JPH09500540A

JPH09500540A - ワクチン組成物

Info

Publication number: JPH09500540A
Application number: JP7505668A
Authority: JP
Inventors: カーン，モハメッド，アンジャム; ホルマーヒ，カルロス，エステニオ; チャットフィールド，スティーヴン，ネヴィル; ドウガン，ゴードン
Original assignee: メデヴァホールディングスビー．ヴイ．
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1997-01-21
Also published as: EP0712442A1; DE69430246T2; WO1995004151A2; WO1995004151A3; CA2168459C; ATE215124T1; CA2168459A1; DE69430246D1; AU7235794A; EP0712442B1

Abstract

(57)【要約】本発明が提供するＤＮＡ構成体は、ＴｅｔＣ−（Ｚ）ａ−Ｈｅｔの式を有する融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列を備えており、ここでＴｅｔＣは、破傷風毒素のＣフラグメント、またはそのエピトープを含有するタンパク質であり：Ｈｅｔは、異種タンパク質であり：Ｚはアミノ酸であり、およびａは０または正の整数であり、ただし（Ｚ）ａは、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含有していない。また、本発明は、この構成体を含有する複製可能な形質転換ベクター、この構成体によって形質転換された細菌、この融合タンパク質それ自体、およびこの融合タンパク質またはこの融合タンパク質を形質発現する弱毒化された細菌から生成したワクチン組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン組成物本発明は、ＤＮＡ構成体、この構成体を含有する複製可能な形質発現ベクター、この構成体を含有する細菌、およびこの細菌またはこの細菌から形質発現された融合タンパク質を含有するワクチンに関するものである。更に詳細には、本発明は、破傷風毒素のＣフラグメントを暗号化する新規なＤＮＡ構成体、および破傷風毒素のＣフラグメントを含有する融合タンパク質に関するものである。二種以上の異種タンパク質を暗号化するＤＮＡ構成体を、適当な宿主の中でこれらのタンパク質を単一の融合タンパク質として形質発現させるために、調製することが知られている。しかし、しばしば見いだされてきたように、この方法で二種のタンパク質を相互に融合させると、各成分の特性をもはや保持していない、不正確に折り畳まれたキメラタンパク質がもたらされる。例えば、コレラ菌（ＣＴ−Ｂ）および大腸菌（ＬＴ−Ｂ）エンテロトキシンのＢサブユニットは、強力な粘膜免疫原であるが、これらのサブユニットへの遺伝子の融合によって、担体の構造および特性が変化し、従ってこれらの免疫原性が変化しうる（M．Sandk vist等、「J．Bacteriol．」169，4570-6頁、1987年、Clements等、1990年、およびM．Lipscombe等「Mol．Microbiol．」5，1385頁、1990年を参照）。更に、細菌中で形質発現する多数の異種タンパク質は、可溶性の適切に折りたたまれた形または活性の形では生産されず、不溶性の凝縮物として堆積する傾向がある（ Schein等「Bio/Technology」6，291-4頁、1988年およびR，Halenbeck等「Bio/Te chnology」7，710-5 頁、1989年を参照）。我々の先行する未公開の国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１６１７号において開示したところでは、抗原を暗号化する第二の配列に対して「ヒンジ領域」を介して結合した破傷風毒素Ｃフラグメント（ＴｅｔＣ）を暗号化するＤＮＡ配列を設けることによって、細菌細胞中におけるこの配列の形質発現が、このＣフラグメントが存在しない構成体に対して向上する。例えば、「Ｓ．Ｍａｎｓｏｎｉ」の全長Ｐ２８のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質の形質発現レベルは、この「ｎｉｒＢ」プロモーターからのＴｅｔＣに対する融合体として形質発現した場合には、このＰ２８のタンパク質が「ｎｉｒＢ」プロモーターから単独で形質発現された場合よりも高い。「Ｓ．Ｍａｎｓｏｎｉ」の全長Ｐ２８のタンパク質に対するＴｅｔＣ融合体は可溶性であり、大腸菌とネズミチフス菌との双方の中で形質発現する。更に、このＴｅｔＣ−Ｐ２８融合タンパク質は、グルタチオン寒天マトリックスによるアフィニティー精製が可能であることから、このＰ２８が、その天然基質にいまだ結合しうる立体配置に正確に適合するように折りたたまれていたことが示唆される。ヒンジ領域が、典型的には高い比率のプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸を暗号化する配列であるが、このＴｅｔＣとＴｅｔＣに対して融合している抗原性タンパク質との双方の個別の折りたたみを促進するのに不可欠であると、以前から考えられていた。