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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Protein, das imstande ist, Immunität gegen Malaria auszulösen, wenn es als eine Vakzine verabreicht wird.
Malaria ist auf der ganzen Welt ein zunehmendes Gesundheitsproblem. Mehrere hundert Millionen Leute leiden an dieser Krankheit und die akuteste Form, die durch den Protozoenoparasiten Plasmodium falciparum verursacht wird, tötet über eine Million Kinder jedes Jahr in Afrika allein.
Der Lebenszyklus des parasitischen Protozoen Plasmodium falciparwn ist komplex und erfordert sowohl den Moskito als auch den Säugerwirt Menschen für die Vollendung. Die Infektion des Menschen wird durch die Inokulation von Sporozoiten in den Speichel eines infizierten Moskito eingeleitet Die Sporozoiten wandern zur Leber und infizieren dort Leberzellen, wo sie über das exoerythrozytische intrazelluläre Stadium in das Merozoitenstadium differenzieren, welches das Blut unter Auslösung von zyklischer Replikation im asexuellen Blutstadium infiziert Der Zyklus wird durch die Differenzierung von Gametozyten im Geschlechtsstadium im Blut vollendet, die vom Moskito eingenommen werden, wo sie sich durch eine Reihe von Stadien im Mittelarm unter Bildung von Sporozoiten entwickeln, die zur Speicheldrüse wandern.
Der Mechanismus von Malariaimmunität ist komplex, doch wird angenommen, dass er sowohl Antikörperals auch zellenvermittelte Komponenten involviert. Im Sporozoitenstadium scheint die Oberfläche des Organismus mit einem einzigen Protein, dem Circumsporozoitenprotein (CSP), überzogen zu sein, das ein immundominantes sich wiederholendes Epitop enthält. Die Rolle des Antikörper beim Vermitteln von Schutz gegen diese Form wird durch die Tatsache bestätigt, dass Antikörper gegen die Wiederholung Ansteckungsfähigkeit zunichte machen und den Angriff von Leberzellen behindern (Hollingdale et al., J.
Immunol. 132, (1984), 909 ; Mazier et al., Science 231, (1985), 156). Es hat sich gezeigt, dass die Struktur dieser Wiederholung in verschiedenen Stämmen von P. falciparum konstant ist und die Wiederholungssequenz wurde sowohl durch Synthese-als auch Rekombinationsmethoden gebildet. Das asexuelle Stadium ist komplexer und der Parasit bildet viele Proteine, die mit dem Immunsystem in Wechselwirkung stehen. Es hat sich gezeigt, dass
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Stadium in Tiermodellen Immunität hervorruft. Diese Klasse von Antigenen ist in allen bisher untersuchten Malariaarten vorhanden und hat in P. falciparum eine Molmasse von etwa 195 000 (bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese). Dieses Protein wird hier mit P. 195 bezeichnet.
Das Circumsporozoiten-Proteingen von P. falciparum wurde geklont und durch zwei Gruppen sequenziert (Dame et al., Science 225. (1984), 593 ; Enea et al., Science 225, (1984), 625). In einem brasilianischen P. falciparum-Isolat enthält das Gen einen mittleren Bereich des tandemartig wiederholten Tetrapeptids Asn-Ala-AsnPro (Wiederholung A), das 37-mal wiederholt ist, wobei 4 kleinere Wiederholungen Asn-Val-Asp-Pro (Wiederholung B) eingestreut sind. Es ist wahrscheinlich, dass diese sich wiederholende Sequenz ein starkes Immunogen ist und imstande ist, Antisporozoitenimmunität zu induzieren. In den U. S. A. finden klinische Untersuchungen der Phase I einer synthetischen Antisporozoitenvakzine statt.
Die Vakzine umfasst entweder A) ein Rekombinationsprotein enthaltend 32 immunodominante Tetrapeptidwiederholungen vom mittleren Wiederholungsbereich des Gens oder B) ein synthetisches Peptid bestehend aus drei Tetrapeptidwiederholungen.
In vitro-Daten zeigen, dass die kleinste Zahl von synthetischen oder bakteriell-exprimierten gebrachten
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und 48 Tandemkopien mit 32 Aminosäuren eines Ter-Gens ausserhalb des Rahmens. Die Basiseinheit für die Bakterienkonstruktion war ein Fragment des CSP-Gens, das 16 Wiederholungen codiert. Gereinigte Proteine, die 32 oder 48 Wiederholungen enhalten, induzierten hohe Antikörpertiter in Mäusen ohne Adjuvantien, während Proteine mit 16 Wiederholungen Alaun oder Freunds komplettes Adjuvans (FCA) für Antigenität erforderten. Anitkörper gegen Rekombinationsproteine reagierten mit CPS an Lebersporozoiten und blockierten fast vollständig den Angriff von menschlichen Hepatomzellen in vitro.
Diese Entdeckungen legen nahe, dass die Verwendung einer Rekombinationsantisporozoitenvakzine wirksam sein kann, da Anitkörpertiter gut mit der Immunität auf Sporozoiteninfektion in Wechselwirkung stehen (Nardin et al., J. Exp. Med. ! JE, (1982), 20),
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(1985), 305) ;ill, (1985), 2790).
P. 195, das ein Glykoprotein zu sein scheint (R. J. Howard et al., Mol. Biochem. Parasitol H, (1984), 349) wird innerhalb der Schizontenform des Parasiten synthetisiert, und am Ende des Intraerythrozytenstadiums wird das Antigen proteolytisch zu einzelnen Fragmenten behandelt (Holder und Freeman, J. Exp. Med. ljü, (1982), 1528), Hall et al., Mol. Biochem. Parasitol 11, (1984), 61). An der Oberfläche der Merozoiten (am Ende des Intraerythrozytenstadiums in das Plasma freigesetzt) ist das Protein voll behandelt, wobei drei einzelne Fragmente von P. 195 mit Molmassen von etwa 83 000,42 000 und 19 000 vorhanden sind und durch polyklonale AntiP. 195-antikörper erkannt werden.
Diese drei Fragmente sind die Hauptoberflächenantigene von Merozoiten und werden durch menschliches Immunserum stark erkannt (Freeman und Holder, J. Exp. Med. 158. (1983), 1647 ; Holder und Freeman, J. Exp. Med. 160, (1984), 624).
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Klonierungs- und immunologische Daten für P. 195 sind in der EP-A1-0 154 454 beschrieben.
Ein Problem mit einer Sporozoitenvakzine allein besteht darin, dass, da diese und das Blutstadium antigenmässig verschieden sind, das Versagen, 100 % Sporozoiten zu neutralisieren, noch die Infektion der Leber ermöglichen und eventuell zu einer Malariainfektion in vollem Massstab führen würde. Desgleichen hätte eine Vakzine, die nur gegen das Blutstadium gerichtet ist, mit einer Malariainfektion zu kämpfen, die in voller Blüte aus der Leber hervorgeht.
Es wurde nun gefunden, dass ein Rekombinationskonjugatprotein, das Fragmente sowohl von CSP als auch Blutstadiumantigenen umfasst, imstande ist, Immunität sowohl gegen das Sporozoitenstadium als auch das Blutstadium des Plasmodium-Lebenszyklus zu induzieren.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung gemäss einem ersten Aspekt auf ein Rekombinationskonjugatprotein, das zumindest ein Epitop jeweils von CSP und einem Blutstadiumantigen eines Plasmodium-Parasiten umfasst
Die Veröffentlichungen : Science, Vol. 228, No. 4702,1985, Seiten 958-962-"Expression of Plasmodium Falciparum Circumsporozoite Proteins in Escherichia Coli for Potential use in a Human Malaria Vaccine" ; EPAI-0 191 748 ; EP2-A-0 166 410 ; GB-A-2 154 240 und WO-A1-86/00911 beziehen sich alle auf ein Circumsporozoiten-Protein und die mögliche Verwendung von Fragmenten hievon in Sporozoiten-Vakzinen.
Die Veröffentlichungen Nature, Vol. 317, No. 6032,1985, Seiten 270-273-"Primary Structure of the Precursor to the three Major Surface Antigens ofPlasmodium Falciparum Merozoites" und EP-A1-0 154 454 beziehen sich auf Plasmodium falciparum-Merozoitenproteine und ihre mögliche Verwendung als Vakzinen gegen P. falciparum. Im Gegensatz dazu sieht die vorliegende Erfindung ein Hybridprotein vor, in dem ein Blutstadiumantigen (Merozoit) eines Plasmodiumparasiten zu einem Circumsporozoitenproteinantigen konjugiert ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Epitop" bezeichnet eine immunogene Determinante eines immunogenen Moleküls, wobei die immunogene Determinante eine Molekülkonfiguration aufweist, die imstande ist, eine schützende Immunreaktion in einem anfälligen Lebewesen hervorzurufen, wenn sie in einer geeigneten Form präsentiert wird.
Mit einer Vakzine, die ein solches Protein enthält, sind mehrere Vorteile verbunden. Im ersten Fall, sogar wenn die gegen das Sporozoitenstadium entstandene Immunreaktion versagt, wird die resultierende anfängliche Blutinfektion sehr starkt abgeschwächt sein, was eine stärkere Bekämpfung und Unterdrückung des Parasiten durch Antikörper gegen dieses Stadium ermöglicht. Diese Sekundärreaktion könnte sonst durch unverminderte Zahlen von angreifenden Parasiten überschwemmt werden. Da jeder Sporozoit, der eine Leberzelle erfolgreich angreift, zu mehreren Zehntausenden von Merozoiten Anlass gibt, wenn der Leberschizont aufplatzt, hat sogar eine mässige Verminderung der Sporozoitenlebensfähigkeit eine dramatische Wirkung auf die anfängliche Blutstadiuminfektion.
Zweitens könnte Vakzinationsdruck zu antigener Veränderung am Parasiten führen, was eine monovalente Vakzine unwirksam macht. Die Wahrscheinlichkeit, die mit einem solchen zweimal auftretenden Fall verbunden ist, eine bivalente Vakzine unwirksam zu machen, ist unendlich klein.
Weitere Vorteile einer Vakzine, die ein Protein gemäss der vorliegenden Erfindung enthält, ergeben sich aus : Reinigung - eine bivalente Vakzine, die zwei getrennte Proteine aufweist, würde zwei getrennte Reinigungen erfordern, was die Chancen des Verbleibens einer unerwünschten Verunreinigung verdoppelt ; Produktion-es muss nur ein Organismus zum Synthetisieren des einen Proteins kultiviert werden, anstatt zwei, was die Verdopplung der Einrichtungen erfordern würde, und ; Vorteile für den Empfänger - eine weitere (oft bakterielle) Proteinsequenz ist ein unerwünschter, aber gewöhnlich unvermeidbarer Teil jedes Rekombinationsproteins und sollte auf einem Minimum gehalten werden. Wenn nur ein Protein notwendig ist, ist die Anwesenheit von weiterer Sequenz vermindert.
