JPH05502880A - トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子光朋Ω 背旦 本発明は細胞結合部位およびトランスロケーション部位を有するハイブリッド分 子に関する。 文献は、ハイブリッド蛋白質をコードする融合遺伝子の多くの例を報告している 。例えばＶｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：３２３７−３７３１．１９７８に記載されて いる融合遺伝子は、真核生物構造遺伝子か非すイトプラズミックなバクテリア遺 伝子に融合したものからなる。この融合遺伝子は、細胞質（サイトプラズマ）外 に輸送されるハイブリッド蛋白質をコードする。 ハイブリッド蛋白質はまた、組換えＤＮＡ技術を使わない他の方法によっても作 られている（例えば、二つの異なる蛋白質分子のカップリング）。例えば、カッ プリング法によって、選択された細胞クラスに特異的に結合する能力を有するリ ガンドヘカップリングした毒素分子部分からなる治療用ハイブリッド蛋白質を作 ることが提唱されている。そのようなハイブリッド蛋白質を作製する一つの試み は、Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５２＋１５１５− １５２２．１９７７に報告されており、ジスルフィド架橋によってジフテリア毒 素Ａ鎖がヒト胎盤乳腺刺激ホルモンにカップリングしたハイブリッド体が得られ ている。このハイブリッド体は乳腺刺激ホルモンリセブターを含む細胞には結合 するが、そのような細胞の蛋白質合成の阻害は生じなかった。 同様にジスルフィド結合により架橋させることによって、リチン毒素Ａ鎖をヒト 絨毛性ゴナドトロピンホルモンにカップリングさせたものからなるハイブリッド 蛋白質も報告されており、特異性を有すると報告されているが、その結合能力は 報告されていない。しかも、ラットのライジッヒ腫瘍細胞において蛋白質合成を 有意に阻害するためには極度に高濃度が要求されたので、エンドサイト−シスに よる非特異的取込みと、ハイブリッド蛋白質の毒素部分か標的細胞の細胞質膜を 横切って輸送されることによる特異的取込みを区別することが困難であった（Ｏ ｅｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４：１０２８−１ ０３２．１９７９）。同じ欠点は、シスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）を架橋剤 として用いてインシュリンにカップリングさせたジフテリアＡからなるハイブリ ッド蛋白質にも認められている（Ｍｉｓｋｉｍｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、９１：１４３−１５１．１ ９７９）。ヘテロバイファンクショナルな架橋剤を用いてリチンＡを上皮生長因 子（ＥＧＦ）にカップリングさせたハイブリッド蛋白質も作製されているか、Ｅ ＧＦにより提供される結合特性は特異的細胞に限定されず、広範な細胞タイプを 包含している（Ｃａｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　２２：５６３−５７０ ．１９８０）。 図１に説明されているとおり、天然ジフテリア毒素分子はいくつかの機能的ドメ インからなり、それらは分子のアミノ末端から出発して、疎水性リーダーシグナ ル配列　Ｓ　（アミノ酸Ｖａ　ｌ　−２５Ａ　ｌ　ａ−１）　：酵素活性フラグ メントΔ（アミノ酸Ｇｌｙ、−Ａｒｇ□９３）；開裂ドメインを含む、プロテア ーゼ感受性ジスルフィドループ　ｌエ　（アミノ酸ＣｙＳｘａｓ　−Ｃ）’３２ ｏｚ　）　：およびトランスロケーションドメインと第ニジスルフィドループ（ １２，アミノ酸Ｃｙｓ、、□−Ｃｙ８４７１　）に隣接する一般的結合ドメイン とを含む、フラグメントＢ（アミノ酸Ｓｅ　ｒｌｏ４−Ｓｅ　ｒ５ｓｓ　）であ る。 ジフテリア毒素か感受性真核生物細胞を中毒させる過程は、少なくとも次の工程 を含んでいる：　（ｉ）−ジフテリア毒素の結合ドメインが感受性細胞の表面の 特異的リセブターに結合する；　（ｉｉ）リセブターに結合している間に、毒素 分子は細胞小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ　ｖｅｓｉｃｌｅ）内にとりこまれる；　 （ｉｉｉ）上記取込み前かあるいは細胞小胞内で、毒素分子はフラグメントＡお よびＢの間のｌｌ内でプロテアーゼによる開裂を受ける；　（ｉｖ）ＪＢＩ胞小 胞のｐＨが６より低くなると毒素は自然にエンドシーム膜に挿入される；（Ｖ） この膜にうめこまれると毒素のトランスロケーションドメインが、細胞質ゾル（ ｃｙｔｏｓｏｌ）中へのフラグメントＡの輸送を助ける：　（ｖｉ）フラグメン トＡの触媒活性（即ち、「エロンゲーションファクター２」と呼ばれる真核生物 蛋白質合成因子の、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−依存性アデノシン ジホスフェート（ＡＤＰ）リボシル化反応）が中毒細胞の死滅をもたらす）。細 胞質ゾル中に運ばれたフラグメントＡの分子一つで、十分に細胞の蛋白質合成機 構を遮断して細胞を殺滅するに十分であることが明らかである。シュードモナス のエンドサイトＡによる、およびおそらく成る種の他の天然存在毒素による細胞 殺滅のメカニズムもこれと非常に似ている。 光咀の櫃！ 概して言えば、本発明はその一つの観点において、ハイブリッド分子であり、こ れは第一部分と第二部分と第三部分が共有結合で連結しており、（ａ）第一部分 は細胞結合リガンドの結合ドメインの部分を含み、該部分は本発明のハイブリッ ド分子を動物の細胞に結合させるものであり：（ｂ）第二部分は蛋白質のトラン スロケーションドメインの部分を含み、該部分は細胞の細胞質膜を横切って第三 部分のトランスロケーションを可能にするものであり、 （Ｃ）第三部分は細胞内に導入されるべき化学成分（これはポリペプチドである ）を含み、但しくｉ）ハイブリッド分子は該ハイブリット分子をコードする組換 えＤＮＡ分子の発現により製造されるものであり、そして（１１）第二部分およ び第三部分は同じ天然存在ポリペプチド毒素のセグメントでは無い（もっとも、 第一および第二部分は同じ毒素、例えばジフテリア毒素またはンユードモナスの エキソトキシンＡ、から由来してもよい）。本明細書中において、「トランスロ ケーション」とは、細胞膜（またはエンドサイト−シス小胞の形成まえに外表面 を形成する成分）表面の外側から化学成分が、該層を通過して細胞内部の原形質 ゾル中へ移動する動きを助長することを意味する。「トランスロケーションドメ イン」とは、蛋白質が細胞膜表面の外側に結合したとき、該蛋白質のある部分を 該層を通して移動させる能力をもつ蛋白質部分を意味する。 本発明はまた、第一部分と第二部分と第三部分とか共有結合で連結したハイブリ ッド分子であって次のようなものにも関する・（ａ）第一部分は細胞結合リガン ド（これはポリペプチドリガンドでもよく、あるいはステロイドホルモンのよう な他のタイプのリガンドでもよい）の結合ドメインの部分を含み、該部分は本発 明のハイブリット分子を動物の細胞に結合させるために有効なものであり。 （ｂ）第二部分は蛋白質のトランスロケーションドメインの部分を含み、該部分 は細胞の細胞質膜を横切って第三部分のトランスロケーションを可能にするもの であり、 （Ｃ）第三部分は細胞内に導入されるべき化学成分（これはポリペプチドであっ てもそうでなくてもよい）を含み、但しくｉ）第一部分および第二部分は同じ天 然存在ポリペプチド毒素のセグメントでは無く、そして（ｉｉ）同様に第二部分 および第三部分は同じ天然存在ポリペプチド毒素のセグメントでは無い。 好ましい態様において、上記いずれの型のハイブリッド分子においても、第二部 分は、天然存在毒素（例えばジフテリア毒素またはシュードモナスのエキソトキ シンＡ）のトランスロケーションドメインの少なくとも一部を含有し、そして前 記リガンドは、ホルモン（例えばポリペプチドホルモン、例えばインシュリン、 インターロイキンＩＩ（ＩＬ２とも呼ばれる）、インターロイキンＩＶ、インタ ーロイキンＶＩまたはＥＧＦ）；モノクローナル抗体の抗体結合性単鎖類縁体； または所望クラスの細胞に結合可能なポリペプチド毒素を含有する。第一、第二 、第三の三つの部分が全てポリペプチドである場合、ハイブリッド分子は好まし くは組換え蛋白質（即ち組換えＤＮＡ技術で生産された蛋白質）である。より好 ましくは、第三部分はモノクローナル抗体の抗原結合性単鎖類縁体である（ここ で抗原は、例えばウィルス蛋白質例えばヒト免疫不全症候群ウィルス（ＨＩ　Ｖ ）プロテアーゼである）か、または酵素（例えばヘキソサミニダーゼＡ（ｈｅ） ｃ。 ｓａｍｉｎｉｄａｓｅ　Ａ）；（！−１．４−グルコシダーゼ；フェニルアラニ ンヒドロキシラーゼ：プロテアーゼ；ヌクレアーゼ：または毒素例えばコレラ毒 素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、シガ菌（Ｓｈｉｇａ）毒素、大腸菌のシガ菌（Ｓｈｉ ｇａ）様毒素、リチン毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ジフテリア毒素またはシ ュードモナスのエキソトキシンＡ）の酵素的に活性な部分であり、そして最も好 ましくは、第三部分は例えば遺伝的欠損のように細胞に欠失している酵素活性を 供給する。