DE3685837T2

DE3685837T2 - Hepatitis-a-virus-impfstoff.

Info

Publication number: DE3685837T2
Application number: DE8686302465T
Authority: DE
Inventors: Daniel Caput; Dino Dina; Steven J Potter; Nest Gary A Van
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1985-04-03
Filing date: 1986-04-03
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2006-04-04
Also published as: HK126095A; ATE77832T1; EP0199480A3; DE3685837D1; CA1324094C; EP0199480A2; EP0199480B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten Impfstoffe und viralen Erkrankungen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung der genomischen Sequenz des Hepatitis-A-Virus, um oligomere Sonden für die Diagnose zu erhalten, um Impfstoffe zu erhalten, die zum Schutz von Lebewesen mit einem Hepatitis-A-Risiko nützlich sind und um Populationen monoklonaler Antikörper zu erhalten, die zur Behandlung von Infizierten und als Diagnostika nützlich sind.

Stand der Technik

Hepatitis ist eine schwere schwächende Erkrankung, die weltweit vorherrschend ist. Sie kann in akuter Form vorkommen und verursacht starke Müdigkeit, Leberschädigung und ist nicht selten tödlich. Die Krankheit wird durch eine virale Infektion hervorgerufen. Die Infektionserreger sind in unterentwickelten Gebieten der Welt, in denen die Mehrheit der Erwachsenen Antikörper gegen virale Antigene trägt, endemisch. In den Vereinigten Staaten, Westeuropa und Japan ist das Vorkommen von Hepatitis ebenfalls insbesondere unter solchen Menschen signifikant, die Bedingungen ausgesetzt sind, die zur Übertragung von viralen Infektionen beitragen. Weil jedoch die Wahrscheinlichkeit der Exposition im allgemeinen niedriger ist, tragen die meisten Erwachsenen in diesen Gebieten keine Antikörper gegen die Antigene des Hepatitis-Virus und sind hohem Risiko bei Reisen in Gegenden, in denen das Virus endemisch ist, ausgesetzt.
Drei sehr verschiedene und immunologisch unterschiedliche Formen des Hepatitis-Virus sind bekannt: Hepatitis-A, Hepatitis-B und eine dritte Form, die gegenwärtig nur als Non-A/Non-B bekannt ist. Das Hepatitis-B- Virus (HBV) wurde gründlich untersucht und Schutzimpfstoffe gegen eine Infektion mit HBV wurden entwickelt. Eine weitere infektiöse Spezies, das Hepatitis-A-Virus (HAV) ist ein Picornavirus, das zur Gattung der Enteroviren gehört. HAV wurde zuerst als die Ursache der akuten Erkrankung von Feinstone, S. M., et al, Science (1978) 182: 1026-1028; Siegl, G., et al, J. Virol. (1978) 26: 40-47, 48-53 charakterisiert. Diese Form des Virus verursacht eine klinisch wichtige Erkrankung und mehr als 100 000 Fälle von HAV-induzierter Hepatitis werden jährlich in den Vereinigten Staaten gemeldet. Das Vorkommen der Krankheit ist anderswo in der westlichen Welt ähnlich.
Da Antikörper gegen Hepatitis B keine Kreuzreaktion mit Hepatitis A oder Schutz gegen eine HAV-Infektion zeigen, besteht die Notwendigkeit, Impfstoffe, die spezifisch gegen eine HAV-Infektion gerichtet sind, zu entwickeln. Während das Virus morphologisch charakterisiert worden ist, und das Genom teilweise sequenziert worden ist, wurde die Entwicklung eines Impfstoffs durch unzureichende Kenntnis der Nukleotidsequenz des Genoms behindert. Wie im folgenden näher erläutert wird, hängt die Entwicklung eines Impfstoffs von der Identifizierung geeigneter Epitope entweder als Primärpeptid-Sequenzen oder als Ergebnis der Ermittlung der dreidimensionalen Konfiguration, die die Bildung von neutralisierenden Antikörpern hervorrufen, zusammen.
HAV besitzt die typische icosahedrische Struktur eines Picornavirus mit einem Durchmesser von 27 - 32 nm. Die Virionen enthalten ein einzelsträngiges genomisches RNA-Molekül von etwa 7,5 kb mit einer positiven Strangpolarität mit einem PolyA-Schwanz am 3'-Ende und können kovalent mit einem Protein an dem 5'-Ende verbunden sein. Es wurde angenommen, daß die Polypeptide, die von der RNA codiert werden, zu denjenigen anderer Picornaviren analog sind, wie beispielsweise die, die für Polio und für die Maul- und Klauenseuche (FMD) verantwortlich sind. Während Variationen vorkommen, wurde gezeigt, daß ausreichende Ähnlichkeit zwischen solchen Viren vorliegt, um die Entwicklung einer systematischen Nomenklatur der Picornavirus-Proteine, wie in Rueckert, R.R., et al, Journal of Virol (1984) 50: 957-959 dargelegt ist, zuverlässig zu entwickeln. Dieses Nomenklatursystem, das die L434-Konvention genannt wird, beruht auf einer idealisierten Karte eines Polyproteins, das von dem Picornavirus-Genom erzeugt wird und welche in das Muster L-ABCD-ABC-ABCD paßt. In dieser Darlegung bedeutet L ein Leaderprotein, das erste Quartett einen Satz von 4 Capsidproteinen, die die viralen Teilchen verkapseln, das mittlere Triplet Proteine verschiedener Funktionen und das stromabwärts gelegene Quartett umfaßt eine Proteinase , die den Polypeptid- Precursor der Capsidproteine in einzelne Peptide spalten kann. Wie durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, entspricht dieses Muster ebenso den von HAV codierten Polypeptiden.
Einige Arbeit, die für die Herstellung von Impfstoffen relevant ist, wurde durchgeführt. Monoklonale Antikörper (Mabs) gegen HAV, die in in vivo Assays neutralisierend sind, aber nicht gegen die Infektion schützen, wurden von MacGregor, A., et al J. Clin. Microbiol (1983) 18: 1237-1243 hergestellt, wobei Milzen aus Mäusen, denen das ganze Virus als Fusionspartner injiziert worden war, zur Herstellung der Mab-bildenden Hybridome verwendet wurden. Diese Mabs scheinen Kreuzreaktionen zu zeigen und erkennen offensichtlich antigenisch ähnliche Determinanten. Zusätzlich stellte Hughes, J.V. et al., J. Virol. (1984) 52: 465-473 Mabs her, die das ganze HAV aber nicht gespaltene oder denaturierte Proteine des Virus erkennen können. Diese Mabs wurden aus Hybridomen erhalten, die unter Verwendung der Milzen von Mäusen, denen ein Gemisch von VP1, VP2 und VP3 HAV-Proteinen injiziert worden war, als Fusionspartner gebildet worden waren. (In Übereinstimmung mit anderen Picornaviren scheinen die Capsidproteine drei oder vier getrennte Proteine VP1, VP2, VP3 und möglicherweise ein VP4, wovon VP1 offensichtlich das am meisten exponierte ist und den Hauptanteil der antigenen Determinanten liefert, zu umfassen.) Es wurde übereinstimmend gezeigt, daß das ganze Virus antigene Stellen enthält, die in den einzelnen Capsidproteinen nicht vorliegen. (Gerlich, W. H., et al, Med. Microbiol. Immunol. (1983) 172: 101-106; Hughes, J.V. et al (wie oben).)
Emini, E.A. et al., Abstracts; Modern Approaches to Vaccines (Sept 12-16, 1984, Cold, Spring Harbor, NY) S. 72 zeigten, daß Poliovirus-Peptide entsprechend den antigenen Stellen des Poliovirus-Capsid bei Konjugation an BSA und Injektion in Kaninchen, Ratten oder Meerschweinchen in der Lage waren, das Lebewesen zur Antwort auf die sub-immunogene Verabreichung von HAV durch Bildung von neutralisierenden Antikörpern zu stimulieren.
Teilklonierung und Sequenzierung des HAV-Genoms wurde von anderen beschrieben (Ticehurst, J.R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80: 5885-5889; Von der Helm, et al., J. Virol. Meth. (1981) 3: 37-44). Diese Berichte ergaben Information, die nicht ausreichend war, die Konstruktion von Polypeptiden, die als Impfstoffe dienen können, zu gestatten. Die vorliegende Erfindung stellt die vollständige Genomsequenz von HAV bereit und gestattet somit Manipulation der möglichen Epitope, um wirksame Impfstoffe gegen HAV zuerhalten.
Die EP-A-0 154 587 mit den benannten Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI und NL, die am 11. September 1985 veröffentlicht wurde, beschreibt die Teilsequenz des HAV-Genoms. Bestimmte Fragmente dieser Sequenz sind ebenfalls beschrieben.
Die EP-A-0 175 613 mit den benannten Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI und NL und veröffentlicht am 11. September 1985 beschreibt bestimmte immunogene Peptide, die sich von HAV ableiten.
Die W085/01517 mit den benannten EPA Vertragsstaaten AT, BG, CH, DE, FR, GB, LU, NL und SE und veröffentlicht am 11. April 1985 beschreibt eine Sequenz aus 1489 Nukleotiden der HAV cDNA.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt cDNA-Replika der gesamten genomischen Sequenz von HAV bereit. Anteile der genomischen Sequenz sind als Sonden zur Diagnose des Vorliegens des Virus in klinischen Proben nützlich. Das Verständnis der genomischen Sequenz stellt auch effektiv die gesamte virale Polypeptid-Sequenz zur Verfügung und gestattet nicht nur die Analyse sondern auch die Herstellung von Teilen davon, sofern geeignet, in der korrekten Konfiguration, um wirksame Impfstoffe bereitzustellen und die Bildung von neutralisierenden Antikörpern zu ermöglichen. Die Verfügbarkeit der ganzen HAV-Sequenz gestattet somit den Entwurf und die Bildung von Polypeptiden, die entweder als Impfstoffe selbst oder als Zwischenprodukte zur Bildung von monoklonalen Antikörper-Präparaten (Mab), die zur passiven Immuntherapie gegen die Krankheit nützlich sind oder als diagnostische Reagentien dienen können. Ohne daß die Sequenz des gesamten Genoms dem Hersteller von therapeutischen oder vorbeugenden Präparaten zur Verfügung steht, wäre eine erfolgreiche Herstellung von optimal wirksamen Produkten unmöglich.
Folglich betrifft gemäß einem Gesichtspunkt die vorliegende Erfindung eine Nukleotidsequenz, die im wesentlichen mit der für das ganze Genom von HAV, wie in Figur 1 dargestellt, identisch ist. Die verbleibenden Beiträge der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung dieser Sequenz oder Teile davon als oligomere Sonden zur Herstellung von Peptiden, die als Impfstoffe oder als Reagentien zur Bildung monoklonaler Antikörper, die zur Behandlung der Erkrankung nützlich sind, dienen können.
Weitere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung umfassen Expressionssysteme, die in der Lage sind, die Bildung eines gewünschten Proteins, das von den vom vollständigen Genom abgeleiteten Sequenzen codiert wird, zu bewirken, rekombinante Vektoren, die solche Systeme oder Teile davon enthalten, rekombinante Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind, Proteine, die von den transformierten Zellen gebildet wurden und Impfstoffe, die von solchen Proteinen hergestellt wurden. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung spezifische Peptidsequenzen, die von dem Genom codierte Epitope darstellen und solche Sequenzen, die covalent an Trägerproteine gebunden sind. Solche Trägerproteine umfassen zusätzlich zu üblicheren Trägern das 22 nm Teilchen, das mit der Hepatitis B Infektion in Zusammenhang steht, das die Polyalbumin-Rezeptorstellen trägt und das 1000fach immunogener ist als die nicht-zusammengebaute Untereinheitskomponente. Durch Inserieren der antigenen HAV-Determinanten in das 22 nm HBsAg-Teilchen wird erhöhte Immunogenizität für diese Epitope erhalten. Die Erfindung betrifft auch deletierte Virionen, die in der Lage sind, neutralisierende Antikörper in den Wirten hervorzurufen und monoklonale Antikörper, die für die passive Immuntherapie nützlich sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung dieser gewünschten Polypeptid-Impfstoffe und Immunglobuline.
Soweit als die vorliegende Erfindung Teile der Sequenz der Figur 1 und ihrer Verwendung zur Expression von Vektoren oder als Oligonukleotid-Sonden betrifft, sind diese Teile der Sequenz diejenigen, die in Anspruch 3 beansprucht werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz des HAV-Genoms. Die cDNA enthält die identische Sequenz mit der logischen Ausnahme, daß T durch U substituiert ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des viralen L434-Polypeptids ist ebenfalls in Figur 1 gezeigt.
Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte und die überlappenden Regionen der vier cDNA Klone, die das ganze 7,5 kb HAV-Genom, pHAV47, pHAV8, pHAV1 und pHAV16 umfassen.
Figur 3 zeigt die Konstruktion von Expressionsvektoren für Sequenzen, die für die Fusions-mRNAs codieren, welche für Teile der Superoxid- Dismutase (SOD) und des HAV-Capsidproteins codieren.
Figur 4 zeigt ein Computerprofil, basierend auf Hydrophilizitäts- und Strukturcharakteristiken der Peptidkette als Funktion der Positionen für Regionen des Poliovirus-Polypeptids und des HAV-Polypeptids.
Figur 5 zeigt die Konstruktion eines Expressionsvektors für Säugerzellen, der für die deletierten HAV-Virionen codiert.
Figur 6 zeigt die Konstruktion von pDC-104 zur Bildung von Hybrid- HAV/HBsAg in Hefe..
Figur 7 zeigt die Konstruktion von pWG-1 zur Bildung von Hybrid- HAV/HBsAg in Hefe.

