JPH06189772A - 原虫類ワクチン用抗原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチン - Google Patents
原虫類ワクチン用抗原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチンInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 原虫類ワクチン用抗原ペプチドおよびこのペ
プチドを含有するワクチンに関するものである。 【構成】 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）からの抗原（Ｐ．１９５）をコードするＤＮＡをク
ローニングすることが可能で、このクローンＤＮＡを、
その抗原またその少なくとも１個のエピトープを含むペ
プチドを適当な宿主中で表現可能な適当なペクター中に
導入することによって、機能抗原またはその断片が得ら
れ、プラスモジウムのＰ．１９５蛋白質のカルボキシ末
端から誘導される分子量４２０００のポリペプチドであ
る。
プチドを含有するワクチンに関するものである。 【構成】 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）からの抗原（Ｐ．１９５）をコードするＤＮＡをク
ローニングすることが可能で、このクローンＤＮＡを、
その抗原またその少なくとも１個のエピトープを含むペ
プチドを適当な宿主中で表現可能な適当なペクター中に
導入することによって、機能抗原またはその断片が得ら
れ、プラスモジウムのＰ．１９５蛋白質のカルボキシ末
端から誘導される分子量４２０００のポリペプチドであ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マラリヤワクチン用抗
原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチンに関
する。
原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチンに関
する。
【０００２】
【従来の技術】全第三世界における保健問題として、マ
ラリヤの重要性はますます増大しつつある。数億の人々
がこの病気に罹っていて、原虫類プラスモジウム（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の寄生によ
って起こる最も急性の病型ではアフリカだけで百万人以
上の小児が死亡している。この寄生虫の血流中における
無性増殖に対する効果的な免疫によればこの疾患を予防
できる。侵入型の分裂小体に対する有効な免疫応答によ
って赤血球の再侵入を防止すればこのサイクルが遮断さ
れる。
ラリヤの重要性はますます増大しつつある。数億の人々
がこの病気に罹っていて、原虫類プラスモジウム（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の寄生によ
って起こる最も急性の病型ではアフリカだけで百万人以
上の小児が死亡している。この寄生虫の血流中における
無性増殖に対する効果的な免疫によればこの疾患を予防
できる。侵入型の分裂小体に対する有効な免疫応答によ
って赤血球の再侵入を防止すればこのサイクルが遮断さ
れる。
【０００３】けつ歯類のマラリヤモデルにおいて、成熟
赤血球内型分裂前体中で合成され、分裂小体の表面上に
表現された蛋白抗原が精製でき、この抗原によるワクチ
ン化でプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅ
ｌｉｉ）に対する保護免疫を生じることが明らかにされ
ている〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．＆Ｆｒ
ｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２９４：３６１〜３６４（１９８１）〕。
赤血球内型分裂前体中で合成され、分裂小体の表面上に
表現された蛋白抗原が精製でき、この抗原によるワクチ
ン化でプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅ
ｌｉｉ）に対する保護免疫を生じることが明らかにされ
ている〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．＆Ｆｒ
ｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２９４：３６１〜３６４（１９８１）〕。
【０００４】この抗原は、見かけの分子量（ＭＷ）２３
０，０００で、ｉｎ ｖｉｖｏで蛋白分解プロセッシン
グを受けて、この抗原の分離断片が分裂小体表面に存在
する〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ）、１９８１、前出；ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ，
Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：パラシトロ
ジー（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）、８８：２１１〜２
１９（１９８４ａ）〕。
０，０００で、ｉｎ ｖｉｖｏで蛋白分解プロセッシン
グを受けて、この抗原の分離断片が分裂小体表面に存在
する〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ）、１９８１、前出；ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ，
Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：パラシトロ
ジー（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）、８８：２１１〜２
１９（１９８４ａ）〕。
【０００５】「分子量」の語は、ドデシル硫酸ナトリウ
ムと標準分子量マーカーの存在下にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定された見かけの相対的分子量
を意味する。本発明の抗原蛋白質の分子量は、したがっ
て、レムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）〔ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７：６８０〜６８５（１９７
０）〕によって報告された方法によって測定するのが好
都合である。便利な標準分子量マーカーとしては、たと
えば、スペクトリンヘテロダイマー（２．２×１０ 5 Ｍ
Ｗ）、β−ガラクトシダーゼ（１．６×１０5 ＭＷ）、
ホスホリラーゼｂ（９．３×１０4 ＭＷ）、ウシ血清ア
ルブミン（６．８×１０4 ＭＷ）、アルドラーゼ（３．
９×１０4 ＭＷ）、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ（２．７×１０4 ＭＷ）およびリゾチーム（１．５×
１０4 ＭＷ）がある。
ムと標準分子量マーカーの存在下にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定された見かけの相対的分子量
を意味する。本発明の抗原蛋白質の分子量は、したがっ
て、レムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）〔ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７：６８０〜６８５（１９７
０）〕によって報告された方法によって測定するのが好
都合である。便利な標準分子量マーカーとしては、たと
えば、スペクトリンヘテロダイマー（２．２×１０ 5 Ｍ
Ｗ）、β−ガラクトシダーゼ（１．６×１０5 ＭＷ）、
ホスホリラーゼｂ（９．３×１０4 ＭＷ）、ウシ血清ア
ルブミン（６．８×１０4 ＭＷ）、アルドラーゼ（３．
９×１０4 ＭＷ）、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ（２．７×１０4 ＭＷ）およびリゾチーム（１．５×
１０4 ＭＷ）がある。
【０００６】マウスのワクチン接種に、この蛋白質を用
いた場合、保護効果はアジュバント依存性で、細胞仲介
エフェクター経路によって与えられるものと思われる
〔フリーマンほか（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｈｏ
ｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．）：クリニカル・エクスペリメンタ
ル・イミュノロジー（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）、５４：６０９〜６１６（１９８３ａ）〕。しか
し、この蛋白質に対するモノクロナール抗体はマウスに
受動免疫を付与することが示されている〔マジャリアム
ほか（Ｍａｊａｒｉａｍ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ）：ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）、１３２：３１３１〜３１３７（１９８４）〕。
いた場合、保護効果はアジュバント依存性で、細胞仲介
エフェクター経路によって与えられるものと思われる
〔フリーマンほか（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｈｏ
ｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．）：クリニカル・エクスペリメンタ
ル・イミュノロジー（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）、５４：６０９〜６１６（１９８３ａ）〕。しか
し、この蛋白質に対するモノクロナール抗体はマウスに
受動免疫を付与することが示されている〔マジャリアム
ほか（Ｍａｊａｒｉａｍ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ）：ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）、１３２：３１３１〜３１３７（１９８４）〕。
【０００７】類似の蛋白質抗原が、他のプラスモジウム
属についても報告されている。プラスモジウム（Ｐ．ｙ
ｏｅｌｉｉ）の２３０，０００ＭＷ精製抗原に対して産
生した多価抗血清は、試験した他のすべてのプラスモジ
ウム属の血液段階型と免疫蛍光により交差反応を示した
〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ）：１９８４ａ、前出〕。
属についても報告されている。プラスモジウム（Ｐ．ｙ
ｏｅｌｉｉ）の２３０，０００ＭＷ精製抗原に対して産
生した多価抗血清は、試験した他のすべてのプラスモジ
ウム属の血液段階型と免疫蛍光により交差反応を示した
〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ）：１９８４ａ、前出〕。
【０００８】プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｃｈａｂａｕｄｉ）においては、抗原はウエスターン法
によって２５０，０００ＭＷの共通抗原として同定さ
れ、これも同様にプロセッシングを受ける〔ホルダーほ
か（Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラ
ー・アンド・バイオケミカル・パラシトロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、９：１
９１〜１９６（１９８３）〕。２５０，０００ＭＷのプ
ラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄ
ｉ）蛋白質に特異的なモノクロナール抗体は、マウスに
おいてプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａ
ｂａｕｄｉ）のチャレンジに受動免疫を付与することが
明らかにされた〔ボイルほか（Ｂｏｙｌｅ，Ｄ．Ｂ．ｅ
ｔ ａｌ）：インフェクション・アンド・イミュニティ
ー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）、３８：９４〜１０
２（１９８２）〕。
ｃｈａｂａｕｄｉ）においては、抗原はウエスターン法
によって２５０，０００ＭＷの共通抗原として同定さ
れ、これも同様にプロセッシングを受ける〔ホルダーほ
か（Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラ
ー・アンド・バイオケミカル・パラシトロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、９：１
９１〜１９６（１９８３）〕。２５０，０００ＭＷのプ
ラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄ
ｉ）蛋白質に特異的なモノクロナール抗体は、マウスに
おいてプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａ
ｂａｕｄｉ）のチャレンジに受動免疫を付与することが
明らかにされた〔ボイルほか（Ｂｏｙｌｅ，Ｄ．Ｂ．ｅ
ｔ ａｌ）：インフェクション・アンド・イミュニティ
ー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）、３８：９４〜１０
２（１９８２）〕。
【０００９】プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）の２３０，０００ＭＷ蛋白質に対す
るモノクロナール抗体は分裂小体を凝集させ、したがっ
てｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて赤血球の寄生虫侵入を阻止
し〔エプシュタインほか（Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｎ．ｅｔ
ａｌ）：ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）、１２７：２１２〜２１７（１９８
１）〕、このプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）の蛋白質はｉｎ ｖｉｖｏにおいて
プロセッシングを受け、分裂小体の表面上に表現される
一連の断片を生成する〔デビッドほか（Ｄａｖｉｄ ｅ
ｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル・
パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．）、１１：２６７〜２８２（１９８４）〕。
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）の２３０，０００ＭＷ蛋白質に対す
るモノクロナール抗体は分裂小体を凝集させ、したがっ
てｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて赤血球の寄生虫侵入を阻止
し〔エプシュタインほか（Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｎ．ｅｔ
ａｌ）：ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）、１２７：２１２〜２１７（１９８
１）〕、このプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）の蛋白質はｉｎ ｖｉｖｏにおいて
プロセッシングを受け、分裂小体の表面上に表現される
一連の断片を生成する〔デビッドほか（Ｄａｖｉｄ ｅ
ｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル・
パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．）、１１：２６７〜２８２（１９８４）〕。
【００１０】プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）において、プラスモジウム
（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の２３０，０００ＭＷ蛋白質に対
する多価抗血清は１９５，０００ＭＷ抗原（以下Ｐ．１
９５蛋白質と呼ぶ）と交差反応した〔ホルダーほか（Ｈ
ｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ）：前出（１９８３ａ）〕。糖
蛋白質と考えられるこの抗原〔ハワードほか（Ｈｏｗａ
ｒｄ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・
バイオケミカル・パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、１１：３４９〜３６２
（１９８４）〕の生合成は、寄生虫の分裂前体内で起こ
り、赤血球内段階の末期に抗原は蛋白分解プロセッシン
グを受けて分離した断片を生じる〔ホルダーほか（Ｈｏ
ｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５６：１５２８〜１５３
８（１９８２）；ホールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル・パラシ
トロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．）１１：６１〜８０（１９８４ａ）〕。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）において、プラスモジウム
（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の２３０，０００ＭＷ蛋白質に対
する多価抗血清は１９５，０００ＭＷ抗原（以下Ｐ．１
９５蛋白質と呼ぶ）と交差反応した〔ホルダーほか（Ｈ
ｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ）：前出（１９８３ａ）〕。糖
蛋白質と考えられるこの抗原〔ハワードほか（Ｈｏｗａ
ｒｄ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・
バイオケミカル・パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、１１：３４９〜３６２
（１９８４）〕の生合成は、寄生虫の分裂前体内で起こ
り、赤血球内段階の末期に抗原は蛋白分解プロセッシン
グを受けて分離した断片を生じる〔ホルダーほか（Ｈｏ
ｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５６：１５２８〜１５３
８（１９８２）；ホールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル・パラシ
トロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．）１１：６１〜８０（１９８４ａ）〕。
【００１１】分裂小体の表面に（赤血球内段階の末期に
血清中に放出され）、蛋白質は完全なプロセッシングを
受け、分子量約８３，０００、４２，０００および１
９，０００の３種の分離したＰ．１９５断片が存在す
る。これらの３種の断片が分裂小体の主要な表面抗原
で、ヒト免疫血清によって強力に認識される〔フリーマ
ンほか（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｈｏｌｄｅｒ，
Ａ．Ａ．）：ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５８：１６４
７〜１６５３（１９８３ｂ）；ホルダーほか（Ｈｏｌｄ
ｅｒ，Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１６０：６２４〜６２９（１９８
４ｂ）〕。
血清中に放出され）、蛋白質は完全なプロセッシングを
受け、分子量約８３，０００、４２，０００および１
９，０００の３種の分離したＰ．１９５断片が存在す
る。これらの３種の断片が分裂小体の主要な表面抗原
で、ヒト免疫血清によって強力に認識される〔フリーマ
ンほか（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｈｏｌｄｅｒ，
Ａ．Ａ．）：ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５８：１６４
７〜１６５３（１９８３ｂ）；ホルダーほか（Ｈｏｌｄ
ｅｒ，Ａ．Ａ．＆ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．）：ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１６０：６２４〜６２９（１９８
４ｂ）〕。
【００１２】本明細書において使用される「Ｐ．１９
５」の語は、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の赤血球分裂前体中に存在する
分子量１．８〜２．３×１０5 の蛋白質であって、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいてプロセッシングを受けて分子量約
８．３×１０4 、４．２×１０4 および１．９×１０4
の分離断片を生じ、寄生虫の分裂小体の表面膜と会合し
ている。
５」の語は、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の赤血球分裂前体中に存在する
分子量１．８〜２．３×１０5 の蛋白質であって、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいてプロセッシングを受けて分子量約
８．３×１０4 、４．２×１０4 および１．９×１０4
の分離断片を生じ、寄生虫の分裂小体の表面膜と会合し
ている。
【００１３】プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５内には、特異的モノ
クロナール抗体の結合度または見かけの分子量のわずか
な差によって検知される構造上のある種の多形現象が存
在するとも思われる〔マックブライドほか（ＭｃＢｒｉ
ｄｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ）：サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２１７：２５４〜２５７（１９８２）；マック
ブライドほか（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａ
ｌ）：トランズアクション・オブ・ザ・ロイアル・ソサ
イアティ・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハ
イジーン（Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．）、７８：３２〜３４（１９８４）；ホ
ールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ）：前出（１９８
４ａ）〕。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５内には、特異的モノ
クロナール抗体の結合度または見かけの分子量のわずか
な差によって検知される構造上のある種の多形現象が存
在するとも思われる〔マックブライドほか（ＭｃＢｒｉ
ｄｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ）：サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２１７：２５４〜２５７（１９８２）；マック
ブライドほか（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａ
ｌ）：トランズアクション・オブ・ザ・ロイアル・ソサ
イアティ・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハ
イジーン（Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．）、７８：３２〜３４（１９８４）；ホ
ールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ）：前出（１９８
４ａ）〕。
【００１４】しかしながら、これらの抗原が対応抗原で
あって、特定の抗原決定基に認められる差は動物におけ
る広い意味での免疫応答には重要でないことは、本来技
術分野における熟練者には自明のとおりである。Ｐ．１
９５で免疫処置されたセイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ）サル
はチャレンジ感染に対して保護されることが示されてい
る〔ペリンほか（Ｐｅｒｒｉｎ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ）：ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディ
シン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１６０：４４１〜４５
