の抑制（ｔｓｌ）法に従って？定した場合、これらマ
ウスの血清は、スボロゾイトの培養ヒト肝癌細胞（Ｈｅ
ｐＧ２−Ａ１６）への侵入を遮断することができなかっ
た。

対照的に、ニュージーランド・ホワイト・ウサギ（Ｎｅ
ｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｒａｂｂｉｔ）をＮ
ｓｌａ＋ＲＬｆＡ９　（１　０　０μｇ）　’ｔ’免疫
化し、０，３および７日に完全７ロイントアジュバント
を投与し、（たとえ、マウスにて測定される価よりも小
さいとしても）ＣＳ蛋白のリピートレス領域に対して高
抗体価を生じた。しかしながら、ＮＳＩ■ＲＬｆΔ９で
免疫処理されたウサギからの血清は、ホリンデールＩＳ
Ｉ検定法に従って試験した場合、スボロゾイトによる肝
癌細胞侵入を有意に抑制すること（ｌ匹の動物では９８
％、平均抑制率は約６０％）が測定された。

ピー・７アルシパラムのクロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕ
ｉｎｅ）耐性株（７Ｇ８株）およびピー・ファルシパラ
ムのクロロキン感受性株（ＮＦＳ４株）のスボロゾイト
は、各々、ＮＳＩ■ＲＬｆΔ９で免疫処理したウサギか
らの血清によって肝癌細胞侵入？有意に抑制された。ピ
ー・７アルシバラム株７Ｇ８のスポロゾイトによる肝癌
侵入の抑制（平均８５％）は、ＮＦＳ４株について測定
したＩＳＩ（平均６０％）よりも大きかった。

ヒト肝癌細胞の代わりに正常なヒト肝細胞を用いたＩＳ
Ｉ研究において、ピー・ファルンバラム株ＮＦ５４スポ
ロゾイトは、ＮＳｌ８１ＲＬｒΔ９で免疫処理したウサ
ギからの血清により肝細胞の侵入を抑制された（ｌ四の
ウサギからの血清は８９％抑制を示し、平均抑制は約４
５％であった）。

