HUT54305A - Process for producing vaccine against malaria - Google Patents
Process for producing vaccine against malaria Download PDFInfo
- Publication number
- HUT54305A HUT54305A HU902652A HU265290A HUT54305A HU T54305 A HUT54305 A HU T54305A HU 902652 A HU902652 A HU 902652A HU 265290 A HU265290 A HU 265290A HU T54305 A HUT54305 A HU T54305A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- asp
- protein
- pro
- asn
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 title description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 87
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 claims abstract description 20
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 74
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 26
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims description 26
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 26
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 12
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims description 10
- 101100408778 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pns-1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 claims description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 claims description 3
- 206010035502 Plasmodium ovale infection Diseases 0.000 claims description 3
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 claims 2
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 claims 2
- 206010035503 Plasmodium vivax infection Diseases 0.000 claims 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 23
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 13
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 7
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 101000726057 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 3
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 3
- 206010035501 Plasmodium malariae infection Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 101710180995 Endonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 description 2
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 2
- 108700005482 Protozoan circumsporozoite Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- -1 i.e. Polymers 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000689231 Aeromonas salmonicida S-layer protein Proteins 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101001022703 Bacillus subtilis ATP-dependent asparagine adenylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710095920 Competence-stimulating peptide type 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100028991 Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000916041 Homo sapiens Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000820585 Homo sapiens SUN domain-containing ossification factor Proteins 0.000 description 1
- 101000673946 Homo sapiens Synaptotagmin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 101000845005 Macrovipera lebetina Disintegrin lebein-2-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108700010674 N-acetylVal-Nle(7,8)- allatotropin (5-13) Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 1
- 101100012910 Plasmodium falciparum (isolate FC27 / Papua New Guinea) FIRA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000223980 Plasmodium falciparum NF54 Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100021651 SUN domain-containing ossification factor Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101000947508 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Cytochrome c isoform 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 1
- IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N Ser-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187234 Streptomyces longisporus Species 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001582429 Tetracis Species 0.000 description 1
- 101000748795 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) Cytochrome c oxidase polypeptide I+III Proteins 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 description 1
- 108090000237 interleukin-24 Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- FKCRAVPPBFWEJD-XVFCMESISA-N orotidine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1C(O)=O FKCRAVPPBFWEJD-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- FKCRAVPPBFWEJD-UHFFFAOYSA-N orotidine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1C(O)=O FKCRAVPPBFWEJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 1
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- VABRZWDEEDQLRD-UHFFFAOYSA-N streptomyces antibiotic uk-63052 Chemical compound CN1C(=O)C(N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(COC(=O)C2(C(C2)C)N(C)C2=O)NC(=O)C=3C(=CC4=CC=CC=C4N=3)O)C(SC(C)CC)SCC2N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(NC(=O)C=2C(=CC3=CC=CC=C3N=2)O)COC(=O)C21CC2C VABRZWDEEDQLRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 1
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Négy Plasmodium fajról ismert hogy embert képesek megfertőzni. Ezek a P. falciparum, P. vivax, P. ovale és a P. malariae, az utóbbi kettő jóval kisebb gyakorisággal fordul elő. Más, tudományos jelentőségű fajok a P. berghei és a P. knowlesi, ennek a két fajnak a gazdaszervezetei rágcsálók illetve majmok.
Kemp és munkatársai a WO 84-02917-A közzétételi számú szabadalomban Írják le a P. falciparum cDNS klónozását E. coliban.
Dame és munkatársai [Science, 225, 593 (1984)] közlik a P. falciparum CS fehérjéjének klónozását ésexpresszióját E.
coliban. A fehérjét úgy , jellemzik, hogy körülbelül 412 aminosavat tartalmaz, hozzávetőleges mo1eku1asú1ya 44,000 dal tón. Egy tetrapept id tandem ismétlődését tartalmazza
Az ismétlődő régióból származó szintetikus
7—, 11- és
15-tagú peptidek kötődnek a CS fehérje elleni monok 1oná1i s antitestekhez.
A P. falciparum CS fehérjéjének ismétlődő tetrapeptidjén alapuló antisporozoita vakcinák nem sikeresek, csak kisszámú egyedben biztosítanak immunitást, és ez az immunitás csak röid ideig tart [Science, 241, 522 (1988)]. Tehát a malária paraziták elleni hatékony vakcina elleni igény továbbra is kielégítetlen.
A találmány tárgya általában olyan polipeptid, amely egy vagy több immunogén determinánst tartalmaz a Plasmodium felületi fehérje központi ismétlődő egysége melletti első régióból, egy vagy több immunogén determinánst az ismétlődési domént kísérő második régióból és a központi ismétlődő régió ismétlődő immunogén determinánsai közül egyet sem vagy az összesét.
A találmány egy előnyős megvalósitási módja szerint a találmány tárgya olyan polipeptid, amely a
Ρ1asmod ium felületi fehérj e i smé11ödö egysége ismét 1ödö i mmunogén determinánsai közül legalább egyet tartalmaz, de nem tartalmazza az összesét, és a Plasmodium felületi fehérje ismétlődő egységével szomszédos régiókból egy vagy több immunogén determinánst tartalmaz.
A találmány egy másik. előnyös megvalósítási módja szerint a polipeptid a központi ismétlődő doménnel szomszédos régiók immunogém determinánsai közül lényegében az Összesét tarta1 mázza,. és mentes a központi ismétlődő dómén immunogén determinánsaitól. Egy másik változat szerint a szomszédos régiók lényegében összes immunogén determinánsát tartalmazó fehérje emellett a központi ismétlődő dómén immunigén determinánsai közül legalább egyet tartalmaz, de nem tartalmazza az Összesét.
A jelen találmány szerinti po1ipeptidekben jól használható immunogén determinánsok közé tartoznak előnyösen azok is, amelyek a Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,
Ρ1asmodium malariae és Plasmodium óvale felületi fehérjéiben ta1á1 hatók.
A találmány újabb megvalósítási mód j a szerint a po1i pepiidet genetikai 1ag egy hordozó fehérj éhez fúzionáltatjuk, előnyösen egy olyan hordozó fehérjéhez, amely vagy megjavítja a polipeptid expresszióját, vagy megerősíti a polpeptid immunogén hatását, vagy mindkettőt teljesíti.
• ♦ · ♦ · • · · · · · • · · · ······· ·· ··· ·
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti polipeptidek egy immunogén hordozó fehérjét tarta1 maznak, például az influenza vírus nem-strukturális 1-es fehérjéje 91 N-terminális aminosavát (NSsi), amely egy szintetikus linkeren keresztül fúziónál a Plasmodium cirkumsporozoita (CS) fehérjéjével, amely maga is a CS fehérje egy második szomszédos régiójához van fúzionáltatva.
Az ilyen polipeptidek tarta1 máz hatnak továbbá a CS fehérje központi ismétlődő régiöjából egynél többet, de kevesebbet mint az összes, például az ismétlődő egység immunogén determinánsát, · amely egy Asn-X-Y-Pro aminosavtetrapeptid, amelyben X jelentése Alá vagy Val, Y jelen tése
Asn vagy Asp. A központi ismétlődő doménböl származó immunogén determinánsokat helyezhetjük például a hordozó fehérje és az első szomszédos régió közé, vagy a első szomszédos régió
A jelen találmány tárgya továbbá a po1ipeptideket kódoló e x pressz iós kezelésére vektorok, a polipeptideket tartalmazó vakcinák;
polipeptidek tisztitására; és módszerek emberek malária fertőzéssel szemben, a polipeptidek fe1 haszná 1ásáva1.
A jelen találmány további tárgyait és előnyeit az alábbi részletes leírásban adjuk meg.
Az ábrák rövid leírása
Az l(a) és 1(b) ábrákon ELISA adatokat látunk gráf ikon formájában, amelyek C3H/HEN egerek két csoportjának antitest reakcióját mutatják, az egyik csoportot NS1Q1RL9 • · ·· • · · · · • ♦ · «*·· ··· ·· fehérjével, a másik csoportot R32tet-= fehérjével immuni zá1va;
A 2(a) és 2(b) ábrákon ELISA adatokat látunk grafikon formájában, amelyek C57BL/6 egerek két csoportjának antitest reakcióját mutatják, az egyik csoportot NSlsiR9 fehérjével, a másik csoportot R32tet3= fehérjével immun i zá1va;
A 3(a) és 3(b) ábrákon ELISA adatokat látunk grafikon formájában, amelyek BALB/C egerek két csoportjának antitest reakcióját mutatják, az egyik csoportot NSlSiR9 fehérjével, a másik csoportot R32tet3= fehérjével immun i zá1va;
A találmány előnyös megvalósításának leírása
A protozoa malária parazita, a Plasmodium számos, a külső sejtfelszínen található állapot-specifikus fehérjével rendelkezik. Ezekről a felületi fehérjékről kiderült, hogy három közös régióval rendelkeznek, azaz egy központi ismétlődő epitop régióval vagy doménnel és ehhez tartozó szomszédos régiókkal. A szomszédos régiók közül az első a központi ismétlődő dómén karboxi-terminá1isához kapcsolódik, a második a központi ismétlődő régió amino-terminá1isához.
A jelen találmány szerinti po1ipeptidek a Plasmodium felületi fehérje egy részéből származnak, amely az első és második szomszédos régió közötti központi ismétlődő dómén immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet vagy semmit nem tartalmaz, és elegendő mennyiségben expresszá1juk ahhoz, hogy malária paraziták fertőzésének gátlására alkalmas gyógyászati hatóanyágként lehessen használni őket.
Másszóval, a találmány szerinti po1ipeptidek kevesebb tandem ismétlődéssel rendelkeznek az első és második szomszédos régió között mint amennyi a vad típusú ismétlődő régiókban található. Tehát az embereknek a P. falciparum fertőzés elleni védelmet biztosító polipeptid tartalmazhatja a teljes első szomszédos régiót, azaz a P.falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének (PfCSP) N-terminális szomszédos régióját, a teljes második régiót, azaz a PfCSP C-terminális szomszédos régióját, és az első és második szomszédos régió között 41-nél kevesebb tandem ismétlődést a PfCSP-böl, azaz 41-nél kevesebb Asn-X-Y-Pro képlett! tetrapeptidet, amelyben X. jelentése Alá vagy Val, és Y jelentése Asp vagy Asn.
Egy vad típusú Plasmodium felületi fehérjében az ismétlődő régió az immun-domináns. A jelen találmány szerinti po1ipeptidekben a tandem ismétlődések vagy ismétlődő egységek számát és helyzetét úgy választjuk meg, hogy ne fedjék le az első és második szomszédos régió immunválaszát. A találmány szerinti polipeptidekben az ismétlődések száma előnyösen nem több mint a vad típusú fehérjében levő ismétlődések számának fele. Még előnyösebb, ha a találmány szerinti po1ipéptidekben az ismétlődések száma nem több mint egy negyede a vad típusú fehérjében jelenlevő ismétlődések számának.
Négy Plasmodium fajról ismert hogy megfertőzik az embert, ezek közül a leglényegesebb a P. falciparum, ezt követi a P.vivax, majd kisebb mértékben a P. malariae és P. ovale.
• · V · · * · • «·· « ·«·· ·
V « « · « · ···«··· · · ··· ·
-ΘΑ Plasmodium fal cipariim sporozoita állapotú cirkumsporozoita (CS) fehérjéj ének központi ismétlődő doménje 41 ismétlődő tetrapeptidet tartalmaz, ezek közül
31-nek az aminosav szekvenciája (Aszparagin (Asn)-A 1an in (A1 a)-Asn-Pro1 in (Pro)), négynek, az aminosav székvenciá j a (Asn-Va1 in (Val)-AszDaraginsav (Asp)-Pro)
A központi ismétlődő dómén mindegyik oldalán az úgynevezett szomszédos régiók találhatók, amelyek az I-es és
ΙΙ-es régiót tartalmazzák, ezek a CS fehérjének olyan régiói, amelyeknek aminosav szekvenciája közel azonos a
P. knowlesi (egy majom malária) CS fehérjéjének megfelelő régióival [Dame et al., Science, 225, 593 (19Θ4)]
A Plasmodium f a 1 ci pariimnak abban a stádiumában, amikor a vérben tartózkodik, szintén rendelkezik i smé 11ödö epitopokkal, például az S antigénnel (Pro-A1a-Lys-A1a-Ser— -G1n-Gly-G1y-Leu-G1u-Asp) ; a FIRA antigénnel (Val-Thr—Thr-Gln-Glu-Pro); és a PF-11 antigénnel (Glu-Glu-Val-Val-Glu-G1u-Va1-Va1-Pro).