１（１９８４）；ホールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１１、３７９〜
３８２（１９８４ｂ）〕。
あって、特定の抗原決定基に認められる差は動物におけ
る広い意味での免疫応答には重要でないことは、本来技
術分野における熟練者には自明のとおりである。Ｐ．１
９５で免疫処置されたセイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ）サル
はチャレンジ感染に対して保護されることが示されてい
る〔ペリンほか（Ｐｅｒｒｉｎ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ）：ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディ
シン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１６０：４４１〜４５
１（１９８４）；ホールほか（Ｈａｌｌ，Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１１、３７９〜
３８２（１９８４ｂ）〕。
【００１５】本明細書に用いる「エピトープ」の語は、
免疫原性分子の抗原性決定基を意味し、抗原性決定基は
適当な形で存在する場合に、感受性動物に保護的免疫応
答を引き出すことができる分子立体配置からなる。Ｐ．
１９５は対立遺伝子変異を受けやすく、プラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の異なる株では異なる形
の蛋白質を表現する場合もあるが、どの株から得られた
Ｐ．１９５も実質的に類似のものであることも明らかで
ある。
免疫原性分子の抗原性決定基を意味し、抗原性決定基は
適当な形で存在する場合に、感受性動物に保護的免疫応
答を引き出すことができる分子立体配置からなる。Ｐ．
１９５は対立遺伝子変異を受けやすく、プラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の異なる株では異なる形
の蛋白質を表現する場合もあるが、どの株から得られた
Ｐ．１９５も実質的に類似のものであることも明らかで
ある。
【００１６】本明細書に記載のプラスモジウム（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）株からのＰ．１９５遺伝子をサイ
ソング（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇ，Ｓ．）らによって単離さ
れた株からの相当する遺伝子〔サイソングほか（Ｔｈａ
ｉｔｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ）：トランズアクション
・オブ・ザ・ロイアル・ソサイアティ・オブ・トロピカ
ル・メディシン・アンド・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ．Ｒ
ｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．）、７８：
２４２〜２４５（１９８４）〕とサザン法で比較したと
ころ、核酸ハイブリダイゼーション〔シュバルツ（Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｔ．）〕によって検出できる構造多
形現象を示した。
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）株からのＰ．１９５遺伝子をサイ
ソング（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇ，Ｓ．）らによって単離さ
れた株からの相当する遺伝子〔サイソングほか（Ｔｈａ
ｉｔｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ）：トランズアクション
・オブ・ザ・ロイアル・ソサイアティ・オブ・トロピカ
ル・メディシン・アンド・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ．Ｒ
ｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．）、７８：
２４２〜２４５（１９８４）〕とサザン法で比較したと
ころ、核酸ハイブリダイゼーション〔シュバルツ（Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｔ．）〕によって検出できる構造多
形現象を示した。
【００１７】以上略述した理由により、プラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５またはその抗
原性断片は血液段階マラリヤのワクチンとして利用価値
があるものと考えられる。
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５またはその抗
原性断片は血液段階マラリヤのワクチンとして利用価値
があるものと考えられる。
【００１８】ｉｎ ｖｉｖｏで産生され、分裂小体表面
上に存在するこの蛋白質またはその抗原性断片を大量か
つ比較的純粋に得るためには、プラスモジウム（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）におけるこの蛋白質の表現をコー
ドする遺伝子のＤＮＡ配列を同定することが望まれる。
この配列を同定したのち、この配列を適当なベクターに
クローニングし適当な宿主中で表現させるか、あるいは
同定した配列に相当するアミノ酸配列を化学的に合成す
ることにより、蛋白質分子の免疫的に有効な部分を再生
することが望ましい。
上に存在するこの蛋白質またはその抗原性断片を大量か
つ比較的純粋に得るためには、プラスモジウム（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）におけるこの蛋白質の表現をコー
ドする遺伝子のＤＮＡ配列を同定することが望まれる。
この配列を同定したのち、この配列を適当なベクターに
クローニングし適当な宿主中で表現させるか、あるいは
同定した配列に相当するアミノ酸配列を化学的に合成す
ることにより、蛋白質分子の免疫的に有効な部分を再生
することが望ましい。
【００１９】
【発明の開示】本発明は、上述のプラスモジウム（Ｐ．
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの抗原（Ｐ．１９５）をコ
ードするＤＮＡをクローニングすることが可能で、この
クローンＤＮＡを、その抗原またはその少なくとも１個
のエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で表現可能
な適当なベクター中に導入することによって、機能抗原
またはその断片が得られることを発見し、完成されたも
のである。本発明に係りプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ）のＰ．１９５蛋白質、またはその少なく
とも１個のエピトープを含むペプチドをコードするクロ
ーンＤＮＡ配列が提供される。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの抗原（Ｐ．１９５）をコ
ードするＤＮＡをクローニングすることが可能で、この
クローンＤＮＡを、その抗原またはその少なくとも１個
のエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で表現可能
な適当なベクター中に導入することによって、機能抗原
またはその断片が得られることを発見し、完成されたも
のである。本発明に係りプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ）のＰ．１９５蛋白質、またはその少なく
とも１個のエピトープを含むペプチドをコードするクロ
ーンＤＮＡ配列が提供される。
【００２０】本明細書において用いられる「クローンＤ
ＮＡ配列」とは、天然宿主の外部で合成されたＤＮＡ配
列を意味する。本明細書において用いられる「ペプチ
ド」の語は、２個以上のアミノ酸からなる主としてアミ
ノ酸によって構成される分子構造を意味する。この定義
によれば、Ｐ．１９５も一種のペプチドである。
ＮＡ配列」とは、天然宿主の外部で合成されたＤＮＡ配
列を意味する。本明細書において用いられる「ペプチ
ド」の語は、２個以上のアミノ酸からなる主としてアミ
ノ酸によって構成される分子構造を意味する。この定義
によれば、Ｐ．１９５も一種のペプチドである。
【００２１】本発明のＤＮＡ配列は天然に生じる配列と
同一でも、またそれが単一もしくは多塩基置換、欠失、
挿入および逆位を含む変異を受けた配列でもよい。ただ
し、このような配列からなるＤＮＡ分子は、常に、プラ
スモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＰ．１９５
蛋白質の少なくとも１個のエピトープを有するペプチド
として表現されるものでなければならない。
同一でも、またそれが単一もしくは多塩基置換、欠失、
挿入および逆位を含む変異を受けた配列でもよい。ただ
し、このような配列からなるＤＮＡ分子は、常に、プラ
スモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＰ．１９５
蛋白質の少なくとも１個のエピトープを有するペプチド
として表現されるものでなければならない。
【００２２】次に、本発明を、図面を参照しながらさら
に詳細に説明する。図１はＰ．１９５をコードする遺伝
子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードするア
ミノ酸配列を示すものである。図２はＰ．１９５遺伝子
のｃＤＮＡ制限地図を示す。図３はＰ．１９５ゲノム配
列の制限地図を示す。図４は本発明を例示する過程で用
いられるプラスミドの構築を例示するものである。
に詳細に説明する。図１はＰ．１９５をコードする遺伝
子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードするア
ミノ酸配列を示すものである。図２はＰ．１９５遺伝子
のｃＤＮＡ制限地図を示す。図３はＰ．１９５ゲノム配
列の制限地図を示す。図４は本発明を例示する過程で用
いられるプラスミドの構築を例示するものである。
【００２３】図１Ａ−１Ｑは、Ｐ．１９５遺伝子のヌク
レオチド配列、それがコードするアミノ酸配列およびそ
の暗号配列の両端におけるストレッチ配列を示してい
る。２段に並んだ文字の下段はヌクレオチドを慣用の略
号によって示したもので、上段は読み取り枠がコードす
るアミノ酸配列をアミノ酸の慣用略号で示したものであ
る。この配列は本明細書に述べる方法で決定されたもの
であり、実験誤差の範囲内で可能な限り正確に決定され
たが、このＰ．１９５遺伝子配列には変動がある可能性
もある。
レオチド配列、それがコードするアミノ酸配列およびそ
の暗号配列の両端におけるストレッチ配列を示してい
る。２段に並んだ文字の下段はヌクレオチドを慣用の略
号によって示したもので、上段は読み取り枠がコードす
るアミノ酸配列をアミノ酸の慣用略号で示したものであ
る。この配列は本明細書に述べる方法で決定されたもの
であり、実験誤差の範囲内で可能な限り正確に決定され
たが、このＰ．１９５遺伝子配列には変動がある可能性
もある。
【００２４】図２は遺伝子ならびに暗号配列の両端に伸
びたｃＤＮＡクローン中の配列を、図の最上段に太線と
して示し、重要な制限酵素部位を記入してある。この図
中の制限酵素記号はすべて慣用法によった。他の制限酵
素部位は、図を複雑にしないように下部の平行線上に示
す。図の最下部の囲まれた線は、各種プラスミド挿入部
が由来するＰ．１９５遺伝子関連位置を示す。ゲノム挿
入部であるＧ１を除いてすべてｃＤＮＡ挿入部である。
ＸおよびＹはＰ．１９５コード配列のそれぞれ５′およ
び３′推定末端を示す。
びたｃＤＮＡクローン中の配列を、図の最上段に太線と
して示し、重要な制限酵素部位を記入してある。この図
中の制限酵素記号はすべて慣用法によった。他の制限酵
素部位は、図を複雑にしないように下部の平行線上に示
す。図の最下部の囲まれた線は、各種プラスミド挿入部
が由来するＰ．１９５遺伝子関連位置を示す。ゲノム挿
入部であるＧ１を除いてすべてｃＤＮＡ挿入部である。
ＸおよびＹはＰ．１９５コード配列のそれぞれ５′およ
び３′推定末端を示す。
【００２５】図３はＰ．１９５遺伝子を含むゲノムＤＮ
Ａのストレッチの制限地図に例示したものである。スケ
ールはｋｂｐで、図中にボールド書体の大文字で示した
Ｐ．１９５遺伝子のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を基準点
として選んだ。他の制限酵素部位は次の記号で表示し
た。Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｒ（Ｒｓａｌ）、Ａ（Ａｌｕ
Ｉ）、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｎ（Ｎｄ
ｅＩ）、Ｔ（ＴａｑＩ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）およびＰ
（ＰｓｔＩ）である。
Ａのストレッチの制限地図に例示したものである。スケ
ールはｋｂｐで、図中にボールド書体の大文字で示した
Ｐ．１９５遺伝子のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を基準点
として選んだ。他の制限酵素部位は次の記号で表示し
た。Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｒ（Ｒｓａｌ）、Ａ（Ａｌｕ
Ｉ）、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｎ（Ｎｄ
ｅＩ）、Ｔ（ＴａｑＩ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）およびＰ
（ＰｓｔＩ）である。
【００２６】制限地図の下に示した配列のストレッチは
指示した特異的クローンにハイブリダイズすることが明
らかにされたストレッチである。カッコ内の数字はその
セグメントがハイブリダイズするｃＤＮＡクローンで、
数字は常に関連ｐＰＦｃクローンに相当する。カッコ外
にさらに数字とそれに続いて上述の２個の文字がある場
合、これは用いられたプローブが全クローンより小さ
く、数字は断片の長さ（ｋｂｐ）、文字はその断片の生
成に用いた制限酵素を示している。
指示した特異的クローンにハイブリダイズすることが明
らかにされたストレッチである。カッコ内の数字はその
セグメントがハイブリダイズするｃＤＮＡクローンで、
数字は常に関連ｐＰＦｃクローンに相当する。カッコ外
にさらに数字とそれに続いて上述の２個の文字がある場
合、これは用いられたプローブが全クローンより小さ
く、数字は断片の長さ（ｋｂｐ）、文字はその断片の生
成に用いた制限酵素を示している。
【００２７】図４はＰ．１９５ＤＮＡの断片の表現に用
いられる２種のプラスミドの構築を例示している。ｐＷ
ＲＬ５０７は図に示されているように多数の特徴的な制
限部位と特徴的な遺伝子機能とを有する。Ｐｔｒｐ、ｔ
ｒｐＥはそれぞれプロモーターおよびアントラニル酸シ
ンテターゼＩで、ＡｍｐR はアンピシリン抵抗性をＴｅ
ｔR はテトラサイクリン抵抗性を付与する。ｐＸＹ４６
０も図に示されているように特徴的な制限部位を有し、
プロモーター（Ｐｔａｃ）、β−ガラクトシダーゼをコ
ードする遺伝子（ｌａｃZ ）およびアンピシリン抵抗性
を付与する遺伝子（ＡｍｐR ）を含む。
いられる２種のプラスミドの構築を例示している。ｐＷ
ＲＬ５０７は図に示されているように多数の特徴的な制
限部位と特徴的な遺伝子機能とを有する。Ｐｔｒｐ、ｔ
ｒｐＥはそれぞれプロモーターおよびアントラニル酸シ
ンテターゼＩで、ＡｍｐR はアンピシリン抵抗性をＴｅ
ｔR はテトラサイクリン抵抗性を付与する。ｐＸＹ４６
０も図に示されているように特徴的な制限部位を有し、
プロモーター（Ｐｔａｃ）、β−ガラクトシダーゼをコ
ードする遺伝子（ｌａｃZ ）およびアンピシリン抵抗性
を付与する遺伝子（ＡｍｐR ）を含む。
【００２８】上述のＤＮＡ配列は、前述した条件を仮定
すれば、またこの配列の決定に際しての実験誤差を考慮
する限り、図１に示されている配列の全部、または一部
を含有することを特徴とするものである。また、上述の
ＤＮＡ配列は、本明細書に述べる方法で決定できる図２
および図３のような制限地図を有することを特徴とする
ものである。
すれば、またこの配列の決定に際しての実験誤差を考慮
する限り、図１に示されている配列の全部、または一部
を含有することを特徴とするものである。また、上述の
ＤＮＡ配列は、本明細書に述べる方法で決定できる図２
および図３のような制限地図を有することを特徴とする
ものである。
【００２９】遺伝子配列は、化学切断法〔マキサムほか
（Ｍａｘａｍ，Ａ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．）：メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．）、６５：４９９（１９８０）〕または目的のＤ
ＮＡ断片をバクテリオファージクローニングベクターに
サブクローニングしたのち〔メッシングほか（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ，Ｊ．＆ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．）：ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、１９：２６９〜２７６（１９８２）〕、ジデオ
キシ法〔サンガーほか（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔａｌ）：プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）、７４：５４６３〜５４６７〕によって
決定された。
（Ｍａｘａｍ，Ａ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．）：メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．）、６５：４９９（１９８０）〕または目的のＤ
ＮＡ断片をバクテリオファージクローニングベクターに
サブクローニングしたのち〔メッシングほか（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ，Ｊ．＆ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．）：ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、１９：２６９〜２７６（１９８２）〕、ジデオ
キシ法〔サンガーほか（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔａｌ）：プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）、７４：５４６３〜５４６７〕によって
決定された。
【００３０】図１に示されている配列の分析により２１
６位に開始コドンと思われるもの（ＡＵＧ）があり、さ
らに１６５４個のコドンの読み取り枠が続いている。ペ
プチド遺伝子生成物の分子量の計算値は１８９，９５３
になる。開始コドンに続いてシグナル配列と推定される
１８個のコドンが存在し、これは蛋白質が成熟する前に
蛋白質から切り離されるアミノ酸配列をコードするもの
と思われる。
６位に開始コドンと思われるもの（ＡＵＧ）があり、さ
らに１６５４個のコドンの読み取り枠が続いている。ペ
プチド遺伝子生成物の分子量の計算値は１８９，９５３
になる。開始コドンに続いてシグナル配列と推定される
１８個のコドンが存在し、これは蛋白質が成熟する前に
蛋白質から切り離されるアミノ酸配列をコードするもの
と思われる。
【００３１】ヌクレオチド４４７〜５２７は、Ｐ．１９
５の８３，０００ＭＷ断片内に生じるトリペプチド配列
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＳｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
の交互のくり返しをコードしている（例６）。翻訳され
た配列内のアミノ酸の一部の分布は不斉である。たとえ
ば１９個のシスティン残基のうち、２個はシグナルペプ
チドと思われる配列中に、１１個はＣ末端の９７個のア
ミノ酸（４２，０００ＭＷ断片）中に存在する。Ａｓｎ
−Ｘ−ＳｅｒまたはＴｈｒ（Ｘはプロリン以外の通常の
アミノ酸である）で示される構造の１１個のトリペプチ
ド配列が確認されているが、これらはＮ−グリコシレー
ション部位と考えられる。
５の８３，０００ＭＷ断片内に生じるトリペプチド配列
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＳｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
の交互のくり返しをコードしている（例６）。翻訳され
た配列内のアミノ酸の一部の分布は不斉である。たとえ
ば１９個のシスティン残基のうち、２個はシグナルペプ
チドと思われる配列中に、１１個はＣ末端の９７個のア
ミノ酸（４２，０００ＭＷ断片）中に存在する。Ａｓｎ
−Ｘ−ＳｅｒまたはＴｈｒ（Ｘはプロリン以外の通常の
アミノ酸である）で示される構造の１１個のトリペプチ
ド配列が確認されているが、これらはＮ−グリコシレー
ション部位と考えられる。
【００３２】図１に示した配列データを用い、この配列
のいかなる部分に相当するペプチドもたとえばメリフィ
ールド他〔Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．およびＭａ
ｒｇｌｉｎ，Ａ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
（１９７０）３９、８４１頁以下参照）〕の方法を用い
て合成することができるということが認識されよう。而
して、本発明に係るもう一つの具体例としてＰ．１９５
の少なくとも１種のエピトープを含む合成ペプチドが提
供される。本明細書で用いる「合成」なる用語は、たと
えば上記のごとき化学的方法により製造されるペプチド
を意味するものとする。
のいかなる部分に相当するペプチドもたとえばメリフィ
ールド他〔Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．およびＭａ
ｒｇｌｉｎ，Ａ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
（１９７０）３９、８４１頁以下参照）〕の方法を用い
て合成することができるということが認識されよう。而
して、本発明に係るもう一つの具体例としてＰ．１９５
の少なくとも１種のエピトープを含む合成ペプチドが提
供される。本明細書で用いる「合成」なる用語は、たと
えば上記のごとき化学的方法により製造されるペプチド
を意味するものとする。
【００３３】Ｐ．１９５をコードするＤＮＡ配列の断片
の同定およびクローニングは、たとえば次のようにして
実施することができる。同調培養したプラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の細胞を界面活性剤で処
理し、エタノール処理および遠心分離でメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を沈殿させ、オリゴ−ｄＴセルロー
ス上クロマトグラフィーに付して精製することにより、
まずｍＲＮＡを抽出した。
の同定およびクローニングは、たとえば次のようにして
実施することができる。同調培養したプラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の細胞を界面活性剤で処
理し、エタノール処理および遠心分離でメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を沈殿させ、オリゴ−ｄＴセルロー
ス上クロマトグラフィーに付して精製することにより、
まずｍＲＮＡを抽出した。
【００３４】ほぼ純粋な生成物を次に、逆転写酵素とＤ
ＮＡポリメラーゼを用いるコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
合成に使用した。生成後、ｃＤＮＡをプラスミドに挿入
し、ついでこれを形質転換により宿主に導入した。生成
したライブラリー中のどのクローンが関連ＤＮＡ挿入部
を含有するかを確認するため、プラスモジウム（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）ｍＲＮＡを庶糖勾配法により遠心
分離してプローブを単利し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳
により分画の性質を調べた。
ＮＡポリメラーゼを用いるコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
合成に使用した。生成後、ｃＤＮＡをプラスミドに挿入
し、ついでこれを形質転換により宿主に導入した。生成
したライブラリー中のどのクローンが関連ＤＮＡ挿入部
を含有するかを確認するため、プラスモジウム（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）ｍＲＮＡを庶糖勾配法により遠心