Gemäss einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Rekombinationskonjugatprotein, wie oben beschrieben, vor, worin die Plasmodium-Art P. falciparum ist.
P. falciparum ist der häufigste Grund von akuter Malaria und ist die Art, gegen welche Reisende Schutz benötigen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Rekombinationskonjugatprotein, wie oben beschrieben, vor, worin die Blutstadiumantigenkomponente P. 195 ist.
Wie oben beschrieben, haben Versuche gezeigt, dass P. 195 imstande ist, Immunität gegen Malaria zu induzieren, wenn es als Vakzine verabreicht wird. Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Rekombinationskonjugatprotein, wie oben beschrieben, vorgesehen, worin die Blutstadiumantigenkomponente ein natürlich vorkommendes Fragment von P. 195 ist, insbesondere das 42kD Fragment und insbesondere das C-terminale Ende des 42kD Fragments.
Wie in der EP-A1-0 154 454 beschrieben, wird P. 195 in vivo in verschiedene Fragmente mit Grössen von etwa 83kD, 42kD und 19kD gespalten. Insbesondere scheint das 42kD-Fragment mit einer schützenden Immunreaktion assoziiert zu sein, insbesondere Sequenzen, die von dessen C-Terminus stammen.
Die Erfindung sieht weiter ein Rekombinationskonjugatprotein, wie oben beschrieben, vor, worin die kürzeste Sequenz, die ein CSP-Epitop enthält, au der Gruppe A (n+l), A (n) B, BAB, ABA, Ba (n) gewählt ist, worin A Asn-Ala-Asn-Pro bedeutet, B Asn-Val-Asp-Pro darstellt und n eine ganze Zahl > 2 ist.
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Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen Proteine in Form einer Vakzine präsentiert. Somit sieht die vorliegende Erfindung gemäss einer anderen Ausführungsform ein Protein, wie oben beschrieben, in Form einer Vakzine vor.
Es ist klar, dass auch in der DNA-Sequenz, die zum Codieren irgendeines oben beschriebenen Proteins erforderlich ist, eine Erfindung liegt.
Somit sieht die vorliegende Erfindung auch eine DNA-Sequenz vor, die eine Protein, wie oben beschrieben, codiert.
Die DNA-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann natürlich vorkommenden Sequenzen entsprechen, die die gewünschten Antigene codieren, oder sie kann einer mutierten Form derartiger Sequenzen entsprechen, wobei mögliche Mutationen einzelne oder mehrfache Basensubstitionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen umfassen, wobei aber die Sequenzen in jedem Fall immer, entweder im positiven oder negativen Sinn, zumindest ein Epitop jeweils des CSP und eines Blutstadiumantigens codieren.
Die DNA-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann ein Peptid von grösserer oder kleinerer Länge als jedes gewünschte Peptidfragment codieren, da DNA-Manipulationstechniken nicht unbedingt zweckmässig zu DNA-Sequenzen führen, die den gewünschten Peptiden entsprechen. So muss beispielsweise eine DNA-Sequenz, die im wesentlichen ein Fragment von P. 195 codiert, nicht die ersten 30 Aminosäuren des Fragments codieren oder kann andererseits auch die letzten 30 Aminosäuren des vorhergehenden Fragments (wo relevant) codieren.
Gemäss einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch ein nicht-pathogenes Virus vor, das mit einer DNA-Sequenz gemäss der Erfindung versehen ist. Dieses kann zum Vorsehen von Immunität gegen Malaria in einem anfälligen Wirbeltierwirt verwendet werden.
Eine derartige Immunität entsteht nach Infektion des Wirts durch das Virus, wodurch das Virus repliziert, wobei die Proteine gebildet werden, die es codiert einschliesslich das Protein gemäss der Erfindung. Die Freisetzung von Virionen aus der Zelle ermöglicht auch die Freisetzung des Immunproteins, womit effizient Immunität hervorgerufen wird und keine kostspielige Vorsynthese von Protein erforderlich ist, sondern blosses Züchten des Virus.
Die Erfindung sieht auch ein nicht-pathogenes Virus, wie oben definiert, vor, das weiter imstander ist, Immunität gegen (eine) andere Infektion (en) vorzusehen, und das gemeinsam oder einzeln zusammen mit irgendeiner anderen Vakzine verabreicht werden kann.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung sieht einen Expressionsvektor vor, der eine DNA-Sequenz gemäss der Erfindung, die tandemartig mit einem amino-terminalen Codierungsteil eines Gens verknüpft ist, das durch einen Wirt translatierbar ist, und gegebenenfalls (eine) damit verbundene Kontrollsequenz (en) enthält
Gemäss einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein vorgesehen, das ein Wirtspeptid und ein Rekombinationskonjugatprotein, wie oben beschrieben, umfasst.
Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionsvektor vorgesehen, der ein Gen umfasst, das in einem geeigneten Wirt zur Translation imstande ist, gegebenenfalls mit relevanten Kontrollsequenzen versehen ist, in welche eine DNA-Sequenz gemäss der Erfindung insertiert ist, die derart geeignet verändert wurde, dass der Teil dieses Gens, der das Wirtspeptid codiert, zusammen mit der insertierten DNA bei Expression in einem geeigneten Wirt unter Bildung eines Fusionsproteins, wie oben beschrieben, korrekt translatiert wird.
Somit sieht die Erfindung weiter einen Vektor vor, der eine DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, enthält. Sie sieht weiters einen Expressionsvektor vor, der eine DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, die tandemartig mit einem Codierteil eines Gens verknüpft ist, das durch einen Wirt translatierbar ist, und gegebenenfalls (eine) damit verbundene Kontro11sequenz (en) enthält
Gemäss einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen, das das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Clonierungsvektor, der die DNA-Sequenz gemäss der Erfindung aufweist, und das Kultivieren der Wirtszelle zum Vorsehen von Expression eines Proteins, wie oben beschrieben, umfasst.
Gemäss einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor vorgesehen, der die DNA-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst
Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Vektor vorgesehen, der die DNA-Sequenz gemäss der Erfindung enthält und weiter eine oder mehrere Kontrollsequenzen zum Regulieren der Expression dieser DNASequenz enthält.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Synthetisieren eines Proteins, wie oben beschrieben, vorgesehen, welches Protein gegebenenfalls kovalent mit einer weiteren Peptidsequenz verknüpft ist, welches darin besteht, dass man a) eine cDNA oder genome DNA-Bibliothek von Plasmodium falciparum bildet, b) Proben für CSP und Blutstadiumantigen-DNA wählt und diese Proben radioaktiv macht, c) ein Mitglied oder Mitglieder dieser Bibliothek durch Anwendung dieser Proben auswählt und d) die so von der genannten Bibliothek gewählte DNA zum Transformieren eines geeigneten Wirtes verwendet, der zur Expression dieses Proteins verwendet werden kann.
Gemäss einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren zum Induzieren von Immunität gegen Malaria in einem anfälligen Wirbeltierwirt vorgesehen, welches die Verabreichung eines wirksamen Anteils einer Vakzine, wie oben definiert, an den Wirt umfasst
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Viren können als Wirte für die DNA-Sequenz gemäss der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise wird ein Stamm von Vaccinia-Virus (TK-), der nicht imstande ist, infizierten Zellen die Fähigkeit zu verleihen, auf Medien, die Hypoxanthin nicht enthalten, zu wachsen, zum Infizieren einer Gewebekultur verwendet. Die Gewebekultur kann dann mit einer DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, die mit einer TK+-genetischen Determinante verknüpft ist, transformiert werden.
Einige der nachfolgenden Virusnachkommen weisen eine derartige Transformationssequenz in Form von Inserts in ihren Genomen auf. Diese können dann durch ihre Fähigkeit, Gewebekulturzellen die Fähigkeit zu verleihen, auf Medien ohne Hypoxanthin zu wachsen, gewählt
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Rekombinationen gegen 5-Bromdesoxyuridin resistent. Derartige Zellen, so wie sie wachsen, werden dann weiter zur Bildung von Malariaantigen, beispielsweise durch Verwendung von menschlichem Immunserum, gewählt. Derartige Vaccinia-Stämme können dann zum Immunsieren von Säugern (einschliesslich Menschen), die für Malaria anfällig sind, verwendet werden, weil der neue Vaccinia-Stamm die Bildung eines immunogenen Malariaproteins bewirkt.
Es dürfte klar sein, dass derartige Vakzine auch leicht imstande sind, durch Einverleibung von relevanten Immunogenen Immunität gegen andere Infektionen vorzusehen, wie Pocken, Diphterie, Heptatitis B, Tollwut, Herpes simplex-Virus, Keuchhusten, HIV und dgl.
Die Insertion eines Stückes von Fremd-DNA in ein E. coli-Gen im richtigen Leserahmen ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, in welchem ein Teil der Aminosäuresequenz von E. coli-Gen stammt und ein Teil hievon von der insertierten DNA stammt. Geeignete Expressionsvektoren mit geeigneten Kontrollsequenzen und zweckmässigen Restriktionsstellen wurden konstruiert, die höhere Ausmasse an Expression von Fusionsproteinen ermöglichen.
So ermöglicht die Untersuchung der Restriktionsmappe des gewählten Expressionssystems und der zu exprimierenden Sequenzen zusammen mit einer Kenntnis des Translationsrahmens, dass spezifische DNAFragmente ohne weitere Manipulation in den Expressionsvektor verknüpft und exprimiert werden. Beispielsweise ist pWRL507 ein aus pAT153 und dem trpE-Gen konstruiertes Plasmid (Nichols et al., J. Mol. Biol. 146.
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eine Stelle innerhalb des trpE-Gens in der richtigen Orientierung, jedoch gewöhnlich im falschen Translationsrahmen geklont werden. Um Expression der insertierten Sequenz zu erzielen, kann ein synthetischer Linker von geeigneter Länge in die Restriktionsstelle zwischen dem trpE-Gen und dem Insert insertiert werden, um ein Expression des Fusionsproteins im Rahmen zu erhalten.
Andererseits kann das die insertierte DNA enthaltende Plasmid an der einzigen Restriktionsstelle zwischen der bakteriellen und der insertierten DNA geöffnet werden und die DNA kurz mit dem Enzym Bal 31 behandelt werden, um einige wenige Basen von jedem Ende der linearisierten DNA zu entfernen. Nach Wiederherstellung mit dem grossen (Klenow) Fragment von DNAPolymerase 1 wird das Plasmid mit T4 Ligase rezirkularisiert und zum Transformieren von Bakterien verwendet.
