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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines Teils des Tetanustoxins
zur Freisetzung einer Zusammensetzung an das Zentralnervensystem
eines Menschen oder eines Tieres. Die Erfindung betrifft auch ein
Hybrid-Fragment des Tetanustoxins, ein Polynucleotid, welches mit
natürlichem
Tetanustoxin hybridisiert und eine Zusammensetzung, welche das Tetanustoxinfragment
als ein aktives Molekül
enthält.
Des Weiteren betrifft die Erfindung einen Vektor, welcher einen
Promotor und eine Nucleinsäuresequenz,
welche das Tetanustoxinfragment kodieren, umfasst.
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Tetanustoxin
wird durch Clostridium tetani als eine inaktive, einzelne Polypeptidkette
von 150 kD, zusammengesetzt aus drei 50 kD Domänen, welche durch proteasesensitive
Schleifen verbunden sind, zusammengesetzt. Das Toxin wird auf selektive
proteolytische Spaltung aktiviert, welche zwei disulfidverbundene Ketten
erzeugt: L (leicht, 50 kD) und H (schwer, 100 kD) [Montecucco C.
und Schiavo G. Q. Rev. Biophys., (1995), 28: 423–472].
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Beweis
für den
rückläufigen axonalen
Transport des Tetanustoxins zum Zentralnervensystem (ZNS) wurde
durch Erdmann et al. [Naunyn Schmiedebergs Arch Phamacol., (1975),
290: 357–373],
Price et al. [Science, (1975), 188: 945–94] und Stoeckel et al. [Brain
Res., (1975), 99: 1–16]
beschrieben. Bei jeder dieser Untersuchungen wurde radiomarkiertes
Toxin innerhalb Membran gebundener Vesikel gefunden. Eine weitere
Eigenschaft war die transsynaptische Bewegung des Tetanustoxins,
welche zuerst durch autoradiographische Lokalisierung von 125I-markiertem Tetanustoxin in Interneuronen
des Rückenmarks
nach Injektion in einen Muskel gezeigt wurde [Schwab und Thoenen,
Brain Res., (1976), 105: 218–227].
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Die
Struktur dieses Tetanustoxins wurde durch Helting et al. [J. Biol.
Chem., (1977), 252: 187–193]
veranschaulicht. Papain spaltet das Tetanustoxin in zwei Fragmente:
- – das
C-terminale Ende der schweren Kette, 451 Aminosäuren, auch genannt Fragment
C; und
- – der
andere Teil enthielt den komplementären Abschnitt, genannt Fragment
B, angebunden an die leichte Kette (Fragment A) über eine Disulfidbindung.
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Das
europäische
Patent
EP 0 030 496
B1 zeigte den rückläufigen Transport
eines Fragments B-II
b an das ZNS und wurde
nach Injektion in den Mittelmuskel des Auges bei Neuronen primärer und
sekundärer
Ordnung festgestellt. Dieses Fragment kann aus "Isofragmenten" bestehen, welche durch Clostridienprotolyse
erhalten wurden. Später
wurde durch Eisel et al. [EMBO J., 1986, 5: 2495–2502] gezeigt, dass dieses
Fragment B-II
b identisch mit Fragment C
war, welches durch Papain-Digestion erhalten wurde.
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Dieses
europäische
Patent zeigt auch den rückläufigen Transport
eines Konjugates, das aus einem Ibc-Tetanustoxinfragment
besteht, das durch eine Disulfidbindung an B-IIb aus
axonalen Endigungen innerhalb des Muskels mit den motoneuronalen
perikoronealen und perizellulären
Räumen
verbunden ist. (Das Ibc-Fragment entspricht
dem anderen Teil, erhalten durch Papain-Digestion, wie oben durch
Helting et al. beschrieben ist). Es gibt keinen Beweis, dass dieses
Konjugat in Neuronen zweiter Ordnung gefunden wurde. Die Autoren behaupteten,
dass ein Konjugat, bestehend aus dem Fragment B-IIb,
verbunden durch eine Disulfidbindung mit einem therapeutischen Mittel,
zur spezifischen Bindung an Ganglioside und synaptische Membranen geeignet
ist. Kein Ergebnis zeigte einen rückläufigen axonalen Transport oder
einen transsynaptischen Transport für ein solches Konjugat.
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Ein
weiteres europäisches
Patent, Nr.
EP 0 057
140 B1 , zeigte gleichermaßen den rückläufigen Transport eines Fragments
II
c an das ZNS. Wie bei dem europäischen Patent
Nr.
EP 0 030 496 B1 bedeuteten
die Verfasser, dass ein Konjugat, bestehend aus dem Fragment II
c und einem therapeutischen Mittel, zur spezifischen
Fixierung in der Lage sind, jedoch veranschaulichte kein Resultat
eine solche Annahme. Dieses Fragment II
c entspricht
dem nun bezeichneten Fragment C, welches durch Papain-Digestion
erhalten wurde.
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Francis
et al. [J. Biol. Chem., (1995), 270(25): 15434–15442] ließen lediglich eine in-vitro-Studie
die Intertnalisierung durch Neuronen eines Hybrids zwischen SOD-1
(Cu Zn Superoxiddismutase) und einem rekombinanten C Tetanustoxinfragment
durch genetische Rekombination zeigen. Dieses rekombinante C-Tetanustoxinfragment
wurde von der Halpern-Gruppe
(siehe Ref. 11) erhalten.
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Des
Weiteren zeigten Kuypers H. G. J. M und Ugolini G. [TINS, (1990),
13(2): 71–75]
in ihrer Veröffentlichung
betreffend Viren als transneurale Tracer bzw. Markierungselemente,
dass, ungeachtet der Tatsache, dass das Tetanustoxinfragment an
spezifische Rezeptoren auf neuronalen Membranen bindet, eine transneuronale
Marikierung relativ schwach ist und nur in einigen der synaptisch
gebundenen Neuronen festgestellt werden kann.
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Ungeachtet
dieser Fortschritte im Stand der Technik besteht nach wie vor ein
Bedürfnis
nach Verfahren für
die Verabreichung von Zusammensetzungen in das menschliche oder
tierische Zentralnervensystem. Im Stand der Technik besteht auch
ein Bedürfnis
nach biologischen Wirkstoffen, welche dieses Ziel erreichen können.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung trägt
zur Ausführung
dieser Bedürfnisse
im Stand der Technik bei. Insbesondere liefert diese Erfindung ein
Verfahren zur in-vivo-Abgabe von erwünschten Zusammensetzungen in das
Zentralnervensystem (ZNS) von Säugern,
wobei die Zusammensetzung ein nicht-toxisches proteolytisches Fragment
von Tetanustoxin (TT) in Verbindung mit wenigstens einem Molekül mit biologischer
Wirksamkeit umfasst. Die Zusammensetzung ist in-vivo zum rückläufigen Transport
und transsynaptischen Transport in das ZNS und zur Freisetzung an
verschiedene Bereiche des ZNS in der Lage.
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Die
vorliegende Erfindung liefert auch ein Hybridfragment des Tetanustoxins,
umfassend das Fragment C plus 11 Aminosäuren der schweren Kette, welche
unmittelbar dem Aminoende des Fragments C vorangehen, und dazu in
der Lage sind, in vivo ein Protein, ein Peptid oder ein Polynucleotid
durch eine neuromuskuläre
Bindungsstelle und wenigstens eine Synapse zu übertragen.
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Des
Weiteren stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur
Verfügung,
welche ein wirksames Molekül
in Verbindung mit dem Hybridfragment des Tetanustoxins (TT) oder
einer Variante davon umfasst. Die Zusammensetzung ist zur Behandlung
eines Patienten oder eines Tieres, das durch eine Erkrankung des
ZNS betroffen ist, nützlich,
wobei die Behandlung die Verabreichung einer Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung an den Patienten oder das Tier umfasst. Des
Weiteren kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung dazu
nützlich
sein, eine Immunantwort in dem Patienten oder dem Tier, welche durch
die ZNS betroffen sind, aufzudecken, wobei die Verabreichung einer
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an den Patienten oder
das Tier umfasst ist.