しかし、現在発見したところでは、上で参照したＣＴ−ＢおよびＬＴ−Ｂについての以前の研究に立脚すると驚くべきことには、このＴｅｔＣとＰ２８のような第二の抗原との間でこのヒンジ領域を省略した場合には、この融合体を構成するタンパク質が、グルタチオン寒天マトリックス上でのアフィニティー精製によって証明されたように、正確な折りたたみを示した。従って、第一の態様においては、本発明は、ＴｅｔＣ−（Ｚ）ａ−Ｈｅｔの式を有する融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ構成体を提供しており、ここでＴｅｔＣは、破傷風毒素のＣフラグメント、またはそのエピトープを含有するタンパク質であり：Ｈｅｔは、異種タンパク質であり：Ｚはアミノ酸であり、およびａは０または正の整数であり、ただし（Ｚ）ａは、配列Ｇｌｙ −Ｐｒｏを含有していない。典型的には、（Ｚ）ａは、０〜１５個のアミノ酸の鎖であり、例えば０〜１０個、好ましくは６個以下、更に好ましくは４個以下のアミノ酸の鎖である。一つの態様においては、（Ｚ）ａは、２個または３個のアミノ酸の鎖であり、このＤＮＡ配列は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を規定する。他の態様において、ａは０である。通常はこの基（Ｚ）ａは、同時にはグリシンとプロリンとの双方を含有しないであろうし、一般的にはグリシンとプロリンとの双方をまったく含有しないであろう。基（Ｚ）ａは、実質的に生物学的活性のないアミノ酸の鎖であってよい。第二の態様においては、本発明によって提供される複製可能な形質発現ベクターは、例えば細菌に使用するのに適しており、前記したようなＤＮＡ構成体を含有している。他の態様においては、本発明は、前記したようなＤＮＡ構成体を含有する宿主（例えば細菌）を提供し、このＤＮＡ構成体は、この宿主内に、プラスミドのような複製可能な形質発現ベクターの形で存在しており、または宿主の染色体の一部分として存在しており、またはその双方の形で存在している。他の態様においては、本発明は、好ましくは実質的に純粋な形の、前記したようなＴｅｔＣ−（Ｚ）ａ−Ｈｅｔの形の融合タンパク質を提供しており、この融合タンパク質は，前記したような複製可能な形質発現ベクターによって形質発現可能である。他の態様においては、本発明は、細菌（好ましくは弱毒化された細菌）の製造方法を提供しており、この方法は、細菌（例えば弱毒化された細菌）を、前記したようなＤＮＡ構成体によって形質転換されることからなる。また、本発明は、前記したような、弱毒化された細菌、または融合タンパク質と、薬剤学上許容された担体を含有しているワクチン組成物を提供する。この異種タンパク質「Ｈｅｔ」は、例えば、異種抗原性配列、例えばウイルス、細菌、菌類、酵母または寄生虫に由来する抗原性配列であって良い。ウイルス抗原性配列の例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２のようなある種のヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶからの、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２からのＣＤ４受容体結合部位、肝炎Ａ、Ｂ、またはＣウイルス、タイプ２またはタイプ１４のようなヒトライノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルスタイプ２または３、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、例えばタイプ１６の乳頭腫ウイルス、そのＥ７タンパク質、およびこのＥ７タンパク質またはそのエピトープを含有するフラグメント、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来する配列である。細菌に由来する抗原の例は、百日咳菌「Bordetella pertussis」（例えば、P6 9タンパク質および糸状菌ヘマグルチニン(FHA)抗原）、「Vibrio cholerae」、炭疽菌「Bacillus anthracis」、および大腸菌熱不安定性毒素Bサブユニット(LT -B)、大腸菌K88抗原およびエンテロトキンシ原性大腸菌抗原のような大腸菌抗原に由来する抗原である。他の例の抗原には、細胞表面抗原CD4、「Schistosoma m ansoni」P28グルタチオンS-トランスフェラーゼ抗原(P28抗原)および吸虫、マイコプラズマ、線虫、条虫、クラミジアトラコマチス「Chlamydia trachomatis」およびマラリア寄生虫、例えば遺伝性マラリア原虫または住血胞子虫類、例えば熱帯熱マラリア原虫「Plasmodium falciparum」、および前記した抗原からの免疫原性エピトープを暗号化するペプチド類が含まれる。特定の抗原としては、全長「Schistosoma mansoni」P28、および免疫原性P28 aa 115-131ペプチド(BおよびT細胞エピトープの双方を含有している)のオリゴマー（例えば2,4および8-マー）、およびヒト乳頭腫ウイルスE7タンパク質、単純ヘルペス抗原、口蹄疫ウイルス抗原およびサル免疫不全ウイルス抗原が含まれる。本発明のＤＮＡ構成体は、周囲環境の変化に応じてプロモーターの活性が誘起されるプロモーターを含有していて良い。このようなプロモーターの配列の例は、嫌気性条件下で誘起される活性を有するプロモーターである。