JP2017524342A - プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素aサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、野生型、志賀毒素細胞毒性を示すことができる、破壊されたフューリン切断モチーフを有する志賀毒素Aサブユニットエフェクターを含むプロテアーゼ切断耐性分子を提供する。以前に、志賀毒素Aサブユニット融合構築物は細胞毒性であり、酵素活性毒素断片をサイトゾルに送達するように自身の細胞内経路決定を自ら指示できることが証明された(Backer M et al., J Control Release 74: 349-55 (2001)、Backer M, Backer J, Bioconjug Chem 12: 1066-73 (2001))が、フューリン切断部位の維持は、最大細胞毒性の維持に重要であると考えられた。
本発明は、志賀毒素A1断片由来領域と該志賀毒素A1断片由来領域のカルボキシ末端に破壊されたフューリン切断モチーフとを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを各々が含む、様々な細胞毒性及び細胞標的化分子を提供する。本発明の細胞毒性及び細胞標的化分子は、野生型、志賀毒素A1断片を含む関連分子と比較してフューリン切断耐性である。フューリン切断耐性であることに加えて、本発明の分子は、一般に、よりプロテアーゼ切断耐性が高く、したがって、例えば、インビボ毒性減少、安定性増加、保存半減期増加及び/又はインビボ半減期増加などの、望ましい特性を示すことができる。
本発明のすべての細胞毒性分子及び細胞標的化分子は、各々、フューリン切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。これらのフューリン切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、各々、志賀毒素ファミリーのメンバーのAサブユニットに由来し、1)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片由来ポリペプチド、及び2)前記志賀毒素A1断片ポリペプチド領域のカルボキシ末端に破壊されたフューリン切断モチーフを含む。
本発明の特定の分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している分子部分も含む。本発明は、フューリン切断性、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して志賀毒素エフェクター細胞毒性を喪失することなく、フューリン切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端側に比較的大きい分子部分を結合させることを可能にする。用語「分子部分」は、天然に存在するものであろうと、合成のものであろうと、ポリペプチド、タンパク質、細胞毒性薬剤、ポリヌクレオシド、検出促進剤、小分子化学療法薬、多糖類、脂質及び他の生体分子を包含する。
本発明の分子はすべて、破壊されたフューリン切断モチーフ及び/又はフューリン切断部位を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化結合領域と会合している、プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。これは、細胞標的化分子が、そのフューリン切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、志賀毒素A1断片を含む野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドで置換されている同じ細胞標的化分子と比較したとき、よりプロテアーゼ切断耐性が高いことを意味する。
本発明の分子の結合領域は、細胞外標的生体分子と特異的に結合することができる、好ましくは、がん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内部に持つ宿主細胞などの、目的の細胞タイプの表面に物理的に結合している、ポリペプチド領域を含む。
本発明では、句「小胞体保持/回収シグナルモチーフ」、KDEL型シグナルモチーフ、又はシグナルモチーフは、真核生物細胞内でKDEL受容体による小胞体へのタンパク質の細胞内局在を促進するように機能することができるKDELファミリーの任意のメンバーを指す。
本発明の個々の分子部分及びポリペプチド及び/又はタンパク質成分、例えば、結合領域及び(細胞毒性であることもあり、並びに/又は触媒活性及び/若しくは細胞毒性を改変、低減若しくは除去する1つ若しくは2つ以上の変異を内部に持つこともある)志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに適切に連結させることができる。結合領域の個々のポリペプチド小成分、例えば、CDR、ABR、VHH領域、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、IgNAR領域、及び/又はVNAR領域を、当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに適切に連結させることができる(例えば、Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009)、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。本発明のタンパク質及びポリペプチド成分、例えば、多鎖結合領域は、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに本発明の他のポリペプチド成分及び/又は分子部分と安定的に連結させることができる。本発明のペプチド成分、例えば、KDELファミリー小胞体保持/回収シグナルモチーフは、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカー、例えばタンパク質性リンカー、によって本発明の別の成分に安定的に連結させることができる。
特定の実施形態において、本発明の分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、短縮型志賀毒素Aサブユニットを含む又は短縮型志賀毒素Aサブユニットから本質的になることがある。志賀様毒素Aサブユニット短縮形は、触媒活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活性化でき、細胞内で発現されたとき細胞毒性である(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)、Di R et al., Toxicon 57: 535-39 (2011))。Slt−1Aの残基1〜240で構成されているカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット断片は、真核細胞のサイトゾルへのカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット構築物の有効な逆行輸送には240位のロイシン残基が必要であるので、真核細胞の小胞体において発現されたとき完全細胞毒性を示すことが証明された(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。同様に、Stx2Aの残基1〜239で構成されているカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット断片は、真核細胞の小胞体において発現されたとき完全細胞毒性を示すことが証明された(Di R et al., Toxicon 57: 535-39 (2011))。
本発明は、治療及び/又は診断応用に有用である、様々なプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれらを含む分子を提供する。本発明の志賀毒素由来の細胞標的化分子を、最適な細胞毒性を有するように、すなわち、野生型、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子と同等の、しかし、プロテアーゼ感受性、野生型、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む特定の細胞標的化分子(例えば、カルボキシ末端の細胞標的化結合領域を含む細胞標的化分子)より改善した細胞毒性を有するように、設計することができる。本明細書において提供するプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素Aサブユニット由来分子は、例えば、標的化細胞殺滅に、特異的細胞タイプへの外因性物質の送達に、診断情報を得るために、並びにがん、免疫障害及び微生物感染を含む様々な疾患、障害及び状態の治療のための治療薬として使用される。
以前は、志賀毒素A1断片触媒領域を含む細胞毒性志賀毒素Aサブユニット構築物は、効率的で強力な細胞毒性を保存するために、中毒細胞内でフューリンによって自然に起こるタンパク質プロセッシングを維持又は何らかの形で補償しなければならないと考えられていた。意外にも、野生型、志賀毒素対照構築物のレベルで強力な志賀毒素細胞毒性が、志賀毒素A1断片のカルボキシ末端での標的細胞媒介フューリン切断事象が起こらないときに、カルボキシ末端の比較的大きい(28kDaより大きい)部分の存在にもかかわらず実現された(下記実施例を参照されたい)ため、フューリン切断事象が強力な細胞毒性に必要でないことを発見した。中毒細胞内でのフューリン切断事象の欠如は、志賀毒素A1断片の効率的遊離を干渉し、それ故、志賀毒素A1断片領域に比較的大きい分子部分が継続的に連結することになると予想された。しかし、この予想に反して、比較的大きいカルボキシ末端部分を含み、例えば改変代替プロテアーゼ部位などの明白な補償的特徴部がない、フューリン切断欠如志賀毒素Aサブユニット構築物で強力な志賀毒素細胞毒性が実現された。
本発明は、フューリン切断耐性、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを含む、様々な、細胞毒性、細胞標的化分子を提供する。特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、特定の細胞型の細胞表面に関連する細胞外標的生体分子と結合し、細胞に侵入することが可能である。本発明の細胞標的化分子の特定の実施形態は、標的化された細胞型内に内在化されたら、標的細胞のサイトゾルに細胞毒性の志賀毒素エフェクターポリペプチドフラグメントの経路を定めることが可能である。本発明の細胞標的化分子の特定の実施形態は、標的化された細胞型のサイトゾル中に入れば、リボソームを酵素的に不活性化し、最終的に細胞を殺滅することが可能である。このシステムは、この強力な細胞毒性を様々な、多様な細胞タイプに標的化すると同時に、低減されたプロテアーゼ切断感受性の改善をもたらすために、任意の数の多様な細胞標的化結合領域、例えば免疫グロブリン型ポリペプチドなどを使用することができる点でモジュラーである。細胞死、例えばその細胞毒性、をもたらす本発明の分子の能力を、当技術分野において周知の多数のアッセイのいずれか1つ又は2つ以上を用いて測定してもよい。
高親和性結合領域を使用してプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドの送達を特異的細胞タイプに標的化することによって、強力な志賀毒素細胞殺滅活性を、特異的に標的化された細胞タイプの優先的殺滅に限定することができる。本発明の特定の細胞標的化分子は、特異的細胞タイプの集団の除去に有用である。例えば、本発明の細胞毒性、細胞標的化分子は、1つ又は2つ以上の細胞表面で高レベルの特定の標的生体分子を発現する悪性細胞を除去することによる特定の腫瘍、がん及び/又は発育異常の治療に有用である。
特定の実施形態において、本発明の分子(例えば本発明の細胞標的化分子)は、フューリン切断感受性アナログと比較して安定性増加及び/又はインビボ忍容性改善を示す。安定性増加をインビトロ及び/又はインビボで示すことができる。
