CN1839133A - 作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用 - Google Patents
作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1839133A CN1839133A CNA2004800241375A CN200480024137A CN1839133A CN 1839133 A CN1839133 A CN 1839133A CN A2004800241375 A CNA2004800241375 A CN A2004800241375A CN 200480024137 A CN200480024137 A CN 200480024137A CN 1839133 A CN1839133 A CN 1839133A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- replacement
- group
- alkyl
- following
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Virology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
Abstract
本发明提供具有二氮杂萘骨架的MIF抑制剂，其在多种病症的治疗，包括与MIF活性相关的病理状况的治疗中具有效用。MIF抑制剂具有下列结构：(Ia)，(Ib)，(Ic)，(Id)，包括其立体异构体，前药和药用盐，其中n，R，R1，R2，X，Y和Z如本文所定义。本发明还提供含有与药用载体组合的MIF抑制剂的药物组合物及其使用方法。
Description
发明领域
本发明提供巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的抑制剂，其具有二氮杂萘(naphthyridine)骨架，其在多种病症的治疗、包括与MIF活性相关的病理状况的治疗中具有效用。
发明背景
淋巴因子，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，已经被鉴定为是巨噬细胞在宿主防御中的功能的介体，并且其表达与延迟的过敏性、免疫调节、炎症和细胞免疫有关。参见Metz和Bucala，Adv.Immunol.66：197-223，1997。巨噬细胞移动抑制因子(MIFs)，它大小介于12-13千道尔顿(kDa)之间，已经在若干哺乳动物和鸟类中鉴定；参见，例如，Galat等，Fed.Eur.Biochem.Soc.319：233-236，1993；Wistow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1272-1275，1993；Weiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7522-7526，1989；Bernhagen等，Nature 365：756-759，1993；Blocki等，Protein Science 2：2095-2102，1993；和Blocki等，Nature 360：269-270，1992。虽然MIF最初被表征为能够阻断巨噬细胞移动，MIF也似乎通过不同于干扰素-γ的作用机理影响巨噬细胞的粘附；诱导巨噬细胞表达白介素-1-β，白介素-6，和肿瘤坏死因子α；上调HLA-DR；提高氧化氮合酶和氧化氮的浓度；和活化巨噬细胞以杀死杜诺凡氏利什曼原虫(Leishmania donovani)肿瘤细胞且抑制支原体(Mycoplasma avium)的生长。除了其作为免疫逃避分子的潜在作用以外，MIF可以在与不完全弗氏制剂或脂质体中的牛血清白蛋白或HIV gp120一起给予时充当免疫佐剂，引起抗原诱导的与完全弗氏可比的增殖作用。另外，MIF已经被描述为糖皮质激素抗衡调节剂和血管生成因子。作为糖皮质激素诱导而不抑制的数种蛋白质中的一种，它发挥减弱糖皮质激素的免疫抑制效果的作用。因此，它被视为调节糖皮质激素的免疫抑制作用的有力要素。所以，当其活性/基因表达被过量外源性糖皮质激素的给药过度诱发时(例如当临床指导抑制炎症、免疫力等)，存在显著的毒性，因为MIF本身加剧炎症/免疫反应。参见Buccala等，Ann.Rep.Med.Chem.33：243-252，1998。
虽然MIF还被认为通过特定受体作用于细胞，由此激活细胞内级联，其中包括erk磷酸化和MAP激酶和基质金属蛋白酶，c-jun，c-fos和IL-1mRNA的上调(参见Onodera等，J.Biol.Chem.275：444-450，2000)，它还具有内源性酶促活性，例如其互变异构化适当底物的性能(例如，多巴色素)。此外，这种酶促活性是否介导对MIF的生物反应和这种蛋白的体外和体内活性仍然不清楚。尽管MIF的定点诱变产生具有完全内在活性的突变体，但能仍然无法具有酶促活性(Hermanowski-Vosatka等，Biochemistry 38：12841-12849，1999)，Swope等已经描述了细胞因子活性和MIF的催化位点之间的直接关联(Swope等，EMBO J.17(13)：3534-3541，1998)。所以，并不清楚通过对多巴色素互变异构酶独自的抑制作用来鉴定MIF活性的抑制剂能够获得具有临床价值的MIF抑制剂的策略。评估MIF对其细胞表面受体的抑制作用的能力也是有限的，因为当前不知道高亲和力受体。
开发MIF抑制剂的兴趣来自于观察到，已知MIF由于其细胞因子活性可将巨噬细胞浓集在感染位点，和细胞介导的免疫性。此外，MIF被视为是巨噬细胞粘附、吞噬作用和杀肿瘤活性的介体。参见Weiser等，J.Immunol.147：2006-2011，1991。因此，MIF的抑制导致细胞因子、生长因子、趋化因子和淋巴因子的间接抑制，否则它可使巨噬细胞到达炎症位点。人MIF cDNA已经自T-细胞系分离，和编码分子量约12.4kDa且含有115个氨基酸残基的蛋白质，它构成活化形式的同源三聚体(Weiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86.：7522-7526，1989)。尽管MIF最初是在活化T-细胞中观察到，现在已报告在多种组织包括肝脏、肺、眼晶状体、卵巢、脑、心脏、脾脏、肾脏、肌肉和其他组织内观察到。参见Takahashi等，Microbiol.Immunol.43(1)：61-67，1999。MIF的另一特征是其缺少常规前导序列(即无前导蛋白质)来指挥经ER/Golgi途径的经典分泌。
通过中和MIF的细胞因子活性而作用的MIF抑制剂(和鉴定MIF抑制剂的方法)提供了优于其他类型抑制剂的显著优越性。例如，互变异构酶活性独自与炎症反应之间的联系还存在争议。此外，细胞内作用的抑制剂常常由于其对有关靶标或靶标内部细胞的作用而呈毒性。配体受体复合物的小分子抑制剂难以识别，更不用说优化和开发。细胞因子如MIF的理想抑制剂是改变MIF本身致使当它被细胞释放出来时已经得到有效中和的物质。具有这种活性的小分子优于抗体，因为蛋白质和化学物质之间作为药物时存在重大差别。参见Metz和Bucala(上文)；Swope和Lolis，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol 139：1-32，1999；Waeber等，Diabetes M.Res.Rev.15(1)：47-54，1999；Nishihira，Int.J.Mol.Med.2(1)：17-28，1998；Bucala，Ann.N.Y.Acad.Sci.840：74-82，1998；Bernhagen等，J.Mol.Med.76(3-4)：151-161，1998；Donnelly和Bucala，Mol.Med.Today 3(11)：502-507，1997；Bucala等，FASEB J.10(14)：1607-1613，1996。
发明概述
由于已经在多种组织中鉴定出MIF并且它与多种病理学事件有关，因此本领域需要鉴定MIF的抑制剂。还需要含有此类抑制剂的药物组合物，以及利用它们治疗例如免疫有关的病症或其他MIF诱导的病理学事件(如肿瘤有关的血管生成)的方法。优选的实施方案可以完全符合这些需求，并且提供了其他优越性。
在优选实施方案中，本发明提供具有下列通式结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，和(Id)的MIF的抑制剂：
包括其立体异构体、前药和药用盐，其中n，R，R1，R2，X，Y和Z定义如下。
优选实施方案的MIF抑制剂具有非常广泛的治疗应用，并且可以用来治疗多种病症、疾病，或者病理症状包括，但不限于，多种免疫相关反应，肿瘤生长(例如，癌症，如前列腺癌，乳腺癌，肺癌，肝癌，皮肤癌，脑癌，骨癌，结肠癌，睾丸癌等)，肾小球肾炎，炎症，疟疾性贫血，脓毒性休克，肿瘤有关的血管生成，玻璃体视网膜病，牛皮癣，移植物抗宿主病(组织排斥)，特应性皮炎，类风湿性关节炎，炎性肠病，炎性肺病，中耳炎，局限性回肠炎，急性呼吸窘迫综合征，延迟型过敏症，移植排斥，CNS疾病(例如早老性痴呆，帕金森病，多发性硬化等)的免疫介导的和炎性要素，肌肉萎缩症，止血疾病(例如凝血病，静脉闭塞病等)，变态反应性神经炎，肉芽肿，糖尿病，移植物抗宿主病，慢性肾损伤，脱发病(脱发)，急性胰腺炎，关节病，心脏机能障碍(例如，收缩期心脏机能障碍，舒张期心脏机能障碍)，心肌梗死，充血性心力衰竭，心血管病(例如再狭窄，动脉粥样硬化)，关节病，骨关节炎，腹膜炎，肾病以及其它。这些方法包括给需要其的动物施用有效量的一种或多种优选实施方案提供的MIF的抑制剂，优选以药物组合物的形式施用。提供药物组合物，其含有一种或多种优选实施方案的MIF抑制剂和药用载体和/或稀释剂。
因此，在第一个实施方案中，提供用于抑制巨噬细胞移动抑制因子的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，该化合物具有选自下组的结构：
其中：
R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；m独立地为0，1，2，3，或4；且n为0，1，或2。
在第一个实施方案的一个方面，具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
其中R选自由下列各项组成的组：氢，C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；R2选自由下列各项组成的组：-NR4R5，-OR3，和-R3；R3独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R3被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基，或R4和R5一起构成被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；X选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；Y选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；Z选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；Ar独立地选自由下列各项组成的组：被一个或多个选自下组的取代基所取代的C6-C12芳基：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；且m独立地为0，1，2，3，或4。
在第一个实施方案的一个方面，具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
其中R选自由下列各项组成的组：氢，C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-S(O)mR3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-NHSO2R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-S(O)mR3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；R2选自由下列各项组成的组：-NR4R5，-OR3，和-R3；R3独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R3被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基，或R4和R5一起构成被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷硫基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；X选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；Y选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；Z选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；Ar选自由下列各项组成的组：被一个或多个选自下组的取代基所取代的C6-C12芳基：氢，-F，-Cl，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；且m独立地为0，1，2，3，或4。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-NH-C(＝O)CH3。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-CN。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-NO2。
在第一个实施方案的一个方面，R1构成-NH2。
在第一个实施方案的一个方面，R2构成
在第一个实施方案的一个方面，R2构成
在第一个实施方案的一个方面，R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第一个实施方案的一个方面，X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；且其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了具有下式结构的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，
在第一个实施方案的一个方面，提供了与药用载体或稀释剂组合的第一个实施方案的化合物。
在第二个实施方案中，提供了在需要其的患者中降低MIF活性的方法，包含向该患者施用有效量的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，该化合物具有选自下组的结构：
和
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；m独立地为0，1，2，3，或4；且n为0，1，或2。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种用于治疗温血动物中炎症的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中的脓毒性休克的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中关节炎的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中癌症的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中急性呼吸窘迫综合征的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中炎性疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该炎性疾病可以选自类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病和哮喘。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中心脏病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。所述心脏病可以选自由下列各项组成的组：心脏功能障碍，心肌梗死，充血性心力衰竭，再狭窄和动脉粥样硬化。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中自身免疫疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该自身免疫疾病可以选自糖尿病，哮喘，和多发性硬化症。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种抑制温血动物中免疫反应的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种减少温血动物中血管生成的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
在第一个实施方案的一个方面，提供一种治疗温血动物中与过度糖皮质激素水平有关的疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该疾病可以是库欣病。
在第三个实施方案中，提供一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将POCl3与式(3)的化合物反应：
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4；由此生成式(4)的化合物：
式(4)；
将式(4)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(5)的化合物：
将式(5)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(6)的化合物：
式(6)
其中式(6)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-NH-C(＝O)CH3。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-CN。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-NO2。
在第三个实施方案的一个方面，R1构成-NH2。
在第三个实施方案的一个方面，R2构成
在第三个实施方案的一个方面，R2构成
在第三个实施方案的一个方面，R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第三个实施方案的一个方面，X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；和其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
在第四个实施方案中，提供一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(13)的化合物与环己胺反应：
式(13)
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(14)的化合物：
将式(14)的化合物与POCl3反应，由此生成式(15)的化合物：
将式(15)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(16)的化合物：
将式(16)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(17)的化合物：
其中式(17)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第四个实施方案的一个方面，R2构成
在第四个实施方案的一个方面，R2构成
在第四个实施方案的一个方面，R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第四个实施方案的一个方面，X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；和其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
在第五个实施方案中，提供了一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(23)的化合物与POCl3和三氟乙酸反应，
其中R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar独立地选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(24)的化合物：
式(24)；
将式(24)的化合物与下式的化合物反应：
其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(25)的化合物：
将式(25)的化合物与具有式RX’的化合物反应，其中X’包含卤素并且其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5，由此生成式(26)的化合物：
其中式(26)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-NH-C(＝O)CH3。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-CN。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-NO2。
在第五个实施方案的一个方面，R1构成-NH2。
在第五个实施方案的一个方面，R2构成
在第五个实施方案的一个方面，R2构成
在第五个实施方案的一个方面，R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第五个实施方案的一个方面，X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；和其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
在第五个实施方案的一个方面，R构成苄基。
在第六个实施方案中，提供了一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(3a)的化合物与POCl3反应，
式(3a)
由此生成式(4a)的化合物：
将式(4a)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(5a)的化合物：
将式(5a)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；且其中R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(6a)的化合物：
式(6a)
其中式(6a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第六个实施方案的一个方面，R2构成
在第七个实施方案中，提供了一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将式(13a)的化合物与环己胺反应：
由此生成式(14)的化合物：
将式(14a)的化合物与POCl3反应，由此生成式(15a)的化合物：
将式(15a)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(16a)的化合物：
将式(16a)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：R3烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(17a)的化合物：
其中式(17a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第七个实施方案的一个方面，R2构成
或
在第八个实施方案中，提供了一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将式(23a)的化合物与POCl3和三氟乙酸反应，
式(23a)
由此生成式(24a)的化合物：
式(24a)
将式(24a)的化合物与下式化合物反应
其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(25a)的化合物：
将式(25a)的化合物与具有式RX的化合物反应，其中X包含卤素并且其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5，其中Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(26a)的化合物：
其中式(26a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
在第八个实施方案的一个方面，R2构成
在第八个实施方案的一个方面，R2构成
在第八个实施方案的一个方面，R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
在第八个实施方案的一个方面，R构成苄基。
这些和其他实施方案及其多个方面在参考下列详述以后将变得显而易见。为此，本文给出多个参考文献，它们更详细地描述了某些方法、化合物和/或组合物，并且在此全文引入作为参考。
优选实施方案详述
下列描述和实施例详细说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，本发明的许多变化和改进属于其范围内。所以，优选实施方案的描述不应认为是对本发明范围的限定。
为了帮助理解所述的优选实施方案，在此提供某些定义。
在此使用的术语“MIF活性，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少部分由巨噬细胞移动抑制因子介导的活性或作用。所以，MIF活性包括，但不限于，抑制巨噬细胞移动，互变异构酶活性(例如，利用苯丙酮酸或多巴色素)，内毒素诱导的休克，炎症，糖皮质激素抗衡调节，胸腺嘧啶核苷掺入3T3成纤维细胞的诱导，erk磷酸化的诱导和MAP激酶活性。
本文所用的术语“输出，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指通过非经规范前导序列的标准前导序列定向分泌的机理、将翻译细胞产物运输到细胞膜或细胞外空间的代谢主动过程，它可以是或可以不是能量依赖型的。此外，“输出，”与依赖前导序列的分泌不同，它耐受布雷菲德菌素A(即，输出的蛋白质不经ER/Golgi运输；布雷菲德菌素A被认为对运输输出蛋白质没有直接影响)和其他类似化合物。在此使用，“输出”还可以是指“非经典分泌”。
本文所用的术语“无前导蛋白质，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指缺乏规范前导序列并且从细胞内部输出到细胞外环境的蛋白质或多肽。无前导蛋白质在细胞外环境中被视为定位在细胞外空间内或者与细胞膜的外表面结合的蛋白质。在优选实施方案的内容中，无前导蛋白质包括天然存在的蛋白质，例如巨噬细胞移动抑制因子及其片段以及改造为缺乏前导序列并且输出的蛋白质，或者改造为包括前导蛋白质或其片段与另一蛋白质融合的蛋白质。
本文所用的术语“抑制剂，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指与抑制剂不存在下的活性或输出比较，可以改变MIF的构象和/或与单克隆抗体竞争MIF并减小MIF的至少一种活性或者其自细胞的输出的分子(例如，天然或合成化合物)。也就是说，“抑制剂”，与不使用抑制剂的试验相比，在使用抑制剂进行的试验中细胞外和/或细胞内检测到的MIF活性或在MIF蛋白质中，如果MIF的测定量发生统计学显著变化，则改变构象和/或活性和/或输出。
本文所用的术语“结合剂，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指任何结合MIF的分子，包括抑制剂。
通常，MIF抑制剂抑制MIF的生理功能，并且由此适用于治疗其中MIF是致病性的疾病。
在某些优选实施方案中，提供具有下面结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，和(Id)的MIF抑制剂或其立体异构体、前药或药用盐：
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；各个R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；各个Ar独立地选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；各个m独立地为0，1，2，3，或4；且n为0，1，或2。
在一个优选实施方案中，提供了在需要其的患者中降低MIF活性的方法，该方法向所述患者施用有效量的具有下列结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，或(Id)的化合物或其立体异构体、前药或药用盐：
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；各个R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；各个Ar独立地选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；各个m独立地为0，1，2，3，或4；且n为0，1，或2。
如本文所用，上述术语具有下列含义。如本文所用，术语“烷基(alkyl)，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指直链或支链、非环或环状、不饱和或饱和的含有1至2，3，4，5，6，7，8，9，或10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多个碳原子的脂族烃，而术语“低级烷基”具有与烷基相同的含义但含有1至2，3，4，5或6个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基，仲丁基，异丁基，叔丁基，异戊基等。不饱和烷基在相邻碳原子之间含有至少一个双键或三键(分别称作“链烯基”或“链炔基，”)。代表性直链和支链链烯基包括乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，等等；而代表性直链和直链链炔基包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1-丁炔基，等等。
本文所用的术语“环烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指包括一元-、二元-或多元-碳环的烷基。环烷基(cycloalkyls)也称为“环烷基(cyclic alkyls)”或“碳环”。代表性饱和环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，-CH2环丙基，-CH2环丁基，-CH2环戊基，-CH2环己基等；其不饱和环烷基包括环戊烯基和环己烯基，等等。环烷基包括十氢萘、金刚烷等。
本文所用术语“芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指芳族碳环部分，例如苯基或萘基。优选地，芳基含有6至7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或更多碳原子。
本文所用术语″芳烷基″是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被芳基部分取代的烷基，例如苄基，-CH2(1或2-萘基)，-(CH2)2苯基，-(CH2)3苯基，-CH(苯基)2，等等。
本文所用术语“杂芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指5或6至10元的具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子(或2，3，或4个或更多杂原子)并含有至少一个碳原子的芳族杂环，包括单环和双环体系两者。代表性杂芳基包括(但不限于)呋喃基，苯并呋喃基，噻吩基，苯并噻吩基，吡咯基，吲哚基，异吲哚基，氮杂吲哚基，吡啶基，喹啉基，异喹啉基，噁唑基，异噁唑基，苯并噁唑基，吡唑基，咪唑基，苯并咪唑基，噻唑基，苯并噻唑基，异噻唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，和喹唑啉基。
本文所用的术语″杂芳烷基″是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被杂芳基部分取代的烷基，例如-CH2吡啶基，-CH2嘧啶基，等等。
本文所用的术语“杂环”和“杂环环，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指5、6或7元单环杂环，或7、8、9、10、11、12、13至14元或更多元多环杂环。该环可以是饱和、不饱和的、芳族的或非芳族的，并且含有1、2、3或4个独立选自氮、氧和硫的杂原子。所述氮和硫杂原子可以被任选氧化，氮杂原子可以任选被季胺化，包括其中任何上述杂环与苯环稠合的二环以及三环(和更高级的)杂环。所述的杂环可以经任何杂原子或碳原子连接。该杂环包括如上定义的杂芳基。由此，除了上述芳族杂芳基以外，杂环也包括(但不限于)吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，乙内酰脲基，戊内酰胺基，环氧乙烷基，氧杂环丁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基，等等。还包括下列结构的杂环：
本文所用的术语“杂环烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被杂环替代的烷基，例如-CH2吗啉基，等等。
本文所用的术语“取代的，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指其中至少一个氢原子被取代基取代的任何上述基团(例如，烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳烷基，杂环或杂环烷基)。在酮基取代基(例如-C(＝O)-)的情况中两个碳原子被取代。当被取代时，“取代基，”在优选实施方案的情况中，包括卤素，羟基，氰基，硝基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，烷基，烷氧基，烷硫基，卤代烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烷基，取代的杂芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，-NRaRb，-NRaC(＝O)Rb，-NRaC(＝O)NRaRb，-NRaC(＝O)ORb -NRaSO2Rb，-ORa，-C(＝O)Ra，-C(＝O)ORa，-C(＝O)NRaRb，-OC(＝O)NRaRb，-SH，-SRa，-SORa，-S(＝O)2Ra，-OS(＝O)2Ra，-S(＝O)2ORa，其中Ra和Rb相同或不同并且独立地选自氢，烷基，卤代烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烷基，取代的杂芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基或取代的杂环烷基。
本文所用的术语“卤素，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指氟，氯，溴和碘。
本文所用的术语“卤代烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个氢原子被卤素取代的烷基，如三氟甲基等。
本文所用的术语“烷氧基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经氧桥连接的烷基部分(即，-O-烷基)，如甲氧基，乙氧基，等等。
本文所用的术语“硫代烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经硫桥连接的烷基部分(即，-S-烷基)，如甲硫基，乙硫基等。
本文所用的术语“烷磺酰基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经磺酰基桥连接的烷基部分(例如，-SO2-烷基)，如甲磺酰基，乙磺酰基，等等。
本文所用的术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”是广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指分别经氮桥连接的一个烷基部分或两个烷基部分(即-N-烷基)例如甲基氨基，乙基氨基，二甲基氨基，二乙基氨基，等等。
本文所用的术语“羟烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被至少一个羟基取代的烷基。
本文所用的术语“一-或二(环烷基)甲基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被一个或两个环烷基取代的甲基，例如环丙基甲基，二环丙基甲基，等等。
本文所用的术语“烷基羰基烷基，”或“酰基烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)烷基取代的烷基。
本文所用的术语“烷基羰氧基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)O-烷基基团或-OC(＝O)烷基基团取代的烷基。
本文所用的术语“烷氧基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-O-烷基取代的烷基。
本文所用的术语“芳基羰基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)芳基取代的芳基。
本文所用的术语“芳基羰基氧基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)O-芳基或-OC(＝O)芳基取代的芳基。
本文所用的术语“芳氧基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-O-芳基取代的烷基。
本文所用的术语“烷基羰基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)芳基取代的烷基。
本文所用的术语“烷基羰基氧基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)O-芳基或-OC(＝O)芳基取代的烷基。
本文所用的术语“烷氧基芳基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-O-芳基取代的烷基。
本文所用的术语“芳基羰基烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)烷基取代的芳基。
本文所用的术语“芳基羰基氧基烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)O-烷基或-OC(＝O)烷基取代的芳基。
本文所用的术语“芳氧基烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-O-烷基取代的芳基。
本文所用的术语“烷硫基烷基”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-S-烷基取代的烷基。
本文所用的术语“一-或二(烷基)氨基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，分别是指被一个烷基或两个烷基取代的氨基。
本文所用的术语“一-或二(烷基)氨基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被一-或二(烷基)氨基取代的烷基。
本文所指的环系包括稠合环，桥连环，和螺环部分，以及单独的单环部分。
下列编号的方案用于优选实施方案中：
如上所述，二氮杂萘环的氮原子可以占据5，6，7，或8环位。优选实施方案的代表性化合物的化学结构在下面提供。在这些结构中，利用下列符号来表示吡啶环，其中氮原子可以占据5，6，7，或8环位：
在以下提供的某些化学结构中，如此描述的吡啶环包括作为取代基的甲基或氯原子。当该取代基存在时，如果吡啶环的氮原子占据5环位，那么取代基占据6、7或8环位。如果吡啶环的氮原子占据6环位，那么取代基占据5、7或8环位。如果吡啶环的氮原子占据7环位，那么取代基占据5、6或8环位。如果吡啶环的氮原子占据8环位，那么取代基占据5、6或7环位。在特别优选的实施方案中，吡啶环的氮原子占据8环位，取代基(如果存在)占据6环位。
优选实施方案的化合物一般可以作为游离酸或游离碱使用。或者，优选实施方案的化合物可以优选采取酸或碱加成盐的形式。优选实施方案的游离碱氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域熟知的方法制备，并且可以由有机和无机酸形成。适宜的有机酸包括马来酸，富马酸，苯甲酸，抗坏血酸，琥珀酸，甲磺酸，乙酸，草酸，丙酸，酒石酸，水杨酸，柠檬酸，葡糖酸，乳酸，扁桃酸，肉桂酸，天门冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，羟基乙酸，谷氨酸，和苯磺酸。适宜的无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，和硝酸。游离酸的碱加成盐同样可以通过本领域熟知的方法制备，并且可以由适当的碱生成，例如选自碱金属和碱土金属的阳离子(例如，锂，钠，钾，镁，钡，或钙)和铵阳离子。术语结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，或(Id)的“药用盐”意欲包括任意和所有可接受的盐形式。
结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，或(Id)的化合物可以按照本领域技术人员已知的有机合成技术以及通过实施例中列举的代表性方法制备。通常，可以按照下列反应路线制备结构(Ia)的化合物。注意在这些合成路线中，二氮杂萘环的氮原子占据8环位。然而，这些合成路线也有效用于制备其中二氮杂萘环的氮原子占据5，6，或7环位的优选实施方案的化合物，如下所述。
中间体1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯的制备
制备式(Ia)化合物的一种优选中间体是1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，其在以下式(3)中描述。用于该合成的原材料是2-氯-3-吡啶羧酸。为了制备式(Ib)的化合物，将氯吡啶羧酸与仲氨基化合物反应。为了举例说明的目的，在下列合成途径中，将苄胺用作原材料。然而，注意其它仲胺也可以用作原材料，包括取代的苄胺，如4-甲氧基苄胺或4-氟苄胺。
合成中间体1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯的第一个步骤是生产2-苄基氨基烟酸，如反应路线1中的式(1)所示：
反应路线1
然后可以将2-苄基氨基烟酸(1)用于制备1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮，如反应路线2中式(2)所示。
反应路线2
然后可以将丙二酸二乙酯与1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)反应以生成1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)，如反应路线3所示：
反应路线3
在该反应中可以使用其他二酯，如果对于获得的式(Ia)(或式(Ib)，(Ic)，或(Id))的化合物的取代基R1优选不同的羧酸酯取代基，例如丙二酸二甲酯，丙二酸二丙酯等。另外，羧酸酯基团可以如下所述被另一个部分例如氰基所取代。
制备式(Ia)的化合物-1-苄基-2-氧代-4-[(4-噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯
使用中间体1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯作为原材料，可以制备优选实施方案的一种化合物。该化合物可以通过应用反应路线4所示的反应序列来制备。
反应路线4
在上述反应中，2-噻吩碳酰氯与1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯反应，生成目标化合物，1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，如反应路线4中的式(6)所示。如果优选取代基R不为2-噻吩，在反应中可以替换另一种碳酰氯化合物。
中间体1-苄基-4-羟基-2-氧代-12-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯的氰基衍生物
包括氰基作为取代基R1的式(Ia)的化合物可以从中间体1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯开始制备。通过反应路线5所示的反应用氰基将中间体官能化：
反应路线5
制备式(Ia)的化合物-1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-3-氰基[1，8]-二氮杂萘
如在反应路线4中式(5)和(6)的化合物的制备中所讨论的，然后通过与哌嗪的反应，接着与2-噻吩碳酰氯反应制备终产物。还如上所述，如果优选取代基R不是2-噻吩，在反应中可以替换另一种碳酰氯化合物。用于制备1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-3-氰基[1，8]-二氮杂萘的反应序列在反应路线6中显示。
反应路线6
制备通式结构(Ia)的化合物
优选的式(Ia)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。该合成的原材料是2-氯-3-吡啶羧酸和4-甲氧基苄胺。合成的步骤顺序如反应路线7所示：
在反应的最后步骤，可以选择适当的卤化物(R-X)作为反应物以便在二氮杂萘环的1位上生成所需的取代基(R)。制备产物的备选最后步骤在反应路线8中显示：
反应路线8
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
制备在二氮杂萘部分的3-位上具有腈的通用结构(Ia)的化合物
优选的式(Ia)的化合物包括1-R-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mN4R5，其中m是0，1，2，3，或4。在反应路线9中通过式20描述的2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈，作为关键的中间体其制备是起始于在反应路线7的式13所述的4-羟基-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯。该关键中间体然后与适当的卤化物(R-X)反应以生成目标化合物。用于合成的步骤顺序在反应路线9中表示：
反应路线9
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
制备在二氮杂萘部分的6-位上具有取代的通用结构(Ia)的化合物
选择2，6-二氯-5-氟-烟酸作为原材料来制备结构(Ia)的化合物，在二氮杂萘部分的6-位上具有氟取代。通过用亚硫酰氯处理酯化2，6-二氯-5-氟-烟酸，接着用无水乙醇回流，生成2，6-二氯-5-氟-烟酸乙酯，如反应路线10中式21所示。当与乙硫醇和氢化钠反应时，该酯生成2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯，如反应路线10中式22所示。通过与乙醇和阮内镍回流，通过胺化2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯，其被转化为5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯，如反应路线10中式24所示，制备6-乙硫基-5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯，如反应路线10中式23所示。然后将5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯与氯甲酸三氯甲酯反应，获得6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮，如反应路线10中式25所示。反应顺序在反应路线10中表示。
反应路线10
将2-羟基烟酸选择作为合成化合物的原材料，该化合物在二氮杂萘部分的6-位上具有氯取代。通过次氯酸钠氯化2-羟基烟酸获得5-氯-2-羟基烟酸，如反应路线11中式26所示。该中间体用亚硫酰氯处理，接着用甲醇回流，生成2，5-二氯-烟酸甲酯，如反应路线11中式27所示。通过对甲氧基苄胺胺化2，5-二氯-烟酸甲酯，获得5-氯-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸甲酯，如反应路线11中式28所示，其转化为6-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮，如反应路线11中式29所示，如反应路线11中所述通过与氯甲酸三氯甲酯反应。
反应路线11
将在反应路线12中式31表示的2-溴-5-甲基烟酸乙酯用作原材料来制备在二氮杂萘部分的6-位上具有甲基取代的化合物。该原材料如下制备：用丙醛与氰基乙酸乙酯缩合，接着环化获得的中间体，如反应路线12所示。通过对甲氧基苄胺胺化2-溴-5-甲基烟酸乙酯，获得5-甲基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯，如反应路线12的式32所示，其然后如反应路线12所示通过与氯甲酸三氯甲酯反应，转化为6-甲基-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮，如反应路线12中式33所示。
反应路线12
在二氮杂萘部分上具有6-取代的化合物制备自分别在反应路线10，11和12中通过式25，29和33所述的酐中间体。应用于这些化合物的合成途径类似于如上所述未取代的类似物的合成途径。用于制备这些化合物的反应序列在反应路线13和14中表示。
反应路线13(Y＝F，Cl，CH3)
反应路线14(Y＝F，Cl，CH3)
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替反应路线13和14中的哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
通用结构(Ic)的化合物的制备
优选的式(Ic)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。
该合成的原材料是通过boc基团保护并转化为4-叔丁氧羰基氨基-烟酸的4-氨基吡啶，如反应路线15中式35所示，通过邻位锂化接着用干冰猝灭。该中间体与氯甲酸三氯甲酯反应，生成1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮，如反应路线15中式36所示，其然后转化为4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，如反应路线15中式37所示。4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯与哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮反应生成2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，如反应路线15中式38所示，其与相应的烷基卤(R-X)反应以生成1-N-取代的-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，如反应路线15所示。
反应路线15
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
备选地，如反应路线16所示，可以由4-氯吡啶或烟酸制备反应路线15中式37表示的中间体4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯。通过LDA邻位锂化4-氯吡啶，接着用干冰猝灭，或者烟酸锂化接着用六氯乙烷猝灭可以获得氯烟酸中间体，如反应路线16中式39所示。将该中间体胺化可以获得如反应路线16中式40所示的3-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸，其可以通过用氯甲酸三氯甲酯处理转化为在反应路线16中式41表示的1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮。该中间体可以转化为在反应路线15的式37所示的4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，如反应路线16所示。
反应路线16
制备在二氮杂萘部分的3位上具有腈基团的通用结构(Ic)的化合物
优选的式(Ic)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-腈，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R和3位上的腈基是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。这些化合物可以通过应用类似于上述[1，8]-二氮杂萘系列的反应序列和方法由反应路线16中式42所示的中间体4-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯制备。合成这些化合物的步骤顺序在反应路线17中显示。
反应路线17
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
制备通用结构(Ib)的化合物
优选的式(Ib)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，7]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。这些化合物可以通过使用吡啶3，4-二羧酸作为原材料来制备。吡啶3，4-二羧酸可以与乙酐反应生成呋喃并[3，4-c]吡啶-1，3-二酮，如反应路线18中式43所示，通过与乙酰胺反应其可以转化为反应路线18的式44所示的吡咯并[3，4-c]吡啶-1，3-二酮。由该中间体的Hoffmann降解可以制备3-氨基异烟酸。3-氨基异烟酸的还原性胺化可以生成反应路线18的式46所示的3-(4-甲氧基-苄基氨基)异烟酸。该中间体还可以如反应路线18所示，通过使用六甲基二硅氮叠氮化锂将3-氨基异烟酸烷基化来制备。
反应路线18
通过应用类似于用于合成通用结构(Ia)的化合物的反应序列和方法，在反应路线18的式46表示的中间体3-(4-甲氧基-苄基氨基)异烟酸可以用于合成通用结构(Ib)的化合物。可以用于制备这些化合物的反应序列在反应路线19中提供。
反应路线19
制备在二氮杂萘部分的3-位上具有腈基的通用结构(Ib)的化合物
优选的式(Ib)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，7]-二氮杂萘-3-腈，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或(CH2)mNR4R5，，其中m是0，1，2，3，或4。这些化合物可以通过应用类似于上述[1，8]-二氮杂萘系列的反应顺序和方法，由反应路线20中式47所示的中间体4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，7]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯合成。合成这些化合物的步骤顺序在反应路线21中表示。
反应路线20
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
通用结构(Id)的化合物的制备
优选的式(Id)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，5]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。这些化合物可以通过使用吡啶2，3-二羧酸作为原材料来制备。吡啶2，3-二羧酸可以与乙酐反应以提供在反应路线21中的式48表示的呋喃并[3，4-b]吡啶-5，7-二酮，其可以通过与乙酰胺反应转化为反应路线21的式49所示的吡咯并[3，4-b]吡啶-5，7-二酮。3-氨基吡啶-2-羧酸可以由该中间体的Hoffmann降解来制备。3-氨基吡啶-2-羧酸的还原性胺化可以提供在反应路线21中的式51表示的3-(4-甲氧基-苄基氨基)-吡啶-2羧酸。该中间体还可以如反应路线21所示通过使用六甲基二硅氮叠氮化锂和对甲氧基苄基氯将3-氨基异烟酸烷基化来制备。
反应路线21
通过应用类似于通用结构(Ia)的化合物合成的反应顺序和方法，在反应路线21中的式51表示的中间体3-(4-甲氧基-苄基氨基)-吡啶-2-羧酸可以用于合成通用结构(Id)的化合物。可以用于制备这些化合物的反应顺序在反应路线22中提供。
反应路线22
制备在二氮杂萘部分的3位上具有腈基的通用结构(Id)的化合物
优选的式(Id)的化合物包括1-R-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，5]-二氮杂萘-3-腈，其中二氮杂萘环的1位上的取代基R是氢，烷基，取代的烷基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，或-(CH2)mNR4R5，其中m是0，1，2，3，或4。这些化合物可以通过应用类似于上述[1，8]-二氮杂萘系列的反应顺序和方法，由反应路线23的式52所示的中间体4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，5]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯制备。合成这些化合物的步骤顺序在反应路线23中显示。
反应路线23
如果优选哌嗪部分中的取代基不是2-噻吩，可以使用相应的N-酰基哌嗪代替哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮，该相应的N-酰基哌嗪可以用相应的酰基氯酰化叔丁基-1-哌嗪羧酸酯接着通过脱保护来制备。
作为药物靶标的MIF
巨噬细胞移动抑制因子(MIF)非常适合作为分析用的药物靶标，因为其活性参与许多病生理学情况。例如，已经证明MIF是炎症反应和细胞增殖两者中的重要介体。在这点上，MIF已经显示出发挥细胞因子、垂体激素、糖皮质激素诱导的免疫调节剂的作用，并且最近被证实作为神经免疫调节剂和具有神经元功能。Takahashi等，Mol.Med.4：707-714，1998；Bucala，Ann.N.Y.Acad.Sci.840：74-82，1998；Bacher等，Mol.Med.4(4)：217-230，1998。此外，最近证实抗MIF抗体具有多种用途，尤其是减弱肿瘤生长，同时血管生成明显减少。Ogawa等，Cytokine 12(4)：309-314，2000；Metz和Bucala(如上)。所以，可以抑制MIF的小分子在炎症反应的治疗，血管生成的减少，病毒感染，细菌感染，癌症(特别是肿瘤发生和细胞凋亡)的治疗，移植物抗宿主病和有关组织排斥的治疗中具有重要价值。MIF抑制剂可具体应用于多种免疫相关反应，肿瘤生长，肾小球肾炎，炎症，疟疾性贫血，脓毒性休克，肿瘤有关的血管生成，玻璃体视网膜病，牛皮癣，移植物抗宿主病(组织排斥)，特应性皮炎，类风湿性关节炎，炎性肠病，炎性肺病，中耳炎，局限性回肠炎，急性呼吸窘迫综合征，延迟型过敏症的治疗中。MIF抑制剂也可以有效治疗应激和糖皮质激素功能病症，例如糖皮质激素作用的反向调节，或者克服糖皮质激素介导的对花生酸酯释放的抑制作用(基于Cys-60的催化MIF氧化还原酶活性或JABI/CSNS-MIF相互作用基础的机制)。
MIF抑制剂实用性的一个实例可以通过这样的事实来证实，即当与内毒素接触后，MIF的可检测血清浓度在急性期内(1-8小时)逐步增高，在8小时达到高峰且在急性期后持续(＞8小时)直至20小时。虽然不受到任何操作理论的限制，MIF似乎可以通过活化的T-细胞和巨噬细胞、在内毒素诱发的休克的促炎阶段中产生，例如，成为对感染的局部应答的部分。一旦通过促炎刺激，例如低浓度的LPS，或者通过TNF-α和IFN-γ得以释放，巨噬细胞衍生的MIF可成为内毒素休克急性期内产生MIF的可能来源。应答LPS释放MIF的垂体和巨噬细胞两者均是内毒素休克急性后期中MIF的可能来源，当感染不再被局限在局部位置时。参见，例如，美国专利6,080,407，其全文在此引入作为参考并描述了这些结果和抗MIF抗体。
优选实施方案的抑制剂抑制了LPS攻击后小鼠中的致死率且有可能削弱IL-1β和TNF-α的水平。所以，许多炎性病症可以用MIF抑制剂加以治疗。在这点上，在其他优点中，对MIF活性和/或释放的抑制可以用于治疗炎性反应和休克。通过在休克反应的早期和晚期两者中进行干预可以获得有益效果。在这方面，尽管不受到任何产生MIF抑制的保护作用的理论或机理的限制，抗MIF研究已经证明，抗MIF抗体的引入与循环血清中TNF-α水平的明显(可达35-40％)减少有关联。这种减少与MIF对体外巨噬细胞的TNF-α-诱导活性相符，并且提示了MIF可能是至少部分负责内毒素施用后1-2小时血清TNF-α水平达到非常高峰的原因，尽管事实上MIF此时在循环中无法检测到。所以，MIF抑制疗法可能在炎症反应的早期有益。
MIF还在休克反应的急性后期发挥作用，并且由此提供了在其他疗法，例如抗TNF-α疗法无效的后期进行干预的机会。MIF的抑制可以保护用高浓度内毒素刺激(即，诱发垂体MIF释放到循环中的浓度)的动物，和用TNF-α刺激的动物对抗致死性休克。所以，抑制MIF和保护用TNF刺激的动物的性能显示，在脓毒性休克的后期、急性后期，中和MIF可能有效。
TNF-α和IL-1β的水平在某些情况中至少与MIF水平有关。所以，抗MIF小分子可以用于多种TNF-α和/或IL-1β有关的病症中，包括移植排斥，CNS疾病的免疫介导的和炎症的要素(例如，早老性痴呆，帕金森病，多发性硬化，等等)，肌肉营养不良，止血的疾病(例如，凝血病，静脉闭合病，等等)，变应性神经炎，肉芽肿，糖尿病，移植物抗宿主病，慢性肾脏损伤，脱发(头发脱落)，急性胰腺炎，关节病，充血性心衰，心血管疾病(再狭窄，动脉粥样硬化)，关节疾病，和骨关节炎。
此外，本领域的其他证据表明，甾族化合物虽然是细胞因子生成的有效抑制剂但明显增强MIF的表达。Yang等，Mol.Med.4(6)：413-424，1998；Mitchell等，J.Biol.Chem.274(25)：18100-18106，1999；Calandra和Bucala，Crit.Rev.Immunol.17(1)：77-88，1997；Bucala，FASEB J.10(14)：1607-1613，1996。所以，特别有效的是在甾族化合物疗法中可以联合应用MIF抑制剂来用于治疗细胞因子介导的病生理疾病例如炎症、休克，和其他细胞因子介导的病理状态中，特别是慢性炎性状态例如类风湿性关节炎。这样的联合疗法甚至可能对随后的病理或其他炎性反应的发作有益。例如，在临床情形中，在脓毒性休克症状发作后给予甾族化合物被证实没有益处。参见Bone等，N.Engl.J.Med.317：653-658，1987；Spring等，N.Engl.J.Med.311：1137-1141，1984。联合的甾族化合物/MIF抑制疗法可以用于克服这个障碍。此外，本领域的技术人员可以理解，这样的疗法可以适合局部和/或系统性地抑制MIF释放和/或活性。
测定
作为MIF抑制剂的化合物的效力可以通过多种实验方法进行测定。优选实施方案的适当抑制剂能够降低一种或多种与MIF和/或MIF输出有关的活性。结构(Ia)，(Ib)，(Ic)，(Id)或其他任何结构的化合物可以通过一种或多种出于此目的且被普遍接受的实验测定作为MIF抑制剂的活性，包括(但不限于)下列测定。
测定一般划分为三类，也就是，那些监测输出的试验；那些监测效应子或小分子的结合的试验，和那些监测MIF活性的那些。然而，这些试验的组合也属于优选实施方案的范围内。令人惊奇地，MIF的表位作图充当着生物活性的替代者。例如，在一种试验中，利用如市售自R&D系统(Minneapolis，MN)的单克隆抗体，候选抑制剂的存在阻止来自细胞的MIF的输出的检测(例如，THP-1细胞)，而多克隆抗体证实MIF是存在的。而且，基于细胞的或体外试验可以用来证明这些潜在抑制剂抑制MIF活性。在另一方面，这两种试验(即，结合和活性试验)可以组合为一个独立试验，它检测试验化合物的结合(例如，替代单克隆抗体或抑制其结合的性能)同时也影响MIF活性。此类试验包括ELISA类试验(或类似结合试验)与MIF互变异构试验或类似功能试验的组合。由于本领域普通技术人员很容易认识到，采用精确试验是不相关的，条件是它能够检测出感兴趣化合物结合MIF的性能。此外，所述的试验优选能够检测化合物抑制MIF活性的性能，因为要选择与生物活性的MIF而不是灭活MIF相互作用的化合物。
证实化合物具有抑制单克隆抗体结合生物活性而非灭活MIF(例如，小分子抑制的)的性能，必须证实与MIF以这样的方式相互作用的化合物(例如，小分子)的存在，所述方式是改变MIF的构象或阻断抗体结合所必需的表位。在其他实施方案中，MIF抑制活性还可以被认为是干预包括MIF的多肽复合物的形成的结果；干扰此类复合物可以达到构象改变抑制作用的检测。所以，监测MIF构象变化的试验的采用是有优势的，当除测定化合物例如小分子与mAb之间的竞争作用的试验以外，或者代替此类试验使用时。许多此类试验是本领域已知的并且包括，量热法，圆二色性，荧光能量传递，光散射，核磁共振(NMR)，表面等离振子共振(surfaceplasmon resonance)，闪烁亲近测定法(参见美国专利5,246,869)，等等。也可参见WO02/07720-A1和WO97/29635-A1。所以，本领域技术人员可以认识到可采用任何显示结合和优先构象改变或接近MIF活性位点的位置的试验。下面描述多种较复杂的亲近试验和构象分析试验，该讨论仅仅是举例且应当不以任何方式构成对技术类型的限制，它们可以用于优选实施方案。
在一个实例中，圆二色性可以用来测定候选抑制剂的结合作用。圆二色性(CD)部分基于大多数生物蛋白质大分子是由不对称单体单元(L-氨基酸)构成的事实，因此它们全部具有光学活性的属性。另外，刚性结构如DNA或α螺旋多肽具有可以用适当光谱体系测定的光学性质。事实上，易于测定的光谱参数的巨大改变可以为识别构象状态和构象状态在不同环境下的变化提供选择性方式，并且有时用于观察大分子内或所连接的单个基团的扰动。此外，CD分析法常常被用于探测不同大分子与小分子和配体之间的相互作用。参见Durand等，Eur.Biophys.J.27(2)：147-151，1998；Kleifeld等，Biochem 39(26)：7702-7711，2000；Bianchi等，Biochem38(42)：13844-13852，1999；Sarver等，Biochim Biophys Acta 1434(2)：304-316，1999。
Pasteur原理指出旋光性分子须是不对称的，也就是说，分子及其镜像不能重叠。平面偏振光是左圆偏振光和右圆偏振光在相中转播的混和光。这种光与不对称分子的相互作用导致一种圆偏振光组分的优先作用，由此在吸收区域内可见到差别吸收(即，二色性)。参见Urry，D.W.，SpectroscopicApproaches to Biomolecular Conformation，American Medical AssociationPress，Chicago，Ill.，pp.33-120(1969)；Berova和Woody，Circular Dichroism：Principles and Applications，John Wiley & Sons，N.Y.，(2000)。
于是，圆二色性是一种吸收现象，当生色团在特定波长与平面偏振光相互作用时可以产生这种现象。吸收带可以是负的或正的，这取决于右和左圆偏振光组分对该生色团的差别吸收。与测定背景和感兴趣的生色团的贡献距离实际光相互作用的区域多少毫微米的旋光色散(ORD)不同，CD在发生光学事件的波长下具有测定该光学事件的优越性。则圆二色性特异于生色团的电子跃迁。参见Berova和Woody，Circular Dichroism：Principlesand Applications，John Wiley & Sons，N.Y.，(2000)。
圆二色性在大分子的溶液中的应用可得到鉴定构象状态的性能(Berova和Woody，Circular Dichroism：Principles and Applications，JohnWiley & Sons，N.Y.，(2000))。该技术可以辨别大分子的无规卷曲，α螺旋，和β螺旋链构象状态。在蛋白质中，α螺旋纤维蛋白质具有非常类似于α螺旋多肽的吸收曲线，但在已知结构的球形蛋白质中，如溶菌酶和核糖核酸酶，该螺旋结构在X射线结晶工作上非常不同。球形蛋白质的另一困难来源在于在280nm附近分子上芳香性生色团的普遍存在。螺旋变化的一个感兴趣变化已经利用肌红蛋白质和脱辅基肌红蛋白质加以证实。除去辅基血红素后，保留的脱辅蛋白质具有减少25％的残余圆二色性椭圆率。螺旋的这种损失归因于分子中10-15残基的展开。其他非肽、旋光生色团包括酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，和半胱氨酸，当位于大分子的一级氨基酸序列中时。非肽椭圆率的实例包括核糖核酸酶中的二硫基转变和胰岛素的半胱氨酸转变。
所以，圆二色性可以用来筛选候选抑制剂影响MIF构象的性能。
在某些实施方案中，MIF结合剂或抑制剂复合物的形成可以通过检测含有MIF和可检测标记结合剂的复合物的存在来进行测定。如下文详述，荧光能量信号检测法，例如通过荧光偏振，能够测定显示MIF结合剂分子复合物形成的信号水平。所以，并且如本文所述，在候选抑制剂不存在和存在条件下基于荧光能量信号进行的MIF结合剂复合物形成的对比提供了一种鉴定是否该试剂改变MIF和结合剂之间的相互作用的方法。例如，结合剂可以是MIF底物，抗MIF抗体，或一种已知的抑制剂，而候选抑制剂可以是被测化合物，或者反之亦然。
如上所述，可以使用基于荧光能量信号的MIF结合剂复合物形成的测定。荧光能量信号检测可以是，例如通过荧光偏振法或荧光共振能量传递法，或通过本领域已知的其他荧光方法。作为实例，该MIF多肽可以和候选抑制剂一起被标记并且可以含有能量传递分子供体-受体对，并且测定能量供体向能量受体提供的荧光共振能量传递的水平。
所述的候选抑制剂和/或结合剂的标记是可检测的，在特别优选的实施方案中，候选抑制剂和/或结合剂能够产生荧光能量信号。候选抑制剂和/或结合剂可以通过共价或非共价连接于适当的报道分子或部分而被可检测地标记，例如根据所用的特定荧光能量技术选择的任何不同荧光物质(例如，荧光团)，如本领域已知的和基于本发明所述方法。本发明提供的荧光报道部分和方法可以参见，例如Haugland(1996 Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals-Sixth Ed.，Molecular Probes，Eugene，OR；1999 Handbook of Fluorescent Probes和ResearchChemicals-Seventh Ed.，Molecular Probes，Eugene，OR，http：//www.probes.com/lit/)和其中引用的参考文献。在优选实施方案中特别优选用作这种荧光团的是荧光素，罗丹明，德克萨斯红，AlexaFluor-594，AlexaFluor-488，俄勒冈(Oregon)绿，BODIPY-FL，和Cy-5。然而，可以使用任何适宜的荧光团，并且在某些实施方案可以优选所列以外的其他荧光团。
如本文所提供的，荧光能量信号包括任何荧光发射，激发，能量传递，猝灭，或去猝灭事件等等。通常，荧光能量信号可以由可检测荧光标记的候选抑制剂和/或结合剂在响应适当波长的光时所介导。简单而言，并且不希望受到理论的约束，荧光能量信号的产生一般包括用适当的能源激发荧光团(例如，对于所选荧光报道部分来说适当波长的光，或荧光团)，由此瞬时使该荧光团的能态从基态变为激发态。被激发的荧光团由此以可检测光的形式发射能量，该光通常具有不同于激发所优选(例如，一般较长)的波长，并且此后恢复到其能量基态。优选实施方案的方法考虑到使用任何荧光能量信号，这依赖于特定的荧光团，底物标记的方法和检测仪器，它很容易且根据标准无需进行过度试验就可选择，这是本领域普通技术人员所熟知的。
在某些实施方案中，该荧光能量信号是荧光偏振(FP)信号。在一些其他实施方案中，该荧光能量信号可以是荧光共振能量传递(FRET)信号。在某些其他优选的实施方案中该荧光能量信号可以是荧光猝灭(FQ)信号或荧光共振光谱(FRS)信号。(有关FP，FRET，FQ和FRS的详情参见，例如，WO97/39326；WO99/29894；Haugland，Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals-6th Ed.，1996，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，p.456；及其引用的文献.)。
FP，一种荧光团的平均角位移(归因于分子转动扩散)的量度，它出现在能量源的光子的吸收与随后的光子发射之间，依赖于在荧光团的激发态过程中旋转扩散的程度和速度、分子的大小和形状、溶液粘度和溶液温度(Perrin，1926 J.Phys.Rad.1：390)。当粘度和温度保持恒定时，FP直接与荧光团的表观分子体积或大小有关。偏振值是相异平面(例如，垂直和水平)中测定的荧光强度的比值，由此是不受荧光团强度影响的无量纲量。低分子量荧光团，例如本发明提供的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂，能够加快溶液(即，低各向异性)中分子的转动并由此得到低的荧光偏振读数。然而，当与较高分子量分子例如如本文所提供的MIF复合时，底物的荧光团部分与在溶液(即，高各向异性)中具有相对缓慢的分子转动的复合物缔合，得到较高的荧光偏振读数。
游离的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂的偏振值与MIF：候选抑制剂和/或结合剂复合物的偏振值的差异可以用来测定复合的(例如，结合的)与游离的之间的比例。这种差异也可用于检测候选药物(即，候选抑制剂)对该复合物的形成和/或对预形成复合物的稳定性的影响，例如通过比较在药物不存在条件下检测的FP和在该药物存在下测定的FP。FP测量可以不用分离反应组分就可进行。
如上所述，优选实施方案的一个方面利用单克隆抗体、已知的抑制剂或其他结合剂和/或候选抑制剂的复合物形成与MIF结合或置换，提供一种鉴定改变MIF活性的抑制剂的方法。在这点上，一类化合物被证实具有抑制/减少单克隆抗体与由细胞天然产生的生物活性MIF结合的性能，同时不影响抗体识别灭活(重组)MIF(如得自商购来源)，并且还证实具有显著的MIF活性的体内调控作用。所以，抗体结合可能优选作为酶活性的替代，由此避免需要对各个候选化合物进行昂贵和复杂的酶试验。本领域普通技术人员很容易理解，避免酶试验的能力使试验可以非常适合于高通量应用。
此外，本领域普通技术人员很容易理解，这样的试验可以应用于MIF背景之外并且无论如何酶或生物活性可以用结合试验代替。例如，可以优选任何其生物活性形式可以被不识别其灭活形式(例如，小分子抑制形式)的单克隆抗体识别的任何酶和其它多肽。在酶的情况中，该单克隆抗体可以结合活性位点，但被小分子替换。由此，任何替换该抗体的小分子可能是成为潜在酶抑制剂的强先导。本领域技术人员懂得，该抗体可以识别依赖于酶的活性状态改变构象的表位，并且小分子的结合可以阻止抗体结合这个表位，由此也可以充当酶活性的替代物，即使该表位不位于活性位点上。所以，本发明采用的试验的类型可以扩展到用于基本上任何多肽，其中抗体置换是活性损失的前兆。因此，以其最简单的形式，任何多肽，例如，酶和其有关中和的抗体可以用于筛选置换这种抗体的小分子，由此鉴定可能的抑制剂。
MIF结合剂/候选抑制剂复合物可以通过任何本领域已知的、用于证明MIF和上述其他分子之间的分子间相互作用的不同技术进行鉴定，例如，共纯化法，共沉淀法，共免疫沉淀法，放射或荧光测定法，蛋白质免疫印迹分析法，亲和捕获法，包括亲和技术例如固相配体-反配体吸附技术，亲和色谱和表面亲和等离振子共振，NMR，等等(参见，例如，美国专利5,352,660)。测定此类复合物的存在可以采用特异性结合MIF或结合剂的抗体，包括单克隆，多克隆，嵌合和单链抗体，等等。
标记的MIF和/或标记的结合剂/候选抑制剂还可以用于检测复合物的存在。感兴趣的分子可以通过共价或非共价连接于适当的报道分子或部分来进行标记，例如任何各种酶，荧光物质，发光物质和放射性物质。适当酶的实例包括，但不限于，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，和乙酰胆碱酯酶。适当荧光物质的实例包括，但不限于，伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯，藻红蛋白质，德克萨斯红，AlexaFluor-594，AlexaFluor-488，俄勒冈绿，BODIPY-FL和Cy-5。适当的发光物质包括，但不限于，鲁米诺并且适当的放射性物质包括放射性磷[32P]，碘[125I或131I]或氚[3H]。
MIF和结合剂和/或候选抑制剂在足以允许组分之间形成分子间复合物的条件和时间下混和。适合形成此类复合物的条件是本领域已知的并且可以很容易地基于本发明提供的教导进行测定，包括溶液条件和检测复合物的存在和/或检测溶液中游离底物的方法。
复合物中可检测标记的结合剂和/或候选抑制剂与MIF和/或不构成该复合物组成部分的结合剂或候选抑制剂的缔合，可以按照优选实施方案、通过检测底物产生的荧光能量信号来鉴定。通常，按照本领域普通技术人员熟知的标准选择检测荧光能量信号的能量源，这依赖于标记底物的荧光报道部分。含有(a)MIF和(b)可检测标记的结合剂和/或候选抑制剂的试验溶液暴露在能量源下以发生荧光能量信号，它可以利用多种公知仪器检测并根据特定荧光能量信号进行鉴定。在优选的实施方案中，该荧光能量信号是荧光偏振信号，它可以用安装有偏振滤光器的分光荧光计进行检测。在特别优选的实施方案中荧光偏振测定是在各个多个反应室中同时完成，该反应室可以用LJL CRITERIONTM Analyst(LJL Biosystems，Sunnyvale，CA)平板读数器读数，例如，在不同的反应室内提供具有不同反应组分或条件的高通量筛选(HTS)。其他适合获得荧光偏振读数的仪器的实例包括POLARSTARTM(BMG Lab Technologies，Offenburg，Germany)，BEACONTM(Panvera，Inc.，Madison，WI)和POLARIONTM(Tecan，Inc.，Research TrianglePark，NC)装置。
测定由MIF和结合剂和/或候选抑制剂之间形成的复合物的存在可以通过多种方法完成，如上所述，包括如本文所提供的和本领域已知的荧光能量信号法。此类方法可以包括，以举例而不是限定的方式FP，FRET，FQ，其他荧光测定法，共纯化法，共沉淀法，共免疫沉淀法，放射测定法，蛋白质免疫印迹分析法，亲和捕获法，包括亲和技术例如固相配体-反配体吸附技术，亲和色谱和表面亲和等离振子共振，圆二色性，等等。对于这些和其他使用的亲和技术，参见，例如，Scopes，R.K.，Protein Purification：Principles and Practice，1987，Springer-Verlag，NY；Weir，D.M.，Handbook ofExperimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston；和Hermanson，G.T.等，Immobilized Affinity ligand Techniques，1992，Academic Press，Inc.，California；其全文在此引入作为参考，它们涉及分离和表征复合物的技术的详情，包括亲和技术。在多个实施方案中，MIF可以与结合剂和/或候选抑制剂经特异性结合相互作用，如过MIF结合结合剂和/或候选抑制剂并且Ka大于或等于约104M-1，优选大于或等于约105M-1，更优选大于或等于约106M-1和还更优选大于或等于约107M-1-1011M-1。结合配偶体的亲和力可以很容易由根据上述荧光能量信号法得到的数据并利用常规数据处理技术计算出来，例如，Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660(1949)所述的那些。
例如，在荧光能量信号是荧光偏振信号的多种实施方案中，游离的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂的荧光各向异性(偏振光中)可以在无MIF下检测，并且可以在滴定量的MIF的存在下检测完全结合的底物荧光各向异性(偏振光中)。偏振光中的荧光各向异性是以被标记候选抑制剂和/或结合剂在荧光团激发态的持续时间内所经历的转动运动的量的函数进行变化，由此游离和完全结合的候选抑制剂和/或结合剂的各向异性可以用于测定在指定的试验条件下与MIF结合的候选抑制剂和/或结合剂的部分，例如，其中存在候选药物的那些(参见，例如，Lundblad等，1996Molec.Endocrinol.10：607；Dandliker等，1971 Immunochem.7：799；Collett，E.，Polarized Light：Fundamentals and Applications，1993 Marcel Dekker，New York)。
某些优选的实施方案部分涉及利用分子间能量传递来监测MIF结合剂复合物的形成和稳定性和/或MIF-候选抑制剂复合物形成。
能量传递(ET)产生自两个分子：贡献能量的“供体”分子和接受能量的“受体”分子之间的共振相互作用。能量传递可以发生在(1)供体的发射光谱重叠受体的吸收光谱时和(2)供体和受体在另一者的特定距离内(例如，小于约10nm)。能量传递的效率主要由供体和受体的接近性表示，并且随距离以6的乘幂衰减。由此ET的测量强有力地反映出受体和供体化合物的接近性，并且ET的变化灵敏地反映出化合物的接近性的变化，例如，供体和受体的缔合和解离。
因此优选实施方案的一个方面是提供一种在相关部分中分析候选MIF抑制剂的方法，该方法通过将MIF或含有一个或多个ET供体的MIF结合剂复合物与ET受体分子接触，激发该ET供体产生激发的ET供体分子并检测由ET供体向ET受体能量传递时产生的信号。如本发明所述的，该方法可以使用任何可以作为供体-受体对起作用的适宜ET供体分子和ET受体分子。
在某些优选实施方案，ET供体和受体分子之间能量传递产生的可检测信号得自于荧光共振能量传递(FRET)，如上所述。当能量由激发的供体荧光团直接传递给受体荧光团时，FRET出现在分子内，或在两类不同的分子之间，(综述参见Wu等，Analyical Biochem.218：1-13，1994)。
在优选实施方案的其他方面，测试候选抑制剂影响MIF输出的能力。
此类试验的第一步是细胞外检测MIF。对于该试验，采用表达MIF的试验细胞(例如，THP-1细胞)。或者试验细胞可以天然产生蛋白质或由转染的表达载体产生。试验细胞优选正常表达蛋白质，由此转染只是提高表达的水平。所以，对于MIF和IL-1的表达，优选THP1细胞。当分析病毒衍生的蛋白质时，例如HIV tat，如果该试验细胞不能“天然地”产生蛋白质，很容易用适当的载体转染它们，使该试验细胞表达所需的蛋白质，这是本领域技术人员容易理解的。
表达之后，利用任何一种熟知的方法和程序检测MIF。所述的方法包括用抗体染色联合流式细胞仪，聚焦显微镜，图像分析，细胞胞质或培养基的免疫沉淀，细胞培养基的蛋白质印迹法，ELISA，1-或2-D凝胶分析法，HPLC，或生物测定。初步筛选的常规试验是ELISA。MIF输出可以通过一种其他试验进行确定，优选通过细胞培养基的免疫沉淀和后续的代谢标记法。简单而言，表达MIF蛋白质的细胞用35S-蛋氨酸和/或35S-半胱氨酸在无蛋氨酸和/或半胱氨酸培养基中脉冲标记15分钟并且加入到补充有过量蛋氨酸和/或半胱氨酸的培养基中。收集培养基组分并通过离心澄清化，例如在微型离心机中。含有1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐(DOC)，20mM Tris，pH 7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，10nM PMSF，10ng/ml抑肽酶，10ng/ml亮抑肽酶，和10ng/ml胃酶抑素的裂解缓冲液加入到该澄清培养基中。加入MIF的抗体，随后在冷却下温育，加入沉淀性第二抗体或免疫球蛋白结合蛋白质用于进一步培养，例如蛋白质A-Sepharose或GammaBindTM-Sepharose。与之平行，作为对照，监测胞质蛋白质并在免疫沉淀法中优选胞质蛋白质的抗体。沉淀免疫复合物并用冰冷的裂解缓冲液洗涤。复合物进一步用冰冷的IP缓冲液(0.15M NaCl，10mM Na-磷酸盐，pH 7.2，1％DOC，1％NP-40，0.1％SDS)洗涤。免疫复合物直接洗脱至SDS-凝胶样品缓冲液中并在SDS-PAGE中电泳。该凝胶进行荧光自显影，干燥和曝光于X射线胶片。或者细胞可以被改造为产生MIF，它用报道分子标记，由此活性MIF的存在可以通过报道分子的代替活性。
不希望受理论的约束，相信现有的抑制剂通过直接与天然产生的MIF相互作用、以改变该蛋白质构象至足以阻断其生物活性的方式发挥功能。这种相互作用可以通过MIF-化合物共结晶的X射线结晶学作图，以便测定相互作用的准确位点。一个位点位于负责MIF的互变异构酶活性的袋内。
MIF输出的抑制剂的筛选试验根据抑制剂的类型和受影响的活性的本质而变化。试验可在体外或体内进行。通常，体外试验设计为评估MIF活性，或多聚化，并且体内试验设计为评估MIF活性，在模型细胞或动物体系中细胞外和细胞内定位。在任何试验中，与适当对照比较统计学意义的增大或减小是增强作用或抑制作用的象征。
一种体外试验可以测试候选化合物对MIF抑制巨噬细胞移动的能力的影响。简单而言，人外周血单核细胞优选作为琼脂糖滴试验系统中的指示细胞，这基本上如Weiser等，Cell.Immunol.90：167-178，1985和Harrington等，J.Immunol.110：752-759，1973所述。也可以采用分析巨噬细胞移动的其他试验体系。该试验由Hermanowski-Vosatka等，Biochem.38：12841-12849，1999描述。
另一体外试验设计为测定MIF催化多巴色素的D-异构体的互变异构化的性能(参见Rosengren等，Mol.Med.2：143-149，1996；Winder等，J.Cell Sci.106：153-166，1993；Aroca等，Biochem.J.277：393-397)。简单而言，在该方法中，在候选抑制剂存在和不存在条件下向MIF提供D-多巴色素并监测催化5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)的互变异构的性能。然而，优选利用D-多巴色素的甲酯，因为观察到较快的反应速度。互变异构化的检测可以通过多种标准方法的任一方法进行。
在类似的方法中，可以测试MIF催化苯丙酮酸酯的互变异构化的性能(参见Johnson等，Biochem.38(48)：16024-16033，1999)。简单而言，在这种方法中，通常，苯丙酮酸酯或(对羟基苯基)丙酮酸酯的酮基化是通过光谱法测定的。此外，通过用MIF处理这些化合物且随后转化为苹果酸盐用于1H NMR分析可以检验产物的形成。
体内试验可以在用含有MIF核酸分子的表达载体瞬时或稳定转染的细胞中进行，如本发明所述的那些。优选这些细胞测定在候选化合物存在和不存在条件下MIF的活性(例如，细胞凋亡的调节，增殖，等等)或细胞外和细胞内定位。当测试凋亡时，可以采用多种细胞检验法，包括，例如，染料染色和显微镜检测核酸片段化和细胞的孔隙率。
其他试验可以在模型细胞或动物体系中进行，这是通过在试验化合物存在或不存在的条件下向所述体系提供重组或天然存在形式的MIF或诱发内源性MIF表达，由此测定该体系病理学的统计学意义上的显著增大或减小。例如，LPS可以用来诱发中毒性休克反应。
在此简述的试验可以用于鉴定对于MIF特异性的抑制剂。
在本发明所述的任何试验中，试验细胞可以自然表达MIF(例如，THP-1细胞)或在引入编码该蛋白质的重组DNA分子后表达。转染和转化方案是本领域熟知的且包括Ca2PO4-介导的转染，电穿孔，用病毒载体感染，DEAE-葡聚糖介导的转染，等等。作为上述蛋白质的替代，可以采用嵌合MIF蛋白质(即，MIF蛋白质与其他蛋白质或蛋白质片段的融合制备的蛋白质)，或改造成缺少前导序列的蛋白质序列。以类似方式，融合可以装配为直接分泌，输出，或胞质保留。任何和所有这样的序列可以用于与MIF的融合构建体以协助分析抑制剂。宿主细胞还可以表达MIF，这是患病、被病毒感染等的后果。依靠前导序列输出的分泌蛋白质是公知的且包括，人绒毛膜促性腺激素(hCGα)，生长激素，肝细胞生长因子，转铁蛋白，神经生长因子，血管内皮生长因子，卵白蛋白，和类胰岛素生长因子。类似地，胞质蛋白质是公知的且包括，新霉素磷酸转移酶，β-半乳糖苷酶，肌动蛋白和其他细胞骨架蛋白质，和酶，例如蛋白质激酶A或C。最适用的胞质或分泌的蛋白质是那些在常规试验中容易测定的那些，例如ELISA。三种蛋白质(无前导序列，分泌的，和胞质的)可以天然地共同表达，这是通过在试验细胞中共转染，或在独立宿主细胞中分开转染。此外，对于本文所述的试验，细胞可以被稳定转化或瞬时表达所述蛋白质。