このようなプロモーター配列の特定例は、例えば国際特許出願ＰCT/GB92/00387号に記載されている「ｎｉｒＢ」プロモーターである。この「ｎｉｒＢ」プロモーターは大腸菌から分離されており、ここで「ｎｉｒＢ」プロモーターは、亜硝酸塩レダクターゼ遺伝子「ｎｉｒＢ」（Jayaraman等、「J．Mol．Bio.」196、781-788頁、1987 年）、および「ｎｉｒＤ」「ｎｉｒＣ」「ｃｙｓＧ」（Peakman等、「Eur．J．B ioche．」191、315-323頁、1990年）を含有するオペロンを形質発現させる。これは亜硝酸塩によっておよび環境の酸素分圧の変化によって調節されており、酸素を除去したときに活性になる(Cole、「Biochem．Biophys．Acta」162、356-36 8頁、1968年)。嫌気生活に対する応答は、多くの嫌気性呼吸遺伝子に対して共通の機構において、転写活性因子として作用するタンパク質FNRによって媒介されている。欠損および突然変異分析によって、嫌気生活に対してのみ応答するプロモーター部分が分離され、他の嫌気的に調節されたプロモーターと比較することによって、共通のFNR結合部位が同定された(Bell等、「Nucl．Acids Res.」17、 3865-3874頁、1989年;Jayaraman等、「Nucl．Acids Res.」17、135-145頁、1989 年）。推定的なFNR結合部位と-10相同性領域との距離が臨界的であることも示されてきた(Bell等、「Molec．Microbiol．」4、1753-1763頁、1990年）。従って、嫌気生活に対してのみ応答する「ｎｉｒＢ」プロモーターの部分だけを使用することが好ましい。ここで使用したように、この「ｎｉｒＢ」プロモーターの参照は、このプロモーターそれ自体を示しているか、または嫌気性条件下での暗号配列の形質発現を促進しうるこのプロモーターの誘導体または一部分を示す。この「ｎｉｒＢ」プロモーターを含有する好ましい配列は、最も好適な態様においては、本発明は、前に規定したような融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列に対して操作可能に結合されているｎｉｒＢプロモーターを備えたＤＮＡ分子を提供する。本発明の更に他の態様において提供する複製可能な形質発現ベクターは、細菌中での使用に適しており、前に規定したような融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列に対して操作可能に結合されているｎｉｒＢプロモーター配列を含有している。このＤＮＡ分子または構成体は、例えばそれ自体は公知の方法によって、細菌染色体の中へと組み込むことができ、従って他の態様においては、本発明は、前記したようなＤＮＡ配列または構成体を細菌染色体の中に含有している細菌を提供する。この融合タンパク質の安定的な形質発現は、インビボで得ることができる。この融合タンパク質は、弱毒化された、従ってワクチンとして使用可能な細菌の中で形質発現させることができる。この弱毒化された細菌は、サルモネラ「Salmonella」、百日咳菌「Bordetella 」、ビブリオ「Vibrio」、ヘモフィルス「Haemophilus」、ナイセリア「Neisser ia」およびエルシニア「Yersinia」族から選択できる。あるいは、この弱毒化された細菌は、エンテロトキンシ原性の大腸菌の弱毒化された菌株であって良い。特に、次の種を上げることができる：「S．typhi」 - ヒトチフスの原因である；「 S．typhimurium」 - 幾つかの動物種におけるサルモネラ症の原因である；「S．en teritidis」 - ヒトにおける食中毒の原因である；「S．choleraesuis」 - ブタにおけるサルモネラ症の原因である；「Bordetella pertussis」 - 百日咳の原因である；「Haemophilus influenzae」 - 髄膜炎の原因である；「Neisseria gonorrho ea」 - 淋病の原因である；および「Yersinia」 - 食中毒の原因である。弱毒化された細菌の例は、例えばEP-A-0322237号およびEP-A-0400958号に開示されており、これらの開示を、本明細書に参照することによって包含する。本発明によるＤＮＡ構成体を含有する弱毒化された細菌は、細菌の染色体の中に存在しているか、あるいはプラスミドの形で存在しているか、あるいは双方であり、ワクチンとして使用できる。この細菌によって形質発現された融合タンパク質（好ましくは実質的に純粋な形の）も、ワクチンを製造する際に使用できる。例えば、精製されたＴｅｔＣP28融合タンパク質であって、このＴｅｔＣタンパク質がそのC末端を通してこのP28タンパク質に対して、介在するヒンジ領域なしに結合されている融合タンパク質が、それ自身に対して免疫原性であることを見いだした。従って他の態様においては、本発明で提供するワクチン組成物は、薬剤学上許容される担体または希釈剤、および活性成分として、前に規定したような弱毒化された細菌または融合タンパク質を含有している。このワクチンは、一種以上の適当なアジュバントを含有していて良い。このワクチンは、好ましくは、患者に経口投与するために、凍結乾燥された形で、例えばカプセル剤の形で存在している。こうしたカプセル剤には、例えば「 Eudragit''S''」、「Eudragit''L''」、酢酸セルロース、酢酸セルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる腸性のコーティングを備えていて良い。