CN1750823A - 巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂及其鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供MIF的抑制剂，其应用于多种疾病的治疗中，包括与MIF活性有关的病理状况的治疗。所述的MIF抑制剂具有右式结构，包括其立体异构体、前药和药用盐，其中n，R1，R2，R3，R4，X，和Z如本文定义。还提供含有MIF的抑制剂和药用载体的组合物，以及使用它们的方法。

Description

巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂及其鉴定方法
发明领域
[0001]本发明一般涉及巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的抑制剂，鉴定MIF抑制剂的方法，和通过施用此类抑制剂治疗MIF相关病症的方法。
发明背景
[0002]淋巴因子，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，已经被鉴定为是巨噬细胞在宿主防御中的功能的介体，并且其表达与延迟的过敏性、免疫调节、炎症和细胞免疫有关。参见Metz和Bucala，Adv.Immunol.66：197-223，1997。巨噬细胞移动抑制因子(MIFs)，它大小介于12-13千道尔顿(kDa)之间，已经在若干哺乳动物和鸟类中鉴定；参见，例如，Galat等，Fed.Eur.Biochem.Soc.319：233-236，1993；Wistow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1272-1275，1993；Weiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7522-7526，1989；Bernhagen等，Nature 365：756-759，1993；Blocki等，Protein Science2：2095-2102，1993；和Blocki等，Nature 360：269-270，1992。MIF抑制剂也公开在待决美国专利申请号10/156,650(2002年5月24日提交)中，其全文内容在此引入作为参考。
[0003]虽然MIF首次被表征为能够阻断巨噬细胞移动，MIF也似乎通过不同于干扰素-γ的作用机理影响巨噬细胞的粘附；诱导巨噬细胞表达白介素-1-β，白介素-6，和肿瘤坏死因子α；上调HLA-DR(人白细胞抗原，d-相关的，由染色体6上的d基因座编码并在淋巴样细胞上发现)；提高氧化氮合酶和氧化氮的浓度；和活化巨噬细胞以杀死杜诺凡氏利什曼原虫(Leishmania donovani)肿瘤细胞且抑制支原体(Mycoplasma avium)的生长。除了其作为免疫逃避分子的潜在作用以外，MIF可以在与不完全弗氏制剂或脂质体中的牛血清白蛋白或HIV gp120一起给予时充当免疫佐剂，与完全弗氏相比引起抗原诱导的增殖作用。另外，MIF已经被描述为糖皮质激素抗衡调节剂和血管生成因子。作为糖皮质激素诱导而不抑制的数种蛋白质中的一种，它发挥减弱糖皮质激素的免疫抑制效果的作用。因此，它被视为调节糖皮质激素的免疫抑制作用的有力要素。所以，当其活性/基因表达被过量外源性糖皮质激素的给药过度诱发时(例如当临床指导抑制炎症、免疫力等)，存在显著的毒性，因为MIF本身加剧炎症/免疫反应。参见Buccala等，Ann.Rep.Med.Chem.33：243-252，1998。
[0004]虽然MIF还被认为通过特定受体作用于细胞，由此激活细胞内级联，其中包括erk磷酸化和MAP激酶和基质金属蛋白酶，c-jun(原癌基因jun)，c-fos(原癌基因fos)和IL-1mRNA的上调(参见Onodera等，J.Biol.Chem.275：444-450，2000)，它还具有内源性酶促活性，例如其互变异构化适当底物的性能(例如，多巴色素)。此外，这种酶促活性是否介导对MIF的生物反应和这种蛋白的体外和体内活性仍然不清楚。尽管MIF的定点诱变产生具有完全内在活性的突变体，但能仍然无法具有酶促活性(Hermanowski-Vosatka等，Biochemistry 38：12841-12849，1999)，Swope等已经描述了细胞因子活性和MIF的催化位点之间的直接关联(Swope等，EMBO J.17(13)：3534-3541，1998)。所以，人们并不清楚通过对多巴色素互变异构酶独自的抑制作用来鉴定MIF活性的抑制剂能够获得具有临床价值的MIF抑制剂的策略。评估MIF对其细胞表面受体的抑制作用的能力也是有限的，因为当前不知道高亲和力受体。
[0005]开发MIF抑制剂的兴趣来自于观察到，已知MIF基于其细胞因子活性可将巨噬细胞浓集在感染的位点，和细胞介导的免疫性。此外，MIF被视为是巨噬细胞粘附、吞噬作用和杀肿瘤活性的介体。参见Weiser等，J.Immunol.147：2006-2011，1991。因此，MIF的抑制导致细胞因子、生长因子、趋化因子和淋巴因子的直接抑制，它可使巨噬细胞到达炎症位点。人MIFcDNA已经自T-细胞系分离，和编码分子量约12.4kDa且含有115个氨基酸残基的蛋白质，它构成活化形式的同源三聚体(Weiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7522-7526，1989)。尽管MIF最初是在活化T-细胞中观察到，现在已报告在多种组织包括肝脏、肺、眼晶状体、卵巢、脑、心脏、脾脏、肾脏、肌肉和其他组织内观察到。参见Takahashi等，Microbiol.Immunol.43(1)：61-67，1999。MIF的另一特征是其缺少常规前导序列(即无前导蛋白质)来指挥经内质网/Golgi(ER/Golgi)途径的经典分泌。
[0006]具有中和MIF的细胞因子活性作用的MIF抑制剂(和鉴定MIF抑制剂的方法)提供了优于其他类型抑制剂的显著优越性。例如，互变异构酶活性独自与炎症反应之间的联系还存在争议。此外，细胞内作用的抑制剂常常由于其对有关靶标或靶标内部细胞的作用而呈毒性。配体受体复合物的小分子抑制剂难以识别，更不用说优化和开发。细胞因子如MIF的理想抑制剂是改变MIF本身致使当它被细胞释放出来时已经得到有效中和的物质。具有这种活性的小分子优于抗体，因为蛋白质和化学物质之间作为药物时存在重大差别。MIF抑制剂公开在待决美国专利申请号10/156,650(2002年5月24日提交)中。
发明概述
[0007]由于已经在多种组织中鉴定出MIF并且它与多种病理学事件有关，因此本领域需要鉴定MIF的抑制剂。还需要含有此类抑制剂的药物组合物，以及利用它们治疗例如免疫有关的病症或其他MIF诱导的病理学事件(如肿瘤有关的血管生成)的方法。优选的实施方案可以完全符合这些需求，并且提供了其他优越性。
[0008]在优选实施方案中，提供具有下列通用结构(Ia)和(Ib)的MIF的抑制剂：
Figure A20048000430500291
包括其立体异构体，前药，和药用盐，其中n，R1，R2，R3，R4，X，和Z定义如下。
[0009]优选实施方案的MIF抑制剂具有非常广泛的治疗应用，并且可以用来治疗多种病症、疾病，或者病理症状包括，但不限于，多种免疫相关反应，肿瘤生长(例如，前列腺癌等)，肾小球肾炎，炎症，疟疾性贫血，脓毒性休克，肿瘤有关的血管生成，玻璃体视网膜病，牛皮癣，移植物抗宿主病(组织排斥)，特应性皮炎，类风湿性关节炎，炎性肠病，中耳炎，局限性回肠炎，急性呼吸窘迫综合症，延迟型过敏症和其他疾病。参见，例如，Metz和Bucala(supra)；Swope和Lolis，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol139：1-32，1999；Waeber等，糖尿病M.Res.Rev.15(1)：47-54，1999；Nishihira，Int.J.Mol.Med.2(1)：17-28，1998；Bucala，Ann.N.Y.Acad.Sci.840：74-82，1998；Bernhagen等，J.Mol.Med.76(3-4)：151-161，1998；Donnelly和Bucala，Mol.Med.Today 3(11)：502-507，1997；Bucala等，FASEBJ.10(14)：1607-1613，1996。这些方法包括给需要其的动物施用有效量的一种或多种优选实施方案提供的MIF的抑制剂，优选以药物组合物的形式施用。所以，在另一实施方案中，提供的药物组合物含有一种或多种优选实施方案的MIF抑制剂和药用载体和/或稀释剂。
[0010]一个优选实施方案的一种策略表征了与MIF相互作用以诱发MIF的构象变化并由此使其丧失对单克隆抗体的免疫反应性的分子。当利用筛选进行识别时，这种变化可以鉴定出小分子MIF的抑制剂。这个特定方案可以扩展到任何其中免疫反应性的丧失可成为活性(例如，细胞因子活性，酶促活性，辅因子活性，等等)的替代的生物活性多肽。
[0011]在第一个实施方案中，提供具有下列结构的化合物：
或其立体异构体、前药或药用盐，其中X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自：
Figure A20048000430500311
-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0012]第一个实施方案的一个方面中，提供一种含有第一个实施方案的化合物以及药用载体或稀释剂的组合物。
[0013]第一个实施方案的一个方面中，提供一种用于治疗温血动物中炎症的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0014]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中的脓毒性休克的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0015]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中关节炎的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0016]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中癌症的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0017]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中急性呼吸窘迫综合症的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0018]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中炎性疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该炎性疾病可以包括类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病或哮喘。
[0019]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中自身免疫疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该自身免疫疾病可以包括糖尿病，哮喘，或多发性硬化症。
[0020]第一个实施方案的一个方面中，提供一种抑制温血动物中免疫反应的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0021]第一个实施方案的一个方面中，提供一种减少温血动物中血管生成的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。
[0022]第一个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中与过度糖皮质激素水平有关的疾病的方法，包括给动物施用有效量的第一个实施方案的化合物。该疾病可以包括库欣病。
[0023]第一个实施方案的一个方面中，提供用于治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物包括第一个实施方案所述的MIF抑制化合物和用于治疗所述疾病或病症的药物，其中该药物不具有可测的MIF抑制活性。
[0024]第一个实施方案的一个方面中，提供用于治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有第一个实施方案所述的MIF抑制化合物和选自下列的药物：非甾类抗炎药，抗感染药，β兴奋剂，甾族化合物，抗组胺药，抗癌药，哮喘药，败血症药物，关节炎药，和免疫抑制药。
[0025]在第二个实施方案中，提供具有下列结构的化合物：
Figure A20048000430500331
或其立体异构体、前药或药用盐。
[0026]在第三个实施方案中，提供一种在需要其的患者中降低MIF活性的方法，包括给该患者施用有效量的具有下面结构的化合物：
Figure A20048000430500332
或其立体异构体、前药或药用盐。
[0027]在第四个实施方案中，提供了具有以下结构的化合物：
Figure A20048000430500341
或其立体异构体、前药或药用盐，其中R1选自：
Figure A20048000430500342
-CH2CH2N(R)2，-CH2CH2NC(O)N(R)2，和-CH2COOR；R12选自氢，氯，氟，和甲基；R4选自：
Figure A20048000430500343
和
Figure A20048000430500344
R独立地选自氢，氟，氯，直链C1-C5烷基，和支链C1-C5烷基；和R””选自氢，卤素，烷基，氰基，硝基，-COOR，-N(R)2，-OR，-NHCOR，和-OCF3。
[0028]在第五个实施方案中，提供了具有以下结构的化合物：
或其立体异构体、前药或药用盐，其中R1选自：
Figure A20048000430500351
和
R4选自：和 和
R12选自氢，氯，氟，和甲基。
[0029]在第六个实施方案中，提供一种在需要其的患者中降低MIF活性的方法，包括给该患者施用有效量的具有以下结构的化合物：
或其立体异构体、前药或药用盐，其中X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1，或2，条件是当n是0，Z是-C(＝O)-；R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自：
-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，取代的烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0030]在第七个实施方案，提供具有以下结构的化合物：
或其立体异构体、前药或药用盐，其中X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自：
Figure A20048000430500372
-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0031]第七个实施方案的一个方面中，提供一种含有第七个实施方案的化合物以及药用载体或稀释剂的组合物。
[0032]第七个实施方案的一个方面中，提供一种用于治疗温血动物中炎症的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0033]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中脓毒性休克的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0034]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中关节炎的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0035]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中癌症的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0036]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中急性呼吸窘迫综合症的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0037]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中炎性疾病的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。该炎性疾病可以包括类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病或哮喘。
[0038]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中自身免疫疾病的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。该自身免疫疾病可以包括糖尿病，哮喘，或多发性硬化症。
[0039]第七个实施方案的一个方面中，提供一种抑制温血动物中免疫反应的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0040]第七个实施方案的一个方面中，提供一种减少温血动物中血管生成的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。
[0041]第七个实施方案的一个方面中，提供一种治疗温血动物中与过量糖皮质激素水平有关的疾病的方法，包括给动物施用有效量的第七个实施方案的化合物。该疾病可以包括库欣病。
[0042]第七个实施方案的一个方面中，提供用于治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物包括第七个实施方案所述的MIF抑制化合物和用于治疗所述疾病或病症的药物，其中该药物不具有可测的MIF抑制活性。
[0043]第七个实施方案的一个方面中，提供用于治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有第七个实施方案所述的MIF抑制化合物和选自下列的药物：非甾类抗炎药，抗感染药，β兴奋剂，甾族化合物，抗组胺药，抗癌药，哮喘药，败血症药物，关节炎药，和免疫抑制药。
[0044]在第八个实施方案中，提供一种在需要其的患者中降低MIF活性的方法，包括给该患者施用有效量的具有以下结构的化合物：
Figure A20048000430500391
或其立体异构体、前药或药用盐，其中X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0045]在第九个实施方案中，提供一种制备式IVa的化合物的方法，该方法包括下列步骤，将式I的化合物：
Figure A20048000430500411
(式I)
与式II的化合物反应：
Figure A20048000430500412
(式II)
由此得到式III的化合物：
Figure A20048000430500413
(式III)
将式III的化合物与式X-R1的化合物反应，由此得到式IVa的化合物：
Figure A20048000430500421
(式IVa)
其中式IVa的化合物适合用作MIF抑制剂，和其中：R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自-CH2R7，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，R8，和-C(＝O)NR5R6；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；X选自Cl，Br，和I；和R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0046]第十个实施方案中，提供一种制备式IVb的化合物的方法，该方法包括以下步骤，将式I的化合物：
Figure A20048000430500431
(式I)
与式II的化合物反应：
Figure A20048000430500432
(式II)
由此得到式III的化合物：
Figure A20048000430500441
(式III)
将式III的化合物与含有X-R1的化合物反应，其中X选自Cl，Br，和I，且其中R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基，其中x是2-4，由此得到式IVb的化合物：
(式IVb)
其中式IVb的化合物适合用作MIF抑制剂。
[0047]第十一个实施方案中，提供一种用于制备式IVa的化合物的方法，该方法包括以下步骤，将式I的化合物：
Figure A20048000430500451
(式I)
与哌嗪反应，由此得到式IIIa的化合物：
Figure A20048000430500452
(式IIIa)
并且此后将式IIIa的化合物与式R4-C(O)-X的化合物反应，由此得到式IVa的化合物：
Figure A20048000430500453
(式IVa)
其中式IVa的化合物适合用作MIF抑制剂，且其中R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；X选自Cl，Br，和I；和R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0048]在第十二个实施方案中，提供一种制备式IVb的化合物的方法，该方法包括以下步骤，将式I的化合物：
(式I)
与哌嗪反应，由此得到式IIIa的化合物：
(式IIIa)
并且此后式IIIa的化合物与式R4-C(O)-X的化合物反应，由此得到式IVb的化合物：
(式IVb)
其中式IVb的化合物适合用作MIF抑制剂，且其中R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，R8，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；X选自Cl，Br，和I；和R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0049]第十三个实施方案中，提供一种制备中间体式I的化合物的方法，包括下列步骤，将式Iaa的化合物：
Figure A20048000430500481
(式Iaa)
与环己烷胺反应，由此得到式IIIaa的化合物：
Figure A20048000430500491
(式IIIaa)；
将式IIIaa的化合物与POCl3反应，由此得到式Ia的化合物：
Figure A20048000430500492
(式Ia)；
并且此后式Ia的化合物与乙酸铵在乙酸中反应，由此得到中间体式I的化合物：
Figure A20048000430500493
(式I)
其中式I的化合物适用于制备MIF抑制剂，且其中R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和R8选自氢，烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；X选自Cl，Br，和I；和R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
[0050]这些和其他实施方案及其多个方面可参考下列详述。最终，本文给出多个参考文献，它们更详细地描述了某些方法、化合物和/或组合物，并且在此全文引入作为参考。
附图简述
[0051]图1提供化合物200的THP-1细胞测定数据。
[0052]图2提供化合物200的体外互变异构酶抑制活性数据。
[0053]图3提供化合物203的体外互变异构酶抑制活性数据。
优选实施方案详述
[0054]下列描述和实施例详细说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，本发明的许多变化和改进属于其范围内。所以，优选实施方案的描述不应认为是对本发明范围的限定。
[0055]为了帮助理解所述的优选实施方案，在此提供某些定义。
[0056]在此使用的术语“MIF活性，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少部分由巨噬细胞移动抑制因子介导的活性或作用。所以，MIF活性包括，但不限于，抑制巨噬细胞移动，互变异构酶活性(例如，利用苯丙酮酸酯或多巴色素)，内毒素诱导的休克，炎症，糖皮质激素抗衡调节，胸腺嘧啶核苷掺入3T3成纤维细胞的诱导，erk磷酸化的诱导和MAP激酶活性。
[0057]术语“输出，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指通过非经规范前导序列的标准前导序列定向分泌的机理、将翻译细胞产物运输到细胞膜或细胞外空间的代谢主动过程，它可以是或可以不是能量依赖型的。此外，“输出，”与依赖前导序列的分泌不同，它耐受布雷菲德菌素A(即，输出的蛋白质不经ER/Golgi运输；布雷菲德菌素A被认为对运输输出蛋白质没有直接影响)和其他类似化合物。在此使用，“输出”还可以是指“非经典分泌”。
[0058]术语“无前导蛋白质，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指缺乏规范前导序列并且从细胞内部输出到细胞外环境的蛋白质或多肽。无前导蛋白质在细胞外环境中被视为定位在细胞外空间内或者与细胞膜的外表面结合的蛋白质。在优选实施方案的内容中，无前导蛋白质包括天然存在的蛋白质，例如巨噬细胞移动抑制因子及其片段以及改造为缺乏前导序列并且输出的蛋白质，或者改造为包括前导蛋白质或其片段与另一蛋白质融合的蛋白质。
[0059]术语“抑制剂，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指与抑制剂不存在下的活性或输出比较，可以改变MIF的构象和/或与单克隆抗体竞争MIF并减小MIF的至少一种活性或者其自细胞的输出的分子(例如，天然或合成化合物)。也就是说，“抑制剂”，与不使用抑制剂的试验相比，在使用抑制剂进行的试验中细胞外和/或细胞内检测到的MIF活性或在MIF蛋白质中，如果MIF的测定量发生明显变化，则改变构象和/或活性和/或输出。
[0060]术语“结合剂，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指任何结合MIF的分子，包括抑制剂。
[0061]通常，MIF抑制剂抑制MIF的生理功能，并且由此适用于治疗其中MIF可能是致病性的疾病。
[0062]在某些优选实施方案中，提供具有下面结构(Ia)和(Ib)的MIF抑制剂：
Figure A20048000430500521
包括其立体异构体，前药或药用盐，其中：X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1或2，条件是当n是0，Z是-C(＝O)-；R1是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；R2和R3相同或不同并且独立地是，卤素，-R5，-OR5，-SR5或-NR5R6；R4是-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7或R8；R5和R6相同或不同并独立地是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7是烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；和R8是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基。
[0063]在优选实施方案中，基团R1，R2，R3，和R4连接在芳香环上(如在R2和R3的情况中)或通过单键连接杂原子(如在R1和R4的情况中)。然而，在某些实施方案中，R1，R2，R3，和R4可以优选通过连接基团相连。优选的连接基团具有碳主链，或是其中一个或多个主链碳被杂原子，例如氮、氧或硫取代的主链。特别优选连接含有醚基团，羧基，羰基，硫化物基团，磺酰基，羧酰胺基团，磺酰胺基，烷基链，芳香环，胺基团等作为主链的部分。优选的连接基团一般具有长度为1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10或更多原子的主链。特别优选主链是长度为1，2，3，4，或5个原子的主链。在优选实施方案中，提供在需要其的患者中降低MIF活性的方法，该方法通过给该患者施用有效量的具有结构(Ia)和/或(Ib)的化合物：
[0064]包括其立体异构体，前药或药用盐，其中：X是氧或硫；Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；R1是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；R2和R3相同或不同并独立地是，卤素，-R5，-OR5，-SR5或-NR5R6；R4是-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7或R8；R5和R6相同或不同并独立地是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7是烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基；和R8是氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，或R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，或二烷基。如本文所用，上述术语具有下列含义。术语“烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指直链或支链、非环或环状、不饱和或饱和的含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10个碳原子的脂族烃，术语“低级烷基”具有与烷基相同的含义但含有1，2，3，4，5或6个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基，仲丁基，异丁基，叔丁基，异戊基等。代表性饱和环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，-CH2环丙基，-CH2环丁基，-CH2环戊基，-CH2环己基等；其不饱和环烷基包括环戊烯基和环己烯基，等等。环烷基也被称作“碳环”和包括二元-和多元-碳环例如十氢萘和金刚烷。不饱和烷基在相邻碳原子之间含有至少一个双键或三键(分别称作“链烯基”或“链炔基，”)。代表性直链和支链链烯基包括乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，等等；并且代表性直链和直链链炔基包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1丁炔基，等等。
[0065]术语“烷基芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个芳基氢原子被烷基部分取代的芳基。
[0066]术语“芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指芳族碳环部分，例如苯基或萘基。
[0067]术语“芳基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被芳基部分取代的烷基，例如苄基，-CH2(1或2-萘基)，-(CH2)2苯基，-(CH2)3苯基，-CH(苯基)2，等等.