Verfahren zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

Wie im folgenden verwendet, bedeutet eine Nukleotidsequenz "im wesentlichen identisch" mit dem als Beispiel aufgeführten HAV-Genom eine Sequenz, die die wesentlichen Eigenschaften des als Beispiel aufgeführten Polynukleotids beibehält. Ein spezielles aber nicht beschränkendes Beispiel für eine solch wesentliche Äquivalenz würde durch eine Sequenz gegeben sein, die für die identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenz codiert, aber wegen der Degeneriertheit der Codons verschiedene spezifische Codons verwenden würde. Nukleotidaustausche sind in der Tat oft zweckmäßig, um Restriktionsschnittstellen zu schaffen oder zu deletieren, um Weiterverarbeitungsstellen zu schaffen oder um die Aminosäuresequenz so zu ändern, daß die Funktionalität nicht nachteilig beeinträchtigt wird. "Nukleotidsequenz" bedeutet sowohl eine Ribonukleotid- als auch Desoxyribonukleotidsequenz und umfaßt den positiven Sinnstrang wie gezeigt und auch den negativen Sinnstrang.
Eine DNA-Sequenz "abgeleitet von" der Nukleotidsequenz, die das Genom von HAV umfaßt, bedeutet eine DNA-Sequenz, die aus einer Region der genomischen Nukleotidsequenz besteht oder eine Kombination von Regionen dieser Sequenz . Diese Regionen sind natürlich nicht notwendigerweise physikalisch von der Nukleotidsequenz des Gens abgeleitet, aber bedeuten Polynukleotide, die auf irgendeine beliebige Art gebildet worden sind, die die gleiche oder "im wesentlichen identische" Basensequenz wie die der Region bzw. der Regionen, von den das Polynukleotid sich ableitet, besitzen. Beispielsweise umfassen typische DNA-Sequenzen "abgeleitet von" dem HAV-Genom Fragmente, die für spezifische Epitope codieren, Fragmente, die für Teile der viralen Polypeptide codieren, Sequenzen, die für die Capsidprotein codieren, Sequenzen, die für deletierte Virionen codieren und Sequenzen, die für die virale Proteinase codieren. In ähnlicher Weise bedeutet ein Peptid "abgeleitet von" dem HAV-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der dieses Polypeptids oder eines Teils davon identisch ist und die gleichen biologischen Eigenschaften wie dieser Teil besitzt. Die Art der Synthese eines solchen "abgeleiteten" Peptids ist nicht wesentlich - es kann eine chemische Synthese oder ein rekombinanter Weg beispielsweise sein.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellinien", "Zellkulturen" und andere derartige Ausdrücke für Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zellinien, die als einzelluläre Einheiten kultiviert worden sind, werden untereinander austauschbar verwendet und bedeuten Zellen, die als Rezipienten für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglichen transfizierten Zelle. Es ist zu verstehen, daß die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle nicht notwendigerweise in morphologischer oder in genomischer Hinsicht oder hinsichtlich der Ergänzung der vollständigen DNA mit dem ursprünglichen Elternstamm infolge einer zufälligen oder absichtlichen Mutation vollständig identisch sein muß. Die Nachkommenschaft der Elternzelle, die ausreichend ähnlich der durch die relevante Eigenschaft zu charakterisierenden Elternzelle ist, wie beispielsweise durch die Anwesenheit einer Nukleotidsequenz, die für das gewünschte Peptid codiert, fallen unter die von dieser Definition umfaßte Nachkommenschaft und fallen unter die oben genannten Ausdrücke.
"Kontrollsequenz" bedeutet DNA-Sequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden Sequenzen, an die sie gebunden sind, zu bewirken. Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich je nach dem Wirtsorganismus; bei Prokaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen im allgemeinen einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle; bei Eukaryonten umfassen solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren, Terminatoren und in einigen Fällen Enhancer. Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" soll minimal alle Komponenten umfassen, deren Anwesenheit zur Expression notwendig sind und kann auch zusätzliche Komponenten, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, umfassen.
"In ausführbarer Weise verknüpft bzw. verbunden" bedeutet eine Anordnung nebeneinander, bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ermöglicht, daß sie in ihrer gewünschten Weise funktionieren. Eine Kontrollsequenz "in ausführbarer Weise gebunden" an eine codierende Sequenz ist so gebunden, daß die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, erzielt wird.

B. Allgemeine Beschreibung

Kern der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Nukleotidsequenz, die das ganze Genom des Hepatitis A Virus enthält. Die Verfügbarkeit dieses vollständigen Polynukleotids gestattet zuerst die Konstruktion von Oligomeren von etwa 20 bp oder mehr, die zur Diagnose der Erkrankung nützlich sind. Solche Sonden können verwendet werden, um das Vorliegen des viralen Genoms, beispielsweise in Fäkalfiltraten von Personen, die vermutlich das Virus beherbergen, zu detektieren. Die Kenntnis der Gensequenz ermöglicht auch den Entwurf und die Entwicklung von Impfstoffen, die wirksam gegen HAV sind und die Bildung von neutralisierenden Mabs. Die von dem Genom verfügbare Sequenzinformation macht es möglich, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids von der anderer bekannter Picornaviren, von denen die Lokationen günstiger Epitope bekannt sind, abgeleitet werden kann und damit verglichen werden kann. Sobald die gewünschten Sequenzen gewählt sind, können ferner Fragmente des Genoms erhalten werden und unabhängig exprimiert werden, wobei die gewünschten Polypeptide unter Verwendung rekombinanter Techniken bereitgestellt werden. Sobald prokaryotische als auch eukaryotische Wirte sind für eine derartige Expression nützliche. Kurze Polypeptidfragmente können chemisch synthetisiert werden und an Trägerproteine zur Verwendung als Impfstoffe geknüpft werden. Rekombinant exprimierte Polypeptide können unter Bedingungen bereitgestellt werden, die eine günstige Umgebung für das Processing, beispielsweise zu deletierten Virionen, liefern und somit die dreidimensionale Rekonstruktion von Epitopstellen, ohne die Gefahr, infektiöse Viren zu schafften, gestattet. Säuger- und Hefezellen stellen besonders geeignete Umgebungen für eine derartige Expression dar. Zusätzlich können Epitope in Bindung an eine Teilchen-bildendes Protein gebildet werden. Die so gebildeten Proteine können selbst als Impfstoffe verwendet werden oder können verwendet werden, um die immunkompetenten B-Zellen in Wirten zu induzieren, welche dann verwendet werden können, um Hybridome zu bilden, die Antikörper, die für eine passive Immuntherapie nützlich sind, sezernieren.

B.1 Herstellung der HAV-Gen-Sequenz

Die genomische Sequenz von HAV wurde unter Verwendung von Stuhlproben infizierter Patienten als Quelle für das Virus hergestellt. Die isolierte virale RNA wurde fraktioniert und die Fraktionen, die RNA ausreichender Länge für das gesamte Genom enthielten, wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt und verwendet, um eine cDNA-Bank zu erhalten. Kolonien von der Bank wurden mit oligomeren Sonden, die den 3'-proximalen Teilen der RNA komplementär waren, hybridisiert. Verschiedenen Kolonien hybridisierten mit diesen Sequenzen und wurden verwendet, um zusätzliche Anteile der RNA-Botschaft von der cDNA-Bank unter Verwendung der "walking"-Techniken zu erhalten. Vier cDNA-Klone wurden von überlappenden Teilen des Gens erhalten und einer Restriktionskartierung und -sequenzierung unterworfen. Die gesamte Genomsequenz wurde von diesen vier cDNA-Insertionen abgeleitet. Die Aminosäuresequenz, die von dem viralen Genom abgeleitet wurde, ist ähnlich der, die für Picornaviren charakteristisch ist und die 5'- und 3'-nicht codierenden Regionen, die möglicherweise an der viralen Replikation beteiligt sind, wurden identifiziert.