A P.vivax cirkumsporozoita fehérjéje tartalmazza a (G1y-Asp-Arg-Ala-Asp-G1y-G1n-Pro-Ala) ismétlődő epitopot, a P. malariae cirkumsporozoita fehérj éje tartalmazza az (Asn-Asp-Ala-Gly) és (Asn-A1a-A1a-G1y) ismétlődő epitopokat.
A jelen találmány szerinti polipeptidek egy vagy több immunogén determinánst tartalmaznak a Plasmodium felületi fehérje központi ismétlődő egységével szomszédos első régióból, egy vagy több immunogén determinánst tartalmaznak az ismétlődő doménnal szomszédos második régióból, és a központi ismétlődő dómén ismétlődő immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet, vagy egyáltalán nem tarta1 máz .
Ez immunogén determinánsok olyan aminosav szekvenciák, amelyek a B vagy T sejtek válaszát váltják ki. Az immunogén determinánsok általában legalább 6 aminosavat tarta1 maznak .
Egy fehérjén belül az immunogén determinánsok pontos meghatározása standard technikákkal végezhető, beleértve a monoklonális antitest térképezést és/vagy aminosavak kiejtését majd az aktivitás vizsgálatát. A jelen találmány szerinti polipeptidek előnyösen legalább 15 aminosavat tartalmaznak mind az első, mind a második határoló régióból; még előnyösebb, ha legalább 30 aminosavat; és legelőnyösebb, ha a szignál szekvenciák kivételével a teljes első és második, határoló régiót.
A találmány egy előnyös megvalósítási mód ja szerint a jelen találmány szerinti polipeptidek a Plasmodium felületi fehérje központi ismétlődő doménjének legalább egy, de az összesnél kevesebb immunogén determinánsát tartalmazzák, és az i smét1ödö dómén t ha tároló felületi fehérje régiójából származó egy vagy több immunogén determinánst.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti polipeptidek lényegében az összes immunogén determinánst tartalmazzák a központi ismétlődő doménnal szomszédos régiókból, de nem tartalmaznak immunogén determinánst a központi ismétlődő régióból, vagy egy másik változat szerint a központi ismétlődő régióból legalább egy, de az összesnél kevesebb immunogén determinánst tartalmaz.
A lényegében az összes kifejezés alatt azt értjük, hogy lényegében a teljes első és második határoló régiót használjuk a szignál szekvencia nélkül; előnyösen nem több • · ·· • *· • «· mint 20 aminosav hiányzik mindegyik régióból, és még előnyösebben a teljes első és második határoló régiót használjuk a szignál szekvenciák nélkül.
A jelen találmány szerinti polipeptidek hibrid polipeptidek, azaz olyan polipeptidek, amelyek egy felületi fehérje egy része és egy hordozó fehérje közötti génfúziót tarta1 maznak.
hég előnyösebbek azok a hibrid polipeptidek, amelyekben a központi ismétlődő doménben levő ismétlődő tetrapeptidek nélküli, vagy az összesnél kevesebbet tartalmazó Plasmodium falciparum cirkumsporozoita (OS) fehérje egy része fúziónál egy hordozó fehérjével.
Különösen előnyösek azok a hibrid po1ioeptidek, amelyekben a hordozó fehérje nemcsak megnöveli a hordozott fehérje immunogenitását, hanem megnöveli a polipeptid expresszióját is egy transzformánsban. A hordozó fehérjék további kívánatos tulajdonságai közé tartozik az is hogy a polipeptid sát és formulázását megjavítsa.
Ilyen hordozó fehérje például az NSlai (az A/PR/8/34) influenza vírus nem szerkezeti
1-es fehérj éj ének
N-terminá1 is aminosava) [ Baez et al., Nucleic Acids
Research, 8, 5845 (1980)]; az
R32 ( [ Asn-A 1 a-Asn-Pro ) x
-(Asn-Va1-Asp-Pro]3) [Young et
Science,
228, 958 (1985)] és a galK fehérje.
A jelen találmány szerinti polipeptid típusok közé az alábbiak tartoznak:
NSlsi-RL.9, egy olyan fúziós polipeptid amely tartalmazza az influenza vírus nem struktúrá1 is
-es fehérjéjének 81
N-terminális aminosavát (NSlei), az I-es • · ·· • · · · • ·«« · • · · · · · ··«··«· ·· ·«· ·
-11régiót, a
Plasmodium falciparum cs fehérj e határoló szakaszát a szignál szekvencia nélkül (IS N-terminális aminosav), valamint a
ΙΙ-es régiót, a Plasmodium falciparum
CS fehérje határoló szakaszát az első kilenc N-terminális aminosav nélkül (RL9).
egy szintetikus DNS linkeren keresztül valósítjuk meg, amely az
Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp szekvenciát kódolja;
NSlSi-RLfAuth, egy olyan fúziós polipeptid amely tartalmazza az NSls±_et, az I-es régiót, a Plasmodium falciparum CS fehérje határoló szakaszát a szignál szekvencia nélkül, valamint a teljes ΙΙ-es régiót a határoló szakasszal együtt (RLfAuth);
NSSi-(Asn-X-Y-Pro)n-RLfAuth, egy olyan fúziós polipeptid, amely tartalmazza az NSlsl-et, az RLfAuth-ot.
valamint az (Asn-X-Y-Pro) szekvenciát, amelyben X jelentése Alá vagy Val, és Y jelentése Asn vagy Asp, n egész szám, értéke egy vagy egynél nagyobb, maximális értéke 100 vagy annál kevesebb, előnyösen 50-nél kevesebb, továbbá az (Asn-X-Y-Pro) az NS1S1 és az RLfAuth között található;
NSleiRLfAuth+(Asn-X-Y-Pro)„, egy olyan fúziós polipeptid, amely tartalmazza NSlsx-et, az RLfAuth-ot és az (Asn-X-Y-Pro)-t, ahol X és Y jelentése az amit az előzőkben meghatároztunk, n értéke < 41, továbbá az (Asn-X-Y-Pro) szakasz az I-es régió (a Plasmodium falciparum CS fehérje határoló szakaszát tartalmazza) és a ΙΙ-es régió (a határoló szakaszt tartalmazza, azaz azt a régiót, amelyet előzőleg a központi ismétlődő dómén foglalt el) között van.
Ezek a po1ipeptidek azonban csak illusztratív jellegűek.
Az alábbiakban közölt leírás alapján a szak terű 1eten j ártas ο · · e · · * ··· · · ·«« • · * · · ···· ··· ·· ···
-12szakember tudja, hogyan készítsen és vizsgáljon le más, a találmány oltalmi körébe tartozó polipeptideket, pé1 dáu1 a felületi fehérjék szekvenciáit tartalmazó fehérjéket, beleértve a Plasmodium fa 1ciparum-tó1 eltérő malária paraziták cirkumsporozoita fehérjéit, olyan polipeptideket, amelyek a felületi fehérjéknél több vagy kevesebb aminosavat tarta1 maznak, kémiailag módosított po1ipeptideket, valamint olyan po1ipeptideket, amelyek további aminosavakhoz vagy fehérjékhez vannak fuzionálva. Ezek a polipeptidek könnyen előállíthatok standard génsebészeti módszerekkel és/vagy fehérjeszintézissel, és állati modelleken levizsgálhatok, 1 ényegében az alábbi leírás szerint. Például egy tálálmány szerinti fehérje tartalmazhat a felületi fehérje határoló régióiból származó aminosav-szekvenciákat, azaz lényegében a teljes cirkumsporozoita fehérjét a központi ismétlődő dómén nélkül, Hepatitisz B vírus felületi antigénjéhez (HBsAg) kapcsolva egy olyan fúziós fehérjében, amely képes hibrid HBsAg részecskéket képezni, amint azt az EP 279,940 sorszámú, 1999 augusztus 17-én publikált szabadalmi leírásban közük.
A felületi fehérje határoló szakaszokat, tetrapeptideket, szintetikus DNS linker szekvenciákat és hordozó fehérjéket kódoló szekvenciákat a szakterületen jártas szakember könnyen előállítja, ismert technikákat alkalmazva. Ezek közé tartozik a szintézis, előnyösen a hírvivő RNS reverz transzkripciója, vagy a genomíális DNS-böl származó teljes gének közvetlen klónozása. A Plasmodium falciparum hírvivő RNS reverz t ransz k. r i pció j á t Ellis és munkatársai írják le [Natúré, 302, 536 (1963)]. A • ·
-13Plasmodium falciparum kromoszómális DNS teljes génjeinek klónozását Dame és munkatársai írják le (az előzőkben idézve. Az ismétlődést tartalmazó polipeptidek klónozását és expresszióját az 1988 október 11-én benyújtott 07/256,229 sorszámú függő szabadalmi leírásban közlik, erre a leírásra a továbbiakban is hivatkozunk.
A teljes Plasmodium DNS-t, vagy annak egy részét meg k1 ónozva ennek fragmentjei, amelyek a felületi fehérjét, vagy annak egy részét kódolják, ismert módszerek k e1 klónozható
A DNS szintézis technikái jól ismertek, és bármely, a kereskedelmi forga1 ómban evő
DNS szintetizátorral e1 végezhetők
Polipeptideket kódoló szekvenciákat coli expressziós vektorokba építhetjük, ezek közül számos közismert és könnyen hozzáférhető. A jelen találmány szerinti eljárást E.coli-ban végrehajtva, egy, a jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvenciát egy DNS vektoron belül egy szabályozó régióhoz kapcsoljuk, ezzel transzformáljuk az E. co1i-t. Számos olyan Gram negatív expressziós vektor ismert, amely ilyen szabályozó elemeket tartalmaz. A szabályozó elem egy promotert tartalmaz, amely az RNS polimeráz kapcsolódását és a transzkripciót szabályozza. A szabá1yozható, azaz indukálható vagy derepresszá1 ható promoterek az előnyösek. Számos különböző hasznos promoter ismert heterológ po1ipéptideknek E. coliban való expresszá1ása céljára. Ezek közé tartozik a trp promoter s a lambda PL promoter [lásd például a 4.578.355 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli • « «
-14szabadalmi leírás, valamint Courtney et al., Natúré, 313, 149 (1985)]. Amint azt aza1ábbiakbán részletessebben leírjuk, azt találtuk., hogy a jelen találmány szerinti po1ipeptideket kódoló nukleinsav szekvenciák különösen jól expresszá1 ódnak a pMG-1 E. coli expressziós vektorban. A pMG-1 vektor származékait, amelyek az NSlSi~töl különböző hordozó fehérjéket kódolnak, például az R32-t és galK-t, szintén előnyösen használhatjuk.
A jelen találmány szerinti eljárást Streptomyces-ben végrehajtva, a jelen
DNS szekvenciát egy találmány szerinti polipeptidet kódoló
Streptomyces vektoron belül egy szabályozó rég ióhoz kapcsoljuk, ezzel transzformálunk
Streptomy ces sejteket
A szabályozó régió promotert tarta1 máz, amely az
RNS polimeráz kapcsolódását és a transzkripciót befο1yásó 1ja. A szabályozható, indukálható vagy derepresszá1 ható promoterek az előnyösek.
Számos különböző hasznos promoter ismert heterológ polipeptideknek Streptomycesben való expresszá1ása céljára.