[0068]术语“杂芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指5、6、7、8、9，或10元的具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子并含有至少一个碳原子的芳族杂环，包括单环和双环体系两者。代表性杂芳基包括(但不限于)呋喃基，苯并呋喃基，噻吩基，苯并噻吩基，吡咯基，吲哚基，异吲哚基，氮杂吲哚基，吡啶基，喹啉基，异喹啉基，噁唑基，异噁唑基，苯并噁唑基，吡唑基，咪唑基，苯并咪唑基，噻唑基，苯并噻唑基，异噻唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，和喹唑啉基。
[0069]术语“杂芳基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被杂芳基部分取代的烷基，例如-CH2吡啶基，-CH2嘧啶基，等等。
[0070]在此使用的术语“杂环”和“杂环环，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指5、6或7元单环，或7、8、9、10、11、12、13或14元多环杂环，它是饱和、不饱和或芳族的，并且它含有1、2、3或4个独立选自氮、氧和硫的杂原子，和其中所述氮和硫杂原子可以被选择性氧化，氮杂原子可以被选择性季胺化，包括其中上述杂环与苯环稠合的双环以及三环(和更高级的)杂环环。所述的杂环可以经任何杂原子或碳原子连接。该杂环包括如上定义的杂芳基。由此，除了上述芳族杂芳基以外，杂环也包括(但不限于)吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，乙内酰脲基，戊内酰胺基，环氧乙烷基，氧杂环丁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基，等等。
[0071]术语“杂环烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个烷基氢原子被杂环替代的烷基杂环，例如-CH2吗啉基，等等。
[0072]术语“杂环芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个芳基氢原子被杂环替代的芳基。
[0073]术语“酰基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指R-C(O)-L-形式的基团或根基，其中R是有机基团，包括但不限于烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，或取代的杂环芳基，各基团如本文定义，和L是定义如上的R或单键。酰基的实例包括下式的部分：
Figure A20048000430500571
其中p是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的整数，和更大的整数，并且其中各Q独立地选自氢和R，其中R是有机基团，包括但不限于烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，或取代的杂环芳基，各基团如本文定义。在一个优选实施方案中，p是1和各Q是氢。
[0074]术语“芳基酰基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指其中R基团含有此处定义的芳基的酰基。
[0075]术语“烷基酰基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指其中R基团包括此处定义的烷基的酰基。
[0076]术语“酰基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指R-C(O)-Alk-形式的基团或根基，其中R是有机基团，包括但不限于烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，各基团如本文定义，和其中Alk包括烷基部分。
[0077]术语“酰基芳基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指R-C(O)-Ary-形式的基团或根基，其中R是有机基团，包括但不限于烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，各基团如本文定义，和其中Ary包括芳基部分。
[0078]术语“取代的，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指其中至少一个氢原子被取代基取代的任何上述基团(例如，烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基，杂环或杂环烷基)。在酮基取代基(“-C(＝O)-”)的情况中两个碳原子被取代。当被取代时，“取代基，”在优选实施方案的情况中，包括卤素，羟基，氰基，硝基，磺胺，羧酰胺，羧基，醚，羰基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，烷基，烷氧基，烷硫基，卤代烷基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烷基，取代的杂芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，-NRaRb，-NRaC(＝O)Rb，-ORa，-NRaC(＝O)NRaRb，-NRaC(＝O)ORb-NRaSO2Rb，-ORa，-C(＝O)Ra -C(＝O)ORa，-SH，-SRa，-C(＝O)NRaRb，-OC(＝O)NRaRb，-SORa，-S(＝O)2Ra，-OS(＝O)2Ra，-S(＝O)2ORa，其中Ra和Rb相同或不同并且独立地是氢，烷基，卤代烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烷基，取代的杂芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基或取代的杂环烷基。
[0079]术语“卤素，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指氟，氯，溴和碘。
[0080]术语“卤代烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指至少一个氢原子被卤素取代的烷基，例如三氟甲基等。
[0081]术语“烷氧基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经氧桥连接的烷基部分(例如，-O-烷基)例如甲氧基，乙氧基，等等。
[0082]术语“烷硫基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经硫桥连接的烷基部分(例如，-S-烷基)例如甲硫基，乙硫基，等等。
[0083]术语“烷基磺酰基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指经磺酰基桥连接的烷基部分(例如，-SO2-烷基)，例如甲基磺酰基，乙基磺酰基，等等。
[0084]在此使用的术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”是广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指分别经氮桥连接的一个烷基部分或两个烷基部分(例如，-N-烷基)例如甲基氨基，乙基氨基，二甲基氨基，二乙基氨基，等等。
[0085]术语“羟基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被至少一个羟基取代的烷基。
[0086]术语“一-或二(环烷基)甲基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被一个或两个环烷基取代的甲基，例如环丙基甲基，二环丙基甲基，等等。
[0087]术语“烷基羰基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)烷基取代的烷基。
[0088]术语“烷基羰氧基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-C(＝O)O烷基基团或-OC(＝O)烷基基团取代的烷基。
[0089]术语“烷氧基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-O-烷基取代的烷基。
[0090]术语“烷硫基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被-S-烷基取代的烷基。
[0091]术语“一-或二(烷基)氨基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，分别是指被一个烷基或两个烷基取代的氨基。
[0092]术语“一-或二(烷基)氨基烷基，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指被一-或二(烷基)氨基取代的烷基。
[0093]下列编号的反应路线用于优选实施方案的情况中：
其中R1，R2，R3，R4，X，Z，和n定义如上。
[0094]根据Z部分，优选实施方案的代表化合物包括当Z是亚甲基(-CH2-)时具有结构(IIa)和(IIb)和当Z是羰基(-C(＝O)-)时具有结构(IIIa)和(IIIb)：
Figure A20048000430500602
Figure A20048000430500611
其中R1，R2，R3，R7，和R8，X，和n定义如上。
[0095]在其他实施方案中，n是0，1，或2分别表示结构(IVa)，(IVb)，(Va)，(Vb)，(VIa)，和(VIb)：
Figure A20048000430500612
Figure A20048000430500621
其中R1，R2，R3，R4，X，和Z定义如上。
[0096]在其他实施方案中，优选实施方案的化合物当X是氧时具有结构(VIIa)和(VIIb)并且当X是硫是具有结构(VIIIa)和(VIIIb)：
其中R1，R2，R3，R4，和Z定义如上。
[0097]在一特别优选的实施方案中，所述的MIF抑制剂具有下列结构：
Figure A20048000430500631
其中R1’选自下式的部分：
Figure A20048000430500632
Figure A20048000430500641
其中各R*独立地选自氢，卤素，烷基，羟基，烷氧基，硝基，胺，腈，羧酸，羧酸酯，烷基胺，CF3，-OCF3，磺胺，和羧酰胺。在特别优选的实施方案中，在R1’中各R*是氢，如以下结构：
Figure A20048000430500651
[0098]在特别优选的实施方案中，该MIF抑制剂具有以下结构：
Figure A20048000430500652
[0099]优选实施方案的化合物一般可以作为游离酸或游离碱使用。或者，优选实施方案的化合物可以优选采取酸或碱加成盐的形式。优选实施方案的游离碱氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域熟知的方法制备，并且可以由有机和无机酸形成。适宜的有机酸包括马来酸，富马酸，苯甲酸，抗坏血酸，琥珀酸，甲磺酸，乙酸，草酸，丙酸，酒石酸，水杨酸，柠檬酸，葡糖酸，乳酸，扁桃酸，肉桂酸，天门冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，羟基乙酸，谷氨酸，和苯磺酸。适宜的无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，和硝酸。游离酸的碱加成盐同样可以通过本领域熟知的方法制备，并且可以由适当的碱生成，例如选自碱金属和碱土金属的阳离子(例如，锂，钠，钾，镁，钡，或钙)和铵阳离子。术语结构(Ia)或(Ib)的“药用盐”包括任意和所有可接受的盐形式。
[0100]结构(Ia)和(Ib)的化合物可以按照本领域技术人员已知的有机合成方法，并且提供实施例中给出的代表性方法制备。
MIF作为药物靶标
[0101]巨噬细胞移动抑制因子(MIF)非常适合作为分析用的药物靶标，因为其活性参与许多病生理学情况。例如，已经证明MIF是炎症反应和细胞增殖两者中的重要介体。在这点上，MIF已经显示出发挥细胞因子、垂体激素、糖皮质激素诱导的免疫调节剂的作用，并且最近被证实作为神经免疫调节剂和具有神经元功能。Takahashi等，Mol.Med.4：707-714，1998；Bucala，Ann.N.T.Acad.Sci.840：74-82，1998；Bacher等，Mol.Med.4(4)：217-230，1998。此外，最近证实抗MIF抗体具有多种用途，尤其是减弱肿瘤生长，同时血管生成明显减少。Ogawa等，Cytokine 12(4)：309-314，2000；Metz和Bucala(如上)。所以，可以抑制MIF的小分子在治疗炎症反应的治疗，血管生成的减少，病毒感染，细菌感染，癌症(特别是肿瘤发生和细胞凋亡)的治疗，移植物抗宿主病和有关组织排斥的治疗中具有重要价值。MIF抑制剂可具体应用于多种免疫相关反应，肿瘤生长，肾小球肾炎，炎症，疟疾性贫血，脓毒性休克，肿瘤有关的血管生成，玻璃体视网膜病，牛皮癣，移植物抗宿主病(组织排斥)，特应性皮炎，类风湿性关节炎，炎性肠病，炎性肺病，中耳炎，局限性回肠炎，急性呼吸窘迫综合症，延迟型过敏症的治疗中。MIF抑制剂也可以有效治疗应激和糖皮质激素功能病症，例如糖皮质激素作用的反向调节，或者克服糖皮质激素介导的对花生酸酯释放的抑制作用(基于Cys-60的催化MIF氧化还原酶活性或JABI/CSNS-MIF相互作用基础的机制)。
[0102]MIF抑制剂实用性的一个实例可以通过这样的事实来证实，即当与内毒素接触后，MIF的可检测血清浓度在急性期内(1-8小时)逐步增高，在8小时达到高峰且在急性期后持续(＞8小时)直至20小时。虽然不受到任何操作理论的限制，MIF似乎可以通过活化的T-细胞和巨噬细胞、在内毒素诱发的休克的促炎阶段中产生，例如，成为对感染的局部应答的部分。一旦通过促炎刺激，例如低浓度的LPS，或者通过TNF-α和IFN-γ得以释放，巨噬细胞衍生的MIF可成为内毒素休克急性期内产生MIF的可能来源。释放MIF应答LPS的垂体和巨噬细胞两者均是内毒素休克急性后期中MIF的可能来源，当感染不再被局限在局部位置时。参见，例如，美国专利6,080,407，其全文在此引入作为参考并描述了这些结果和抗MIF抗体。
[0103]如本发明所证实的，优选实施方案的抑制剂抑制了LPS刺激后小鼠中的致死率且有可能削弱IL-1β和TNF-α的水平。所以，许多炎性病症可以用MIF抑制剂加以治疗。在这点上，在其他优点中，对MIF活性和/或释放的抑制可以用于治疗炎性反应和休克。通过在休克反应的早期和晚期两者中进行干预可以获得有益效果。在这方面，尽管不受到任何产生MIF抑制的保护作用的理论或机理的限制，抗MIF研究已经证明，抗MIF抗体的引入与循环血清中TNF-α水平的明显(可达35-40％)减少有关联。这种减少与MIF对体外巨噬细胞的TNF-α-诱导活性相符，并且提示了MIF可能是至少部分负责内毒素施用后1-2小时血清TNF-α水平达到非常高峰的部分原因，尽管事实上MIF此时在循环中无法检测到。所以，MIF抑制疗法可能在炎症反应的早期有益。
[0104]MIF还在休克反应的急性后期发挥作用，并且由此提供了在其他疗法，例如抗TNF-α疗法无效的后期进行干预的机会。MIF的抑制可以保护用高浓度内毒素刺激(即，诱发垂体MIF释放到循环中的浓度)的动物，和用TNF-α刺激的动物对抗致死性休克。所以，抑制MIF和保护用TNF刺激的动物的性能显示，在脓毒性休克的后期、急性后期中和MIF可能有效。
[0105]如本发明证实的，TNF-α和IL-1β的水平在某些情况中至少与MIF水平有关。所以，抗MIF小分子可以用于多种TNF-α和/或IL-1β有关的病症中，包括移植排斥，CNS疾病的免疫介导的和炎症的元素(例如，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多发性硬化症，等等)，肌肉营养不良，止血的疾病(例如，凝血病，静脉闭合病，等等)，变应性神经炎，肉芽肿，糖尿病，移植物抗宿主病，慢性肾脏损伤，脱发(头发脱落)，急性胰腺炎，关节病，充血性心衰，心血管疾病(再狭窄，动脉粥样硬化)，关节疾病，和骨关节炎。
[0106]此外，本领域的其他证据表明，甾族化合物虽然是细胞因子生成的有效抑制剂但明显增强MIF的表达。Yang等，Mol.Med.4(6)：413-424，1998；Mitchell等，J.Biol.Chem.274(25)：18100-18106，1999；Calandra和Bucala，Crit.Rev.Immunol.17(1)：77-88，1997；Bucala，FASEB J.10(14)：1607-1613，1996。所以，特别有效的是在甾族化合物疗法中可以联合应用MIF抑制剂来用于治疗细胞因子介导的病生理疾病例如炎症、休克，和其他细胞因子介导的病理状态中，特别是慢性炎性状态例如类风湿性关节炎。这样的联合疗法甚至可能对随后的病理或其他炎性反应的发作有益。例如，在临床情形中，在脓毒性休克症状发作后给予甾族化合物被证实没有益处。参见Bone等，N.Engl.J.Med.317：653-658，1987；Spring等，N.Engl.J.Med.311：1137-1141，1984。联合的甾族化合物/MIF抑制疗法可以用于克服这个障碍。此外，本领域的技术人员可以理解，这样的疗法可以特定局部和/或系统性地抑制MIF释放和/或活性。
测定
[0107]作为MIF抑制剂的化合物的效力可以通过多种实验方法进行测定。优选实施方案的适当抑制剂能够降低一种或多种与MIF和/或MIF输出有关的活性。结构(Ia)或(Ib)或其他任何结构的化合物可以通过一种或多种出于此目的且被普遍接受的实验测定作为MIF抑制剂的活性，包括(但不限于)下列测定。
[0108]测定一般划分为三类，也就是，那些监测输出的试验；那些监测效应子或小分子的结合的试验，和那些监测MIF活性的那些。然而，应当注意，这些试验的组合也属于本发明的范畴。令人惊奇地，MIF的表位作图充当着生物活性的替代者。例如，在一种试验中，利用单克隆抗体如市售R&D系统(Minneapolis，MN)，候选抑制剂的存在阻止来自细胞的MIF的输出的检测(例如，THP-1细胞-人急性单核细胞白血病细胞系)，而多克隆抗体证实MIF是存在的。而且，细胞基础的或体外试验可以用来证明这些潜在抑制剂抑制MIF活性。在另一方面，这两种试验(即，结合和活性试验)可以组合为一个独立试验，它检测试验化合物的结合(例如，替代单克隆抗体或抑制其结合的性能)同时也检测MIF活性。此类试验包括组合ELISA类试验(或类似结合试验)与MIF互变异构试验或类似功能试验相组合。由于本领域普通技术人员很容易认识到，采用精确试验是不相关的，条件是它能够检测出感兴趣化合物结合MIF的性能。此外，所述的试验优选能够检测化合物抑制MI活性的性能，因为要选择与生物活性的MIF而不是灭活MIF相互作用的化合物。
[0109]还应理解，证实化合物具有抑制单克隆抗体结合生物活性而非灭活MIF(例如，小分子抑制的)的性能，必须证实与MIF以这样的方式相互作用的化合物(例如，小分子)的存在，所述方式是改变MIF的构象或阻断抗体结合所必需的表位。在其他实施方案中，MIF抑制活性还可以被认为是干预包括MIF的多肽复合物的形成的结果；干扰此类复合物可以达到构象改变抑制作用的检测。所以，监测MIF构象变化的试验的采用，适宜于除测定化合物例如小分子与mAb之间的竞争作用的试验以外进行，或者代替此类试验。许多此类试验是本领域已知的并且包括，量热法，圆二色性，荧光能量传递，光散射，核磁共振(NMR)，表面等离振子共振(surface plasmon resonance)，闪烁亲近测定法(参见美国专利5,246,869)，等等。也可参见WO02/07720-A1和WO97/29635-A1。所以，本领域技术人员可以认识到可采用任何显示结合和优先构象改变或接近MIF活性位点的位置的试验。下面描述多种较复杂的亲近试验和构象分析试验，该讨论仅仅是举例且应当不以任何方式构成对技术类型的限制，它们可以用于优选实施方案。
[0110]在一个实例中，圆二色性可以用来测定候选抑制剂的结合作用。圆二色性(CD)部分基于大多数生物蛋白质大分子是由不对称单体单元(L-氨基酸)构成的事实，因此它们全部具有光学活性的属性。另外，刚性结构如DNA或α螺旋多肽具有可以用适当光谱体系测定的光学性质。事实上，易于测定的光谱参数的巨大改变可以为识别构象状态和构象状态在不同环境下的变化提供选择性方式，并且有时用于观察大分子内或所连接的单个基团的扰动。此外，CD分析法常常被用于探测不同大分子与小分子和配体之间的相互作用。参见Durand等，Eur.Biophys.J.27(2)：147-151，1998；Kleifeld等，Biochem 39(26)：7702-7711，2000；Bianchi等，Biochem38(42)：13844-13852，1999；Sarver等，Biochim Biophys Acta 1434(2)：304-316，1999。
[0111]Pasteur原理指出旋光性分子须是不对称的，也就是说，分子及其镜像不能重叠。平面偏振光是左圆偏振光和右圆偏振光在相中转播的混和光。这种光与不对称分子的相互作用导致一种圆偏振光组分的优先作用，由此在吸收区域内可见到差别吸收(即，二色性)。参见Urry，D.W.，Spectroscopic Approaches to Biomolecular Conformation，American MedicalAssociation Press，Chicago，Ill.，pp.33-120(1969)；Berova和Woody，CircularDichroism：Principles and Applications，John Wiley & Sons，N.Y.，(2000)。
[0112]于是，圆二色性是一种吸收现象，当生色团在特定波长与平面偏振光相互作用时可以产生这种现象。吸收带可以是负的或正的，这取决于右和左圆偏振光组分对该生色团的差别吸收。与测定背景和感兴趣的生色团的贡献距离实际光相互作用的区域多少毫微米的旋光色散(ORD)不同，CD在发生光学事件的波长下具有测定该光学事件的优越性。则圆二色性特异于生色团的电子跃迁。参见Berova和Woody，Circular Dichroism：Principles and Applications，John Wiley & Sons，N.Y.，(2000)。
[0113]圆二色性在大分子的溶液中的应用可得到鉴定构象状态的性能(Berova和Woody，Circular Dichroism：Principles and Applications，JohnWiley & Sons，N.Y.，(2000))。该技术可以辨别大分子的无规卷曲，α螺旋，和β螺旋链构象状态。在蛋白质中，α螺旋纤维蛋白质具有非常类似于α螺旋多肽的吸收曲线，但在已知结构的球形蛋白质中，如溶菌酶和核糖核酸酶，该螺旋结构在X射线结晶工作上非常不同。球形蛋白质的另一困难来源在于在280nm附近分子上芳香性生色团的普遍存在。螺旋变化的一个感兴趣变化已经利用肌红蛋白质和脱辅基肌红蛋白质加以证实。除去辅基血红素后，保留的脱辅蛋白质具有减少25％的残余圆二色性椭圆率。螺旋的这种损失归因于分子中10-15残基的展开。其他非肽、旋光生色团包括酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，和位于大分子的一级氨基酸序列中时的半胱氨酸。非肽椭圆率的实例包括核糖核酸酶中的二硫基转变和胰岛素的半胱氨酸转变。
[0114]所以，圆二色性可以用来筛选候选抑制剂影响MIF构象的性能。
[0115]在本申请提供的某些实施方案中，MIF结合剂或抑制剂复合物的形成可以通过检测含有MIF和可检测标记结合剂的复合物的存在来进行测定。如下文详述，荧光能量信号检测法，例如通过荧光偏振，能够测定显示MIF结合剂分子复合物形成的信号水平。所以，并且如本文所述，在候选抑制剂不存在和存在条件下基于荧光能量信号进行的MIF结合剂复合物形成的对比提供了一种鉴定是否该试剂改变MIF和结合剂之间的相互作用的方法。例如，结合剂可以是MIF底物，抗MIF抗体，或一种已知的抑制剂，而候选抑制剂可以是被测化合物，或者反之亦然。
[0116]如上所述，某些优选的实施方案也可以部分涉及基于荧光能量信号的MIF结合剂复合物形成的测定。荧光能量信号检测可以是，例如通过荧光偏振法或荧光共振能量传递法，或通过本领域已知的其他荧光方法。在一些其他实施方案的实例中，该MIF多肽可以和候选抑制剂一起被标记并且可以含有能量传递分子供体-受体对，并且测定能量供体向能量受体提供的荧光共振能量传递的水平。
[0117]在某些实施方案中，所述的候选抑制剂和/或结合剂的标记是可检测的，在特别优选的实施方案中，候选抑制剂和/或结合剂能够产生荧光能量信号。候选抑制剂和/或结合剂可以通过共价或非共价连接于适当的报道分子或部分而被可检测地标记，例如根据所用的特定荧光能量技术选择的任何不同荧光物质(例如，荧光团)，如本领域已知的和基于本发明所述方法。本发明提供的荧光报道部分和方法可以参见，例如Haugland(1996Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals-Sixth Ed.，Molecular Probes，Eugene，OR；1999 Handbook of Fluorescent Probes和Research Chemicals-Seventh Ed.，Molecular Probes，Eugene，OR，http：//www.probes.com/lit/)和其中引用的参考文献。在优选实施方案中特别优选用作这种荧光团的是荧光素，罗丹明，德克萨斯红，AlexaFluor-594，AlexaFluor-488，俄勒冈(Oregon)绿，BODIPY-FL，和Cy-5。然而，可以使用任何适宜的荧光团，并且在某些实施方案可以优选所列以外的其他荧光团。
[0118]如本文所提供的，荧光能量信号包括荧光发射，激发，能量传递，猝灭，或去猝灭事件等等。通常，荧光能量信号可以由可检测荧光标记的候选抑制剂和/或结合剂在响应适当波长的光时所介导。简单而言，并且不希望受到理论的约束，荧光能量信号的产生一般包括用适当的能源激发荧光团(例如，对于所选荧光报道部分来说适当波长的光，或荧光团)，由此瞬时使该荧光团的能态从基态变为激发态。被激发的荧光团由此以可检测光的形式发射能量，该光通常具有不同于激发所优选(例如，一般较长)的波长，并且此后恢复到其能量基态。优选实施方案的方法考虑到使用任何荧光能量信号，这依赖于特定的荧光团，底物标记的方法和检测仪器，它很容易且根据标准无需进行过度试验就可选择，这是本领域普通技术人员所熟知的。
[0119]在某些实施方案中，该荧光能量信号是荧光偏振(FP)信号。在一些其他实施方案中，该荧光能量信号可以是荧光共振能量传递(FRET)信号。在某些其他优选的实施方案中该荧光能量信号可以是荧光猝灭(FQ)信号或荧光共振光谱(FRS)信号。(有关FP，FRET，FQ和FRS的详情参见，例如，WO97/39326；WO99/29894；Haugland，Handbook of FluorescentProbes和Research Chemicals-6th Ed.，1996，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，p.456；及其引用的文献.)。
[0120]FP，一种荧光团的平均角位移(归因于分子转动扩散)的量度，它出现在能量源的光子的吸收与随后的光子发射之间，依赖于在荧光团的激发态过程中旋转扩散的程度和速度、分子的大小和形状、溶液粘度和溶液温度(Perrin，1926 J.Phys.Rad.1：390)。当粘度和温度保持恒定时，FP直接与荧光团的表观分子体积或大小有关。偏振值是相异平面(例如，垂直和水平)中测定的荧光强度的比值，由此是不受荧光团强度影响的无量纲量。低分子量荧光团，例如本发明提供的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂，能够加快溶液(即，低各向异性)中分子的转动并由此得到低的荧光偏振读数。然而，当与较高分子量分子例如如本文所提供的MIF复合时，底物的荧光团部分与在溶液(即，高各向异性)中具有相对缓慢的分子转动的复合物缔合，得到较高的荧光偏振读数。
[0121]游离的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂的偏振值与MIF：候选抑制剂和/或结合剂复合物的偏振值的差异可以用来测定复合的(例如，结合的)与游离的之间的比例。这种差异也可用于检测候选药物(即，候选抑制剂)对该复合物的形成和/或对预形成复合物的稳定性的影响，例如通过比较在药物不存在条件下检测的FP和在该药物存在下测定的FP。FP测量可以不用分离反应组分就可进行。
[0122]如上所述，优选实施方案的一个方面利用单克隆抗体、已知的抑制剂或其他结合剂和/或候选抑制剂的复合物形成与MIF结合或置换，提供一种鉴定改变MIF活性的抑制剂的方法。令人惊奇地，优选实施方案的抑制剂以这种非常规方式鉴定。在这点上，一类化合物被证实具有抑制/减少单克隆抗体与由细胞天然产生的生物活性MIF结合的性能，同时不影响抗体识别灭活(重组)MIF(如得自商购)，并且还证实具有显著的MIF活性的体内调控作用。所以，抗体结合可能优选作为酶活性的替代，由此避免需要对各个候选化合物进行昂贵和复杂的酶试验。本领域普通技术人员很容易理解，避免酶试验的能力使试验可以非常适合于高通量应用。
[0123]此外，本领域普通技术人员很容易理解，这样的试验可以应用于MIF背景之外并且无论如何酶或生物活性可以用结合试验代替。例如，优选任何其生物活性形式可以被不识别其灭活形式(例如，小分子抑制形式)的任何酶和其它多肽。在酶的情况中，该单克隆抗体可以结合活性位点，但不被小分子替换。由此，任何替换该抗体的小分子可能是成为潜在酶抑制剂的强者。本领域技术人员懂得，该抗体可以识别依赖于酶的活性状态改变构象的表位，并且小分子的结合可以阻止抗体结合这个表位，由此也可以充当酶活性的替代物，即使该表位不位于活性位点上。所以，本发明采用的试验的类型可以扩展到用于基本上任何多肽，其中抗体置换是活性损失的前兆。因此，以其最简单的形式，任何多肽，例如，酶和其有关中和的抗体可以用于筛选置换这种抗体的小分子，由此鉴定可能的抑制剂。
[0124]MIF结合剂/候选抑制剂复合物可以通过任何本领域已知的、用于证明MIF和上述其他分子之间的分子间相互作用的不同技术进行鉴定，例如，共纯化法，共沉淀法，共免疫沉淀法，放射或荧光测定法，蛋白质免疫印迹分析法(western immunoblot analyses)，亲和捕获法，包括亲和技术例如固相配体-反配体吸附技术，亲和色谱和表面亲和等离振子共振，NMR，等等(参见，例如，美国专利5,352,660)。测定此类复合物的存在可以采用特异性结合MIF或结合剂的抗体，包括单克隆，多克隆，嵌合和单链抗体，等等。