B.2. Herstellung von viralen Polypeptidfragmenten in E. coli

Die Verfügbarkeit der gesamten Genomsequenz erlaubt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die für vermutlich antigenisch aktive Regionen der Capsidproteine codieren. Fragmente, die für die gewünschten Proteine codieren, werden von den cDNA-Klonen unter Verwendung des konventionellen Restriktionsabbaus erhalten und in Vektoren ligasiert, die Teile der Fusionssequenzen, wie beispielsweise β-Galactosidase oder SOD, bevorzugt SOD, enthalten. Jeder beliebige gewünschte Teil des HAV-Genoms könnte als Fusionsprotein exprimiert oder mit einem anderen leicht gebildeten Protein in E. coli unter Verwendung dieser Technik coexprimiert werden. Jedoch wurden zum Zwecke der Erzeugung von Peptiden, die Antikörper gegen HAV erzeugen können, Fragmente, die Teile des Genoms, die für die Capsidprotein-Regionen VP1, VP2 und VP3 codieren, wiedergeben, verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden für menschliche SOD-codierende Sequenzen an die von HAV abgeleiteten Sequenzen, wie im folgenden näher beschrieben, fusioniert. Da eine dreidimensionale antigene Stelle sich aus einer geeigneten Anordnung von einzelnen Peptidketten ergeben kann, können alternativ bakterielle Expressionsvektoren einschließlich der codierenden Sequenz für die virale Proteinase, die von dem stromabwärts gelegenen Quartett codiert werden würde, in dem gleichen oder cotransformierten Expressionsvektor mit dem der für den Vorläufer (PI) der Capsidproteine konstruiert wurde, eingeschlossen werden. Die gleichzeitige Expression der Sequenzen, die für das Capsid und die Proteinase codieren, können auch zu Präparaten führen, die die verschiedenen Capsidproteine als einzelne Peptide erzeugen (siehe z.B. Klump, W., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1984) 81:3351- 3355; Hanecak, R., et al, Cell (1984) 37: 1063-1073.) Diese können sich dann zu der geeigneten dreidimensionalen Struktur zusammenlagern.

B.3. Herstellung von antigenen Polypeptiden und Konjugation mit dem Träger

Die Verfügbarkeit der gesamten Genomsequenz macht eine Computeranalyse der strukturellen Charakteristika des abgeleiteten Proteins zum Vergleich mit der bekannten Sequenz des Poliovirus ebenfalls möglich. Da die antigenen Regionen des Poliovirus bekannt sind, ermöglichen solche Vergleiche die Bezeichnung von kurzen Peptidregionen, die Epitope darstellen. Diese können dann unter Verwendung chemischer Verfahren synthetisiert werden und beispielsweise mit Cysteinresten am C-terminalen Ende versehen werden, die ein Mittel zur Knüpfung der Peptide an neutrale Trägerproteine darstellen. Eine Anzahl von Techniken zum Erhalt einer solchen Verknüpfung sind nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen die Bildung von Disulfidbindungen unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) und Succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl)-cyclohexan-1-carboxylate (SMCC), erhalten von Pierce Company, Rockford, Illinois. Diese Reagentien schaffen eine Disulfidbindung untereinander und zwischen den Peptidcysteinresten an einem Protein und eine Amidbindung über die &epsi;-Aminogruppe an einem Lysin oder eine andere freie Aminogruppe in dem anderen. Eine Vielzahl solcher Disulfid-/Amid- bildenden Reagentien sind bekannt. Vergleiche beispielsweise, Immun. Rev. (1982) 62:185. Andere bifunktionelle Kopplungsmittel bilden eher einen Thioether als eine Disulfidbindung. Viele dieser Thioether-bildenden Mittel sind im Handel erhältlich und umfassen reaktive Ester von 6- Maleimidocapronsäure, 2-Bromessigsäure, 2-Iodessigsäure, 4- (N-Maleimido- methyl)-cyclohexan-1-carbonsäure und dergleichen. Die Carboxylgruppen können durch Kombination mit Succinimid oder 1-Hydroxy-2-nitro-4-sulfonsäure, Natriumsalz aktiviert werden. Die vorangehende Liste ist nicht als erschöpfend anzusehen und Modifikationen der aufgezählten Verbindungen können klar verwendet werden.
Jeder beliebige Träger, der nicht selbst die Bildung von Antikörpern, die dem Wirt schaden, verursacht, wie beispielsweise die verschiedenen Serumalbumine, Tetanus-Toxoide oder das Schneckenhämocyanin (keyhole limpet hemocyanin KLH) können verwendet werden.
Die Konjugate führen bei Injektion in geeignete Lebewesen zur Bildung von Antisera, die Immunglobuline enthalten, welche spezifisch nicht nur gegen die Konjugate, sondern auch gegen Fusionsproteine, die die analogen Teile der Sequenz tragen und gegen geeignete Determinanten auf dem ganzen HAV reaktiv sind.

B. 4. Herstellung von nicht-infektiösen (deletierten) Virionen in Prokaryonten oder Eukaryonten

Virionen, die die dreidimensionale Epitopkonfiguration des intakten HAV nachahmen, können ebenfalls hergestellt werden. Es wird allgemein angenommen, daß die antigenen Stellen sich aus der dreidimensionalen Faltung der immunogenen Proteine ergeben und speziell bezüglich HAV wurde beschrieben, daß Antikörper, die als Antwort auf eine Injektion mit HAV-Capsidproteinen gebildet werden, gegen die denaturierten viralen Peptide nicht reaktiv sind (Gerlich et al, Med Microbiol Immunol (1983) 172: 101- 106).
Die deletierten Virionen werden dadurch hergestellt, daß man DNA- Sequenzen bereitstellt, denen die 5'- und 3'-nicht codierenden Regionen des HAVs, die möglicherweise für die replikativen Funktionen verantwortlich sind, fehlen. Den Sequenzen fehlt auch ein Teil der 3'-codierenden Region, die vermutlich aufgrund Homologie mit anderen Picornaviren für den Replicase-Origin codiert. Diese Fragmente werden bevorzugt in Plasmidexpressionsvektoren, die für Hefe oder Säugerzellen, die in der Lage sind, das post-transkriptionale und post-translationale Processing auszuführen, geeignet sind, kloniert; jedoch können ebenfalls Prokaryonten verwendet werden. Deletierte Virionen, die in Wirten, die mit diesen Vektoren transformiert worden sind, gebildet werden, sind gegen konvaleszente menschliche HAV-Antisera immunreaktiv und können zur Immunisierung verwendet werden.

B.5. Herstellung von Hybrid-Teilchen-Immunogenen, die HAV- Epitope enthalten

Die Immunogenizität der Epitope von HAV kann auch dadurch erhöht werden, daß man sie in Säuger- oder Hefesystemen, die mit Teilchen-bildenden Proteinen, wie beispielsweise dem, das mit Hepatitis-B-Oberflächenantigen assoziiert ist, fusioniert sind, herstellt. Konstrukte, in denen das HAV-Epitop direkt an die für das Teilchen-bildende Protein codierenden Sequenzen geknüpft ist, bilden Hybride, die bezüglich des HAV- Epitops immunogen sind. Zusätzlich umfassen alle hergestellten Vektoren Epitope, die für das Hepatitis-B-Virus (HBV) spezifisch sind und verschiedene Immunogenizitätsgrade, beispielsweise für das prä-S-Peptid, besitzen. Somit sind Teilchen, die von dem Teilchen-bildenden Protein einschließlich der HAV-Sequenzen gebildet worden sind, sowohl bezüglich HAV als auch HBV immunogen.
Es wurde gezeigt, daß das Hepatitis-Oberflächen-Antigen (HBsAg) in S. cerevisiae gebildet und zusammengebaut wird (Valenzuela et al, Nature (1982) 298: 344-350); ebenso wird es beispielsweise in Säugerzellen (Valenzuela, P., et al, Hepatitis B (1984), Millman, I., et al, ed, Plenum Press, S. 225-236) gebildet und zusammengebaut. Es wurde gezeigt, daß die Bildung solcher Teilchen die Immunogenizität der Monomer-Untereinheit erhöht. Die Konstrukte können auch das immundominante Epitop von HBsAg, welches die 55 Aminosäuren der Presurface-Region (pre-S-Region) umfaßt. (Neurath et al, Science (1984) 224: 392-394.) Die Konstrukte der präS-HBsAg-Teilchen, die in Hefe exprimierbar sind, sind in U.S. S.N. 621,756, eingereicht am 18. Juni 1984, beschrieben; Hybride einschließlich heterologe virale Sequenzen zur Expression in Hefe sind in U.S. S.N. 650,323, eingereicht am 13. September 1984, beschrieben. Beide Anmeldungen sind auf den hier Bezeichneten übertragen und auf sie wird hiermit Bezug genommen. Diese Konstrukte können auch in Säugerzellen, wie beispielsweise den Ovarzellen des chinesischen Hamsters unter Verwendung von SV40-Dihydrofolat-Reduktase als Vektor exprimiert werden (Michelle et al, Int Symp on Viral Hepatitis (1984)).
Zusätzlich können Teile der für das Teilchen-bildende Protein codierenden Sequenz an sich durch Codons für ein HAV-Epitop ersetzt werden. Bei diesem Ersatz können Regionen, die nicht erforderlich sind, um die Aggregation der Einheiten zur Bildung immunogener Teilchen in Hefe oder Säugern zu vermitteln, deletiert werden, wodurch zusätzliche Hepatitis-B-antigene Stellen der Kompetition mit dem HAV-Epitop entzogen werden.

B.6. Herstellung von Impfstoffen

Die Herstellung von Impfstoffen, die Peptidsequenzen als aktive Inhaltsstoffe enthalten, ist nach dem Stand der Technik ebenfalls gut bekannt. Typischerweise werden solche Impfstoffe als injizierbare Zubereitungen entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen hergestellt; feste Formen, die geeignet zur Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit oder Injektion sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden oder das Protein kann in Liposomen verkapselt werden. Der aktive immunogene Inhaltsstoff wird oft mit Exzipientien vermischt, die pharmazeutisch annehmbar und mit dem aktiven Inhaltsstoff verträglich sind. Geeignete Exzipientien sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Zusätzlich kann, sofern zweckmäßig, der Impfstoff geringe Mengen von Hilfssubstanzen wie Benetzungsmitteln oder Emulgiermitteln, Mitteln zum Puffern des pH-Werts oder Adjuvantien, die die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöhen, enthalten. Die Impfstoffe werden üblicherweise parenteral, durch Injektion beispielsweise entweder subkutan oder intramuskulär verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungswege geeignet sind, umfassen Suppositorien und in einigen Fällen orale Formulierungen. Für Suppositorien können übliche Bindemittel und Träger verwendet werden, beispielsweise Polyalkaliglykole oder Triglyceride; derartige Suppositorien können von Gemischen, die den Wirkstoff im Bereich von 0,5% bis 10%, bevorzugt 1% bis 2% enthalten, gebildet werden. Orale Formulierungen umfassen normalerweise verwendete Exzipientien, beispielsweise Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dgl. in pharmazeutischer Reinheit. Diese Präparate können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulver einnehmen und enthalten 10% bis 95%, bevorzugt 25% bis 70% wirksamen Inhaltsstoff.
Die Proteine können zu Impfstoffen als Neutralstoffe oder in Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Peptids) und solche, die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dgl. gebildet wurden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet wurden, können auch von anorganischen Basen, beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen-(III)- Hydroxiden und organischen Basen wie beispielsweise Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dgl. abgeleitet sein. Die Impfstoffe werden so verabreicht, wie es mit der Dosisformulierung verträglich ist und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam und immunogen ist. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Lebewesen, der Kapazität des Immunsystems des Lebewesens, Antikörper zu synthetisieren, und dem gewünschten Schutzgrad ab. Präzise Mengen des aktiven Inhaltsstoffs, der verabreicht wird, hängen von dem Urteil des praktizierenden Arztes ab und sind für jedes Lebewesen charakteristisch.

