CN113831416A - 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够表现出有效的志贺毒素功能(例如，亚细胞路线递送和细胞毒性)的包含志贺毒素效应子多肽的耐受蛋白酶切割的分子。本发明也提供用于靶向特定细胞型(例如，感染的或恶性细胞)的耐受蛋白酶切割的、细胞靶向的分子。本发明的某些分子是细胞毒性的，并且本发明的某些细胞靶向分子可以用于靶向性杀死特定的细胞型和治疗多种疾病、病症和病患，包括癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。与包含蛋白酶切割敏感性的野生型志贺毒素效应子多肽的相关细胞靶向分子相比，本发明的某些细胞靶向分子表现出改善的体内耐受性。本发明的细胞靶向分子可以将另外的物质(诸如，例如，抗原，细胞毒性剂和检测促进剂)递送到靶细胞内部。

Description

耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽和包含其的细 胞靶向分子
本申请是申请日为2015年6月10日、发明名称为“耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子”的中国专利申请No.201580040778.8的分案申请。
发明领域
本发明涉及来源于天然存在的志贺毒素的A亚基的志贺毒素效应子多肽和包含其的细胞靶向分子，其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端附近存在破坏的弗林蛋白酶切割位点，并且，任选地，存在与志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端相连的分子结构部分。本文所述的志贺毒素效应子多肽作为细胞靶向分子(例如，治疗剂和/或诊断剂)的成分是有益的。例如，本文所述的志贺毒素效应子多肽可以用作细胞毒性的细胞靶向分子(例如，免疫毒素和配体-毒素融合体)的成分，以用于靶向杀死特定的细胞类型。本发明的分子在施用到生物体中后可以具有减少的非特异性毒性，但是对特异性靶向的细胞毒性没有任何明显的作用。另外，本发明的分子在制备、存储和施用过程中可以具有提高的稳定性。本发明的某些分子包含用于调节细胞靶向的结合区和用于实现细胞毒性的催化活性的志贺毒素效应子多肽。本发明的分子具有，例如，作为治疗剂和诊断剂的成分的用途，用于诊断、预后和治疗多种疾病、病症和病患，包括癌症、肿瘤、免疫病症和微生物感染。
背景
已经通过合理改变毒素的结构、特征和生物学活性改造志贺毒素以用于治疗应用(例如，参见专利US7713915，EP1051482，EP1727827，EP1945660；和专利申请：US2009/0156417 A1，EP2228383 B1，EP2402367 A1，US2013/0196928 A1，WO 2014/164680，WO2014/164693，WO 2015/113005，WO 2015/113007，WO 2015/120058，WO 2015/138435，和WO2015/138452，它们通过引用分别完全结合在本文中)。志贺毒素及其成分可以用于改造治疗分子，诸如，例如，免疫毒素和配体-毒素融合体，其利用志贺毒素的高细胞毒性与用于在体内精确靶向的高亲和力靶标结合的组合。尤其是，即使截短或融合到其他蛋白结构域上，志贺毒素的催化性A亚基也是稳定的、有酶活性和细胞毒性的(Haddad J等人，J Bacteriol175:4970-8(1993)；Backer M等人，J Control Release 74:349-55(2001)；Backer M，Backer J，Bioconjug Chem 12:1066-73(2001)；LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。当设计包含志贺毒素A亚基多肽的合成分子时，志贺毒素中毒性的天然机制可能是重要的考虑。
多种细菌毒素依赖于宿主细胞细胞内蛋白酶的位点特异性加工才有最佳的细胞毒性，诸如，例如，用于毒素激活和/或亚细胞路线递送(参见，例如Thomas G，Nat Rev MolCell Biol 3:753-66(2002))。志贺毒素利用位点特异性切割进行毒素激活和亚细胞路线递送(subcellular routing)二者。志贺毒素活性通过蛋白水解切割增加(Brown J等人，FEBS Lett 117:84-8(1980)；Reisbig R等人，J Biol Chem 256:8739-44(1981))。为了最有效地杀死中毒的细胞，在中毒的细胞中，志贺毒素需要内切蛋白酶弗林蛋白酶对其A亚基进行细胞内切割(Garred
Figure BDA0003274689110000021
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000022
等人，J BiolChem 270:10817-21(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。为了提供最大的志贺毒素细胞毒性所需要的最有效的毒素激活和/或亚细胞路线递送，在包含志贺毒素A亚基来源的成分的分子的设计中必须考虑这一蛋白水解加工(参见Garred
Figure BDA0003274689110000023
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，BiochemBiophys Res Commun 357:144-9(2007))。
相关蛋白毒素的志贺毒素家族，特别是从痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和大肠杆菌(E.coli)分离的毒素，由多种天然存在的结构和功能相关的毒素构成(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000024
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素家族的成员共有相同的整体结构和作用机制(Engedal，N等人，Microbial Biotech 4:32-46(2011))。在感染宿主过程中，志贺毒素家族的成员被细菌用作毒力因子(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000031
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。在被感染的宿主中，由于毒素有效的抑制蛋白合成和促进凋亡细胞死亡的能力，志贺毒素是细胞毒性的(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000032
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素对宿主细胞的有效的细胞毒性作用可以在人中导致出血性大肠炎(hemorrhagic colitis)和溶血性尿毒性综合征(hemolytic uremic syndrome)(JohannesL，
Figure BDA0003274689110000033
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。
志贺毒素家族的成员共有以志贺蛋白亚基的A(B)5排列为特征的相同的、多中心的蛋白结构(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000034
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。每种志贺毒素由两种蛋白亚基A和B组成，它们以A(B)5排列结合形成全毒素蛋白复合物。志贺毒素A亚基是约32-33千道尔顿(kDa)的包含酶结构域的单体，志贺毒素B亚基是约7.6-7.7kDa的亚基，其与另外四个志贺毒素B亚基结合形成约38.1-38.5kDa的志贺毒素B亚基五聚体。B亚基的五聚体与一个A亚基结合形成志贺全毒素，其约为70-72kDa(O’Brien A，Holmes，R，Microbiol Rev 51:206-20(1987))。整体上，志贺毒素A亚基形成单个球形蛋白，该球形蛋白具有延伸到全毒素内的B亚基五聚体中的螺旋(Fraser M等人，Acta Crystallogr SectF Struct Biol Cryst Commun 62:627-30(2006))。
通过志贺毒素进行的有效的细胞杀死需要内切蛋白酶弗林蛋白酶将志贺毒素A亚基在细胞内切割成保守的、表面暴露的、延伸的环结构(Garred
Figure BDA0003274689110000035
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000036
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun357:144-9(2007))。弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基的氨基端片段称为志贺毒素“A1片段”(或Stxn-A1，SLTn-A1，SLT-nA1)，A亚基的羧基端片段称为志贺毒素“A2片段”。志贺毒素A1片段是约为27.5kDa的多肽，其包含志贺毒素的催化结构域(Fraser M等人，Nat StructBiol 1:59-64(1994))。
只有志贺毒素A1片段位于中毒细胞的细胞溶胶中，而志贺毒素A2片段和B亚基保持在内质网中(Tam P，Lingwood C，Microbiology 153:2700-10(2007))。志贺毒素A亚基在该保守的、延伸的环结构处的蛋白水解切割有助于催化性A1片段的释放和A1片段到细胞溶胶的亚细胞路线递送(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000041
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素A2片段是约4.5-4.7kDa的多肽，对于催化活性其是多余的(Haddad J等人，JBacteriol 175:4970-8(1993)；Backer M等人，J Control Release 74:349-55(2001)；Backer M，Backer J，Bioconjug Chem 12:1066-73(2001)；LaPointe P等人，J Biol Chem280:23310-18(2005)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。
弗林蛋白酶是一种由宽泛种类的细胞型、在所检验的所有人组织中和由大部分动物细胞表达的专门的丝氨酸内切蛋白酶(参见Shiryaev S等人，J Biol Chem 282:20847-53(2007))。弗林蛋白酶切割包含通常在最小的、二元共有基序R-x-(R/K/x)-R中心上的可及基序的多肽(Thomas G，Nat Rev Mol Cell Biol 3:735-66(2002)；Tian S，BiochemInsights 2:9-20(2009))。志贺毒素家族成员的A亚基包含保守的、表面暴露的、延伸的环结构(例如，在StxA和SLT-1A中的242-261，和在SLT-2中的241-260)，该结构具有被弗林蛋白酶切割的保守的S-R/Y-x-x-R基序(Garred
Figure BDA0003274689110000042
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000043
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem BiophysRes Commun 357:144-9(2007)；Faqerquist C，Sultan O，J Biomed Biotechnol 2010:123460(2010))。位于StxA中氨基酸残基242-261处的表面暴露的、延伸的环结构是弗林蛋白酶诱导的StxA切割所需要的，包括侧连最小的、弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R的特征(Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。
在志贺毒素中毒过程中，A亚基在保守的精氨酸残基的羧基键被弗林蛋白酶蛋白水解切割(例如，在StxA与SLT-1A中位置251的精氨酸残基和在Stx2A与SLT-2A中位置250的精氨酸残基)(Garred
Figure BDA0003274689110000044
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000045
等人，J BiolChem 270:10817-21(1995)；Faqerquist C，Sultan O，J Biomed Biotechnol 2010:123460(2010))。志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割发生在内质网和/或高尔基区室中(Garred
Figure BDA0003274689110000046
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun357:144-9(2007))。
志贺毒素A1片段与A2片段的解离是激活A1片段的催化结构域所需要的(Garred
Figure BDA0003274689110000051
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000052
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。志贺毒素的催化结构域在弗林蛋白酶切割之前是没有活性的，这可能是由于A亚基的A2部分封闭了A1部分的活性位点，A2蛋白的甲硫氨酸-260伸到A1部分的活性位点缝(active site cleft)中并且封闭该活性位点(Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；还参见Fraser M等人，Nat Struct Biol 1:59-64(1994))。
志贺毒素A1片段与A2片段和志贺全毒素其余部分的解离是将A1片段从内质网腔转运到细胞溶胶中所需要的(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。A1片段的释放暴露疏水结构域，其促进一系列的复杂步骤：1)内质网相关的降解(ERAD)系统识别A1片段，2)解折叠，3)穿过内质网膜逆向转运(retrotranslocation)，和4)在细胞溶胶中重新折叠成催化形式(Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。
首先，在弗林蛋白酶切割并从志贺全毒素其余部分释放后暴露的志贺毒素A1片段的羧基端被ERAD系统识别。ERAD系统识别ER中末端错误折叠的蛋白，用聚泛蛋白标记它们，并且将它们运输到细胞溶胶中进行蛋白酶体破坏(Smith M等人，Science 334:1086-90(2011))。通过由位于弗林蛋白酶切割产生的A1片段的羧基端的包含一段相对疏水的氨基酸残基的局部错误折叠的多肽区模拟解折叠的ERAD底物，志贺毒素的A1片段利用ERAD途径获得到细胞溶胶的通路(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Yu M，Haslam D，Infect Immun 73:2524-32(2005)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。在通过弗林蛋白切割暴露的志贺毒素A1片段羧基端附近的部分解折叠的疏水性氨基酸残基片段可以被ERAD系统的内质网伴侣蛋白识别(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Yu M，Haslam D，Infect Immun 73:2524-32(2005)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。
当志贺毒素A1片段首先进入中毒的真核细胞的细胞溶胶中时，据信其是聚泛蛋白化的，并且由于未折叠，其处于基本上无序的构象，因此A1片段必须避免蛋白酶体降解，并且再折叠成催化活性构象，从而发挥它们的细胞毒性催化活性(Tam P，Lingwood C，Microbiology 153:2700-10(2007)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。一旦处于细胞溶胶中，活性志贺毒素A1片段能够通过A1片段的有力的酶促活性，以每分钟约700个核糖体的速率不可逆地依次严重消弱真核核糖体(Brigotti M等人，Toxicon 35:1431–1437(1997)；Tam P，Lingwood C，Microbiology 153:2700-10(2007))。当阈值数量的核糖体失活后，预计中毒的宿主细胞在蛋白合成中经历充分的减少，从而通过细胞凋亡诱导细胞死亡(Iordanov M等人，Mol Cell Biol 17:3373-81(1997)；Smith W等人，Infect Immun 71:1497-504(2003)；Lee S等人，Cell Microbiol 10:770-80(2008)；Tesh V，FutureMicrobiol 5:431-53(2010))。
志贺毒素A亚基在A1和A2片段之间的细胞内弗林蛋白酶切割对最大的志贺毒素细胞毒性是重要的。实验表明，最大的志贺全毒素细胞毒性要求：1)位于志贺毒素A亚基的A1和A2片段之间的最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R；2)志贺毒素A亚基的包含最小的弗林蛋白酶切割位点的表面暴露的延伸的环结构中的某些氨基酸残基；以及3)中毒的脊椎动物细胞的弗林蛋白酶的细胞表达。
保护缺乏弗林蛋白酶的人类细胞以免受志贺毒素细胞毒性的伤害，并且通过强迫表达弗林蛋白酶，可以使这些相同的弗林蛋白酶缺陷型细胞变成志贺毒素敏感的(Garred
Figure BDA0003274689110000061
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys ResCommun 357:144-9(2007))。
已证明弗林蛋白酶在某些人类癌细胞中是最大的志贺毒素细胞毒性必需的(Garred
Figure BDA0003274689110000062
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem BiophysRes Commun 357:144-9(2007))。具有破坏的弗林蛋白酶切割位点和/或在保守的表面暴露的延伸的环结构中的突变的志贺毒素表现出降低的细胞毒性。以氨基酸残基取代或缺失破坏志贺毒素A亚基的表面暴露的延伸的环中的S-R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序在脊椎动物细胞中导致效率较低的A亚基切割和效率较低的核糖体抑制(Burgess B，Roberts L，MolMicrobiol 10:171-9(1993)；Garred
Figure BDA0003274689110000063
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun357:144-9(2007))。破坏SLT-1的A亚基中的弗林蛋白酶切割基序将其核糖体抑制活性降低60倍(Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999))。另外，在不破坏最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R的情况下破坏弗林蛋白酶切割基序的侧翼区也降低Stx的核糖体抑制活性(Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。
在使细胞中毒前，在体外用弗林蛋白酶预处理志贺全毒素，可以增强耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素突变体和弗林蛋白酶缺陷型细胞的志贺毒素细胞毒性。可用弗林蛋白酶在体外有效切割志贺毒素A亚基(Garred
Figure BDA0003274689110000075
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995))。在向弗林蛋白酶缺陷型人类细胞施用前，在体外用弗林蛋白酶进行预处理Stx使核糖体抑制活性增加30-50倍(Garred
Figure BDA0003274689110000071
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。类似地，与用未处理的耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素中毒的脊椎动物细胞相比，在体外用胰蛋白酶预处理耐受弗林蛋白酶切割的突变志贺毒素增加中毒的脊椎动物细胞中的核糖体抑制(Kurmanova A等人，BiochemBiophys Res Commun 357:144-9(2007))。
A1片段与A2片段的解离可能是激活A1片段的催化结构域所需的(Garred
Figure BDA0003274689110000072
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000073
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。志贺毒素的催化结构域在弗林蛋白酶切割之前可能是没有活性的，这是因为催化结构域在空间上受阻(Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；还参见Fraser M等人，Nat Struct Biol 1:59-64(1994))。
志贺毒素细胞毒性的模型是，在中毒细胞中弗林蛋白酶对志贺毒素A亚基的细胞内蛋白水解加工对于以下各项必要的：1)从志贺全毒素的其余部分释放A1片段；2)通过暴露A1片段羧基端的疏水结构域，使A1片段逃离内质网；以及3)酶促激活A1片段(参见Johannes L，
Figure BDA0003274689110000074
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。在中毒细胞的内质网中，使志贺毒素A1片段从A2片段以及志贺全毒素其余成分释放，对于向细胞溶胶的有效细胞内途径发送、最大的酶促活性、有效的核糖体失活以及实现最佳细胞毒性(即与野生型志贺毒性相当)是必要的。
使志贺毒素A1片段从所有其他结构部分释放对于以下而言是必需的：1)暴露A1片段的羧基端，以被中毒细胞内质网中的细胞因子识别；以及2)使催化活性最大化。
暴露A1片段的羧基端需要释放志贺毒素A1片段。认为位于StxA的A1片段的羧基端区域中224-241周围的疏水区在A1片段从内质网的腔向细胞溶胶的逆向转运中发挥作用(Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66:5252-9(1998)；LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在切割Stx1A和Stx2A中的志贺毒素A亚基后，该疏水区中的若干氨基残基变得更加表面可及(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。因此，志贺毒素A1片段的释放和其羧基端疏水区的暴露可能引发A1片段从内质网向细胞溶胶的运输(Suhan M，HovdeC，Infect Immun 66:5252-9(1998)；LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。另外，A1片段的羧基端可能发挥作为被内质网受体识别和结合的配体的功能，而不是伴侣蛋白，这有助于A1片段的有效逆向转运(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
增强志贺毒素A1片段的细胞毒性的结构变化可能发生在A1片段从所有其他结构部分释放后。游离的志贺毒素A1片段可以表现出最佳的催化活性，诸如，例如通过暴露包埋在志贺全毒素结构中的某些催化区(参见Tesh V等人，Infect Immun 61:3392-402(1993)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。在蛋白水解切割和暴露于还原条件后志贺毒素的催化激活，或在蛋白水解加工和暴露于还原条件后志贺毒素毒性的增强，最有可能是A1片段与A2片段分离的结果(Tesh V等人，Infect Immun 61:3392-402(1993))。在从志贺全毒素其余部分解离后志贺毒素A1片段的结构变化可能与功能性变化有关，诸如，例如形成新折叠的结构的能力，所述结构在被ERAD机制解折叠和易位到细胞溶胶后更具催化活性，细胞溶胶A1片段逃避蛋白酶体降解的能力，以及形成增强酶促活性的、具有更开放的催化活性位点和/或结合缝(binding clefts)的结构的能力(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。
例如，在志贺毒素A1片段释放之后，Stx1A中的催化残基N75和Y77变得更加溶剂暴露，并且在A1片段释放后，Stx1和Stx2二者的A1片段羧基端氨基酸残基位置205-250周围的许多残基可能经历显著的表面可及性变化(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。尤其是，在志贺毒素A1片段释放之后，Stx1A的240-251区中和Stx2A的239-250区中的氨基酸残基表现出显著的表面暴露性增加(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。另一个实例是，在志贺毒素A1片段释放后，Stx2A的区域42-49和246-250中的氨基酸残基变得更加溶剂暴露(Smith M等人，Infect Immun 77:2730-40(2009)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。因此，由于结构和功能的变化，志贺毒素A1片段从所有其他结构部分的释放可能是最大的志贺毒素细胞毒性所必需的，所述结构和功能的变化增强A1片段到中毒细胞的细胞溶胶的亚细胞路线递送，中毒细胞的细胞溶胶中A1片段的酶促活性，以及A1片段在中毒细胞的细胞溶胶中的持久性。
总之，相信最大的志贺毒素细胞毒性需要志贺毒素A亚基的切割，邻近A1片段羧基端的疏水区域在内质网中暴露，和A1片段从全毒素的其余部分释放，所有这些可能导致A1片段的多种结构和功能变化。另外，相信志贺毒素A1片段到细胞溶胶的最佳细胞内转运需要相同的事件：A亚基切割，A1片段羧基端的暴露，和A1片段从所有其他分子结构部分的释放。在不存在志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割的条件下，可能发生志贺毒素催化结构域的亚细胞路线递送，但是不是最优的、有效性较低，并且导致核糖体抑制功效降低(Garred
Figure BDA0003274689110000091
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007)。
由于在中毒的脊椎动物细胞中志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶蛋白水解加工对于最大的细胞毒性是至关重要的，因此，当设计来源于志贺毒素A亚基的细胞毒性分子时，保持或补偿该天然存在的蛋白水解加工对于保持最大的志贺毒素细胞活性是重要的。没有已知的方案，该方案完全补偿包含与羧基端结构部分(其干扰志贺毒素A1片段来源的成分的天然亚细胞路线递送和/或细胞毒性)连接的耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基的结构对弗林蛋白酶切割的缺乏。
理想的是具有包含尽可能是细胞毒性的志贺毒素A亚基来源的成分的细胞毒性分子。具有包含在多种医学应用中保持杀死特定细胞型的高功效的志贺毒素效应子多肽成分的改善的细胞靶向分子也是理想的。然而，在本领域中，当细胞毒性分子包含羧基端分子结构部分，诸如，例如，细胞靶向、免疫球蛋白型结合区时，仍然需要改造包含志贺毒素A亚基来源的区域的细胞毒性分子的方式，以在施用到生物体后具有降低的非特异性毒性、改善的稳定性、增加的体内半衰期和/或改善的毒性模式。
发明概述
本发明提供多种耐受蛋白酶切割的志贺A亚基毒素效应子多肽和包含其的细胞毒性分子，其可以用作多种物质组合物的成分，诸如细胞靶向分子和诊断组合物的成分。本发明还提供多种包含与实现细胞靶向的结合区结合的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子。细胞靶向结合区与耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的结合允许改造有效的志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向和/或白细胞淤积(cytostasis)，同时改善体内耐受性。由于在给定剂量产生非特异性毒性的可能性降低，本发明的某些细胞靶向分子具有改善的作为治疗剂和/或诊断剂施用给脊椎动物的有用性。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：1)结合区，包括免疫球蛋白型结合区，其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子，和2)志贺毒素效应子多肽，其包含志贺毒素A1片段区，所述志贺毒素A1片段区具有羧基端并且在A1片段区的羧基端具有破坏的弗林蛋白酶切割基序。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区与志贺毒素效应子多肽的羧基端连接。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区与志贺毒素效应子多肽融合。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区与志贺毒素效应子多肽融合，形成单个的连续多肽。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，结合区直接或间接融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端。在某些实施方案中，分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽通过至少一个不是二硫键的共价键连接在结合区上。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区选自由下述组成的组：免疫球蛋白型结合区(sdAb)片段，纳米抗体，从骆驼科动物(camelid)来源的重链抗体结构域(VHH片段)，从软骨鱼(cartilaginous fish)来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3(CDR3)片段，受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，Fd片段，抗原结合片段(Fab)，纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalins)，Kunitz结构域，蛋白-A-来源的Z结构域，γ-B晶体蛋白-来源的结构域，泛蛋白-来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitins)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白(小蛋白)，C-型凝集素-样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，结合区能够结合细胞外靶标生物分子，所述细胞外靶标生物分子选自由下述组成的组：CD20，CD22，CD40，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAMs(例如EGP-2，EGP-40)，EphB2，前列腺特异性的膜抗原，Cripto，内皮糖蛋白，成纤维细胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，叶酸结合蛋白，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，FAP，生腱蛋白，CD64，间皮素(mesothelin)，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，人酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)，人酪氨酸酶相关蛋白2，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，前列腺干细胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD52，CD133，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，mrp-14，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，II类MHC，CD284-TLR4，CD107-Mac3，CD195-CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282-TLR2，CD11c，以及前述任一种的任意免疫原性片段。对于某些实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞施用本发明的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起细胞死亡。对于某些其他的实施方案，当向两种关于细胞外靶标生物分子的存在或水平不同的不同细胞型群体施用本发明的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够以比针对没有与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型的CD50至少三倍或更小的CD50引起与细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与显著量的结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面上表达显著量的所述细胞靶向分子结合区的靶标生物分子的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子还包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序(carboxy-terminal endoplasmic reticulumretention/retrieval signal motif)(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含选自由下述组成的组的羧基端内质网保留/回收信号基序：KDEL(SEQ ID NO:62)，HDEF(SEQ ID NO:63)，HDEL(SEQ ID NO:64)，RDEF(SEQ ID NO:65)，RDEL(SEQ ID NO:66)，WDEL(SEQ ID NO:67)，YDEL(SEQ ID NO:68)，HEEF(SEQ ID NO:69)，HEEL(SEQ ID NO:70)，KEEL(SEQ ID NO:71)，REEL(SEQ ID NO:72)，KAEL(SEQ ID NO:73)，KCEL(SEQ ID NO:74)，KFEL(SEQ ID NO:75)，KGEL(SEQ ID NO:76)，KHEL(SEQ ID NO:77)，KLEL(SEQ ID NO:78)，KNEL(SEQ ID NO:79)，KQEL(SEQ ID NO:80)，KREL(SEQ ID NO:81)，KSEL(SEQ ID NO:82)，KVEL(SEQ ID NO:83)，KWEL(SEQ ID NO:84)，KYEL(SEQ ID NO:85)，KEDL(SEQ ID NO:86)，KIEL(SEQ ID NO:87)，DKEL(SEQ ID NO:88)，FDEL(SEQ ID NO:89)，KDEF(SEQ ID NO:90)，KKEL(SEQ ID NO:91)，HADL(SEQ ID NO:92)，HAEL(SEQ ID NO:93)，HIEL(SEQ ID NO:94)，HNEL(SEQ ID NO:95)，HTEL(SEQ ID NO:96)，KTEL(SEQ ID NO:97)，HVEL(SEQ ID NO:98)，NDEL(SEQ ID NO:99)，QDEL(SEQ ID NO:100)，REDL(SEQ ID NO:101)，RNEL(SEQ ID NO:102)，RTDL(SEQ ID NO:103)，RTEL(SEQ ID NO:104)，SDEL(SEQ IDNO:105)，TDEL(SEQ ID NO:106)，和SKEL(SEQ ID NO:107)。