Einer in drei der Transformanten soll die DNA-Sequenz im richtigen Leserahmen enthalten, um mit dem trpEGenprodukt als Fusionsprotein expromiert zu werden. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es klar, dass das Ausmass an Digestion mit Bal 31 die Endgrösse des exprimierten Fusionsproteins und die relativen Längen von trpE und der innerhalb desselben enthaltenen insertierten Sequenz bestimmen wird. Weiterhin erleichtern die Insertion eines synthetischen Linker während der Verknüpfung nach Bal 31-Digestion und Wiederherstellung die Analyse besonderer Stämme nach Transformation. Durch die vernünftige Anwendung von spezifischer Restriktionsenzymdigestion und Bal 31 Enzymbehandlung kann jeder spezifische Bereich eines Malariaproteinantigens als Fusionsprotein exprimiert werden.
Andererseits kann Nuclease S l, die bevorzugt einstrangige DNA abbaut, zum Abdigerieren des "klebrigen" Endes der Bgl II Restriktionsstelle verwendet werden, wobei ein "blunt" Ende verbleibt. Die Rezirkularisierung des Plasmids bringt dann die insertierte DNA in einen neuen und möglicherweise korrekten Leserahmen.
Eine alternative Methode zum Exprimieren von DNA-Fragmenten besteht in der Verwendung eines offenen Leserahmen (ORF)-Vektors, in welchen (gewöhnlich) kurze Stücke von DNA insertiert werden können, oft innerhalb der Sequenz, die die N-terminale Aminosäuresequenz eines E. coli-Proteins codiert. Die insertierte DNA muss keine Stopcodons im korrekten Translationsrahmen enthalten, in der richtigen Orientierung in bezug auf die Transkriptionsrichtung sein und an jedem Ende im richtigen Rahmen sein. Für DNA-Stücke von einer Proteincodierungssequenz, die durch eine Zufallsspaltungsmethode erzeugt wurde, beträgt die theoretische Wahrscheinlichkeit des Durchlesens im korrekten Rahmen 1 : 18. ORF-Vektoren auf Basis von ss-Galaktosidase wurden beschrieben (Koenen et al., EMBO. J. l, (1982), 509).
Die Insertion eines DNA-Stückes in eine Stelle am N-Terminus des Proteins im richtigen Rahmen verleiht Durchlese-Expression des ss-Galaktosidaseproteins, was durch Hydrolyse des chromogenen Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ss-D-galaktosid (Xgal) nachgewiesen werden kann. Wenn beispielsweise Xgal im Agar vorhanden ist, auf welchem die Kolonien gezüchtet werden, ergibt die Transformation eines geeigneten Wirtsstammes mit einem eine funktionelle ss-Galaktosidase exprimierenden Plasmid eine blaue Kolonie. Ein solcher Vektor, pXY460, enthält das ss-Galaktosidasegen unter
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der Kontrolle des tac-Promotors. Die Insertion von DNA in der Sma I Stelle nächst der EcoRI-Stelle kann das Gen zur Expression im Rahmen überführen.
Die Transformation eines E. coli-Wirtes, wie JM105, überführt die Bakterien in Ampicillinresistenz und Expression des Fusionsproteins kann in hohen Ausmassen durch den Zusatz von Isopropyl-ss-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) induziert werden.
Die wirtscodierte Sequenz in einem Fusionsprotein kann von diesem Fusionsprotein durch enzymatische oder chemische Spaltung der geeigneten Peptidbindung gespalten werden. Für den Fachmann auf dem Gebiet wird es durch Untersuchung der exprimierten Aminosäuresequenz klar sein, welche enzymatische oder chemische Spaltungsmethode angewandt werden soll. Durch Insertion eines synthetischen Oligonucleotid-Linker zwischen der Malaria-DNA-Sequenz und der bakteriellen Gensequenz im Fusionsproteinexpressionssystem kann eine geeignete Stelle für die enzymatische oder chemische Spaltung zwischen der Malariasequenz und dem Rest des exprimierten Fusionsproteins vorgesehen werden. Auf diese Weise können die Malariaproteinfragmente von den Wirtspeptiden weg gereinigt werden.
Die direkte Expression der Codierungssequenz für das oben beschriebene Protein kann erzielt werden, indem die insertierte DNA-Sequenz direkt nach einem AUG-Startcodon derart in den richtigen Leserahmen gebracht wird, dass das DNA-Insert die Codiersequenz ersetzt, die gewöhnlich durch den bakteriellen Kontrollbereich transkribiert und translatiert wird. Ein derartiger Kontrollbereich inkludiert einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle in der optimalen Position in bezug auf das Startcodon. Die zu exprimierende DNA-Sequenz kann durch die Anwendung von geeigneten Restriktionsstellen und, wenn notwendig, durch Verwendung eines geeigneten synthetischen Oligonucleotid-Linker korrekt positioniert werden.
Am Ende der Insert-DNA-Sequenz kann ein Stopcodon im richtigen Leserahmen insertiert werden, um Translation zu stoppen, und eine Terminatorsequenz zum Stoppen der Transkription kann zugesetzt werden. Die zu exprimierende insertierte DNA kann die gesamten Codierungssequenzen von CSP und Blutstadiumantigen oder die gesamte Sequenz, von der die amino-terminale Signalsequenz entfernt wurde, oder vorzugsweise Teile der Codiersequenzen entsprechend immunogenen Fragmenten der Proteine sein. Geeignete Fragmente können durch Restriktionsenzymdigestion eines geeigneten DNA-Klons (nach Untersuchung der Nucleotidsequenz) und, wenn notwendig, weitere Behandlung an einem oder beiden Enden mit Bal 31 zum Abdigerieren von Teilen der DNA-Sequenz auf kontrollierte Weise hergestellt werden.
Kontrollierte Digestion wird durch Wahl eines geeigneten Puffers, Temperatur, Reaktionszeit und Anteil an Enzym erzielt. In diesem Stadium kann ein geeigneter synthetischer Linker, vorzugsweise durch"blund-end" Verknüpfung mit dem Insert, zugesetzt werden, um ein AUG-Startcodon vorzusehen oder die Verknüpfung in den Expressionsvektor zu erleichtern.
Kontrollierte Expression jedes geklonten Fragments ist durch Verwendung der Sequenzen an jedem Ende der Sequenz oder durch Verwendung anderer, bereits bekannter Sequenzen möglich. Derartige Sequenzen inkludieren Promotoren und Verstärker. Beispiele derartiger Promotoren sind lac, trp, Bakteriophag pL und Hybrid trplac (tac). Geeignete Verstärker sind der SV40-Verstärker und der Verstärker aus Rinderpapillomavirus.
Der oben angegebene Vektor kann jeder geeignete Vektor sein, der zum Klonen der DNA geeignet ist und der zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden kann und dadurch das betreffende Protein exprimiert.
Derartige Vektoren umfassen Plasmide, Bakteriophage und Cosmide. Vektoren, die zum Klonen von cDNA verwendet werden können, sind pUC8, pUC9, pAT153, pBR325 und PBR328 zur Verwendung in Escherichia coli, pBD9 und pKT438 zur Verwendung in Bacillus subtilis, pMA56 zur Verwendung in Hefe und pAdD265V (A)-3, pSV2-dhfr, SVEHA3 und SVLKHAB zur Verwendung in Säugerzellen. Andere Vektoren können in anderen Expressionssystemen verwendet werden, beispielsweise Vacciniavirus und Baculovirus in einem Insektenzellensystem.
Vektoren zur Verwendung bei der Expression des betreffenden Proteins umfassen Kontrollsequenzen, wie oben erwähnt. Derartige Vektoren sind pXY460 und pWRL507 zur Verwendung in E. coli oder pSV2-dhfr zur Verwendung in Säugerzellen.
Beispiele geeigneter Wirtszellen zur Verwendung im oben beschriebenen Verfahren können prokaryotisch, wie Bakterien (beispielsweise E. coli HB101 und DH1, B. subtilis sp. BD170 und IH6140), oder eukaryotisch, wie Hefe (beispielsweise XV610-8C Hefezellen), Insekten- oder Säugerzellen (beispielsweise Affen CV-1-Zellen), sein.
Vakzinen gemäss der Erfindung umfassen zweckmässigerweise das genannte Protein zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Pharmazeutisch annehmbare Träger in diesem Falle sind flüssige Medien, die zur Verwendung als Vehikel zum Einführen des Antigens in den Patienten geeignet sind. Ein Beispiel eines derartigen Trägers ist Kochsalzlösung. Das Protein gemäss der Erfindung kann in Lösung oder als Feststoff im Träger suspendiert sein oder es kann durch Zusatz eines pharmazeutisch annehmbaren Detergens löslich gemacht sein.
Die Vakzine kann auch ein Adjuvans zum Stimulieren der Immunreaktion umfassen und dadurch die Wirkung der Vakzine erhöhen. Ein zweckmässiges Adjuvans zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Aluminiumhydroxid.
Zweckmässigerweise werden die Vakzinen so formuliert, dass sie eine Endkonzentration des Proteins im
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Formulierung kann die Vakzine in einen sterilen Behälter eingebracht werden, der dann verschlossen und bei niedriger Temperatur, beispielsweise 4'C, gelagert wird, oder gefriergetrocknet werden.
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Um in Wirbeltierwirten Immunität gegen Malaria hervorzurufen, können eine oder mehrere Dosen der geeignet formulierten Vakzine verabreicht werden. Es wird empfohlen, dass jede Dosis 0, 1 bis 2 ml, vorzugsweise 0, 2 bis 1 ml, am meisten bevorzugt 0, 5 ml, Vakzine ist.
Die Vakzinen können nach jeder herkömmlichen Methode für die Verabreichung von Vakzinen verabreicht werden einschliesslich oraler und parenteraler (z. B. subkutaner oder instramuskulärer) Injektion. Die Behandlung kann aus einer einzigen Dosis der Vakzine oder eine Vielzahl von Dosen über einen längerem Zeitraum bestehen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese hierauf beschränkt sein soll.
Beispiel l : Klonen und Sequenzen des CSP-Gens
Das CSP-Gen von P. falciparum wurde wie folgt geklont und sequenziert. Asynthetisches 21-mer Oligonucleotid, 5TGCATTTGGGTTTGCATTTGG3', entsprechend dem nicht-codierenden Strang der Asn-AlaAsn-Pro-Wiederholung wurde als Probe zum Isolieren des CSP-Gens aus P. falciparum verwendet. Genome DNA wurde mit Mungobohnennuclease in Anwesenheit von Formamid zum Erzeugen von Fragmenten von Gengrösse digeriert (Dame et al., supra) und Southern Blotting-Versuche unter Verwendung der Probe zeigten ein grösseres Hybridationsfragment von 1, 7 kb.