分離してプローブを単利し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳
により分画の性質を調べた。
【００３５】Ｐ．１９５をコードすることが明らかにさ
れた分画を、部分アルカリ加水分解したのち、ポリヌク
レオチドキナーゼとγ32Ｐ−ＡＴＰによって放射標識し
た。このプローブをコロニ−ハイブリダイゼーション実
験に用いたところ、数個のクローンがそれとハイブリダ
イズし、その一部は強力にハイブリダイズすることが明
らかになった。これらをクロスハイブリダイゼーション
によってファミリーに分類し、各ファミリーから１個ず
つをニックトランスレーションにより、ＤＮＡポリメラ
ーゼとα−32Ｐ−ｄＡＴＰで放射標識した。
れた分画を、部分アルカリ加水分解したのち、ポリヌク
レオチドキナーゼとγ32Ｐ−ＡＴＰによって放射標識し
た。このプローブをコロニ−ハイブリダイゼーション実
験に用いたところ、数個のクローンがそれとハイブリダ
イズし、その一部は強力にハイブリダイズすることが明
らかになった。これらをクロスハイブリダイゼーション
によってファミリーに分類し、各ファミリーから１個ず
つをニックトランスレーションにより、ＤＮＡポリメラ
ーゼとα−32Ｐ−ｄＡＴＰで放射標識した。
【００３６】これらのプローブがＰ．１９５のＤＮＡ配
列の一部であるとすれば、プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ）ｍＲＮＡの全抽出物中、１９５，００
０ＭＷの蛋白質をコードするのに必要なｍＲＮＡの最低
の長さである５，３００塩基以上のｍＲＮＡとハイブリ
ダイズするはずである。
列の一部であるとすれば、プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ）ｍＲＮＡの全抽出物中、１９５，００
０ＭＷの蛋白質をコードするのに必要なｍＲＮＡの最低
の長さである５，３００塩基以上のｍＲＮＡとハイブリ
ダイズするはずである。
【００３７】このようなｍＲＮＡを認識するプローブ
（ノーザン法）を、さらに、適当な宿主中でそのｃＤＮ
Ａ配列を融合ペプチドとして表現できるベクター中に導
入して、その性質を調べた。このｃＤＮＡの表現を確認
するため、その断片をベクター中に導入する前にエキソ
ヌクレアーゼで処理して、読み取り枠をランダム化し
た。表現ペプチドはＰ．１９５に対して誘発された多価
ウサギ血清で検査した。上述のＤＮＡ断片はこのような
操作で検出された。
（ノーザン法）を、さらに、適当な宿主中でそのｃＤＮ
Ａ配列を融合ペプチドとして表現できるベクター中に導
入して、その性質を調べた。このｃＤＮＡの表現を確認
するため、その断片をベクター中に導入する前にエキソ
ヌクレアーゼで処理して、読み取り枠をランダム化し
た。表現ペプチドはＰ．１９５に対して誘発された多価
ウサギ血清で検査した。上述のＤＮＡ断片はこのような
操作で検出された。
【００３８】Ｐ．１９５に対する完全なｃＤＮＡのクロ
ーニングについては、全ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの
合成法が数種知られている〔たとえばハイデッカーほか
（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ，Ｇ． ＆ Ｍｅｓｓｉｇ，
Ｊ．）：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１１：４８９１〜４
９０６（１９８３）〕。またクローニングは、容易に調
整できる全ゲノムＤＮＡ消化ライブラリー、およびこの
ライブラリー中に上述の断片をプローブとして用いるこ
とにより検出される関連配列またはその断片を使用して
も実施できる〔たとえばオディンクほか（Ｏｄｉｎｋ，
Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオ
ケミカル・パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、１０：５５〜５６（１９８
４）〕。
ーニングについては、全ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの
合成法が数種知られている〔たとえばハイデッカーほか
（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ，Ｇ． ＆ Ｍｅｓｓｉｇ，
Ｊ．）：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１１：４８９１〜４
９０６（１９８３）〕。またクローニングは、容易に調
整できる全ゲノムＤＮＡ消化ライブラリー、およびこの
ライブラリー中に上述の断片をプローブとして用いるこ
とにより検出される関連配列またはその断片を使用して
も実施できる〔たとえばオディンクほか（Ｏｄｉｎｋ，
Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオ
ケミカル・パラシトロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、１０：５５〜５６（１９８
４）〕。
【００３９】この方法で見出される配列の一部は要求さ
れるｃＤＮＡ配列の全長であるが、多くはこの配列の断
片である。ライブラリー中のどのクローンが所望のＤＮ
Ａの一部に相当するかを決定するためには、染色体歩行
として知られている方法〔ハッドフィールド（Ｈａｄｆ
ｉｅｌｄ，Ｃ．）：フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、５：１
〜５（１９８３）〕を使用する。
れるｃＤＮＡ配列の全長であるが、多くはこの配列の断
片である。ライブラリー中のどのクローンが所望のＤＮ
Ａの一部に相当するかを決定するためには、染色体歩行
として知られている方法〔ハッドフィールド（Ｈａｄｆ
ｉｅｌｄ，Ｃ．）：フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、５：１
〜５（１９８３）〕を使用する。
【００４０】この方法は既知の断片（プローブ）を用い
て、クロスハイブリダイゼーションにより他の断片を検
出するものである。これらの新たに突き止められた配列
はそれ自体プローブとして使用してもよく、この方法
で、Ｐ．１９５をコードするＤＮＡの全配列が同定さ
れ、クローン化できる。この操作によればＤＮＡ配列の
制限地図特性も明らかにできる。
て、クロスハイブリダイゼーションにより他の断片を検
出するものである。これらの新たに突き止められた配列
はそれ自体プローブとして使用してもよく、この方法
で、Ｐ．１９５をコードするＤＮＡの全配列が同定さ
れ、クローン化できる。この操作によればＤＮＡ配列の
制限地図特性も明らかにできる。
【００４１】ゲノムＤＮＡ中のＰ．１９５の遺伝子の物
理的地図の、制限エンドヌクレアーゼ切断、ゲル電気泳
動、ニトロセルロースまたはポリアミド膜へのトランス
ファーおよびクローンＤＮＡ由来の特異的プローブへの
ハイブリダイゼーションによる構築はｃＤＮＡの方向性
および位置ならびにゲノムクローンの確認にきわめて有
用でそれを容易にする。さらに、ｃＤＮＡクローン内の
制限部位とゲノム中の制限部位の比較は、ｃＤＮＡが合
成されるｍＲＮＡ中には存在しない遺伝子の特徴を検出
するのに使用できる。
理的地図の、制限エンドヌクレアーゼ切断、ゲル電気泳
動、ニトロセルロースまたはポリアミド膜へのトランス
ファーおよびクローンＤＮＡ由来の特異的プローブへの
ハイブリダイゼーションによる構築はｃＤＮＡの方向性
および位置ならびにゲノムクローンの確認にきわめて有
用でそれを容易にする。さらに、ｃＤＮＡクローン内の
制限部位とゲノム中の制限部位の比較は、ｃＤＮＡが合
成されるｍＲＮＡ中には存在しない遺伝子の特徴を検出
するのに使用できる。
【００４２】たとえば、暗号配列内の分断、イントロン
の存在を検出でき、これは転写ＲＮＡから特異的スプラ
イシングによって切り取られる。このような約７００
ｂ．ｐ．のイントロンと思われる例が、上述の方法によ
りヌクレオチド暗号配列２２１と３１３の間（図１）、
すなわちこれらの位置でＭｂｏＩ（Ｍ）とＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位の間（図３）に認められている。
の存在を検出でき、これは転写ＲＮＡから特異的スプラ
イシングによって切り取られる。このような約７００
ｂ．ｐ．のイントロンと思われる例が、上述の方法によ
りヌクレオチド暗号配列２２１と３１３の間（図１）、
すなわちこれらの位置でＭｂｏＩ（Ｍ）とＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位の間（図３）に認められている。
【００４３】上述のように、Ｐ．１９５はｉｎ ｖｉｖ
ｏでプロセッシングを受け、上に述べたような断片を含
む分離断片となる。これらの断片がマラリヤに対する免
疫を付与するのに有益であることは容易に証明でき、こ
のような断片のＤＮＡ配列は本発明の重要な一態様であ
る。とくに、このような配列は一般に、全蛋白質のＤＮ
Ａ配列よりも適当なベクター中で良好に表現されるから
である。したがって、さらに本発明に係る一態様とし
て、ｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ．１９５断片をコードす
るクローンＤＮＡ配列を挙げることができる。
ｏでプロセッシングを受け、上に述べたような断片を含
む分離断片となる。これらの断片がマラリヤに対する免
疫を付与するのに有益であることは容易に証明でき、こ
のような断片のＤＮＡ配列は本発明の重要な一態様であ
る。とくに、このような配列は一般に、全蛋白質のＤＮ
Ａ配列よりも適当なベクター中で良好に表現されるから
である。したがって、さらに本発明に係る一態様とし
て、ｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ．１９５断片をコードす
るクローンＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００４４】感受性宿主に免疫応答をとくに引き出しや
すい天然に生じるＰ．１９５断片は、分裂小体表面に存
在する断片である。さらに本発明に係る一態様として、
プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の分裂小
体表面膜上にｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ．１９５断片を
コードするクローンＤＮＡ配列が提供される。
すい天然に生じるＰ．１９５断片は、分裂小体表面に存
在する断片である。さらに本発明に係る一態様として、
プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の分裂小
体表面膜上にｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ．１９５断片を
コードするクローンＤＮＡ配列が提供される。
【００４５】線状遺伝子配列中のプロセッシング断片の
位置決定のためには〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ）：前出（１９８４ｂ）〕、ひとつの
直接的アプローチとして、断片を精製して部分アミノ酸
配列を決定し、ついでこれを翻訳された遺伝子配列と比
較する方法がある。これは分裂小体から多分、赤血球侵
入過程で特異的に離脱すると思われ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
培養液の上清に蓄積する８３，０００ＭＷ断片について
実行可能なことが明らかにされている。Ｐ．１９５の８
３，０００ＭＷ断片の２０個のアミノ末端残基の配列決
定により、相当する暗号配列が図１のヌクレオチド２７
３〜３３２に存在すること、すなわちこの断片が遺伝子
内にあることが示されている。
位置決定のためには〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ）：前出（１９８４ｂ）〕、ひとつの
直接的アプローチとして、断片を精製して部分アミノ酸
配列を決定し、ついでこれを翻訳された遺伝子配列と比
較する方法がある。これは分裂小体から多分、赤血球侵
入過程で特異的に離脱すると思われ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
培養液の上清に蓄積する８３，０００ＭＷ断片について
実行可能なことが明らかにされている。Ｐ．１９５の８
３，０００ＭＷ断片の２０個のアミノ末端残基の配列決
定により、相当する暗号配列が図１のヌクレオチド２７
３〜３３２に存在すること、すなわちこの断片が遺伝子
内にあることが示されている。
【００４６】モノクロナール抗体を用い常法によって、
４２，０００ＭＷ断片の位置が決定され、これは例７に
記載されている。４２，０００ＭＷおよび８３，０００
ＭＷ両断片の暗号配列は、遺伝子の逆の末端にあること
が確認されている。Ｐ．１９５遺伝子内の対立変異を明
らかにする実験から、最大の保存は領域５′のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位（８３，０００ＭＷ断片中）および３′非暗
号領域（図２）に起こることが示されている。もっとも
保存性の高い配列は４２，０００ＭＷ断片のカルボキシ
末端における約１３０個のアミノ酸残基に相当する遺伝
子の３′末端にあって、この断片が少なくとも１個の有
用なエピトープを含むことを示唆している。
４２，０００ＭＷ断片の位置が決定され、これは例７に
記載されている。４２，０００ＭＷおよび８３，０００
ＭＷ両断片の暗号配列は、遺伝子の逆の末端にあること
が確認されている。Ｐ．１９５遺伝子内の対立変異を明
らかにする実験から、最大の保存は領域５′のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位（８３，０００ＭＷ断片中）および３′非暗
号領域（図２）に起こることが示されている。もっとも
保存性の高い配列は４２，０００ＭＷ断片のカルボキシ
末端における約１３０個のアミノ酸残基に相当する遺伝
子の３′末端にあって、この断片が少なくとも１個の有
用なエピトープを含むことを示唆している。
【００４７】したがって、本発明に係る一態様として、
さらにＰ．１９５の４２，０００ＭＷ断片に相当するＤ
ＮＡ配列が提供される。本発明に係るＤＮＡ配列は、こ
のＤＮＡ配列を含有するウイルスの産生にも使用でき
る。たとえば、感染細胞にヒポキサンチンを含有しない
培地上での生育能を付与できないワクシニアウイルスの
株（ＴＫ- ）を用いて組織培養体に感染させる。この組
織培養体をＴＫ+ 遺伝決定基に結合したＰ．１９５遺伝
子またはその断片で形質転換する。以後の子孫ウイルス
の一部はこの形質転換配列をゲノム中への挿入体の形で
保有することになる。これらは、組織培養細胞にヒポキ
サンチン欠乏培地上での生育能を付与する能力により選
択できる。
さらにＰ．１９５の４２，０００ＭＷ断片に相当するＤ
ＮＡ配列が提供される。本発明に係るＤＮＡ配列は、こ
のＤＮＡ配列を含有するウイルスの産生にも使用でき
る。たとえば、感染細胞にヒポキサンチンを含有しない
培地上での生育能を付与できないワクシニアウイルスの
株（ＴＫ- ）を用いて組織培養体に感染させる。この組
織培養体をＴＫ+ 遺伝決定基に結合したＰ．１９５遺伝
子またはその断片で形質転換する。以後の子孫ウイルス
の一部はこの形質転換配列をゲノム中への挿入体の形で
保有することになる。これらは、組織培養細胞にヒポキ
サンチン欠乏培地上での生育能を付与する能力により選
択できる。
【００４８】生育するコロニーをさらに、たとえばＦ１
１１．２のような関連モノクロナール抗体を用い、Ｐ．
１９５またはその少なくとも１個のエピトープを含むペ
プチドの産生について選択する。このようなワクシニア
株は免疫原性マラリヤペプチドを産生するので、マラリ
ヤに罹患しやすい動物の感染に使用できる。すなわち、
本発明に係る一態様として、感受性脊椎動物にマラリヤ
の免疫を付与するのに使用できる、上述のＤＮＡ配列を
もった非病原性ウイルスが提供される。
１１．２のような関連モノクロナール抗体を用い、Ｐ．
１９５またはその少なくとも１個のエピトープを含むペ
プチドの産生について選択する。このようなワクシニア
株は免疫原性マラリヤペプチドを産生するので、マラリ
ヤに罹患しやすい動物の感染に使用できる。すなわち、
本発明に係る一態様として、感受性脊椎動物にマラリヤ
の免疫を付与するのに使用できる、上述のＤＮＡ配列を
もった非病原性ウイルスが提供される。
【００４９】このようなワクチンはまた、他の感染、た
とえば天然痘、ジフテリア、Ｂ型肝炎、狂犬病、単純疱
疹、百日咳等に対する免疫も容易に付与できることは明
白である。したがって、本発明は、さらに他の感染に対
する免疫も付与できる上述のような非病原性ウイルスを
も提供するものである。これは他のワクチンと一緒にあ
わせて、または個々に、同時投与することができる。
とえば天然痘、ジフテリア、Ｂ型肝炎、狂犬病、単純疱
疹、百日咳等に対する免疫も容易に付与できることは明
白である。したがって、本発明は、さらに他の感染に対
する免疫も付与できる上述のような非病原性ウイルスを
も提供するものである。これは他のワクチンと一緒にあ
わせて、または個々に、同時投与することができる。
【００５０】Ｐ．１２５のＤＮＡ配列の上述の特性に基
づき、得られた制限地図を参照して、この配列の任意の
所望の断片のクローニングが可能である。外来性ＤＮＡ
小片を正しい読み取り枠で大腸菌遺伝子に挿入すると、
一部のアミノ酸配列は大腸菌遺伝子から、一部は挿入Ｄ
ＮＡに由来する融合蛋白質が表現される。適当な制御配
列と有利な制限部位をもつ適当なベクターが構築されて
いて、融合蛋白質の高レベルの表現が可能になってい
る。
づき、得られた制限地図を参照して、この配列の任意の
所望の断片のクローニングが可能である。外来性ＤＮＡ
小片を正しい読み取り枠で大腸菌遺伝子に挿入すると、
一部のアミノ酸配列は大腸菌遺伝子から、一部は挿入Ｄ
ＮＡに由来する融合蛋白質が表現される。適当な制御配
列と有利な制限部位をもつ適当なベクターが構築されて
いて、融合蛋白質の高レベルの表現が可能になってい
る。
【００５１】選ばれた表現システムの制限地図と表現さ
せる配列を調査し、これに翻訳枠の知識があれば、特異
的ＤＮＡ断片を表現ベクター中にリゲートするだけの操
作で、その表現が可能である。たとえば、ｐＷＲＬ５０
７はｐＡＴ１５３とｔｒｐＥ遺伝子から〔ニコルスほか
（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ． ｅｔ ａｌ）：ジャーナ
ル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ．）、１４６：４５〜５４（１９８
１）〕、ｔｒｐＥ遺伝子のヌクレオチド１２２３のＢｇ
ｌＩＩ部位に合成ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩリンカーを挿
入して構築されたプラスミドである（図４）。
せる配列を調査し、これに翻訳枠の知識があれば、特異
的ＤＮＡ断片を表現ベクター中にリゲートするだけの操
作で、その表現が可能である。たとえば、ｐＷＲＬ５０
７はｐＡＴ１５３とｔｒｐＥ遺伝子から〔ニコルスほか
（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ． ｅｔ ａｌ）：ジャーナ
ル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ．）、１４６：４５〜５４（１９８
１）〕、ｔｒｐＥ遺伝子のヌクレオチド１２２３のＢｇ
ｌＩＩ部位に合成ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩリンカーを挿
入して構築されたプラスミドである（図４）。
【００５２】このベクターはＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、このＤＮＡ小断片をｐＰＦｇｌの２．７Ｋ
ｂｐＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ｐＰＥｃ１０２８の４
００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片またはｐＰＦｃ
１０２８の２．４Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位はこのプラスミドのポリリンカー
中にある）断片でそれぞれ置換できる。さらに、ｐＰＦ
ｃ１０２８の１．２Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩのよ
うな特異的断片をｐＵＣ９のポリリンカー領域（この場
合、ＥｃｏＲＩ／ブラント末端断片として）にサブクロ
ーンし、ついでＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出
し、ｐＷＲＬ５０７のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩカッ
トにクローン化することができる。
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、このＤＮＡ小断片をｐＰＦｇｌの２．７Ｋ
ｂｐＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ｐＰＥｃ１０２８の４
００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片またはｐＰＦｃ
１０２８の２．４Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位はこのプラスミドのポリリンカー
中にある）断片でそれぞれ置換できる。さらに、ｐＰＦ
ｃ１０２８の１．２Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩのよ
うな特異的断片をｐＵＣ９のポリリンカー領域（この場
合、ＥｃｏＲＩ／ブラント末端断片として）にサブクロ
ーンし、ついでＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出
し、ｐＷＲＬ５０７のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩカッ
トにクローン化することができる。
【００５３】適当な制限酵素部位を用い、Ｐ．１９５遺
伝子配列からのＤＮＡ断片をｔｒｐＥ遺伝子内に正しい
方向でクローニングすることは可能であるが、通常、翻
訳枠がずれてしまう。挿入配列を発現させるには、適当
な長さの合成リンカーをｔｒｐＥ遺伝子と挿入体の間の
制限部位に挿入して、融合蛋白質を読み取り枠どおりに
発現させる。また、挿入ＤＮＡを含むプラスミドをバク
テリアＤＮＡと挿入ＤＮＡの間の特徴的制限部位で開裂
し、そのＤＮＡを酵素Ｂａｌ３１で短時間処理して直線
化ＤＮＡの各末端から数個の塩基を除去する。
伝子配列からのＤＮＡ断片をｔｒｐＥ遺伝子内に正しい
方向でクローニングすることは可能であるが、通常、翻
訳枠がずれてしまう。挿入配列を発現させるには、適当
な長さの合成リンカーをｔｒｐＥ遺伝子と挿入体の間の
制限部位に挿入して、融合蛋白質を読み取り枠どおりに
発現させる。また、挿入ＤＮＡを含むプラスミドをバク
テリアＤＮＡと挿入ＤＮＡの間の特徴的制限部位で開裂
し、そのＤＮＡを酵素Ｂａｌ３１で短時間処理して直線
化ＤＮＡの各末端から数個の塩基を除去する。
【００５４】ＤＮＡポリメラーゼ１の大（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）断片で修復したのち、プラスミドをＴ4 リガーゼで
再び環化し、バクテリアの形質転換に使用する。形質転
換体の３個中１個はＰ．１９５配列を正しい読み取り枠
で含有し、ｔｒｐＥ遺伝子生成物との融合蛋白質として
表現される。Ｂａｌ３１による消化の程度が表現される
融合蛋白質の最終サイズおよびｔｒｐＥとそれに含まれ
るＰ．１９５配列との長さの割合によって決まることは
本技術分野における熟練者には自明のとおりである。
ｗ）断片で修復したのち、プラスミドをＴ4 リガーゼで
再び環化し、バクテリアの形質転換に使用する。形質転
換体の３個中１個はＰ．１９５配列を正しい読み取り枠
で含有し、ｔｒｐＥ遺伝子生成物との融合蛋白質として
表現される。Ｂａｌ３１による消化の程度が表現される
融合蛋白質の最終サイズおよびｔｒｐＥとそれに含まれ
るＰ．１９５配列との長さの割合によって決まることは
本技術分野における熟練者には自明のとおりである。
【００５５】さらに、Ｂａｌ３１消化および修復後のリ
ゲーションの間に合成リンカーを挿入すれば、形質転換
後の特定株の分析が容易になる。特異的制限酵素による
消化とＢａｌ３１酵素処理を上手に使用すればＰ．１９
５の任意の特定領域を融合蛋白質として表現することが
できる。
ゲーションの間に合成リンカーを挿入すれば、形質転換
後の特定株の分析が容易になる。特異的制限酵素による
消化とＢａｌ３１酵素処理を上手に使用すればＰ．１９
５の任意の特定領域を融合蛋白質として表現することが
できる。
【００５６】したがって、本発明に係る、さらに他の態
様として、適当な宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミ
ノ末端コード部分に縦列に結合したＤＮＡ配列を含むベ
クターが提供される。このベクターは任意の制御配列を
伴っていてもよく、適当な形質転換宿主を用いると、
Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはその少なくとも１
個のエピトープからなる融合蛋白質が産生される。
様として、適当な宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミ
ノ末端コード部分に縦列に結合したＤＮＡ配列を含むベ
クターが提供される。このベクターは任意の制御配列を
伴っていてもよく、適当な形質転換宿主を用いると、
Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはその少なくとも１
個のエピトープからなる融合蛋白質が産生される。
【００５７】ＤＮＡ断片を発現させる別法としては読み
取り枠（ＯＲＦ）ベクターを用いる方法がある。これに
ＤＮＡの通常は短い断片、多くの場合に大腸菌蛋白質の
Ｎ末端アミノ酸配列をコードする配列内に挿入できる。
この挿入ＤＮＡは停止コドンを正しい翻訳枠で含有して
はならず、転写方向に関して正しい方向性をもたねばな
らず、また各末端が正しい枠内になければならない。ラ
ンダム切断法で生じた蛋白質コード配列からのＤＮＡ切
片が正しい枠で読み取られる確率は１／１８である。
取り枠（ＯＲＦ）ベクターを用いる方法がある。これに
ＤＮＡの通常は短い断片、多くの場合に大腸菌蛋白質の
Ｎ末端アミノ酸配列をコードする配列内に挿入できる。
この挿入ＤＮＡは停止コドンを正しい翻訳枠で含有して
はならず、転写方向に関して正しい方向性をもたねばな
らず、また各末端が正しい枠内になければならない。ラ
ンダム切断法で生じた蛋白質コード配列からのＤＮＡ切
片が正しい枠で読み取られる確率は１／１８である。
【００５８】β−ガラクトシダーゼに基づくＯＲＦベク
ターが報告されている〔ケネンほか（Ｋｏｅｎｅｎ ｅ
ｔ ａｌ）、１９８２〕。この蛋白質のＮ末端における
部位にＤＮＡ切片を正しい枠で挿入すると、β−ガラク
トシダーゼ蛋白質を読み通して表現され、これは発色性
基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を加水分解するので検知で
きる。たとえば、Ｘｇａｌが含まれているアガール上で
コロニーを生育させると、機能性β−ガラクトシダーゼ
を表現するプラスミドをもつ適当な宿主株の形質転換体
は青色のコロニーを産生する。このようなベクターの一
つのｐＸＹ４６０はｔａｃプロモーターの制御下にβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。
ターが報告されている〔ケネンほか（Ｋｏｅｎｅｎ ｅ
ｔ ａｌ）、１９８２〕。この蛋白質のＮ末端における
部位にＤＮＡ切片を正しい枠で挿入すると、β−ガラク
トシダーゼ蛋白質を読み通して表現され、これは発色性
基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を加水分解するので検知で
きる。たとえば、Ｘｇａｌが含まれているアガール上で
コロニーを生育させると、機能性β−ガラクトシダーゼ
を表現するプラスミドをもつ適当な宿主株の形質転換体
は青色のコロニーを産生する。このようなベクターの一
つのｐＸＹ４６０はｔａｃプロモーターの制御下にβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。
【００５９】ＥｃｏＲＩ部位のとなりのＳｍａＩ部位に
ＤＮＡを挿入すると遺伝子が正しい読み取り枠で発現す
るように変換できる。ＪＭ１０５のような大腸菌宿主の
形質転換はバクテリアをアンピシリン抵抗性に変換し、
融合蛋白質の表現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により高レベルに誘導
される。
ＤＮＡを挿入すると遺伝子が正しい読み取り枠で発現す
るように変換できる。ＪＭ１０５のような大腸菌宿主の
形質転換はバクテリアをアンピシリン抵抗性に変換し、
融合蛋白質の表現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により高レベルに誘導
される。
【００６０】したがって、本発明に係る別の一態様とし
て、適当な宿主中で翻訳可能な遺伝子からなり、関連制
御配列をもっていてもよいベクターであって、本発明に
係るＤＮＡ配列が上記遺伝子カルボキシ末端部分から上
記ＤＮＡ配列まで正しく翻訳されて適当な宿主中で表現
するように改変して挿入されているベクターが提供され
る。これにより、Ｐ．１９５の少なくとも一部分または
その少なくとも１個のエピトープを含むペプチドと上記
遺伝子がコードする蛋白質の部分とからなる融合蛋白質
が産生される。
て、適当な宿主中で翻訳可能な遺伝子からなり、関連制
御配列をもっていてもよいベクターであって、本発明に
係るＤＮＡ配列が上記遺伝子カルボキシ末端部分から上
記ＤＮＡ配列まで正しく翻訳されて適当な宿主中で表現
するように改変して挿入されているベクターが提供され
る。これにより、Ｐ．１９５の少なくとも一部分または
その少なくとも１個のエピトープを含むペプチドと上記
遺伝子がコードする蛋白質の部分とからなる融合蛋白質
が産生される。
【００６１】Ｐ．１９５遺伝子の部分によってコードさ
れた、融合蛋白質中のペプチドは適当なペプチド結合の
酵素的または化学的切断によって融合蛋白質から切り取
ることができる。表現されたアミノ酸配列の検査によ
り、酵素的または化学的切断法のどれを採用するかは本
技術分野の熟練者であれば容易に決定できる。融合蛋白
質表現システムのＰ．１９５ＤＮＡ配列とバクテリア遺
伝子配列との間に合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿
入すれば、Ｐ．１９５配列と表現された融合蛋白質の残
部の間に酵素的または化学的切断に適した部位が付与さ
れる。この方法でＰ．１９５遺伝子コード断片を宿主ペ
プチドから分離、精製することができる。
れた、融合蛋白質中のペプチドは適当なペプチド結合の
酵素的または化学的切断によって融合蛋白質から切り取
ることができる。表現されたアミノ酸配列の検査によ
り、酵素的または化学的切断法のどれを採用するかは本
技術分野の熟練者であれば容易に決定できる。融合蛋白
質表現システムのＰ．１９５ＤＮＡ配列とバクテリア遺
伝子配列との間に合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿
入すれば、Ｐ．１９５配列と表現された融合蛋白質の残
部の間に酵素的または化学的切断に適した部位が付与さ
れる。この方法でＰ．１９５遺伝子コード断片を宿主ペ
プチドから分離、精製することができる。
【００６２】Ｐ．１９５蛋白質またはその部分をコード
する配列を直接表現させるには、ＡＵＧ開始コドンの後
に挿入ＤＮＡ配列を直接、ＤＮＡ挿入体がバクテリア制
御領域によって通常は転写、翻訳されるコード配列を置
換するように正しい読み取り枠で位置させればよい。こ
のような制御領域は、開始コドンに対して至適位置にプ
ロモーターとリボソーム結合部位とを含有する。表現す
べきＤＮＡ配列は適当な制限部位の使用により正しく位
置され、必要ならば適当なオリゴヌクレオチドリンカー
を使用することもできる。挿入ＤＮＡ配列の末端には、
翻訳を停止させるために停止コドンを正しい読み取り枠
で挿入させ、また転写を停止させるためにターミネータ
ー配列を添加することもできる。
する配列を直接表現させるには、ＡＵＧ開始コドンの後
に挿入ＤＮＡ配列を直接、ＤＮＡ挿入体がバクテリア制
御領域によって通常は転写、翻訳されるコード配列を置
換するように正しい読み取り枠で位置させればよい。こ
のような制御領域は、開始コドンに対して至適位置にプ
ロモーターとリボソーム結合部位とを含有する。表現す
べきＤＮＡ配列は適当な制限部位の使用により正しく位
置され、必要ならば適当なオリゴヌクレオチドリンカー
を使用することもできる。挿入ＤＮＡ配列の末端には、
翻訳を停止させるために停止コドンを正しい読み取り枠
で挿入させ、また転写を停止させるためにターミネータ
ー配列を添加することもできる。
【００６３】表現すべき挿入ＤＮＡはＰ．１９５の全コ
ード配列もしくはアミノ末端シグナル配列を除去した全
配列、また好ましくはその蛋白質の免疫原性断片に相当
する一部のコード配列である。適当な断片は適当なｃＤ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡクローン（ヌクレオチド配列の
検査後に）の制限酵素消化により調製でき、必要に応じ
て一端または両端をさらにＢａｌ３１で処理し、ＤＮＡ
配列の一部を制御された方法で消化、除去する。制御さ
れた消化は、適当な緩衝液、温度、反応時間、酵素量を
たとえば例８に述べるように選択することにより達成さ
れる。この段階で、適当な合成リンカーを、好ましくは
ブラント末端リゲーションにより挿入体に添加すると、
ＡＵＧ開始コドンの付与また表現ベクターへのリゲーシ
ョンの容易化が可能になる。
ード配列もしくはアミノ末端シグナル配列を除去した全
配列、また好ましくはその蛋白質の免疫原性断片に相当
する一部のコード配列である。適当な断片は適当なｃＤ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡクローン（ヌクレオチド配列の
検査後に）の制限酵素消化により調製でき、必要に応じ
て一端または両端をさらにＢａｌ３１で処理し、ＤＮＡ
配列の一部を制御された方法で消化、除去する。制御さ
れた消化は、適当な緩衝液、温度、反応時間、酵素量を
たとえば例８に述べるように選択することにより達成さ
れる。この段階で、適当な合成リンカーを、好ましくは
ブラント末端リゲーションにより挿入体に添加すると、
ＡＵＧ開始コドンの付与また表現ベクターへのリゲーシ
ョンの容易化が可能になる。
【００６４】本発明に係るさらに別の態様として、宿主
細胞を上記で定義したクローニングベクターで形質転換
し、この宿主細胞を培養して上記Ｐ．１９５またはその
少なくとも１個のエピトープからなるペプチドを表現さ
せることを特徴とする方法が提供される。
細胞を上記で定義したクローニングベクターで形質転換
し、この宿主細胞を培養して上記Ｐ．１９５またはその
少なくとも１個のエピトープからなるペプチドを表現さ
せることを特徴とする方法が提供される。
【００６５】クローン断片の制御された表現は、その配
列の一方の末端の配列の使用によりまたは既知の他の配
列の使用によって可能である。このような配列にはプロ
モーターおよびエンハンサーがある。このようなプロモ
ーターの例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、バクテリオファ
ージλｐＬおよびハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａ
ｃ）を挙げることができる。適当なエンハンサーの例と
してはＳＶ４０エンハンサーおよびウシ乳頭腫ウイルス
からのエンハンサーがある。
列の一方の末端の配列の使用によりまたは既知の他の配
列の使用によって可能である。このような配列にはプロ
モーターおよびエンハンサーがある。このようなプロモ
ーターの例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、バクテリオファ
ージλｐＬおよびハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａ
ｃ）を挙げることができる。適当なエンハンサーの例と
してはＳＶ４０エンハンサーおよびウシ乳頭腫ウイルス
からのエンハンサーがある。
【００６６】本発明に係るさらに別の一態様として、本
発明に係る上述のＤＮＡ配列を含有するベクターが提供
される。上述のベクターはＤＮＡのクローニングに適
し、宿主細胞の形質転換に使用でき、関連蛋白質を表現
させることができる適当な任意のベクターである。この
ようなベクターとしては、プラスミド、バクテリオファ
ージおよびコスミドを挙げることができる。ＤＮＡのク
ローニングに使用できるベクターとしては、大腸菌に用
いる場合ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＴ１５３、ｐＢＲ３
２５およびｐＢＲ３２８が、枯草菌に用いる場合ｐＢＤ
９およびｐＫＴ４３８が、酵母に用いる場合ｐＭＡ５６
が、哺乳類細胞に用いる場合ｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）−
３、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ＳＶＥＨＡ３およびＳＶＬＨ
Ａ８がある。
発明に係る上述のＤＮＡ配列を含有するベクターが提供
される。上述のベクターはＤＮＡのクローニングに適
し、宿主細胞の形質転換に使用でき、関連蛋白質を表現
させることができる適当な任意のベクターである。この
ようなベクターとしては、プラスミド、バクテリオファ
ージおよびコスミドを挙げることができる。ＤＮＡのク
ローニングに使用できるベクターとしては、大腸菌に用
いる場合ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＴ１５３、ｐＢＲ３
２５およびｐＢＲ３２８が、枯草菌に用いる場合ｐＢＤ
９およびｐＫＴ４３８が、酵母に用いる場合ｐＭＡ５６
が、哺乳類細胞に用いる場合ｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）−
３、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ＳＶＥＨＡ３およびＳＶＬＨ
Ａ８がある。
【００６７】関連蛋白質の表現に使用されるベクターは
上述したような制御配列を包含するものである。このよ
うなベクターとしては、大腸菌に用いる場合にはｐＸＹ
４６０およびｐＷＲＬ５０７があり、哺乳類細胞に用い
る場合にはｐＳＶ２−ｄｈｆｒがある。本発明に係るさ
らに別の一態様として、本発明に係るＤＮＡ配列と、さ
らにそのＤＮＡ配列の表現を調節するための１個または
２個以上の制御配列を含有するベクターが提供される。
上述したような制御配列を包含するものである。このよ
うなベクターとしては、大腸菌に用いる場合にはｐＸＹ
４６０およびｐＷＲＬ５０７があり、哺乳類細胞に用い
る場合にはｐＳＶ２−ｄｈｆｒがある。本発明に係るさ
らに別の一態様として、本発明に係るＤＮＡ配列と、さ
らにそのＤＮＡ配列の表現を調節するための１個または
２個以上の制御配列を含有するベクターが提供される。
【００６８】上述の方法に使用するのに適当な宿主細胞
の例としては、原核生物、たとえばバクテリア（たとえ
ば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１およびＤＨ１、枯
草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐ．）ＢＤ１７０およ
びＩＨ６１４０）の細胞、真核生物、たとえば酵母細胞
（たとえばＸＶ６１０−８Ｃ酵母細胞）または哺乳類細
胞（たとえばシミアンＣＶ−１細胞）がある。
の例としては、原核生物、たとえばバクテリア（たとえ
ば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１およびＤＨ１、枯
草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐ．）ＢＤ１７０およ
びＩＨ６１４０）の細胞、真核生物、たとえば酵母細胞
（たとえばＸＶ６１０−８Ｃ酵母細胞）または哺乳類細
胞（たとえばシミアンＣＶ−１細胞）がある。
【００６９】本発明に係る別の一態様として、Ｐ．１９
５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少なくとも
１個を含むペプチド、あるいはさらに他のペプチド配列
と共有結合していてもよい上記Ｐ．１９５の少なくとも
一部分またはペプチドを合成する方法が提供される。
５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少なくとも
１個を含むペプチド、あるいはさらに他のペプチド配列
と共有結合していてもよい上記Ｐ．１９５の少なくとも
一部分またはペプチドを合成する方法が提供される。
【００７０】この方法は： ａ） プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライ
ブラリーを作り、 ｂ） Ｐ．１９５のプローブを選択して、そのプローブ
を放射標識し、 ｃ） そのプローブを用いてライブラリーの少なくとも
１個のメンバーを選択し、そして ｄ） ライブラリーから選択されたＤＮＡを用いて、
Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少
なくとも１個を含むペプチドの表現に使用できる適当な
宿主を形質転換する各工程からなる。
ｃｉｐａｒｕｍ）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライ
ブラリーを作り、 ｂ） Ｐ．１９５のプローブを選択して、そのプローブ
を放射標識し、 ｃ） そのプローブを用いてライブラリーの少なくとも
１個のメンバーを選択し、そして ｄ） ライブラリーから選択されたＤＮＡを用いて、
Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少
なくとも１個を含むペプチドの表現に使用できる適当な
宿主を形質転換する各工程からなる。
【００７１】本発明によって、上述の方法のいずれかに
よって得られたＰ．１９５蛋白質またはそのエピトープ
少なくとも１個からなるペプチドが提供される。これら
の物質は、マラリヤに対する免疫を付与するためのワク
チンに導入することができる。この目的には、抗原性蛋
白質またはそのエピトープの少なくとも１個からなるペ
プチドを医薬的に許容される担体と配合して提供する。
この抗原性蛋白質またはペプチドは単独で、または他の
Ｐ．１９５エピトープ含有ペプチドもしくはマラリヤに
対する免疫を付与する他の蛋白質と組合せて使用でき
る。
よって得られたＰ．１９５蛋白質またはそのエピトープ
少なくとも１個からなるペプチドが提供される。これら
の物質は、マラリヤに対する免疫を付与するためのワク
チンに導入することができる。この目的には、抗原性蛋
白質またはそのエピトープの少なくとも１個からなるペ
プチドを医薬的に許容される担体と配合して提供する。
この抗原性蛋白質またはペプチドは単独で、または他の
Ｐ．１９５エピトープ含有ペプチドもしくはマラリヤに
対する免疫を付与する他の蛋白質と組合せて使用でき
る。
【００７２】本発明は、その一態様として、Ｐ．１９５
またはその少なくとも１個のエピトープを含有するペプ
チドを医薬的に許容される担体と配合してなる、マラリ
ヤに対する免疫を誘発するワクチンを提供するものであ
る。この場合の医薬的に許容される担体とは、患者に抗
原を導入するためのビークルとして使用するのに適当な
液体メジウムである。このような担体の例としては食塩
水がある。Ｐ．１９５またはペプチドは担体中に溶液と
しても、また固体として懸濁してもよく、また医薬的に
許容される界面活性剤の添加により可溶化してもよい。
またはその少なくとも１個のエピトープを含有するペプ
チドを医薬的に許容される担体と配合してなる、マラリ
ヤに対する免疫を誘発するワクチンを提供するものであ
る。この場合の医薬的に許容される担体とは、患者に抗
原を導入するためのビークルとして使用するのに適当な
液体メジウムである。このような担体の例としては食塩
水がある。Ｐ．１９５またはペプチドは担体中に溶液と
しても、また固体として懸濁してもよく、また医薬的に
許容される界面活性剤の添加により可溶化してもよい。
【００７３】このワクチンは免疫応答を刺激するための
アジュバント加え、ワクチンの効果を増強させることも
できる。本発明に使用するのに便利なアジュバントには
水酸化アルミニウムがある。このワクチンはＰ．１９５
またはペプチドを最終濃度が０．２〜５ｍｇ／ｍｌの範
囲、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ、とくに好ましく
は１ｍｇ／ｍｌになるように処方するのが便利である。
処方後、ワクチンは滅菌容器に充填し、密封し、低温た
とえば４℃に保存してもよい。また凍結乾燥することも
できる。
アジュバント加え、ワクチンの効果を増強させることも
できる。本発明に使用するのに便利なアジュバントには
水酸化アルミニウムがある。このワクチンはＰ．１９５
またはペプチドを最終濃度が０．２〜５ｍｇ／ｍｌの範
囲、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ、とくに好ましく
は１ｍｇ／ｍｌになるように処方するのが便利である。
処方後、ワクチンは滅菌容器に充填し、密封し、低温た
とえば４℃に保存してもよい。また凍結乾燥することも
できる。
【００７４】脊椎動物にマラリヤに対する免疫を誘発さ
せるためには、適当に処方されたワクチンを１回または
２回以上投与する。１回投与量は０．１〜２ｍｌ、好ま
しくは０．２〜１ｍｌ、とくに好ましくは０．５ｍｌで
ある。本発明によるワクチン、急性毒性の問題をひきお
こすことなく治療用量で投与することができる。
せるためには、適当に処方されたワクチンを１回または
２回以上投与する。１回投与量は０．１〜２ｍｌ、好ま
しくは０．２〜１ｍｌ、とくに好ましくは０．５ｍｌで
ある。本発明によるワクチン、急性毒性の問題をひきお
こすことなく治療用量で投与することができる。
【００７５】本発明はさらにその一態様として、感受性
の脊椎動物宿主に、上述のワクチンの有効量を投与する
ことによる、宿主へのマラリヤに対する免疫の誘発方法
を提供するものである。このワクチンはワクチンの投与
に際して慣用されている任意の方法、経口的にまたは非
経口的に（たとえば皮下もしくは筋肉内注射）投与され
る。処置はワクチンの１回投与または一定期間における
複数の投与によって行われる。
の脊椎動物宿主に、上述のワクチンの有効量を投与する
ことによる、宿主へのマラリヤに対する免疫の誘発方法
を提供するものである。このワクチンはワクチンの投与
に際して慣用されている任意の方法、経口的にまたは非
経口的に（たとえば皮下もしくは筋肉内注射）投与され
る。処置はワクチンの１回投与または一定期間における
複数の投与によって行われる。
【００７６】
【実施例】次に本発明を実施例によってさらに詳細に説
明するが、これは単に本発明を例示するものであって、
本発明をいかなる意味でも限定するものではない。例 １ Ｐ．１９５遺伝子からのｃＤＮＡクローンの同定 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）培養を維
持し、ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ：前出、１９８２）の記載に従って同調させ、再侵入
の最終サイクル後の３０〜４０時間に遠心分離して細胞
を集めた。ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中
で洗浄したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３％
ｗ／ｖになるように添加したＳＤＳの４倍容に細胞を再
懸濁した。
明するが、これは単に本発明を例示するものであって、
本発明をいかなる意味でも限定するものではない。例 １ Ｐ．１９５遺伝子からのｃＤＮＡクローンの同定 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）培養を維
持し、ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ：前出、１９８２）の記載に従って同調させ、再侵入
の最終サイクル後の３０〜４０時間に遠心分離して細胞
を集めた。ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中
で洗浄したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３％
ｗ／ｖになるように添加したＳＤＳの４倍容に細胞を再
懸濁した。
【００７７】同じ緩衝液で平衡化したフェノール：クロ
ロホルム（１：１）により激しく５分間抽出したのち、
１６，０００ｇで３分間遠心分離した。水相に２回目の
抽出を行ったのち、エタノールで核酸を沈殿させ、遠心
分離し、ペレットを０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に
ＣｓＣｌ ４ｇを加えた液４ｍｌ中に溶解した。ＲＮＡ
を０．１Ｍ ＥＤＴＡ中９５％（ｗ／ｖ）ＣｓＣｌをク
ッションとして、２５℃、１５０，０００ｇで１６時間
遠心分離してペレット化し、蒸留水に再溶解し、エタノ
ールで２回沈殿させた。
ロホルム（１：１）により激しく５分間抽出したのち、
１６，０００ｇで３分間遠心分離した。水相に２回目の
抽出を行ったのち、エタノールで核酸を沈殿させ、遠心
分離し、ペレットを０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に
ＣｓＣｌ ４ｇを加えた液４ｍｌ中に溶解した。ＲＮＡ
を０．１Ｍ ＥＤＴＡ中９５％（ｗ／ｖ）ＣｓＣｌをク
ッションとして、２５℃、１５０，０００ｇで１６時間
遠心分離してペレット化し、蒸留水に再溶解し、エタノ
ールで２回沈殿させた。
【００７８】ｍＲＮＡを精製するため、オリゴ−ｄＴセ
ルロースクロマトグラフィーを標準法によって実施した
〔マニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ． ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）：
分子クローニング−実験便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１
９８２〕。庶糖勾配によるＲＮＡのサイズ分画は以前に
報告されているように行った〔オディンクほか（Ｏｄｉ
ｎｋ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ）：ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５６：１４５３〜１４５８（１９８１）〕。