直接細胞殺滅に加えて、本発明の特定の分子は、標的細胞の内部へのさらなる外因性物質の送達に使用されることがあってもよい。さらなる外因性物質の送達を、例えば、細胞毒性、細胞分裂停止、免疫系刺激、免疫細胞標的化、情報収集、及び/又は診断機能のために使用してもよい。本発明の細胞毒性分子の非毒性バリアント、又は細胞毒性であってもよいバリアントを使用して、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞の内部にさらなる外因性物質を送達してもよく、及び/又は細胞の内部を標識してもよい。標的生体分子を発現する様々なタイプの細胞及び/又は細胞集団が、外因性物質を受け取るために、本発明の細胞標的化分子によって少なくとも1つの細胞表面に標的化されることもある。本発明の細胞標的化分子の機能性成分は、腫瘍細胞及び/又はそれらの細胞内区画の非侵襲性インビボイメージングなどの多様な応用をもたらすために、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド及びさらなる外因性物質が様々な結合領域と連結されていることがある点で、モジュラーである。
本発明の特定の細胞標的化分子は、上述の特異的細胞、細胞タイプ、細胞集団及び/又は特異的細胞内区画のインビトロ及び/又はインビボ検出に使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載する細胞標的化分子は、診断と治療の両方に、又は診断単独に使用される。同じ細胞標的化分子を診断と治療の両方に使用する場合、本明細書に記載する例示的置換を含む、1つ又は2つ以上のアミノ酸置換による志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒不活性化によって、診断のための検出促進剤を含む細胞標的化分子のバリアントを非毒性にしてもよい。検出促進剤にコンジュゲートされる本発明の細胞毒性、細胞標的化分子の非毒性形態は、診断機能に、例えば同じ又は関連する結合領域を含む治療レジメンと共に使用されるコンパニオン診断に使用されてもよい。
本発明のプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分及び分子(例えば、本発明の細胞毒性分子及び細胞標的化分子並びに前述のもののいずれかをコードするポリヌクレオチド)を、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は細胞標的化分子の全構造及び機能、例えば、1つ若しくは2つ以上の志賀毒素エフェクター機能、細胞標的化機能、標的生体分子結合、標的化細胞毒性活性、インビボ忍容性改善、安定性増加、及び/又は標的細胞に外因性物質を送達する能力などを維持することによって、それらの生物活性を減少させることなく、変化させることができることは、当業者には理解されるであろう。
本発明のプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分及び細胞標的化分子は、当業者に周知の生物化学工学技術を使用して産生することができる。例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、標準的な合成方法、組換え発現系の使用、又は他のあらゆる好適な方法によって製造され得る。したがって、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、多数の方法で合成することが可能であり、このような方法としては、例えば、(1)標準的な固相又は液相の手法を使用して、段階的に又はフラグメントのアセンブリのいずれかによってタンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成するステップと、最終的なポリペプチド又はタンパク質生成物を単離し精製するステップとを含む方法;(2)宿主細胞中の本発明の分子(例えば、ポリペプチド又はタンパク質)のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを発現させるステップと、宿主細胞又は宿主細胞培養から発現生成物を回収するステップとを含む方法;又は(3)インビトロで本発明の分子(例えば、細胞標的化ポリペプチド又はタンパク質)をコードするポリヌクレオチドを無細胞発現させるステップと、発現生成物を回収するステップとを含む方法;又は(1)、(2)又は(3)の方法のあらゆる組合せによって、ペプチド成分のフラグメントを得て、その後フラグメントを合体させ(例えばライゲートして)ペプチド成分を得て、ペプチド成分を回収する方法が挙げられる。例えば、ポリペプチド及び/又はペプチド成分を、例えばN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN−エチル−5−フェニル−イソオキサゾリウム−3’−スルホネート(ウッドワード試薬K)などのカップリング試薬を使用して互いにライゲートしてもよい。
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状(例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、成長異常、免疫障害、及び微生物感染)の治療又は防止のための医薬組成物において、単独で、又は1又は2以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するための分子及び細胞標的化分子を提供する。本発明はさらに、本発明に従って、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と共に、本発明の分子、例えば、本発明の細胞標的化分子など、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の分子又は細胞標的化分子のホモ多量体及び/又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療、緩和又は予防する方法において有用であると予想される。このような疾患、状態、障害、又は症状はそれぞれ、本発明に係る医薬組成物の使用に対して別の実施形態であると想定される。本発明は、さらに、以下でより詳細に説明されるように、少なくとも1つの本発明に係る治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
例えば本発明の細胞標的化分子などの、本発明の分子のいずれかについての薬学的に許容される塩又は溶媒和物も同様に本発明の範囲内である。
本発明の分子のほかにも、本発明のポリペプチド及びタンパク質、又はそれらの機能的な部分をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内にある。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同等であり、その両方が、デオキシリボ核酸(DNA,deoxyribonucleic acid)のポリマー、リボ核酸(RNA,ribonucleic acid)のポリマー、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたこれらのDNA又はRNAの類似体、並びにそれらの誘導体、フラグメント及びホモログを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。開示されるポリヌクレオチドは、例えば、RNAコドンの第三の位置で許容されるが異なるRNAコドンとして同じアミノ酸をコードすることが公知のゆらぎを考慮に入れて、例示的な細胞標的化分子をコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドを包含するように具体的に開示されている(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照)。
本発明の特定の実施形態は、固体基材上に固定化された、本発明の分子(例えば、プロテアーゼ切断耐性、細胞毒性分子若しくは細胞標的化分子)又はその任意のエフェクター断片を含む。本明細書において企図される固体基材には、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、マトリックス材料、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、又は当技術分野において公知の任意の固体表面が含まれるが、これらに限定されない(例えば、米国特許第7,771,955号明細書を参照されたい)。これらの実施形態に従って、当業者に公知の技術を使用して、本発明の分子を例えばビーズ、粒子又はプレートなどの固体基材に共有結合で連結させてもよく、又は非共有結合で連結させてもよい。本発明の固定化分子を、当技術分野において公知の技術を使用するスクリーニング応用に使用してもよい(例えば、Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011)、Sutton C, Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012)、Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013)、Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)を参照されたい)。
特定の実施形態において、本発明は、1又は2以上の本発明の物質の組成物、例えば対象に送達するための医薬組成物を含むデバイスに関する。したがって、1又は2以上の本発明の物質の組成物を含む送達デバイスを使用して、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射;経口投与;経皮投与;肺内又は経粘膜投与;インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ又はマイクロポンプによる投与;又は当業者によって認識される他の手段による投与などの様々な送達方法によって本発明の物質の組成物を患者に投与することができる。
一般的に、本発明の目的は、特定のがん、腫瘍、成長異常、免疫障害、又は本明細書で述べられるさらなる病的状態などの疾患、障害、及び状態の予防及び/又は治療において使用することができる薬理活性薬剤、加えてそれを含む組成物を提供することである。したがって、本発明は、本発明の分子(プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、医薬組成物、及び診断用組成物を含む)を細胞の標的化殺滅のために、さらなる外因性物質を標的細胞に送達するために、標的細胞内部を標識するために、診断情報を収集するために、並びに本明細書に記載の疾患、障害及び状態を治療するために使用する方法を提供する。
[実施例]
フューリン耐性、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを、各々が細胞標的化、免疫グロブリン型、結合領域をさらに含む細胞標的化分子の成分として生成し、試験した。志賀毒素エフェクターポリペプチドを工学的に操作してプロテアーゼ耐性にするために、SLT−1Aのアミノ酸1〜251を含む、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A,A subunit of Shiga-like Toxin 1)に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドに、2つのアミノ酸残基置換、R248A及びR251A、を導入した。このフューリン切断耐性R248A及びR251A二重変異構築物を、本明細書では(SLT−1Aフューリン耐性(SLT-1A furin resistant)にちなんで)「SLT−1A−FR」と呼ぶ。本明細書では「SLT−1A−FR−2」と呼ぶ、第2のフューリン切断耐性変異型構築物は、単一残基置換R248Aで生じさせた。本明細書では「SLT−1A−FR−3」と呼ぶ、第3のフューリン切断耐性変異型構築物は、単一残基置換R251Aを含む。フューリンコンセンサスモチーフ領域240〜256のコアにある最小、フューリンプロテアーゼ、切断部位R−x−x−Rの変異は、フューリン並びに他のプロテアーゼ、例えばプロタンパク質転換酵素及び無差別なプロテアーゼなど、によるタンパク質分解に対するこの領域の感受性を破壊すると予想された。フューリン切断部位のR248A/R251A破壊を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−FRを使用して、例示的細胞標的化分子を生成した。