[0125]标记的MIF和/或标记的结合剂/候选抑制剂还可以用于检测复合物的存在。感兴趣的分子可以通过共价或非共价连接于适当的报道分子或部分来进行标记，例如各种酶，荧光物质，发光物质和放射性物质。适当酶的实例包括，但不限于，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，和乙酰胆碱酯酶。适当荧光物质的实例包括，但不限于，伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯，藻红蛋白质，德克萨斯红，AlexaFluor-594，AlexaFluor-488，俄勒冈绿，BODIPY-FL和Cy-5。适当的发光物质包括，但不限于，鲁米诺并且适当的放射性物质包括放射性磷[32P]，碘[125I或131I]或氚[3H]。
[0126]MIF和结合剂和/或候选抑制剂在足以允许组分之间形成分子间复合物的条件和时间下混和。适合形成此类复合物的条件是本领域已知的并且可以很容易地基于本发明提供的教导进行测定，包括溶液条件和检测复合物的存在和/或检测溶液中游离底物的方法。
[0127]复合物中可检测标记的结合剂和/或候选抑制剂与MIF和/或不构成该复合物组成部分的结合剂或候选抑制剂的缔合，可以按照优选实施方案、通过检测底物产生的荧光能量信号来鉴定。通常，按照本领域普通技术人员熟知的标准选择检测荧光能量信号的能量源，这依赖于标记底物的荧光报道部分。含有(a)MIF和(b)可检测标记的结合剂和/或候选抑制剂的试验溶液暴露在能量源下以发生荧光能量信号，它可以利用多种公知仪器检测并根据特定荧光能量信号进行鉴定。在优选的实施方案中，该荧光能量信号是荧光偏振信号，它可以用安装有偏振滤光器的分光荧光计进行检测。在特别优选的实施方案中荧光偏振测定是在各个多个反应室中同时完成，该反应室可以用LJL CRITERIONTM Analyst(LJL Biosystems，Sunnyvale，CA)平板读数器读数，例如，在不同的反应室内提供具有不同反应组分或条件的高通量筛选(HTS)。其他适合获得荧光偏振读数的仪器的实例包括POLARSTARTM(BMG Lab Technologies，Offenburg，Germany)，BEACONTM(Panvera，Inc.，Madison，WI)和the POLARIONTM(Tecan，Inc.，Research Triangle Park，NC)装置。
[0128]测定由MIF和结合剂和/或候选抑制剂之间形成的复合物的存在可以通过多种方法完成，如上所述，包括如本文所提供的和本领域已知的荧光能量信号法。此类方法可以包括，以举例而不是限定的方式FP，FRET，FQ，其他荧光测定法，共纯化法，共沉淀法，共免疫沉淀法，放射测定法，蛋白质免疫印迹分析法，亲和捕获法，包括亲和技术例如固相配体-反配体吸附技术，亲和色谱和表面亲和等离振子共振，圆二色性，等等。对于这些和其他使用的亲和技术，参见，例如，Scopes，R.K.，ProteinPurification：Principles and Practice，1987，Springer-Verlag，NY；Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston；和Hermanson，G.T.等，Immobilized Affinity ligand Techniques，1992，AcademicPress，Inc.，California；其全文在此引入作为参考，它们涉及分离和描述复合物特征的技术的详情，包括亲和技术。在多个实施方案中，MIF可以与结合剂和/或候选抑制剂经特异性结合相互作用，如MIF结合结合剂和/或候选抑制剂并且Ka大于或等于约104M-1，优选大于或等于约105M-1，更优选大于或等于约106M-1和仍然更优选大于或等于约107M-1-1011M-1。结合配偶体的亲和力可以很容易由根据上述荧光能量信号法得到的数据并利用常规数据处理技术计算出来，例如，Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660(1949)所述的那些。
[0129]例如，在荧光能量信号是荧光偏振信号的多种实施方案中，游离的可检测标记的候选抑制剂和/或结合剂的荧光各向异性(偏振光中)可以在无MIF下检测，并且可以在滴定量的MIF的存在下检测完全结合的底物荧光各向异性(偏振光中)。偏振光中的荧光各向异性是以被标记候选抑制剂和/或结合剂在荧光团激发态的持续时间内所经历的转动运动的量的函数进行变化，由此游离和完全结合的候选抑制剂和/或结合剂的各向异性可以用于测定在指定的试验条件下与MIF结合的候选抑制剂和/或结合剂的部分，例如，其中存在候选药物的那些(参见，例如，Lundblad等，1996 Molec.Endocrinol.10：607；Dandliker等，1971 Immunochem.7：799；Collett，E.，Polarized Light：Fundamentals和Applications，1993 MarcelDekker，New York)。
[0130]某些优选的实施方案部分涉及利用分子间能量传递来监测MIF结合剂复合物的形成和稳定性和/或MIF-候选抑制剂复合物形成。
[0131]能量传递(ET)产生自两个分子：贡献能量的“供体”分子和接受能量的“受体”分子，之间的共振相互作用。能量传递可以发生在(1)供体的发射光谱重叠受体的吸收光谱时和(2)供体和受体在另一者的特定距离内(例如，小于约10nm)。能量传递的效率主要由供体和受体的接近性表示，并且随距离以6的乘幂衰减。由此ET的测量强有力地反映出受体和供体化合物的接近性，并且ET的变化灵敏地反映出化合物的接近性的变化，例如，供体和受体的缔合和解离。
[0132]因此优选实施方案的一个方面是提供一种在相关部分中分析候选MIF抑制剂的方法，该方法通过将MIF或含有一个或多个ET供体的MIF结合剂复合物与ET受体分子接触，激发该ET供体产生激发的ET供体分子并检测由ET供体向ET受体能量传递时产生的信号。如本发明所述的，该方法可以使用任何可以发挥供体-受体对的适宜ET供体分子和ET受体分子。
[0133]在某些优选实施方案，ET供体和受体分子之间能量传递产生的可检测信号得自于荧光共振能量传递(FRET)，如上所述。当能量由激发的供体荧光团直接传递给受体荧光团时，FRET出现在分子内，或在两类不同的分子之间，(综述参见Wu等，Analytical Biochem.218：1-13，1994)。
[0134]在优选实施方案的其他方面，测试候选抑制剂影响MIF输出的能力。
[0135]此类试验的第一步是检测细胞外MIF。对于该试验，采用表达MIF的试验细胞(例如，THP-1细胞)。或者试验细胞可以天然产生蛋白质或由转染的表达载体产生。试验细胞优选正常表达蛋白质，由此转染只是提高表达的水平。所以，对于MIF和IL-1的表达，优选THP1细胞。当分析病毒衍生的蛋白质时，例如HIV tat(一种由人免疫缺陷病毒感染的细胞释放的蛋白质)，如果该试验细胞不能“天然地”产生蛋白质，很容易用适当的载体转染它们，使该试验细胞表达所需的蛋白质，这是本领域技术人员容易理解的。
[0136]表达之后，利用任何一种熟知的方法和程序检测MIF。所述的方法包括用抗体染色联合流式细胞仪，聚焦显微镜，图像分析，细胞胞质或培养基的免疫沉淀，细胞培养基的蛋白质印迹法，ELISA，1-或2-D凝胶分析法，HPLC，或生物测定。初步筛选的常规试验是ELISA。MIF输出可以通过一种其他试验进行确定，优选通过细胞培养基的免疫沉淀和后续的代谢标记法。简单而言，表达MIF蛋白质的细胞用35S-蛋氨酸和/或35S-半胱氨酸在无蛋氨酸和/或半胱氨酸培养基中脉冲标记15分钟并且加入到补充有过量蛋氨酸和/或半胱氨酸的培养基中。收集培养基组分并通过离心澄清化，例如在微型离心机中。含有1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐(DOC)，20mMTris，pH 7.5，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，2mM EGTA，10nM苯基甲基磺酰基氟(PMSF)，10ng/ml抑肽酶，10ng/ml亮抑肽酶，和10ng/ml胃酶抑素的裂解缓冲液加入到该澄清培养基中。加入MIF的抗体，随后在冷却下温育，加入沉淀性第二抗体或免疫球蛋白结合蛋白质用于进一步培养，例如蛋白质A-Sepharose或GammaBindTM-Sepharose。A-Sepharose是蛋白质A，一种用于测定和纯化游离和细胞结合的抗原和抗体的免疫球蛋白G(IgG)结合试剂，它购自Pharmacia，Inc。蛋白质A结合抗体(IgG类)的Fc部分但不扰乱其抗原的结合。Pharmacia，Inc.的GammaBindTM-Sepharose是蛋白质G，一种结合试剂，它结合许多种类的免疫球蛋白G的恒定区，并且可以用来检测、定量和纯化IgG抗体和抗原/抗体复合物。与之平行，作为对照，监测胞质蛋白质并在免疫沉淀法中优选胞质蛋白质的抗体。沉淀免疫复合物并用冰冷的裂解缓冲液洗涤。复合物进一步用冰冷的IP缓冲液(0.15M NaCl，10mM Na-磷酸盐，pH 7.2，1％DOC，1％NP-40，0.1％SDS)洗涤。免疫复合物直接洗脱至SDS-凝胶样品缓冲液中并在SDS-PAGE中电泳。该凝胶进行荧光自显影，干燥和曝光于X射线胶片。或者细胞可以被改造为产生MIF，它用报道分子标记，由此活性MIF的存在可以通过报道分子的代替活性。
[0137]不希望受理论的约束，相信现有的抑制剂通过直接与天然产生的MIF相互作用、以改变该蛋白质构象至足以阻断其生物活性的方式发挥功能。这种相互作用可以通过MIF-化合物共结晶的X射线结晶学作图，以便测定相互作用的准确位点。一个位点位于负责MIF的互变异构酶活性的袋内。
[0138]MIF输出的抑制剂的筛选试验根据抑制剂的类型和受影响的活性的本质而变化。试验可在体外或体内进行。通常，体外试验设计为评估MIF活性，或多聚化，并且体内试验设计为评估MIF活性，在模型细胞或动物体系中细胞外和细胞内定位。在任何试验中，与适当对照比较统计学意义的增大或减小是增强作用或抑制作用的象征。
[0139]一种体外试验可以测试候选化合物对MIF抑制巨噬细胞移动的能力的影响。简单而言，人外周血单核细胞优选作为琼脂糖滴试验系统中的指示细胞，这基本上如Weiser等，Cell.Immunol.90：167-178，1985和Harrington等，J.Immunol.110：752-759，1973所述。也可以采用分析巨噬细胞移动的其他试验体系。该试验由Hermanowski-Vosatka等，Biochem.38：12841-12849，1999描述。
[0140]另一体外试验设计为测定MIF催化多巴色素的D-异构体的互变异构化的性能(参见Rosengren等，Mol.Med.2：143-149，1996；Winder等，J.Cell Sci.106：153-166，1993；Aroca等，Biochem.J.277：393-397)。简单而言，在该方法中，在候选抑制剂存在和不存在条件下向MIF提供D-多巴色素并监测催化5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)的互变异构的性能。然而，利用D-多巴色素的甲酯可以适合于观察较快的反应速度。互变异构化的检测可以通过多种标准方法的任一方法进行。
[0141]在类似的方法中，可以测试MIF催化苯丙酮酸酯(盐)的互变异构化的性能(参见Johnson等，Biochem.38(48)：16024-16033，1999)。简单而言，在这种方法中，通常，苯丙酮酸酯或(对羟基苯基)丙酮酸酯的酮基化是通过光谱法测定的。此外，通过用MIF处理这些化合物且随后转化为苹果酸盐用于1H NMR分析可以检验产物的形成。
[0142]体内试验可以在用含有MIF核酸分子的表达载体瞬时或稳定转染的细胞进行，如本发明所述的那些。这些细胞适合于测定在候选化合物存在和不存在条件下MIF的活性(例如，细胞凋亡的调节，增殖，等等)或细胞外和细胞内定位。当测试凋亡时，可以采用多种细胞检验法，包括，例如，染料染色和显微镜检测核酸片段化和细胞的孔隙率。
[0143]其他试验可以在模型细胞或动物体系中进行，这是通过在试验化合物存在或不存在的条件下向所述体系提供重组或天然存在形式的MIF或诱发内源性MIF表达，由此测定该体系病理学的统计学意义上的显著增大或减小，例如，LPS可以用来诱发中毒性休克反应。
[0144]在此简述的试验可以用于鉴定对于MIF特异性的抑制剂。
[0145]在本发明所述的任何试验中，试验细胞可以自然表达MIF(例如，THP-1细胞)或在引入编码该蛋白质的重组DNA分子后表达。转染和转化方案是本领域熟知的且包括Ca2PO4-介导的转染，电穿孔，用病毒载体感染，DEAE-葡聚糖介导的转染，等等。作为上述蛋白质的替代，可以采用嵌合MIF蛋白质(即，MIF蛋白质与其他蛋白质或蛋白质片段的融合)，或改造成缺少前导序列的蛋白质序列。以类似方式，融合可以装配为直接分泌，输出，或胞质保留。任何和所有这样的序列可以用于与MIF的融合构建体以协助分析抑制剂。宿主细胞还可以表达MIF，这是患病、被病毒感染等的后果。依靠前导序列输出的分泌蛋白质是公知的且包括，人绒毛膜促性腺激素(hCGα)，生长激素，肝细胞生长因子，转铁蛋白，神经生长因子，血管内皮生长因子，卵白蛋白，和类胰岛素生长因子。类似地，胞质蛋白质是公知的且包括，新霉素磷酸转移酶，β-半乳糖苷酶，肌动蛋白和其他细胞骨架蛋白质，和酶，例如蛋白质激酶A或C。最适用的胞质或分泌的蛋白质是那些在常规试验中容易测定的那些，例如ELISA。三种蛋白质(无前导序列，分泌的，和胞质的)可以天然地共同表达，这是通过在试验细胞中共转染，或在独立宿主细胞中分开转染。此外，对于本文所述的试验，细胞可以被稳定转化或瞬时表达所述蛋白质。
[0146]免疫沉淀法是一种这样的试验，它可以用来测定抑制作用。简单而言，在无蛋氨酸-和/或半胱氨酸细胞培养基，天然地或来自引入载体构建体的表达MIF的细胞用35S-蛋氨酸和/或35S-半胱氨酸标记短暂的时间，通常15分钟或更长时间。脉冲式标记后，如果非前导蛋白质是肝素结合的，细胞用补充有过量未标记的蛋氨酸和半胱氨酸加肝素的培养基洗涤。此后细胞在相同种类的追踪培养基中培养多种不同的时间周期。加入不同浓度的候选抑制剂或增强剂。收集培养上清液且澄清化。上清液用抗MIF免疫血清或单克隆抗体培养，或者如果肽标记存在的话用抗标记抗体培养，随后用展开试剂例如金黄色葡萄球菌Cowan株I，蛋白质A-Sepharose，或Gamma-bindTM G-Sepharose。免疫复合物通过离心沉淀，用含有1％NP-40和0.5％脱氧胆酸盐，EGTA，PMSF，抑肽酶，亮抑肽酶，和胃酶抑素的缓冲液洗涤。进而沉淀在含有磷酸钠pH 7.2，脱氧胆酸盐，NP-40，和SDS的缓冲液中洗涤。免疫复合物被洗脱到SDS凝胶样品缓冲液中并用SDS-PAGE分离。该凝胶用于荧光自显影，干燥，和暴露在X射线胶片下。
[0147]或者，ELISA可能优选用于检测和定量分析细胞上清液中的MIF含量。ELISA适宜于在高通量筛选中检测。简单而言，96孔平板用抗MIF抗体或抗标记抗体涂层，洗涤，和用2％BSA封闭。此后将细胞上清液加入到孔中。培养和洗涤后，加入第二抗体(例如，向MIF)。该第二抗体可以与标记或检测试剂偶联，例如酶或生物素。进一步培养后，加入展开剂并用ELISA平板读数器测定MIF的量。该展开剂是偶联于第二抗体(通常是抗同位型抗体)的酶的底物或是偶联于链霉抗生物素的酶的底物。适宜的酶是本领域熟知的并且包括辣根过氧化物酶，它在比色反应中发挥底物的作用(例如，ABTS)。还认识到与其使用偶联于酶的第二抗体，不如可以将抗MIF抗体直接偶联于辣根过氧化物酶，或其他等效检测试剂上。如果需要，可以浓缩细胞上清液达到检测水平。此外，检测方法，例如ELISA等等可以用来监测细胞内和细胞外的MIF水平。当细胞内水平是所希望的时，优选细胞裂解物。当细胞外水平是所希望的时，可以筛选培养基。
[0148]ELISA还可以很容易适应高通量筛选多种候选抑制剂或增强剂。简单而言，这样的试验通常是以细胞为基础并在96孔平板中进行。天然或稳定表达MIF的试验细胞铺板达到足够表达产物检测的水平，例如，约20,000细胞/孔。然而，如果细胞无法自然表达蛋白质，获得瞬时表达，例如通过电穿孔或Ca2PO4-介导的转染。对于电穿孔，100μl的细胞(例如，150,000细胞/ml)和载体DNA(5μg/ml)的混合物分散在96孔平板的各个孔中。该细胞用带有96个孔电极的仪器电穿孔(例如，ECM 600电穿孔系统，BTX，Genetronics，Inc.)。通过试验测定对于特定宿主细胞类型的电穿孔的最佳条件。电压，电阻，和脉冲长度是改变的典型参数。有关优化电穿孔的指南可以得自制造商或在工具手册中查找，例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等(ed.)，Wiley Interscience，1987)。细胞用等体积的培养基稀释且培养48小时。可以对多种细胞类型进行电穿孔，包括哺乳动物细胞，酵母细胞，细菌等等。培养后，加入含有或不含有抑制剂的培养基且细胞进一步培养1-2天。此时，收获培养基且通过本文所述的任何试验分析所述蛋白质。优选地，利用ELISA检测所述的蛋白质。测试的初始浓度为50μM。如果这个量得到统计学显著的输出的减少或单克隆Ab检测的减少，则进一步测试该候选抑制剂的剂量反应。
[0149]另外，浓缩的上清液可以在SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到固体支持体上，例如尼龙或硝基纤维素。此后，用含有同位素和非同位素报道分子基团的MIF的抗体，通过免疫印迹法检测MIF(参见Harlow，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。这些报道分子基团包括，但不限于酶，辅因子，染料，放射性同位素，发光分子，荧光分子，和生物素。优选地，该报道分子基团为125I或辣根过氧化物酶，它可以通过与2，2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起培养来检测到。如果MIF含有肽标记，上述这些检测试验很容易适用。在这种情况中，所述的抗体结合肽标记。其他试验包括以大小或电荷为基础的色谱法，包括HPLC，和亲和色谱。
[0150]或者，可以采用生物测定法定量在细胞培养基中存在的活性MIF的量。例如，MIF的生物活性可以通过巨噬细胞移动试验测定。简单而言，将用含有MIF的表达载体转染的细胞培养约30小时，期间加入候选抑制剂或增强剂。培养后，将细胞转移到低血清培养基中继续培养16小时。除去培养基和通过离心澄清化。向培养基中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，或者，裂解细胞并按照下列方法测定内部水平。随后，MIF的生物活性通过巨噬细胞移动试验，异构酶活性或增殖试验进行测定。增殖试验是通过加入不同量的洗脱物到培养的静止3T3细胞来进行。将氚代胸腺嘧啶核苷加入到培养基中并在约24小时后测定TCA可沉淀计数。活体染料MTT的还原是测定增殖作用的另一途径。作为标准，可以采用纯化的重组人FGF-2(成纤维细胞生长因子2)。其他功能可以在其他本领域可利用的适当生物测定中进行分析，例如囊多糖(CPS)诱发的中毒性休克，TSST-1诱发的中毒性休克，胶原蛋白诱发的关节炎，等等。
[0151]其他体外血管生成试验包括测定内皮细胞在胶原凝胶中增殖作用的生物测定法(Goto等，Lab Invest.69：508，1993)，脑毛细管内皮细胞在通过一个室与输出MIF蛋白质的细胞分开的胶原凝胶上的共培养(Okamure等，B.B.R.C.186：1471，1992；Abe等，J.Clin.Invest.92：54，1993)，或细胞移动试验(参见Warren等，J.Clin.Invest.95：1789，1995)。
抗体的生产
[0152]在此使用的术语“抗体，”是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指多克隆，单特异性和单克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段抗体。对于优选实施方案的抗-MIF/靶向抗体，术语“抗原”在此使用的是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指巨噬细胞移动抑制因子多肽或靶向多肽，其变体或功能片段。抗MIF/靶向抗体，或此类抗体的抗原结合片段，可以特征描述为对靶向多肽或其表位具有至少约1×105M-1，一般至少约1×106M-1，和优选至少约1×108M-1的特异性结合活性。抗MIF/靶向抗体的Fab，F(ab’)2，Fd和Fv片段，其保留了对于MIF/靶向多肽-特异性表位的特异性结合活性，属于优选实施方案的范围内。特别感兴趣的是那些结合活性多肽并置换抑制小分子的结合作用的抗体。本领域技术人员很容易理解，这样的置换可以造成构象变化，由此改变表位的性质，竞争性结合该表位，或抗体从其表位具有空间排阻。在一个实施例中，酶的活性位点可以是特定抗体的表位并当小分子在该活性位点处或附近结合时，该抗体的免疫反应性丧失，由此允许使用丧失免疫反应性的抗体作为酶活性的替代标记。
[0153]此外，术语“抗体”在此使用的是一个广义术语并且采用其普通意义，包括，但不限于，是指天然存在的抗体和非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体，嵌合，双功能和人源化抗体，以及其抗原结合片段。可以用固相肽合成装配的非天然抗体可以重组制成，或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(Huse等，Science 246：1275-1281(1989))。这些和其他制备例如嵌合，人源化，CDR-接枝的，单链，和双功能抗体的方法是本领域熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today14：243-246(1993)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1992)；Borrabeck，Antibodies Engineering，2d ed.，Oxford Univ.Press(1995)；Hilyard等，Proteins Engineering：A practical approach，IRL Press(1992))。
[0154]在某些优选实施方案中，抗MIF/靶向抗体可以用免疫原生产，例如，含有MIF的活性位点区或靶向多肽的分离肽，其可以由天然来源制备或通过重组制备，如上所述，或MIF/靶向多肽的免疫原片段(例如，含有8-30个或更多相邻氨基酸序列的免疫原序列)，包括合成肽，如上所述。MIF/靶向多肽的非免疫原性肽部分可以通过将半抗原与载体分子如牛血清白蛋白(BSA)或匙红血蓝蛋白(KLH)偶联来被免疫原化，或通过表达该肽部分作为融合蛋白质。偶联半抗原和载体分子的多种其他载体分子和方法是本领域熟知的(Harlow和Lane，如上，1992)。
[0155]本领域熟知在例如兔、山羊、鼠或其他哺乳动物中获得多克隆抗体的方法。此外，单克隆抗体可以采用本领域熟知和常规的方法获得(Harlow和Lane，如上，1992)。例如，来自靶向多肽免疫哺乳动物的脾细胞可以与适当的骨髓瘤细胞系例如SP/02骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。克隆的杂交瘤细胞系可以用标记的靶向多肽或其功能片段筛选以鉴定分泌具有所需特异性的靶向多肽单克隆抗体的克隆。表达具有预期特异性和亲和力的靶向多肽单克隆抗体的杂交瘤可被分离并用作该抗体的持续性来源，它适用于例如制备标准化试剂盒。同样地，表达例如单链抗靶向多肽的重组噬菌体也提供可以用于制备标准化试剂盒的单克隆抗体。
利用MIF抑制剂的应用和方法
[0156]MIF的抑制剂可以具有多种适当的应用，如上所述。MIF的候选抑制剂可以被分离或得自多种来源，例如细菌，真菌，植物，寄生物，化学物(小分子)的文库，肽或肽衍生物等等。此外，本领域的技术人员懂得当观察到与对照相比存在统计学上显著性差异时抑制作用已经出现。
[0157]对于MIF在病理学和内稳态中的不同角色，MIF活性的抑制或MIF细胞外定位可能具有治疗作用。例如，最新研究已经证实MIF是内毒素血症的介质，其中抗MIF抗体完全保护小鼠免于LPS诱导的致死。参见Bernhagen等，Nature 365：756-759，1993；Calandra等，J.Exp.Med.179：1895-1902，1994；Bernhagen等，Trends Microbiol.2：198-201，1994。此外，抗MIF抗体明显提高用诱发脓毒性休克的革兰氏阳性菌刺激的小鼠的存活率。Bernhagen等，J.Mol.Med.76：151-161，1998。其他研究已经证实MIF在肿瘤细胞生长的作用并且其对MIF的反义抑制产生对编程性细胞死亡刺激的抗性。Takahashi等，Mol.Med.4：707-714，1998；Takahashi等，Microbiol.Immunol.43(1)：61-67，1999。此外，MIF是糖皮质激素作用的反调节剂的发现表明抑制MIF细胞外定位的方法可能能够治疗多种病理症状，包括自身免疫性，炎症，内毒素血症，和成人呼吸窘迫综合症，炎性肠病，中耳炎，炎性关节疾病和局限性回肠炎.Bernhagen等，J.Mol.Med.76：151-161，1998；Calandra等，Nature 377：68-71，1995；Donnelly等，Nat.Med.3：320-323，1997。由于还认识到MIF是血管生成性的，所以这种细胞因子的抑制可以具有抗血管生成活性并且特别适合于血管生成疾病包括，但不限于，癌症，糖尿病性视网膜病，牛皮癣，血管病，生育力，肥胖和糖皮质激素病症的遗传疾病，如Cushings和Addisons病。
[0158]MIF活性或输出的抑制剂可以治疗上应用且也与那些结合对特定细胞具有特异性的细胞表面报道基因的靶向部分联合使用。抑制剂或增强剂的给药一般按照确定的给药方案。优选实施方案的组合物可以配制为所述的给药方式，包括例如，口服，经鼻，静脉内，颅内，腹膜内，皮下，或肌肉内给药。对于其他实施方案，本发明所述的组合物可以作为缓释植入物的组成部分给药。在另外的其他实施方案中，优选实施方案的组合物可以配制为冷冻干燥剂，利用适当的赋形剂得到冷冻干燥物所具有的稳定性，和随后再脱水。
[0159]在另一实施方案中，提供含有一种或多种MIF抑制剂的组合物。出于给药的目的，优选实施方案的化合物可以配制为药物组合物。优选实施方案的药物组合物含有一种或多种优选实施方案的MIF抑制剂以及药用载体和/或稀释剂。MIF的抑制剂在该组合物中以有效治疗特定疾病的量存在，也就是说，足以达到降低MIF水平或活性，症状的量和/或优选对于患者而言具有可接受毒性的量。优选地，优选实施方案的药物组合物可以包括MIF的抑制剂的量是小于约0.01mg至大于约1000mg/剂，这取决于给药途径，优选约0.025，0.05，0.075，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，或0.9mg至约65，70，75，80，85，90，95，100，125，150，175，200，225，250，300，350，375，400，425，450，500，600，700，800，或900mg，和更优选约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，或25mg至约30，35，40，45，50，55，或60mg。然而，在某些实施方案中，或多或少于上述的剂量可能也适宜。本领域技术人员可以很容易地测定出适当的浓度和剂量。
[0160]药用载体和/或稀释剂对于本领域技术人员来说是熟悉的。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，和可以选择性地包括抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和其他常规添加剂。该组合物还可以配制为丸剂，胶囊剂，颗粒剂，或片剂，它们除含有MIF的抑制剂以外，还含有稀释剂，分散剂和表面活性剂，粘合剂，和润滑剂。本领域的技术人员可以进一步以适当方式并且根据一般实践配制MIF的抑制剂，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，Ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA 1990所述的那些。
[0161]此外，前药也包括在优选实施方案的内容中。前药是任何与载体共价结合的、当将该前药给予患者可在体内释放出结构(Ia)或(Ib)的化合物的物质。前药一般是通过修饰官能团来制得，修饰的方式是使该修饰在常规处理中或在体内可以裂解生成母体化合物。
[0162]对于立体异构体，结构(Ia)和(Ib)的化合物可以具有手性中心并且可以作为外消旋体、外消旋混合物存在和单独对映异构体或非对映异构体存在。所有这些异构形式属于优选实施方案中，包括其混合物。此外，某些结构(Ia)和(Ib)的化合物的结晶形式可以存在多晶型，它们属于优选实施方案。另外，某些结构(Ia)和(Ib)的化合物也可以与水或其他有机溶剂形成溶剂化物。这些溶剂化物同样地属于优选实施方案的范围内。
[0163]在其他实施方案中，提供一种治疗多种病症或疾病的方法，包括炎性疾病，关节炎，免疫有关的病症等等。此类方法包括给温血动物施用足以治疗该病症或疾病的量的优选实施方案的化合物。此类方法包括系统性给予优选实施方案的MIF的抑制剂，优选以药物组合物的形式。如此所述，系统性给药包括口服和非肠道给药的方法。对于口服给药，适当的MIF的抑制剂的药物组合物包括散剂，颗粒剂，丸剂，片剂和胶囊剂以及液体，糖浆剂，混悬剂，和乳剂。这些组合物还可以包括调味剂，防腐剂，悬浮剂，增稠剂和乳化剂和其他药用添加剂。对于非肠道给药，优选实施方案的化合物可以制备为含水注射溶液，它除了含有MIF活性和/或输出的抑制剂以外，还含有缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂和其他此类溶液中常用的添加剂。
[0164]如上所述，优选实施方案的化合物的给药可以用于治疗许多不同的病症或疾病。特别是，优选实施方案的化合物给药施用给温血动物以治疗炎症，癌症，免疫疾病等等。
[0165]MIF抑制化合物可以与其他药物化合物以联合疗法方式应用。在优选实施方案中，MIF抑制化合物与用于治疗疾病或病症的常规药物联合存在，所述疾病或病症中MIF是致病因素或其中MIF在该疾病进程中发挥关键或其他作用。在特别优选实施方案中，提供含有一种或多种MIF抑制化合物的药物组合物，包括，但不限于结构(1a)或(1b)的化合物，联合使用一种或多种附加的药物化合物，包括，但不限于用于治疗多种癌症，哮喘或其他呼吸疾病，脓毒症，关节炎，炎性肠病(IBD)，或其他炎性疾病，免疫病症，或其他其中MIF是致病性的疾病或病症的化合物。