Digerierte DNA in diesem Grössenbereich wurde in den Vektor pUC9 verknüpft. Etwa 5000 Rekombinanten wurden erhalten und 8 von diesen ergaben ein starkes positives Signal, als sie mit der P-markierten Oligonucleotidprobe Screening unterworfen wurden. Die meisten dieser positiven Rekombinanten enthielten ein Insert von 1, 7 kb und eines, pCSP6, wurde weiter untersucht. Partielles "Restriktions-mapping"und Sequenzierung dieses Klons bestätigte, dass es das CSP-Gen enthielt. Der Bereich enthielt insgesamt 43 (37) A-Wiederholungen und 3 (4) B-Wiederholungen (die Ziffern in Klammer sind Nummern im veröffentlichen brasilianischen Stamm). Die Wiederholungen waren als ABABA15BA26 im
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eine kurze Länge flankierender Sequenz enthielt.
Dieses Fragment wurde mit BAL-31 behandelt, um die Enden zu randomisieren, mit Klenow poliert und in die Smal-Stelle des offenen Leserahmenvektors pXY460 verknüpft. Es wurden Konstruktionen erhalten, die die Wiederholungen als N-terminale Fusionen mit ss-Galaktosidase exprimieren. Die Induktion eines dieser Rekombinanten, pCSP 600/3, mit IPTG bildete ein Fusionsprotein mit einer scheinbaren Molmasse von etwa 140 000, nachgewiesen durch Anfärben von Zelllysaten mit CoomassieBlau nach SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Dieses Protein reagierte auch an einem Western-Blot mit einem monoklonalen Antikörper, der für das CSP spezifisch ist, und Antikörper gegen das synthetische Peptidträgerkonjugat, das in Beispiel 10 beschrieben ist, entstanden.
Die Sequenzen der Berührungspunkte des Inserts mit dem Plasmidvektor werden durch plasmid-geprimtes Sequenzieren bestimmt (Chen und Seeburg, DNA !, (1985), 165). In pCSP 600/3 ist das Insert Nucleotid 428 bis 1011.
Beispiel 3 : Klonen, Sequenzieren und Expression des P. 195-Gens
Diese Arbeit wurde im einzelnen in der EP-A1-0 154 454 und Nature, 317, (1985), 270, und Parasitology 21., (1987), 199, beschrieben. Mehrere weitere Fragmente, die vom P. 195 stammen, wurden am Merozoiten nachgewiesen und es wurde gefunden, dass die 19kd Art ein Subfragment darstellt, das vom C-Terminus der 42kd Art stammt. Weitere Fragmente von 38,30 und 28kd wurden festgestellt und ungefähr innerhalb der linearen Gensequenz lokalisiert.
Beispiel 4 : Wirkung von Antikörpern gegen P. 195 in einem vitro-Inhibierungstest : Identifizierung eines Bereiches des Proteins, der imstande ist, angriffsinhibierende Antikörper zu induzieren.
Teile des P. 195-Gens wurden in einen Expressionsvektor eingebracht, um entweder ss-Galaktosidase-oder Anthranilatsynthase-Fusionsproteine zu bilden (Holder et al., Parasitology (1987), supra). Die Fusionsproteine wurden zum Bilden von Antikörpern in Kaninchen verwendet. Eine Immunglobulinfraktion wurde aus den Sera hergestellt und in einer Endkonzentration von etwa 2 mg/ml in vitro-Kulturen von Plasmodium falciparum zugesetzt. Der Parasit wurde in RPMI 1650 ergänzt mit 8 % menschlichem Serum und menschlichem Erythrozyten bei einem Hämatokrit von 2 % und einer Ausgangsparasitämie von 0, 5 % Schizonten kultiviert.
Die Fähigkeiten der IgG-Fraktion zum Inhibieren von Merozoitenangriff wurde durch Zählen der Zahl von mit dem Parasiten befallenen roten Zellen in Giemsa-angefärbten Abstrichen nach einer Zeit von 24 h und Vergleichen dieser Zahl mit jener in einer Kontrollkultur, der kein Kaninchenantikörper oder Antikörper von einem nicht-immunisierten Lebewesen zugesetzt worden war, gemessen.
Lediglich Fusionsproteine, die die letzten (C-terminalen) 420 Aminosäuren der P. 195-Sequenz enthielten, induzierten Antikörper, die Angriff um bis zu 50 % inhibieren. Ein Fusionsprotein, das die letzten 100 Aminosäuren vor der hydrophoben Schwanzsequenz enthielt, induzierte Antikörper, die fast so wirksam waren wie jene, die die gesamten terminalen 420 Aminosäuren enthielten, siehe Tabelle I.
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Tabelle I Inhibierung von in vitro-Angriff durch Antisera, die gegen das Rekombinationsprotein gebildet waren
EMI7.1
<tb>
<tb> P. <SEP> 195 <SEP> Nucleotid- <SEP> % <SEP> Inhibierung
<tb> Plasmid <SEP> produzierend <SEP> Fusionsprotein <SEP> sequenz <SEP> über <SEP> 24 <SEP> h
<tb> pME1 <SEP> (507 <SEP> pPfgl <SEP> Ndel-EcoRI) <SEP> 876 <SEP> - <SEP> 3559 <SEP> < 5
<tb> pME2 <SEP> (507 <SEP> pPfc <SEP> 1028 <SEP> EcoRI-Hind <SEP> ill) <SEP> 3555 <SEP> - <SEP> 5920 <SEP> 25
<tb> pME3 <SEP> (507 <SEP> pPfc <SEP> 1028 <SEP> ECoRI-Nde <SEP> 1) <SEP> 3555 <SEP> - <SEP> 4759 <SEP> < 5
<tb> pue11 <SEP> (507/460 <SEP> pPfc <SEP> 1028 <SEP> Bam <SEP> Hl-Pst <SEP> 1/4) <SEP> 4043 <SEP> - <SEP> 5260 <SEP> 30
<tb> pME13 <SEP> (460 <SEP> pPfc <SEP> 1028 <SEP> Dde <SEP> 3-10) <SEP> 4926 <SEP> - <SEP> 5230 <SEP> 35
<tb> pME14 <SEP> (460 <SEP> pPfc <SEP> 1028 <SEP> Dde <SEP> 2-9)
<SEP> 3120-4910 <SEP> (ungef.) <SEP> < 5
<tb> pME15 <SEP> (507 <SEP> 1028 <SEP> EH <SEP> Bal <SEP> -4000 <SEP> - <SEP> 5920 <SEP> 50
<tb> pME16 <SEP> (507 <SEP> 1028 <SEP> EH <SEP> Bal <SEP> -4000 <SEP> - <SEP> 5920 <SEP> 20
<tb> pME <SEP> 17 <SEP> (507 <SEP> pPf <SEP> 1028 <SEP> EcoRI-Bam <SEP> H1) <SEP> 3559 <SEP> - <SEP> 4028 <SEP> 15
<tb>
Beispiel 5 : Vakziniation von Aotus-Affen mit Rekombinationsproteinen und Merozoiten-Schutz gegen Reizungsinfektion mit Hybridproteinen, die P. 195-Sequenzen enthalten. a) Zur Immunisierung verwendetes Material
Merozoiten wurden aus in vitro-Kulturen von P. falciparum (Freeman & Holder, J. Exp. Med. 158. (1983), 1647) hergestellt.
Die Fusionsproteinprodukte von zwei E. coli-Klonen, 507/460 pPfc 1028 BamHI-Pstl/4 (auch pME11 genannt) und 460 pPfc 1028 Dde 3-10 (auch pME13 genannt) wurden teilweise gereinigt. In 507/460 pPfc 1028 Bam Hl-Pst 1/4 ist das Fusionsprotein ein Hybrid mit dem trpE-Genprodukt und enthält Aminosäuren exprimiert von Nucleotide 4043 bis 5260 in der P. 195-Gensequenz (Holder et al., Nature 1985).
In 460 1028 Dde 3-10 ist das Fusionsprotein ein Hybrid mit ss-Galaktosidase und enthält von Nucleotiden 4926 bis 5230 exprimierte Aminosäuren. Die trpE-Fusion wurde aus Zelllysaten auf Basis ihrer Unlöslichkeit in einer Zahl von Extraktionspuffem gereinigt. Das Galaktosidasehybrid wurde durch Affinitätschromatographie gereinigt (Steers, Cuatrecases & Pollard, J. Biol. Chem. 246, (1971), 196). b) Immunisierungsprotokoll
Drei Gruppen von Tieren wurden verwendet : Gruppe l : Negative Kontrolle-0, 5 ml 0, 85 % ige Kochsalzlösung wurden mit Freunds-Adjuvans gemischt.
0, 2 ml/Tier (3 Tiere) wurden injiziert.
Gruppe 2 : Positive Kontrolle-Immunisierung mit ganzen Parasiten. Zwei Phiolen, die jeweils 4 x 109 Merozoiten in 0, 2 ml enthielten, wurden mit Kochsalzlösung auf 0, 5 ml gebracht und mit 0, 5 ml FreundsAdjuvans gemischt. 0, 2 ml (109 Merozoiten)/Tier (3 Tiere) wurden injiziert.
Gruppe 3 : Testgruppe-Immunisierung mit durch Rekombinations-DNA-Methoden gebildetem Testantigen.
Eine Lösung von 0, 6 ml enthaltend ungefähr 1, 2 mg jedes Fusionsproteins in Kochsalzlösung wurde mit 0, 6 ml Freunds-Adjuvans gemischt. 0, 2 ml/Tier (4 Tiere) wurden injiziert.
Die drei Tiergruppen wurden gemäss dem nachstehend angegebenen Schema immunisiert : Tag 0: Primäre Immunisierung mit Antigenen in Freunds komplettem Adjuvans, instramuskulär. 50 ill Blutprobe jedem Tier wurde zum Messen des Präimmunisierungsantikörpertiters entnommen.
Tag 14 : 50 fil Blutprobe wurde jedem Tier zum Messen des Antikörpertiters entnommen.
Tag 28 : Sekundäre Immunisierung mit Antigenen in Freunds inkompletten Adjuvans, intramuskulär.
Tag 42 : Tertiäre Immunisierung mit Antigenen in Freunds inkomplettem Adjuvans, intramuskulär. 50 til Blutprobe wurde jedem Tier zum Messen des Antikörpertiters entnommen.
Tag 48 : Spenderaffe wurde mit Plasmodium falciparum infiziert.