酵素がコレラ毒素である場合、得られるハイブリッド分子は標的動物 細胞内でのサイクリックＡＭＰレベルを上昇させるために用いることが可能で、 好ま［、＜はこのように処理される標的細胞はＴ細胞であり、そしてハイブリッ ド分子はＩＬ２の結合ドメインの少なくとも一部を含んでいる。 本発明のハイブリッド分子は、図６に説明されているプラスミドによりコードさ れるコレラ毒素Ａ／ジフテリア毒素Ｂ’／ＩＬ２）Ａイブリッドポリペプチド： 図９に説明されているプラスミドによりコードされるＳｈｉｇａ様毒素Ａ／ジフ テリア毒素Ｂ’／ＩＬ２ハイブリッドポリペプチド、図１２に説明されているプ ラスミドによりコードされるリチンＡ／ジフテリア毒素Ｂ’　／Ｉ　Ｌ２／λイ ブリッドポリペプチド；図１４に説明されているプラスミドによりコードされる フェニルアラニンヒドロキシラーゼ／ジフテリア毒素フラグメントＢハイブリッ ドポリペプチド；後述のように製造されるＨＩＶペプチダーゼ結合蛋白質（ＨＩ ＶＰ−ＢＰ）／ジフテリア毒素Ｂ’／ＩＬ２ハイブリッドポリペブチＥ；および Ｓｈｉｇａ様毒素Ａ／ＩＬ２ハイブリッド（酵素活性およびトランスロケーショ ン機能の双方共該ハイブリッドのｓｈｉｇａ様毒素Ａ部分により提供され、そし てプロテアーゼに感受性のジスルフィドループを含んでいる）を包含する。さら に、上記全てのハイブリッドポリペプチドの生物学的に活性な変異類縁体を包含 する。 本明細書における「生物学的に活性な変異類縁体」とは、類似する上記の７）イ ブリッドポリペプチドと同じ型の細胞結合特異性を持ち、そして同じ型の生物学 的活性（例えば、特定の酵素活性または抗原結合活性）を持つが、１またはそれ 以上のアミノ酸残基のセグメントの１またはそれ以上の削除および／または１ま たはそれ以上の置換によって、上記列記したハイブリッドポリペプチドとは異な るポＩＪ”／（ブチドを意味する。好ましくは、生物学的活性変異類縁体のアミ ノ酸配列は、それが類似するハイブリッドポリペプチドに対して、少なくとも７ ０％（より好ましくは８０％そして最も好ましくは９０％）のホモロジ−（即ち 、アミノ酸配列の同一性）を有し、そして該類縁体はそれが類似するハイブリッ ドポリペプチドが有する生物学的活性の少なくとも５０％（より好ましくは少な くとも７５％）の活性を有する。 さらにまた、本発明は、上記ハイブリッドポリペプチド分子の任意の物（生物学 的活性変異類縁体も含めて）をコードする組換えＤＮＡ分子、そのような組換え ＤＮＡ分子を含むベクター、そのようなベクターまたは組換えＤＮＡを含む細胞 （および好ましくは該膜換えＤＮＡ分子を発現する能力を有し、該分子によりコ ードされるハイブリッドポリペプチドを生産することができる細胞）、および該 ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を含む細胞（形質転換細胞）に組換 えＤＮＡ分子を発現させて、本発明のハイブリッドポリペプチド分子を生産する 方法も包含する。 他の好ましい態様において、第三部分は、検出可能な標識、より好ましくは螢光 成分、放射性成分、または高電子密度成分をも含んでいる。 本発明はさらに、検出可能標識を含む第三部分を有するハイブリッド分子を細胞 に接触させることよりなる、−クラスの細胞の標識方法も含む。 本発明はさらにまた、（１）特定の酵素欠損を有する動物に、該酵素を含む有効 量のハイブリッド分子を投与することによる、動物の治療方法；および（２）第 三部分としてＨＩＶプロテアーゼに対するモノクローナル抗体のＨＩＶプロテア ーゼ結合性単鎖類縁体を有するハイブリッド分子の有効量を患者に投与すること よりなる、ＨＩＶ感染したヒト患者の治療方法にも関する。 ある種の型のポリペプチド毒素は三つの独立した機能領域（標的細胞表面の特定 のりセブターに分子を結合させる第一領域、酵素学的に活性な領域が細胞の細胞 質ゾル内へ侵入することを助ける第二領域、および毒素分子の毒性を特徴づける 酵素活性を発揮する第三の領域）を有するという観察に基づいて、本発明はこれ らの領域のいずれをも他の起源の機能的に匹敵する領域で置換しうる三部分ハイ ブリッド分子を包含する。即ち、第一の機能領域は、選択されたクラスの細胞へ ハイブリッド分子を結合させる特定の結合部分、例えばＩＬ２（高親和性ＩＬ２ リセプターを持つＴ細胞に結合する）、またはαメラノサイト刺激ホルモン（α ＭＳＨ，これはメラノサイトに結合する）に置換することが可能であり、あるい はコレラ毒素およびジフテリア毒素の結合ドメインに特徴的な、広範な細胞タイ プに結合する部分に置換することが可能であり；第二部分は、トランスロケーシ ョンドメインが見出され得る任意のタイプのポリペプチドから採用することが可 能であろうが、但し、殆どの場合はジフテリア毒素およびシュードモナスエキソ トキシン八と同様の方法でトランスロケーションを行う毒素分子のものからであ ろう。第三の部分は、細胞内へ挿入しようと欲し、トランスロケーションドメイ ンにより形成される膜中のチャンネルに適合する任意のタイプの部分であってよ く：例えば、Ｓｈｉｇａ毒素のような細胞殺滅酵素；フェニルアラニンヒドロキ シラーゼ（フェニルケトン尿症で欠失している酵素）のような代謝酵素；標的細 胞内に存在する抗原に対するモノクローナル抗体の抗原結合性単鎖類朦体；また は螢光標識であってよい。ハイブリッド分子の酵素学的活性領域と残りの領域と の間のプロテアーゼ感受性ループ（例えばジフテリア毒素の１１）は、ハイブリ ッド分子の機能において重要な役割を担っているようである。 医学界では多くの病気の分子レベルでの理解を急速に拡大しているとはいえ、こ の理解を特に病気の合理的治療方法へと応用する努力にとって悩ましい一つの課 題が存在する：その課題とは、いかにして適当な治療を障害された細胞に施して 、該細胞を正常に機能させて病気から治癒または回復させるかである。そのよう な方法を提供することにより、本発明は実質的に無限の応用性を有するであろう ・障害された細胞に対し失われた機能を供給する酵素を輸送して遺伝学的欠損症 を治療することから、特定の酵素または微量の前駆体もしくは補助因子の細胞内 レベルを補強すること、特定の細胞（例えば脂肪細胞、癌細胞またはウィルス感 染細胞）を殺傷するために毒素または他の毒物を向けること、ウィルス蛋白質に 対する抗体を適切な細胞に導入することによりＨＩＶ（これはＡＩＤＳの原因で ある）のようなウィルス感染に対処することまで。本発明はまた、検出可能標識 のような他の非治療物質を入手する方法も提供する。トランスロケーション機構 の使用は、標的細胞内に興味対象の物質が高量に取り込まれるため、ハイブリッ ド分子が比較的低量でも有効であることを保証する。 本発明のハイブリッド分子の三つの部分がポリペプチドであるかぎり、これらは 単一ハイブリッド組換え蛋白質として製造することができ、再現性、信頼性およ びいかなる医薬製品においても望ましい組成の厳密な管理を可能にする。 本発明の他の態様および利点は以下の好ましい態様に関する説明および請求の範 囲から明らかになろう。 旺棗旦胚聾掻Ω脱■ ４、

【図面の簡単な説明】

図面 図１はジフテリア毒素分子の模式図である。 図２はコリネファージ（ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ）βｔＯＸの３．９ｋｂ　Ｂａ ｍＨ１制限フラ制限フラグメントチリアのｔｏｘ遺伝子の位置および向きを示す 制限地図である。 図３はジフテリア毒素遺伝子および隣接領域を示す図であり、コードされる蛋白 質は上方に示されており、Ｂ′領領域印をつけた５ａｕ３Ａ１−２と５ｐｈｒ部 位との間の領域である。 図４はジフテリア毒素のフラグメントＢ°をコードするプラスミドの構築に用い た方法を示す模式１程図である。 図５は腸炎コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）毒素遺伝子のヌクレオチ ド配列を示し、下側に示すアミノ酸はコドンに対応している。 図６はコレラ毒素へ〇−ジフテリア毒素Ｂ’　−ＩＬ２ハイブリッドをコードす るプラスミドを構築するために用いたクローニング方法の模式１程図である。 図７はプラスミドｐＰＡ１２３の構築に用いたクローニング方法の模式１程図で ある。 図８はＥ、ｃｏｌｉバクテリオファージＨ１９Ｂ　Ｓｈｉｇａ様毒素遺伝子のヌ クレオチド配列を示し、下側に示すアミノ酸はコドンに対応している。 図９はＳｈ　ｉ　ｇａ様毒素Ａ−ジフテリア毒素Ｂ’−ＩＬ２ハイブリッドをコ ードするプラスミドの構築のために提唱されるクローニング方法の模式１程図で ある。 図１０はＳｈ　ｉ　ｇａ様毒素Ａ−ジフテリア毒素Ｂ’　−■Ｌ２ハイブリッド をコードするプラスミドの構築のためのクローニング方法の別法の模式１程図で ある図１１はＲｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓのリチン遺伝子のヌクレオチド 配列を示し、上側に示すアミノ酸はコドンに対応している。この図はＨａｌｌｉ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８０１９−８０３ ３．１９８５）から採用した。 図１２はりチンＡ−ジフテリア毒素Ｂ’　−ＩＬ２ハイブリッドをコードするプ ラスミドの構築のために提唱されるクローニング方法の模式１程図である。 図１３はヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼのｃＤＮＡのヌクレオチド配列 を示し、下側に示すアミノ酸はコドンに対応している。 