B.7. Herstellung von Mabs gegen HAV-Epitope

Die wie oben beschrieben hergestellten immunogenen Proteine werden zur Immunisierung von Säugetieren verwendet. Lymphozyten von diesen Tieren können verwendet werden, um Hybridome herzustellen, die in der Lage sind, die monoklonalen Antikörper gegen diese Epitope und mit Kreuzreaktion gegen das infektiöse Virus zu sezernieren. Die entstandenen monoklonalen Antikörper sind besonders geeignet zur Diagnose und die neutralisierenden Antikörper sind nützlich zur passiven Immuntherapie.

C. Allgemeine Verfahren

Die allgemeinen Techniken, die verwendet werden um die RNA aus dem Virus zu extrahieren, die cDNA-Bank herzustellen und abzusuchen, die Klone zu sequenzieren, die Expressionsvektoren zu konstruieren, die Zellen zu transformieren und dgl. sind nach dem Stand der Technik bekannt, und Laborhandbücher, die diese Techniken beschreiben, sind verfügbar. Jedoch werden im folgenden als allgemeine Leitlinie einige gegenwärtig verfügbare Quellen für solche Verfahren und für Materialien, die zu deren Durchführung nützlich sind, genannt.

C.1. Wirte und Expressionskontrollsequenzen

Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können zur Expression der gewünschten codierenden Sequenzen verwendet werden, wenn geeignete Kontrollsequenzen, die mit dem bezeichneten Wirt kompatibel sind, verwendet werden. Unter den prokaryotischen Wirten wird am häufigsten E. coli verwendet und zwar meistens wegen der Einfachheit. Die Expressionskontrollsequenzen für Prokaryonten umfassen Promotoren, die gegenbenenfalls Operatorteile enthalten und Ribosomenbindungsstellen. Die Transfervektoren, die mit prokaryiotischen Wirten kompatibel sind, leiten sich üblicherweise beispielsweise von pBR322, einem Plasmid, das Operons für Ampicillin- und Tetrazyclinresistenz enthält und den verschiedenen pUC-Vektoren, die ebenfalls Sequenzen für Antibiotikaresistenz enthalten, ab. Die zuvor genannten Operons können als Marker verwendet werden, um durch Selektion erfolgreiche Transformanten zu erhalten. Üblicherweise verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen umfassen die β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang, et al. Nature, (1977) 198: 1056), das Tryptophan (trp) Promotor- System (Goeddel, et al, Nucleic Acids Res (1980) 8: 4057) und den von λ abgeleiteten PL-Promotor und N-Gen-Ribosomen-Bindungsstellen (Schimatake, et al, Nature (1981) 292: 128) und den hybriden Tac-Promotor (De Boer et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 80: 21-25), der sich von Sequenzen der trp- und der lac-UV5-Promotoren ableitet. Die zuvor genannten Systeme sind besonders kompatibel mit E. coli.; sofern zweckmäßig, können andere prokaryotische Wirte, wie beispielsweise Stämme von Bacillus oder Pseudomonas mit entsprechenden Kontrollsequenzen verwendet werden.
Eukaryotische Wirte umfassen Hefe- und Säugerzellkulturen. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe und Saccharomyces carlsbergensis sind die am häufigsten verwendeten Hefewirte, wieder wegen ihrer Einfachheit. Mit Hefe kompatible Vektoren tragen Marker, die die Selektion von erfolgreichen Transformanten gestatten, indem sie Prototrophie auxotrophen Mutanten verleihen oder indem sie Antibiotikaresistenz oder Resistenz gegenüber Schwermetallen den Wildtypstämmen verleihen. Mit Hefe kompatible Vektoren können den 2 Micrometer-Origin der Replikation (Broach, J., et al., Meth Enz (1983) 101: 307), die Kombination aus CEN3 und ARS1 oder andere Mittel zur Gewährleistung der Replikation, wie beispielsweise Sequenzen, die zur Inkorporation eines geeigneten Fragments in das Wirtszellgenom führen, verwenden. Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese glycolytischer Enzyme (Hess, et al, J. Adv Enzyme Reg (1968) 7: 149, Holland, et al, Biochemistry (1978) 17: 4900), und den Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman, et al, J Biol Chem (1980) 225: 2073). Für die Hefeexpression können Terminatoren ebenfalls eingeschlossen werden, wie beispielsweise diejenigen, die sich von dem Enolasegen (Holland, M. J., J Biol Chem (1981) 256: 1385) ableiten. Besonders nützliche Kontrollsysteme umfassen die darin speziell beschriebenen, die den Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase- (GAPDH) Promotor oder den den regulierbaren Alkohol-Dehydrogenase- (ADH) Promotor, Terminatoren, ebenfalls abgeleitet von GAPDH und, sofern Sekretion erwünscht ist, eine Leadersequenz aus dem Alphafaktor von Hefe umfassen. Diese Systeme sind ausführlich in den U.S. S.N. 468,589 und 522,909, eingereicht am 22. Februar 1983 und am 12. August 1983, die beide auf den hierin Genannten übertragen sind und auf die hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.
Säugerzellinien, die als Wirte zur Expression verfügbar sind, können viele immortalisierte Zellinien, die von der American Type Culture Collection verfügbar sind einschließlich HeLa-Zellen, Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Nierenzellen des kleinen Hamsters (BHK) und eine Anzahl anderer Zellinien umfassen. Geeignete Promotoren für Säugerzellen umfassen vorwiegend virale Promotoren, wie beispielsweise die des Simian-40-Virus (SV40) (Fiers, et al, Nature (1978) 273: 113) oder andere virale Promotoren, wie beispielsweise das Rous-Sarcoma-Virus (RSV)- Adenovirus und das Rinderpapiloma-Virus (BPV). Säugerzellen können ebenfalls Terminatorsequenzen benötigen. Vektoren, die für die Replikation in Säugerzellen geeignet sind, können virale Replikons oder Sequenzen, die die Integration der geeigneten Sequenzen in das Wirtsgenom gewährleisten, umfassen.

C.2. Transformationen

Das verwendete Transformationsverfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Bei der bakteriellen Transformation wird im allgemeinen Behandlung mit Calcium- oder Rubidiumchlorid (Cohen, S.N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 2110, Maniatis, et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, Seite 254) verwendet. Hefetransformationen können unter Verwendung des Verfahrens von Hinnen, et al, Proc Natl Acad Sci (1978) 75: 1929-1933 durchgeführt werden. Säugertransformationen werden unter Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren nach Graham and van der Eb, Virology, (1978) 52: 546, oder den verschiedenen Modifikationen davon durchgeführt.

C.3. Konstruktion des Vektors

Bei der Konstruktion des Vektors werden Techniken verwendet, die bis jetzt gut verstanden sind. Ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym unter Bedingungen, die im allgemeinen vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Enzyme näher erläutert sind, durchgeführt (siehe beispielsweise The New England Biolabs Product Catalogue). Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid- oder DNA-Sequenz mit 1 Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung in einer Inkubationszeit von etwa 1 bis 2 Stunden bei etwa 37ºC gespalten. Nach Inkubation mit dem Restriktionsenzym wird das Protein durch Phenol-/Chloroformextraktion entfernt und die DNA wird durch Repräzipitation mit Ethanol gewonnen. Die gespaltenen Fragmente können unter Verwendung von Polyacrylimid- oder Agarosegel-Elektropho-resetechniken gemäß den allgemeinen Verfahren, beschrieben in Methods in Enzymology (1980) 65: 499- 560 getrennt werden.
Spaltfragmente mit klebrigen Enden können zu solchem mit glatten Enden unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der geeigneten Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) und unter Verwendung von Inkubationsbedingungen, entsprechend der Polymerase, umgewandelt werden. Die Polymerase baut hervorstehende 3'-Einzelstränge ab, aber füllt hervorstehende 5'-Enden gemäß den dNTPs, die in dem Gemisch vorliegen. Die Behandlung mit S1-Nuklease kann ebenfalls verwendet werden, da dies zur Hydrolyse aller einzelsträngigen DNA-Anteile führt.
Die Ligationen werden unter Verwendung von Standardpuffer- und - Temperaturbedingungen unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und ATP durchgeführt; Ligasierungen mit klebrigen Enden benötigen weniger ATP und weniger Ligase als Ligasierungen mit stumpfen Enden. Wenn Vektorfragmente als Teil eines Ligasierungsgemisches verwendet werden, wird das Vektorfragment oft mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und um somit die Religasierung des Vektors zu verhindern; alternativ kann der Abbau unerwünschter Fragmente durch Restriktionsenzyme verwendet werden, um die Religasierung zu verhindern.
Die Ligasierungsgemische werden in geeignete Klonierungswirte, wie beispielsweise E. coli transformiert und erfolgreiche Transformanten werden beispielsweise mittels Antibiotikaresistenz ausgewählt und nach der korrekten Konstruktion abgesucht.

C.4. Konstruktion der gewünschten DNA-Sequenzen

Synthetische Oligonukleotide können unter Verwendung eines automatischen Oligonukleotidsynthesizers wie von Warner, B.D. et al, DNA (1984) 3: 401-411 beschrieben, hergestellt werden. Sofern zweckmäßig, können diese synthetischen Stränge zur Markierung mit ³²P unter Verwendung eines Überschusses an Polynukleotidkinase in Gegenwart von markiertem ATP unter Standardkinasierungsbedingungen kinasiert werden.
DNA-Sequenzen einschließlich derjenigen, die von genomischen oder cDNA-Banken isoliert worden sind, können durch ortsspezifische Mutagenese, wie von Zoller, M. et al, Nucleic Acids Res (1982) 10: 6487-6499 beschrieben, modifiziert werden. In Kürze: die zu modifizierende DNA wird in Phagen als einzelsträngige Sequenz gepackt und in eine doppelsträngige DNA mit DNA-Polymerase unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids, das dem zu modifizierenden DNA-Anteil komplementär ist und die gewünschten Modifikationen in der eigenen Sequenz enthält, als Primex umgewandelt. Die entstandene doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-tragendes Wirtsbakterium umgewandelt und Kulturen der transformierten Bakterien, die Replikationen jedes Phagenstranges enthalten, werden auf Agar platiert , um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen, die als Einzelstrang die mutierte Form enthalten; 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Replikate der Plaques werden mit kinasierten synthetischen Sonden bei Temperaturen und Bedingungen, die die Hybridisierung mit dem korrekten Strang, aber nicht mit der unmodifizierten Sequenz, gestatten, hybridisiert. Die so identifizierten, gewünschten, modifizierten Sequenzen werden dann gewonnen und kloniert und dienen somit als Quellen für die gewünschte DNA.

