DE69430246T2

DE69430246T2 - Rekombinante tetc-fusionsprotein enthaltene impfstoffzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69430246T2
Application number: DE69430246T
Authority: DE
Inventors: Steven Neville Chatfield; Gordon Dougan; Carlos Estenio Hormaeche; Mohammed Anjam Khan
Original assignee: Medeva Holdings BV
Current assignee: Medeva Holdings BV
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2014-07-30
Also published as: CA2168459C; WO1995004151A3; CA2168459A1; EP0712442A1; AU7235794A; WO1995004151A2; JPH09500540A; EP0712442B1; DE69430246D1; ATE215124T1

Description

Diese Erfindung betrifft DNA-Konstrukte, replizierbare Expressionsvektoren, die diese Konstrukte enthalten, Bakterien, die diese Konstrukte enthalten, und Vakzinen, die diese Bakterien oder durch sie exprimierten Fusionsproteine enthalten. Genauer gesagt betrifft die Erfindung neuartige DNA-Konstrukte, die das C-Fragment des Tetanus-Toxins kodieren, als auch Fusionsproteine, die das C-Fragment des Tetanus-Toxins enthalten.
Die Herstellung von DNA-Konstrukten, die zwei oder mehr heterologe Proteine kodieren, ist bezüglich der Exprimierung dieser Proteine in einem geeigneten Wirt in Form eines einzigen Fusionsproteins bekannt. Allerdings wurde häufig festgestellt, dass eine Fusion zweier Proteine in dieser Art und Weise zu einem inkorrekt gefalteten chimären Protein führt, das die Eigenschaften der Einzelkomponenten nicht beibehalten hat. Zum Beispiel sind die B-Untereinheiten der Vibrio cholerae (CT-B)- und E. coli (LT-B)-Enterotoxine starke mukosale Immunogene, doch können Genfusionen an diese Untereinheiten die Struktur und Eigenschaften der Träger und folglich deren Immunogenität verändern (siehe M. Sandkvist et al., J. Bacteriol. 169, S. 4570-6, 1987, Clements et al., 1990 und M. Lipscombe et al., Mol. Microbiol. 5, S. 1385, 1990). Außerdem werden viele in Bakterien exprimierte heterologe Proteine nicht in löslichen, korrekt gefalteten oder aktiven Formen erzeugt und zeigen die Neigung, sich als unlösliche Aggregate anzuhäufen (siehe C. Schein et al., Bio/Technology 6, S. 291-4, 1988 und R. Halenbeck et al., Bio/Technology 7, S. 710-5, 1989).
In unserer früheren unveröffentlichten Internationalen Patentanmeldung PCT/GB93/01617 ist beschrieben, dass durch Bereitstellung einer das C-Fragment des Tetanus-Toxins (TetC) kodierenden DNA-Sequenz, die über eine "Gelenkregion" an eine zweite, ein Antigen kodierende Sequenz geknüpft ist, die Expression der Sequenz in Bakterienzellen relativ zu Konstrukten erhöht ist, bei denen das C- Fragment nicht vorhanden ist. Zum Beispiel war die Expressionsmenge des Volllänge-P28-Glutathion-S-Tansferase-Proteins von S. mansoni höher, wenn als eine Fusion an TetC vom nirB-Promotor exprimiert, als wenn lediglich das P28- Protein vom nirB-Promotor exprimiert wurde. Die TetC-Fusion an das Volllänge-P28- Protein von S. mansoni war löslich und exprimierte sowohl in E. coli als auch in S. typhimurium. Außerdem war das TetC-P28-Fusionsprotein durch eine Glutathion- Agarose-Matrix affinitätsreinigbar, was nahelegt, dass sich P28 korrekt gefaltet und eine Konformation angenommen hatte, die noch zur Bindung an ihr natürliches Substrat in der Lage war. Es wurde bereits früher in Betracht gezogen, dass eine Gelenkregion, bei der es sich üblicherweise um eine Sequenz handelt, die einen hohen Anteil der Prolin- und/oder Glycin-Aminosäuren kodiert, zur Förderung der unabhängigen Faltung sowohl des TetC als auch des damit fusionierten antigenen Proteins wesentlich ist. Allerdings wurde nun überraschenderweise im Hinblick auf die oben erwähnten Untersuchungen an CT-B und LT-B entdeckt, dass dann, wenn die Gelenkregion zwischen dem TetC und einem zweiten Antigen wie P28 weggelassen wird, die Proteine, die die Fusion eingehen, eine korrekte Faltung zeigen, wie durch Affinitätsreinigung auf einer Glutathion-Agarose-Matrix nachgewiesen.
Demgemäß wird mit der vorliegenden Erfindung bei einer ersten Erscheinungsform ein DNA-Konstrukt bereitgestellt, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein der Formel TetC-(Z) -Het kodiert, worin TetC das C-Fragment des Tetanus- Toxins ist; Het ein heterologes Protein ist; Z eine Aminosäure ist, und kleiner 4 ist, vorausgesetzt, dass (Z)a die Sequenz Gly-Pro nicht enthält.
Bei einer Ausführungsform ist (Z)a eine Kette von zwei oder drei Aminosäuren, wobei die DNA-Sequenz dafür eine Restriktionsendonuklease-Spaltstelle definiert.
Bei einer anderen Ausführungsform ist Null.
Generell enthält die Gruppe (Z)a überhaupt kein Glycin noch Prolin.