Tag 53 : 1 ml Blutprobe wurde jedem Affen (ausgenommen dem Spender) zum Testen entnommen.
Tag 62 : Reizinfektion durch intravenöse Injektion von mit Plasmodium falciparum infizierten AotusErythrozyten (105) vom Spender.
Tag 69 und danach : Dünne Blutabstriche wurden je nach Bedarf täglich oder alle zwei Tage genommen, bis sich die Affen erholten. Jene, die sich nicht erholten, wurden durch intramuskuläre Injektion von Chloroquin behandelt, als dieParasitämie 10 % überschritt.
Wenn angezeigt, wurden Serumproben genommen und auf ihre Antikörperspezifität analysiert. Jedes Serum wurde durch i) indirekte Immunofluoreszenz gegen acetonfixierte Abstriche von mit Parasiten befallenen roten Zellen, ii) Radioimmuntest (RIA), iii) Western-Blotting gegen gereinigtes P. 195 Protein (und spezifische Fragmente), Extrakte von
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Merozoiten und Extrakte von V ollblutstadiumfonnen, iv) ihre Fähigkeit, 35S Methionin-markiertes Protein aus Detergensextrakten von mit Parasiten befallenen Zellen zu immunpräzipitieren, Screening unterworfen.
c) Ergebnisse der Reizung
In Gruppe 1 gab es nachweisbare Parasiten in allen Tieren am Tag 7 und der Versuch wurde durch Verabreichung von Chloroquin an die Tiere 1 und 2 am Tag 13 und Tier 3 am Tag 18 nach Reizung beendet, als die Parasitämie in jedem Tier auf über 10 % stieg, beendet.
In Gruppe 2 bekämpfte ein Tier, Nr. 5, die Infektion erfolgreich, wobei die Parasitämie nicht über 1 % stieg, und vom Tag 29 an wurden in Blutabstrichen keine Parasiten nachgewiesen. Tier Nr. 6 zeigte einen Infektionsverlauf, der sich von den Kontrolltiere in Gruppe 1 nicht unterschied, und wurde mit Chloroquin am Tag 13 behandelt. Das dritte Tier (Nr. 4) schien eine schwere Infektion zu bekämpfen mit abnehmender Parasitämie an den Tagen 19 und 20, starb aber am Tag 22.
In Gruppe 3 versagten zwei Tiere, Nr. 9 und 10, bei der Bekämpfung der Infektion und hatten einen ähnlichen Infektionsverlauf wie die Tiere 1 bzw. 3 in der Kontrollgruppe 1. Die beiden übrigen Tiere, Nr. 7 und 8, bekämpften ihre Infektionen. Eine Spitzenparasitämie von 4 % wurde in Tier 7 am Tag 18 nach Reizung festgestellt und die Parasiten konnten in Blutabstrichen nach Tag 26 nicht nachgewiesen werden. In Tier 8 war eine Spitzenparasitämie von 2, 3 % am Tag 14 am Tag 22 überwunden. d) Analyse der Antikörperreaktion der immunisierten Tiere i) Immunfluoreszenz
Der Antikörpertiter gegen mit acetonfixierte Abstriche von mit P. falciparum infizierten roten Zellen wurde für Sera von den Tieren vor der Immunisierung und ungefähr 7 Tage nach der primären, sekundären und tertiären Injektion bestimmt.
In Gruppe l waren keine nachweisbaren spezifischen Antikörper bei der niedrigsten Serumverdünnung (1/50) in irgendeiner der Proben vorhanden. In Gruppe 2 wurden spezifische Antikörper nach primärer oder sekundärer Immunisierung nachgewiesen und der spezifische Titer schien nach der tertiären Immunisierung auf 1 : 800 (Tier 6), 1 : 1600 (Tier 4) und 1 : 3200 (Tier 5) zu steigen. In Gruppe 3 schien lediglich Tier 10 parasitenspezifische Antikörper (bei einem Titer von 1 : 100) nach dem Immunisierungsschema aufzuweisen. ii) Radioimmuntest
Die Serumproben von den Tieren nach der dritten Immunisierung wurden durch RIA auf ihre Reaktion auf gereinigtes P. 195 in einem Mikrotiterplattenversuch analysiert.
Sera von mit dem gereinigten P. 195 Protein und mit den einzelnen Rekombinationsproteinen immunisierten Kaninchen wurden als Kontrollen aufgenommen.
Etwas Antikörper (bei 1 in 25 Verdünnung) in den Sera von allen Tieren in den Gruppen 2 und 3 wurde nachgewiesen.
Als die Reaktion auf das gesamte trpE Fusionsprotein oder den ss-Galaktosidaseträger untersucht wurde, war klar, dass die Tiere in Gruppe 3 ausserordentlich gut auf den von E. coli stammenden Teil des Polypeptids angesprochen hatten. iii) Westem-Blotting
Die Antisera wurden durch Westem-Blotting unter Verwendung der folgenden Antigene analysiert : a) gereinigtes P. 195 Protein und spezifische Fragmente mit oder ohne vorherige Reduktion mit Dithiothreitol b) gesamt infizierte rote Zellen c) gesamte Merozoiten mit oder ohne vorherige Reduktion mit Dithiothreitol.
Alle Tiere in Gruppe 2 und 3 bildeten Antikörper, die gereinigtes P. 195 und das 150 kd Fragment erkannten ; die Tiere in Gruppe 2 bildeten auch Antikörper gegen die 110 und 83 kd Fragmente. In Extrakten von Schizonten reagieren die Antikörper von den Tieren in Gruppe 2 mit einer grossen Zahl von Polypeptiden, insbesondere Arten von 70 bis 80 000 kd. Diese Arten waren auch in den Merozoitenextrakten vorhanden. Die P. 195 und die 150 kd Art wurden durch die Antikörper in Sera der Gruppe 3 erkannt und weitere Arten von etwa 45 und 42 kd wurden durch die Sera von Tier 9 und 10 nachgewiesen. Diese Arten mit niedrigerer Molmasse stammen von C-Terminus des P. 195.
In Extrakten von Merozoiten gab es wenig Reaktion der Sera der Gruppe 3 mit irgendeinem der Antigene. iv) Immunpräzipitation
Als die Antisera zum Immunpräzipitieren von 35S-methioninmarkierten Polypeptiden von Extrakten von frühen intrazellulären Parasiten ("Ringen") oder asynchronen Parasiten verwendet wurden, wurde eine grosse Zahl von Polypeptiden durch die Tiere in Gruppe 2 erkannt. In Gruppe 3 schien in diesem Versuch nur Tier 10 für P.
195 spezifische Antikörper zu bilden.
Der durch Immunisierung mit dem Rekombinationsprotein erzielte Schutz war so gut wie jener, der erzielt wird, wenn der ganze Parasit als Immunogen verwendet wird. Die mit ganzen Merozoiten immunisierten Tiere bildeten Antikörper gegen ein Spektrum von Polypeptiden, während die mit den Rekombinationsproteinen immunisierten Tiere eine spezifische Reaktion auf P. 195 zu geben schienen.
In der Testgruppe wurde die Reaktion auf das P. 195 Antigen am deutlichsten durch Westem-Blotting nachgewiesen, eine Technik, die wahrscheinlich für den Nachweis von Antikörpern gegen "denaturiertes" Antigen empfindlicher ist Nur Tier 10 schien annehmbar gut zu reagieren, als es durch Immunfluoreszenz oder Immunpräzipitation getestet wurde, doch
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war dieses Tier nicht besser geschützt als andere Tiere in dieser Gruppe.
Beispiel 6 : Epitopanalyse der C-terminalen 292 Aminosäuresequenz des P. 195-Gens
B-Zellen, die Oberflächen IgM (und gegebenenfalls lösliche Immunglobulinmoleküle) exprimieren, erkennen Proteinepitope, die gewöhnlich sterisch exponiert sind und oft aus 5 bis 7 Aminosäuren zusammengesetzt sind, für welche ein eine Konformationsraumanordnung entscheidend ist. Es wurden Algorithmen zum Definieren von hydrophilen Bereichen von Proteinen (z. B. Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 18., (1981), 3824) zum Vorhersagen solcher Antigendeterminanten verwendet. Epitope, die von T-Zellen erkannt werden, sind oft linear und es wurde angenommen, dass sie eine amphipatische Helix bilden können (Delisi und Berofsky, Proc. Acad.
Sci USA 82, (1985), 7048), was eine Wechselwirkung mit grösseren Histokompatibilitätsproteinen der Klasse n auf der Oberfläche von antigenaufweisenden Zellen und dem spezifischen Rezeptor einer geeigneten T-Zelle ermöglicht. Die Aminosäuresequenz der P. 195 Komponente des Zybridproteins wurde durch sekundäre strukturprädiktive Algorithmen (z. B. gemäss Chou und Fasman, Biochemistry 13, (1974) 222) zum Identifizieren von potentiellen Helixstrukturen untersucht. Alfa-Helixstruktur wurde für die Reste 1350-1363,1385-1402, 1417-1445,1451-1476, 1492-1528,1532-1540, 1548-1561,1583-1591 und 1628-1640 vorhergesagt.
Als diese Bereiche unter Anwendung der Hydrophilitätsvorhersagen von Hopp und Woods, weiter geprüft wurden, waren die Bereiche 1350-1363,1532-1540, 1548-1561 und 1583-1591 mässig oder stark hydrophil, während von den anderen Bereichen (mit Ausnahme von 1628-1640, der sehr hydrophob ist) vorhergesagt wurde, dass sie amphipathische Helices sind, d. h. Sequenzen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie weder stark hydrophil noch stark hydrophob sind, und in welchen es eine Abtrennung von hydrophoben und hydrophilen Resten zu gegenüberliegenden Seiten der Helix gibt (eine Wendel der Helix stellt 3, 6 Reste dar, d. h. 1000 Drehung pro Rest).
Daher kann vorhergesagt werden, dass potentielle Helixsegmente 1350-1363,1532-1540, 1548-1561 und 1583-1591 die ganzen B-Zellenepitope oder ein Teil derselben sein können, die von Antikörpern erkannt werden, während die Helixsegmente 1385-1402,1417-1445, 1451-1476 und 1492-1528 potentielle T-Zellenepitope bilden, die imstande sind, von einer T-Zelle mit dem geeigneten Rezeptor erkannt zu werden, wenn sie in Verbindung mit einem grösseren Histrokompatibilitätsprotein der Klasse II präsentiert werden.