Ilyen például a Streptomyces galaktóz operon galaktózzal indukálható promotere [Fornwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2130, (1987)], a Streptomyces lividans (3-ga 1 ak toz idáz gén konstitutív promotere [Eckhardt et al., J. Bacteríol., 169, 4249 (1987); Brawner et al., 4,717,666 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás] és a Streptomyces longisporus tripszin inhibitor gén konstitutív promotere (87 307 260.7 sorszámú európai szabadalmi bejelentés), vagy egy időlegesen szabályozott promoter, mint amilyet a M. echinosporsa törzsnél írtak le [Baum et al., J. Bacteríol., 170, 71 (1988)]. A Streptomyces
-15transzkripciós terminációs régiók bizonyos Streptomyces gének 3' végéről származnak, például a Streptomyces galaktóz operon végén levő terminációs szignál, vagy az, amit a Streptomyces f rád i ae neomi cin-főszfotranszferáz végén találtak [Thompson and Gray ,
Proc. Natl. Acad
Sci. USA, 80,
5190 (1983)]. A -fehérjéknek a sejtkbői való szolgáló szekvenciák közé tar toz i k például az, amelyet a
Streptomyces lividans β-galaktozidáz gén bő 1 izoláltak, a
Streptomyces lividans
LEP-10 gén (a
Θ7 307 260.7 sorszámú európai szabadalmi bejelentés), valamint az, amelyet a
Streptomyces
1ongisporus tripszin inhibitor génből izoláltak.
A jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló gént egy nagyobb DNS molekulába építjük be, amely egy genetikai szelekciós marker-rendszert tartalmaz. A szelekciós marker-rendszer bármely lehet azok közül az ismert marker-rendszerek közül amelyeken a marker szelektálható új fenotipust biztosít a transz forrná 11 sejteknek. A példák közé tartoznál a Streptomyces antibiotikum-rezisztencia gének, úgymint a tiostrepton rezisztenciát adó riboszomális metiláz [Thompson et al., Gene, 20, 51 (1982)], a neomicin főszfotranszferáz (Thompson et al., supra), és az eritromicin rezisztenciát biztosító riboszomális metiláz (Thompson et al., supra). A DNS molekula tartalmazhat még egy szekvenciát, amely autonóm replikációt biztosít Streptomycesben, ilyenek például pIJlOl származékok [Kaiser et al., Mól. Gén. Génét., 185, 223 (1982)] vagy egy SLP1 eredetű vektor [Bibb et al., Mól. Gén. Génét. 184, 230 (1981)]. A DNS molekula olyan markert is tarta1 máz hat, amely
• · · · ·
-161 ehetővé teszi a gén-sokszorozást.
Az ilyen markerek,
St reptomyces-ben a gén kópiaszámának megsokszorozását szolgálják, például a spektinomicin rezisztencia [Hornemann et al . ,
J. Bacteriol., 169, 2360 (1987)] és az arginin auxotrófia [Altenbuchner et al., Mól. Gén. Génét. 195, 134 (1984)]. A jelen találmány szerinti eljárást élesztőben végrehajtva, a jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvenciát egy élesztő vektoron belül egy szabályozó régióhoz kapcsoljuk, ezzel transzformálunk élesztő sejteket. Bármely olyan élesztő gazdaszervezet használható, amelyhez transzformációs, klónozási és expressziós rendszerek léteznek. Ilyenek például a Hansenula, Pichia, K1uyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida és Saccharomyces nemzetséghez tartozó élesztők. Az előnyösen használható élesztő gazdaszervezet a Saccharomyces cerevisiae.
A szabályozó régió promotert tartalmaz, amely az RNS polimeráz kapcsolódását és a transzkripciót befolyásolja. A szabályozható, azaz indukálható vagy derepresszá1 ható promoterek az előnyösek. Számos különböző hasznos promoter ismert heterológ polipeptideknek élesztőben való expresszálása céljára. Ezek közé tartozik például a rézzel indukálható metállotionein gén (CUP1) promotere és a glikolizis génjei közül a g1icera1dehid-3-főszfát dehidrogenáz (TDH3) és az alkohol dehidrogenáz (ADH) gén promotere. Az élesztő transzkripciós terminációs régiói valamely élesztő gén 3' végéről származnak, például az izo-l-citokróm C (CYC1) génből.
» ·
A jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló gént egy nagyobb DNS molekulába építjük be, amely egy genetikai szelekciós marker-rendszert tartalmaz. A szelekciós marker-rendszer bármely lehet azok közül az ismert marker-rendszerek közül amelyeken a marker szelektálható új Genotípust biztosít a transzformált sejteknek. A példák közé tartoznak az élesztő bioszintetikus enzimeinek génjei, például a főszfo-ribozi1-antrani1át-izomeráz (TRP1) vagy az orotidin-5'-főszfát-dekarboxi1áz (URA3), valamint az antibiotikum rezisztencia gének, például a GAJLS rezisztencia vagy a benomi1-antrani1át-izomeráz (TRP1), vagy a benomi1 rezisztencia (BÉNI). A DNS molekula tartalmazhat az élesztőben való autonóm replikáció biztositó szekvenciát, például az élesztő 2 mikronos plazmidjának őri régióját, vagy egy kromoszómái is autonóm replikációs régiót (ARS), például az ARSl-et, és egy élesztő centromérát (CEN), például a CEN3-mat, ezzel biztosítva a plazmid autonóm replikációját.
Még egyéb expressziós rendszerek is ismertek és könnyen hozzáférhetők. Például számos rovarsejt és ahhoz való expressziós rendszer található heterológ fehérjék expresszálására, például egy baculovirus expressziós rendszer heterológ fehérjék Lepidoptera sejtekben való expresszá1ására. Ha szükséges az expresszió befolyásolása eukarióta expressziós rendszerek ben, akkor szükséges lehet a felületi fehérje karboxi terminális horgonyzó régiójának deléciója. Csak példaként említjük, hogy a Plasmodium falciparum karboxi-terminá1is horgonyzó régióját jelentő 392-412 sorszámú aminosavak deléciójára lehet szükség. (Lásd
-18például az 1988 december 21-én benyújtott 07/287,934 sorszámú Amerikai Egyesül Allamok-beli függő szabadalmi leírást, amelyre a továbbiakban hivatkozunk).
Más példa expressziós rendszerre az, amelyet az 1988 július 28-án benyújtott. 07/222,202 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek, erre a leírásra a továbbiakban hivatkozunk, ez olyan Salmonella baktérium törzsre vonatkozik, amelyet egy E.coli promoter szekvenciához kapcsolt kiválasztott heterológ génnel transzforrná 1unk , és a transzformáns képes konstitutív m ódon expresszálni a heterológ gén termékét.
Az így expresszált poli peptideket a termelő sej ttenyészetbői standard fehérje-izo1á1ási módszerekkel ezek közül számos jól ismert szakirodalomban.
Például egy használható tisztítási eljárás sémája a következő lehet:
(1) a baktériumsejtek feltárása (2) a sejttörmelék eltávolítása (3) a jelen találmány szerinti polipeptidek elválasztása a többi, a tisztított sejt-extraktumban levő fehérjétől (4) végső tisztítás a maradék szennyező anyagok e1 távolítására, beleértve a maradék polipeptideket, szénhidrátokat, nuk1einsavakat, 1ipopoliszacharidokat és endotoxinokat.
A találmány szerinti vakcinában közvetlenül a polipeptid vizes oldatát használhatjuk, előnyösen fiziológiás pH-n pufferelve. Egy másik módszer szerint a po1ipéptideket • · · • · · • ♦ · · · · ·♦··**· · · «·· ·
-19bárme1y ismert adjuvánssa1 vagy adszorbeáltathatjuk.
Az adjuvánsok közé tartozik például az aluminium-hidroxid, murami1-dipeptid és a szaponinok, például a Quil
A.
szerint a polipeptideket mikrorészecskékbe, például
1i pcszómák ba kapszulázhatjuk.
Egy másik, eltérő megoldás szerint, a jelen találmány szerinti polipeptideket egy immunstimu1á1ó mákromo1eku1áva1 konjugá1 hatjuk, például elölt SordetelIával vagy tetanusz toxoiddal.
A vakcina készítményeket általánosságban a kővetkező szakkönyvben ismertetik: New Trends and Developments in
Vaccines, Voller et al., University Park Press, Baltimore, ND, USA (197S). A liposzómákba való k.apszulázást például a Fullerton féle 4,235,077 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban ismertetik. A fehérjéknek mákromolekulákkal való konjugálását a Likhite féle 4,372,945 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban és az Armor et al. féle 4,474,757 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban ismertetik. A Quil A használatát Dalsgaard és munkatársai ismertetik [Acta Vet. Scand., 13,349 (1977).
Az egyes vakcina dózisban található polipeptid mennyisége annyi, amennyi védekező immunreakciót vált ki lényeges káros mellékhatás nélkül. Ez a mennyiség attól függ, hogy milyen polipeptidet használunk, valamint attól, hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst. Általában az várható, hogy mindegyik dózis 1-1000 pg polipeptidet tartalmaz, előnyösen 10-200 pg-ot. Egy adott vakcinánál az optimális mennyiséget külön vizsgálatokkal határozzuk meg, beleértve ·· ··♦· ·· ··«· ···· • · · ♦ · · · • ··· ♦ · ··· · • · · · « · *·····♦ ·♦ ··· · az antitest titerek megfigyelését, valamint az alanyok más reakcióit. Egy indító vakcinálás után körülbelül négy héttel az alanyok előnyösen egy gerjesztő dózist kapnak, ezt újab gerjesztő dózisok követik minden hat hónapban, egészen addig, amíg a fertőzés veszélye fennáll.
Általában az intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás adagolási mód az előnyős, bár néhány esetben más adagolási mód is használható. Például ha rekombináns Salmonellát használunk, akkor az adagolás előnyös útja a szájon át való adagolás.
A következő példák csak illusztrációk, nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
A CS fehérje kódoló szekvenciáját
James Weber szolgáltatta (Walter Reed Army Institute fór
Researeh), a lambda f ragmen tj e formáj ában [Dame et
Science, 225. 593 (1984)] a pUC8, egy standard E.
coli klónozó vektor EcoRI helyéré k 1 ónozva (kapható
Bethesda
Research
Laboratories-tó1, Gaithersburg, MD). A kapott pUCS kiónra a továbbiakban mint a pUC8 1-es kiónra hivatkozunk.
1. Példa
A pNSleiRL9 előállítása
Röviden összefoglalva, a pNSlSiRL9 plazmidot a következőképpen állítjuk elő. A pCSP (leírása az alábbiakban következik), ami egy E.coli expressziós vektor, egy olyan 1216 bázispár méretű fragmentet tartalmaz, amely az első 18 aminosav kivételével a teljes Plasmodium falciparum cirkumsporozoi ta (CS) fehérjét kódolja, elsö alikvotját Fok I restrikciós enzimmel emésztjük, a végeket • ··
-21feltöltjük (Klenow fragmenttel), majd BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott 319 bázispár méretű f ragmen tét, amely a CS fehérjének a 19. (Leu) és
123. (Pro) aminosav közötti részét kódolja elektroelúcióval kinyerjük.
A pCSP egy másod i k alikvot részét
Tthl11
I enzimmel végei t feltöltjük, majd Sáli restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott 655 bázispár méretű fragmentet, ame 1 y a CS fehérje 297. (Gly) &<=> 412. (Asn) aminosav közötti részét kódolja, e1ektroe1úcióva1 izoláljuk.
(Ebből szekvenciából hiányzik a ΙΙ-es régiót tartalmazó határoló régió 9 N-terminális aminosava, a 289. (Pro) és a 296. (Gin) közötti rész. )
A CS fehérjét kódoló 318 bázispár méretű és 655 bázispár méretű gén-fragmenteket E. coli expressziós vektorba ligáljuk (leírása az alábbiakban), amelyet előzőleg BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettünk. A kapott vektor jele pUCRL9.