フューリン切断を破壊するためにプロテアーゼ切断感受性領域240〜256を変異させた後の志賀毒素エフェクターポリペプチドのフューリン切断感受性を、カルボキシ末端、細胞標的化結合領域を含む融合タンパク質の分子環境で試験した。SLT−1A−FR::scFv−1及びSLT−1A−FR::scFv−2を切断するフューリンの能力を評価するために、リン酸緩衝食塩水(PBS,phosphate buffered saline)中の精製タンパク質試料を、フューリン切断緩衝液(100ミリモル(mM)HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)、pH7、1mM CaCl2)中の1マイクログラム(μg)の試料タンパク質当たり0.5フューリン活性単位(U)のフューリン(New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.)とともに、25〜30時間(hrs)、摂氏30又は37度(℃)でインキュベートした。対照試料は、フューリンなしで、4、30又は37℃で、同じ緩衝液中でインキュベートした。変性条件下でドデシル硫酸ナトリウム(SDS,sodium dodecyl sulfate)、ポリアクリルアミドゲルを用いて様々なタンパク質試料を電気泳動させ、クーマシーで染色した(図2及び3)。
本発明の分子はすべて、少なくとも1つの志賀毒素Aサブユニットに由来する触媒ドメインを含む。インビトロリボソーム阻害アッセイを使用して、フューリン切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−FRの酵素活性を試験した。SLT−1A−FR::scFv−1及びSLT−1A−FR::scFv−2を使用して、カルボキシ末端、細胞標的化結合領域の分子環境で、SLT−1A−FRのリボソーム不活性化活性を試験した。
プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−FRを含む例示的細胞標的化分子の細胞毒性を、当業者に公知の細胞殺滅アッセイを使用して判定した。特異的細胞毒性は、標的発現細胞に対する例示的細胞標的化分子の細胞毒性を非標的化、野生型、志賀毒素エフェクター対照(SLT−1A−WT)の細胞毒性と比較することによって判定した。選択的細胞毒性は、標的発現細胞に対する細胞毒性を、細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子を発現しない細胞に対する細胞毒性と比較することによって、判定した。scFv−1又はscFv−2の細胞外標的生体分子の有意な量を少なくとも1つの細胞表面で発現した細胞、すなわち、結合領域標的生体細胞陽性であった細胞を選択した(細胞株A、B、C及びDは、scFv−1の標的について陽性であり、細胞株E、F及びGは、scFv−2の標的について陽性であった)。いずれの細胞表面でもscFv−1の有意な量の細胞外標的生体分子を発現しなかった、及び/又はいずれの細胞表面でもscFv−2の有意な量の細胞外標的生体分子を発現しなかった細胞、すなわち、結合領域scFv−1及びscFv−2の一方又は両方のいずれの標的についても標的生体分子陰性であった細胞を選択した。
例示的、細胞毒性、細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−1及びSLT−1A−FR::scFv−2(これらの各々が、フューリン切断耐性、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチド領域を含む)の様々な投薬量に対する忍容性を試験した。マウスを使用して、例示的細胞標的化分子の様々な投薬量で明らかな有害作用が忍容される程度を判定した。インビボ有効性研究のための開始用量の情報を得るために最大耐用量の測定を目的として、マウス用量設定を用いて治療忍容性を判定した。忍容性研究は、表3に記載する4つの独立した研究で、Charles River Laboratories(Charles River Laboratories International社、Morrisville、NC、U.S.)において行った。研究ごとに、重症複合免疫不全(SCID,severe combined immune deficiency)の雌C.B−17 SCIDマウスを、同様の平均体重を有する群に分けた。試験薬又はビヒクル対照を注射1回につき体重1キログラム当たり0.25〜5.00ミリグラム(mg/kg/inj)の範囲の用量でマウスに投与し、1又は2週間、週に3回、注射を投与した。研究を通して体重及び臨床徴候をモニターした。実験動物を使用するインビボ忍容性研究の結果を表3に要約する。表3は、群当たりのマウスの数、投与した試料、注射用量、マウス1匹当たりのkg当たりのmg(mg/kg/マウス)での累積投薬量、観察された治療関連死の数(死亡数)、及び群ごとの平均死亡日を示す。
ヒト腫瘍の播種性異種移植モデルを使用して、ヒト腫瘍担持マウスにおいて例示的、細胞毒性、細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−2のインビボ有効性を判定した。ルシフェラーゼを構成的に発現し、scFv−2の標的の細胞表面発現を提示するヒト腫瘍細胞を、この異種移植モデルに使用した。
最小フューリン切断モチーフR/Y−x−x−Rの変異を含む例示的、細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−1及びSLT−1A−FR::scFv−2は、ヒトフューリンによってタンパク質分解されなかったが、野生型、志賀毒素Aサブユニット領域を含む細胞標的化タンパク質に匹敵する特異的細胞毒性を示した。例示的、細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−2は、哺乳類モデルにおいてヒト腫瘍増殖を有効に阻害した。加えて、SLT−1A−FR::scFv−1及びSLT−1A−FR::scFv−2両方は、野生型、志賀毒素Aサブユニット領域を含む親分子と比較して忍容性改善を示した。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αCD20抗原は、ヒトCD20を認識する免疫グロブリン型ドメインに由来し(例えば、Haisma H et al., Blood 92: 184-90 (1999)、Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439-43 (2006)、Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010)を参照されたい)、CD20の細胞外部分に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む。CD20は、B細胞リンパ腫細胞、有毛細胞白血病細胞、B細胞慢性リンパ球性白血病細胞、及びメラノーマ細胞などの複数のがん細胞型で発現する。さらに、CD20はいくつかの自己免疫疾患、障害、及び過活動B細胞を含む状態を治療するための治療学への魅力的な標的である。
免疫グロブリン型結合領域αCD20とプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドを互いに連結させて、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、αCD20抗原結合タンパク質SLT−1A−FR::αCD20をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって融合タンパク質を産生する(例えば、配列番号50、51、52及び53を参照されたい)。前の実施例で説明したような、細菌性及び/又は無細胞いずれかのタンパク質翻訳系を使用して、SLT−1A−FR::αCD20細胞毒性分子の発現を遂行する。
CD20+細胞及びCD20−細胞に対する本実施例の細胞毒性分子の結合特性を、当技術分野において公知の蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによって判定する。Prismソフトウェア(GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.)を使用して、結合−飽和という見出しのもとにある1サイト結合についてのPrismソフトウェア機能[Y=Bmax*X/(KD+X)]を使用してBmax及びKDを計算する。Bmaxは、MFIで報告される最大特異的結合である。KDは、nMで報告される平衡結合定数である。CD20+細胞へのSLT−1A−FR::αCD20のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100ナノモル(nM)である一方、このアッセイにおいてはCD20−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A−FR::αCD20の細胞毒性特性を、CD20+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A−FR::αCD20の選択的細胞毒性特性を、CD20+細胞と比較してCD20−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、CD20+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にCD20を発現する細胞と比較して細胞表面上にCD20を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性分子SLT−1A−FR::αCD20のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にCD20を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性分子の効果を試験する。
この実施例において、プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀毒素様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来した。免疫グロブリン型結合領域は、米国特許出願第2011/0059090号に記載される、ラクダ抗体の単ドメイン可変領域(VHH)であるタンパク質5F7に由来するαHER2 VHHである。
免疫グロブリン型結合領域及びプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドは共に連結して、細胞毒性、細胞標的化分子を形成した(例えば、配列番号54を参照されたい)。本実施例において、タンパク質5F7に由来するαHER2−VHH可変領域をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で既知のリンカーをコードするポリヌクレオチドを有するフレーム、及び配列番号22のアミノ酸を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するフレームにクローニングすることができる。細胞毒性分子「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」のバリアントは、結合領域を志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の隣に配置していてもよく、カルボキシ末端にKDELファミリーの小胞体シグナルモチーフを含んでいてもよいように作製した。細胞毒性分子バリアント「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
HER2+細胞及びHER2−細胞に対する本実施例の細胞毒性分子の結合特性を、当技術分野において公知の蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによって判定する。HER2+細胞への「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはHER2−細胞への有意な結合はない。
「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」バリアントの細胞毒性特性を、HER2+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、HER2+細胞と比較してHER2−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、HER2+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にHER2を発現する細胞と比較して細胞表面上にHER2を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性分子「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にHER2を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性分子の効果を試験する。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン・バー抗原は、エプスタイン・バー抗原に対するモノクローナル抗体(Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30 (2004))に由来し、エプスタイン・バーウイルスに感染したヒト細胞又はエプスタイン・バー抗原を発現する形質転換細胞に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む。エプスタイン・バー抗原は、エプスタイン・バーウイルスに感染した細胞やがん細胞(例えば、リンパ腫及び上咽頭がん細胞)などの複数の細胞型で発現する。さらに、エプスタイン・バー感染は、他の疾患、例えば、多発性硬化症を伴う。