[0166]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种非甾类抗炎药物(NSAIDs)或其他用于治疗关节炎或其他炎性疾病的药学化合物联合给药。优选的化合物包括，但不限于，塞来考昔(celecoxib)；罗非考昔(rofecoxib)；NSAIDS，例如，阿司匹林，塞来考昔，胆碱三水杨酸镁，双氯芬酸钾，双氯芬酸钠，二氟尼柳，依托度酸，非诺洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚美辛，酮洛芬，酮咯酸，melenamic acid，萘丁美酮，萘普生，萘普生钠，噁丙嗪，吡罗昔康双，罗非考昔，双水杨酸酯，舒林酸，和托美丁；和糖皮质类固醇类，例如，可的松，氢化可的松，甲泼尼松，泼尼松，泼尼松龙，倍他米松，二丙酸倍他米松，布地奈德，地塞米松磷酸钠，氟尼缩松，丙酸氟地松，曲安奈德，倍他米松，氟轻松，氟轻松醋酸酯，二丙酸倍他米松，戊酸倍他米松，地奈德，去羟米松，氟轻松，曲安西龙，曲安奈德，丙酸氯倍他索，和地塞米松。
[0167]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种β兴奋剂、吸入皮质类固醇、抗组胺药、激素或其他用于治疗哮喘、急性呼吸窘迫或其他呼吸疾病的药物化合物联合给药。优选的化合物包括，但不限于，β兴奋剂，例如，常用的支气管扩张药；吸入皮质类固醇，例如，倍氯米松，氟地松，曲安西龙，莫米他松，和泼尼松的形式例如泼尼松，泼尼松龙，和甲泼尼松；抗组胺药，例如，阿扎他定，卡比沙明/假麻黄碱，西替立嗪，赛庚啶，右氯苯那敏，非索非那定，氯雷他定，异丙嗪，扑敏宁，溴苯那敏，cholopheniramine，氯马斯汀，苯海拉明；和激素类，例如，肾上腺素。
[0168]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与治疗IBD的药学化合物以药物组合物的形式联合给药，例如硫唑嘌呤或皮质类固醇。
[0169]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与治疗癌症的药学化合物以药物组合物的形式联合给药，例如紫杉醇。
[0170]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与免疫抑制化合物以药物组合物的形式给药。在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与一种或多种治疗自身免疫疾病的药物联合给药，例如，Lyme氏疏螺旋体病，狼疮(例如，系统性红斑狼疮(SLE))，或获得性免疫缺损综合症(AIDS)。所述的药物包括蛋白酶抑制剂，例如，印地那韦(indinavir)，安普那韦(amprenavir)，沙奎那韦，洛品那韦(lopinavir)，利托那韦(ritonavir)，和奈非那韦(nelfinavir)；核苷反转录酶抑制剂，例如，齐多夫定，阿巴韦(abacavir)，拉米夫定(lamivudine)，idanosine，扎西他滨，和斯它夫定(stavudine)；核苷酸反转录酶抑制剂，例如，替诺福韦disoproxil fumarate；非核苷反转录酶抑制剂，例如，delavirdine，依法韦仑，和奈韦拉平；生物反应修饰剂，例如，依那西普，英夫利昔单抗，和其他抑制或感染肿瘤坏死因子的化合物；抗病毒药物，例如，阿米夫定(amivudine)和齐多夫定。
[0171]在特别优选实施方案中，一种或多种MIF抑制化合物与用于治疗脓毒症的药学化合物联合给药，例如甾族化合物或抗感染药。甾族化合物的实例包括皮质类固醇雷，例如，可的松，氢化可的松，甲泼尼松，泼尼松，泼尼松龙，倍他米松，二丙酸倍氯米松，布地奈德，地塞米松磷酸钠，氟尼缩松，丙酸氟地松，曲安奈德，倍他米松，氟轻松，氟轻松醋酸酯，二丙酸倍他米松，戊酸倍他米松，地奈德，去羟米松，氟轻松，曲安西龙，曲安奈德，丙酸氯倍他索，和地塞米松甲苯。抗感染药的实例包括驱虫药(甲苯咪唑)，抗生素雷包括氨基糖甙类(庆大霉素，新霉素，妥布霉素)，抗真菌抗生素(两性霉素b，氟康唑，灰黄霉素，伊曲康唑，酮康唑，制酶菌素，双氯苯咪唑，托萘酯)，头孢菌素类(头孢克洛，头孢唑啉，头孢噻污，头孢他啶，头孢曲松，头孢呋辛，头孢氨苄)，β-内酰胺抗生素(头孢替坦，美罗匹宁)，氯霉素，大环内酯类(阿齐霉素，甲红霉素，红霉素)，青霉素类(青霉素G钠盐，阿莫西林，氨苄青霉素，双氯西林，萘夫西林，哌拉西林，替卡西林)，四环素类(脱氧土霉素，米诺环素，四环素)，杆菌肽；克林霉素；多粘菌素甲磺酸五钠；硫酸多粘菌素b；万古霉素；抗病毒药物包括无环鸟苷，金刚烷胺，地达诺新，依法韦仑，磷卡萘，丙氧鸟苷，印地那韦(indinavir)，拉米夫定(lamivudine)，奈非那韦，利托那韦，沙奎那韦，斯它夫定(stavudine)，伐昔洛韦，伐甘洛韦(valganciclovir)，齐多夫定；喹诺酮类(环丙沙星，左氟沙星)；磺胺类(磺胺嘧啶，磺胺异噁唑)；砜类(氨苯砜)；呋喃唑酮；甲硝唑；戊双脒；磺胺结晶；加替沙星；和新诺明/甲氧苄啶。
[0172]在某些疾病的治疗中，可以有益地用MIF抑制剂联合麻醉药治疗患者，例如，乙醇，布比卡因，氯普鲁卡因，左布比卡因，利多卡因，卡波卡因，普鲁卡因，罗比卡因，丁卡因，去氟烷，异氟烷，氯氨酮，普鲁泊福，七氟醚，可待因，芬太尼，氢吗啡酮，麻卡因，度冷丁，美沙酮，吗啡，羟考酮，雷芬太尼(remifentanil)，舒芬太尼，布托啡诺，纳布啡，曲马朵，苯佐卡因，二丁卡因，氯乙烷，塞罗卡因(xylocaine)，和非那吡啶。
实施例
[0173]优选实施方案的MIF的抑制剂可以按照下列实施例所述制备和筛选其对活性或输出的抑制作用。
实施例1
巨噬细胞移动试验
[0174]巨噬细胞移动通过如Harrington和Stastny等，J.Immunol.110(3)：752-759，1973所述的琼脂糖滴实验和毛细管法进行测定。简单而言，将含巨噬细胞样品加入到血细胞比容管内，该管长75mm，内径为1.2mm。将该管加热密封并离心100×G for 3分钟，在细胞液界面切割并嵌入Sykes-Moore培养室中一滴硅氧烷润滑膏中。该培养室含有对照蛋白质(BSA)或样品。37℃下培养24和48小时后测定移动区域，测定方法是跟踪巨噬细胞跟随物(fans)的投影图像并利用平面几何学测定移动的面积。
[0175]或者，96孔平板的各孔用1微升含于水中的液态0.8％(w/v)SeaPlaque琼脂糖预涂层，分散在各孔的中间。此后该平板在光箱内轻微加热直至琼脂糖滴刚刚变干。将2微升在介质内可达25％(v/v)(存在或不存在MIF或其他对照)的含巨噬细胞的细胞混悬液加入到上述预涂层平板孔中并冷却至4℃达5分钟，该混悬液含有0.2％琼脂糖(w/v)并加热至37℃。各孔随后填充有培养基并在37℃和5％CO2-95％空气下培养48小时。通过测定液滴的边缘到移动的外周之间的距离来测量琼脂糖滴的移动。
移动测定
[0176]重组鼠科和人野生型和鼠科突变型MIF的单核细胞移动抑制活性是利用人外周血单核细胞或T细胞贫化单核细胞在改进的Boyden室格内分析。钙黄绿素AM-标记的单核细胞悬以2.5to 5×106/mL悬浮在RPMI1640培养基中(用于人白细胞细胞在单层或悬浮培养物中的培养基，得自Roswell Park Memorial Institute)，培养基中含有L-谷酰胺(无酚红)和0.1mg/mL人血清白蛋白或牛血清白蛋白。将等份试样的(200μL)细胞混悬液加入到预热至37℃的U形底96孔培养平板的孔中(Costar，Cambridge，MA)。将存在于RPMI 1640中的MIF加入到该细胞混悬液中达到终浓度为1，10，100，和1000ng/mL。该培养平板被置于温控平板读数器的室内，混和30秒，并且在37℃下温育10-20分钟。在培养期间，将28μL的10或25ng/mL的预热人单核细胞趋化性蛋白质1(MCP-1；Pepro Tech.，Inc.，Rocky Hill，NJ)或含有0.1mg/mL Has的RPMI 1640加入到ChemoTX平板的底孔中(Neuro Probe Inc.，Gaithersburg，MD；3mm孔径，5μM滤器孔径)。小心地将过滤平板加入到基板。从恒温箱内取出处理的细胞混悬液并向过滤平板的各孔内加入30μL。装配的平板在37℃下在含有5％CO2的加湿室内培养90分钟。培养后，从滤器的表面抽吸该细胞混悬液并从基板取出滤器且通过加入50μL of 1X HBSS-(Hanks’平衡盐溶液，1X浓度)至各滤器部分洗涤3次。两次洗涤之间，用涂刷器(NeuroProbe)除去残余的HBSS-。使滤器风干且在荧光平板读数器中直接读数，在485nm下激发并在535nm下发射。趋化性或无规移动指数定义为一组孔的平均滤器结合荧光除以不含有MCP-1或MIF的孔中滤器的平均荧光。荧光标记的细胞的滴定揭示出，该试验中检测的荧光的水平与细胞数目具有线性关系(未给出)。
互变异构酶试验
[0177]互变异构反应基本上按照Rosengren等，Mol.Med.2(1)：143-149，1996所述方法进行。评估D-多巴色素转化为5，6-二羟基吲哚-2-羧酸。制备1ml在样品溶液内含有0.42mM底物和1.4μg MIF的比色杯，该样品溶液中含有0.1mM EDTA和10mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0，并且在475nm下追踪亚氨铬(iminochrome)吸光度的减小率。用L-多巴色素作为对照。此外，反应产物可以用HPLC检测，采用含有20mM KH2PO4缓冲液(pH4.0)和15％甲醇的流动相且流速为1.2ml/min。荧光检测是在295/345nm下进行。
[0178]或者，利用苯丙酮酸酯(盐)或(p-羟基苯基)丙酮酸酯(盐)的互变异构反应基本上按照Johnson等，Biochem.38：16024-16033，1999所述进行。在这种情况中，苯丙酮酸酯的酮基化是在288nm(ε＝17300M-1cm-1)下监测且(p-羟基苯基)丙酮酸酯的酮基化是在300nm(ε＝21600M-1cm-1)下监测。该试验混合物含有50mM Na2HPO4缓冲液(1mL，pH 6.5)和一等份的MIF溶液，将其充分稀释(0.5-1.0μL的2.3mg/mL溶液，终浓度93-186nM)得到初始线性率(liner rate)。该试验始于加入少量(1-3.3μL)来自储备液的苯丙酮酸酯或(p-羟基苯基)丙酮酸酯在乙醇中。苯丙酮酸酯和(p-羟基苯基)丙酮酸酯的结晶形式专门作为烯醇异构体(Larsen等，ActaChem.Scand.B 28：92-96，1974)。底物的浓度可以在10-150M的范围内，同时在小于0.5％v/v下观察到对MIF活性没有显著的抑制作用。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析
[0179]细胞培养试验被设计为表征候选化合物的活性，MIF表达，运输，和输出。基本上按照现有方法制备用于免疫沉淀的细胞和条件培养基组分(Florkiewicz等，生长因子4：265-275，1991；Florkiewicz等，Ann.N.Y.Acad.Sci.638：109-126)，但除了将400μl的细胞裂解缓冲液(1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，20mM Tris pH 7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，0.01mM苯基甲基磺酰氟，10ng/ml抑肽酶，10ng/ml亮抑肽酶，10ng/ml peptstatin)加入到在微型离心机中离心15分钟澄清化的培养基组分中。细胞或培养基组分与MIF的单克隆或多克隆抗体一起培养并且加入GammaBindTM GSepharose(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)继续培养30分钟。免疫复合物通过微型离心机离心进行沉降，用细胞裂解缓冲液洗涤3次，并且用冰冷的免疫沉淀洗涤缓冲液(0.15M NaCl，0，01M Na-磷酸盐pH 7.2，1％脱氧胆酸盐，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠)洗涤4次。将免疫复合物直接解离在SDS凝胶样品缓冲液125mM Tris，pH 6.8，4％SDS，10％甘油，0.004％溴酚蓝，2mM EGTA中，并且用12％SDS-PAGE分离。该凝胶进行荧光自显影，干燥，并且在-70℃下暴露在X射线胶片下。当新霉素磷酸转移酶被免疫沉淀时，采用兔抗NPT抗体(5Prime-3Prime，Boulder，CO)。
[0180]对于蛋白质印迹分析法，将蛋白质自12％SDS-PAGE凝胶转移至硝基纤维素膜(孔径0.45μm，在含有25mM 3-[二甲基(羟甲基)甲基氨基]-2-羟丙烷-磺酸的冷缓冲液中，pH 9.5，20％甲醇0.4amps下90分钟。对于蛋白质印迹分析，细胞条件化的培养基中，将该培养基离心(10分钟，在800g下)并且把上清液通过膜过滤法浓缩10倍(10kDa截止，Centricon-10Amicon)。在还原条件下将样品随后再溶于16％SDS Tris-对羟基苯基甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上并在20V下3小时转移到硝基纤维素膜(Novex)上。膜与兔多克隆抗大鼠抗体(1∶1000)(Torrey PinesBiolab，San Diego，CA)一起培养，并且随后与辣根过氧化物酶偶联物(1∶1000)(Pierce，Rockford，IL)一起培养。用氯萘酚(chloronaphtnol)/H2O2展开目测观察MIF。重组MIF(2ng，购自R&D systems，Minneapolis)经过电泳和转移作为标准。膜在10mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，5mM NaN3，0.35％聚氧化乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯和5％脱脂干燥牛奶(Carnation Co.，Los Angeles，CA)中室温下封闭1小时。膜与单克隆抗体(Catalog Number MAB289，购自R&D Systems，Minneapolis，MN)或多克隆(山羊多克隆血清，R&D Systems cat#AF-289-PB)一起温育。温育后，膜在室温下用含有150mM NaCl，500mM磷酸钠pH 7.4，5mM NaN3，和0.05％聚氧化乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯的缓冲液洗涤10次。当使用单克隆抗体时，膜随后在含有1μg/ml兔抗小鼠IgG(H+L，affinipure，JacksonImmuno Research Laboratories，West Grove，PA)的封闭缓冲液中室温下温育30分钟。对于多克隆探测，培养采用兔抗山羊(Sigma，Catalog NumberG5518)。膜进而在1L的上述缓冲液中洗涤，并且在100ml的含有15μCi125I-蛋白质A(ICN Biochemicals，Costa Mesa，CA)的封闭缓冲液中培养，并且用1L的缓冲液洗涤。放射信号通过放射自显影法观测。
[0181]由LPS(10μg/ml)处理的THP-1细胞收集过夜条件化培养基，还用不同量的候选化合物处理并通过免疫沉淀法筛选同时用单克隆或多克隆抗体检测MIF结合。条件培养基显示出，在10μM候选化合物的存在下使用单克隆抗体时可检测MIF的损失明显，这在使用多克隆抗体时无法观察到。这种响应反映出候选化合物对MIF酶活性的作用。所以，单克隆反应性发挥酶促活性的替代标记的作用。
[0182]不同浓度的抑制剂类似物加入到LPS刺激的THP-1细胞并允许培养过夜。次日利用ELISA评估免疫反应性MIF的检测量。候选化合物抑制识别MIF的抗体的能力。
[0183]测定候选化合物降低THP-1细胞所产生的MIF免疫反应性的能力。THP-1细胞用10μg/ml的LPS处理并在LPS刺激后不同的时间加入10μM的候选化合物，用抗MIF单克隆检测免疫反应性。加入候选化合物后，免疫反应性迅速丧失。当在不同时间向细胞培养物加入候选化合物时，测量化合物或只含缓冲液的对照对MIF检测的作用，并且此后相应条件培养基样品以时间依赖性方式处理。
[0184]候选化合物调控MIF的抗体识别的性能采用预条件培养基在肝细胞不存在下测试。在本试验中，LPS加入到存在于上述培养基中的THP1细胞。6小时后，除去条件培养基，澄清化细胞碎片，测定的MIF的量为22ng/ml。这种预条件培养基此后分为2组。两组均在37℃下培养不同的时间周期，之后加入候选化合物或单独缓冲液(对照)继续在37℃下培养30分钟。可检测MIF的水平进而通过ELISA法、利用检测用的单克隆抗MIF抗体进行测定。MIF特异性ELISA信号的快速丧失依赖于存在的候选化合物。MIF的对照水平没有变化。所以，候选化合物与MIF相互作用，并且阻断抗体随后与MIF相互作用的性能，甚至在不存在细胞时也如此。由于这种相互作用发生在催化位点或约束催化活性，免疫反应性的丧失与失去的酶促活性和/或MIF相关活性有关联。
细胞外定位试验
[0185]为了进一步评估候选化合物调控MIF输出的体外活性，选择小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞(鼠科巨噬细胞细胞系，American TypeCulture Collection，Manassas，VA)。
[0186]将Raw 264.7巨噬细胞(3×106细胞/孔)铺板在12孔组织培养平板(Costar)中并在RPMI/1％热灭活胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)中培养。37℃下在含5％CO2的加湿空气中培养3小时，除去未粘附的细胞并且孔用RPMI/1％FBS洗涤2次。细胞随后用LPS(0111：B4)或TSST-1(中毒性休克综合症毒素-1，Toxin Technology，Sarasota，FL)培养24小时，它是约95％纯且重新悬浮在无热原水中，浓度范围为1pg/ml-1000ng/ml(用于剂量反应试验)。对于时间—过程试验，平行培养物的条件培养基在用1ng/ml TSST-1或LPS刺激后0.5，1，2，4，8和24小时的时间间隔取出。对于抑制研究，RAW 264.7细胞(3×106细胞/孔)与1ng/mlLPS(0111：B4)或1ng/ml TSST-1在0.01μM-10μM候选化合物或缓冲液(作为对照)的存在下一起培养24小时。在滤器上浓缩存在于细胞条件培养基中的细胞并且通过蛋白质印迹法分析样品中残留的MIF，MIF带密度也可以通过Stratagene Eagle EyeTM测定。
[0187]通过加入1ng/ml TSST-1或LPS并培养24小时，RAW细胞可以被诱导表达MIF。按照上述方法测定条件培养基中的MIF。与单用缓冲液培养的细胞相比，候选化合物以浓度依赖方式降低条件培养基中可免疫检测到的MIF水平。
细胞培养物，转染和代谢标记
[0188]得自American Type Culture Collection(ATCC No.CRL 1650)的靶向细胞在48孔平板中DMEM(Dulbecco改进的Eagles氏培养基)内培养过夜，该培养基中补充有10％胎牛血清，2mM L-谷酰胺，1mM丙酮酸钠，100nM非必需氨基酸，和50μg/ml庆大霉素。靶向细胞随后用2μg/mlCsCl纯化的质粒DNA在转染缓冲液(140mM NaCl，3mM KCl，1mMCaCl2，0.5mM MgCl2，0.9mM Na2HPO4，25mM Tris，pH 7.4)中转染。向各孔内，加入300μl存在于转染缓冲液中的DNA。细胞在37℃下培养30分钟，并且抽吸该缓冲液。在1.5小时内加入补充有100μm氯喹的培养基。除去这种培养基且细胞用完全培养基洗涤2次。随后细胞培养40-48小时小时。感兴趣的质粒用pMAMneo(糖皮质类固醇可诱导的含有耐新霉素基因的哺乳动物表达载体，Clontech，Palo Alto，CA)共转染，其含有选择性标记物新霉素磷酸转移酶。当2μg的感兴趣质粒用10μg pMAMneo共转染时，70％以上的转染细胞表达了MIF和neo两者，通过免疫荧光显微镜法测定。
[0189]对于免疫沉淀试验，靶向细胞用100μCi 35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸(Trans 35S-label，ICN Biomedicals，Irvine，CA)在1ml无蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中代谢地脉冲标记15分钟。标记后，该细胞单层用补充有过量(10mM)未标记蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM洗涤1-2分钟1次。细胞随后在2ml的该培养基中培养指定长的时间并在无前导蛋白质的存在下免疫沉淀该细胞上清液。对于所述的培养物，追踪培养基补充有指定浓度的调节剂。
[0190]或者，对于ELISA的分析，靶向细胞用250μl的0.1M碳酸钠，pH 11.4洗涤1-2分钟且立刻抽吸。另外优选高盐溶液。该细胞用含有0.5％FBS加25μg/ml肝素的培养基洗涤且随后该细胞在同样的培养基中培养指定长短的时间。对于所述的培养物，追加培养基补充有调节剂。对于用编码含有前导序列的蛋白质例如hCG-α或任何其他非肝素结合蛋白质的载体转染的细胞，可以忽略使用碳酸盐洗涤和含肝素培养基。
MIF抑制剂的高通量筛选试验
[0191]MIF抑制剂的高通量筛选试验是在96孔格内用产自THP-1细胞的MIF进行并且按照下列方法完成。MIF试验通过上述ELISA进行。THP-1细胞再悬浮在RPMI培养基中达到约5×106细胞/ml，该培养基含有20μg/ml的细菌LPS并且该细胞培养18-20小时。此后收集细胞上清液且用推定的抑制剂进行培养。简单而言，96孔平板(Costar Number 3590)ELISA平板在37℃下用MIF单克隆抗体(R&D Systems Catalog Number MAB289)包被2小时达到浓度为4μg/ml。将未稀释的培养上清液加入到该ELISA平板室温下培养2小时。此后洗涤孔，加入生物素化MIF多克隆抗体(R&DSystems #AF-289-PB)，随后加入链霉抗生物素-HRP和产色底物。MIF的量通过外推法由MIF底物曲线计算。
血清中候选抑制剂HPLC分析
[0192]评估小分子的体内作用之前，希望能够以定量方式检测体液如血液中的化合物。为首次可再现检测试验化合物，例如MIF抑制剂，建立分析方法，并且随后测定其在生物流体中的浓度。
[0193]RP-HPLC采用带有Symmetry Shield RP-8(4.6×75mm id，Waters，Milford，MA)的Hewlett-Packard Model HP-1100单元进行。流动相为等度溶液，该溶液含有35％乙腈/含0.1％三氟乙酸的水。在235nm下监测吸光度。为了测量试验化合物在血清中的量，样品血清蛋白质首先用50％乙腈(4℃过夜)分离，随后在14000rpm下离心30分钟。该上清液此后通过RP-HPLC分析且该化合物的浓度基于已知标准品的校准曲线进行计算。按照这种方法，用反相HPLC在1.5-800ng(R2＝1)的线性范围内、利用峰(spiked)试验样品检测候选化合物(未给出)。当将上述分析技术应用于来自接受候选化合物的动物的血清时，定量测定候选化合物的循环浓度。
[0194]随着上述方法的发展，可以评估化合物不同给药途径的功效并且描述生物活性的特征。对于试验时间依赖性血清生物利用度，动物用候选化合物通过腹膜内注射(i.p.)和饲管口服进行处理。
MIF的体内抑制
[0195]下列体内试验的目的在于证实利用候选化合物抑制MIF的初始体外试验结果。LPS诱导的毒性似乎与MIF以及TNF-α和IL-1β的过度生产有关。由于动物可以通过中和或抑制这些炎症介体受到保护免于内毒素休克。选择本模型，因为它提供了脓毒症和脓毒性休克的可再现和快速致死模型。
[0196]脂多糖(LPS)的剂量在各试验之前更新。LPS(Escherichia Coli0111：B4，Sigma)是通过加入0.5％TEA(1ml USP水+5ml三乙胺(Pierce))到5mg内毒素的瓶内来重构。一旦重构化，该溶液在37℃下培养30分钟。此后，该溶液在56-60℃浴超声器中超声30秒共3次。超声后，持续涡旋该混合物3分钟。此后LPS的储备液备用。
血液中IL-1β和TNF-α和MIF的检测
[0197]10只10周龄(20±2gram)雌性BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratories，Kingston，NY)以每笼5只/组笼养，同时随意获得食物和水，并且在试验之前适应环境至少1周。试验的当天，称重小鼠并随意分布为相等平均体重的10只动物组。给小鼠i.p注射200μL的配制候选化合物或缓冲液本身，此后即刻i.p.注射LPS(Escherichia coli 0111：B4，10mg/kg或5mg/kg体重)和β-D-半乳糖胺(50mg/kg体重)。各剂量的LPS(0.2ml对于20gram小鼠)，腹膜内给药并混和，β-D-半乳糖胺的终浓度为50mg/ml。收集从心脏穿刺采集的血液标本之后，处死该动物。通常，在LPS处理后4小时进行收集。按照制造商的方案将血清分离到血清分离器(Microtainer(R)Becton Dickinson，Minneapolis，NJ)。小鼠血清IL-1β和TNF-α通过ELISA、利用“小鼠IL-1β免疫分析或小鼠TNF-α免疫分析”试剂盒(R&D System Minneapolis，MN)、按照制造商的指导进行测量。小鼠血清中血清MIF浓度通过三明治ELISA(ChemiKine MIF Kit，Chemicon，SanDiego，CA)定量。样品一式双份分析，将结果平均。
鼠LPS模型
[0198]10只8-10周龄(20±2gram)雌性BALB/c小鼠按照上述方法笼养并适应环境。在试验的当天，称重小鼠并随意分布为相等平均体重的10只动物组。给小鼠注射200μL的配制候选化合物或其缓冲液(平均20mg/kg化合物)，随后i.p.注射LPS(E.Coli 055B5，Sigma)(40，10，5，2或0.5mg/kg体重)和50mg/kg β-D-半乳糖胺。在第一个18小时内每2小时观察小鼠并在7天内每天观察2次。对于这些研究，采用Kaplan-Meier评估法评价动物的存活。
[0199]对于所有体内研究，处理组间的标准统计学对比是利用针对分类数据的Fisher试验和针对连续变量的Mantel-Cox试验进行。为了测定血清IL-1的水平是否与血清MIF相关，采用Fisher试验。分析使用StatView 5.0软件(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。全部报告的p值是双侧的且小于0.05的值被认为具有统计学意义。
[0200]初始对照试验用于测定鼠科模型体系中内源性MIf的基线水平(雌性Balb/c小鼠)，并且进一步测定用LPS(10mg/kg)处理后内源性MIF增高的速率和程度。Female Balb/c小鼠用混和有50mg/kg β-D-半乳糖胺的LPS(Sigma 0111：B1)处理。MIF在血清中的水平通过HPLC按照上述方法在LPS/半乳糖胺处理后0，2，5和6小时时测定。在该代表性试验的开始时，当小鼠用候选化合物(配制为50％水溶液)和10mg/kg LPS处理时测定内源性MIF的基线水平，可以检测到循环MIF的水平明显降低。在另一试验中，经ELISA测定小鼠血清中的MIF和IL-1β两者。MIF和IL-1β中观察到两者之间存在直接和高度的相关性。这种相关性在MIF和TNF-α之间也可观察到。在同样的试验中，在给予20mg/kg候选化合物后观察到血清IL-1β水平和血清TNF-α水平的降低。
[0201]试验性LPS诱导的中毒性休克的研究已经揭示了对于MIF和TNF-α的重要作用。事实上LPS刺激巨噬细胞样细胞产生MIF，由此诱发巨噬细胞样细胞的TNF-α分泌，这表明了MIF在LPS的致病机理中的潜在作用。为了试验候选化合物是否可以预防LPS休克，采用在β-D-半乳糖胺敏化的BALB/c小鼠中的致死LPS介导的休克模型。候选化合物在注射致死剂量的LPS(2，5和10mg/kg)的同时的处理提高存活率。该作用是通过所用LPS的浓度进行调节，这证实当试验较高浓度的LPS时，候选化合物的作用可被饱和，由此是特异性的。
MIF克服候选化合物的作用
[0202]当施用候选化合物时内源性重组人MIF可以逆转该化合物的有益效果，由此支持了候选化合物通过调节小鼠血清中MIF水平提高动物对LPS的抗性的假设。在本试验中，小鼠用标准LPS方案、但除了1mg/kg LPS和20mg/kg的候选化合物之外进行处理，一些动物还接受300μg/kg人重组MIF。12小时时，在候选化合物存在下明显增多的小鼠幸存于LPS，但该存活率被MIF的施用抵消。
MIF抑制剂在胶原诱发的关节炎模型中
[0203]20只DBA/1LacJ小鼠，10-12周龄，在第0天在尾底用在弗氏完全佐剂(FCA；GibcoBRL)中乳化的II型牛胶原蛋白(CII 100μg)免疫。在第7天，经同样的途径施用第二剂量的胶原(在弗氏完全佐剂中乳化)。第14天给小鼠皮下注射100mg的LPS(055：B5)。第70天给小鼠腹膜内注射40μgLPS(0111：B4)。按照爪厚度划分组，随机分布后，用卡钳测量得到平衡起始组。存在于缓冲液中的候选化合物在第71，72，73，和74天施用给小鼠(总的8个剂量，0.4mg/剂，约20mg/kg体重)。此后在74天由两个观察人员检测小鼠的爪厚度。在本试验中，消退的小鼠(成熟关节炎的减退)在第70天用末次i.p.注射LPS处理以刺激细胞因子的产生和急性炎症。候选化合物处理的小鼠与只用载体对照处理的相比适度发展为爪水肿减轻。在后面的时间点，处理组中的动物与其对照比较没有达到胶原诱导性关节炎的成熟表达。
[0204]在另一试验中，15只DBA/1J小鼠，10-12周龄在第0天在尾底用在弗氏完全佐剂(FCA；GibcoBRL)中乳化的II型牛胶原蛋白(CII 100μg)免疫。在第21天，经同样的途径施用第二剂量的胶原(在弗氏完全佐剂中乳化)。第28天给小鼠皮下注射100μg的LPS(055：B5)。第71天给小鼠腹膜内注射40μgLPS(0111：B4)。分组和处理方案按照上述相同的方法进行。在第74天，收集样品病测定细胞因子。候选化合物与未处理CIA样品相比降低了血清MIF水平。检测到更显著的对血清TNF-α水平的抑制作用。
实施例2
[0205]某些实施方案中MIF抑制剂可以按照下列反应路线进行制备。这些MIF抑制剂分别属于上述化合物的一类。变量R1，R2，R3，R4，Z，和n如上所述。
本发明化合物的合成通用方法
[0206]所述的化合物由取代或未取代的靛红酸酐开始合成。将R2和/或R3基团引入上述结构(1a)和(1b)的化合物的策略涉及取代的靛红酸酐作为前体化合物由取代邻氨基苯甲酸类的制备。取代的邻氨基苯甲酸类是由取代的硝基苯甲酸类制成。在一些情况中，硝基苯甲酸是通过适当苯甲酸的硝化来获得，如反应路线1所示，然而，可以采用任何适合制备硝基苯甲酸类化合物的方法。
反应路线1
Figure A20048000430500991
[0207]利用两种不同的方法把R1基团引入到上述结构(1a)和(1b)的化合物中。在一种方法中，按照反应路线1制备的取代靛红酸酐在N-1位烷基化，此后转化为结构i的取代喹啉酮中间体(在下面反应路线2中描述)。中间体i的胺化生成结构ii的酰胺中间体，它与三氯氧磷反应生成如反应路线2所示的iii型的中间体.