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Darüber hinaus
liefert die vorliegende Erfindung Polynucleotid variantenfragmente,
welche zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit der
natürlichen
Tetanustoxinsequenz in der Lage sind. Die stringenten Bedingungen
sind beispielsweise wie folgt: bei 42°C während 4 bis 6 Stunden in Gegenwart
von 6 × SSC-Puffer,
1 × Denhardt's-Lösung, 1
% SDS und 250 μg/ml
tRNA. (1 × SSC
entspricht 0,15 M NaCl und 0,05 M Natriumcitrat; 1 × Denhardt's-Lösung entspricht
0,02 % Ficoll, 0,02 Polyvinylpyrrolidon und 0,02 % Rinderserumalbumin).
Die zwei Waschschritte werden bei Raumtemperatur in Gegenwart von
0,1 × SCC
und 0,1 % SDS durchgeführt.
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Ein
Polynucleotidvariantenfragment bedeutet ein Polynucleotid, welches
eine Tetanustoxinsequenz, abgeleitet aus der nativen Tetanustoxinsequenz
mit derselben Transporteigenschaft, kodiert.
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Darüber hinaus
liefert die Erfindung einen Vektor, umfassend einen Promotor, fähig zur
Expression in Muskelzellen, und wahlweise einen Verstärker, eine
Nucleinsäuresequenz,
kodierend für
das Fragment des Tetanustoxins der Erfindung oder ein Aminosäurevariantenfragment
der Erfindung, verbunden mit einem Polynucleotid, kodierend für ein Protein
oder ein Polypeptid von Interesse. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann der Promotor der CMV-Promotor und
vorzugsweise der CMV-Promotor sein, welcher in pcDNA 3.1 (In Vitrogen,
ref. V790-20) enthalten ist, oder der Promotor Actin sein, wie in
Bronson S.V. et al. (PNAS, 1996), 93: 9067–9072) beschrieben ist.
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Darüber hinaus
liefert die Erfindung einen Vektor, umfassend einen Promotor, welcher
zur Expression in neuronalen Zellen oder in Vorläufern (wie NT2(hNT)-Vorläuferzellen
von Stratagen, Bezugsnummer 204101) und wahlweise einen Verstärker, eine
Nucleinsäuresequenz,
kodierend für
das Fragment des Tetanustoxins der vorliegenden Erfindung, oder
ein Aminosäurevariantenfragment
der vorliegenden Erfindung, verbunden mit einem Polynucleotid, kodierend
für ein
Protein oder ein Polypeptid von Interesse. In einer bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann der Promotor Actin (siehe die obige
Bezugsquelle) sein. Diese Vektoren sind zur Behandlung eines Patienten
oder eines Tieres, welche mit ZNS-Erkrankungen infiziert sind, nützlich sein,
umfassend die Abgabe des Vektors der vorliegenden Erfindung an den
Patienten oder das Tier. Darüber
hinaus sind diese Vektoren zur Aufklärung einer Immunantwort in
dem Patienten oder dem Tier nützlich.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung, umfassend das Tetanustoxinfragment,
besteht darin, einen besseren Transport des Fragmentes innerhalb
des Organismus verglichen mit dem Fragment C zu erhalten. Ein weiterer
Vorteil der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht darin,
eine deutlich definierte Aminosäuresequenz
und nicht eine multimerische Zusammensetzung zu erhalten. Daher
kann man diese Zusammensetzung in der Gentherapie leicht manipulieren.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung wird vollständiger unter Bezugnahme auf
die Zeichnungen beschrieben, worin
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1 die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz
des TTC-Fragments,
kloniert in pBS:TTC zeigt,
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2 die
Einzelheiten des Konstruktes pBS:TTC zeigt.
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Die TTC-cDNA-Isolierung:
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Die
TTC-cDNA wurde aus einem Clostridium-Tetani-Stamm unter Verwendung
von Polymerasekettenreaktion isoliert. Es wurde eine dreimalige
PCR verwendet, um drei überlappende
Fragmente jeweils von 465 bp (PCR1; Primer 1: 5'CCC CCC GGG CCA CCA TGG TTT TTT CAA
CAC CAA TTC CAT TTT CTT ATT C-3' & Primer 2: 5'-CTA AAC CAG TAA
TTT CTG-3'), von
648 bp (PCR2; Primer 3: 5'-AAT
TAT GGA CTT TAA AAG ATT CCG C-3' & Primer 4: 5'GGC ATT ATA ACC TAC
TCT TAG AAT-3')
und von 338 bp (PCR3; Primer 5: 5'-AAT GCC TTT AAT AAT CTT GAT AGA AAT-3' und Primer 6: 5'-CCC CCC GGG CAT
ATG TCA TGA ACA TAT CAA TCT GTT TAA TC-3') erzeugt, und jedes Fragment wurde
sequenziell in pBluescript KS+ kloniert, um das Plasmid pBS-TTC
zu erzeugen. Der stromaufwärtige
Primer 1 enthielt die Ribosombindungsstelle (RBS) und Translationsstartsignale.
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3 zeigt das Konstrukt pGEX:lacZ-TTC.
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4 zeigt das Konstrukt pGEX:TTC-lacZ.
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5 zeigt
Details des Konstrukts pCMV:lacZ-TTC.
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GENAUE BESCHREIBUNG
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Tetanustoxin
ist ein potentes Neurotoxin von 1315 Aminosäuren, welches durch Clostridium
tetani (1, 2) erzeugt wird. Es beugt der inhibitorischen Neurotransmitterfreisetzung
aus Rückenmark-Interneuronen durch
einen spezifischen Mechanismus der Zellenintoxikation vor (hier
wird auf Ref. 3 Bezug genommen). Für diesen pathologischen Mechanismus
wurde gezeigt, dass er einen retrograden axonalen und transsynaptischen
Transport des Tetanustoxins beinhaltet. Das Toxin wird durch Nervenendigungen
an den neuromuskulären
Verbindungen aufgenommen, wirkt aber nicht an dieser Stelle; demgegenüber wird
das Toxin in ein vesikuläres
Abteil transportiert und wandert entlang von Motoraxonen über einen
beträchtlichen
Abstand, bis es seine Ziele erreicht. Die transsynaptische Bewegung
von Tetanustoxin wurde zuerst durch autoradiographische Lokalisierung
in Rückenmarkinterneuronen
nach Injektion in einen Muskel gezeigt (4). Jedoch waren jüngste Untersuchungen
des transsynaptischen Durchganges von Tetanustoxin aus Motoneuronen
durch die rasche Entwicklung klinischem Tetanus und demTod des Versuchstieres
beschränkt
(4, 5, 6).
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Für ein Fragment
von Tetanustoxin, erhalten durch Proteaseverdauung, das C-Fragment,
wurde gezeigt, dass es durch Neuronen in ähnlicher Weise zu jener von
natürlichem
Toxin ohne Verursachung klinischer Symptome transportiert wird (7,
8, 9, 10). Für
ein rekombinantes C-Fragment wurde berichtet, dass es die gleichen
Eigenschaften wie das Fragment besitzt, welches durch Proteaseverdauung
(11) erhalten wird. Die Tatsache, dass ein atoxisches Fragment des
Toxinmoleküls
in der Lage ist, rückläufig innerhalb
des Axons zu migrieren und sich in dem ZNS anzusammeln, führte zu
der Spekulation, dass ein solches Fragment als ein neurotropher
Träger
verwendet werden könnte
(12). Ein C-Fragment, das chemisch mit verschiedensten großen Proteinen
konjugiert war, wurde durch Neuronen in Gewebekulturen (13) aufgenommen
und durch Motorneuronen im Tiermodell (Ref. 12, 14 und 15). Gemäß der Erfindung
besteht das Fragment von Tetanustoxin aus einem nicht-toxischen
proteolytischen Fragment aus Tetanustoxin (TT), umfassend ein Fragment
C plus 11 Aminosäuren
der schweren Kette, welche unmittelbar dem Aminoende des Fragments
C vorangehen.