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，志贺毒素效应子多肽包含突变，所述突变降低或消除志贺毒素效应子多肽的酶活性，但是不使至少志贺毒素效应子多肽的一部分向细胞溶胶的亚细胞路线递送减少低于野生型志贺毒素效应子多肽的亚细胞路线递送水平。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：1)志贺毒素效应子多肽，其包含志贺毒素A1片段区，所述志贺毒素A1片段区具有羧基端和在A1片段区的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序，相对于野生型志贺毒素A亚基，在最小的弗林蛋白酶切割基序中包含一个或多个突变；和2)结合区，所述结合区能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子并且与志贺毒素效应子多肽的羧基端连接。在本发明的细胞靶向分子的这些实施方案中，在最小的弗林蛋白酶切割基序中的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入或置换。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽通过至少一个不是二硫键的共价键连接到结合区上。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区直接或间接融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区与志贺毒素效应子多肽的羧基端融合，形成单个的连续多肽。在某些实施方案中，结合区在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区选自由下述组成的组：单结构域抗体(sdAb)片段，纳米抗体，从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段)，从软骨鱼来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3(CDR3)片段，受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，Fd片段，抗原-结合片段(Fab)，纤连蛋白来源的、第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度-脂蛋白-受体来源的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalins)，Kunitz结构域，蛋白-A来源的Z结构域，γ-B晶体蛋白来源的结构域，泛蛋白来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitins)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，以及保留它的结合功能性的任意前述物质的任何遗传操作的对应物。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，结合区能够结合选自由下述组成的组的细胞外靶标生物分子：CD20，CD22，CD40，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAMs(例如EGP-2，EGP-40)，EphB2，前列腺特异性膜抗原，Cripto，内皮糖蛋白，成纤维细胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，叶酸结合蛋白，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，FAP，生腱蛋白，CD64，间皮素，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，人酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)，人酪氨酸酶相关蛋白2，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，前列腺干细胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD52，CD133，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，mrp-14，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，II类MHC，CD284-TLR4，CD107-Mac3，CD195-CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282-TLR2，CD11c，以及前述任一种的任意免疫原性片段。对于本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞施用所述细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起细胞死亡。对于某些其他的实施方案，当向两种关于细胞外靶标生物分子的存在或水平不同的不同细胞型群体施用本发明的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够以比针对没有与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型的CD50至少三倍或更小的CD50引起与细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与显著量的结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面上表达显著量的所述细胞靶向分子结合区的靶标生物分子的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含SEQ ID NOs:4-36中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-36中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子还包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含选自由下述组成的组的羧基端内质网保留/回收信号基序：KDEL(SEQ ID NO:62)，HDEF(SEQ ID NO:63)，HDEL(SEQ ID NO:64)，RDEF(SEQ ID NO:65)，RDEL(SEQ ID NO:66)，WDEL(SEQ ID NO；67)，YDEL(SEQ ID NO:68)，HEEF(SEQ ID NO:69)，HEEL(SEQ ID NO:70)，KEEL(SEQ ID NO:71)，REEL(SEQ ID NO:72)，KAEL(SEQ ID NO:73)，KCEL(SEQ ID NO:74)，KFEL(SEQ ID NO:75)，KGEL(SEQ ID NO:76)，KHEL(SEQ ID NO:77)，KLEL(SEQ ID NO:78)，KNEL(SEQ ID NO:79)，KQEL(SEQ ID NO:80)，KREL(SEQ ID NO:81)，KSEL(SEQ ID NO:82)，KVEL(SEQ ID NO:83)，KWEL(SEQ ID NO:84)，KYEL(SEQ ID NO:85)，KEDL(SEQ ID NO:86)，KIEL(SEQ ID NO:87)，DKEL(SEQ ID NO:88)，FDEL(SEQ ID NO:89)，KDEF(SEQ ID NO:90)，KKEL(SEQ ID NO:91)，HADL(SEQ ID NO:92)，HAEL(SEQ ID NO:93)，HIEL(SEQ ID NO:94)，HNEL(SEQ ID NO:95)，HTEL(SEQ ID NO:96)，KTEL(SEQ ID NO:97)，HVEL(SEQ ID NO:98)，NDEL(SEQ ID NO:99)，QDEL(SEQ ID NO:100)，REDL(SEQ ID NO:101)，RNEL(SEQ ID NO:102)，RTDL(SEQ ID NO:103)，RTEL(SEQ ID NO:104)，SDEL(SEQ ID NO:105)，TDEL(SEQ ID NO:106)，和SKEL(SEQ ID NO:107)。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，志贺毒素效应子多肽包含突变，所述突变降低或消除志贺毒素效应子多肽的酶活性，但是不使至少志贺毒素效应子多肽的一部分向细胞溶胶的亚细胞路线递送减少低于野生型志贺毒素效应子多肽的亚细胞路线递送水平。
在某些实施方案中，本发明的细胞毒性分子包含志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽包含：1)具有羧基端的志贺毒素A1片段，和2)在A1片段区的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中，当第一细胞靶向分子的成分包含能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的结合区和与所述志贺毒素效应子多肽的羧基端连接的分子结构部分时，所述细胞毒性分子能够表现出与第二细胞靶向分子相等的细胞毒性，所述第二细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，不同之处在于所述志贺毒素效应子多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成。这意味着，第二细胞靶向分子包含与本发明的第一细胞靶向分子相同的结合区和相同的分子结构部分，但是不包含相同的志贺毒素效应子多肽，第二细胞靶向分子包含野生型志贺毒素效应子多肽，所述野生型志贺毒素效应子多肽包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1-251，或SEQ ID NO:3的氨基酸1-250)和在所述野生型志贺毒素效应子多肽的A1片段区羧基端的野生型弗林蛋白酶切割位点；其中与野生型志贺毒素A1多肽的羧基端连接的分子结构部分具有与在第一细胞靶向分子中相同的连接。在某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含至少一个直接或间接融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在某些实施方案中，所述分子结构部分包含来源于天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段的肽和/或多肽。在某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽通过至少一个不是二硫键的共价键连接在所述分子结构部分上。在某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的多肽，形成单个连续的多肽。在本发明的细胞毒性分子的某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个突变，所述突变改变天然位于1)志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)的248-251，或2)志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)的247-250的区域中的至少一个氨基酸残基。在本发明的细胞毒性分子的某些其他实施方案中，所述突变是用不带正电荷的氨基酸残基置换精氨酸残基的氨基酸残基置换。在本发明的细胞毒性分子的某些其他实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽包含SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽组成。在本发明的细胞毒性分子的某些其他实施方案中，与第二细胞靶向分子相比，第一细胞靶向分子能够表现出改善的体内耐受性。在本发明的细胞毒性分子的某些其他实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应子多肽包含突变，所述突变降低或消除志贺毒素效应子多肽的酶活性，但是不使至少志贺毒素效应子多肽的一部分向细胞溶胶的亚细胞路线递送减少低于野生型志贺毒素效应子多肽的亚细胞路线递送水平。
在本发明的细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:2所示的多肽组成，其还包含下述两个氨基酸残基置换：R248H和R251H。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个氨基酸残基置换：R248H和R251H。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述两个氨基酸残基置换：R248G和R251G。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个氨基酸残基置换：R248G和R251G。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，A253G，和S254A。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，A253G，和S254A。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，R248G，R251G，A253G，和S254A。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，R248G，R251G，A253G，和S254A。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:2所示的多肽组成，其还包含天然位于247-252的区域的缺失。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含含有天然位于247-252的区域的缺失的志贺毒素效应子多肽。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ IDNO:2所示的多肽组成，其还包含下述两个缺失：245-247和253-255。在细胞毒性分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个缺失：245-247和253-255。
在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子包含：1)能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的结合区，2)志贺毒素效应子多肽，其包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区和在A1片段区的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序，和3)与志贺毒素效应子多肽的羧基端连接的分子结构部分；并且，其中所述细胞毒性的细胞靶向分子能够表现出与第二细胞靶向分子相等的细胞毒性，所述第二细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，不同之处在于所述志贺毒素效应子多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成。这意味着，第二细胞靶向分子包含与本发明的细胞毒性的细胞靶向分子相同的结合区和相同的分子结构部分，但是不包含相同的志贺毒素效应子多肽，第二细胞靶向分子包含野生型志贺毒素效应子多肽，所述野生型志贺毒素效应子多肽包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区和在所述野生型志贺毒素效应子多肽的A1片段区羧基端的野生型弗林蛋白酶切割位点；其中与野生型志贺毒素A1多肽的羧基端连接的分子结构部分具有与在第一细胞靶向分子中相同的连接。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含结合区。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子结构部分包含来源于天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段的肽和/或多肽。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述结合区包含含有免疫球蛋白型结合区的多肽。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区选自由下述组成的组：单结构域抗体(sdAb)片段，纳米抗体，从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段)，从软骨鱼来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3(CDR3)片段，受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，Fd片段，抗原-结合片段(Fab)，纤连蛋白来源的、第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度-脂蛋白-受体来源的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalins)，Kunitz结构域，蛋白-A来源的Z结构域，γ-B晶体蛋白来源的结构域，泛蛋白来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitins)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽通过至少一个不是二硫键的共价键连接到分子结构部分上。
在某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含至少一个融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的氨基酸残基。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含融合在志贺毒素效应子多肽羧基端的多肽，形成单个连续的多肽。对于某些实施方案，当向两种关于细胞外靶标生物分子的存在或水平不同的不同细胞型群体施用本发明的细胞毒性的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够以比针对没有与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型观察到的CD50低至少三倍的CD50引起与细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与显著量的结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面上表达显著量的所述细胞靶向分子结合区的靶标生物分子的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述结合区能够结合选自由下述组成的组的细胞外靶标生物分子：CD20，CD22，CD40，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAMs(例如EGP-2，EGP-40)，EphB2，前列腺特异性膜抗原，Cripto，内皮糖蛋白，成纤维细胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，叶酸结合蛋白，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，FAP，生腱蛋白，CD64，间皮素，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，人酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)，人酪氨酸酶相关蛋白2，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，前列腺干细胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD52，CD133，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，mrp-14，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，II类MHC，CD284-TLR4，CD107-Mac3，CD195-CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282-TLR2，CD11c，以及前述任一种的任意免疫原性片段。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子包含SEQ IDNOs:50-61中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子还包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含选自由下述组成的组的羧基端内质网保留/回收信号基序：KDEL(SEQ ID NO:62)，HDEF(SEQ ID NO:63)，HDEL(SEQ ID NO:64)，RDEF(SEQ ID NO:65)，RDEL(SEQ ID NO:66)，WDEL(SEQ ID NO:67)，YDEL(SEQ ID NO:68)，HEEF(SEQ ID NO:69)，HEEL(SEQ ID NO:70)，KEEL(SEQ ID NO:71)，REEL(SEQ ID NO:72)，KAEL(SEQ ID NO:73)，KCEL(SEQ ID NO:74)，KFEL(SEQ ID NO:75)，KGEL(SEQ ID NO:76)，KHEL(SEQ ID NO:77)，KLEL(SEQ ID NO:78)，KNEL(SEQ ID NO:79)，KQEL(SEQ ID NO:80)，KREL(SEQ ID NO:81)，KSEL(SEQ ID NO:82)，KVEL(SEQ ID NO:83)，KWEL(SEQ ID NO:84)，KYEL(SEQ ID NO:85)，KEDL(SEQ ID NO:86)，KIEL(SEQ ID NO:87)，DKEL(SEQ ID NO:88)，FDEL(SEQ ID NO:89)，KDEF(SEQ ID NO:90)，KKEL(SEQ ID NO:91)，HADL(SEQ ID NO:92)，HAEL(SEQ ID NO:93)，HIEL(SEQ ID NO:94)，HNEL(SEQ ID NO:95)，HTEL(SEQ ID NO:96)，KTEL(SEQ ID NO:97)，HVEL(SEQ ID NO:98)，NDEL(SEQ ID NO:99)，QDEL(SEQ ID NO:100)，REDL(SEQ ID NO:101)，RNEL(SEQ IDNO:102)，RTDL(SEQ ID NO:103)，RTEL(SEQ ID NO:104)，SDEL(SEQ ID NO:105)，TDEL(SEQID NO:106)，和SKEL(SEQ ID NO:107)。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，与第二细胞靶向分子相比，所述细胞靶向分子能够表现出改善的体内耐受性。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应子多肽包含突变，所述突变降低或消除志贺毒素效应子多肽的酶活性，但是不使至少志贺毒素效应子多肽的一部分向细胞溶胶的亚细胞路线递送减少低于野生型志贺毒素效应子多肽的亚细胞路线递送水平。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有免疫细胞表面受体的片段的羧基端结合区。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区不包含人免疫细胞表面共受体的片段。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述结合区不包含人CD4，I型跨膜糖蛋白的片段。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含融合到包含对应于氨基酸残基19-183的人CD4的片段的羧基端结合区上的包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-247、SEQ ID NO:2的45-247和/或SEQID NO:2的75-247的志贺毒素效应子多肽。
在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子包含：1)能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的结合区；2)志贺毒素效应子多肽，其包含具有羧基端的志贺毒素A1片段和位于A1片段区的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；和3)与志贺毒素效应子多肽连接的分子结构部分；并且，其中与第二细胞靶向分子的体内耐受性相比(所述第二细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，不同之处在于所述志贺毒素效应子多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成)，所述细胞毒性的细胞靶向分子能够表现出改善的体内耐受性。这意味着，第二细胞靶向分子包含与本发明的细胞毒性的细胞靶向分子相同的结合区和相同的分子结构部分，但是不包含相同的志贺毒素效应子多肽，第二细胞靶向分子包含野生型志贺毒素效应子多肽，所述野生型志贺毒素效应子多肽包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区和在所述野生型志贺毒素效应子多肽的A1片段区羧基端的野生型弗林蛋白酶切割位点；其中与野生型志贺毒素A1多肽的羧基端连接的分子结构部分具有与在第一细胞靶向分子中相同的连接。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽不是细胞毒性的，并且分子结构部分是毒性的。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区在空间上覆盖A1片段区的羧基端。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子结构部分包含结合区。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽通过至少一个不是二硫键的共价键连接到分子结构部分上。在某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含至少一个融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的氨基酸残基。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含融合在志贺毒素效应子多肽羧基端的多肽，形成单个连续的多肽。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子结构部分包含来源于天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段的肽和/或多肽。对于某些其他实施方案，当向两种关于细胞外靶标生物分子的存在或水平不同的不同细胞型群体施用本发明的细胞毒性的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够以比针对没有与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型观察到的CD50低至少三倍的CD50引起与细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与显著量的结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，当将本发明的细胞毒性的细胞靶向分子施用给第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面上表达显著量的所述细胞靶向分子结合区的靶标生物分子的第二细胞群体时，相对于所述第二细胞群体的成员，细胞靶向分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区包含含有免疫球蛋白型结合区的多肽。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区选自由下述组成的组：单结构域抗体(sdAb)片段，纳米抗体，从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段)，从软骨鱼来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3(CDR3)片段，受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，Fd片段，抗原-结合片段(Fab)，纤连蛋白来源的、第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度-脂蛋白-受体来源的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalins)，Kunitz结构域，蛋白-A来源的Z结构域，γ-B晶体蛋白来源的结构域，泛蛋白来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitins)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽包含SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-49中任一项所示的多肽组成。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述分子结构部分包含至少一个直接或间接融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的氨基酸残基。在某些其他实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子包含SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:50-61中任一项所示的多肽组成。在某些其他实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子还包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)。在某些其他实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子包含选自由下述组成的组的羧基端内质网保留/回收信号基序：KDEL(SEQ ID NO:62)，HDEF(SEQ ID NO:63)，HDEL(SEQ ID NO:64)，RDEF(SEQ ID NO:65)，RDEL(SEQ ID NO:66)，WDEL(SEQ ID NO:67)，YDEL(SEQ ID NO:68)，HEEF(SEQ ID NO:69)，HEEL(SEQ ID NO:70)，KEEL(SEQ ID NO:71)，REEL(SEQ ID NO:72)，KAEL(SEQ ID NO:73)，KCEL(SEQ ID NO:74)，KFEL(SEQ ID NO:75)，KGEL(SEQ ID NO:76)，KHEL(SEQ ID NO:77)，KLEL(SEQ ID NO:78)，KNEL(SEQ ID NO:79)，KQEL(SEQ ID NO:80)，KREL(SEQ ID NO:81)，KSEL(SEQ ID NO:82)，KVEL(SEQ ID NO:83)，KWEL(SEQ ID NO:84)，KYEL(SEQ ID NO:85)，KEDL(SEQ ID NO:86)，KIEL(SEQ ID NO:87)，DKEL(SEQ ID NO:88)，FDEL(SEQ ID NO:89)，KDEF(SEQ ID NO:90)，KKEL(SEQ ID NO:91)，HADL(SEQ ID NO:92)，HAEL(SEQ ID NO:93)，HIEL(SEQ ID NO:94)，HNEL(SEQ ID NO:95)，HTEL(SEQ ID NO:96)，KTEL(SEQ ID NO:97)，HVEL(SEQ ID NO:98)，NDEL(SEQ ID NO:99)，QDEL(SEQ ID NO:100)，REDL(SEQ ID NO:101)，RNEL(SEQ ID NO:102)，RTDL(SEQ ID NO:103)，RTEL(SEQ IDNO:104)，SDEL(SEQ ID NO:105)，TDEL(SEQ ID NO:106)，和SKEL(SEQ ID NO:107)。在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应子多肽包含突变，所述突变降低或消除志贺毒素效应子多肽的酶活性，但是不使至少志贺毒素效应子多肽的一部分向细胞溶胶的亚细胞路线递送减少低于野生型志贺毒素效应子多肽的亚细胞路线递送水平。
在某些实施方案中，不管是有细胞毒性的还是没有细胞毒性的，本发明的细胞靶向分子不包含天然存在的志贺毒素B亚基。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含任何含有天然的志贺毒素B亚基的功能结合结构域或由其组成的多肽。相反，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素A亚基来源的区域与异源性结合区功能性连接，以实现细胞靶向。
在某些实施方案中，不管是有细胞毒性的还是没有细胞毒性的，本发明的细胞靶向分子不包含志贺毒素家族成员的任何志贺毒素A2片段或其功能片段。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在破坏的弗林蛋白酶切割基序的羧基端不包含任何来自天然的野生型志贺毒素A2片段的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的细胞毒性分子不包含志贺毒素家族成员的任何志贺毒素A2片段或其功能片段。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性分子在破坏的弗林蛋白酶切割基序的羧基端不包含任何来自天然的野生型志贺毒素A2片段的氨基酸序列。