免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン・バー抗原及びプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αエプスタイン・バー抗原結合タンパク質「SLT−1A−FR::αエプスタイン・バー::KDEL」をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子「SLT−1A−FR::αエプスタイン・バー::KDEL」の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
エプスタイン・バー抗原陽性細胞及びエプスタイン・バー抗原陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。エプスタイン・バー抗原陽性細胞への「αエプスタイン・バーと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはエプスタイン・バー抗原陰性細胞への有意な結合はない。
「αエプスタイン・バーと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、エプスタイン・バー抗原陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αエプスタイン・バーと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、エプスタイン・バー抗原陽性細胞と比較してエプスタイン・バー抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、エプスタイン・バー抗原陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現する細胞と比較して細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性分子「αエプスタイン・バーと連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性分子の効果を試験する。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原は、当技術分野で既知の技術を用いて生成された、細胞内トリパノソーマ原虫を保有するヒト細胞に存在する細胞表面のリーシュマニア抗原への抗体に由来する(Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001)、Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6 (1999)、Berman J and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、リーシュマニア抗原結合タンパク質SLT−1A−FR::αリーシュマニア::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αリーシュマニア::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
リーシュマニア抗原陽性細胞及びリーシュマニア抗原陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。リーシュマニア抗原陽性細胞への「αリーシュマニアと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはリーシュマニア抗原陰性細胞への有意な結合はない。
「αリーシュマニアと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αリーシュマニアと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してリーシュマニア抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、リーシュマニア抗原陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現する細胞と比較して細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシンRは、DARPin(商標)(GenBank受託番号:2P2C_R)又はヒトニューロテンシン受容体と結合するモノクローナル抗体(Ovigne J et al., Neuropeptides 32: 247-56 (1998))に由来する。ニューロテンシン受容体は、乳がん、結腸がん、肺がん、メラノーマ、及び膵臓がん細胞など様々ながん細胞で発現する。
免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシンR及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結した、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、ニューロテンシン受容体結合タンパク質SLT−1A−FR::αニューロテンシンR::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αニューロテンシンR::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成した。
ニューロテンシン受容体陽性細胞及びニューロテンシン受容体陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。ニューロテンシン受容体陽性細胞への「αニューロテンシンRと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはニューロテンシン受容体陰性細胞への有意な結合はない。
「αニューロテンシンRと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αニューロテンシンRと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞と比較してニューロテンシン受容体陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、ニューロテンシン受容体陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現する細胞と比較して細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性分子「αニューロテンシンRと連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性分子の効果を試験する。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。結合領域αEGFRは、AdNectin(商標)(GenBank受託番号:3QWQ_B)、Affibody(商標)(GenBank受託番号:2KZI_A;米国特許第8,598,113号明細書)、又は、その全てが1又は2以上のヒト上皮増殖因子受容体に結合する抗体に由来する。上皮増殖因子受容体の発現は、例えば、肺がん細胞、乳がん細胞、及び結腸がん細胞などのヒトがん細胞と関連がある。
免疫グロブリン型結合領域αEGFR及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、EGFR結合タンパク質SLT−1A−FR::αEGFR::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αEGFR::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
EGFR+細胞及びEGFR−細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。EGFR+細胞への「αEGFRと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはEGFR−細胞への有意な結合はない。
「αEGFRと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、EGFR+細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αEGFRと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してEGFR−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、EGFR+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にEGFRを発現する細胞と比較して細胞表面上にEGFRを発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性分子「αEGFRと連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にEGFRを発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性分子の効果を試験する。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αCCR5は、ヒトCCR5(CD195)に対するモノクローナル抗体(Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19 (2012))に由来する。CCR5は主に、T細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びミクログリアで発現する。さらに、CCR5はヒト免疫不全ウイルス(HIV、human immunodeficiency virus)の発症及び蔓延に影響を与える。
免疫グロブリン型結合領域αCCR5及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αCCR5結合タンパク質SLT−1A−FR::αCCR5::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αCCR5::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
CCR5+細胞及びCCR5−細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。CCR5+陽性細胞への「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはCCR5−細胞への有意な結合はない。
「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、CCR5+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、CCR5+細胞と比較してCCR5−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、CCR5+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にCCR5を発現する細胞と比較して細胞表面上にCCR5を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