図１４はフェニルアラニンヒドロキシラーゼ−ジフテリア毒素Ｂ／％イブリッド をコードするプラスミドの構築のために提唱されるクローニング方法の模式１程 図である。 璽遣 本発明のハイブリッド分子の一態様は三部分ハイブリッド蛋白質であり、これは つぎの成分を含む：（１）細胞結合ドメイン；（２）トランスロケーションドメ イン、例えばジフテリア毒素からのもの：および（３）細胞内へ導入すべきポリ ペプチド、このポリペプチドはトランスロケーションドメイン配列のものと同じ 天然存在蛋白質に由来するものではない。細胞結合ドメインは一般結合性のもの （即ち、天然に存在するジフテリア毒素の細胞結合ドメインのように、広範な細 胞タイプにハイブリッド分子を結合させる能力を有するもの）であってもよく、 あるいは一つまたは少数のタイプの細胞に特異的なものであってもよい。このハ イブリツドの第三部分はトランスロケーションドメインに共有結合しており、該 トランスロケーションドメインは、該ハイブリッドの細胞結合部分が結合した細 胞の膜内に又は該層を横切って、該第三部分を運搬することができるようになっ ている。この第三部分は、例えば酵素活性ポリペプチド、モノクローナル抗体の 抗原結合部分、または螢光色素のような検出可能標識であってよい。しかしなが ら、第三部分はトランスロケーションドメインが由来するものと同じ天然存在分 子のフラグメントであることはできない。 トランスロケーションドメインをもつことが知られている天然存在蛋白質には、 ジフテリア毒素およびシュウトモナスのエキソトキシンＡが含まれ、さらに他の 毒素および非毒素分子も含まれうる。ジフテリア毒素およびシュウトモナスのエ キソトキシンＡのトランスロケーションドメインは、十分に究明されており（例 えば、Ｈｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、８２：１６９２−１６９６，１９８５；Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１：３０３０−３０３５，１９８６；およ びＤｅｌｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　１６０：８２−８６．１９８３を 参照）、および他の分子のそのようなドメインの存在及び存在場所は、Ｈｗａｎ ｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４８：１２９−１３６，１９８７；およびＧｒａ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１：２ ６４５−２６４９．１９８４によって採用された方法で決定することができる図 ３で「フラグメントＢ」と記されているジフテリア毒素のセグメントは、トラン スロケーションドメインおよび天然存在分子の一般性細胞結合ドメインの双方を 含んでいる。フラグメントＢを短縮してＢ″と記されているセグメントにすると 、ジフテリア毒素分子のトランスロケーション機能を維持したままでジフテリア 毒素の細胞結合機能を効果的に除去できる。５ｐｈＩ制限部位でまたはその下流 で終了する配列によりコードされるフラグメントＢの部分をトランスロケーショ ンドメインとして用いることも可能である１しかしながら、該ハイブリッド分子 がジフテリア毒素のもの以外の細胞結合領域を含むと、５ｐｈｒ部位から下流の フラグメン５８部分を含んでよいのは、該部分が機能的ジフテリア毒素リセブタ ー結合ドメインを与えるのに十分なジフテリア毒素リセブター結合ドメイン部分 をコードする配列を含まない場合に限られる。 ポリペプチドリガンドにより与えられるハイブリッド蛋白質の部分は、完全リガ ンドからなることも可能であり、該リガンドの完全結合ドメインを含むリガンド 部分でもよく、あるいは結合ドメインの有効部分であることも可能である。使用 されるリガンドが大きい場合は、該リガンドの非結合部分は出来るだけ少なく含 んで、分子内の結合ドメインがトランスロケーションドメインに近い位置に存在 することが好ましい。リガンド分子の結合ドメインの全部又は大部分を含むこと も好ましい。 本発明のハイブリッド分子の部分は、ハイブリッド蛋白質をコードする所望の融 合遺伝子を形成させ、そして次に該融合遺伝子を発現させることを含む、組換え ＤＮＡ技術を用いて慣用法で製造することができる。ハイブリッド分子の各部分 の一つまたはそれ以上がポリペプチドでない場合に限り、化学架橋法が使用され る。 ＤＮＡクローニング、細胞の形質転換およびプラスミドの単離のための標準的方 法（例えば「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ）」　〔コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＮＹ、１９８２］に記載されて いる〕、およびオリゴデオキシヌクレオチド調製の標準的方法を使用して、以下 の構築物を作製することが可能である。 叉施伍士 ジフテリア　、Ｂ′をコード　る　−フラグメントと　々のリガンドの　】台　 をコード　る配置との融ム・生じたハイブリッドポリペプチドの　−および思慮 図２および３を参照すると、コリネファージ　βｔｏｘｌの３．　９ｋｂのＢａ ｍＨＩ制限フラ制限フラグメントチリアｔＯＸオペロンの存在場所および方向は 、ｔ。 Ｘオペ０ンか所望の位置で開裂し、そして該オペロンの所望部分か選択されたポ リペプチドリガンドの遺伝子の所望部分へ融合することを可能にする。 本発明の遺伝子融合体は次のようにして作製できる。先ず、フラグメントＢ。 の大部分をコードするＮｓ　１Ｉ−Ｓｐｈ＋フラグメント（図３）をプラスミド ｐＡＢＭ５０８　（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａ ｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：８２５８−８２６２．１９８６）のｔｏｘ遺伝子から単 離する。次のリンカ−を５’　（Ｎｓｉｌ）末端に連結する二５’　ＣＡＴＧＴ ＣＡＧＴＡＧＧＴＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＣＡ　３’３　’　ＡＧＴ　Ｃ ＡＴ　ＣＣＡ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＡＡＣＡＧＴ　５゜コード対象　ｆｍｅｔ−Ｓ ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ！／２　１／ ２ Ｎｃｏｌ　Ｎ５ｉｌ そして次のリンカ−を３’　（ｓｐｈｉ）末端に連結する５°　ＣＡＴ　ＧＡＡ 　３゜ ３°　Ｇ　ＴＡＣＧＴＡ　ＣＴＴ　ＴＣＧ　Ａ　５’Ｓｐｈｌ　ＨｉｎｄＩ１１ 次に、得られたフラグメントを、ＮｃｏｌとＨｉｎｄｌｌ＋で消化したｐＫＫ２ ３３−２　（ファルマシア、ビス力夕ウエイ、ＮＪ）にクローニングする。 この変更によってフラグメントＢ°の発現がＥ、ｃｏｌｉ中でｔｒｃプロモータ ー（Ｐｔ、、）から開始されることが可能となる。Ｓｐｈｌ部位はペプチドリガ ンドの結合ドメインをコードする遺伝子配列との、読み枠を一致させた融合を可 能にする。 一股に、操作はクローニングベクター、例えばファージまたはプラスミドを用い て行われる。ポリペプチドリガンドの結合ドメインをコードする遺伝子材料は、 天然源からクローニングされたＤＮＡであってもよく、または合成オリゴヌクレ オチド配列であってもよい。一般に融合遺伝子はクローニングベクター、例えば プラスミドまたはファージ上に存在し、これを培養バクテリア、酵母または組織 培養宿主細胞に形質転換するために用いる。次にハイブリッド蛋白質を細胞がら 慣用技術を用いて収穫する。本発明のハイブリッド蛋白質の精製は、用いられる ポリペプチドリガンドとは無関係に、ジフテリア毒素フラグメントＢに対するモ ノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで行うことが可能 である。 精製された本発明のハイブリッド蛋白質は、検出可能標識を特定の細胞に運ぶた めの輸送システムとして用いることが可能である。このハイブリッド蛋白質分子 に付する標識は、診断用標識に用いられる任意の慣用の原子または分子であり得 、例えば１２５Ｉ−化合物、テクネチウムアイソトープのような放射性標識、Ｎ ＭＲリポータ−基および螢光色素である。最も好ましい標識は、以下により詳細 に説明するように標的細胞の細胞質膜に取り込まれる、螢光標識のような疎水性 標識である（最も一般的螢光色素は、たまたま疎水性である）。慣用の標識技術 により、標識をハイブリッド蛋白質に付着させることが可能である。用いられる 標識の量は１、ノゾブリッド蛋白質分子の結合性または細胞透過機能を損なわな い量（例えば、蛋白質分子力たり、標識分子１または２個）である。 本発明の標識ハイブリッド蛋白質は、診断のために所望クラス（ハイブリッド分 子に結合ドメインを提供する特異的ポリペプチドリガンドによって決定されるク ラス）の標的細胞を標識するために用いることが可能である。ポリペプチドのり ガント部分の特異的結合ドメインは、それらの細胞に選択的に結合し、次いで標 識分子がリセブター介在エンドサイトーンスによって細胞に取り込まれ、そして 標識は次に標的細胞の細胞膜および／または細胞質へ配送される。 