ルロースクロマトグラフィーを標準法によって実施した
〔マニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ． ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）：
分子クローニング−実験便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１
９８２〕。庶糖勾配によるＲＮＡのサイズ分画は以前に
報告されているように行った〔オディンクほか（Ｏｄｉ
ｎｋ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ）：ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５６：１４５３〜１４５８（１９８１）〕。
【００７９】ｃＤＮＡライブラリーは標準操作を用いて
構築した〔マニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ）：前出（１９８２）〕。ｃＤＮＡは６μｇのポ
リＡ＋ＲＡＮ、５μｇのオリゴ−ｄＴ（１２〜１８）、
１ｍＭの各ヌクレオシドトリホスフェート、０．１Ｍト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび３０ＵのＡ
ＭＶ逆転写酵素を含む反応液５０μｌ中、４２℃で９０
分間反応させて合成した。
構築した〔マニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ）：前出（１９８２）〕。ｃＤＮＡは６μｇのポ
リＡ＋ＲＡＮ、５μｇのオリゴ−ｄＴ（１２〜１８）、
１ｍＭの各ヌクレオシドトリホスフェート、０．１Ｍト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび３０ＵのＡ
ＭＶ逆転写酵素を含む反応液５０μｌ中、４２℃で９０
分間反応させて合成した。
【００８０】第２鎖の合成は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、７０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭの各ヌクレオシドト
リホスフェートおよび５０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ大断片を含む液０．１ｍｌ中、１５℃で１６時間反応
させて行った。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、ＤＮＡ５μｇ
を回収し、０．５μｇをｐＵＣ８のＰｓｔＩ部位に単独
重合Ｇ−Ｃテイリングによって挿入した〔ヴィアイラほ
か（Ｖｉｅｉｒａ Ｊ． ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．）：ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９：２５９〜２６８
（１９８２）〕。
Ｈ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、７０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭの各ヌクレオシドト
リホスフェートおよび５０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ大断片を含む液０．１ｍｌ中、１５℃で１６時間反応
させて行った。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、ＤＮＡ５μｇ
を回収し、０．５μｇをｐＵＣ８のＰｓｔＩ部位に単独
重合Ｇ−Ｃテイリングによって挿入した〔ヴィアイラほ
か（Ｖｉｅｉｒａ Ｊ． ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．）：ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９：２５９〜２６８
（１９８２）〕。
【００８１】形質転換には大腸菌ＨＢ１０１を用いた。
３，０００の形質転換体をもつレプリカフィルターを、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳で以前にＰ．１９５をコードす
るｍＲＮＡに富むことが示されているγ−32Ｐ−ＡＴＰ
ポリヌクレオチドキナーゼ標識３３Ｓ ｍＲＮＡ〔オデ
ィンクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ）、１９８４〕で
検査した。この検査で、６０個の組換体プラスミドが検
出され、そのうち１２個は強力なシグナルを与えた。ニ
ックトランスレーションを行った挿入体のクロスハイブ
リダイゼーションに基づき、１２個の組換体から６個の
サブグループが形成された。
３，０００の形質転換体をもつレプリカフィルターを、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳で以前にＰ．１９５をコードす
るｍＲＮＡに富むことが示されているγ−32Ｐ−ＡＴＰ
ポリヌクレオチドキナーゼ標識３３Ｓ ｍＲＮＡ〔オデ
ィンクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ）、１９８４〕で
検査した。この検査で、６０個の組換体プラスミドが検
出され、そのうち１２個は強力なシグナルを与えた。ニ
ックトランスレーションを行った挿入体のクロスハイブ
リダイゼーションに基づき、１２個の組換体から６個の
サブグループが形成された。
【００８２】これらの組換えプローブはＰ．１９５のＤ
ＮＡ配列の一部を表わすという前提から、プラスモジウ
ム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の全抽出物からの５，
３００塩基以上の長さのｍＲＮＡに上記プローブはハイ
ブリダイズするはずである。これが約１９５，０００Ｍ
Ｗの蛋白質をコードするのに必要な最低な長さと評価さ
れるからである。各グループからのメンバーをニックト
ランスレーションで標識し、プラスモジウム（Ｐ．ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）ＲＮＡをプローブとしてノザン法で
検出した〔トーマス（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｓ．）：プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７７：５２０１〜５２０５
（１９８０）〕。
ＮＡ配列の一部を表わすという前提から、プラスモジウ
ム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の全抽出物からの５，
３００塩基以上の長さのｍＲＮＡに上記プローブはハイ
ブリダイズするはずである。これが約１９５，０００Ｍ
Ｗの蛋白質をコードするのに必要な最低な長さと評価さ
れるからである。各グループからのメンバーをニックト
ランスレーションで標識し、プラスモジウム（Ｐ．ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）ＲＮＡをプローブとしてノザン法で
検出した〔トーマス（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｓ．）：プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７７：５２０１〜５２０５
（１９８０）〕。
【００８３】それぞれ１．６ｋｂ、２．３ｋｂおよび
１．１ｋｂのｃＤＮＡ挿入体をもつ３個の組換体、ｐＦ
Ｃ１５、ｐＦＣ１６およびｐＦＣ１７を、それぞれサイ
ズ９ｋｂ、７．５ｋｂおよび５．５ｋｂのｍＲＮＡにハ
イブリダイズした。ｐＦＣ１７から単離された挿入ＤＮ
ＡをエキソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理して、読み取
り枠のランダム化と、トリプトファンオペロンの部分を
もつ表現プラスミドへの挿入を行った。ＤＮＡはＢｓｓ
ｈＩＩ部位に挿入された。成熟ｔｒｐＥ遺伝子生成物、
アントラニル酸シンテターゼＩのカルボキシ末端から１
３個のアミノ酸である。
１．１ｋｂのｃＤＮＡ挿入体をもつ３個の組換体、ｐＦ
Ｃ１５、ｐＦＣ１６およびｐＦＣ１７を、それぞれサイ
ズ９ｋｂ、７．５ｋｂおよび５．５ｋｂのｍＲＮＡにハ
イブリダイズした。ｐＦＣ１７から単離された挿入ＤＮ
ＡをエキソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理して、読み取
り枠のランダム化と、トリプトファンオペロンの部分を
もつ表現プラスミドへの挿入を行った。ＤＮＡはＢｓｓ
ｈＩＩ部位に挿入された。成熟ｔｒｐＥ遺伝子生成物、
アントラニル酸シンテターゼＩのカルボキシ末端から１
３個のアミノ酸である。
【００８４】この部位にｃＤＮＡをシフト変異を生じな
いように挿入すると５６，０００ＭＷのアントラニル酸
シンテアーゼＩをもつ融合蛋白質が産生される。β−イ
ンドールアクリル酸の存在下に、トリプトファン飢餓に
より、遺伝子を誘導すると、生成した組換体の一つ、ｐ
ＦＴ１７３３は７２，０００ＭＷ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
測定）の融合蛋白質を与え、これはｃＤＮＡ挿入体によ
ってコードされる１６，０００ＭＷが付加したことを意
味する。
いように挿入すると５６，０００ＭＷのアントラニル酸
シンテアーゼＩをもつ融合蛋白質が産生される。β−イ
ンドールアクリル酸の存在下に、トリプトファン飢餓に
より、遺伝子を誘導すると、生成した組換体の一つ、ｐ
ＦＴ１７３３は７２，０００ＭＷ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
測定）の融合蛋白質を与え、これはｃＤＮＡ挿入体によ
ってコードされる１６，０００ＭＷが付加したことを意
味する。
【００８５】バクテリア抽出物とプラスモジウム（Ｐ．
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）分裂前体抽出物をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースに
移し、ついでＰ．１９５に特異的な多価ウサギ血清で調
べた。ｐＦＴ１７３３の融合蛋白質は抗血清によって明
らかに検知された。この抗血清はプラスモジウム（Ｐ．
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）分裂前体の全抽出物からＰ．１
９５のみを検知し、著しくＰ．１９５に特異的であっ
た。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）分裂前体抽出物をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースに
移し、ついでＰ．１９５に特異的な多価ウサギ血清で調
べた。ｐＦＴ１７３３の融合蛋白質は抗血清によって明
らかに検知された。この抗血清はプラスモジウム（Ｐ．
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）分裂前体の全抽出物からＰ．１
９５のみを検知し、著しくＰ．１９５に特異的であっ
た。
【００８６】ｔｒｐＥ遺伝子生成物および口蹄疫ウイル
スＶＰ１蛋白質からなる８０，０００ＭＷ融合蛋白質を
含むバクテリア抽出物とは反応しなかった。さらに、正
常ウサギ血清を用いた対照では結合は認められなかっ
た。すなわち、ｐＦＣ１７はプラスモジウム（Ｐ．ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５の抗原決定基の一部をコ
ードする。ｐＦＣ１７については、以下でその別名ｐＰ
Ｆｃ１０１７によって表わされる。
スＶＰ１蛋白質からなる８０，０００ＭＷ融合蛋白質を
含むバクテリア抽出物とは反応しなかった。さらに、正
常ウサギ血清を用いた対照では結合は認められなかっ
た。すなわち、ｐＦＣ１７はプラスモジウム（Ｐ．ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐ．１９５の抗原決定基の一部をコ
ードする。ｐＦＣ１７については、以下でその別名ｐＰ
Ｆｃ１０１７によって表わされる。
【００８７】例 ２ ｐＰＦｃ１０１７関連の重複ｃＤＮＡクローンの調製 組換ｃＤＮＡライブラリーをサイズ分画したｃＤＮＡか
ら構築した。例１と同様にして調製し、テイリングした
ｃＤＮＡを２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中５％〜２
０％（ｗ／ｖ）庶糖勾配５ｍｌに、ＳＷ５０．１ロータ
ー（ベックマン）を用い４５，０００ｒｐｍで３時間遠
心分離した。２ｋｂｐ〜８ｋｂｐ領域のｃＤＮＡ（約１
００ｎｇ）を収穫し、３００ｎｇのｄＧ−テイリングＰ
ｓｔ１消化ｐＵＣ９でアニーリングし、ＤＨ１細胞のア
ンピシリン抵抗性形質転換に使用した。
ら構築した。例１と同様にして調製し、テイリングした
ｃＤＮＡを２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中５％〜２
０％（ｗ／ｖ）庶糖勾配５ｍｌに、ＳＷ５０．１ロータ
ー（ベックマン）を用い４５，０００ｒｐｍで３時間遠
心分離した。２ｋｂｐ〜８ｋｂｐ領域のｃＤＮＡ（約１
００ｎｇ）を収穫し、３００ｎｇのｄＧ−テイリングＰ
ｓｔ１消化ｐＵＣ９でアニーリングし、ＤＨ１細胞のア
ンピシリン抵抗性形質転換に使用した。
【００８８】６個のアガール板上に１，２００個の組換
体が得られた。レプリカフィルターを、ニックトランス
レーションで標識した。ｐＰＦｃ１０１７からの挿入Ｄ
ＮＡで検査した。１１個のクローンがこのプローブにハ
イブリダイズしたＤＮＡを含むものとして同定された。
これらのクローンにｐＰＦｃ１００１から１０１１まで
の番号を付した。これらのクローンを、ｐＰＦｃ１０１
７とクロスハイブリダイゼーションしないｐＰＦｃ１０
０７中の挿入体の一部分を用いて再スクリーニングし
た。このプローブにハイブリダイズするさらに８個のク
ローン、ｐＰＦｃ１０２８〜１０３５が単離された。
体が得られた。レプリカフィルターを、ニックトランス
レーションで標識した。ｐＰＦｃ１０１７からの挿入Ｄ
ＮＡで検査した。１１個のクローンがこのプローブにハ
イブリダイズしたＤＮＡを含むものとして同定された。
これらのクローンにｐＰＦｃ１００１から１０１１まで
の番号を付した。これらのクローンを、ｐＰＦｃ１０１
７とクロスハイブリダイゼーションしないｐＰＦｃ１０
０７中の挿入体の一部分を用いて再スクリーニングし
た。このプローブにハイブリダイズするさらに８個のク
ローン、ｐＰＦｃ１０２８〜１０３５が単離された。
【００８９】１００ｎｇのｄＣ−テイリングｃＤＮＡを
用いてさらにｃＤＮＡライブラリーを構築し、１００ｎ
ｇのＧ−テイリングｐＵＣ９でアニーリングし、ＤＨ１
細胞に形質転換した。約６０００個の組換体が得られ、
これらをレプリカフィルター上、ｐＰＦｃ１０１７から
の３４０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ１断片でスクリ
ーニングした。このプローブにハイブリダイズしたクロ
ーンｐＰＦｃ１０１３〜１０１６および１０１８〜１０
２７を取り、精製した。このライブラリーもｐＰＦｃ１
００７由来のプローブでスクリーニングし、さらに１１
個のコロニー、ｐＰＦｃ１０３６〜１０４６を得た。
用いてさらにｃＤＮＡライブラリーを構築し、１００ｎ
ｇのＧ−テイリングｐＵＣ９でアニーリングし、ＤＨ１
細胞に形質転換した。約６０００個の組換体が得られ、
これらをレプリカフィルター上、ｐＰＦｃ１０１７から
の３４０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ１断片でスクリ
ーニングした。このプローブにハイブリダイズしたクロ
ーンｐＰＦｃ１０１３〜１０１６および１０１８〜１０
２７を取り、精製した。このライブラリーもｐＰＦｃ１
００７由来のプローブでスクリーニングし、さらに１１
個のコロニー、ｐＰＦｃ１０３６〜１０４６を得た。
【００９０】これらのｃＤＮＡクローンからのプラスミ
ドＤＮＡを塩化セシウム勾配上で遠心分離して精製し、
制限酵素地図の作成およびクロスハイブリダイゼーショ
ンによって性質を調べた。ｃＤＮＡクローンを重複線状
配列に調製した。配列分析に用いた６個のｃＤＮＡクロ
ーンの位置を図２に示す。
ドＤＮＡを塩化セシウム勾配上で遠心分離して精製し、
制限酵素地図の作成およびクロスハイブリダイゼーショ
ンによって性質を調べた。ｃＤＮＡクローンを重複線状
配列に調製した。配列分析に用いた６個のｃＤＮＡクロ
ーンの位置を図２に示す。
【００９１】例 ３ Ｐ．１９５遺伝子からのゲノムクローンｐＰＦｇ１の単
離 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡ
〔オディンクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ）：前出
（１９８４）の方法で調製〕をＨｉｎｄＩＩＩで完全に
消化し、サンプルを１０〜４０％庶糖勾配含有１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ上に負荷し、ベックマンＳＷ２７ローター
を用いて２０℃、２６，０００ｒｐｍで２４時間遠心分
離した。
離 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡ
〔オディンクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ）：前出
（１９８４）の方法で調製〕をＨｉｎｄＩＩＩで完全に
消化し、サンプルを１０〜４０％庶糖勾配含有１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ上に負荷し、ベックマンＳＷ２７ローター
を用いて２０℃、２６，０００ｒｐｍで２４時間遠心分
離した。
【００９２】管の底の細孔部から０．５ｍｌの分画を集
め各分画の一部を１％アガロースゲル上に走らせた。ニ
ックトランスレーションを行ったｐＰＦｃ１０１７との
ハイブリダイゼーションで陽性シグナル示した勾配領域
の分画をＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製ＨｉｎｄＩＩＩ
＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ８ＤＮＡでリゲートした。各分
画からのＤＨＩ形質転換体約４００個をニトロセルロー
スフィルター上、ｐＰＦｃ１０１７挿入体とのコロニー
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングを行った
〔グルンシュタインほか（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．
＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．）：プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）、
７２：３９６１（１９７５）〕。
め各分画の一部を１％アガロースゲル上に走らせた。ニ
ックトランスレーションを行ったｐＰＦｃ１０１７との
ハイブリダイゼーションで陽性シグナル示した勾配領域
の分画をＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製ＨｉｎｄＩＩＩ
＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ８ＤＮＡでリゲートした。各分
画からのＤＨＩ形質転換体約４００個をニトロセルロー
スフィルター上、ｐＰＦｃ１０１７挿入体とのコロニー
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングを行った
〔グルンシュタインほか（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．
＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．）：プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）、
７２：３９６１（１９７５）〕。
【００９３】分画３９からの１個のコロニーが陽性シグ
ナルを与えた。この組換体、ｐＰＦｇ１は相当するゲノ
ムＤＮＡ断片と共移動する３．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ
−ＥｃｏＲＩ断片を含み、両者は同じ制限酵素地図を有
する。ｐＰＦｇ１挿入体の部分末端標識マッピングによ
りｐＰＦｇ１の制限地図が得られた〔スミスほか（Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｈ．Ｏ． ＆ Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｍ．
Ｌ．）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．）、３：２３８７（１９６
７）〕。配列決定は例５に記載のサンガー・ジデオキシ
ン法で実施した。
ナルを与えた。この組換体、ｐＰＦｇ１は相当するゲノ
ムＤＮＡ断片と共移動する３．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ
−ＥｃｏＲＩ断片を含み、両者は同じ制限酵素地図を有
する。ｐＰＦｇ１挿入体の部分末端標識マッピングによ
りｐＰＦｇ１の制限地図が得られた〔スミスほか（Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｈ．Ｏ． ＆ Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｍ．
Ｌ．）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．）、３：２３８７（１９６
７）〕。配列決定は例５に記載のサンガー・ジデオキシ
ン法で実施した。
【００９４】例 ４ プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡ中
のＰ．１９５遺伝子地図の構築 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡは
オディンクほか〔Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ：前出（１９
８４）〕の記載したようにして調製し、その一部を、特
異的エンドヌクレアーゼを個々にまとめた場合により二
重消化、すなわち２個の制限エンドヌクレアーゼを用い
て制限した。生成物を０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロミドを含有するトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
２）中アガロースゲル（０．７％〜１．５％）上、平行
トラックに既知の長さのＤＮＡ断片をサイズマーカーと
して置いて、電気泳動に付した。
のＰ．１９５遺伝子地図の構築 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡは
オディンクほか〔Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ：前出（１９
８４）〕の記載したようにして調製し、その一部を、特
異的エンドヌクレアーゼを個々にまとめた場合により二
重消化、すなわち２個の制限エンドヌクレアーゼを用い
て制限した。生成物を０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロミドを含有するトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
２）中アガロースゲル（０．７％〜１．５％）上、平行
トラックに既知の長さのＤＮＡ断片をサイズマーカーと
して置いて、電気泳動に付した。
【００９５】ＤＮＡを毛管ブロット操作によってジーン
・スクリーン・プラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕ
ｓ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｄｕｐ
ｏｎｔ）に移し、業者の示したプロトコールに従って５
０％ホルムアミドの存在下に、４２℃で32Ｐ標識プロー
ブＤＮＡにハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプ
ローブＤＮＡはクロネックス・ライトニング−プラス
（Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ）スク
リーン間のＸ−Ｏ ｍａｔ Ｓフィルムを用い、７０℃
でオートラジオグラフィーにより検出した。
・スクリーン・プラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕ
ｓ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｄｕｐ
ｏｎｔ）に移し、業者の示したプロトコールに従って５
０％ホルムアミドの存在下に、４２℃で32Ｐ標識プロー
ブＤＮＡにハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプ
ローブＤＮＡはクロネックス・ライトニング−プラス
（Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ）スク
リーン間のＸ−Ｏ ｍａｔ Ｓフィルムを用い、７０℃
でオートラジオグラフィーにより検出した。
【００９６】プローブＤＮＡはｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡプラスミドクローンから切り出した特異的プラスミ
ドＤＮＡまたは特異的配列であり、アガロースゲル電気
泳動および溶出により精製した。ＤＮＡは32〔Ｐ〕α−
ＡＴＰの存在下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼとのニック
トランスレーションにより標識した。特異的プローブに
ハイブリダイズしたゲノムＤＮＡ内からの制限断片のサ
イズの分析により、構築すべき制限酵素部位の線状地図
ができた。
ＮＡプラスミドクローンから切り出した特異的プラスミ
ドＤＮＡまたは特異的配列であり、アガロースゲル電気
泳動および溶出により精製した。ＤＮＡは32〔Ｐ〕α−
ＡＴＰの存在下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼとのニック
トランスレーションにより標識した。特異的プローブに
ハイブリダイズしたゲノムＤＮＡ内からの制限断片のサ
イズの分析により、構築すべき制限酵素部位の線状地図
ができた。
【００９７】このようなＰ．１９５遺伝子地図を、特異
的断片がハイブリダイズする典型的な部位およびプロー
ブとともに図３に示す。ゲノムＤＮＡの他の特異的消化
も数種実施し、クローンＤＮＡからの他の特異的断片で
検査したことはいうまでもない。結果は図３に示した地
図と一致した。地図を繁雑にしないように、ＤＮＡ配列
に存在する制限部位のすべては示していない。
的断片がハイブリダイズする典型的な部位およびプロー
ブとともに図３に示す。ゲノムＤＮＡの他の特異的消化
も数種実施し、クローンＤＮＡからの他の特異的断片で
検査したことはいうまでもない。結果は図３に示した地
図と一致した。地図を繁雑にしないように、ＤＮＡ配列
に存在する制限部位のすべては示していない。
【００９８】ＤＮＡ配列からのゲノム地図および制限酵
素地図の調査により、これらの２つは蛋白質コード配列
に相当する領域で、ヌクレオシド３１３におけるＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位の右側に、共直線性であることが示され
た。しかしながら、ゲノムＤＮＡには、ｃＤＮＡクロー
ンに存在しない付加的な７００ｐｂの配列が、ｃＤＮＡ
配列中のヌクレオシド２２１と３１３のＭｂｏ１部位お
よびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に存在した。これはコード
配列の開始直後のイントロンと考えられる。
素地図の調査により、これらの２つは蛋白質コード配列
に相当する領域で、ヌクレオシド３１３におけるＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位の右側に、共直線性であることが示され
た。しかしながら、ゲノムＤＮＡには、ｃＤＮＡクロー
ンに存在しない付加的な７００ｐｂの配列が、ｃＤＮＡ
配列中のヌクレオシド２２１と３１３のＭｂｏ１部位お
よびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に存在した。これはコード
配列の開始直後のイントロンと考えられる。
【００９９】地図上に示した部位は、酵素Ａ（Ａｌｕ
Ｉ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ）、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｎ（ＮｄｅＩ）、Ｐ
（ＰｓｔＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｒ（ＲｓａＩ）お
よびＴ（ＴａｑＩ）部位の一部である。プローブは全プ
ラスミドかまたは挿入体もしくはプラスミドポリリンカ
ー領域内での部位で特異的酵素により消化して誘導した
特異的断片である。
Ｉ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ）、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｎ（ＮｄｅＩ）、Ｐ
（ＰｓｔＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｒ（ＲｓａＩ）お
よびＴ（ＴａｑＩ）部位の一部である。プローブは全プ
ラスミドかまたは挿入体もしくはプラスミドポリリンカ
ー領域内での部位で特異的酵素により消化して誘導した
特異的断片である。
【０１００】例 ５ Ｐ．１９５をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列 ＤＮＡの配列分析はマサキムほか（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ、前出、１９８０）の化学的切断法および
サンガーの（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、前出、１９７
７）ジデオキシ法で実施した。
ｉｌｂｅｒｔ、前出、１９８０）の化学的切断法および
サンガーの（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、前出、１９７
７）ジデオキシ法で実施した。
【０１０１】１． 化学的切断 配列分析に適当なＤＮＡ断片は次のようにして調製し
た。 ａ） ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（業者指定の条
件による）で消化し、ついで混合物にウシ腸アルカリホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え、反応
を３７℃で３０分間続けた。ＤＮＡをクロロパンで抽出
し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡの５′末端をマニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、前出、１９
８２）の記載に従い、ポリヌクレチオドキナーゼを用い
て〔32Ｐ〕で標識した。標識ＤＮＡを第２の適当な制限
エンドヌクレアーゼで切断し、混合物を１％（ｗ／ｖ）
アガロースゲルに負荷し、問題のＤＮＡバンドをこのア
ガロースゲルから電気溶出し、その配列を決定した。
た。 ａ） ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（業者指定の条
件による）で消化し、ついで混合物にウシ腸アルカリホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え、反応
を３７℃で３０分間続けた。ＤＮＡをクロロパンで抽出
し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡの５′末端をマニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、前出、１９
８２）の記載に従い、ポリヌクレチオドキナーゼを用い
て〔32Ｐ〕で標識した。標識ＤＮＡを第２の適当な制限
エンドヌクレアーゼで切断し、混合物を１％（ｗ／ｖ）
アガロースゲルに負荷し、問題のＤＮＡバンドをこのア
ガロースゲルから電気溶出し、その配列を決定した。
【０１０２】ｂ） ＤＮＡ断片は上記ａ）項に記載の操
作を改良法によっても調製した。ＤＮＡを制限エンドヌ
クレアーゼで消化し、ホスファターゼ処理し、５′末端
を上に略述したようにして〔32Ｐ〕で標識した。次にＤ
ＮＡ断片を脱イオンホルムアミド添加〔最終濃度７０％
（ｖ／ｖ）〕により変性させ、１００℃に５分間加熱し
た。サンプルを氷水で急冷し、直ちに非変性１５％ポリ
アクリルアミドゲル〔アクリルアミド：ビスアクリルア
ミド比、６０：１（ｗ／ｗ）〕上に負荷した。分離され
たＤＮＡ鎖をゲルから電気溶出し、配列決定した。
作を改良法によっても調製した。ＤＮＡを制限エンドヌ
クレアーゼで消化し、ホスファターゼ処理し、５′末端
を上に略述したようにして〔32Ｐ〕で標識した。次にＤ
ＮＡ断片を脱イオンホルムアミド添加〔最終濃度７０％
（ｖ／ｖ）〕により変性させ、１００℃に５分間加熱し
た。サンプルを氷水で急冷し、直ちに非変性１５％ポリ
アクリルアミドゲル〔アクリルアミド：ビスアクリルア
ミド比、６０：１（ｗ／ｗ）〕上に負荷した。分離され
たＤＮＡ鎖をゲルから電気溶出し、配列決定した。
【０１０３】２． ジデオキシ配列決定 挿入体断片を線状ファージクローニング／シクエンシン
グベクターＭ１３ｍｐ８中にサブクローニングしてＤＮ
Ａ鋳型を調製した〔メシングほか（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆
Ｖｉｅｉｒａ）：前出、１９８２〕。配列決定はサン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ：前出、１９７７）の
記載に従い、合成共通プライマー（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）
および〔35Ｓ〕−ｄＡＴＰαＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて実施した。特異的
断片の配列決定には二塩基法を用いた。まず、特異的制
限断片（ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＲｓａＩ−ＡｈａＩＩ
Ｉ、ＴａｑＩ消化により製造）を電気溶出によって精製
し、必要な場合には、付着端をクレノーＤＮＡポリメラ
ーゼＩ断片を用いてブラント端にした。
グベクターＭ１３ｍｐ８中にサブクローニングしてＤＮ
Ａ鋳型を調製した〔メシングほか（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆
Ｖｉｅｉｒａ）：前出、１９８２〕。配列決定はサン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ：前出、１９７７）の
記載に従い、合成共通プライマー（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）
および〔35Ｓ〕−ｄＡＴＰαＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて実施した。特異的
断片の配列決定には二塩基法を用いた。まず、特異的制
限断片（ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＲｓａＩ−ＡｈａＩＩ
Ｉ、ＴａｑＩ消化により製造）を電気溶出によって精製
し、必要な場合には、付着端をクレノーＤＮＡポリメラ
ーゼＩ断片を用いてブラント端にした。
【０１０４】上記プロトコールによるクローニングまた
は配列決定が困難な断片はＢａｌ−３１〔マニアティス
ほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、１９８２）〕で
処理した。条件（ＤＮＡおよび酵素濃度）は、断片の各
末端から１００〜１５０ｂｐＤＮＡが３０℃で１分間に
除去されるように選択した。消化の過程で一連の重複断
片が得られた。Ｂａｌ−３１処理ＤＮＡをＤＮＡポリメ
ラーゼＩクレノー断片で修復した。ＤＮＡをホスファタ
ーゼ処理ＳｍａＩ−消化Ｍ１３ｍｐ８（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）でリゲートし、ＪＭ１０３またはＪＭ１０１にトラ
ンスフェクションした〔メシングほか（Ｍｅｓｓｉｎｇ
Ｊ． ｅｔ ａｌ）：ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、９：３０９
（１９８１）〕。標準操作に従って、鋳型ＤＮＡを調製
した。可能な場合には、各クローンの両鎖から配列が得
られた。
は配列決定が困難な断片はＢａｌ−３１〔マニアティス
ほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、１９８２）〕で
処理した。条件（ＤＮＡおよび酵素濃度）は、断片の各
末端から１００〜１５０ｂｐＤＮＡが３０℃で１分間に
除去されるように選択した。消化の過程で一連の重複断
片が得られた。Ｂａｌ−３１処理ＤＮＡをＤＮＡポリメ
ラーゼＩクレノー断片で修復した。ＤＮＡをホスファタ
ーゼ処理ＳｍａＩ−消化Ｍ１３ｍｐ８（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）でリゲートし、ＪＭ１０３またはＪＭ１０１にトラ
ンスフェクションした〔メシングほか（Ｍｅｓｓｉｎｇ
Ｊ． ｅｔ ａｌ）：ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、９：３０９
（１９８１）〕。標準操作に従って、鋳型ＤＮＡを調製
した。可能な場合には、各クローンの両鎖から配列が得
られた。
【０１０５】各クローンの配列を重複させることにより
得られた全配列を図１に示す。配列の決定に用いたクロ
ーンはＤＮＡ配列から得られた図２の制限地図の下に示
す。
得られた全配列を図１に示す。配列の決定に用いたクロ
ーンはＤＮＡ配列から得られた図２の制限地図の下に示
す。
【０１０６】例 ６ 培養上清からの８３，０００ＭＷ断片の精製および部分
アミノ酸配列の決定 ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）からの上清（例１参照）を収穫し、１０，
０００ｇで５分間遠心分離して細胞屑を除去した。培養
上清各１００ｍｌに１ｍｌの１Ｍトリス、１００ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍｌの１００ｍＭ
ＰＭＳＦ、１ｍｌの０．５Ｍヨードアセトアミド、１
ｍｌの１０ｍＭ ＴＬＣＫおよび０．５ｇのデオキシコ
ール酸ナトリウムを加えた。
アミノ酸配列の決定 ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）からの上清（例１参照）を収穫し、１０，
０００ｇで５分間遠心分離して細胞屑を除去した。培養
上清各１００ｍｌに１ｍｌの１Ｍトリス、１００ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍｌの１００ｍＭ
ＰＭＳＦ、１ｍｌの０．５Ｍヨードアセトアミド、１
ｍｌの１０ｍＭ ＴＬＣＫおよび０．５ｇのデオキシコ
ール酸ナトリウムを加えた。
【０１０７】ｐＨをＨＣｌで８．２に調整し、ついでサ
ンプルを１００，０００ｇで４５分間遠心分離した。遠
心分離後の上清を、あらかじめ１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
ＭＥＧＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸
ナトリウム含有１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
（平衡緩衝液）で平衡化した抗体８９．１−セファロー
スカラム〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅ
ｍａｎ）、前出（１９８４ｂ）に記載の方法により調
製〕１０ｍｌに適用した。
ンプルを１００，０００ｇで４５分間遠心分離した。遠
心分離後の上清を、あらかじめ１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
ＭＥＧＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸
ナトリウム含有１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
（平衡緩衝液）で平衡化した抗体８９．１−セファロー
スカラム〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅ
ｍａｎ）、前出（１９８４ｂ）に記載の方法により調
製〕１０ｍｌに適用した。
【０１０８】カラムを平衡緩衝液で十分洗浄したのち、
カラムに残った物質を０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコー
ル酸ナトリウム含有５０ｍＭジエチルアミン塩酸塩（ｐ
Ｈ１１．５）で溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ ＸＭ
５０フィルターを用いて限外濾過し、ｐＨを８．２に
調製した。溶出液中の主ポリペプチドは８３，０００Ｍ
Ｗ種であり、これがウエスタン法でモノクロナール抗体
８９．１、ウサギ多価抗Ｐ．１９５血清またはヒトプラ
スモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）免疫血清のい
ずれかと反応する唯一の成分であった。
カラムに残った物質を０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコー
ル酸ナトリウム含有５０ｍＭジエチルアミン塩酸塩（ｐ
Ｈ１１．５）で溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ ＸＭ
５０フィルターを用いて限外濾過し、ｐＨを８．２に
調製した。溶出液中の主ポリペプチドは８３，０００Ｍ
Ｗ種であり、これがウエスタン法でモノクロナール抗体
８９．１、ウサギ多価抗Ｐ．１９５血清またはヒトプラ
スモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）免疫血清のい
ずれかと反応する唯一の成分であった。
【０１０９】生成物中の主夾雑物はＩｇＧで、溶出液を
濃縮したのち、上述のようにして平衡化したプロテイン
Ａ−セファロースカラム（０．９×１０ｃｍ）（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を通し
て除去できた。ＩｇＧが除去された、遅れない物質を集
めた。固体の塩酸グアニジンを澄明な溶液が得られるま
で加え、ついで蛋白質を還元し、Ｓ−カルボキシメチル
化した〔ワックスダールほか（Ｗａｘｄａｌ，Ｍ．Ｊ．
ｅｔ ａｌ）：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、７：１９５９〜１９６６（１９６８）〕。
濃縮したのち、上述のようにして平衡化したプロテイン
Ａ−セファロースカラム（０．９×１０ｃｍ）（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を通し
て除去できた。ＩｇＧが除去された、遅れない物質を集
めた。固体の塩酸グアニジンを澄明な溶液が得られるま
で加え、ついで蛋白質を還元し、Ｓ−カルボキシメチル
化した〔ワックスダールほか（Ｗａｘｄａｌ，Ｍ．Ｊ．
ｅｔ ａｌ）：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、７：１９５９〜１９６６（１９６８）〕。
【０１１０】還元され、Ｓ−カルボキシメチル化された
８３，０００ＭＷポリペプチドを最後に、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび６Ｍ塩酸グアニジン含有
の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）で平衡化し
たセファクリルＳ３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン）のカラムを通
して精製した。各分画を２８０ｎｍでの比色定量および
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べ、８３，０００ＭＷ
種含有分画をプールした。
８３，０００ＭＷポリペプチドを最後に、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび６Ｍ塩酸グアニジン含有
の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）で平衡化し
たセファクリルＳ３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン）のカラムを通
して精製した。各分画を２８０ｎｍでの比色定量および
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べ、８３，０００ＭＷ
種含有分画をプールした。
【０１１１】水および５％（ｖ／ｖ）ギ酸に対して十分
に透析したのち、サンプルを凍結乾燥し、５％ギ酸の小
容量にとり自動シクエンサーに適用した。この蛋白質
を、バカナリーら〔Ｂａｃｃａｎａｒｉ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ
ａｌ：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９：１２２９
１〜１２２９８（１９８４）〕の記載のように０．３３
Ｍ Ｑｕａｄｒｏｌプログラムを用い、Ｓｅｑｕａｍａ
ｔ Ｐ6 オートコンバーターおよびＳｅｑｕａｍａｔ
ＳＣ−５１０プログラムコントローラーを装置したベッ
クマン８９０Ｃシクエンサーにより、２０サイクルの自
動化エドマン分解に付した。
に透析したのち、サンプルを凍結乾燥し、５％ギ酸の小
容量にとり自動シクエンサーに適用した。この蛋白質
を、バカナリーら〔Ｂａｃｃａｎａｒｉ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ
ａｌ：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９：１２２９
１〜１２２９８（１９８４）〕の記載のように０．３３
Ｍ Ｑｕａｄｒｏｌプログラムを用い、Ｓｅｑｕａｍａ
ｔ Ｐ6 オートコンバーターおよびＳｅｑｕａｍａｔ
ＳＣ−５１０プログラムコントローラーを装置したベッ
クマン８９０Ｃシクエンサーにより、２０サイクルの自
動化エドマン分解に付した。
【０１１２】放出されたアミノ酸のフェニルチオヒダン
トイン誘導体を逆相ＨＰＬＣで同定し、逆加水分解で確
認した〔バカナリーほか（Ｂａｃｃａｎａｒｉ，ｅｔ
ａｌ）：前出、１９８４〕。培養上清９１０ｍｌから出
発し、親和性カラムからの溶出液に蛋白質５．９ｍｇが
存在した。蛋白質２．６ｍｇをプロテインＡ−セファロ
ースカラムに通じ、精製蛋白質４００μｇをエドマン分
解に付した。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に出発し、
分解サイクルをくり返すと、以下の部分アミノ酸配列が
得られた。
トイン誘導体を逆相ＨＰＬＣで同定し、逆加水分解で確
認した〔バカナリーほか（Ｂａｃｃａｎａｒｉ，ｅｔ
ａｌ）：前出、１９８４〕。培養上清９１０ｍｌから出
発し、親和性カラムからの溶出液に蛋白質５．９ｍｇが
存在した。蛋白質２．６ｍｇをプロテインＡ−セファロ
ースカラムに通じ、精製蛋白質４００μｇをエドマン分
解に付した。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に出発し、
分解サイクルをくり返すと、以下の部分アミノ酸配列が
得られた。
【０１１３】
【表１】 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. N.I. N.I. N.I. N.I. N.I. Tyr Gln Glu Leu Val 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Lys/Phe Lys/Phe Leu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Val
【０１１４】位置１〜５の残基は明瞭に同定できなかっ
た（Ｎ．Ｉ．）。用いたＨＰＬＣシステムではリジンと
フェニルアラニン誘導体をたがいに分離できなかった。
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンから誘導されたヌ
クレオチド配列の検査によって、この残基の配列（６〜
２０）はヌクレオチド２８８〜３２２の翻訳配列に相当
することがわかった。
た（Ｎ．Ｉ．）。用いたＨＰＬＣシステムではリジンと
フェニルアラニン誘導体をたがいに分離できなかった。
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンから誘導されたヌ
クレオチド配列の検査によって、この残基の配列（６〜
２０）はヌクレオチド２８８〜３２２の翻訳配列に相当
することがわかった。
【０１１５】この分析では、８３，０００ＭＷ断片は
Ｐ．１９５プレカーサーのアミノ末端配列から誘導され
る。完全配列では、ヌクレオチド２１６のＡＵＧ（メチ
オニン）開始コドンが１８個のアミノ酸のヌクレオチド
配列が続き、これは多くの膜または分泌蛋白質の一次翻
訳生成物上に存在するシグナル配列に相当し、通常これ
は蛋白質が小胞体の管腔中に通過するとき切断される
〔クライル（Ｋｒｅｉｌ，Ｇ．）：アニュアル・レビュ
ー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）、５０：３１７〜３４８（１９８
１）〕。
Ｐ．１９５プレカーサーのアミノ末端配列から誘導され
る。完全配列では、ヌクレオチド２１６のＡＵＧ（メチ
オニン）開始コドンが１８個のアミノ酸のヌクレオチド
配列が続き、これは多くの膜または分泌蛋白質の一次翻