これらのカプセル剤をそのまま使用することができ、または、凍結乾燥された材料を、投与に先立って、例えば懸濁液として再構成できる。再構成を適当なpHの緩衝液中で実施して、微生物の生存を確保することが好ましい。弱毒化された細菌を保護し、胃液の酸性からワクチンを保護するために、ワクチンを各々投与するのに先立って、重炭酸ナトリウム調製液を投与することが好ましい。あるいは、このワクチンを、非経口的な投与、鼻孔内投与または筋肉内投与するように調製できる。本発明のＤＮＡ構成体または融合タンパク質を含有する弱毒化された細菌は、特にはヒト宿主であるが動物宿主の可能性もある宿主を予防処置する際に、使用できる。したがって、微生物、特には病原体によって引き起こされる感染は、本発明による弱毒化された細菌を有効量投与することによって防止できる。次いで、この細菌は、この微生物に対する抗体を生じさせうる融合タンパク質を形質発現する。採用する用量は、宿主の大きさおよび体重、調製したワクチンのタイプおよび融合タンパク質の性質を含む、種々の因子に依存するであろう。本発明による弱毒化された細菌は、前に規定したようなＤＮＡ構成体で、弱毒化された細菌を形質転換させることによって、製造できる。エレクトロポレーションのような、あらゆる好適な形質転換技術を採用できる。この方法において、細菌に対して異種の一種または複数種のタンパク質を形質発現しうる、弱毒化された細菌を得ることができる。この弱毒化された細菌の培養物は、嫌気性条件下で成長しうる。このように十分な量の細菌を、ワクチンとしての調製物用に調製し、融合タンパク質の最適な形質発現を起こさせる。このＤＮＡ構成体は、融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列に対して操作可能に結合されている「ｎｉｒＢ」プロモーターを含有する複製可能な形質発現ベクターであって良い。この「ｎｉｒＢ」プロモーターは、形質発現ベクター中へと挿入することができ、この形質発現ベクターは、異種タンパク質の遺伝子を暗号化するもの（例えば破傷風毒素Ｃフラグメント）を、このタンパク質の形質発現を調節する現存するプロモーターの場所中に既に組み込んでいる。次いで、他の異種タンパク質を暗号化する遺伝子（例えば、抗原配列）を挿入できる。むろん、この形質発現ベクターは、このベクターが挿入されるべき弱毒化された細菌に対して適合していなければならない。この形質発現ベクターは、「ｎｉｒＢ」プロモーターの他に、転写終結部位および翻訳開始および停止コドンを含む、適当な転写および翻訳調節要素を備えている。適当なリボソーム結合部位を設ける。このベクターは、典型的には、複製の開始点と、望むならば、抗生物質耐性の遺伝子のような選択可能な標識遺伝子を備えている。このベクターはプラスミドであって良い。ここで続く実施例および添付図面を参照して本発明を説明するが、これらに限定はされない。ここで、図１は、プラスミドｐＴＥＣＨ１の構成体の概略図であり；図２は、出発物質ｐＴＥＣＨ１およびＰＵＣ１９−Ｐ２８からのプラスミドｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８の製造の概略図であり；図３は、出発物質プラスミドｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８およびｐＴＥＴｎｉｒ１５からのプラスミドｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８の製造を示す概略図であり；図４および５は、ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８構成体を宿す細菌細胞から得たウエスタンブロットであり；図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー青色染色法によって測定されたＴｅｔＣ融合体のグルタチオンアフィニティー精製を示す。本発明に従って、異種のヒンジ領域を使用することなしに、破傷風毒素の高度に免疫原性のＣフラグメントのＣ末端に対して遺伝子融合させることが可能なように、ベクターを構成する。「Schistosoma mansoni」からの保護的な28kDaのグルタチオンS-トランスフェラーゼを暗号化する遺伝子によって、融合体を構成する。組み換え体ベクターを、ネズミチフス菌「Salmonella typhimurium」（SL33 8;rm+）中へと形質転換させた。得られたキメラタンパク質を、サルモネラ菌中で可溶性の形で、ウエスタンブロット法によって評価したように、フラグメントCおよびグルタチオンS-トランスフェラーゼ抗血清によって、安定的に形質発現する。更に、この融合体のP28成分が、グルタチオンを結合する能力を保持していることを見いだした。このベクターの構成およびベクターから形質発現した融合タンパク質の特性を、下記に更に詳細に説明する。実施例１ｐＴＥＣＨ１の調製ｐＴＥＣＨ１、「ｎｉｒＢ」プロモーターおよびＴｅｔＣ遺伝子を組み込んだプラスミド、およびヒンジ領域を暗号化し、第二のないしゲストタンパク質を暗号化する遺伝子の挿入を可能とする制限エンドヌクレアーゼ部位を有するＤＮＡ配列の調製を、図１に示す。形質発現プラスミドｐＴＥＴｎｉｒ１５を、図１に示す出発物質であるが、ｐＴＥＴｔａｃ１１５から構成し(Makoff等「Nucl．Aci ds Res．」