免疫沉淀法是一种这样的试验，它可以用来测定抑制作用。简单而言，在无蛋氨酸-和/或半胱氨酸细胞培养基，天然地或来自引入载体构建体的表达MIF的细胞用35S-蛋氨酸和/或35S-半胱氨酸标记短暂的时间，通常15分钟或更长时间。脉冲式标记后，如果非前导蛋白质是肝素结合的，细胞用补充有过量未标记的蛋氨酸和半胱氨酸加肝素的培养基洗涤。此后细胞在相同种类的追踪培养基中培养多种不同的时间周期。加入不同浓度的候选抑制剂或增强剂。收集培养上清液且澄清化。上清液用抗MIF免疫血清或单克隆抗体培养，或者如果肽标记存在的话用抗标记抗体培养，随后用展开试剂例如金黄色葡萄球菌Cowan株I，蛋白质A-Sepharose，或Gamma-bindTM G-Sepharose。免疫复合物通过离心沉淀，用含有1％NP-40和0.5％脱氧胆酸盐，EGTA，PMSF，抑肽酶，亮抑肽酶，和胃酶抑素的缓冲液洗涤。进而沉淀在含有磷酸钠pH 7.2，脱氧胆酸盐，NP-40，和SDS的缓冲液中洗涤。免疫复合物被洗脱到SDS凝胶样品缓冲液中并用SDS-PAGE分离。该凝胶用于荧光自显影，干燥，和暴露在X射线胶片下。
或者，ELISA可能优选用于检测和定量分析细胞上清液中的MIF含量。ELISA适宜于在高通量筛选中检测。简单而言，96孔平板用抗MIF抗体或抗标记抗体涂层，洗涤，和用2％BSA封闭。此后将细胞上清液加入到孔中。培养和洗涤后，加入第二抗体(例如，针对MIF的抗体)。该第二抗体可以与标记或检测试剂偶联，例如酶或生物素。进一步培养后，加入展开剂并用ELISA平板读数器测定MIF的量。该展开剂是偶联于第二抗体(通常是抗同位型抗体)的酶的底物或是偶联于链霉抗生物素的酶的底物。适宜的酶是本领域熟知的并且包括辣根过氧化物酶，它发挥底物的作用(例如，ABTS)，导致比色反应。认识到除了使用偶联于酶的第二抗体，还可以将抗MIF抗体直接偶联于辣根过氧化物酶，或其他等效检测试剂上。如果需要，可以浓缩细胞上清液达到检测水平。此外，检测方法，例如ELISA等等可以用来监测细胞内和细胞外的MIF水平。当细胞内水平是所希望的时，优选细胞裂解物。当细胞外水平是所希望的时，可以筛选培养基。
ELISA还可以很容易适应高通量筛选多种候选抑制剂或增强剂。简单而言，这样的试验通常是以细胞为基础并在96孔平板中进行。天然或稳定表达MIF的试验细胞铺板达到足够表达产物检测的水平，例如，约20,000细胞/孔。然而，如果细胞无法自然表达蛋白质，获得瞬时表达，例如通过电穿孔或Ca2PO4-介导的转染。对于电穿孔，100μl的细胞(例如，150,000细胞/ml)和载体DNA(5μg/ml)的混合物分散在96孔平板的各个孔中。该细胞用带有96个孔电极的仪器电穿孔(例如，ECM 600电穿孔系统，BTX，Genetronics，Inc.)。通过试验测定对于特定宿主细胞类型的电穿孔的最佳条件。电压，电阻，和脉冲长度是改变的典型参数。有关优化电穿孔的指南可以得自制造商或在工具手册中查找，例如Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等(ed.)，Wiley Interscience，1987)。细胞用等体积的培养基稀释且培养48小时。可以对多种细胞类型进行电穿孔，包括哺乳动物细胞，酵母细胞，细菌等等。培养后，加入含有或不含有抑制剂的培养基且细胞进一步培养1-2天。此时，收获培养基且通过本文所述的任何试验分析所述蛋白质。优选地，利用ELISA检测所述的蛋白质。测试的初始浓度为50μM。如果这个量得到统计学显著的输出的减少或单克隆Ab检测的减少，则进一步测试该候选抑制剂的剂量反应。
备选地，浓缩的上清液可以在SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到固体支持体上，例如尼龙或硝基纤维素。此后，用含有同位素和非同位素报道分子基团的MIF的抗体，通过免疫印迹法检测MIF(参见Harlow，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。这些报道分子基团包括，但不限于酶，辅因子，染料，放射性同位素，发光分子，荧光分子，和生物素。优选地，该报道分子基团为125I或辣根过氧化物酶，它可以通过与2，2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起培养来检测到。如果MIF含有肽标记，上述这些检测试验很容易适用。在这种情况中，所述的抗体结合肽标记。其他试验包括以大小或电荷为基础的色谱法，包括HPLC，和亲和色谱。
备选地，可以采用生物测定法定量在细胞培养基中存在的活性MIF的量。例如，MIF的生物活性可以通过巨噬细胞移动试验测定。简单而言，将用含有MIF的表达载体转染的细胞培养约30小时，期间加入候选抑制剂或增强剂。培养后，将细胞转移到低血清培养基中继续培养16小时。除去培养基和通过离心澄清化。向培养基中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，或者，裂解细胞并按照下列方法测定内部水平。随后，MIF的生物活性通过巨噬细胞移动试验，异构酶活性或增殖试验进行测定。增殖试验是通过加入不同量的洗脱物到培养的静止3T3细胞来进行。将氚代胸腺嘧啶核苷加入到培养基中并在约24小时后测定TCA可沉淀计数。活体染料MTT的还原是测定增殖作用的另一途径。作为标准，可以采用纯化的重组人FGF-2。其他功能可以在其他本领域可利用的适当生物测定中进行分析，例如CPS诱发的中毒性休克，TSST-1诱发的中毒性休克，胶原蛋白诱发的关节炎，等等。
其他体外血管生成试验包括测定内皮细胞在胶原凝胶中增殖作用的生物测定法(Goto等，Lab Invest.69：508，1993)，脑毛细管内皮细胞在通过一个室与输出MIF蛋白质的细胞分开的胶原凝胶上的共培养(Okamure等，B.B.R.C.186：1471，1992；Abe等，J.Clin.Invest.92：54，1993)，或细胞移动试验(参见Warren等，J.Clin.Invest.95：1789，1995)。
抗体的生产
在此使用的术语“抗体，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指多克隆，单特异性和单克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段抗体。对于优选实施方案的抗-MIF/靶向抗体，术语“抗原”在此使用的是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指巨噬细胞移动抑制因子多肽或靶向多肽，其变体或功能片段。抗MIF/靶向抗体，或此类抗体的抗原结合片段，可以特征描述为对靶向多肽或其表位具有至少约1×105M-1，一般至少约1×106M-1，和优选至少约1×108M-1的特异性结合活性。抗MIF/靶向抗体的Fab，F(ab’)2，Fd和Fv片段，其保留了对于MIF/靶向多肽-特异性表位的特异性结合活性，属于优选实施方案的范围内。特别感兴趣的是那些结合活性多肽并置换抑制小分子的结合作用的抗体。本领域技术人员很容易理解，这样的置换可以造成构象变化，由此改变表位的性质，竞争性结合该表位，或抗体从其表位具有空间排阻。在一个实施例中，酶的活性位点可以是特定抗体的表位并当小分子在该活性位点处或附近结合时，该抗体的免疫反应性丧失，由此允许使用丧失免疫反应性的抗体作为酶活性的替代标记。
此外，在此使用的术语“抗体”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指天然存在的抗体和非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体，嵌合，双功能和人源化抗体，以及其抗原结合片段。可以用固相肽合成装配的非天然抗体可以重组制成，或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(Huse等，Science 246：1275-1281(1989))。这些和其他制备例如嵌合，人源化，CDR-接枝的，单链，和双功能抗体的方法是本领域熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today14：243-246(1993)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1992)；Borrabeck，Antibodies Engineering，2d ed.，Oxford Univ.Press(1995)；Hilyard等，Proteins Engineering：A practical approach，IRL Press(1992))。
在某些优选实施方案中，抗-MIF/靶向抗体可以用免疫原生产，例如，含有MIF的活性位点区或靶向多肽的分离肽，其可以由天然来源制备或通过重组制备，如上所述，或MIF/靶向多肽的免疫原片段(例如，含有8-30个或更多相邻氨基酸序列的免疫原序列)，包括合成肽，如上所述。MIF/靶向多肽的非免疫原性肽部分可以通过将半抗原与载体分子如牛血清白蛋白(BSA)或匙红血蓝蛋白(KLH)偶联来被免疫原化，或通过表达该肽部分作为融合蛋白质。偶联半抗原和载体分子的多种其他载体分子和方法是本领域熟知的(Harlow和Lane，如上，1992)。
本领域熟知在例如兔、山羊、鼠或其他哺乳动物中获得多克隆抗体的方法。此外，单克隆抗体可以采用本领域熟知和常规的方法获得(Harlow和Lane，如上，1992)。例如，来自靶多肽免疫哺乳动物的脾细胞可以与适当的骨髓瘤细胞系例如SP/02骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。克隆的杂交瘤细胞系可以用标记的靶多肽或其功能片段筛选以鉴定分泌具有所需特异性的靶多肽单克隆抗体的克隆。表达具有预期特异性和亲和力的靶多肽单克隆抗体的杂交瘤可被分离并用作该抗体的持续性来源，它适用于例如制备标准化试剂盒。同样地，表达例如单链抗靶向多肽的重组噬菌体也提供可以用于制备标准化试剂盒的单克隆抗体。
利用MIF抑制剂的应用和方法
MIF的抑制剂可以具有多种适当的应用，如上所述。MIF的候选抑制剂可以被分离或得自多种来源，例如细菌，真菌，植物，寄生物，化学物(小分子)的文库，肽或肽衍生物等等。此外，本领域的技术人员懂得当观察到与对照相比存在统计学上显著性差异时抑制作用已经出现。
对于MIF在病理学和内稳态中的不同角色，MIF活性的抑制或MIF细胞外定位可能具有治疗作用。例如，最新研究已经证实MIF是内毒素血症的介质，其中抗MIF抗体完全保护小鼠免于LPS诱导的致死。参见Bernhagen等，Nature 365：756-759，1993；Calandra等，J.Exp.Med.179：1895-1902，1994；Bernhagen等，Trends Microbiol.2：198-201，1994。此外，抗MIF抗体明显提高用诱发脓毒性休克的革兰氏阳性菌刺激的小鼠的存活率。Bernhagen等，J.Mol.Med.76：151-161，1998。其他研究已经证实MIF在肿瘤细胞生长的作用并且其对MIF的反义抑制产生对编程性细胞死亡刺激的抗性。Takahashi等，Mol.Med.4：707-714，1998；Takahashi等，Microbiol.Immunol.43(1)：61-67，1999。此外，MIF是糖皮质激素作用的反调节剂的发现表明抑制MIF细胞外定位的方法可能能够治疗多种病理症状，包括自身免疫性，炎症，内毒素血症，和成人呼吸窘迫综合征，炎性肠病，中耳炎，炎性关节疾病和局限性回肠炎。参见Bernhagen等，J.Mol.Med.76：151-161，1998；Calandra等，Nature 377：68-71，1995；Donnelly等，Nat.Med.3：320-323，1997。由于还认识到MIF是血管生成性的，所以这种细胞因子的抑制可以具有抗血管生成活性并且特别适合于血管生成疾病包括，但不限于，癌症，糖尿病性视网膜病，牛皮癣，血管病，生育力，肥胖和糖皮质激素病症的遗传疾病，如库欣病(Cushing’s)和Addison’s病。
MIF活性或输出的抑制剂可以治疗上应用且也与那些结合对特定细胞具有特异性的细胞表面报道基因的靶向部分联合使用。抑制剂或增强剂的给药一般按照确定的给药方案。优选实施方案的组合物可以配制为所述的给药方式，包括例如，口服，经鼻，透粘膜，经皮，静脉内，颅内，腹膜内，皮下，或肌肉内给药。对于其他实施方案，本发明所述的组合物可以作为缓释植入物的组成部分给药。在另外的其他实施方案中，优选实施方案的组合物可以配制为冷冻干燥剂，利用适当的赋形剂得到冷冻干燥物所具有的稳定性，和随后再脱水。
在另一实施方案中，提供含有一种或多种MIF抑制剂的组合物。出于给药的目的，优选实施方案的化合物可以配制为药物组合物。优选实施方案的药物组合物含有一种或多种优选实施方案的MIF抑制剂(即结构(Ia)或(Ib)的化合物)以及药用载体和/或稀释剂。MIF的抑制剂在该组合物中以有效治疗特定疾病的量存在，也就是说，足以达到降低MIF水平或活性，症状的量和/或优选对于患者而言具有可接受毒性的量。优选地，优选实施方案的药物组合物可以包括MIF的抑制剂的量是小于约0.01mg至大于约1000mg/剂，这取决于给药途径，优选约0.025，0.05，0.075，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，或0.9mg至约65，70，75，80，85，90，95，100，125，150，175，200，225，250，300，350，375，400，425，450，500，600，700，800，或900mg，和更优选约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，或25mg至约30，35，40，45，50，55，或60mg。然而，在某些实施方案中，或多或少于上述的剂量可能也优选。本领域技术人员可以很容易地测定出适当的浓度和剂量。
药用载体和/或稀释剂对于本领域技术人员来说是熟悉的。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，和可以选择性地包括抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和其他常规添加剂。该组合物还可以配制为丸剂，胶囊剂，颗粒剂，或片剂，它们除含有MIF的抑制剂以外，还含有稀释剂，分散剂和表面活性剂，粘合剂，和润滑剂。本领域的技术人员可以进一步以适当方式并且根据一般实践配制MIF的抑制剂，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1990所述的那些。
此外，前药也包括在优选实施方案的内容中。前药是任何与载体共价结合的、当将该前药给予患者可在体内释放出结构(Ia)或(Ib)的化合物的物质。前药一般是通过修饰官能团来制得，修饰的方式是使该修饰在常规处理中或在体内可以裂解生成母体化合物。
对于立体异构体，结构(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物可以具有手性中心并且可以作为外消旋体、外消旋混合物存在和单独对映异构体或非对映异构体存在。所有这些异构形式属于优选实施方案中，包括其混合物。此外，某些结构(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物的结晶形式可以存在多晶型，它们属于优选实施方案。另外，某些结构(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物也可以与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。这些溶剂化物同样地属于优选实施方案的范围内。
在其他实施方案中，提供一种治疗多种病症或疾病的方法，包括炎性疾病，关节炎，免疫有关的病症等等。此类方法包括给温血动物施用足以治疗该病症或疾病的量的优选实施方案的化合物。此类方法包括系统性给予优选实施方案的MIF的抑制剂，优选以药物组合物的形式。如此所述，系统性给药包括口服和非肠道给药的方法。对于口服给药，适当的MIF的抑制剂的药物组合物包括散剂，颗粒剂，丸剂，片剂和胶囊剂以及液体，糖浆剂，混悬剂，和乳剂。这些组合物还可以包括调味剂，防腐剂，混悬剂，增稠剂和乳化剂和其他药用添加剂。对于非肠道给药，优选实施方案的化合物可以制备为含水注射溶液，它除了含有MIF活性和/或输出的抑制剂以外，还含有缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂和其他此类溶液中常用的添加剂。
如上所述，优选实施方案的化合物的给药可以用于治疗许多不同的病症或疾病。特别是，优选实施方案的化合物给药施用给温血动物以治疗炎症，癌症，免疫疾病等等。
MIF抑制化合物可以与其他药物化合物以联合疗法方式应用。在优选实施方案中，MIF抑制化合物与用于治疗疾病或病症的常规药物联合存在，所述疾病或病症中MIF是致病因素或其中MIF在该疾病进程中发挥关键或其他作用。在特别优选实施方案中，提供含有一种或多种MIF抑制化合物的药物组合物，包括，但不限于结构(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物，联合使用一种或多种附加的药物化合物，包括，但不限于用于治疗多种癌症，哮喘或其他呼吸疾病，脓毒症，关节炎，炎性肠病(IBD)，或其他炎性疾病，免疫病症，或其他其中MIF是致病性的疾病或病症的化合物。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种非甾类抗炎药物(NSAIDs)或其他用于治疗关节炎或其他炎性疾病的药物化合物联合给药。优选的化合物包括，但不限于，塞来考昔(celecoxib)；罗非考昔(rofecoxib)；NSAIDS，例如，阿司匹林，塞来考昔，胆碱三水杨酸镁，双氯芬酸钾，双氯芬酸钠，二氟尼柳，依托度酸，非诺洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚美辛，酮洛芬，酮咯酸，melenamic acid，萘丁美酮，萘普生，萘普生钠，噁丙嗪，吡罗昔康双，罗非考昔，双水杨酸酯，舒林酸，和托美丁；和皮质甾类，例如，可的松，氢化可的松，甲泼尼松，泼尼松，泼尼松龙，倍他米松，二丙酸倍他米松，布地奈德，地塞米松磷酸钠，氟尼缩松，丙酸氟地松，曲安奈德，倍他米松，氟轻松，氟轻松醋酸酯，二丙酸倍他米松，戊酸倍他米松，地奈德，去羟米松，氟轻松，曲安西龙，曲安奈德，丙酸氯倍他索，和地塞米松。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种β兴奋剂、吸入皮质甾类、抗组胺药、激素或其他用于治疗哮喘、急性呼吸窘迫或其他呼吸疾病的药物化合物联合给药。优选的化合物包括，但不限于，β兴奋剂，例如，常用的支气管扩张药；吸入皮质甾类，例如，倍氯米松，氟地松，曲安西龙，莫米他松，和泼尼松的形式例如泼尼松，泼尼松龙，和甲泼尼松；抗组胺药，例如，阿扎他定，卡比沙明/假麻黄碱，西替立嗪，赛庚啶，右氯苯那敏，非索非那定，氯雷他定，异丙嗪，扑敏宁，溴苯那敏，cholophenir胺，氯马斯汀，苯海拉明；和激素类，例如，肾上腺素。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与治疗IBD的药物化合物以药物组合物的形式联合给药，例如硫唑嘌呤或皮质甾类。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与治疗癌症的药物化合物以药物组合物的形式联合给药，例如紫杉醇。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与免疫抑制化合物以药物组合物的形式给药。在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种治疗自身免疫疾病的药物联合给药，例如，Lyme氏疏螺旋体病，狼疮(例如，系统性红斑狼疮(SLE))，或获得性免疫缺损综合征(AIDS)。所述的药物包括蛋白酶抑制剂，例如，印地那韦(indinavir)，安普那韦(amprenavir)，沙奎那韦，洛品那韦(lopinavir)，利托那韦(ritonavir)，和奈非那韦(nelfinavir)；核苷反转录酶抑制剂，例如，齐多夫定，阿巴韦(abacavir)，拉米夫定(lamivudine)，idanosine，扎西他滨，和斯它夫定(stavudine)；核苷酸反转录酶抑制剂，例如，替诺福韦disoproxil fumarate；非核苷反转录酶抑制剂，例如，delavirdine，依法韦仑，和奈韦拉平；生物反应修饰剂，例如，依那西普，英夫利昔单抗，和其他抑制或感染肿瘤坏死因子的化合物；抗病毒药物，例如，阿米夫定(amivudine)和齐多夫定。
在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与用于治疗脓毒症的药物化合物联合给药，例如甾族化合物或抗感染药。甾族化合物的实例包括皮质甾类，例如，可的松，氢化可的松，甲泼尼松，泼尼松，泼尼松龙，倍他米松，二丙酸倍氯米松，布地奈德，地塞米松磷酸钠，氟尼缩松，丙酸氟地松，曲安奈德，倍他米松，氟轻松，氟轻松醋酸酯，二丙酸倍他米松，戊酸倍他米松，地奈德，去羟米松，氟轻松，曲安西龙，曲安奈德，丙酸氯倍他索，和地塞米松。抗感染药的实例包括驱虫药(甲苯咪唑)，抗生素类包括氨基糖甙类(庆大霉素，新霉素，妥布霉素)，抗真菌抗生素(两性霉素b，氟康唑，灰黄霉素，伊曲康唑，酮康唑，制酶菌素，双氯苯咪唑，托萘酯)，头孢菌素类(头孢克洛，头孢唑啉，头孢噻污，头孢他啶，头孢曲松，头孢呋辛，头孢氨苄)，β-内酰胺抗生素(头孢替坦，美罗匹宁)，氯霉素，大环内酯类(阿齐霉素，甲红霉素，红霉素)，青霉素类(青霉素G钠盐，阿莫西林，氨苄青霉素，双氯西林，萘夫西林，哌拉西林，替卡西林)，四环素类(脱氧土霉素，米诺环素，四环素)，杆菌肽；克林霉素；多粘菌素甲磺酸五钠；硫酸多粘菌素b；万古霉素；抗病毒药物包括无环鸟苷，金刚烷胺，地达诺新，依法韦仑，磷卡萘，丙氧鸟苷，印地那韦(indinavir)，拉米夫定(lamivudine)，奈非那韦，利托那韦，沙奎那韦，斯它夫定(stavudine)，伐昔洛韦，伐甘洛韦(valganciclovir)，齐多夫定；喹诺酮类(环丙沙星，左氟沙星)；磺胺类(磺胺嘧啶，磺胺异噁唑)；砜类(氨苯砜)；呋喃唑酮；甲硝唑；戊双脒；磺胺结晶(sulfanilamidum crystallinium)；加替沙星；和新诺明/甲氧苄啶。
在某些疾病的治疗中，可以有益地用MIF抑制剂联合麻醉药治疗患者，例如，乙醇，布比卡因，氯普鲁卡因，左布比卡因，利多卡因，卡波卡因，普鲁卡因，罗比卡因，丁卡因，去氟烷，异氟烷，氯氨酮，普鲁泊福，七氟醚，可待因，芬太尼，氢吗啡酮，麻卡因，度冷丁，美沙酮，吗啡，羟考酮，雷芬太尼(remifentanil)，舒芬太尼，布托啡诺，纳布啡，曲马多，苯佐卡因，二丁卡因，氯乙烷，塞罗卡因(xylocaine)，和非那吡啶。
实施例
通过实施例1所述方法制备优选实施方案的MIF抑制剂。
实施例1
合成2-苄基氨基烟酸(1)
将苄基胺(14mL，126.8mmol)加入氯烟酸(10g，63.4mmol)在吡啶中的溶液并回流过夜。蒸馏吡啶并将残余物溶解在1N NaOH中。用水稀释溶液，将pH调节至10-11并用二氯甲烷洗涤。用冷10％HCl水溶液中和水相，将pH调节至6-7。过滤形成的固体，用冷水洗涤，真空炉中干燥，生成12.2g(84％)2-苄基氨基烟酸(1)，为白色固体。MP：148℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 4.69(d，J＝3.6Hz，2H)，6.61(dd，J＝4.9，7.7Hz，1H)，7.23(m，1H)，7.29(m，4H)，8.08(dd，J＝1.8，7.0Hz，1H)，8.28(dd，J＝1.8，7.0Hz，1H)，8.47(b r.s，1H)，13.10(s，1H)；EIMS：229(M+1)，251(M+23)。
合成1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)
将氯甲酸三氯甲酯(2.5mL，21mmol)缓慢加入(1)(4g，17.5mmol)在二噁烷中的悬浮液，在氮气气氛下回流8小时。冷却该溶液，真空去除溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷中并用饱和NaHCO3溶液洗涤。通过Na2SO4干燥有机相并蒸发，获得残余物。通过乙醚再结晶残余物，获得3.02g(68％)1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)，为白色固体。MP：168℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 5.35(s，2H)，7.26(m，1H)，7.30(m，2H)，7.39(m，3H)，8.41(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.72(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：277(M+23)。
制备如上所述的2-苄基氨基烟酸(1)和1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)的反应顺序如下所示：
合成1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)
将丙二酸二乙酯(0.6mL，4mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，164mg，4.1mmol)在二甲基乙酰胺(20mL)中的悬浮液，并在室温下在惰性气氛下搅拌0.5小时。向溶液中加入1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)(1g，4mmol)并在110℃加热4小时(TLC对照)。冷却该溶液并倒入冰水中。用冷10％HCl将溶液的pH调节至3。过滤形成的固体，用过量的水洗涤，在真空炉中干燥以生成940mg(72％)1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)，为白色固体。MP：143℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝6.9Hz，3H)，4.31(q，J＝6.9Hz，2H)，5.55(s，2H)，7.23(m，5H)，7.36(m，1H)，8.45(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：325(M+1)，347(M+23)。
合成1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(4)
将1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)(0.94g，2.9mmol)在纯POCl3中在90℃加热3小时。冷却该溶液并且在真空下蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，通过固体NaHCO3中和，用二氯甲烷萃取。连续用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤有机层，通过Na2SO4干燥，蒸发，产生0.9g(98％)1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(4)，为白色固体。MP：109℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.31(t，J＝6.9Hz，3H)，4.37(q，J＝6.9Hz，2H)，5.62(s，2H)，7.27(m，5H)，7.51(dd，J＝4.7，8.0Hz，1H)，8.46(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.80(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：343(M+1)，365(M+23)。
制备如上所述的1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)和1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(4)的反应序列如下所示：
合成1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)
将1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(4)(1.2g，3.5mmol)的二氯甲烷溶液缓慢加入哌嗪(0.9g，10.5mmol)在二氯甲烷中的室温下的搅拌溶液中。室温下搅拌溶液过夜。蒸发溶剂，将残余物悬浮在水中，简短超声，用二氯甲烷萃取。通过水和盐水连续洗涤合并的有机相，通过Na2SO4干燥，蒸发而获得1.12g(82％)1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)，为黄色固体。MP：120℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝6.9Hz，3H)，2.28(m，4H)，3.03(m，4H)，4.28(q，J＝6.9Hz，2H)，5.55(s，2H)，7.16-7.28(m，5H)，7.36(m，1H)，8.25(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.63(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：393(M+1)，415(M+23)。
合成1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，81-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(6)
在惰性气氛下在0℃下将2-噻吩碳酰氯(0.16mL，1.5mmol)加入1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)(392mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液。使得该溶液达到室温，进一步搅拌18小时。将该溶液倒入水中，过滤形成的固体，用水洗涤，干燥，通过乙醚和乙酸乙酯再结晶，获得256mg(51％)1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(6)，为白色固体。MP：168℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝6.9Hz，3H)，3.16(m，4H)，3.88(m，4H)，4.31(q，J＝6.9Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.15(dd，J＝3.5，4.9Hz，1H)，7.20-7.29(m，5H)，7.38(dd，J＝4.6，8.2Hz，1H)，7.97(d，J＝4.9Hz，1H)，8.35(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.66(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：503(M+1)，525(M+23)。分析值C27H26N4O4S(C，H，N)。
制备如上所述的1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)和1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(6)的反应序列如下所述：
合成1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(7)
将环己胺(1.18mL，10.35mmol)加入1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(3)(1-68g，5.17mmol)在二甲苯中的搅拌溶液中，并在140℃加热3小时。冷却该溶液并在真空下蒸发溶剂。将残余物悬浮在水中，通过二氯甲烷萃取。用水和盐水洗涤合并的有机相，然后通过Na2SO4干燥，蒸发，生产1.6g(82％)1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(7)，为白色固体。MP：143℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.22-1.87(m，10H)，3.87(m，1H)，5.62(s，2H)，7.20-7.32(m，5H)，7.43(dd，J＝4.6，8.0Hz，1H)，8.48(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.77(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，10.20(s，1H)；EIMS：378(M+1)。
合成1-苄基-4-氯-2-氧代-12-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(8)
将1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(7)(1.3g，3.44mmol)在纯POCl3中的溶液在90℃加热过夜。冷却该溶液，真空下蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，通过饱和NaHCO3溶液碱化并通过二氯甲烷萃取。通过饱和NaHCO3溶液、水和盐水连续洗涤合并的有机相，通过Na2SO4干燥，并蒸发。通过丙酮将残余物结晶，获得530mg(52％)1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(8)，为白色固体。MP：188℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 5.61(s，2H)，7.21-7.31(m，5H)，7.56(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，8.53(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.86(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)；EIMS：296(M+1)。
制备如上所述的1-苄基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(7)和1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(8)的反应顺序如下所述：
合成1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)
室温下将1-苄基-4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(8)(530mg，1.79mmol)的二氯甲烷溶液缓慢加入搅拌的哌嗪(463mg，5.37mmol)在二氯甲烷中的溶液。将该溶液在室温下进一步搅拌过夜并通过二氯甲烷稀释。连续用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤该溶液，然后通过Na2SO4干燥并蒸发以获得610mg(98％)1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)，为白色固体。MP：211℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d2.93(m，4H)，3.57(m，4H)，5.53(s，2H)，7.20-7.27(m，5H)，7.34(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，8.26(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.65(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)；EIMS：296(M+1).EIMS：346(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(10)
在0℃下将2-噻吩碳酰氯(0.16mL，1.5mmol)加入1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)(345mg，1mmol)在吡啶中的搅拌溶液中。使得该溶液达到室温并在室温下进一步搅拌过夜。将溶液倒入冰水中并过滤形成的固体，用水洗涤，并干燥。通过快速色谱法纯化粗产物，用CH2Cl2中的0-3％MeOH的线性梯度洗脱，获得273mg(45％)1-苄基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(10)，为白色固体。MP：263℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.75(m，4H)，3.94(m，4H)，5.58(s，2H)，7.15(dd，J＝3.5，4.8Hz，1H)，7.19-7.29(m，5H)，7.40(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.52(dd，J＝4.0，5.2Hz，1H)，8.35(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.72(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)；EIMS：456(M+1).分析值C25H21N5O2S(C，H，N)。
制备如上所述的1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)和1-苄基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(10)的反应顺序如下所述：
合成2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸(11)
将对-甲氧基苄基胺(8.24mL，63.5mmol)加入2-氯烟酸(5g，31.7mmol)在吡啶中的溶液并回流过夜。蒸馏吡啶并将残余物溶解在1N NaOH中。用水稀释该溶液，将pH调节至10-11，用二氯甲烷洗涤。用冰冷的10％HCl水溶液中和水相，将pH调节至4-5。过滤形成的固体，用冷水洗涤，真空炉中干燥以生成6.32g(77％)2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸(11)，为白色固体。MP：229℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.72(s，3H)，4.60(d，J＝3.6Hz，2H)，6.40(dd，J＝4.9，7.7Hz，1H)，6.62(d，J＝7.6Hz，2H)，7.25(d，J＝7.6Hz，2H)，8.09(dd，J＝1.8，7.0Hz，1H)，8.26(dd，J＝1.8，7.0Hz，1H)，8.48(br.s，1H)，13.11(s，1H)；EIMS：259(M+1)，281(M+23)。
合成1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(12)
将氯甲酸三氯甲酯(3.36mL，27.8mmol)缓慢加入2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸(11)(6g，23.23mmol)在二噁烷中的悬浮液，在氮气气氛下回流18小时。冷却该溶液，真空去除溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷中并用饱和NaHCO3溶液洗涤。通过Na2SO4干燥有机相，蒸发，获得残余物。通过醚将残余物再结晶，获得4.47g(67％)1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(12)，为白色固体。MP：160℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.71(s，1H)，5.27(s，2H)，6.85(d，J＝7.0Hz，2H)，7.33(m，3H)，8.40(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.75(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：286(M+23)。
制备如上所述的2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸(11)和1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(12)的反应顺序如下所示：
合成4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)
将丙二酸二乙酯(2.37mL，15.61mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，0.62g，15.61mmol)在二甲基乙酰胺(40mL)中的悬浮液中并在室温下在惰性气氛下搅拌0.5小时。向该溶液中加入1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(12)(4.47g，15.61mmol)，并在110℃加热3小时(TLC对照)。冷却该溶液并倒入冰水中。通过冷却的10％HCl将溶液的pH调节至3。过滤形成的固体，用过量水洗涤，真空炉中干燥。通过乙酸乙酯将粗产物再结晶，获得1.2g(21％)4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)，为白色固体。MP：153℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，3.68(s，3H)，4.32(q，J＝7.0Hz，2H)，5.47(s，2H)，6.81(d，J＝7.7Hz，2H)，7.21(d，J＝7.6Hz，2H)，7.36(d，J＝7.6Hz，1H)，8.42(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，13.00(S，1H)；EIMS：355(M+1)。
制备如上所述的4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)的反应顺序如下所示：
合成4-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(14)
将4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)(0.40g，1.13mmol)和三乙胺(393μL，2.82mmol)的溶液在纯POCl3中在90℃下加热3小时。冷却该溶液，真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得400mg(95％)4-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(14)，为白色固体。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.0Hz，3H)，3.62(s，3H)，4.30(q，J＝7.0Hz，2H)，5.47(s，2H)，6.81(d，J＝7.7Hz，2H)，7.21(d，J＝7.6Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，1H)，8.40(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.71(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：373(M+1)。
合成4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(15)