C.5. Hybridisierung mit Sonden

DNA-Banken werden unter Verwendung der Verfahren von Grunstein und Hogness (Proc Natl Acad Sci) (USA) (1975) 73: 3961 abgesucht. In Kürze: bei diesen Verfahren wird die abzusuchende DNA auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert, denaturiert und mit einem Puffer, der 0-50% Formamid, 0,6 M NaCl, 60 mM Natriumcitrat, 0,02% (Gew./Vol.) jeweils Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrolidin und Ficoll, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,5), 1% Glycin und 100 ug/ml Träger denaturierte DNA enthält, vorhybridisiert. Der Prozentsatz an Formamid in dem Puffer, ebenso wie die Zeit und die Temperaturbedingungen der Vorhybridisierung und der anschließenden Hybridisierungsstufen hängen von der gewünschten Stringenz ab. Oligomere Sonden, die Bedingungen geringerer Stringenz benötigen, werden im allgemeinen mit niedrigeren Prozentsätzen an Formamid, niedrigeren Temperaturen und längeren Hybridisationszeiten verwendet. Sonden, die mehr als 30 oder 40 Nukleotide, wie beispielsweise, die die von cDNA oder genomischen Sequenzen abgeleitet sind, benötigen im allgemeinen höhere Temperaturen, beispielsweise etwa 40-42ºC und einen höheren Prozentsatz an Formamid, beispielsweise 50%. Nach Vorhybridisierung wird dieser gleiche Puffer, der nun die ³²P-kinasierte 0ligonukleotidsonde enthält, zugesetzt, um Hybridisierung zu erzielen. Die Radioautographie der behandelten Filter zeigt die Anordnung der hybridisierten Sonde und die entsprechenden Anordnungen auf den Replikafiltern, die nicht abgesucht worden sind, können dann als Quelle für die gewünschte DNA verwendet werden.

C.6. Verifizierung der Konstruktion und Sequenzierung

Für routinemäßige Vektorkonstruktionen werden die Ligasierungsgemische in den E. coli-Stamm HB101 oder einen anderen geeigneten Wirt transformiert und erfolgreiche Transformanten werden durch Antibiotikaresistenz oder andere Marker selektiert. Anschließend werden Plasmide von den Transformanten gemäß dem Verfahren von Clewell, D.B., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1969) 62: 1159, üblicherweise nach der Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, D.B., J Bacteriol (1972) 110: 667) hergestellt. Die isolierte DNA wird isoliert und mittels Restriktionsanalyse analysiert oder nach dem Didesoxyverfahren von Sanger, F. et al, Proc Natl Acad Sci, (USA), (1977) 74: 5463, wie weiter beschrieben von Messing et al, Nucleic Acids Res, (1981), 9: 309 oder nach dem Verfahren von Maxam, et al, Methods in Enzymology (1980) 65: 499 sequenziert.

D. Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern aber nicht beschränken. Die dargestellten Verfahren, beispielsweise in D.1. können, sofern zweckmäßig, wiederholt werden aber müssen es nicht, da Techniken zur Konstruktion der gewünschten Nukleotidsequenzen, basierend auf der erfindungsgemäß bereitgestellten Information, verfügbar sind. Die Expression ist beispielhaft in E. coli und in Hefe ausgeführt, jedoch sind, wie ausführlicher in C.1. dargestellt, andere Systeme verfügbar. Zusätzliche Epitope, abgeleitet von der genomischen Struktur können ebenfalls gebildet werden und zur Erzeugung von Antikörpern, wie im folgenden dargelegt, verwendet werden.

D.1. Herstellung von HAV-cDNA

Das HAV-Virus wurde vom Stuhl eines Hepatitis-A-Patienten, der während eines epidemischen Ausbruches in Los Angeles, Kalifornien, gewonnen worden war, isoliert. Andere Isolate, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, hätten auch verwendet werden können. Vergleiche beispielsweise Daemer, R.J., et al, Infect Immunity (1981) 32: 388-393; Frosner, G.G., et al, Infection, (1979) 7: 303-350. Die Techniken für eine derartige Isolierung und die Fortpflanzung sind nach dem Stand der Technik gut bekannt.
Das Isolat wurde auf PCL/PRF/5 (Alexander-Hepatom-Zellen) inokuliert und anschließend bei 34ºC kultiviert. Eine detektierbare Virusproduktion wurde nach 3 bis 4 Wochen beobachtet und die ursprünglichen infizierten Zellkulturen wurden kontinuierlich in DME/15% FCS für die vergangenen 2 Jahre ohne Verlust der Virustiter gegeben. (Die Virustiter wurden mittels Immunfluoreszens und/oder eines kompetitiven Radioimmunassays (HAVAB, Abbott) bestimmt.)
Die virale RNA wurde aus den Virionen nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise dem von Ticehurst J.E., et al, Proc Acad Sci (USA) (1983) 80: 5885-5889 beschriebenen Verfahren einschließlich Proteasebehandlung und Phenol-/Chloroformextraktion mit anschließender Ethanolfällung extrahiert. Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht wurden von der RNA genomischer Länge mittels eines 15-30%igen Saccharosegradienten, der 5 h bei 40 000 x g in einem SW 41 Spinco-Rotor lief, fraktioniert. Die Gradienten wurden in 22 bis 24 Fraktionen gewonnen, jede Fraktion gefällt und auf einem Formaldehydagarosegel laufen gelassen (Lehrach, H. et al, J Biochem (1977) 16: 474c). Jedes Gel wurde auf Nitrocellulosemembran transferiert und an markierte spezifische Sonden, wie von Thomas, Proc Natl Acad Sci (USA) (1980) 77: 5201 beschrieben, hybridisiert.
Die Vorhybridisierung und die Hybridisierung wurden im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt. Die Sonden wurden am 5'-Terminus mit T4-Kinase gemäß dem Verfahren von Lellehaug, et al, Biochemistry (1976) 15: 1858 kinasiert und anschließend auf einem Sep-pak (Millipore) -Filter gereinigt. Zwei Oligonukleotidsonden mit den Bezeichnungen HAV 1 und 2 wurden auf der von Ticehurst, et al (siehe oben) erhaltenen Sequenzinformation konstruiert. Die Sonden besaßen die folgenden Sequenzen:
Diese Sonden wurden somit durch Hybridisierung auf die Gele, die mit HAV-RNA von teilgereinigten Virionen gelaufen waren, bestätigt.
RNA aus den Saccharosefraktionen, die HAV-RNA in voller Länge enthielten, wurden durch die oben beschriebene Hybridisierungsblotting- Techniken identifiziert. Die Proben wurden vereinigt, mit Ethanol präzipitiert und zur Bildung einer cDNA-Bank verwendet. Das verwendete Klonierungsverfahren stellt eine Modifikation des zuvor von Wood und Lee, Nucleic Acid Res (1976) 3: 1961,; Lain et al, Cell (1979) 16: 851 beschriebenen Verfahrens dar. Die zwei Modifikationen die im Vergleich zu dem beschriebenen Verfahren eingeführt wurden, sind wie folgt: (a) eine kurze doppelsträngige synthetische Primer dT wurde mit der poly-A+-RNA reassoziiert, um die cDNA zu synthetisieren; (b) nach der Schwanzbildung mit dC wurden die cDNA:RNA-Hybridmoleküle anschließend mit PstI-geschnittenem pBR322 mit einem dG-Schwanz reassoziiert. Vor der Transformation wurden die pBR322:mRNA:cDNA-Moleküle mit konzentriertem Extrakt aktivierter Xenopus-Eier, der wie im folgenden angegeben hergestellt worden war, repariert. Die Ligasierungsgemische wurden anschließend in E. coli K12 MC1061 auf Amp transformiert.
Xenopus laevis-Eier wurden, wie von Newport und Kirschner, Cell (1982) 30: 675-686 beschrieben, erhalten und zweimal mit MMR (0,1 M NaCl, 2mM KCl, 1 mM MgSO&sub4;, 2 mM CaCl&sub2;, 5 mM Hepes, pH 7,8, 0,1 mM EDTA) und in 2% Cystein von Gallerte befreit. Die Eier wurden anschließend zweimal mit MMR/4 gewaschen und durch einen elektrischen Schock (5 sec, 12 V) aktiviert; anschließend wurden sie 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann zweimal mit 160 mM β-Glycerinphosphat, 2 mM EGTA, 10 mM MgCl&sub2;, 10% Glycerin, 1 mM PMSF, 25 ug/ml Creatin-Phosphokinase, 5 mM Phosphokreatin, pH 7,5 gewaschen und dann durch Pipettieren zerstossen und 10 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert. Der Rohextrakt wurde durch die Lipidschicht gewonnen und 30 Minuten bei 40 000 UpM nochmals zentrifugiert. Der klare Extrakt wurde in Aliquots eingeteilt und bei -80ºC gefroren gelagert.
Die entstandene cDNA-Bank wurde durch Transferieren der Kolonien auf Replika-Nitrocellulosefilter abgesucht und mit HAV1 und HAV2, wie oben beschrieben, hybridisiert. Unter Verwendung der vorausgehenden Sonden und durch Selektion der Kolonien, die mit beiden hybridisierten, wurden 3'-proximale Klone erhalten. Weitere Anteile des Genoms wurden durch "Walking"-Techniken indentifiziert. Ein zusätzlicher Klon wurde unter Verwendung des 5'-terminalen PstI/PstI-Fragment aus pHAV1307 als Sonde erhalten (Ticehurst, J., et al (siehe oben)).
Vier rekombinante cDNA-Insertionen mit den Bezeichnungen pHAV16, pHAV1, pHAV8 und pHAV47 wurden selektiert und Restriktionskarten wurden hergestellt. Die überlappenden Regionen wurden durch Kreuzhybridisierungsstudien bestätigt und die Gesamtlänge der nicht-überlappenden Regionen betrug etwa 7,5 kb, die ganze Spanne des HAV-Genoms. Die Ergebnisse der Restriktionskartierung und der Überlappung sind in Figur 2 dargestellt. pHAV16, pHAV1, pHAV8 und pHAV47 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 29. März 1985 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern 53077, 53078, 53076 bzw. 53079.
Die vollständige Sequenzierung der Serien der vier Insertionen, die in Figur 2 gezeigt sind, ergaben die Ergebnisse für die entsprechende virale RNA, welche in Figur 1 dargestellt sind. (Die Analyse der offenen Leseraster, die mit dieser Sequenz verbunden sind, zeigte eine Deletion von 22 Nukleotiden in Position 3530 des HAV-Genoms; dies wurde durch ortsspezifische Mutagenese korrigiert, wobei die in Figur 1 gezeigte Sequenz erhalten wurde; das korrigierte Plasmid wurde als pHAV1* bezeichnet).
Auf die heteropolymere Sequenz aus 7478 Nukleotiden folgt ein polyA-Abschnitt unbestimmter Länge. Ein einzelnes offenes Leseraster startet bei einem AUG-Triplett bei Nukleotid 734 und endet mit einem UGA-Codon bei Nukleotid 7415. Somit besitzt das codierte Polyprotein 2227 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 251 940 Daltons. Die abgeleitete genomische RNA-Sequenz in Figur 1 zeigt die 5'-nicht-codierende Region, die für die Verknüpfung an einen Tyrosinrest an einem viralen Protein erforderlich ist und die ersten 75 Nukleotide der Sequenz können in der hochstabilen Sekundärstruktur, die Stammbereiche und Schleifen, die von anderen Picornaviren-RNA-Sequenzen bekannt sind, umfaßt, angeordnet werden. Ebenso enthält der 5'-terminale Anteil lange U+C Repeats, wie es üblicherweise bei anderen Picornaviren beobachtet wird.