17、10191-10202頁、1989年)；lacI遺伝子およびtacプラスミドを有するEcoRI-ApaI領域(1354bp)を、オリゴ1および2の次の対によって置換することによった；このオリゴヌクレオチドを「ファルマシアジーンアセンブラー:Pharmasia G ene Assembler」上で合成し、得られたプラスミドを配列決定によって確認した( Makoff等「Bio/Technology」7、1043-1046頁、1989年)。次いで、このpTETnir15プラスミドを使用して、異種ＤＮＡの挿入部位として適したポリリンカー領域を組み込んだｐＴＥＣＨ１プラスミドを構成し、フラグメントＣ融合タンパク質を形質発現させる。pTETnir15は、フラグメントＣを形質発現させる既知のｐＡＴ１５３をベースとしたプラスミドである。しかし、このＴｅｔＣ遺伝子の３’末端に存在する自然発生した適当な制限部位はない。従って、ヒンジ領域に先立つ標的部位を、「アドオン」アダプター配列に適合したプライマーＳＥＱＮｏ：４およびＳＥＱＮｏ：５（表１）によって、ＴｅｔＣ暗号領域の３’末端に導入し；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した〔 K．Mullis等、コールドスプリングハーバー「Sym．Quant．Biol，」51、263-273 頁、1986年〕。従って、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩ部位をカバーする領域に対応するプライマーを使用するＰＣＲ反応中で、鋳型としてpTETnir15を使用した。この増殖におけるアンチセンスプライマーを、３８ベース５’−アダプターと適合させた。新規なＸｂａＩ、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を暗号化する配列がこのＰＣＲ精製物中に組み込まれるように、このアンチセンスプライマーを設計した。更に、プロリンを含む更なる余剰アミノ酸を暗号化するＤＮＡ配列を組み込み（ヒンジ領域）、フラグメントＣ転写解読枠によって枠中に翻訳停止コドン信号を組み込んだ。このＰＣＲ精製物をゲル精製し、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、前にＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化された、残留した２．８ｋｂのベクターpTETnir15中へとクローニングした。形質転換したコロニーから精製して得られたプラスミドであって、ｐＴＥＣＨ１と呼ぶものを、図１に示す。「Schistosoma mansoni」P28グルタチオンS-トランスフェラーゼ(P28) を暗号化する配列のような異種配列を、既知の方法に従ってＸｂａＩ、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中へとクローニングした。プラスミドｐＴＥＣＨ１のＤＮＡ配列を、ＳＥＱＩＤＮＯ：６として配列リストに示す。実施例２ｐＴＥＣＨ１− Ｐ２８の構成体Ｐ２８遺伝子形質発現カセットを、ｐＵＣ１９−Ｐ２８ＤＮＡ（リール(Lille )、パスツゥール研究所のR．ピアス博士からの親切な贈り物）を鋳型として使用したＰＣＲによって製造した。開始コドンによって開始し、停止コドンによって終結する全長P28遺伝子を増殖させるように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。更に、センスおよびアンチセンスプライマーを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩに対する制限部位にそれぞれ適合させた。これらのプライマーを、ＳＥＱＩＤＮＯ：７およびＳＥＱＩＤＮＯ：８として配列リストに示す。この精製物をゲル精製し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、次いでこれらの酵素によって前に消化され、続いてゲル精製されたｐＴＥＣＨ１中へとクローニングした。ｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８のＤＮＡ配列を、ＳＥＱＩＤＮＯ：９として配列リストに示す。ＴｅｔＣ−ヒンジ−Ｐ２８融合タンパク質の形質発現幾つかの細菌株、即ち、ネズミチフス菌株ＳＬ５３３８(A．Brown等、「J．In fect．Dis．」155、86-92頁、1987年)、およびＳＬ３２６１および大腸菌（ＴＧ２）を、エレクトロポレーション法で、ｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８によって形質転換させた。ｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８プラスミドを宿しているＳＬ３２６１株は、英国、ＮＷ９５ｔｈ、ロンドン、コリンデールアベニュー６１のナショナルコレクションオブタイブカルチャーズに、承認番号ＮＣＴＣ１２８３３の下に寄託されてきた。ｐＴＥＣＨ１プラスミドを含有するＳＬ３２６１の株は、承認番号ＮＣＴＣ１２８３１の下に寄託されてきた。組み換え体の同定は、この細胞によって宿されたプラスミドＤＮＡの制限マッピングによって検証された。次いで、ＴｅｔＣ−Ｐ２８融合タンパク質他の形質発現は、この構成体を宿す細菌細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって評価した。