これらの研究は、ＮＳＩ■ＲＬｆΔ９抗原におけるスボ
ロゾイト中和エピトーブの存在を示唆している。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）および第１図（ｂ）は、２つの群のＣ３Ｈ
／ＨＥＮマウス、すなわち、ＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９で免
疫化した１群とＲ　３　２　ｔｅＬ３２で免疫化した他
の群のＣ３Ｈ／ＨＥＮマウスの抗体応答を説明するＥＬ
　Ｉ　ＳＡデータであり、第２図（ａ）および第２図（
ｂ）は、２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウス、すなわち、
ＮＳｌａ＋ＲＬｆΔ９で免疫化したｉｎとＲ　３　２　
ｔ６ｔｘｚで免疫化した他の群のＣ５７ＢＬ／６マウス
の抗体応答を説明するＥＬＩＳＡデータであり、第３ｒ
ｌＡ（ａ）および第３図（ｂ）は、２つの群のＢ　Ａ　
Ｌ　Ｂ／Ｃマウス、すなわち、Ｎ　Ｓ　ｌ　ｓ１ＲＬｆ
Δ９で免疫化した１群とＲ　３　２　ｔｅｔ，２で免疫
化した他の群のＢＡＬＢ／Ｃマウスの抗体応答を説明す
るＥＬＩＳＡデータである。 特許出願人　スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション 代 理 人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）表面蛋白
   の第１のフランキング領域からの１以上の免疫原決定因
   子と、第２のフランキング領域からの１以上の免疫原決
   定因子とを含有し、かつ、その間の繰返しドメインから
   の繰返し免疫原決定因子の全てより少ない因子を含有す
   るか、全く欠くポリペプチド。 ２、第１と第２のフランキング領域の間のプラスモジウ
   ム表面蛋白繰返しドメインの少なくとも１つの繰返し免
   疫原決定因子を含有する請求項１記載のポリペプチド。 ３、実質的に、第１のフランキング領域と第２のフラン
   キング領域の全ての免疫原決定因子を含有する請求項１
   記載のポリペプチド。 ４、プラスモジウム表面蛋白の免疫原決定因子が、ピー
   ・ファルシパラム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ピー
   ・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ）、ピー・マラリアエ（
   Ｐ、ｍａｌａｒｉａｌ）またはピー・オベール（Ｐ、ｏ
   ｖａｌｅ）のいずれかの表面蛋白から選択される請求項
   １記載のポリペプチド。 ５、さらに、第１と第２のフランキング領域の間のプラ
   スモジウム表面蛋白繰返しドメインの少なくとも１つの
   免疫原決定因子を含有する請求項３記載のポリペプチド
   。 ６、キャリア蛋白に融合した請求項１〜請求項５記載の
   いずれかの１つのポリペプチド。７、表面蛋白がサーカ
   ムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍ−ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ
   ）蛋白である請求項１〜請求項６記載のいずれかの１つ
   のポリペプチド。 ８、キャリア蛋白がインフルエンザウイルス非構造蛋白
   １の８１のＮ−末端アミノ酸からなる請求項６記載のポ
   リペプチド。 ９、第１のフランキング領域がピー、ファルシパラムＣ
   Ｓ蛋白のアミノ酸１９（Ｌｅｕ）〜１２３（Ｐｒｏ）に
   対応するアミノ酸配列からなり、第２のフランキング領
   域がピー・ファルシパラムＣＳ蛋白のアミノ酸２９７（
   Ｇｌｙ）〜４１２（Ａｓｎ）に対応するアミノ酸配列か
   らなる請求項３記載のポリペプチド。 １０、第１のフランキング領域がピー、ファルシパラム
   ＣＳ蛋白のアミノ酸１９（Ｌｅｕ）〜１２３（Ｐｒｏ）
   に対応するアミノ酸配列からなり、第２のフランキング
   領域がピー、ファルシパラムＣＳ蛋白のアミノ酸２８８
   （Ａｓｎ）〜４１２（Ａｓｎ）に対応するアミノ酸配列
   からなる請求項１記載のポリペプチド。 １１、さらに、式： −（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）＿ｎ− ［式中、ＸはＡｌａまたはＶａｌ、ＹはＡｓｎまたはＡ
   ｓｐ）ｎは免疫原決定因子がフランキング領域の間に位
   置する場合は４１以下の整数であり、免疫原決定因子が
   フランキング領域の前にある場合は１００以下の整数を
   意味する］ で示される免疫原決定因子を含有する請求項９または請
   求項１０記載のポリペプチド。 １２、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌ
   ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１
   ＿２＿３−ＣＳ＿２＿９＿７＿−＿４＿１＿２で示され
   る請求項１記載のポリペプチド。 １３、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌ
   ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１
   ＿２＿３−Ｇｌｙ−ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２
   で示される請求項１記載のポリペプチド。 １４、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌ
   ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１
   ＿２＿３−（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）＿ｎ−Ｇｌｙ−
   ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２ ［式中、ＸはＡｌａまたはＶａｌ、ＹはＡｓｎまたはＡ
   ｓｐおよびｎは１以上であって４１以下の整数を意味す
   る］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 １５、式： ＮＳｌ＿８＿１−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１＿２＿３
   −（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＿ｎ−Ｇｌｙ−
   ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿＿４＿１＿２ ［式中、ｎは１以上であって４１以下の整数を意味する
   ］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 １６、ｎが２である請求項１５記載のポリペプチド。 １７、式： ＮＳｌ＿８＿１−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１＿２＿３
   −（Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）＿ｎ−Ｇｌｙ−
   Ｃｓ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２ ［式中、ｎは１以上であって４１以下の整数を意味する
   ］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 １８、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−（Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ）
   ＿ｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
   ｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１＿２＿３−Ｇｌｙ−
   ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２ ［式中、ｎは１以上であって１００以下の整数を意味す
   る］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 １９、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
   Ｐｒｏ）＿ｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１＿２＿３−
   Ｇｌｙ−ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２［式中、ｎ
   は１以上であって１００以下の整数を意味する］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 ２０、ｎが４である請求項１９記載のポリペプチド。 ２１、式： ＮＳｌ＿１＿−＿８＿１−（Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−
   Ｐｒｏ）＿ｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＣＳ＿１＿９＿−＿１＿２＿３−
   Ｇｌｙ−ＣＳ＿２＿８＿８＿−＿４＿１＿２［式中、ｎ
   は１以上であって１００以下の整数を意味する］ で示される請求項１記載のポリペプチド。 ２２、ｎが４である請求項２１記載のポリペプチド。 ２３、請求項１のポリペプチドをコードする発現ベクタ
   ー。 ２４、イー・コリ発現ベクターである請求項２３記載の
   ベクター。 ２５、イー・コリ発現ベクターのｐＭＧ−ｌ。 ２６、イー・コリ発現ベクターのｐＮＳｌ＿８＿１−Ｒ
   ＬｆΔ９。 ２７、イー・コリ発現ベクターのｐＮＳｌ＿８＿１−Ｒ
   ＬｆＡｕｔｈ。 ２８、ｎが１以上の整数であるイー・コリ発現ベクター
   のＮＳｌ＿８＿１、ＲＬｆＡｕｔｈ＋（ＮＡＮＰ）＿ｎ
   。 ２９、ｎが１以上の整数であるイー・コリベクターのｐ
   ＮＳｌ＿８＿１（ＮＡＮＰ）＿ｎＲＬｆＡｕｔｈ。 ３０、ｎが１以上の整数であるイー・コリ発現ベクター
   のｐＮＳｌ＿８＿１（ＮＶＤＰ）＿ｎＲＬｆＡｕｔｈ。 ３１、免疫保護量の請求項１記載のポリペプチドからな
   る、プラスモジウム・スポロゾイトによる感染からのヒ
   ト保護用ワクチン。 ３２、有効量の請求項１記載のポリペプチドとプラスモ
   ジウム・スポロゾイトに対する抗体応答を誘発するワク
   チン剤を共同投与することからなる、プラスモジウム・
   スポロゾイトによる感染からのヒト治療方法。