Die Gruppe (Z)a kann eine Kette von Aminosäuren sein, die im wesentlichen frei von biologischer Aktivität ist.
Bei einer zweiten Erscheinungsform wird mit der Erfindung ein replizierbarer Expressionsvektor bereitgestellt, der zum Beispiel zur Verwendung in Bakterien geeignet ist, enthaltend ein DNA-Konstrukt, wie zuvor definiert.
Bei einer anderen Erscheinungsform wird mit der Erfindung ein Wirt (z. B. ein Bakterium) bereitgestellt, enthatlend ein wie zuvor definiertes DNA-Konstrukt, wobei das DNA-Konstrukt im Wirt entweder in Form eines replizierbaren Expressionsvektors, z. B. eines Plasmids, oder als Teil des Wirtschromosoms vorhanden ist, oder beides.
Bei einer weiteren Erscheinungsform wird mit der Erfindung ein Fusionsprotein der Form TetC-(Z)a-Het, wie zuvor definiert, vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form bereitgestellt, welches Fusionsprotein durch einen replizierbaren Expressionsvektor, wie zuvor definiert, exprimierbar ist.
Bei einer weiteren Erscheinungsform wird mit der Erfindung ein Verfahren zur Präparierung eines Bakteriums (vorzugsweise eines attenuierten Bakteriums) bereitgestellt, welches Verfahren das Transformieren eines Bakteriums (z. B. eines attenuierten Bakteriums) mit einem wie zuvor definierten DNA-Konstrukt umfasst.
Mit der Erfindung wird auch eine Vakzine-Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein attenuiertes Bakterium oder ein Fusionsprotein, wie zuvor definiert, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Das heterologe Protein "Het" kann zum Beispiel eine heterologe antigene Sequenz, zum Beispiel eine von einem Virus, Bakterium, Fungus, Hefe oder Parasiten stammende antigene Sequenz sein.
Bei Beispielen der viralen antigenen Sequenzen handelt es sich um solche, die von einem Typ des humanen T-Zell-Leukämie-Virus (HIV), wie etwa HIV-1 oder HIV-2, der CD4-Rezeptor-Bindungsstelle von HIV, zum Beispiel HIV-1 oder -2, Hepatitis A-, B- oder C-Virus, humanem Rhinovirus, wie etwa Typ 2 oder Typ 14, Herpes simplex- Virus, Poliomyelitis-Virus Typ 2 oder 3, Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV), Tollwut-Virus, Rotavirus, Grippevirus, Coxsackie-Virus, humanem Papilloma-Virus (HPV), zum Beispiel dem Typ 16-Papilloma-Virus, dem E7-Protein davon, und Fragmenten, enthaltend das E7-Protein oder seine Epitope; und Simian-T-Zell- Leukämie-Virus (SIV), stammen.
Beispiele der von Bakterien stammenden Antigene umfassen solche, die von Bordetella pertussis (z. B. P69-Protein- und filamentöses Hämagglutinin-(FHA)- Antigene), Vibrio cholerae-, Bacillus anthracis- und E. coli-Antigene, wie z. B. E. coliwärmelabile Toxin-B-Untereinheit (LT-B), E. coli-K88-Antigenen und enterotoxigene E. coli-Antigenen abstammen. Zu weiteren Beispielen der Antigene zählen das Zelloberflächen-Antigen CD4, Schistosoma mansoni-P28-Glutathion-S-Transferase- Antigene (P28-Antigene) und Antigene von Saugwürmern, Mycoplasma, Rundwürmern, Spulwürmern, Chlamydia trachomatis und Malaria-Parasiten, z. B. Parasiten der Gattung Plasmodia oder Babesia, zum Beispiel Plasmodium falciparum, und Peptide, die immunogene Epitope der zuvor genannten Antigene kodieren.
Spezielle Antigene umfassen das Volllänge-Schistosoma mansoni-P28, und Oligomere (z. B. 2-, 4- und 8-mere) des immunogenen P28 aa 115-131-Peptids (das sowohl ein B- als auch T-Zell-Epitop enthält) und humanes Papilloma-Virus-E7- Protein, Herpes simplex-Antigene, Maul- und Klauenseuche-Virus-Antigene und Simian-T-Zell-Leukämie-Virus-Antigene.
Die DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung können einen Promotor enthalten, dessen Aktivität als Reaktion auf eine Veränderung im umgebenden Milieu induziert wird. Ein Beispiel einer solchen Promotorsequenz ist eine solche mit einer Aktivität, die durch anaerobe Bedingungen induziert wird. Ein besonderes Beispiel solch einer Promotorsequenz stellt der nirB-Promotor dar, der zum Beispiel in der Internationalen Patentanmeldung PCT/GB92/00387 beschrieben ist. Der nirB-Promotor wurde aus E. coli isoliert, wo es die Expression eines Operons lenkt, das das Nitrit- Reduktase-Gen nirB enthält (Jayaraman et al., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987), und nirD, nirC, cysG (Peakman et al., Eur. J. Biochem. 