D.2. Konstruktion des Expressionsvektors und Expression der HAV-Sequenzen in E. coli

Vier bakterielle Expressionsplasmide wurden konstruiert, die die gleichzeitige Synthese von menschlicher Superoxiddismutase (SOD) (Hallewell, et al, Nucleic Acids Res (1985) 13: 2017) und auch Anteile aller Hepatitis-A-Capsid-Vorläuferproteine, P1 (Najarian, et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82: 2627) dirigierten. Drei der Plasmide synthetisierten das P1 in Fusion an das Carboxyl-terminale Ende von SOD teilweise oder ganz. Das vierte Plasmid erzeugte ebenfalls eine fusionierte mRNA für SOD und P1-Gensequenzen, aber enthielt eine Sequenz zwischen den SOD- und P1-Genen, die ein Stoppcodon für die Termination der Translation von SOD allein zusammen mit einer Ribosomenbindungsstelle zum Wiederbeginn der Translation an dem Methionincodon, das vermutlich das natürliche Startcodon des P1 ist, enthielt. Die Konstruktionen sind schematisch in Figur 3 dargestellt.
Die Expressionsplasmide basierten auf dem von Tac-Promotor dirigierten Expressionsplasmid pSOD16 von Halewell et al, (siehe oben). Das Plasmid pSOD16cf2 wurde aus pSOD16 durch Ersatz eines Teils der für den Carboxylterminus codierenden Region des SOD-Gens und stromabwärts gelegener Polylinkersequenzen bis zur EcoRI-Stelle durch die neue Polylinkersequenz
Der Ersatz dieser Polylinkersequenz führt zur Entfernung des natürlichen Carboxyl-terminalen Gln von SOD.

pSODHAV2-2

Ein 1390 Basenpaar langes BglII (repair)/XmnI-Fragment wurde aus dem Abbaugemisch von pHAV8116SV7d (sie Nr. D.4) isoliert und wurde in die SmaI-Schnittstelle von pSOD16cf2 kloniert. DNA des entstandenen Klons mit der HAV-Insertion in der richtigen Orientierung wurde mit KpnI abgebaut und das überstehende 3'-Ende wurde mit T4-DNA-Polymerase entfernt, anschließend mit HindIII abgebaut und diese Stelle wurde mit Reversertranskriptase gefüllt. Die entstandene lineare DNA mit glatten Enden wurde religasiert und in den E. coli-Stamm D1210 (Sadler, et al. Gene, (1980) 8: 270-300) unter Erhalt von pSODHAV2-2 transformiert.
pSODHAV2-2 wurde in E. coli RRIΔM15 (Ruther, U., Nucleic Acid Res (1982) 10: 5765-5772) zur Expression unter Erhalt eines Fusionsproteins von SOD, bei dem das natürliche Carboxyl-terminale Gln von SOD durch Met-Glu und die anschlies-sende HAV-Sequenz, beginnend mit Leu, codiert von HAV-Nukleotid 2072 des VP3-Capsidproteins und durchgehend von VP1 bis Val, codiert von Nukleotid 3201 und endend mit der Sequenz Gly-Arg- Leu-Asn-Asp, codiert vom Polylinker, ersetzt war, transformiert.

pSODHAVP1/1

pSODHAVP1/1 enthält zusätzlich zu den Sequenzen in pSODHAV2-2 den Rest von VP3 und die Carboxyl-terminale Hälfte von VP2. pSODHAV2-2 wurde mit NcoI (5' zu den HAV-Sequenzen) und mit SacI, das innerhalb der VP1- Sequenz schneidet, abgebaut. Das 3,4 kb Fragment, das alle SOD Sequenzen und einen Teil der VP1-Sequenzen enthielt, wurde gelchromatographisch isoliert, an ein 1806 bp NcoI/SacI Fragment, isoliert aus pHAV81167d (siehe Nr. D.4) ligasiert und in den E. coli Stamm D1210 unter Erhalt von pSODHAVP1/1 transformiert.
Bei Expression im E. coli Stamm RRIΔM15 ergab SODHAVP1/1 ein Fusionsprotein von SOD mit HAV-Sequenzen, beginnend an dem Val von VP2, codiert bei Nukleotid 1182, durchgehend bis zu Val von VP1, codiert von Nukleotid 3201.

pSODHAV9-1

pSODHAV9-1 wurde von pSODHAVP1/1 abgeleitet und enthält die zusätzliche Hälfte von VP2, wodurch die volle P1-Precursorsequenz erzeugt wird. Ein 438 Basenpaar langes BstXI Fragment aus pHAV47 (siehe D.1.), welches das 5'-Ende von VP2 enthielt, wurde gelchromatographisch isoliert und an das einzelsträngige synthetische DNA-Oligomere über den BstXI Überschuß am 3'-Ende des 438 bp langen Fragments ligasiert. Die einzelsträngige Sequenz entspricht dem codierenden Strang des HAV-Genoms vom äußeren 5'-Ende des P1-Precursors. Das Oligomere wurde an dessen 5'-Ende phosphoreliert und der dem Oligomeren komplementäre Strang wurde mit reverser Transkriptase unter Verwendung des 3'-Hydroxyls des Überstandes des 438 Basenpaar langen Fragments von BstXI als Primer synthetisiert. Das entstandene Fragment wurde anschließend mit NcoI abgebaut und das NcoI/glatte Fragment einschließlich der angefügten 30 Basenpaare des doppelsträngigen Oligomeren wurden gelchromatographisch isoliert und an pSODHAVP1/1 ligasiert, das zuvor mit NcoI bei Raumtemperatur 2 Stunden lang abgebaut worden war. Der Reaktionsansatz wurde verdünnt und die vier dNTPs, Klenow, und zusätzliche Ligase wurden zugesetzt, um die DNA zu zirkularisieren. Das Ligasierungsgemisch wurde in E. coli RRIΔM15 transformiert, wobei pSODHAV9-1 erhalten wurde, das die HAV-Nukleotide 734 bis 3201 (VP2, VP3, VP1) enthielt.

pSODHAV10-5

pSODHAV10-5 wurde analog dem oben für pSODHAV9-1 beschriebenen Verfahren konstruiert, jedoch mit der Ausnahme, daß das synthetische DNA- Oligomere verwendet wurde. Das Oligomere liefert ein Stoppcodon und eine Ribosomenbindungsstelle stromabwärts zusätzlich zu den HAV-Sequenzen. pSODHAV10-5 führt bei Expression zu freier SOD, wobei das natürliche enständige Gln durch die Sequenz Met-Ile-Glu-Glu-Leu ersetzt ist und wobei auch dem freien HAV P1 13 Carboxyl-terminale Aminosäuren fehlen, die durch Gly-Arg-Leu-Asn-Asp ersetzt wurden.