在本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:2所示的多肽组成，其还包含下述两个氨基酸残基置换：R248H和R251H。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个氨基酸残基置换：R248H和R251H。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述两个氨基酸残基置换：R248G和R251G。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个氨基酸残基置换：R248G和R251G。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，A253G，和S254A。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，A253G，和S254A。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:1所示的多肽组成，其还包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，R248G，R251G，A253G，和S254A。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述全部的氨基酸残基置换：A246G，S247A，R248G，R251G，A253G，和S254A。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:2所示的多肽组成，其还包含天然位于247-252的区域的缺失。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含含有天然位于247-252的区域的缺失的志贺毒素效应子多肽。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不是由SEQ ID NO:2所示的多肽组成，其还包含下述两个缺失：245-247和253-255。在细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽不包含下述两个缺失：245-247和253-255。
本发明还提供包含本发明的分子和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物；和所述分子或包含其的组合物在制备所述药物组合物和在本发明进一步所述的方法中的应用。在本发明的某些实施方案中，是包含本发明的任一细胞毒性分子和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物。
除了本发明的分子以外，能够编码前述任一项(例如，包含本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽或蛋白的多肽)的多核苷酸也在本发明范围内，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的表达载体的宿主细胞。包含表达载体的宿主细胞可以用在例如通过重组表达生产本发明的分子(例如，多肽或蛋白)或其多肽成分或片段的方法中。
本发明还包括本发明的物质的任意组合物，其固定在固体基底上。本发明的物质的组合物的此种设置可以用在例如筛选本文所述的分子的方法中。
除了本发明的物质的组合物之外，本发明涉及多种方法，诸如，例如，使用本发明的物质的组合物的方法和/或产生本发明的物质的组合物的方法。
在本发明的某些实施方案中，是用于改善分子的体内耐受性和/或体外稳定性的方法，所述方法包括：1)志贺毒素效应子多肽，其包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区和邻近A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位点，和2)异源的分子结构部分，其连接在志贺毒素效应子多肽的羧基端并且包含能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的结合区；所述方法包括破坏包含弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序的步骤。在该方法的某些实施方案中，所述破坏步骤包括产生降低志贺毒素效应子多肽的羧基端的蛋白酶切割敏感性的突变、截短和/或氨基酸功能基团修饰。在该方法的某些实施方案中，所述异源的分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。本发明还包括使用这种方法产生的任何分子，与在邻近A1片段区的羧基端包含未破坏的弗林蛋白酶切割基序的母本分子相比，所述分子能够表现出改善的体内耐受性。
在本发明的某些实施方案中，是用于改善分子的体内耐受性和/或体外稳定性的方法，所述方法包括：1)志贺毒素效应子多肽，其包含具有羧基端的志贺毒素A1片段区和邻近A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位点，和2)异源的分子结构部分，其连接在志贺毒素效应子多肽的羧基端并且是有毒的；所述方法包括破坏包含弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序的步骤。在该方法的某些实施方案中，所述破坏步骤包括产生降低志贺毒素效应子多肽的羧基端的蛋白酶切割敏感性的突变、截短和/或氨基酸功能基团修饰。在该方法的某些实施方案中，所述异源的分子结构部分在空间上覆盖A1片段区的羧基端。本发明还包括使用这种方法产生的任何分子，与在邻近A1片段区的羧基端包含未破坏的弗林蛋白酶切割基序的母本分子相比，所述分子能够表现出改善的体内耐受性。
在本发明的某些实施方案中，是杀伤细胞的方法，所述方法包括使细胞与本发明上述细胞靶向分子中任一种或本发明上述药物组合物接触的步骤。在某些实施方案中，所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。在细胞杀伤方法的其他实施方案中，当接触关于蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子的细胞外存在和/或表达水平不同的细胞混合物时，所述方法能够比其他细胞和/或细胞型优先选择性杀伤细胞和/或细胞型。
本发明还提供治疗患者中的疾病、病症和/或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的分子或药物组合物。在某些实施方案中，使用本发明的这种方法治疗的疾病、病症或病患选自：癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染。在这种方法的某些实施方案中，要治疗的癌症选自由下述组成的组：骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。在这种方法的某些实施方案中，要治疗的免疫病症是与选自由以下组成的组的疾病有关的免疫病症：淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病、移植排斥(graft rejection)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒性综合征(hemolytic uremic syndrome)、HIV-相关的疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、多发性动脉炎(polyarteritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriaticarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、脓毒性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)和血管炎(vasculitis)。
在本发明的某些实施方案中，是包含本发明的分子(例如，多肽或蛋白)的组合物、包含本发明的分子的化合物、或本发明的组合物(例如，药物组合物)用于治疗或预防癌症、免疫病症或微生物感染。在本发明的某些实施方案中，是本发明的化合物(例如，蛋白)或组合物在制备用于治疗或预防癌症、免疫病症或微生物感染的药物中的应用。
本发明的分子的某些实施方案可以用于将一种或多种另外的外源物质递送进与本发明的分子的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞中。另外，本发明提供了一种用于将外源物质递送至细胞内部的方法，所述方法包括使体外或体内细胞与本发明的分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明还提供了一种用于将外源物质递送至有此需要的患者中的细胞内部的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用本发明的分子，其中所述靶细胞与本发明的分子的细胞外靶标生物分子物理连接。
本发明的任意组合物(例如，细胞靶向分子，药物组合物，或诊断组合物)用于诊断、预后和/或表征疾病、病症和/或病患的应用在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中是本发明的物质的一种或多种组合物(例如，药物组合物)在癌症、肿瘤、或免疫病症的治疗或预防中的应用。在本发明的某些实施方案中是本发明的物质的一种或多种组合物(例如，药物组合物)在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、或免疫病症的药物中的应用。
在本发明的某些实施方案中是包含本发明的分子(例如，分子、细胞靶向分子、多肽或蛋白)和检测促进剂的诊断组合物，其用于收集信息，诸如，关于细胞型、组织、器官、疾病、病症、病患和/或患者的诊断有用的信息。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的分子和/或诊断组合物检测细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使细胞与分子和/或诊断组合物接触，并且检测所述分子和/或诊断组合物的存在。在某些实施方案中，所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。在某些实施方案中，所述检测细胞的步骤发生在体外。在某些实施方案中，所述检测细胞的步骤发生在体内。
例如，本发明的诊断组合物可以用于检测体内细胞，其通过向哺乳动物受试者施用包含本发明的分子并且包含检测促进剂的组合物，并且检测在体外或体内本发明的分子的存在而进行。收集的信息可以关于与本发明的分子的结合区的细胞外靶标物理连接的细胞的存在，并且可以用于诊断、预后、表征和/或治疗疾病、病症或病患。本发明的某些化合物(例如，多肽和蛋白)、组合物(例如，药物组合物)和方法可以用于确定患者是否属于响应本发明的药物组合物的组。
在本发明的某些实施方案中是试剂盒，其包括本发明的物质的组合物，以及任选地，使用说明书，另外的试剂，和/或药物递送装置。
参考以下描述、所附权利要求和附图，会更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。本发明的前述要素可以单个地组合或自由地除去以便形成本发明的其他实施方案，在下文中没有反对这样的组合或除去的任何陈述。
附图简要说明
图1显示本发明的某些示例性的分子的一般排列，所述分子分别包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽。本发明的某些示例性的分子包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽，在其羧基端连接分子结构部分。“N”和“C”分别表示所述分子的多肽成分的氨基端和羧基端。
图2显示与包含含有野生型弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应子多肽的几乎相同的细胞毒性的细胞靶向分子相比，包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子(SLT-1A-FR::scFv-1)的弗林蛋白酶切割耐受性。图2显示在用纯化的重组人弗林蛋白酶或多种阴性对照条件处理后的蛋白样品的电泳后的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。凝胶的泳道编号表示，并且图例表示每种细胞靶向分子样品在将样品上样到凝胶上之前的预处理条件：温度以摄氏度(℃)表示，预处理时间以小时(表示为“hrs”)表示，并且是否加入任意的弗林蛋白酶由弗林蛋白酶活性单位(U)量/微克(μg)的样品细胞毒性蛋白(标记为“U/μg弗林蛋白酶”)或“无弗林蛋白酶”(0U/μg弗林蛋白酶)表示。标记为“L”的泳道显示蛋白分子量梯子的迁移模式，并且每个梯子蛋白条带的大致尺寸以千道尔顿(kDa)表示。该图例表示在每条泳道中在每种细胞靶向分子样品中存在哪种志贺毒素效应子多肽，即，1)野生型弗林蛋白酶切割位点(WT)或2)破坏的弗林蛋白酶切割基序(FR)。处理的样品在30℃经受0.5弗林蛋白酶活性单位/微克细胞靶向分子(U/μg弗林蛋白酶)25小时(hrs)。图2显示在30℃，SLT-1A-FR::scFv-1耐受0.5弗林蛋白酶活性单位/微克的SLT-1A-FR::scFv-1。
图3显示包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子(SLT-1A-FR::scFv-2)在多个温度的弗林蛋白酶耐受性。图3显示在用纯化的重组人弗林蛋白酶或不用弗林蛋白酶处理的蛋白样品的电泳后的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。凝胶的泳道编号表示，并且图例表示每种细胞靶向分子样品在将样品上样到凝胶上之前的预处理条件：温度以摄氏度(℃)表示，预处理时间以小时(表示为“hrs”)表示，并且是否加入任意的弗林蛋白酶由弗林蛋白酶活性单位量/微克的样品细胞毒性蛋白(标记为“U/μg弗林蛋白酶”)或“无弗林蛋白酶”(0U/μg弗林蛋白酶)表示。标记为“L”的泳道显示蛋白分子量梯子的迁移模式，并且每个梯子蛋白条带的大致尺寸以千道尔顿(kDa)表示。图3显示在4°至37℃范围内的温度，SLT-1A-FR::scFv-2耐受0.5弗林蛋白酶活性单位/微克的SLT-1A-FR::scFv-2。
图4示意性显示示例性的耐受蛋白酶切割的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1表现出与包含具有野生型弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应子多肽的几乎相同的细胞毒性的细胞靶向分子相当的细胞靶向性细胞毒性。将靶标阳性细胞的百分比存活性针对施用给所述细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。
图5示意性显示示例性的耐受蛋白酶切割的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1表现出与包含具有野生型弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应子多肽的几乎相同的细胞毒性的细胞靶向分子相当的非靶向性细胞毒性。SLT-1A-FR::scFv-1还表现出与未被靶向的野生型志贺毒素A亚基构建体相当的非靶向性细胞毒性。将靶标阴性细胞的百分比存活性针对施用给所述细胞的细胞靶向分子浓度以10为底的对数绘图。
图6显示与SLT-A1-WT::scFv-1相比，施用了重复剂量的SLT-A1-FR::scFv-1的小鼠改善的存活。图6显示施用了2.5毫克/kg体重/次注射蛋白酶切割敏感性的SLT-1A-WT::scFv-1或示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1共三次注射的小鼠的Kaplan-Meier存活图。y-轴是级联组内小鼠的百分比存活，x-轴是以天为单位。与他们对蛋白酶切割敏感性的SLT-1A-WT::scFv-1的耐受性相比，小鼠表现出优越的针对耐受蛋白酶切割的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1的耐受性。
图7显示在人癌症小鼠异种移植模型中示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2在体内抑制靶标阳性的人肿瘤细胞的生长。图7显示基于人肿瘤细胞的荧光素酶报道子表达通过随时间的生物发光/个体小鼠测定的肿瘤负担。个体小鼠由绘制在图表上的每个符号表示，即，由空心三角形、实心三角形、空心圆或实心正方形表示。Y-轴是个体小鼠的总生物发光信号，其表示肿瘤负担，单位是百万光子/秒(光子/sec)，X-是注射剂量，其范围在0至2毫克SLT-1A-FR::scFv-2/千克体重/注射。四个x-轴剂量组对应于四组小鼠。实验包括四组十只小鼠，按接受的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子的注射剂量分组：组#1–小鼠接受0毫克的SLT-1A-FR::scFv-2，组#2–小鼠接受0.05毫克的SLT-1A-FR::scFv-2/千克体重，组#3–小鼠接受0.5毫克的SLT-1A-FR::scFv-2/千克体重，和组#4–小鼠接受2毫克的SLT-1A-FR::scFv-2/千克体重。实验运行至少4周。图7显示示例性的细胞毒性的耐受蛋白酶切割的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2表现出的对人肿瘤细胞生长的抑制的剂量-和时间-依赖性。
详述
在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。
为了可以更容易地理解本发明，在下面定义某些术语。在发明详述内可以发现另外的定义。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两种物质A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两种物质诸如A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每种物质以单个或多个可能性存在)。
贯穿本说明书，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其他整数(或组分)或整数(或组分)的组。
贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互换使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对结合到蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于总计15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示在物理上构成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基，取决于长度。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写，代表它们从氨基端至羧基端的次序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体(isosteriomers))，且除非另有限制，也包括可以以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，诸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸羟丁赖氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的简写名称描述在本文中提及的氨基酸：
表A.氨基酸命名法
Figure BDA0003274689110000341
Figure BDA0003274689110000351
关于多肽的短语“保守置换”表示多肽的氨基酸组成的变化，所述变化不会实质上改变整体多肽的功能和结构(参见Creighton，Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman and Company，New York(第2版，1992))。
本文中使用的术语“表达”(“expressed,”“expressing,”或“expresses,”)及其语法变体表示多核苷酸或核酸翻译成多肽或蛋白。表达的多肽或蛋白可以保留在细胞内，变成细胞表面膜的成分，或者被分泌进细胞外空间中。
用于本文时，在至少一个细胞表面表达显著量的细胞外靶标生物分子的细胞是“靶标阳性细胞”或“靶标+细胞”，并且是与指定的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞。
本文中使用的符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区的功能特性，这基于它与该符号后的生物分子结合的能力。
就本发明的目的而言，与两个分子成分相关的术语“连接的”或“相连”是指这两个成分接合、附着、相连、连接、或另外偶联形成单个分子的状态，不清包括共价和/或非共价的连接。
就本发明的目的而言，术语“连接”是指通过一种或多种原子相互作用连接的两个以上的分子成分，以形成单个分子，并且其中所述原子相互作用包括至少一个共价键。
就本发明的目的而言，术语“融合的”是指通过至少一个座位肽键的共价键连接的两个以上的蛋白样成分。融合在一起的两个蛋白样成分的非限制性实例包括，例如，通过肽键与多肽融合的氨基酸、肽或多肽，以使得到的分子是单个连续的多肽。
符号“::”是指在它前面和后面的多肽区域融合在一起以形成连续多肽。
就本发明的目的而言，术语“效应子”是指提供生物活性，诸如细胞毒性、生物信号传导、酶促催化、亚细胞路线递送(subcellular routing)、和/或导致一种或多种因子的募集和/或变构效应的分子间结合。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素效应子多肽”、“志贺毒素A亚基效应子多肽”、“志贺毒素效应子区”或“志贺毒素效应子多肽区”是指来源于志贺毒素家族成员的志贺毒素A亚基的能够表现出至少一种志贺毒素功能的多肽。志贺毒素功能包括，例如，促进细胞进入、使脂膜变形、刺激网格蛋白介导的胞吞作用、指导其本身的亚细胞路线递送、指导其本身的逆转运、避免细胞内降解、催化灭活核糖体、发挥细胞毒性和发挥细胞抑制作用。
就本发明的目的而言，短语“来源于”意指，所述多肽包含最初在蛋白中发现的氨基酸序列，且其现在可能包含由原始序列的添加、缺失、截短或其他改变，使得总功能和结构是基本上保守的。熟练的技术人员能够使用本领域已知的技术，例如，多肽序列比对软件，鉴定所衍生的多肽区所来源的母本分子。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素A1片段区”是指基本上由志贺毒素A1片段组成和/或来源于志贺毒素的志贺毒素A1片段的多肽区。
就本发明的目的而言，术语“异源的”意指欲志贺全毒素不同的资源，例如，异源的分子结构部分或多肽是不是天然发现为由天然存在的细菌物种表达的天然志贺毒素的天然存在的A亚基的一部分或与其连接的分子结构部分或多肽。
就本发明的目的而言，并且关于本发明的分子成分之间的连接，术语“二硫键”包括对称的二硫键和不对称的二硫键。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段的羧基端区”是指来源于天然存在的志贺毒素A1片段的多肽区，该区以疏水残基(例如，StxA-A1和SLT-1A1的V236，和SLT-2A1的V235)起始，接着是疏水残基和以在志贺毒素A1片段多肽之间保守的弗林蛋白酶切割位点结束，并且在天然志贺毒素A亚基中的A1片段与A2片段之间的连接处结束。就本发明的目的而言，志贺毒素A1片段的羧基端区包括来源于志贺毒素A1片段多肽的肽区，诸如，例如，包含或基本上由志贺毒素A1片段的羧基端组成的肽区。来源于志贺毒素A1片段的羧基端的肽区的非限制性的实例包括天然位于Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)的位置236-位置239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，或251的氨基酸残基序列；和SLT-2A(SEQ ID NO:3)的位置235-位置239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，或250的氨基酸残基序列。
就本发明的目的而言，关于所连接的分子结构部分的术语“邻近”A1片段多肽的羧基端是指限定A1片段多肽区中最后一个残基的12个氨基酸残基或更少的氨基酸残基的分子距离。
就本发明的目的而言，短语“空间上覆盖A1片段来源的区域的羧基端”包括与A1片段来源的区域的羧基端中的氨基酸残基共价连接的大小为4.5kDa以上的任意分子结构部分，诸如，例如，所述氨基酸残基来源于天然位于Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ IDNO:1)中的位置236-251或SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的235-250中任一个位置的氨基酸残基。就本发明的目的而言，短语“空间上覆盖A1片段来源的区域的羧基端”还包括与A1片段来源的区域的羧基端中的氨基酸残基共价连接的大小为4.5kDa以上的任意分子结构部分，诸如，例如，所述氨基酸残基在最后的氨基酸A1片段来源的区域或志贺毒素效应子多肽的羧基端。就本发明的目的而言，短语“空间上覆盖A1片段来源的区域的羧基端”还包括物理防止A1片段来源的区域的羧基端的细胞识别的大小为4.5kDa以上的任意分子结构部分，诸如，例如，被ERAD机制识别。
就本发明的目的而言，短语“在A1片段区羧基端的弗林蛋白酶切割基序”是指在志贺毒素A亚基之间保守的特异性的弗林蛋白酶切割基序，其桥接在天然的志贺毒素A亚基中的A1片段与A2片段之间的接合。
就本发明的目的而言，短语“邻近A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位点”是指任何可鉴定的弗林蛋白酶切割位点，其具有限定A1片段区中最后的残基的七个氨基酸残基或更少的氨基酸残基之内的氨基酸残基。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应子功能是由来源于志贺毒素A亚基的多肽赋予的生物活性。志贺毒素效应子功能的非限制性实例包括细胞内在化，志贺毒素效应子，催化活性，和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括，例如，核糖体失活，蛋白合成抑制，N-糖苷酶活性，多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是使核糖体失活的蛋白(RIPs)。RIPs可以使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和polyA)和病毒核酸去嘌呤化(depurinate)(Barbieri L等人，Biochem J 286:1-4(1992)；Barbieri L等人，Nature 372:624(1994)；Ling J等人，FEBS Lett 345:143-6(1994)；Barbieri L等人，Biochem J 319:507-13(1996)；Roncuzzi L，Gasperi-Campani A，FEBS Lett 392:16-20(1996)；Stirpe F等人，FEBS Lett 382:309-12(1996)；Barbieri L等人，Nucleic AcidsRes 25:518-22(1997)；Wang P，Tumer N，Nucleic Acids Res 27:1900-5(1999)；BarbieriL等人，Biochim Biophys Acta 1480:258-66(2000)；Barbieri L等人，J Biochem 128:883-9(2000)；Brigotti M等人，Toxicon 39:341-8(2001)；Brigotti M等人，FASEB J 16:365-72(2002)；Bagga S等人，J Biol Chem 278:4813-20(2003)；Picard D等人，J BiolChem 280:20069-75(2005))。一些RIPs表现出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等人，Antimicrob Agents Chemother 37:835-8(1993)；Au T等人，FEBS Lett 471:169-72(2000)；Parikh B，Tumer N，Mini Rev Med Chem 4:523-43(2004)；Sharma N等人，PlantPhysiol 134:171-81(2004))。已经在体外和在体内观察到志贺毒素催化活性。用于志贺毒素效应子活性的测定可以测量多种活性，诸如，例如，蛋白合成抑制活性、去嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋结构DNA松弛活性和/或核酸酶活性。
本文中使用的志贺毒素效应子功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，与野生型志贺毒素效应子多肽对照相当的志贺毒素功能活性水平。对于核糖体抑制，志贺毒素效应子功能是展现10,000皮摩尔(pM)以下的IC50。对于在靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性，取决于细胞类型和其适当的细胞外靶标生物分子的表达，志贺毒素效应子功能是展现1,000纳摩尔(nM)以下的CD50。
就本发明的目的而言，并且关于本发明的分子的志贺毒素效应子功能而言，术语“合理的活性”是指等于或大于关于仅包含野生型的志贺毒素多肽序列的多肽的志贺毒素效应子活性水平限定的最低活性水平的志贺毒素效应子生物活性的活性水平。对于细胞毒性的志贺毒素效应子功能，合理的活性水平包括在包含野生型的志贺毒素构建体的分子的500-倍以内，并且如果注意，任何其他分子结构的500-倍以内。
用于本文时，表现出“显著的”志贺毒素效应子功能是指，通过具有重现性的适当的定量测定测量的，与包含全长志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应子多肽相当的志贺毒素功能活性水平。对于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应子功能是展现300pM以下的IC50，这取决于核糖体的来源(例如，细菌、古细菌(archaea)或真核生物(藻类，真菌，植物或动物))。与催化失活的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的约100,000pM的IC50相比，这是显著更大的抑制作用。对于在实验室细胞培养物中的靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性，显著的志贺毒素效应子功能是展现100、50或30nM以下的CD50，这取决于细胞系和其对适当的细胞外靶标生物分子的表达。与单独的没有细胞靶向性结合区的SLT-1A成分(其具有100-10,000nM的CD50)相比，这是对适当的靶细胞系显著更高的细胞毒性，其取决于细胞系。
应该注意，即使志贺毒素效应子多肽的细胞毒性相对于野生型志贺毒素效应子减少，在实践中，使用减毒的志贺毒素效应子多肽的应用可以与使用野生型志贺毒素效应子多肽一样有效或更有效，原因在于，功效最高的变体可能展现不需要的作用，而在功效降低的变体中不需要的作用减至最小或减少。野生型志贺毒素效应子多肽是非常有效的，能够仅以到达细胞溶胶的一个分子或内在化的大约40个分子进行杀伤(Tam P，Lingwood C，Microbiology 153:2700-10(2007))。与野生型志贺毒素效应子多肽相比，具有甚至相当减少的志贺毒素效应子功能(诸如，例如，亚细胞路线递送或细胞毒性)的志贺毒素效应子多肽，对于涉及靶向的细胞杀伤和/或特定的细胞检测的实际应用，可能仍然是足够有效的。
对于一些样品，由于不能收集必要的数据点进行准确的曲线拟合，IC50或CD50的准确值可能是不能获得的。当确定显著的志贺毒素效应子功能活性时，不应该考虑不准确的IC50和/或CD50值。在示例性的志贺毒素效应子功能测定(诸如，例如，在实施例中所述的测定)的数据分析中描述为不足以准确拟合曲线的数据不应该被认为代表实际的志贺毒素效应子功能。例如，如果在给定样品的浓度系列中分别不发生大于50％的核糖体抑制或细胞死亡，则理论上不可能确定IC50和CD50。
不能检测志贺毒素效应子功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠、和/或多肽稳定性，而不是缺少细胞进入、亚细胞路线递送和/或酶活性。志贺毒素效应子功能的测定可能不需要很多本发明的分子来测量显著量的志贺毒素效应子功能活性。在凭经验确定低或没有效应子功能的潜在的原因与蛋白表达或稳定性相关的程度上，本领域技术人员可以能够利用本领域已知的蛋白化学和分子改造技术抵消这些因素，使得志贺毒素功能性效应子活性可以被恢复并测量。例如，基于不适当的细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列进行抵消；不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定末端序列、或稳定蛋白三维结构的非效应子区中的补偿性突变等。当关于个体志贺毒素功能的新测定可用时，可以分析志贺毒素效应子多肽的任意水平的这些志贺毒素效应子功能，诸如是野生型志贺毒素效应子多肽的活性的特定倍数的活性以内。有意义的活性差异的实例是，例如，具有是野生型志贺毒素效应子多肽的活性的1000-倍或100-倍以下的活性的志贺毒素效应子多肽；或与功能性敲低或敲除的志贺毒素效应子多肽相比，具有3-倍至30-倍或更高的活性的志贺毒素效应子多肽。
某些志贺毒素效应子功能是不容易测量的，例如，亚细胞路线递送活性。目前没有途径、定量测定区分志贺毒素效应子多肽不是细胞毒性的是否是由于不正确的亚细胞路线递送，但是，在测试可用的时候，可以与适当的野生型志贺毒素效应子区相比，分析志贺毒素效应子多肽任意显著水平的亚细胞路线递送。然而，如果本发明的志贺毒素效应子多肽表现出与野生型志贺毒素A亚基构建体相等的细胞毒性，那么推测亚细胞路线递送活性水平与野生型志贺毒素A亚基构建体的亚细胞路线递送活性水平相等。
关于细胞毒性的分子的细胞毒性活性的术语“选择性的细胞毒性”是指在被靶向的细胞群体和未被靶向的旁观(bystander)细胞群体之间细胞毒性的相对水平，其可以表示为针对被靶向的细胞型的半最大细胞毒性浓度(CD50)与针对未被靶向的细胞型的CD50的比率，以显示对被靶向的细胞型的细胞杀伤的优先性。
免疫毒素和配体-毒素融合物作为细胞毒性分子的有效性和功效受它们在靶细胞表面上的靶抗原的密度(参见，例如Decket T等人，Blood 103:2718-26(2004)；Du X等人，Blood 111:338-43(2008)；Baskar S等人，mAbs 4:349-61(2012))、表位位置(Press O等人，J Immunol 141:4410-7(1988)；Godal A等人，In J Cancer 52:631-5(1992)；Yazdi P等人，Cancer Res 55:3763-71(1995))、表面结合的细胞毒性分子的内在化的速率(参见，例如Du X等人，Cancer Res 68:6300-5(2008))和细胞内路线(Tortorella L等人，PLoSOne 7:e47320(2012))的影响。
给定的细胞外靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度可能影响可能最适合使用本发明的细胞靶向分子的应用。细胞之间给定的靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度的差异可能定量和定性地改变给定的本发明的细胞靶向分子的内在化和/或细胞毒性。在靶标生物分子阳性的细胞之间，或者甚至在细胞周期或细胞分化的不同时间点的同一细胞上，给定的靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度可能极大地不同。可以使用本领域技术人员已知的方法确定给定的靶标生物分子在特定细胞或细胞群体上的总细胞表面表现，所述方法诸如荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞计数方法。
引言
本发明提供包含具有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素A亚基效应子的耐受蛋白酶切割的分子，其能够表现出野生型志贺毒素的细胞毒性。之前，表明志贺毒素A亚基融合构建体是细胞毒性的并且能够自身指导它们本身的细胞内按途径发送，将酶活性的毒素片段递送到细胞溶胶中(Backer M等人，J Control Release 74:349-55(2001)；BackerM，Backer J，Bioconjug Chem 12:1066-73(2001))；然而，认为保留弗林蛋白酶切割位点对于维持最大的细胞毒性是重要的。