この融合タンパク質が、可溶性を維持し、ＴｅｔＣおよびＰ２８の双方に対する抗血清と架橋反応し、また全長融合体に対して予期される分子量である８０ｋＤａｌを有していることを見いだした。この融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって判断されたように、大腸菌（ＴＧ２）およびネズミチフス菌（ＳＬ５３３８、ＳＬ３２６１）中で安定的に形質発現した。興味深いことに、ＴｅｔＣ−ヒンジタンパク質単独と共に移動し、抗ＴｅｔＣ−ヒンジ抗血清と排他的に架橋反応する５０ｋＤａｌのバンドが、ウエスタンブロットで見ることができる。このヒンジ領域中におけるコドンの選択が次善であるように設計されていたので、ほとんどのコドンは、翻訳の未終結のうちの停止をもたらすことがある翻訳の間の休止を引き起こすことはなく、これがこのバンドを説明している。ＴｅｔＣ−Ｐ２８融合体のアフィニティー精製グルタチオンは、Ｐ２８の天然の基質であり、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。結合しているグルタチオンの中に包含されるこのアミノ酸残留物は、ポリペプチドの一時構造中に空間的に分離されており、共にこの三次構造中にグルタチオン結合ポケットを生成させるものと考えられる(P．Reinemer等、「EMBO」J8、1997-2005頁、1991年)。この融合体のＰ２８成分が、グルタチオンを結合する能力のある立体配置に正確に適合するように折りたたまれたかとうかを測定するために、そのグルタチオン寒天マトリックス上でアフィニティー生成されうる可能性を試験した。こうして得られた結果（図示せず）が示すところでは、ＴｅｔＣ−Ｐ２８は、実際にこのマトリックスに対して結合することができ、この結合は可逆的であるが、この融合体が遊離のグルタチオンによって競争的に溶出されうるからである。実施例３ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８の構成体プラスミドｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８は、「Ｓ．mansoni」Ｐ２８タンパク質を、Ｃ末端融合体として、異種ヒンジ領域によって分離された破傷風毒素からのフラグメントＣへと形質発現させる。この融合タンパク質の形質発現は、「ｎｉｒＢ」プロモーターの調節下にある。このベクターｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８は、部分的に、プラスミドｐＴＥＴｎｉｒｌ５から、「Pyrococcus fusorius」からの高再現性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構成されており、このＤＮＡポリメラーゼは、関連する３’５’エキソヌクレアーゼ校正活性を有している。この工程の配列を図５に要約する。ＴｅｔＣ −ヒンジレス置換カセットを生成させるために、このＴｅｔＣ遺伝子中の特異的ＳａｃＩＩ部位から終結コドンになるＤＮＡのセグメントを、ＰＣＲ反応によって、pTETnir1 5を鋳型ＤＮＡとして使用して、増殖させた。このＰＣＲ増殖反応で使用するプライマーを、配列リスト中に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０およびＳＥＱＩＤＮＯ：１１として示す。この増殖反応のアンチセンスプライマーを、ＸｂａＩ認識配列と適合させた。この増殖反応を、生産者の指示に従って実施した（「Stratagene」La Jolla，カリフォルニア州、米国）。この生成物をゲル精製し、ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩを使用して消化し、次いで各酵素ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩによって前に消化したｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８ベクター中へとクローニングした。こうして得られたベクターをｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８と呼んだ。ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８のＤＮＡ配列を、配列リスト中にＳＥＱＩＤＮＯ：１２として示す。実施例４ネズミチフス菌ＳＬ５３３８（ｇａｌＥ r - m + ）のｐＴＥＣＨ3-P28による形質転換、およびこの形質転換体の分析ネズミチフス菌SL5338（ｇａｌＥ r - m + ）を、LまたはYTブロースのいずれかの中で、適当な場合にはアンピシリン(50g/ml)によってL-寒天の上で培養し、ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８によって形質転換した。この形質転換プロトコルは、マクラーレンおよびサンダーソンによって記述された方法に基づいていた（マクラーレンおよびサンダーソンＫＥ、１９８５年、「プラスミドＤＮＡによるネズミチフス菌の形質転換(Transformation of Salmonella typhimuri um with plasmid DNA)：ラフおよびスムース株の間の相違(differences between rough and smmoth strains)」「J．