191, 315323, 1990). Es wird sowohl durch Nitrit als auch durch Veränderungen in der Sauerstoffspannung in der Umgebung reguliert, indem es durch Sauerstoffentzug aktiv wird (cole, Biochem. Biophys. Acta. 162, 356-368, 1968). Die Reaktion auf Anaerobiose wird durch das Protein FNR vermittelt, das als ein Transkriptions-Aktivator bei einem Mechanismus dient, das vielen anaeroben respiratorischen Genen gemeinsam ist. Durch Deletions- und Mutations-Analyse wurde der Teil des Promotors, der ausschließlich auf Anaerobiosis reagiert, isoliert, und durch Vergleich mit anderen anaerob regulierten Promotoren wurde eine Konsensus-FNR-Bindungsstelle identifiziert (Beil et al., Nucl. Acids. Res. 17, 3865-3874, 1989; Jayaraman et al., Nucl. Acids, Res. 17, 135-145, 1989). Auch wurde gezeigt, dass der Abstand zwischen der mutmaßlichen FNR- Bindungsstelle und der -10-Homologieregion entscheidend ist (Beil et al., Molec. Microbiol. E, 1753-1763, 1990). Daher ist die Verwendung lediglich jenes Teils des nirB-Promotors bevorzugt, der ausschließlich auf Anaerobiose reagiert. Wie hierin verwendet, meinen Bezugnahmen auf den nirB-Promotor den Promotor selbst oder einen Teil oder ein Derivat davon, der oder das zur Förderung der Expression einer kodierenden Sequenz unter anaeroben Bedingungen in der Lage ist. Die bevorzugte Sequenz, die auch den nirB-Promotor enthält, ist:
Bei einer bevorzugtesten Erscheinungsform wird mit der vorliegenden Erfindung ein DNA-Molekül bereitgestellt, umfassend den nirB-Promotor in funktionsfähiger Knüpfung an eine DNA-Sequenz, die ein wie zuvor definiertes Fusionsprotein kodiert.
Bei einer anderen bevorzugten Erscheinungsform der Erfindung wird ein replizierbarer Expressionsvektor bereitgestellt, der sich zur Verwendung in Bakterien eignet, enthaltend die nirB-Promotorsequenz in funktionsfähiger Knüpfung an eine DNA-Sequenz, die ein wie zuvor definiertes Fusionsprotein kodiert.
Das DNA-Molekül oder -Konstrukt kann in das Bakterienchromosom zum Beispiel mittels als solche bekannte Methoden integriert werden, weshalb bei einer weiteren Erscheinungsform mit der Erfindung ein Bakterium bereitgestellt wird, das in seinem Chromosom eine wie zuvor definierte DNA-Sequenz oder -Konstrukt enthält.
Eine stabile Expression des Fusionsproteins kann in vivo erreicht werden. Das Fusionsprotein kann in einem attenuierten Bakterium exprimiert werden, welches so als eine Vakzine verwendet werden kann.
Das attenuierte Bakterium kann gewählt werden aus den Gattungen Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria und Yersinia. Alternativ kann das attenuierte Bakterium ein abgeschwächter Stamm des enterotoxigenen Escherichia coli sein. Insbesondere können die folgenden Spezies genannt werden: S. typhi - der Erreger des humanen Fleckfiebers; S. typhimurium - der Erreger von Salmonellose bei verschiedenen Tierspezies; S. enteritidis - der Erreger einer Lebensmittelvergiftung beim Menschen; S. choleraesuis - der Erreger von Salmonellose bei Schweinen; Bordetella pertussis - der Erreger von Keuchhusten, Haemophilus influenzae - der Erreger von Meningitis, Neisseria gonorrhoea - der Erreger von Gonorrhö; und Yersinia - der Erreger von Lebensmittelvergiftungen.
Beispiele für attenuierte Bakterien sind zum Beispiel beschrieben in EP-A-0322237 und EP-A-0400958, deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind.
Ein attenuiertes Bakterium, enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung, das entweder im Bakterienchromosom oder in Plasmidform oder beides vorhanden ist, kann als eine Vakzine eingesetzt werden. Fusionsproteine (vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form), wie durch die Bakterien exprimiert, können ebenfalls in der Vakzine-Präparation verwendet werden. Zum Beispiel wurde ein gereingtes TetC-P28-Fusionsprotein, in dem das TetC-Protein über seinen C-Terminus an das P28-Protein ohne dazwischen liegende Gelenkregion geknüpft ist, als von sich aus immunogen befunden. Bei einer weiteren Erscheinungsform wird daher mit der Erfindung eine Vakzine-Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel, und als Wirkstoff ein attenuiertes Bakterium oder Fusionsprotein, wie zuvor definiert.
Die Vakzine kann ein oder mehrere geeignete Adjuvanzien umfassen.
Die Vakzine wird vorteilhafterweise in einer lyophilisierten Form bereitgestellt, zum Beispiel in Kapselform zur oralen Verabreichung an einen Patienten. Solche Kapseln können mit einer enterischen Beschichtung versehen werden, umfassend z. B. Eudragit "S", Eudragit "L", Celluloseacetat, Celluloseacetatphthalat oder Hydroxypropylmethylcellulose. Diese Kapseln können als solche verwendet werden, oder alternativ kann das lyophilisierte Material vor Verabreichung zum Beispiel als eine Suspension rekonstituiert werden. Die Rekonstitution wird in vorteilhafter Weise in Puffer bei einem geeigneten pH-Wert zur Gewährleistung der Lebensfähigkeit der Organismen vorgenommen. Um die attenuierten Bakterien und den Impfstoff vor Magensäure zu schützen, wird vor jeder Verabreichung des Impfstoffs vorteilhafterweise ein Natriumbicarbonat-Präparat verabreicht. Alternativ kann der Impfstoff zur parenteralen Verabreichung, intranasalen Verabreichung oder intramammären Verabreichung zubereitet werden.