Expression

Zellen des E. coli Stamms RRIΔM15, Ruther, U. (siehe oben) wurden mit den oben beschriebenen Plasmiden transformiert und Einzelkolonie- Transformanten wurden über Nacht bei 37ºC in 2 ml L-Bouillon plus 100 ug/ml Ampicillin gezüchtet. Glycerin (50%)-ansätze dieser Kulturen wurden hergestellt und bei -20ºC gelagert.
Zur Analyse der Proteinexpression wurden über Nacht Kulturen in den Medien, wie oben angegeben, ausgehend von den Glycerinansätzen angesetzt. Diese Kulturen wurden 1/100 im gleichen Medium verdünnt und bei 37ºC bis zu einer OD&sub6;&sub5;&sub0; von 0,5-0,8 gezüchtet. Nicht-induzierte Kontrollen wurden hergestellt, indem ein 1 ml Anteil der wachsenden Kultur mit einem gleichen Volumen desselben Mediums verdünnt wurde. Die durch den Tac-Promotor gesteuerte Proteinsynthese wurde entweder durch Verdünnung von 1 ml wachsender Kultur mit Medium plus 2 mM IPTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid) oder durch Zugabe eines 1/100 Volumens von 100 mM IPTG zu einem größeren Volumen der Kulturen induziert, wobei in beiden Fällen zum Erhalt von 1 mM IPTG 3-4 Stunden bei 37ºC induziert wurde. Kulturen in großem Maßstab enthielten 50 ml Medium in 500 ml Kolben oder 250 ml Medium in 1-Liter Kolben.
Die Zellen wurden in Anwesenheit von SDS und DTT zur Analyse auf denaturierenden Polyacrylamidgelen (Laemmli, Nature (1970) 277: 680) oder mit Glaskugeln zur Analyse auf nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen lysiert.
Die Expression wurde durch das Auftreten einer Proteinbande bzw. von Proteinbanden mit der erwarteten Größe, die in induzierten Probenlysaten, aber nicht in nicht-induzierten Proben vorlagen, detektiert; die induzierten Proteine wurden mit ihren jeweiligen erwarteten Molekulargewichten für alle Plasmide detektiert.
Die HAV-Komponente der Fusionen und des freien p1 von pSODHAV10-5 wurden mittels Coomassie-Färbung und durch spezifische Reaktion mit anti-HAV-Antikörpern detektiert. Die SOD-Komponente der Fusionen wurde durch Coomassie-Färbung und durch anti-SOD Antikörper detektiert; freie SOD wurde sowohl durch Coomassie-Färbung als auch durch enzymatische Aktivität in den nativen Gelen detektiert. Die Gele wurden entweder mit Coomassie-Blau gefärbt oder einer Western-Analyse nach Elektroblotting auf Nitrocellulosefiltern unterworfen (Towbin et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1979) 76: 3450); die Blots wurden mit 0,3% Tween 20 in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC inkubiert, mit anti-HAV oder anti-SOD in einer 1:100 Verdünnung behandelt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. (Kaninchen anti-HAV wurde unter Verwendung teilweise zerstörter HAV-Virionen hergestellt. Anti-human SOD wurde durch aufeinanderfolgende Exposition von Kaninchen gegenüber gereinigtem menschlichen SOD, gebildet in Hefe (siehe EPO 138 111) hergestellt.) Die Blots wurden ausgiebig in 0,3% Tween/PBS gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer 1:200 Verdünnung von Meerrettichperoxidase, konjugiert an einen Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, inkubiert, anschließend gewaschen und mit einem Bio-Rad HRP Farbreagens in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in 8 mM Tris HCl pH 7,5, 16 mM NaCl, 0,015% H&sub2;O&sub2;, 16% Methanol behandelt.
Die SOD-Aktivität in nicht-denaturierenden Gelen wurde nach dem Verfahren von Beauchamp, C., et al., Anal Biochem (1971) 44: 276 identifiziert. In Kürze: die Gele wurden in Abwesenheit von Licht eingeweicht, zuerst in 2,5 mM Nitroblau-Tetrazolium 20 Minuten bei Raumtemperatur, anschließend in 36 mM KPO&sub4;, pH 7,8, 29 mM TEMED, 28 uM Riboflavin 15 Min. bei Raumtemperatur. Der Puffer wurde entfernt und das Gel wurde 15 Min. von unten beleuchtet, wobei eine Fluoreszenslichtbox verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 MG (induziert) Plasmid Coomassie Färbung (PAGE) "Western" mit anti-HAV-Antikörper SOD Aktivität berechnet beobachtet nt = nicht getestet
Die Expressionsprodukte machten etwa 1-3% des gesamten zellulären Proteins für pSODHAV2-2 und pS0DHAV1/1 und etwa um 50fach weniger für pSODHAV9-1 und pSODHAV10-5 aus.
Die Fusionsproteine SODHAV2-2 und SODHAVP1/1 wurden auf präparativen SDS-Acrylamidgelen gereinigt, durch Coomassie-Färbung lokalisiert und elektrisch eluiert. Diese gereinigten Proteine wurden Mäusen injiziert und die entstandenen Sera wurden auf ihre Reaktivität mit dem HAV- Virus auf Wesertern-Blots und im ELISA-Assay getestet. Mäuse-Antisera gegen SODHAV2-2 reagieren mit einem 34 kd Protein von dem HAV-Virus auf Western-Blots, welches HAV-VP1 zu sein scheint und daher auch als anti- SOD-VP1 bezeichnet wurde. In einem Einfang-ELISA zeigten sowohl Maus- anti-SODHAV2-2 als auch -anti-SODHAVP1/1 Reaktion mit dem HAV-Virus.
In dem ELISA-Assay wurden Microtiter-Kavitäten über Nacht mit IgG von einem HAV-seropositiven Patienten beschichtet. Die beschichteten Kavitäten wurden gewaschen und 1 Stunde mit gereinigtem HAV inkubiert. Verdünnungen der Mäusesera wurden anschließend in den Cavitäten 1 Stunde lang inkubiert. Die Kavitäten wurden dann 1 Stunde mit Peroxidase, konjugiert an Ziege-anti-Maus-IgG und anschließende Reaktion mit dem Peroxidasesubstrat 2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat] (ABTS) und H&sub2;O&sub2; inkubiert. Anschließend wurden die Platten auf einem ELISA-Lesegerät bei 414 nm abgelesen; der Titer ist als reziproker Wert der Verdünnung, die 50% des Maximalabsorptionswertes ergibt, ausgedrückt. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Kontrolle Maus a < 10
Kontrolle Maus b < 10
Maus-Anti-SOD-VP1 a 308
Maus-Anti-SOD-VP1 b 158
Maus-Anti-SOD-P1 a 183
Maus-Anti-SOD-P1 b 160
Maus-Anti-SOD-P1 c 30
Maus-Anti-SOD-P1 d 42
In weiteren Assays wurden 20 ng SODHAV2-2 und SODHAVP1/1 auf Nitrocellulosestreifen getüpfelt und die Streifen wurden dann mit zwei HAV seropositiven Humansera und zwei seronegativen Humansera umgesetzt. Die Streifen wurden gewaschen und mit Peroxidase in Konjugation an Ziege- anti-Mensch-IgG umgesetzt und dann mit dem Peroxidasesubstrat 4-Chlor-1- naphthol umgesetzt, um die Bindung des Peroxidase-konjugierten Antikörpers sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigten, daß SODHAVP1/1 mit beiden seropositiven Proben, aber mit keiner seronegativen Probe reagierte. Das SODHAV2-2 reagierte mit einer der beiden seropositiven Proben und keiner der seronegativen Proben.
In einem weiteren Assay wurde SODHAVP1/1 als beschichtendes Antigen in einem ELISA-Assay mit HAV-seronegativen und HAV-seropositiven Human- und Schimpansensera verwendet. Alle vier positiven Sera zeigten eine größere Reaktion mit dem SODHAVP1/1 als die vier negativen Sera. In diesem Assay wurden Microtiterkavitäten mit einer Lösung von 5 ug/ml SODHAVP1/1 beschichtet. Die beschichteten Kavitäten wurden dann mit einer 1:50 Verdünnung der verschiedenen Schimpansen und Humansera 1 Stunde reagieren gelassen und anschließend mit Peroxidase in Konjugation an Ziege-anti-Human-IgG (das mit Schimpansen-IgG Kreuzreaktion zeigt) inkubiert. Die Cavitäten wurden schließlich mit ABTS und H&sub2;O&sub2; inkubiert und anschlies-send in einem ELISA-Lesegerät bei 414 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Absorptionseinheiten angegeben. Serum HAV-Reaktiv Human Chimp

D.3. Konstruktion von Aminosäuresequenzen entsprechend möglichen Epitopen

Drei kurze Aminosäuresequenzen wurden basierend auf der Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz von HAV und dem Vergleich mit bekannten Epitopen des Poliovirusproteins synthetisiert. Die Hydrophilie und die Struktureigenschaften als Funktion der Position sowohl für das Poliopolypeptid als auch das HAV-Polypeptid wurden mit Hilfe einer Computeranalyse verglichen. "Peaks", die vermutliche Regionen mit Strukturhomologie zeigten, wurden mit entsprechenden römischen Ziffern identifiziert und sind in Figur 4 gezeigt.
Die Regionen III und V des Polioviruspolypeptids stellen hauptsächliche antigene Stellen von VP1 (Minor et al, Nature (1983) 301: 674-679; Evans et al, Nature (1983) 304: 459-462) dar.
Basierend auf dieser Information und auf der Homologie zwischen HAV und Polio wurden zwei Polypeptide mit Sequenzen, die zu den entsprechenden HAV-Peaks Va und IIIa (Figur 4) führten, synthetisiert. Ein drittes Polypeptid entsprechend einer HAV- Region mit ähnlichen Eigenschaften wie von Va und IIIa, aber ohne die homologe Region in der Poliosequenz, wurde ebenfalls synthetisiert.
Die drei synthetisierten Sequenzen sind wie folgt, wobei die Zahlen den Positionen gemäß der abgeleiteten Sequenz nach Figur 1 entsprechen. Peak IIIa: Peak Va Keine Polio Homologie
Jede dieser Sequenzen endet mit einem C-terminalen Cystein zur Verwendung bei der Konjugation in einer kovalenten Bindung an ein Trägerprotein ausreichender Größe, um dem Peptidepitop Immunogenizität zu verleihen.
Die synthetisierten Proteine wurden an das Trägerprotein Schneckenhämocyanin (KLH) mittels Disulfidbindung über das Cystein des Peptids unter Verwendung des m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimidesters (MBS) als Kopplungsreagenz konjugiert (Liu et al, Biochem (1979) 18:690-697; Green,N., et al, Cell (1982) 28:477-487). Alternativ wurden die Peptide an KLH unter Verwendung von Glutaraldehyd (0,05-0,3%) gekoppelt.
Die konjugierten Peptide wurden Kaninchen injiziert. Seren, die 31- 100 Tage später erhalten wurden, enthielten Antikörper gegen die injizierten Konjugate, wie mittels ELISA bestimmt wurde. Western Blots unter Verwendung der Antisera gegen Gele, die mit HAV aus einer Gewebskultur gelaufen waren, zeigten Immunpräzipitate für die in Antwort auf das Protein entsprechend dem Peak Va und auf das Protein mit fehlender Homologie zu Polio gebildeten Antisera. Es wurde eine Immunpräzipitation mit den Banden entsprechend dem VP1 Protein beobachtet.

D.4. Herstellung von nichtinfektiösen (deletierten) Virionen

Deletierte Virionen können unter Verwendung von Expressionsvektoren, die mit prokaryotischen Zellen, Hefe- und Säugerzellen kompatibel sind, hergestellt werden.
Der P1 Precursor von verschiedenen Picornaviren, die in vitro synthetisiert worden sind, kann zu individuellen Virionproteinen, die sich dann zu immunreaktiven virionenartigen Partikeln zusammenbauen, weiterverarbeitet werden (Nicklin, et al, Biotechnology (1986) 4:33; Palmenberg, et al, J Virol (1979) 32:770; Shih, et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1978) 75:5807; Hanecak, et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1982) 79:3973; Grubman, et al, J Virol (1985) 56:120).
Um einen ähnlichen Effekt in vivo zu erhalten, kann E.coli, das mit pSODHAV10-5 transfiziert ist und das den P1 Precursor (siehe D.2) produziert, so modifiziert werden, daß die viruscodierte Proteinase (3C) zusammen mit dem P1-Protein gebildet wird. Die entstandene Kombination des P1-Precursors in Koexpression mit Proteinase führt zu nichtinfektiösen zusammmengebauten virionartigen Teilchen. Ähnliche Konstruktionen, die den P1-Precursor und die Proteinase exprimieren, können in Hefe- und Säugerzellen gebildet werden. Zur Bildung nichtinfektiöser virionartiger Teilchen können Säugerzellen mit dem HAV- Genom unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Elemente transfiziert werden. Durch Deletion des 3'-Endes des Genoms bis zu den Sequenzen, die für 3C kodieren (d.h. die 3D-Region) wird das Replikase-Gen entfernt, wobei die Replikationsfähigkeit des Virus lahmgelegt wird. Die transfizierten Zellen bilden alle Virionproteine von der P1- und P2-Region zusätzlich zu 3A, 3B und 3C. Dies reicht aus, um virionartige Partikel zu erzeugen, aber führt nicht zu infektiösen Viren.
Beispielsweise wird ein Expressionsvektor, der mit Säugerzellen kompatibel ist, pHAV8161-SV7d wie in Figur 5 gezeigt, konstruiert. Die codierenden Sequenzen von HAV werden durch Abbau von pHAV1*, pHAV8 und pHAV16 (D.1) erhalten. Die Replikations- und Kontrollsysteme von Säugern werden durch pSV7d (siehe unten) welches ein pBR322 Derivat ist, das so modifiziert ist, daß es den SV40 Replikationsorigin, den frühen Promotor und Polyadenylierungsstellen enthält, bereitgestellt. Es besitzt auch einen Polylinker mit verschiedenen Restriktionsstellen stromabwärts von dem SV40 Promotor, ebenso wie TAA Stoppcodons in allen drei Leserastern stromabwärts von dem Polylinker.
Ausführlicher: pSV7d wurde wie folgt konstruiert: das 400 bp BamHI/HindIII-Fragment, das den SV40 Replikationsorigin und den frühen Promotor enthielt, wurde von pSVgt1 (Mulligan et al, Mol Cell Biol (1981) 1:854-864) herausgeschnitten und gereinigt. Das 240 bp SV40 BclI/BamHI-Fragment, welches die SV40 polyA Anheftungsstellen enthielt, wurde aus pSV2/dhfr herausgeschnitten (Subramani et al, J Mol Cell Biol (1981) 1:854-864) und gereinigt. Die Fragmente wurden durch den Linker Stop Codons Überschuß
fusioniert, der die gezeigten Restriktionsstellen und Stoppcodons in allen drei Leserastern enthielt.
Das entstandene 670 bp lange Fragment, welches den SV40 Replikationsorigin, den frühen SV40Promotor, den Polylinker mit Stoppcodons und die SV40Polyadenylierungsstelle enthielt wurde in die BamHI- Schnittstelle von pML, einem pBR322-Derivat mit einer etwa 2,5 kb langen Deletion kloniert (Lusky und Botchan, Cell (1984) 36: 391), dabei wurde pSV6 erhalten. Die EcoRI- und EcoRV-Schnittstellen in den pML-Sequenzen von pSV6 wurden durch Abbau mit EcoRI und EcoRV und Behandlung mit Bal31-Nuklease zur Entfernung von etwa 200 bp pro Ende behandelt und religalisiert, wobei pSV7a erhalten wurde. (Die Bal31-Resektion entfernte auch eine BamHI-Restriktionsschnittstelle, die die SV40-Region etwa 200 bp von der EcoRV-Schnittstelle entfernt flankiert.) Um die andere BamHI- Schnittstelle, die die SV40-Region flankiert zu entfernen, wurde pSV7a mit NruI, das in der pML-Sequenz stromaufwärts des Replikationsorigins schneidet, abgebaut und mittels Ligasierung der glatten Enden unter Erhalt von pSV7b rezirkularisiert.
pSV7c und pSV7d stellen aufeinanderfolgende Polylinkeraustausche dar. Zuerst wurde pSV7b mit StuI und XbaI abgebaut und der Linker wurde in den Vektor unter Erhalt von pSV7c ligasiert. pSV7c wurde mit BglII und XbaI abgebaut und der Linker
wurde unter Erhalt von pSV7d ligasiert.
Zur Konstruktion von pHAV8161-SV7d wurde pHAV161 (siehe oben) mit BamHI und SalI unter Freisetzung des 4,2 kb Fragments, das für einen Teil der HAV-Sequenz codiert, abgebaut. pHAV8 wurde mit SalI und BamHI unter Erhalt der stromaufwärts der SalI-Schnittstelle in der pHAV161-Insertion gelegenen codierenden Sequenz abgebaut. Diese zwei Fragmente wurden in die BamHI-Schnittstelle von pSV7d ligasiert. Der entstandene Vektor pHAV8161-SV7d stellt die ligasierten HAV-Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 2076 codieren, unter die Kontrolle des SV40-Promotors und direkt hinter das durch den Vektor gelieferte Stoppcodon wie in Figur 8 gezeigt ist.
pHAV8161-SV7d kann in COS-Zellen transfiziert werden und die vorübergehende Expression wurde mittels Immunfluoreszens unter Verwendung von konvaleszentem Humanserum für HAV getestet. Die Plasmid-DNA aus erfolgreichen COS-Transformanten kann anschließend verwendet werden, um Vektoren zur stabilen Expression zu konstruieren.