本発明の標識ハイブリッド蛋白質が細胞に取り込まれる過程は、次のように要約 できる。標識ハイブリッド分蛋白質はりセプター介在エンドサイトーシスによっ て標識細胞の細胞内小胞に取り込まれ：その後、細胞のＡＴＰ依存性プロトンポ ンプの結果として細胞内小胞の膜横断方向のｐＨの相違が確立される。この膜横 断方向のｐＨの相違によって、脂質会合部分および標識を含めてハイブリッド蛋 白質が細胞内小胞の膜面に挿入される。ハイブリッド蛋白質の疎水性は該蛋白質 を膜内に止まらせ、酵素作用による急速な分解から保護する（標識蛋白質か細胞 質内または細胞内小胞の内腔に存在するとすればこのような分解が生じつる）細 胞内小胞の膜の平面に挿入された後、標識ハイブリッド蛋白質は次のように移動 する。細胞内小胞は細胞質膜から芽を出し、細胞の細胞質に入り、そこでライリ ゾームと融合して標識ハイブリッド蛋白質はライリゾームに取り込まれる。 あるいは、細胞内小胞は細胞の細胞質膜へ逆戻りすることもあり得る。いずれの 場合も、標識は標的細胞に捕捉された状態で止まっている。 上記のとおり、標識ハイブリッド蛋白質の主な診断用途は、慣用の細胞染色およ び標識技術を用いた、転移部位のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出で あろう。そのような検出は、例えば転移性メラノーマ細胞の除去術において、ど の程度組織を切除すべきかを知るための情報を外科医に提供することにより、外 科手術において特に有用であろう。 叉施■至 コレラ　、Ａ　−ジフテリア　：Ｂ’　−ＩＬ２’　−７−の　および′　られ たハイブリッド　の コレラ毒素の酵素的に活性なＡ１フラグメントを含むプラスミドｐＣＶＤ２　（ 図５参照）を、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３０６：５ ５１−５５７．１９８３）に記載されているＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ　Ｄ ＮＡライブラリーから調製した。図６にコレラ毒素Ａ１−ジフテリア毒素Ｂ’− ＩＬ２遺伝子の造成に採用した方法のアウトラインを示す。簡単に述べれば、ｐ ＣＶＤ２の単一のＸｂａ１部位を制限酵素Ｘｂａｌで開裂した。直線化したプラ スミドに、各末端にＸｂａ１部位１／２を有する下記の合成リンカ−を連結して 、Ｘｂａｒ部位の上流にＮｃｏ１部位を導入した・５’　ＣＴＡＧ　ＡＣＣＡＴ Ｇ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＣＧＧ　ＧＣ Ａ　ＧＡＴ　Ｔ３°　ＴＧＧ　ＴＡＣＣＣＴ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＴＴＣ ＡＡＴ　ＡＴＡ　ＧＣＣＣＧＴ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＴＣペプチド°　ｆｍｅ　ｔ −Ｇ　１ｙ　−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａ ｌａ−Ａｓｐ−Ｓｓｒ−Ａｒｇ適当な構築物を制限部位のマツピングおよび配列 決定により選択し、ＮｃｏｌおよびＣＩａ、Ｉで消化して、Ｎｃ　ｏｌ　−Ｃｌ 　ａ＋フラグメントを作製した。これを５ｃｒＦ１で消化した。得られたＮｃｏ ｌ−８ｃｒＦｒフラグメントの３°末端を次の合成リンカ−に連結した ５°−Ｇ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＣＣ−３’３°−ＣＣＡＡＧＴＣ−５’ ペプチド　Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。 ＳｃｒＦＩ　Ａｐａｌ 生じたＮｃｏｌ　−Ａｐａｌルミｌフラグメントドされるポリペプチドは天然の コレラ毒素シグナル配列を欠失し、そのかわりにｆｍ、ｅｔ−Ｇｌｙを有し、そ の後ろにコレラ毒素の成熟Ａ１領域、さらにＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを 有していた。この構築物はヒトインターロイキン−２遺伝子に融合したジフテリ ア毒素フラグメントＢ′をコードするプラスミドにクローニング可能である（プ ラスミドｐＰＡ１２３．図４）。プラスミドｐＰＡ１２３は、図７に概略したよ うにして、ｐＤＷ１２４　（Ｄｉ　ａｎｅ　Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｊａｍｓの博士論文 、ボストンユニバーシティ・スクールオンメディスン、ボストン、ＭＡ、０２１ １８．’１９８９）から構築した。プラスミドｐＤＷ１２４は、Ｅ、ｃｏｌｉ中 でｔｒｃプロモーターから発現される、ジフテリア毒素フラグメントＡ−フラグ メントＢ’−ＩＬ２融合蛋白質をコードする。フラグメントＡをコードする配列 は制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＮｓ　Ｈによる消化で削除された。次 のオリゴヌクレオチドを用いてフラグメントＡ／Ｂジスルフィドループ（１□） 配列を再構築し、該ループの５°末端にＡｐａ１部位を導入し、そして翻訳開始 ＡＴＧコドンをコードするＮｃｏ１部位を再度構築した：５’　−ＣＡＴＧ　Ｇ ＧＧ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＣＣＣＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＣＧ Ｔ　ＧＴＣ−３’　−ＣＣＡＧＴ　ＣＴＡ　ＣＣＣＧＧＧ　ＡＣＡ　ＣＧＴ　Ｃ ＣＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ−ペプチド：　ｆｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ４ａｌ −Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ｉａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−−ＡＧＧ 　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　ＡＧＣＴＣＡ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＣＡ 　−３゜−ＴＣＣＧＣＴ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＡＡＣＡ ＧＴ　−５’−Ａｒｇ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌ ｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ上記プラスミドｐＰＡ１２３は、上記オリゴヌクレオチド フラグメントを、Ｎｃｏｒ　−Ｎｓ　ｉ＋消化したｐＤＷ１２４ベクターフラグ メントに連結して得られた。このプラスミドｐＰＡ１２３は、図６に示すように 、コレラ毒素フラグメントＡ１をコードする配列をジフテリア毒素Ｂ’　−ＩＬ ２に融合させるために用いることができる。プラスミドｐＰＡ１２３を制限酵素 ＮｃｏｒおよびＡｐａｒで消化し、得られたベクターフラグメントを上記の修飾 したコレラ毒素フラグメントＡ１に連結し、コレラ毒素Ａ、−ジフテリア毒素Ｂ ’−ＩＬ２ハイブリッド（ＣＴＡ／ＤＴＢ’　／Ｉ　Ｌ２ハイブリッド）をコー ドするプラスミドを得る。このハイブリッドはプラスミドのｔｒｃプロモーター から発現される。 Ｅ、ｃｏｌｉ中での組換え遺伝子の発現に続いて、ＣＴＡ／ＤＴＢ’　／Ｉ　Ｌ ２ハイブリッド蛋白質を単離し、適当な治療方法に用いることができる：例えば ジフテリア毒素−ＩＬ２ハイブリッドによる治療の補助とすることかできる。ジ フテリア毒素−ＩＬ２ハイブリッドは、ジフテリア毒素の細胞殺滅能力を効果的 にＩＬ２リセブター含有細胞、例えばある種の白血病Ｔ細胞に向かわせる。しか しながら、ジフテリア毒素−ＩＬ２ハイブリッドの医薬としての効果は、循環血 液中の内因性ＩＬ２（活性化Ｔ細胞により天然に合成され、Ｔ細胞上のｒＬ２リ セブターをジフテリア毒素−ＩＬ２ハイブリッドと奪いあう）により希釈されて しまう。最初に標的細胞をＣＴＡ／ＤＴＢ’　／ＩＬ２ハイブリッドに暴露する ことにより、コレラ毒素の生物学的活性を利用してこの問題を軽減できる。天然 コレラ毒素のＡエサブユニットは、アデニレートサイクラーゼ複合体のＧＴＰ− 結合性調節成分のＡＤＰ−リボシレーンヨンを酵素触媒し、作用された細胞内の サイクリックＡＭＰの蓄積を生じ、そのため細胞を殺滅することなく細胞機能の 多くを破壊する。コレラ毒素Ａ□活性をＩＬ２リセブターを有する細胞に特異的 に作用させると、これらの細胞内でのｒＬ２の合成を一時的に阻害するであろう 。こうして、Ｔ細胞表面のｒＬ２リセプターの発現を阻害することなく、そして 非標的細胞に傷害を与えることなく、ＩＬ２リセブターをジフテリア毒素−ＩＬ ２と奪いあう循環ＩＬ２の量を減少させることができる。その後にジフテリア毒 素−ＩＬ２による治療を行うと、ＣＴＡ／ＤＴＢ’　／ＩＬ２ハイブリッドを用 いない場合よりも、Ｔ細胞の殺滅をより効果的に行うことができる。 叉鳳泗１ Ｓｈｉａ−、Ａ−ジフテリア　：Ｂ’　−ｒＬ２ｉ　−の　および′られたハイ ブリッド　の　。 