当设计合成的志贺毒素A亚基构建体时，应该考虑志贺毒素中毒的天然机制，诸如，例如，通过弗林蛋白酶的细胞内蛋白水解释放A1片段和将A1片段逆转运到细胞溶胶中。去掉志贺毒素A1片段羧基端的所有分子结构部分可能是下述二者需要的：1)暴露A1片段的羧基端，用于中毒的细胞的内质网内的细胞因子的识别，以促进向细胞溶胶的有效按路径发送，和2)当在不存在任何羧基端结构部分的条件下在细胞溶胶中将A1片段重新折叠成结构时，使催化活性最大。这些机制可能全部有助于关于野生型志贺毒素观察到的最大的志贺毒素细胞毒性。
由于在中毒的脊椎动物细胞中志贺全毒素的志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶蛋白水解加工对于有效的细胞毒性是关键的，因此认为对于天然存在的蛋白水解加工必须保留或弥补弗林蛋白酶切割才能保持有效的天然的亚细胞路线递送和高度进化的且有效的志贺毒素细胞毒性机制的催化激活。为了下述：1)使A1片段的羧基端或类似于天然的A1片段的羧基端在内质网中可及，从有效转运到细胞溶胶中，和2)将稳定的且最优的催化性A1片段结构递送到细胞溶胶中，必须保留、模仿或另外弥补志贺毒素A1片段与A2片段的分离。
之前，关于包含异源的羧基端结构部分并且缺失弗林蛋白酶切割事件但是在效用和功效方面仍然表现出最大的野生型志贺毒素细胞毒性的志贺毒素A亚基来源的结构没有任何的证明。特别地，没有这样的已知的志贺毒素A亚基来源的结构：当将志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端共价连接到并且空间上覆盖有相对大的分子结构部分(诸如，例如，细胞靶向性的免疫球蛋白型结合区)时，所述志贺毒素A亚基来源的结构避免了最大的志贺毒素细胞毒性的蛋白水解加工。
令人惊讶地，本发明包含具有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽的示例性的分子表现出充分的志贺毒素效应子功能，从而提供最大的野生型志贺毒素细胞毒性，同时允许在其羧基端连接相对大的(大于28kDa)分子结构部分(见实施例，同前所述)。如在下文实施例中详细所述，本发明包含含有催化结构域的志贺毒素A亚基来源的多肽的示例性的分子表现出与包含可被弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽(诸如野生型志贺毒素A亚基多肽)的细胞靶向分子相当的志贺毒素细胞毒性功效和效力。不需要任意另外的补偿性的特征的改造，例如，诸如，添加异位蛋白酶切割位点。这些观察产生了包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基来源的多肽的改善的细胞靶向分子的设计，其中所述分子表现出与包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子相等的细胞毒性。
本发明提供耐受蛋白酶切割的分子，其包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素A亚基效应子多肽。本发明的包含1)催化活性的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或2)细胞毒性的分子结构部分的细胞毒性的分子可以用于杀伤细胞的应用。本发明的包含催化活性的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的分子可以用作免疫毒素和配体-毒素融合物的成分，所述免疫毒素和配体-毒素融合物用于靶向杀伤特定的细胞型和治疗多种疾病，包括癌症、免疫病症和微生物感染。本发明的细胞靶向分子具有多种应用，例如，用于靶向的细胞杀伤，将外源物质递送到特定细胞型中，获得诊断信息，和作为治疗多种疾病、病症和病患(包括癌症、免疫病症和微生物感染)的治疗剂。本发明的细胞毒性的细胞靶向分子还用于涉及靶向杀伤特定细胞型和治疗多种疾病(包括癌症、免疫病症和微生物感染)的应用。本发明还提供改造志贺毒素A亚基来源的分子(例如，免疫毒素或配体-毒素融合物)的特定方式，所述分子包含在志贺毒素A1片段区羧基端的分子结构部分，所述方式涉及破坏在所述志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的弗林蛋白酶切割基序。
I.本发明的细胞毒性分子和细胞靶向分子的一般结构
本发明提供多种细胞毒性的和细胞靶向的分子，每种所述分子包含含有志贺毒素A1片段来源的区域和在所述志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽。与包含野生型志贺毒素A1片段的相关分子相比，本发明的细胞毒性的和细胞靶向的分子是耐受弗林蛋白酶切割的。除了是耐受弗林蛋白酶切割的，本发明的分子通常更加耐受蛋白酶切割，并且因此可能表现出需要的特性，诸如，例如，降低的体内毒性，增加的稳定性，增加的存储半衰期和/或增加的体内半衰期。
本发明的细胞毒性的分子还包含连接在志贺毒素效应子多肽羧基端的分子结构部分。分子结构部分的实例是细胞靶向性的免疫球蛋白型的结合区，其包含一个或多个以高亲和力与细胞表面生物分子结合的多肽。
本发明的细胞靶向分子还包含能够特异性结合与细胞物理连接的至少一个细胞外靶标生物分子的结合区，所述细胞外靶标生物分子诸如在细胞表面上表达的靶标生物分子。尽管缺少志贺毒素A亚基来源的多肽区的弗林蛋白酶蛋白水解加工，细胞靶向性结合区与本文所述的志贺毒素效应子多肽的结合允许改造有效的志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向。本发明的细胞靶向分子的这种一般结构是模块式的，原因在于，任意数量的多样性细胞靶向性结合区可以连接到多个耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽上，产生相同的一般结构的变化。
本发明基于出乎意料的发现：当连接相对大的(大于28kDa)羧基端分子结构部分时，破坏天然连接志贺毒素A1片段与A2片段的弗林蛋白酶的蛋白酶位点不降低其细胞毒性。令人惊讶地，在不存在弗林蛋白酶切割事件的条件下，最大的野生型志贺毒素细胞毒性是可能的，尽管存在大的羧基端结构部分，所述羧基端结构部分可能干扰志贺毒素A亚基的释放所有其他大分子结构部分使羧基端疏水结构域暴露的天然机制，所述机制导致：1)ERAD系统识别A1片段的羧基端，2)解开A1片段，3)A1片段的遍在蛋白化，4)催化结构域从内质网到细胞溶胶的逆转运，5)避免蛋白酶降解催化结构域，和6)是包含多肽的催化结构域重折叠，形成完全活性的酶结构(参见Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66:5252-9(1998)；LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Yu M，Haslam D，Infect Immun 73:2524-32(2005)；Falguieres T，Johannes L，Biol Cell 98:125-34(2006)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011)；Li S，PLoS One 7:e41119(2012))。
在本文所述的发现之前，认为在设计目的具有最优细胞毒性的志贺毒素A亚基来源的融合蛋白时，必须保留或补偿弗林蛋白酶切割事件。通过在志贺毒素A亚基来源的区域内保留弗林蛋白酶切割事件，志贺毒素A亚基A1片段样多肽可以与其羧基端连接的并且空间上覆盖着A1片段的羧基端的任何结构部分释放，从而使完整分子的核糖体抑制活性提高60倍以上(参见Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999))。然后，A1片段样多肽的释放的羧基端可以用其疏水结构域向中毒细胞的ERAD机制传导信号，用于从内质网的腔转运到细胞溶胶中，A1片段样多肽可以被解开，包含多肽的志贺催化结构域可以被有效地转运到细胞溶胶中，并且所述催化结构域在细胞溶胶中可以重新折叠成活性构型，这与对于野生型志贺毒素所发生的相似。另外，如果在融合蛋白中存在A2片段样区域，那么A1片段在与任意的A2片段样区域解离后可能变得更加被催化激活。备选地，对缺少弗林蛋白酶切割事件的补偿可以通过将“预先加工的”形式的志贺毒素A亚基来源的多肽呈递到邻近融合蛋白的羧基端，以使所述分子的羧基端模仿弗林蛋白酶切割的志贺毒素A1片段。
A.耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽
本发明全部的细胞毒性分子和细胞靶向分子分别包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽。这些耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽分别来源于志贺毒素家族成员的A亚基，并且包含：1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的多肽，和2)在志贺毒素A1片段多肽区的羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
就本发明的目的而言，短语“耐受弗林蛋白酶切割的”意指，与野生型志贺毒素A亚基中的志贺毒素A1片段羧基端或其中天然存在的弗林蛋白酶切割基序未被破坏的构建体(即，在类似的多肽区仅包含天然存在的志贺毒素A亚基所呈现的野生型天然存在的序列)的志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端相比，多肽区表现出较少的弗林蛋白酶切割。
志贺毒素效应子多肽是来源于志贺毒素家族成员的志贺毒素A亚基的多肽。志贺毒素家族蛋白毒素包括多种天然存在的结构和功能相关的毒素例如，志贺毒素，志贺样毒素1，和志贺样毒素2(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000451
W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素家族成员共有相同的整体结构和作用机制(Engedal，N等人，Microbial Biotech 4:32-46(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在不含细胞的系统中表现出不可区分的酶活性(Head S等人，J Biol Chem 266:3617-21(1991)；Tesh V等人，Infect Immun 61:3392-402(1993)；Brigotti M等人，Toxicon 35:1431–1437(1997))。
志贺毒素家族包括从痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)血清型1分离的真正的志贺毒素(Stx)、从肠出血性的大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)和从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅一个残基不同，并且二者都被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxins)或维罗毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien，Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在氨基酸序列水平上彼此仅有约53-60％的相似性，但是它们享有志贺毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性的机制(Johannes L，
Figure BDA0003274689110000461
W，Nat Rev Microbiol8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺毒素，如定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d、和Stx2a-g(Scheutz F等人，J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。志贺毒素家族成员并不天然地限于任何细菌物种，因为编码志贺毒素的基因可以经由水平基因转移在细菌物种之间传播(Strauch E等人，Infect Immun 69:7588-95(2001)；Bielaszewska M等人，Appl Environ Micrbiol 73:3144-50(2007)；Zhaxybayeva O，Doolittle W，Curr Biol21:R242-6(2011))。作为物种间转移的实例，在从患者中分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)的菌株中发现了志贺毒素(Grotiuz G等人，J Clin Microbiol 44:3838-41(2006))。一旦编码志贺毒素的多核苷酸进入新的亚种或物种，则假定志贺毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力发展少量序列变化而同时仍然保持志贺毒素家族成员共有的细胞毒性的机制(参见Scheutz，J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。
志贺毒素家族成员的志贺毒素A亚基包含在其A1片段区的羧基端的保守的弗林蛋白酶切割位点，该切割位点对志贺毒素功能是重要的。弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割位点可以由熟练的技术人员和/或通过使用本文的信息来鉴定。
已经鉴定了由弗林蛋白酶切割的底物中的共有基序具有某种程度的特异性。使用Schechter I，Berger，A，Biochem Biophys Res Commun 32:898-902(1968)中所述的命名法，弗林蛋白酶切割位点基序已被描述为包含20个氨基酸残基的区域，其可以是标记的P14至P6’(Tian S，Biochem Insights 2:9-20(2009)；Tian S，Jianhua W，Int J Biol Sci 6:89-95(2010)；Tian S等人，Int J Mol Sci 12:1060-5(2011)；Tian S等人，Sci Rep 2:261(2012))。按照该命名法，切割位点是在指定为P1的氨基酸残基的羧基键处，并且在从该参比P1残基到氨基端的方向上，残基编号为P2、P3、P4等。从P1参比残基到羧基端的残基用基本概念(prime notation)P2’、P3’、P4’等编号。
一般的弗林蛋白酶切割位点通常描述为共有基序R-x-x-R，其对应于P4-P3-P2-P1；其中“R”表示精氨酸残基(参见表A，同前所述)，破折号“-”表示肽键，小写字母“x”表示任意的氨基酸残基(Schalken J等人，J Clin Invest 80:1545-9(1987)；Bresnahan P等人，J Cell Biol 111:2851-9(1990)；Hatsuzawa K等人，J Biol Chem 265:22075-8(1990)；Wise R等人，Proc Natl Acad Sci USA.87:9378-82(1990)；Molloy S等人，J BiolChem 267:16396-402(1992))。然而，其他的残基和位置可能帮助进一步限定弗林蛋白酶切割基序(Hosaka M等人，J Biol Chem 266:12127-30(1991)；Oda K等人，Biochem BiophysRes Commun 179:1181-6(1991)；Leduc R等人，J Biol Chem 267:14304-8(1992)；Watanabe T等人，J Biol Chem 267:8270-4(1992))。略微更加限制的弗林蛋白酶切割位点基序通常报道为共有基序R-x-[K/R]-R(其中正斜杠“/”意指“或”，并且划分在同一位置上备选的氨基酸残基)，其对应于P4-P3-P2-P1，原因在于观察到弗林蛋白酶具有切割包含该基序的底物的强优先性(参见Rockwell N等人，Chem Rev 102:4525-48(2002)；Remacle A等人，J Biol Chem 283:20897-906(2008)；Tian S，Biochem Insights 2:9-20(2009)；Tian S，Jianhua W，Int J Biol Sci 6:89-95(2010)；Tian S等人，Int J Mol Sci 12:1060-5(2011)；Tian S等人，Sci Rep 2:261(2012))。
与此一致的，多种弗林蛋白酶抑制剂包含含有基序R-x-x-R的肽(参见例如MisumiY等人，Biochem Biophys Res Commun 171:236-42(1990)；Hallenberger S等人，Nature360:358-61(1992)；Garten W等人，Biochimie 76:217-25(1994)；Angliker H，J Med Chem38:4014-8(1995)；Van Rompaey L等人，Biochem J 326:507–514(1997)；Cameron A等人，JBiol Chem 275:36741-9(2000)；Jean F等人，Proc Natl Acad Sci USA.97:2864-9(2000)；Basak A，Lazure C，Biochem J 373:231-9(2003)；Kacprzak M等人，J Biol Chem279:36788-94(2004))。弗林蛋白酶的合成抑制剂的实例是R-V-K-R(参见例如Henrich S等人，Nat Struct Biol 10:520-6(2003))。通常，可以预测包含表面可及的二元氨基酸基序的多肽(具有由两个氨基酸残基隔开的连个带正电荷的氨基酸)是弗林蛋白酶切割敏感性的，切割发生在该基序中最后一元氨基酸的羧基键处(Rockwell N等人，Chem Rev 102:4525-48(2002)；Remacle A等人，J Biol Chem 283:20897-906(2008))。
除了R-x-x-R的最小的弗林蛋白酶切割位点，还已经描述了较大的弗林蛋白酶切割位点基序，其在某些位置具有特定氨基酸残基偏好性。通过比较多种已知的弗林蛋白酶底物，已经对20个氨基酸残基长的弗林蛋白酶切割位点基序中的氨基酸残基表征了某些物理化学特性。弗林蛋白酶切割基序的P6至P2’区域勾画出核心弗林蛋白酶切割位点，其与弗林蛋白酶的酶结构域物理性相互作用。两个侧翼区P14至P7和P3’至P6’通常是亲水性的，富含极性的氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的表面可及性。
通常，位置P5至P1的弗林蛋白酶切割基序区域倾向于包含具有正电荷和/或高等电点的氨基酸残基。具体地，标记弗林蛋白酶蛋白水解的位置的P1位置通常被精氨酸占据，但是在该位置也可以存在其他带正电荷的氨基酸残基。位置P2和P3倾向于被柔性的氨基酸残基占据，并且具体地，P2倾向于被精氨酸、赖氨酸或有时被非常小的且柔性的氨基酸残基如甘氨酸占据。在弗林蛋白酶底物中，P4位置倾向于被带正电荷的氨基酸残基占据。然而，如果P4位置被脂族氨基酸残基占据，那么缺少带正电荷的官能团可以被位于位置P5和/或P6的带正电荷的残基补偿(Tian S，Jianhua W，Int J Biol Sci 6:89-95(2010))。位置P1’和P2’通常被脂族和/或疏水性氨基酸残基占据，其中P1’位置最长被精氨酸占据(Tian S，Biochem Insights 2:9-20(2009)；Tian S等人，Sci Rep 2:261(2012))。
两个亲水性侧翼区倾向于被极性的亲水性的和/或具有较小的氨基酸官能团的氨基酸残基占据；然而，在某些验证的弗林蛋白酶底物中，核心弗林蛋白酶切割基序的侧翼区不包含任何共有的亲水性氨基酸残基(参见Tain S，Biochem Insights 2:9-20(2009))。在一些病毒蛋白的弗林蛋白酶切割基序中，位置P3’至P6’倍具有小的、疏水性的官能团的氨基酸残基占据，诸如，例如，被丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸占据(Tian S，Biochem Insights 2:9-20(2009)；Tian S等人，Sci Rep 2:261(2012))。尽管对于弗林蛋白酶的蛋白水解不是必需的，在位置P5和/或P6存在带正电荷的氨基酸残基可能增加弗林蛋白酶切割效率。在志贺毒素A亚基中，位于志贺毒素A1片段与A2片段的连接处的保守的弗林蛋白酶切割基序可能具有优化的竞争功能，诸如，例如，平衡有效的弗林蛋白酶切割，在切割后暴露在A1片段羧基端的非结构化的疏水性片段。
本发明的细胞毒性分子和细胞靶向分子分别包含志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽包含在A1片段区羧基端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
就本发明的目的而言，术语“弗林蛋白酶切割位点”是指在志贺毒素A亚基的蛋白酶敏感性环中的最小的弗林蛋白酶切割共有位点R/Y-x-x-R。
就本发明的目的而言，术语“弗林蛋白酶切割基序”是指基本上由20个氨基酸残基(即本文所述的共有多肽序列(P14至P6’))组成的多肽，其包含：1)最小的弗林蛋白酶切割基序P4至P1，2)核心弗林蛋白酶切割基序P6至P2’，和3)两个侧翼多肽区P14至P7和P3’至P6’。
就本发明的目的而言，“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是一个或多个来源于所述20个氨基酸残基的区域的氨基酸残基的改变，所述20个氨基酸残基的区域是在天然志贺毒素A亚基中存在的在志贺毒素A1片段与A2片段区之间的连接处的弗林蛋白酶切割基序，并且这样的位置使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致产生A1和A2片段；其中，与包含融合在羧基端多肽上的野生型志贺毒素A1片段区的参比分子相比(所述羧基端多肽尺寸足够大，足以使用适当的测定监测弗林蛋白酶切割)，破坏的弗林蛋白酶切割基序表现出减少的弗林蛋白酶切割。弗林蛋白酶切割的减少可以由本领域技术人员使用本领域已知的和/或本文所述的测定来确定。例如，与参比分子相比，一种分子的弗林蛋白酶切割的减少可以使用下述实施例中所述的体外弗林蛋白酶切割测定来确定，所述测定使用相同的条件进行，然后进行由切割产生的任意片段的条带密度的定量。在本发明的分子的某些实施方案中，与包含在其羧基端与多肽融合的野生型志贺毒素A1片段的参比分子(诸如例如，实施例中所述的参比分子SLT-1A-WT::scFv-1)相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序表现出30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％或更多的体外弗林蛋白酶切割减少。
在天然志贺毒素A亚基中存在于志贺毒素A1片段与A2片段弗林蛋白酶切割基序之间的连接处的20个氨基酸残基的弗林蛋白酶切割基序在某些志贺毒素中得到充分表征。例如，在StxA(SEQ ID No:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:1)中，该弗林蛋白酶切割基序天然位于L238至F257，并且在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中，该弗林蛋白酶切割基序天然位于V237至Q256。基于本文所述的氨基酸同源性、实验和/或弗林蛋白酶切割测定，熟练的技术人员能够鉴定其他天然的志贺毒素A亚基中的弗林蛋白酶切割基序，其中预测所述基序在中毒的整合细胞对这些志贺毒素A亚基进行弗林蛋白酶切割后导致A1和A2片段的产生。
弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的改变包括多种突变以及翻译后修饰，诸如，例如，糖基化等，其涉及将大分子连接到氨基酸残基的官能团上。弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的改变包括缺失、插入、倒置、置换和/或弗林蛋白酶切割基序的羧基端截短。由于其已被破坏，某些破坏的弗林蛋白酶切割基序可能不容易被识别为与任意的弗林蛋白酶切割基序相关；然而，志贺毒素A1片段区的羧基端是可识别的，并且将限定如果其不被破坏时所述弗林蛋白酶切割基序的位置。例如，与志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序可以包含弗林蛋白酶切割基序的少于20个的氨基酸残基，并且呈现羧基端截短。
就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏(disruption)”、“破坏的(disrupting)”或“被破坏的(disruptied)”是指天然存在的弗林蛋白酶切割位点的改变，诸如，例如，突变，与野生型志贺毒素A亚基相比，其导致在该位点的弗林蛋白酶切割的减少。由于弗林蛋白酶切割基序包含约20个氨基酸残基，因此，理论上，涉及这20个位置中任一个的一个或多个的突变、缺失或插入可以导致弗林蛋白酶切割敏感性的减少(Tian S等人，Sci Rep 2:261(2012))。所述破坏可以或可以不提高对其他蛋白酶的耐受性。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变的类型的实例是氨基酸残基缺失、插入、倒置和/或置换，包括与非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的置换。另外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以通过包含氨基酸修饰的突变而被破坏，通过添加掩蔽该位点或基序中的至少一个氨基酸的共价连接的化学结构，参见，例如PEG化(参见Zhang C等人，BioDrugs 26:209-15(2012)和添加小分子辅助物(Flower D，Expert Opin Drug Discov 7:807-17(2012))进行修饰。
将所述最小的弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基序并且防止在该位点的弗林蛋白酶切割(参见，例如Duda A等人，J Virol 78:13865-70(2004))。类似地，将最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的一个或两个精氨酸残基置换为技术人员已知的任意非保守氨基酸残基的氨基酸残基置换将降低该基序的弗林蛋白酶切割敏感性。具体地，精氨酸置换为缺少正电荷的任意非碱性氨基酸残基(诸如，例如，A，G，P，S，T，D，E，Q，N，C，I，L，M，V，F，W，和Y)的氨基酸残基置换将导致破坏的弗林蛋白酶切割基序。此外，在最小的弗林蛋白酶切割位点或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在本发明的分子的某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含关于共有氨基酸残基P1和P4(诸如，例如，在最小的弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的位置1和4的氨基酸残基)中的一个或两个的存在、位置或官能团的破坏。
在某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间隔中的破坏，即，插入的氨基酸残基的数目不是两个，由此将P4和/或P1变成不同的位置，并且消除P4和/或P1指定。
在本文中通过引用在序列表中提供的天然志贺毒素A亚基的特定氨基酸位置表示特定的弗林蛋白酶切割基序破坏，注意，天然存在的志贺毒素A亚基可以包含含有在其氨基端的约22个氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被去除后产生成熟的志贺毒素A亚基并且是熟练的技术人员能够认出的。此外，通过引用在天然志贺毒素A亚基中特定位置天然存在的特定氨基酸(例如，R关于精氨酸残基)(例如，对于在从氨基端开始的位置251的精氨酸残基，为R251)，然后是在讨论的具体突变中置换该残基的氨基酸(例如，R251A表示在从氨基端开始的氨基酸残基251处的精氨酸置换为丙氨酸的氨基酸置换)来表示包含突变的特定弗林蛋白酶切割基序破坏。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R251被任意不带正电荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基Y247被任意不带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R250被任意不带正电荷的氨基酸残基置换。在其他特定的实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，而是相反包含破坏的侧翼区，在天然位置(例如，241-247和/或252-259)的弗林蛋白酶切割基序侧翼区中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述破坏包括蛋白酶基序区内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒置和/或突变。在某些实施方案中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽可以包含志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)的位置249-251或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)的位置247-250或保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列中的等价位置处天然排列的氨基酸序列的破坏。在某些其他实施方案中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽包含这样的破坏，其包括在蛋白酶基序区内的至少一个氨基酸的缺失。在某些其他实施方案中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽包含这样的破坏，其包括在蛋白酶基序区内插入至少一个氨基酸。在某些其他实施方案中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽包含这样的破坏，其中在蛋白酶基序区内存在至少一个倒置的氨基酸。在某些其他实施方案中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽包含这样的破坏，其包括突变，诸如氨基酸残基置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。在实施例中提供了单个氨基酸置换的实例。
在某些实施方案中，所述耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽包含破坏，所述破坏包含在蛋白酶基序区内的氨基酸置换，其中所述置换发生在选自由下述位置组成的组的天然位置排列的氨基酸处：SEQ ID NO:3的247，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248，SEQID NO:3的250，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251，或在保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列中的等价位置。在某些其他实施方案中，所述置换是置换为任意非保守的氨基酸，并且所述置换发生在选自由下述位置组成的组的天然位置排列的氨基酸残基处：SEQ ID NO:3的247，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248，SEQ ID NO:3的250，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251，或在保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列中的等价位置。在某些其他实施方案中，突变包含选自由下述组成的组的氨基酸置换：R247A，R248A，R250A R251A，或在保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列中的等价位置。
在本发明的分子的某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序九个、十个或更多个羧基端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点或最小的弗林蛋白酶切割基序。换言之，某些实施方案缺少在A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位点。
在某些实施方案中，本发明的分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感性环中的突变。例如，在StxA和SLT-1A中，该蛋白酶敏感性环天然位于位置242-位置261，并且在SLT-2A中，该环天然位于位置241-位置260。基于多肽序列同源性，熟练的技术人员能够鉴定其他志贺毒素A亚基中的该保守的蛋白酶敏感性的环。在某些其他实施方案中，本发明的分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在志贺毒素A亚基的这一蛋白酶敏感性环中的突变，所述突变降低该环内某些氨基酸残基的表面可及性，从而降低弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，本发明的分子包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的切割位点共有基序中的一个或两个精氨酸残基被A、G或H置换的氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含天然位于StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的247-252的区域的缺失，或天然位于SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的246-251的区域的缺失；天然位于StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的244-246的区域的缺失，或天然位于SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的243-245的区域的缺失；或天然位于StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的253-259的区域的缺失，或天然位于SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的252-258的区域的缺失。某些其他实施方案包括含有任意前述突变的组合(可能的话)的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含羧基端截短，所述截短导致弗林蛋白酶切割基序内一个或多个氨基酸残基的缺失。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含羧基端截短，其缺失在最小的切割位点Y/R-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置250，249，248，247，246，245，244，243，242，241，240或更小的位置终止；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置249，248，247，246，245，244，243，242，241或更小的位置终止。