Beispiel 7 :
Expression von CSP/P. 195 Fusionsproteinen in E. coli a) Typ/CSP trpE P. 195 Hybride
Etwa 2 pu DNA der Plasmide pfOltrp75, pfOltrp77 und pfOltrp750 (A.J. Makoff; Publikation beantragt) wurden mit den Restriktionsenzymen BamHl und Hind ICI unter Anwendung von Bedinungen, die vom Hersteller vorgeschlagen werden, digeriert und dann durch ein 0, 8 % Agarosel in einem Trisborat-EDTA-Puffer enthaltend Äthidiumbromid Elektrophorese unterworfen. Die DNA-Fragmente wurden durch UV-Beleuchtung sichtbar
EMI9.1
einem Plasmid, das das EcoR1Hind in-Fragment von pPfc1028 enthielt (Nucleotide 3555 bis 5920 in Holder et al., Nature, 317 (1985), 270), durch Digerieren dieses Plasmids mit Xho n und Hind III herausgeschnitten.
Vier Mikrogramme von DNA wurden mit 8 Einheiten Xho II in 50 gl Xho II Puffer bei 37 C während 3 1/4 h digieriert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 0, 5 pJ 5M NaCI und 20 Einheiten Hind III zugegeben und die Digestion 2 h lang fortgesetzt. Die digerierten DNA- Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0, 8 % Agarosegel getrennt. Ein 1462bp-Fragment (Nucleotide 4459 bis 5920), das die Codiersequenz für die C-terminalen 293 Aminosäuren enthielt (vom Rest 1348), wurde eluiert und gereinigt
Aliquote Anteile des Xho n-Hind M-Fragments wurden mit dem Bami-hind IM-Fragment der Vektoren gemischt und mit T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 10 p. l Verknüpfungspuffer behandelt. Die Verknüpfungsmischung wurde zum Transformieren kompetenter DHI-Zellen verwendet.
Eine 4- bis 50-fache Stimulierung in der Zahl von Transformanten im Vergleich mit dem Vektor DNA Selbstverknüpfungskontrollen wurde festgestellt. Transformanten wurden analysiert, um festzustellen, ob sie die korrekten Plasmide mit der insertierten DNA enthalten. Eine Probe von ungefähr 1 pg Plasmid-DNA von einem Klon jeder derselben wurde mit BamH1 an der einzigen BamHl-Stelle (durch die Verknüpfung des BamHl klebrigen Endes mit dem Xho II klebrigen Ende) in Anwesenheit von 0, 5 pal (12 Einheiten) Kälberintestinalphosphatase digeriert. Nach Digestion während 2 h bei 37 C wurden die linearisierten Plasmid-DNAs durch ein 0, 8 % Agarosegel Elektrophorese unterworfen und dann eluiert und gereinigt pCSP600/3 wurde über Nacht in 10 ml LB Medium enthaltend 100 go (mol Ampicillin gezüchtet.
Die Plasmid-DNA wurde hergestellt und dann mit EcoR1 und BamHl (48 Einheiten jedes Enzyms) in 100 ; il BamHl Digestionspuffer 2 h bei 37 C digeriert. Die digerierte DNA wurde durch ein 0, 78 % Agarosegel Elektrophorese unterworfen und das 583 bp Fragment wurde eluiert und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit Xho II (2, 5 Einheiten) in einem Endvolumen von 20 gel 2 h bei 37 C weiter digeriert.
Die Digestionsprodukte wurden auf einem 2 % Agarosegel Elektrophorese unterworfen und zwei Fragmente, jene von 348 bp und 192 bp, wurden gereinigt
Aliquote Anteile sowohl des 348 bp als auch des 192 bp Fragments wurden mit dem BamH1linearisierten,
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phosphatasebehandelten Vektoren in einem Endvolumen von 10 J. Ú Verknüpfungspuffer und 03 il T4 Ligase bei 4 C während 65 h und bei 150 C während 2 h gemischt. Die verknüpfte DNA wurde zum Transformieren kompetenter DH1-Zellen verwendet. Einzelne Klone wurden in Übemachtkulturen gezüchtet und die PlasmidDNA in jeder wurde durch Restriktionsenzymdigestion analysiert.
Aliquote Anteile der Übernachtkulturen wurden auch 1 : 5 in LB-Medium enthaltend 100 g/ml Ampicülin und 10 gg/ml Indolacrylsäure zum Induzieren von Expression vom trp Promotor verdünnt Nach 5 h wurden diese Kulturen durch Zentrifugieren geerntet, und die Zellpellets wurden in einem Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltenden Puffer gelöst.
Proteine, die in den Zelllysaten vorhanden waren, wurden durch Elektrophorese in 10 % Polyacrylamidgelen in Anwesenheit von SDS abgetrennt, und dann wurden die Proteine entweder mit Doomassie-Blau angefärbt oder in Nitrozellulose transferiert Die transferierten Proteine wurden mit Antikörpern, die für das CSP oder P. 195 spezifisch sind, sondiert. Es wurde eine Reihe von Rekombinanten erhalten, die Plasmide enthielten, welche Fusionsproteine exprimieren, die mit beiden Antisera reagieren. Diese Fusionsproteine enthielten entweder die
EMI10.1
Fragments enthielten, erhalten wurden. Die Molmasse der Fusionsproteine, bestimmt aus der PlyacrylidgelElektrophorese, wird mit der berechneten Molmasse in Tabelle III verglichen.
E-coli-Stamm 750/CSP (a)/P. 195 wurde bei National Collection of Type Cultures hinterlegt und als NCTC 11952 registriert b) Verkürzte trpE/CSP/P-195 Hybride
EMI10.2
die von trpE stammende Aminosäuresequenz codiert, 440 bp von der Eco Rl-Stelle und 150 bp vom Berührungspunkt mit der CSP-Wiederholungssequenz. Zum Bilden von Fusionsproteinen, die weniger von dieser Sequenz enthalten, wurde das Plasmid an dieser Stelle durch mit Bal 31 digeriertes Restriktionsenzym geöffnet und dann wieder verknüpft. Expression von Protein im korrekten Leserahmen wurde durch Western-Blotting von Zelllysaten festgestellt.
10 gag des Plasmids 750/CSP (a)/P. 195 wurden bis zur Vollendung mit dem Enzym Tth III 1 digeriert. Das linearisierte Plasmid wurde mit der Exonuclease Bal 31 30, 60 und 120 s behandelt, mit DNA-PolymeraseKlenowfragment wiederhergestellt und dann mit T4 Ligase bei 4 C über Nacht rezirkularisiert Die DNA wurde zum Transformieren von DH 1 Zellen verwendet und ampicillinrestistente Klone wurden auf Agarplatten selektiert. 60 einzelne Stämme wurden genommen und die Plasmide wurden durch"Restriktions-mapping"mit Eco Rl und Bam Hl analysiert Plasmide von Interesse enthielten das Bam Hl Fragment von 348 bP, das die CSP-Wiederholung codiert, und ein kleineres Eco R1-Bam HI Fragment, das die aminosequenz-terminale trpE Sequenz codiert.
Stämme, die diese Plasmide enthielten, wurden weiter durch Westem-Blotting von Zelllysaten analyisiert. In den Stämmen 750/CSP (a)/P. 195 Tth 1111 Bal 31 6a, 4b, llb und 12b wurde das Eco Rl-Bam Hl Fragment bei 235,350, 330 bzw. 320 bp kalkuliert im Vergleich mit einem 591 bp Fragment im Eltern
EMI10.3
(a) ! p. 195 Plasmid.entfernt worden. c) CSP/P-195 Hybride mit minimaler weiterer Sequenz
EMI10.4
Sequenz. Expression dieser Konstruktion (CSP 600 (3/P-195) führt zu einer einzigen Proteinart, die vom tac Promotor gesteuert wird, der Epitope sowohl des CSP (46 Wiederholungen) als auch des P. 195 Proteins enthält.
Das Plasmid 750/CSP (a)/P. 195 (20 gag) wurde mit 40 Einheiten Sal 1 3 h bei 37 C digeriert. Nach Äthanolausfällung wurde die DNA wieder in Puffer gelöst und dann mit 36 Einheiten Bam Hl Enzym 7 min bei 37 C digeriert. Die Produkte wurden auf einem 0, 8 % Agarosegel fraktioniert und das partielle Digestionsfragment des 2431 Basenpaares wurde eluiert und durch Binden an eine Elutip-Säure gereinigt. Das Plasmid pXY461 (16 J. l. g) wurde mit 40 Einheiten Sal 13 h bei 37 C und dann mit 36 Einheiten BamHl 3 h bei 37 C digeriert. Die Produkte wurden durch Agarose Elektrophorese unterworfen, und das 3253 pb Fragment wurde eluiert und gereinigt.
Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4 Ligase verknüpft und dann
EMI10.5
und X-gal enthaltendes Agar plattiert und weisse Kolonien, die von Stämmen stammen, in welchen das Galaktosidasgen im Plasmid verloren gegangen war, wurden genommen und analysiert 10 von 12 genommenen Stämmen enthielten Plasmide mit der korrekten Konstruktion, in welchen dem tac Promotor ein offener Leserahmen folgt, der die Aminosäuresequenz
EMI10.6
<Desc/Clms Page number 11>
(NANP) Tabelle II
Vorhergesagte Struktur der Expressionsprodukte Stemm trpe Sequenz/CSP-Sequenz/C-terminale Sequenz von P.195
EMI11.1
<tb>
<tb> 35 <SEP> 1348
<tb> 77/CSP <SEP> (a)/P.195 <SEP> ...RPAT/DP(NANP)26NKNNQGNGQG/DPYK....
<tb>
116 <SEP> 1348
<tb> 750/CSP <SEP> (a)/P. <SEP> 195... <SEP> DEDA/DP <SEP> (NANP) <SEP> NKNNQGNGQG/DPYK....
<tb>
131 <SEP> 1348
<tb> 75/CSP <SEP> (a)P.195 <SEP> ...RLLQ/DP(NANP)26NKNNQGNGQG/DPYK....
<tb>
35 <SEP> 1348
<tb> 77/CSP <SEP> (b)/P.195 <SEP> ...RPAT/DP(NANP)15NV/DPYK....
<tb>
116 <SEP> 1348
<tb> 750/CSP <SEP> (b)/P.195 <SEP> ...DEDA/DP(NANP)15NV/DPYK....
<tb>
131 <SEP> 1348
<tb> 75/CSP <SEP> (b)/P.195 <SEP> ...RLLQ/DP(NANP)15NV/DPYK....
<tb>
116 <SEP> 1348
<tb> 750/CSP <SEP> (b2)/P.195 <SEP> ...DEDA/DP(NANP)15NVDP(NANP)15NV/DPYK....