反应路线2
Figure A20048000430500992
[0208]为了将R4引入到结构(1a)和(1b)的化合物中，结构iii的氯中间体或者与酰化哌嗪反应，或者首先与过量哌嗪反应得到结构iv的中间体，并且此后酰化生成如反应路线3所示的目标化合物。中间体iv的酰化是通过该中间体用市售的酰氯处理或者用由相应羧酸与草酰氯反应制备的酰氯来处理，如反应路线3所示。
反应路线3
Figure A20048000430501001
[0209]在将R1基团引入到结构(1a)和(1b)的化合物中的另一方法中，结构ix的结构是由靛红酸酐制备并且在最后步骤中烷基化N-1位。靛红酸酐通过用丙二酸二乙酯转化为结构v的中间体。中间体v胺化，随后与热三氯氧磷反应后得到结构vii的二氯喹啉酮中间体。中间体vii与乙酸铵在醋酸中反应生成结构viii的中间体，它用酰基哌嗪处理得到如反应路线4所示的结构ix的中间体。
反应路线4
Figure A20048000430501011
[0210]中间体ix的N-1位的烷基化生成具有不同R1取代的预期化合物。该烷基化是通过加热中间体ix与碳酸钾和相应烷基卤化物，或通过将该中间体用氢化钠和烷基卤化物在室温下处理来完成，如反应路线5所示。
反应路线5
Figure A20048000430501012
反应路线6
Figure A20048000430501021
[0211]适合用作中间体的酰基和烷基哌嗪类可以按照下列方法合成。在保持温度低于20C下将存在于二氯甲烷(5ml)中的新蒸馏亚硫酰氯(3.9ml；0.053mol)滴加到2-噻吩甲醇(4.2ml；0.044mol)和三乙胺(7.4ml；0.05mol)在二氯甲烷(25ml)中的搅拌溶液内。在1小时内使温度升高至40℃，并且将该溶液倾入碎冰。分离该CH2Cl2相且用MgSO4干燥，随后滴加到N-Boc-哌嗪(2g；0.011mol)和三乙胺(1.5ml；0.011mol)在CH2Cl2(45ml)中的搅拌溶液内。参见，例如.，Meanwell等，J.Med.Chem.(1993)Vol.36.，pp.3251-3264；Carceller等，J.Med.Chem.(1993)No.36，pp.2984-2997。该混合物在室温下搅拌过夜。此后减压下除去溶剂，并且残余物用醚萃取。该醚溶液在减压下蒸发，并且将残余物溶解在三氟乙酸(TFA)(3.3ml；0.043mol)中并保持30分钟。减压下除去TFA，残余物用醚研磨，过滤沉淀并风干得到1-(2-噻吩基甲基)哌嗪双三氟乙酸盐(3.16g；72％)。参见例如.，Archer等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.II.(1983)pp.813-819.
反应路线7
Figure A20048000430501022
[0212]将新蒸馏的亚硫酰氯(3.9ml；0.053mol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液滴加到糠醇(3.8ml；0.044mol)和三乙胺(7.4ml；0.05mol)在二氯甲烷(25ml)中的溶液内；该温度保持在低于20℃。将混合物搅拌1小时，此后蒸发溶剂，并且将残余物溶解在CH2Cl2(150ml)中。将所得溶液滴加到N-Boc-哌嗪(2g；0.011mol)和三乙胺(4ml；0.029mol)在CH2Cl2(45ml)中的搅拌溶液内。室温下将该混合物搅拌过夜，减压下除去溶剂，残余物用乙醚萃取。减压下蒸发该醚溶液，将残余物溶解在TFA(3.3ml；0.043mol)中并保持30分钟。减压下除去TFA，残余物用乙醚研制，过滤得到的黑色沉淀。此后，将该沉淀溶解在200ml的MeOH中，加入活性炭，并且该化合物在加热下回流30分钟。过滤除去炭，蒸发溶剂，残余物用乙醚研制。过滤得到的白色沉淀并且风干得到1-(2-呋喃基甲基)哌嗪双三氟乙酸盐(1.64g；40％)。参见，例如Lukes等，Collection Czechoslov.Chem.Commun.(1954)Vol.19，pp.609-610.
4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物595-03)的制备
[0213]在0℃和N2气氛下将2-噻吩羰基氯(2.04g，1.49mL)加入到1-哌嗪羧酸叔丁酯(2.5g，13.4mmol)和DMAP(20mg)在吡啶(15mL)中的溶液内并且室温下搅拌过夜。将该混合物倾入冰水，过滤沉淀，用水洗涤数次，并且干燥得到白色固体(3.5g，88％)。M.P.76℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.42(s，12H)，3.40(m，4H)，3.61(m，4H)，7.12(m，1H)，7.43(d，J＝4.1Hz，1H)，7.77(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z 297(M+1)，319(M+23).Anal.(C14H20N2O3S)C，H，N.
Figure A20048000430501031
哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(化合物595-04)的制备
[0214]向595-03(3.5g，11.8mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液内加热三氟乙酸(10mL)。室温下搅拌该溶液3小时。真空下蒸发溶剂且将残余物溶解在氯仿中。有机相用碳酸氢钠的饱和溶液洗涤，用Na2SO4干燥并蒸发得到2.20g(94％)的褐色粘性油。1H NMR(DMSO-d6)：δ2.78(m，4H)，3.59(m，4H)，7.12(t，J＝4.1，1H)，7.38(d，J＝4.1Hz，1H)，7.74(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z 197(M+1).
反应路线8
[0215]结构vi的N-取代的哌嗪类是制备MIF抑制剂的有用中间体。它们可以通过使被保护的中间体v(在这种情况中，例如用N-叔丁氧基羰基或“Boc”保护)脱保护来制备。该被保护的中间体可以由N-保护的哌嗪iv、通过引入所需R4基团来制备。在上述反应路线中，Z是-CH2-或-C(＝O)-；n是0，1或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，R8，和
Figure A20048000430501042
R5和R6独立地选自氢，烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，和取代的杂环烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；R7选自烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，和取代的杂环烷基；和R8选自氢，烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，和取代的杂环烷基。
实施例3
[0216]下面描述下示通式结构1’(a)和1’(b)的化合物文库的合成。命名中包括“M”的化合物合并有CN部分。下表1中给出数字命名。
[0217]在命名中包含“+i”的化合物中，R13是位于喹诺酮氧原子上而不是氮原子上的取代基，即，下式结构1’(b)的化合物。命名“i”此外出现在
优选实施方案中，并且是指位于喹诺酮的氧原子而不是氮原子上的取代基。
Figure A20048000430501051
                       R11官能团的数字命名
  氢   甲基   氯
  1   2   3
                       R12官能团的数字命名
Figure A20048000430501052
                       R13官能团的数字命名
Figure A20048000430501061
[0218]制备的MIF抑制剂的数字命名在表1中给出。
                              表1.
Figure A20048000430501062
[0219]制备中间体或MIF抑制剂的反应路线的详情如下所述。
代表性化合物的合成
4-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物1)的制备
[0220]N2气氛下将丙二酸二乙酯的溶液(8.16g，51mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，2.24g，56mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。将该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后加热至90℃达30分钟。并且冷却至室温。缓慢加入N-甲基靛红酸酐(10g，56mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液且该混合物在120℃下加热过夜。随后该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到8.47g(67％)的白色固体。M.P.67℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.30(t，J＝7.0Hz，3H)，3.53(s，3H)，4.32(q，J＝7.0Hz，2H)，7.30(t，J＝7.5Hz，1H)，7.52(d，J＝8.5Hz，1H)，7.75(t，J＝8.4Hz，1H)，8.04(d，J＝7.8Hz，1H)，13.03(s，1H).EIMS m/z 248(M+1)，270(M+23).分析值(C13H13NO4)C，H，N.
4-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物2)的制备
[0221]将环己胺(2.0mL，18.20mmol)加入到化合物1(2.25g，9.1mmol)在甲苯(20mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。使所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤得到1.9g(70％)的白色固体.M.P.145℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.26(m，1H)，1.38(m，4H)，1.54(m，1H)，1.68(m，2H)，1.86(m，2H)，3.62(s，3H)，3.87(m，1H)，7.37(t，J＝7.5Hz，1H)，7.63(d，J＝8.5Hz，1H)，7.80(t，J＝8.4Hz，1H)，8.09(d，J＝7.8Hz，1H)，10.46(s，1H)，17.46(s，1H)，.EIMS m/z 301(M+1)，323(M+23).分析值(C17H20N2O3)C，H，N.
Figure A20048000430501081
4-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物3)的制备
[0222]化合物2(1.5g，5mmol)在20mL三氯氧磷中的溶液在90℃下加热2小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到903mg(82％)的白色固体.M.P.235℃.1H NMR(DMSO-d6)：3.66(s，3H)，7.50(t，J＝7.7Hz，1H)，7.74(d，J＝8.6Hz，1H)，7.91(t，J＝8.7Hz，1H)，8.08(d，J＝7.6Hz，1H).EIMS m/z 219(M+1)，241(M+23).分析值(C17H7ClN2O)C，H，N.
1-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物4)的制备
[0223]将哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(600mg，3.06mmol)加入到化合物3(319mg，1.46mmol)在甲苯中(40mL)中的溶液内并在120℃下加热过夜。真空下除去溶剂。残余物悬浮在水中，超声，并且过滤得到540mg(98％)的白色固体.M.P.247℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.58(s，3H)，3.63(m，4H)，3.92(m，4H)，7.16(t，J＝4.8Hz，1H)，7.33(t，J＝7.5Hz，1H)，7.48(d，J＝3.5Hz，1H)，7.59(d，J＝8.5Hz，1H)，7.75(t，J＝7.25，2H)，7.79(d，J＝4.8Hz，1H)7.92(d，J＝7.5Hz，1H).EIMS m/z 379(M+1)，401(M+23).分析值(C20H18N4O2S)C，H，N.
1-(4-氟苄基)-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物5)的制备
[0224]将靛红酸酐(20g，122mmol)在二甲基甲酰胺中(DMF)的溶液加入到NaH(60％在矿物油中，5.39g，135mmol)在DMF中的混悬液内并且室温下搅拌1小时。此后，加入4-氟苄基溴(16.8mL，135mmol)并且该混合物在室温下搅拌4小时。将该溶液倾入水中并且过滤生成的固体，用水相洗涤数次并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到30g(90％)的白色固体.M.P.167℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.27(s，2H)，7.17(t，J＝8.8Hz，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，7.31(t，J＝7.4Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.74(t，J＝7.0Hz，1H)，8.02(d，J＝7.8Hz，1H).分析值(C15H10FNO3)C，H，N.
1-(4-氟苄基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物6)的制备
[0225]N2气氛下将丙二酸二乙酯(8.0g，51mmol)的溶液缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，2.21g，55mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。使该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后加热至90℃达30分钟。并且冷却至室温。化合物5(15g，53mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液缓慢加入到该混合物，将其在120℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，并用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到13.37g(78％)的白色固体.M.P.116-120℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，4.36(q，J＝7.0Hz，2H)，5.43(s，2H)，7.13(m，2H)，7.23-7.30(m，3H)，7.37(d，J＝8.5Hz，1H)，7.63(t，J＝7.0Hz，1H)，8.08(d，J＝7.6Hz，1H)，13.20(s，1H).EIMS m/z 342(M+1)，364(M+23).分析值(C19H16FNO4)C，H，N.
Figure A20048000430501101
1-(4-氟苄基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物7)的制备
[0226]将环己胺(0.67mL，5.85mmol)加入到化合物6(1.0g，2.92mmol)在甲苯(20mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。将所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到1.0g(87％)的白色固体.M.P.168℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.26(m，1H)，1.36(m，4H)，1.55(m，1H)，1.68(m，2H)，1.89(m，2H)，3.88(m，1H)，5.51(s，2H)，7.13(m，2H)，7.25(m，2H)，7.33(t，J＝7.5Hz，1H)，7.45(d，J＝8.5Hz，1H)，7.70(t，J＝8.4Hz，1H)，8.12(d，J＝7.9Hz，1H)，10.35(s，1H)，17.66(s，1H)，.EIMS m/z 395(M+1)，417(M+23).分析值(C23H23FN2O3)C，H，N.
4-氯-1-(4-氟苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物8)的制备
[0227]化合物7(0.7g，1.77mmol)在20mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热2小时。减压下蒸发溶剂。使残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到420mg(76％)的白色固体.M.P.231℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ5.54(s，2H)，7.13(m，2H)，7.34(m，2H)，7.46(t，J＝7.5Hz，1H)，7.55(d，J＝8.5Hz，1H)，7.80(t，J＝8.4Hz，1H)，8.12(d，J＝7.9Hz，1H).EIMS m/z 335(M+23).分析值(C17H10ClFN2O)C，H，N.
1-(4-氟苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物9)的制备
[0228]将哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(234mg，1.19mmol)加入到化合物8(170mg，0.54mmol)在甲苯中(40mL)中的溶液内并在120℃下加热过夜。真空下除去溶剂。残余物悬浮在冰水中，超声，并且过滤得到247mg(97％)的白色固体.M.P.258℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.69(m，4H)，3.94(m，4H)，5.47(s，2H)，7.16(m，3H)，7.28(m，3H)，7.43(d，J＝8.5Hz，1H)，7.50(d，J＝3.3Hz，1H)，7.64(t，J＝7.25，2H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H)7.95(d，J＝7.5Hz，1H).EIMS m/z 473(M+1)，495(M+23).分析值(C26H21FN4O2S)C，H，N.
Figure A20048000430501111
2-氨基-5-甲基苯甲酸(化合物10)的制备
[0229]向5-甲基-2-硝基苯甲酸(20g，110mmol)在乙醇中的溶液加入10％Pd/C(1g)。该混合物在室温和氢气氛下搅拌过夜。该溶液经硅藻土(celite)过滤并在减压下蒸发得到16g(96％)的白色固体.M.P.162℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.13(s，3H)，6.65(d，J＝8.6Hz，1H)，7.06(dd，J＝8.6，1.8Hz，1H)，7.48(d，J＝1.1，1H).EIMS m/z 174(M+1)，152(M+23).
Figure A20048000430501112
6-甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物11)的制备
[0230]室温下将氯甲酸三氯甲酯(36.27mL，300mmol)加入到化合物10(41.3g，273mmol)在干燥二噁烷中的搅拌溶液内并该溶液回流4小时。冰浴中冷却该溶液并过滤生成的固体。该固体用醚洗涤并且真空室温下干燥得到45.5g(94％)的白色固体.M.P.257℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，7.06(d，J＝8.6Hz，1H)，7.56(dd，J＝8.6，1.8Hz，1H)，7.71(d，J＝1.1，1H)，11.63(s，1H).EIMS(neg.mode)m/z 176(M-1)，152(M+23).分析值(C9H7NO3)C，H，N.
1-苄基-6-甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物12)的制备
[0231]将化合物11(25g，141mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，6.21g，155mmol)在DMF中的溶液内并且室温下进一步搅拌1小时。随后，加入纯净苄基溴(19.53mL，155mmol)并且该溶液在室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水，并且过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到36.5g(97％)的白色固体。M.P.150℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，5.27(s，2H)，7.15(d，J＝8.7Hz，1H)，7.26-7.39(m，5H)，7.54(dd，J＝1.5，8.7Hz，1H)，7.83(d，J＝1.5Hz，1H).分析值(C16H13NO3)C，H，N.
1-(4-氟苄基-6-甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物13)的制备
[0232]将化合物11(5g，28mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，1.24g，31mmol)在DMF中的混悬液内并且在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入纯净4-氟苄基溴(3.81mL，31mmol)，和将该溶液在室温下进一步搅拌3小时。把该溶液倾入冰水且过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。将该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到6.3g(79％)的白色固体。M.P.153℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，5.24(s，2H)，7.14-7.17(m，3H)，7.44(m，2H)，7.54(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，7.83(d，J＝1.2Hz，1H).分析值(C16H12FNO3)C，H，N.
1，6-二甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物14)的制备
[0233]将化合物11(5g，28mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，1.24g，31mmol)在DMF中的混悬液内并且在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入碘甲烷(1.92mL，31mmol)并且在室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到4.9g(74％)的白色固体。M.P.153℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，3.52(s，3H)，7.38(d，J＝8.6Hz，1H)，7.54(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，7.83(d，J＝1.2Hz，1H).
1-苄基-4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物15)的制备
[0234]N2气氛下将纯丙二酸二乙酯(19.07mL，125mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，5.52g，138mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。将该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后加热至90℃达30分钟并且冷却至室温。缓慢加入化合物12(36.8g，138mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且该混合物在110℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化.过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到41g(97％)的白色固体.M.P.113℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝7.5Hz，3H)，2.33(s，3H)，4.35(q，J＝7.5Hz，2H)，5.43(s，2H)，7.15-7.30(m，6H)，7.43(dd，J＝1.6，8.7Hz，1H)，7.85(d，J＝1.5Hz，1H).EIMS m/z 338(M+1)，360(M+23).分析值(C20H19NO4)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物16)的制备
[0235]N2气氛下将纯丙二酸二乙酯(3.04mL，20mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，0.88g，22mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。将该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后将该混合物在90℃下加热30分钟并且冷却至室温。缓慢加入化合物13(6.3g，22mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且该混合物在110℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到5.1g(71％)的白色固体。M.P.130℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，2.34(s，3H)，4.37(q，J＝7.5Hz，2H)，5.94(s，2H)，7.09-7.32(m，5H)，7.45(dd，J＝1.6，8.7Hz，1H)，7.86(d，J＝1.5Hz，1H).EIMS m/z 356(M+1)，378(M+23).分析值(C20H18FNO4)C，H，N.
4-羟基-1，6-二甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物17)的制备
[0236]N2气氛下将纯丙二酸二乙酯(2.28g，14.26mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，628mg，15.69mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟。并且冷却至室温。缓慢加入化合物14(10g，56mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且该混合物在120℃下加热过夜。该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到3.26g(87％)的白色固体。M.P.132℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.30(t，J＝6.9Hz，3H)，2.50(s，3H)，3.50(s，3H)，4.33(q，J＝6.9Hz，2H)，7.41(d，J＝8.6Hz，1H)，7.56(dd，J＝1.7，8.5Hz，1H)，7.82(d，J＝1.7Hz，1H)，13.03(s，1H).EIMS m/z 262(M+1)，284(M+23).
1-苄基-4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物18)的制备
[0237]将环己胺(3.41mL，29.64mmol)加入到化合物15(5.0g，14.82mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到5.5g(95％)的白色固体。M.P.87℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.22(m，1H)，1.36(m，4H)，1.56(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，2.36(s，3H)，3.87(m，1H)，5.51(s，2H)，7.14-7.33(m，6H)，7.47(d，J＝8.6Hz，1H)，7.90(s，1H)，10.44(s，1H).EIMS m/z 391(M+1).
1-(4-氟苄基)-4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物19)的制备
[0238]将环己胺(3.22mL，28.14mmol)加入到化合物16(5.0g，14.07mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到5.3g(93％)的黄色固体。M.P.156℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.24(m，1H)，1.37(m，4H)，1.57(m，1H)，1.68(m，2H)，1.88(m，2H)，2.36(s，3H)，3.87(m，1H)，5.49(s，2H)，7.11(m，2H)，7.22(m，2H)，7.36(d，J＝8.7Hz，1H)，7.51(dd，J＝1.6，8.7Hz，1H)，7.90(d，J＝1.6Hz，1H)，10.39(s，1H).EIMS m/z409(M+1)，431(M+23).
4-羟基-1，6-二甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物20)的制备
[0239]将环己胺(2.85mL，24.95mmol)加入到化合物17(3.26g，12.47mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤.粗产物用醚重结晶得到3.8g(97％)的白色固体.M.P.218℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.28(m，1H)，1.36(m，4H)，1.55(m，1H)，1.68(m，2H)，1.87(m，2H)，2.40(s，3H)，3.59(s，3H)，3.87(m，1H)，7.51(d，J＝8.7Hz，1H)，7.61(d，J＝8.7Hz，1H)，7.86(s，1H)，10.49(s，1H).EIMS m/z 315(M+1)，337(M+23).
Figure A20048000430501151
1-苄基-4-氯-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物21)的制备
[0240]化合物18(5g，12.80mmol)在30mL纯三氯氧磷中的溶液在100℃下加热3小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到1.51g(38％)的黄色固体。M.P.219℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.40(s，3H)，5.54(s，2H)，7.23-7.26(m，3H)，7.29-7.32(m，2H)，7.45(d，J＝8.8Hz，1H)，7.61(dd，J＝1.5，8.8Hz，1H)，7.89(d，J＝1.5Hz，1H).EIMS m/z 309(M+1)，331(M+23).
4-氯-1-(4-氟苄基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物22)的制备
[0241]化合物19(5g，12.24mmol)在30mL纯三氯氧磷中的溶液在100℃下加热3小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到1.90g(47％)的黄色固体。M.P.206℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.40(s，3H)，5.52(s，2H)，7.12-7.15(m，2H)，7.30-7.33(m，2H)，7.46(d，J＝8.7Hz，1H)，7.64(dd，J＝1.2，8.7Hz，1H)，7.89(d，J＝1.2Hz，1H).EIMS m/z 327(M+1).
4-氯-1，6-二甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物23)的制备
[0242]化合物20(3g，9.5mmol)在30mL纯净三氯氧磷中的溶液在100℃下加热3小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到1.2g(54％)的黄色固体。M.P.241℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ2.44(s，3H)，3.64(s，3H)，7.62(d，J＝8.7Hz，1H)，7.73(dd，J＝1.5，8.7Hz，1H)，7.85(d，J＝1.5Hz，1H).EIMS m/z 255(M+1).
1-苄基-6-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物24)的制备
[0243]哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(490mg，2.5mmol)加入到化合物20(309mg，1mmol)在甲苯(20mL)中的溶液内并在110℃下加热过夜。真空下除去溶剂。残余物悬浮在水中，超声，并且过滤。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-2％甲醇的二氯甲烷梯度液洗脱得到362mg(77％)的白色固体.M.P.183℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.36(s，3H)，3.69(m，4H)，3.94(m，4H)，5.47(s，2H)，7.16-7.20(m，4H)，7.23-7.33(m，3H)，7.44(d，J＝8.8Hz，1H)，7.50(d，J＝3.8Hz，1H)，7.70(s，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z491(M+23).分析值(C27H24N4O2S)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物25)的制备
[0244]哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(490mg，2.5mmol)加入到化合物21(327mg，1mmol)在甲苯(20mL)中的溶液内并在110℃下加热过夜。真空下除去溶剂。残余物悬浮在水中，超声，并且过滤。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-2％甲醇的二氯甲烷梯度液洗脱得到210mg(43％)的白色固体.M.P.274℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.37(s，3H)，3.68(m，4H)，3.94(m，4H)，5.45(s，2H)，7.12-7.18(m，3H)，7.24-7.27(m，2H)，7.33(d，J＝8.6Hz，1H)，7.45(d，J＝8.8Hz，1H)，7.50(d，J＝3.5Hz，1H)，7.70(s，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z 509(M+23).分析值(C27H23FN4O2S)C，H，N.
Figure A20048000430501171
1-苄基-6-甲基-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物26)的制备
[0245]室温下将化合物21(1.2g，3.9mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(1.67g，19.4mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液中。该溶液在室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中并用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到1.34g(96％)的黄色固体.M.P.152℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.34(s，3H)，2.94(m，4H)，3.54(m，4H)，5.44(s，2H)，7.16-7.20(m，2H)，7.22(d，J＝7.6Hz，1H)，7.28-7.31(m，3H)，7.40(d，J＝8.8Hz，1H)，7.64(s，1H).EIMSm/z 359(M+1).
1-(4-氟-苄基)-6-甲基-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物27)的制备
[0246]室温下将化合物22(1.6g，4.9mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(2.2g，24.5mmol)在CH2Cl2中的搅拌溶液内并继续搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中和用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到1.30g(72％)的黄色固体.M.P.121℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.35(s，3H)，2.96(m，4H)，3.54(m，4H)，5.42(s，2H)，7.11-7.17(m，2H)，7.23-7.26(m，2H)，7.44(dd，J＝1.2，8.6Hz，1H)，7.64(s，1H).EIMS m/z 377(M+1).
1，6-二甲基-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物28)的制备
[0247]室温下将化合物23(1g，4.3mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(1.1g，12.9mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。该溶液室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中和用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到1.07g(88％)黄色固体。M.P.274℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.39(s，3H)，2.94(m，4H)，3.48(m，4H)，3.54(s，3H)，7.45(d，J＝8.6Hz，1H)，7.56(dd，J＝1.3，8.6Hz，1H)，7.64(s，1H).EIMS m/z 283(M+1).
1-苄基-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物29)的制备
[0248]氩气和0℃下将2-糠酰氯(118μL，1.2mmol)加入到化合物26(287mg，0.8mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升到室温室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥并用己烷和醚重结晶得到340mg(90％)的白色固体.M.P.146℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.36(s，3H)，3.69(m，4H)，3.97(m，4H)，5.47(s，2H)，6.66(t，J＝2.5Hz，1H)，7.09(d，J＝3.4Hz，1H)，7.18(d，J＝7.3Hz，2H)，7.23(d，J＝7.4Hz，1H)，7.29-7.33(m，3H)，7.44(d，J＝1.3，8.7Hz，1H)，7.71(s，1H)，7.89(s，1H).EIMS m/z 475(M+23).分析值(C27H24N4O3)C，H，N.