訳生成物上に存在するシグナル配列に相当し、通常これ
は蛋白質が小胞体の管腔中に通過するとき切断される
〔クライル（Ｋｒｅｉｌ，Ｇ．）：アニュアル・レビュ
ー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）、５０：３１７〜３４８（１９８
１）〕。
【０１１６】例 ７ Ｐ．１９５のプロセッシング断片と抗体の反応および線
状コーディング配列内のこれらの断片の位置 直接アミノ酸配列決定により、８３，０００ＭＷ断片の
アミノ末端はＰ．１９５アミノ末端に近接して存在する
ことが明らかにされた（例６）。ｉｎ ｖｉｖｏでの蛋
白分解によるプロセッシングで産生された他の断片は、
Ｐ．１９５に対して誘発された特異的抗体（好ましくは
モノクロナール抗体）によって認識されるポリペプチド
のサイズの分析により線状遺伝子配列中に見出すことが
できた。
状コーディング配列内のこれらの断片の位置 直接アミノ酸配列決定により、８３，０００ＭＷ断片の
アミノ末端はＰ．１９５アミノ末端に近接して存在する
ことが明らかにされた（例６）。ｉｎ ｖｉｖｏでの蛋
白分解によるプロセッシングで産生された他の断片は、
Ｐ．１９５に対して誘発された特異的抗体（好ましくは
モノクロナール抗体）によって認識されるポリペプチド
のサイズの分析により線状遺伝子配列中に見出すことが
できた。
【０１１７】この分析には２種のモノクロナール抗体を
使用した。抗体８９．１〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ
＆ Ｆｒｅｅｍａｎ）：前出（１９８２）〕は分裂前
体中の細胞内Ｐ．１９５および分裂小体表面上の８３，
０００ＭＷ断片と反応する。それは、この寄生虫の次の
環ステージとは反応せず（免疫蛍光による）、赤血球の
分裂小体侵入時のこの断片の喪失と一致した。抗体１１
１．２は分裂前体中の細胞内Ｐ．１９５、分裂小体表面
および環ステージ寄生虫と反応する（免疫蛍光によ
る）。この特異性は最近ホールほか（Ｈａｌｌ ｅｔ
ａｌ：前出、１９８４ａ）によって報告されたモノクロ
ナール抗体の場合に類似している。
使用した。抗体８９．１〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ
＆ Ｆｒｅｅｍａｎ）：前出（１９８２）〕は分裂前
体中の細胞内Ｐ．１９５および分裂小体表面上の８３，
０００ＭＷ断片と反応する。それは、この寄生虫の次の
環ステージとは反応せず（免疫蛍光による）、赤血球の
分裂小体侵入時のこの断片の喪失と一致した。抗体１１
１．２は分裂前体中の細胞内Ｐ．１９５、分裂小体表面
および環ステージ寄生虫と反応する（免疫蛍光によ
る）。この特異性は最近ホールほか（Ｈａｌｌ ｅｔ
ａｌ：前出、１９８４ａ）によって報告されたモノクロ
ナール抗体の場合に類似している。
【０１１８】Ｐ．１９５およびそのプロセッシング断片
は、メチオニンを含まないメジウム中での寄生虫培養液
に〔35Ｓ〕メチオニンを添加することによりｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで標識できる〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ）前出（１９８２）、フリーマンほか
（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｒ）：前出（１９８
３）〕。天然に放出された分裂小体の表面上のプロセッ
シング断片はすでに報告されているように（フリーマン
ほか（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｒ）：前出（１
９８３ｂ）；ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅ
ｅｍａｎ）：前出（１９８４ｂ）〕ラクトパーオキシダ
ーゼを用い〔125 Ｉ〕ヨウ素での放射ヨード化により標
識できる。
は、メチオニンを含まないメジウム中での寄生虫培養液
に〔35Ｓ〕メチオニンを添加することによりｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで標識できる〔ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ）前出（１９８２）、フリーマンほか
（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｒ）：前出（１９８
３）〕。天然に放出された分裂小体の表面上のプロセッ
シング断片はすでに報告されているように（フリーマン
ほか（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｒ）：前出（１
９８３ｂ）；ホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅ
ｅｍａｎ）：前出（１９８４ｂ）〕ラクトパーオキシダ
ーゼを用い〔125 Ｉ〕ヨウ素での放射ヨード化により標
識できる。
【０１１９】〔35Ｓ〕メチオニン標識分裂前体の界面活
性剤抽出物から、Ｐ．１９５に対するウサギ多価抗血清
は、Ｐ．１９５ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定さ
れた分子量１５３，０００；１１０，０００；８３，０
００；４５，０００；４２，０００および２９，０００
の断片を免疫沈殿された。非還元ゲル上（ジチオスレイ
トールの非存在下）、４５，０００および４２，００Ｍ
Ｗ種はそれぞれ見かけの分子量３８，０００および３
６，０００のように移動した。抗体８９．１はＰ．１９
５ならびに１５３，０００、１１０，０００および８
３，０００ＭＷ種を免疫沈殿させた。抗体１１１．２は
Ｐ．１９５ならびに４５，０００および４２，０００Ｍ
Ｗ種を免疫沈殿させた。
性剤抽出物から、Ｐ．１９５に対するウサギ多価抗血清
は、Ｐ．１９５ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定さ
れた分子量１５３，０００；１１０，０００；８３，０
００；４５，０００；４２，０００および２９，０００
の断片を免疫沈殿された。非還元ゲル上（ジチオスレイ
トールの非存在下）、４５，０００および４２，００Ｍ
Ｗ種はそれぞれ見かけの分子量３８，０００および３
６，０００のように移動した。抗体８９．１はＰ．１９
５ならびに１５３，０００、１１０，０００および８
３，０００ＭＷ種を免疫沈殿させた。抗体１１１．２は
Ｐ．１９５ならびに４５，０００および４２，０００Ｍ
Ｗ種を免疫沈殿させた。
【０１２０】表面標識分裂小体の界面活性剤抽出物か
ら、多価抗Ｐ．１９５血清は、見かけの分子量８３，０
００；４２，０００および１９，０００の３種の断片を
免疫沈殿させた。８３，０００ＭＷ断片は抗体８９．１
によって免疫沈殿された。抗体１１１．２は４２，００
０および１９，０００ＭＷ種を免疫沈殿させた。これら
の断片のペプチドマッピングによる分析では、これらは
多分、Ｐ．１９５の非重複片と考えられた〔ホルダーほ
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ）；前出（１９
８４ｂ）〕。
ら、多価抗Ｐ．１９５血清は、見かけの分子量８３，０
００；４２，０００および１９，０００の３種の断片を
免疫沈殿させた。８３，０００ＭＷ断片は抗体８９．１
によって免疫沈殿された。抗体１１１．２は４２，００
０および１９，０００ＭＷ種を免疫沈殿させた。これら
の断片のペプチドマッピングによる分析では、これらは
多分、Ｐ．１９５の非重複片と考えられた〔ホルダーほ
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ）；前出（１９
８４ｂ）〕。
【０１２１】これらのデータおよび例６と例１０との記
載に基づき、Ｐ．１９５コード配列内の断片の線状順序
が決定できる。８３，０００ＭＷ断片のアミノ末端につ
いて決定したアミノ酸配列は、遺伝子のコード領域の
５′末端、推定シグナル配列の直後の配列に相当する。
したがって、８３，０００ＭＷ断片はＰ．１９５のアミ
ノ末端４２％に由来する。
載に基づき、Ｐ．１９５コード配列内の断片の線状順序
が決定できる。８３，０００ＭＷ断片のアミノ末端につ
いて決定したアミノ酸配列は、遺伝子のコード領域の
５′末端、推定シグナル配列の直後の配列に相当する。
したがって、８３，０００ＭＷ断片はＰ．１９５のアミ
ノ末端４２％に由来する。
【０１２２】抗体８９．１で認識され、抗体１１１．２
によって認識されない１５３，０００ＭＷの主たる中間
プロセッシング断片はコード配列のアミノ末端７８．５
％に由来し、したがって全８３，０００ＭＷ断片を包含
する。抗体１１１．２は１５３，０００ＭＷ断片と反応
しないので、コード配列のカルボキシ末端２１．５％に
由来する。１９，０００ＭＷ断片は、１５３，０００Ｍ
Ｗ種の配列内に存在し、８３，０００ＭＷ種内には存在
しないものと推定される。
によって認識されない１５３，０００ＭＷの主たる中間
プロセッシング断片はコード配列のアミノ末端７８．５
％に由来し、したがって全８３，０００ＭＷ断片を包含
する。抗体１１１．２は１５３，０００ＭＷ断片と反応
しないので、コード配列のカルボキシ末端２１．５％に
由来する。１９，０００ＭＷ断片は、１５３，０００Ｍ
Ｗ種の配列内に存在し、８３，０００ＭＷ種内には存在
しないものと推定される。
【０１２３】例 ８ Ｐ．１９５配列の大腸菌内での融合蛋白質としての表現
および生成物の精製 別の実験で、ｐＷＲＬ５０７（図４）をＮｄｅＩとＥｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化し、関連断片をアガロースゲル電気
泳動で精製した。このＤＮＡ（０．１ｐｍｏｌ）をＰ．
１９５組換体から誘導されたＤＮＡ断片０．５ｐｍｏｌ
と、関連対の制限酵素でリゲートし、ついでＤＨ１細胞
をアンピシリン抵抗性に形質転換するのに使用した。
および生成物の精製 別の実験で、ｐＷＲＬ５０７（図４）をＮｄｅＩとＥｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化し、関連断片をアガロースゲル電気
泳動で精製した。このＤＮＡ（０．１ｐｍｏｌ）をＰ．
１９５組換体から誘導されたＤＮＡ断片０．５ｐｍｏｌ
と、関連対の制限酵素でリゲートし、ついでＤＨ１細胞
をアンピシリン抵抗性に形質転換するのに使用した。
【０１２４】コロニーを小プラスミドプレパレーション
の制限酵素消化によるスクリーニングに付した。その挿
入体を含むプラスミドをもつ株をさらに、１００μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌインドールアク
リル酸（誘発表現）または１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンおよび１０μｇ／ｍｌトリプトファン（非誘発表現）
含有Ｍ９最小培地中で生育させた。バクテリアを１０，
０００ｇで１分間遠心分離して収穫し、ＰＡＧＥに対す
るＳＤＳサンプル負荷緩衝液〔２％（ｗ／ｖ）ドデシル
硫酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．
１Ｍジチオスレイトールおよび０．００５％（ｗ／ｖ）
ブロモフェノールブルー含有６２．５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ６．８）〕の添加により分解した。
の制限酵素消化によるスクリーニングに付した。その挿
入体を含むプラスミドをもつ株をさらに、１００μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌインドールアク
リル酸（誘発表現）または１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンおよび１０μｇ／ｍｌトリプトファン（非誘発表現）
含有Ｍ９最小培地中で生育させた。バクテリアを１０，
０００ｇで１分間遠心分離して収穫し、ＰＡＧＥに対す
るＳＤＳサンプル負荷緩衝液〔２％（ｗ／ｖ）ドデシル
硫酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．
１Ｍジチオスレイトールおよび０．００５％（ｗ／ｖ）
ブロモフェノールブルー含有６２．５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ６．８）〕の添加により分解した。
【０１２５】その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に
付し、ついでゲルをクーマシーブルーで染色して全蛋白
質を検出するか、または分解蛋白質をニトロセルロース
に移し、精製Ｐ．１９５に対して誘発された多価抗血清
によるウエスタン法に使用した。ｐＰＦｇＩのＮｄｅＩ
−ＥｃｏＲＩ断片を含む株は、クーマシーブルー染色ま
たは多価抗血清との反応で分解物中に検出できる１３
５，０００ＭＷの誘発融合蛋白質を産生した。これはｔ
ｒｐＥ遺伝子生成物のＮ末端からの２３３個のアミノ酸
およびＰ．１９５からの９０７個のアミノ酸を含有する
融合蛋白質に相当する。
付し、ついでゲルをクーマシーブルーで染色して全蛋白
質を検出するか、または分解蛋白質をニトロセルロース
に移し、精製Ｐ．１９５に対して誘発された多価抗血清
によるウエスタン法に使用した。ｐＰＦｇＩのＮｄｅＩ
−ＥｃｏＲＩ断片を含む株は、クーマシーブルー染色ま
たは多価抗血清との反応で分解物中に検出できる１３
５，０００ＭＷの誘発融合蛋白質を産生した。これはｔ
ｒｐＥ遺伝子生成物のＮ末端からの２３３個のアミノ酸
およびＰ．１９５からの９０７個のアミノ酸を含有する
融合蛋白質に相当する。
【０１２６】ｐＰＦｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を含む株は、ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸
とリンカーとＰ．１９５からの１５６個のアミノ酸を含
有する分子量５３，０００の融合蛋白質を産生した。ｐ
ＰＦｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含
む株は、ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸とリンカー
とＰ．１９５からの５９４個のアミノ酸を含有する１０
５，０００ＭＷ融合蛋白質を産生した。
Ｉ断片を含む株は、ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸
とリンカーとＰ．１９５からの１５６個のアミノ酸を含
有する分子量５３，０００の融合蛋白質を産生した。ｐ
ＰＦｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含
む株は、ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸とリンカー
とＰ．１９５からの５９４個のアミノ酸を含有する１０
５，０００ＭＷ融合蛋白質を産生した。
【０１２７】ｐＰＦｃ１０２８からのＥｃｏＲＩ−Ｎｄ
ｅＩ断片を含む株はｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸
とＰ．１９５からの４０１個のアミノ酸からなる８５，
０００ＭＷの融合蛋白質を産生した。いずれの場合も、
融合蛋白質はクーマシーブルー染色で検出され、多価抗
Ｐ．１９５血清とウエスタン法で反応した。
ｅＩ断片を含む株はｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸
とＰ．１９５からの４０１個のアミノ酸からなる８５，
０００ＭＷの融合蛋白質を産生した。いずれの場合も、
融合蛋白質はクーマシーブルー染色で検出され、多価抗
Ｐ．１９５血清とウエスタン法で反応した。
【０１２８】ヌクレオチド８６３〜１６１３とそのＧ−
Ｃ末端およびＰｓｔＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位まで
のｐＵＣ９ポリリンカー領域からなる、ｃＤＮＡクロー
ンｐＰＦｃ１０１３由来の７５０ｂｐ ＲｓａＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片をあらかじめＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
ウシ腸ホスファターゼで処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したプラスミドｐＵＣ９にクローニングした。こ
の挿入体を次にＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐ
ＵＣ９から切り取り、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによ
るｐＷＲＬ５０７カットに正しい方向で挿入した。
Ｃ末端およびＰｓｔＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位まで
のｐＵＣ９ポリリンカー領域からなる、ｃＤＮＡクロー
ンｐＰＦｃ１０１３由来の７５０ｂｐ ＲｓａＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片をあらかじめＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
ウシ腸ホスファターゼで処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したプラスミドｐＵＣ９にクローニングした。こ
の挿入体を次にＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐ
ＵＣ９から切り取り、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによ
るｐＷＲＬ５０７カットに正しい方向で挿入した。
【０１２９】読み取り枠の合った表現を得るために、こ
のプラスミド５μｇをＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、構
築体を線状化した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５
００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む水５０μｌに溶かし、つ
いで等容量のＢａｌ３１緩衝液と混合した〔マニアティ
スほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）：前出（１９
８２）〕。ＤＮＡを０．０２単位の酵素Ｂａｌ３１（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）により３０℃で１分間消化し、ついで２
μｌの１Ｍトリス、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＥＧＴＡを加えて反応を停止させた。
のプラスミド５μｇをＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、構
築体を線状化した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５
００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む水５０μｌに溶かし、つ
いで等容量のＢａｌ３１緩衝液と混合した〔マニアティ
スほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）：前出（１９
８２）〕。ＤＮＡを０．０２単位の酵素Ｂａｌ３１（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）により３０℃で１分間消化し、ついで２
μｌの１Ｍトリス、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＥＧＴＡを加えて反応を停止させた。
【０１３０】ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で精製
し、ついでヌクレオチドトリホスフェートの存在下、最
終容量５０μｌのニックトランスレーション緩衝液〔マ
ニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）：前
出（１９８２）〕中、酵素（ベーリンガー／マンハイ
ム）２．５単位を用いてＤＮＡポリメラーゼ１大断片
（クレノー）で、室温において９０分間処理した。ＤＮ
Ａ（０．１ｐｍｏｌ）を２００単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）と７℃で一夜インキュベーション
して再び環化し、ついでＤＨ１細胞をアンピシリン抵抗
性に形質転換するのに用いた。
し、ついでヌクレオチドトリホスフェートの存在下、最
終容量５０μｌのニックトランスレーション緩衝液〔マ
ニアティスほか（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）：前
出（１９８２）〕中、酵素（ベーリンガー／マンハイ
ム）２．５単位を用いてＤＮＡポリメラーゼ１大断片
（クレノー）で、室温において９０分間処理した。ＤＮ
Ａ（０．１ｐｍｏｌ）を２００単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）と７℃で一夜インキュベーション
して再び環化し、ついでＤＨ１細胞をアンピシリン抵抗
性に形質転換するのに用いた。
【０１３１】１０個の形質転換株をプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析によりスクリーニングした。８個の形質転
換体の１グループがＥｃｏＲＩ部位を失ったプラスミド
を含有した。このグループについて、インドールアクリ
ル酸またはトリプトファンの存在下におけるＭ９メジウ
ム中での生育によりさらに分析した。１個の株が、イン
ドールアクリル酸の存在下に生育したとき約６５，００
０ＭＷの融合蛋白質を産生し、この融合蛋白質はウエス
タン法で多価抗Ｐ．１９５血清と反応した。
制限酵素分析によりスクリーニングした。８個の形質転
換体の１グループがＥｃｏＲＩ部位を失ったプラスミド
を含有した。このグループについて、インドールアクリ
ル酸またはトリプトファンの存在下におけるＭ９メジウ
ム中での生育によりさらに分析した。１個の株が、イン
ドールアクリル酸の存在下に生育したとき約６５，００
０ＭＷの融合蛋白質を産生し、この融合蛋白質はウエス
タン法で多価抗Ｐ．１９５血清と反応した。
【０１３２】同様にして、ｐＰＦｃ１０２８からのＮｄ
ｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（この場合ＨｉｎｄＩＩＩ部
位はプラスミドポリリンカーである）をブラント末端−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、あらかじめＨｉｎｄＩＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ９中にサブクロー
ニングした。この断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩに
よるｐＷＲＬ５０７カットに挿入したのち、この新しい
構築体をＥｃｏＲＩで再び開裂し、Ｂａｌ３１で処理
し、ついで上述のように再び環化した。１個の株が約５
６，０００ＭＷの融合蛋白質を産生し、これは抗Ｐ．１
９５血清とのウエスタン法で検出され、Ｐ．１９５遺伝
子のコード領域のＣ末端１９０個のアミノ酸配列を含有
した。
ｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（この場合ＨｉｎｄＩＩＩ部
位はプラスミドポリリンカーである）をブラント末端−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、あらかじめＨｉｎｄＩＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ９中にサブクロー
ニングした。この断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩに
よるｐＷＲＬ５０７カットに挿入したのち、この新しい
構築体をＥｃｏＲＩで再び開裂し、Ｂａｌ３１で処理
し、ついで上述のように再び環化した。１個の株が約５
６，０００ＭＷの融合蛋白質を産生し、これは抗Ｐ．１
９５血清とのウエスタン法で検出され、Ｐ．１９５遺伝
子のコード領域のＣ末端１９０個のアミノ酸配列を含有
した。
【０１３３】各融合蛋白質の比較的純粋なプレパレーシ
ョンを細胞分解物から製造した。１個の株からの単一コ
ロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９
メジウム１００ｍｌ中、３７℃で一夜生育させた。翌
日、一夜培養した液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよ
び１０μｇ／ｍｌインドールアクリル酸含有Ｍ９培養メ
ジウム４００ｍｌで希釈し、３７℃で５時間インキュベ
ートした。バクテリアを１０分間６，０００ｇで遠心分
離して収穫した。
ョンを細胞分解物から製造した。１個の株からの単一コ
ロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９
メジウム１００ｍｌ中、３７℃で一夜生育させた。翌
日、一夜培養した液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよ
び１０μｇ／ｍｌインドールアクリル酸含有Ｍ９培養メ
ジウム４００ｍｌで希釈し、３７℃で５時間インキュベ
ートした。バクテリアを１０分間６，０００ｇで遠心分
離して収穫した。
【０１３４】バクテリアのペレットを１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０お
よび１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する２５ｍＭトリス
（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に懸濁し、氷上に２時間放置
した。この時点で１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２０μｌおよび１
ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ２００μｌを添加し、このサン
プルを氷上でさらに２時間放置してインキュベートし
た。不溶物質を２０，０００ｇで１０分間遠心分離して
収穫し、上清（Ｓ１）は保存した。
Ａ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０お
よび１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する２５ｍＭトリス
（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に懸濁し、氷上に２時間放置
した。この時点で１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２０μｌおよび１
ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ２００μｌを添加し、このサン
プルを氷上でさらに２時間放置してインキュベートし
た。不溶物質を２０，０００ｇで１０分間遠心分離して
収穫し、上清（Ｓ１）は保存した。
【０１３５】ペレット化した物質を、５ｍＭ ＥＧＴ
Ａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１％Ｎ
Ｐ４０を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１
０ｍｌに懸濁して洗浄した。これを２０，０００ｇで１
０分間遠心分離して、上清（Ｓ２）を保存した。ペレッ
トを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、５ｍＭＥ
ＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＫＳＣＮの１０
ｍｌに再懸濁し、ついで２０，０００ｇで１０分間遠心
分離して、第三の上清（Ｓ３）とペレット分画（Ｐ）を
得た。
Ａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１％Ｎ
Ｐ４０を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１
０ｍｌに懸濁して洗浄した。これを２０，０００ｇで１
０分間遠心分離して、上清（Ｓ２）を保存した。ペレッ
トを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、５ｍＭＥ
ＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＫＳＣＮの１０
ｍｌに再懸濁し、ついで２０，０００ｇで１０分間遠心
分離して、第三の上清（Ｓ３）とペレット分画（Ｐ）を
得た。
【０１３６】このペレット分画は０．１％（ｗ／ｖ）ド
デシル硫酸ナトリウムを加えた、または加えない水１０
ｍｌに再懸濁して物質を可溶化し、ついで０．８９％Ｎ
ａＣｌに対して十分透析した。各上清およびペレット分
画の一部をとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー
染色およびウエスタン法で分析した。融合蛋白質の高レ
ベルでの表現がある場合には、この操作で最終ペレット
分画に融合蛋白質が多く、したがって融合蛋白質の精製
が有効に行われた。表現レベルが低い場合には、融合蛋
白質はＳ１およびＰ両分画に存在した。
デシル硫酸ナトリウムを加えた、または加えない水１０
ｍｌに再懸濁して物質を可溶化し、ついで０．８９％Ｎ
ａＣｌに対して十分透析した。各上清およびペレット分
画の一部をとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー
染色およびウエスタン法で分析した。融合蛋白質の高レ
ベルでの表現がある場合には、この操作で最終ペレット
分画に融合蛋白質が多く、したがって融合蛋白質の精製
が有効に行われた。表現レベルが低い場合には、融合蛋
白質はＳ１およびＰ両分画に存在した。
【０１３７】ヌクレオチド２９６１〜４７５４（１７９
３個のヌクレオチド）およびヌクレオチド４７５３〜５
１２８（３７５個のヌクレオチド）に相当するｐＰＦｃ
１０２８からの２個のＤｄｅＩ断片をアガロースゲル電
気泳動で精製し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ０．０４単位
により３０℃で２．５分間処理し、ついで上述のように
してＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で修復した。
このＤＮＡを、あらかじめＳｍａ１で切断し、ウシアル
カリホスファターゼで処理したｐＸＹ４６０にリゲート
し、これをＪＭ１０５細胞のアンピシリン抵抗性への形
質転換に用いた。
３個のヌクレオチド）およびヌクレオチド４７５３〜５
１２８（３７５個のヌクレオチド）に相当するｐＰＦｃ
１０２８からの２個のＤｄｅＩ断片をアガロースゲル電
気泳動で精製し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ０．０４単位
により３０℃で２．５分間処理し、ついで上述のように
してＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で修復した。
このＤＮＡを、あらかじめＳｍａ１で切断し、ウシアル
カリホスファターゼで処理したｐＸＹ４６０にリゲート
し、これをＪＭ１０５細胞のアンピシリン抵抗性への形
質転換に用いた。
【０１３８】形質転換体をＸｇａｌを含むアガール板上
に置き、得られた青色のコロニーを取った。この方法で
得られた株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析、クーマ
シーブルー染色、およびＩＰＴＧの存在下に生育させた
細胞からの分解物のウエスタン・ブロッティングにより
スクリーニングした。Ｄｄｅ１大断片を含む株はすべ
て、ウサギ多価抗Ｐ．１９５血清と反応する大きい融合
蛋白質を産生した。
に置き、得られた青色のコロニーを取った。この方法で
得られた株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析、クーマ
シーブルー染色、およびＩＰＴＧの存在下に生育させた
細胞からの分解物のウエスタン・ブロッティングにより
スクリーニングした。Ｄｄｅ１大断片を含む株はすべ
て、ウサギ多価抗Ｐ．１９５血清と反応する大きい融合
蛋白質を産生した。
【０１３９】Ｄｄｅ１小断片を含む１０個の株について
も同様に検討したが、わずかに１個が野生型β−ガラク
トシダーゼより有意に大きい融合蛋白質を産生し、この
融合蛋白質はウサギ抗Ｐ．１９５血清と反応した。他の
株は挿入体を含有していたが、遺伝子生成物は正常β−
ガラクトシダーゼと同じ大きさで、ウサギ抗Ｐ．１９５
血清と反応しなかった。融合蛋白質を産生した１個の株
は、その蛋白質のＣ末端領域をカバーする３１０ｂｐの
挿入体を含んでいた。
も同様に検討したが、わずかに１個が野生型β−ガラク
トシダーゼより有意に大きい融合蛋白質を産生し、この
融合蛋白質はウサギ抗Ｐ．１９５血清と反応した。他の
株は挿入体を含有していたが、遺伝子生成物は正常β−
ガラクトシダーゼと同じ大きさで、ウサギ抗Ｐ．１９５
血清と反応しなかった。融合蛋白質を産生した１個の株
は、その蛋白質のＣ末端領域をカバーする３１０ｂｐの
挿入体を含んでいた。
【０１４０】例 ９ Ｐ．１９５配列の大腸菌内での直接発現 ｐＰＦｃ１０２８由来のＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩとＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を例８に記載したようにして
ｐＷＲＬ５０７に挿入し、ｔｒｐＥ発現プラスミド中の
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＹ４６０（図４）から
のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置換することにより直接
発現させた。
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を例８に記載したようにして
ｐＷＲＬ５０７に挿入し、ｔｒｐＥ発現プラスミド中の
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＹ４６０（図４）から
のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置換することにより直接
発現させた。
【０１４１】この構築において、ｔｒｐ制御領域とコー
ド配列はｔａｃ制御領域〔デ・ボアほか（ｄｅ Ｂｏｅ
ｒ，Ｈ．Ａ．ｅｔ ａｌ）：プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）、
８０：２１〜２５（１９８３）〕およびＡＵＧ開始コド
ンで置換される。直接発現生成物は細胞分解物中に、精
製Ｐ．１９５に対して誘発された抗血清とのウエスタン
法で検出された。これらの２つの構築からの直接発現生
成物の見かけの分子量はそれぞれ４７，０００および７
０，０００であった。
ド配列はｔａｃ制御領域〔デ・ボアほか（ｄｅ Ｂｏｅ
ｒ，Ｈ．Ａ．ｅｔ ａｌ）：プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）、
８０：２１〜２５（１９８３）〕およびＡＵＧ開始コド
ンで置換される。直接発現生成物は細胞分解物中に、精
製Ｐ．１９５に対して誘発された抗血清とのウエスタン
法で検出された。これらの２つの構築からの直接発現生
成物の見かけの分子量はそれぞれ４７，０００および７
０，０００であった。
【０１４２】例１０ 大腸菌内で産生された融合蛋白質の免疫原性および抗原
性の分析 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来Ｐ．
１９５に特異的なウサギ多価抗血清は、フロインド完全
アジュバント（ＦＣＡ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ
- ｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）中蛋白質１００μｇでウ
サギを免疫処置し、ついで２２、４３および２１１日に
フロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）中蛋白質１０
０μｇをブースター投与することによって得られた。
性の分析 プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来Ｐ．
１９５に特異的なウサギ多価抗血清は、フロインド完全
アジュバント（ＦＣＡ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ
- ｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）中蛋白質１００μｇでウ
サギを免疫処置し、ついで２２、４３および２１１日に
フロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）中蛋白質１０
０μｇをブースター投与することによって得られた。
【０１４３】多価抗血清は精製融合蛋白質（例８）によ
る免疫処置により産生した。ウサギにＦＣＡ中蛋白質２
５０μｇを皮下投与して免疫処置し、ついで２１日目に
ＦＩＡ中蛋白質２５０μｇをブースター投与した。３５
日目に一次免疫処置後、血清サンプルを採取した。マウ
スにＦＣＡ中蛋白質１２５μｇを腹腔内投与して免疫処
置し、２３日目に同容量をブースター投与した。３０日
目に一次免疫処置後、血清サンプルを採取した。
る免疫処置により産生した。ウサギにＦＣＡ中蛋白質２
５０μｇを皮下投与して免疫処置し、ついで２１日目に
ＦＩＡ中蛋白質２５０μｇをブースター投与した。３５
日目に一次免疫処置後、血清サンプルを採取した。マウ
スにＦＣＡ中蛋白質１２５μｇを腹腔内投与して免疫処
置し、２３日目に同容量をブースター投与した。３０日
目に一次免疫処置後、血清サンプルを採取した。
【０１４４】抗血清の蛋白質に対する抗体への結合力価
は、固相放射免疫定量法（ＲＩＡ）で定量化できた。マ
イクロタイタープレートのウエルを蛋白質でコーティン
グし、ついで抗体溶液の一連の希釈液を一連のウエルを
加える。非結合抗体を洗い去ったのち、結合抗体を高度
標識特異的試薬、たとえば第一の抗体に特異的なスタヒ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）からのプロテインＡまたは親和性精製ＩｇＧを用
いて検出する。
は、固相放射免疫定量法（ＲＩＡ）で定量化できた。マ
イクロタイタープレートのウエルを蛋白質でコーティン
グし、ついで抗体溶液の一連の希釈液を一連のウエルを
加える。非結合抗体を洗い去ったのち、結合抗体を高度
標識特異的試薬、たとえば第一の抗体に特異的なスタヒ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）からのプロテインＡまたは親和性精製ＩｇＧを用
いて検出する。
【０１４５】マイクロタイタープレートのコーティング
に用いた蛋白質は例８に記載大腸菌分解物から精製した
融合蛋白質、またはホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８４ｂ）によって記載され
たようにプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
感染赤血球からモノクロナール抗体親和性クロマトグラ
フィーで精製したＰ．１９５のいずれかであった。
に用いた蛋白質は例８に記載大腸菌分解物から精製した
融合蛋白質、またはホルダーほか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８４ｂ）によって記載され
たようにプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
感染赤血球からモノクロナール抗体親和性クロマトグラ
フィーで精製したＰ．１９５のいずれかであった。
【０１４６】抗原を０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ
９．６）２０μｇ／ｍｌ中２０μｇ／ｍｌに希釈し、こ
の溶液５０μｌを、ウエル９６個つきＰＶＣマイクロタ
イタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）の各ウエルに添加した。９０分後に、プレー
トを０．５％（ｖ／ｖ）ツイーン４０および０．２％
（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン補給リン酸緩衝食塩水
（洗浄緩衝液）で完全に洗浄した。各血清希釈液５０μ
ｌをウエルに二重に加え、３０分後にプレートを１０分
間、洗浄緩衝液で洗浄した。５０μｌの 125Ｉ標識プロ
テインＡ（１．５×１０5 ｃｐｍ）を３０分間加え、十
分洗浄し、パッカードＰＥＤガンマーカウンターを用い
て特異的抗体を検出した。
９．６）２０μｇ／ｍｌ中２０μｇ／ｍｌに希釈し、こ
の溶液５０μｌを、ウエル９６個つきＰＶＣマイクロタ
イタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）の各ウエルに添加した。９０分後に、プレー
トを０．５％（ｖ／ｖ）ツイーン４０および０．２％
（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン補給リン酸緩衝食塩水
（洗浄緩衝液）で完全に洗浄した。各血清希釈液５０μ
ｌをウエルに二重に加え、３０分後にプレートを１０分
間、洗浄緩衝液で洗浄した。５０μｌの 125Ｉ標識プロ
テインＡ（１．５×１０5 ｃｐｍ）を３０分間加え、十
分洗浄し、パッカードＰＥＤガンマーカウンターを用い
て特異的抗体を検出した。
【０１４７】第１表から明らかなように、Ｐ．１９５配
列を含む融合蛋白質で免疫処置したウサギは、ＲＩＡで
精製したＰ．１９５と反応する抗体、および融合蛋白質
と反応するＰ．１９５含有抗体に対する多価抗血清を産
生した。この場合、融合蛋白質１はｔｒｐＥに挿入され
たｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片の生成
物であり、融合蛋白質２はｔｒｐＥに挿入されたｐＰＦ
ｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の生成物
である。
列を含む融合蛋白質で免疫処置したウサギは、ＲＩＡで
精製したＰ．１９５と反応する抗体、および融合蛋白質
と反応するＰ．１９５含有抗体に対する多価抗血清を産
生した。この場合、融合蛋白質１はｔｒｐＥに挿入され
たｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片の生成
物であり、融合蛋白質２はｔｒｐＥに挿入されたｐＰＦ
ｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の生成物
である。
【０１４８】例８に、融合蛋白質が多価抗Ｐ．１９５抗
血清中の抗体とウエスタン法で反応することを示した。
融合蛋白質に対して誘発された抗血清は、融合蛋白質お
よび精製Ｐ．１９５蛋白質とウエスタン法で反応した。
血清中の抗体とウエスタン法で反応することを示した。
融合蛋白質に対して誘発された抗血清は、融合蛋白質お
よび精製Ｐ．１９５蛋白質とウエスタン法で反応した。
【０１４９】線状コード配列中のプロセッシング断片の
位置は、一部、35Ｓ−メチオニン標識プラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の界面活性剤抽出物（例
７）からの免疫沈殿で決定された。融合蛋白質に対する
抗血清をこの抽出物から蛋白質を免疫沈殿させるために
用いたときはいずれの場合もＰ．１９５が認識された。
さらに、ｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ挿入
体によってコードされる蛋白質に対して誘発されたウサ
ギ抗血清は１５３，０００および２９，０００ＭＷ断片
と優先的に反応した。ｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体に対して誘発されたウサギ抗血清
は、４２，０００ＭＷ断片と優先的に反応した。
位置は、一部、35Ｓ−メチオニン標識プラスモジウム
（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の界面活性剤抽出物（例
７）からの免疫沈殿で決定された。融合蛋白質に対する
抗血清をこの抽出物から蛋白質を免疫沈殿させるために
用いたときはいずれの場合もＰ．１９５が認識された。
さらに、ｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ挿入
体によってコードされる蛋白質に対して誘発されたウサ
ギ抗血清は１５３，０００および２９，０００ＭＷ断片
と優先的に反応した。ｐＰＦｃ１０２８ ＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体に対して誘発されたウサギ抗血清
は、４２，０００ＭＷ断片と優先的に反応した。
【０１５０】
【表２】 第 １ 表 固相ＲＩＡによる各種抗原への抗体結合 １／１０希釈抗血清中抗体によって結合された 125Ｉ─プロテインＡ(cpm) 抗 原 正常 抗P.195 抗融合蛋白質１ 抗融合蛋白質２ ウサギ ウサギ ウサギ ウサギ ─────────────────────────────────── Ｐ．１９５ １６１ ６５８１ １９５９ １４３２ 融合蛋白質１ ２３４ ２００７ １０９５２ １３２９１ 融合蛋白質２ ５２ １０９３ ３６００ ３４１６
【図１Ａ】Ｐ．１９５をコードする遺伝子を含むプラス
モジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡのストレ
ッチ塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列。
モジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡのストレ
ッチ塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列。
【図１Ｂ】図１ＡのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｃ】図１ＢのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｄ】図１ＣのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｅ】図１ＤのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｆ】図１ＥのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｇ】図１ＦのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｈ】図１ＧのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｉ】図１ＨのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｊ】図１ＩのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｋ】図１ＪのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｌ】図１ＫのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｍ】図１ＬのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｎ】図１ＭのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｏ】図１ＮのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｐ】図１ＯのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図１Ｑ】図１ＰのつづきのＰ．１９５をコードする遺
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
伝子を含むプラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）ＤＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードす
るアミノ酸配列。
【図２】Ｐ．１９５遺伝子のｃＤＮＡ制限地図。
【図３】Ｐ．１９５ゲノム配列の制限地図。
【図４】本発明に係り使用できるプラスミドの構築例を
示す模式図。
示す模式図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ (72)発明者 ジヤスビアー シング サンデユ イギリス国ケント，ベツケンハム，ラング リイ コート（番地なし) (72)発明者 バレンテイナ リベロス − モレノ イギリス国ケント，ベツケンハム，ラング リイ コート（番地なし) (72)発明者 カレル ゲリツト オデインク スイス国スレンケンドルス，エツトストラ ーセ 19
Claims (2)
- 【請求項１】 以下のＤＮＡ配列のヌクレオチド５１７
８で終わる配列に実質的に対応するクローンＤＮＡ配列
によってコードされ、プラスモジウム（Ｐ．ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）のＰ．１９５蛋白質のカルボキシ末端から
誘導される分子量４２０００のポリペプチドおよび医薬
として使用可能な担体を含む、マラリアに対する免疫を
誘導するワクチン。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 - 【請求項２】 感受性の脊椎動物宿主に対する免疫誘導
において使用するための、以下のＤＮＡ配列のヌクレオ
チド５１７８で終わる配列に実質的に対応するクローン
ＤＮＡ配列によってコードされ、プラスモジウム（Ｐ．
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＰ．１９５蛋白質のカルボキ
シ末端から誘導される分子量４２０００のポリペプチ
ド。 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】
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