在某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含作为弗林蛋白酶切割基序的部分羧基端截短的突变；然而，本发明的某些分子不包含作为完整的20个氨基酸残基的弗林蛋白酶切割基序的完全羧基端截短的破坏的弗林蛋白酶切割基序。例如，本发明的某些细胞毒性的细胞靶向分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含多至StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中天然位置240的A1片段区部分羧基端截短，但是不是在位置239或更小的位置的羧基端截短。类似地，本发明的某些细胞毒性的细胞靶向分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含多至SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的天然位置239的A1片段区的羧基端截短，但是不是在位置238或更小的位置的羧基端截短。在包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的最大的羧基端截短突变中，仍然存在弗林蛋白酶切割基序的位置P14和P13。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序内的氨基酸置换和羧基端截短二者。在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基置换和羧基端截短二者，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大的位置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置排列的氨基酸残基R248和/或R251；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大的位置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置排列的氨基酸残基Y247和/或R250。在某些实施方案中，所述包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的阶段的志贺毒素效应子多肽还包含在位置P9、P8和/或P7的弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基，从而保留最佳的细胞毒性。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个内部氨基酸残基缺失。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失。例如，StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽包含天然位置排列的氨基酸残基R248和/或R251的内部缺失，其可以与周围残基的缺失组合，诸如，例如，与249，250，247，252等组合；并且SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽包含天然位置排列的氨基酸残基Y247和/或R250的内部缺失，其可以与周围残基的缺失组合，诸如，例如，与248，249，246，251等组合。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含四个连续的氨基酸残基的缺失，其缺失了最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，诸如，例如，StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽缺少R248-R251，并且SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽缺少Y247-R250。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在侧连核心弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基缺失，，诸如，例如，在SLT-1A或StxA中的244-247和/或252-255的缺失。在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含整个表面暴露的蛋白酶切割敏感性环的内部缺失，诸如，例如，对于StxA和SLT-1来源的志贺毒素效应子多肽，缺失天然位置排列的氨基酸残基241-262；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，缺失天然位置排列的氨基酸残基240-261。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序内的内部氨基酸残基缺失和羧基端截短二者。在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基缺失和羧基端截短二者。例如，具有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽可以包含在截短的StxA或SLT-1A中天然位置排列的氨基酸残基248-249和/或250-251或在截短的SLT-2A中氨基酸残基247-248和/或249-250的缺失。在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含四个连续的氨基酸残基的缺失(其缺失了最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R)和羧基端截短，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大的位置终止，并且缺失R248-R251；对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大的位置终止，并且缺失Y247-R250。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换二者。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任意不带正电荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基Y247被任意不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任意不带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基端截短。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任意不带正电荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，天然位置排列的氨基酸残基Y247被任意不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任意不带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换和羧基端截短，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸位置249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大位置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置排列的氨基酸残基R248和/或R251；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应子多肽，截短在天然氨基酸残基位置248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，或更大的位置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置排列的氨基酸残基Y247和/或R250。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基的插入，只要所插入的氨基酸残基不产生新形成的弗林蛋白酶切割位点即可。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基酸残基的插入破坏在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R的精氨酸残基之间的天然间隔，诸如，例如，StxA和SLT-1A来源的多肽包含在249或250并且由此在R248和R251之间的一个或多个氨基酸残基的插入；或SLT-2A来源多肽包含在248或249并且由此在Y247和R250之间的一个或多个氨基酸残基的插入。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和羧基端截短二者。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基置换和氨基酸残基置换二者。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基缺失二者。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基端截短。
在某些实施方案中，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽通过肽键直接融合在包含氨基酸、肽和/或多肽的分子结构部分上，其中所述融合的结构包含单一的连续多肽。在这些融合物实施方案中，在所述破坏的弗林蛋白酶切割基序后的氨基酸序列不应该在融合结合处重新产生弗林蛋白酶切割位点。
除了在高度保守的表面暴露的环结构中和在StxA和SLT-1A中L238至F257和SLT-2A中V237至Q256的区域中天然位置排列的弗林蛋白酶切割基序之外，志贺毒素A亚基可能具有其他的弗林蛋白酶切割基序。例如，StxA和SLT-1A包含在天然位置排列的氨基酸残基区220至223附近的弗林蛋白酶切割基序。然而，没有证据证明在志贺毒素A亚基中的这一第二弗林蛋白酶位点在体内被切割。相反，除了在Arg250之外，在体外用人弗林蛋白酶处理Stx2权毒素在A亚基中的任意其他的R-x-x-R基序没有产生切割(氨基酸残基179-222的天然位置排列的基序)，这表明在志贺毒素A亚基内的其他潜在的二元位点不容易被弗林蛋白酶接近(Faqerquist C，Sultan O，J Biomed Biotechnol 2010:123460(2010))。尽管也可以改造破坏其他切割位点，例如，在StxA1和SLT-1A中L238至F257的弗林蛋白酶切割基序，但是破坏在SLT-1A中220至223区域中天然位置排列的弗林蛋白酶切割基序可能使其细胞毒性活性降低低于合理的活性(参见，例如Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999))，并且，如果220-223中的蛋白酶位点不是蛋白酶可及的，将提供很少与蛋白酶耐受性相关的益处。
B.位于志贺毒素效应子多肽的羧基端的分子结构部分
本发明的某些分子包含与志贺毒素效应子多肽的羧基端连接的分子结构部分。本发明允许在耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的羧基端连接相对大的分子结构部分，而与弗林蛋白酶可切割的志贺毒素效应子多肽相比，没有任何志贺毒素效应子细胞毒性损失。术语“分子结构部分”包括多肽、蛋白、细胞毒性试剂、多核苷酸、检测促进剂、小分子化疗剂、多糖、脂质、和其他生物分子，不管是天然存在的还是合成的。
在中毒的细胞内的志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶蛋白水解提供至少三个事件：暴露志贺毒素A1片段的羧基端，将A1片段与所有其他分子结构部分释放，和将A1片段从内质网转运到细胞溶胶中。A1片段与A2片段和志贺全毒素其余部分的解离是A1片段从内质网的腔转运到细胞溶胶中所必需的，并且到达细胞溶胶区室的志贺全毒素的唯一的成分是A1片段(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Tam P，Lingwood C，Microbiology 153:2700-10(2007)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。
在志贺毒素中毒过程中弗林蛋白酶切割的一个重要的功能似乎是使志贺毒素A1片段的羧基端暴露。认为在中毒的细胞的内质网中A1片段羧基端的暴露是最佳的亚细胞路线递送和细胞毒性所必需的。当在中毒细胞的内质网中，志贺毒素A亚基来源的结构不能暴露A1片段的羧基端时，则该结构的细胞毒性作用被减少(Burgess B，Roberts L，MolMicrobiol 10:171-9(1993)；Garred
Figure BDA0003274689110000601
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun357:144-9(2007))。这可以通过一个或多个空间上覆盖志贺毒素A1片段羧基端的分子结构部分的持续存在导致A1片段到细胞溶胶的正常有效的细胞内按路径发送的波动进行解释。缺少弗林蛋白酶蛋白水解加工的志贺毒素A亚基来源的结构不能有效地到达中毒细胞的细胞溶胶(Garred
Figure BDA0003274689110000602
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000603
等人，Exp Cell Res218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999))。
在志贺毒素中毒过程中弗林蛋白酶切割的另一个重要的功能是将志贺毒素A1片段与志贺全毒素其余部分释放。认为在中毒细胞的内质网中A1片段的释放是最佳的亚细胞路线递送和细胞毒性必需的。当志贺毒素A1片段不能被弗林蛋白酶切割并且释放到中毒细胞的内质网中时，则细胞毒性作用减少(Burgess B，Roberts L，Mol Microbiol 10:171-9(1993)；Garred
Figure BDA0003274689110000611
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。同样地，这可以通过一个或多个与志贺毒素A1片段的羧基端连接的分子结构部分的持续存在导致A1片段到细胞溶胶的正常有效细胞内按路径发送的波动进行解释。
对于最大的志贺毒素细胞毒性，模型表明志贺毒素A1片段与所有同其羧基端连接的和/或空间上覆盖其羧基端的分子结构部分释放对于有效的细胞溶胶按路径发送、最佳的蛋白酶体避开、最佳的催化结构形成、和最大的酶活性是重要的(Garred
Figure BDA0003274689110000612
等人，ExpCell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000613
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005)；Yu M，Haslam D，Infect Immun 73:2524-32(2005)；Kurmanova A等人，BiochemBiophys Res Commun 357:144-9(2007)；Smith M等人，Infect Immun 77:2730-40(2009)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。例如，在野生型志贺全毒素中，志贺毒素A2片段与A1片段融合，并且志贺毒素B亚基的五聚体结合在A2片段的羧基端(Fraser M等人，Nat Struct Biol 1:59-64(1994))。类似地，最大的志贺毒素细胞毒性可能需要使A1片段与所有同其羧基端连接的分子结构部分(诸如，例如，至少与A2片段(4.5-4.7kDa)一样大的结构部分)释放和志贺全毒素(42.7-43.2kDa)其余部分大部分的释放。
相关地，最大的志贺毒素细胞毒性可能需要使A1片段与所有在空间上覆盖所述A1片段的羧基端的羧基端结构部分释放，因为该区域必须暴露才能有效地转运到细胞溶胶中(参见Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66:5252-9(1998)；LaPointe P等人，J Biol Chem280:23310-18(2005)；Yu M，Haslam D，Infect Immun 73:2524-32(2005)；Li S等人，PLoSOne 7:e41119(2012))。
另外，对于最大的志贺毒素细胞毒性，使A1片段与包含细胞靶向结合结构域(其结合细胞膜成分，如志贺毒素B亚基，其结合脂质双层膜中的神经节苷脂)的分子结构部分释放可能是重要的。可能的是，当A1片段共价连接到以高亲和力结合内质膜靶标的细胞靶向性结构部分时，则所述志贺毒素A1片段保持连接在内质网的脂膜上，以这种方式干扰有效的A1片段释放和/或转运到细胞溶胶所需要的机制和事件。
本发明提供示例性的结构，所述结构证明在上文模型中志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶-切割功能不是合成的细胞靶向分子所表现出的志贺细胞毒性的野生型水平所需要的(见实施例，同前所述)。明显地，对于向细胞溶胶的有效的细胞内按路径发送，不需要暴露志贺毒素A1片段的羧基端，并且明显地，对于最大的志贺毒素细胞毒性，不需要使A1片段与所有其他分子结构部分释放。因此，在细胞靶向分子中，志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割基序可以是被破坏的，而不损害任何细胞毒性，除非存在位于志贺毒素效应子多肽区的羧基端的分子结构部分与细胞靶向分子。
本发明的某些分子包含与志贺毒素效应子多肽的羧基端连接的分子结构部分。在某些其他实施方案中，所述连接包括志贺毒素效应子多肽的羧基端与分子结构部分直接或间接的共价连接。在某些其他实施方案中，所述连接包括肽键，其使志贺毒素效应子多肽的羧基端与分子结构部分的一个或多个氨基酸残基融合。在某些其他实施方案中，志贺毒素效应子多肽与分子结构部分融合形成单一的连续的多肽，使得志贺毒素效应子多肽物理位于所述连续的多肽内在所述分子结构部分的氨基端。
分子结构部分的尺寸可以不同。本发明的分子的分子结构部分包括：足够大足以在空间上覆盖志贺毒素A1片段的羧基端的结构部分，包含能够结合脂膜结合的靶标的结合区的任意尺寸的结构部分，提供邻近本发明的志贺毒素A1片段的羧基端区域的良好结构化的三级多肽结构的任意尺寸的结构部分，比志贺毒素A1片段的羧基端更加极性和亲水的任意尺寸的结构部分，和等于或大于天然的志贺毒素A亚基的尺寸(约28kDa)的任意结构部分。尺寸等于或大于28kDa的分子结构部分在本文中称为“相对大的”。
在某些实施方案中，本发明的分子可以包含含有肽的分子结构部分。在某些实施方案中，本发明的分子可以包含具有1.5kDa以上质量的分子结构部分。在某些实施方案中，本发明的分子可以包含具有至少4.5kDa，6，kDa，9kDa，12kDa，15kDa，20kDa，25kDa，28kDa，30kDa，41kDa，50kDa，100kDa，或更大的质量的分子结构部分，只要所述分子保留本文所述的适当的志贺毒素生物活性。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约4.5kDa的质量或另外志贺毒素A2片段的等效质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持与志贺毒素A1片段的羧基端连接，而不破坏中毒细胞内亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约7.6kDa的质量或另外志贺毒素B亚基的等效质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持与志贺毒素A1片段的羧基端连接，而不破坏中毒细胞内亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约6-10kDa或更大的质量，并且包含含有抗体模拟物或备用抗体格式的结合区，诸如，例如，经工程改造的Armadillo重复多肽(ArmRPs)，经工程改造的纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(monobodies，AdNectinsTM，或AdNexinsTM)；包含经工程改造的锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；经工程改造的低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；经工程改造的蛋白-A-来源的Z结构域(AffibodiesTM)；经工程改造的、γ-B晶体蛋白来源的支架或经工程改造的、泛蛋白来源的支架(Affilins)；和Sac7d-来源的多肽(
Figure BDA0003274689110000631
或affitins)。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约11kDa或更大的质量，并且包含含有免疫球蛋白结构域的结合区，并且所述结合区以高亲和力特异性结合细胞外靶标生物分子，诸如，例如，VHH或纳米抗体。在某些其他实施方案中，所述分子结构部分具有约24kDa或更大的质量，并且包含含有免疫球蛋白结构域的结合区，并且所述结合区以高亲和力特异性结合细胞外靶标生物分子，诸如，例如，scFv。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约12kDa的质量或另外志贺毒素A2片段与B亚基复合物的等效质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持连接在志贺毒素A1片段的羧基端，而不破坏中毒细胞内的亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率。
在某些实施方案中，所述分子结构部分具有约28kDa的质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持与志贺毒素A1片段的羧基端连接，而不破坏中毒细胞内的亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率；然而，本文的实施例证明了包含与28kDa分子结构部分融合的志贺毒素A1片段的耐受弗林蛋白酶-切割的分子不表现出对亚细胞按路径发送、核糖体抑制或细胞毒性的任何明显的破坏。
在某些实施方案中，相对大的分子结构部分具有约39kDa的质量或另外志贺毒素B亚基五聚体的等效质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持与志贺毒素A1片段的羧基端连接，而不破坏中毒细胞内的亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率。
在某些实施方案中，相对大的分子结构部分具有约43.2kDa的质量或另外志贺毒素A2片段与B亚基五聚体复合物的等效质量。出乎意料的是，这一尺寸的结构部分可以保持与志贺毒素A1片段的羧基端连接，而不破坏中毒细胞内的亚细胞按路径发送和核糖体失活的效率。
在某些实施方案中，所述分子结构部分是分支的。在某些实施方案中，所述分子结构部分是非蛋白样的。在某些实施方案中，所述分子结构部分是细胞毒性试剂或检测促进剂，诸如本文所述的试剂。
在某些实施方案中，所述分子结构部分在空间上覆盖本发明的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段多肽的羧基端。就本发明的目的而言，“在空间上覆盖”或“空间上覆盖”是指直接共价连接在本发明的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段多肽的羧基端的结构部分。在某些实施方案中，所述分子结构部分在空间上覆盖本发明的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段多肽的羧基端区域，使得在本发明的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段多肽的羧基端区域内的疏水区保持被包埋，并且在内质网中不被表面暴露，由此保持A1片段区的羧基端被覆盖，并且防止A1片段来源的区域的羧基端的细胞识别，诸如，例如，被ERAD机制识别。
在某些实施方案中，所述分子结构部分包含比志贺毒素A1片段的羧基端区域更加极性和亲水性的多肽，以使在本发明的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段多肽的羧基端区域内的疏水区保持被包埋，并且在内质网中不表面暴露，由此保持A1片段区的羧基端被覆盖并且防止A1片段来源的区域的羧基端的细胞识别，诸如，例如，被ERAD机制识别。
在某些实施方案中，所述分子结构部分包含能够特异性结合至少一种靶标生物分子的结合区，所述靶标生物分子膜结合在内质网膜中。
在某些实施方案中，所述分子结构部分包含能够特异性结合至少一种靶标生物分子的结合区。
C.本发明包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞靶向分子
本发明的分子全都包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应子多肽。本发明的细胞靶向分子包含与细胞靶向性结合区连接的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽。这意味着，当与其耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽被包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应子多肽替换的相同的细胞靶向分子相比时，所述细胞靶向分子更加耐受蛋白酶切割。
与更加蛋白酶切割敏感性的变体相比，耐受蛋白酶切割的分子在施用到脊椎动物中后可以表现出增加的体内半衰期。此外，与更加蛋白酶切割敏感性的变体(其具有更大的断裂的倾向性，由此释放毒性成分)相比，包含毒性成分(例如，毒素效应子区)的耐受蛋白酶切割的细胞靶向分子可以表现出降低的非特异性毒性。
本发明的细胞靶向分子可以包含单个多肽、彼此连接的多个多肽、分支的多肽成分和/或一个或多个非多肽结构部分。
本发明的细胞靶向分子的结合区包含能够特异性结合靶标生物分子的肽或多肽区。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区包含一种或多种能够选择性且特异性结合细胞外靶标生物分子的多肽。结合区可以包含一种或多种不同的肽或多肽结构部分，诸如随机产生的肽序列，天然存在的配体或其衍生物，免疫球蛋白衍生的结构域，作为免疫球蛋白结构域的替代物的合成的经工程改造的构架等。
本领域中存在多种可用于使多肽通过它们的结合特征靶向特定的细胞型的结合区，诸如配体、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物和抗体经工程改造的替代物。
按照一个具体单非限制性的方面，本发明的分子的结合区包含天然存在的配体或其保留针对细胞外靶标生物分子(通常是细胞表面受体)的结合功能性的衍生物。例如，可以使用本领域已知的多种细胞因子、生长因子和激素使细胞靶向分子靶向表达同源的细胞因子受体、生长因子受体或激素受体的特定细胞型的细胞表面。配体的某些非限制性的实例包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、白介素(诸如IL-2，IL-6，和IL-23)以及B细胞活化因子(BAFF)。
按照某些其他的实施方案，所述结合区包含能够结合细胞外靶标生物分子的合成配体(参见，例如Liang S等人，J Mol Med 84:764-73(2006)；Ahmed S等人，Anal Chem 82:7533-41(2010)；Kaur K等人，Methods Mol Biol 1248:239-47(2015))。
按照一个具体但非限制性的方面，所述结合区可以包含免疫球蛋白型结合区。用于本文的术语“免疫球蛋白型结合区”是指能够结合一个或多个靶标生物分子(诸如抗原或表位)的多肽区域。结合区在功能上可以由它们的结合靶分子的能力来限定。免疫球蛋白型结合区通常源自抗体或抗体样结构；但是，预见到来自其他来源的替代支架在该术语的范围内。
免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基并且拥有特征性Ig折叠，其中典型地7-9个反向平行的β链排列为两个形成夹心样结构的β片层。Ig折叠通过夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和链中半胱氨酸残基之间的高度保守的二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-组)、恒定的(IgC或C-组)或中间的(IgI或I-组)。一些Ig结构域可能与互补性决定区或互补决定区(CDR)有关，所述互补决定区对于抗体与它们的表位的结合的特异性而言是重要的。Ig-样结构域也存在于非免疫球蛋白的蛋白中，并且基于此被分类为Ig蛋白超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)提供了含有Ig-样结构域的家族的成员的清单。
如在本文中所使用的，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别是指任何抗体VH或VL结构域(例如，人VH或VL结构域)及其至少保持相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如，源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDRs或ABRs中断的“构架”区组成。构架区用于排列用于特异性结合抗原表位的CDRs。从氨基端到羧基端，VH和VL结构域二者均包含以下构架(FR)和CDR区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对于骆驼科VHH片段，软骨鱼的IgNARs，VNAR片段，以及它们的衍生物，存在包含相同的基本排列的单一重链可变结构域：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。
免疫球蛋白型结合区可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中例如通过分子工程改造或通过文库筛选进行选择，所述氨基酸序列已经与天然抗体或非免疫球蛋白蛋白的Ig-样结构域的氨基酸序列有所不同。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区的产生中的关联性，可以重新设计抗体以获得期望的特征，诸如较小的尺寸、细胞进入(cell entry)、或其他治疗改善。可能的变化有很多，并且范围可以为从仅一个氨基酸的改变到例如可变区的完全重新设计。典型地，将做出可变区的改变以便改善抗原结合特征、改善可变区稳定性、或降低免疫原性应答的可能。
还存在众多预见到作为本发明的分子(诸如例如，本发明的细胞靶向分子)的成分的免疫球蛋白型结合区。免疫球蛋白结合区通常包含一个或多个CDRs。在某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区源自免疫球蛋白结合区域，诸如能够结合细胞外靶标生物分子的抗体互补位。在某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含经工程改造的多肽，所述经工程改造的多肽并非源自任何免疫球蛋白结构域，而是通过提供对细胞外靶标生物分子的高亲和力结合而象免疫球蛋白结合区一样发挥作用。这种经工程改造的多肽可以任选地包括包含来自如本文中所述的免疫球蛋白的互补决定区或者基本上由所述互补决定区组成的多肽支架。
在现有技术中还存在众多通过它们的高亲和性结合特征用于靶向多肽或特定细胞型的结合区。在某些实施方案中，本发明的结合区选自包括下述的组：单结构域抗体结构域(sdAb)、纳米抗体、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段)、二价纳米抗体、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、双特异性的串联的scFv片段、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定化的抗原结合(Fab)片段、二价F(ab’)2片段、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微抗体、双特异性微抗体、二聚CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受限的构架区3、CDR3、构架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、以及保留它的互补位和结合功能的前述物质的任何遗传操作的对应物(关于综述，参见Weiner L，Cell 148:1081-4(2012)；Ahmad Z等人，Clin Dev Immunol 2012:980250(2012))。
根据某些其他实施方案，所述结合区包括免疫球蛋白结构域的经工程改造的替代支架，其表现出相似的功能特征，诸如对靶标生物分子的高亲和力和特异性结合，并且允许改善的特征的改造，诸如更大的稳定性或降低的免疫原性。对于本发明的蛋白的某些实施方案，所述结合区选自包括下述的组：经工程改造的Armadillo重复多肽(ArmRPs)，经工程改造的、纤连蛋白来源的、第10个纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单抗体、AdNectinsTM或AdNexinsTM)；经工程改造的、生腱蛋白来源的、生腱蛋白III型结构域(CentrynsTM)；经工程改造的、含有锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；经工程改造的、低密度-脂蛋白-受体来源的、A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂质运载蛋白(anticalins)；经工程改造的、蛋白酶抑制剂来源的、Kunitz结构域；经工程改造的、蛋白-A来源的、Z结构域(AffibodiesTM)；经工程改造的、γ-B晶体蛋白来源的支架或经工程改造的、泛蛋白来源的支架(Affilins)；Sac7d来源的多肽(
Figure BDA0003274689110000681
或affitins)；经工程改造的、Fyn来源的、SH2结构域
Figure BDA0003274689110000682
和经工程改造的抗体模拟物；以及保留它的结合功能性的前述物质的任何遗传操作的对应物(
Figure BDA0003274689110000683
A，Plückthun A，J Mol Biol 305:989-1010(2001)；Xu L等人，Chem Biol 9:933-42(2002)；Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004)；Binz H等人，Nat Biotechnol 23:1257-68(2005)；Holliger P，Hudson P，Nat Biotechnol23:1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17:653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352:95-109(2007)；Byla P等人，J Biol Chem 285:12096(2010)；Zoller F等人，Molecules 16:2467-85(2011)；Alfarano P等人，Protein Sci 21:1298-314(2012)；Madhurantakam C等人，Protein Sci 21:1015-28(2012)；VaradamsettyG等人，J Mol Biol 424:68-87(2012))。
在本发明某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区来源于纳米抗体或单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH。通常，纳米抗体由在骆驼科动物和软骨鱼类(Chondrichthyes)中发现的种类的天然存在的单一、单体可变结构域抗体(sdAbs)的片段构建。通过截短单一、单体可变结构域以产生较小和较稳定的分子，诸如，例如，IgNAR，VHH，和VNAR构建体，由这些天然存在的抗体改造出纳米抗体。由于它们的小尺寸，纳米抗体能够与不能接近整个抗体的抗原结合。