1-(4-氟苄基)-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物30)的制备
[0249]氩气和0℃下将2-糠酰氯(118μL，1.2mmol)加入到化合物27(300mg，0.8mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用己烷和醚重结晶得到320mg(85％)的白色固体。M.P.276℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ2.37(s，3H)，3.69(m，4H)，3.97(m，4H)，5.45(s，2H)，6.67(dd，J＝1.7，3.7Hz，1H)，7.09(d，J＝3.4Hz，1H)，7.12(m，2H)，7.26(m，2H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，7.45(d，J＝8.8Hz，1H)，7.71(s，1H)，7.89(s，1H).EIMS m/z 493(M+23).分析值(C27H23FN4O3)C，H，N.
4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，6-二甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物31)的制备
[0250]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物28(282mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到221mg(59％)的白色固体。M.P.231℃。1HNMR(DMSO-d6)：δ2.41(s，3H)，3.56(s，3H)，3.63(m，4H)，3.95(m，4H)，6.66(dd，J＝1.5，3.6Hz，1H)，7.08(d，J＝3.4Hz，1H)，7.48(d，J＝8.7Hz，1H)，7.59(dd，J＝1.2，8.8Hz，1H)，7.69(s，1H)，7.88(s，1H).EIMS m/z 399(M+23).分析值(C21H20N4O3)C，H，N.
1，6-二甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物32)的制备
[0251]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物28(282mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到277mg(70％)的白色固体。M.P.214℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ2.41(s，3H)，3.55(s，3H)，3.63(m，4H)，3.92(m，4H)，7.16(t，J＝4.1Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.56(d，J＝8.7Hz，1H)，7.68(s，1H)，7.80(d，J＝4.9Hz，1H).EIMS m/z 393(M+1)，415(M+23).分析值(C21H20N4O2S)C，H，N.
5-氟-2-硝基苯甲酸(化合物33)的制备
[0252]通过轻微加热至室温以上使3-氟苯甲酸(1g，7.13mmol)溶解在浓H2SO4(2ml)中。冷却该溶液至0℃。将发烟硝酸(539mg，8.56mmol)缓慢加入到该溶液同时保持温度低于0℃。将该溶液在0℃下搅拌3小时。将该溶液倾入冰水，过滤生成的固体，用冷水洗涤，并且干燥得到1.2g(92％)的白色固体.M.P.122℃.1H NMR(DMSO-d6)：7.60(dt，J＝2.9，8.5Hz，1H)，7.71(dd，J＝2.9，8.6Hz，1H)，8.13(dd，J＝4.8，8.8Hz，1H).EIMSm/z 186(M+1).
2-氨基-5-氟苯甲酸(化合物34)的制备
[0253]化合物33(10g，54mmol)在乙醇(100mL)中的溶液在氢气中、于10％Pd/C(0.5g)的存在和室温下搅拌4小时。该溶液经硅藻土过滤。减压下蒸发溶剂得到8.2g(98％)的白色固体.M.P.142℃.1H NMR(DMSO-d6)：6.71(dd，J＝4.9，8.9Hz，1H)，7.15(dt，J＝2.9，8.4Hz，1H)，7.37(dd，J＝2.9，9.8Hz，1H)，8.60(s，1H).EIMS m/z 156(M+1).
6-氟-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物35)的制备
[0254]室温下将氯甲酸三氯甲酯(7.01mL，58.13mmol)加入到化合物34(8.2g，52.85mmol)在干燥二噁烷中的搅拌溶液内并且将该溶液回流4小时。冰浴中冷却该溶液且过滤生成的固体。该固体用醚洗涤并且真空室温下干燥得到9.1g(96％)的白色固体.M.P.240℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ7.19(dd，J＝4.2，8.9Hz，1H)，7.63-7.71(m，1H)，11.77(s，1H).EIMS(neg.mode)m/z 180(M-1).分析值(C8H4FNO3)C，H，N.
Figure A20048000430501211
1-苄基-6-氟-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物36)的制备
[0255]将化合物35(3g，16.57mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，729mg，18.23mmol)在DMF中的混悬液内并在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入纯苄基溴(2,17mL，18.23mmol)且将该溶液在室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥.该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到1.88g(42％)的白色固体。M.P.95℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.29(s，2H)，7.26(m，2H)，7.35(m，5H)，7.40(m，2H)，7.64(dt，J＝2.9，8.4Hz，1H)，7.82(dd，J＝3.2，8.0Hz，1H).分析值(C16H13NO3)C，H，N.
6-氟-1-(4-氟苄基)-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物37)的制备
[0256]化合物35(3g，16.57mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，729mg，18.22mmol)在DMF中的混悬液内且在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入纯净4-氟苄基溴(2.28mL，18.23mmol)且该溶液室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到3.23g(67％)的白色固体.M.P.107℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.27(s，2H)，7.19(m，2H)，7.29(dd，J＝3.9，9.0Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.65(td，J＝5.5，9.0Hz，1H)，7.81(dd，J＝2.9，7.9Hz，1H).分析值(C15H9F2NO3)C，H，N.
6-氟-1-甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物38)的制备
[0257]化合物35(3g，16.57mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，0.729g，18.23mmol)在DMF中的混悬液内且在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入纯净碘甲烷(1.14mL，18.23mmol)且该溶液室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥.使该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到1.84g(57％)的白色固体.M.P.133℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.90(s，3H)，7.51(dd，J＝4.0，8.8Hz，1H)，7.77(m，12).分析值(C9H6FNO3)C，H，N.
1-苄基-6-氟-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物39)的制备
[0258]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(0.89mL，5.8mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，256mg，6.41mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟并且冷却至室温。把化合物36(1.74g，6.41mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液缓慢加入到该混合物，将其在110℃下加热过夜。该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到1.4g(64％)的白色固体.M.P.129℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.30(t，J＝6.9Hz，3H)，4.34(q，J＝6.9Hz，2H)，5.46(s，2H)，7.17-7.24(m，5H)，7.38(dd，J＝4.6，9.6Hz，1H)，7.50(td，J＝2.9，8.3Hz，1H)，7.80(dd，J＝3.1，9.4Hz，1H).EIMS m/z 342(M+1)，364(M+23).分析值(C19H16FNO4)C，H，N.
6-氟-1-(氟-苄基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物40)的制备
[0259]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(1.2mL，8.0mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，352mg，8.8mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟并且冷却至室温。缓慢加入化合物37(2.5g，8.8mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并在110℃下加热过夜。该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到2.5g(87％)的白色固体。M.P.123℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，4.37(q，J＝7.5Hz，2H)，5.43(s，2H)，7.19(m，2H)，7.29(dd，J＝3.9，9.0Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.65(td，J＝5.5，9.0Hz，1H)，7.81(dd，J＝2.9，7.9Hz，1H).EIMS m/z 360(M+1)，382(M+23).分析值(C19H15F2NO4)C，H，N.
6-氟-4-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物41)的制备
[0260]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(1.27g，8.4mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，372mg，9.3mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟。并且冷却至室温。缓慢加入化合物38(1.8g，9.3mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且该混合物在120℃下加热过夜。该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到1.3g(53％)的白色固体。M.P.131℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.30(t，J＝6.9Hz，3H)，3.54(s，3H)，4.31(q，J＝6.9Hz，2H)，7.56(dd，J＝4.6，9.3Hz，1H)，7.64(dd，J＝2.9，9.1Hz，1H)，7.76(dd，J＝2.9，9.3Hz，1H)，12.80(s，1H).EIMS m/z 266(M+1)，288(M+23).
1-苄基-6-氟-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物42)的制备
[0261]将环己胺(2.95mL，25.78mmol)加入到化合物39(4.4g，12.89mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流3小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到4.0g(78％)的白色固体。M.P.130-134℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.37(m，5H)，1.56(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，3.87(m，1H)，5.29(s，2H)，7.17(m，2H)，7.23(m，1H)，7.33(m，1H)，7.46(dd，J＝3.9，9.1Hz，1H)，7.57(td，J＝2.9，8.3Hz，1H)，7.81(dd，J＝2.9，8.8Hz，1H).EIMS m/z 394(M+1).
6-氟-1-(4-氟苄基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物43)的制备
[0262]将环己胺(3.25mL，28.38mmol)加入到化合物40(5.1g，14.19mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到5.0g(86％)的白色固体。M.P.118℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.18(m，2H)，1.35(m，3H)，1.57(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，3.86(m，1H)，5.48(s，2H)，7.13(m，2H)，7.24(m，2H)，7.35(dd，J＝3.9，9.0Hz，1H)，7.53(td，J＝5.5，9.0Hz，1H)，7.80(dd，J＝2.9，7.9Hz，1H).EIMS m/z 413(M+1).
6-氟-4-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物44)的制备
[0263]环己胺(1.98mL，17.34mmol)加入到化合物41(2.3g，8.67mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到2.38g(97％)的白色固体。M.P.193℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.28(m，1H)，1.36(m，4H)，1.55(m，1H)，1.68(m，2H)，1.87(m，2H)，3.62(s，3H)，3.90(m，1H)，7.70(m，3H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)，10.41(s，1H).EIMS m/z 341(M+23).
1-苄基-4-氯-6-氟-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物45)的制备
[0264]化合物42(3.5g，8.86mmol)在30mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到1.29g(47％)的黄色固体。M.P.228℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.29(s，2H)，7.27(m，4H)，7.32(m，2H)，7.58(dd，J＝4.3，9.3Hz，1H)，7.71(td，J＝2.4，8.0Hz，1H)，7.91(dd，J＝2.9，8.9Hz，1H)..EIMS m/z 335(M+23).
Figure A20048000430501241
4-氯-6-氟-1-(4-氟苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物46)的制备
[0265]化合物43(5.1g，12.36mmol)在20mL纯净三氯氧磷中的溶液在100℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。使残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到2.05g(50％)的黄色固体。M.P.236℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.54(s，2H)，7.14(m，2H)，7.33(m，2H)，7.59(dd，J＝4.0，9.1Hz，1H)，7.72(td，J＝2.8，7.9Hz，1H)，7.91(dd，J＝2.8，8.9Hz，1H).EIMSm/z 331(M+1).
4-氯-6-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物47)的制备
[0266]化合物44(2g，6.28mmol)在20mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。使残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到0.80g(56％)的黄色固体。M.P.258℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.67(s，3H)，7.78-7.89(m，3H).EIMS m/z 259(M+23).
1-苄基-6-氟-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物48)的制备
[0267]室温下将化合物45(1.0g，3.2mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(826mg g，9.59mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。将该溶液室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中短时超声并且过滤。把该固体溶解在乙酸乙酯中并用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到1.1g(96％)黄色固体。M.P.162℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.70(s，1H)，2.94(m，4H)，3.53(m，4H)，5.47(s，2H)，7.19-7.25(m，3H)，7.42(m，2H)，7.51(dd，J＝4.3，9.3Hz，1H)，7.54(td，J＝2.4，8.0Hz，1H)，7.58(dd，J＝2.9，8.9Hz，1H)..EIMS m/z 363(M+1).
6-氟-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物49)的制备
[0268]室温下将化合物46(2.0g，6.04mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(1.56g，18.21mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。该溶液室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中和用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到2.18g(95％)黄色固体。M.P.240℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.84(s，1H)，2.94(m，4H)，3.54(m，4H)，5.45(s，2H)，7.15(m，2H)，7.27(m，2H)，7.44(dd，J＝4.4，9.3Hz，1H)，7.53(td，J＝2.4，8.0Hz，1H)，7.58(dd，J＝2.9，8.9Hz，1H).EIMS m/z 381(M+1).
6-氟-1-甲基-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物50)的制备
[0269]室温下将化合物47(750mg，3.17mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(819mg，9.50mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。该溶液室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中和用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到780mg(86％)的黄色固体.M.P.211℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.91(m，4H)，3.47(m，4H)，3.56(s，3H)，7.54(m，1H)，7.63(m，2H).EIMS m/z 287(M+1).
1-苄基-6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物51)的制备
[0270]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物48(363mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到332mg(73％)的白色固体。M.P.209℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.69(m，4H)，3.97(m，4H)，5.49(s，2H)，6.66(m，1H)，7.09(d，J＝3.3Hz，1H)，7.22(m，3H)，7.32(m，2H)，7.45(dd，J＝4.7，9.5Hz，1H)，7.55(m，1H)，7.69(dd，J＝2.8，9.7Hz，1H)，7.88(s，1H).EIMS m/z479(M+23).分析值(C26H21FN4O3)C，H，N.
6-氟-1-(4-氟-苄基)-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物52)的制备
[0271]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物49(380mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并且用乙酸乙酯重结晶得到282mg(85％)的白色固体.M.P.248℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.68(m，4H)，3.96(m，4H)，5.47(s，2H)，6.66(dd，J＝1.6，3.6Hz，1H)，7.08(d，J＝3.4Hz，1H)，7.15(m，2H)，7.28(m，2H)，7.47(dd，J＝4.7，9.6Hz，1H)，7.55(m，1H)，7.69(dd，J＝2.8，9.7Hz，1H)，7.88(s，1H).EIMS m/z 497(M+23).分析值(C26H20F2N4O3)C，H，N.
6-氟-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物53)的制备
[0272]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物50(286mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到333mg(87％)的白色固体。M.P.263℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.58(s，3H)，3.62(m，4H)，3.95(m，4H)，6.66(d，J＝3.6Hz，1H)，7.08(d，J＝3.4Hz，1H)，7.65(m，3H)，7.88(s，1H).EIMS m/z 403(M+23).分析值(C20H17FN4O3)C，H，N.
1-苄基-6-氟-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物54)的制备
[0273]氩气和0℃下2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物48(362mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到359mg(76％)的白色固体。M.P.246℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.67(m，4H)，3.94(m，4H)，5.49(s，2H)，7.16(m，1H)，7.20-7.26(m，3H)，7.45(dd，J＝4.6，9.4Hz，1H)，7.50(d，J＝3.9Hz，1H)，7.55(td，J＝2.7，9.2Hz，1H)，7.66(dd，J＝2.8，9.7Hz，1H)，7.80(d，J＝5.1Hz，1H).EIMS m/z 473(M+1).分析值(C26H21FN4O2S)C，H，N.
6-氟-1-(氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物55)的制备
[0274]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物49(380mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到294mg(60％)的白色固体.M.P.211℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.67(m，4H)，3.94(m，4H)，5.47(s，2H)，7.15(m，3H)，7.27(m，2H)，7.46(m，2H)，7.54(td，J＝2.6，9.2Hz，1H)，7.67(dd，J＝2.8，9.7Hz，1H)，7.80(d，J＝5.1Hz，1H).EIMS m/z 491(M+1).分析值(C26H20F2N4O2S)C，H，N.
6-氟-1-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物56)的制备
[0275]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物50(286mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到390mg(98％)的白色固体。M.P.286℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.58(s，3H)，3.62(m，4H)，3.92(m，4H)，7.16(dd，J＝3.5，5.0，1H)，7.50(d，J＝3.2Hz，1H)，7.63-7.68(m，3H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z 397(M+1).分析值(C20H17FN4O2S)C，H，N.
2-氨基-5-氯苯甲酸(化合物57)的制备
[0276]向5-氯-2-硝基苯甲酸(20g，110mmol)在乙醇中的溶液内加入新活化的阮内镍(2g)。氢气氛下该混合物在室温下搅拌过夜。该溶液经硅藻土过滤并在减压下蒸发得到16g(96％)的白色固体.1H NMR(DMSO-d6)：δ6.77(d，J＝8.9Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.9，8.9Hz，1H)，7.62(d，J＝2.9Hz，1H)，8.7(b，3H)；EIMS：170(M-H).
Figure A20048000430501291
6-氯-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物58)的制备
[0277]室温下将氯甲酸三氯甲酯(4.8mL，300mmol)加入到化合物57(6.84g，40mmol)在干燥二噁烷中的搅拌溶液内且该溶液回流4小时。冰浴中冷却该溶液和过滤生成的固体。该固体用醚洗涤并且真空室温下干燥得到7.3g(92％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ7.47(d，J＝8.6Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.6，1.8Hz，1H)，7.82(d，J＝1.1，1H)，11.63(s，1H)。
1-苄基-6-氯-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物59)的制备
[0278]将化合物58(4.9g，25mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，1.2g，30mmol)在DMF中的混悬液内且在室温下进一步搅拌1小时。随后，加入纯净苄基溴(3.78mL，30mmol)且该溶液室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到6.5g(90％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ5.45(s，2H)，7.17(d，J＝8.7Hz，1H)，7.26-7.39(m，5H)，7.65(dd，J＝1.5，8.7Hz，1H)，8.02(d，J＝1.5Hz，1H).
6-氯-1-(4-氟苄基)-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物60)的制备
[0279]将化合物58(5g，25mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，1.24g，31mmol)在DMF中的混悬液内且在室温下进一步搅拌1小时。随后，加入纯净4-氟苄基溴(3.81mL，31mmol)且该溶液室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥。该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到7.3g(96％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ5.45(s，2H)，7.14-7.17(m，3H)，7.44(m，2H)，7.64(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，7.80(d，J＝1.2Hz，1H).
1，6-二甲基-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(化合物61)的制备
[0280]将化合物58(5g，25mmol)在DMF中的溶液缓慢加入到NaH(60％在矿物油中，1.24g，31mmol)在DMF中的混悬液内，并且将该溶液在室温下进一步搅拌1小时。此后，加入碘甲烷(1.92mL，31mmol)且该溶液在室温下进一步搅拌3小时。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且干燥.该固体悬浮在己烷中，短时超声，过滤，并用己烷洗涤得到4.6g(75％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ3.52(s，3H)，7.54(d，J＝8.2Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，7.80(d，J＝1.2Hz，1H)。
1-苄基-6-氯-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物62)的制备
[0281]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(19.07mL，125mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，5.52g，138mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟，随后冷却至室温。缓慢加入化合物59(39.88g，138mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且该混合物在110℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到38g(86％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝7.2Hz，3H)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H)，5.45(s，2H)，7.17(d，J＝7.2Hz，2H)，7.2(m，2H)，7.31(t，J＝6.8Hz，1H)，7.37(d，J＝9.2Hz，1H)，7.65(dd，J＝2.8，9.2Hz，1H)，8.02(d，J＝2.4Hz，1H)，12.90(b，1H)；EIMS：358(M+H).
6-氯-1-(4-氟-苄基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物63)的制备
[0282]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(3.04mL，20mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，0.88g，22mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟并且冷却至室温。缓慢加入化合物60(6.7g，22mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液且该混合物在110℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体，用水洗涤数次，并且在室温和真空下干燥得到6.4g(85％)的白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝6.8Hz，3H)，4.34(q，J＝6.8Hz，2H)，5.43(s，2H)，7.1(m，2H)，7.2(m，2H)，7.40(d，J＝9.2，1H)，7.66(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，8.02(d，J＝2.8Hz，1H)，13.00(b，1H)；EIMS：376(M+H).
6-氯-4-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物64)的制备
[0283]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(2.28g，14.26mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，628mg，15.69mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟。随后冷却至室温。缓慢加入化合物61(12g，56mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液且该混合物在120℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到3.96g(97％)的白色固体.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.29(t，J＝6.9Hz，3H)，3.52(s，3H)，4.30(q，J＝6.9Hz，2H)，7.54(d，J＝9.1Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.6，8.9Hz，1H)，8.0(m，1H)，12.80(b，1H)；EIMS：282(M+H).
1-苄基-6-氯-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物65)的制备
[0284]将环己胺(1.27mL，11.17mmol)加入到化合物62(2.0g，5.6mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。将所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到2.23g(96％)的白色固体。M.P.158℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.22(m，2H)，1.35(m，3H)，1.56(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，3.87(m，1H)，5.51(s，2H)，7.16(m，2H)，7.24(m，1H)，7.32(m，2H)，7.42(d，J＝9.0Hz，1H)，7.70(d，J＝9.0Hz，1H)，7.80(d，J＝2.1Hz，1H)，10.36(s，1H).EIMS m/z411(M+1).
6-氯-1-(4-氟苄基)-4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物66)的制备
[0285]将环己胺(1.83mL，16mmol)加入到化合物63(3.0g，8mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。将所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到3.1g(90％)的白色固体。M.P.157℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.21(m，2H)，1.35(m，3H)，1.55(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，2.36(s，3H)，3.87(m，1H)，5.49(s，2H)，7.13(m，2H)，7.23(m，2H)，7.44(d，J＝9.3Hz，1H)，7.70(dd，J＝2.6，9.4Hz，1H)，7.80(d，J＝2.8Hz，1H)，10.33(s，1H).
4-氯-6-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物67)的制备
[0286]将环己胺(1.62mL，14.2mmol)加入到化合物64(2.0g，7.1mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。将所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到2.27g(67％)的白色固体。M.P.186℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.28(m，1H)，1.38(m，4H)，1.54(m，1H)，1.69(m，2H)，1.87(m，2H)，3.60(s，3H)，3.87(m，1H)，7.66(d，J＝9.0Hz，1H)，7.83(d，J＝9.0Hz，1H)，7.98(s，1H)，10.39(s，1H).EIMS m/z 335(M+1).
1-苄基-4，6-二氯-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物68)的制备
[0287]将化合物65(2g，4.86mmol)在20mL纯净三氯氧磷中溶液在90℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到810mg(51％)的黄色固体。M.P.243℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.55(s，2H)，7.25(m，3H)，7.32(m，2H)，7.56(d，J＝9.0Hz，1H)，7.85(dd，J＝2.1，9.0Hz，1H)，7.89(d，J＝2.1Hz，1H).EIMS m/z 352(M+23).
4，6-二氯-1-(4-氟苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物69)的制备
[0288]将化合物66(3g，7mmol)在30mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到1.2g(50％)的黄色固体。M.P.252℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ5.53(s，2H)，7.15(m，2H)，7.33(m，2H)，7.56(d，J＝9.0Hz，1H)，7.86(dd，J＝2.1，9.0Hz，1H)，8.08(d，J＝2.1Hz，1H).
4，6-二氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物70)的制备
[0289]将化合物67(2.2g，6.57mmol)在20mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热5小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在冰水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到0.8g(48％)的黄色固体。M.P.256℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.65(s，3H)，7.60(d，J＝9.0Hz，1H)，7.94(dd，J＝2.1，9.0Hz，1H)，8.06(d，J＝2.1Hz，1H).EIMS m/z 254(M+1).
Figure A20048000430501332
1-苄基-6-氯-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物71)的制备
[0290]室温下将化合物68(0.8g，2.43mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(628mg g，7.29mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。该溶液在室温下搅拌过夜。随后减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中且用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到0.9g(98％)的黄色固体.M.P.156℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.94(m，4H)，3.55(m，4H)，5.47(s，2H)，7.19(m，2H)，7.24(m，1H)，7.31(m，2H)，7.39(d，J＝8.9Hz，1H)，7.64(dd，J＝2.6，8.9Hz，1H)，7.81(d，J＝2.6Hz，1H).EIMS m/z 379(M+1).
6-氯-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物72)的制备
[0291]室温下将化合物69(1.2g，3.48mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(0.9g，10.45mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。将该溶液在室温下搅拌过夜。随后减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中并用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到1.36(98％)的黄色固体。M.P.189℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.94(m，4H)，3.54(m，4H)，5.43(s，2H)，7.14(m，2H)，7.26(m，2H)，7.43(d，J＝9.0Hz，1H)，7.67(dd，J＝2.5，9.0Hz，1H)，7.81(d，J＝2.5Hz，1H).EIMSm/z 397(M+1).
6-氯-1-甲基-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物73)的制备
[0292]室温下将化合物70(0.8g，3.16mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(819mg，9.50mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。将该溶液室温下搅拌过夜。随后减压下除去溶剂。将残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。把固体溶解在乙酸乙酯中且用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到950mg(99％)的黄色固体。M.P.223℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.92(m，4H)，3.48(m，4H)，3.55(s，3H)，7.60(d，J＝8.8Hz，1H)，7.77(m，2H).EIMS m/z 303(M+1).
1-苄基-6-氯-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物74)的制备
[0293]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物71(379mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到361mg(76％)的白色固体。M.P.221℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.70(m，4H)，3.97(m，4H)，5.48(s，2H)，6.67(dd，J＝2.0，3.6Hz，1H)，7.10(d，J＝3.6Hz，1H)，7.20(m，2H)，7.25(m，1H)，7.27(m，2H)，7.42(d，J＝9.2Hz，1H)，7.70(dd，J＝2.4，9.2Hz)，7.90(s，1H).EIMS m/z496(M+23).分析值(C26H21ClN4O3)C，H，N.
6-氯-1-(4-氟-苄基)-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物75)的制备
[0294]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物72(397mg，1mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到212mg(43％)的白色固体。M.P.253℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.69(m，4H)，3.96(m，4H)，5.45(s，2H)，6.66(m，1H)，7.08(d，J＝3.6Hz，1H)，7.20(m，2H)，7.27(m，2H)，7.46(d，J＝9.0Hz，1H)，7.69(dd，J＝2.4，9.0Hz)，7.89(s，1H).EIMS m/z 514(M+23).分析值(C26H20ClFN4O3)C，H，N.
6-氯-4-[4-(呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物76)的制备
[0295]氩气和0℃下将2-糠酰氯(148μL，1.5mmol)加入到化合物73(303mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水并过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到271mg(68％)的白色固体。M.P.228℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ3.56(s，3H)，3.64(m，4H)，3.94(m，4H)，6.65(m，1H)，7.08(d，J＝3.4Hz，1H)，7.60(d，J＝9.0Hz，1H)，7.79(dd，J＝1.9，9.0Hz，1H)，7.86(m，2H).EIMS m/z 419(M+23).分析值(C20H17ClN4O3)C，H，N.
1-苄基-6-氯-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物77)的制备
[0296]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物71(379mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到398mg(82％)的白色固体。M.P.266℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ3.70(m，4H)，3.93(m，4H)，5.48(s，2H)，7.15(m，1H)，7.19-7.26(m，3H)，7.32(m，2H)，7.42(d，J＝8.9Hz，1H)，7.51(d，J＝4.0Hz，1H)，7.68(dd，J＝2.6，8.9Hz，1H)，7.80(d，J＝4.0Hz，1H)，7.88(s，1H).EIMS m/z 512(M+23).分析值(C26H21ClN4O2S)C，H，N.
6-氯-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物78)的制备
[0297]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物72(397mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到280mg(55％)的白色固体。M.P.253℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.70(m，4H)，3.93(m，4H)，5.46(s，2H)，7.13-7.17(m，3H)，7.27(m，2H)，7.44(d，J＝9.0Hz，1H)，7.51(d，J＝4.0Hz，1H)，7.68(dd，J＝2.6，9.0Hz，1H)，7.79(d，J＝4.0Hz，1H)，7.89(s，1H).EIMS m/z 508(M+1).分析值(C26H20FClN4O2S)C，H，N.