A pUCRL9 vektort BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük, végeit feltöltjük, majd Sáli restrikciós endonukleázza1 emésztjük. A kapott 1035 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehérje 19. és 123. aminosava közötti részt, valamint a 297. és 412. aminosava közötti részt kódolja, elektroelúcióval nyerjük ki.
A pMG-1 expressziós vektort (leírása az a 1ábbiakbán), amely az influenza vírus nem strukturális 1-es fehérjéjének N-terminális aminosavait az 1. (Met) és a 81. (Met) kódoló DNS fragmentet tartalmazza, valamint egy szintetikus DNS linkért, EcoRV és Xhol endonukleázokkal emésztjük. Az előzőleg a pUCRL9 vektorból izolált 1035 bázispár méretű • · · · · · ··· · 4 4 ·* • · · · · · *«····· 9 fragmentet ezután a pMG-1 vektorba ligáljuk. fi kapott expressziós vektor, a pNSlSiRL9 a kővetkező aminosav sorrendű fehérjét kódolja:
NSlsi-fisp-His-Met-Leu-Thr-fisp-Pro-CSi^-i^r.-CS-^y-eiz
A pNSlaj_RL9 vektor előállítását az alábbiakban rész 1etez zÜk.
A. A pCSP plazmid előálítása pg tisztított pUC 1-es klón plazmid DNS-t emésztünk Stul és Rsal restrikciós endonukleázokkal (mindegyik enzimből 100 egységet használunk) 400 pl közepes pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 50 mmól NaCl, 1 mmól ditíotreitol (DTT) és 10 mmól MgCl=, pH=7.5) 1.5 órán át 37°C-on A kapott 1216 bázispár méretű fragmentet, amely az első IS aminosav kivételével (amelyekről úgy gondolják, hogy a CS fehérje szignál szekvenciáját kódolják) a teljes cirkumsporozoita (CS) fehérjét kódolja, elektroforézissel izoláljuk 67.-os poliakrilamid gélből (PAGE), majd elektroelúcióval kinyerjük.
A pASl expressziós vektorból (ATCC 39262, részletesebb leírása megtalálható a Rosenberg féle 4,578,355 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban) tíz mikrogramot 25 egység BamHI restrikciós endonuk1eázza1 emésztünk 200 pl, az előzőkben ismertetett összetételű közepes erősségű pufferben 1.5 órán át 37°C-on. Az emésztett plazmidot ezután 15 percig 25°C-on a DNS polimeráz I nagy fragmentjéve 1 kezeljük (5 egység Klenow fragment 20 mmól • · · • · · · · • · · · · « * · · · · · ··♦···· ·· ··* ·
-23TRIS-HC1 pH=7.5, mmól MgCl=, mmól
NaC1< 6 mmó1
2-merkapto-etano1 és 0.25 mmól mind a négy dezoxinukleotid trifőszfátbó1) a BamHI vég fe1tö1tésére.
A cirkumsporozoita fehérje gén-fragmentet (1 pg ) ezután
100 ng fenti vektorba ligálunk 30 pl ligáz pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 1 mmól DTT, 10 mmól (*1gCl2, 100 pmól rATP, pH=7.5) egy egység
T4 DNS ligázzal órán át
4°C-on.
1igáló elegyet
E.coli MM294CI+ törzsbe transzformáljuk. Ampicillin rezisztens telepeket kapunk, ezeket levizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a pASl vek torba építve a CS gén-fragmentét. Egy megfelelő szerkezetű □lazmidot (pCSP) azonosítunk.
B. A pUCRL9 készítése
100 pg tisztított pCSP p1azmid DNS-1 emész tűn k 100 egység Fok I endonukleázzal 400 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd előzőkben) 3 órán át 37‘C-on. Ezt követően a plazmidot a DNS polimeráz I nagy fragmentjéve1 kezeljük (lásd fent) a Fok I vég fe1tö1tésére. A plazmidot ezután 100 egység BamHI restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük 400 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd az előzőkben) 3 órán át 37°C-on. A kapott 318 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehrje 19-293. aminosavait kódolja, 67.-os pol iakri 1 amid gélen (PAGE) végzett elektroforézissel izoláljuk, majd elektroelúcióval kinyerj ük.
A pCSP egy további alikvot részét (100 pg) 100 egység
Tthlll I restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük 400 pl közepes • · · · * · ··
-24erősségű pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át
65’C-on. Ezt követően a plazmidot a
DNS polimeráz I nagy fragmentjével kezeljük (lásd fent) a Tth111 vég feltől tésére .
A plazmidot ezután
100 egység Sál I endonuk1eázza1 kezeljük 400 μΐ közepes erősségű pufferben 3 órán át 37’C-on, és a keletkező 655 bázispár ame 1 y a C-S fehérje 297-412 . aminosavait kódolja,
67.-os po1i a k ri1 amid gél en futtatjuk, máj d e 1 ektroe1úcióva1 kinyerjük.
Tíz mikrogram pUCIS expressziós vektort [Yanish-Perron et al., Gene, 53, 103 (1985)], egy standard E.coli expressziós vektort (beszerezhető például a Bethesda Research Laboratories, Inc.-töl, Gaithersburg, MD) 20-20 egység BamHI és Sáli restrikciós endonuk1eázza1 200 μΐ közepes erősségű pufferben (összetételét lásd fent) emésztünk 2 órán át 37°C-on. A 318 bázispár méretű Bamhl végfel töltéses /Fok I fragmentet (1 pg ) és a 655 bázispár méretű Tthlll I végfeltöltéses /Sáli fragmentet (1 pg ) eztán pUC18 vektorba ligáljuk 30 pl ligáz pufferben (összetételét lásd fent) egy egység T4 T4 DNS ligázzal 16 órán át 4°C-on. A megfelelő szerkezetű plazmidot (pUCRL9) azonosítjuk.
C. A pMG-1 plazmid készítése
A pMG27N- expressziós vektorból tíz mikrogramot [M. Gross et al., Mól. Cell. Bioi., 5, 1015 (1985)] 50-50 egység
BamHI és Sac I restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl közepes ionerösségü pufferben (lásd fent) 3 órán át 37’C-on.
A pAPR801 expressziós vektorból [Voung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6105 (1983)], amely az influenza « *· • · ·t · • · 9 · · * • 9 9 9 «· ···♦··· 9 9 **·t
-25vírus (A/PR/8/34) nem-strukturális 1-es fehérjéjét (NS1) kódoló régiót
Acids
Research, 8, 5845 (1900)] tíz mikrogramot emésztünk
20-20 egység Ncol é
BamHI restrikciós enzimmel
200 μΐ magas sótartalmú pufferben (50 mmól TRIS-HC1, 1 mmól
DTT, 10 mmó 1
MgCl = és 100 mmól NaCl, pH=7.5) két órán át 37eC-on. A keletkező 230 bázispár méretű fragment, amely az NS1 első 81 N-terminális aminosavát kódolja, 67.-os poliakrilamid gélen (PAGE) elektroforetizá1juk, majd elektroelúcióval izoláljuk.
A BamHI/ SacI enzimekkel hasított pMG27N- (leírása a fentiekben) vektorból negyven nanogramot ligálunk 80 ng 230 bázispár méretű NcoI/BamHI NSlsx-et kódoló fragmenttel és 80 ng szintetikus linkerrel, melynek szekvenciája a következő:
AspHisMetLeuThrAsp
5'CATGGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT 3'
BamHI 3' CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC 5' SacI
A keletkező pMG-1 plazmidot azonosítjuk annak a BamHI helynek az alapján amely akkor keletkezik, amikor az NS19i kódoló szekvenciát a pMG27N- BamHI helyére ligáijuk; annak az Ncol helynek az alapján, amely akkor keletkezik, amikor az NSlai kódoló szekvenciát az Ncol végénél a szintetikus linker Ncol helyére ligáljuk; valamint annak a SacI helynek az alapján, ami akkor keletkezik, ha a szintetikus linkért a SacI végénél a pMG27N- vektor SacI helyére klónozunk. Ez a vektor egyedülálló restrikciós felismerési helyeket • « * *·· tartalmaz, amelyek lehetővé teszik, hogy DNS fragmenteket a három leolvasási keret bármelyikében beépíthessünk a vektorba, a TGA terminációs kodont mind a három leolvasási keretben tartalmazza a cll riboszomális kötőhely ATG iniciációs kodonjától 3' irányban, ennek eredményeképpen expresszió esetén mindhárom leolvasási keretben kapunk NSlSi fúziós fehérjéket. Ha a pNG-1 plazmidot Ndel restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük, ezt követően a vektort a fentiek szerint ligáljuk, igy nem-fúziós fehérjéket expresszá 1 link (azaz, nem fúzioná1 ódnak az NSlsl-hez).
D. A pNSIbiRL? előállítása.
100 pg pUCRLf expressziós vektort 100 egység SamHI restrikciós endonuk1eázza1 emésztünk 400 pl magas sótartalmú pufferben 3 órán át 37eC-on. Az emésztett plazmidot ezt követően a DNS polimeráz I nagy fragmentjévé1 kezeljük (lásd fent), a SamHI hasítási hely feltöltése céljából. A plazmidot ezután 20 egység Sáli restrikciós enzimmel emésztjük közepes ionerösségü pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át 37°C-on. A keletkező 1035 bázispár méretű fragmentet 67.-os po 1 iák ri 1 amid gélen (PAGE) elektrofőretizá1juk, majd e1ektroe1úcióva1 kinyerjük.
A pMG-1 expressziós vektorból 10 pg-ot 25-25 egység EcoRV és Xhol restrikciós enzimmel emésztünk közepes ionerösségü pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át 37°C-on, Ezután a pUCRLf vektor 1035 bázispár méretű BamHIvégfel töltéses/SalI fragmentjét a fenti vektor 100 ng-jával ligáljuk 30 pl 1igáz pufferben (összetételét lásd fent) egy egység T4 DNS ligázzal 16 órán át 4°C-on.
-271 iqá1ό e1 egyet
E.coli
MM294C1+ törzsbe transz forrná 1 juk . A kapott ampicillin rezisztens telepeket átvizsgáljuk, hogy tarta1 mázzák-e megfelelő orientációban a beépített gént. A megfelelő szerkezetű plazmidot azonosítjuk (pNSleiRL9)
E.co1i
AR58 (CIts857) törzsbe transzformá1juk, és vizsgáljuk, hogy expresszá1 ódik-e a következő összetételű cirkumsporozoita fehérje géntermék: hiányzik belőle az első 18 N-terminális aminosav (CSi_ls), benne van a központi ismétlődő dómén és a 9 N-terminális aminosav a határoló régiót tartalmazó ΙΙ-es régióból (, amely a pMGl expressziós vektorba ligáit szintetikus linker által, kódolt 6 aminosavon keresztül (Asp-His-Met-Leu-Thr—Asp) kapcsolódik az influenza nem szerkezeti 1-es fehérjéje első 81 aminosavához, az NSlsi-hez. Az NSls=RL9 szekvenciája a következő:
NS131-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS-1,_1-3-CS297-4iAz Asp-t (a szintetikus linker C-terminálisáról) az RL9 (CS13-i~t.-CS297-4i x) - tő 1 elválasztó Pro műtermék, amely akkor keletkezik, amikor a pCSP BamHI/Fokl fragmentjének BamHI végét feltöltjük.
A sejteket Luria-Bertani táptalajon (LB) növesztjük 32’C-on addig, amíg a 650 nm-en mért abszorbanciája (A^^o) a 0.6-os értéket eléri, majd majd a tenyészet hőmérsékletét 42°C-ra emeljük, ezzel indukáljuk az expressziós plazmid PL promoterének transzkripcióját, majd az NSlax CS fehérje-származék transz 1ációját. A sejtekből 1 ml-es mintákat veszünk, ülepítjük, lizis pufferben szuszpendá1juk, (lOmmól ·» »··4 ·· ···· »οι • · · * · · · « *♦· · · ··♦ · • « · * · « ·*·· ··· ·· ·»Β 4
-28TRIS-HC1 ρΗ=7.8 , 25 tf7. glicerin, 27. 2-merkapto-etano1 , 27.
nátrium-dodeci1-szulfát (SDS), 0.17. brómf enol kék ) , majd egy 105‘C-os hevítő blokkban 5 percig inkubáljuk.