任何以上结合区可以用作本发明的细胞靶向分子的成分，只要所述结合区成分对细胞外靶标生物分子具有10-5至10-12摩尔/升、优选地小于200纳摩尔(nM)的解离常数即可。
细胞特异性靶向可以通过将本发明的分子连接到细胞靶向性载体上而实现，所述细胞靶向性载体诸如，例如，脂质体，聚合物，纳米载体，微球体，纳米球体，树状高分子(dendrimers)，聚合的胶束，硅或碳材料，诸如，例如，纳米管，纳米棒和纳米角，磁性纳米颗粒，微乳剂，和其他纳米结构(Sinha R等人，Molecular Cancer Therapeutics 5:1909–17(2006)；L Brinton等人，Journal of the National Cancer Institute 100:1643-8(2008)；Tanaka T等人，Biomed Micro Devices 11:49-63(2009))。连接可以使用共价键和/或包封实现。
细胞外靶标生物分子
本发明的分子的结合区包含这样的多肽区域：其能够特异性地结合细胞外靶标生物分子，优选地其物理连接至目标细胞类型(诸如癌细胞、肿瘤细胞、浆细胞、被感染的细胞或携带细胞内病原体的宿主细胞)的表面。
术语“靶标生物分子”表示这样的生物分子，通常是蛋白或通过翻译后修饰(诸如糖基化)而修饰的蛋白：其能够被结合区结合以使蛋白靶向生物体内的特定细胞类型或位置。细胞外靶标生物分子可以包括多个表位，包括未修饰的多肽、通过添加生化官能团而修饰的多肽、和糖脂(参见例如美国专利5,091,178；EP 2431743)。合乎需要的是，细胞外靶标生物分子在与本发明的分子相互作用以后被内源性地内化或容易地被迫内化。
就本发明的目的而言，关于修饰靶标生物分子，术语“细胞外的”表示这样的生物分子：它的结构的至少一部分暴露于细胞外环境。细胞外靶标生物分子包括细胞膜成分、跨膜蛋白、细胞膜锚定的生物分子、细胞表面结合的生物分子和分泌的生物分子。
关于本发明，当用于描述靶标生物分子时，短语“物理连接”是指将靶标生物分子或其部分与细胞外部关联的共价和/或非共价分子间相互作用，诸如靶标生物分子和细胞之间的多个非共价相互作用，其中每个单独相互作用的能量是在约1-5千卡的量级(例如静电键、氢键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有嵌膜蛋白与细胞膜、以及周围膜蛋白物理连接。例如，细胞外靶标生物分子可能包含跨膜区域、脂质锚、糖脂锚和/或与包含前述任一种的因子非共价地结合(例如通过非特异性疏水相互作用和/或结合脂质的相互作用)。
可以基于众多标准(诸如它们的靶标生物分子的细胞类型特异性的表达和/或它们的靶标生物分子关于特定细胞类型的物理定位)来设计或选择本发明的蛋白的结合区。例如，本发明的某些细胞靶向分子包含这样的结合结构域：其能够使由仅一种细胞类型排他地表达的细胞表面靶标结合至细胞表面。这允许相对于不表达该细胞外靶标生物分子的“旁观”细胞类型以高优先性(至少3-倍的细胞毒性作用)进行特定细胞类型的靶向性细胞杀伤。备选地，如果细胞外靶标生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不被靶向的细胞类型物理连接，则结合区的靶标生物分子的表达可以不专属于一种细胞类型。这还允许相对于不表达显著量的细胞外靶标生物分子或不与显著量的细胞外靶标生物分子物理连接的“旁观”细胞类型以高优先性(至少3-倍的细胞毒性作用)进行特定细胞类型的靶向性细胞杀伤。可以在不同细胞条件下，诸如离体、体外培养的或在体内——包括在多细胞生物体内在它们天然位置的原位的细胞，用本发明的细胞毒性的细胞靶向分子杀伤被靶向的细胞。
本发明的蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子可以包括过比例地或排他地存在于癌细胞、免疫细胞和被细胞内病原体(诸如病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物)感染的细胞中的生物标志物。
本发明的细胞靶向分子的一般结构是模块式的，原因在于，多个多样性的结合区可以与相同的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽一起使用，以提供多种细胞外靶标生物分子的多样性靶向，并且由此使细胞毒性、白细胞淤积和/或外源物质递送靶向多种不同的细胞型。没有细胞毒性的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽仍然可用于将外源物质递送到细胞、某些亚细胞区室中，和/或提供到细胞溶胶的有效的亚细胞路线递送。任选地，本发明的细胞靶向分子可以进一步包含羧基端内质网保留/回收信号基序，诸如KDEL。
D.KDEL家族成员的内质网保留/回收信号基序
就本发明的目的而言，短语“内质网保留/回收信号基序”、KDEL-型信号基序(SEQID NO:62)，或信号基序表示能够在真核细胞内起作用以促进蛋白通过KDEL受体向内质网的亚细胞定位的KDEL家族的任何成员(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)。
羧基端赖氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-亮氨酸(KDEL(SEQ ID NO:62))序列是真核细胞中的可溶性蛋白的一种规范的、内质网停留和取回信号基序，且被KDEL受体识别(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)(关于综述，参见Capitani M，Sallese M，FEBS Lett 583:3863-71(2009))。KDEL信号基序家族包括许多KDEL-样基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)，诸如HDEL(SEQ ID NO:64)，RDEL(SEQ ID NO:66)，WDEL(SEQ ID NO:67)，YDEL(SEQ ID NO:68)，HEEL(SEQ ID NO:70)，KEEL(SEQ ID NO:71)，REEL(SEQ ID NO:72)，KFEL(SEQ ID NO:75)，KIEL(SEQ ID NO:87)，DKEL(SEQ ID NO:88)，KKEL(SEQ ID NO:91)，HNEL(SEQ ID NO:95)，HTEL(SEQ ID NO:96)，KTEL(SEQ ID NO:97)，和HVEL(SEQ ID NO:98)，它们都存在于蛋白的羧基端，所述羧基端已知是遍布于多个系统发生界的生物体的内质网的腔的停留者(MunroS，Pelham H，Cell 48:899-907(1987)；Raykhel I等人，J Cell Biol 179:1193-204(2007))。KDEL信号基序家族(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)包括至少46个使用合成构建体证实的多肽变体(Raykhel，J Cell Biol 179:1193-204(2007))。另外的KDEL(SEQ ID NO:62)信号基序包括ALEDEL(SEQ ID NO:109)，HAEDEL(SEQ ID NO:110)，HLEDEL(SEQ ID NO:111)，KLEDEL(SEQ ID NO:112)，IRSDEL(SEQ ID NO:113)，ERSTEL(SEQ ID NO:114)和RPSTEL(SEQ ID NO:115)(Alanen H等人，J Mol Biol 409:291-7(2011))。一种代表大多数KDEL信号基序(SEQ ID NO:62)的普遍化共有基序已经描述为[KRHQSA]-[DENQ]-E-L(SEQID NO:116)(Hulo N等人，Nucleic Acids Res 34:D227-30(2006))。
含有KDEL家族信号基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)的蛋白被遍布于高尔基复合体的KDEL受体(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)结合并通过微管依赖性机制运输至内质网用于释放进内质网的腔中(Griffiths G等人，J Cell Biol 127:1557-74(1994)；
Figure BDA0003274689110000721
G，Rothman J，J Cell Biol 129:309-19(1995))。KDEL受体(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)在高尔基复合体和内质网之间动态地循环(Jackson M等人，EMBO J.9:3153-62(1990)；Schutze M等，EMBO J 13:1696–1705(1994))。
就本发明的目的而言，KDEL家族的成员(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)包括合成的信号基序，其能够在真核细胞内起作用以促进蛋白通过KDEL受体(‘KDEL’公开为SEQ IDNO:62)向内质网的亚细胞定位。换而言之，KDEL家族的有些成员(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)可能不存在于自然界中，或尚未在自然界中观察到，但是已经或可以使用本领域已知的方法构建和根据经验进行验证；例如，参见Raykhel I等人，J Cell Biol 179:1193-204(2007)。
作为本发明的分子的某些实施方案的成分，KDEL-型信号基序在分子内物理地定位、朝向或排列，使得它是在多肽或蛋白成分的羧基端。
就本发明的细胞靶向分子的目的而言，志贺毒素效应子多肽和细胞靶向性结合区相对于彼此或整个蛋白的N-端和C-端的具体顺序或取向不是固定的(例如，参见图1)。在本发明的细胞靶向分子中，结合区和志贺毒素效应子多肽区以及任意的分子结构部分(如果存在)可以彼此直接连接和/或适当地通过一个或多个本领域公知的接头彼此连接。
E.连接本发明的分子的成分的键
本发明的各个分子结构部分和多肽和/或蛋白成分，例如结合区和志贺毒素效应子多肽区(其可以是有细胞毒性的和/或携带一个或多个改变、降低或消除催化活性和/或细胞毒性的突变)，可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。结合区的各个多肽亚成分，例如，CDR、ABR、VHH区、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、IgNAR区和/或VNAR区，可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接(例如，参见Weisser N，Hall J，Biotechnol Adv 27:502-20(2009)；ChenX等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。本发明的蛋白和多肽成分，例如，多链结合区域，可以通过本领域众所周知的一个或多个接头适当地彼此连接或连接至本发明的其他多肽成分和/或分子结构部分。本发明的肽成分，例如，KDEL家族内质网保留/回收信号基序(‘KDEL’公开为SEQ ID NO:62)，可以通过本领域众所周知的一个或多个接头(诸如蛋白性接头)适当地连接至本发明的另一个成分。
合适的接头通常是允许本发明的每个多肽成分以这样的三维结构折叠的那些接头，所述三维结构非常类似于在没有任何接头或其他成分的情况下单独产生的多肽成分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头，诸如例如各种非蛋白性的碳链，无论是分支的还是环状的(例如，参见Alley S等人，Bioconjug Chem 19:759-65(2008)Ducry L，Stump B，Bioconjug Chem 21:5-13(2010)；Chen X等人，Adv Drug DelivRev 65:1357-69(2013))。
合适的接头可以是蛋白性的，且包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性的接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性的接头典型地具有约2至约50个氨基酸残基，诸如，例如，约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度取决于多种因素，诸如，例如，选择所述接头所期望的一种或多种性质(例如，参见Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。
合适的接头可以是非蛋白性的，例如，化学接头(例如，参见Dosio F等人，Toxins3:848-83(2011)；Feld J等人，Oncotarget 4:397-412(2013))。本领域已知的各种非蛋白性的接头可以用于连接志贺毒素效应子多肽与大于20千道尔顿的分子结构域，诸如常用于将免疫球蛋白多肽缀合到异源多肽上的接头。例如，使用它们的氨基酸残基的功能侧链和碳水化合物结构部分(诸如，例如，羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环状环基)，可以连接本发明的分子的多肽成分。例如，二硫键和硫醚键可以用于连接两个或更多个多肽(参见例如Fitzgerald D等人，Bioconjugate Chem 1:264-8(1990)；Pasqualucci L等人，Haematologica 80:546-56(1995))。另外，非天然的氨基酸残基可以与其他功能侧链诸如酮基一起使用(参见例如Axup J等人，Proc Natl Acad Sci USA.109:16101-6(2012)；SunS等人，Chembiochem Jul 18(2014)；Tian F等人，Proc Natl Acad Sci USA 111:1766-71(2014))。非蛋白性化学接头的例子包括、但不限于：N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，S-(N-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC或MCC)，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，马来酰亚胺基己酰基(MC)，马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基二氯苯酚，2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)，3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼，Ellman氏试剂，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸(参见例如Thorpe P等人，Eur J Biochem 147:197-206(1985)；Thorpe P等人，Cancer Res 47:5924-31(1987)；Thorpe P等人，Cancer Res 48:6396-403(1988)；Grossbard M等人，Blood 79:576-85(1992)；Lui C等人，Proc Natl Acad Sci USA93:8618-23(1996)；Doronina S等人，Nat Biotechnol 21:778-84(2003)；Feld J等人，Oncotarget 4:397-412(2013))。
合适的接头(无论是蛋白性的还是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头(参见例如Dosio F等人，Toxins 3:848-83(2011)；Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013)；Feld J等人，Oncotarget 4:397-412(2013))。
可以选择蛋白性的接头用于掺入本发明的重组融合蛋白中。例如，本发明的成分多肽或它们的亚成分可以通过一个或多个包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽的接头连接。对于本发明的重组融合蛋白，接头典型地包含约2-50个氨基酸残基，优选约5-30个氨基酸残基(Argos P，J Mol Biol 211:943-58(1990)；Williamson M，Biochem J 297:240-60(1994)；George R，Heringa J，Protein Eng 15:871-9(2002)；Kreitman R，AAPS J 8:E532-51(2006))。通常，蛋白性的接头包含大多数具有极性的、不带电荷的和/或带电荷的残基的氨基酸残基，诸如，例如，苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸(参见例如Huston J等人Proc Natl Acad Sci USA.85:5879-83(1988)；Pastan I等人，Annu Rev Med58:221-37(2007)；Li J等人，Cell Immunol 118:85-99(1989)；Cumber A等人BioconjChem 3:397-401(1992)；Friedman P等人，Cancer Res 53:334-9(1993)；Whitlow M等人，Protein Engineering 6:989-95(1993)；Siegall C等人，J Immunol 152:2377-84(1994)；Newton等人Biochemistry 35:545-53(1996)；Ladurner等人J Mol Biol 273:330-7(1997)；Kreitman R等人，Leuk Lymphoma 52:82-6(2011)；U.S.4,894,443)。蛋白性的接头的非限制性例子包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)(SEQ IDNO:117)、缬氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM(SEQ ID NO:118)，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，且x是1-10的整数。
可以基于期望的性能选择蛋白性的接头。技术人员可以记住特定特征来选择蛋白性的接头，诸如以优化融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性能、药效动力学性能和/或在融合构建体的背景下融合的结构域的活性(相对于相同结构域自身的活性)中的一种或多种。例如，可以基于柔性、刚度和/或切割性选择蛋白性的接头(参见例如ChenX等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。技术人员在选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。可以选择某些接头以优化表达(参见例如Turner D等人，J ImmunolMethods 205:43-54(1997))。可以选择某些接头以促进相同多肽或蛋白之间(以形成同型多聚体)或不同多肽或蛋白之间(以形成异型多聚体)的分子间相互作用。例如，可以选择蛋白性的接头，其允许本发明的分子的多肽成分之间的期望的非共价相互作用，诸如，例如，与二聚体和其他更高级多聚体的形成有关的相互作用(参见例如U.S.4,946,778)。
柔性的蛋白性的接头经常具有大于12个氨基酸残基的长度，且富含小的、非极性的氨基酸残基、极性的氨基酸残基和/或亲水的氨基酸残基，诸如，例如，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸(参见例如Bird R等人，Science 242:423-6(1988)；Friedman P等人，Cancer Res53:334-9(1993)；Siegall C等人，J Immunol 152:2377-84(1994))。可以选择柔性的蛋白性的接头以增加成分之间的空间分离和/或允许成分之间的分子内相互作用。例如，多种“GS”接头是技术人员已知的，且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成，有时在重复单元中，例如(GxS)n(SEQ ID NO:119)，(SxG)n(SEQ ID NO:120)，(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)和(G)n(SEQ ID NO:122)，其中x是1-6，且n是1-30(参见例如WO 96/06641)。柔性的蛋白性的接头的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:123)，GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:124)，GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:125)，GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:126)，EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:127)，SRSSG(SEQ ID NO:128)，和SGSSC(SEQ ID NO:129)。
刚性的蛋白性的接头经常是坚硬的α-螺旋结构且富含脯氨酸残基和/或一个或多个在战略上放置的脯氨酸(参见Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。可以选择刚性的接头以防止连接的成分之间的分子内相互作用。
可以选择合适的接头以允许成分的体内分离，例如，由于切割和/或环境特异性的不稳定性(参见Dosio F等人，Toxins 3:848-83(2011)；Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev65:1357-69(2013))。体内可切割的蛋白性的接头能够通过蛋白水解加工和/或还原环境(经常在生物体内的特定部位或在特定细胞类型内)而解连(参见例如Doronina S等人，Bioconjug Chem 17:144-24(2006)；Erickson H等人，Cancer Res 66:4426-33(2006))。体内可切割的蛋白性的接头经常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一个或多个半胱氨酸对形成的二硫键(参见例如Pietersz G等人，Cancer Res 48:4469-76(1998)；The J等人，JImmunol Methods 110:101-9(1998)；参见Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。可以将体内可切割的蛋白性的接头设计成对仅存在于生物体中的某些位置、或细胞内的区室的蛋白酶敏感，和/或其仅在某些生理学或病理学状况下变得有活性(诸如，例如，具有异常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位过表达的蛋白酶，和由病原性微生物特异性地表达的蛋白酶)。例如，存在本领域已知的蛋白性的接头，其被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型内的蛋白酶和仅在病理学状况(如癌症或炎症)下存在的蛋白酶切割，例如，R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SEQ ID NO:116)。
在本发明的分子的某些实施方案中，可以使用这样的接头：其包含一个或多个蛋白酶敏感的位点以提供存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的分子的某些实施方案中，可以使用不可切割的接头以在施用给脊椎动物生物体以后降低不希望的毒性(参见例如Polson等人，Cancer Res 69:2358-(2009))。
合适的接头可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头，无论是蛋白性的还是非蛋白性的(参见ChenX等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。
合适的可切割的接头可以包括含有本领域已知的可切割基团的接头，诸如，例如，Zarling D等人，J Immunol 124:913-20(1980)；Jung S，Moroi M，Biochem Biophys Acta761:152-62(1983)；Bouizar Z等人，Eur J Biochem 155:141-7(1986)；Park L等人，JBiol Chem 261:205-10(1986)；Browning J，Ribolini A，J Immunol 143:1859-67(1989)；Joshi S，Burrows R，J Biol Chem 265:14518-25(1990)所述的接头。
合适的接头可以包括pH敏感的接头。例如，可以由于它们在较低pH环境中的不稳定性而选择某些合适的接头以提供在靶细胞的亚细胞区室内的解离。例如，包含一个或多个三苯甲基、衍生化的三苯甲基、双马来酰亚胺othoxy丙烷基团(bismaleimideothoxypropane groups)、己二酸二酰肼基和/或酸不稳定的转铁蛋白基团的接头可以提供本发明的成分(例如多肽成分)在具有特定pH范围的环境中的释放(参见例如
Figure BDA0003274689110000781
H等人，JBiol Chem 266:4309-14(1991)；Fattom A等人，Infect Immun 60:584-9(1992))。可以选择在特定pH范围被切割的某些接头，所述特定pH范围对应于组织之间的生理pH差异，诸如，例如，肿瘤组织的pH低于健康组织中的pH(参见例如US 5,612,474)。
光可切割的接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射(诸如可见范围内的光)后被切割的接头(参见例如Goldmacher V等人，Bioconj Chem 3:104-7(1992))。光可切割的接头可以用于在暴露于某些波长的光以后释放本发明的分子的成分(例如多肽成分)。光可切割的接头的非限制性例子包括硝基苄基(作为半胱氨酸的光可切割的保护基)、硝基苄氧基碳酰氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物(Hazum E等人，Pept Proc Eur Pept Symp，16th，Brunfeldt K，ed.，105-110(1981)；Senter等人，Photochem Photobiol 42:231-7(1985)；Yen等人，Makromol Chem190:69-82(1989)；Goldmacher V等人，Bioconj Chem 3:104-7(1992))。光可切割的接头可以在连接成分以形成本发明的分子(其被设计成用于治疗可以使用纤维光学暴露于光的疾病、病症和病患)中具有特定用途。
在本发明的分子的某些实施方案中，使用任意数目的技术人员已知的方式，包括共价键和非共价键，将细胞靶向性结构部分(例如，结合区)连接至志贺毒素效应子多肽区(参见例如Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013)；Behrens C，Liu B，MAbs6:46-53(2014))。
在本发明的分子的某些实施方案中，所述分子包含细胞靶向性结合区，所述结合区是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。存在众多本领域已知的适合用于此目的的接头，诸如，例如，15-残基(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO:130)。可以用于形成非共价多价结构的合适的scFv接头包括GGS，GGGS(Gly3Ser或G3S)(SEQ ID NO:131)，GGGGS(Gly4Ser或G4S)(SEQ ID NO:132)，GGGGSGGG(SEQ ID NO:133)，GGSGGGG(SEQID NO:134)，GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO:135)，和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO:136)(Plückthun A，Pack P，Immunotechnology 3:83-105(1997)；Atwell J等人，ProteinEng 12:597-604(1999)；Wu A等人，Protein Eng 14:1025-33(2001)；Yazaki P等人，JImmunol Methods 253:195-208(2001)；Carmichael J等人，J Mol Biol 326:341-51(2003)；Arndt M等人，FEBS Lett 578:257-61(2004)；Bie C等人，World J Hepatol 2:185-91(2010))。
用于连接本发明的分子的成分的合适方法可以是通过目前本领域已知的用于实现该目的的任意方法，只要所述连接不会实质上阻碍分子的细胞内在化和/或当通过适当测定(包括本文描述的测定)测量的志贺毒素效应子多肽区的期望的毒素效应子功能即可。
就本发明的细胞靶向分子的目的而言，除非另外相反地具体指明，志贺毒素效应子多肽区和结合区相对于彼此或整个分子的具体顺序或取向没有固定(参见例如图1)。本发明的细胞靶向分子的成分可以以任意顺序排列，前提条件是，期望的结合区和志贺毒素效应子多肽的活性没有消除。期望的活性包括为所述分子提供下述能力，例如，结合表达靶标的细胞，诱导细胞内在化，引起白细胞淤积，引起细胞毒性和/或将外源物质递送到细胞内部的能力。
在本发明的分子的上述实施方案的一些中，志贺毒素效应子多肽、分子结构部分、和任选的内质网保留/回收信号基序可以直接地彼此连接和/或适当地通过一个或多个插入多肽序列(诸如用本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头)彼此连接。在本发明的细胞靶向分子的上述实施方案中，所述志贺毒素效应子多肽区、结合区和在某些实施方案中存在的气体成分(例如，分子结构部分和/或内质网保留/回收信号基序)可以直接地彼此连接和/或适当地通过一个或多个插入多肽序列(诸如用本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头)彼此连接。
II.本发明的分子的成分的特异性结构变化的实例
在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应子多肽区包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由截短的志贺毒素A亚基组成。志贺毒素A亚基截短是有催化活性的，能够在体外使核糖体酶失活，并且当在细胞内表达时是有细胞毒性的(LaPointe P等人，J BiolChem 280:23310-18(2005)；Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。证明包含Slt-1A的残基1-240的羧基端截短的志贺毒素A亚基片段当在真核细胞的内质网中表达时表现出完全的细胞毒性，因为在位置240的亮氨酸残基是羧基端截短的志贺毒素A亚基构建体有效逆转运到真核细胞的细胞溶胶中所必需的(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005))。类似地，表明包含Stx2A的残基1-239的羧基端截短的志贺毒素A亚基片段当在真核细胞的内质网中表达时表现出全球的细胞毒性(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。
在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应子多肽区包含SLT-1A(SEQ IDNO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸75-240或基本上由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQID NO:2)的氨基酸75-240组成，或包含SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸75-239或基本上由SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸75-239组成。其他实施方案是包含志贺毒素效应子多肽的分子，所述志贺毒素效应子多肽包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-240或基本上由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-240组成，或包含SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-239或基本上由SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-239组成。其他实施方案是包含志贺毒素效应子多肽的分子，所述志贺毒素效应子多肽包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-240以及在位置240羧基端而不是位置250的羧基端的一个或多个氨基酸或基本上由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-240以及在位置240羧基端而不是位置250的羧基端的一个或多个氨基酸组成；并且类似地，其他实施方案是包含志贺毒素效应子多肽的分子，所述志贺毒素效应子多肽包含SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-239以及在位置239的羧基端而不是位置249的羧基端的一个或多个氨基酸或基本上由SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-239以及在位置239的羧基端而不是位置249的羧基端的一个或多个氨基酸组成。
在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应子多肽区包含SLT-1A(SEQ IDNO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-251或基本上由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQID NO:2)的氨基酸1-251组成，或包含SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-250或基本上由SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-250组成，其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的弗林蛋白酶切割基序中，至少一个氨基酸残基被破坏。其他实施方案是包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区的分子，所述耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区包含SLT-1A(SEQID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-261或基本上由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-261组成，或包含SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-260或基本上由SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-260组成，其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的弗林蛋白酶切割基序中，至少一个氨基酸残基被破坏。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含来源于免疫球蛋白型多肽的结合区，针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合选择所述结合区，其中所述抗原在癌细胞中的表达是受限的(参见Glokler J等人，Molecules 15:2478-90(2010)；Liu Y等人，Lab Chip 9:1033-6(2009))。按照其他实施方案，所述结合区针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合进行选择，其中所述抗原较非癌症细胞由癌细胞过表达或优先表达。一些代表性的靶标生物分子包括，但不限于，下文列举的与癌症和/或特定免疫细胞型相关的靶标。