6-氯-1-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物79)的制备
[0298]氩气和0℃下将2-噻吩羰基氯(160μL，1.5mmol)加入到化合物73(303mg，1.0mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水和过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并用乙酸乙酯重结晶得到341mg(83％)的白色固体.M.P.262℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.57(s，3H)，3.64(m，4H)，3.91(m，4H)，7.16(m，1H)，7.50(d，J＝3.2Hz，1H)，7.62(d，J＝9.0Hz，1H)，7.79(m，2H)，7.86(s，1H).EIMS m/z 414(M+1).分析值(C20H17ClN4O2S)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-(哌嗪-1-基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物80)的制备
[0299]室温下将化合物8(15g，48mmol)在二氯甲烷中的溶液缓慢加入到哌嗪(12g，144mmol)在二氯甲烷中的搅拌溶液内。将该溶液室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂。使残余物溶于水中，短时超声，并且过滤。将该固体溶解在乙酸乙酯和用水洗涤。有机层用Na2SO4干燥并浓缩得到17.17g(98％)的黄色固体.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.8(m，2H)，3.0(m，2H)，3.6(m，2H)，3.7(m，2H)，5.45(s，2H)，7.1(m，2H)，7.3(m，3H)，7.4(m，1H)，7.6(m，1H)，7.90(t，J＝8.2Hz，1H)；EIMS：363(M+H).
Figure A20048000430501371
在哌嗪部分酰化
[0300]称作化合物81-102的化合物通过上述通用方法A或者通用方法B制备。通用方法A用于从市售相应酰氯化合物制备标题化合物，而通用方法B用于从市售酸制备标题化合物。
通用方法A
[0301]氩气和0℃下将相应的酰氯(1.25mmol)加入到化合物80(300mg，0.82mmol)在吡啶(5mL)中的搅拌溶液内。使该溶液回升至室温并继续搅拌过夜。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并且通过快速色谱纯化、用含有0-2％MeOH的CH2Cl2梯度液洗脱。
通用方法B
[0302]室温下依次将草酰氯(1.66mmol)和DMF(2滴)加入到相应酸(1.25mmol)在CH2Cl2中的搅拌溶液内，此后在氩气氛下继续搅拌2小时。室温和真空下除去溶剂得到干燥的相应酰氯。将在干燥吡啶中的化合物80(300mg，0.82mmol)的溶液在氩气氛下加入到残余物中并简短超声。氩气氛下将该溶液在室温下搅拌过夜。将该溶液倾入冰水且过滤生成的固体。固体用过量水洗涤，干燥，并且通过快速色谱纯化、用含0-2％MeOH的CH2Cl2梯度液洗脱。
4-(4-苯甲酰基-哌嗪-1-基)-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物81)的制备
[0303]本标题化合物利用通用方法A制备得到269mg(72％)的白色固体.M.P.242℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.66(m，4H)，3.92(m，4H)，5.46(s，2H)，7.14(m，3H)，7.28(m，3H)，7.42(d，J＝9.0Hz，1H)，7.48(m，5H)，7.63(m，1H)，7.94(dd，J＝1.5，9.0Hz，1H).EIMS m/z 467(M+1).分析值(C28H23FN4O2)C，H，N.
4-(4-环戊烷羰基-哌嗪-1-基)-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3- 腈(化合物82)的制备
[0304]该标题化合物通过通用方法A制备得到216mg(58％)的白色固体.M.P.233℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.56-1.75(m，8H)，3.07(m，1H)，3.56(m，4H)，3.80(m，4H)，5.46(s，2H)，7.14(m，2H)，7.28(m，3H)，7.42(d，J＝9.0Hz，1H)，7.64(m，1H)，7.94(dd，J＝1.5，9.0Hz，1H).EIMS m/z 459(M+1).分析值(C27H27FN4O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(2-噻吩-2-基-乙酰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物83)的制备
[0305]该标题化合物通过通用方法A制备得到72mg(18％)的白色固体.M.P.199℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.58(m，4H)，3.82(m，4H)，4.05(s，2H)，5.46(s，2H)，6.97(m，2H)，7.14(m，2H)，7.28(m，3H)，7.40(m，2H)，7.48(m，5H)，7.63(m，1H)，7.92(dd，J＝1.5，9.0Hz，1H).EIMS m/z 487.4(M+1).分析值(C27H23FN4O2S)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-4-[4-(异噁唑-5-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物84)的制备
[0306]该标题化合物通过通用方法A制备得到213mg(58％)的白色固体.M.P.253℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.70(m，4H)，3.84(m，4H)，5.47(s，2H)，7.03(d，J＝2.0Hz，1H)，7.13(m，2H)，7.27(m，3H)，7.45(d，J＝8.4Hz，1H).7.64(m，1H)，7.93(dd，J＝1.5，8.0Hz，1H)，8.79(d，J＝2.0Hz，1H).EIMS m/z 458(M+1).分析值(C25H20FN5O3)C，H，N.
4-[4-(4-氟苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物85)的制备
[0307]该标题化合物通过通用方法A制备得到341mg(88％)的白色固体.M.P.272℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.66(m，4H)，3.84(m，4H)，5.46(s，2H)，7.13(m，2H)，7.31(m，5H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.55(m，2H)，7.65(m，1H)，7.93(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H).EIMS m/z 485(M+1).分析值(C28H22F2N4O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(吡啶-4-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物86)的制备
[0308]该标题化合物通过通用方法A制备得到273mg(73％)的白色固体.M.P.274℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.60(m，4H)，3.86(m，4H)，5.46(s，2H)，7.12(m，2H)，7.28(m，3H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.61(m，1H)，7.90(d，J＝7.2Hz，1H)，8.71(dd，J＝1.2，4.4Hz，1H).EIMSm/z 468(M+1).分析值(C27H22FN5O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(哌啶-1-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物87)的制备
[0309]该标题化合物通过通用方法B制备得到243mg(62％)的白色固体.M.P.223℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.51(m，6H)，3.19(m，4H)，3.40(m，4H)，3.62(m，4H)，5.46(s，2H)，7.12(m，2H)，7.28(m，3H)，7.41(d，J＝8.8Hz，1H)，7.64(m，2H)，7.92(d，J＝8.0Hz，1H).EIMS m/z 474(M+1).分析值(C27H28FN5O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(吡咯烷-1-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物88)的制备
[0310]该标题化合物通过通用方法B制备得到252mg(67％)的白色固体.M.P.232℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.78(m，4H)，3.44(m，4H)，3.61(m，4H)，5.46(s，2H)，7.12(m，2H)，7.27(m，3H)，7.42(d，J＝8.8Hz，1H)，7.62(m，2H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H).EIMS m/z 459(M+1).分析值(C26H26FN5O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-磺酰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物89)
[0311]该标题化合物通过通用方法B制备得到332mg(79％)的黄色固体.M.P.226℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.25(m，4H)，3.73(m，4H)，5.44(s，2H)，7.13(m，2H)，7.26(m，3H)，7.41(d，J＝8.4Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.71(m，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，1H)，8.12(d，J＝4.5Hz，1H).EIMS m/z509(M+1).分析值(C25H21FN4O3S2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-4-[4-(呋喃-3-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物90)的制备
[0312]该标题化合物通过通用方法B制备得到183mg(48％)的白色固体.M.P.261℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.65(m，4H)，3.86(m，4H)，5.47(s，2H)，6.73(s，1H)，7.13(m，2H)，7.28(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(m，1H)，7.78(s，1H)，7.92(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，8.12(s，1H).EIMS m/z457(M+1).分析值(C26H21FN4O3)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-4-[4-(1-甲基-1-H-吡咯-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物91)的制备
[0313]该标题化合物通过通用方法B制备得到233mg(60％)的白色固体.M.P.236℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.66(m，4H)，3.92(m，4H)，5.47(s，2H)，6.06(dd，J＝2.4，3.6Hz，1H)，6.40(d，J＝4.0Hz，1H)，6.93(s，1H)，7.15(m，2H)，7.29(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.62(m，1H)，7.94(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H).EIMS m/z 470(M+1).分析值(C27H24FN5O2)C，H，N.
4-[4-(5-乙酰基-噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物92)的制备
[0314]该标题化合物通过通用方法B制备得到259mg(60％)的白色固体.M.P.269℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.70(m，4H)，3.90(m，4H)，5.47(s，2H)，7.12(m，2H)，7.29(m，3H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.53(d，J＝3.6Hz，1H)，7.64(m，1H)，7.94(m，2H).EIMS m/z 515(M+1).分析值(C28H23FN4O3S)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-3-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物93)的制备
[0315]该标题化合物通过通用方法B制备得到312mg(79％)的白色固体.M.P.251℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.66(m，4H)，3.82(m，4H)，5.46(s，2H)，7.12(m，2H)，7.28(m，3H)，7.48(d，J＝8.4Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.87(m，1H)，7.92(d，J＝8.4Hz，1H).EIMS m/z 473(M+1).分析值(C26H21FN4O2S)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(吡啶-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物94)的制备
[0316]该标题化合物通过通用方法B制备得到123mg(32％)的白色固体.M.P.231℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.63(m，2H)，3.72(m，4H)，3.96(m，2H)，5.47(s，2H)，6.73(s，1H)，7.14(m，2H)，7.28(m，3H)，7.42(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(m，1H)，7.68(m，2H)，7.96(m，2H)，8.64(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H).EIMS m/z 468(M+1).分析值(C27H22FN5O2)C，H，N.
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(吡嗪-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物95)的制备
[0317]该标题化合物通过通用方法B制备.MP：145-156℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.8(m，8H)，5.47(s，2H)，7.15(t，J＝8.8Hz，2H)，7.3(m，3H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(t，J＝7.8Hz，1H)，7.95(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，8.7(m，1H)，8.78(d，J＝2.4Hz，1H)，8.94(d，J＝1.6Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(喹啉-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物96)的制备
[0318]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：144-157℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，6H)，4.0(m，2H)，5.47(s，2H)，7.1(m，2H)，7.3(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(t，J＝7.2Hz，1H)，7.71(t，J＝7.6Hz，1H)，7.78(d，J＝8.4Hz，1H)，7.86(t，J＝7.6Hz，1H)，7.97(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，8.07(d，J＝9.2Hz，2H)，8.55(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：518(M+H).
1-(4-氟-苄基)-4-[4-(5-甲基-异噁唑-3-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物97)的制备
[0319]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：130-137℃；1H-NMR(DMSO-d6)：2.48(s，3H)，3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，5.47(s，2H)，6.53(s，1H)，7.15(t，J＝9.2Hz，2H)，7.3(m，3H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(t，J＝7.8Hz，1H)，7.94(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：472(M+H).
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(四氢-呋喃-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物98)的制备
[0320]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：123-135℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.8(m，2H)，2.1(m，2H)，3.6(m，4H)，3.8(m，6H)，4.7(m，1H)，5.47(s，2H)，7.15(d，J＝8.8Hz，2H)，7.3(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(t，J＝7.8Hz，1H)，7.93(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：461(M+H).
4-[4-(苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-羰基)-哌嗪-1-基]-1-(4-氟-苄基)-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物99)的制备
[0321]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：140-160℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，8H)，5.47(s，2H)，6.09(s，2H)，7.00(s，2H)，7.1(m，1H)，7.15(t，J＝7.8Hz，2H)，7.3(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(t，J＝7.8Hz，1H)，7.92(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)；EIMS：511(M+H).
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(4-三氟甲基-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物100)的制备
[0322]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：181-185℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，8H)，5.47(s，2H)，7.1(m，2H)，7.3(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.6(m，1H)，7.7(m，1H)，7.8(m，1H)，7.9(m，2H)，7.91(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：535(M+H).
1-(4-氟-苄基)-4-[4-(1H-咪唑-4-羰基)-哌嗪-1-基]-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物101)的制备
[0323]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：176-183℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.67(s，4H)，4.3(m，4H)，5.47(s，2H)，7.2(m，2H)，7.3(m，3H)，7.45(d，J＝8.4Hz，1H)，7.6(m，2H)，7.76(d，J＝1.2Hz，1H)，7.97(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)；EIMS：457(M+H).
1-(4-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(四氢-噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物102)的制备
[0324]该标题化合物通过通用方法B制备。MP：133-140℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.9(m，1H)，2.0(m，1H)，2.1(m，1H)，2.3(m，1H)，2.9(m，2H)，3.7(m，8H)，4.32(t，J＝5.6Hz，1H)，5.47(s，2H)，7.15(t，J＝8.0Hz，2H)，7.3(m，3H)，7.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(t，J＝7.6Hz，1H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS：477(M+H).
4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物103)的制备
[0325]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(18.05g，112.7mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，4.96mg，124mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟。此后冷却至室温。缓慢加入化合物11(22g，124mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液且该溶液在110℃下加热过夜。使该混合物冷却至室温，倾入冰水，和用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到10.2g(36％)的白色固体。M.P.242℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，2.35(s，3H)，4.34(q，J＝7.2Hz，2H)，7.19(d，J＝8.4Hz，1H)，7.46(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，7.72(d，J＝1.6Hz，1H)，11.35(s，1H)，13.03(s，1H).EIMS m/z 248(M+1).
Figure A20048000430501431
4-羟基-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物104)的制备
[0326]将环己胺(13.88mL，121.33mmol)加入到化合物102(10g，40.44mmol)在甲苯(200mL)中的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到12g(98％)的白色固体。M.P.269℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.28(m，5H)，1.32(m，1H)，1.67(m，2H)，1.88(m，2H)，2.37(s，3H)，3.90(m，1H)，7.26(d，J＝8.7Hz，1H)，7.51(d，J＝8.7Hz，1H)，7.74(s，1H)，10.49(s，1H)，11.80(s，1H).EIMS m/z 301(M+1).
2，4-二氯-6-甲基-喹啉-3-腈(化合物105)的制备
[0327]将化合物104(12g，39.95mmol)在40mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热3小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到7.2g(76％)的白色固体。M.P.159℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.28(s，3H)，7.93(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，8.02(d，J＝8.8Hz，1H)，8.07(s，1H).EIMS m/z 237(M+1).
4-氯-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物106)的制备
[0328]将醋酸铵加入到化合物105(7.1g，29.95mmol)在冰醋酸中混悬液中且在140℃下加热4小时。冷却该溶液并倾入冰水.过滤生成的固体，用水洗涤，并且真空干燥得到4.5g(69％)的白色固体。M.P.264℃.1HNMR(DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，7.34(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)，7.75(s，1H).EIMS m/z 219(M+1).
6-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物107)的制备
[0329]将哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(8.73g，41.16mmol)加入到化合物106(4.5g，20.08mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并在110℃下加热过夜。真空下除去溶剂。残余物悬浮在水中，超声，并且过滤。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-2％甲醇的二氯甲烷梯度液洗脱得到7.0g(92％)的白色固体。M.P.269℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.34(s，3H)，3.65(m，4H)，3.92(m，4H)，7.14(m，1H)，7.23(d，J＝8.4Hz，1H)，7.43(d，J＝8.6Hz，1H)，7.49(d，J＝3.5Hz，1H)，7.51(s，1H)，7.81(d，J＝4.8Hz，1H).EIMS m/z 379(M+1).
Figure A20048000430501451
1-(2-二甲基氨基-乙基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物108)的制备
[0330]将化合物107(800mg，2.11mmol)、2-二甲基氨基乙基氯盐酸盐(1.52g，10.55mmol)和碳酸钾(2.91g，21.10mmol)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且干燥。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-10％甲醇的乙酸乙酯梯度液洗脱得到210mg(24％)的浅黄色固体。M.P.132℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.24(s，6H)，2.40(s，3H)，2.44(m，2H)，3.63(m，4H)，3.97(m，4H)，4.29(m，2H)，7.17(dd，J＝3.4，4.8Hz，1H)，7.49(m，2H)，7.57(m，1H)，7.69(s，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z 450(M+1).分析值(C24H27N5O2S)C，H，N.
6-甲基-1-(2-吗啉-4-基-乙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物109)的制备
[0331]将化合物107(1g，2.64mmol)、4-(2-氯乙基)吗啉(2.45g，13.2mmol)和碳酸钾(3.64g，26.4mmol)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且干燥。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-10％甲醇的乙酸乙酯梯度液洗脱得到223mg(17％)的白色固体。M.P.207℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ2.40(s，3H)，3.54(m，4H)，3.63(m，4H)，3.92(m，4H)，4.35(m，2H)，7.16(dd，J＝3.4，4.8Hz，1H)，7.49(m，2H)，7.61(m，1H)，7.69(s，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z492(M+1).分析值(C26H29N5O3S)C，H，N.
1-(2-二甲基氨基-乙基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物110)的制备
[0332]化合物107(1g.，2.64mmol)、2-(二异丙基氨基)乙基氯盐酸盐(2.64g，13.2mmol)和碳酸钾(3.64g，26.4mmol)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且干燥。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-10％甲醇的乙酸乙酯梯度液洗脱得到409mg(30％)的浅黄色固体。M.P.110-117℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ0.93(s，12H)，2.40(s，3H)，2.59(m，2H)，3.01(m，2H)，3.61(m，4H)，3.91(m，4H)，4.15(m，2H)，7.16(dd，J＝3.4，4.8Hz，1H)，7.49(m，2H)，7.58(m，1H)，7.69(s，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z 506(M+1).分析值(C28H35N5O2S)C，H，N.
6-甲基-2-氧代-1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物111)的制备
[0333]将化合物107(1g.，2.64mmol)、1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(2.24g，13.2mmol)和碳酸钾(3.64g，26.4mmol)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且干燥。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-10％甲醇的乙酸乙酯梯度液洗脱得到236mg(19％)的浅黄色固体.M.P.139-143℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.67(m，4H)，2.41(s，3H)，2.53(m，4H)，2.61(m，2H)，3.01(m，2H)，3.62(m，4H)，3.93(m，4H)，4.30(m，2H)，7.16(dd，J＝3.4，4.8Hz，1H)，7.49(m，2H)，7.60(m，1H)，7.69(s，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z 476(M+1).分析值(C26H29N5O2S)C，H，N.
4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(化合物112)的制备
[0334]N2气氛下将纯净丙二酸二乙酯(18.05g，112.7mmol)缓慢加入到氢化钠(60％在矿物油中，4.96mg，124mmol)在二甲基乙酰胺中的混悬液内。将该混合物在室温下搅拌直至停止放出氢气，随后该混合物在90℃下加热30分钟。并且冷却至室温。缓慢加入靛红酸酐(20g，124mmol)在二甲基乙酰胺中的溶液并且使该混合物在110℃下加热过夜。将该混合物冷却至室温，倾入冰水，用冷10％HCl酸化。过滤生成的固体并用水洗涤数次得到8.7g(30％)的白色固体。M.P.173℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.31(t，J＝6.6Hz，3H)，4.34(q，J＝6.6Hz，2H)，7.20(t，J＝8.0Hz，1H)，7.27(d，J＝8.4Hz，1H)，7.62(t，J＝7.2Hz，1H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H)，11.50(b，1H)；EIMS：234(M+H).
4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羧酸环己基酰胺(化合物113)的制备
[0335]将环己胺(13.88mL，121.33mmol)加入到化合物112(9.4g，40.44mmol)在甲苯中(200mL)的溶液内并回流4小时。冷却该溶液并真空蒸发溶剂。所得残余物悬浮在水中，简短超声，并且过滤。粗产物用醚重结晶得到10.1g(87％)的白色固体。M.P.223℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1.3(m，4H)，1.6(m，2H)，1.7(m，2H)，1.9(m，2H)，3.8(m，1H)，7.25(t，J＝7.7Hz，1H)，7.35(d，J＝8.3Hz，1H)，7.65(t，J＝7.2Hz，1H)，7.95(d，J＝7.7Hz，1H)，10.44(b，1H)；EIMS(neg.mode)：285(M-H).
Figure A20048000430501471
2，4-二氯-喹啉-3-腈(化合物114)的制备
[0336]将化合物113(8.5g，30mmol)在40mL纯净三氯氧磷中的溶液在90℃下加热3小时。减压下蒸发溶剂。残余物悬浮在水中并用固体碳酸氢钠中和。过滤生成的固体，用水洗涤，并且通过快速色谱纯化、用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱得到6.0g(91％)的白色固体。M.P.157℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1H-NMR(DMSO-d6)：7.9(m，1H)，8.09(d，J＝4.3Hz，2H)，8.28(d，J＝8.8Hz，1H)；EIMS：223(M+H).
4-氯-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物115)的制备
[0337]将醋酸铵(2.1g，27mmol)加入到化合物114(6.0g，27mmol)在冰醋酸中的混悬液内并在140℃下加热4小时。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且真空干燥得到5.2g(94％)的白色固体。M.P.302℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ1H-NMR(DMSO-d6)：7.4(m，2H)，7.79(t，J＝7.6Hz，1H)，7.96(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS：205(M+H).
2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物116)的制备
[0338]将哌嗪-1-基-噻吩-2-基-甲烷酮(8.0g，41mmol)加入到化合物115(4.1g，20mmol)在甲苯(50mL)中的溶液内并在110℃下加热过夜。真空下除去溶剂。将残余物悬浮在水中，超声，并且过滤。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-2％甲醇的二氯甲烷梯度液洗脱得到6.4g(88％)的白色固体。M.P.264℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，7.16(t，J＝4.8Hz，1H)，7.23(t，J＝5.9Hz，1H)，7.31(d，J＝8.6Hz，1H)，7.49(d，J＝4.0Hz，1H)，7.61(t，J＝8.3Hz，1H)，7.8(m，2H)，11.90(b，1H)；EIMS：364(M+H).
Figure A20048000430501481
在喹啉酮部分的N-1位烷基化
[0339]称作化合物117-158的化合物通过通用方法C或通用方法D制备。
通用方法C
[0340]将化合物116(364mg，1mmol)和碳酸钾(691g，5mmol)与2.5mmol的相应烷基卤化物(氯，溴或碘)在DMF中的溶液在90℃下加热过夜。冷却该溶液并倾入冰水。过滤生成的固体，用水洗涤，并且干燥。在没有形成固体的情况中，产物用二氯甲烷或正丁醇萃取并真空下浓缩。粗产物通过快速色谱纯化、用含0-5％甲醇的二氯甲烷梯度液洗脱。
通用方法D
[0341]室温和氩气氛下将化合物116(364mg，1mmol)在DMF中的溶液加入到NaH(60％在矿物油中，44mg，1.1mmol)在DMF中的搅拌溶液内。将该溶液在室温下搅拌1小时且经注射器加入相应烷基卤化物。将该溶液在室温下进一步搅拌3-48小时(TLC控制)。该反应按照通用方法C所述方法处理
1-(2-二甲基氨基-乙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物117)的制备
[0342]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法D制备得到白色固体。收率211mg(48％).M.P.96-99℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ2.20(s，6H)，2.46(m，1H)，2.71(s，1H)，3.68(m，4H)，3.93(m，4H)，4.30(m，1H)，4.55(m，1H)，7.16(dd，J＝3.4，4.8Hz，1H)，7.32(m，1H)，7.49(m，1H)，7.59(d，J＝8.4Hz，1H)，7.71(m，2H)，8.02(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z 436(M+1).分析值(C23H25N5O2S)C，H，N.
1-异丁基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物118)的制备
[0343]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法D制备得到白色固体。收率89mg(21％).M.P.209℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ0.89(s，6H)，2.12(m，1H)，3.65(m，4H)，3.93(m，4H)，4.11(d，J＝7.6Hz，2H)，7.16(dd，J＝3.6，4.8Hz，1H)，7.32(m，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，1H)，7.70(m，1H)，7.79(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，7.93(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H).EIMS m/z 421(M+1).分析值(C23H24N4O2S)C，H，N.
1-(4-甲氧基苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物119)的制备
[0344]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法D制备得到白色固体。收率127mg(26％).M.P.246℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.68(m，4H)，3.70(s，3H)，3.93(m，4H)，5.41(s，2H)，6.86(m，2H)，7.16(m，3H)，7.29(m，1H)，7.49(m，2H)，7.63(m，1H)，7.80(d，J＝4.8，2H)，7.93(d，J＝5.2Hz，1H).EIMS m/z 485(M+1).分析值(C27H24N4O3S)C，H，N.
1-(2-环己基-乙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物120)的制备
[0345]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。MP：213-215℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.9(m，2H)，1.2(m，3H)，1.4(m，3H)，1.6(m，3H)，1.7(m，2H)，3.6(m，4H)，3.92(s，4H)，4.22(t，J＝7.2Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.55(d，J＝8.4Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.93(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)；EIMS：498(M+Na).
2-(2-环己基-乙氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物121)的制备
[0346]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。MP：170-173℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.0(m，2H)，1.2(m，3H)，1.5(m，1H)，1.7(m，7H)，3.7(m，4H)，3.94(b，4H)，4.48(t，J＝6.8Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，1H)，7.50(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.01(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：475(M+H).
2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-(4-三氟甲基-苄基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物122)的制备
[0347]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。MP：248℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.72(s，4H)，3.95(s，4H)，5.59(s，2H)，7.2(m，1H)，7.32(t，J＝8.0Hz，1H)，7.39(d，J＝8.4Hz，1H)，7.43(d，J＝8.0Hz，2H)，7.51(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.6(m，1H)，7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.82(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.97(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：545(M+Na).
1-环己基甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物123)的制备
[0348]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。MP：122-127℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.1(m，5H)，1.6(m，6H)，3.6(m，4H)，3.93(b，4H)，4.11(b，2H)，7.2(m，1H)，7.32(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.9(m，1H)；EIMS：461(M+H).
2-环己基甲氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物124)的制备
[0349]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.166℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.4(m，5H)，1.7(m，6H)，3.68(b，4H)，3.94(b，4H)，4.25(d，J＝6.0Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，1H)，7.50(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.01(d，8.0Hz，1H)；EIMS：461(M+H).
2-氧代-1-苯乙基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物125)的制备
[0350]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.258-260℃；1H-NMR(DMSO-d6)：2.8(m，2H)，3.65(b，4H)，3.93(b，4H)，4.4(m，2H)，7.2(m，1H)，7.3(m，6H)，7.50(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.95(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
2-苯乙氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物126)的制备
[0351]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.145-147℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.09(t，J＝6.8Hz，2H)，3.68(b，4H)，3.93(b，4H)，4.62(t，J＝6.8Hz，2H)，7.1(m，1H)，7.2(m，1H)，7.31(t，J＝7.2Hz，2H)，7.4(m，2H)，7.5(m，1H)，7.51(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.01(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
2-(4-甲氧基-苄氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物127)的制备
[0352]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.192-194℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.69(b，4H)，3.76(s，3H)，3.94(b，4H)，5.47(s，2H)，6.96(d，J＝8.4Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.5(m，4H)，7.78(d，J＝3.6，2H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.03(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：485(M+H).
2-氧代-1-(2-氧代-2-苯基-乙基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物128)的制备
[0353]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.260-261℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.71(b，4H)，3.96(b，4H)，5.90(s，2H)，7.17(m，1H)，7.33(m，1H)，7.45(d，J＝8.8Hz，1H)，7.51(dd，J＝1.2，4.0Hz，1H)，7.6(m，3H)，7.75(t，J＝7.6Hz，1H)，7.81(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，7.97(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，8.14(d，J＝7.2Hz，2H)；EIMS：483(M+H).