A fehérjéket SDS-poliakri1 amid gé1e1ektrofőrézisse1 (SDS-PAGE) választjuk szét (137. akrilamid, 30:0.Θ akrilamid; bisz-akri1 amid arány ) A fehérjéket nitrocellulóz membránra visszük, és az E. coli által termelt NSlsiRL9 fehérjét Western Biot módszerrel detektáljuk, a CS fehérje I-es Régió-jával reagáló poliklonális antitestet használva erre a célra [Dame et al., Science,225, 593 (1984)], valamint az
NSlsx fehérjével reagá1ó poliklonális anti testet. Az E.co1i által termelt NSlslRL9 fehérjéről kiderült, hogy nem reagál 5 olyan monoklonális antitest keverékével, amelyek a Plasmodium falciparum CS fehérjéje ismétlődő tetrapeptid doménje ellen irányulnak.
2. Példa
A pNSlsxRLfAuth plazmid elöáállitása
A pCSP E.coli expressziós vektort (lásd fent) közepes ionerösségü pufferben BamHI és Fok I restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott DNS fragmentet, amely az I-es régiót tartalmazó határoló szakaszt tartalmazza az első IS N-terminális aminosav kivételével, elektroelúcióval nyerjük ki.
A pCSP egy másik részét Tthlll 1 és Sál I restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük közepes ionerösségü pufferben. A kapott DNS fragmentet, amely az első 9 N-terminális aminosav kivételével a ΙΙ-es Régiót tartalmazó határoló szakaszt
-29tartalmazza, e1ektroe1úcióva1 kinyerjük
Sál ·· ···· ·· ···♦ ·*·· • · ♦ · · · · • ··· · · ··· · * · · · · · ···· ··· ·· ··· 4
A pUC18 E.coli expressziós vektort (lásd fent) restrikciós ionerösségü pufferben.
A II-es dómén j ét
Tthl11 vesztek el sz in teti kus
BamHI és endonuk1eázokka 1 emésztjük közepes régió, amely a tarta1 máz za, szekvenciával
CS helyreállitására, fehérj e központi ismét 1ödö
N-terminá1 is aminosavának amely aminosavak restrikciós endonuk1eázza1 egy Fok I és Tthl11 1 in kért á11i tunk rendel kéz ik elő, pCSP való emésztésekor véggel ame 1 y rendel k.ezö k övetkezö
AspProG1yAsnLysAsnAsnG1nG1yAsnG1yG1n
5' ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA 3'
Fok I 3'
GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT
5' Tthlll 1
A BamHI/Fok I fragmentet, a Tthlll 1/Sal I fragmentet és a szintetikus fragmentet a BamHI/ Sál I restrikciós endonukleázokkal emésztett pUC18 vektorba ligáljuk.
A keletkező plazmidot, jele pUCRLfAuth, BamHI restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük közepes ionerösségü pufferben, a végeit feltöltjük, majd Sál I restrikciós endonukleázzal emésztjük. A keletkező DNS fragmentet, amely a helyes cirkumsporozoita fehérj ét tartalmazza az első 18 N—terminális aminosav és a központi ismétlődő dómén kivételével, elektroelúcióval kinyerjük.
Az izolált BamHI-végfe1tö1téses/Sa1 I fragmentet ezután az NSlsl-et kódoló E.coli expressziós vektorba, a pMG-l-be
| ·· »··· | ·« | ··»· | • •f · |
| • · · | • · | • | • |
| • ··· | • · | ··· | • |
| • · | • · | • | • |
| ···· ··· | ·· | ··· | • |
-30liqáljuk (lásd fent), amelyet előzőleg EcoRV és Xhol restrikciós endonukleázokkal emésztettünk. A keletkező vektor, a pNSlsxRLfAuth a következő szekvenciáiú fehérjét expresszá1 ja:
NSlsx-Asp-His-Met-Leu-Thr—Asp-rro-CSi,_1Z3-Gly-CS-s=-4x = (Az I-es Régiót s ΙΙ-es Régiót tartalmazó CS határoló szakaszokat (CSX^_X=3? és CS-se_^x=) elválasztó glicin a szintetikus Fokl/Tthlll 1 DNS linker szekvencia műterméke.
Az NSlexRLfAuth teljes nukleotid és aminosav szekvenciája a következő:
• · • ··« · ···· • · · · · • · · · ··· ·· · · * —1K MS I
ATggatccaaacactgtgtcaagctttcaggtagattgctttctttggcatgtccgcaaa
--------->---------♦---------♦---------t---------♦---------«. 50
TAcctaggtttgtgacacagttcgaaagtccatctaacgaaagaaaccgtacaggcgtct
I
MetAspProAsnThrValSerSerPheGlnValAspCysPheLeuTrpHisValArgLys cgagttgcagaccaagaactaggtgatgccccattccttgatcggctccgccgagatcag
61---------+--------->---------♦---------+---------+---------* 120 gctcaacgtctggttcttgatccactacggggtaaggaactagccgaagcggctctagcc
ArgValAlaAspGlnGluLeuGlyAspAlaProPheLeuAspArgLeuArgArgAspGln aaatccctaagaggaaggggcagcactcttggtctggacatcgagacagccacacgeget ^21____-____ + _____>_______----------------♦---------*. 180 tttagggattctccttccccgtcgtgagaaccagacctgtagctctgtcggtgtgcacga LysSerLeuArgGlyArgGlySerThrLeuGlyLeuAspIleGLuThrAlaThrArgAla ggaaagcagatagtggagcggatcctgaaagaagaatccgatgaggcacctaaaatgacc
131---------+---------+---------♦---------*---------+ cctttcgtctatcacctcgcctaagactttcttcttaggctactccgtgaattttactgg
GlyLysGlnlleValGluArglleLeuLysGluGluSerAspGluAlaLeuLysMetThr -
| atg | —-¼ L < n <* <-> gatcacatgtcaacagat | ccc | r*·45 TTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGTTCGTCA |
| tac 81 Met | ccagtatacaattgtcta AspHisMetLeuThrAsp | ggc Prc | AATAAGGTCCTTATGGTCACGATACCTTCAAGCAGT R LeuPheGlnGluTyrGlnCysTyrGlySerSerSer |
AACACAAGGGTTCTAAATGAATTAAATTATGATAATGCAGGCACTAATTTATATAATGAA
301---------♦---------+---------+---------♦·---------+-♦ 360
TTGTGTTCCCAAGATTTACTTAATTTAATACTATTACGTCCGTGATTAAATATATTACTT
AsnThrArgValLeuAsnGluLeuAsnTyrAspAsnAlaGlyThrAsnLeuTyrAsnGlu TTAGAAATGAATTATTATGGGAAACAGGAAAATTGGTATAGTCTTAAAAAAAATAGTAGA
361---------+---------+---------+---------+---------«., 420 aatctttacttaataataccctttgtccttttaaccatatcagaattttttttatcatct
LeuGluMetAsnTyxTyrGlyLysGlnGluAsnTrpTyrSerLeuLysLysAsnSerArg TCACTTGGAGAAAATGATGATGGAAATAATAATAATGGAGATAATGGTCGTGAAGGTAAA
421---------♦---------+---------*---------+---------+♦ 430
AGTGAACCTCTTTTACTACTACCTTTATTATTATTACCTCTATTACCAGCACTTCCATTT
SerLeuGlyGluAsnAspAspGlyAsnAsnAsnAsnGlyAspAsnGlyArgGluGlyLys 481
GATGAAGATAAAAGAGATGGAAATAACGAAGACAACGAGAAATTAAGGJAAACCAAAACAT +---------*
CTACTTCTATTTTCTCTACCTTTATTGCTTCTGTTGCTCTTTAATTCdTTTGGTTTTGTA ··?
AspGluAspLysArgAspGlyAsnAsnGluAspAsnGluLysLeuArqLysProLysHis
| AAAAAATTAAAGCAACCAGGGGATGGTAATCCT | □ATCCc | agg | aataaaaacaaccaaggt |
| TTTTTTAATTTCGTTGGTCCCCTACCATTAGGA •Al LysLysLeuLysGlnProGlyAspGlyAsnPrc | ZTAGGg UL JA3 4sp?rc | ccc Gly | r. tar. tr. t tgttg<jt.tcca AsnLysAsnAsnGlnGly |
aatggacaaGGTCACAATATGCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTAAT
601---------+---------+·---------♦---------♦---------+---------* 6ttacctgttCCAGTGTTATACGGTTTACTGGGTTTGGCTTTACATCTACTTTTACGATTA ZW
AsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAlaAsn GCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAACAA
661 ---------*---------+---------·♦---------*---------*---------♦ Ί·
CGGTTGTTACGACATTTTTTATTATTATTGCTTCTTGGTTCACTATTCGTGTATCTTGTT
AlaAsnAsnAlaValLysAsnAsnAsnAsnGluGluProSerAspLysHisIleGluGln
721
781 /-¼ SAjv.n JT
TATTTAAAGAAAATAAAAAATTCTATTTC£{ACTGAATGGTCCCCATGTAGTGTAACTTGT
---------+>
ATAAATTTCTTTTATTTTTTAAGATAAAGTfTGACTTACCAGGGGTACATCACATTGAACA
GGAAATGGT \TTCAAGTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCTAATAAACCTAAAGACGAATTA h---------+---------+--------->---------+
CCTTTACCA rAAGTTCAATCTTATTTCGGACCGAGACGATTAT-TTGGATTTCTGCTTAAT iSí
GlyAsnGly|lleGlnValArgIleLysProGlySerAlaAsnLysProLysAspGluLeu
GATTATGAAAATGATATTGAAAAAAAAATTTGTAAAATGGAAAAATGTTCCAGTGTGTTT 841---------+---------+---------+---------+---------+-----'+ 9C
CTAATACTTTTACTATAACTTTTTTTTTAAACATTTTACCTTTTTACAAGGTCACACAAA
AspTyrGluAsnAspIleGluLysLysIleCysLysMetGluLysCysSerSerValPhe -
AATGTCGTAAATAGTTCAATAGGATTAATAATGGTATTATCCTTCTTGTTCCTTAATfTAG + ttacagcatttatcaagttatcctaattattaccataataggaagaacaaggaattaIatc
AsnVa 1 Va 1 As nSe r Ser IleGly Leül leMetValLeuSerPheLeuPheLeuAsnF.nd ATAA
961 ---- 964
TATT
- * 96
3. Példa
A pNSlsxRLfAuth+(NANP ) = előállítása
Az előzőkben említett pNSlslRLfAuth plasmidot Smal restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük közepes ionerösségü puf ferben (1 elrása az előzők ben, plusz KCl-ot tartalmaz)
25°C-on 3 órán át.
A Smal restrikciós endonuk leázzal emésztett pNSlsxRL-f Auth plazmidba egy szintetikus DNS linkért ligálunk. Szekvenciája a kővetkező:
AsnA 1 aAsnProAsnA1aAsnPro
5' AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC 3'
3' TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG 5'
A szintetikus
DNS linker a (NANP)--t kódolja (egybetüs kódok az aminosavak jelzésére, N=aszparagin (Asn); A=alanin (Alá);
(Pro)), a tetrapeptid a CS fehérje immunodomináns ismét 1Ödő egységének úgynevezett konszenzus szekvenciá j át kódolj a.