Das attenuierte Bakterium, enthaltend das DNA-Konstrukt oder Fusionsprotein der Erfindung, kann zur prophylaktischen Behandlung eines Wirts, insbesondere eines menschlichen Wirts, doch möglicherweise ebenso eines tierischen Wirts, verwendet werden. Eine durch einen Mikroorganismus, insbesondere ein Pathogen, verursachte Infektion kann so durch Verabreichung einer wirksamen Dosis eines attenuierten Bakteriums gemäß der Erfindung verhütet werden. Das Bakterium exprimiert dann das Fusionsprotein, das zur Erzeugung von Antikörper gegen den Mikroorganismus fähig ist. Die angewendete Dosierung hängt von verschiedenen Faktoren einschließlich der Größe und des Gewichts des Wirts, der Art des formulierten Wirkstoffs und der Natur des Fusionsproteins ab.
Ein attenuiertes Bakterium gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Transformieren eines attenuierten Bakteriums mit einem DNA-Konstrukt, wie zuvor definiert, präpariert werden. Jede geeignete Transformations-Technik kann angewendet werden, zum Beispiel die Elektroporation. Auf diese Weise kann ein attenuiertes Bakterium, das zur Exprimierung eines Proteins oder von zum Bakterium heterologen Proteinen in der Lage ist, erhalten werden. Eine Kultur der attenuierten Bakterien kann dann unter anaeroben Bedingungen gezüchtet werden. Auf diese Weise wird eine ausreichende Menge des Bakteriums zur Formulierung eines Impfstoffs bei minimal erfolgender Expression des Fusionsproteins erhalten werden.
Das DNA-Konstrukt kann ein replizierbarer Expressionsvektor sein, umfassend den nirB-Promotor in funktionsfähiger Knüpfung an eine DNA-Sequenz, die das Fusionsprotein kodiert. Der nirB-Promotor kann in einen Expressionsvektor inseriert werden, in den bereits ein Gen eingebaut ist, das eines der heterologen Proteine kodiert (z. B. das C-Fragment des Tetanus-Toxins), anstelle des existierenden Promotors, der die Expression des Proteins kontrolliert. Das Gen, das das andere heterologe Protein kodiert (z. B. eine antigene Sequenz), kann dann eingebaut werden. Der Expressionsvektor sollte natürlich mit dem attenuierten Bakterium kompatibel sein, in das der Vektor zu inserieren ist.
Der Expressionsvektor wird mit geeigneten Transkriptions- und Translations- Kontrollelementen versehen, zu denen, über den nirB-Promotor hinaus, eine Transkriptions-Terminationsstelle und Translations-Start- und Stoppcodons zählen. Eine geeignete ribosomale Bindungsstelle wird bereitgestellt. Der Vektor umfasst typischerweise einen Replikationsursprung und, sofern erwünscht, ein wählbares Markergen, wie etwa ein Antibiotika-Resistenzgen. Der Vektor kann ein Plasmid sein.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, ohne dadurch eingeschränkt werden zu sollen, wobei:
Abb. 1 ein Schemabild für die Konstruktion des Plasmids pTECH1 zeigt;
Abb. 2 schematisch die Herstellung des Plasmids pTECH1-28 aus den Ausgangsmaterialien pTECH1 und PUC19-P28 veranschaulicht;
Abb. 3 schematisch die Herstellung des Plasmids pTECH3-P28 aus den Ausgangsmaterialien Plasmide pTECH1-P28 und pTETnir15 veranschaulicht;
Abb. 4 und 5 Western Blots zeigen, wie aus Bakterienzellen erhalten, die das pTECH3-P28-Konstrukt beherbergen; und
Abb. 6 die Glutathion-Affinitätsreinigung der TetC-Fusionen veranschaulicht, wie mittels SDS-PAGE und Coomassie-Blue-Anfärbung bestimmt.
Gemäß der Erfindung wurde ein Vektor konstruiert, um Genfusionen an den C- Terminus des hochgradig immunogenen C-Fragments von Tetanus-Toxin ohne Verwendung einer heterologen Gelenkdomäne zu ermöglichen. Eine Fusion wurde mit dem Gen herbeigeführt, das die schützende 28 kDa-Glutathion-S-Transferase von Schistosoma mansoni kodiert. Der rekombinante Vektor wurde in Salmonella typhimurium (SL338; rm&spplus;) transformiert. Das resultierende chimäre Protein wurde in Salmonella in einer löslichen Form stabil exprimiert, wie mittels Western Blotting mit Fragment C- und Glutathion-S-Transferase-Antiseren beurteilt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die P28-Komponente der Fusion die Fähigkeit zur Bindung des Glutathions beibehält.
Die Konstruktion des Vektors und die Eigenschaften des damit exprimierten Fusionsproteins sind nachstehend ausführlicher beschrieben.