将4-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)(0.40g，1.07mmol)在纯三氟乙酸(TFA)中的溶液回流3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的TFA。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。用水洗涤固体，室温干燥以获得252mg(93％)4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(15)，为白色固体。MP：172℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，4.35(q，J＝6.9Hz，2H)，7.41(dd，J＝4.7，8.0Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，12.90(s，1H)；EIMS：253(M+1)。
上述制备4-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(14)和4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(15)的反应顺序如下所示：
合成2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(16)
在室温下将DABCO(0.57g，5.14mmol)加入4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(15)(0.65g，2.57mmol)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮(0.60g，3.08mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液。将溶液在110℃下加热过夜。冷却溶液并倒入冰水中。过滤形成的固体，用水洗涤，干燥获得420mg(39％)2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(16)，为白色固体。MP：239℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.0Hz，3H)，3.13(m，4H)，3.87(m，4H)，4.30(q，J＝7.0Hz，2H)，7.15(dd，J＝3.5，4.8Hz，1H)，7.40(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.45(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.56(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)12.25(s，1H)；EIMS：413(M+1)。
上述制备2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(16))的反应顺序如下所示：
通过在二氮杂萘部分的N-1位上烷基化制备化合物
通过应用通用方法A或通用方法B制备称为化合物17-28的化合物。
通用方法A
在室温下将固体2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(16)(455mg，1.1mmol)分几份加入NaH(60％在矿物油中，53mg，1.32mmol)在DMF中的搅拌悬浮液中。将溶液进一步在室温下搅拌1小时以获得黄色的澄清溶液。将相应的烷基卤(1.32mmol)加入该溶液并进一步搅拌3小时。将该溶液倒入冰水中并过滤形成的固体，用冷水洗涤并干燥。通过快速色谱法纯化粗产物，用二氯甲烷中0-2％甲醇梯度洗脱，获得标题化合物。
通用方法B
将2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(16)(455mg，1.1mmol)，相应的烷基卤(1.65mmol)和无水碳酸钾(5.5mmol)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液，真空下去除DMF。将残余物悬浮在水中，简短超声，过滤，室温干燥。通过快速色谱法纯化粗产物，用二氯甲烷中0-2％甲醇梯度洗脱，获得标题化合物。
合成1-(4-乙氧基-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(17)
按照通用方法A通过使用4-乙氧基苄基溴(305mg，1.32mmol)制备化合物，获得275mg(45％白色固体。MP；123℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d1.37(t，J＝6.9Hz，3H)，2.19(s，3H)，3.22(m，4H)，3.95(m，4H)，4.40(q，J＝6.9Hz，2H)，5.81(s，2H)，7.10(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(m，1H)，7.22(d，J＝8.0Hz，2H)，7.45(m，1H)，7.47(d，J＝3.2Hz，1H)，7.84(d，J＝4.8Hz，1H)，8.41(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：561(M+1)。分析值(C29H28N4O6S)C，H，N。
合成1-(2-二甲基氨基乙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(18)
按照通用方法B通过使用2-二甲基氨基乙基氯盐酸盐(188mg，1.32mmol)制备化合物，获得223mg(35％)白色固体。MP：134℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.35(t，J＝7.0Hz，3H)，2.20(S，6H)，3.02(m，4H)，3.90(m，4H)，4.30(q，J＝7.0Hz，2H)，4.50(m，2H)，7.15(dd，J＝3.5，4.8Hz，1H)，7.41(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.45(d，J＝3.6Hz，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H)，8.38(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)，8.76(dd，J＝1.5，7.5Hz，1H)；EIMS：484(M+1)。分析值(C24H29N5O4S)C，H，N。
合成1-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(19)
按照通用方法A通过使用甲基碘(82μL，1.32mmol)制备化合物，获得102mg(22％)白色固体。MP 164℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.31(t，J＝6.8Hz，3H)，3.13(m，4H)，3.64(s，3H)，3.88(m，4H)，4.31(q，J＝6.8Hz，2H)，7.15(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.38(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.45(d，J＝3.6Hz，1H)，7.79(d，J＝4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：427(M+1)。分析值(C21H22N4O4S)C，H，N。
合成1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(20)
按照通用方法A通过使用4-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得355mg(62％)白色固体。MP 196℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.24(t，J＝6.8Hz，3H)，3.20(m，4H)，3.90(m，4H)，4.31(q，J＝6.8Hz，2H)，5.57(s，2H)，7.10-7.20(m，3H)，7.30-7.40(m，3H)，7.56(d，J＝3.6Hz，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H)，8.30(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：521(M+1)。分析值(C27H25FN4O4S)C，H，N。
合成2-氧代-1-丙基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(21)
按照通用方法B通过使用1-碘丙烷(129μL，1.32mmol)制备化合物，获得140mg(28％)黄色固体。MP 92-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，1.6(m，2H)，3.13(s，4H)，3.88(s，4H)，4.3(m，4H)，7.1(m，1H)，7.4(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 455(M+H)。
合成1-丁基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(22)
按照通用方法B通过使用碘丁烷(151μL，1.32mmol)制备化合物，获得200mg(39％)黄色固体。MP 90-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.92(t，J＝7.2Hz，3H)，1.3(m，5H)，1.6(m，2H)，3.13(s，4H)，3.88(s，4H)，4.32(m，4H)，7.15(m，1H)，7.38(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6，1H)，7.79(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 469(M+H)。
合成1-烯丙基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(23)
按照通用方法B通过使用烯丙基碘(134μL，1.32mmol)制备化合物，获得170mg(34％)黄色固体。MP 89-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(s，4H)，3.89(s，4H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.0(m，4H)，5.9(m，1H)，7.15(m，1H)，7.39(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.46(dd，J＝0.8，3.6Hz)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.68(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 453(M+H)。
合成1-(2-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(24)
按照通用方法B通过使用2-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得170mg(30％)黄色固体。MP 105-110℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.19(s，4H)，3.91(s，4H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，5.60(s，2H)，6.81(m，1H)，7.04(m，1H)，7.2(m，3H)，7.39(m，1H)，7.46(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.38(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.63(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 521(M+H)。
合成1-(3-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(25)
按照通用方法B通过使用3-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得190mg(33％)黄色固体。MP 105-110℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d1.29(t，J＝6.8Hz，3H)，3.18(s，4H)，3.89(s，4H)，4.31(q，J＝6.8Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.1(m，4H)，7.4(m，3H)，7.79(d，J＝4.4Hz，1H)，8.36(d，J＝7.6Hz，1H)，8.67(d，J＝3.2Hz，1H)；EIMS m/z 521(M+H)。
合成1-(3-二甲基氨基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(26)
按照通用方法B通过使用β-二甲基氨基丙基盐酸盐(209mg，1.32mmol)制备化合物，获得110mg(20％)黄色固体。MP 84-94℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，1.7(m，2H)，2.14(s，6H)，2.30(t，J＝6.8Hz，2H)，3.13(b，4H)，3.88(b，4H)，4.3(m，4H)，7.2(m，1H)，7.3(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 498(M+H)。
合成2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(27)
按照通用方法B通过使用2-溴苯乙酮(262μL，1.32mmol)制备化合物，获得58mg(10％)红色固体。MP 115℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.21(s，4H)，3.92(s，4H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.89(s，2H)，7.16(t，J＝4.4Hz，1H)，7.4(m，1H)，7.47(d，J＝3.2Hz，1H)，7.61(t，J＝7.6Hz，2H)，7.74(t，J＝7.2Hz，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，8.12(d，J＝7.6Hz，2H)，8.38(d，J＝8.0Hz，1H)，8.56(d，J＝4.8Hz，1H)；EIMS m/z 531(M+1)。
合成4-羟基-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(29)
将环己胺(1.18mL，10.35mmol)加入4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(13)(1.80g，5.17mmol)在二甲苯中搅拌的溶液中并在140℃下加热3小时。冷却溶液，真空蒸发溶剂。将残余物悬浮在水中，通过二氯甲烷萃取。用水和盐水洗涤合并的有机相，然后通过Na2SO4干燥并蒸发，以获得1.68g(82％)4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(29)，为白色固体。MP：149℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.2-1.4(m，5H)，1.55(m，1H)，1.70(m，2H)，1.90(m，2H)，3.69(s，3H)，3.86(m，1H)，5.54(s，2H)，6.81(d，J＝8.8Hz，2H)，7.20(d，J＝8.8Hz，2H)，7.43(m，1H)，8.47(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.79(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)，10.22(d，J＝7.2Hz，1H)；EIMS m/z 408(M+1)。
合成2，4-二氯-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(30)
将4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(29)在纯POCl3中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液，真空下蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，通过饱和NaHCO3溶液碱化，用二氯甲烷萃取。连续用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤合并的有机相，通过Na2SO4干燥并蒸发。通过丙酮将残余物结晶，获得624mg(81％)2，4-二氯-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(30)，为棕色固体。MP：231；1H-NMR(DMSO-d6)：d 7.95(m，1H)，8.78(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，9.33(dd，J＝2.0，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 224(M+1)。
上述制备4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(29)和2，4-二氯-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(30)的反应顺序如下所示：
合成4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(31)
在室温下将乙酸铵(6.81g，88.37mmol)加入2，4-二氯-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(30)在乙酸中的悬浮液并在140℃加热45分钟。冷却溶液并倒入冰水中。过滤形成的固体，用冰水洗涤并悬浮在饱和碳酸氢钠溶液中。在室温搅拌过夜后，过滤固体，用冰水洗涤，室温下真空干燥，获得8.0g(48％)4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(31)，为白色固体。MP：310℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 7.58(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，8.50(d，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.83(dd，J＝4.4，1.6Hz，1H)，13.03(S，1H)；EIMS：206(M+1)。
备选方法
将1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-1，2-二氢-2-氧代-1，8-二氮杂萘-3-腈(32)(326mg，1mmol)在TFA中的溶液回流24小时。冷却溶液，在减压下蒸馏过量的TFA。将残余物放入水中，通过固体NaHCO3碱化，过滤。用过量的水洗涤固体并干燥，获得197mg(95％)4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(31)，为白色固体。MP；310℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 7.58(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，8.50(d，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.83(dd，J＝4.4，1.6Hz，1H)，13.03(s，1H)；EIMS：206(M+1)。
合成1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-1，2-二氢-2-氧代-1，8-二氮杂萘-3-腈(32)
将4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(29)(1.22g，3mmol)和三乙基胺(1.04mL，7.5mmol)的溶液在纯POCl3中在90℃下加热过夜。冷却溶液，真空下蒸馏过量的POCl3。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相并蒸发，获得0.83g(85％)，1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-1，2-二氢-2-氧代-1，8-二氮杂萘-3-腈(32)，为棕色固体。MP 195℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.69(s，3H)，5.42(s，2H)，6.83(d，J＝8.8Hz，2H)，7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，7.55(m，1H)，8.50(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.88(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 326(M+1)。
上述制备4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(31)和1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-1，2-二氢-2-氧代-1，8-二氮杂萘-3-腈(32)的反应顺序如下所示：
合成2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(33)
在室温下将1，4-二氮杂二环[2.2.2]-辛烷(8.60g，77mmol)加入4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(31)(7.9g，38mmol)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮(11.30g，57mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液。将溶液在110℃下加热过夜。冷却溶液并倒入冰冷的10％NH4Cl溶液。过滤形成的固体，用冷水洗涤，真空室温下干燥，获得7.1g(51％)2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(33)，为白色固体。MP 320℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.69(m，4H)，3.90(m，4H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.30(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.49(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.20(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.60(d，J＝3.2Hz，1H)，12.20(S，1H)；EIMS：366(M+1)。
上述制备2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(33)的反应顺序如下所示：
通过在二氮杂萘部分的N-1位上烷基化制备化合物
通过应用上述通用方法A或通用方法B，由2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(33)(400mg，1.1mmol)和相应的烷基卤制备称为化合物34-48的化合物。
合成1-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(34)
按照通用方法A，通过使用甲基碘(82μL，1.32mmol)制备化合物，获得221mg(53％)白色固体。MP 266℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.62(s，3H)，3.69(m，4H)，3.91(m，4H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.48(d，J＝4.4Hz，1H)，7.79(d，J＝4.8Hz，1H)，8.29(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.74(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：380(M+1)。分析值(C19H17N5O2S)C，H，N。
合成2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-乙烯基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(35)
按照通用方法A，通过使用烯丙基碘(121μL，1.32mmol)制备化合物，获得283mg(63％)白色固体。MP 228℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.71(m，4H)，3.92(m，4H)，4.94(d，J＝5.2Hz，2H)，5.02(dd，J＝1.2，10.4Hz，1H)，5.08(dd，J＝1.2，10.4Hz，1H)，5.92(m，1H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.49(d，J＝3.6Hz，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H)，8.32(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.71(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：405(M+1)。分析值(C21H19N5O2S)C，H，N。
合成1-丁基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(36)
按照通用方法A，通过使用碘丁烷(151μL，1.32mmol)制备化合物，获得296mg(64％)白色固体。MP 143℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，1.32(m，2H)，1.59(m，2H)，3.67(m，4H)，3.90(m，4H)，4.34(t，J＝7.6Hz，2H)，7.16(dd，J＝4.4，5.2Hz，1H)，7.36(dd，J＝4.8，8.2Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.2Hz，1H)，8.32(dd，J＝2.0，8.2Hz，1H)，8.71(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：422(M+1)。分析值(C22H23N5O2S)C，H，N。
合成1-(3-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(37)
按照通用方法A通过使用3-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得262mg(50％)白色固体。MP 231℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.93(m，4H)，5.55(s，2H)，7.06(m，3H)，7.17(m，1H)，7.30(m，2H)，7.49(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，8.33(d，J＝8.0Hz，1H)，8.68(d，J＝4.4Hz，1H)；EIMS：474(M+1).分析值(C25H20FN5O2S)C，H，N。
合成2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(38)
按照通用方法A通过使用2-溴苯乙酮(262mg，1.32mmol)制备化合物，获得113mg(21％)白色固体。MP 269℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.78(m，4H)，3.94(m，4H)，5.88(s，2H)，7.17(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.59(m，2H)，7.74(m，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.2Hz，1H)，8.12(d，J＝7.6Hz，1H)，8.39(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，8.59(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：484(M+1)。分析值(C26H21N5O3S)C，H，N。
合成1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(39)
按照通用方法A通过使用4-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得361mg(69％)白色固体。MP 271℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d3.72(m，4H)，3.92(m，4H)，5.52(s，2H)，7.10(m，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.33-7.39(m，3H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.33(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：474(M+1)。分析值(C25H20FN5O2S)C，H，N。
合成1-(2-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(40)
按照通用方法A通过使用2-氟苄基溴(162μL，1.32mmol)制备化合物，获得370mg(71％)白色固体。MP 286℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.74(m，4H)，3.92(m，4H)，5.58(s，2H)，6.89(m，1H)，7.03(m，1H)，7.16-7.26(m，3H)，7.37(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.50(dd，J＝1.2，4.0Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.65(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：474(M+1)。分析值(C25H20FN5O2S)C，H，N。
合成乙酸-2-{3-氰基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-1-基}-乙酯(41)
按照通用方法A通过使用α-溴乙酸乙酯(145μL，1.32mmol)制备化合物，获得326mg(65％)白色固体。MP 189℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.88(s，3H)，3.70(m，4H)，3.92(m，4H)，4.30(t，J＝5.6Hz，2H)，4.60(t，J＝5.6Hz，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.2Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.33(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.72(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：452(M+1).分析值(C22H21N5O4S)C，H，N。
合成2-氧代-1-丙基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(42)
按照通用方法A通过使用1-碘丙烷(129μL，1.32mmol)制备化合物，获得234mg(52％)白色固体。MP 196℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 0.90(t，J＝7.6Hz，3H)，1.64(m，2H)，3.67(m，4H)，3.91(m，4H)，4.28(m，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.36(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.48(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.2Hz，1H)，8.29(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：408(M+1)。分析值(C21H21N5O2S)C，H，N。
合成1-(2，2-二甲基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(43)
按照通用方法A通过使用新戊基碘(175μL，1.32mmol)制备化合物，获得223mg(46％)白色固体。MP 232℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 0.89(s，9H)，3.70(m，4H)，3.92(m，4H)，4.35(s，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.34(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，4.0Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.2Hz，1H)，8.29(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：436(M+1)。分析值(C23H25N5O2S)C，H，N。
合成1-(4-氰基-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(44)
按照通用方法B通过使用α-溴-对苄基腈(259mg，1.32mmol)制备化合物，获得353mg(66％)白色固体。MP 241℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.91(m，4H)，5.61(s，2H)，7.10(m，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.44(m，2H)，7.50(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.74(m，2H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.65(d，J＝4.0Hz，1H)；EIMS：481(M+1)。分析值(C26H20N6O2S)C，H，N。
合成1-环己基-2-氧代-4-[(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(45)
按照通用方法B通过使用溴甲基环己烷(183μL，1.32mmol)制备化合物，获得243mg(48％)白色固体。MP 192℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d1.05-1.13(m，5H)，1.53-1.65(m，5H)，2.80(m，1H)，3.69(m，4H)，3.91(m，4H)，4.21(d，J＝7.6Hz，2H)，7.16(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.34(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.48(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.28(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.72(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS：462(M+1)。分析值(C25H27N5O2S)C，H，N。
合成{3-氰基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-1-基}-乙酸乙酯(46)
按照通用方法B通过使用溴乙酸乙酯(146μL，1.32mmol)制备化合物，获得267mg(54％)白色固体。MP 236℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.19(t，J＝7.2Hz，3H)，3.76(m，4H)，3.92(m，4H)，4.12(q，J＝7.2Hz，2H)，5.07(s，2H)，7.16(dd，J＝4.0，5.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.68(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：452(M+1)。分析值(C22H21N5O4S)C，H，N。
合成1-(3-二甲基氨基-丙基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(47)
按照通用方法B通过使用β-二甲基氨基丙基盐酸盐(209mg，1.32mmol)制备化合物，获得194mg(39％)白色固体。MP176℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.73(m，2H)，2.11(s，6H)，2.29(m，2H)，3.68(m，4H)，3.91(m，4H)，4.34(t，J＝7.6Hz，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.35(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.48(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.31(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.74(dd，J＝1.2，4.4Hz，1H)；EIMS：451(M+1)。分析值(C23H26N6O2S)C，H，N。
合成1-环丙基甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(48)
按照通用方法B通过使用溴甲基环丙烷(128μL，1.32mmol)制备化合物，获得278mg(60％)白色固体。MP 189℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 0.42(m，4H)，1.28(m，1H)，3.70(m，4H)，3.90(m，4H)，4.23(d，J＝7.2Hz，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.37(dd，J＝4.4，8.0Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.32(dd，J＝1.6，8.0，Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：420(M+1)。分析值(C22H21N5O2S)C，H，N。
通过在二氮杂萘部分上取代的哌嗪的酰化制备化合物
通过应用通用方法C或通用方法D，由1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)制备称为49-55的化合物。
通用方法C
在0℃下在氩气下将相应的酰基氯(1.5mmol)加入搅拌的1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)(392mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的溶液。使得溶液达到室温并进一步搅拌过夜。将溶液倒入冰水中，过滤形成的固体。用过量水洗涤固体，干燥，通过快速色谱法纯化，用CH2Cl2中0-2％MeOH梯度洗脱。
通用方法D
室温下将草酰氯(2mmol)和DMF(2滴)连续加入搅拌的相应的酸(1.5mmol)在CH2Cl2中的溶液，然后在氩气气氛下进一步搅拌2小时。室温下真空去除溶剂，获得相应的酰基氯。在氩气气氛下将1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(5)(392mg，1mmol)在无水吡啶(5mL)中的溶液加入残余物，简短超声。室温下在氩气气氛下搅拌溶液过夜。将溶液倒入冰水中并过滤形成的固体。用过量的水洗涤固体，干燥，通过快速色谱法纯化，用CH2Cl2中0-2％MeOH梯度洗脱。
合成1-苄基-4-(4-环戊烷羰基-哌嗪-1-基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(49)
按照通用方法C制备化合物。白色固体，产率64％，mp 170℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝6.8Hz，3H)，1.6(m，8H)，3.05(m，5H)，3.74(m，4H)，4.29(q，J＝7.2Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.25(m，5H)，7.38(m，1H)，8.34(dd，J＝1.6，7.6Hz，1H)，8.67(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 489(M+1)。
合成4-(4-苯甲酰基-哌嗪-1-基)-1-苄基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(50)
按照通用方法C制备化合物。白色固体，产率90％，mp 220℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝6.8Hz，3H)，3.1(m，4H)，3.5-4.0(m，4H)，4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.23(m，5H)，7.40(m，6H)，8.33(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，8.66(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS m/z497(M+1)。
合成1-苄基-4-[4-(4-氯-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(51)