動物モデルを用いて、ドナー材料のT細胞を減少させ(Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)を参照されたい)、細胞毒性分子「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。非ヒト霊長類を用いて、「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」のインビボでの効果を決定する。ドナー臓器を「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」で前処理したとき(Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009)を参照されたい)、腎臓移植後のアカゲザルの移植片対宿主病について分析する。異なる用量の「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」の非経口投与後、霊長類カニクイザルの末梢血Tリンパ球のインビボでの減少を観察する。「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」を使用したHIV感染の阻害は、サル免疫不全ウイルス(SIV、simian immunodeficiency virus)にさらされたときに循環するT細胞を大きく減少させるために、非ヒト霊長類に急性用量の「αCCR5と連結されたSLT−1A−FR」を与えることによって試験する(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)を参照されたい)。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀毒素のAサブユニット(StxA)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αEnvは、GP41、GP120、GP140、又はGP160(例えば、Chen W et al., J Mol Bio 382: 779-89 (2008)、Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71 (2013)、van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)を参照されたい)などのHIVエンベロープ糖タンパク質(Env)に結合する既存の抗体、又は標準的な技術を用いて生成された抗体(Prabakaran P et al., Front Microbiol 3: 277 (2012)を参照されたい)に由来する。EnvはHIV複製中のHIV感染細胞の細胞表面に提示される、HIV表面タンパク質である。Envは、主に感染細胞のエンドソーム区画に発現するが、本発明の強力な細胞毒性、細胞標的化分子によって、十分な量のEnvが標的とされる細胞表面に存在させることができる。さらに、Env標的細胞毒性分子は、HIVビリオンと結合でき、ビリオンと宿主細胞が融合する間に、感染細胞に新たに進入することができる。
免疫グロブリン型結合領域αEnv及びプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αEnv結合タンパク質SLT−1A−FR::αEnv::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αEnv::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
Env+細胞及びEnv−細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。Env+陽性細胞への「αEnvと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはEnv−細胞への有意な結合はない。
「αEnvと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、Env+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αEnvと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、Env+細胞と比較してEnv−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株及び/又は細胞に感染して、細胞をEnv+にするのに使用されるHIV株に応じて、Env+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にEnvを発現する細胞と比較して細胞表面上にEnvを発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
「αEnvと連結されたSLT−1A−FR」を使用したHIV感染の阻害は、サル免疫不全ウイルス(SIV)に感染した非ヒト霊長類(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)を参照されたい)に、「αEnvと連結されたSLT−1A−FR」を投与することによって試験する。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αUL18は、当技術分野で既知の技術を用いて、細胞表面サイトメガロウイルスタンパク質UL18に生成され、サイトメガロウイルスに感染したヒト細胞に存在する(Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100 (2008))。ヒトサイトメガロウイルス感染は、様々ながん及び炎症性障害を伴う。
免疫グロブリン型結合領域αUL18及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αUL18結合タンパク質SLT−1A−FR::αUL18::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αUL18::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
サイトメガロウイルスUL18陽性細胞及びサイトメガロウイルスUL18陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性分子の結合特性は、当技術分野において周知の蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞への「αUL18と連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはサイトメガロウイルスタンパク質UL18陰性細胞への有意な結合はない。
「αUL18と連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「αUL18と連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞と比較してサイトメガロウイルスタンパク質UL18陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、細胞株に応じて、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質UL18を発現する細胞と比較して細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質UL18を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域α蠕虫腸管抗原は、当技術分野において公知の技術を用いてヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログに対して産生された抗体に由来する(例えば、the nematode gene gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL、Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015)を参照されたい)。
細胞毒性、細胞標的化分子を形成するために、免疫グロブリン型結合領域α蠕虫腸管抗原とプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを互いに連結させ、KDELファミリーのカルボキシ末端小胞体シグナルモチーフをともに連結させてもよい。例えば、SLT−1A−FR::α蠕虫腸管抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって融合タンパク質を産生する。前の実施例で説明したような、細菌性及び/又は無細胞いずれかのタンパク質翻訳系を使用して、SLT−1A−FR::α蠕虫腸管抗原細胞毒性タンパク質の発現を遂行する。
本実施例の細胞毒性、細胞標的化分子の結合特性を、精製組換え標的タンパク質を使用する当技術分野において公知の分子結合アッセイによって判定する。標的タンパク質への「α蠕虫腸管抗原と連結されたSLT−1A−FR」のKDは、おおよそ100nMであると測定されるが、このアッセイでは陰性対照タンパク質(例えば、精製された組換えヒトトランスフェリン受容体)への有意な結合はない。
蠕虫に対する「α蠕虫腸管抗原と連結されたSLT−1A−FR」の毒性を、モデル蠕虫を使用して判定する(例えば、Iatsenko I et al., Toxins 2050-63 (2014)を参照されたい)。例えばSLT−1A::α蠕虫腸管抗原融合タンパク質を発現する細菌に蠕虫を浸漬することによって、又は代替的にそのような細菌を蠕虫に給餌することによって、精製「α蠕虫腸管抗原と連結されたSLT−1A−FR」を蠕虫に投与することができる。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀毒素のAサブユニット(StxA,A subunit of Shiga toxin)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドである。特異的ペプチドと複合体を形成しているヒト主要組織適合性(MHC,major Histo-Compatibility)分子に結合する免疫グロブリン型結合領域は、当業者に公知の標準的技術を用いてスクリーニングした抗体及び/又は免疫グロブリン型ライブラリーから得る又は設計する(Tohidkia M et al., J Drug Target 20: 195-208 (2012)、de Marco A, Crit Rev Biotechnol 33: 40-8 (2013)、Wen F, Zhao H, Methods Mol Biol 1061: 245-64 (2013)を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域αMHC−ペプチドとプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを互いに連結させて、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、結合領域が、結核菌又は熱帯熱マラリア原虫からの抗原性ペプチドと複合体を形成している特異的ヒトHLAサブタイプMHC分子に結合する、SLT−1A−FR::αMHC−ペプチドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって、融合タンパク質を産生する。前の実施例に関して上で説明したような、細菌性及び/又は無細胞いずれかのタンパク質翻訳系を使用して、SLT−1A−FR::αMHC−ペプチド細胞毒性分子の発現を遂行する。マラリア抗原又はマイコバクテリウム抗原と複合体を形成している他のHLAタイプに特異的な結合領域を設計し、試験して、ヒト亜集団のよりよい適用範囲を得る。
感染ヒト細胞に対する本実施例の細胞毒性分子の結合特性を、当技術分野において公知の蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによって判定する。抗原提示細胞に対する「αMHC−ペプチドと連結されたSLT−1A−FR」のBmaxは、0.01〜100nMの範囲内のKDでおおよそ50,000〜200,000MFIであると測定されるが、このアッセイでは陰性対照細胞への有意な結合はない。
「αMHC−ペプチドと連結されたSLT−1A−FR」の細胞毒性特性は、特異的MHC分子−ペプチド複合体について陽性の感染細胞及び/又は抗原提示細胞を使用して、前の実施例において上で説明したように一般的細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、「αMHC−ペプチドと連結されたSLT−1A−FR」の選択的細胞毒性特性を、同じ一般的細胞殺滅アッセイによって判定する。本実施例の細胞毒性分子のCD50は、MHC−ペプチド+細胞については細胞株に依存しておおよそ0.01〜100nMである。細胞毒性分子のCD50は、特異的標的化、MHC−ペプチドを細胞表面に提示する細胞と比較して、同じMHC−ペプチドを細胞表面で発現しない細胞のほうがおおよそ10〜10,000倍大きい(細胞毒性が少ない)。