现有技术中存在许多种识别与癌细胞相关的表位的免疫球蛋白型结合区，诸如靶向下述的结合区：CD4，CD20(B-淋巴细胞抗原蛋白CD20)，CD22，CD25(白介素-2受体IL2R)，CD30(TNFRSF8)，CD38(环形ADP核糖水解酶)，CD40，CD44(透明质酸受体)，CD71(转铁蛋白受体)，CD73，CD79，内皮糖蛋白(END或CD105)，CD200，基细胞粘附分子(B-CAM或CD239)，CD248(内皮唾液酸蛋白或TEM1)，癌胚抗原蛋白(CEA)，硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSP4，MCSP，NG2)，表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1)，人表皮生长因子受体2(HER2/Neu/ErbB2/CD340)，Ephrin型-B受体2(EphB2)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，成纤维细胞激活蛋白(FAP/seprase)，蛋白酶-活化的-受体(诸如PAR1)，脊髓灰质炎病毒受体-样4(PVRL4)，B3黑素瘤抗原，B4黑素瘤抗原，前列腺-特异性膜抗原蛋白(PSMA)，和肿瘤-相关的钙信号转导蛋白(TACSTDs)(参见，例如，Lui B等人，Cancer Res 64:704-10(2004)；Bagley R等人，Int J Oncol 34:619-27(2009)；Beck A等人，Nat Rev Immunol 10:345-52(2010)；Andersen J等人，J Biol Chem287:22927-37(2012)；Nolan-Stevaux O等人，PLoS One 7:e50920(2012)；Rust S等人，MolCancer 12:11(2013))。该靶标生物分子的列表旨在是非限制性的。技术人员应该理解，可以使用任何与癌细胞或其他需要的细胞类型相关的靶标生物分子来设计或选择与志贺毒素效应子区连接的结合区，从而产生本发明的分子。
与癌细胞强烈相关并且具有已知与它们结合的免疫球蛋白型结合区的其他靶标生物分子的实例包括CD19(B-淋巴细胞抗原蛋白CD19)，CD21((补体受体-2或补体3d受体)，CS1(SLAM家族成员7或SLAMF7)，CD26(二肽基肽酶-4，DPP4，或腺苷脱氨酶复合蛋白2)，CD33(唾液酸-结合免疫球蛋白-型凝集素-3)，CD52(CAMPATH-1抗原)，CD56，CD133(prominin-1)，基细胞粘附分子(BCAMs或卢巴奇血型糖蛋白(Lutheran blood groupglycoproteins)，膀胱肿瘤抗原(BTA)，睾丸癌抗原NY-ESO-1，睾丸癌抗原LAGE蛋白，细胞表面A33抗原蛋白(gpA33)，肝细胞生长因子受体(HGFR或c-Met)，EB病毒抗原蛋白，黑素瘤-相关的抗原1蛋白(MAGE-1)，黑素瘤-相关的抗原3(MAGE-3)，GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤相关的癌症/睾丸抗原)，BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)，粘蛋白(诸如MUC1和癌症抗原125(CA-125))，优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)蛋白，由T-细胞1蛋白识别的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA)，前列腺特异性的抗原蛋白(PSA)，前列腺干细胞抗原蛋白(PSCA)，晚期糖基化终产物受体(RAGE)，肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)，和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)抗原。
其他与癌细胞强烈相关的靶标生物分子的实例是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)，叶酸结合蛋白(FBPs和叶酸受体)，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，血管内皮生长因子受体(VEGFRs)，整联蛋白α-Vβ-3(αvβ3)，整联蛋白α-Vβ-5(αvβ5)，整联蛋白α-5β-1(α5β1)，受体酪氨酸-蛋白激酶erB-3，胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，蝶素(ephrin)型-A受体3(EphA3)，肿瘤坏死因子受体10A(TRAIL-R1/DR4)，肿瘤坏死因子受体10B(TRAIL-R2)，核因子κB的受体激活剂(RANK)，生腱蛋白C，claudin蛋白(CLDN3，CLDN4)，间皮素(MSLN)，和CD64(FcγRI)(参见，Hough C等人，Cancer Res 60:6281-7(2000)；Thepen T等人，NatBiotechnol 18:48-51(2000)；Pastan I等人，Nat Rev Cancer 6:559-65(2006)；Pastan，Annu Rev Med 58:221-37(2007)；Fitzgerald D等人，Cancer Res 71:6300-9(2011)；Scott A等人，Cancer Immun 12:14-22(2012))。该靶标生物分子的列表旨在是非限制性的。
另外，存在所考虑的靶标生物分子的多种其他的实例，诸如黑素细胞蛋白PMEL(gp100)，人酪氨酸酶，酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1或TRP1)，酪氨酸酶-相关蛋白2(TRP-2)，溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1(LPGAT1/IAA0205)，SART蛋白，ADP-核糖基转移酶(ART1，ART4)，人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶(HAAH)，蝶素型-A受体2(EphA2)，受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3，酪氨酸酶相关的抗原(TAA)，断点簇区-c-abl癌基因(break point clusterregion-c-abl oncogene)(BCR-ABL)蛋白，ADAM金属蛋白酶(例如，ADAM-9，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-15，ADAM-17)，甲胎蛋白抗原17-A1蛋白，骨髓间质抗原(BST1，BST2)，CD2，CD3(T-细胞共同受体)，CD7，CD15，CD23(FC epsilon RII)，CD53，CD88(补体成分5a受体1)，CD129(白介素9受体)，CD183(趋化因子受体CXCR3)，CD191(CCR1)，CD193(CCR3)，CD244(天然杀伤细胞受体2B4)，CD294(GPR44)，CD305(白细胞-相关的免疫球蛋白-样受体1)，C3aR(补体成分3a受体)，FceRIa，半乳凝集素-9，骨髓-相关的蛋白-14(mrp-14)，Siglecs(唾液酸-结合免疫球蛋白-型凝集素)，CD49d，CD13，CD54(细胞内粘附分子1)，CD63(四跨膜蛋白(tetraspanin))，CD69，CD123(白介素-3受体)，CD284(Toll-样受体4)，FceRIa，溶酶体-相关的膜蛋白(LAMPs，诸如CD107)，CD203c，CD14，CD15(Lewis X或阶段特异胚抗原1)，清道夫受体(诸如CD64和CD68)，CD80，CD86，CD115(集落刺激因子1受体)，F4/80，免疫球蛋白-样转录物ILT-3，整联蛋白(诸如CD11a-c)，CD195(趋化因子受体CCR5)，CD282(toll-样受体2)，多配体聚糖(syndecans)(诸如SDC1或CD138)，和CD225(干扰素-诱导的跨膜蛋白1)(参见Scott A等人，Cancer Immun 12:14(2012))；Cheever M等人，Clin Cancer Res 15:5323-37(2009)，关于靶标生物分子，并且注意本文所述的靶标分子是非限制性的实例)。技术人员应该理解，可以使用任何需要的靶标生物分子来设计或选择要与耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区连接的结合区，以产生本发明的分子。
在某些实施方案中，所述结合区包含针对与免疫系统细胞类型的细胞表面的特异性和高亲和力结合选择的免疫球蛋白型多肽或基本上由其组成。例如，已知结合下述的免疫球蛋白型结合结构域：CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD9，CD10，CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD40，CD41，CD56，CD61，CD62，CD66，CD95，CD117，CD123，CD235，CD146，CD326，白介素-2受体(IL-2R)，核因子κB的受体激活剂(RANKL)，SLAM-相关的蛋白(SAP)，和TNFSF18(肿瘤坏死因子配体18或GITRL)。
对于某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含SEQ ID NOs:50-61任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:50-61任一项所示的多肽组成。这些耐受蛋白酶切割的、结合CD20的、细胞毒性的细胞靶向分子实施方案可以用于治疗和/或诊断骨癌、白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、黑素瘤(melanoma)、骨髓瘤(myeloma)、淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘、克罗恩病(Crohn’sdisease)、糖尿病、移植物排斥、移植物对抗宿主病(graft-versus-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremicsyndrome)、HIV-相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化(multiple sclerosis)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、多关节炎(polyarthritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、脓毒性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和/或脉管炎(vasculitis)。
在某些实施方案中，所述结合区包含针对靶向细胞外受体选择的配体或基本上由所述配体组成。一些代表性的配体包括，但不限于，下述骨形态生成蛋白和激活蛋白膜结合的抑制剂BAMBI(也称为TGFBR)，CD137L(也称为4-1BB)，诱饵受体3DcR3(也称为TR6和TNFRSF6B)，I类MHC多肽-相关的序列(例如MICA，MICB)，NKG2D配体(例如ULBP1，ULBP2，ULBP3，和ULBP4-6)，和肿瘤坏死因子TWEAK(也称为TNFSF12和APO3L)。关于更多非限制性的示例性配体，见实施例中的表5。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区是单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH，其表现出特异性针对HER2的高亲和力结合，诸如来源于骆驼科动物抗体(VHH)蛋白5F7的单结构域可变区，如在美国专利申请公布2011/0059090中所述。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:50的氨基酸270-513、SEQ ID NO:51的261-512、SEQID NO:52的270-514、或SEQ ID NO:53的279-522或基本上由SEQ ID NO:50的氨基酸270-513、SEQ ID NO:51的261-512、SEQ ID NO:52的270-514、或SEQ ID NO:53的279-522组成，所有这些表现出特异性针对人CD20的高亲和力结合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:54的氨基酸267-384、SEQ ID NO:58的269-512，或SEQ ID NO:61的269-403或基本上由SEQ ID NO:54的氨基酸267-384、SEQ ID NO:58的269-512，或SEQ ID NO:61的269-403组成，所有这些表现出特异性针对人HER2的高亲和力结合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的多肽配体，所述多肽配体包含SEQ ID NO:56的氨基酸269-401或基本上由SEQ ID NO:56的氨基酸269-401组成，其表现出特异性针对人白介素-2受体(IL-2受体)的高亲和力结合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的多肽配体，所述多肽配体包含SEQ ID NO:57的氨基酸269-508或基本上由SEQ ID NO:57的氨基酸269-508组成，其表现出特异性针对人CD38的高亲和力结合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:59的氨基酸269-516或基本上由SEQ ID NO:59的氨基酸269-516组成，其表现出特异性针对人CD19的高亲和力结合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含这样的免疫球蛋白型结合区，所述免疫球蛋白型结合区包含SEQ ID NO:60的氨基酸269-518或基本上由SEQ ID NO:60的氨基酸269-518组成，其表现出特异性针对人CD74的高亲和力结合。
使用本发明的分子的片段、变体和/或衍生物也在本发明的范围内，本发明的分子包含功能性细胞外靶标生物分子结合位点，并且甚至更优选地能够以高亲和力结合所述靶标生物分子(例如，由KD所示)。例如，尽管本发明提供了可以结合CD20、HER2、IL-2受体、CD38、CD19和CD74的多肽序列，但是，任何以10-5至10-12摩尔/升、优选小于200nM的解离常数结合靶标生物分子(优选表达在细胞表面上)的结合区可以替代用于制备本发明的细胞靶向分子和用于本发明的方法。
III.本发明的分子的一般功能
本发明提供多种耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽和包含其的分子，它们可用于治疗和/或诊断应用。可以将本发明的志贺毒素来源的细胞靶向分子设计成具有最佳的细胞毒性(即，等于包含野生型志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子的细胞毒性)但是较包含蛋白酶切割敏感性的野生型志贺毒素效应子多肽的某些细胞靶向分子(例如，包含羧基端细胞靶向结合区的细胞靶向分子)具有改善。本文提供的耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基来源的分子具有这样的用途，例如，用于靶向的细胞杀伤，将外源物质递送到特定细胞型中，获得诊断信息，并且作为治疗剂用于治疗多种疾病、病症和病患，包括癌症、免疫病症和微生物感染。
细胞靶向性结合区与耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的连接允许改造具有改善的特征的治疗剂和诊断剂，诸如，例如，具有提高的分子稳定性和改善的体内耐受的细胞靶向分子。破坏在志贺毒素A亚基效应子多肽中志贺毒素A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割基序减少在所述基序的弗林蛋白酶切割，并且可能减少由除弗林蛋白酶之外的其他蛋白酶的切割，诸如，例如，在脊椎动物的维管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶。在志贺毒素A亚基效应子多肽中志贺毒素A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割基序的破坏允许改造细胞靶向分子，使其具有功效上与包含弗林蛋白酶切割敏感性的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子相当的志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向，但是在施用到脊椎动物中后，与包含蛋白酶切割敏感性的野生型志贺毒素效应子多肽的某些细胞靶向分子相比，具有改善的毒性模式。与包含野生型志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子相比，本发明的某些分子在施用给脊椎动物后表现出降低的有害作用(例如，非特异性毒性)，并且可能在制备、储存和施用过程中表现出稳定性。
A.降低志贺毒素A亚基效应子多肽的蛋白酶切割敏感性同时保留有效的细胞内路 线递送和有效的细胞毒性
之前，相信包含志贺毒素A1片段催化区的细胞毒性的志贺毒素A亚基构建体必须保留或以某种方式补偿中毒的细胞内弗林蛋白酶的天然存在的蛋白水解加工，才能保持有效的且强效的细胞毒性。出乎意料地是，发现弗林蛋白酶切割事件不是强效的细胞毒性所必需的，原因在于，在志贺毒素A1片段的羧基端不存在靶细胞介导的弗林蛋白酶切割事件，而在该羧基端存在相对大的(大于28kDa)结构部分时(见实施例，同前所述)，获得在野生型志贺毒素对照构建体水平的强效的志贺毒素细胞毒性。预计在中毒的细胞内缺少弗林蛋白酶切割事件干扰志贺毒素A1片段的有效释放，并且由此导致相对大的分子结构部分继续连接在志贺毒素A1片段区。然而，尽管有这样的预测，使用包含相对大的羧基端结构部分并且缺少任意明显的补偿特征(诸如，例如，经工程改造的替代的蛋白酶位点)的弗林蛋白酶切割缺陷的志贺毒素A亚基构建体获得强效的志贺毒素细胞毒性。
这些结果是令人惊讶的，原因在于认为最佳的志贺毒素中毒过程需要使志贺毒素A1片段与所有其他的大分子结构部分释放并且暴露A1片段的羧基端，才能有效地将释放的A1片段从内质网逆转运到细胞溶胶中，在细胞溶胶中，所述A1片段可以形成使中毒的细胞的核糖体催化失活的酶活性结构。具体地，预计覆盖志贺毒素A1片段的羧基端的分子结构部分的持续存在和/或无效的释放干扰志贺毒素A1片段有效获得细胞溶胶进入的天然机制，该天然机制涉及暴露被ERAD系统识别的A1片段的疏水性羧基端结构域(参见Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011)；Li S等人，PLoS One 7:e41119(2012))。例如，预计覆盖志贺毒素A1片段的羧基端的分子结构部分的持续存在破坏所述志贺毒素A1片段的羧基端对内质网中ERAD机制的可及性，并且有效地获得进入细胞溶胶的通路，在细胞溶胶中，其形成酶活性结构。出乎意料的是，发现这是不正确的，原因在于，在志贺毒素A1片段的羧基端不存在靶细胞介导的弗林蛋白酶切割事件而存在大的羧基端细胞靶向性结构部分时(见实施例，同前所述)，获得有效的且强效的志贺毒素细胞毒性。
备选地，缺少中毒细胞介导的弗林蛋白酶切割事件可以假设地进行补偿。潜在的补偿方法的非限制性实例包括：1)使构建体的一个羧基端以志贺毒素A1片段样多肽区的羧基端终止，2)制备志贺毒素来源的构建体，以使志贺毒素A亚基多肽在其志贺毒素A1片段样多肽的羧基端附近已带切口(nicked)，3)改造异源的和/或异位的蛋白酶位点，其可以在功能上替代缺少的天然的志贺毒素弗林蛋白酶切割事件，和4)组合两种或三种方法。在第一种方法中，志贺毒素A1片段样多肽的羧基端没有被任何羧基端结构部分覆盖，并且由此，志贺毒素A1片段样多肽的羧基端永久性地暴露，用以被内质网中的ERAD机制识别。在后三种方法中，可以将志贺毒素A1片段样多肽设计成这样：当分子到的中毒细胞的内质网时，在细胞内与构建体的一种或多种其他成分解离，从而在内质网中，所述志贺毒素A1片段样多肽的羧基端变为暴露的，用以被ERAD机制识别。
补偿特征的实例是包含这样的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞毒性分子，所述志贺毒素A亚基效应子多肽在接触靶细胞之前用蛋白酶预处理，以将A1片段样区域的羧基端附近的多肽区切开。另一个实例是包含这样的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞毒性分子，所述志贺毒素A亚基效应子多肽被改造以具有包含的被靶细胞的细胞内蛋白酶切割的异位的、异源的蛋白酶位点。
这些提议的设计补偿缺少的中毒细胞介导的弗林蛋白酶切割事件的志贺毒素A亚基效应子多肽的方法是假设性的。与包含野生型志贺毒素A亚基的分子或仅包含野生型序列(其包含天然存在于A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位点)的志贺毒素A亚基构建体相比，所有四种提议的方法都可以显著地改变细胞毒性的有效性和效力。另外，只有第三种方法的某些变体，依赖于靶细胞的内切蛋白酶的变体，可能允许相对于志贺毒素效应子多肽融合在羧基端位置的结构部分。然而，目前还没有已知依赖于除弗林蛋白酶外的靶细胞的内切蛋白酶的补偿方法，所述补偿方法可以提供与弗林蛋白酶切割等价的完全的补偿性细胞毒性，并且，已经证明替代的细胞蛋白酶(如calpain)在促进志贺毒素细胞毒性方面的有效性较低(Garred
Figure BDA0003274689110000891
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110000892
等人，J Biol Chem270:10817-21(1995)；Kurmanova，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。
本发明包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽的分子全都表现出降低的对弗林蛋白酶切割的敏感性。由于多种蛋白酶(诸如，高度泛宿主性的蛋白酶(例如，胰蛋白酶))共有最小的弗林蛋白酶切割R/Y-x-x-R基序，因此，预计本发明的志贺毒素效应子多肽的某些破坏的弗林蛋白酶切割基序表现出降低的对除弗林蛋白酶之外的多种蛋白酶切割的敏感性(参见，例如Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。例如，前蛋白转化酶种类的肽酶在人中包括至少七个成员：PC1，PC2，PC3，PC4，PACE4，PC5，PC6，和PC7(Fugere M，Day R，Trends Pharmacol Sci 26:294-301(2005))，已知它们中的多种在单个或成对的碱性残基(诸如，例如，一个或多个精氨酸残基)处切割它们的底物(Seidah N，Ann N Y Acad Sci 1220:149-61(2011))。
尽管存在融合在志贺毒素效应子多肽的羧基端的不能通过中毒细胞内部的弗林蛋白酶切割释放的分子结构部分，本发明的某些细胞靶向分子同包含蛋白酶切割敏感性的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子一样具有有效且强效的细胞毒性。
B.通过靶向性志贺毒素细胞毒性的细胞杀伤
本发明提供多种包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞毒性的细胞靶向分子。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够结合与特定细胞型的细胞表面连接的细胞外靶标生物分子并且进入这些细胞。一旦在靶向的细胞型的细胞溶胶中，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案能够酶促失活核糖体，并最终杀伤细胞。该系统是模块式的，原因在于可以使用任意数量的多样性的细胞靶向性结合区(诸如，例如，免疫球蛋白型多肽)使该有效的细胞毒性靶向多种多样性的细胞型，同时提供降低的蛋白酶切割敏感性的改善。本发明的分子引起细胞死亡的能力，例如，其细胞毒性，可以使用本领域公知的多种测定中的任意一种或多种进行测量。
在本发明的耐受蛋白酶切割的细胞毒性的细胞靶向分子的某些实施方案中，当同与本发明的细胞毒性分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞(靶标+细胞)接触时，所述细胞靶向分子能够引起所述细胞的死亡。在不同的靶细胞条件下，诸如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或体内靶细胞，使用本发明的细胞靶向分子可以实现细胞杀伤。
为了通过本发明的细胞毒性的细胞靶向分子进行靶向的细胞杀伤，靶标生物分子的表达不需要是天然的。靶标生物分子的细胞表面表达可以是感染、存在病原体和/或存在细胞内微生物病原体的结果。靶标生物分子的表达可以是人工的，诸如，例如，在用病毒表达载体感染后通过迫使或诱导表达，参见，例如，腺病毒、腺伴随病毒和反转录病毒系统。靶标生物分子诱导表达的实例是暴露于类视黄醇(如全反视黄酸和各种合成的类视黄醇)或任意视黄酸受体(RAR)激动剂的细胞的CD38表达的上调(Drach J等人，Cancer Res 54:1746-52(1994)；Uruno A等人，J Leukoc Biol 90:235-47(2011))。在另一个实例中，可以通过使细胞暴露于电离辐射而诱导CD20、HER2和EGFR表达(Wattenberg M等人，Br JCancer 110:1472-80(2014))。
就本发明的目的而言，与包含野生型志贺毒素A1片段多肽的第二细胞靶向分子的细胞毒性相比，表现出“相等的”志贺毒素效应子细胞毒性是指，通过适当的定量测定检测的，细胞毒性水平在百分之十或更低的以内，具有与包含全长志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应子多肽相当的可重现性。对于在实验室相比培养物中的靶标阳性细胞的杀伤测定中的细胞毒性，“相等的”细胞毒性典型地是在参比的细胞毒性的细胞靶向分子(本文称为“第二细胞靶向分子”，其包含与目的分子相同的结合区，并且如果合适，包含与目的分子相同的分子结构部分)的CD50值的百分之十以内的CD50值；并且其中，参比分子的结合区、志贺毒素效应子多肽以及分子结构部分(如果合适)全部与在目的分子中这些成分如何连接相同地彼此连接。
此外，如果本发明的分子(单独的或作为细胞靶向分子的成分)表现出与包含野生型志贺毒素A1片段多肽的参比细胞靶向分子相等的细胞毒性，那么所述分子的志贺毒素效应子多肽区表现出与所述参比分子的亚细胞路线递送活性水平相等的活性水平的志贺毒素效应子亚细胞路线递送活性，即，与野生型相等的亚细胞路线递送活性。
C.在细胞型之间的选择性细胞毒性
通过利用高亲和性结合区使耐受蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽的递送靶向特定细胞型，该有效的志贺毒素细胞杀伤活性可以限制为优先杀伤特异性靶向的细胞型。本发明的某些细胞靶向分子可用于消除特定细胞型的群体。例如，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子可以通过消除在一个或多个细胞表面上表达升高水平的特定的靶标生物分子的恶性细胞而用于治疗某些肿瘤、癌症、和/或生长异常。
在某些实施方案中，在将本发明的细胞靶向分子施用给细胞型的混合物后，所述细胞靶向分子能够相对于没有与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型选择性地杀死与细胞外靶标生物分子物理连接的那些细胞。因为志贺毒素家族的多个成员适合用于杀伤真核细胞，使用志贺毒素A亚基效应子多肽设计的分子可以显示出有效的细胞毒性活性。通过使用高亲和力结合区将酶活性的志贺毒素A亚基效应子多肽的递送靶向特定细胞型，该有效的细胞杀伤活性可以限于仅优先杀死希望通过它们与被选择的结合区特异性结合的靶标生物分子的物理结合而靶向的那些细胞型。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同细胞型的混合物内的特定细胞型的死亡。这能够实现与不表达靶标生物分子的“旁观”细胞类型相比高优先的对特定细胞型的靶向性细胞毒性活性，诸如3倍的细胞毒性效应。备选地，如果靶标生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不靶向的细胞型物理连接，则结合区的靶标生物分子的表达可以不专属于一种细胞类型。这允许相对于不表达显著量的靶标生物分子或不与显著量的靶标生物分子物理连接的“旁观”细胞类型以高优先性(诸如3-倍的细胞毒性作用)进行特定细胞类型的靶向性细胞杀伤。
细胞表面上细胞外靶标生物分子的水平可以使用熟练的技术人员已知的多种方法确定，诸如例如，FACS法。用于本文时，通过FACS分析，在细胞表面上表达的显著量的细胞外靶标生物分子大于10,000，20,000，30,000，40,000，50,000，60,000，或70,000平均荧光强度(MFI)，这取决于细胞类型。
在某些其他实施方案中，在将细胞毒性的细胞靶向分子施用给两个关于细胞外靶标生物分子的存在和/或多肽序列不同的细胞型群体后，细胞靶向分子能够造成细胞死亡，如通过关于靶细胞群体(其成员表达细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的，例如，其剂量比相同细胞靶向分子对于其成员不表达细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少3倍。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子对与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的群体的细胞毒性活性比对没有与本发明的细胞靶向分子特异性结合的任何细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型群体的细胞毒性活性高至少3倍。根据本发明，可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞毒性：(a)对与结合区的靶标生物分子物理连接的特定细胞型的细胞群体的细胞毒性：(b)对没有与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，相对于没有与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型，对与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型的选择性的细胞毒性至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍高。例如，在将本发明的某些细胞毒性蛋白施用给两个关于细胞外靶标生物分子的存在和/或多肽序列不同的不同细胞型群体后，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子能够造成与被所述细胞毒性蛋白的结合区结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡，例如，与没有与被细胞毒性的细胞靶向分子的结合区结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的观察到的CD50或与仅与包含破坏所述细胞靶向分子的结合区的结合特异性的序列变异或突变的细胞外靶标生物分子形式物理连接的细胞型的观察到的CD50相比，其CD50低至少三倍。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，在将细胞靶向分子施用给两个不同的细胞型群体后，所述细胞靶向分子能够造成细胞死亡，如通过关于第一细胞群体(其成员在细胞表面表达所述细胞靶向分子的结合区的靶标生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的，其剂量比相同细胞靶向分子对于其成员不表达所述细胞靶向分子的结合区的任意靶标生物分子、不表达显著量的所述细胞靶向分子的结合区的任意靶标生物分子、或不暴露于显著量的所述细胞靶向分子的结合区的任意靶标生物分子的第二细胞群体的CD50剂量低至少三倍。
这种优先的细胞杀伤功能允许在不同的条件下且在未被靶向的旁观细胞的存在下，诸如离体操作的细胞型混合物、具有细胞型混合物的体外培养的组织、或在体内在多种细胞型存在下(例如，在多细胞生物体内在原位或在天然位置)，被靶向的细胞被本发明的某些细胞毒性的细胞靶向分子杀伤。
D.改善的体内耐受性和稳定性
在某些实施方案中，与弗林蛋白酶切割敏感性类似物相比，本发明的分子(例如，本发明的细胞靶向分子)表现出提高的稳定性和/或改善的体内耐受性。可以在体外和/或体内表现出提高的稳定性。
治疗剂或诊断剂分子随时间的稳定性是一个重要的特征，并且可以影响哪些应用可以具体使用所述分子。分子稳定性包括体外和体内稳定性，诸如，例如，在施用后在生物体内的稳定性和在一定范围的温度和浓度下在存储过程中的稳定性。对于某些免疫毒素或配体-毒素融合物，毒素与其他成分之间的连接的稳定性可能影响在生物体的体内随时间由于非靶向性毒素的释放引起的非特异性毒性的量。
本发明的某些细胞靶向分子可用作治疗剂和/或诊断剂，并且，与更加蛋白酶切割敏感性的变体相比，表现出降低的体内非特异性毒性，这表现为改善的体内耐受性。体内耐受性可以由熟练的技术人员使用本领域已知的和/或本文所述的技术确定。除了使用死亡率评估体内耐受性之外，发病的迹象可以用于评估体内耐受性，诸如，例如，体重、外貌、可测量的临床迹象、无端的行为和对外部刺激的反应各方面(例如，参见Morton D，GriffithsP，Vet Rec 116:431-43(1985)；Montgomery C，Cancer Bull 42:230-7(1990)；Ullman-CulleréM，Foltz C，Lab Anim Sc 49:319-23(1999)；Clingerman K，Summers L，J AmAssoc Lab Anim Sci 51:31-6(2012))。响应发病和/或患病迹象，可以使用安乐死，由此产生死亡的时间点。例如，在啮齿动物中，在2-3天内体重减轻15-20％用作发病迹象，并且用作安乐死的判断(例如，参见Institute of Laboratory Animal Research 2011.Guidefor the care and use of laboratory animals，第8版，Washington，DC，U.S.:NationalAcademies Press(2011))。
就本发明的目的而言，术语“改善的体内耐受性”是指，与参比分子比较(比较时在相同的条件下使用相同的测定，例如，相同的物种，相同的剂量和累积剂量，相同的给药时间方案，和对观察和/或测量的时间点相同的持续时间)，分子对接受该分子施用后的整个生物体的健康或存活的毒性和/或一般有害作用的可重现的且统计学显著的减少，诸如，给予哺乳动物生物体的改善的分子减少20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，优选50％或更多。毒性或一般有害作用的减少可以通过在特定事件持续过程中死亡率和/或发病率的降低进行测量。
如在实施例中所示，毒性的降低可能表示，与接受参比分子的哺乳动物在相同的时间点的100％死亡率相比，接受具有改善的体内耐受性的分子的哺乳动物在给定的时间持续过程中的100％存活。死亡率可能是由于死亡或出于上述怜悯原因的安乐死。通常，给药时间方案是二至三次剂量/周，持续2，3，4或更多周，其中每个剂量约为0.001-40mg分子/kg体重。