按照通用方法C制备化合物。白色固体，产率，86％，mp 110-115℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.1(m，4H)，3.5-4.0(m，4H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.25(m，5H)，7.38(m，1H)，7.46(d，J＝6.4Hz，2H)，7.54(d，J＝6.4Hz，2H)，8.33(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.66(J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 531(M+1)。
合成1-苄基-4-基-4-[4-(6-氯-吡啶-3-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(52)
按照通用方法C制备化合物。黄色固体，产率89％，mp 125-130℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝6.8Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.5-4.0(m，4H)，4.31(q，J＝6.8Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.27(m，5H)，7.38(m，1H)，7.65(d，J＝6.8Hz，1H)，7.96(dd，J＝2.4，8.0Hz，1H)，8.33(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.52(d，J＝2.0Hz，1H)，8.67(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMSm/z 532(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(吡啶-4-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(53)
按照通用方法C制备化合物。黄色固体，产率32％，mp 130-135℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.08(b，2H)，3.20(b，2H)，3.50(b，2H)，3.90(b，2H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.25(m，5H)，7.36(m，1H)，7.40(d，J＝5.6Hz，2H)，8.32(d，J＝7.2Hz，1H)，8.66(d，J＝3.2Hz，1H)，8.70(d，J＝5.2Hz，2H)；EIMS m/z 498(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(吡啶-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(54)
按照通用方法C制备化合物。黄色固体，产率23％，mp 112-117℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.12(b，2H)，3.20(b，2H)，3.66(b，2H)，3.91(b，2H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.26(m，5H)，7.37(m，1H)，7.51(m，1H)，7.63(d，J＝8.0Hz，1H)，7.96(t，J＝7.6Hz，1H)，8.61(d，J＝4.0Hz，1H)，8.66(d，J＝3.6Hz，1H)；EIMS m/z 498(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(噻吩-3-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(55)
按照通用方法D制备化合物。白色固体，产率68％，mp 115℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.14(b，4H)，3.75(b，4H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.25(m，6H)，7.37(m，1H)，7.65(m，1H)，7.85(dd，J＝1.2，2.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.67(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 503(M+1)。
通过将二氮杂萘腈部分上取代的哌嗪酰化来制备化合物
通过应用上述通用方法C或通用方法D，由1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)制备称为56-64的化合物。
合成1-苄基-4-(4-环戊烷羰基-哌嗪-1-基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(56)
按照通用方法C制备化合物。棕色固体，产率64％，mp 197℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.7(m，8H)，3.07(m，1H)，3.70(m，8H)，5.55(s，2H)，7.23(m，5H)，7.37(m，1H)，8.31(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 442(M+1)。
合成4-(4-苯甲酰基-哌嗪-1-基)-1-苄基-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(57)
按照通用方法C制备化合物。白色固体，产率71％，mp 287℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.7(m，8H)，5.55(s，2H)，7.23(m，5H)，7.35(m，1H)，7.49(m，5H)，8.31(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 450(M+1)。
合成1-苄基-4-[4-(4-氯-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(58)
按照通用方法C制备化合物。黄色固体，产率75％，mp 298℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.7(m，8H)，5.55(s，2H)，7.25(m，5H)，7.36(m，1H)，7.55(m，4H)，8.30(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 484(M+1)。
合成1-苄基-4-[4-(6-氯-吡啶-3-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(59)
按照通用方法C制备化合物。白色固体，产率89％，mp 250℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.75(m，8H)，5.55(s，2H)，7.25(m，5H)，7.37(m，1H)，7.65(d，J＝8.4Hz，1H)，8.00(dd，J＝2.4，8.0Hz，1H)，8.30(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.56(dd，J＝0.4，2.4Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.2，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 485(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(吡啶-4-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(60)
按照通用方法C制备化合物。棕色固体，产率，93％，mp 275℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.55(b，2H)，3.65(b，2H)，3.76(b，2H)，3.92(b，2H)，5.55(s，2H)，7.25(m，5H)，7.36(m，1H)，7.48(d，J＝6.0Hz，2H)，8.29(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(m，3H)；EIMS m/z 451(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(吡啶-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(61)
按照通用方法C制备化合物。棕色固体，产率47％，mp 256℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.70(m，6H)，3.94(m，2H)，5.55(s，2H)，7.25(m，5H)，7.36(m，1H)，7.52(m，1H)，7.68(m，1H)，7.97(m，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.64(m，1H)，8.69(m，1H)；EIMS m/z 451(M+1)。
合成1-苄基-2-氧代-4-[4-(噻吩-3-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(62)
按照通用方法D制备化合物。棕色固体，产率96％，mp 257℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.75(m，8H)，5.55(s，2H)，7.25(m，6H)，7.35(m，1H)，7.65(m，1H)，7.88(dd，J＝1.2，2.8Hz，1H)，8.31(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 456(M+1)。
合成1-苄基-4-[4-(5-氟-噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(63)
按照通用方法D制备化合物。白色固体，产率80％，mp 226℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.93(m，4H)，5.55(s，2H)，6.82(d，J＝4.4Hz，1H)，7.25-7.31(m，6H)，7.37(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H)，8.33(d，J＝8.0Hz，1H)，8.69(d，J＝4.4Hz，1H)；EIMS m/z 474(M+1)。分析值(C25H20FN5O2S)C，H，N。
合成1-苄基-4-[4-(5-氯-噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(64)
按照通用方法D制备化合物。白色固体，产率77％，mp 249℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.92(m，4H)，5.55(s，2H)，7.21-7.29(m，6H)，7.36(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.41(d，J＝4.0Hz，1H)，8.33(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 490(M+1)。分析值(C25H20ClN5O2S)C，H，N。
合成2，6-二氯-5-氟-烟酸乙酯(65)
将2，6-二氯-5-氟烟酸(43g，205mmol)在亚硫酰氯(200mL)和甲苯(200mL)中的悬浮液回流3小时，获得澄清溶液。冷却溶液，真空蒸发溶剂。在冰浴中冷却残余物，缓慢加入冷无水乙醇。在0℃搅拌15分钟后，将溶液在氩气下回流30分钟。冷却溶液，真空去除溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得48.5g(99％)2，6-二氯-5-氟-烟酸乙酯(65)，为无色粘状油。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.32(t，J＝7.2Hz，3H)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H)，8.46(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS m/z 238(M)。
合成2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯(66)
将乙硫醇(15.08mL，204mmol)缓慢加入搅拌的NaH(在矿物油中60％，8.15g，204mmol)在THF中的悬浮液中，室温下搅拌30分钟，获得白色粘稠悬浮液。该悬浮液用冷THF稀释，冷却至0℃，在-20℃下在氩气下转移到已经冷却的2，6-二氯-5-氟-烟酸乙酯(65)(48.5g，204mmol)在THF中的溶液，保持温度低于-10℃。将溶液在-20℃搅拌15分钟，使得缓慢达到室温。将溶液倒入水中，用乙酸乙酯萃取。通过MgSO4干燥有机层，减压浓缩，获得53g(98％)2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯(66)，为棕色液体。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.33(m，6H)，3.19(q，J＝7.2Hz，2H)，4.33(q，J＝7.2Hz，2H)，8.10(d，J＝9.6Hz，1H)；EIMS m/z 264(M+1)。
合成6-乙硫基-5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(67)
将2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯(66)(53g，201mmol)在无水乙醇中的溶液用氩气冲洗并在室温下加入对-甲氧基苄基胺(52.5mL，402mmol)。将溶液在氩气下回流过夜。冷却溶液，减压蒸发溶剂。将残余物吸收在二氯甲烷中，简短超声，滤去不溶性固体。用水洗涤滤液，通过MgSO4干燥并浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，用己烷∶CH2Cl2(1∶1)洗脱，获得47g(64％)6-乙硫基-5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(67)，为粘性油，在室温真空下保持数天后将其固化成白色固体。Mp 59℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.18(t，J＝7.2Hz，3H)，1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.08(q，J＝7.2Hz，2H)，3.71(s，3H)，4.26(q，J＝7.2Hz，2H)，4.62(d，J＝5.6Hz，2H)，6.87(m，2H)，7.24(m，2H)，7.71(d，J＝10Hz，1H)，8.32(m，1H)；EIMS m/z 365(M+1)。
制备上述2，6-二氯-5-氟-烟酸乙酯(65)，2-氯-6-乙硫基-5-氟-烟酸乙酯(66)和6-乙硫基-5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(67)的反应顺序如下所示：
合成5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(68)
将新活化的阮内镍(50g)加入6-乙硫基-5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(67)(31g，85mmol)在无水乙醇中的溶液并回流48小时。冷却溶液，滤过硅藻土。减压蒸发滤液，获得24g(93％)5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(68)，为粘性油，在室温下真空保持数天后固化为白色固体。Mp 90℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.71(s，3H)，4.29(q，J＝7.2Hz，2H)，4.55(d，J＝5.6Hz，2H)，6.87(m，2H)，7.26(m，2H)，7.96(dd，J＝3.2，8.8Hz，1H)，8.12(m，1H)，8.35(d，J＝3.2Hz，1H)；EIMS m/z 305(M+1)。
合成6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(69)
将氯甲酸三氯甲酯(11.41mL，94.63mmol)缓慢加入5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(68)(24g，78.86mmol)在二噁烷中的溶液，并在氮气气氛下回流4小时。冷却该溶液，真空去除溶剂。通过乙醚再结晶残余物，获得21.5g(90％)6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(69)，为白色固体。MP：143℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.71(s，3H)，5.27(s，2H)，6.85(m，2H)，7.35(m，2H)，8.40(dd，J＝2.8，6.8Hz，1H)，8.82(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：303(M+1)。
制备上述5-氟-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸乙酯(68)，6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(69)的反应顺序如下所示：
合成5-氯-2-羟基-烟酸(70)
将次氯酸钠(14％可用氯，35mL，82.21mmol)溶液加入搅拌的2-羟基烟酸(7g，50.3mmol)在10％NaOH水溶液中的溶液。将溶液在室温下搅拌48小时。加入亚硫酸钠(3.150g，25mmol)的水溶液并进一步在室温下搅拌30分钟。用冷水稀释溶液，用冷的稀HCl将pH调节至2。过滤形成的固体，用冷水洗涤，干燥获得6.8g(78％)5-氯-2-羟基-烟酸(70)，为白色固体。MP：276℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 8.23(d，J＝2.8Hz，1H)，8.29(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：174(M+1)。
合成2，5-二氯-烟酸甲酯(71)
将5-氯-2-羟基-烟酸(70)(6g，3.46mmol)在亚硫酰氯(200mL)和DMF(1mL)中的悬浮液回流3小时，获得澄清溶液。冷却溶液，真空蒸发过量的亚硫酰氯。将残余物在冰浴中冷却，缓慢加入冷的无水甲醇。在0℃下搅拌15分钟后，将溶液在氩气下回流1小时。冷却溶液，在真空下去除溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中并连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得4.3g(60％)2，5-二氯-烟酸甲酯(71)，为无色粘状油。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.88(s，3H)，8.39(d，J＝2.8Hz，1H)，8.70(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS m/z 206(M)。
制备上述5-氯-2-羟基-烟酸(70)和2，5-二氯-烟酸甲酯(71)的反应顺序如下所示：
合成5-氯-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸甲酯(72)
将2，5-二氯-烟酸甲酯(71)(25g，121mmol)在无水甲醇中的溶液用氩气冲洗，室温下加入对-甲氧基苄基胺(34.5mL，266mmol)。将溶液在氩气下回流过夜。冷却溶液并在减压下蒸发溶剂。将残余物吸收在二氯甲烷中，简短超声，滤去不溶性固体。用水洗涤滤液，通过MgSO4干燥并浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，用己烷∶CH2Cl2(1∶1)洗脱，获得16.2g(44％)5-氯-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸甲酯(72)，为白色固体。Mp 94℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.71(s，3H)，3.82(s，3H)，4.59(d，J＝5.6Hz，2H)，6.87(m，2H)，7.24(m，2H)，8.06(d，J＝2.8Hz，1H)，8.27(m，1H)，8.32(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS m/z 307(M+1)。
合成6-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(73)
将氯甲酸三氯甲酯(5.40mL，44.82mmol)缓慢加入5-氯-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸甲酯(72)(12.5g，40.75mmol)的二噁烷溶液并在氩气气氛下回流4小时。冷却溶液，真空去除溶剂。通过乙醚再结晶残余物，获得11.80g(91％)6-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(73)，为白色固体。MP：173℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.71(s，3H)，5.25(s，2H)，6.85(m，2H)，7.33(m，2H)，8.49(d，J＝2.8Hz，1H)，8.82(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：319(M+1)。
制备上述5-氯-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-烟酸甲酯(72)，6-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(73)的反应顺序如下所示：
合成6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(74)
将丙二酸二乙酯(10.79mL，71.38mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，3.13g，78.24mmol)在二甲基乙酰胺(200mL)中的悬浮液，在室温下在惰性气氛下搅拌0.5小时。将6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并-[2，3-d]-[1，3]-噁嗪-2，4-二酮(69)(21.5g，71.31mmol)加入溶液并在110℃下加热4小时(TLC对照)。冷却溶液，倒入冰水中。通过冷的10％HCl将溶液的pH调节至3。过滤形成的固体，用过量的水洗涤，真空炉中干燥，获得26.01g(98％)6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(74)，为浅黄色固体。MP：163℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，3.68(s，3H)，4.27(q，J＝7.0Hz，2H)，5.43(s，2H)，6.81(m，Hz，2H)，7.19(m，2H)，8.26(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，8.74(d，J＝2.8Hz，1H)，13.00(br.S，1H)；EIMS：373(M+1)。
合成6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(75)
将丙二酸二乙酯(6.02mL，71.38mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，3.13g，78.24mmol)在二甲基乙酰胺(200mL)中的悬浮液，在氩气气氛下在室温下搅拌0.5小时。将6-氯-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-吡啶并-[2，3-d]-[1，3]-噁嗪-2，4-二酮(73)(21.5g，71.31mmol)加入溶液并在110℃加热4小时(TLC对照)。冷却该溶液并倒入冰水中。用冷的10％HCl将溶液的pH调节至3。过滤形成的固体，用过量的水洗涤，真空炉中干燥，获得14.0g(99％)6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(75)，为白色固体。MP：198℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.68(s，3H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，5.43(s，2H)，6.81(m，Hz，2H)，7.20(m，2H)，8.43(d，J＝2.8Hz，1H)，8.74(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：389(M+1)。
制备上述6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(74)和6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(75)的反应顺序如下所示：
69R＝F 74R＝F
73R＝Cl 75R＝Cl
合成4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(76)
将6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(74)(7.0g，18.79mmol)和三乙基胺(5.2mL，37.58mmol)的溶液在纯POCl3中90℃加热3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得6.2g(85％)4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(76)，为黄色蜡状固体。1H-NMR(DMSO-d6)：d1.31(t，J＝7.2Hz，3H)，3.70(s，3H)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H)，5.51(s，2H)，6.84(m，2H)，7.24(m，2H)，8.37(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，8.82(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：391(M+1)。
合成4，6-二氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(77)
将6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(75)(6.0g，15.43mmol)和三乙基胺(5.36mL，38.57mmol)的溶液在纯POCl3中90℃加热3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得6.2g(85％)4，6-二氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(77)，为黄色蜡状固体。1H-NMR(DMSO-d6)：d1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.69(s，3H)，4.38(q，J＝7.2Hz，2H)，5.50(s，2H)，6.82(m，2H)，7.24(m，2H)，8.48(d，J＝2.4Hz，1H)，8.87(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：407(M)。
合成4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)
将4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(76)(6.0g，15.35mmol)在纯TFA中的溶液回流3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的TFA。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。用水洗涤固体，室温干燥获得4.1g(98％)4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)，为白色固体。MP：217℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，4.35(q，J＝7.2Hz，2H)，8.24(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，8.75(d，J＝2.8Hz，1H)，13.00(s，1H)；EIMS：271(M+1)。
合成4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)
将4，6-二氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(77)(6.0g，14.73mmol)在纯TFA中的溶液回流3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的TFA。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。用水洗涤固体，室温干燥获得4.2g(99％)4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)，为白色固体。MP：228℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H)，8.38(d，J＝2.4Hz，1H)，8.75(d，J＝2.4Hz，1H)，13.10(s，1H)；EIMS：287(M)。
制备上述4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(76)，4，6-二氯-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(77)，4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)和4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)的反应顺序如下所示：
74R＝F 76R＝F 78R＝F
75R＝Cl 77R＝Cl 79R＝Cl
通过取代的哌嗪衍生物胺化4-氯-二氮杂萘部分
按照通用方法E，通过与相应的哌嗪衍生物反应，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)或4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)制备称为80-82的化合物。
通用方法E
在室温下将DABCO(2mol当量)加入4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)或4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)(1mol.当量)和相应的哌嗪衍生物(1.2mol.当量)在二甲基乙酰胺中的溶液。将溶液在110℃下加热3小时。冷却溶液并倒入冰水中。过滤形成的固体，用水洗涤，干燥获得相应的产物。
合成6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)
按照通用方法E，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮制备该化合物。产率3.16g(66％)，MP 124-133℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.26(t，J＝7.2Hz，3H)，3.11(m，4H)，3.88(m，4H)，4.28(q，J＝7.2Hz，2H)，7.15(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.79(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.05(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，8.63(d，J＝2.8Hz，1H)12.40(s，1H)；EIMS：431(M+1)。
合成6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)
按照通用方法E，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(78)和2-糠酰哌嗪制备该化合物。产率3.11g(74％)，MP 207℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝6.8Hz，3H)，3.11(m，4H)，3.90(m，4H)，4.29(q，J＝6.8Hz，2H)，6.65(dd，J＝2.0，3.6，Hz，1H)，7.04(d，J＝3.6Hz，1H)，7.87(d，J＝1.6Hz，1H)，8.06(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，8.63(d，J＝2.8Hz，1H)12.40(s，1H)；EIMS：415(M+1)。
合成6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[L8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)
按照通用方法E，由4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(79)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮制备该化合物。产率6.4g(73％)，MP242℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.12(m，4H)，3.87(m，4H)，4.28(q，J＝7.2Hz，2H)，7.15(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.46(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.17(d，J＝2.4Hz，1H)，8.61(d，J＝2.8Hz，1H)12.40(s，1H)；EIMS：447(M)。
制备上述6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)，6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)和6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)的反应顺序如下所示：
78R＝F 80R＝F， X＝S
79R＝Cl 81R＝F， X＝O
82R＝Cl，X＝S
通过在6-取代的二氮杂萘部分的N-1位上烷基化制备化合物
通过应用通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)，或6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)或6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)和相应的烷基卤制备称为化合物83-91的化合物。
合成1-苄基-6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(83)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)和苄基溴制备该化合物。产率152mg(21％)，MP 130℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.90(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.55(s，2H)，7.14-7.30(m，6H)，7.45(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.16(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.74(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：521(M+1)。分析值(C27H25FN4O4S)C，H，N。
合成6-氟-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(84)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率113mg(8％)，MP 113℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.90(m，4H)，4.33(q，J＝7.2Hz，2H)，5.55(s，2H)，7.08(m，3H)，7.15(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.34(m，1H)，7.46(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.17(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.74(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：539(M+1)。分析值(C27H24F2N4O4S)C，H，N。
合成6-氟-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(85)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(80)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率293mg(38％)，MP 262℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.19(m，4H)，3.92(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.88(s，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.72(m，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H)，8.11(m，2H)，8.18(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.65(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：549(M+1)。分析值(C28H25FN4O5S)C，H，N。
合成1-苄基-6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(86)
按照通用方法B，由6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)和苄基溴制备该化合物。产率391mg(47％)，MP 119℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.92(m，4H)，4.29(q，J＝7.2Hz，2H)，5.54(s，2H)，6.65(dd，J＝1.6，3.2，Hz，1H)，7.05(d，J＝3.6Hz，1H)，7.20(m，5H)，7.87(d，J＝3.2Hz，1H)，8.18(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.74(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：505(M+1)。分析值(C27H25FN4O5)C，H，N。
合成6-氟-1-(3-氟苄基)-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(87)
按照通用方法B，由6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率421mg(49％)，MP 121℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.92(m，4H)，4.29(q，J＝7.2Hz，2H)，5.53(s，2H)，6.65(dd，J＝1.6，3.2，Hz，1H)，7.05(m，4H)，7.33(m，1H)，7.87(d，J＝1.6Hz，1H)，8.18(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.73(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：523(M+1).分析值(C27H24F2N4O5)C，H，N。
合成6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(88)
按照通用方法B，由6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(81)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率298mg(34％)，MP 134℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，3.19(m，4H)，3.94(m，4H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.88(s，2H)，6.66(dd，J＝1.6，3.2，Hz，1H)，7.07(d，J＝3.6Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.74(m，1H)，7.88(d，J＝1.2Hz，1H)，8.11m，2H)，8.20(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，8.64(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：533(M+1)。分析值(C28H25FN4O6)C，H，N。
合成1-苄基-6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(89)