1-萘-2-基甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物129)的制备
[0354]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.276-279℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.71(b，4H)，3.96(b，4H)，5.65(b，2H)，7.2(m，1H)，7.3(m，1H)，7.41(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，7.5(m，3H)，7.51(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.6(m，1H)，7.7(s，1H)，7.8(m，2H)，7.9(m，2H)，7.96(d，J＝9.2Hz，1H)；EIMS：505(M+H).
2-(萘-2-基甲氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物130)的制备
[0355]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.250℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，4H)，3.95(b，4H)，5.72(s，2H)，7.2(m，1H)，7.5(m，4H)，7.67(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，7.8(m，3H)，7.9(m，3H)，8.1(m，2H)；EIMS：505(M+H).
1-(3-二甲基氨基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物131)的制备
[0356]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.203-204℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.7(m，2H)，2.24(s，6H)，2.4(m，2H)，3.64(b，4H)，3.93(b，4H)，4.23(t，J＝7.2Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.34(m，1H)，7.50(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.67(d，J＝8.4Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.95(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)；EIMS：450(M+H).
2-(3-二甲基氨基-丙氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物132)的制备
[0357]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.130℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.9(m，2H)，2.17(s，6H)，2.43(t，J＝6.8Hz，2H)，3.7(m，4H)，3.95(b，4H)，4.47(t，J＝6.8Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.5(m，1H)，7.52(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS：450(M+H).
1-(2，2-二甲基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物133)的制备
[0358]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.111-116℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.9(s，9H)，3.65(b，4H)，3.93(b，4H)，4.20(b，2H)，7.2(m，1H)，7.30(t，J＝7.6Hz，1H)，7.50(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.8(m，2H)，7.91(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)；EIMS：457(M+Na).
2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-(2，2，2-三氟-乙基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物134)的制备
[0359]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.242℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.71(b，4H)，3.93(b，4H)，5.2(m，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，1H)，7.50(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.81(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，7.95(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS：447(M+H).
4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-(2，2，2-三氟-乙氧基)-喹啉-3-腈(化合物135)的制备
[0360]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.204℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.70(b，4H)，3.95(b，4H)，5.2(m，2H)，7.2(m，1H)，7.5(m，2H)，7.8(m，3H)，8.1(m，1H)；EIMS：447(M+H).
2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1-(4-三氟甲氧基-苄基)-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物136)的制备
[0361]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.150-160℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，5.52(s，2H)，7.2(m，1H)，7.3(m，5H)，7.44(d，J＝8.3Hz，1H)，7.51(d，J＝3.8Hz，1H)，7.64(t，J＝7.1Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.0，5.0Hz，1H)，7.96(J＝1.3，8.3Hz，1H)；EIMS：539(M+H).
4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-2-(4-三氟甲氧基-苄氧基)-喹啉-3-腈(化合物137)的制备
[0362]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.170-172℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，4H)，3.98(b，4H)，5.63(s，2H)，7.2(m，1H)，7.46(d，J＝8.0Hz，2H)，7.5(m，2H)，7.70(d，J＝8.8Hz，2H)，7.8(m，2H)，7.85(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.08(d，8.4Hz，1H)；EIMS：539(M+H).
1-(3-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物138)的制备
[0363]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.261-263℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，4H)，3.94(b，4H)，5.50(s，2H)，7.1(m，3H)，7.2(m，1H)，7.3(m，2H)，7.41(d，J＝8.4Hz，1H)，7.51(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.6(m，1H)，7.81(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.9(m，1H)；EIMS：473(M+H).
1-(2-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物139)的制备
[0364]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.203-205℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，5.50(s，2H)，6.86(t，J＝6.7Hz，1H)，7.07(t，J＝7.5Hz，1H)，7.2(m，1H)，7.3(m，4H)，7.50(dd，J＝0.9，3.6Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.81(dd，J＝0.9，5.0Hz，1H)，7.97(dd，J＝1.2，8.2Hz，1H)；EIMS：473(M+H).
2-氧代-1-丙基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物140)的制备
[0365]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.210-212℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.97(t，J＝7.2Hz，3H)，1.6(m，2H)，3.6(m，4H)，3.9(m，4H)，4.16(t，J＝7.6Hz，2H)，7.1(m，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.63(d，J＝8.4Hz，1H)，7.7(m，1H)，7.79(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，7.94(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：407(M+H).
2-丙氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物141)的制备
[0366]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.198-199℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.01(t，J＝7.6Hz，3H)，1.8(m，2H)，3.69(b，4H)，3.94(b，4H)，4.41(t，J＝6.4Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，1H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.02(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：407(M+H).
1-丁基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物142)的制备
[0367]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.155-157℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.93(t，J＝7.2Hz，3H)，1.4(m，2H)，1.6(m，2H)，3.6(m，4H)，3.92(b，4H)，4.20(t，J＝7.6Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.50(d，J＝3.2Hz，1H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.75(t，J＝7.2Hz，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，7.94(d，J＝7.6Hz，1H)；EIMS：421(M+H).
2-丁氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物143)的制备
[0368]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.190-191℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.96(t，J＝7.2Hz，3H)，1.5(m，2H)，1.8(m，2H)，3.68(b，4H)，3.94(b，4H)，4.46(t，J＝6.4Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，1H)，7.50(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.02(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：421(M+H).
1-(3-羟基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物144)的制备
[0369]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.209-210℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.7(m，2H)，3.5(m，2H)，3.6(m，4H)，3.9(m，4H)，4.26(t，J＝7.2Hz，2H)，4.65(t，J＝5.2Hz，1H)，7.1(m，1H)，7.34(t，J＝7.2Hz，1H)，7.49(d，J＝3.2Hz，1H)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H)，7.76(t，J＝7.2Hz，1H)，7.80(d，J＝5.2Hz，1H)，7.94(d，J＝7.6Hz，1H)；EIMS：423(M+H).
1-环丙基甲基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物145)的制备
[0370]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.198℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.45(d，J＝6.4Hz，4H)，1.2(m，1H)，3.6(m，4H)，3.9(m，4H)，4.17(d，J＝6.8Hz，2H)，7.1(m，1H)，7.3(m，1H)，7.49(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.79(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，7.94(d，J＝7.6Hz，1H)，；EIMS：419(M+H).
2-环丙基甲氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物146)的制备
[0371]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.200-203℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.5(m，2H)，0.6(m，2H)，1.3(m，1H)，3.69(b，4H)，3.94(b，4H)，4.31(d，J＝6.8Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.5(m，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.8(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.02(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：419(M+H).
1-(4-氰基-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物147)的制备
[0372]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.260-263℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.72(b，4H)，3.95(b，4H)，5.58(s，2H)，7.2(m，1H)，7.31(t，J＝7.6Hz，1H)，7.34(d，J＝8.8Hz，1H)，7.40(d，J＝8.4Hz，2H)，7.50(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.63(t，J＝7.2Hz，1H)，7.8(m，3H)，7.96(d，J＝7.2Hz，1H)；EIMS：480(M+H).
2-(4-氰基-苄氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物148)的制备
[0373]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.214-218℃；1H-NMR(DMSO-d6)：3.71(b，4H)，3.95(b，4H)，5.58(s，2H)，7.17(t，J＝2.8Hz，1H)，7.31(t，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝8.8Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.63(t，J＝7.2Hz，1H)，7.8(m，3H)，7.96(d，J＝8.0Hz，1H)；EIMS：480(M+H).
2-氧代-1-戊基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物149)的制备
[0374]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.201-202℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.88(t，J＝6.8Hz，3H)，1.3(m，4H)，1.6(m，2H)，3.6(m，4H)，3.92(b，4H)，4.19(t，J＝7.6Hz，2H)，7.2(m，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.75(t，J＝7.2Hz，1H)，7.8(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，7.94(dd，J＝0.8，8.0Hz，1H)；EIMS：435(M+H).
2-戊氧基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物150)的制备
[0375]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.152-155℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，1.4(m，4H)，1.7(m，2H)，3.7(m，4H)，3.94(b，4H)，4.45(t，J＝6.8Hz，2H)，7.17(t，J＝4.4Hz，1H)，7.4(m，1H)，7.50(d，J＝3.6Hz，1H)，7.7(m，2H)，7.80(d，J＝4.8Hz，1H)，8.02(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：435(M+H).
1-(4-甲基-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物151)的制备
[0376]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.236-238℃；1H-NMR(DMSO-d6)：2.25(s，3H)，3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，5.44(s，2H)，7.12(s，4H)，7.2(m，1H)，7.29(t，J＝7.8Hz，1H)，7.41(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(dd，J＝1.2，4.0Hz，1H)，7.6(m，1H)，7.81(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，7.94(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
2-(4-甲基-苄氧基)-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-喹啉-3-腈(化合物152)的制备
[0377]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.188-191℃；1H-NMR(DMSO-d6)：2.31(s，3H)，3.7(m，4H)，3.9(m，4H)，5.50(s，2H)，7.2(m，1H)，7.21(d，J＝7.6Hz，2H)，7.41(d，J＝8.0Hz，2H)，7.5(m，2H)，7.77(d，J＝4.0Hz，2H)，7.80(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.03(d，J＝8.4Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
2-氧代-1-丙基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物153)的制备
10378]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.92-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，1.6(m，2H)，3.13(s，4H)，3.88(s，4H)，4.3(m，4H)，7.1(m，1H)，7.4(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：455(M+H).
1-丁基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物154)的制备
[0379]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.90-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：0.92(t，J＝7.2Hz，3H)，1.3(m，5H)，1.6(m，2H)，3.13(s，4H)，3.88(s，4H)，4.32(m，4H)，7.15(m，1H)，7.38(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6，1H)，7.79(dd，J＝1.2，5.2Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：469(M+H).
1-烯丙基-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物155)的制备
[0380]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.89-96℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，3.15(s，4H)，3.89(s，4H)，4.31(t，J＝7.2Hz，2H)，5.0(m，4H)，5.9(m，1H)，7.15(m，1H)，7.39(dd，J＝4.8，8.0Hz，1H)，7.46(dd，J＝0.8，3.6Hz)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.68(dd，J＝1.6，4.8Hz，1H)；EIMS：453(M+H).
1-(2-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物156)的制备
[0381]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.105-110℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.19(s，4H)，3.91(s，4H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，5.60(s，2H)，6.81(m，1H)，7.04(m，1H)，7.2(m，3H)，7.39(m，1H)，7.46(dd，J＝0.8，3.6Hz，1H)，7.80(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.38(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，8.63(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)；EIMS：521(M+H).
1-(3-氟-苄基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物157)的制备
[0382]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.105-110℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.29(t，J＝6.8Hz，3H)，3.18(s，4H)，3.89(s，4H)，4.31(q，J＝6.8Hz，2H)，5.56(s，2H)，7.1(m，4H)，7.4(m，3H)，7.79(d，J＝4.4Hz，1H)，8.36(d，J＝7.6Hz，1H)，8.67(d，J＝3.2Hz，1H)；EIMS：521(M+H).
1-(3-二甲基氨基-丙基)-2-氧代-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-[1，8]萘啶-3-羧酸乙酯(化合物158)的制备
[0383]该化合物由相应烷基卤化物按照通用方法C制备。M.P.84-94℃；1H-NMR(DMSO-d6)：1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，1.7(m，2H)，2.14(s，6H)，2.30(t，J＝6.8Hz，2H)，3.13(b，4H)，3.88(b，4H)，4.3(m，4H)，7.2(m，1H)，7.3(m，1H)，7.45(dd，J＝1.2，3.6Hz，1H)，7.79(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.34(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，8.70(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)；EIMS：498(M+H).
2-氧代-1-苯基-4-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-1，2-二氢-喹啉-3-腈(化合物159)的制备
[0384]将醋酸铜(497mg，2.74mmol)、三乙胺(380μL，2.74mmol)和苯基硼酸(335mg，2.74mmol)依次加入到化合物116(500mg，1.37mmol)在二氯甲烷中的溶液内。该溶液在室温搅拌48小时。该溶液经硅藻土过滤并用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。有机相用Na2SO4干燥且蒸发得到残余物，该残余物通过快速色谱纯化，用含0-1％MeOH的二氯甲烷梯度液洗脱得到187mg(31％)的白色固体.M.P.289℃.1H NMR(DMSO-d6)：δ3.78(m，4H)，4.02(m，4H)，6.60(d，J＝7.6Hz，1H)，7.22(m，1H)，7.38(m，3H)，7.57-7.71(m，5H)，7.88(dd，J＝0.8，4.8Hz，1H)，8.02(d，J＝7.2Hz，1H).EIMS m/z 441(M+1).分析值(C25H20N4O2S)C，H，N.
实施例4
[0385]下列MIF的抑制剂通过实施例所述的方法制备。这些MIF抑制剂各自属于上述结构1(a)类的化合物。互变异构酶试验的结果表明，各个下列候选化合物具有特别高的抑制MIF活性的水平。这些MIF抑制剂分别在0.01nM-50μM的浓度下具有活性。
          化合物200                             化合物201                             化合物202
          化合物203                            化合物204                            化合物205
Figure A20048000430501601
          化合物206                            化合物207                            化合物208
Figure A20048000430501602
          化合物209                            化合物210                            化合物211
Figure A20048000430501611
          化合物212                            化合物213                            化合物214
          化合物215                            化合物216                               化合物217
Figure A20048000430501621
          化合物218                            化合物219                               化合物220
          化合物221                            化合物222                           化合物223
          化合物224                            化合物225                           化合物226
          化合物227                             化合物228                             化合物229
Figure A20048000430501641
          化合物230                             化合物231                             化合物232
Figure A20048000430501642
          化合物233                             化合物234                             化合物235
          化合物236                             化合物237                             化合物238
Figure A20048000430501652
          化合物239                             化合物240                            化合物241
          化合物242                             化合物243                            化合物244
Figure A20048000430501662
          化合物245                           化合物246                              化合物247
Figure A20048000430501671
          化合物248                           化合物249                              化合物250
         化合物251                            化合物252                            化合物253
Figure A20048000430501681
         化合物254                            化合物255                            化合物256
Figure A20048000430501682
          化合物257                             化合物258                            化合物259
Figure A20048000430501691
          化合物260                             化合物261                            化合物262
Figure A20048000430501692
          化合物263                            化合物264                            化合物265
          化合物266                            化合物267                            化合物268
          化合物269                             化合物270
Figure A20048000430501711
实施例5
[0387]下列优选实施方案的MIF抑制剂可以通过实施例所述的方法制备。
          化合物300                         化合物301                       化合物302
Figure A20048000430501712
     化合物303                            化合物304                           化合物305
Figure A20048000430501721
     化合物306                            化合物307                           化合物308
Figure A20048000430501722
     化合物309                              化合物310                                化合物311
Figure A20048000430501731
     化合物312                              化合物313                                化合物314
Figure A20048000430501732
       化合物315                               化合物316                            化合物317
       化合物318                               化合物319                            化合物320
Figure A20048000430501742
       化合物321                              化合物322                              化合物323
Figure A20048000430501751
       化合物324                              化合物325                              化合物326
Figure A20048000430501752
       化合物327                             化合物328                            化合物329
Figure A20048000430501761
       化合物330                             化合物331                            化合物332
Figure A20048000430501762
      化合物333                            化合物334                              化合物335
Figure A20048000430501771
      化合物336                            化合物337                              化合物338
Figure A20048000430501772
       化合物339                          化合物340                           化合物341
Figure A20048000430501781
       化合物342                          化合物343                           化合物344
Figure A20048000430501782
       化合物345                           化合物346                          化合物347
Figure A20048000430501791
       化合物348                           化合物349                          化合物350
Figure A20048000430501792
       化合物351                          化合物352                           化合物353
Figure A20048000430501801
       化合物354                          化合物355                           化合物356
       化合物357                          化合物358                           化合物359
Figure A20048000430501803
       化合物360                             化合物361                          化合物362
       化合物363                             化合物364                          化合物365
Figure A20048000430501812
       化合物366                             化合物367                           化合物368
       化合物369                             化合物370                           化合物371
Figure A20048000430501822
       化合物372                           化合物373                             化合物374
       化合物375                           化合物376                             化合物377
Figure A20048000430501832
       化合物378                           化合物379                             化合物380
       化合物381                             化合物382                          化合物383
       化合物384                             化合物385                          化合物386
Figure A20048000430501842
       化合物387                              化合物388                           化合物389
Figure A20048000430501851
       化合物400                              化合物401                           化合物402
       化合物403                             化合物404                           化合物405
       化合物406                             化合物407                           化合物408
Figure A20048000430501862
       化合物409                              化合物410                           化合物411
Figure A20048000430501871
       化合物412                              化合物413                           化合物414
Figure A20048000430501872
       化合物415                           化合物416                           化合物417
Figure A20048000430501881
       化合物418                           化合物419                           化合物420
Figure A20048000430501882
       化合物421                           化合物422                           化合物423
Figure A20048000430501883
       化合物424                        化合物425                              化合物426
Figure A20048000430501891
       化合物427                        化合物428                              化合物429
Figure A20048000430501892
       化合物430                        化合物431                              化合物432
Figure A20048000430501893
       化合物433                         化合物434                            化合物435
Figure A20048000430501901
       化合物436                         化合物437                            化合物438
       化合物439                             化合物440                            化合物441
Figure A20048000430501911
       化合物442                             化合物443                            化合物444
Figure A20048000430501912
       化合物445                             化合物446                          化合物447
Figure A20048000430501921
       化合物448                             化合物449                          化合物450
       化合物451                            化合物452                           化合物453
Figure A20048000430501931
       化合物454                            化合物455                           化合物456
Figure A20048000430501932
       化合物457                               化合物458                          化合物459
Figure A20048000430501941
       化合物460                               化合物461                          化合物462
Figure A20048000430501942
       化合物463                             化合物464                             化合物465
       化合物466                             化合物467                             化合物468
Figure A20048000430501952
       化合物469                            化合物470                          化合物471
       化合物472                            化合物473                          化合物474
       化合物475                            化合物476                          化合物477
       化合物478                           化合物479                            化合物480
       化合物481                           化合物482                            化合物483
       化合物484                           化合物485                            化合物486
Figure A20048000430501973
实施例6
[0387]在THP-1细胞试验中测试数个不同浓度下化合物200。化合物200显示MIF抑制活性，如图1所示。化合物200显示MIF抑制活性。
实施例7
[0388]测试数个不同浓度下化合物200的体外互变异构酶抑制活性。化合物200显示MIF抑制活性，如图2所示。
实施例8
[0389]测试数个不同浓度下化合物203的体外互变异构酶抑制活性。化合物203显示MIF抑制活性，如图3所示。
实施例9
[0390]比较化合物200和化合物203的MIF抑制活性。两者具有令人满意的MIF抑制活性。
                               表2
               MIF抑制剂的体外活性(50μm的抑制浓度(IC))
  化合物   互变异构酶试验   平均IC 50   THP-1/MIF抑制   平均IC 50
  200   0.30(0.23-0.4)   0.32   0.023(0.001-0.52)   0.15(0.13-0.17)
  200   0.34(0.12-0.9)   ---   0.15(0.13-0.17)   ---
  200   ---   ---   0.15(0.13-0.17)   ---
  203   0.098(0.071-0.134)   0.098   ---   ---
[0391]优选实施方案结合其具体实施方案加以描述。应理解能够进一步改进，并且本申请覆盖任何按照本发明的一般性原理对本发明所作的改变、应用或适应，并且包括不同于本申请内容但在本领域的已知或常规实践中保持了本发明并采用了上述必要特征，并且属于本发明的范围内及其等同方案。在此引用的各个参考文献，包括但不限于专利和技术文献，在此全文引入作为参考。

Claims (45)

1.一种具有下面结构的化合物：
Figure A2004800043050002C1
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
X是氧或硫；
Z是-CH2-或-C(＝O)-；
n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，
Figure A2004800043050003C1
Figure A2004800043050003C2
和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
2.含有权利要求1的化合物以及药用载体或者稀释剂的组合物。
3.一种治疗温血动物炎症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
4.一种治疗温血动物脓毒性休克的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
5.一种治疗温血动物关节炎的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
6.一种治疗温血动物癌症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
7.一种治疗温血动物急性呼吸窘迫综合症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
8.一种治疗温血动物炎性疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
9.权利要求8的方法，其中该炎性疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病，和哮喘。
10.一种治疗温血动物自身免疫疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
11.权利要求10的方法，其中该自身免疫疾病选自糖尿病，哮喘，和多发性硬化症。
12.一种抑制温血动物免疫应答的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
13.一种减少温血动物血管生成的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
14.一种治疗温血动物与糖皮质激素水平过高有关的疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求1的化合物。
15.权利要求14的方法，其中该疾病是库欣病。
16.一种治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的MIF抑制化合物和治疗该疾病或病症的药物，其中该药物不具有可检测到的MIF抑制活性。
17.一种治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的MIF抑制化合物和选自非甾类抗炎药、抗感染药、β兴奋剂、甾族化合物、抗组胺药、抗癌药、哮喘药、脓毒病药、关节炎药和免疫抑制药的药物。
18.一种具有下列结构的化合物：
Figure A2004800043050005C1
或其立体异构体、前药或药用盐。
19.一种在需求其的患者中降低MIF活性的方法，包括给该患者施用有效量的具有下式结构的化合物：
Figure A2004800043050005C2
或其立体异构体、前药或药用盐。
20.一种具有下式结构的化合物：
Figure A2004800043050006C1
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
R1选自-(CH2)nCOOR”’，-(CH2)nN(R”’)2，-(CH2)nC(O)N(R”’)2，
Figure A2004800043050006C2
和
Figure A2004800043050006C3
其中n是1-4的整数；
R12选自氢，氯，氟，和甲基；
R4选自
Figure A2004800043050006C4
和
Figure A2004800043050006C5
R”’独立地选自氢，氟，氯，直链C1-C5烷基，和支链C1-C5烷基；和
R””选自氢，卤素，烷基，氰基，硝基，-COOR”’，-N(R”’)2，-OR”’，-NHCOR”’，和-OCF3。
21.一种具有下式结构的化合物：
Figure A2004800043050007C1
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
R1选自：
Figure A2004800043050007C2
和
Figure A2004800043050007C3
R12选自氢，氯，氟，和甲基；和
R4选自
Figure A2004800043050007C4
和
22.一种在需求其的患者中降低MIF活性的方法，包括给该患者施用有效量的具有下式结构的化合物：
Figure A2004800043050008C1
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
X是氧或硫；
Z是-CH2-或-C(＝O)-；
n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，
-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7， 和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，取代的烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
23.一种具有下式结构的化合物：
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
X是氧或硫；
Z是-CH2-或-C(＝O)-；
n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，
-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，
Figure A2004800043050010C2
和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
24.含有权利要求23的化合物以及药用载体或者稀释剂的组合物。
25.一种治疗温血动物炎症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
26.一种治疗温血动物脓毒性休克的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
27.一种治疗温血动物关节炎的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
28.一种治疗温血动物癌症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
29.一种治疗温血动物急性呼吸窘迫综合症的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
30.一种治疗温血动物炎性疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
31.权利要求30的方法，其中该炎性疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性肠病，和哮喘。
32.一种治疗温血动物自身免疫疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
33.权利要求32的方法，其中该自身免疫疾病选自糖尿病，哮喘，和多发性硬化症。
34.一种抑制温血动物免疫应答的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
35.一种减少温血动物血管生成的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物.
36.一种治疗温血动物与糖皮质激素水平过高有关的疾病的方法，包括给该动物施用有效量的权利要求23的化合物。
37.权利要求36的方法，其中该疾病是库欣病。
38.一种治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有权利要求23所述的MIF抑制化合物和治疗该疾病或病症的药物，其中该药物不具有可检测到的MIF抑制活性。
39.一种治疗其中MIF是致病性的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物含有权利要求23所述的MIF抑制化合物和选自非甾类抗炎药、抗感染药、β兴奋剂、甾族化合物、抗组胺药、抗癌药、哮喘药、脓毒病药、关节炎药和免疫抑制药的药物。
40.一种在需要其的患者中降低MIF活性的方法，包括给患者施用有效量的具有下面结构的化合物：
Figure A2004800043050013C1
或其立体异构体、前药或药用盐，其中：
X是氧或硫；
Z是-CH2-或-C(＝O)-；
n是0，1，或2，条件是当n是0时，Z是-C(＝O)-；
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
41.一种制备式IVa的化合物的方法，包括下列步骤：
将式I的化合物：
Figure A2004800043050014C1
(式I)
与式II的化合物反应：
Figure A2004800043050015C1
(式II)
由此得到式III的化合物：
(式III)
并且使式III的化合物与式X-R1的化合物反应，由此得到式IVa的化合物：
(式IVa)
其中式IVa的化合物适合用作MIF抑制剂，和其中：
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
X选自Cl，Br，和I；和
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
42.一种制备式IVb的化合物的方法，包括以下步骤：
将式I的化合物：
(式I)
与式II的化合物反应：
Figure A2004800043050017C2
(式II)
由此得到式III的化合物：
(式III)
；和
使式III的化合物与含有X-R1的化合物反应，其中X选自Cl，Br，和I，且其中R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基，其中x是2-4，由此得到式IVb的化合物：
(式IVb)
其中式IVb的化合物适合用作MIF抑制剂。
43.一种制备式IVa的化合物的方法，包括以下步骤：
将式I的化合物：
(式I)
与哌嗪反应，由此得到式IIIa的化合物：
Figure A2004800043050019C2
(式IIIa)
并且此后使式IIIa的化合物与式R4-C(O)-X的化合物反应，由此得到式IVa的化合物：
Figure A2004800043050020C1
(式IVa)
其中式IVa的化合物适合用作MIF抑制剂，和其中：
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
X选自Cl，Br，和I；和
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
44.一种制备式IVb的化合物的方法，包括以下步骤：
将式I的化合物：
Figure A2004800043050021C1
(式I)
与哌嗪反应，由此得到式IIIa的化合物：
Figure A2004800043050022C1
(式IIIa)
并且此后使式IIIa的化合物与式R4-C(O)-X的化合物反应，由此得到式IVb的化合物：
Figure A2004800043050022C2
(式IVb)
其中式IVb的化合物适合用作MIF抑制剂，且其中：
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
X选自Cl，Br，和I；和
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
45.一种制备式I的中间体化合物的方法，包括下列步骤：
将式Iaa的化合物：
Figure A2004800043050024C1
(式Iaa)
与环己胺反应，由此得到式IIIaa的化合物：
(式IIIaa)
将式IIIaa的化合物与POCl3反应，由此得到式Ia的化合物
Figure A2004800043050024C3
(式Ia)
                                              ；
并且此后将式1a的化合物与乙酸铵在乙酸中反应，由此得到式I的中间体化合物：
(式I)
其中式I的化合物适合用于制备MIF抑制剂，且其中：
R2和R3独立地选自卤素，-R5，-OR5，-SR5，和-NR5R6；
R4选自-CH2R7，-C(＝O)NR5R6，-C(＝O)OR7，-C(＝O)R7，和R8；
R5和R6独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；或R5和R6与它们所连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7选自烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；和
R8选自氢，烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基；
X选自Cl，Br，和I；和
R1选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，二烷基，和R’R”N(CH2)x-，其中x是2-4，且其中R’和R”独立地选自氢，烷基，烷基芳基，取代的烷基芳基，芳基，取代的芳基，芳基烷基，取代的芳基烷基，酰基烷基，取代的酰基烷基，酰基芳基，取代的酰基芳基，杂环，取代的杂环，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂环芳基，取代的杂环芳基，和二烷基。
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