BEISPIEL 1

Herstellung von pTECH1

Die Herstellung von pTECH1, einem Plasmid, das den nirB-Promotor und das TetC- Gen und eine DNA-Sequenz enthält, die eine Gelenkregion kodiert und Restriktionsendonuklease-Stellen enthält, um die Insertion eines für einen zweiten oder ein Gastprotein kodierenden Gens zu ermöglichen, ist in Abb. 1 veranschaulicht. Das Expressionsplasmid pTETnir15, dessen Ausgangsmaterial in Abb. 1 gezeigt ist, wurde aus pTETtac115 konstruiert (Makoff et al., Nucl. Acids Res. 17, 10191-10202, 1989), indem die EcoRI-ApaI-Region (1354bp), enthaltend das lacI- Gen und den tac-Promotor, durch das folgende Paar von Oligonukleotiden 1 und 2 ersetzt wurde:
Die Oligonukleotide wurden auf einem Pharmacia Gene Assembler synthetisiert und die resultierenden Plasmide mittels Sequenzierung bestätigt (Makoff et al., Bio/Technology, 7, 1043-1046, 1989).
Das pTETnir15-Plasmid wurde dann zur Konstruktion des pTECH1-Plasmids unter Aufnahme einer Polylinker-Region verwendet, die sich als Stelle für die Insertion der heterologen DNA eignete, um die Expression der Fragment-C-Fusionsproteine zu lenken. Bei pTETnir15 handelt es sich um ein bekanntes, auf pAT153 basierendes Plasmid, das die Expression des Fragment C lenkt. Allerdings sind keine natürlich vorkommenden geeigneten Restriktionsstellen am 3'-Ende des TetC-Gens vorhanden. Daher wurden Zielstellen, denen eine Gelenkregion vorausging, am 3'- Ende der TetC-kodierenden Region mittels der Primer SEQ ID NR. 4 und SEQ ID NR. 5 eingeführt, die mit "add-on"-Adaptorsequenzen (Tabelle 1) unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) maßgeschneidert wurden [K. Mullis et al. Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol. 51, 263-273, 1986]. Demgemäß wurde pTETnir15 als ein Template bei einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Primern entsprechend den Regionen verwendet, die die SacII und BamHI-Stellen abdecken. Der Antisense-Primer bei dieser Amplifikation wurde mit einer 38-Basen-5'-Adaptorsequenz maßgeschneidert. Dieser Antisense-Primer wurde so konstruiert, dass eine für neue XbaI-, SpeI- und BamHI-Stellen kodierende Sequenz in das PCR-Produkt eingebaut wurde. Außerdem wurden Sequenzen, die weitere zusätzliche Aminosäuren einschließlich Prolin kodieren (die Gelenkregionen) und ein Translations- Stoppcodon-Signal in-frame mit dem offenen Fragment-C-Leseraster eingebaut.
Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt und mit SacII und BamHI verdaut, und in den restlichen 2,8 kb-Vektor pTETnir15 kloniert, der zuvor mit SacII und BamHI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, das von transformierten Kolonien gereinigt und mit pTECH1 bezeichnet wurde, ist in Abb. 1 gezeigt. Heterologe Sequenzen, wie etwa die Schistosoma mansoni-P28-Glutathion-S-Transferase (P28) kodierende Sequenz wurden in die XbaI-, SpeI- und BamHI-Stellen gemäß bekannter Methoden kloniert.
Die DNA-Sequenz des Plasmid pTECH1 ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR. 6 gezeigt. TABELLE 1 DNA-Sequenzen der bei der Konstruktion der TetC-Gelenkvektoren verwendeten Oligonukleotide A.) Primer 1. Sense-PCR (21-mer). (SEQ ID NR. 4) B.) Primer 2. Antisense-PCR-Primer (64-mer) (SEQ ID NR. 5)

BEISPIEL 2

Konstruktion von pTECH1-P28

Eine P28-Genexpressionskassette wurde mittels PCR unter Verwendung von pUC19-P28-DNA (freundliche Gabe von Dr. R. Pierce, Pasteur Institute, Lille) als Template erzeugt. Oligonukleotid-Primer wurden zur Amplifikation des Vollänge-P28- Gens, beginnend mit dem Startcodon und endend mit dem Stoppcodon, konstruiert. Außerdem wurden die Sense- und Antisense-Primer mit den Restriktionsstellen für XbaI bzw. BamHI maßgeschneidert. Die Primer sind in der Sequenzliste als SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID NR. 8 gezeigt.
Das Produkt wurde gelgereinigt und mit XbaI und BamHI verdaut und dann in pTECH1 kloniert, das vorab mit diesen Enzymen verdaut und anschließend gelgereinigt worden war. Die DNA-Sequenz von pTECH1-P28 ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR. 9 gezeigt.