按照通用方法B，由6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)和苄基溴制备该化合物。产率319mg(59％)，MP 197℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(m，4H)，3.95(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.52(s，2H)，7.15-7.28(m，6H)，7.46(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.29(d，J＝2.8Hz，1H)，8.73(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：537(M+1)。分析值(C27H25ClN4O4S)C，H，N。
合成6-氯-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(90)
按照通用方法B，由6-氟-6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率207mg(37％)，MP186℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.16(m，4H)，3.92(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.24(s，2H)，7.07(m，3H)，7.15(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.30(m，1H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.29(d，J＝2.8Hz，1H)，8.73(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：555(M+1)。分析值(C27H24ClFN4O4S)C，H，N。
合成6-氯-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(91)
按照通用方法B，由6-氯-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(82)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率333mg(59％)，MP 227℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.20(m，4H)，3.92(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.87(s，2H)，7.17(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.48(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.73(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.11(m，2H)，8.32(d，J＝2.6Hz，1H)，8.64(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：565(M+1)。分析值(C28H25ClN4O5S)C，H，N。
合成6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(92)
将环己胺(6.14mL，53.65mmol)加入搅拌的6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(74)(10g，26.82mmol)在二甲苯中的溶液，在140℃加热3小时。冷却溶液，真空下蒸发溶剂。将残余物悬浮在水中并用二氯甲烷萃取。用水和盐水洗涤合并的有机相，然后通过Na2SO4干燥并蒸发，获得7.46g(65％)6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(92)，为白色固体。MP：176℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.25-1.41(m，5H)，1.54(m，1H)，1.66(m，2H)，1.87(m，2H)，3.68(s，3H)，3.86(m，1H)，5.51(s，2H)，6.81(d，J＝8.8Hz，2H)，7.20(d，J＝8.8Hz，2H)，8.31(d，J＝8.0Hz，1H)，8.83(s，1H)，10.24(s，1H)；EIMS m/z 426(M+1)。
合成6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(93)
将环己胺(6.15mL，53.70mmol)加入搅拌的6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(75)(10.44g，26.85mmol)在二甲苯中的溶液并在140℃加热3小时。冷却溶液，真空下蒸发溶剂。将残余物悬浮在水中并用二氯甲烷萃取。用水和盐水洗涤合并的有机相，然后通过Na2SO4干燥并蒸发，获得10.6g(89％)6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(93)，为白色固体。MP：193℃；1H-NMR(CDC13)：d 1.24-1.99(m，10H)，3.47(s，3H)，3.93(m，1H)，5.59(s，2H)，6.78(m，2H)，7.37(m，2H)，8.39(d，J＝2.4Hz，1H)，8.60(d，J＝2.4Hz，1H)，10.15(s，1H)；EIMS m/z 442(M+1)。
制备上述6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(92)和6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(93)的反应顺序如下所示：
74R＝F 92R＝F
75R＝Cl 93R＝Cl
合成4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(94)
将6-氟-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(92)(7.46g，17.53mmol)和三乙基胺(6.1mL，43.83mmol)的溶液在纯POCl3中90℃加热过夜。冷却溶液并真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得4.2g(69％)4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(94)，为白色固体。MP 195℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d3.69(s，3H)，5.51(s，2H)，6.82(d，J＝8.8Hz，2H)，7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，8.48(dd，J＝2.8，8.4Hz，1H)，8.96(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS m/z344(M+1)。
合成4，6-二氯-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(95)
将6-氯-4-羟基-1-(4-甲氧基-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-羧酸环己酰胺(93)(10.6g，24mmol)和三乙胺(8.33mL，60mmol)的溶液在纯POCl3中90℃加热过夜。冷却溶液并真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在饱和NaHCO3溶液中，简短超声并过滤。将固体溶解在二氯甲烷中，连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。通过MgSO4干燥有机相，蒸发获得8.2g(95％)4，6-二氯-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(95)，为白色固体。MP 208℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.69(s，3H)，5.50(s，2H)，6.82(m，2H)，7.87(m，2H)，8.59(d，J＝2.8Hz，1H)，8.94(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS m/z 362(M+2)。
合成4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)
将4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(94)(4.3g，12.50mmol)在纯TFA中回流24小时。冷却溶液并在减压下蒸馏去除过量的TFA。将残余物吸收在水中，通过固体NaHCO3碱化并过滤，用过量水洗涤固体，干燥获得2.6g(96％)4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)，为白色固体。MP：272℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 8.26(dd，J＝2.8，8.2Hz，1H)，8.81(d，J＝2.8Hz，1H)，13.03(S，1H)；EIMS：224(M+1)。
合成4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)
将4，6-二氯-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(95)(8.2g，22.70mmol)在纯TFA中回流24小时。冷却溶液并在减压下蒸馏去除过量的TFA。将残余物吸收在水中，通过固体NaHCO3碱化并过滤，用过量水洗涤固体，干燥获得5.2g(96％)4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)，为黄色固体。MP：247℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 8.45(dd，J＝2.4Hz，1H)，8.82(d，J＝2.4Hz，1H)，13.17(S，1H)；EIMS：240(M)。
制备上述4-氯-6-氟-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(94)，4，6-二氯-1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-1，2-二氢-1，8-二氮杂萘-3-腈(95)，4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)和4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)的反应顺序如下所示：
92R＝F 94R＝F 96R＝F
93R＝Cl 95R＝Cl 97R＝Cl
通过取代的哌嗪衍生物胺化4-氯-二氮杂萘腈部分
按照上述通用方法E，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)或4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)通过与相应的哌嗪衍生物反应，制备称为98-101的化合物。
合成6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)
按照上述通用方法E，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮制备该化合物，获得4.85g(79％)6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)，为黄色固体。MP 244℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.72(m，4H)，3.91(m，4H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.49(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，8.05(dd，J＝2.8，7.2Hz，1H)，8.70(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：384(M+1)。
合成6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)
按照上述通用方法E，由4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(96)和2-糠酰哌嗪制备该化合物，获得2.87g(71％)6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)，为白色固体。MP 312℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.69(m，4H)，3.93(m，4H)，6.66(dd，J＝1.6，3.6Hz，1H)，7.08(d，J＝3.6Hz，1H)，7.89(d，J＝1.6Hz，1H)，8.07(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.69(d，J＝2.8Hz，1H)，12.30(s，1H)；EIMS：368(M+1)。
合成6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)
按照上述通用方法E，由4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮制备该化合物，获得6.8g(74％)6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)，为黄色固体。MP 158℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.64(m，4H)，3.90(m，4H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.21(d，J＝2.4Hz，1H)，8.66(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：400(M+1)。
合成6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)
按照上述通用方法E，由4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(97)和2-糠酰哌嗪制备该化合物，获得2.27g(71％)6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)，为黄色固体。MP 303℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.76(m，4H)，3.93(m，4H)，6.65(dd，J＝1.6，3.6Hz，1H)，7.09(d，J＝3.6Hz，1H)，7.89(d，J＝1.6Hz，1H)，8.21(d，J＝2.4Hz，1H)，8.66(d，J＝2.4Hz，1H)，12.36(s，1H)；EIMS：384(M+1)。
制备上述6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)，6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)，6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)和6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)的反应顺序如下所示：
96R＝F 98R＝F，X＝S
97R＝Cl 99R＝F，X＝O
100R＝Cl，X＝S
101R＝Cl，X＝O
通过在6-取代的二氮杂萘腈部分的N-1位上烷基化制备化合物
通过应用上述通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)或6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)或6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)或6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)和相应的烷基卤制备称为化合物102-113的化合物。
合成1-苄基-6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(102)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)和苄基溴制备该化合物。产率317mg(43％)，MP 173℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.92(m，4H)，5.53(s，2H)，7.22-7.30(m，6H)，7.49(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.16(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.77(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：474(M+1)。分析值(C25H20FN5O2S)C，H，N。
合成6-氟-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(103)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率428mg(56％)，MP 137℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.73(m，4H)，3.93(m，4H)，5.52(s，2H)，7.06-7.10(m，3H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.33(m，1H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.17(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.77(d，J＝2.8Hz，1H)；ELMS：492(M+1)。分析值(C25H19F2N5O2S)C，H，N。
合成6-氟-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(104)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(98)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率293mg(38％)，MP 262℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.79(m，4H)，3.95(m，4H)，5.87(s，2H)，7.16(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.51(d，J＝3.6Hz，1H)，7.59(m，2H)，7.50(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.12(m，2H)，8.23(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.70(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：502(M+1)。分析值(C26H20FN5O3S)C，H，N。
合成1-苄基-6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(105)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)和苄基溴制备该化合物。产率136mg(18％)，MP 216℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.72(m，4H)，3.95(m，4H)，5.53(s，2H)，6.66(dd，J＝2.0，3.6Hz，1H)，7.08(d，J＝3.6Hz，1H)，7.21-7.28(m，5H)，7.89(d，J＝2.0Hz，1H)，8.18(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.77(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：458(M+1)。分析值(C25H20FN5O3)C，H，N。
合成6-氟-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(106)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率297mg(38％)，MP 211℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.72(m，4H)，3.95(m，4H)，5.52(s，2H)，6.67(dd，J＝1.6，3.6，Hz，1H)，7.06-7.10(m，4H)，7.33(m，1H)，7.89(d，J＝1.6Hz，1H)，8.18(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.78(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：476(M+1)。分析值(C25H19F2N5O3)C，H，N。
合成6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(107)
按照通用方法B，由6-氟-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(99)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率242mg(31％)，MP 293℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.79(m，4H)，3.98(m，4H)，5.87(s，2H)，6.67(dd，J＝1.6，3.2Hz，1H)，7.10(d，J＝3.6Hz，1H)7.59(m，2H)，7.73(m，1H)，7.90(d，J＝1.6Hz，1H)，8.12(m，2H)，8.21(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.70(d，J＝2.8Hz，1H)；EIMS：486(M+1)。分析值(C26H20FN5O4)C，H，N。
合成1-苄基-6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(108)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)和苄基溴制备该化合物。产率184mg(37％)，MP 221℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.75(m，4H)，3.92(m，4H)，5.51(s，2H)，7.15-7.30(m，6H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.81(d，J＝5.2Hz，1H)，8.32(d，J＝2.4Hz，1H)，8.75(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：490(M+1)。分析值(C25H20ClN5O2S)C，H，N。
合成6-氯-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(109)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率214mg(42％)，MP 204℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.76(m，4H)，3.92(m，4H)，5.51(s，2H)，7.06(m，3H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.33(m，1H)，7.50(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.33(d，J＝2.4Hz，1H)，8.75(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：508(M+1)。分析值(C25H19ClFN5O2S)C，H，N。
合成6-氯-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(110)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(100)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率117mg(23％)，MP 316℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.81(m，4H)，3.94(m，4H)，5.86(s，2H)，7.17(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.51(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.73(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.12(m，2H)，8.36(dd，J＝2.4Hz，1H)，8.67(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：518(M+1).分析值(C26H20ClN5O3S)C，H，N。
合成1-苄基-6-氯-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(111)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)和苄基溴制备该化合物。产率223mg(31％)，MP 196℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.75(m，4H)，3.94(m，4H)，5.51(s，2H)，6.66(dd，J＝1.6，3.6Hz，1H)，7.09(d，J＝3.2Hz，1H)，7.22-7.28(m，5H)，7.89(d，J＝1.6Hz，1H)，8.32(d，J＝2.4Hz，1H)，8.76(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：474(M+1)。分析值(C25H20ClN5O3)C，H，N。
合成6-氯-1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(112)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率113mg(15％)，MP 134℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.75(m，4H)，3.95(m，4H)，5.51(s，2H)，6.66(dd，J＝1.6，3.2，Hz，1H)，7.06-7.10(m，4H)，7.33(m，1H)，7.89(d，J＝2.0Hz，1H)，8.33(dd，J＝2.4Hz，1H)，8.75(d，J＝2.4Hz，1H)；EIMS：492(M+1)。分析值(C25H19ClFN5O3)C，H，N。
合成6-氯-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(113)
按照通用方法B，由6-氯-2-氧代-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(101)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率233mg(31％)，MP 328℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.81(m，4H)，3.97(m，4H)，5.86(s，2H)，6.66(dd，J＝1.6，3.2Hz，1H)，7.10(d，J＝3.2Hz，1H)7.59(m，2H)，7.73(m，1H)，7.90(d，J＝1.6Hz，1H)，8.14(m，2H)，8.37(d，J＝2.0Hz，1H)，8.67(d，J＝2.0Hz，1H)；EIMS：502(M+1)。分析值(C26H20C1N5O4)C，H，N。
合成1-苄基-4-羟基-3-(甲磺酰基)-[1，8]-二氮杂萘-2(1H)-酮(114)
将甲磺酰乙酸乙酯(1.3mL，9.83mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，433mg，10.81mmol)在二甲基乙酰胺(20mL)中的悬浮液中，在室温下在氩气下搅拌0.5小时。将1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)(2.5g，9.83mmol)加入溶液并在110℃下加热4小时(TLC对照)。将溶液冷却和倒入冰水中。通过冷10％HCl将溶液的pH调节至4。过滤形成的固体，用过量的水洗涤，真空炉中干燥以获得950mg(30％)1-苄基-4-羟基-3-(甲磺酰基)-[1，8]-二氮杂萘-2(1H)-酮(114)，为白色固体。MP：155℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.51(s，3H)，5.57(s，2H)，7.23(m，1H)，7.27(m，4H)，7.43(m，1H)，8.48(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.79(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)；EIMS m/z 331(M+1)。
合成1-苄基-4-氯-3-(甲磺酰基)-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(115)
将三乙胺(1.2mL，8.6mmol)加入1-苄基-4-羟基-3-(甲磺酰基)-[1，8]-二氮杂萘-2(1H)-酮(114)(0.94g，2.9mmol)在纯POCl3中的悬浮液并在90℃下加热3小时。冷却溶液并真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，用固体NaHCO3中和，用二氯甲烷萃取。有机层连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤，通过MgSO4干燥，蒸发获得1-苄基-4-氯-3-(甲磺酰基)-[1，8]-二氮杂萘-2(1H)-酮(115)，为黄色固体。产率0.92g(92％)，mp191℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.50(s，3H)，5.65(s，2H)，7.28(m，5H)，7.55(m，1H)，8.70(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.84(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 349(M+1)。
制备上述1-苄基-4-羟基-3-(甲磺酰基)-[1，8]-二氮杂萘-2(1H)-酮(114)和1-苄基-4-氯-3-(甲磺酰基)-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(115)的反应顺序如下所示：
合成1-苄基-3-甲磺酰基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(116)
在室温下将DABCO(0.57g，5.0mmol)加入1-苄基-4-氯-3-(甲磺酰基)-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(115)(0.88g，2.5mmol)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮(0.60g，3.08mmol)在N-甲基吡咯烷酮中的溶液。将溶液在110℃下加热15分钟。冷却该溶液并倒入冰冷的10％氯化铵水溶液。过滤形成的固体，用水洗涤，干燥获得0.95g(74％)1-苄基-3-甲磺酰基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(116)，为黄色固体。MP：223℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.37(s，3H)，3.59(m，4H)，3.93(b，4H)，5.59(s，2H)，7.2(m，6H)，7.38(m，1H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.46(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS m/z 509(M+1)。
制备上述1-苄基-3-甲磺酰基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(116)的反应顺序如下所示：
合成吡啶-4-基-氨基甲酸叔丁酯(117)
在室温下通过固体添加漏斗将4-氨基吡啶(25g，265mmol)缓慢加入搅拌的二碳酸二叔丁酯(63.75g，292mmol)在THF中的溶液。将溶液在室温下进一步搅拌1小时。减压去除溶剂，用乙醚再结晶残余物，获得43.5g(84％)吡啶-4-基-氨基甲酸叔丁酯(117)，为白色固体。MP：260℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.48(s，9H)，7.40(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.33(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，9.93(s，1H)；EIMS m/z 195(M+1)。
合成4-叔丁氧羰基氨基-烟酸(118)
在-40℃下将n-Buli(1.6M soln，155mL，249mmol)加入搅拌的TMEDA(37.36mL，249mmol)在THF中的溶液。在10分钟内将溶液达到室温并搅拌另外10分钟。将溶液冷却至-78℃。缓慢加入吡啶-4-基-氨基甲酸叔丁酯(117)(22g，113.26mmol)在THF中的溶液。在3小时内使得溶液达到室温。在室温下搅拌15分钟后，再次将溶液冷却至-78℃，加入新压碎的干冰。使得溶液达到室温，搅拌30分钟，倒入冰冷的10％NH4Cl溶液中。通过1N NaOH溶液碱化溶液，用二氯甲烷洗涤。通过冷的10％HCl溶液将水相的pH调节至4。过滤形成的固体，用水洗涤并在室温下真空干燥，获得16.3g(30％)4-叔丁氧羰基氨基-烟酸(118)，为白色固体。MP：260℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.49(s，9H)，8.23(d，J＝6.0Hz，1H)，8.55(d，J＝6.0Hz，1H)，8.96(s，1H)；EIMS m/z 238(M+1)。
制备上述吡啶-4-基-氨基甲酸叔丁酯(117)，4-叔丁氧羰基氨基-烟酸(118)的反应顺序如下所示：
合成1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(119)
将氯甲酸三氯甲酯(9mL，75mmol)缓慢加入4-叔丁氧羰基氨基-烟酸(118)(16.2g，68mmol)在二噁烷中的溶液并在氮气气氛下回流4小时。冷却该溶液，真空去除溶剂。通过乙醚再结晶残余物，获得10.92g(98％)1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(119)，为白色固体。MP：243℃；1H-NMR(DMSO-d6)：)，d 7.32(d，J＝6.0Hz，1H)，8.71(d，J＝6.0Hz，1H)，9.11(s，1H)；EIMS m/z 165(M+1)。
合成4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(120)
将丙二酸二乙酯(13.77mL，91mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，3.63mg，91mmol)在二甲基乙酰胺中的悬浮液，在室温下在惰性气氛下搅拌0.5小时。向溶液中加入1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(119)(15g，91mmol)，并在110℃加热过夜。冷却溶液并倒入冰水中。通过饱和NaHCO3溶液碱化，用二氯甲烷萃取。通过冷10％HCl将水相的pH调节至3，用n-BuOH萃取。将在蒸发丁醇后获得的残余物溶解在POCl3中并在90℃加热3小时。冷却该溶液，真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，用固体NaHCO3中和，通过乙酸乙酯萃取。连续用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤有机层，通过Na2SO4干燥，蒸发为残余物。通过快速色谱法纯化粗产物，获得0.8g(3％)4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(120)，为白色固体。MP：219℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.31(t，J＝7.2Hz，3H)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H)，7.30(d，J＝5.6Hz，1H)，8.63(d，J＝5.6Hz，1H)，9.05(s，1H)，12.80(s，1H)；EIMS：253(M+1)。
制备上述1H-吡啶并[4，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(119)，4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(120)的反应顺序如下所示：
合成2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)
在室温下将DABCO(0.7g，6.3mmol)加入4-氯-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(120)(0.8g，3.16mmol)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮(0.93g，4.74mmol)DMA的溶液中。将溶液在110℃加热2小时。冷却溶液并倒入冰冷的10％氯化铵水溶液。过滤形成的固体，用水洗涤，干燥获得1.2g(92％)2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)，为白色固体。MP：231℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.18(m，4H)，3.89(m，4H)，4.27(q，J＝7.2Hz，2H)，7.14(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.18(d，J＝6.0Hz，1H)，7.47(d，J＝3.6Hz，1H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.51(d，J＝5.6Hz，1H)，8.91(s，1H)；EIMSm/z 413(M+1)。
制备上述2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)的反应顺序如下所示：
通过在6-取代的二氮杂萘部分的N-1位上烷基化来制备化合物
通过应用如上所述的通用方法B，由2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)和相应的烷基卤制备称为化合物122-124的化合物。
合成1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(122)
按照通用方法B，由2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)和4-氟苄基溴制备该化合物。产率210mg(55％)，MP 132℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.21(m，4H)，3.91(m，4H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，5.41(s，2H)，7.13-7.29(m，5H)，7.41(d，J＝6.0Hz，1H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝4.8，1.2Hz，1H)，8.57(d，J＝6.0Hz，1H)，9.09(s，1H)；EIMS：521(M+1)。分析值(C27H25FN4O4S)C，H，N。
合成1-(3-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(123)
按照通用方法B，由2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)和3-氟苄基溴制备该化合物。产率113mg(22％)，MP 135℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.22(m，4H)，3.92(m，4H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.44(s，2H)，6.98(d，J＝7.6Hz，1H)，7.10(m，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.34(m，2H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，8.56(d，J＝6.0Hz，1H)，9.09(s，1H)；ELMS：521(M+1)。分析值(C27H25FN4O4S)C，H，N。
合成2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(124)
按照通用方法B，由2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，6]-二氮杂萘-3-羧酸乙酯(121)和2-溴苯乙酮制备该化合物。产率127mg(24％)，MP 157℃；1H-NMR(DMSO-d6)：d 1.27(t，J＝6.8Hz，3H)，3.24(m，4H)，3.93(m，4H)，4.26(q，J＝7.2Hz，2H)，5.85(s，2H)，7.15(dd，J＝3.6，5.2Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.62(m，2H)，7.74(m，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，8.13(d，J＝5.2Hz，1H)，8.32(d，J＝7.2Hz，2H)，8.56(d，J＝6.0Hz，1H)，9.12(s，1H)；EIMS：531(M+1)。分析值(C28H26N4O5S)C，H，N。
合成1-苄基-4-羟基-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(125)