マラリア感染、マイコバクテリウム、スポロゾイト感染、及び肝臓段階プラスモジウム寄生虫感染の動物モデルに「αMHC−ペプチドと連結されたSLT−1A−FR」を投与することによって、プラスモジウム又はマイコバクテリウム感染を阻害するための「αMHC−ペプチドと連結されたSLT−1A−FR」の使用を試験する。このタイプのMHC−ペプチド複合体標的治療は、例えば無脾症、T細胞欠損及び/又はHIV感染患者などの、免疫不全でもあるマイコバクテリウム又はプラスモジウム感染個体において特に有用でありうる。
本実施例における志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)、志賀毒素のAサブユニット(StxA)及び/又は志賀様毒素2のAサブユニット(SLT−2A)に由来するプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、SLT−1A及びStxAについては248〜251又はLT2−2Aについては247〜250に天然に存在するアミノ酸配列での破壊されたプロテアーゼ感受性部位を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドである。結合領域は表5の第1列から選択される分子の免疫グロブリンドメインに由来し、表5の第2列に示される細胞外標的生体分子と結合する。本実施例の例示的細胞標的化分子は、カルボキシ末端にKDEL型シグナルモチーフを有し及び/又は当技術分野で既知の試薬及び技術を用いて作製していてもよい。本実施例の例示的細胞毒性、細胞標的化分子は、前記の実施例において記載したように、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を用いて試験される。本実施例の例示的細胞標的化分子は、例えば、表5の第3列に示される疾患、状態、及び/又は障害を診断及び治療するために用いることができる。
態において、結合領域は、ヒトCD4の断片、I型膜貫通糖タンパク質を含まない。特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、アミノ酸残基19〜183に対応するヒトCD4の断片を含むカルボキシ末端、結合領域に融合されている、配列番号2のアミノ酸1〜247、配列番号2のアミノ酸45〜247、及び/又は配列番号2のアミノ酸75〜247を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含まない。
本発明では、句「小胞体保持/回収シグナルモチーフ」、KDEL型シグナルモチーフ(配列番号62)、又はシグナルモチーフは、真核生物細胞内でKDEL受容体(配列番号62として開示される「KDEL」)による小胞体へのタンパク質の細胞内局在を促進するように機能することができるKDELファミリー(配列番号62として開示される「KDEL」)の任意のメンバーを指す。
本発明の個々の分子部分及びポリペプチド及び/又はタンパク質成分、例えば、結合領域及び(細胞毒性であることもあり、並びに/又は触媒活性及び/若しくは細胞毒性を改変、低減若しくは除去する1つ若しくは2つ以上の変異を内部に持つこともある)志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに適切に連結させることができる。結合領域の個々のポリペプチド小成分、例えば、CDR、ABR、VHH領域、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、IgNAR領域、及び/又はVNAR領域を、当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに適切に連結させることができる(例えば、Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009)、Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。本発明のタンパク質及びポリペプチド成分、例えば、多鎖結合領域は、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに本発明の他のポリペプチド成分及び/又は分子部分と安定的に連結させることができる。本発明のペプチド成分、例えば、KDELファミリー小胞体保持/回収シグナルモチーフ(配列番号62として開示される「KDEL」)は、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカー、例えばタンパク質性リンカー、によって本発明の別の成分に安定的に連結させることができる。
特定の実施形態において、本発明の分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、短縮型志賀毒素Aサブユニットを含む又は短縮型志賀毒素Aサブユニットから本質的になることがある。志賀様毒素Aサブユニット短縮形は、触媒活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活性化でき、細胞内で発現されたとき細胞毒性である(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)、Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011))。Slt−1Aの残基1〜240で構成されているカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット断片は、真核細胞のサイトゾルへのカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット構築物の有効な逆行輸送には240位のロイシン残基が必要であるので、真核細胞の小胞体において発現されたとき完全細胞毒性を示すことが証明された(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。同様に、Stx2Aの残基1〜239で構成されているカルボキシ末端短縮型志賀毒素Aサブユニット断片は、真核細胞の小胞体において発現されたとき完全細胞毒性を示すことが証明された(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011))。
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状(例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、成長異常、免疫障害、及び微生物感染)の治療又は防止のための医薬組成物において、単独で、又は1又は2以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するための分子及び細胞標的化分子を提供する。本発明はさらに、本発明に従って、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と共に、本発明の分子、例えば、本発明の細胞標的化分子など、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の分子又は細胞標的化分子のホモ多量体及び/又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療、緩和又は予防する方法において有用である。このような疾患、状態、障害、又は症状はそれぞれ、本発明に係る医薬組成物の使用に対して別の実施形態であると想定される。本発明は、さらに、以下でより詳細に説明されるように、少なくとも1つの本発明に係る治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
免疫グロブリン型結合領域及びプロテアーゼ切断耐性、志賀毒素エフェクターポリペプチドは共に連結して、細胞毒性、細胞標的化分子を形成した(例えば、配列番号54を参照されたい)。本実施例において、タンパク質5F7に由来するαHER2−VHH可変領域をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で既知のリンカーをコードするポリヌクレオチドを有するフレーム、及び配列番号22のアミノ酸を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するフレームにクローニングする。細胞毒性分子「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」のバリアントは、結合領域を志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の隣に配置していてもよく、カルボキシ末端にKDELファミリー(配列番号62として開示される「KDEL」)の小胞体シグナルモチーフを含んでいてもよいように作製した。細胞毒性分子バリアント「αHER2−VHHと連結されたSLT−1A−FR」の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン・バー抗原及びプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αエプスタイン・バー抗原結合タンパク質「SLT−1A−FR::αエプスタイン・バー::KDEL」(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子「SLT−1A−FR::αエプスタイン・バー::KDEL」(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、リーシュマニア抗原結合タンパク質SLT−1A−FR::αリーシュマニア::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αリーシュマニア::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシンR及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結した、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、ニューロテンシン受容体結合タンパク質SLT−1A−FR::αニューロテンシンR::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αニューロテンシンR::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成した。
免疫グロブリン型結合領域αEGFR及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、EGFR結合タンパク質SLT−1A−FR::αEGFR::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αEGFR::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αCCR5及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αCCR5結合タンパク質SLT−1A−FR::αCCR5::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αCCR5::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αEnv及びプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αEnv結合タンパク質SLT−1A−FR::αEnv::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αEnv::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
免疫グロブリン型結合領域αUL18及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを共に連結し、カルボキシ末端にKDEL(配列番号62)を付加し、細胞毒性、細胞標的化分子を形成する。例えば、融合タンパク質は、αUL18結合タンパク質SLT−1A−FR::αUL18::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性分子SLT−1A−FR::αUL18::KDEL(配列番号62として開示される「KDEL」)の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