Expression des TetC-Gelenk-P28-Fusionsproteins

Mehrere Bakterienstämme, nämlich die S. typhimurium-Stämme SL5338 (A. Brown et al., J. Infect. Dis. 155, 86-92, 1987) und SL3261 und E. coli (TG2) wurden mit pTECH1-P28 mittels Elektroporation transformiert. Die SL3261-Stämme, die das pTECH1-P28-Plasmid beherbergen, wurden bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 5HT, UK, unter der Zugriffsnummer NCTC 12833 hinterlegt. Ein Stamm von SL3261, enthaltend das pTECH1-Plasmid, wurde unter der Zugriffsnummer NCTC 12831 hinterlegt. Die Identität der Rekombinanten wurde durch Restriktionskartierung der durch die Zellen beherbergten Plasmid-DNA verifiziert. Die weitere Expression des TetC-P28-Fusionsproteins wurde dann mittels SDS-PAGE und Western Blotting der das Konstrukt beherbergenden Bakterienzellen ausgewertet. Es wurde festgestellt, dass das Fusionsprotein löslich bleibt, mit Antiseren sowohl gegen TetC als auch gegen P28 kreuzreagiert, und es außerdem das erwartete Molekulargewicht von 80 kDa für eine Vollänge- Fusion aufweist.
Das Fusionsprotein wurde in E. coli (TG2) und S. typhimurium (SL5338, SL3261) stabil exprimiert, wie mittels SDS-PAGE und Western Blotting beurteilt. Von Interesse war eine Bande von 50 kDa, die zusammen mit dem TetC-Gelenkprotein allein wanderte und ausschließlich mit dem Anti-TetC-Serum kreuzreagiert, wie im Western Blot erkennbar. Da die Codon-Selektion in der Gelenkregion als suboptimal ausgelegt war, können die seltenen Codons während der Translation Pausen verursachen, was gelegentlich zur vorzeitigen Termination der Translation führen kann und so für diese Bande verantwortlich ist.

Affinitätsreinigung der TetC-P28-Fusion

Glutathion stellt das natürliche Substrat für P28, eine Glutathion-S-Transferase, dar. Die an der Bindung von Glutathion beteiligten Aminosäure-Reste stellt man sich als in der Primärstruktur des Polypeptids räumlich getrennt vor, die zur Bildung einer Glutathion-Bindungstasche in der Primärstruktur zusammengebracht werden (P. Reinemer et al., EMBO, J8, 1997-2005, 1991). Um zu beurteilen, ob die P28- Komponente der Fusion sich korrekt gefaltet hat, um eine zur Bindung des Glutathions fähige Konformation anzunehmen, wurde ihre Affinitätsreinigbarkeit auf einer Glutathion-Agarose-Matrix getestet. Die erhaltenen Ergebnisse (nicht gezeigt) wiesen nach, dass TetC-P28 tatsächlich an die Matrix binden kann und die Bindung reversibel ist, da die Fusion mit freiem Glutathion kompetitiv eluierbar ist.

BEISPIEL 3

Konstruktion von pTECH3-P28

Das Plasmid pTECH1-P28 lenkt die Expression des S. mansoni-P28-Proteins als eine C-terminale Fusion an Fragment-C von Tetanus-Toxin, das durch eine heterologe Gelenkdomäne getrennt ist. Die Expression des Fusionsproteins steht unter der Kontrolle des nirB-Promotors. Der Vektor pTECH3-P28 wurde zum Teil aus dem Plasmid pTETnir15 mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der thermostabilen "high fidelity" DNA-Polymerase von Pyrococcus fusorius konstruiert, welche eine assoziierte 3'→5'-Exonuklease-Korrekturlesefunktions-Aktivität aufweist. Die Abfolge der Schritte ist in Abb. 5 zusammengefasst. Um eine gelenklose TetC-Ersetzungskassette zu erzeugen, wurde das DNA-Segment von der einzigen SacII-Stelle innerhalb des TetC-Gens zum abschließenden Codon mittels der PCR- Reaktion unter Verwendung von pTETnir15 als Template-DNA amplifiziert. Die bei der PCR-Amplifikation verwendeten Primer sind in der Sequenzliste als SEQ. ID. Nr. 10 und SEQ. ID. Nr. 11 gezeigt. Der Antisense-Primer bei dieser Amplifikationsreaktion wurde mit einer XbaI-Erkennungssequenz maßgeschneidert.
Die Amplifikationsreaktion wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers (Stratagene, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Das Produkt wurde gelgereinigt, mit SacII und XbaI verdaut und dann in den restlichen pTECH1-P28-Vektor kloniert, der vorab mit den entsprechenden Enzymen SacII und XbaI verdaut worden war. Der resultierende Vektor wurde als pTECH3-P28 bezeichnet. Die DNA-Sequenz von pTECH3-P28 ist in der Sequenzliste als SEQ. ID. Nr. 12 gezeigt.