Bacteriology」161、442-445頁)。ネズミチフス菌SL5338の1mlの終夜培養物（ｒ- ｍ+；Brown A．Hormaeche CE 、Demarco de Hormaeche R．Dougan G．Winther M．Maskell D．およびStocker BAD、1087年、「J．Infect．Dis．」155、86-92頁）を使用して、100mlのLBブロースを植菌し、この培養物がＯＤ650イコール0.2になるまで37℃で振とうした。これらの細胞を3000×ｇで回収し、0.5容量の氷冷された0.1MのMgCl2中で再懸濁した。この細胞を再度ペレット化し、0.5容量の氷冷されたCaCl2中に再懸濁した。この工程を更に一回繰り返し、１mlの0.1MのCaCl2中に再懸濁した細胞に対して、50μlのTES(50mMのトリス、10mMのEDTA、50mMのNaCl、pH8.0)を添加した。これらの細胞を氷上で45〜90分間の間培養した。150μlの細胞に対して、1-2μl の100ngのプラスミドＤＮＡを添加した。この混合物を、氷上で30分間培養し、次いで42℃で2分間熱処理し、氷上で1分間直ちに再培養した。この形質転換された混合物に対して、2mlのLBブロースを添加し、1.5時間の間培養してアンピシリン薬剤耐性遺伝子、Ｂ−ラクタマーゼを形質発現させた。培養につづいて、２０ μｌおよび２００μｌの細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上へと展開させた。これらのプレートを乾燥し、37℃で終夜培養させた。組み換え体の同一性を、プラスミドＤＮＡの制限マッピングによって、およびＴｅｔＣおよびP28に対して向けられた抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって検証した。 SDS-PAGE およびウエスタンブロッティングＴｅｔＣ融合体の形質発現を、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングを用いて試験した。pTECH3-P28プラスミドを含有し、抗生物質選択によって、ミッドロッグ相中で成長するネズミチフス菌SL5338(galE ｒ- ｍ+ )細菌細胞を、遠心分離法によって回収し、このタンパク質を10％SDS-PAGEによって分割した。このタンパク質をニトロセルロース膜へとエレクトロブロッティングによって移植し、ＴｅｔＣに対して向けられたポリクローナルウサギ抗血清と全長P28タンパク質とのいずれかと反応させた。次いでこのブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Dako High Wycombe、Bucks:、英国)に接合したヤギ抗ウサギIgによって測定し、4-クロロ-1-ナフトールによって展開させた。このウエスタンブロッティング実験の結果を図4および図5に示す。図４は、ウサギ抗ＴｅｔＣポリクローナル抗血清によるプロービングの結果を示し、図５は、ウサギ抗Ｐ２８ポリクローナル抗血清によるプロービングの結果を示す。各場合において、レーン１、２、および３はＳＬ５３３８（ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８）の独立したクローンであり、レーン４、５、６は、ＳＬ５３３８（ｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８）であり、レーン７はＳＬ５３３８（ｐＴＥｎｉｒ１５）である。この分子量標識を示す。これらの結果から、この融合タンパク質が可溶性のままであり、抗血清と共にＴｅｔＣおよびＰ２８の双方に対して反応し、また全長融合体に対して予期された８０ｋＤａの分子量を有していることが明らかである（図４）。更に、この融合タンパク質は安定的に形質発現するように見える。グルタチオン−寒天アフィニティー精製グルタチオンは、Ｐ２８、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに対する天然基質である。結合中のグルタチオン中にあるこのアミノ酸残留物は、ポリペプチドの一次構造中で空間的に分離されており、共同してこの三次構造中のグルタチオン結合ポケットの精製をもたらすものと考えられている。この融合体のＰ２８成分が、グルタチオンを結合しうる立体配置に正確に適合するように折りたたまれているかどうかを測定するために、我々は、グルタチオン寒天マトリックス上でアフィニティー精製されうる能力を試験した。ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２８を含有しており、ＴｅｔＣ全長Ｐ２８遺伝子融合体を形質発現する細菌細胞を、ログ相へと成長させ、氷上で冷し、２５００×ｇで１５分間４℃で遠心分離することによって回収した。これらの細胞を、もとの容量の１／１５で氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、「ＭＳＥ Soniprep 1 50」(Gallenkamp，Leiceter，UK)中で超音波処理によって溶菌させた。この不溶性の物質を遠心分離によって除去し、この上澄み液に対して、1/6の容量の予め膨張させたグルタチオン寒天ビーズの50％スラリーを添加した(Sigma，Poole，D orset，UK)。１時間室温で穏やかに混合した後に、このビーズを、１０００×ｇで１０秒間遠心分離によって回収した。この上澄み液を廃棄し、ビーズを２０容量倍の冷却ＰＢＳ−０．５％「ＴｒｉｔｏｎＸ１００」中に再懸濁し、このビーズを遠心分離によって再び回収した。この洗浄工程を、更に３回繰り返した。この融合タンパク質を、１容量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって溶出させた。比較の目的のために、類似した手順を、ＴｅｔＣ−ヒンジ− Ｐ２８融合タンパク質が形質発現したｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８プラスミドを含有する細菌細胞について続けた。いずれかのプラスミドを含有するクローンからの抽出物を、ＳＤＳ −ＰＡＧＥを使用して比較し、この結果を図６に示す。図６においては、レーン１、２および３は、ＳＬ５３３８（ｐＴＥＣＨ１−Ｐ２８）のクローンを示し、一方レーン４、５および６は、ＳＬ５３３８（ｐＴＥＣＨ３−Ｐ２）の独立したクローンである。これらの結果が示すところでは、このＴｅｔＣ−Ｐ２８融合タンパク質は、実際にマトリックスに対して結合することができ、この結合は、異種ヒンジ領域が存在していないのにも係わらず（データは示していない）、可逆的であった。ＴｅｔＣのＣ末端に存在するペプチド配列は、実際に、この特定の領域に対して可とう性を付与しうることが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホルマーヒ，カルロス，エステニオイギリス国，シービー２１キューピーケンブリッジ，テニスコートロード, ケンブリッジユニヴァーシティーデパートメントオブパソロジー（番地なし) (72)発明者チャットフィールド，スティーヴン，ネヴィルイギリス国，エスダブリュ７２エイワイロンドン，インペリアルカレッジオブサイエンスアンドテクノロジー, デパートメントオブバイオケミストリー，メディヴァヴァクシーンリサーチユニット（番地なし) (72)発明者ドウガン，ゴードンイギリス国，エスダブリュ７２エイワイロンドン，インペリアルカレッジオブサイエンスアンドテクノロジー, デパートメントオブバイオケミストリー，メディヴァヴァクシーンリサーチユニット（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．ＴｅｔＣ−（Ｚ）ａ−Ｈｅｔの式を有する融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ構成体であって、ＴｅｔＣは、破傷風毒素のＣフラグメント、またはそのエピトープを含有するタンパク質であり：Ｈｅｔは、異種タンパク質であり：Ｚはアミノ酸であり、およびａは０または正の整数であり、ただし（Ｚ）ａは、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含有していない、ＤＮＡ構成体。２．（Ｚ）ａが０〜１５個のアミノ酸の鎖である、請求項１記載のＤＮＡ構成体。３．（Ｚ）ａが４個未満のアミノ酸の鎖である、請求項１記載のＤＮＡ構成体。４．（Ｚ）ａが２個または３個のアミノ酸の鎖であり、このＤＮＡ配列が制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を規定する、請求項３記載のＤＮＡ構成体。５．ａが０である、請求項２記載のＤＮＡ構成体。６．（Ｚ）ａがグリシンおよび／またはプロリンを含有しない、請求項２記載のＤＮＡ構成体。７．前記異種タンパク質Ｈｅｔが、ウイルス、細菌、菌類、酵母類または寄生虫類に由来する抗原性配列である、請求項１〜６のいずれか一つの請求項記載のＤＮＡ構成体。８．前記異種タンパク質Ｈｅｔが、「Schistosoma mansoni」Ｐ２８グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗原である、請求項７記載のＤＮＡ構成体。９．請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載のＤＮＡ構成体を含有しており、例えば細菌中に使用するのに適合した、複製可能な形質発現ベクター。１０．例えば細菌である宿主であって、その染色体ＤＮＡの中へと、請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載したＤＮＡ構成体が組み込まれている宿主。１１．請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載の融合タンパク質。１２．細菌（好ましくは弱毒化された細菌）の製造方法であって、請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載のＤＮＡ構成体によって細菌を形質転換させる、細菌の製造方法。１３．融合タンパク質、またはこの融合タンパク質を形質発現する弱毒化された細菌を含有し、この融合タンパク質が請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載されており；および薬剤学上許容される担体を含有している、ワクチン組成物。１４．患者、例えばヒト患者を免疫化する方法であって、請求項１３記載のワクチン組成物を免疫化に有効な量、この患者に対して投与することを含む、患者を免疫化する方法。