A pNSlsxRLfAuth Smal endonukleázzal való emésztése lehetővé teszi, hogy tetszőleges számú, szintetikus DNS linker által kódolt ismétlődő tetrapeptidet építsünk a CS fehérjének erre a helyére, amelyet korábban az immunodomináns ismétlődő dómén foglalt el. További tetrapeptidet kódoló DNS fragmentek ligálhatók ilymódon a vektorba. A kapott plazmid, a pNSlexRLfAuth+(NANP)- a kővetkező szekvenciával rendelkező pepiidet kódolja:
NSlSi-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS1<?_x = 3- ( NANP ) =81y“CS^gs—4i2
4. Példa
A pNSlsi(NANP)aRLfAuth plazmid előállítása
| Az | előzök szerint előállított pUCRLfAuth expressziós |
| vektort | BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük. |
| Egy | szintetikus, (NANP)^-et kódoló DNS fragmentet |
ligálunk a BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett pÜCRLf vektorba. A szintetikus DNS fragment szekvenciája a következő:
ProAsnA1aAsnProAsnA1aAsnProAsnAlaAsnProAsnA1aAsnPro
5'GATCCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCTAACCCCAACGCTAACCCC
3' GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTGCGATTGGGGTTGCGATTGGGGCTAG
A keletkező plazmid jelzése pUClS(NANP)4RLfAuth.
A pUClS(NANP)4RLfAuth expressziós vektort BamHI restrikciós endonukleázza1 emésztjük, végeit feltöltjük (Klenow fragment), Sáli restrikciós endonuk1eázza1 emésztjük, majd a keletkező DNS fragmentet e1ektroe1úcióva1 kinyerjük.
A BamHI végfe1 tő 1téses/Sa1I fragmentet az NSlsl-et kódoló pMGl expressziós vektorba (leírása az előzőkben) ligáljuk, amelyet előzőleg EcoRV és Xhol restrikciós endonukleázzal emésztünk. A keletkező plazmid jelzése pNSlsi(NANPURLfAuth, és egy olyan fehérjét kódol, amelyben a szintetikus DNS fragment által kódolt ismétlődő aminosava (Met) és az NcoI/SacI sz inteti kus
DNS linker N-terminális
Asp-je közé van i11es2 tve:
NSlsx-( NANP ) Α-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS x=-.— Gly — 0^238 — 4x3
5. PéIda
A pNSlsi. ( NVDP ) ARLf Auth plazmid előállítása
A pNSlsi(NVDP)RLfAuth plazmidot ugyanúgy állítjuk elő mint a pNSlsx(NANP)^RLfAuth plazmidot, azzal a különbséggel, hogy az (NVDP)^-et (a CS fehérje központ i ismétlődő doménjének egy variáns tetrapeptid szék, véneié j a ) k ódo1ó szintetikus DNS linker szekvenciája a k övetkezö:
AsnValAspProAsnVa1AspProAsnVa1AspProAsnVa1
5' GATCCCAATGTAGACCCCAACGTTGATCCGAACGTAGACCCGAATGTA 3'
3' GGTTACATCTGGGGTTGCAACTAGGCTTGCATCTGGGCTTACAT 5'
A keletkező plazmid a következő szekvenciájú fehérjét kódolj a:
NSlsx ( NVDP ) ^-Asp-His-Met-Leu-Thr—Asp-Pro-CSx^_13;3G 1 y CSzss — ά x 2
6. Példa
Az NSlsxRL9 izolálása E.coliból
Az NSleiRL9 szintézisének indukálása után hőmérséklet érzékeny lambda lizogénben (CIts957) a bak tériumsejteket centrifugá1 ássa 1 összegyűjtjük, és a kapott csapadékot -70°C-on tároljuk. A koncentrált, 1efagyasztott sejtből körülbelül 12g-ot megolvasztunk olymódon, hogy 120 ml lizáló • · · · · * *
pufferoldatba tesszük (összetétele: 50 mmól TRIS pH=8, 10 mmól EDTA, 5 7. glicerin és 10 mmól ditiotreitol (DTT)). Lizozimet (Sigma Chemical Co. , St. Louis, NO) adunk hozzá 0.2 mg/ml végkoncentrációban, és az oldatot 30 percig 4'C-on kevertetjük. A sejteket Branson ultrahangos feltáróval feltárjuk, egészen addig, amíg az oldat elfο 1yósodottnak tűnik. 107.-os dezoxikolát oldatot adunk hozzá 0.1 tf7. koncentrációban, és az oldatot 15600 x g-vel centrifugáljuk 30 percig 4°C-on Sorvall RC 5B centrifugával (DuPont).
A felülúszót elöntjük, és a megmaradó fehérje-tarta1mú üledéket 100 ml pufferben szuszpendá1juk (összetétele 50 mmól glicin, 2 mmól· EDTA, 57. glicerin, pH=10). A szuszpenziót a fentiek szerint feltárjuk, és Triton Χ-100-at (Sigma) adunk hozzá 1 tf7. végkoncentrációban. A feltárt oldatot 30 percig kevertetjük 4eC-on és a fentiek szerint centrifugáljuk.
A fehérje-tartalmú felülúszóhoz karöamidot adunk Θ mól végkoncentrációban, és az oldat pH-ját 507.-os ecetsav oldattal 5.5-re állítjuk. Az oldatot 25 ml-es QAE Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopon kromatografá1juk, amelyet előzőleg egy pufferoldattal hoztunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrium-acetát, 1 7. Triton X-100 és Θ mól karbamid, pH=5.5), 300 cm/óra áramlási sebességgel. A fehérjét abban a frakcióban találjuk, amely nem kötődik, majd 10 ml-es Sp Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük, amelyet előzőleg egy pufferoldattal hoztunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrium-acetát, Θ mól karbamid, pH=5.5), 120 cm/óra áramlási sebességgel. Az elfolyó oldatot 280 nm-en monitorozzuk. A fehérjét erről az oszlopról 100 mmól TRIS, 8 ·♦ ·
...‘ ι mól karbamid, pH=8 összetételű pufferrel oldjuk le,
A kapott termék SDS-PAGE analízise egy körülbelül 40000 kD látszólagos molekulasúlyú fö csíkot mutat, ennek tisztasága körülbelül Θ07.. A tisztítási eljárással 12 mg olyan fehérjét kapunk amelynek aktivitása körülbelül 14 endotoxin egység/mg fehérje.
7, Példa
Az N51SiRL9 izolálása E.coliból
Az NSlsi szntézisének hőmérséklet érzékeny lambda 1i zogén ben való indukálása után a bak tér ium-sejtek et centrifugálással kinyerjük.és a kapott csapadékot -70’C-on tároljuk. A töményitett, fagyasztott sejtekből körülbelül 636 g-ot megolvasztunk 2200 ml puffer oldatban (60 mmól TRIS, 12 mmól EDTA, 67. glicerin, 12 mmól ditiotreitol (DTT) , pH=8.0). A megolvasztott sejteket egy Hanton Gaulin homogenizátoron bocsátjuk keresztül kétszer egymás után 6000-7000 psi nyomással. 10 7.-os dezoxikolát oldatot adunk hozzá 0.1 tf7. végkoncentrációban, a lizátumot 30 percig
4’C-on kevertetjük, majd
10000 x g-ve 1 centrifugáljuk
Sorva11
RC 5B centrifugával (Du
Pon t) percig 4’C-on
Az üledéket elöntjük, és μΐ
1050 vagy 2100 Biocryl gyöngy keveréket (Supelco) adunk a fehérje tartalmú felülúszó minden egyes milliliteréhez. Az oldatot kevertetjük majd a fentiek szerint centrifugáljuk.
Az üledéket eldobjuk, és a megmaradó fehérje tartalmú felülúszóhoz 207. telítettségig szilárd ammón ium-szu1fátot adunk öt percre.
• * · · » • · · · · » • · « · ·««« ··· ·· • «*
-38A szuszpenziót a fentiek szerint és centrifugáljuk.
Az üledéket
400 puffer oldatban szuszpendáljuk (összetétele 20 mmól mátr ium-acetát, 1 7.
Triton X-100 és 8 mól karbamid pH=5.5) Ezt a szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszót dializáljuk egy puf fer oldattal szemben (összetétele 100 mmól TRIS, Θ mól karbamid,
100 ml-es SP Sepharose Fást Flow oszlopon (Pharmacia) kromatografáljuk, amelyet előzőleg egy puffer oldattal hozunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrium-acetát, 1 7.
Triton X-100, 3 mól karbamid, pH=5.5), 10 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlopot az egyensúlyba hozó pufferrel mossuk, majd egy másik pufferre, amelynek összetétele 0.1 mól TRIS és 3 mól k arbamid, pH=8. Az oszlopot 500 ml,
0.0-0.5 mól közötti
1ineáris nátrium-k1orid gradienssel mossuk, ame 1 y
Ο.1 mó1
TRIS-t és mól karbamidot tartalmaz,
A fehérje
0.3 mó 1 nátrium-klórid koncén trá cióná1 e1uá1 ód i k.
egy Amicon kevert cellában töményítjük, YM 10 membránt alkalmazva és egy puffér oldattal szemben dializálva, amelynek összetétele mmól
TRIS, pH=3.0), majd foszfáttal puffereit sóoldattal szemben puffereljük (pH=7.0).
A kapott termék
SDS-PAGE elemzése szerint egy erős esik található benne
40000 kD átszó1agos molekulasúlynál, valamint számos mg fehérjét minor komponens. A tisztítási eljárás után kapunk, ennek aktivitása 144 endotoxin egység/mg fehérje * «
8. Példa
Az R16CSP izolálása E.coliból
Az E.co1ibán expresszált RÍ 6 CSP-1 úgy állítjuk elő hogy a pUC8 1-es kiónból (lásd fent) egy XhoII fragmentet pCSP-be (lásd fent) ligálunk, amelyet előzőleg BamHI restrikciós endonukleázza1 emésztettünk. Az R16CSP-t, amelyet ELISA befogó antigénként alkalmazunk a 9. példában, a következőképpen tisztítjuk.
Az R16CSP szintézisének E.coliban való indukálása után a baktériumsejteket centrifugá1 ássa 1 kinyerjük, és a kapott üledéket -20°C-on lefagyasztjuk. Körülbelül 373 g töményített, lefagyasztott sejtet megolvasztunk 1.43 liter pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 10 mmól EDTA, 57.
glicerin, 10 mól ditiotreitol , pH=3.0). 10 7.-os dezoxikolát oldatból annyit adunk hozzá, hogy legyen, ezután a sejteket a végkoncentráció 0.1 tf7.
kétszer átbocsátjuk egy
Manton-Gau1 in homogenizátoron
7000 psi nyomássá 1.
Polietilén-imin (BRL)
0.5 mól
TRIS (pH=8.0) pufferben készült 10, v’/.-os oldatát adjuk homogéni zátumhoz hogy a végkoncentráció 0.57. legyen.
Az oldatot 1 órán át 4’C-on kevertetjük, majd 13000 x g-vel centrifugá1juk Sorvall RC 2B centrifugában (DuPont) 45 percig 4eC-on
Az üledéket eldobjuk, majd szilárd ammónium-szulfátot adunk 357. telítési értékben a felülúszóhoz 5 percre. Az oldatot az előzök szerint kevertetjük és centrifugáljuk.
Az üledéket 300 ml pufferbe szuszpendá1juk, melynek összetétele 20 mmól TRIS, 10 mmól EDTA, pH=8.0. 300 ml 8 mól karbamidot, majd 2.7 liter 10 mmól nátrium—acetátot és 4 mól karbamidot tartalmazó oldatot adunk hozzá, majd a pH-t • ·
-40azonnal 4.0-ra állítjuk. Az oldatot az előzők szerint centrifugáljuk.
A felüluszót 50 ml-es SP-Sepharose, Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük, amelyet előzőleg 20 mmól nátrium-acetátot és 4 mól karbamidot tartalmazó (pH=4.0) puf ferre 1 hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 250 mmólos nátrium-acetát pufferrel (pH=5.0) mossuk, majd 250 ml olyan lineáris nátrium-klórid gradienssel mossuk, amely 0.0-1.0 mól NaCl-t tartalmaz a mosópufferben.