<tb>
116
<tb> 750/CSP <SEP> (b4)/P.195 <SEP> ...DEDA/DP(NANP)15NVDP(NANP)15NVDP(NANP)15
<tb> 1348
<tb> NVDP <SEP> (NANP) <SEP> igNV/DPYK.... <SEP>
<tb>
CSP600/3/P.195 <SEP> MNSHPNANPNVDPNANPNVDP <SEP> (NANP)15NVDP(NANP)26
<tb> 1348
<tb> NKNNQGNGQG/DPYK....
<tb>
1348
<tb> 461/CSP <SEP> (a)/P.195 <SEP> MNSPSMG/DP(NANP)26NKNNQGNGQG/DPYK....
<tb>
Die Sequenzen sind im Standard-Einbuchstabencode für Aminosäuren angegeben. Die Berührungspunkte zwischen den verschiedenen Elementen (/) sind angezeigt und die Numerierung gibt den Aminosäurerest in der trpE- und in der P. 195-Sequenz an.
Tabelle m
Molmassen der Fusionsproteine
EMI11.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> brechnete <SEP> Masse <SEP> scheinbare <SEP> Masse <SEP> (SDS-PAGE)
<tb> 77/CSP <SEP> (a)/P. <SEP> 195 <SEP> 49 <SEP> 276 <SEP>
<tb> 750/CSP <SEP> (a)/P. <SEP> 195 <SEP> 57 <SEP> 752 <SEP> 62 <SEP> 000 <SEP>
<tb> 75/CSP <SEP> (a)/P. <SEP> 195 <SEP> 59 <SEP> 501 <SEP> 62 <SEP> 500 <SEP>
<tb> 77/CSP <SEP> (a)/p. <SEP> 195 <SEP> 44 <SEP> 122 <SEP> 47000 <SEP>
<tb> 750/CSP <SEP> (b)/P. <SEP> 195 <SEP> 52 <SEP> 598 <SEP> 54 <SEP> 000 <SEP>
<tb> 75/CSP <SEP> (b)/P. <SEP> 195 <SEP> 54 <SEP> 347 <SEP> 54 <SEP> 000 <SEP>
<tb> 750/CSP <SEP> (b2)/P. <SEP> 195 <SEP> 58 <SEP> 963 <SEP> 66 <SEP> 000 <SEP>
<tb> 750/CSP <SEP> (b4)/P. <SEP> 195 <SEP> 71693 <SEP> 93 <SEP> 000 <SEP>
<tb> CSP600/3/P. <SEP> 195 <SEP> 53 <SEP> 735 <SEP>
<tb> 461/CSP <SEP> (a)/P.
<SEP> 195 <SEP> 46 <SEP> 096 <SEP> 49 <SEP> 500 <SEP>
<tb>
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Beispiel 8:
Expression von CSP/P. 195 durch Rekombinations-Vaccinia-Virus a) Konstruktion von Plasmid pPfc1028 PD/SV40
Ein Pst 1-Dra 1 Fragment umfassend Nucleotide 5271 bis 5338 in der P. 195 Nucleotidscquenz (Holder et al., Nature, 1985) wurde in das Plasmid pUC 9 geklont, das mit Pst 1 und Hind II digeriert worden war. Die "blunt- ended" Verknüpfung schafft wieder ein Stopcodon (TGA) an der Stelle des TAA-Stopcodons, das Teil der Dra 1 Erkennungsstelle ist, und einer der Stämme wurde gewählt und pPfc1028PD-1 genannt.
DNA von pPfc1028PD-l wurde mit BamHl an der einzigen Stelle digeriert und dann mit einem von SV40 Virus DNA stammenden Bam Hl-Bgl II-Fragment, das eine Terminationssequenz enthält (Subramani et al.,
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Cell BioI1 : 854, 1981),verwendet Die Plasmid-DNA in sechs ampicillinresistenten Stämmen wurde durch"Restriktions-mapping"unter Verwendung von Pst 1 und Bam H1 analysiert. Drei der sechs Klone enthielten die SV40 Terminationssequenz in der korrekten Orientierung, der Rest enthielt die Sequenz in der entgegegesetzten Richtung. Eine der korrekten Konstruktionen wurde gewählt und pPfc1028 PD/SV40 genannt. b) Expression des CSP/P. 195 Hybrids durch Vaccinia-Virus DNA, die das CSP/P. 195 Hybrid codiert, wurde
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al. in Vaccines 86. New approaches to immunization, Herausg. F. Brown, R.
M. Channock und R. A. Lemer, S.
303-309 ; Newton et al. in Vaccines 87. Modern approaches to new vaccines, in Druck). DNA, enthaltend einen offenen Leserahmen und in richtiger Orientierung in die einzige Eco R l Stelle insertiert, wird unter der Kontrolle des pl1k Promoters transkribiert und in die Proteinsequenz in einer rekombinieren vaccinia-infinizierten Zelle translatierL
Es wurde eine Dreifragmentverknüpfung durchgeführt. Plasmid pVpl1k (4 gg) wurde mit Eco R1 (10 Einheiten) zusammen mit 12, 5 Einheiten Kälberintestinalphosphatase 5 h bei 370 C digeriert. Das linearisierte dephosphorylierte Plasmid wurde durch ein Agarosegel Elektrophorese unterworfen, elektroeluiert und dann gereinigt.
Plasmid 461/CSP (a)/p. 195 (2, 6 Ilg) wurde mit Eco R1 und Pst 1 digeriert und das Fragment enthaltend den Codierungsbereich für die CSP-Wiederholungen zusammen mit dem P. 195 Codierungsbereich zur Pst 1 Stelle wurde digeriert. DNA für den Rest der P-195 Codierungssequenz zusammen mit der SV40 Terminationssequenz wurde durch Digestion des Plasmids pPfc 1028 PD/SV40 mit Pst l und Eco R1 erhalten.
Diese drei Fragmente wurden mit T4 Ligase verknüpft, und die Produkte wurden zum Transformieren von DH 1 Zellen verwendet. 42 Kolonien wurden durch"Restriktions-mapping"von Plasmid-DNA mit Eco R 1 + Pst 1 mit Cla 1 und mit Bam H 1 untersucht. Vier dieser Stämme enthielten alle drei Fragmente in der korrekten Orientierung. Einer derselben, pVpllk/CSP (a)/P. 195 wurde für weitere Analyse gewählt. Der offene Leserahmen ist der gleiche wie jener in 461/CSP (a)/P. 195. Vaccinia-Rekombinanten wurden unter Anwendung der von Mackett et al. beschriebenen Methoden erhalten (J. Virology 49, (1984), 857) erhalten. Die gereinigte PlasmidDNA wurde zum Transfizieren CV-1 Zellen, die mit Vaccinia-Virus infiziert waren, verwendet.
Selektierte Virusplaques, die 5-brom- desoxyuridin-resistent waren, wurden analysiert und 6 von 12 derselben exprimierten ein Protein, das mit spezifischen Antikörpern reagierte (entstanden gegen das CSP Peptid-BSA-Konjugat, P. 195 und exprimierte Produkte von PME2 und 750/CSP (a)/P. 195) aufWestem-Blots von Zelllysaten.
Beispiele
Expression von CSP/P. 195 Fusionsproteinen durch Rekombinationsbaculoviren in Insektenzellen.
Das Plasmid pAc 360 (Smith et al., Mol. Cell. BioI. , (1983), 2156) enthält DNA, die die ersten 11 Aminosäuren von Polyhedrin codiert, gefolgt von einem synthetischen Bam H1 Linker und dann der Polyhedrinsequenz 3'der natürlichen Bam H1 Stelle bei +177 bezogen auf den Initiator ATG. Es wurde bis zur Beendigung an dieser einzigen Bam Hl Stelle digeriert und dann mit einem 1461 pb Xho II Fragment von einem
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war.
Diese bildete das Plasmid pAc 360 195c, das den Codierungsbereich für die Aminosäuresequenz MPDYSYRPTIGP/DPYK..... enthält (Polyhedrin N-Terminus/292 Aminosäuren vom P. 195 C-Terminus). pAc 960 enthält DNA, die die ersten 11 Aminosäuren von Polyhedrin codiert, gefolgt von einem synthetischen Bam H 1 Linker, der nahe dem Ende des offenen Leserahmens von Polyhedrin verknüpft ist Dieses Plasmid wurde mit H 1 digeriert und dann mit zwei Bam Hl-Pst 1 Fragmenten verknüpft, wovon eines das Pst 1Bam H1 Fragment war, das vom Plasmid pPfc 1028 PD-1 stammt (Beispiel 8), und das andere das Pst 1-partielle Bam Hl 1158 bp Fragment von 750/CSP (a)/P. 195 enthaltend die CSP Wiederholungscodierungssequenz und von der Xho n Stelle zur Pst 1 Stelle im P. 195 Gen war.
Dies erzeugte ein Plasmid pAc CSP (a)/p. 195 3', in welchem dem Polyhedrinpromotor die Codierungssequenz für MPDYSYRPTIGP/DP (NANP) 26NKNNQGNGQGDPY.... folgt (Polyhedrin/CSP Wiederholung/P. 195 CTerminus). pAc 360 195c und pAc CSP (a)/P. 195. 1\3' wurden mit Eco RI und Pst l digeriert und zum Konstruieren von pAc CSP (a) 195c verwendet. In dieser Konstruktion ist der dem Polyhedrinpromotor folgende offene Leserahmen
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identisch mit jenem in pAc CSP (a)/p. 195 l13'und die 3'nicht-translatierte Sequenz vom P. 195 Gen ist vorhanden.
Diese Plasmide wurden unter Anwendung der von Smith et al. (supra) beschriebenen Methoden zum Erzeugen von Rekombinationsbaculoviren verwendet. Okklusionsnegative Plaques wurden durch visuelles Screening identifiziert und Viren wurden durch Southern-Blotting analysiert. Exprimierte Proteine wurden durch Anfärben mit Coomassie-Blau nach SDS-PAGE und durch Western-Blotting mit spezifischen Sera nachgewiesen.
Beispiel 10:
Synthese eines Peptids entsprechend einem Teil der CSP-Wiederholung und dessen Konjugation mit einem Trägerprotein.
Ein Peptid wurde durch die Festphasentechnik (Merrifield et al., Ann. Rev. Biochem. 39, (1970), 841) mit der Sequenz (S-Acetamidomethyl) cystein- (Asn-Ala-Asn-Pro) 4-Asn-Ala synthetisiert und unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids an succinyliertes Rinderserumalbumin gekoppelt. 200 nMol (71, 5 mg) succinyliertes Rinderserumalbumin wurde mit 10 ,mol (19,6 mg) Peptid in 2 ml 0, 1 M Natriumphosphat, pH 4, 75, gemischt. 20 pol (3, 8 mg) 1-Äthyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid wurden zugesetzt und die Lösung 16 h bei 22 C stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 3 ml 1M Natriumacetat, ausgedehnte Dialyse gegen 1 %ige Essigsäure und Gefriertrocknen beendet.