将硝基乙酸乙酯(8.7mL，78mmol)缓慢加入NaH(在矿物油中60％，3.46mg，87mmol)在二甲基乙酰胺中的悬浮液，在室温下在氩气下搅拌0.5小时。向溶液中加入1-苄基-1H-吡啶并[2，3-d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(2)(2.5g，9.83mmol)并在110℃下加热12小时(TLC对照)。冷却溶液，滤过硅藻土垫。通过冷水稀释滤液，通过冷10％HCl将pH调节至2。过滤形成的固体，用过量水洗涤，真空炉中干燥，获得白色固体。产率9.7g，42％，mp ca 182℃(不尖锐)。1H-NMR(DMSO-d6)：d 5.53(s，2H)，7.25(m，6H)，8.46(dd，J＝2.0，7.6Hz，1H)，8.63(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 298(M+1)。
合成1-苄基-4-氯-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(126)
将三乙胺(12.2mL，88mmol)加入1-苄基-4-羟基-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(125)(8.7g，29mmol)在纯POCl3中的悬浮液，在90℃加热3小时。冷却溶液，真空蒸馏过量的POCl3。将残余物悬浮在水中，通过固体NaHCO3中和，用二氯甲烷萃取。连续用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤有机层，通过Na2SO4干燥，蒸发获得黄色固体。产率9.2g，98％，Mp ca 215℃(不尖锐)。1H-NMR(DMSO-d6)：d 5.66(s，2H)，7.28(m，5H)，7.61(m，1H)，8.57(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.89(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 316(M+1)。
制备上述1-苄基-4-羟基-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(125)和1-苄基-4-氯-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(126)的反应顺序如下所示：
合成1-苄基-3-硝基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(127)
室温下将DABCO(6.26g，55mmol)加入1-苄基-4-氯-3-硝基-1，8-二氮杂萘-2(1H)-酮(126)(8.81g，28mmol)和哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲酮(6.57g，33mmol)在N-甲基吡咯烷酮中的溶液。将溶液在110℃加热2小时。冷却溶液并倒入冰冷的10％氯化铵水溶液中。过滤形成的固体，用水洗涤，干燥以获得黄色固体。产率11g(83％)，mp 255℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.26(m，4H)，3.90(m，4H)，5.61(s，2H)，7.15(m，1H)，7.25(m，5H)，7.47(m，2H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，8.43(d，J＝7.6Hz，1H)，8.76(d，J＝4.4Hz，1H)；EIMS m/z 476(M+1)。
合成3-氨基-1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(128)
将1-苄基-3-硝基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(127)(475mg，1mmol)和Pd/C(10％，50mg)在乙醇中的溶液在室温下在氢气气氛下搅拌过夜。将溶液过滤通过硅藻土垫，浓缩滤液获得黄色固体，产率75％，mp 210℃。1H-NMR(DMSO-d6)：d 3.05(b，2H)，3.35(b，2H)，3.70(b，2H)，4.00(b，2H)，5.54(s，2H)，5.68(s，2H)，7.2(m，7H)，7.47(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.77(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.31(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS m/z 446(M+1)。
制备上述1-苄基-3-硝基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(127)和3-氨基-1-苄基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1H-[1，8]-二氮杂萘-2-酮(128)的反应顺序如下所示：
合成1-苄基-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(129)
按照通用方法C，由2-呋喃基氯和1-苄基-2-氧代-4-哌嗪-1-基-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(9)制备该化合物。反应生成1-苄基-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，8]-二氮杂萘-3-腈(129)，为白色固体。MP：206℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.60(m，4H)，3.76(m，4H)，5.51(s，2H)，6.65(dd，J＝3.5，4.8Hz，1H)，7.10(dd，J＝3.5，4.8Hz，1H)，7.20-7.35(m，5H)，7.42(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.92(d，J＝5.2Hz，1H)，8.39(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)；EIMS：440(M+1)。分析值C25H21N5O3(C，H，N)。
实施例2
以下部分描述评估潜在的MIF抑制剂的活性的测定。
巨噬细胞移动试验
巨噬细胞移动通过如Harrington和Stastny等，J.Immunol.110(3)：752-759，1973所述的琼脂糖滴实验和毛细管法进行测定。简单而言，将含巨噬细胞样品加入到血细胞比容管内，该管长75mm，内径为1.2mm。将该管加热密封并离心100×G3分钟，在细胞液界面切割并嵌入Sykes-Moore培养室中一滴硅氧烷润滑膏中。该培养室含有对照蛋白质(BSA)或样品。37℃下培养24和48小时后测定移动区域，测定方法是跟踪巨噬细胞跟随物(fans)的投影图像并利用平面几何学测定移动的面积。
或者，96孔平板的各孔用1微升含于水中的液态0.8％(w/v)Sea Plaque琼脂糖预涂层，分散在各孔的中间。此后该平板在光箱内轻微加热直至琼脂糖滴刚刚变干。将2微升在介质内可达25％(v/v)(存在或不存在MIF或其他对照)的含巨噬细胞的细胞混悬液加入到上述预涂层平板孔中并冷却至4℃达5分钟，该混悬液含有0.2％琼脂糖(w/v)并加热至37℃。各孔随后填充有培养基并在37℃和5％CO2-95％空气下培养48小时。通过测定液滴的边缘到移动的外周之间的距离来测量琼脂糖滴的移动。
移动测定
重组鼠科和人野生型和鼠科突变型MIF的单核细胞移动抑制活性是利用人外周血单核细胞或T细胞贫化单核细胞在改进的Boyden室格内分析。钙黄绿素AM-标记的单核细胞以2.5至5×106/mL悬浮在RPMI 1640培养基中，培养基中含有L-谷酰胺(无酚红)和0.1mg/mL人血清白蛋白或牛血清白蛋白。将等份试样的(200μL)细胞混悬液加入到预热至37℃的U形底96孔培养平板(Costar，Cambridge，MA)的孔中，达到终浓度为1，10，100，和1000ng/mL。该培养平板被置于温控平板读数器的室内，混和30秒，并且在37℃下温育10-20分钟。在培养期间，将28μL的10或25ng/mL的预热人单核细胞趋化性蛋白质1(MCP-1；Pepro Tech.，Inc.，Rocky Hill，NJ)或含有0.1mg/mL HSA的RPMI 1640加入到ChemoTX平板(Neuro ProbeInc.，Gaithersburg，MD；3mm孔径，5μM滤器孔径)的底孔中。小心地将过滤平板加入到基板。从恒温箱内取出处理的细胞混悬液并向过滤平板的各孔内加入30μL。装配的平板在37℃下在含有5％CO2的加湿室内培养90分钟。培养后，从滤器的表面抽吸该细胞混悬液并从基板取出滤器且通过加入50μL of 1X HBSS-至各滤器部分洗涤3次。洗涤之间，用涂刷器(NeuroProbe)除去残余的HBSS-。使滤器风干且然后在荧光平板读数器中直接读数，在485nm下激发并在535nm下发射。趋化性或无规移动指数定义为给定组的孔的平均滤器结合荧光除以不含有MCP-1或MIF的孔中滤器的平均荧光。荧光标记的细胞的滴定揭示出，该试验中检测的荧光的水平与细胞数目具有线性关系(未给出)。
互变异构酶试验
互变异构反应基本上按照Rosengren等，Mol.Med.2(1)：143-149，1996所述方法进行。评估D-多巴色素转化为5，6-二羟基吲哚-2-羧酸。制备1ml在样品溶液内含有0.42mM底物和1.4μg MIF的比色杯，该样品溶液中含有0.1mM EDTA和10mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0，并且在475nm下追踪亚氨铬(iminochrome)吸光度的减小率。用L-多巴色素作为对照。此外，反应产物可以用HPLC检测，采用含有20mM KH2PO4缓冲液(pH 4.0)和15％甲醇的流动相且流速为1.2ml/min。荧光检测是在295/345nm下进行。
或者，利用苯丙酮酸酯(盐)或(p-羟基苯基)丙酮酸酯(盐)的互变异构反应基本上按照Johnson等，Biochem.38：16024-16033，1999所述进行。在这种情况中，苯丙酮酸酯的酮基化是在288nm(e＝17300M-1cm-1)下监测且(p-羟基苯基)丙酮酸酯的酮基化是在300nm(e＝21600M-1cm-1)下监测。该试验混合物含有50mM Na2HPO4缓冲液(1mL，pH 6.5)和一等份的MIF溶液，将其充分稀释(0.5-1.0μL的2.3mg/mL溶液，终浓度93-186nM)得到初始线性率(liner rate)。该试验始于加入少量(1-3.3μL)来自储备液的苯丙酮酸酯或(p-羟基苯基)丙酮酸酯，该储备液配制在乙醇中。苯丙酮酸酯和(p-羟基苯基)丙酮酸酯的结晶形式专门作为烯醇异构体(Larsen等，Acta Chem.Scand.B 28：92-96，1974)。底物的浓度可以在10-150M的范围内，同时在小于0.5％v/v下观察到对MIF活性没有显著的抑制作用。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析
细胞培养试验被设计为表征候选化合物的活性，MIF表达，运输，和输出。基本上按照现有方法制备用于免疫沉淀的细胞和条件培养基组分(Florkiewicz等，生长因子4：265-275，1991；Florkiewicz等，Ann.N.Y.Acad.Sci.638：109-126)，但除了将400μl的细胞裂解缓冲液(1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，20mM Tris pH 7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，0.01mM苯基甲基磺酰氟，10ng/ml抑肽酶，10ng/ml亮抑肽酶，10ng/ml peptstatin)加入到在微型离心机中离心15分钟澄清化的培养基组分中。细胞或培养基组分与MIF的单克隆或多克隆抗体一起培养并且加入GammaBindTM GSepharose(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)继续培养30分钟。免疫复合物通过微型离心机离心进行沉降，用细胞裂解缓冲液洗涤3次，并且用冰冷的免疫沉淀洗涤缓冲液(0.15M NaCl，0,01M Na-磷酸盐pH 7.2，1％脱氧胆酸盐，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠)洗涤4次。将免疫复合物直接解离在SDS凝胶样品缓冲液125mM Tris，pH 6.8，4％SDS，10％甘油，0.004％溴酚蓝，2mM EGTA中，并且用12％SDS-PAGE分离。该凝胶进行荧光自显影，干燥，并且在-70℃下暴露在X射线胶片下。当新霉素磷酸转移酶被免疫沉淀时，采用兔抗-NPT抗体(5Prime-3Prime，Boulder，CO)。
对于蛋白质印迹分析法，将蛋白质自12％SDS-PAGE凝胶转移至硝基纤维素膜(孔径0.45μm，在含有25mM 3-[二甲基(羟甲基)甲基氨基]-2-羟丙烷-磺酸的冷缓冲液中，pH 9.5，20％甲醇0.4amps下90分钟。对于蛋白质印迹分析，细胞条件化的培养基中，将该培养基离心(10分钟，在800g下)并且把上清液通过膜过滤法浓缩10倍(10kDa截止，Centricon-10Amicon)。在还原条件下将样品随后再溶于16％SDS Tris-对羟基苯基甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上并在20V下3小时转移到硝基纤维素膜(Novex)上。膜与兔多克隆抗大鼠抗体(1∶1000)(Torrey Pines Biolab，SanDiego，CA)一起培养，并且随后与辣根过氧化物酶偶联物(1∶1000)(Pierce，Rockford，IL)一起培养。用氯萘酚(chloronaphtnol)/H2O2展开目测观察MIF。重组MIF(2ng，购自R&D systems，Minneapolis)经过电泳和转移作为标准。膜在10mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，5mM NaN3，0.35％聚氧化乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯和5％脱脂干燥牛奶(Carnation Co.，LosAngeles，CA)中室温下封闭1小时。膜与单克隆抗体(Catalog NumberMAB289，购自R&D Systems，Minneapolis，MN)或多克隆(山羊多克隆血清，R&D Systems cat#AF-289-PB)一起温育。温育后，膜在室温下用含有150mM NaCl，500mM磷酸钠pH 7.4，5mM NaN3，和0.05％聚氧化乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯的缓冲液洗涤10次。当使用单克隆抗体时，膜随后在含有1μg/ml兔抗小鼠IgG(H+L，affinipure，Jackson Immuno ResearchLaboratories，West Grove，PA)的封闭缓冲液中室温下温育30分钟。对于多克隆探测，培养采用兔抗山羊(Sigma，Catalog Number G5518)。膜进而在1L的上述缓冲液中洗涤，并且在100ml的含有15μCi125I-蛋白质A(ICNBiochemicals，Costa Mesa，CA)的封闭缓冲液中培养，并且用1L的缓冲液洗涤。放射信号通过放射自显影法观测。
细胞外定位试验
为了进一步评估候选化合物调控MIF输出的体外活性，选择小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。将Raw 264.7巨噬细胞(3×106细胞/孔)铺板在12孔组织培养平板(Costar)中并在RPMI/1％热灭活胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)中培养。37℃下在含5％CO2的加湿空气中培养3小时，除去未粘附的细胞并且孔用RPMI/1％FBS洗涤2次。细胞随后用LPS(0111:B4)或TSST-1(Toxin Technology，Sarasota，FL)培养24小时，它是约95％纯且重新悬浮在无热原水中，浓度范围为1pg/ml-1000ng/ml(用于剂量反应试验)。对于时间-过程试验，平行培养物的条件培养基在用1ng/ml TSST-1或LPS刺激后0.5，1，2，4，8和24小时的时间间隔取出。对于抑制研究，RAW 264.7细胞(3×106细胞/孔)与1ng/ml LPS(0111:B4)或1ng/ml TSST-1在0.01μM-10μM候选化合物或缓冲液(作为对照)的存在下一起培养24小时。在滤器上浓缩存在于细胞条件培养基中的细胞并且通过蛋白质印迹法分析样品中残留的MIF，MIF带密度也可以通过Stratagene Eagle EyeTM测定。
通过加入1ng/ml TSST-1或LPS并培养24小时，RAW细胞可以被诱导表达MIF。按照上述方法测定条件培养基中的MIF。与单用缓冲液培养的细胞相比，MIF抑制化合物以浓度依赖方式降低条件培养基中可免疫检测到的MIF水平。
细胞培养物，转染和代谢标记
得自American Type Culture Collection(ATCC No.CRL 1650)的靶向细胞在48孔平板中DMEM内培养过夜，该培养基中补充有10％胎牛血清，2mM L-谷酰胺，1mM丙酮酸钠，100nM非必需氨基酸，和50μg/ml庆大霉素。靶向细胞随后用2μg/ml CsCl纯化的质粒DNA在转染缓冲液(140mM NaCl，3mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，0.9mM Na2HPO4，25mM Tris，pH 7.4)中转染。向各孔内，加入300μl存在于转染缓冲液中的DNA。细胞在37℃下培养30分钟，并且抽吸该缓冲液。在1.5小时内加入补充有100μm氯喹的培养基。除去这种培养基且细胞用完全培养基洗涤2次。随后细胞培养40-48小时。感兴趣的质粒用pMAMneo(Clontech，Palo Alto，CA)共转染，其含有选择性标记物新霉素磷酸转移酶。当2μg的感兴趣质粒用10μg pMAMneo共转染时，70％以上的转染细胞表达了MIF和neo两者，通过免疫荧光显微镜法测定。
对于免疫沉淀试验，靶向细胞用100μCi 35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸(Trans 35S-label，ICN Biomedicals，Irvine，CA)在1ml无蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中代谢地脉冲标记15分钟。标记后，该细胞单层用补充有过量(10mM)未标记蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM洗涤1-2分钟1次。细胞随后在2ml的该培养基中培养指定长的时间并在无前导蛋白质的存在下免疫沉淀该细胞上清液。对于所述的培养物，追踪培养基补充有指定浓度的调节剂。
或者，对于ELISA的分析，靶向细胞用250μl的0.1M碳酸钠，pH 11.4洗涤1-2分钟且立刻抽吸。另外优选高盐溶液。该细胞用含有0.5％FBS加25μg/ml肝素的培养基洗涤且随后该细胞在同样的培养基中培养指定长短的时间。对于所述的培养物，追加培养基补充有调节剂。对于用编码含有前导序列的蛋白质例如hCG-α或任何其他非肝素结合蛋白质的载体转染的细胞，可以忽略使用碳酸盐洗涤和含肝素培养基。
MIF抑制剂的高通量筛选试验
MIF抑制剂的高通量筛选试验是在96孔格内用产自THP-1细胞的MIF进行并且按照下列方法完成。MIF试验通过上述ELISA进行。THP-1细胞再悬浮在RPMI培养基中达到约5×106细胞/ml，该培养基含有20μg/ml的细菌LPS并且该细胞培养18-20小时。此后收集细胞上清液且用推定的抑制剂进行培养。简单而言，96孔平板(Costar Number 3590)ELISA平板在37℃下用MIF单克隆抗体(R&D Systems Catalog Number MAB289)包被2小时达到浓度为4μg/ml。将未稀释的培养上清液加入到该ELISA平板室温下培养2小时。此后洗涤孔，加入生物素化MIF多克隆抗体(R&DSystems#AF-289-PB)，随后加入链霉抗生物素-HRP和产色底物。MIF的量通过外推法由MIF底物曲线计算。
血清中候选抑制剂HPLC分析
评估任何小分子的体内作用之前，希望能够以定量方式检测体液如血液中的化合物。为首次可再现检测试验化合物，例如MIF抑制剂，建立分析方法，并且随后测定其在生物流体中的浓度。
RP-HPLC采用带有Symmetry Shield RP-8(4.6×75mm id，Waters，Milford，MA)的Hewlett-Packard Model HP-1100单元进行。流动相为等度溶液，该溶液含有35％乙腈/含0.1％三氟乙酸的水。在235nm下监测吸光度。为了测量试验化合物在血清中的量，样品血清蛋白质首先用50％乙腈(4℃过夜)分离，随后在14000rpm下离心30分钟。该上清液此后通过RP-HPLC分析且该化合物的浓度基于已知标准品的校准曲线进行计算。按照这种方法，用反相HPLC在1.5-800ng的线性范围内、利用峰(spiked)试验样品检测候选化合物。当将上述分析技术应用于来自接受候选化合物(0.4mg/20克小鼠)的动物的血清时，定量测定候选化合物的循环浓度。
随着上述定量候选化合物的方法的发展，可以评估化合物不同给药途径的功效并且描述生物活性的特征。对于试验时间依赖性血清生物利用度，动物用候选化合物通过腹膜内注射(i.p.)和饲管口服进行处理。
MIF的体内抑制
体内试验的目的在于证实利用候选化合物抑制MIF的初始体外试验结果。LPS诱导的毒性似乎与MIF以及TNF-α和IL-1β的过度生产有关，因为动物可以通过中和或抑制这些炎症介体受到保护免于内毒素休克。选择本模型，因为它提供了脓毒症和脓毒性休克的可再现和快速致死模型。
脂多糖(LPS)的剂量在各试验之前更新。LPS(Escherichia Coli 0111:B4，Sigma)是通过加入0.5％TEA(1ml USP水+5ml三乙胺(Pierce))到5mg内毒素的瓶内来重构。一旦重构化，该溶液在37℃下培养30分钟。此后，该溶液在56-60℃浴超声器中超声30秒共3次。超声后，持续涡旋该混合物3分钟。此后LPS的储备液备用。
血液中IL-1β和TNF-α和MIF的检测
10只10周龄(20±2gram)雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Kingston，NY)以每笼5只/组笼养，同时随意获得食物和水，并且在试验之前适应环境至少1周。试验的当天，称重小鼠并随意分布为相等平均体重的10只动物组。给小鼠i.p注射200μL的配制候选化合物或缓冲液本身，此后即刻i.p.注射LPS(Escherichia coli 0111:B4，10mg/kg或5mg/kg体重)和β-D-半乳糖胺(50mg/kg体重)。各剂量的LPS(0.2ml对于20gram小鼠)，腹膜内给药并混和，β-D-半乳糖胺的终浓度为50mg/ml。收集从心脏穿刺采集的血液标本之后，处死该动物。通常，在LPS处理后4小时进行收集。按照制造商的方案将血清分离到血清分离器(Microtainer(R)Becton Dickinson，Minneapolis，NJ)。小鼠血清IL-1β和TNF-α通过ELISA、利用“小鼠IL-1β免疫分析”或“小鼠TNF-α免疫分析”试剂盒(R&D SystemMinneapolis，MN)、按照制造商的指导进行测量。小鼠血清中血清MIF浓度通过三明治ELISA(ChemiKine MIF Kit，Chemicon，San Diego，CA)定量。样品一式双份分析，将结果平均。
鼠LPS模型
10只8-10周龄(20±2gram)雌性BALB/c小鼠按照上述方法笼养并适应环境。在试验的当天，称重小鼠并随意分布为相等平均体重的5只动物组。给小鼠注射200μL的配制候选化合物或其缓冲液(平均20mg/kg化合物)，随后i.p.注射LPS(E.Coli 055B5，Sigma)(40，10，5，2或0.5mg/kg体重)和50mg/kg β-D-半乳糖胺。在第一个18小时内每2小时观察小鼠并在7天内每天观察2次。对于这些研究，采用Kaplan-Meier评估法评价动物的存活。
对于所有体内研究，处理组间的标准统计学对比是利用针对分类数据的Fisher试验和针对连续变量的Mantel-Cox试验进行。为了测定血清IL-1的水平是否与血清MIF相关，采用Fisher’s检验。分析使用Stat View5.0软件(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。全部报告的p值是双侧的且小于0.05的值被认为具有统计学意义。
初始对照试验用于测定鼠科模型体系中内源性MIF的基线水平(雌性Balb/c小鼠)，并且进一步测定用LPS(10mg/kg)处理后内源性MIF增高的速率和程度。雌性Balb/c小鼠用混和有50mg/kg β-D-半乳糖胺的LPS(Sigma 0111:B1)处理。MIF在血清中的水平通过HPLC按照上述方法在LPS/半乳糖胺处理后0，2，5和6小时测定。在该代表性试验的开始时，内源性MIF的基线水平约为45ng/ml。然而，在这六小时实验的期间内，在收集的血清样品中检测的MIF水平有依赖于时间的增加。当小鼠用候选化合物(配制为50％水溶液)和10mg/kg LPS处理时，可以检测到循环MIF的水平明显降低。在LPS施用时用20mg/kg体重的候选化合物腹膜内注射BALB/c小鼠。5.5小时后收集血样。结果证明用候选化合物处理的动物具有降低的应答LPS的能力，并且检测到降低的MIF水平。在进一步的研究中，用半LPS剂量(5mg/kg)给予小鼠，在处理后4小时测定血清MIF。该数据显示MIF降低。在另一试验中，经ELISA测定小鼠血清中的MIF和IL-1β两者。实验显示MIF和IL-1β两者之间存在直接和高度的相关性。这种相关性在MIF和TNF-α之间也可观察到。在同样的试验中，在给予20mg/kg候选化合物后观察到血清IL-1β水平和血清TNF-α水平的降低。
试验性LPS诱导的中毒性休克的研究已经揭示了对于MIF和TNF-α的重要作用。事实上LPS刺激巨噬细胞样细胞产生MIF，由此诱发巨噬细胞样细胞的TNF-α分泌，这表明了MIF在LPS的致病机理中的潜在作用。为了试验候选化合物是否可以预防LPS休克，采用在β-D-半乳糖胺敏化的BALB/c小鼠中的致死LPS介导的休克模型。候选化合物在注射致死剂量的LPS(2，5和10mg/kg)的同时的处理显著提高存活率。该作用是通过所用LPS的浓度进行调节，这证实当试验较高浓度的LPS时，候选化合物的作用可被饱和，由此是特异性的。候选化合物可以以浓度依赖型的方式保护小鼠免于LPS诱导的中毒性休克。
MIF克服候选化合物的作用
当施用候选化合物时内源性重组人MIF可以逆转该化合物的有益效果，由此支持了候选化合物通过调节小鼠血清中MIF水平提高动物对LPS的抗性的假设。小鼠用标准LPS方案、但除了1mg/kg LPS和20mg/kg的候选化合物之外进行处理，一些动物还接受300μg/kg人重组MIF。12小时时，在候选化合物存在下明显增多的小鼠幸存于LPS，但该存活率被MIF的施用抵消。
MIF抑制剂在胶原诱发的关节炎模型中
20只DBA/1LacJ小鼠，10-12周龄，在第0天在尾底用在弗氏完全佐剂(FCA；GibcoBRL)中乳化的II型牛胶原蛋白(CII 100μg)免疫。在第7天，经同样的途径施用第二剂量的胶原(在弗氏完全佐剂中乳化)。第14天给小鼠皮下注射100mg的LPS(055:B5)。第70天给小鼠腹膜内注射40μgLPS(0111:B4)。按照爪厚度划分组，随机分布后，用卡钳测量得到平衡起始组。存在于缓冲液中的候选化合物在第71，72，73，和74天施用给小鼠(总的8个剂量，0.4mg/剂，约20mg/kg体重)。此后在74天由两个观察人员检测小鼠的爪厚度。在本试验中，消退的小鼠(成熟关节炎的减退)在第70天用末次i.p.注射LPS处理以刺激细胞因子的产生和急性炎症。候选化合物处理的小鼠与只用载体对照处理的相比适度发展为爪水肿减轻。在后面的时间点，处理组中的动物与其对照比较没有达到胶原诱导性关节炎的成熟表达。
在另一试验中，15只DBA/1J小鼠，10-12周龄在第0天在尾底用在弗氏完全佐剂(FCA；GibcoBRL)中乳化的II型牛胶原蛋白(CII 100μg)免疫。在第21天，经同样的途径施用第二剂量的胶原(在弗氏完全佐剂中乳化)。第28天给小鼠皮下注射100μg的LPS(055:B5)。第71天给小鼠腹膜内注射40μg LPS(0111:B4)。分组和处理方案按照上述相同的方法进行。在第74天，收集血样并测定细胞因子。候选化合物与未处理CIA样品相比降低了血清MIF水平。检测到更显著的对血清TNF-α水平的抑制作用。
通过选择的化合物抑制MIF-互变异构酶测定
通过优选实施方案的方法制备下列MIF抑制剂。在下列结构中，用“COOEt”表示式-C(＝O)OCH2CH3的基团，用“Et”表示式-CH2CH3基团。互变异构酶测定的结果显示每种MIF抑制剂化合物在100μM或更低的浓度下都显示显著的MIF抑制活性。
MIF抑制剂
通过优选实施方案的方法制备下列化合物，预料这些化合物显示显著的MIF抑制活性。在下列结构中，用“COOEt”表示式-C(＝O)OCH2CH3的基团，用“Et”表示式-CH2CH3基团。
本文所引用的所有参考文献通过参考完整地结合于此。如果通过参考结合的出版物和专利或专利申请与包含在本说明书中的公开内容矛盾，意欲本说明书替代和/或优先于任何这种矛盾材料。
本文所用的术语“包含”与“包括，”“含有，”或“特征在于，”同义，并且是包含性的或开放式的，不排除另外的、未提及的要素或方法步骤。
应当理解，用于说明书和权利要求中的所有表达成分的量、反应条件等的数字借助于术语“大约”在所有情形中是可以改变的。因此，除非所示相反，在说明书和后附权利要求中阐述的数字参数是近似的，其可以根据本发明寻求获得的期望性能而变化。决非意欲限制权利要求范围等价原则的应用，每个数字参数应当根据有效数字的数量和普通舍入方法来理解。
上述说明书公开了本发明的数种方法和材料。本发明在方法和材料方面易于改进，并且在制备方法和装置方面易于改变。在考虑本文公开的本发明的该公开内容或实施后，这种改变对于本领域技术人员是显而易见的。因此，意欲本发明不限于本文公开的具体实施方案，它包括在后附权利要求所体现的本发明真实范围和实质内的所有改进和备选方案。
Claims (102)
1.一种用于抑制巨噬细胞移动抑制因子的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，该化合物具有选自下组的结构：
其中：
R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；
R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；
R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；
R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；
R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；
X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；
m独立地为0，1，2，3，或4；且
n为0，1，或2。
2.权利要求1的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
其中：
R选自由下列各项组成的组：氢，C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
R2选自由下列各项组成的组：-NR4R5，-OR3，和-R3；
R3独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R3被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；
R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基，或R4和R5一起构成被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；
X选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
Y选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
Z选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-S(O)mR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
Ar独立地选自由下列各项组成的组：被一个或多个选自下组的取代基所取代的C6-C12芳基：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；且
m独立地为0，1，2，3，或4。
3.权利要求1的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
其中：
R选自由下列各项组成的组：氢，C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-S(O)mR3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-OC(＝O)R3，-NHSO2R3，-C(＝O)NR3R3，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR3R3，-NR3SO2R3，-OR3，-SR3，-S(O)mR3，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR3R3；
R2选自由下列各项组成的组：-NR4R5，-OR3，和-R3；
R3独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和C2-C12杂环，其中R3被一个或多个选自下组的取代基所取代：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基；
R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：C1-C12烷基，C2-C12链烯基，C3-C12环烷基，C6-C12芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12烷基芳基，C2-C12酰基烷基，C3-C12杂环烷基，C3-C12烷基杂环，和被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷氧基，和C1-C12烷硫基，或R4和R5一起构成被一个或多个选自下组的取代基所取代的C2-C12杂环：氢，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-CN，-NO，-NO2，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷硫基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；
X选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；
Y选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；
Z选自由下列各项组成的组：氢，-F，-Cl，-OCF3，-CF3，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；
Ar选自由下列各项组成的组：被一个或多个选自下组的取代基所取代的C6-C12芳基：氢，-F，-Cl，C1-C12烷基，和被一个或多个选自氢、-F和-Cl的取代基所取代的C1-C12烷基；且
m独立地为0，1，2，3，或4。
4.权利要求2的化合物，其中R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
5.权利要求2的化合物，其中R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
6.权利要求2的化合物，其中R1构成-NH-C(＝O)CH3。
7.权利要求2的化合物，其中R1构成-CN。
8.权利要求2的化合物，其中R1构成-NO2。
9.权利要求2的化合物，其中R1构成-NH2。
10.权利要求2的化合物，其中R2构成
11.权利要求2的化合物，其中R2构成
12.权利要求2的化合物，其中R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
13.权利要求2的化合物，其中X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；且其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
14.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
15.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
16.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
17.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
18.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
19.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
20.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
21.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
22.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
23.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
24.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
25.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
26.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
27.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
28.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
29.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
30.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
31.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
32.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
33.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
34.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
35.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
36.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
37.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
38.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
39.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
40.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
41.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
42.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
43.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
44.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
45.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
46.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
47.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
48.权利要求2的化合物或其立体异构体、前药或药用盐，所述化合物具有下式结构：
49.组合物，包含权利要求1的化合物以及药用载体或稀释剂。
50.化合物或其立体异构体、前药或药用盐在制备药物中的应用，该药物用于在需要其的患者中降低MIF活性，所述化合物具有选自下列各项的结构：
和
其中：
R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；
R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；
R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3；
R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；
R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；
X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；
Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；
m独立地为0，1，2，3，或4；且
n为0，1，或2。
51.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物炎症。
52.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物脓毒性休克。
53.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物关节炎。
54.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物癌症。
55.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物急性呼吸窘迫综合征。
56.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物炎性疾病。
57.权利要求56的应用，其中所述炎性疾病选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病，和哮喘。
58.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物心脏病。
59.权利要求58的应用，其中所述心脏病选自由下列各项组成的组：心脏功能障碍，心肌梗死，充血性心力衰竭，再狭窄和动脉粥样硬化。
60.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物自身免疫疾病。
61.权利要求60的应用，其中该自身免疫疾病选自糖尿病，哮喘，和多发性硬化症。
62.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于抑制温血动物免疫应答。
63.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于减少温血动物血管生成。