Ｓｈ　ｉ　ｇａ一様毒素のＡサブユニット（ＳＬＴ−Ａ）のＤＮＡ配列および対 応アミノ酸配列は図８に示されている。５ＬＴ−Ａを生産するＥ、ｃｏｌｉ株か らのバタテリオファージＨ１９Ｂは、Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、の記 載（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：４３６４−４３ ６８．１９８７）に従って調製し、ＴａｑｌおよびＸｍｎ１で消化する。Ｓ　Ｌ Ｔ−Ａのコード配列（ｓｌｔＡ遺伝子）の大部分に相当するＴａｑｌ−ＸｍｎＩ フラグメント（約６５０ｂｐ）を単離しく図９）１次いでこのフラグメントの５ ’　（Ｔａｑｌ）末端に下記のオリゴヌクレオチドを連結する・５−ＣＡＴＧ　 ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＡ　ＧＡＣＴＴＣＴ　−３゜３° −ＣＣＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＣ− ５’ペプチド　ｆｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒこのオリゴヌクレオチド配列は、ｆｍｅｔ−Ｇｌｙコー ド配列を提供し、それに続いて成熟５ＬＴ−Ａサブユニットの最初の８個のアミ ノ酸をコードする配列が存在して、遺伝子をＴａｑｌ消化した間に開裂して消滅 した天然遺伝子の当該セクション（毒素シグナルペプチドおよび成熟５ＬＴ−Ａ サブユニットの同じ８個のアミノ酸をコードする）を置換している。さらに当該 オリゴヌクレオチドリンカーは構築物のＳ°末端に１／２Ｎｃｏ１部位を提供し て、当該ハイブリッドプラスミドがｔｒｃプロモーターから発現できるようにし ている。 下記のオリゴヌクレオチド配列は、５ＬＴ−Ａサブユニットのカルボキシ末端の コード領域（ＸｍｎＩ消化で開裂消滅したもの）を最初のＣｙｓコドンまで、再 生しそしてＡｐａｒ制限部位を導入するために、５ｌｔＡ遺伝子フラグメントの ３’　（Ｘｒｎｎｌ　）末端に連結する：５′〜　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　Ｇ ＧＡ　ＡＧＣＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＣＴＧ−３’　−ＴＡＡ　ＡＧ Ａ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＡＡ　ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＴＡＡ　ＧＡＣ−ペプ チド：　ｌ１ｅ−９ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ− １１ｅ−Ｌｅｕ−ｍｎ１ −ＧＧＡ　ＡＧＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　 ＣＣ−３’−ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＣＡＣＣＧＴ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＣＴＴＡ　 Ｃ−５’−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −Ｇｌｙ−Ｐｒ。 １／２　Ａｐａｌ このＮｃｏｌ　−Ａｐａｌ　ｓ　ｌ　ｔＡ遺伝子配列は、ＮｃｏｒとＡｐａｌで 消化したプラスミドｐＰＡ１２３　Ｃ図７）に連結して、５ＬＴＡ−ジフテリア 毒素Ｂ’　−ＩＬ２　（ＳＬＴＡ／ＤＴＢ’　／ＩＬ２ハイブリッド）遺伝子を 得、これを該プラスミドのｔｒｃプロモーターからＥ、ｃｏｌｉ内で発現させる ことが可能である（図９参照）。 Ｓｈ　ｉ　ｇａ様毒素Ａ−ジフテリア毒素Ｂ’−ＩＬ２ハイブリッドをコードす るプラスミドの構築の別のクローニング法か図１０に説明されている。 精製された５ＬＴＡ／ＤＴＢ’　／ＩＬ２ハイブリッド蛋白質は、ある種のＴ細 胞リンホーマおよび臓器移植拒絶反応のような、ＩＬ２リセブターを有する細胞 の過剰生産を含む症状の治療剤として有用であろう。このハイブリッド分子のＩ Ｌ２部分はジフテリア毒素−ＩＬ２の場合と同様に、ハイブリッド分子を特異的 にＩＬ２リセブター含有細胞に付着させ、ハイブリッド分子の酵素部分が標的細 胞内に挿入出来るようにし；次いで両タイプのハイブリッド毒素は細胞内の蛋白 質合成機構に作用して蛋白質合成を遮断し、こうして細胞を殺滅する。これら二 つのタイプのバイブ１ルソド毒素の相違は、それらの酵素活性の性質であるニジ フチリア毒素−ＩＬ２ハイブリッドの酵素部分は、エロンゲーションファクター ２のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドによるＡＤＰ−リボシル化を触媒し て、この蛋白質合成に必要な因子を不活化するが、これに対して５ＬＴＡ／ＤＴ Ｂ’／ＩＬ２ハイブリツドの酵素部分は、リポソームＲＮＡを必須部位で開裂す る能力を持つリボヌクレアーゼであり、こうしてリポソームを不活化する。従っ て、５ＬＴＡ／ＤＴＢ’　／ＩＬ２ハイブリッドは、ジフテリア毒素−ＩＬ２ハ イブリッドと同じ症状の治療に有用であり、そして例えば、増殖中のＴｗｉ胞が 後者のハイブリッド毒素に対する抵抗性を獲得したような場合に、代替治療剤と なりつる。 大施伍エ リチンＡ−ジフテリア　：Ｂ’−ＩＬ２　−　の　および′れらたハイブリッ上 蛋亘質Ω思慮 キャスタービーン（ｃａｓｔｏｒ　ｂｅａｎ：Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉ ｓ）ＤＮＡのゲノムクローンバンクを、Ｈａｌｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１３：８０１９−８０３３．１９８５の記載に従って 調製し、リチン遺伝子の約７８０ｂｐのＢａｎ１フラグメント（リチンＡドメイ ンの大部分（酵素活性ドメイン）およびリチンＡとＢのリンカ−ペプチド部分に 相当する）を単離する（図１１参照）。このフラグメントの両端に下記の合成オ リゴヌクレオチドを連結し、示したＤＮＡの下側の鎖のみをリン酸化する＝５’ 　−ＣＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＴＴＣＣＣＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＴＡＣＣＣＡ　 ＡＴＴ−３’−ＣＧＡ　丁ＡＴ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　７７丁　０７丁　ＡＴＧ　Ｇ ＧＴ　ＴＡＡ−ペプチド：　ｆｍｅｔ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙ ｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−ＮｃｏＩ −ＡＴＡ　ＡＡＣＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＡ　ＧＣＧ　Ｇ　−３゜−ＴＡＴ　ＴＴＧ 　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＧ　−５゜−Ｉｉｇ−Ａｓｎ−Ｐ ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａａｎｌ 連結したフラグメント（図１１に説明されている）をＦｓｐＩで部分消化し、そ して５゛末端にＮｃｏｌ　−Ｂａｎｌリンカ−を有するＢａｎ１−ＦｓｐＩリチ ンリチ伝子フラグメントに対応する約”ｉ’５ｏｂｐのバンドを単離する（図１ １参照）。Ｎｃｏｌ−Ｂａｎｌリンカ−は、成熟リチンＡのＮ末端アミノ酸コド ン（Ｂａｎｌ消化中にフラグメントから消失したもの）ならびに天然リチンＡの シグナルペプチドの代わりになるｆｍｅｔ−Ａを付与する。 このフラグメントの３’　（Ｆｓｐｌ）プラント末端に、下記のオリゴヌクレオ チドを連結し、示されている上側の鎖のみリン酸化する・５’　−ＧＣＡ　ＣＣ Ｔ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＧ　丁ＣＡ　ＣＡＧ　丁丁丁　ＧＧＧ　ＣＣ−３’３ ’　−ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＡＧＣＡＧＴ　ＧＴＣＡＡＡ　Ｃ−５ ’ペプチド：　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｐ ｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。 Ｆｓｐｌ　Ａｐａｌ このリンカ−は、ＦｓｐＩ消化の間にリチンＡフラグメントの３゛末端から消失 したりチンＡコード配列、ならびにプラスミドｐＰＡ１２３への融合のための１ ／２ＡｐａＩ部位を付与する。 この完成した構築物を、次にＮｃｏｌ／Ａｐａ＋消化したｐＰＡ１２３にクロー ニングして、リチンＡ−ジフテリア毒素Ｂ’　−ＩＬ２遺伝子を得る；これはＥ 、ｃｏｌｉ中で該プラスミド上のｔｒｃプロモーターから発現できる（図１２参 照）。 精製したりチンＡ−ジフテリア毒素Ｂ’−ＩＬ２ハイブリッドは、実施例３のＳ Ｌ’ＦＡ／ＤＴＢ”／ＩＬ２ハイブリッドと同様に、ＩＬ２リセブターを有する 細胞のリポソームを不活性化し、標的細胞の蛋白質合成の停止と死滅をもたらす 。