細胞毒性、細胞標的化分子を形成するために、免疫グロブリン型結合領域α蠕虫腸管抗原とプロテアーゼ耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを互いに連結させ、KDELファミリー(配列番号62として開示される「KDEL」)のカルボキシ末端小胞体シグナルモチーフをともに連結させてもよい。例えば、SLT−1A−FR::α蠕虫腸管抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって融合タンパク質を産生する。前の実施例で説明したような、細菌性及び/又は無細胞いずれかのタンパク質翻訳系を使用して、SLT−1A−FR::α蠕虫腸管抗原細胞毒性タンパク質の発現を遂行する。
Claims (68)
- i)1つ又は2つ以上のポリペプチドを含み、少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合できる、免疫グロブリン型結合領域を含む結合領域と、
ii)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端の破壊されたフューリン切断モチーフ
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと
を含む細胞標的化分子。 - 結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している、請求項1に記載の細胞標的化分子。
- 結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとが融合されている、請求項1又は2に記載の細胞標的化分子。
- 免疫グロブリン型結合領域が、
シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域3断片、拘束FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、Fd断片、抗原結合断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作された任意の対応物
からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の細胞標的化分子。 - 結合領域が、
CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis−Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis−Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質1、チロシナーゼ関連タンパク質2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、HPV−E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトプロテイン抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD52、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、CD193、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD33、CD64、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a−c、GITRL、MHCクラスII、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、CD123、及び前述のもののいずれかの任意の免疫原性断片
からなる群から選択される細胞外標的生体分子と結合できる、請求項4に記載の細胞標的化分子。 - 結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞への細胞標的化分子の投与によって、前記細胞を死滅させることができる、請求項4に記載の細胞標的化分子。
- メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第1の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第2の細胞集団への細胞標的化分子の投与によって、前記第2の細胞集団のメンバーと比較して前記第1の細胞集団のメンバーに対する前記細胞標的化分子の細胞毒性作用が少なくとも3倍大きい、請求項6に記載の細胞標的化分子。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項7に記載の細胞標的化分子。
- 配列番号50〜61のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号50〜61のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項8に記載の細胞標的化分子。
- KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端小胞体保持/回収シグナルモチーフをさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載の細胞標的化分子。
- KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、及びSKELからなる群から選択される、カルボキシ末端小胞体保持/回収シグナルモチーフを含む、請求項10に記載の細胞標的化分子。
- i)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端において、野生型、志賀毒素Aサブユニットと比較して最小、フューリン切断モチーフの1つ又は2つ以上の変異を含む破壊されたフューリン切断モチーフ
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
ii)少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合でき、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している結合領域と
を含む細胞標的化分子。 - 志賀毒素エフェクターポリペプチドと結合領域が融合されている、請求項12に記載の細胞標的化分子。
- 結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞への細胞標的化分子の投与によって、前記細胞を死滅させることができる、請求項13に記載の細胞標的化分子。
- メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第1の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第2の細胞集団への細胞標的化分子の投与によって、前記第2の細胞集団のメンバーと比較して前記第1の細胞集団のメンバーに対する前記細胞標的化分子の細胞毒性作用が少なくとも3倍大きい、請求項14に記載の細胞標的化分子。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号4〜36のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号4〜36のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項15に記載の細胞標的化分子。
- 配列番号50〜61のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号50〜61のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項16に記載の細胞標的化分子。
- i)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
ii)前記A1断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフューリン切断モチーフ
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞毒性分子であって、
第1の細胞標的化分子の構成要素が、
少なくとも1つの細胞標的外生体分子に特異的に結合できる結合領域と、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している分子部分と
を含む場合、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが野生型、志賀毒素A1ポリペプチドからなることを除いて前記細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子の細胞毒性と同等の細胞毒性を示すことができる、前記細胞毒性分子。 - 分子部分が、少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、前記分子部分の少なくとも1つのアミノ酸残基と融合されている、請求項18に記載の細胞毒性分子。
- 破壊されたフューリン切断モチーフが、野生型、志賀毒素Aサブユニットと比較して1つ又は2つ以上の変異を含み、前記変異が、
志賀様毒素1のAサブユニット(配列番号1)若しくは志賀毒素のAサブユニット(配列番号2)の248〜251に、又は
志賀様毒素2のAサブユニット(配列番号3)の247〜250に
天然に位置する領域内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変するものである、請求項19に記載の細胞毒性分子。 - 変異の少なくとも1つが、正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である、請求項20に記載の細胞毒性分子。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項18〜20のいずれかに記載の細胞毒性分子。
- 志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するAサブユニットと比較して、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を低減又は除去する変異をさらに含む、請求項18〜22のいずれかに記載の細胞毒性分子。
- 第1の細胞標的化分子が、第2の細胞標的化分子と比較してインビボ忍容性改善を示すことができる、請求項18〜23のいずれかに記載の細胞毒性分子。
- i)少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合できる結合領域と、
ii)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフューリン切断モチーフ
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
iii)前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している分子部分と
を含む、細胞毒性、細胞標的化分子であって、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが野生型、志賀毒素A1ポリペプチドからなることを除いて前記細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子の細胞毒性と同等の細胞毒性を示すことができる、前記細胞毒性、細胞標的化分子。 - 分子部分が結合領域を含む、請求項25に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 結合領域が、免疫グロブリン型結合領域を含むポリペプチドを含む、請求項26に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 免疫グロブリン型結合領域が、
シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域3断片、拘束FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、Fd断片、抗原結合断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作された任意の対応物