BEISPIEL 4

Transformation von S. typhimurium SL5338 (galE r&supmin;m&spplus;) mit pTECH3-P28 und Analyse der Transformanden

S. typhimurium SL5338 (galE r&supmin;m&spplus;) wurde entweder in L- oder YT-Kulturbrühe und auf L-Agar mit Ampicillin (50 g/ml), sofern geeignet, kultiviert und mit dem pTECH3- P28-Plasmid transformiert. Das Transformations-Protokoll basierte auf der von MacLachlan und Sanderson beschriebenen Methode. (MacLachlan PR und Sanderson KE, 1985. Transformation of Salmonella typhimurium with plasmid DNA: differences between rough and smooth strains. J. Bacteriology 161, 442-445).
Eine über Nacht angesetzte 1-ml-Kultur von S. typhimurium SL5338 (r&supmin;m&spplus;; Brown A, Hormaeche CE, Demarco de Hormaeche R, Dougan G, Winther M, Maskell D und Stocker BAD, 1987. J. Infect. Dis. 155, 86-92) wurde zur Beimpfung von 100 ml der LB-Kulturbrühe verwendet und diese bei 37ºC geschüttelt, bis die Kultur eine OD&sub6;&sub5;&sub0; = 0,2 erreicht hatte. Die Zellen wurden bei 3.000 · g abgeerntet und in 0,5 Volumina eiskaltem 0,1 M MgCl&sub2; resuspendiert. Die Zellen wurden nochmals pelletiert und in 0,5 Volumina eiskaltem CaCl&sub2; resuspendiert. Dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt und die Zellen in 1 ml an 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert, dem 50 ul TES (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 8,0) zugegeben wurden. Die Zellen wurden auf Eis über 45 bis 90 Minuten inkubiert. 150 ul der Zellen wurden 100 ng der Plasmid-DNA in 1-2 ul zugegeben. Das Gemisch wurde auf Eis über 30 Minuten inkubiert, dann bei 42ºC über 2 Minuten Hitzeschock-behandelt und sofort nochmals auf Eis über 1 Minute inkubiert. Dem transformierten Gemisch wurden 2 ml LB- Kulturlösung zugegeben und dies 1,5 Stunden lang inkubiert, um die Expression des Ampicillin-Resistenzgens β-Lactamase zu ermöglichen. Im Anschluss an die Inkubation wurden 20 ul und 200 ul der Zellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, verteilt. Die Platten wurden getrocknet und bei 37ºC über Nacht inkubiert.
Die Identität der Rekombinanten wurde mittels Restriktionskartierung der Plasmid- DNA und durch Western Blotting mit gegen TetC und P28 gerichteten Antiseren verifiziert.

SDS-PAGE und Western Blotting

Die Expression der TetC-Fusionen wurde mittels SDS-PAGE und Western Blotting getestet. S. typhimurium SL5338 (galE r&supmin;m&spplus;)-Bakterienzellen, enthaltend das pTECH3-P28-Plasmid und gezüchtet in Mitt-log-Phase mit Antibiotika-Selektion wurden mittels Zentrifugation abgeerntet und die Proteine mittels 10% SDS-PAGE fraktioniert. Die Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-Membran zum Electroblotting transferiert und entweder mit einem gegen TetC gerichteten polyklonalen Kaninchen- Antiserum oder dem Volllänge-P28-Protein umgesetzt. Die Blots wurden dann mit Ziege-Anti-Kaninchen-Ig in Konjugation an Meerrettichperoxidase (Dako, High Wycombe, Bucks, UK) sondiert und mit 4-Chloro-1-naphtol entwickelt. Die Ergebnisse der Western Blotting-Experimente sind in Abb. 4 und 5 gezeigt; Abb. 4 verdeutlicht die Ergebnisse der Sondierung mit Kaninchen-Anti-TetC- polyklonalem Antiserum, und Abb. 5 zeigt die Ergebnisse der Sondierung mit Kaninchen-Anti-P28-polyklonalem Antiserum. In jedem Falle stellen Bahnen 1, 2 und 3 unabhängige Klone von SL5338 (pTECH3-P28), Bahnen 4, 5 und 6 von SL5338 (pTECH1-P28) und Bahn 7 von SL5338 (pTETnir15) dar. Die Molekulargewicht- Marker sind angegeben. Aus den Ergebnissen ist offensichtlich, dass das Fusionsprotein löslich bleibt, mit Antiseren sowohl gegen TetC als auch P28 reagiert, und es außerdem das erwartete Molekulargewicht von 80 kDa für die Volllänge-Fusion aufweist (Abb. 4). Außerdem scheint das Fusionsprotein stabil exprimiert zu sein.