64.权利要求1的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗温血动物与糖皮质激素水平过高有关的疾病。
65.权利要求63的应用，其中所述疾病是库欣病。
66.一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将POCl3与式(3)的化合物反应：
式(3)，
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4；由此生成式(4)的化合物：
式(4)；
将式(4)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(5)的化合物：
将式(5)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(6)的化合物：
其中式(6)的化合物适合用作MIF抑制剂。
67.权利要求66的方法，其中R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
68.权利要求66的方法，其中R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
69.权利要求66的方法，其中R1构成-NH-C(＝O)CH3。
70.权利要求66的方法，其中R1构成-CN。
71.权利要求66的方法，其中R1构成-NO2。
72.权利要求66的方法，其中R1构成-NH2。
73.权利要求66的方法，其中R2构成
74.权利要求66的方法，其中R2构成
75.权利要求66的方法，其中R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
76.权利要求66的方法，其中X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；且其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
77.一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(13)的化合物与环己胺反应：
其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(14)的化合物：
式(14)；
将式(14)的化合物与POCl3反应，由此生成式(15)的化合物：
式(15)；
将式(15)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(16)的化合物：
将式(16)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(17)的化合物：
其中式(17)的化合物适合用作MIF抑制剂。
78.权利要求77的方法，其中R2构成
79.权利要求77的方法，其中R2构成
80.权利要求77的方法，其中R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
81.权利要求77的方法，其中X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；且其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
82.一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(23)的化合物与POCl3和三氟乙酸反应，
式(23)，
其中R1选自由下列各项组成的组：-CN，-NO，-NO2，-C(＝O)R3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-SO2NR4R5，-NR3SO2R3，-NHSO2R3，-S(O)mR3，-(CH2)mNR4R5，和-(CH2)mC(＝O)Ar；R3独立地选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环；X选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Y选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Z选自由下列各项组成的组：氢，卤素，-F，-Cl，-CN，-NO，-NO2，-OCF3，-CF3，-NHSO2R3，-C(＝O)R3，-C(＝O)OR3，-C(＝O)NR4R5，-NR3C(＝O)R3，-NR3SO2R3，-S(O)mR3，-R3，-OR3，-SR3，-C(＝O)OH，-NHC(＝O)R3，和-NR4R5；Ar独立地选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(24)的化合物：
将式(24)的化合物与下式的化合物反应：
其中R2选自-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，由此生成式(25)的化合物：
将式(25)的化合物与具有式RX’的化合物反应，其中X’包含卤素并且其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5，由此生成式(26)的化合物：
其中式(26)的化合物适合用作MIF抑制剂。
83.权利要求82的方法，其中R1构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
84.权利要求82的方法，其中R1构成-C(＝O)OCH2CH3。
85.权利要求82的方法，其中R1构成-NH-C(＝O)CH3。
86.权利要求82的方法，其中R1构成-CN。
87.权利要求82的方法，其中R1构成-NO2。
88.权利要求82的方法，其中R1构成-NH2。
89.权利要求82的方法，其中R2构成
90.权利要求82的方法，其中R2构成
91.权利要求82的方法，其中R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
92.权利要求82的方法，其中X选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；其中Y选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯；和其中Z选自由下列各项组成的组：氢，氟，和氯。
93.权利要求82的方法，其中R构成苄基。
94.一种制备化合物的方法，该方法包含以下步骤：
将式(3a)的化合物与POCl3反应，
式(3a)
由此生成式(4a)的化合物：
将式(4a)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(5a)的化合物：
式(5a)；
将式(5a)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；且其中R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(6a)的化合物：
式(6a)
其中式(6a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
95.权利要求94的方法，其中R2构成
96.一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将式(13a)的化合物与环己胺反应：
式(13a)
由此生成式(14)的化合物：
式(14a)
将式(14a)的化合物与POCl3反应，由此生成式(15a)的化合物：
式(15a)
将式(15a)的化合物与哌嗪反应，由此生成式(16a)的化合物：
将式(16a)的化合物与具有式R2-C(＝O)Cl的化合物反应，其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：R3烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(17a)的化合物：
式(17a)
其中式(17a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
97.权利要求96的方法，其中R2构成
或
98.一种制备化合物的方法，该方法包含下列步骤：
将式(23a)的化合物与POCl3和三氟乙酸反应，
由此生成式(24a)的化合物：
式(24a)
将式(24a)的化合物与下式化合物反应
其中R2选自由下列各项组成的组：-CH2R3，-NR4R5，-OR3，和-R3，其中R3选自由下列各项组成的组：烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环；R4和R5独立地选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，和取代的杂环，或R4和R5一起构成杂环或取代的杂环，由此生成式(25a)的化合物：
式(25a)；
将式(25a)的化合物与具有式RX的化合物反应，其中X包含卤素并且其中R选自由下列各项组成的组：氢，烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，杂环，取代的杂环，-(CH2)mC(＝O)Ar，和-(CH2)mNR4R5，其中Ar选自由下列各项组成的组：芳基和取代的芳基；且m独立地为0，1，2，3，或4，由此生成式(26a)的化合物：
式(26a)
其中式(26a)的化合物适合用作MIF抑制剂。
99.权利要求98的方法，其中R2构成
100.权利要求98的方法，其中R2构成
101.权利要求98的方法，其中R构成-(CH2)mC(＝O)Ar。
102.权利要求98的方法，其中R构成苄基。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49744303P | 2003-08-22 | 2003-08-22 | |
| US60/497,443 | 2003-08-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1839133A true CN1839133A (zh) | 2006-09-27 |
Family
ID=34272569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2004800241375A Pending CN1839133A (zh) | 2003-08-22 | 2004-08-09 | 作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050124604A1 (zh) |
| EP (1) | EP1656376A1 (zh) |
| JP (1) | JP2007503388A (zh) |
| CN (1) | CN1839133A (zh) |
| AR (1) | AR045471A1 (zh) |
| AU (1) | AU2004268941A1 (zh) |
| BR (1) | BRPI0413695A (zh) |
| CA (1) | CA2531506A1 (zh) |
| MX (1) | MXJL06000006A (zh) |
| PE (1) | PE20051112A1 (zh) |
| TW (1) | TW200524928A (zh) |
| UY (1) | UY28483A1 (zh) |
| WO (1) | WO2005021546A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103360388A (zh) * | 2012-04-10 | 2013-10-23 | 江苏先声药物研究有限公司 | 5-氨基-1,4-二氢-1,8-萘啶衍生物及其药物组合物和用途 |
| CN111658653A (zh) * | 2019-03-08 | 2020-09-15 | 南京药捷安康生物科技有限公司 | 磷酸二酯酶抑制剂的用途 |
| CN112654621A (zh) * | 2018-06-27 | 2021-04-13 | 百时美施贵宝公司 | 可作为t细胞活化剂的经取代萘啶酮化合物 |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UY27304A1 (es) | 2001-05-24 | 2002-12-31 | Avanir Pharmaceuticals | Inhibidores del factor inhibidor de la migración de los macrófagos y métodos para su identificación |
| TW200418829A (en) * | 2003-02-14 | 2004-10-01 | Avanir Pharmaceutics | Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same |
| US20060229314A1 (en) * | 2005-03-24 | 2006-10-12 | Jagadish Sircar | Thienopyridinone derivatives as macrophage migration inhibitory factor inhibitors |
| GB0605689D0 (en) * | 2006-03-21 | 2006-05-03 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2008076427A2 (en) | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Amgen Inc. | Naphthalenone compounds exhibiting prolyl hydroxylase inhibitory activity, compositions, and uses thereof |
| EP2097416B1 (en) | 2006-12-18 | 2012-09-12 | Amgen, Inc | Azaquinolone based compounds exhibiting prolyl hydroxylase inhibitory activity, compositions, and uses thereof |
| JP2010524942A (ja) | 2007-04-18 | 2010-07-22 | アムジエン・インコーポレーテツド | プロリルヒドロキシラーゼを阻害するキノロン及びアザキノロン |
| US7569726B2 (en) | 2007-04-18 | 2009-08-04 | Amgen Inc. | Indanone derivatives that inhibit prolyl hydroxylase |
| EP2150251B9 (en) | 2007-05-04 | 2013-02-27 | Amgen, Inc | Thienopyridine and thiazolopyridine derivatives that inhibit prolyl hydroxylase activity |
| AU2008248165B2 (en) | 2007-05-04 | 2011-12-08 | Amgen Inc. | Diazaquinolones that inhibit prolyl hydroxylase activity |
| US9643922B2 (en) | 2008-08-18 | 2017-05-09 | Yale University | MIF modulators |
| US9540322B2 (en) | 2008-08-18 | 2017-01-10 | Yale University | MIF modulators |
| WO2011056566A2 (en) * | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for treatment of cancer |
| WO2012009649A1 (en) | 2010-07-16 | 2012-01-19 | Anderson Gaweco | Mif inhibitors and their uses |
| WO2012031383A1 (zh) * | 2010-09-06 | 2012-03-15 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 酰胺类化合物 |
| EP3354640A3 (en) * | 2011-04-13 | 2018-10-31 | Innovimmune Biotherapeutics, Inc. | Mif inhibitors and their uses |
| US9617212B2 (en) | 2013-12-17 | 2017-04-11 | Controlled Chemicals, Inc. | Isoindolin-1-ones as macrophage migration inhibitory factor (MIF) inhibitors |
| LT3558955T (lt) | 2016-12-22 | 2021-11-10 | Amgen Inc. | Benzizotiazolo, izotiazolo[3,4-b]piridazino ir ftalazino, pirido[2,3-d] piridazino ir pirido[2,3-d]pirimidino dariniai, kaip kras g12c inhibitoriai, skirti plaučių, kasos arba storosios žarnos vėžio gydymui |
| JOP20190272A1 (ar) | 2017-05-22 | 2019-11-21 | Amgen Inc | مثبطات kras g12c وطرق لاستخدامها |
| TWI731264B (zh) | 2017-09-08 | 2021-06-21 | 美商安進公司 | Kras g12c抑制劑以及其使用方法 |
| CN107556309B (zh) * | 2017-09-11 | 2020-12-01 | 浙江永宁药业股份有限公司 | 多取代四氢萘啶类化合物的药物用途及其制备方法 |
| JP7266043B2 (ja) | 2018-05-04 | 2023-04-27 | アムジエン・インコーポレーテツド | ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ阻害剤及びそれを使用する方法 |
| MX2020011582A (es) | 2018-05-04 | 2020-11-24 | Amgen Inc | Inhibidores de kras g12c y metodos para su uso. |
| JP7361720B2 (ja) | 2018-05-10 | 2023-10-16 | アムジエン・インコーポレーテツド | がんの治療のためのｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤 |
| EP3802535B1 (en) | 2018-06-01 | 2022-12-14 | Amgen, Inc | Kras g12c inhibitors and methods of using the same |
| AU2019284472B2 (en) * | 2018-06-11 | 2024-05-30 | Amgen Inc. | KRAS G12C inhibitors for treating cancer |
| AU2019336588B2 (en) | 2018-06-12 | 2022-07-28 | Amgen Inc. | KRAS G12C inhibitors encompassing a piperazine ring and use thereof in the treatment of cancer |
| EP3814347B1 (en) * | 2018-06-27 | 2023-05-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Naphthyridinone compounds useful as t cell activators |
| JP2020090482A (ja) | 2018-11-16 | 2020-06-11 | アムジエン・インコーポレーテツド | Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤化合物の重要な中間体の改良合成法 |
| EP3883565A1 (en) | 2018-11-19 | 2021-09-29 | Amgen Inc. | Kras g12c inhibitors and methods of using the same |
| JP7377679B2 (ja) | 2018-11-19 | 2023-11-10 | アムジエン・インコーポレーテツド | がん治療のためのｋｒａｓｇ１２ｃ阻害剤及び１種以上の薬学的に活性な追加の薬剤を含む併用療法 |
| CN111471059B (zh) * | 2019-01-23 | 2022-12-02 | 药捷安康(南京)科技股份有限公司 | Pde9抑制剂及其用途 |
| EP3738593A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-18 | Amgen, Inc | Dosing of kras inhibitor for treatment of cancers |
| US11236091B2 (en) | 2019-05-21 | 2022-02-01 | Amgen Inc. | Solid state forms |
| AR119821A1 (es) | 2019-08-28 | 2022-01-12 | Bristol Myers Squibb Co | Compuestos de piridopirimidinonilo sustituidos útiles como activadores de células t |
| AR120823A1 (es) | 2019-12-23 | 2022-03-23 | Bristol Myers Squibb Co | Compuestos bicíclicos sustituidos útiles como activadores de células t |
| US11767321B2 (en) | 2020-10-05 | 2023-09-26 | Enliven Inc. | 5- and 6-azaindole compounds for inhibition of BCR-ABL tyrosine kinases |
| WO2022093817A1 (en) * | 2020-10-26 | 2022-05-05 | Yale University | Macrophage migration inhibitory factor inhibitors, and methods of making and using same |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4324893A (en) * | 1979-04-18 | 1982-04-13 | American Home Products Corporation | 4-Amino-3-carboxy or cyano-1,2-dihydro-2-oxo-1,8-naphthyridine derivatives |
| US4299814A (en) * | 1979-05-25 | 1981-11-10 | Monsanto Company | Radioimmunoassay of MIF |
| US4284768A (en) * | 1980-07-02 | 1981-08-18 | American Home Products Corporation | 1,2-Dihydro-4-amino-2-oxo-3-quinoline-carboxylic acid derivatives |
| DK79985A (da) | 1984-02-22 | 1985-08-23 | Wellcome Found | Kloning af dna for protozoelle antigener og dets anvendelse |
| US5869534A (en) | 1992-05-21 | 1999-02-09 | The Picower Institute For Medical Research | Glycosylation of lipids and lipid-containing particles, and diagnostic and therapeutic methods and materials derived therefrom |
| US5733524A (en) * | 1984-03-19 | 1998-03-31 | The Picower Institute For Medical Research | Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke |
| US5801200A (en) * | 1984-03-19 | 1998-09-01 | The Picower Institute For Medical Research | Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke |
| US5733933A (en) * | 1984-03-19 | 1998-03-31 | The Picower Institute For Medical Research | Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke |
| US5700447A (en) * | 1992-05-21 | 1997-12-23 | The Picowder Institute For Medical Research | Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke |
| AU592753B2 (en) | 1984-05-24 | 1990-01-25 | Ciba-Geigy Ag | Lymphokine in pure foem, novel monoclonal antibodies hybridoma cell lines, processes and applications |
| US4708937A (en) * | 1984-10-15 | 1987-11-24 | Brigham & Women's Hospital | Purified migration inhibitory factor also having colony stimulating factor activity |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| GB8602626D0 (en) * | 1986-02-04 | 1986-03-12 | Ciba Geigy Ag | Neurite-promoting factor |
| ES2052602T3 (es) | 1986-10-03 | 1994-07-16 | Ciba Geigy Ag | Nuevos peptidos afines a las linfocinas. |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| FI82144C (fi) * | 1989-03-22 | 1991-01-10 | Wallac Oy | Foerfarande foer samtidig bestaemning av flera ligander. |
| GB8915414D0 (en) | 1989-07-05 | 1989-08-23 | Ciba Geigy | Novel cytokines |
| US5328990A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-12 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Isolation of macrophage migration inhibition factor from ocular lens |
| US5352660A (en) * | 1991-10-31 | 1994-10-04 | Mount Sinai Hospital Corporation | Method for assaying for a substance that affects a SH2-phosphorylated ligand regulatory system |
| US5624804A (en) * | 1991-12-20 | 1997-04-29 | The Rockefeller University | Immunochemical detection of In vivo advanced glycosylation end products |
| US6774227B1 (en) | 1993-05-17 | 2004-08-10 | Cytokine Pharmasciences, Inc. | Therapeutic uses of factors which inhibit or neutralize MIF activity |
| US6080407A (en) * | 1993-05-17 | 2000-06-27 | The Picower Institute For Medical Research | Diagnostic assays for MIF |
| EP0702566B1 (en) | 1993-05-17 | 2010-07-21 | Cytokine Pharmasciences, Inc | Inhibition of migration inhibitory factor in the treatment of diseases involving cytokine-mediated toxicity |
| US5650295A (en) * | 1995-06-02 | 1997-07-22 | Human Genone Sciences, Inc. | Macrophage migration inhibitory factor-3 |
| US6420188B1 (en) * | 1996-02-16 | 2002-07-16 | The Picower Institute For Medical Research | Screening assay for the identification of inhibitors for macrophage migration inhibitory factor |
| US6492428B1 (en) | 2000-07-26 | 2002-12-10 | The Picower Institute For Medical Research | Compounds having MIF antagonist activity |
| EP0898709A2 (en) | 1996-04-18 | 1999-03-03 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | $i(IN VITRO) FLUORESCENCE POLARIZATION ASSAY |
| US5883224A (en) | 1996-04-19 | 1999-03-16 | Cytokine Sciences, Inc. | Characterization of transfer factors and methods of use |
| JPH1171351A (ja) * | 1997-08-29 | 1999-03-16 | Ss Pharmaceut Co Ltd | 置換キノロン誘導体及びこれを含有する医薬 |
| US6413939B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-07-02 | The Picower Institute For Medical Research | Inducible phosphofructokinase and the Warburg effect |
| ES2192801T3 (es) | 1997-12-05 | 2003-10-16 | Upjohn Co | Ensayos de criba de alta productividad de proteina quinasas y fosfatasas, basados en fluorescencia. |
| US6238874B1 (en) * | 1998-07-28 | 2001-05-29 | Biometric Imaging, Inc. | Cell motility assay |
| US6214343B1 (en) * | 1999-05-24 | 2001-04-10 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and treatment of necrotizing enterocolitis |
| DE60018782T2 (de) * | 1999-10-19 | 2006-04-06 | Merck & Co., Inc. | Tyrosin kinase inhibitoren |
| CA2389229A1 (en) * | 1999-10-29 | 2001-05-10 | The Picower Institute For Medical Research | Compounds having mif antagonist activity |
| EP1345603A4 (en) * | 2000-12-20 | 2004-09-08 | Merck & Co Inc | P38 KINASE INHIBITORS (HALO-BENZO CARBONYL) HETEROCYCLO- FUSIONNES PHENYL |
| UY27304A1 (es) * | 2001-05-24 | 2002-12-31 | Avanir Pharmaceuticals | Inhibidores del factor inhibidor de la migración de los macrófagos y métodos para su identificación |
| JP4117462B2 (ja) * | 2001-07-03 | 2008-07-16 | 株式会社大塚製薬工場 | ナフチリジンおよびキノリン誘導体 |
| US6822097B1 (en) * | 2002-02-07 | 2004-11-23 | Amgen, Inc. | Compounds and methods of uses |
| JP2006511445A (ja) * | 2002-06-07 | 2006-04-06 | コーティカル・ピーティーワイ・リミテッド | マクロファージ遊走阻止因子（ｍｉｆ）のサイトカインまたは生物学的活性を阻害するナフタレン誘導体 |
| TW200418829A (en) * | 2003-02-14 | 2004-10-01 | Avanir Pharmaceutics | Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same |
-
2004
- 2004-08-09 EP EP04780510A patent/EP1656376A1/en not_active Ceased
- 2004-08-09 JP JP2006523903A patent/JP2007503388A/ja active Pending
- 2004-08-09 CA CA002531506A patent/CA2531506A1/en not_active Abandoned
- 2004-08-09 WO PCT/US2004/025683 patent/WO2005021546A1/en active Application Filing
- 2004-08-09 CN CNA2004800241375A patent/CN1839133A/zh active Pending
- 2004-08-09 AU AU2004268941A patent/AU2004268941A1/en not_active Abandoned
- 2004-08-09 MX MXJL06000006A patent/MXJL06000006A/es unknown
- 2004-08-09 BR BRPI0413695-0A patent/BRPI0413695A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-08-17 US US10/920,031 patent/US20050124604A1/en not_active Abandoned
- 2004-08-18 TW TW093124762A patent/TW200524928A/zh unknown
- 2004-08-20 AR ARP040102991A patent/AR045471A1/es not_active Application Discontinuation
- 2004-08-20 UY UY28483A patent/UY28483A1/es not_active Application Discontinuation
- 2004-08-21 PE PE2004000808A patent/PE20051112A1/es not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-03-16 US US11/687,601 patent/US7361760B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103360388A (zh) * | 2012-04-10 | 2013-10-23 | 江苏先声药物研究有限公司 | 5-氨基-1,4-二氢-1,8-萘啶衍生物及其药物组合物和用途 |
| CN103360388B (zh) * | 2012-04-10 | 2017-11-14 | 江苏先声药业有限公司 | 5‑氨基‑1，4‑二氢‑1，8‑萘啶衍生物及其药物组合物和用途 |
| CN112654621A (zh) * | 2018-06-27 | 2021-04-13 | 百时美施贵宝公司 | 可作为t细胞活化剂的经取代萘啶酮化合物 |
| CN112654621B (zh) * | 2018-06-27 | 2024-05-14 | 百时美施贵宝公司 | 可作为t细胞活化剂的经取代萘啶酮化合物 |
| CN111658653A (zh) * | 2019-03-08 | 2020-09-15 | 南京药捷安康生物科技有限公司 | 磷酸二酯酶抑制剂的用途 |
| WO2020182076A1 (zh) * | 2019-03-08 | 2020-09-17 | 南京药捷安康生物科技有限公司 | 磷酸二酯酶抑制剂的用途 |
| CN111658653B (zh) * | 2019-03-08 | 2022-09-09 | 药捷安康(南京)科技股份有限公司 | 磷酸二酯酶抑制剂的用途 |
| AU2020235187B2 (en) * | 2019-03-08 | 2023-09-07 | Transthera Sciences (Nanjing), Inc. | Uses of phosphodiesterase inhibitors |
| TWI816026B (zh) * | 2019-03-08 | 2023-09-21 | 大陸商藥捷安康(南京)科技股份有限公司 | 磷酸二酯酶抑制劑的用途和藥盒 |
| AU2020235187A8 (en) * | 2019-03-08 | 2024-02-08 | Transthera Sciences (Nanjing), Inc. | Uses of phosphodiesterase inhibitors |
| AU2020235187B8 (en) * | 2019-03-08 | 2024-02-08 | Transthera Sciences (Nanjing), Inc. | Uses of phosphodiesterase inhibitors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1656376A1 (en) | 2006-05-17 |
| US20050124604A1 (en) | 2005-06-09 |
| UY28483A1 (es) | 2005-03-31 |
| AU2004268941A1 (en) | 2005-03-10 |
| BRPI0413695A (pt) | 2006-10-24 |
| TW200524928A (en) | 2005-08-01 |
| JP2007503388A (ja) | 2007-02-22 |
| MXJL06000006A (es) | 2006-05-04 |
| AR045471A1 (es) | 2005-10-26 |
| CA2531506A1 (en) | 2005-03-10 |
| US20070191388A1 (en) | 2007-08-16 |
| WO2005021546A1 (en) | 2005-03-10 |
| US7361760B2 (en) | 2008-04-22 |
| PE20051112A1 (es) | 2006-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1839133A (zh) | 作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用 | |
| CN1750823A (zh) | 巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂及其鉴定方法 | |
| CN1523989A (zh) | 巨噬细胞转移抑制因子抑制剂及其鉴定方法 | |
| CN1051548C (zh) | 杂双环衍生物、含有它们的药物组合物及其制备方法与用途 | |
| CN1234693C (zh) | 抑制蛋白激酶的吲唑化合物和药物组合物及它们的应用 | |
| CN1183113C (zh) | 作为ppar受体配体的三芳基酸衍生物 | |
| CN1085666C (zh) | 用于抑制蛋白质酪氨酸激酶介导的细胞增殖的6－芳基吡啶并[2,3－d]嘧啶和1,5－二氮杂萘 | |
| CN1114403C (zh) | 玻连蛋白受体拮抗剂 | |
| CN1246857A (zh) | 取代的嘧啶酮和吡啶酮化合物和它们的应用 | |
| CN1656073A (zh) | 可用于治疗蛋白激酶依赖性疾病的二芳基脲衍生物 | |
| CN1209063A (zh) | 玻连蛋白受体拮抗剂 | |
| CN1156995A (zh) | 玻璃体结合蛋白受体拮抗剂 | |
| CN1575177A (zh) | Cxcr3拮抗剂 | |
| CN1468241A (zh) | 作为gabaa受体配体的杂环化合物 | |
| CN1678586A (zh) | 取代的喹啉ccr5受体拮抗剂 | |
| CN1377354A (zh) | 某些亚烷基二胺一取代的吡唑并[1,5－a]－1,5－嘧啶和吡唑并[1,5－a]－1,3,5－三嗪 | |
| CN1759114A (zh) | 作为细胞因子抑制剂的杂环n－芳基甲酰胺 | |
| CN1209744A (zh) | 玻连蛋白受体拮抗剂 | |
| CN1660840A (zh) | 治疗炎性疾病的酞嗪衍生物 | |
| CN1688573A (zh) | 糖原合成酶激酶3的吡咯基抑制剂 | |
| CN1400970A (zh) | 取代的芳基吡嗪 | |
| CN1993347A (zh) | 钾通道抑制剂 | |
| CN1413210A (zh) | 用于治疗炎症、自身免疫性疾病和呼吸系统疾病的vla－4依赖性细胞结合的非肽基抑制剂 | |
| CN1633296A (zh) | 糖皮质素模拟物、其制备方法、药物组合物及其用途 | |
| CN1688549A (zh) | 具有TGFβ抑制活性的化合物和含所述化合物的药用组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20060927 |