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Das
Molekül
mit einer biologischen Funktion wird aus der Gruppe ausgewählt, welche
aus dem Protein von Interesse besteht, beispielsweise für die Kompensation
oder die Modulierung der Funktionen unter der Kontrolle des ZNS
oder des Rückenmarks
oder der Modulation der Funktionen im ZNS oder dem Rückenmark, oder
einem Protein von Interesse für
die Freigabe durch ein Gentherapieexpressionssystem, an das ZNS
oder das Rückenmark.
Proteine von Interesse sind beispielsweise das Protein SMN, impliziert
in spinaler muskulärer
Atrophie (Lefebvre et al., Cell, (1995), 80: 155–165 und Roy et al., Cell,
(1955), 80: 167–178);
neurotrophe Faktoren, wie BDNF (Brain-derived neurotrophic factor);
NT-3 (Neurotrophin-3); NT-4/5; GDNF (Glial cell-line-derived neurotrophic
factor); IGF (Insulin-like
growth factor) (Oppenheim, Neuron, (1996), 17: 195–197; Thoenen
et al., Exp. Neurol., (1933), 124: 47–55 und Hendersen et al., Adv.
Neurol., (1995), 68 235–240);
oder PNI (Proteasenexin I), welches Neuritenauswuchs steigert (dieser Faktor
kann für
die Behandlung von Alzheimer-Erkrankung verwendet werden (Houenou
et al., PNAS, (1995), 92: 895–899));
oder SPI3, ein Serin-Proteaseinhibitorprotein (Safaei, Dev. Brain
Res., (1997), 100: 5–12);
oder ICE (Interleukin-1 konvertierendes Enzym), ein Faktor, welcher
in Apoptosis impliziert ist, um Apoptosis zu verhindern (Nagata,
Cell, (1997), 88: 355–365);
oder Bcl-2, ein intrazellulärer
Schlüsselregulator
des programmierten Zelltodes (Jacobson, M.D. (1997), Current Biology,
7: R277–R281);
oder grün
fluoreszierendes Protein (Lang et al., Neuron, (1997), 18: 857–863) als
ein Marker; Enzym (ex. -Gal); endonucleaseähnliches I-SceI (Choulike A., et al. (1995), Molecular
and Cellular biology, 15(4): 1968–1973 oder CRE (Gu H., et al.
(1994), Science, 265: 103–106);
spezifische Antikörper;
Arzneimittel, speziell gerichtet gegen neurodegenerative Erkrankungen,
wie latero-spinale Amyotrophie. Verschiedene Moleküle können mit
einem TT-Fragment verbunden sein.
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In
Verbindung bedeutet eine Verbindung, welche durch genetische Rekombination
erhalten wird. Diese Verbindung kann stromaufwärts sowie stromabwärts zum
TT-Fragment realisiert werden. Die bevorzugte Weise der Realisierung
der Erfindung ist stromaufwärts
und ist im Detail beschrieben; eine stromabwärtige Realisierung wird auch
in Erwägung
gezogen. (Trotz Halpern et al., J. Biol. Chem., (1993) 268(15):
11188–11192, welcher
darauf hinwies, dass die Carboxyl-endständigen Aminosäuren den
Bereich enthalten, welcher zur Bindung an gereinigte Ganglioside
und neuronale Zellen erforderlich ist.)
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Der
gewünschte
ZNS-Bereich bedeutet beispielsweise die Zunge, welche ausgewählt wird,
um den Transport zu den hypoglossalen Motoneuronen zu dirigieren;
der Armmuskel, welcher ausgewählt
wird, um den Transport zu den Rückenmarkmotoneuronen
zu dirigieren.
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Für diese
Realisierung der Transplantation eines Neurons in das ZNS oder dem
Rückenmark,
siehe Gage, F.H. et al. (1987), Neuroscience, 23: 725–807, "Grafting genetically
modified cells to the brain: possibilities for the future."
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Die
Techniken zum Einführen
der Polynucleotide in Zellen sind in den US-Patenten 5,580,859 und 5,589,466
beschrieben, auf welche Bezug genommen wird. Beispielsweise können die
Nucleotide durch in-vitro-Transfektion vor der Reimplantation im
Bereich des ZNS oder des Rückenmarks
eingeführt
werden.
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Für eine besondere
Ausführungsform
der Erfindung wird eine chemische Bindung in Betracht gezogen und
umfasst die Verbindung zwischen dem TT-Fragment und einem Polynucleotid,
welches für
das Molekül von
Interesse kodiert, mit seinen Regulationselementen, wie einem Promotor
und Verstärker,
welche dieses Polynucleotid exprimieren können. Dann ermöglicht das
TT-Fragment den retrograden axonalen und/oder transsynaptischen
Transport und das Produkt des Polynucleotids wird direkt in den
Neuronen exprimiert. Diese chemische Verbindung kann kovalent sein
oder nicht, jedoch jedoch vorzugsweise durch Thiolisierungsreaktion
oder durch jegliche andere Bindungsreaktion, wie in "Bioconjugate Techniques" von Gret T. Hermanson (Academic
press, 1996) beschrieben ist, kovalent durchgeführt.
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Der
axonale retrograde Transport beginnt auf Muskelebene, wo die Zusammensetzung
von Interesse an der neuromuskulären
Verbindung aufgenommen wird und zu dem neuronalen Körper der
Motoneuronen (welche auch die Neuronen erster Ordnung genannt werden)
in der ZNS oder dem Rückenmark
wandern. Neuronen erster Ordnung bedeuten Neuronen, welche die Zusammensetzung
von Interesse verinnerlicht haben und so in diesem Falle Motoneuronen
entsprechen.
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Der
transsynaptische retrograde Transport entspricht Interneuronen-Kommunikationen über die
Synapsen von den Motoneuronen und umfasst Neuronen zweiter Ordnung
und Neuronen höherer
Ordnung (vierter Ordnung entspricht Neuronen in der Hirnrinde).
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Die
verschiedenen Stufen des neuronalen Transports finden durch die
neuromuskuläre
Verbindung, das Motoneuron, auch genannt Neuron erster Ordnung,
der Synapse in jeder Stufe zwischen den Neuronen verschiedener Ordnung,
dem Neuron zweiter Ordnung bis vierter Ordnung, welches der Hirnrinde
entspricht, statt.
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Bei
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass ein β-gal-TTC
(TT-Fragment C)-Hybridprotein die biologischen Aktivitäten von
beiden Proteinen in vivo beibehält.
Daher kann das Hybridprotein einen retrograden und transneuronalen
Transport durch eine Kette von zwischenverbundenen Neuronen durchlaufen,
wie durch seine enzymatische Aktivität nachgewiesen ist. Diese Ergebnisse
stimmen mit jenen von anderen überein,
welche chemisch konjugiertes TTC oder TTC, das mit anderen Proteinen
kondensiert bzw. verbunden ist (12, 13, 14, 15) verwendeten. Bei
diesen in-vitro-Analysen wurde die Aktivität der konjugierten oder Hybrid-Proteine
gleichermaßen
beibehalten oder nur wenig abgeschwächt. Abhängig von der Natur des TTC-Bindungspartners
können
verschiedene Typen potenzieller Anwendungen in Betracht gezogen werden.
Beispielsweise kann diese Anwendung dazu verwendet werden, ein biologisch
aktives Protein in das ZNS zu therapeutischen Zwecken freizugeben
bzw. zu liefern. Solche Hybridgene können auch dazu verwendet werden,
synaptisch verbundene Neuronen zu analysieren und abzubilden, wenn
Reporter, wie lacZ oder das grün
fluoreszierende Protein(GFP; 29)-Gen mit TTC kondensiert waren.
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Der
retrograde Transport des Hybridproteins kann wie folgt veranschaulicht
werden. Beim Injizieren in einen Muskel lokalisierte sich β-gal-Aktivität rasch
im Soma von Motoneuronen, welche den Muskel stimulieren. Die Arborisation
des gesamten Nervs, Axons, Somas und der Dendriten kann leicht visualisiert
werden. Im Vergleich zu neurotropen Viren zeigt jedoch das Ausmaß retrograden
transneuronalen Transports des Hybridproteins aus den hypoglossalen
Neuronen, dass lediglich ein Untersatz verbundener Neuronen festgestellt wird,
obwohl die meisten Bereiche, welche Interneuronen zweiter Ordnung
enthalten, durch den β-gal-TTC-Marker
identifiziert worden waren. Die transneurale Aufnahme ist hauptsächlich auf
Neuronen zweiter Ordnung beschränkt.
Bei solchen Experimenten wird, wenn eine begrenzte Menge eines neuronalen
Tracers in einen Muskel oder eine Zelle injiziert wird, lediglich
eine Fraktion durch eine Synapse transportiert werden, was eine
experimentelle Beschränkung
der Feststellung mit sich bringt. Derzeit verlässt sich die effizienteste
Methode, im Hinblick auf das Ausmaß des Transportes, auf neurotrope
Viren. Beispiele umfassen: α-Herpesviren, wie
Herpessimplex Typ 1 (HSV-1), Pseudo-Tollwutvirus (PrV) und Rhabdovirus (24,
25). Virale Methoden sind sehr empfindlich, da jedes Mal, wenn ein
Virus eine neue Zelle infiziert, er sich repliziert, wodurch das
Signal verstärkt
wird und eine Visualisierung von Neuronen höherer Ordnung in einer Kette
ermöglicht wird.
Letztendlich will man jedoch ein neuronales Netzwerk in einer in-vivo-Situation,
wie einem transgenen Lebewesen bzw. Tier, abbilden. Hier ist der
Nachteil der viralen Markierung ihre potenzielle Toxizität. Die meisten
Viren sind für
die Nervenzelle nicht unschädlich
und ihre Replikation induziert eine zelluläre Antwort und manchmal Zellabbau
(24). Des Weiteren kann, abhängig
von den experimentellen Bedingungen, ein Keimen des Virus auftreten,
was zu seiner Ausbreitung in benachbarte Zellen und Gewebe führt.
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Unterschiede
in den Mechanismen transneuraler Migration könnten auch zu der beschränkten Anzahl von
Neuronen beitragen, welche durch β-gal-TTC
markiert sind. Matteoli et al. lieferten einen starken Beweis dafür, dass
das intakte Tetanustoxin die Synapsen kreuzt, indem der physiologische
Prozess synaptischer Vesikelrezyklierung an der Nervenendigung parasitiert
wird (22). Das Toxin bindet wahrscheinlich an die innere Oberfläche eines
synaptischen Vesikels während
der Zeit, in welcher das Lumen dem äußeren Medium ausgesetzt ist.
Eine Vesikelendocytose würde
dann wahrscheinlich den Mechanismus zur Internalisierung des Toxins
liefern. Da das TTC-Fragment dafür
bekannt ist, die Migration des Toxins in vivo nachzuahmen, könnte es daher
das Fusionsprotein entlang einem ähnlichen transsynaptischen
Weg leiten. Wenn diese Hypothese bestätigt wird, würde dies
stark unterstützen,
dass für
den transneuralen Transport von β-gal-TTC synaptische Aktivität erforderlich
ist. Daher würden
nur aktive neuronale Schaltkreise durch das Hybridprotein festgestellt werden.
Die mögliche
Abhängigkeit
von β-gal-TTC
von synaptischer Vesikel-Exocytose und -Endocytose könnte des
Weiteren untersucht werden, da jetzt Techniken zur Verfügung stehen,
um synaptische Aktivität
in neuralen Netzwerken in-vitro
aufzuzeichnen (30). Im Gegensatz dazu ist der transneurale Weg neurotroper
Viren noch nicht aufgeklärt
worden und könnte
grundsätzlich
verschieden sein, beinhaltend eine Viruskeimung in der Nachbarschaft
einer Synapse. Schließlich
könnte
der transneurale Transport des Hybridproteins von einer synaptischen
Spezifität
abhängen,
obwohl das Tetanustoxin nicht dafür bekannt ist, eine solche
zu zeigen (7, 23). Es ist daher wahrscheinlich, dass ein Virus unterschiedliche
oder inaktive Synapsen kreuzt. Zusammenfassend macht das begrenzte
Spektrum interneuronalen Transports, zusätzlich zu seiner nicht-Toxizität, das β-gal-TTC-Hybridprotein
zu einem neuen und starken Werkzeug zur Analyse neuronaler Wege.
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Ein
Vorteil des Fusionsgenes der vorliegenden Erfindung zur neuronalen
Abbildung ist, dass es von einer einzelnen genetischen Einheit abgeleitet
ist, die für
Genmanipulation und -gestaltung zugänglich ist. Vor einigen Jahren
wurde eine Technik, basierend auf homologer Rekombination in Embryonenstammzellen,
entwickelt, um spezifisch Gene in der Maus (31, 32) zu ersetzen.
Diese Methode erzeugt eine Null-Mutation
in dem substituierten Gen, obwohl nach einer leicht modifizierten
Strategie auch eine dicistronische m-RNA erzeugt werden kann (33,
34). Wenn ein Reporter-Gen, wie E.coli lacZ, als das Substitutionsgen
verwendet wird, liefert diese Technik ein Mittel zur Markierung
der mutierten Zellen, so dass sie während der Embryogenese verfolgt
werden können.
Demzufolge vereinfacht diese Technik stark die Analyse sowohl der
heterozygoten Expression des Zielgens wie auch des Phenotyps von
(homozygoten) Null-Mutantentieren.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Zusammensetzung,
welche das Fusionsgen umfasst, ein Antigen oder Antigene kodieren
kann. Demzufolge kann die Zusammensetzung zur Aufklärung einer
Immunantwort in ihrem Wirt verwendet werden und danach einen Schutz
des Wirtes gegen das exprimierte Antigen bzw. die exprimierten Antigene
verleihen. Diese Immunisierungsverfahren sind in Robinson et al.,
US-Patent Nr. 5,43,578
beschrieben. Insbesondere umfasst das Verfahren zur Immunisierung
eines Patienten- oder Tierwirtes das Einführen einer DNA-Transkriptionseinheit,
umfassend das Fusionsgen der vorliegenden Erfindung, welches ein
gewünschtes
Antigen oder Antigene kodiert. Die Aufnahme der DNA-Transkriptionseinheit
durch den Wirt resultiert in der Exprimierung des gewünschten
Antigens bzw. der gewünschten Antigene
und die nachfolgende Aufklärung
der humoralen und/oder zellmediierten Immunantworten.
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Nervenzellen
errichten spezifische und komplexe Netzwerke von miteinander verbundenen
Zellen. Wäre
ein Gen in einer gegebenen Nervenzelle mutiert worden, würden wir
erwarten, dass diese Mutation eine wesentliche Auswirkung auf die
Funktionen von anderen verbundenen Nervenzellen besitzen würde. Unter diesen
Betrachtungen wäre
ein Genmarker, der durch aktive Synapsen diffundieren kann, zur
Analyse der Wirkung der Mutation sehr nützlich. In heterozygoten Mutanttieren
könnten
die Zellen, in welchen das Zielgen normalerweise transkribiert wird,
identifiziert werden, ebenso wie die synaptisch verbundenen Zellen
eines neuralen Netzwerkes. In einem homozygoten Tier könnte die
Auswirkung der Mutation auf den Aufbau oder die Aktivität des neuralen
Netzwerkes bestimmt werden. Die Ausführbarkeit einer solchen in-vivo-Annäherung hängt kritisch
von der Wirksamkeit des Fusionsproteins sowie seiner Stabilität und zellulären Anordnung
ab.
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Eine
weitere Ausdehnung der vorliegenden Erfindung betrifft Gentherapie,
die am ZNS durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung sorgt für die Aufnahme eines nicht-toxischen
Enzym-Vektor-Konjugats
durch Axonen-Endigungen und retrograden Transport an Hirnstamm-Motoneuronen.
Ein selektiver retrograder transsynaptischer Mechanismus transportiert
dann das Hybridprotein in verbundene Neuronen zweiter Ordnung. Ein
solcher Weg, welcher die Blut-Hirn-Schranke umläuft, kann Makromoleküle an das
ZNS abgeben. Tatsächlich
werden pathogene Wirkstoffe, wie Tetanustoxin und neurotrope Viren,
in ähnlicher
Weise durch Nervenendigungen aufgenommen, internalisiert und rückläufig. zum
Nervenzellensomatum transportiert. In einem solchen Szenarium würde der
lacZ-Reporter durch ein Gen ersetzt werden, das ein Protein kodiert,
welches eine erforderliche Aktivität und/oder Funktion oder eine
solche von Interesse liefern wird. Beispielsweise würden die humane
CuZn-Superoxiddismutase,
SOD-1, und das humane Enzym β-N-Acetylhexosaminidase
A, HexA, mit dem TTC-Fragment verbunden oder chemisch gebunden (13,
16), und ihre Aufnahme durch Neuronen in-vitro war beträchtlich
erhöht
und ihre enzymatischen Funktionen teilweise erhalten. Verbunden
mit den hier unter Verwendung von β-gal-TTC beschriebenen in-vivo-Experimenten erscheint
ein Gentherapieversuch, basierend auf TTC-Hybridproteinen, ein machbares
Verfahren zur Einführung
einer biologischen Funktion in das ZNS zu sein. Es müssen jedoch
Wege gefunden werden, um die TTC-Hybridproteine, welche wahrscheinlich in
Vesikeln sequestriert sind, auf das geeignete subzelluläre Kompartment
zu richten. Eine solche therapeutische Strategie könnte insbesondere
zur Behandlung neurodegenerativer und motoneuronaler Erkrankungen nützlich sein,
wie amyotrophische Lateralsklerose (ALS, 35), spinale Muskelatrophien
(SMA, 36, 37) oder neurodegenerative lysosomale Speichererkrankungen
(38, 39). Injektion in ausgewählte
Muskeln, sogar in-utero, könnten
dabei helfen, die geeigneten Neuronen spezifisch anzuzielen. Darüber hinaus
würde ein
solcher Ansatz die sekundären
und potenziell toxischen Wirkungen verhindern, welche mit der Verwendung
von fehlerhaften Viren zur Bereitstellung eines Gens, verhindern
(40, 41).
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1: Plasmidkonstruktionen
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(A) TTC-Klonierung:
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Eine
TTC-DNA vollständiger
Länge wurde
aus der genomischen DNA aus Clostridium Tetani-Stamm (ein Geschenk
von Dr. M. Popoff, Institut Pasteur) unter Verwendung von PCR erzeugt.
Es wurden drei überlappende
Fragmente synthetisiert: PCR1 von 465 bp (Primer 1: 5'-CCC CCC GGG CCA
CCA TGG TTT TTT CAA CAC CAA TTC CAT TTT CTT ATT C-3' und Primer 2: 5'-CTA AAC CAG TAA
TTT CTG-3'), PCR2 von 648 bp
(Primer 3: 5'-AAT
TAT GGA CTT TAA AAG ATT CCG C-3' und
Primer 4: 5'-GGC
ATT ATA ACC TAC TCT TAG AAT-3' )
und PCR3 von 338 bp (Primer 5: 5'-AAT
GCC TTT AAT AAT CTT GAT AGA AAT-3' und Primer 6: 5'-CCC CCC GGG CAT ATG TCA TGA ACA TAT
CAA TCT GTT TAA TC-3').
Die drei Fragmente wurden sequenziell in PBluescript KS+ (Stratagene)
eingeführt,
um pBS:TTC-Plasmid zu ergeben. Der stromaufwärtige Primer 1 enthält auch
eine optimierte eukaryotische Ribosomenbindungsstelle (RBS) und
Translationsinitiierungssignale. Unser TTC-Fragment (462 Aminosäuren) repräsentiert
die Aminosäuren
854–1315
von Tetanusholotoxin, die carboxylendständige 451-Aminosäuren der
schweren Kette, welche das C-Fragment plus 11 Aminosäuren der
schweren Kette bilden, welche unmittelbar dem Aminoende des Fragmentes
C vorangehen. Die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des TTC-Fragments,
kloniert in pBS:TTC, ist in 1 gezeigt. Das
Konstrukt pBS:TTC ist in 2 gezeigt.
-
(B) pGEX: lacZ-TTC:
-
pGEX:lacZ
wurde durch Klonieren eines SmaI/XhoI-lacZ-Fragments aus dem pGNA-Vektor
(ein Geschenk von Dr. H. Le Mouellic) in pGEX 4T-2 (Pharmacia) erhalten.
PCR wurde verwendet, um das lacZ-Stoppkodon in eine NcoI-Restriktionsstelle
zu konvertieren. Zwei Primer (stromaufwärtig: 5'-CTG AAT ATC GAC GGT TTC CAT ATG-3' und stromabwärtig: 5'-GGC AGT CTC GAG
TCT AGA CCA TGG CTT TTT GAC ACC AGA C-3') wurden zur Verstärkung der Sequenz zwischen
NdeI und XhoI verwendet, wodurch pGEX:lacZ(NcoI) aus pGEX:lacZ erzeugt
wurde. pGEX:lacZ-TTC wurde durch Insertion des TTC-NcoI/XhoI-Fragments
in pGEX:lacZ(NcoI) erhalten, wobei TTC unmittelbar stromabwärts von
der lacZ-Kodierungsregion und in demselben Leserahmen fixiert wird. 3 zeigt die Einzelheiten des pGEX:lacZ-TTC-Konstrukts.
-
(C) pGEX:TTC-lacZ:
-
pBS:TTC
wurde modifiziert, um NcoI in eine BamHI Restriktionsstelle (Linker
5'-CAT GAC TGG GGA TCC
CCA GT-3') am Anfang
der TTC-DNA umzuwandeln, um pBS:TTC(BamHI)-Plasmid zu erhalten. pGEX:TTC
wurde durch Klonieren des TTC BamHI/SmaI-Fragments aus pBS:TTC(BamHI) in pGEX
4T-2 (Pharmacia) erhalten. Es wurde PCR verwendet, um das TTC-Stoppkodon
in eine NheI-Restriktionsstelle
umzuwandeln. Es wurden zwei Primer (stromaufwärts: 5'-TAT GAT AAA AAT GCA TCT TTA GGA-3' und stromabwärts: 5'-TGG AGT CGA CGC
TAG CAG GAT CAT TTG TCC ATC CTT C-3') verwendet, um die Sequenz zwischen
NsiI und SmaI zu verstärken,
unter Erzeugung von pGEX:TTC(NheI) aus pGEX:TTC. Die lacZ-cDNA aus
Plasmid pGNA wurde an ihrem 5'-Ende
modifiziert, um SacII in eine NheI-Restriktionsstelle umzuwandeln (Linker
5'-GCT AGC GC-3'). pGEX:TTC-lacZ
wurde durch Insertion des lacZ NheI/XhoI-Fragments in pGEX:TTC(NheI),
Verschmelzen bzw. Fixieren von lacZ unmittelbar stromabwärts der
TTC-Kodierungsregion und in demselben Lesebereich erhalten. Die
Einzelheiten des Konstruktes von pGEX:TTC-lacZ sind in 4 gezeigt.
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(D) pCMV:lacZ-TTC:
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Der
pCMV-Vektor wurde aus pGFP-C1 (Clontech Laboratories) nach einigen
Modifikationen erhalten: Die GFP-Sequenz wurde durch eine BglII/NheI-Verdauung
und Relegation ausgeschnitten und SacII in dem Polylinker wurde
in eine AscI-Restriktionsstelle umgewandelt (Linker 5'-GAT ATC GGC GCG
GCG CCA GC-3' und
5'-TGG CGC GCC GAT
ATC GC-3').
-
pBluescript
KS+ (Stratagene) wurde modifiziert, um XhoI in eine AscI-Restriktionsstelle
umzuwandeln (Linker 5'-TCG
ATG GCG CGC CA-3'),
woraus pBS(AscI)-Plasmid resultiert. pBS:lacZ-TTC wurde durch Klonieren
eines XmaI lacZ-TTC-Fragments aus pGEX:lacZ-TTC in pBS(AscI) erhalten.
pCMV:lacZ-TTC wurde durch Insertion des lacZ-TTC XmnI/AscI-Fragments
in den pCMV-Vektor an den XhoI- und
AscI-Stellen erhalten (XhoI und XmnI wurden mit der Klonierung eliminiert),
wobei die Verschmelzung bzw. Fixierung stromabwärts von dem CMV-Promotor angelegt
wurde. 5 zeigt die Einzelheiten des Konstruktes pCMV:lacZ-TTC. Plasmid
pCMV:lacZ-TTC wurde am 12. August 1997 bei der Collection Nationale
de Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25, Rue
des Docteur Roux, F-75724, Paris Cedex 15, Frankreich, unter der Hinterlegungsnummer
I-1912 hinterlegt.
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BEISPIEL 2: Reinigung
des Hybridproteins
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Der
E. coli-Stamm SR3315 (ein Geschenk von Dr. A. Pugsley, Institut
Pasteur), transfiziert mit pGEX:lacZ-TTC, wurde zur Proteinproduktion
verwendet. Eine Übernacht-Bakterienkultur
wurde 1:100 in LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, verdünnt und
für mehrere
Stunden bei 32°C
gezüchtet,
bis ein OD-Wert von 0,5 erreicht war. Die Induktion aus dem Ptac-Promotor wurde durch
die Zugabe von 1 mM IPTG und 1 mM MgCl2 und
weiteren zwei Stunden der Inkubation erreicht. Die induzierten Bakterien
wurden durch Zentrifugieren für
20 Minuten bei 3000 UpM pelletiert, mit PBS gewaschen und in Lysepuffer
resuspendiert, welcher 0,1 M Tris, pH 7,8, 0,1 M NaCl, 20 % Glycerin,
10 mM EDTA, 0,1 % Triton-X100, 4 mM DTT, 1 mg/ml Lysosym und einer
Mischung von Anti-Proteasen (100 μg/ml Pefablok,
1 μg/ml
Leupeptin, 1 μg/ml
Pepstatin, 1 mM Benzamidin) enthielt. Nach Zell-Verteilung in einer
French Press, wurde das gesamte bakterielle Lysat 10 Minuten bei
30000 UpM zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde über Nacht
bei 4°C
mit der Affinitätsmatrix
Glutathion-Sepharose 4B (Stratagene) unter langsamem Rühren inkubiert.
Nach Zentrifugieren für 5
Minuten bei 3000 UpM wurde die Matrix drei Mal mit demselben Lysepuffer
gewaschen, aber ohne Lysosym und Glycerin, und dann drei Mal mit
PBS. Das Harz wurde über
Nacht bei 4°C
mit Thrombin (10 U/ml; Sigma) in PBS inkubiert, um das β-gal-TTC-Fusionsprotein
von der Glutation-S-Transferase(GST)-Sequenz abzuspalten und dadurch diese
von der Affinitätssäule zu eluieren.
Die Konzentrierung des eluierten Fusionsproteins wurde durch Zentrifugieren
in Centricon-X-100-Röhren
erreicht (Amicon; 100.000 MW Cutoff-Membran).
-
Das
gereinigte Hybridprotein wurde durch Western Blotting nach elektrophoretischer
Abtrennung in 8 % Acrylamid SDS/PAGE unter reduzierenden Bedingungen
unter nachfolgender elektrophoretischer Übertragung auf Nitrocellulosemembranen
(0,2 mm Porosität,
BioRad) analysiert. Die Immunodetektion von geblotteten Proteinen
wurde mit einem Vectastaln ABC-Alkaliphosphotase-Kit
(Vector Laboratories) und DAB-Farbentwicklung
durchgeführt.
Antikörper
wurden wie folgt verwendet: Kaninchen-Anti-β-gal-Antiserum (Capel), Verdünnung 1:1000;
Kaninchen-Anti-TTC-Antiserum (Calbiochem), Verdünnung 1:20000. Ein Hauptband
mit einer relativen Molekularmasse von 180 kDa entsprechend dem β-gal-TTC-Hybridprotein,
wurde sowohl bei Anti-β-Gal-
als auch bei Anti-TTC-Antikörpern
festgestellt.
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BEISPIEL 3: Bindung und
Internalisierung von rekombinantem Protein in differenzierten 1009-Zellen
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Die
1009-Zelllinie wurde von aus einem spontanen testikulären Teratokarzinom
abgeleitet, welches in einem rekombinanten Inzucht-Mausstamm (129 × B6) (17)
auftritt. Die 1009-Zellen wurden in dem von Dulbecco modifizierten
Eagle-Medium (DMEM), welches 10 % fötales Kälberserum enthält, gezüchtet und
an der Subkonfluenzstelle passiert. Eine in-vitro-Differenzierung
mit Retinolsäure
und cAMP wurde wie beschrieben (18) durchgeführt. Acht Tage nach der Retinolsäurebehandlung
wurden Zellen für
die Internalisierungsexperimente sowohl mit dem Hybridprotein oder β-Gal verwendet.
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Bindung
und Internalisierung der β-gal-TTC-Fusion
wurden bewertet, indem ein modifiziertes Protokoll (16) verwendet
wurde. Differenzierte 1009-Zellen wurden zwei Stunden bei 37°C mit 5 μg/ml β-gal-TTC
oder β-Gal-Protein
verdünnt
in Bindungspuffer (0,25 % Sucrose, 20 mM Trisacetat, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,25 %
Rinderserum Albumin, in PBS) bewertet. Die Zellen wurden dann mit
1 μg/ml
Pronase E (Sigma) in PBS für 10
Minuten bei 37°C
inkubiert, gefolgt von Waschen mit Proteaseinhibitoren, verdünnt in PBS
(100 μg/ml
Pefablok, 1 mM Benzamidin).
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Die
Zellen wurden mit 4 % Formalin in PBS 10 Minuten bei Raumtemperatur
(RT) fixiert und dann extensiv mit PBS gewaschen. Die β-Gal-Aktivität wurde
an fixierten Zellen durch eine bei 37°C in X-Gal-Lösung (0,8 μg/ml X-Gal, 4 mM Eisen(III)cyanid,
4 mM Kaliumferrocyanid, 4 mM MgCl2 in PBS) über Nacht
durchgeführte
Färbung
festgestellt. Für
eine Elektronenmikroskopie wurden die Zellen des Weiteren in 2,5
Glutaralkdehyd für
18 Stunden fixiert und dann wie beschrieben (19) weiter verarbeitet.
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Zur
immunohistochemischen Markierung wurden Zellen mit 4 Paraformaldehyd
in PBS für
10 Minuten bei RT fixiert, dann extensiv mit PBS gewaschen, gefolgt
von einer einstündigen
Inkubation bei Raumtemperatur mit 2 % RSA/0,02 % Triton X-100 in
PBS. Zellen wurden in primären
Antikörpern,
verdünnt
in 2 RSA/0,02 % Triton X-100 in PBS für 2 Stunden bei RT coinkubiert.
Verwendete Antikörper
waren ein Mäuse-Antineurofilament-Antikörper (NF
200 Kd, Verdünnung
1:50; Sigma) oder der Kaninchen-Anti-TTC-Antikörper (Verdünnung 1:1000). Die Markierung
wurde unter Verwendung fluoreszenter sekundärer Antikörper visualisiert: Cy3, Ziegen-Anti-Kaninchen
IgG (Verdünnung
1:500; Amersham) oder Anti-Maus IgG mit Extravidin-FITC (Verdünnung 1:200;
Sigma) visualisiert. Zellen wurden in Moviol befestigt und mit Epifluorezenz.
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BEISPIEL 4: In-vivo-Injektion
von rekombinantem Protein
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14
Wochen alte B6D2F1-Mäuse
wurden von IFFA-CREDO erhalten. Es wurde in den Zungenmuskel der
Tiere unter Verwendung einer Hamilton-Spritze (20 μl pro Tier)
unter allgemeiner Anästhesie
mit 3 % Avertin (15μl/g
pro Tier) injiziert. Die Proteinkonzentration betrug 0,5 bis 5 μg/ml in PBS;
daher empfingen Mäuse etwa
10 bis 100 μg
pro Injektion. Die Tiere wurden für 12 Stunden bis 48 Stunden
nach der Injektion am Leben gehalten, um die Migration des injizierten
Proteins zu erlauben, und in keinem Fall wurden irgendwelche Tetanussymptome
festgestellt. Die Mäuse
wurden durch intrakardiale Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd in
PBS unter tiefer Anästhesie
getötet.
Die Gehirne wurden geerntet, in PBS gewaschen und über Nacht
bei 4°C
und 15 % Sucrose inkubiert, dann vor der Teilung in Gewebe-Tek befestigt,
15 μm dicke
Scheiben unter Verwendung eines Kryostats.
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BEISPIEL 5: Histologie,
Immunohistologie und X-Gal-Färbung
-
Für eine in-toto-X-Gal-Anfärbung des
entnommenen GehiRNA und der Zunge, wurden Mäuse (10 Tiere) getötet und,
wie oben beschrieben, fixiert. Das Gehirn wurde des Weiteren mit
einem Skalpell entlang der Mittelebene geschnitten und direkt für zwölf Stunden
in X-Gal-Lösung
inkubiert.
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Zur
Immunohistologie wurden Schnitte in einer 1:5000-Verdünnung von
Anti-TTC-Antikörper
in 2 % RSA/0,02 % Triton X-100 in PBS über Nacht bei 4°C, nachdem
nicht-spezifische Antikörper-Bindungssstellen durch
eine einstündige
Inkubierung in dem gleichen Puffer blockiert worden sind, inkubiert.
Die Antikörperdetektion
wurde durchgeführt,
indem Vectastain-ABC-Alkaliphosphatase-Kit
mit DAB-Farbentwickler verwendet wurde. Für die X-Gal-Anfärbung wurden
Schnitte in X-Gal-Lösung
inkubiert und 30 Sekunden mit Hematoxylin 115 (v/v) in PBS zur Kontrolle
angefärbt.
Die Histologie an benachbarten Schnitten wurde nach X-Gal-Anfärbung durchgeführt, unter
Verwendung einer Inkubation in Hematoxylin/Thionin-Lösung für 30 Sekunden.
Alle Schnitte wurden in Moviol vor acht Mikroskopieanalysen befestigt.
-
BEISPIEL 6A: Internalisierung
von β-gal-TTC-Fusionsprotein
durch Neuronen in-vitro
-
Die
Differenzierung von 1009-Zellen mit Retinolsäure und cAMP in vitro erzielt
neuronale und gliale Zellen (18, 20). Eine X-Gal-Anfärbung oder Immunomarkierung
wurden nach Inkubation mit dem β-gal-TTC-Fusionsprotein
oder entweder mit dem β-gal-
oder TTC-Protein alleine durchgeführt. Nur wenn das Hybridprotein
mit differenzierten 1009-Zellen inkubiert wurde, wurde eine starke
X-Gal-Färbung
in Zellen mit neuronalem Phenotyp festgestellt. Es wurde kein Signal
erhalten, wenn β-gal
unter denselben Bedingungen allein inkubiert wurde. Ein ähnliches
X-Gal-Färbemuster
wurde nach Pronasebehandlung der Zellen erhalten, um oberflächengebundene
Proteine zu entfernen, was anzeigt, dass das Hybridprotein internalisiert
worden war. Die intrazelluläre
Lokalisierung des Hybridproteins wurde des Weiteren durch Elektronenmikroskopieanalyse
von X-Gal-gefärbten
Zellen bestätigt.
Des Weiteren erschien es, dass die enzymatische Aktivität, welche in
Axonen beobachtet wurde, in Vesikeln, die mit Filamenten verbunden
waren, lokalisiert ist, was mit der früheren Arbeit an TTC-Fragment
oder nativem Tetanustoxin übereinstimmt
(14, 21, 22). Eine Co-Markierung mit Anti-TTC- und Anti-Neurofilament-Antikörpern brachte
hervor, dass eine β-gal-Aktivität mit TTC-Fragment
in neuronalen Zellen co-lokalisiert ist. Es wurden keine Glialzellen
wurden mit irgendeinem Antikörper
markiert.
-
BEISPIEL 6B Internalisierung
des TTC-β-gal-Fusionsproteins
durch Neuronen in-vitro
-
Das
Verfahren, das zur Internalisierung verwendet wurde, war identisch
mit dem, das in Beispiel 6 oben beschrieben ist. Die Ergebnisse
zeigen wirksame Internalisierung des Hybrids wie in Beispiel 6 oben.
-
BEISPIEL 7 Retrograder
Transport des Hybridproteins in-vivo
-
Um
das Verhalten des β-gal-TTC-Proteins
in vivo zu untersuchen, wurde das Hybridprotein in einem gut charakterisierten
neuronalen Netzwerk, dem hypoglossalen System, ausgetestet. Nach
intramuskulärer
Injektion von β-gal-TTC-Protein
in die Mäusezunge
wurde die Verteilung des Hybridproteins in das ZNS durch X-Gal-Färbung analysiert.
Verschiedenste Verdünnungen
des Proteins wurden injiziert und sequenzielle Zeitpunkte wurden
untersucht, um einen Proteintransport in hypoglossale Motoneuronen
(Xll) und dessen weitere transneurale Migration in verbundene Neuronen
zweiter Ordnung zu erlauben.
-
Ein
gut definiertes Profil von großen,
offensichtlich retrograden, markierten Neuronen war deutlich in der
hypoglossalen Struktur vorhanden, analysiert in-toto bei 12 Stunden
nach der Injektion. Eine starke Markierung war auch in dem hypoglossalen
Nerv (Xlln) der Zunge der injizierten Mäuse vorhanden. Auf der Ebene von
Muskelfasern wurden Knopfstrukturen beobachtet, welche eine Markierung
von neuromuskulären
Verbindungsstellen reflektieren könnten, wo das Hybridprotein
in Nervenaxone internalisiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass
das β-gal-TTC-Hybridprotein
rasch durch retrograden axonalen Transport, bis zu Motoneuronenzellkörpern migrieren
kann, nach vorheriger Aufnahme durch Nervenendigungen in der Zunge.
Diese spezifische Aufnahme und der intraaxonale Transport sind ähnlich mit
den Eigenschaften, welche für
das native Toxin beschrieben worden sind (6, 21, 23).
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Der
Transport des Hybridproteins wurde in größerer Genauigkeit durch Analysierung
von X-Gal-gefärbten
Hirnschnitten untersucht. Motoneuronen des hypoglossalen Kern wurden
rasch markiert, wobei 12 Stunden der früheste untersuchte Zeitpunkt
war. Der Großteil
der Markierung wurde dem neuronalen Soma zugeordnet, wobei der Zellkern
unmarkiert blieb. Die Intensität
der Markierung hängt
von der Konzentration des injizierten β-gal-TTC-Proteins ab: Wurden 10 μg Protein
injiziert, wurde nur das hypoglossale Soma festgestellt, wohingegen
mit 25 bis 50 μg
ein verschwommenes Netzwerk von Dendriten visualisiert wurde; transsynaptischer
Transfer wurde mit 100 μg
Hybridprotein festgestellt. Eine identische Verteilung der Markierung wurde
dann bei Gehirnschnitten beobachtet, wenn sie mit einem Anti-TTC-Antikörper immunogefärbt waren, was
zeigt, dass das β-gal- und TTC-Fragment
innerhalb von Zellen gemeinsam lokalisiert sind. Schließlich resultierte
die Injektion von β-gal
alleine nicht in der Markierung des hypoglossalen KeRNA und bestätigt daher, dass
der Transport des Hypoproteins TTC-abhängig ist. Eine Markierung mit
einem Anti-TTC-Antikörper
war weniger informativ als die Feststellung von β-gal-Aktivität; beispielsweise konnte der
Nervenweg zum Gehirn nicht durch die Anti-TTC-Immunfärbung visualisiert
werden. 18 Stunden nach der Injektion wurde eine Markierung in dem
hypoglossalen Kern beobachtet: Alle Motoneuronenzellkörper und
die meisten proximalen Teile ihrer Dendrite waren sehr dicht gefärbt. Im
Gegensatz dazu wurde keinerlei Markierung in glialen Zellen festgestellt,
welche an Xll-Motoneuronen oder deren Axonen angrenzen. Unsere Ergebnisse
sind in Übereinstimmungen
mit denen von Anderen, welche ein identisches Muster der Immunomarkierung
nach Injektion einzig des TTC-Fragments (9) berichten. Ein transneuraler
Transfer ist nach 24 Stunden feststellbar. Weitere 24 Stunden und
darüber
hinaus erzielten keine verschiedene Anfärbung.
-
BEISPIEL 8 Transneuraler
Transport des Hybridproteins
-
Interneuronen
zweiter Ordnung sowie Neuronen höherer
Ordnung, welche mit den hypoglossalen Motoneuronen synapsieren,
wurden unter Verwendung herkömmlicher
Marker extensiv untersucht, wie dem Weizenkeim-Agglutinin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex
(WGA-HRP) oder neurotropen
Viren, wie Alpha-Herpes (24) und Rhabdoviren (25). Eine erschöpfende Zusammenstellung
bzw. Aufstellung von Bereichen im Gehirn, welche synaptisch mit
dem hypoglossalen Kern verbunden sind, wurde ebenfalls kürzlich beschrieben
(25). Bei der vorliegenden Erfindung hing die Verteilung der β-gal-TTC-Fusion
von der anfänglichen
Konzentration des in den Muskel injizierten Proteins und der Zeit
ab, welche zum Transport nach der Injektion zur Verfügung gestellt
wurde. Bis zu 24 Stunden nach der Injektion war die Markierung auf
den hypoglossalen Kern beschränkt.
Nach 24 Stunden war die Verteilung von transneural markierten Zellen
zweiter Ordnung in verschiedensten Bereichen des Gehirns konsistent
und reproduzierbar. Sogar nach längeren
Zeitpunkten (z.B. 48 Stunden) blieb die Markierung der hypoglossalen
Kerne konstant. Bei höherer
Verstärkung
wurde eine diskrete und lokalisierte Färbung von Neuronen zweiter
Ordnung beobachtet, was unterstellt, dass das Hybridprotein auf
Vesikel innerhalb des Zell-Soma, Synapsen und Axonen gerichtet war.
Eine ähnliche
uneinheitliche Verteilung wurde kürzlich für Tetanustoxin und TTC-Fragment
alleine beschrieben (14, 21, 22).
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Eine
intensive transneurale Markierung wurde in der lateralen retikulären Formation
(LRF) festgestellt, wo medulläre,
retikuläre
Neuronen dafür
beschrieben worden sind, dass sie zahlreiche Projektionen auf die hypoglossalen
Kerne ausbilden (26, 27). β-gal-Aktivität wurde
bilateral in diesen Abschnitten festgestellt. Markierungsgeführte LRF-Projektionen
bildeten eine kontinuierliche Säule
entlang der rostrokaudalen Achse, beginnend lateral zu dem hypoglossalen
Kern, wobei wenige Neuronen vorzugsweise in dem medulären, retikulären dorsalen (MdD)
und dem medullären,
retikulären
ventralen (MdV) Kern gefärbt
werden. Diese Säule
erstreckt sich rostral durch das Medullar bzw. Mark, wobei Neuronen
in dem parvizellulären,
retikulären
Kern (PCRt, caudal und rostral) stärker markiert werden. Nach
48 Stunden waren Zellen in MdD und PCRt stärker gefärbt. Eine zweite bilaterale
Verteilung medullärer
Neuronen, welche sich in den hypoglossalen Kern erstrecken, wurde
in dem solitären
Kern (Sol) festgestellt, aber die Markierung war geringer wie in
der retikulären Formation,
wahrscheinlich weil relativ wenige Zellen des solitären Kernes
zum hypoglossalen Kern vorragen (26). Es wurde jedoch keine Markierung
in dem spinalen trigeminalen Kern (Sp5) gefunden, für den auch
gezeigt worden war, dass er sich in den hypoglossalen Kern erstreckt
(26). Ein transsynaptischer Transport des β-gal-TTC-Proteins wurde auch
im pontinen, retikulären
caudalen Kern (PnC), dem Locus-Coeruleus (LC), dem medialen vestibulären Kern
(MVe) und in wenigen Zellen des untergeordneten vestibulären Kerns
(IV) festgestellt. Diese Zellgruppen sind dafür bekannt, sich zu dem hypoglossalen
Kern zu erstrecken (25), aber ihre Markierung war schwach, wahrscheinlich
aufgrund der größeren Länge ihrer
Axonen. Einige markierte Zellen wurden in dem dorsalen paragigantozellulären Kern
(DPGi), dem magnozellulären,
caudalen Kern (RMc) und dem caudalen Raph-Kern (R) beobachtet; ihre
Verbindungen mit dem hypoglossalen Kern wurden ebenfalls berichtet
(25). Schließlich
wurden markierte Neuronen bilateral in Mittelhirnprojektionen festgestellt, wie
jenen des mesencephalischen trigeminalen Kerns (Me5), und einige
Neuronen wurden in dem mesencephalischen zentralen grauen Bereich
(CG) gefärbt.
Diese letzteren Kerne wurden als mutmaßliche Zellgruppen dritter
Ordnung typisiert, die mit dem hypoglossalen Kern verbunden sind
(25).
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Es
wurden auch Neuronen im motortrigeminalen Kern (Mo5) und dem anschließenden trigeminalen Abschnitt
(Acs5) markiert, zusammen mit einer Population von Neuronen im facialen
Kern (N7). Die Interpretation dieser Markierung ist jedoch mehrdeutiger,
da es bekannt ist, dass Motoneuronen in diesen Kernen auch andere Teile
des Muskelgewebes anregen und eine Diffusion des Hybridproteins
zur Zeit der Injektion aufgetreten sein könnte. Im Gegensatz dazu könnten sich
diese Kerne auch zur Zungenmuskulator über Nerv XII fortgesetzt haben,
da für
Neuronen in N7 berichtet worden ist, dass sie direkt hypoglossalen
Nerveneintrag empfangen (28). Diese letztere Erklärung ist
mit der Tatsache übereinstimmend,
dass die Markierung in diesen Kernen nur nach 10 Stunden festgestellt
wurde; jedoch wurde dieser Punkt nicht weiter untersucht.
-
Zusammengenommen
manifestieren die in Tabelle 1 zusammengefassten Daten deutlich
einen transneuralen Transport des β-gal-TTC-Fusionsproteins aus
den hypoglossalen Neuronen in verschiedene verbundene Bereiche des
Hirnstamms. Tabelle
1: Transneuraler Transport der lacZ-TTC-Fusion aus dem XII-Nerv:
Markierung verschiedener Zelltypen im Zentralnervensystem
- (*) bedeutet Zellgruppen zweiter Ordnung,
welche auch putative Neuronen dritter Ordnung (siehe Text) enthalten.
-, keine Markierung; + bis +++, zunehmende Dichte der Markierung;
+/schwache Markierung. 16 Tiere wurden während der 12–18 Stunden
p.i.-Daten analysiert; 6 Tiere wurden für 24–48 Stunden p.i.-Daten analysiert.
-
LITERATUR
-
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auf welche Bezug genommen worden ist, folgen:
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