Glutathion-Agarose-Affinitätsreinigung

Glutathion stellt das natürliche Substrat für P28, einer Glutathion-S-Transferase dar. Die an der Bindung von Glutathion beteiligten Aminosäure-Reste werden als in der Primärstruktur des Polypeptids räumlich getrennt erachtet und werden zur Bildung einer Glutathion-Bindungstasche in der Tertiärstruktur zusammengebracht. Um zu beurteilen, ob die P28-Komponente sich korrekt gefaltet hat, um eine zur Bindung von Glutathion fähige Konformation anzunehmen, wurde ihre Affinitätsreinigbarkeit auf einer Glutathion-Agarose-Matrix getestet.
Die Bakterienzellen, die pTECH3-P28 enthielten und die TetC-Volllänge-P28-Genfusion exprimierten, wurden zur log-Phase gezüchtet, auf Eis gekühlt und mittels Zentrifugation bei 2500 · g über 15 Minuten bei 4ºC abgeerntet. Die Zellen wurden in 1/15 des Ursprungsvolumens der eiskalten Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und mittels Beschallung in einem MSA Soniprep 150 (Gallenkamp, Leicester, UK) lysiert. Das unlösliche Material wurde mittels Zentrifugation entfernt, und dem Überstand wurde 1/6 Volumen einer 50%igen Aufschlämmung der vorgequollenen Glutathion-Agarose-Kügelchen (Sigma, Poole, Dorset, UK) zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen bei Raumtemperatur über 1 Stunde wurden die Kügelchen mittels Zentrifugation bei 1.000 · g über 10 Sek. abgesammelt. Der Überstand wurde beseitigt und die Kügelchen in 20 Volumina kaltem PBS-0,5% Triton X100 resuspendiert und dann die Kügelchen nochmals mittels Zentrifugation abgesammelt. Der Waschschritt wurde drei weitere Male wiederholt. Das Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 1 Volumen SDS-PAGE-Probenpuffer eluiert. Zu Vergleichszwecken wurde eine ähnliche Vorgehensweise mit Bakterienzellen befolgt, enthaltend das pTECH1-P28-Plasmid, das TetC-Gelenk-P28-Fusionsprotein exprimiert. Die Extrakte aus Klonen, enthaltend jeweils einen der Plasmide, wurden unter Anwendung von SDS-PAGE verglichen; die Ergebnisse sind in Abb. 6 gezeigt. In Abb. 6 stellen Bahnen 1, 2 und 3 Klone von SL5338 (pTECH1-P28) dar, wohingegen Bahnen 4, 5 und 6 unabhängige Klone von SL5338 (pTECH3-P28) sind.
Die Ergebnisse legen nahe, dass das TetC-P28-Fusionsprotein tatsächlich an die Matrix binden kann und die Bindung unabhängig von der Abwesenheit einer heterologen Gelenkdomäne reversibel ist (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass eine am C-Terminus von TetC vorhandene Peptidsequenz dieser bestimmten Region tatsächlich Biegsamkeit verleihen kann.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: MEDEVA HOLDINGS BV
(B) STRAßE: CHURCHILL-LAAN 223
(C) STADT: AMSTERDAM
(E) LAND: DIE NIEDERLANDE
(F) PLZ: 1078 ED
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: IMPFSTOFFE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM-ART: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Version #1,25 (EPA)
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: PCT/GB93/01617
(B) EINREICHUNGSDATUM: 30. Jul. 1993
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: GB 9401787.8
(B) EINREICHUNGSDATUM: 31. Jan. 1994
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Promotor
(B) LOKALISIERUNG: 1..61 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 64 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3754 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 asenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4378 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. !2:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4366 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:

Claims

1. DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionprotein der Formel TetC-(Z)a-Het kodiert, worin TetC das C-Fragment des Tetanus-Toxins ist, Het ein heterologes Protein ist, Z eine Aminosäure ist und kleiner 4 ist, vorausgesetzt, dass (Z)a nicht die Sequenz Gly-Pro enthält.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin (Z)a eine Kette von zwei oder drei Aminosäuren ist, wobei die DNA-Sequenz dafür eine Restriktionsendonuklease- Spaltstelle definiert.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin Null ist.

4. DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin (Z)a frei von Glycin und/oder Prolin ist.

5. DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Gruppe (Z)a eine Kette von Aminosäuren ist, die im wesentlichen frei von biologischer Aktivität ist.

6. DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüch, worin das heterologe Protein Het eine antigene Sequenz ist, die von einem Virus, Bakterium, Fungus, Hefe oder Parasiten stammt.

7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, worin das heterologe Protein Het das Schistosoma mansoni-P28-Glutathion-S-transferase-Antigen ist.

8. Replizierbarer Expressionsvektor, enthaltend ein DNA-Konstrukt, wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert.

9. Replizierbarer Expressionsvektor nach Anspruch 8, der sich zur Anwendung in Bakterien eignet.

10. Nicht-humaner Wirt, in dessen chromosomale DNA ein DNA-Konstrukt integriert ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert.

11. Wirt nach Anspruch 10, der ein Bakterium ist.

12. Fusionsprotein, das durch ein DNA-Konstrukt kodiert ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert.

13. Verfahren zur Präparierung eines Bakteriums, welches Verfahren das Transformieren eines Bakteriums mit einem DNA-Konstrukt umfasst, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Bakterium ein attenuiertes Bakterium ist.

15. Vakzine-Zusammensetzung, umfassend ein Fusionsprotein, wie in Anspruch 12 definiert, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

16. Vakzine-Zusammensetzung, umfassend ein attenuiertes Bakterium, das ein Fusionsprotein exprimiert, welches durch ein DNA-Konstrukt kodiert ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.