このりチンＡハイブリッドは、こうして実施例３に記載した５ＬＴＡ／ＤＴＢ ’／ＩＬ２ハイブリツドと同じ用途を有する。 叉施員旦 フェニルアラニンヒドロキシラーゼ−ジフテリア　、Ｂ゛　−の　および″られ たハイブリッド　の　′ ヒト肝＠ｃＤＮＡライブラリーから、Ｋｗｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、２４：５６−５６１．１９８５の記載に従って、フェニルアラニンヒドロキシ ラーゼ（ＰＨ）ｃＤＮＡをスクリーニングする。ＰＨ蛋白質の大部分をコードす る約１１６０ｂｐのＥ　ｃ　ｏＲＴＩ−Ａ　ｆ　ｌ　ＩＩフラグメントを単離す る（図１３および１４参照）。この５°ＥｃｏＲＨ末端に下記のリンカ−を連結 して、５゛コ一ド配列の再生およびＮｃｏ１部位の導入を行う：５’−ＣＡＴＧ ＴＣＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣ−３’３“−ＡＧＧ　ＴＧＡ　Ｃ ＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＣＣ−５゜ｆｍｅｔ−３ｅｒ−Ｔ ｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ３°Ａｆｌ１ １末端に下記のリンカ−を連結して、ＰＨコード配列を完成させ且つジフテリア 毒素フラグメントＢ配列に融合させるために正しく読み枠を一致させてＡｐａＩ 制限部位を導入する（図１４）：５’　−ｎ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＧＣＴ 　ＧＡＴ　ＴＣＣＡＴＴ　ＡＡＣＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＧＡ−３”−ＣＴ ＡＡ　ＡＡＣＣＧＡ　ＣＴＡ　ＡＧに　ＴＡＡ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＴＡ Ａ　ＣＣＴ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ　−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ −Ａ　５ｎ−３ｅｒ−Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ｇ　１ｙ−ｆｌｌＴ −Ａ丁ＣＣＴ丁　ＴＧＣＡＧＴ　ＧＣＣＣＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＡＡＧ 　ＧＧＧ　ＣＣ−３’−ＴＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　Ｇ ＴＣＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＣＣ−５゜−Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−５ｅｒ− Ａ　１　ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ　−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒ。 ＡｐａＩ 次にこのフラグメントをＮｃｏｌ−Ａｐａｌ消化したｐＰＡ１２３ベクター（図 １４）に連結して、フェニルアラニンヒドロキシラーゼがジフテリア毒素Ｂ。 −ＩＬ２に融合したものをコードするプラスミドを得る。最後にこのプラスミド をＥｃｏＲＩおよび５ｐｈｌで消化してｒＬ２コード配列を除去し、ジフテリア 毒素フラグメントＢの３′末端をコードするコリネバクテリオファージβの約２ ３０ｂｐ　５ｐｈｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置き代える（図１４）。この完 成した構築物はＰＨ−ジフテリア毒素Ｂハイブリッド蛋白質をコードし、プラス ミド上のｔｒｃプロモーターから大腸菌中で発現される（図１４参照）。 遺伝病であるフェニルケトン尿症は、フェニルアラニンの代謝不能が過剰のフェ ニルアラニンの蓄積をもたらし患者の脳に障害を与えると考えられるが、酵素Ｐ Ｈの遺伝的欠損が原因とされている。活性ＰＨ酵素がジフテリア毒素フラグメン トＢの細胞結合ドメインおよびトランスロケーションドメインに結合した分子を 構築すれば、天然のジフテリア毒素が通常攻撃する広範な細胞を標的としてこの 酵素を取り込ませ、フェニルケトン尿症のような欠損症で要求される全身療法を 達成することが可能である。このクローニング方法は他の遺伝欠損症の治療に有 用なハイブリッドの構築にも応用可能であろう。 叉施皿旦 ＨＩＶプロテアーゼ　Ａ　−ジフテリア　−Ｂ’　−ＩＬ２ｉ　−の　および′ られたハイブリッド　の リンカ−ペプチドにより抗体の可変軽鎖アミノ酸配列（ＶＬ）が可変重鎮配列（ ＶＷ）に連結してなる新規蛋白質である、モノクローナル抗体の抗原結合性、単 鎖ポリペプチド類縁体を発現する組換え遺伝子を、Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３−４２６．１９８８の記載にしたがって、ＨＩ Ｖプロテアーゼに特異的且つこれを不活性化できるモノクローナル抗体のＶ、４ とＶＬ配列（Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ｅｍｂｏ　Ｊ、７：１７８５−１７ ９１．１９８８）およびＢｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ、により設計されたリンカ−をも とにして構築する。■Ｌ−リンカーーＶＨ遺伝子の両末端を適当な制限酵素およ び合成ｃＤＮＡリンカ−で修飾して、１／２のＮｃｏｒ部位を５′末端に及び１ ／２Ａｐａ１部位を３°末端に有する欠陥のない■５−リンカーー■、遺伝子を 製造する。次にこの遺伝子をＮｃｏＩとＡｐａＩで消化したｐＰＡ１２３にクロ ーニングして、ｔｒｃプロモーターからＨＩＶプロテアーゼ結合蛋白質−ジフテ リア毒素Ｂ’　−Ｉ　Ｌ　２ハイフリツト蛋白質（ＨＩＶＰ−ＢＰ／ＤＴＢ’　 ／ＩＬ２ハイブリッド）を発現するプラスミドを製造する。 大腸菌中での組換え遺伝子の発現に続いて、このＨＩＶＰ−ＢＰ／ＤＴＢ’　／ ＩＬ２ハイブリッド蛋白質を単離し、そしてヒト患者のＨＩＶｉ染の治療に使用 することが可能である。ＨＩＶウィルスはＴ細胞に感染して該細胞中で増殖し、 細胞の蛋白質合成機構を奪ってウィルス自身の蛋白質を多コピー製造する。特に 一つの蛋白質、ＨＩＶプロテアーゼは他のウィルス蛋白質の加工に関して不可欠 の役割を果たしており；このプロテアーゼを感染細胞内で不活性化する方法をつ きとめることは、効果的ＡＩＤＳ治療法の開発の最近の多くの努力の焦点である （例えばＨａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、参照）、ＨＩＶＰ−ＢＰ／ＤＴＢ’　／Ｉ Ｌ２ハイブリッドはウィルスプロテアーゼに特異的なインヒビターをＩＬ２リセ ブターを有する活性化Ｔ細胞に特異的に運び、こうして低用量で他のタイプの細 胞に殆どないし全く毒性を及ぼすことなく効果を発揮することができる。この技 術は他のウィルス感染または遺伝病にも応用可能と考えられる。 他Ω悪掻 他の態様も請求の範囲内である。例えば、標識すべき特定のクラスの細胞に特異 的な結合ドメインを有する任意の細胞特異性ポリペプチドリガンドを用ることが できる。ポリペプチドホルモンはそのような有用なリガンドである。例えば、α またはβ　ＭＳＨの結合ドメインを用いて製造したハイブリッド蛋白質は、メラ ノサイトに特異的に結合することができ、そのためこのハイブリッドを検出可能 な標識で標識すれば、メラノーマの診断並びにｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉ ｔｒｏで転移メラノーマ部位を検出するために有用である。そのようなハイブリ ッドは、検出可能標識の代わりに毒素分子の酵素活性部分を結合させれば、毒素 活性を特異的に標的メラノーマ細胞に運搬するために用いることが可能であろう 。他のリガンドは異なる特異性を付与する　例えば、サブスタンスＰの結合ドメ インは、痛みの伝達に関与するニューロン表面のりセブターを認識し、そのため 、サブスタンスＰを用いて得られる標識ハイブリッドは、サブスタンスＰリヤブ タ−を含む神経系領域の地図作成に用いることができる。使用可能な他の特異結 合性リガンドは、インシュリン、ソマトスタチン、ＥＧＦ、およびインターロイ キン　Ｉ　、ｌｌ５ＩＩＩ　、ＩＶ　およびｖＩである。インターロイキン１１ は特に重要であり、なぜなら、活性化Ｔ細胞をともなうアレルギー反応および自 己免疫疾患例えば全身紅斑性ろうそう（Ｓ　Ｌ　Ｅ）に重要な役目を果たしてい るからである。細胞特異結合ドメインを有する他の有用なポリペプチドリガンド は、ろ胞刺激ホルモン（卵巣細胞に特異的）、黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特 異的）、甲状腺刺激ホルモン（甲状腺細胞に特異的）、バンブレシン（子宮細胞 ならびに膀胱細胞および腸細胞に特異的）、プロラクチン（胸腺細胞に特異的） 、および成長ホルモン（特定の骨細胞に特異的）である。