A termék körülbelül
0.3 mól nátrium-k1orid koncentrációnál e1uá1ódik.
2.3-ra reverz ioncserélt termék 50 ml-es a1i kvot j ának a pH-j á t állítjuk 10 tf7.-os trif 1 uor-ecetsavva 1 (TFA) és C4 fázisú oszlopon kromatografá1juk (Vydac, 1 x cm), amelyet előzőleg 0.1 7.
TFA—val hoztunk egyensúlyba
0-60 7.
acetonitril (ACN) 0.1
7. TFA-ban készült lineáris gradiensét futtatjuk 45 percig, termék körülbelül
607. ACN koncentrációnál eluálódik. A fordított fázisról lejött terméket 25 μΐ/ml 1 mólos ammónium-hidrogén—karbonát hozzáadásával semlegesítjük.
A fordított fázisról lejött termékből kb. 45 ml-t pufferrel szemben dializálunk, amelynek összetétele 2 mól guanidin-hidrok. lórid (pH=5.0), majd 20 ml-re töményítünk YM 30 membránon (Amicon). Egy 10 ml-es alikvot részt 2.5 x 50 cm-es Superose 12 (Pharmacia) oszlopon kromatografálunk, amelyet pH=5.0-ás 2 mólos guanidin-hidroklóriddal hoztunk egyensúlyba. Az eluálódott fehérjét (látszólagos mo1eku1asú1ya 358 kD) 20 mmólos nátrium-acetát pufferrel szemben (pH=4.5) dializálunk.
• · · 9 9 · « l*« « « »·· • · · · » « ·♦»· ··♦ ««« »
-41Α Superose termék Coomassie-va1 festett SDS-PAGE-ja két fö csíkot mutat, ezeknek látszólagos mo1eku1asú1ya 72 kD illetve 70 kD. A végtermék aminosav-ana1ízise és N-terminális szekvenálása a várt érték 157.-án belül volt.
9. PéIda
Egerek antitest válasza NSlslRl_9-re
Immunogenitásának meghatározása céljából a tisztított
NSlSiRL9 antigént három egértörzsbe oltjuk be, a
C57BL/6(H—2to) : a BALB/C ( H-2d ) ; és a C3H/HEN (H-2R-) törzsekbe.
Az már korábban kiderült, hegy csak H-2& haplotipusú egerek antitesteket ·
Plasmodium cirkumsporozoita fehérjéje ismétlődő epitopjával szemben. Az antigént Freund féle adjuvánssal injektáljuk be, és az immunizált állatokból vett szérum-mintákat enzimmel kapcsolt immunadszorbens esszével (ELISA) vizsgáljuk. A kontrol 1 állatokat R32tet32-vel immunizáljuk, egy olyan antigénnel, amely a CS fehérje ismétlődő tetrapeptidjeit tartalmazza.
Mindhárom egértörzsnek NSlaiRL9-cel való inokulálása olyan antitest termelődését eredményezte, amely a cirkumsporozoita fehérje nem ismétlődő (határoló) régiójával reagál.
Az immunogenitási vizsgálatok részleteit és eredményeit az alábbiakban közöljük.
Mindhárom egértörzset két csoportra osztjuk, mindegyik csoport 4-5 állatot tartalmaz. Az állatok első csoportját
NSlSiRL9-cel, második csoportot
R32tet32-vel immunizáljuk [J.Young et al., Science, 223,
95Θ (1985)]. Az
R32tet32 két Xho II fragmentet tartalmaz, mindegyik fragment az [ (Asn-A 1 a-Asn-Pro ) ( Asn-Va 1 -Asp-Pro ) ] = szekvenciát
-42kódolja. A tét-— egy 32 tetraci k1 in rezisztencia fáz isban .
példa szerint • · · * · · 4 • ··· · 4 · ·· · • · · · » « ··»· ··· ·* ··« * aminosavból álló peptid amelyet a gén kódol, nincs leolvasási tisztított
NSlslRL9 antigént komplett Freund adjuvánssal keverjük el közvetlenül a beadás előtt. 6-Θ hetes egereket immunizálunk bőr alá adott 50 pg antigénnel, 200 pl, a jobb hátsó részbe adott dózisban. Az egereket kétszer immunizáljuk, először egy egyszeri 200 pl-es dózissal, amely pg antigént tartalma komplett
Freund adjuvánsban
Erősítő injekciókat négy hétté 1 később adunk ugyanezzel kísérleti elrendezéssel, azzal különbséggel, hogy az antigént in kompiett F reund adj uvánsban szuszpendáljuk.
Az áll átok at második immunizálás után nappa1 kivéreztétjük
Az egy csoportban levő állatok összes vérét egyesítjük, hagyjuk összecsapzódni éjszakán át 4“C-on, majd a szérum elvá1 asztására 1ecentrifugá1juk, utána -70eC-on táró 1juk.
ELISA-t használunk az egyesített szérumokban
R32tet-~,
NSlSiRL9 vagy
R16CSP ellen termelődött antitestek k imutatására (Az R16CSP-t a fentiek szerint tisztítjuk és állítjuk elő.) a mikrotiter lemez lukainak falára adszorbeálva R32 tet-=_t,
R16CSP-t és
NSlaxRLR-et tartalmaz.
A befogó antigént úgy adszorbeá1juk a mikrotiter lemez lukainak falára, hogy mindegyik lukhoz pl olyan PBS ο 1 datot adunk, amely 0.75 pg befogó antigént és 0.2 pg forralt kazeint tartalmaz. Ezt az ο1datot úgy állítjuk elő, hogy Θ pl (3.76 pg) befogó antigént adunk 2.5 ml olyan « · ·» oldathoz, amelyben 4 μΐ 0.5 7.-os forralt kazein oldatot tartalmaz (összetételét lásd az előzőkben) 5 ml Dulbecco féle foszfáttal puffereit sóoldat (PBS) (egy vizes oldat, amelynek összetétele 0.Θ7. NaCl, 0.2177. Na-HPCU x 7 H=0, 0.027. KH-POa és 0.027. KC1 , pH=7.4 ) .
Miután éjszakán át inkubáltuk szobahömérsék1eten, a lukak tartalmát leszívjuk, és a megmaradó aktiv helyeket 0.5 7.-os forralt kazein oldattal blokkoljuk (5 g/1 kazein (J.T.Baker Chemical Co), 0.1 g/1 Thimersol (Sigma Chemical Co.), 0.02 g/1 fenolvörös (Sigma Chemical Co.), 900 ml PBS pH=7.4 és 100 ml 0.1 normál NaOH), amelyet 99:1 arányban hígítunk 1 7.-os Tween 20-szal ( po 1 iox iet i 1 én-szor bi tán-monolaurát, Sigma Chemical Co.)· fiz egérszérumokat 1:100, 1:1 000, 1:10 000, 1:100 000 és 1:1 000 000 arányban hígítjuk 0.025 7. Tween 20-at tartalmazó 0.57.-os forralt kazein oldatban. A vizsgált szérumot ezután hozzáadjuk a lukhoz majd kétórás inkubálás után a szérumot eltávolítjuk és a lukakat kétszer mossuk 0.057. Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal. Egy peroxidázhoz konjugált anti-egér IgG Ab-t adunk a lukhoz, amelyet 1:2000 arányban hígítunk a szérumhoz használt higítószerre 1. Egyórás inkubálás után a lukak tartalmát leszívjuk, háromszor mossuk 0.05 7. Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal, majd tiszta peroxidáz szubsztrát oldatot adunk hozzá (Kirkegaard and Perry, készítése az előállító utasítása szerint). A peroxidáz és a szubsztrát reakciója egy sötétzöld terméket eredményez, a szín intenzitása arányos a szérum mintában jelenlevő antitest mennyiségével. Az eredményeket 15 perc elteltével 405-414 nanométeren olvassuk le ELISA
-44 — leolvasóval, és optikai egységben (OD) jegyezzük fel.
Az eredményeket az l(a) és l(b) ábrákon (antitest válasz C3H/HEN egérben); a 2(a), 2(b) ábrákon (antitest válasz
C57BL/6 egérben) és a 3(a) 3(b) ábrákon (antitest válasz BALB/C egérben) adjuk meg.
Mindhárom egértörzs (C3H/HEN (H-2k), BALB/C (H-2d) és
C3H/HEN (H-2b) antigénnel való beoltása olyan antitesteket eredményez, amelyek erősen reagálnak a cirkumsporozoita fehérje ismétlődés nélküli régiójával. Az
NSlsxRL? befogó antigénre való reakció kicsit erősebb mint az R16CSP-re. (Az R16CSP befogó antigén csak a CS fehérje ismétlődés mentes része el.leni antitesteket detektálja, míg az
NS1S1RL9 befogó antigén lehetővé teszi mind az anti-NSlsi mind az anti-RL9 elleni antitestek detektálását.) Amint az várható volt a C3H/HEN egerek nem adtak antitest választ az
R32tet-^-re, míg a C57B1/6 egerek igen □ ól lehet lényegesen gyengébb, (1 nagyságrenddel kisebb) mint a C57BL/HEN egerekben megfigyelt antitest válasz,
BALB/C egerek R32tet^-re adott antitest válasza nem volt várható, és ellen tétben áll azzal a negatív vá1 assza 1 amelyet az i rodalómban az ilyen haplotipusú egereknek (NANP)4O-re adott reakciójáról [Dél
Giudice et a1., J.Immuno1.,
137, 2952 (1986)], a leírás szerint tizennégy egértörzset (kilenc kü lönbözö
H-2 haplotípusba tartoztak, beleértve a BALB/C (H-2d)-t is), (NANP) 4.j-ne 1 immunizáltak hordozó fehérje nélkül, és csak a H-2a egerek adtak antitest választ a (NANP)AO ellen. A 14-2=1 egerek (BALB/C) egyáltalán nem adtak választ. A BALB/C egereket fúrócsiga hemocianinhoz mint hordozó fehérjéhez • · · • · ·
-45kötött ( NANP ) «(;>-ne 1 immunizálva anti- ( NANP ) antitesteket kapunk.
9. Példa
A sporozoita invázió gátlása
Ebben a vizsgálatban NSlsxRL9-cel immunizált nyúlak szérumát vizsgáljuk, hogy képesek-e meggátolni a
P.falciparum sporozoiták belépését a májsejtekbe, ahol a sporozoiták kifejlődnek és az exo-eritrocta állapotba érnek.
Három egértörzs (BALB/C, C57BL/6, A/J), NSlsxRL9-cel immunizálva komplett Preund adjuvánsban vagy alumínium hidroxidban, magas antitest titert mutatnak a CS fehérje ismétlődés egereknek a nélküli régiójával szemben. Azonban ezeknek az széruma nem képes megakadá1yozni a sporozoiták behatolását a tenyésztett humán hepatóma sej tek be (HepG2-A16) ha a Sporozoita Invázió Gátlása (ISI) teszttel vizsgáljuk [Hollingdale,
M.R. et al., J.Immunoi
132.
909 (1984)]
Ezzel ellentétben, az
Uj-Zélandi fehér nyulak
100 pg
NSlsxRL9-cel immunizálva komplett
Freund adjuvaánsban
0., 3. és 7. héten megemelkedett antitest titert adnak (jóllehet a 1acsonyabbat mint az egerek) a CS fehérje ismétlödésmentes régiójára.
Azonban az
NSlsxRL9-cel immunizált nyulakból származó szérumról kiderült, hogy lényegesen gátolja a hepatóma sejtek sporozoita invázióját, a Hollingdale féle ISI módszerrel vizsgálva (98 7. egy állat esetében, az átlagos gátlás körülbelül 607.).
Egy chloroquine rezisztens P.falciparum törzset (7G8 törzs) és egy chloroquine érzékeny P.falciparum törzset • · · · ··
-46♦ Λ ·♦·· ·»· (NF54 törzs) is jelentésen gátolta a hepatóma sejtekbe való belépésben az NSlSiRL9-cel immunizált nyulak széruma. A Plasmodium falciparum 7G8 törzs sporozoitáinak hepatóma inváziójának gátlása jelentősebb az ISI módszerrel meghatározva (átlagban 957.) mint az NF54 törzsé (átlagban 607.) .