D.5. Hybridteilchen von HAV als Immunogene

Auf die U.S. S.N. 650 323, eingereicht am 12. April 1984 und dem hier Bezeichneten übertragen wird hiermit Bezug genommen. Die Anmeldung beschreibt die Konstruktion von Hybridteilchen des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg), welches Insertionen für Fremdimmunogene in den codierenden Teil der Prä-Oberfläche (pre-S) im Leseraster mit den Codons für HBsAg enthält. Das darin beschriebene Plasmid pDC101 enthält einen Teil des pre-S/HBsAg Gens einschließlich 55 Codons der pre-S-Region, in einer GAPDH-kontrollierten Expressionskassette, die in die BamHI- Schnittstelle eines pBR322-Derivats kloniert war. Die in Bezug genommene Anmeldung beschreibt die Insertion der gewünschten Immunogene wie beispielsweise der gD (Glycoprotein D) antigenen Schnittstelle in eine einzige EcoRI-Schnittstelle, die in der pre-S-Region von pDC101 vorliegt, wobei das hybride Plasmid pDC103 erhalten wurde. In ähnlicher Weise können erfindungsgemäß die gewünschten Epitope, die sich von dem HAV-Genom ableiten, mit geeigneten EcoRI-Linkern bereitgestellt werden und im richtigen Leseraster in die EcoRI-Schnittstelle von pDC101 inseriert werden oder verwendet werden, um die gD-Codons in dem pDC103-Hybrid zu ersetzen. pDC103 ist bei der ATCC hinterlegt und besitzt die Hinterlegungsnummer 20726.
Die Konstruktion von pDC-104, ein Hefeexpressionsvektor für ein hybrides Gen, welches die Sequenz, die für das HAV-VP1-Epitop, welches in Figur 6 gezeigt ist, codiert, war wie folgt. Das von HAV1307 erhaltene HindIII/SalI-Fragment (und welches die Codons für die Aminosäuren 445- 657 der VP1-Region enthielt) wurde mit synthetischen EcoRI-Linker versehen und in die EcoRI-Schnittstelle von pDC103 anstelle der gD-Sequenzen inseriert. Das entstandene Produkt wurde in den Hefewirt S. carlsbergensis 2150-2-3 transformiert und die kultivierten Wirte wurden gewonnen. Das hybride HBV/HAV-Teilchen wurde in Lysaten von Hefezellen detektiert, wobei immobilisierte HBV-Antisera verwendet wurden, um das Antigen einzufangen und unter Verwendung eines zweiten löslichen Antiserums gegen HAV, das mit Meerrettichperoxidase markiert war. Alternativ können gebundene anti-HAV-Antisera verwendet werden, um die Teilchen einzufangen, worauf anschließend ein zweites markiertes anti-HBV-Antiserum verwendet wird.
pWG-1, ein Hefeexpressionsvektor, der die codierende Sequenz für das Hybridgen, das das VP-1 neutralisierende Epitop in dem teilchenbildenden Teil des HBsAg-codierenden Gens beherbergt, wird ähnlich (siehe Figur 7) konstruiert. Die DNA entsprechend dem HAV-Epitop der folgenden Sequenz:
codiert für die Aminosäuren 792-848 und wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen automatischen Oligonukleotidsynthesizers synthetisiert. Das entstandene synthetische Oligomere, das die BamHI-Schnittstellen enthält, wird anschließend in die BglII-Schnittstellen des Wirtsvektors pDC101, der in der U.S. S.N.650 323 (siehe oben) beschrieben ist, kloniert, wobei ein 150 bp langes Fragment des HBsAg, das für ein dominantes Epitop codiert, ersetzt wird. Der entstandene Vektor pWG- 1 wird in S. carlsbergensis wie oben transformiert und die Transformanten werden nach Leu+ selektioniert. Erfolgreiche Transformanten werden kultiviert und gezüchtet und die modifizierten HBsAg-Teilchen werden aus dem Medium gewonnen und ihr bifunktioneller Charakter wird wie oben bestätigt.
Immunogene Hybridteilchen werden somit hergestellt, wobei die fusionierten codierenden Sequenzen für HBsAg und HAV verwendet werden, und sie liefern erhöhte Immunogenizität für die HAV-Epitope.

Claims

1. Nukleotidsequenz, im wesentlichen identisch mit der des HAV-Genoms, wie in Figur 1 dargestellt.

2. Nukleotidsequenz, codierend für ein virales Polypeptid, das im wesentlichen mit dem identisch ist, das von der HAV-Genomsequenz, wie in Figur 1 gezeigt, codiert wird.

3. Rekombinantes Expressionssystem, umfassend einen codierenden Teil, abgeleitet von der Sequenz nach Anspruch 1, in ausführbarer Weise geknüpft an eine mit dem gewünschten Wirt kompatible Kontrollsequenz, wobei der codierende Teil jeder beliebige Teil außer Fragmente, die im wesentlichen identisch mit den Nukleotiden 328-3305, 2074-3047, 1812-3305, 1969-3047, 1806-3305, 1808-1834, 2207-2239, 2288- 2323, 2324-2413, 2474-2530, 2675-2716 oder 23-3295 der Sequenz nach Figur 1 sind, ist.

4. Rekombinante Wirtszellen, transformiert mit dem Expressionssystem nach Anspruch 3.

5. Protein, gebildet von den Zellen nach Anspruch 4.

6. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin, angrenzend an den codierenden Teil und im Leseraster damit eine fusionierte Nukleotidsequenz, die für ein nicht-HAV-codiertes Protein oder einen Teil davon codiert, enthält.

7. Rekombinantes Expressionssystem, umfassend einen codierenden Teil, abgeleitet von der Sequenz nach Anspruch 1, in ausführbarer Weise gebunden an eine mit dem gewünschten Wirt verträgliche Kontrollsequenz, enthaltend weiterhin stromaufwärts des codierenden Teils und getrennt durch ein Stopcodon, eine fusionierte Nukleotidsequenz, die für ein nicht-HAV-codiertes Protein oder einen Teil davon codiert.

8. System nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die fusionierte DNA-Sequenz für menschliche Superoxid-Dismutase oder einen Teil davon codiert.

9. System nach den Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die fusionierte DNA-Sequenz für ein nicht-HAV-Teilchen-bildendes Protein codiert.

10. Rekombinante Wirtszellen, transformiert mit dem System nach Anspruch 6 oder 7.

11. Protein, gebildet von den Zellen nach Anspruch 10.

12. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der codierende Teil die Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 zwischen den Nukleotidpositionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2072-3201, 1182-3201 und 734-3201, ist.

13. Antigenes Peptid, umfassend eine Sequenz, abgeleitet von der Sequenz nach Anspruch 1, in covalenter Bindung an den C-Terminus an Cystein, ausgewählt aus der Gruppe:

14. Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich-net, daß das Protein ein Epitop von HAV in Kopplung an ein nicht-HAV-Teilchen-bildendes Protein, unter Bildung eines Komplexes enthält, so daß der Komplex in der Lage ist, ein Teilchen zu bilden, das gegen eine HAV-Infektion immunogen ist.

15. Protein nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß das Epitop von den Aminosäuren 445- 657 oder 792-848 der HAV-Polypeptidsequenz abgeleitet ist.

16. Oligonukleotid, geeignet zur Detektion auf die Anwesenheit von HAV in einer biologischen Probe, umfassend eine DNA-Sequenz, abgeleitet von der Nukleotidsequenz nach Figur 1, wobei das Oligonukleotid ein Fragment nach Anspruch 3 ist.

17. Protein nach einem der Ansprüche 5, 11 und 13 bis 15 zur Verwendung in einem Impfstoff, der gegen das Hepatitis-A-Virus wirksam ist.

18. Expressionssystem für ein deletiertes HAV-Virion, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend für das P1-Precursor-Protein, wie in Figur 1 gezeigt, wobei die Nukleotidsequenz in ausführbarer Weise an geeignete Kontrollsequenzen gebunden ist und in eine Wirtszelle transformiert ist, die in der Lage ist, eine Protease zu erzeugen, die wirksam den P1-Precursor unter Erhalt eines deletierten HAV-Virions spaltet.

19. Expressionssystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease von der 3C HAV- Region der Figur 1 codiert ist.

20. Expressionssystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das deletierte Virion von einer DNA, entsprechend den Nukleotiden 734-5767 der Sequenz nach Figur 1 codiert ist.

21. Protein, gebildet von einem Expressionssystem nach einem der Ansprüche 18 bis 20.

22. Expressionssystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz für VP2 codiert.

23. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend HAV-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen nach Anspruch 4 oder Anspruch 10 oder Zellen, die ein Expressionssystem nach Anspruch 18 enthalten, kultiviert und das so erhaltene Protein gewinnt.