特異的標的を目的とし ない場合は、これらの代わりに、比較的特異性の小さい広範な生体細胞タイプに 結合可能な細胞結合リガンド（ジフテリア毒素またはりチン毒素のようなもの） を用いて、該生体全体に特異的化学成分を導入することもできる。 多くの細胞特異リガンドにおいて、各リガンド内で結合ドメインが存在する領域 は現在知られている。さらに、固相ポリペプチド合成法の最近の進歩は、該リガ ンドの種々のフラグメントを合成して標識すべきクラスの細胞に結合する能力を 調べることにより、当業者が実質的に任意のリガンドについて結合ドメインの決 定をすることを可能にしている。したがって、本発明のハイブリッド分子はリガ ンド全体を含む必要はなく、所望の細胞結合能力を発揮するりガントフラグメン トのみを含んでもよい。同様に、リガンドまたはその細胞結合領域の若干の配列 変異を有する類縁体を合成し、細胞に結合する能力を調べ、そして本発明のハイ ブリッド分子に含めること力呵能である。他の可能なリガンドには、標的細胞膜 の表面に発現されたりセブターまたは他の部分に対する抗体である、モノクロー ナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合性単鎖類縁体が含まれる。 ハイブリッド分子のトランスロケーション機能は、ジフテリア毒素以外の適当な ポリペプチド断片により提供することも可能であるが、ただしジフテリア毒素と 同様の様式またはハイブリッド分子の機能的第三部分を細胞の細胞質内にトラン スロケーションさせる目的を達成する他のいずれかの様式でトランスロケーショ ンを行うことができるものでなければならない（例えばンユードモナスのエキソ トキシンＡ１ボツリヌスの神経毒またはりチン）。 細胞内に挿入されるべき化学成分は広範に変化可能であり、そのようなものも本 発明の範囲内である。例えば、チー病（Ｔａｙ−５ａｃｈｓ　ｄｉｓｅａｓｅ） において遺伝的に欠損する酵素であるヘキソサミニダーゼＡを、チー病による影 響を最も受ける神経細胞に対して特異的な細胞結合ドメインをもつハイブリッド に結合させることが可能であろう。タイプ２の糖原症（ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉ ｓ）患者は、主に筋肉細胞、肝細胞およびリンパ球を標的とするようにインシュ リンに結合したジフテリア毒素のトランスロケーションセグメントに結合したα −１，４−グルコンダーゼからなるハイブリッドにより治療すること力呵能であ ると思われる（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２３： １３０４−１３０６．１９８４）。これらは例示にすぎず、天然酵素またはその 遺伝子が配列決定されている（または過度の実験を要さずに当業者が配列決定可 能なものも含む）あらゆる酵素に関する欠損症は、適当な細胞結合性リガンドに 結合したトランスロケーションドメインに結合した活性酵素からなるハイブリッ ドにより治療できると考えられる。 細胞内のウィルスおよびバクテリア感染も、適当なハイブリッド：例えば、強力 な抗生物質またはウィルスの粒子もしくは蛋白質に特異的に結合する組換えＶ、 −リンカー−Ｖ　Ｈ抗原結合性ポリペプチドを細胞内に配送するノーイブリッド により治療可能であろう。 同様に本発明のハイブリッドは特定の細胞を特異的に破壊するためにも有用であ ろう。細胞殺傷機能は、既に例示したコレラ毒素Ａ□−ハイブリッド、リチンＡ −ハイブリッドおよびＳｈｉｇａ一様毒素Ａ−／’イブリッド以外にも、ＬＴ毒 素、Ｃ３毒素、Ｓｈ　ｉ　ｇａ毒素、百日咳毒素、破傷風毒素およびシュードモ ナスエキソトキシンＡを含めて（但しこれらに限定されない）任意のポリペプチ ド毒素の酵素活性部分により提供すること力呵能である。標的とする細胞は、癌 細胞、ウィルス感染細胞または脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）でありうる。 本発明は、前記ハイブリッドポリペプチドの生物学的に活性な変異類縁体も含む 。遺伝子工学分野の当業者によく知られている方法を使用して、ハイブリッドポ リペプチドをコードしている組換えＤＮＡ配列を操作することにより、組換えＤ ＮＡ配列中の個々の塩基対または複数の塩基対の削除および／または置換を含む 変異のシリーズを先ず造成する。そのような変異配列の各々を次に発現ベクター に挿入し、そして適当な発現系で発現させる。こうして作られた変異類縁体の生 物活性を元のハイブリッド分子（親のポリペプチド）の活性と比較する。用いら れるアッセイは親ポリペプチドの特定の酵素活性および細胞結合特異性により決 定される。例えば、Ｓｈｉｇａ様毒素Ａ／ジフテリア毒素Ｂ′／ＩＬ２　（ＳＬ ＴＡ／ＤＴＢ’　／Ｉ　Ｌ２）ハイブリッド、コレラ毒素ＡＩ／ジフテリア毒素 Ｂ゛／ＩＬ２　（ＣＴＡ／ＤＴＢ’　／Ｉ　Ｌ２）ノｈイブリッド、およびリチ ンＡ／ジフテリア毒素Ｂ’／ＩＬ２ハイブリッドの変異類縁体は、ｒＬ２リセプ ター含有細胞に結合可能な毒素に特異的な細胞毒性アッセイを用いて試験し、各 親ポリペプチドと比較することが可能である。 ヱヱ皇ヱ法 培養されたＨＵＴ１０２／６ＴＧ　（Ｔｓｕｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：９６９４，１９８６）またはＹＴ２ Ｃ２（Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６５： ２２３．１９８７）細胞を、１０％胎児ウシ血清（Ｃｅｌｌｅｃｔ、ギブコ）、 ２ｍＭグルタミン、および各５０１Ｕと５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよびスト レプトマイシンで強化したＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ、グランドアイランド 、　ＮＹ）中で維持する。細胞を完全培地中で、９６ウエルのＶ底プレート（Ｌ 　ｉ　ｎ　ｂ　ｒｏ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マクリーン、ＶＡ ）に、ウェル当たり５Ｘ１０’の濃度でシードする。毒素候補を種々の濃度（１ ０−１２Ｍないし１０−’Ｍ）で添加し、そして培養細胞を３７℃で５％ＣＯ２ 雰囲気下で１８時間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを １７０Ｘｇで５分間遠心し、培地を除去し、１．　Ｏμｃｉ／ｍｌ　［”Ｃ］　 −ｏインン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、ＭＡ）を含 むロインン不含培地（Ｍ　Ｅ　Ｍ、ギブコ）２００μｌに交換する。さらに９０ 分間３７℃においた後、プレートを５分間１７０Ｘｇで遠心し、培地を除去し、 細胞に４Ｍ　ＫＯＨを加えて溶解する。１０％トリクロロ酢酸を加えて蛋白質を 沈澱させ、次にセルフ１−ベスター（Ｓｋａｔｒｏｎ、スターリング、ＶＡ）を 用いて、不溶性物質をグラスフィルター繊維上に集める。フィルターを洗浄し、 乾燥しそして標準的方法でカウントする。培地のみで培養した細胞をコントロー ルとする。 ＩＬ２の代わりにＩＬ４をハイブリッドの細胞結合部分として使用する場合には 、ハイブリッドおよびその変異類縁体の試験は、同様の方法により、ＣＴ４Ｒ細 胞（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ、Ｐａｕｌ、ＮＩＨ）、Ｐ８１５細胞（Ａ、ＴＣＣ）ま たはＣＴＬＬ２　（ＡＴｃＣ）を用いて、ウェル当たりＩ　Ｘ　１０’細胞でシ ードし、４０時間インキュベートして行うことができる。 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　２ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５−Ｊ ＭＥＴＰｒｏＡｒｇＧｌｙＧｌｎＳｓ＋ｒＧｌｎＴｙｒＰｈｅ＾ｓｏＡｒｇＧＩ ｙＴｈｒＧｌｎＭＥＴ＾ｓｎ　ｌ　Ｉ　ｅＡｓｎＬｅｕＴｙ■ Ｓｅｒ　ｌ　ＩｅｓｅｒＬｅｕＡｒｇＳｓｒＡｌａＨｌ　５ＬｅｕＶａＩＧＩｙ ＧＩｎＴｈｒ　Ｉ　１ｅＬｅｕｓｅｒＧｌｙＨ１ｓＳｅｒＴ■■ Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ｌ　ｌ　ｅＴｙｒＶａ　ｌ　ｌ　Ｉ　ｅＡ　ｌ　ａＴｈｒＡ　 ｌ　ａＰｒｏＡｓｎＭＥＴＰｈｅＡｓｎＶａ　ｌＡ＊ｎ＾１垂uａｌＬｅｕＡＩ ａ Ａ　ｌ　ａＴｙｒｓｅｒＰｒｏＨｌ　５ＰｒｏＡｓｐＧ　ｌ　ｕＧ　ｌ　ｎＧ　 ｌ　ｕＶａ　ＩＳ＠ｒＡ　１ａＬｅｕＧ　ｌｙＧ　ｌｙ　ｌ@Ｉ　ｅＰｒｏＴｙ ｒｓｅｒ ＦＩＧ、　５−２ Ｇ　ｌ　ｎ　ｌ　ｌ　ｅＴｙｒＧ　！