からなる群から選択される、請求項27に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。 - 分子部分が、少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、前記分子部分の少なくとも1つのアミノ酸残基と融合されている、請求項25〜28のいずれかに記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第1の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第2の細胞集団への細胞毒性、細胞標的化分子の投与によって、前記第2の細胞集団のメンバーと比較して前記第1の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性、細胞標的化分子の細胞毒性作用が少なくとも3倍大きい、請求項25〜29のいずれかに記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 結合領域が、
CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis−Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis−Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質1、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、HPV−E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトプロテイン抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD52、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、CD193、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD33、CD64、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a−c、GITRL、MHCクラスII、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、CD123、及び前述のもののいずれかの任意の免疫原性断片
からなる群から選択される細胞外標的生体分子と結合できる、請求項30に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。 - 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項31に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 配列番号51〜60のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号51〜60のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項32に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 第2の細胞標的化分子と比較してインビボ忍容性改善を示すことができる、請求項25〜33のいずれかに記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- i)少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合できる結合領域と、
ii)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフューリン切断モチーフ
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
iii)前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合している分子部分と
を含む、細胞毒性、細胞標的化分子であって、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが野生型、志賀毒素A1ポリペプチドからなることを除いて前記細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子のインビボ忍容性と比較してインビボ忍容性改善を示すことができる、前記細胞毒性、細胞標的化分子。 - 志賀毒素エフェクターポリペプチドが細胞毒性でなく、分子部分が毒性である、請求項35に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 分子部分が結合領域を含む、請求項35に記載の、細胞毒性、細胞標的化分子。
- メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第1の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第2の細胞集団への細胞毒性、細胞標的化分子の投与によって、前記第2の細胞集団のメンバーと比較して前記第1の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性、細胞標的化分子の細胞毒性作用が少なくとも3倍大きい、請求項35〜37のいずれかに記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 結合領域が、免疫グロブリン型結合領域を含むポリペプチドを含む、請求項37又は38に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 免疫グロブリン型結合領域が、
シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域3断片、拘束FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、Fd断片、抗原結合断片、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作された任意の対応物
からなる群から選択される、請求項39に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。 - 志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号4〜49のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項40に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 分子部分が、少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、前記分子部分の少なくとも1つのアミノ酸残基と融合されている、請求項35〜40のいずれかに記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 配列番号51〜60のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む、又は配列番号51〜60のいずれか1つで示されるポリペプチドから本質的になる、請求項42に記載の細胞毒性、細胞標的化分子。
- 請求項1〜43のいずれかに記載の物質の合成物と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜43のいずれかに記載の分子のポリペプチド若しくはタンパク質、若しくはその補体、又は前述のもののいずれかの断片をコードすることができるポリヌクレオチド。
- 請求項45に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項45又は46に記載のポリヌクレオチド及び発現ベクターのうちのいずれか1つを含む宿主細胞。
- 請求項1〜43のいずれかに記載の物質の合成物と、
検出促進剤と
を含む診断用組成物。 - 固体基材上に固定化されている、請求項1〜48のいずれかに記載の物質の合成物。
- i)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端に近接しているフューリン切断部位
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
ii)前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合しており、少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合できる結合領域を含む異種分子部分と
を含む分子のインビボ忍容性を改善させる方法であって、
前記フューリン切断部位を含むフューリン切断モチーフを破壊するステップを含む、前記方法。 - i)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域のカルボキシ末端に近接しているフューリン切断部位
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
ii)前記志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合しており、毒性である異種分子部分と
を含む分子のインビボ忍容性を改善させる方法であって、
前記フューリン切断部位を含むフューリン切断モチーフを破壊するステップを含む、前記方法。 - 請求項50又は51に記載の方法によって産生される分子。
- 細胞を、請求項1〜43のいずれかに記載の分子、又は請求項44に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、前記細胞を殺滅する方法。
- 接触させるステップがインビトロで行われる、請求項53に記載の方法。
- 接触させるステップがインビボで行われる、請求項53に記載の方法。
- 患者における疾患、障害又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項1〜43のいずれかに記載の分子、又は請求項44に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、前記方法。
- 疾患、障害又は状態が、がん、腫瘍、免疫障害及び微生物感染からなる群から選択される、請求項56に記載の方法。
- がんが、骨がん、乳がん、中枢/末梢神経系がん、胃腸がん、胚細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎・尿路癌、肝がん、肺/胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん及び子宮がんからなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 免疫障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、HIV関連疾患、エリテマトーデス、多発性硬化症、結節性多発性動脈炎、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎及び血管炎からなる群から選択される疾患に関連するものである、請求項57に記載の方法。
- がん、腫瘍、免疫障害又は微生物感染の治療又は予防のための、請求項1〜48のいずれかに記載の分子を含む組成物。
- がん、腫瘍、免疫障害又は微生物感染の治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項1〜48のいずれかに記載の物質の合成物の使用。
- 疾患、障害又は状態の診断、予後予測又は特性評価における、請求項1〜48のいずれかに記載の物質の合成物の使用。
- 細胞を検出する方法であって、
前記細胞を請求項48に記載の診断用組成物と接触させるステップと
前記診断用組成物の存在を検出するステップと
を含む、前記方法。 - 接触させるステップがインビトロで行われる、請求項63に記載の方法。
- 接触させるステップがインビボで行われる、請求項63に記載の方法。
- 検出するステップがインビトロで行われる、請求項63に記載の方法。
- 検出するステップがインビボで行われる、請求項63に記載の方法。
- 請求項1〜48のいずれかに記載の物質の合成物と、さらなる試薬及び/又は医薬送達デバイスとを備えるキット。
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