Beispiel 11 :
Reinigung der in E. coli gebildeten Fusion.
Die durch die Stämme 750/CSP (a)/P. 195 (NCTC 11952), 750/CSP (b)/P. 195 und 750/CSP (b2)/P. 195 gebildeten Fusionsproteine wurden wie folgt partiell gereinigt.
Relativ reine Präparate der einzelnen Fusionsproteine wurden aus Zelllysaten hergestellt. Eine einzige Kolonie von einem Stamm wurde über Nacht bei 37 C in 100 ml M9 Medium enthaltend 50 tig/ml Ampicillin gezüchtet. Am folgenden Tag wurde die Übemachtkultur mit 400 ml M9 Kulturmedium enthaltend 50 gg/ml
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0,PMSF und 1 % NP40 gewaschen. Das Material wurde 10 min bei 20 000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde zurückbehalten (S2). Das Pellet wurde in 10 ml 50 mM Tris-HCI, pH 8, 1, 5 mM EDTA und 0, 5 KSCN wieder suspendiert und dann 10 min bei 20 000 g zentrifugiert, wobei eine dritte überstehende Flüssigkeit (S3) und eine Pelletfraktion (P) erhalten wurde.
Die Pelletfraktion wurde in 5 ml H20 wieder suspendiert und dann gründlich gegen 0, 89 % NaCl dialysiert. Aliquote Teile jeder überstehenden Flüssigkeit und der Pelletfraktion wurden durch SDS-PAGE und Anfärben mit Coomassie-Blau analysiert. Dieser Vorgang führte zu einer Endpelletfraktion, die hauptsächlich das Fusionsprotein enthielt und daher eine effektive Reinigung des Fusionsproduktes darstellte.
Weitere Reinigung des 750/CSP (a)/P. 195 Fusionsprotein durch Chromatographie wurde durchgeführt. Die Endpelletfraktion wurde in 50 mM Tris-HCI, pH 8, 5, 8 M Harnstoff, 1 mM EDTA, 50 mM NaCI und 100 mM Dithiothreitol (DTT) suspendiert und unlösliches Material wurde abzentrifugiert. Das Protein wurde durch Gelfiltration in diesem Puffer (enthaltend 1 mM DTT anstelle von 100 mM) auf einer Säule von Superose 6 (Pharmacia) weiter gereinigt. Alternativ wurde die Lösung auf 1 M Ammoniumsulfat eingestellt und auf eine Säule von Phenyl-Sepharose, die mit diesem Puffer äquilibriert war, aufgebracht. Unter diesen Bedingungen verband sich das Fusionsprotein mit der Säule und konnte durch Vermindern der Ammoniumsulfatkonzentration eluiert werden.
Beispiel 12 :
Immunogenität der Hybridproteine.
Die partiell gereinigten Proteine wurden zum Immunisieren von Kaninchen durch intramuskuläre Inokulation mit 0, 5 mg Protein in Freunds komplettem Adjuvans verwendet, wobei die Dosen an den Tagen 21 und 35 mit 0, 5 mg Protein in Freunds inkomplettem Adjuvans verstärkt wurden. Am Tag 56 nach der primären Immunisierung wurden Serumproben gesammelt. Weitere Verstärkungen wurden an den Tagen 98 und 125
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supra). Das zweite war ein synthetisches Peptid enthaltend die mit einem Trägerprotein konjugierte CSP Wiederholung. Die Proteine wurden zum Markieren von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für den Radioimmuntest (RIA) verwendet, wie in der EP-A1-0 154 454 beschrieben.
Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, dass die Fusionsproteine immunogen sind und Antikörper sowohl gegen
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P. 195 als auch die CSP-Aminosäuresequenz hervorrufen. b) Antikörperreaktion auf P. 195 Protein, getestet durch Immunpräzipitation, Westem-Blotting und Immunfluoreszenz.
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Fusionsproteine von 750/CSP (a) ! p. 195 bildeten, erkannten das intakte P. 195 in diesem Extrakt von Schizonten, wie durch Immunpräzipitation, SDS-PAGE und Fluorgraphie gezeigt. Von Extrakten von oberflächenmarkierten Merozoiten immunpräzipitierte das gleiche Serum die 42 und 19 kd Fragmente des P. 195 Proteins.
Bei einem alternativen Versuch wurde P. 195 durch monoklonale Antikörper-Affinitätschromatographie (Holder und Freeman, 1984, supra) gereinigt, durch ein Polyacrylamidgel Elektrophorese unterworfen und dann in Nitrozellulose transferiert. Western-Blotting mit Antisera, die sich gegen 750/CSP (a)/P. 195, 750/CSP (b)/P. 195 und 750/CSP (b2) ! P. 195 gebildet hatten, zeigte eine positive Reaktion der Antikörper in diesen Sera mit dem gereinigten P. 195 Protein. Alle drei Antisera reagierten durch Immunfluoreszenz mit Blutstadiumparasiten auf luftgetrockneten, acetonfixierten Abstrichen.
Tabelle IV J125-Protein A-Bereich (cpm) und als Prozentsatz des Maximalwertbereiches in Klammern nach 2 Verstärkungsinjektionen oder 4 Verstärkungsinjektionen (Ober- bzw. Untergrenze).
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<tb>
<tb>
Antiserum <SEP> von
<tb> Tier <SEP> immunisiert <SEP> Serumverdünnung
<tb> mit <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10000 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> 000 <SEP>
<tb> A. <SEP> Titriert <SEP> gegen <SEP> P. <SEP> 195 <SEP> Protein
<tb> 750/CSPa/P. <SEP> 195 <SEP> 2287 <SEP> (45, <SEP> 1) <SEP> 1732 <SEP> (34, <SEP> 1) <SEP> 597 <SEP> (11, <SEP> 7) <SEP> 324 <SEP> (6, <SEP> 4) <SEP> 236 <SEP> (4, <SEP> 6) <SEP>
<tb> Fusionsprotein <SEP> 2936 <SEP> (72, <SEP> 8) <SEP> 2251 <SEP> (55, <SEP> 8) <SEP> 632 <SEP> (15, <SEP> 7) <SEP> 259 <SEP> (6, <SEP> 4) <SEP> 142 <SEP> (3, <SEP> 5) <SEP>
<tb> 750/CSPb <SEP> ! <SEP> P.
<SEP> 195 <SEP> 625 <SEP> (12, <SEP> 3) <SEP> 262 <SEP> (5, <SEP> 2) <SEP> 146 <SEP> (2, <SEP> 9) <SEP> 191 <SEP> (3, <SEP> 8) <SEP> 159 <SEP> (3, <SEP> 1) <SEP>
<tb> Fusionsprotein <SEP> 3506 <SEP> (86, <SEP> 9) <SEP> 1711 <SEP> (65, <SEP> 6) <SEP> 575 <SEP> (14, <SEP> 2) <SEP> 189 <SEP> (4, <SEP> 7) <SEP> 142 <SEP> (2, <SEP> 8) <SEP>
<tb> 750/CSPb2 <SEP> ! <SEP> P. <SEP> 195 <SEP> 1151 <SEP> (23, <SEP> 5) <SEP> 336 <SEP> (6, <SEP> 6) <SEP> 185 <SEP> (3, <SEP> 6) <SEP> 166 <SEP> (3, <SEP> 3) <SEP> 197 <SEP> (3, <SEP> 9) <SEP>
<tb> 2498 <SEP> (61, <SEP> 9) <SEP> 1092 <SEP> (27, <SEP> 1) <SEP> 294 <SEP> (7, <SEP> 3) <SEP> 139 <SEP> (3, <SEP> 4) <SEP> 109 <SEP> (2, <SEP> 7) <SEP>
<tb> P.
<SEP> 195 <SEP> 5074 <SEP> (100) <SEP> 4977 <SEP> (98) <SEP> 3743 <SEP> (78) <SEP> 1791 <SEP> (35) <SEP> 793 <SEP> (16) <SEP>
<tb> 4033 <SEP> (100) <SEP> 3818 <SEP> (95) <SEP> 3145 <SEP> (78) <SEP> 1855 <SEP> (46) <SEP> 1011 <SEP> (25) <SEP>
<tb> übliche <SEP> Kontrolle <SEP> 620 <SEP> (12, <SEP> 2) <SEP> 264 <SEP> (5, <SEP> 2) <SEP> 217 <SEP> (4, <SEP> 2) <SEP> 230 <SEP> (4, <SEP> 5) <SEP> 222 <SEP> (4, <SEP> 4) <SEP>
<tb> 587 <SEP> (14, <SEP> 5) <SEP> 212 <SEP> (5, <SEP> 2) <SEP> 154 <SEP> (3, <SEP> 8) <SEP> 106 <SEP> (2, <SEP> 6) <SEP> 134 <SEP> (3, <SEP> 3) <SEP>
<tb>
EMI14.3
EMI14.4
<tb>
<tb> 750/CSPa/P. <SEP> 195 <SEP> 3365 <SEP> 1379 <SEP> 330 <SEP> 168 <SEP> 362
<tb> Fusionsprotein
<tb> 750/CSPb/P. <SEP> 195 <SEP> 2824 <SEP> 1674 <SEP> 729 <SEP> 598 <SEP> 1351
<tb> Fusionsprotein
<tb> 750/CSPb2/P.
<SEP> 195 <SEP> 3068 <SEP> 2588 <SEP> 382 <SEP> 416 <SEP> 271
<tb> Fusionsprotein
<tb> CSP <SEP> Peptid-BSA <SEP> 2947 <SEP> 3684 <SEP> 3312 <SEP> 2161 <SEP> 940
<tb> übliche <SEP> Kontrolle <SEP> 662 <SEP> 231 <SEP> 147 <SEP> 409 <SEP> 143
<tb>
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Am Ende von Beispiel 7, Teil a) supra, wird auf die Hinterlegung des E. coli-Stammes 750/CSP (a)/P. 195 bezuggenommen. Vollständige Details dieser Hinterlegung, die gemäss dem Budapester-Abkommen erfolgt ist, sind wie folgt : (a) Name und Adresse der internationalen Hinterlegungsbehörde :
National Collection of Type Cultures
Central Public Health Laboratory
Colindale Avenue
London NW9 5HT, Grossbritannien
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:PATENTANSPRÜCHE 1.
Rekombinationskonjugatprotein, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Epitop sowohl von Ciccumsporozoiten-Proteingen (CSP) als auch eines Blutstadiumantigens eines Plasmodium-Parasiten aufweist.