ｙＴｒｐＴｙｒＡｒｇＶａ　ＩＨｌ　５Ｐ ｈｅＧ　１ｙＶａ　１ＬｅｕＡｓｐＧ　１ｕＧｌ　ｎＬｅｕgｌ　ｓＡｒｇＡｓ ｎ ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＡｒｇＡｓｐＡｒｇＴｙｒＴｙｒＳｅｒＡｓｎＬｅｕＡｓｐ 目ｅＡ　ｌ　ａＰｒｏＡ　ｌ　ａＡ　Ｉ　ａＡｓｏＧ　ｌ　凾sｙｒ Ｇ　１ｙＬｅｕＡ　１ａＧＩ　ｙＰｈｅＰｒｏＰｒｏＧ　ｌｕＨｌ　ｓＡｒｇＡ 　ｌａＴｒｐＡｒｇＧｌｕＧ　１ｕＰｒｏＴｒＤ　Ｉ　ｌｅgｌ　ｓｏｌ　ｓ Ａ　ｌ　ａＰｒｏｐｒｏＧＩＯ＋　ａＡｓｎＡ＋　ａＰｒｏＡｒｇｓｅｒＳｅｒ 巴５ｅｒＡｓｎＴｈｅＡｓｐＧ　Ｉ　ＵＬｙｓＴｈｒＧｌｎｓｅｒＬｅｕＧｌｙ ＶａｌＬｙｓＰｈｅＬｓｕＡｓｏＧｌｕＴｙｒＧｌｎＳｅｒＬｙｓνａｌＬｙｓ ＡｒｇＧｌｎｌｌｅ浄書（内容に変更なし］ 浄書（内容に変更なし） ＦｆＧ、　８−ｆ Ｖａ　ｌ　目ｅＡｒｇＳｅｒＡ　ｌ　ａ　＋　ｌ　ｅＧ　ＩｙＴｈｒＰｒｏＬｅ ｕＧ　１ｎＴｈｒ　Ｉ　ｌｅｓ＠ｒｓ＠ｒＧ　ｌｙＧ　ＩｙsｈｒＳｓｒＬｅｕ ＰｒｏＧ　ｌ　ｕＧ　ｌ　ｕＧ　ｌ　ｙＡｒ　ｇＰｈｅＡｓｎＡｓｎＬｅｕＡｒ 　ｇＬａｕ　ｌ　ｌ　ｅＶａ　ＩＧ　Ｉ　ｕＡｒ　ｇＡｓｎ`ｓｎＬｅｕＴｙｒ Ｖａ　ｌ ＴｈｒＧＩｙＰｈｅＶａｌＡｓｎＡｒｇＴｈｒＡｓｎＡｓｎＶａｌＰＭＴｙｒＡ ｒｇＰｈｅ＾１ａＡｓｐＰｈｓｓｅｒＨｌｓＶａｌＴｈｒ　ＰｈｅＰｒｏＧ　＋ 　ｙＴｈｒ　ＴｈｒＡ　ｌ　ａＶａ　ｌ　’ｒｈｒｔ、ｅｕｓｅｒａ　Ｉ　ｙＡ ｓｐｓｅｒｓｅｒ　ＴｙｒＴｈ秩@ＴｈｒＬａｕＧ　ｌ　ｎ ＦＩＧ．　８−２ ＡｒｇＶａ　ＩＡｌａＧｌｙｌ　ｌａＳｓｒＡｒｇＴｈｒＧｌｙＭＥＴＧｌｎ目 ｅＡｓｎＡｒｇＨｌｓｓｅｒＬｅｕ丁ｈｒＴｈｒＳｅｒＴｙｒＬｅｕＡｓｐＬｅ ｕＭＥＴＳｓｒＨｌｓＳｅｒＧｌｙＴｈｒＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧ＋ｎＳｅｒＶａ ｌ＾ｌａＡｒｇＡｌａＭＥＴＬｓｕＡｒｇＰｈｅＶａｌＴｈｒＶａＩＴｈｒＡｌ ａＧｌｕＡｌａＬａｕＡｒｇＰｈｅＡｒｇＧｌｎｌＩｅＧｌｎＡｒｇＧｌｙＰｈ ｅ＾ｒｇＴｈｒＴｈｒＬｅｕＡｓｐＡｓｐＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇｓｅｒＴｙ ｒＶａＩＭＥＴＴｈｒＡｌａＧｌｕ＾ｓｐＶａｌＡｓｐＬｓｕＴｈｒＬｅｕＡｓ 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そして（１１）該第二部分および該第三部分は同一の天然存在ポリペプチド毒素 のセグメントではない、ことを特徴とする上記ハイブリッド分子：該ハイブリッ ド分子をコードする組換えＤＮＡ分子；および該ハイブリッド分子を製造する方 法。 手続補正書 平成　４年り０月／ψ日 特許庁長官　蘇生　渡　殿　国団 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７６１９ 平成３年特許願第５０２９２１号 ２、発明の名称 トランスロケーション領域および 細胞結合領域を有するハイブリッド分子３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　セラジエン・インコーホレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 国際調査報告 １川１＋ｊ＋４＋劃＾ｏｅ１．ｆＮ６ｐｃ−「ｌ＋＜ｏｎ＋ｎ＝ｃ＋ｎ

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．第一部分、第二部分および第三部分が共有結合でつながってなるハイブリッ ド分子であって、 （ａ）第一部分は、ハイブリッド分子を動物の細胞に結合させる効果を有する、 細胞結合リガンドの結合ドメインの部分を含み；（ｂ）第二部分は、第三部分を 細胞の細胞質膜を横切ってトランスロケーションさせる能力をもつ蛋白質のトラ ンスロケーションドメインの部分を含み；そして、 （ｃ）第三部分は細胞内へ導入すべき化学成分を含むが、但し、（ｉ）該ハイブ リッド分子はそれをコードする組換えＤＮＡ分子の発現により製造されるもので あり、そして（ｉｉ）第二部分および第三部分は同一の天然存在ポリペプチド毒 素のセグメントではない、 ことを特徴とする上記ハイブリッド分子。
2. ２．第一部分、第二部分および第三部分が共有結合でつながってなるハイブリッ ド分子であって、 （ａ）第一部分は、ハイブリッド分子を動物の細胞に結合させる効果を有する、 細胞結合リガンドの結合ドメインの部分を含み；（ｂ）第二部分は、第三部分を 細胞の細胞質膜を横切ってトランスロケーションさせる能力をもつ蛋白質のトラ ンスロケーションドメインの部分を含み；そして、 （ｃ）第三部分は細胞に導入すべき化学成分を含み；但し（ｉ）第一部分と第二 部分は同一の天然存在ポリペプチド毒素のセグメントではなく、そして（ｉｉ） 第二部分と第三部分は同一の天然存在ポリペプチド毒素のセグメントではない、 ことを特徴とする上記ハイブリッド分子。
3. ３．蛋白質が天然に存在する毒素である、請求項１または２記載のハイブリッド 分子。
4. ４．蛋白質がジフテリア毒素およびシュードモナスエキソトキシンＡからなる群 から選択される、請求項２記載のハイブリッド分子。
5. ５．リガンドがポリペプチドホルモンである、請求項１または２記載のハイブリ ッド分子。
6. ６．ホルモンが、インシュリン、インターロイキンＩＩ、インターロイキンＩＶ 、インターロイキンＶＩ、およびＥＧＦからなる群から選択される、請求項５記 載のハイブリッド分子。
7. ７．リガンドがステロイドホルモンである請求項２記載のハイブリッド分子。
8. ８．リガンドが、細胞の表面に発現される抗原に対するモノクローナル抗体の抗 原結合性単鎖類縁体である、請求項１または２記載のハイブリッド分子。
9. ９．リガンドが、細胞に結合可能なポリペプチド毒素である、請求項１または２ 記載のハイブリッド分子。
10. １０．いずれか二つの隣接する部分がいずれもポリペプチドであり、そして該二 つの部分の間の共有結合がペプチド結合である、請求項２記載のハイブリッド分 子。
11. １１．第一部分および第二部分が各々ポリペプチドからなり、そしてハイブリッ ド分子が組換え蛋白質である、請求項１０記載のハイブリッド分子。
12. １２．化学成分が、酵素の酵素活性部分を含む、請求項１または２記載のハイブ リッド分子。
13. １３．酵素が毒素である、請求項１２記載のハイブリッド分子。
14. １４．酵素が、コレラ毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、シガ菌（Ｓｈｉｇａ）毒素、 大腸菌のシが菌様毒素、リチン毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ジフテリア毒素 およびシュードモナスのエキソトキシンＡからなる群から選択される、請求項１ ３記載のハイブリッド分子。
15. １５．酵素がコレラ毒素である、請求項１４記載のハイブリッド分子。
16. １６．酵素が、ヘキソサミニダーゼＡ、α−１，４−グルコシダーゼ、フェニル アラニンヒドロキシラーゼ、プロテアーゼおよびヌクレアーゼからなる群から選 択される、請求項１２記載のハイブリッド分子。
17. １７．酵素活性部分が、細胞に欠失している酵素活性を提供する、請求項１２記 載のハイブリッド分子。
18. １８．欠失が遺伝的欠失である、請求項１７記載のハイブリッド分子。
19. １９．化学成分がモノクローナル抗体の抗原結合性単鎖類縁体を含む、請求項１ または２記載のハイブリッド分子。
20. ２０．抗原がウイルス蛋白質である、請求項１９記載のハイブリッド分子。
21. ２１．ウイルス蛋白質がＨＩＶプロテアーゼである、請求項２０記載のハイブリ ッド分子。
22. ２２．ＣＴＡ／ＤＴＢ′／ＩＬ２ハイブリッドを含む、ハイブリッドポリペプチ ド分子。
23. ２３．ＳＬＴＡ／ＤＴＢ′／ＩＬ２ハイブリッドを含む、ハイブリッドポリペプ チド分子。
24. ２４．リチンＡ−ジフテリア毒素Ｂ′−ＩＬ２ハイブリッドを含む、ハイブリッ ドポリペプチド分子。
25. ２５．図１４のフェニルアラニンヒドロキシラーゼージフテリア毒素フラグメン トＢ遺伝子によりコードされるハイブリッドポリペプチド分子。
26. ２６．ＨＩＶＰ−ＢＰ／ＤＴＢ′／ＩＬ２ハイブリッドを含む、ハイブリッドポ リペプチド分子。
27. ２７．請求項２２ないし２６のいずれか１項に記載のハイブリッド分子の生物活 性変異類縁体を含む、ハイブリッドポリペプチド分子。
28. ２８．Ｓｈｉｇａ様毒素Ａの酵素活性部分および細胞結合性ポリペプチドリガン ドの結合ドメインの部分を含み、該結合ドメイン部分がハイブリッド分子を動物 細胞に結合させることができる、ハイブリッドポリペプチド分子。
29. ２９．ポリペプチドリガンドがＩＬ２である、請求項２８記載のハイブリッド分 子。
30. ３０．請求項１７記載の酵素欠損により特徴づけられる病気の動物に、請求項１ ７記載のハイブリッド分子の有効量を投与することよりなる、該病気の治療方法 。
31. ３１．標的細胞を請求項１５記載のハイブリッド分子と接触させることよりなる 、標的細胞内のサイクリックＡＭＰレベルを高める方法。
32. ３２．標的細胞がＴ細胞であり、そしてハイブリッド分子がインターロイキンＩ Ｉの結合ドメインの少なくとも一部を含む、請求項３１記載の方法。
33. ３３．ＨＩＶ感染ヒト患者に請求項２１記載のハイブリッド分子を有効量投与す ることよりなる、該患者の治療方法。
34. ３４．請求項１または２記載のハイブリッド分子をコードする組換えＤＮＡ分子 。
35. ３５．請求項３４記載の組換えＤＮＡ分子を含むベクター。
36. ３６．請求項３４記載の組換えＤＮＡ分子を含む細胞。
37. ３７．該組換えＤＮＡ分子を発現する能力を有する請求項３６記載の細胞。
38. ３８．請求項１または２記載のハイブリッド分子をコードする組換えＤＮＡ分子 を含む細胞（形質転換細胞）を用意し、そして該形質転換細胞に該組換えＤＮＡ 分子を発現させる、ことよりなる請求項１または２記載のハイブリッド分子を製 造する方法。