Azokban az ISI vizsgálatokban, amelyekben a normál hepatocitákat humán hepatóma sejtekkel helyettesítjük, a P.falciparum NF54 sejtek sporozoitáit gátolják a hepatoci ták ba való belépésben az NSlei.RL9-ce 1 immunizált egerekből származó szérumok (egy nyúlnál 897.-os gátlás, az átlagos gátlás körülbelül 457.)
Ezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy az NSlSiRL9 antigénen sporozoita neutralizáló epitopok vannak.
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Polipeptid, amely egy Plasmodium felületi fehérje első határoló régiójából egy vagy több immunogén determinánst tartalmaz, a második határoló régiójából egy vagy több immunogén determinánst tartalmaz, és a kettő között levő ismétlődő doménböl az összesnél kevesebb immunogén determinánst vagy semmit nem tartalmaz.Az 1 .igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy Plasmodium felületi fehérje ismétlődő dóménjébő 1 az első és második határoló régió közötti régióból legalább egy ismétlődő immunogén determinánst tarta1 máz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az első határoló régiónak és a második határoló régiónak lényegében az összes immunogén determinánsát tartalmazza.
- 4. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a Plasmodium felületi fehérje immunogén determinánsait a P.fa 1ciparum, P.vivax, P.malarial vagy P.ovale közül bármelyiknek a felületi fehérjéi közül vá1 asz thatjuk.
- 5. A 3. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy Plasmodium felületi fehérje első és második határoló régiója közötti ismétlődő doménböl legalább egy immunogén determinánst tartalmaz.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy hordozó fehérjéhez van fuzionálva.
- 7.Az1-6.igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a felületi fehérj e egy cirkumsporozoita fehérje.
- 8. A 6. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a hordozó fehérje az influenza vírus nem-szerkezeti 1-es fehérjéjének 81 N-terminális aminosavát tartalmazza.
- 9. A 3.igénypont szerinti polipeptid, azzal jeli emezve, hogy az első határoló régió a P.falciparum CS fehérje 19.(Leu) és 123. (Pro) aminosava közötti aminosav szekvencia, a második határoló régió a P.falciparum CS fehérje 297. (Gly) és 412 (Asn) aminosavai közötti szekvencia.-4910.Az igénypont szerinti polipeptid, azzal jeli emezve, hogy az első határoló régió aP.falciparum CS fehérje 19 ( Leu ) és123. (Pro) amínosava közötti aminosav szekvencia, másod i k határo1ó régióP.falciparum CS fehérje288 (Asn ) és412 (Asn ) aminosavai közötti szekvencia11. A 9-11.igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy ( Asn-X-Y-Pro ) r-> képletű immunogén determinánst tartalmaz, ahol X jelentésa Alá vagy Val, Y jelentése Asn vagy Asp, n egész szám, értéke kisebb mint 41, ha az immunogén· determináns a határoló régiók között van, és kisebb mint 100 ha az immunogén determináns megelőzi a határoló régiókat.12. Az 1.igénypont polipeptid, az za 1 jellemezve, hogy képlete az alábbi:NS1 i_sx-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx<?-i=T.-CSz;“?z-»x13. Az 1.igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy képlete az alábbi:NS1-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSGly CS^as— 4 x zz ♦ · · 9· 9 • ♦·· 9 9 9 9»9 · · ·· ···* ·Μ·«·-5014. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy képlete az alábbi:NS1 x-sx-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx^-ixz;- (Asn-X-Y-Pro)r->-Gly-CS-ss-4-i=, ahol X jelentése Alá vagy Val, Y jelentése Asn vagy Asp, n egész szám, értéke nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 41-néI.15. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy képlete az alábbi:NSlBx-Asp-His-F!et-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx<?_i = T;- ( Asn-A 1 a-Asn-Pro ) ,-,-G 1 y-CS~2S-4xx , n egész szám , értéke nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 41-nél.
16. A 15. igénypont szerinti polipeptid, azzal jel lemezve, hogy n=2. 17. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jeli emezve, hogy képlete az alábbi: NSlsi-Asp-His-í'let-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx^-x^z;- ( Asn-Va 1-Asp-Pro ) r->-G 1 y-CS^sa-^xcE , n egész szám, nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 41-nél.értéke ··*· ··· • •«4 ···· *·· ·*»-511Θ. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy képlete az alábbi:NS1x-si(Asn-X-Y-Pro)n-Asp-His-Met-Leu-Thr—Asp-Pro-CSx^-izT -G1y-CS-ee-axz, n egész szám, értéke nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 100-nál.19. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy képlete az alábbi:NS1χ-θχ(Asn-A1a-Asn-Pro)0-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx^-icr.-G 1 y-CSzee-4x2, n egész szám, értéke nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 100-nál.20. A 19 igénypont szerinti polipeptid, az za 1 jel lemezve, hogy n=4. 21 . Az 1 . igénypont szerinti polipeptid, azzal jeli emezve, hogy képlete az a 1ábbi: NS1x-sl(Asn-Val-Asp-Pro)„-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSx^-xa^-Gly-CS=Ss-4i2, n egész szám, értéke nagyobb vagy egyenlő eggyel és kisebb 100-nál.22. A 21.igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy n=4· • · · · · · · • ··· · · ·«· · • · · · · · ···» 4·· ·· ··· ·23. Az 1. igénypont szerinti polipeptidet kódoló expressz iós vektor.24. A 23. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jeli emezve, hogy E.coli expressziós vektor.25. A pMG-l E.coli expressziós vektor.26. A pNSlexRL? E.coli expressziós vektor.27. A pNSlexRLfAuth E;coli expressziós vektor.23. A pNSlexRLfAuth+(NANP)„ E.coli expressziós vektor, ahol n egész szám, értéke egy, vagy egynél nagyobb.29. A pNSlsx(NANP)nRLfAuth E.coli expressziós vektor, ahol n egész szám, értéke egy, vagy egynél nagyobb.30. A pNSlsl(NVDP)nRLfAuth E.coli expressziós vektor, ahol n egész szám, értéke egy, vagy egynél nagyobb.·· «··· ·· *··< ·«·♦ • · ·> V « · · • ··· · · ··· · • · · · · · ···· ··· ·· ··· ·31, Eljárás embereket Plasmodium sporozoitákka1 való fertőzéssel szemben védő vakcina e1öá11ítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti po 1 i pept idek. bő 1 immunológiai védelmet nyújtó mennyiségét a vakcinakészitésben szokásos vivő- és egyéb segédanyagokkal összekeverve vakcinává alakítunk.meghata1mázott:
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34686389A | 1989-05-03 | 1989-05-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU902652D0 HU902652D0 (en) | 1990-09-28 |
| HUT54305A true HUT54305A (en) | 1991-02-28 |
Family
ID=23361342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU902652A HUT54305A (en) | 1989-05-03 | 1990-05-03 | Process for producing vaccine against malaria |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0398540A1 (hu) |
| JP (1) | JPH0317099A (hu) |
| CN (1) | CN1046937A (hu) |
| AU (1) | AU635737B2 (hu) |
| CA (1) | CA2015722A1 (hu) |
| FI (1) | FI902206A0 (hu) |
| HU (1) | HUT54305A (hu) |
| IL (1) | IL94257A0 (hu) |
| MA (1) | MA21833A1 (hu) |
| NO (1) | NO901959L (hu) |
| NZ (1) | NZ233494A (hu) |
| PL (1) | PL285045A1 (hu) |
| PT (1) | PT93951A (hu) |
| ZA (1) | ZA903327B (hu) |
| ZW (1) | ZW7290A1 (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ233255A (en) * | 1989-04-11 | 1993-02-25 | Chiron Corp | Plasmodium cs protein analogues lacking one or more of the repeat epitopes, and containing at least one nonrepeat flanking epitope |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| US5972351A (en) * | 1992-04-03 | 1999-10-26 | Isis Innovation Limited | Plasmodium falciparum MHC class I-restricted CTL epitopes derived from pre-erythrocytic stage antigens |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| ZA856655B (en) * | 1984-09-12 | 1986-04-30 | Univ New York | Cross-reactive and protective epitopes of circumsporozoite proteins |
| CN86100979A (zh) * | 1985-02-07 | 1986-12-17 | 史密丝克莱恩贝克曼公司 | 疟疾疫苗的制备方法 |
| EP0254862A1 (en) * | 1986-06-26 | 1988-02-03 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Vaccines against protozoan parasites |
-
1990
- 1990-04-30 CA CA002015722A patent/CA2015722A1/en not_active Abandoned
- 1990-04-30 NZ NZ233494A patent/NZ233494A/xx unknown
- 1990-05-01 EP EP90304720A patent/EP0398540A1/en not_active Withdrawn
- 1990-05-01 AU AU54505/90A patent/AU635737B2/en not_active Ceased
- 1990-05-02 NO NO90901959A patent/NO901959L/no unknown
- 1990-05-02 JP JP2116693A patent/JPH0317099A/ja active Pending
- 1990-05-02 CN CN90102621A patent/CN1046937A/zh active Pending
- 1990-05-02 IL IL94257A patent/IL94257A0/xx unknown
- 1990-05-02 PL PL28504590A patent/PL285045A1/xx unknown
- 1990-05-02 ZA ZA903327A patent/ZA903327B/xx unknown
- 1990-05-02 FI FI902206A patent/FI902206A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-05-02 ZW ZW72/90A patent/ZW7290A1/xx unknown
- 1990-05-03 HU HU902652A patent/HUT54305A/hu unknown
- 1990-05-03 MA MA22098A patent/MA21833A1/fr unknown
- 1990-05-03 PT PT93951A patent/PT93951A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU635737B2 (en) | 1993-04-01 |
| PL285045A1 (en) | 1991-01-14 |
| EP0398540A1 (en) | 1990-11-22 |
| IL94257A0 (en) | 1991-03-10 |
| NO901959D0 (no) | 1990-05-02 |
| PT93951A (pt) | 1991-01-08 |
| ZA903327B (en) | 1991-03-27 |
| NO901959L (no) | 1990-11-05 |
| ZW7290A1 (en) | 1990-10-10 |
| FI902206A0 (fi) | 1990-05-02 |
| JPH0317099A (ja) | 1991-01-25 |
| CN1046937A (zh) | 1990-11-14 |
| MA21833A1 (fr) | 1990-12-31 |
| HU902652D0 (en) | 1990-09-28 |
| NZ233494A (en) | 1993-08-26 |
| CA2015722A1 (en) | 1990-11-03 |
| AU5450590A (en) | 1990-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5726292A (en) | Immuno-potentiating systems for preparation of immunogenic materials | |
| JPH03173830A (ja) | ワクチン組成物 | |
| JPH06189772A (ja) | 原虫類ワクチン用抗原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチン | |
| DK167817B1 (da) | Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria | |
| CA2505724C (en) | Malaria vaccine | |
| EP0191748B1 (en) | Malaria vaccine | |
| AU634837B2 (en) | Malaria vaccine | |
| HUT54305A (en) | Process for producing vaccine against malaria | |
| KR20210110318A (ko) | 융합에 의해 변형된 cmv의 바이러스-유사 입자 | |
| HUT51332A (en) | Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast | |
| Matsumoto et al. | Stable expression and secretion of the B-cell epitope of rodent malaria from Mycobacterium bovis BCG and induction of long-lasting humoral response in mouse | |
| EP0250261A1 (en) | Vaccines containing epitopes of both the CSP and a blood stage antigen of a plasmodium parasite | |
| JPH04500668A (ja) | プラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト表面抗原の対立遺伝子変異体 | |
| IE910966A1 (en) | Plasmodium Sporozoite Antigen | |
| AU638216C (en) | Allelic variants of plasmodium falciparum merozoite surface antigen | |
| PT100757A (pt) | Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |