JP4991073B2 - 神経細胞への治療薬の送達のための構築物 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、神経細胞へ治療物質を送達するための構築物、その製造および使用、ならびに、特に、クロストリジウム菌神経毒素に基づく構築物に関する。
【０００２】
現在、中枢神経系の主な障害に対して有効な治療法はほとんどない。このような障害には、神経変性疾患、発作、てんかん、脳腫瘍、感染症、およびＨＩＶ脳症が含まれ、これらの疾患の罹患者は癌および心臓疾患の罹患率よりはるかに多数である。発作および神経変性疾患のようなＣＮＳ障害の罹患者数は、特に人口の平均年齢が上昇している発展途上国において、増加している。脳薬理学の知識が増加し、そしてその基礎となる病理学が解明されるにつれて、可能性のある治療方法が明らかになる。しかし、これらの治療はすべて、関連する種々の神経細胞集団への治療剤の効率的な送達についての膨大な問題に直面する。したがって、薬物、酵素、増殖因子、治療ペプチド、および遺伝子を含む広範囲の治療物質について、神経細胞に効率的に送達し得るベクターが必要とされる。
【０００３】
発作または損傷によって誘導される虚血／再潅流損傷は、１つの顕著な例であり、治療薬の迅速かつ効率的な送達は、かなり有益である。外傷または虚血によって損傷したニューロンは、上昇したレベルの酸素フリーラジカルを生じ、そして大量のグルタミン酸塩を放出する。これらの物質は、高濃度では、ニューロンおよび周辺細胞の両方に毒性であり、傷害プロセスを強化および増幅する。これらの毒性物質のレベルを減少させるスーパーオキシドジスムターゼまたはグルタミンシンセターゼのような薬剤は、種々のインビトロおよびインビボ虚血モデルにおいて神経細胞死を減少させることが示されている（Gorovitsら, PNAS (1997) 94, 7024-7029；Francisら, Experimental Neurology (1997) 146, 435-443；Limら, Ann. Thorac. Surg. (1986) 42, 282-286；Cuevasら, Acta Anat. (1990) 137, 303-310）。このような治療の使用における主な問題は、外傷部位への有用な濃度の活性薬剤の送達である。したがって、特異的な神経ベクターは、神経細胞にこのような化合物をターゲティングすることに重要な役割を果たし得る。
【０００４】
運動ニューロン疾患のような末梢神経系障害は、治療薬のターゲティングされた送達に有益である疾患のさらなる例である。このような治療は、遺伝子治療方法による薬物送達またはＤＮＡ送達の形態を取り得る。
【０００５】
遺伝子治療は、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療にかなり有望である。現在利用可能なウイルスおよび非ウイルス遺伝子送達ベクターのほとんどは組織特異性がなく、使用の効率および安全性の両方を減少させる。したがって、発現される神経疾患に対する有効な治療を可能にするために、広範囲の遺伝子ベクターに適切な神経細胞特異的ターゲティングリガンドが、必要とされる。
【０００６】
ボツリヌス菌神経毒素は、タンパク質毒素のファミリーであり、その一次作用部位は神経筋接合部であり、その部位で伝達物質であるアセチルコリンの放出をブロックする。ヒトおよび動物の末梢神経系におけるこれらの毒素の作用は、ボツリヌス中毒症候群を引き起こし、これは広範な弛緩性筋肉麻痺によって特徴づけられる（Shone (1986) 「Natural Toxicants in Foods」, D. Watson編, Ellis Harwood, UK）。各ボツリヌス菌神経毒素は、２つのジスルフィド結合したサブユニットからなる；神経毒素の最初の結合および神経終末へのインターナリゼーションに役割を果たす１００ｋＤａの重いサブユニット（Dollyら (1984) Nature, 307, 457-460）およびエキソサイトーシス過程をブロックするように細胞内で作用する５０ｋＤａの軽いサブユニット（MclnnesおよびDolly (1990) Febs Lett., 261, 323-326；de PaivaおよびDolly (1990) Febs Lett., 277, 171-174）。
【０００７】
クロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞におけるカルシウム依存的神経伝達物質分泌の強力なインヒビターである。これらは、現在、神経伝達物質分泌の小胞ドッキングおよび膜融合事象の中心にある、３つの小胞またはシナプス前膜結合タンパク質であるVAMP、シンタキシン、またはSNAP-25の少なくとも１つの特異的なタンパク質内切断によってこの活性を媒介すると考えられる。破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素の神経細胞ターゲティングは、レセプター媒介事象であると考えられ、その後、毒素は、インターナライズされ、そして続いて適切な細胞内コンパートメントに移り、そこでエンドペプチダーゼ活性を発揮する。
【０００８】
クロストリジウム菌神経毒素は、レセプター結合およびトランスロケーションＨ鎖（ＨＣ、約１００ｋＤａ）にジスルフィド結合した触媒Ｌ鎖（ＬＣ、約５０ｋＤａ）の共通の構成物を有する。ＨＣポリペプチドは、２つの異なる機能的ドメインのすべてまたは一部を含むと考えられる。ＨＣドメインと命名したＨＣのカルボキシ末端半分（約５０ｋＤａ）は、標的ニューロンにおける細胞表面レセプターへの神経毒素の高親和性の神経特異的結合に関連し、一方、ＨＮドメインと命名したアミノ末端半分（約５０ｋＤａ）は、神経毒素の少なくともいくつかの部分の細胞膜を横切るトランスロケーションを媒介すると考えられ、そのためＬＣの機能的活性がターゲット細胞内で発現される。ＨＮドメインはまた、低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過性チャネルを形成する特性を有し、そしてこれは、いくつかの様式で、そのトランスロケーション機能に関連し得る。ボツリヌス菌神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）については、これらのドメインは、ＨＣについてはアミノ酸残基８７２〜１２９６、ＨＮについてはアミノ酸残基４４９〜８７１、およびＬＣについては残基１〜４４８内にあると考えられる。
【０００９】
したがって、神経毒素分子内のドメインの機能的定義を、以下のように提供することができる：
【００１０】
（Ａ）クロストリジウム菌神経毒素軽鎖：
エキソサイトーシス過程に関連する小胞および／または形質膜結合タンパク質に高い基質特異性を示す、メタロプロテアーゼ。特に、これは、SNAP-25、VAMP（シナプトブレビン／セルブレビン）、およびシンタキシンの１つ以上を切断する。
【００１１】
（Ｂ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮドメイン：
軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で起きるような、神経毒素分子の一部のトランスロケーションを可能にする重鎖の一部。
【００１２】
結合ドメインを介して神経毒素がその特異的細胞表面レセプターへ結合した後、標的細胞へのエンドペプチダーゼ活性のトランスロケーションの原因となるドメイン。
【００１３】
低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過性孔の形成の原因となるドメイン。
【００１４】
（Ｃ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＣドメイン：
細胞への毒素のインターナリゼーションの前の、クロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターへの天然のホロ毒素の結合の原因である重鎖の一部。
【００１５】
これらの毒素に対する細胞認識マーカーの同一性は、現在理解されておらず、そして特異的レセプター種はまだ同定されていないが、Kozakiらは、シナプトタグミンがボツリヌス菌神経毒素Ｂ型に対するレセプターであり得ることを報告している。神経毒素のそれぞれが異なるレセプターを有するようである。
【００１６】
破傷風菌毒素は、ボツリヌス菌神経毒素と構造的に非常に類似するが、その一次作用部位は中枢神経系であり、そこで中枢シナプス（レンショウ細胞）からの抑制性神経伝達物質の放出をブロックする。
【００１７】
７つの血清型のほとんどに由来する破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素は、それらに由来する重鎖とともに、ｎＭの範囲の高い親和性で多様な神経細胞型、例えば、ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素と結合することが示されている（Evansら, (1986) Eur. J. Biochem. 154, 409-416）。
【００１８】
しかし、送達ベクターとしての天然のクロストリジウム菌重鎖フラグメントの使用のための主な障害は、溶液中での非常に凝集した状態が、生体組織中への適切な拡散を抑制し、そのためターゲティングベクターとしての効率を減少させることである。治療剤用の神経ターゲティングリガンドとしての天然の破傷風菌毒素フラグメントの提案されたあらゆる臨床的使用でのさらに重大な問題は、破傷風に対して免疫されている集団の大多数における毒素に対する循環抗体の存在である。これらの抗体の存在は、破傷風菌毒素フラグメントに基づく構築物の有効性を減少させるようである。したがって、クロストリジウム菌神経毒素フラグメントは、確認された問題に対する解決を提供しない。
【００１９】
本発明は、クロストリジウム菌神経毒素に基づく治療組成物を使用することにおける実際の困難性の発見、および上記の欠点を避けるクロストリジウム菌神経毒素フラグメントに基づく改変ポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドの発明に基づく。
【００２０】
したがって、本発明の第１の局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、非毒性ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインは、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮドメインではなく、そしてクロストリジウム菌毒素のＨＮドメインのフラグメントまたは誘導体ではない。
【００２１】
結合ドメインは、クロストリジウム菌重鎖フラグメントまたは改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを適切に含むまたはこれらに由来する。本明細書では、用語「改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント」とは、ボツリヌス菌神経毒素または破傷風菌神経毒素の対応する重鎖に類似の生物学的機能を保持するが、対応する重鎖と比較してそのアミノ酸配列および他の特性が異なる、ポリペプチドフラグメントを意味する。本発明は、より詳細には、ボツリヌス菌神経毒素および破傷風菌神経毒素に由来するフラグメントに基づくこのような構築物を提供する。
【００２２】
さらなる局面では、本発明はまた、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該得られるポリペプチド構築物は非凝集性である。
【００２３】
構築物が凝集性のものであるかどうかは、通常、構築物の溶解性の欠如から明らかであり、そしてこれは、水性媒体中での構築物の簡単な目視検査によってわかり得る：非凝集性ドメインは、部分的にまたは好ましくは全体的に可溶性の本発明の構築物を生じるが、凝集性ドメインは、単一のポリペプチドのサイズの数十倍または数百倍の見かけのサイズを有するポリペプチドの非可溶性凝集体を生じる。一般的に、構築物は、ゲル電気泳動でのサイズによって測定される場合に非凝集性であるべきであり、そして測定が生理学的条件を用いて天然ＰＡＧＥ上で適切に行われる場合、測定される構築物のサイズまたは見かけのサイズは、好ましくは、５．０×１０５ダルトンより小さく、より好ましくは１．５×１０５ダルトンより小さい。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインは、（１）ジフテリア菌毒素のＨＮドメイン、（２）ジフテリア菌毒素のＨＮドメインのトランスロケーション活性を実質的に保持する（１）のフラグメントまたは誘導体、（３）融合性ペプチド、（４）膜破壊ペプチド、（５）ボツリヌス菌毒素Ｃ２由来のＨＮ、および（６）（３）、（４）、および（５）のトランスロケーションフラグメントおよび誘導体から選択される。
【００２５】
ボツリヌス菌毒素Ｃ２は、神経特異性を有さないので神経毒素ではなく、その代わりにエンテロトキシンでありそして非凝集性トランスロケーションドメインを提供するために本発明における使用に適切であることに留意すべきである。
【００２６】
本発明のよりさらなる局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該ポリペプチドは、天然の破傷風菌毒素重鎖の中和抗体への親和性と比較して破傷風菌毒素に対する中和抗体への親和性が減少している。
【００２７】
上記の局面は、本発明のポリペプチドによって単一でまたはいくつか組み合わせて示され得、したがって、本発明の代表的な好ましいポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒性活性がなく、（ii）クロストリジウム菌神経毒素の神経細胞への親和性に対応する神経細胞の高い親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）生理学的緩衝液中でボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素由来の対応する重鎖よりも凝集していない状態で存在する。
【００２８】
本発明のポリペプチドの顕著な利点は、それらの非凝集状態であり、したがって、従来技術の構築物がなし得なかった可溶性ポリペプチドとして使用可能になり、そしてクロストリジウム菌神経毒素に基づく従来の構築物の欠点を全部ではないとしてもほとんど克服している。
【００２９】
本発明のポリペプチドには、一般的に、ボツリヌス菌神経毒素および破傷風菌神経毒素のＨＣドメインに由来する配列が含まれ、そしてこれらは、他のタンパク質由来の機能的ドメインと組み合わされ、そのため、神経細胞に結合する、天然の重鎖の必須の機能が保持される。したがって、例えば、ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素のＨＣドメインは、ジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインに融合されて、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを得る。驚くべきことに、このようなポリペプチドは、天然のクロストリジウム菌重鎖よりも、神経細胞に物質を送達するための構築物として有用である。
【００３０】
したがって、本発明の好ましい局面によれば、（ａ）ボツリヌス菌神経毒素または破傷風菌神経毒素のＨＣフラグメントに基づくサブ配列、および（ｂ）例えば、ジフテリア菌毒素に由来するトランスロケーションドメインに基づく、クロストリジウム菌神経毒素に由来しない、サブ配列、を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供され、そして、このポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒素活性がなく、（ii）神経細胞に対して高親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）生理学的緩衝液中でボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素の対応する重鎖よりも凝集していない状態で存在する。
【００３１】
改変クロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素の結合ドメイン（ＨＣドメイン）と非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインとを組み合わせることによって、適切に生成される。したがって、例えば、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメイン（例えば、Ｆ型ＨＣフラグメント、残基８６５〜１２７８；Ａ型ＨＣフラグメント、残基８７２〜１２９６）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得る。
【００３２】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素のＨＣドメインとトランスロケーションドメインとして機能する膜破壊ペプチド、適切にはウイルスペプチドとを組み合わせることによって生成される。したがって、例えば、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメインとインフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ２に基づくペプチド（残基１〜２３）とを組み合わせることによって構築され得る。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、神経ターゲティングリガンドとして有用にする特性を有し；これらは、非毒性であるがボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素によって提示される神経細胞への特異的な高親和性結合を保持する。しかし、天然のクロストリジウム菌重鎖とは異なって、改変クロストリジウム菌重鎖は、溶液中であまり凝集していない状態で存在し、神経細胞への接近を改善する。好ましい構築物は、従来技術の構築物の非常に凝集した状態とは反対に、水溶液に可溶性である。
【００３４】
本発明の他の局面では、改変破傷風菌重鎖フラグメントが提供され、これは、上で定義された改変重鎖の特性の他に、抗破傷風菌接種の結果として存在する中和抗体に対する親和性が、天然の破傷風菌毒素重鎖と比較して減少するという利点が付加されている。本発明のこの局面によれば、ポリペプチドは、一般的に、破傷風菌毒素の重鎖に由来するサブ配列（残基４５８〜１３１５）を含み、そして、破傷風菌毒素の免疫原性の原因であるエピトープが、必要に応じて減少または除去されている。したがって、例えば、ＨＣドメインと関連した免疫原性エピトープならびにＨＮドメインのエピトープを排除することが所望される。少数のアミノ酸（例えば、２０未満または好ましくは１０未満のアミノ酸）を欠失することによってエピトープを排除することが可能であるが、破傷風菌毒素重鎖の免疫原性に関連するエピトープが、多数のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１００、少なくとも２００、および好ましくは４００以上の残基）を他の毒素由来のアミノ酸配列に置換することによってより大きく減少され得ることが見出されている。
【００３５】
したがって、改変破傷風菌重鎖に関する本発明の好ましい局面によれば、（ａ）非クロストリジウム菌ソース（例えば、ジフテリア菌毒素）由来のＨＮドメイン、（ｂ）ボツリヌス菌ＨＣの配列に由来する１以上のサブ配列、および（ｃ）破傷風菌毒素ＨＣの配列に由来する１以上のサブ配列、を含む、アミノ酸配列を有するポリペプチドが提供され、そして、このポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒素活性がなく、（ii）破傷風菌神経毒素の神経結合に対応する神経細胞への高親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）抗破傷風菌接種の結果として存在する破傷風菌毒素に対する中和抗体への低親和性を有する。
【００３６】
この後者の改変破傷風菌重鎖フラグメントは、破傷風菌神経毒素の結合ドメイン（ＨＣドメイン）と非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインとを組み合わせることによって生成され得る。したがって、例えば、改変破傷風菌重鎖フラグメントは、破傷風菌毒素のＨＣドメイン（残基８６５〜１３１５）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得る。
【００３７】
本発明の他の実施態様では、改変破傷風菌重鎖は、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメインに融合した非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインに由来し、そこに、破傷風菌毒素の最小ドメインが挿入されて、生じたハイブリッド上に破傷風菌毒素様結合活性を与える。したがって、例えば、改変破傷風菌重鎖は、ボツリヌス菌Ｆ型フラグメントのＨＣドメイン（残基８６５〜１２７８）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得、そこで、ＨＣドメインの残基１０９７〜１２７３は、破傷風菌毒素由来の相同配列によって置換されている。
【００３８】
改変破傷風菌重鎖は、神経ターゲティングリガンドとして有用にする特性を有し；これらは、非毒性であるが破傷風菌毒素によって提示される神経細胞への特異的な高親和性結合を保持する。しかし、天然の破傷風菌毒素結合フラグメントとは異なって、改変クロストリジウム菌結合フラグメントは、より臨床的に有用にする種々の免疫原性特性を有する。詳細には、本発明の改変クロストリジウム菌結合フラグメントの異なる免疫原性特性は、天然の破傷風菌毒素配列に対する現存する抗体によって引き起こされる問題を顕著に減少させる。
【００３９】
ボツリヌス菌神経毒素に基づく改変重鎖を神経ターゲティングリガンドとして使用することは、予め存在する循環抗体の問題にわずらわされないが、破傷風菌毒素は、抑制性ニューロン（例えば、レンショウ細胞）に対して選択性を有するという点で、クロストリジウム菌毒素の中でも独特であり、そしてこのように、改変破傷風菌毒素重鎖は、このクラスのニューロンに対して価値のあるターゲティングリガンドである。破傷風菌毒素はまた、末梢から中枢神経系まで輸送を逆行し得るという特性を有する。
【００４０】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、トランスロケーションドメインのＮ末端を介してリンカーペプチドに融合され、そこにポリペプチドペイロードが付着され得る。このようなリンカーペプチドの１例は、配列ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号１）であり、これは、トロンビンプロテアーゼ切断部位およびジスルフィド架橋形成のためのシステイン残基を含む。このようなペプチドリンカーは、リンカーペプチドによって改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのＮ末端に融合されたポリペプチド治療分子を含む組換え融合タンパク質を生成させる。次いで、後者の一本鎖融合タンパク質は、二本鎖タンパク質を得るためにトロンビンで処理され得、そこでポリペプチド治療剤は、ジスルフィド結合によって改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのトランスロケーションドメインに連結される。例えば、トランスロケーションドメインが融合性ペプチドである場合のように、トランスロケーションドメインがそのＣ末端近くの遊離のシステイン残基を含まないリンカーペプチドの他の例では、リンカーペプチドは、ジスルフィド架橋に必要とされる両方のシステイン残基を含む。後者のリンカーペプチドの１例は、アミノ酸配列：ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰＳＡＧＳＳＡＣ（配列番号２）である。
【００４１】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、神経細胞に送達される場合に治療的有益性を有する、酵素、増殖因子、タンパク質、またはペプチドであり得るポリペプチドに連結される。ポリペプチドは、化学的手段によって改変クロストリジウム菌重鎖に連結され得る。あるいは、ポリペプチドは、上記のようにリンカーペプチドを使用する組換え技法によって、改変クロストリジウム菌結合フラグメントに連結された融合タンパク質として生成され得る。このような例では、構築物は、以下の成分を含む：
ポリペプチド治療物質；
リンカーペプチド；および
改変クロストリジウム菌重鎖。
【００４２】
ポリペプチド治療ペイロードの１例は、スーパーオキシドジスムターゼである。
【００４３】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、ＤＮＡに直接的または間接的に連結され、そのため、構築物は、例えば、破傷風菌毒素に対するレセプターを介して、神経細胞にＤＮＡを送達し得る。このような構築物は、遺伝子治療適用性を有し、そして細胞で選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切るために使用される。ＤＮＡは、リポソーム内に含まれ得るか、あるいはペプチドまたはタンパク質を介して凝縮され得る。改変クロストリジウム菌重鎖は、化学的カップリング剤によってＤＮＡ凝縮をもたらすタンパク質に化学的に連結され得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖は、組換え技法によって、ＤＮＡの凝縮をもたらし得るペプチドとの融合タンパク質として生成され得る。
【００４４】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、組換えウイルスに連結され得、そのため、改変されたウイルスは、改変された向性を有し、そして破傷風菌毒素レセプターを介して細胞に形質導入し得る。このような構築物は、神経細胞内で選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切ることによって遺伝子欠失を修正するために使用される。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、化学架橋剤を用いてウイルスの表面に直接的に連結され得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ウイルスに特異的に結合する抗体を介して組換えウイルスに連結され得る。この場合、改変クロストリジウム菌結合フラグメントは、ウイルス表面上のマーカーを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に化学的にカップリングされる。類似の改変クロストリジウム菌結合フラグメント−抗体融合タンパク質は、組換え技法によって生成され得、そこでは、抗体成分は、組換え一本鎖抗体である。
【００４５】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、適切なポリマーから構築され得るマイクロパーティクルなどの薬物放出システムに連結される。これらのポリマーとしては、例えば、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリヒドロキシルアルコネート、コラーゲン、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体）またはこのようなマイクロパーティクルに有用な他のポリマーが挙げられる。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、共有化学結合、または静電もしくは疎水力によって、薬物放出システムに連結され得る。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントはまた、改変クロストリジウム菌結合フラグメントの一部が表面で露出されるならば、治療ペイロードとともに放出ベヒクル内にカプセルで包まれ得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ＮまたはＣ末端のいずれかで、ペプチドまたはタンパク質に連結されて、薬物放出システムへのフラグメントのカップリングを容易にし得る。
【００４６】
他の方法が公知であり、それにより、種々の確立された化学的架橋技法を用いて、改変重鎖結合フラグメントがある範囲の治療物質に連結され得、そして改変クロストリジウム菌結合フラグメントおよび他のポリペプチドを含む種々の融合タンパク質が生成され得る。これらの技法を用いて、種々の物質が、改変クロストリジウム菌結合フラグメントを用いて神経細胞にターゲティングされ得る。神経送達ベクターとしての改変クロストリジウム菌結合フラグメントの可能性のある使用の例を、以下の表１に詳細に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
本発明の構築物は、当該技術分野で公知の方法を用いて神経組織または非神経組織のいずれかに導入され得る。神経細胞組織へのその後の特異的結合によって、ターゲティングされた構築物は、その治療効果を発揮する。理想的には、構築物は、治療介入を必要とする部位の近くに注入される。
【００４９】
本発明の構築物は、治療物質の適応および特性に依存して、懸濁液、乳化液、溶液、または凍結乾燥粉末として生成され得る。本発明の構築物は、適応に応じて種々の薬学的に受容可能な液体に再懸濁または希釈され得る。
【００５０】
「クロストリジウム菌神経毒素」とは、破傷風菌神経毒素または７つのボツリヌス菌神経毒素のうちの１つのいずれかを意味し、後者は、血清型Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、またはＧ型と命名されている。
【００５１】
「改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント」とは、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素に由来する対応する重鎖と同様に神経細胞レセプターに結合するが、破傷風菌毒素由来の対応するフラグメントと比較してそのアミノ酸配列および特性が異なるポリペプチドフラグメントを意味する。
【００５２】
ボツリヌス菌および破傷風菌の重鎖フラグメントに関して「結合する」とは、クロストリジウム菌フラグメントと、細胞表面上の結合フラグメントの局在化を生じる１以上の細胞表面レセプターまたはマーカーとの間の特異的相互作用を意味する。クロストリジウム菌神経毒素の場合、所定の血清型のフラグメントと同様に「結合」し得るフラグメントの特性は、リガンドと天然の毒素との間の神経細胞レセプターに対する競合によって証明され得る。
【００５３】
「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞に特異的な高親和性結合」とは、所定の神経毒素の特異的結合に関連する神経細胞の細胞表面レセプターに、リガンドが強力に結合する能力をいう。所定のリガンドがこれらの細胞表面レセプターに強力に結合する能力は、従来の競合結合アッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイにおいては、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素を、種々の濃度の非放射標識リガンドの存在下で神経細胞と接触させる。リガンド混合物を、低温（０〜３℃）で細胞とインキュベートして、リガンドインターナリゼーションを抑制し、その間、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素と非標識リガンドとの競合が起こり得る。このようなアッセイにおいて、使用される非標識リガンドが標識された神経毒素と同じ場合、非標識神経毒素の濃度が上昇するにつれて、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞レセプターから置換される。したがって、この場合に得られる競合曲線は、リガンドの行動を代表し、これは、本明細書で使用されるように、「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞への高親和性結合特異性」を示す。
【００５４】
「トランスロケーションドメイン」とは、膜または脂質二重層を横切って、それ自体および／または他のタンパク質および物質を輸送する、タンパク質のドメインまたはフラグメントを意味する。脂質二重層の膜は、レセプター媒介されるエンドサイトーシスのプロセス中にトランスロケーションが起こるエンドソームの膜であり得る。トランスロケーションドメインは、低ｐＨで脂質膜中に測定可能な孔を形成し得る特性によってしばしば同定され得る（Shoneら, Eur J. Biochem. 167, 175-180）。トランスロケーションドメインの例を、以下の図１により詳細に記載する。本出願において、トランスロケーションドメインは、しばしば「ＨＮドメイン」という。
【００５５】
トランスロケーションドメインに関して「トランスロケーション」とは、細胞表面への結合後に起こるインターナリゼーション事象を意味する。これらの事象は、神経細胞のサイトゾルへ物質を輸送させる。
【００５６】
「治療物質」または「治療薬」とは、改変クロストリジウム菌結合フラグメントによって送達される場合、神経疾患の治療に有益である、任意の物質、薬剤、またはそれらの混合物を意味する。これらの例としては、薬物、増殖因子、酵素、および種々の形態にパッケージされたＤＮＡ（例えば、改変されたウイルス、カチオン性リポソーム、および凝縮されたＤＮＡ）が挙げられる。
【００５７】
本発明では、宿主中でポリペプチドをコードする核酸を発現することによって本発明のポリペプチドを製造する方法、ならびに神経細胞に関連する疾患状態の治療における本発明によるポリペプチドまたは組成物の使用も提供される。
【００５８】
本発明は、以下の特定の実施態様および添付の図面で説明される。
【００５９】
より詳細には、図１は、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを組み込む本発明の実施態様の例を示す。
【００６０】
結合ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素の配列に由来する：
（ａ）ＨＣドメイン、例えば、
ＢｏＮＴ／Ａ残基 ８７２〜１２９６
ＢｏＮＴ／Ｂ残基 ８５９〜１２９１
ＢｏＮＴ／Ｃ残基 ８６７〜１２９１
ＢｏＮＴ／Ｄ残基 ８６３〜１２７６
ＢｏＮＴ／Ｅ残基 ８４６〜１２５２
ＢｏＮＴ／Ｆ残基 ８６５〜１２７８
ＢｏＮＴ／Ｇ残基 ８６４〜１２９７
破傷風菌残基 ８８０〜１３１５
（ｂ）ハイブリッドＨＣドメイン、例えば、
ＢｏＮＴ／ＦのＨＣドメインと破傷風菌とのハイブリッド
（ｃ）短縮型ＨＣドメイン。
【００６１】
トランスロケーションドメインは、多くのソースに由来し得る：
（ａ）細菌毒素、例えば、ジフテリア菌毒素フラグメントＢ（残基１９４〜３８６）
（ｂ）ウイルス融合性ペプチド、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ−２由来
（ｃ）合成の膜破壊ペプチド（例えば、Plankら, J. Biol. Chem., 269, 12918-12924）。
【００６２】
図２は、精製ペプチドタグおよび特異的プロテアーゼ切断部位の位置を示す組換え改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント融合タンパク質の例を示す（適切なプロテアーゼでの処理によって、精製ペプチドタグは、改変クロストリジウム菌結合フラグメントから除去され得る）。
【００６３】
精製ペプチドタグの例は、以下のとおりである：
Ｈｉｓ６
Ｓペプチド
Ｔ７ペプチド
カルモジュリン結合ペプチド
マルトース結合タンパク質。
【００６４】
特異的プロテアーゼ切断部位の例は以下のとおりである：
トロンビン
エンテロキナーゼ
第Ｘ因子。
【００６５】
［実施例１］
組換え改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの調製および精製
標準的な分子生物学プロトコルを、すべての遺伝子操作に用いた（例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。C. botulinum Ｆ型由来のボツリヌス菌毒素のＨＣ領域（残基８６５〜１２７８）および破傷風菌毒素のＨＣ領域（残基８８０〜１３１５）をコードする完全合成遺伝子を、所望の配列を含む自己プライミングオリゴヌクレオチドを用いる回帰ＰＣＲ反応（ProdromouおよびPearl 1992, Protein Engineering, 5: 827-829）を使用して生成した。コドンバイアスとＧＣ／ＡＴ塩基との比を、E. coliにおける発現を容易にするために調整した。フラグメントを、pLitmus 38（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）中に連続的にクローニングして、遺伝子全体をアセンブルした。発現用の構築物をpMALc2 (NEB)にサブクローニングしてBamH1-EcoR1フラグメントを置換した。ライゲーション反応物を、E.coli JM109（Promega）中に形質転換した。
【００６６】
プラスミドＤＮＡを増幅し、精製し、そして適切な配列の存在についてスクリーニングした（Ausubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）。正確な配列を有することが確認された遺伝子構築物を、次いで、発現宿主E. coli BL21 (DE3)に形質転換した（StudierおよびMoffatt 1986, Journal of Molecular Biology, 189: 113-130）。
【００６７】
アフィニティー精製タグおよびこれらのアフィニティータグのその後の除去のための１以上の特異的プロテアーゼ部位を付加するための追加の配列も、遺伝子産物のリーディングフレームに含んだ。
【００６８】
pMALで発現される、アミノ末端マルトース結合タンパク質タグを有する組換えタンパク質を生成して、アミロース樹脂でのアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。簡単にいえば、E. coli BL21 (DE3) pMALc2-HCの培養物を、Terrificブロス−アンピシリン（100μg/ml）−カナマイシン（30μg/ml）中で2.5〜3.8のＯＤ６００まで増殖し、そしてタンパク質発現を、１mM IPTGの添加によって約２時間誘導した。細胞を、凍結／融解、次いで超音波処理によって溶解し、ライセートを遠心分離によって澄明にし、そして上清をアミロース樹脂カラムにロードし、そしてマルトースで溶出した。使用したすべての緩衝液は、製造業者が記載したとおりであった。トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ部位がタンパク質内に含まれており、これらの精製タグはその後除去された。
【００６９】
所望のタンパク質の発現を可能にする他のコード配列も使用可能である。他のタグまたは連結部位も、配列中に組み込まれ得る。これらの選択肢のいくつかの例を、図２にまとめる。
【００７０】
［実施例２］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの生成
実施例１に記載の技法を用いて、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを、ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素または破傷風菌神経毒素のいずれかのＨＣフラグメントのドメインとジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメインとを融合させることによって構築した。実施例のアミノ酸配列を、配列番号８〜１７に示し、これはまた、ＨＣフラグメントが、破傷風菌神経毒素とボツリヌス菌Ｆ型神経毒素とのハイブリッドである、改変破傷風菌重鎖の例を示す。
【００７１】
［実施例３］
タンパク質または酵素への改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのカップリング
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントに連結されるべきポリペプチド、タンパク質、または酵素を、まず、適切な架橋剤で誘導体化する。Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を、0.15M NaClを含む0.05M Hepes緩衝液pH 7.0中の15モル過剰のＳＰＤＰ（Pierce）を用いて25℃にて60分間の処理によって改変した。過剰のＳＰＤＰを、同じ緩衝液に対する４℃にて16時間の透析によって除去した。次いで、置換されたＳＯＤを、ジフテリア菌毒素に由来するトランスロケーションドメインに融合された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントと、１：５のモル比で混合し（図３を参照のこと）、そして25℃にて16時間インキュベートした。インキュベーション後、ＳＯＤ改変クロストリジウム菌結合フラグメント結合体を、Sephadex G200でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
［実施例４］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントと凝縮されたＤＮＡとのカップリング
ＤＮＡの凝縮に使用されるポリ−Ｌ−リジン（Ｍｒ1000〜4000）（10mg）を、0.15M NaClを含む２mlの20mM Hepes緩衝液pH 7.4（ＨＢＳ）に溶解した。この溶液に、0.6mgのスルホ-LC-SPDP（Pierce and Warriner, UK Ltd.）を添加し、そしてこの混合物を25℃にて30分間インキュベートした。次いで、活性化したポリ−Ｌ−リジンを、1000分子量カットオフの透析チューブを用いて、ＨＢＳに対して４℃にて透析し、次いでＨＢＳを用いて１mg/mlまで希釈した。
【００７３】
ＤＮＡの凝縮を、ガラスチューブ中で行った。適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター、または神経特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター））の制御下に治療タンパク質をコードする遺伝子（またはリポーター遺伝子）を含む精製されたプラスミドＤＮＡを、ＨＢＳ中で１mg/mlに作成し、そしてガラスチューブに入れ、上記のように調製した活性化したポリ−Ｌ−リジンを添加した。活性化したポリ−Ｌ−リジンを、種々の割合でこのＤＮＡに添加し（表２を参照のこと）、そして25℃にて90分間インキュベートした。
【００７４】
【表２】
【００７５】
インキュベーション後、凝縮したＤＮＡパーティクルのサイズを、Brookhaven BI90 particle sizerを用いて評価した。100nM未満の直径の凝縮したＤＮＡパーティクルを最高の割合で得るインキュベーション条件を用いて、ＤＮＡ−改変クロストリジウム菌結合フラグメント結合体を生成した。改変クロストリジウム菌重鎖を、ＨＢＳに対して透析した。
【００７６】
次いで、透析したフラグメント（100μg）を、１mlの凝縮したＤＮＡに加え、そして25℃にて18時間インキュベートして、改変クロストリジウム菌結合タンパク質−凝縮したＤＮＡ構築物を形成した（図４を参照のこと）。
【００７７】
［実施例５］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントレセプターを介する神経細胞へのＤＮＡの送達
実施例４に記載の改変クロストリジウム菌重鎖−凝縮したＤＮＡ構築物を、２mlのＭＥＭ無血清培地で希釈した。１２ウェルディッシュ中で増殖したＮＧ１０８由来の増殖培地を取り出し、そして１mlの希釈した構築物を加え、そして５％ＣＯ２の存在下で37℃にて２時間インキュベートした。次いで、増殖培地（１ml）を各ウェルに加え、そしてインキュベーションを同じ条件下で24〜48時間続けた。この時間の後、細胞を検査した。
【００７８】
実験において、凝縮したＤＮＡは、グリーン蛍光タンパク質をコードするリポーター遺伝子を含んでおり、いくつかの細胞がリポータータンパク質の可視発現を示し、これは、神経細胞へのＤＮＡの送達が成功したことを示した。種々のコントロール実験を行って、ＮＧ１０８細胞において観察されたトランスフェクションがレセプターで媒介されることを確認した。
【００７９】
ＮＧ１０８細胞のトランスフェクションが、結合体内の改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの存在に依存的であることがわかった（凝縮したパーティクルＤＮＡ単独ではトランスフェクションは観察されなかった）。
【００８０】
重鎖−ＤＮＡ結合体を用いる非神経細胞（Vero細胞）においては、トランスフェクションは観察されなかった。
【００８１】
［実施例６］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントとラクチド−グリコリド共重合体からなるマイクロパーティクルとの結合体の調製
398mgの低内部粘性のラクチド−グリコリド共重合体（3000MW）（Beohringer Mannheim）を、４mlのジクロロメタンに溶解した。これを、酵素および／または薬物のような治療物質を含む１mlの緩衝溶液とともに、2000rpmにて150秒間ホモジナイズした。Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼの場合、10mgの酵素を、100mM NaClを含む10mM Hepes緩衝液pH 8.0に溶解した。次いで、混合物を、50mlの８％ポリビニルアルコールに加え、そして2000rpmにてさらに150秒間乳化した。エマルジョンを、300mlの超純粋蒸留水に37℃で注ぎ、そして37℃にて30分間撹拌した。マイクロパーティクルを、20℃で10000×gにて25分間の遠心分離によって回収し、次いで、300mlの水に再懸濁し、そして上記のように遠心分離した。この洗浄手順を、さらに４回繰り返した。最終の遠心分離の後、水上清液を除去し、そしてマイクロパーティクルを凍結乾燥した。
【００８２】
２mgのラクチド−グリコリド共重合体マイクロパーティクルを、１mlの活性化緩衝液（0.5M NaClを含む01.M MES緩衝液、pH 6.0）に再懸濁した。固体の1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド（ＥＤＣ）およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホNHS）をそれぞれ２mMおよび５mM加え、そして混合物を25℃にて15分間インキュベートした。マイクロパーティクルを、10000×gで１分間の遠心分離によって洗浄し、そして１mlの活性化緩衝液に再懸濁した。洗浄工程を４回繰り返し、次いで、マイクロパーティクルを、33μMの改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを含む１mlの活性化緩衝液に再懸濁し、そして25℃にて２時間インキュベートした。次いで、反応を、10mMのヒドロキシルアミンで停止した。25℃にて20分後、マイクロパーティクルを上記のように遠心分離によって適切な緩衝液で洗浄した。
【００８３】
［実施例７］
改変重鎖フラグメントによって提示される神経細胞組織への高親和性結合の証明
クロストリジウム菌神経毒素を、クロラミンＴを用いて125-ヨウ素で標識し得、そして種々の細胞への結合を、Evansら 1986, Eur J. Biochem., 154, 409またはWadsworthら 1990, Biochem. J. 268, 123に記載のような標準的方法によって評価し得る。これらの実験において、改変クロストリジウム菌重鎖構築物が神経細胞または脳シナプトソームに存在するレセプターに対して天然のクロストリジウム菌神経毒素と競合する能力を評価した。すべての結合実験を、結合緩衝液中で行った。ボツリヌス菌神経毒素については、この緩衝液は、50mM hepes pH 7.0、30mM NaCl、0.25％スクロース、0.25％ウシ血清アルブミンからなった。破傷風菌毒素については、結合緩衝液は、0.6％ウシ血清アルブミンを含む0.05M MES緩衝液pH 6.0であった。代表的な結合実験では、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素を、１〜10nMの間の固定濃度に保持した。反応混合物を、放射標識された毒素と種々の濃度の非標識神経毒素または改変クロストリジウム菌重鎖構築物とを混合することによって調製した。次いで、反応混合物を、神経細胞またはラット脳シナプトソームに加え、次いで０〜３℃にて２時間インキュベートした。この時間の後、神経細胞またはシナプトソームを、氷冷結合緩衝液で２回洗浄し、そして細胞またはシナプトソームに結合した標識されたクロストリジウム菌神経毒素の量を、γカウンティングによって評価した。
【００８４】
破傷風菌毒素由来の結合ドメインおよびジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインからなる改変クロストリジウム菌重鎖構築物を用いる実験において、構築物が、非標識の天然の破傷風菌神経毒素と同様の様式で、神経細胞レセプターに対して１２５Ｉ-標識された破傷風菌神経毒素と競合することがわかった（図６を参照のこと）。これらのデータは、この構築物が、天然の神経毒素の結合特性を保持していることを示した。
【００８５】
改変クロストリジウム菌重鎖としてジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣを用いるさらなる実験では、この構築物が、神経シナプス膜上のレセプターに対して１２５Ｉ-標識されたＢｏＮＴ／Ｆと競合することがわかった（図７）。これらのデータは、改変クロストリジウム菌重鎖が、ＢｏＮＴ／Ｆの神経レセプター結合特性を保持することを示す。
【００８６】
［実施例８］
天然のボツリヌス菌毒素重鎖（Ａ型）のサイズと改変クロストリジウム菌重鎖（組換えジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ）のサイズとを比較するための非変性ゲル電気泳動
ボツリヌス菌Ａ型重鎖を、既述のように精製し（Shoneら 1985 Eur J. Biochemistry 151, 75-82）、そして組換えジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣを、実施例１および２に記載のように精製した。改変クロストリジウム菌重鎖を、マルトース結合タンパク質融合物として精製し、次いで、融合タンパク質を、第Ｘａ因子での処理によって取り出した。Ａ型重鎖（20μg）およびジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ（10μg）の試料を、Tris-グリシン緩衝液中４〜20％Tris-グリシンポリアクリルアミドゲル上にロードした。試料を、平衡まで電気泳動し（Novexゲルシステム；43ボルト、16時間）、そしてゲルをクーマシーブルーで染色した。結果を図８に示す。ジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ／ＨＣについての主バンドは、約７０ｋＤａの予測分子量の非常に近くに移動して現れる。逆に、天然のＡ型重鎖は、推定分子量の１００ｋＤａと比べると、約５００ｋＤａに拡散したバンドとして現れ、これは、大きなタンパク質凝集体の形成を示唆する。
【００８７】
［実施例９］
組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体
以下の成分の組み合わせを含む、組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体を調製した：
Bacillus stearothermophilus由来の細菌スーパーオキシドジスムターゼ；
スーパーオキシドジスムターゼとトランスロケーションドメインとの間のジスルフィド結合の形成を可能にし、そして二本鎖分子を形成させるために第Ｘａ因子またはトロンビンによる切断のための独特のプロテアーゼ切断部位も含む、リンカー領域；
ジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインまたはインフルエンザウイルス血球凝集素由来のエンドソーム溶解性（融合性）ペプチド；および
破傷風菌神経毒素またはボツリヌス菌神経毒素Ｆ型由来の神経細胞特異的結合ドメイン。
【００８８】
これらの組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体の配列を、配列番号３〜７に示す。
【００８９】
これらの構造の性質を確認するために、組換えクロストリジウム菌改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体を、リンカー領域内の切断部位配列に対応する独特のプロテアーゼでの処理によって二本鎖形態に変換した。トロンビン切断部位を含む結合体を、37℃にて20時間トロンビン（１mgの結合体あたり20μg）で処理し；第Ｘａ因子切断部位を含む結合体を22℃にて20分間第Ｘａ因子（１mgの結合体あたり20μg）で処理した。
【００９０】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、結合体は、分子量約１２０ｋＤａのバンドとして現れた。還元剤（ジチオトレイトール）の存在下では、２つのバンドが、それぞれ改変クロストリジウム菌重鎖およびスーパーオキシドジスムターゼに対応する分子量約７０および３０ｋＤａに観察された。これらのデータは、独特のプロテアーゼでの処理後、結合体が、ジスルフィド架橋によって連結される後者の２つの成分からなることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 融合タンパク質として組換え技法によって生成された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを示す。
【図２】 組換え技法によって生成された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを示す；融合タンパク質は、タンパク質の精製において補助するために１以上の精製ペプチドタグを含み得る；１以上のプロテアーゼ切断部位も精製ペプチドタグの除去を可能にするために含まれ得る；類似の精製方法も、トランスロケーションドメインを含む改変クロストリジウム菌結合フラグメントについて用いられ得る。
【図３】 治療物質への改変クロストリジウム菌結合フラグメントの連結を示す；改変クロストリジウム菌重鎖は、遊離のチオール基（この特性を有するトランスロケーションドメインの１例は、ジフテリア菌毒素のアミノ酸配列１９４〜３８６である）を有するトランスロケーションドメインを含み、治療物質上の遊離のアミノ基は、その後、改変クロストリジウム菌結合フラグメントに存在する遊離のチオール基を用いて結合体形成を可能にする架橋試薬（例えば、ＳＰＤＰ；Pierce & Warriner, UK Ltd.）で改変される。
【図４】 実施例４に記載されるように、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントとオリゴヌクレオチドとの間の結合体の形成を示す。
【図５】 ポリペプチド治療物質との融合タンパク質としての組換え改変クロストリジウム菌重鎖を生成するための方法を示す。ポリペプチド治療物質は、リンカーペプチドによって改変クロストリジウム菌重鎖に融合される。リンカーペプチドは、独特のプロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビンによって認識される部位）およびシステイン残基を含む。リンカーペプチドの例は、（ａ）ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰおよび（ｂ）ＣＧＩＥＧＲＡＰＧＰ（配列番号１８）である。システイン残基は、改変重鎖フラグメントのトランスロケーションドメイン上の他の利用可能なシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する。所望であれば、次いでトロンビン処理によって、ポリペプチド治療物質がジスルフィド架橋によって重鎖に連結される二本鎖産物が生成され得る。
【図６】 神経シナプス膜への改変重鎖の結合と天然の神経毒素の結合との比較を示し、改変重鎖は、実施例７に記載の方法によって評価されるように、破傷風菌神経毒素に特徴的な結合を提示する。
【図７】 ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素の結合ドメインに基づく改変クロストリジウム菌重鎖の神経膜への結合を示す；この例において、改変重鎖は、ジフテリア菌毒素のトランスロケーション（ＨＮ）ドメインおよびＦ型神経毒素の結合（ＨＣ）ドメインを含む。
【図８】 天然の重鎖と比較して、非変性条件下での、改変クロストリジウム菌重鎖の分子サイズの比較を示す；改変クロストリジウム菌重鎖（ジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ）は、約７０ｋＤａのモノマーとして泳動され、一方、天然の重鎖（ＢｏＮＴ／Ａ由来）は、５００ｋＤａより大きい凝集体として泳動される。
【配列表】
本発明は、神経細胞へ治療物質を送達するための構築物、その製造および使用、ならびに、特に、クロストリジウム菌神経毒素に基づく構築物に関する。
【０００２】
現在、中枢神経系の主な障害に対して有効な治療法はほとんどない。このような障害には、神経変性疾患、発作、てんかん、脳腫瘍、感染症、およびＨＩＶ脳症が含まれ、これらの疾患の罹患者は癌および心臓疾患の罹患率よりはるかに多数である。発作および神経変性疾患のようなＣＮＳ障害の罹患者数は、特に人口の平均年齢が上昇している発展途上国において、増加している。脳薬理学の知識が増加し、そしてその基礎となる病理学が解明されるにつれて、可能性のある治療方法が明らかになる。しかし、これらの治療はすべて、関連する種々の神経細胞集団への治療剤の効率的な送達についての膨大な問題に直面する。したがって、薬物、酵素、増殖因子、治療ペプチド、および遺伝子を含む広範囲の治療物質について、神経細胞に効率的に送達し得るベクターが必要とされる。
【０００３】
発作または損傷によって誘導される虚血／再潅流損傷は、１つの顕著な例であり、治療薬の迅速かつ効率的な送達は、かなり有益である。外傷または虚血によって損傷したニューロンは、上昇したレベルの酸素フリーラジカルを生じ、そして大量のグルタミン酸塩を放出する。これらの物質は、高濃度では、ニューロンおよび周辺細胞の両方に毒性であり、傷害プロセスを強化および増幅する。これらの毒性物質のレベルを減少させるスーパーオキシドジスムターゼまたはグルタミンシンセターゼのような薬剤は、種々のインビトロおよびインビボ虚血モデルにおいて神経細胞死を減少させることが示されている（Gorovitsら, PNAS (1997) 94, 7024-7029；Francisら, Experimental Neurology (1997) 146, 435-443；Limら, Ann. Thorac. Surg. (1986) 42, 282-286；Cuevasら, Acta Anat. (1990) 137, 303-310）。このような治療の使用における主な問題は、外傷部位への有用な濃度の活性薬剤の送達である。したがって、特異的な神経ベクターは、神経細胞にこのような化合物をターゲティングすることに重要な役割を果たし得る。
【０００４】
運動ニューロン疾患のような末梢神経系障害は、治療薬のターゲティングされた送達に有益である疾患のさらなる例である。このような治療は、遺伝子治療方法による薬物送達またはＤＮＡ送達の形態を取り得る。
【０００５】
遺伝子治療は、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療にかなり有望である。現在利用可能なウイルスおよび非ウイルス遺伝子送達ベクターのほとんどは組織特異性がなく、使用の効率および安全性の両方を減少させる。したがって、発現される神経疾患に対する有効な治療を可能にするために、広範囲の遺伝子ベクターに適切な神経細胞特異的ターゲティングリガンドが、必要とされる。
【０００６】
ボツリヌス菌神経毒素は、タンパク質毒素のファミリーであり、その一次作用部位は神経筋接合部であり、その部位で伝達物質であるアセチルコリンの放出をブロックする。ヒトおよび動物の末梢神経系におけるこれらの毒素の作用は、ボツリヌス中毒症候群を引き起こし、これは広範な弛緩性筋肉麻痺によって特徴づけられる（Shone (1986) 「Natural Toxicants in Foods」, D. Watson編, Ellis Harwood, UK）。各ボツリヌス菌神経毒素は、２つのジスルフィド結合したサブユニットからなる；神経毒素の最初の結合および神経終末へのインターナリゼーションに役割を果たす１００ｋＤａの重いサブユニット（Dollyら (1984) Nature, 307, 457-460）およびエキソサイトーシス過程をブロックするように細胞内で作用する５０ｋＤａの軽いサブユニット（MclnnesおよびDolly (1990) Febs Lett., 261, 323-326；de PaivaおよびDolly (1990) Febs Lett., 277, 171-174）。
【０００７】
クロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞におけるカルシウム依存的神経伝達物質分泌の強力なインヒビターである。これらは、現在、神経伝達物質分泌の小胞ドッキングおよび膜融合事象の中心にある、３つの小胞またはシナプス前膜結合タンパク質であるVAMP、シンタキシン、またはSNAP-25の少なくとも１つの特異的なタンパク質内切断によってこの活性を媒介すると考えられる。破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素の神経細胞ターゲティングは、レセプター媒介事象であると考えられ、その後、毒素は、インターナライズされ、そして続いて適切な細胞内コンパートメントに移り、そこでエンドペプチダーゼ活性を発揮する。
【０００８】
クロストリジウム菌神経毒素は、レセプター結合およびトランスロケーションＨ鎖（ＨＣ、約１００ｋＤａ）にジスルフィド結合した触媒Ｌ鎖（ＬＣ、約５０ｋＤａ）の共通の構成物を有する。ＨＣポリペプチドは、２つの異なる機能的ドメインのすべてまたは一部を含むと考えられる。ＨＣドメインと命名したＨＣのカルボキシ末端半分（約５０ｋＤａ）は、標的ニューロンにおける細胞表面レセプターへの神経毒素の高親和性の神経特異的結合に関連し、一方、ＨＮドメインと命名したアミノ末端半分（約５０ｋＤａ）は、神経毒素の少なくともいくつかの部分の細胞膜を横切るトランスロケーションを媒介すると考えられ、そのためＬＣの機能的活性がターゲット細胞内で発現される。ＨＮドメインはまた、低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過性チャネルを形成する特性を有し、そしてこれは、いくつかの様式で、そのトランスロケーション機能に関連し得る。ボツリヌス菌神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）については、これらのドメインは、ＨＣについてはアミノ酸残基８７２〜１２９６、ＨＮについてはアミノ酸残基４４９〜８７１、およびＬＣについては残基１〜４４８内にあると考えられる。
【０００９】
したがって、神経毒素分子内のドメインの機能的定義を、以下のように提供することができる：
【００１０】
（Ａ）クロストリジウム菌神経毒素軽鎖：
エキソサイトーシス過程に関連する小胞および／または形質膜結合タンパク質に高い基質特異性を示す、メタロプロテアーゼ。特に、これは、SNAP-25、VAMP（シナプトブレビン／セルブレビン）、およびシンタキシンの１つ以上を切断する。
【００１１】
（Ｂ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮドメイン：
軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で起きるような、神経毒素分子の一部のトランスロケーションを可能にする重鎖の一部。
【００１２】
結合ドメインを介して神経毒素がその特異的細胞表面レセプターへ結合した後、標的細胞へのエンドペプチダーゼ活性のトランスロケーションの原因となるドメイン。
【００１３】
低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過性孔の形成の原因となるドメイン。
【００１４】
（Ｃ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＣドメイン：
細胞への毒素のインターナリゼーションの前の、クロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターへの天然のホロ毒素の結合の原因である重鎖の一部。
【００１５】
これらの毒素に対する細胞認識マーカーの同一性は、現在理解されておらず、そして特異的レセプター種はまだ同定されていないが、Kozakiらは、シナプトタグミンがボツリヌス菌神経毒素Ｂ型に対するレセプターであり得ることを報告している。神経毒素のそれぞれが異なるレセプターを有するようである。
【００１６】
破傷風菌毒素は、ボツリヌス菌神経毒素と構造的に非常に類似するが、その一次作用部位は中枢神経系であり、そこで中枢シナプス（レンショウ細胞）からの抑制性神経伝達物質の放出をブロックする。
【００１７】
７つの血清型のほとんどに由来する破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素は、それらに由来する重鎖とともに、ｎＭの範囲の高い親和性で多様な神経細胞型、例えば、ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素と結合することが示されている（Evansら, (1986) Eur. J. Biochem. 154, 409-416）。
【００１８】
しかし、送達ベクターとしての天然のクロストリジウム菌重鎖フラグメントの使用のための主な障害は、溶液中での非常に凝集した状態が、生体組織中への適切な拡散を抑制し、そのためターゲティングベクターとしての効率を減少させることである。治療剤用の神経ターゲティングリガンドとしての天然の破傷風菌毒素フラグメントの提案されたあらゆる臨床的使用でのさらに重大な問題は、破傷風に対して免疫されている集団の大多数における毒素に対する循環抗体の存在である。これらの抗体の存在は、破傷風菌毒素フラグメントに基づく構築物の有効性を減少させるようである。したがって、クロストリジウム菌神経毒素フラグメントは、確認された問題に対する解決を提供しない。
【００１９】
本発明は、クロストリジウム菌神経毒素に基づく治療組成物を使用することにおける実際の困難性の発見、および上記の欠点を避けるクロストリジウム菌神経毒素フラグメントに基づく改変ポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドの発明に基づく。
【００２０】
したがって、本発明の第１の局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、非毒性ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインは、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮドメインではなく、そしてクロストリジウム菌毒素のＨＮドメインのフラグメントまたは誘導体ではない。
【００２１】
結合ドメインは、クロストリジウム菌重鎖フラグメントまたは改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを適切に含むまたはこれらに由来する。本明細書では、用語「改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント」とは、ボツリヌス菌神経毒素または破傷風菌神経毒素の対応する重鎖に類似の生物学的機能を保持するが、対応する重鎖と比較してそのアミノ酸配列および他の特性が異なる、ポリペプチドフラグメントを意味する。本発明は、より詳細には、ボツリヌス菌神経毒素および破傷風菌神経毒素に由来するフラグメントに基づくこのような構築物を提供する。
【００２２】
さらなる局面では、本発明はまた、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該得られるポリペプチド構築物は非凝集性である。
【００２３】
構築物が凝集性のものであるかどうかは、通常、構築物の溶解性の欠如から明らかであり、そしてこれは、水性媒体中での構築物の簡単な目視検査によってわかり得る：非凝集性ドメインは、部分的にまたは好ましくは全体的に可溶性の本発明の構築物を生じるが、凝集性ドメインは、単一のポリペプチドのサイズの数十倍または数百倍の見かけのサイズを有するポリペプチドの非可溶性凝集体を生じる。一般的に、構築物は、ゲル電気泳動でのサイズによって測定される場合に非凝集性であるべきであり、そして測定が生理学的条件を用いて天然ＰＡＧＥ上で適切に行われる場合、測定される構築物のサイズまたは見かけのサイズは、好ましくは、５．０×１０５ダルトンより小さく、より好ましくは１．５×１０５ダルトンより小さい。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインは、（１）ジフテリア菌毒素のＨＮドメイン、（２）ジフテリア菌毒素のＨＮドメインのトランスロケーション活性を実質的に保持する（１）のフラグメントまたは誘導体、（３）融合性ペプチド、（４）膜破壊ペプチド、（５）ボツリヌス菌毒素Ｃ２由来のＨＮ、および（６）（３）、（４）、および（５）のトランスロケーションフラグメントおよび誘導体から選択される。
【００２５】
ボツリヌス菌毒素Ｃ２は、神経特異性を有さないので神経毒素ではなく、その代わりにエンテロトキシンでありそして非凝集性トランスロケーションドメインを提供するために本発明における使用に適切であることに留意すべきである。
【００２６】
本発明のよりさらなる局面は、神経細胞への治療薬の送達のための、ポリペプチドを提供し、これは、
該神経細胞に結合する結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、該ポリペプチドは、天然の破傷風菌毒素重鎖の中和抗体への親和性と比較して破傷風菌毒素に対する中和抗体への親和性が減少している。
【００２７】
上記の局面は、本発明のポリペプチドによって単一でまたはいくつか組み合わせて示され得、したがって、本発明の代表的な好ましいポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒性活性がなく、（ii）クロストリジウム菌神経毒素の神経細胞への親和性に対応する神経細胞の高い親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）生理学的緩衝液中でボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素由来の対応する重鎖よりも凝集していない状態で存在する。
【００２８】
本発明のポリペプチドの顕著な利点は、それらの非凝集状態であり、したがって、従来技術の構築物がなし得なかった可溶性ポリペプチドとして使用可能になり、そしてクロストリジウム菌神経毒素に基づく従来の構築物の欠点を全部ではないとしてもほとんど克服している。
【００２９】
本発明のポリペプチドには、一般的に、ボツリヌス菌神経毒素および破傷風菌神経毒素のＨＣドメインに由来する配列が含まれ、そしてこれらは、他のタンパク質由来の機能的ドメインと組み合わされ、そのため、神経細胞に結合する、天然の重鎖の必須の機能が保持される。したがって、例えば、ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素のＨＣドメインは、ジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインに融合されて、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを得る。驚くべきことに、このようなポリペプチドは、天然のクロストリジウム菌重鎖よりも、神経細胞に物質を送達するための構築物として有用である。
【００３０】
したがって、本発明の好ましい局面によれば、（ａ）ボツリヌス菌神経毒素または破傷風菌神経毒素のＨＣフラグメントに基づくサブ配列、および（ｂ）例えば、ジフテリア菌毒素に由来するトランスロケーションドメインに基づく、クロストリジウム菌神経毒素に由来しない、サブ配列、を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供され、そして、このポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒素活性がなく、（ii）神経細胞に対して高親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）生理学的緩衝液中でボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素の対応する重鎖よりも凝集していない状態で存在する。
【００３１】
改変クロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素の結合ドメイン（ＨＣドメイン）と非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインとを組み合わせることによって、適切に生成される。したがって、例えば、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメイン（例えば、Ｆ型ＨＣフラグメント、残基８６５〜１２７８；Ａ型ＨＣフラグメント、残基８７２〜１２９６）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得る。
【００３２】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素のＨＣドメインとトランスロケーションドメインとして機能する膜破壊ペプチド、適切にはウイルスペプチドとを組み合わせることによって生成される。したがって、例えば、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメインとインフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ２に基づくペプチド（残基１〜２３）とを組み合わせることによって構築され得る。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、神経ターゲティングリガンドとして有用にする特性を有し；これらは、非毒性であるがボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素によって提示される神経細胞への特異的な高親和性結合を保持する。しかし、天然のクロストリジウム菌重鎖とは異なって、改変クロストリジウム菌重鎖は、溶液中であまり凝集していない状態で存在し、神経細胞への接近を改善する。好ましい構築物は、従来技術の構築物の非常に凝集した状態とは反対に、水溶液に可溶性である。
【００３４】
本発明の他の局面では、改変破傷風菌重鎖フラグメントが提供され、これは、上で定義された改変重鎖の特性の他に、抗破傷風菌接種の結果として存在する中和抗体に対する親和性が、天然の破傷風菌毒素重鎖と比較して減少するという利点が付加されている。本発明のこの局面によれば、ポリペプチドは、一般的に、破傷風菌毒素の重鎖に由来するサブ配列（残基４５８〜１３１５）を含み、そして、破傷風菌毒素の免疫原性の原因であるエピトープが、必要に応じて減少または除去されている。したがって、例えば、ＨＣドメインと関連した免疫原性エピトープならびにＨＮドメインのエピトープを排除することが所望される。少数のアミノ酸（例えば、２０未満または好ましくは１０未満のアミノ酸）を欠失することによってエピトープを排除することが可能であるが、破傷風菌毒素重鎖の免疫原性に関連するエピトープが、多数のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１００、少なくとも２００、および好ましくは４００以上の残基）を他の毒素由来のアミノ酸配列に置換することによってより大きく減少され得ることが見出されている。
【００３５】
したがって、改変破傷風菌重鎖に関する本発明の好ましい局面によれば、（ａ）非クロストリジウム菌ソース（例えば、ジフテリア菌毒素）由来のＨＮドメイン、（ｂ）ボツリヌス菌ＨＣの配列に由来する１以上のサブ配列、および（ｃ）破傷風菌毒素ＨＣの配列に由来する１以上のサブ配列、を含む、アミノ酸配列を有するポリペプチドが提供され、そして、このポリペプチドは、（ｉ）ボツリヌス菌毒素および破傷風菌毒素の神経毒素活性がなく、（ii）破傷風菌神経毒素の神経結合に対応する神経細胞への高親和性を提示し、（iii）細胞膜を横切ってトランスロケーションをもたらし得るドメインを含み、そして（iv）抗破傷風菌接種の結果として存在する破傷風菌毒素に対する中和抗体への低親和性を有する。
【００３６】
この後者の改変破傷風菌重鎖フラグメントは、破傷風菌神経毒素の結合ドメイン（ＨＣドメイン）と非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインとを組み合わせることによって生成され得る。したがって、例えば、改変破傷風菌重鎖フラグメントは、破傷風菌毒素のＨＣドメイン（残基８６５〜１３１５）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得る。
【００３７】
本発明の他の実施態様では、改変破傷風菌重鎖は、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメインに融合した非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインに由来し、そこに、破傷風菌毒素の最小ドメインが挿入されて、生じたハイブリッド上に破傷風菌毒素様結合活性を与える。したがって、例えば、改変破傷風菌重鎖は、ボツリヌス菌Ｆ型フラグメントのＨＣドメイン（残基８６５〜１２７８）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得、そこで、ＨＣドメインの残基１０９７〜１２７３は、破傷風菌毒素由来の相同配列によって置換されている。
【００３８】
改変破傷風菌重鎖は、神経ターゲティングリガンドとして有用にする特性を有し；これらは、非毒性であるが破傷風菌毒素によって提示される神経細胞への特異的な高親和性結合を保持する。しかし、天然の破傷風菌毒素結合フラグメントとは異なって、改変クロストリジウム菌結合フラグメントは、より臨床的に有用にする種々の免疫原性特性を有する。詳細には、本発明の改変クロストリジウム菌結合フラグメントの異なる免疫原性特性は、天然の破傷風菌毒素配列に対する現存する抗体によって引き起こされる問題を顕著に減少させる。
【００３９】
ボツリヌス菌神経毒素に基づく改変重鎖を神経ターゲティングリガンドとして使用することは、予め存在する循環抗体の問題にわずらわされないが、破傷風菌毒素は、抑制性ニューロン（例えば、レンショウ細胞）に対して選択性を有するという点で、クロストリジウム菌毒素の中でも独特であり、そしてこのように、改変破傷風菌毒素重鎖は、このクラスのニューロンに対して価値のあるターゲティングリガンドである。破傷風菌毒素はまた、末梢から中枢神経系まで輸送を逆行し得るという特性を有する。
【００４０】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、トランスロケーションドメインのＮ末端を介してリンカーペプチドに融合され、そこにポリペプチドペイロードが付着され得る。このようなリンカーペプチドの１例は、配列ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号１）であり、これは、トロンビンプロテアーゼ切断部位およびジスルフィド架橋形成のためのシステイン残基を含む。このようなペプチドリンカーは、リンカーペプチドによって改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのＮ末端に融合されたポリペプチド治療分子を含む組換え融合タンパク質を生成させる。次いで、後者の一本鎖融合タンパク質は、二本鎖タンパク質を得るためにトロンビンで処理され得、そこでポリペプチド治療剤は、ジスルフィド結合によって改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのトランスロケーションドメインに連結される。例えば、トランスロケーションドメインが融合性ペプチドである場合のように、トランスロケーションドメインがそのＣ末端近くの遊離のシステイン残基を含まないリンカーペプチドの他の例では、リンカーペプチドは、ジスルフィド架橋に必要とされる両方のシステイン残基を含む。後者のリンカーペプチドの１例は、アミノ酸配列：ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰＳＡＧＳＳＡＣ（配列番号２）である。
【００４１】
本発明の他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、神経細胞に送達される場合に治療的有益性を有する、酵素、増殖因子、タンパク質、またはペプチドであり得るポリペプチドに連結される。ポリペプチドは、化学的手段によって改変クロストリジウム菌重鎖に連結され得る。あるいは、ポリペプチドは、上記のようにリンカーペプチドを使用する組換え技法によって、改変クロストリジウム菌結合フラグメントに連結された融合タンパク質として生成され得る。このような例では、構築物は、以下の成分を含む：
ポリペプチド治療物質；
リンカーペプチド；および
改変クロストリジウム菌重鎖。
【００４２】
ポリペプチド治療ペイロードの１例は、スーパーオキシドジスムターゼである。
【００４３】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖は、ＤＮＡに直接的または間接的に連結され、そのため、構築物は、例えば、破傷風菌毒素に対するレセプターを介して、神経細胞にＤＮＡを送達し得る。このような構築物は、遺伝子治療適用性を有し、そして細胞で選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切るために使用される。ＤＮＡは、リポソーム内に含まれ得るか、あるいはペプチドまたはタンパク質を介して凝縮され得る。改変クロストリジウム菌重鎖は、化学的カップリング剤によってＤＮＡ凝縮をもたらすタンパク質に化学的に連結され得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖は、組換え技法によって、ＤＮＡの凝縮をもたらし得るペプチドとの融合タンパク質として生成され得る。
【００４４】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、組換えウイルスに連結され得、そのため、改変されたウイルスは、改変された向性を有し、そして破傷風菌毒素レセプターを介して細胞に形質導入し得る。このような構築物は、神経細胞内で選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切ることによって遺伝子欠失を修正するために使用される。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、化学架橋剤を用いてウイルスの表面に直接的に連結され得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ウイルスに特異的に結合する抗体を介して組換えウイルスに連結され得る。この場合、改変クロストリジウム菌結合フラグメントは、ウイルス表面上のマーカーを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に化学的にカップリングされる。類似の改変クロストリジウム菌結合フラグメント−抗体融合タンパク質は、組換え技法によって生成され得、そこでは、抗体成分は、組換え一本鎖抗体である。
【００４５】
本発明のさらに他の実施態様では、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、適切なポリマーから構築され得るマイクロパーティクルなどの薬物放出システムに連結される。これらのポリマーとしては、例えば、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリヒドロキシルアルコネート、コラーゲン、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体）またはこのようなマイクロパーティクルに有用な他のポリマーが挙げられる。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、共有化学結合、または静電もしくは疎水力によって、薬物放出システムに連結され得る。改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントはまた、改変クロストリジウム菌結合フラグメントの一部が表面で露出されるならば、治療ペイロードとともに放出ベヒクル内にカプセルで包まれ得る。あるいは、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ＮまたはＣ末端のいずれかで、ペプチドまたはタンパク質に連結されて、薬物放出システムへのフラグメントのカップリングを容易にし得る。
【００４６】
他の方法が公知であり、それにより、種々の確立された化学的架橋技法を用いて、改変重鎖結合フラグメントがある範囲の治療物質に連結され得、そして改変クロストリジウム菌結合フラグメントおよび他のポリペプチドを含む種々の融合タンパク質が生成され得る。これらの技法を用いて、種々の物質が、改変クロストリジウム菌結合フラグメントを用いて神経細胞にターゲティングされ得る。神経送達ベクターとしての改変クロストリジウム菌結合フラグメントの可能性のある使用の例を、以下の表１に詳細に示す。
【００４７】
【表１】
本発明の構築物は、当該技術分野で公知の方法を用いて神経組織または非神経組織のいずれかに導入され得る。神経細胞組織へのその後の特異的結合によって、ターゲティングされた構築物は、その治療効果を発揮する。理想的には、構築物は、治療介入を必要とする部位の近くに注入される。
【００４９】
本発明の構築物は、治療物質の適応および特性に依存して、懸濁液、乳化液、溶液、または凍結乾燥粉末として生成され得る。本発明の構築物は、適応に応じて種々の薬学的に受容可能な液体に再懸濁または希釈され得る。
【００５０】
「クロストリジウム菌神経毒素」とは、破傷風菌神経毒素または７つのボツリヌス菌神経毒素のうちの１つのいずれかを意味し、後者は、血清型Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、またはＧ型と命名されている。
【００５１】
「改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント」とは、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素に由来する対応する重鎖と同様に神経細胞レセプターに結合するが、破傷風菌毒素由来の対応するフラグメントと比較してそのアミノ酸配列および特性が異なるポリペプチドフラグメントを意味する。
【００５２】
ボツリヌス菌および破傷風菌の重鎖フラグメントに関して「結合する」とは、クロストリジウム菌フラグメントと、細胞表面上の結合フラグメントの局在化を生じる１以上の細胞表面レセプターまたはマーカーとの間の特異的相互作用を意味する。クロストリジウム菌神経毒素の場合、所定の血清型のフラグメントと同様に「結合」し得るフラグメントの特性は、リガンドと天然の毒素との間の神経細胞レセプターに対する競合によって証明され得る。
【００５３】
「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞に特異的な高親和性結合」とは、所定の神経毒素の特異的結合に関連する神経細胞の細胞表面レセプターに、リガンドが強力に結合する能力をいう。所定のリガンドがこれらの細胞表面レセプターに強力に結合する能力は、従来の競合結合アッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイにおいては、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素を、種々の濃度の非放射標識リガンドの存在下で神経細胞と接触させる。リガンド混合物を、低温（０〜３℃）で細胞とインキュベートして、リガンドインターナリゼーションを抑制し、その間、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素と非標識リガンドとの競合が起こり得る。このようなアッセイにおいて、使用される非標識リガンドが標識された神経毒素と同じ場合、非標識神経毒素の濃度が上昇するにつれて、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞レセプターから置換される。したがって、この場合に得られる競合曲線は、リガンドの行動を代表し、これは、本明細書で使用されるように、「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞への高親和性結合特異性」を示す。
【００５４】
「トランスロケーションドメイン」とは、膜または脂質二重層を横切って、それ自体および／または他のタンパク質および物質を輸送する、タンパク質のドメインまたはフラグメントを意味する。脂質二重層の膜は、レセプター媒介されるエンドサイトーシスのプロセス中にトランスロケーションが起こるエンドソームの膜であり得る。トランスロケーションドメインは、低ｐＨで脂質膜中に測定可能な孔を形成し得る特性によってしばしば同定され得る（Shoneら, Eur J. Biochem. 167, 175-180）。トランスロケーションドメインの例を、以下の図１により詳細に記載する。本出願において、トランスロケーションドメインは、しばしば「ＨＮドメイン」という。
【００５５】
トランスロケーションドメインに関して「トランスロケーション」とは、細胞表面への結合後に起こるインターナリゼーション事象を意味する。これらの事象は、神経細胞のサイトゾルへ物質を輸送させる。
【００５６】
「治療物質」または「治療薬」とは、改変クロストリジウム菌結合フラグメントによって送達される場合、神経疾患の治療に有益である、任意の物質、薬剤、またはそれらの混合物を意味する。これらの例としては、薬物、増殖因子、酵素、および種々の形態にパッケージされたＤＮＡ（例えば、改変されたウイルス、カチオン性リポソーム、および凝縮されたＤＮＡ）が挙げられる。
【００５７】
本発明では、宿主中でポリペプチドをコードする核酸を発現することによって本発明のポリペプチドを製造する方法、ならびに神経細胞に関連する疾患状態の治療における本発明によるポリペプチドまたは組成物の使用も提供される。
【００５８】
本発明は、以下の特定の実施態様および添付の図面で説明される。
【００５９】
より詳細には、図１は、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを組み込む本発明の実施態様の例を示す。
【００６０】
結合ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素の配列に由来する：
（ａ）ＨＣドメイン、例えば、
ＢｏＮＴ／Ａ残基 ８７２〜１２９６
ＢｏＮＴ／Ｂ残基 ８５９〜１２９１
ＢｏＮＴ／Ｃ残基 ８６７〜１２９１
ＢｏＮＴ／Ｄ残基 ８６３〜１２７６
ＢｏＮＴ／Ｅ残基 ８４６〜１２５２
ＢｏＮＴ／Ｆ残基 ８６５〜１２７８
ＢｏＮＴ／Ｇ残基 ８６４〜１２９７
破傷風菌残基 ８８０〜１３１５
（ｂ）ハイブリッドＨＣドメイン、例えば、
ＢｏＮＴ／ＦのＨＣドメインと破傷風菌とのハイブリッド
（ｃ）短縮型ＨＣドメイン。
【００６１】
トランスロケーションドメインは、多くのソースに由来し得る：
（ａ）細菌毒素、例えば、ジフテリア菌毒素フラグメントＢ（残基１９４〜３８６）
（ｂ）ウイルス融合性ペプチド、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ−２由来
（ｃ）合成の膜破壊ペプチド（例えば、Plankら, J. Biol. Chem., 269, 12918-12924）。
【００６２】
図２は、精製ペプチドタグおよび特異的プロテアーゼ切断部位の位置を示す組換え改変クロストリジウム菌重鎖フラグメント融合タンパク質の例を示す（適切なプロテアーゼでの処理によって、精製ペプチドタグは、改変クロストリジウム菌結合フラグメントから除去され得る）。
【００６３】
精製ペプチドタグの例は、以下のとおりである：
Ｈｉｓ６
Ｓペプチド
Ｔ７ペプチド
カルモジュリン結合ペプチド
マルトース結合タンパク質。
【００６４】
特異的プロテアーゼ切断部位の例は以下のとおりである：
トロンビン
エンテロキナーゼ
第Ｘ因子。
【００６５】
［実施例１］
組換え改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの調製および精製
標準的な分子生物学プロトコルを、すべての遺伝子操作に用いた（例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。C. botulinum Ｆ型由来のボツリヌス菌毒素のＨＣ領域（残基８６５〜１２７８）および破傷風菌毒素のＨＣ領域（残基８８０〜１３１５）をコードする完全合成遺伝子を、所望の配列を含む自己プライミングオリゴヌクレオチドを用いる回帰ＰＣＲ反応（ProdromouおよびPearl 1992, Protein Engineering, 5: 827-829）を使用して生成した。コドンバイアスとＧＣ／ＡＴ塩基との比を、E. coliにおける発現を容易にするために調整した。フラグメントを、pLitmus 38（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）中に連続的にクローニングして、遺伝子全体をアセンブルした。発現用の構築物をpMALc2 (NEB)にサブクローニングしてBamH1-EcoR1フラグメントを置換した。ライゲーション反応物を、E.coli JM109（Promega）中に形質転換した。
【００６６】
プラスミドＤＮＡを増幅し、精製し、そして適切な配列の存在についてスクリーニングした（Ausubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）。正確な配列を有することが確認された遺伝子構築物を、次いで、発現宿主E. coli BL21 (DE3)に形質転換した（StudierおよびMoffatt 1986, Journal of Molecular Biology, 189: 113-130）。
【００６７】
アフィニティー精製タグおよびこれらのアフィニティータグのその後の除去のための１以上の特異的プロテアーゼ部位を付加するための追加の配列も、遺伝子産物のリーディングフレームに含んだ。
【００６８】
pMALで発現される、アミノ末端マルトース結合タンパク質タグを有する組換えタンパク質を生成して、アミロース樹脂でのアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。簡単にいえば、E. coli BL21 (DE3) pMALc2-HCの培養物を、Terrificブロス−アンピシリン（100μg/ml）−カナマイシン（30μg/ml）中で2.5〜3.8のＯＤ６００まで増殖し、そしてタンパク質発現を、１mM IPTGの添加によって約２時間誘導した。細胞を、凍結／融解、次いで超音波処理によって溶解し、ライセートを遠心分離によって澄明にし、そして上清をアミロース樹脂カラムにロードし、そしてマルトースで溶出した。使用したすべての緩衝液は、製造業者が記載したとおりであった。トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ部位がタンパク質内に含まれており、これらの精製タグはその後除去された。
【００６９】
所望のタンパク質の発現を可能にする他のコード配列も使用可能である。他のタグまたは連結部位も、配列中に組み込まれ得る。これらの選択肢のいくつかの例を、図２にまとめる。
【００７０】
［実施例２］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの生成
実施例１に記載の技法を用いて、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを、ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素または破傷風菌神経毒素のいずれかのＨＣフラグメントのドメインとジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメインとを融合させることによって構築した。実施例のアミノ酸配列を、配列番号８〜１７に示し、これはまた、ＨＣフラグメントが、破傷風菌神経毒素とボツリヌス菌Ｆ型神経毒素とのハイブリッドである、改変破傷風菌重鎖の例を示す。
【００７１】
［実施例３］
タンパク質または酵素への改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントのカップリング
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントに連結されるべきポリペプチド、タンパク質、または酵素を、まず、適切な架橋剤で誘導体化する。Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を、0.15M NaClを含む0.05M Hepes緩衝液pH 7.0中の15モル過剰のＳＰＤＰ（Pierce）を用いて25℃にて60分間の処理によって改変した。過剰のＳＰＤＰを、同じ緩衝液に対する４℃にて16時間の透析によって除去した。次いで、置換されたＳＯＤを、ジフテリア菌毒素に由来するトランスロケーションドメインに融合された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントと、１：５のモル比で混合し（図３を参照のこと）、そして25℃にて16時間インキュベートした。インキュベーション後、ＳＯＤ改変クロストリジウム菌結合フラグメント結合体を、Sephadex G200でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
［実施例４］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントと凝縮されたＤＮＡとのカップリング
ＤＮＡの凝縮に使用されるポリ−Ｌ−リジン（Ｍｒ1000〜4000）（10mg）を、0.15M NaClを含む２mlの20mM Hepes緩衝液pH 7.4（ＨＢＳ）に溶解した。この溶液に、0.6mgのスルホ-LC-SPDP（Pierce and Warriner, UK Ltd.）を添加し、そしてこの混合物を25℃にて30分間インキュベートした。次いで、活性化したポリ−Ｌ−リジンを、1000分子量カットオフの透析チューブを用いて、ＨＢＳに対して４℃にて透析し、次いでＨＢＳを用いて１mg/mlまで希釈した。
【００７３】
ＤＮＡの凝縮を、ガラスチューブ中で行った。適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター、または神経特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター））の制御下に治療タンパク質をコードする遺伝子（またはリポーター遺伝子）を含む精製されたプラスミドＤＮＡを、ＨＢＳ中で１mg/mlに作成し、そしてガラスチューブに入れ、上記のように調製した活性化したポリ−Ｌ−リジンを添加した。活性化したポリ−Ｌ−リジンを、種々の割合でこのＤＮＡに添加し（表２を参照のこと）、そして25℃にて90分間インキュベートした。
【００７４】
【表２】
インキュベーション後、凝縮したＤＮＡパーティクルのサイズを、Brookhaven BI90 particle sizerを用いて評価した。100nM未満の直径の凝縮したＤＮＡパーティクルを最高の割合で得るインキュベーション条件を用いて、ＤＮＡ−改変クロストリジウム菌結合フラグメント結合体を生成した。改変クロストリジウム菌重鎖を、ＨＢＳに対して透析した。
【００７６】
次いで、透析したフラグメント（100μg）を、１mlの凝縮したＤＮＡに加え、そして25℃にて18時間インキュベートして、改変クロストリジウム菌結合タンパク質−凝縮したＤＮＡ構築物を形成した（図４を参照のこと）。
【００７７】
［実施例５］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントレセプターを介する神経細胞へのＤＮＡの送達
実施例４に記載の改変クロストリジウム菌重鎖−凝縮したＤＮＡ構築物を、２mlのＭＥＭ無血清培地で希釈した。１２ウェルディッシュ中で増殖したＮＧ１０８由来の増殖培地を取り出し、そして１mlの希釈した構築物を加え、そして５％ＣＯ２の存在下で37℃にて２時間インキュベートした。次いで、増殖培地（１ml）を各ウェルに加え、そしてインキュベーションを同じ条件下で24〜48時間続けた。この時間の後、細胞を検査した。
【００７８】
実験において、凝縮したＤＮＡは、グリーン蛍光タンパク質をコードするリポーター遺伝子を含んでおり、いくつかの細胞がリポータータンパク質の可視発現を示し、これは、神経細胞へのＤＮＡの送達が成功したことを示した。種々のコントロール実験を行って、ＮＧ１０８細胞において観察されたトランスフェクションがレセプターで媒介されることを確認した。
【００７９】
ＮＧ１０８細胞のトランスフェクションが、結合体内の改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントの存在に依存的であることがわかった（凝縮したパーティクルＤＮＡ単独ではトランスフェクションは観察されなかった）。
【００８０】
重鎖−ＤＮＡ結合体を用いる非神経細胞（Vero細胞）においては、トランスフェクションは観察されなかった。
【００８１】
［実施例６］
改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントとラクチド−グリコリド共重合体からなるマイクロパーティクルとの結合体の調製
398mgの低内部粘性のラクチド−グリコリド共重合体（3000MW）（Beohringer Mannheim）を、４mlのジクロロメタンに溶解した。これを、酵素および／または薬物のような治療物質を含む１mlの緩衝溶液とともに、2000rpmにて150秒間ホモジナイズした。Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼの場合、10mgの酵素を、100mM NaClを含む10mM Hepes緩衝液pH 8.0に溶解した。次いで、混合物を、50mlの８％ポリビニルアルコールに加え、そして2000rpmにてさらに150秒間乳化した。エマルジョンを、300mlの超純粋蒸留水に37℃で注ぎ、そして37℃にて30分間撹拌した。マイクロパーティクルを、20℃で10000×gにて25分間の遠心分離によって回収し、次いで、300mlの水に再懸濁し、そして上記のように遠心分離した。この洗浄手順を、さらに４回繰り返した。最終の遠心分離の後、水上清液を除去し、そしてマイクロパーティクルを凍結乾燥した。
【００８２】
２mgのラクチド−グリコリド共重合体マイクロパーティクルを、１mlの活性化緩衝液（0.5M NaClを含む01.M MES緩衝液、pH 6.0）に再懸濁した。固体の1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド（ＥＤＣ）およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホNHS）をそれぞれ２mMおよび５mM加え、そして混合物を25℃にて15分間インキュベートした。マイクロパーティクルを、10000×gで１分間の遠心分離によって洗浄し、そして１mlの活性化緩衝液に再懸濁した。洗浄工程を４回繰り返し、次いで、マイクロパーティクルを、33μMの改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを含む１mlの活性化緩衝液に再懸濁し、そして25℃にて２時間インキュベートした。次いで、反応を、10mMのヒドロキシルアミンで停止した。25℃にて20分後、マイクロパーティクルを上記のように遠心分離によって適切な緩衝液で洗浄した。
【００８３】
［実施例７］
改変重鎖フラグメントによって提示される神経細胞組織への高親和性結合の証明
クロストリジウム菌神経毒素を、クロラミンＴを用いて125-ヨウ素で標識し得、そして種々の細胞への結合を、Evansら 1986, Eur J. Biochem., 154, 409またはWadsworthら 1990, Biochem. J. 268, 123に記載のような標準的方法によって評価し得る。これらの実験において、改変クロストリジウム菌重鎖構築物が神経細胞または脳シナプトソームに存在するレセプターに対して天然のクロストリジウム菌神経毒素と競合する能力を評価した。すべての結合実験を、結合緩衝液中で行った。ボツリヌス菌神経毒素については、この緩衝液は、50mM hepes pH 7.0、30mM NaCl、0.25％スクロース、0.25％ウシ血清アルブミンからなった。破傷風菌毒素については、結合緩衝液は、0.6％ウシ血清アルブミンを含む0.05M MES緩衝液pH 6.0であった。代表的な結合実験では、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素を、１〜10nMの間の固定濃度に保持した。反応混合物を、放射標識された毒素と種々の濃度の非標識神経毒素または改変クロストリジウム菌重鎖構築物とを混合することによって調製した。次いで、反応混合物を、神経細胞またはラット脳シナプトソームに加え、次いで０〜３℃にて２時間インキュベートした。この時間の後、神経細胞またはシナプトソームを、氷冷結合緩衝液で２回洗浄し、そして細胞またはシナプトソームに結合した標識されたクロストリジウム菌神経毒素の量を、γカウンティングによって評価した。
【００８４】
破傷風菌毒素由来の結合ドメインおよびジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインからなる改変クロストリジウム菌重鎖構築物を用いる実験において、構築物が、非標識の天然の破傷風菌神経毒素と同様の様式で、神経細胞レセプターに対して１２５Ｉ-標識された破傷風菌神経毒素と競合することがわかった（図６を参照のこと）。これらのデータは、この構築物が、天然の神経毒素の結合特性を保持していることを示した。
【００８５】
改変クロストリジウム菌重鎖としてジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣを用いるさらなる実験では、この構築物が、神経シナプス膜上のレセプターに対して１２５Ｉ-標識されたＢｏＮＴ／Ｆと競合することがわかった（図７）。これらのデータは、改変クロストリジウム菌重鎖が、ＢｏＮＴ／Ｆの神経レセプター結合特性を保持することを示す。
【００８６】
［実施例８］
天然のボツリヌス菌毒素重鎖（Ａ型）のサイズと改変クロストリジウム菌重鎖（組換えジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ）のサイズとを比較するための非変性ゲル電気泳動
ボツリヌス菌Ａ型重鎖を、既述のように精製し（Shoneら 1985 Eur J. Biochemistry 151, 75-82）、そして組換えジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣを、実施例１および２に記載のように精製した。改変クロストリジウム菌重鎖を、マルトース結合タンパク質融合物として精製し、次いで、融合タンパク質を、第Ｘａ因子での処理によって取り出した。Ａ型重鎖（20μg）およびジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ（10μg）の試料を、Tris-グリシン緩衝液中４〜20％Tris-グリシンポリアクリルアミドゲル上にロードした。試料を、平衡まで電気泳動し（Novexゲルシステム；43ボルト、16時間）、そしてゲルをクーマシーブルーで染色した。結果を図８に示す。ジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ／ＨＣについての主バンドは、約７０ｋＤａの予測分子量の非常に近くに移動して現れる。逆に、天然のＡ型重鎖は、推定分子量の１００ｋＤａと比べると、約５００ｋＤａに拡散したバンドとして現れ、これは、大きなタンパク質凝集体の形成を示唆する。
【００８７】
［実施例９］
組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体
以下の成分の組み合わせを含む、組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体を調製した：
Bacillus stearothermophilus由来の細菌スーパーオキシドジスムターゼ；
スーパーオキシドジスムターゼとトランスロケーションドメインとの間のジスルフィド結合の形成を可能にし、そして二本鎖分子を形成させるために第Ｘａ因子またはトロンビンによる切断のための独特のプロテアーゼ切断部位も含む、リンカー領域；
ジフテリア菌毒素由来のトランスロケーションドメインまたはインフルエンザウイルス血球凝集素由来のエンドソーム溶解性（融合性）ペプチド；および
破傷風菌神経毒素またはボツリヌス菌神経毒素Ｆ型由来の神経細胞特異的結合ドメイン。
【００８８】
これらの組換え改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体の配列を、配列番号３〜７に示す。
【００８９】
これらの構造の性質を確認するために、組換えクロストリジウム菌改変重鎖−スーパーオキシドジスムターゼ結合体を、リンカー領域内の切断部位配列に対応する独特のプロテアーゼでの処理によって二本鎖形態に変換した。トロンビン切断部位を含む結合体を、37℃にて20時間トロンビン（１mgの結合体あたり20μg）で処理し；第Ｘａ因子切断部位を含む結合体を22℃にて20分間第Ｘａ因子（１mgの結合体あたり20μg）で処理した。
【００９０】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、結合体は、分子量約１２０ｋＤａのバンドとして現れた。還元剤（ジチオトレイトール）の存在下では、２つのバンドが、それぞれ改変クロストリジウム菌重鎖およびスーパーオキシドジスムターゼに対応する分子量約７０および３０ｋＤａに観察された。これらのデータは、独特のプロテアーゼでの処理後、結合体が、ジスルフィド架橋によって連結される後者の２つの成分からなることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 融合タンパク質として組換え技法によって生成された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを示す。
【図２】 組換え技法によって生成された改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントを示す；融合タンパク質は、タンパク質の精製において補助するために１以上の精製ペプチドタグを含み得る；１以上のプロテアーゼ切断部位も精製ペプチドタグの除去を可能にするために含まれ得る；類似の精製方法も、トランスロケーションドメインを含む改変クロストリジウム菌結合フラグメントについて用いられ得る。
【図３】 治療物質への改変クロストリジウム菌結合フラグメントの連結を示す；改変クロストリジウム菌重鎖は、遊離のチオール基（この特性を有するトランスロケーションドメインの１例は、ジフテリア菌毒素のアミノ酸配列１９４〜３８６である）を有するトランスロケーションドメインを含み、治療物質上の遊離のアミノ基は、その後、改変クロストリジウム菌結合フラグメントに存在する遊離のチオール基を用いて結合体形成を可能にする架橋試薬（例えば、ＳＰＤＰ；Pierce & Warriner, UK Ltd.）で改変される。
【図４】 実施例４に記載されるように、改変クロストリジウム菌重鎖フラグメントとオリゴヌクレオチドとの間の結合体の形成を示す。
【図５】 ポリペプチド治療物質との融合タンパク質としての組換え改変クロストリジウム菌重鎖を生成するための方法を示す。ポリペプチド治療物質は、リンカーペプチドによって改変クロストリジウム菌重鎖に融合される。リンカーペプチドは、独特のプロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビンによって認識される部位）およびシステイン残基を含む。リンカーペプチドの例は、（ａ）ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰおよび（ｂ）ＣＧＩＥＧＲＡＰＧＰ（配列番号１８）である。システイン残基は、改変重鎖フラグメントのトランスロケーションドメイン上の他の利用可能なシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する。所望であれば、次いでトロンビン処理によって、ポリペプチド治療物質がジスルフィド架橋によって重鎖に連結される二本鎖産物が生成され得る。
【図６】 神経シナプス膜への改変重鎖の結合と天然の神経毒素の結合との比較を示し、改変重鎖は、実施例７に記載の方法によって評価されるように、破傷風菌神経毒素に特徴的な結合を提示する。
【図７】 ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素の結合ドメインに基づく改変クロストリジウム菌重鎖の神経膜への結合を示す；この例において、改変重鎖は、ジフテリア菌毒素のトランスロケーション（ＨＮ）ドメインおよびＦ型神経毒素の結合（ＨＣ）ドメインを含む。
【図８】 天然の重鎖と比較して、非変性条件下での、改変クロストリジウム菌重鎖の分子サイズの比較を示す；改変クロストリジウム菌重鎖（ジフテリア菌ＨＮ−ＢｏＮＴ／Ｆ ＨＣ）は、約７０ｋＤａのモノマーとして泳動され、一方、天然の重鎖（ＢｏＮＴ／Ａ由来）は、５００ｋＤａより大きい凝集体として泳動される。
【配列表】
Claims (12)
- ポリペプチドに連結された治療薬を含む組成物であって、該ポリペプチドが、神経細胞への治療薬の送達のためのものであり、
該神経細胞に結合する結合ドメインであって、ボツリヌス菌神経毒素のＨＣドメインを含む、結合ドメイン、および
該神経細胞に該治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインであって、ジフテリア菌毒素のＨＮドメインを含む、トランスロケーションドメインを含む、
組成物。 - ボツリヌス菌Ｂ型フラグメント（残基８５９〜１２９１）またはＡ型フラグメント（残基８７２〜１２９６）またはＦ型フラグメント（残基８６２〜１２７８）に基づく、請求項１に記載の組成物。
- 前記治療薬が、前記ポリペプチドに化学的に結合されている、請求項１または２に記載の組成物。
- 前記治療薬が、前記ポリペプチドのトランスロケーションドメインに連結されている、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
- 前記治療薬が、酵素、増殖因子、タンパク質、またはペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
- 前記治療薬が、組換え技法によって融合タンパク質として生成される、請求項４または５に記載の組成物。
- 前記治療薬が、遺伝子治療薬またはアンチセンス薬物として有用な核酸である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
- 前記核酸が、リポソーム内に含まれるか、あるいはペプチドもしくはタンパク質を介して凝縮しているかまたは化学的カップリング剤を用いる凝縮によって凝縮されている、請求項７に記載の組成物。
- 前記核酸が、組換えウイルスの形態で存在する、請求項７に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、改変された向性を有し、そしてクロストリジウム菌毒素レセプターを介して細胞に形質導入し得る、請求項９に記載の組成物。
- 請求項１から１０のいずれかに記載の組成物の製造方法であって、該組成物をコードする核酸を非ヒト宿主細胞中で発現させる工程を含む、方法。
- 神経細胞に関連する疾患状態の治療において用いられる組成物であって、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物を含む、組成物。
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