对于本发明示例性的细胞靶向分子观察到的改善的体内耐受性表明，与包含弗林蛋白酶切割敏感性的志贺毒素效应子多肽的相关分子的剂量相比，可以将高得多的剂量的这些细胞靶向分子安全地施用给哺乳动物。与更加蛋白酶切割敏感性的变体相比，本发明的某些细胞靶向分子可能表现出降低的非特异性毒性，原因在于蛋白酶切割耐受性起作用保护并且保留志贺毒素效应子成分与细胞靶向性结构部分成分之间的连接。
另外，与更加蛋白酶切割敏感性的变体相比，本发明的某些分子表现出增加的体外和/或体内半衰期。分子稳定性可以通过关于其成分的连接确定目的分子的半衰期而进行测定。与弗林蛋白酶切割敏感性变体相比，本发明的分子的某些实施方案具有更长的半衰期，尤其是关于志贺毒素效应子成分与一种或多种其他成分的持续的连接而言。例如，与弗林蛋白酶切割敏感性变体(其中弗林蛋白酶切割敏感性位点位于这两个成分之间)相比，就志贺毒素效应子成分与另一种成分(例如，细胞靶向性结构部分)的持续的连接而言，本发明的分子的某些实施方案具有更长的半衰期。E.另外的外源物质向靶细胞内部的递送
除了直接的细胞杀伤以外，本发明的某些分子任选地可以用于将另外的外源物质递送至靶细胞内部。另外的外源物质的递送可以用于，例如，细胞毒性、细胞抑制、免疫系统刺激、免疫细胞靶向、信息收集和/或诊断功能。本发明的细胞毒性分子的无毒变体、或任选地细胞毒性变体，可以用于将另外的外源物质递送至与细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞和/或标记所述细胞的内部。在至少一个细胞表面表达靶标生物分子的多种细胞型和/或细胞群体可以被本发明的细胞靶向分子靶向，用于接受外源物质。本发明的细胞靶向分子的功能成分是模块式的，原因在于多种志贺毒素效应子多肽和另外的外源物质可以与多个结合区连接，以提供多样性的应用，诸如肿瘤细胞和/或它们的亚细胞区室的非侵入性体内成像。
因为本发明的细胞靶向分子(包括其无毒的形式)能够进入与细胞外靶标生物分子(其被本发明的细胞靶向分子的结合区识别)物理连接的细胞中，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进被靶向的细胞型的内部。在一个意义上，本发明的整个分子是进入细胞的外源物质；因而，“另外的”外源物质是与核心细胞靶向分子本身连接、但是除此以外的异源物质。本发明的无毒的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽仍然可以用作细胞靶向分子的成分，用于将外源物质递送到靶细胞内，只要所述耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽有效地指导向其所存在的细胞的细胞溶胶的细胞内路线递送即可。
本发明的细胞毒性分子和细胞靶向分子的变体和衍生物仅在天然位于75，77，114，167，170，176和203(或在相关的志贺毒素A亚基的相对应位置，例如，在SLT-2A中的位置204)的催化重要的氨基酸残基方面不同，与在所有不同的位置具有野生型氨基酸残基的母本分子相比，它们将具有相同的亚细胞路线递送活性水平。
本文中使用的“另外的外源物质”表示一个或多个分子，其经常是通常不存在于天然靶细胞内，其中本发明的分子可以用于特异性地将这样的物质运输至细胞内部。另外的外源物质的非限制性例子是细胞毒性试剂、肽、多肽、蛋白、多核苷酸、检测促进剂和小分子化学治疗剂。
在本发明用于递送另外的外源物质的分子的某些实施方案中，所述另外的外源物质是细胞毒性试剂，诸如，例如，小分子化学治疗剂，细胞毒性抗生素、烷基化试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。细胞毒性试剂的非限制性实例包括氮丙啶(aziridines)，顺铂(cisplatins)，四嗪(tetrazines)，丙卡巴肼(procarbazine)，六甲蜜胺(hexamethylmelamine)，长春花生物碱(vinca alkaloids)，紫杉烷(taxanes)，喜树碱(camptothecins)，依托泊苷(etoposide)，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，替尼泊苷(teniposide)，新生霉素(novobiocin)，阿柔比星(aclarubicin)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，放线菌素(actinomycin)，博来霉素(bleomycin)，普利霉素(plicamycin)，丝裂霉素(mitomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，多拉司他汀(dolastatins)，美坦辛(maytansines)，多西他赛(docetaxel)，阿霉素(adriamycin)，加利车霉素(calicheamicin)，阿里他汀(auristatins)，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003274689110000961
(pyrrolobenzodiazepine)，卡铂(carboplatin)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)，卡培他滨(capecitabine)，丝裂霉素C(mitomycin C)，紫杉酚(paclitaxel)，1,3-二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)，利福平(rifampicin)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)和吉西他滨(gemcitabine)。
在某些实施方案中，所述另外的外源物质包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其他实施方案中，所述另外的外源物质是核酸，诸如，例如，作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中，所述另外的外源物质是抗原，诸如从细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常表达的蛋白、或T-细胞互补决定区来源的抗原。例如，外源物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞特有的那些抗原，和能够作为外源抗原起作用的T-细胞互补决定区。外源物质的另外的实例包括大于抗原肽的多肽和蛋白，诸如酶。包含多肽或蛋白的外源物质可以任选地包含一种或多种抗原，不管是熟练的技术人员已知的还是未知的。
在某些实施方案中，本发明的分子的分子结构部分包含另外的外源物质或基本上由另外的外源物质组成。
F.用于诊断功能的信息收集
本发明的某些细胞靶向分子用在前述特定细胞、细胞型、细胞群体和/或特定亚细胞区室的体外和/或体内检测中。在某些实施方案中，本文描述的细胞靶向分子用于诊断和治疗二者，或仅用于诊断。当相同的细胞靶向分子用于诊断和治疗二者时，通过一个或多个氨基酸置换(包括本文描述的示例性置换)对志贺毒素效应子多肽的催化灭活，可以使包含用于诊断的检测促进剂的细胞靶向分子变体无毒。与检测促进剂缀合的、本发明的细胞毒性细胞靶向分子的无毒形式任选地可以用于诊断功能，诸如用于与包含相同或相关结合区域的治疗方案联合使用的伴侣诊断。
将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞靶向分子缀合的能力会提供用于检测癌症、肿瘤、免疫和被感染的细胞的有用组合物。通过本领域已知的各种成像技术和测定，本发明的细胞靶向分子的这些诊断实施方案可以用于信息收集。例如，通过患者或活组织检查样品中各个癌细胞、免疫细胞或受感染的细胞的细胞内细胞器(例如内吞区室、高尔基区室、内质网区室和细胞溶质区室)的成像，本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以用于信息收集。
使用本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以收集不同类型的信息，无论用于诊断用途还是其他用途。该信息可用于，例如，诊断赘生性细胞类型，确定患者的疾病的治疗敏感性，测定抗肿瘤治疗随时间的进展，测定免疫调节治疗随时间的进展，测定抗微生物治疗随时间的进展，评价受感染的细胞在移植物中的存在，评价不希望的细胞类型在移植物中的存在，和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。
例如，使用用本发明的细胞靶向分子的诊断变体收集的信息，可能确定患者亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者进一步分类成亚群。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一类判据。例如，可以使用本发明的特定细胞毒性细胞靶向分子的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对本发明的相同分子的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此，使用本发明的细胞靶向分子，包括本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的无毒变体，进行患者鉴别、患者分级和诊断的有关方法被认为是在本发明范围内。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子用于这样的方法(例如，细胞杀伤、递送另外的外源物质和/或检测特定细胞型的特定亚细胞区室的方法)中，所述方法涉及表达弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶型蛋白酶的靶细胞，从而在所述靶细胞选自由下述组成的组的亚细胞区室中存在弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶型蛋白酶：高尔基体、核内体、和内质网。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子用于杀伤表达弗林蛋白酶的细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子用于杀伤弗林蛋白酶缺陷型的细胞，并且在施用给脊椎动物时表现出改善的体内耐受性。
IV.本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和分子中的多肽序列中的变 异
熟练的技术人员会认识到，可以对本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分和分子(例如，本发明的细胞毒性分子和细胞靶向分子以及编码前述任一种的多核苷酸)做出变化，而不减少它们的生物活性，例如，通过维持志贺毒素效应子多肽和/或细胞靶向分子的整体结构和功能，诸如，例如，一种或多种志贺毒素效应子功能，细胞靶向功能，靶标生物分子结合，靶向的细胞毒性活性，改善的体内耐受性，提高的稳定性和/或将外源物质递送到靶细胞中的能力。
例如，有些修饰可以促进表达、纯化、药代动力学性能和/或免疫原性。这样的修饰是熟练的技术人员众所周知的，且包括，例如，将甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位点，将另外的氨基酸放置在任一端上以产生方便地定位的限制位点或终止密码子，和使生化亲和标签与任一端融合以提供方便的检测和/或纯化。
在本文中还预见到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基，诸如表位标签或其他结构部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆、表达、翻译后修饰、合成、纯化，检测和施用。表位标签和结构部分的非限制性例子是：壳多糖(chitin)结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶结构部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在某些以上实施方案中，通过一个或多个保守氨基酸置换改变本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分的多肽序列，只要所述志贺毒素效应子多肽保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要所述志贺毒素效应子多肽(单独的和/或作为细胞靶向分子的成分)表现出一种或多种选自下述中的一种或多种志贺毒素效应子功能：细胞内路线递送，催化活性和/或细胞毒性。在某些以上实施方案中，通过向多肽区域中引入的一个或多个保守氨基酸置换改变本发明的分子的细胞靶向分子的多肽序列，只要所述志贺毒素效应子多肽保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要所述结合区保留细胞外靶标生物分子结合特异性。
本文中使用的术语“保守置换”表示，一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。例子包括具有相似特征的氨基酸残基(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的置换(参见，例如，下表B)。使用通常不存在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的一个例子是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于与肽和蛋白中表型上沉默的置换相关的其他信息，参见，例如，Bowie J等人，Science 247:1306-10(1990)。
在下表B的保守置换方案中，示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组——I：中性的、亲水的；II：酸和酰胺；III：碱性的；IV：疏水的；V：芳族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的，X疏水的，XI极性的，XII小的，XIII允许旋转的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括以下的：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
表B.保守氨基酸置换的实例
Figure BDA0003274689110001001
在某些实施方案中，本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或分子可以包含本发明的多肽区域的功能片段或变体，与本文引用的多肽序列相比，所述功能片段或变体最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，1)只要志贺毒素效应子多肽保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要所述志贺毒素效应子多肽单独地或作为本发明的细胞靶向分子的成分表现出合理水平的与细胞内路线递送、催化活性和/或细胞毒性相关的志贺毒素效应子功能；和2)只要所述细胞靶向分子包含保留细胞外靶标生物分子结合特异性的结合区。作为通过下述改变本发明的分子的多肽的结果，本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分和/或本发明的细胞靶向分子的变体是在本发明范围内：改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸(诸如在细胞靶向性结合区或志贺毒素效应子多肽内)，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或分子还可以具有或没有信号序列。
在某些实施方案中，本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分与本文引用的多肽的氨基酸序列中的任一个具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性，只要所述志贺毒素效应子多肽保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要所述志贺毒素效应子多肽单独地或作为细胞靶向分子的成分保留可测量的生物学活性，诸如，例如，亚细胞路线递送、细胞毒性、酶催化和/或使核糖体催化失活。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子与本文引用的多肽的氨基酸序列中的任一个具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性，只要其志贺毒素效应子多肽区保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要所述细胞靶向分子保留可测量的生物学活性，诸如，例如，亚细胞路线递送、细胞毒性、细胞外靶标生物分子结合、细胞内在化、酶催化和/或使核糖体催化失活。
在某些实施方案中，可以改变本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分，以改变其酶活性和/或细胞毒性，只要其保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且只要其单独地或作为细胞靶向分子的成分表现出选自下述中的一种或多种的志贺毒素效应子功能：细胞内路线递送，催化活性和/或细胞毒性。这种改变可以或可以不引起志贺毒素效应子多肽或改变的志贺毒素效应子多肽是其中的成分的细胞毒性分子的细胞毒性的改变。可能的改变包括志贺毒素效应子多肽的选自由下列各项组成的组的突变：截短、缺失、倒置、插入、重排和置换，只要保留破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且所述志贺毒素效应子多肽单独地和/或作为细胞靶向分子的成分保留选自下述中的一种或多种的志贺毒素效应子功能：细胞内路线递送，催化活性和/或细胞毒性。
本发明的分子分别包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽区，其保留志贺毒素效应子功能(流，细胞内路线递送到细胞溶胶中)，但是在某些实施方案中，其可以由细胞毒性的母本分子改造成具有降低的或消除的细胞毒性的分子，以用于无细胞毒性的功能，例如，实现白细胞淤积、递送外源物质和/或检测细胞类型，所述改造通过将一个或多个对酶活性重要的残基突变进行。
可以通过突变或截短来降低或消除志贺毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒性活性。已经将志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性最重要的残基绘图定位在下述残基位置：特别是精氨酸-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176(Di R等人，Toxicon 57:525-39(2011))。尤其是，含有谷氨酸-E167到赖氨酸和精氨酸-176到赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体完全失活；而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。已经显示标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人，Proc Natl AcadSci USA 85:2568-72(1988)；Deresiewicz R等人，Biochemistry 31:3272-80(1992)；Deresiewicz R等人，Mol Gen Genet 241:467-73(1993)；Ohmura M等人，Microb Pathog15:169-76(1993)；Cao C等人，Microbiol Immunol 38:441-7(1994)；Suhan，Infect Immun66:5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中，将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在利用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一种方法中，将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变在所述表达水平上消除了Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
在本发明来源于或博阿含来源于SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的成分的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应子包含野生型志贺毒素序列的改变，诸如，例如，下述置换中的一个或多个：位置75处的天冬酰胺、位置77处的酪氨酸、位置114处的酪氨酸、位置167处的谷氨酸、位置170处的精氨酸、位置176处的精氨酸，和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员来说，基于现有技术，这种置换的实例将会是已知的，如位置75处的天冬酰胺变为丙氨酸、位置77处的酪氨酸变为丝氨酸、位置114处的酪氨酸变为丝氨酸的置换、位置167处的谷氨酰胺变为天冬氨酸的置换、位置170处的精氨酸变为丙氨酸的置换、位置176处的精氨酸变为赖氨酸的置换、和/或位置203处的色氨酸变为丙氨酸的置换，只要所述破坏的弗林蛋白酶切割基序保持被破坏，并且所述志贺毒素效应子多肽单独地和/或作为细胞靶向分子的成分保留选自下述的一种或多种的志贺毒素效应子功能：细胞内路线递送，催化活性和/或细胞毒性。增强或降低志贺毒素酶活性和/或细胞毒性的其他突变也在本发明的范围之内，并且可以使用公知的技术和本文公开的测定确定。
在本发明的分子的某些实施方案中，可以突变、插入或删除一个或多个氨基酸残基，从而增加耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽区的酶活性，只要所述破坏的弗林蛋白酶切割基序保持被破坏。例如，将Stx1A中的残基位置丙氨酸-231突变为谷氨酸在体外增加其酶活性(Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66:5252-9(1998))，但是没有恢复弗林蛋白酶切割敏感性。
本发明的分子可以任选地与一种或多种另外的药剂缀合，所述另外的药剂可以包括本领域中已知的治疗剂和/或诊断剂，包括本文所述的此类试剂。
V.耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和包含其的分子的生产、制造和纯化
本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽成分和细胞靶向分子可以使用对本领域技术人员来说公知的生物化学工程技术生产。例如，本发明的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子可以通过标准合成方法、利用重组表达系统生产，或者通过任何其他适合的方法生产。因此，本发明的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子可以以多种方式合成，包括，例如包括下列各项的方法：(1)使用标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成多肽或蛋白的多肽成分，并且将最终的多肽或蛋白产物分离并纯化；(2)在宿主细胞中表达编码本发明的分子的多肽或多肽成分(例如，多肽或蛋白)的多核苷酸，并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)进行编码本发明的分子(例如，细胞靶向多肽或蛋白)的多核苷酸的无细胞体外表达，并且回收表达产物；或者通过方法(1)、(2)或(3)的任意组合以获得肽成分的片段，随后将片段结合(例如连接(ligating))以获得肽成分，并且回收肽成分。例如，多肽和/或肽成分可以使用偶联剂连接在一起，所述偶联剂诸如，例如，N,N’-二环己基碳二亚胺和N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3'-磺酸酯(Woodward’s试剂K)。
可以优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的分子(例如细胞靶向分子)的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽或多肽或多肽成分。本发明的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子可以适合地通过标准合成方法生产。因此，可以通过例如这样的方法来合成肽，所述方法包括通过标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成肽，并且将最终的肽产物分离并纯化。在该情形中，可以参考WO 1998/11125，或尤其是Fields G等人，Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides，Grant G，编，Oxford University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成实例。
本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子可以使用在本领域内公知的重组技术制备(生产和纯化)。通常，通过培养转化或转染有包含编码多核苷酸的载体的宿主细胞并且从细胞培养物中回收多肽来制备多肽的方法被描述于，例如Sambrook J等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等人，PCR Primer:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)。任何适合的宿主细胞均可以用于生产本发明的志贺毒素效应子多肽和/或分子(例如，细胞靶向蛋白)。宿主细胞可以是用一种或多种驱动本发明的分子的多肽表达的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外，可以通过修饰编码本发明的分子的多核苷酸来生产本发明的志贺毒素效应子多肽和/或分子(例如，细胞靶向蛋白)，这导致改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸，以便实现所需性质，如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。
存在宽泛种类的可以选择用于生产本发明的分子(例如，志贺毒素效应子多肽或细胞靶向蛋白)的表达系统。例如，用于表达本发明的蛋白的宿主生物体包括原核生物，诸如大肠杆菌和芽胞枯草杆菌(B.subtilis)，真核细胞，诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))，藻类(如衣藻(C.reinhardtii))，昆虫细胞系，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，植物细胞系，和真核生物体，如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本生烟草(N.benthamiana))。
因此，本发明还提供用于根据以上所述方法并且使用下述来生产本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或分子(例如，多肽或蛋白)的方法：(i)编码本发明的分子或其多肽成分的部分或全部的多核苷酸，(ii)包含当被引入到适当的宿主细胞中或不含细胞的表达系统中时能够编码本发明的分子或其多肽成分的部分或全部的本发明的至少一种多核苷酸的表达载体，和/或(iii)包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达多肽或蛋白时，有利的是从其他成分如宿主细胞因子中分离(或纯化)所需的多肽或蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制剂。纯化可以通过在本领域内公知的方法完成，如离心技术，提取技术，层析和分馏技术(例如，通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法，以用于去除污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。任何数量的生物化学纯化技术均可以用于增加本发明的志贺毒素效应子多肽和/或分子(例如，志贺毒素效应子多肽，细胞靶向蛋白，或其他细胞靶向分子)的纯度。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可以任选地以同型多聚体形式(即，两个以上相同的本发明的蛋白或细胞靶向分子的蛋白复合物)或异型多聚体形式(即，两个以上不同的本发明蛋白或细胞靶向分子的蛋白复合物)纯化。
在以下实施例中的是对用于生产本发明的分子(例如，细胞靶向分子)的方法的非限制性实例的描述，以及本发明示例性分子(例如，单链的、融合多肽)的生产的具体但非限制性的方面。
VI.包含本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的药物组合物和诊断组 合物
本发明提供这样的分子和细胞靶向分子，其用于单独地或在药物组合物中与一种或多种另外的治疗剂组合地用于治疗或预防以下更详细描述的病患、疾病、病症、或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)。本发明还提供药物组合物，其包含本发明的分子，诸如，例如，细胞靶向分子，或其根据本发明的其药用盐或溶剂化物，以及至少一种药用载体、赋形剂、或媒介物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含本发明的分子或细胞靶向分子的同型多聚体和/或异型多聚体形式。本发明的药物组合物可用于治疗、改善、或预防以下更详细描述的疾病、病患、病症、或症状的方法。预期各个这样的疾病、病患、病症、或症状均为就本发明所述的药物组合物的用途而言的单独的实施方案。本发明还提供用于至少一种如以下更详细描述的本发明所述的治疗方法的药物组合物。
如在本文中所使用的，术语“患者”和“受试者”可互换使用，以指代任何生物，通常是脊椎动物如人和动物，其表现出至少一种疾病、病症、或病患的症状、征兆、和/或指征。这些术语包括哺乳动物如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、宠物(例如猫、狗等)以及实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性实例。
如在本文中所使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”以及它们的语法变体是指用于获得有益或所需的临床结果的方法。该术语可以指延缓病患、病症或疾病的发病或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病患的全部或部分消退，或者以上任何的一些组合。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不限于，无论是否是可检测的或不可检测的，症状的减轻或缓解、疾病程度降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病发展的推迟或延缓、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的或全部的)。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”还可以意指相对于在不接受治疗的情况下的预期存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理状态或症状的严重性的增加，并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病患完全停止。关于肿瘤和/或癌症，治疗包括整体肿瘤负担和/或个体肿瘤尺寸的减小。
如在本文中所使用的，术语“防止(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”以及它们的语法变体是指用于预防病患、疾病、或病症的发展或者改变病患、疾病、或病症的病理学的方法。因此，“预防”可以指预防或防止的措施。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不限于，无论是否是可检测的或不可检测的，预防或延缓疾病的症状、进展或发展。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况延缓疾病的发病，并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病患的永久性预防。因此在某些情形中病患的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”可以是指降低发展病患的风险，或者预防或推迟与该病患有关的症状的发展。
如在本文中所使用的，“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种所需治疗效果的组合物(例如治疗组合物或药剂)的量或剂量，如预防或治疗目标病患或有益地缓解与该病患有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人员为需要其的给定受试者选择的具体治疗的所需功效的量。这种量将会根据各种技术人员理解的因素变化，包括但不限于，治疗性分子或组合物的特性(包括活性、药物动力学、药效学、和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、总体身体状况、对给定剂量的响应性、和药物的类型)，药用载体或制剂中载体的性质，以及给药途径。临床和药理学技术的人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对施用物质的组合物的响应并且相应地调节剂量(参见，例如，Remington:The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro A，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。
本发明的诊断组合物包含本发明的分子和一种或多种检测促进剂。各种检测促进剂是本领域已知的，诸如同位素、染料、比色测量剂、反差增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂。这些试剂可以在任何位置掺入本发明的分子中。所述试剂的掺入可以是通过本发明的细胞毒性分子的氨基酸残基或通过本领域已知的一些连接类型，包括通过接头和/或螯合剂。所述试剂的掺入是以这样的方式：能够在筛选、测定、诊断操作和/或成像技术中检测诊断组合物的存在。
当生产或制备本发明的诊断组合物时，本发明的分子(例如，细胞靶向分子)可以直接地或间接地连接至一个或多个检测促进剂。存在技术人员已知的众多检测促进剂，它们可以可操作地连接至本发明的分子用于信息收集方法，诸如用于针对生物体的疾病、病症或病患的诊断和/或预后应用(参见例如Cai W等人，J Nucl Med 48:304-10(2007)；Nayak T，Brechbiel M，Bioconjug Chem 20:825-41(2009)；Paudyal P等人，Oncol Rep22:115-9(2009)；Qiao J等人，PLoS ONE 6:e18103(2011)；Sano K等人，Breast CancerRes 14:R61(2012))。例如，检测促进剂包括增强图像的造影剂，诸如荧光染料(例如Alexa680、吲哚菁绿和Cy5.5)、同位素和放射性核素，诸如11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R；顺磁离子，诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属，诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)；超声-反差增强剂，诸如脂质体；不透射线的试剂，诸如钡、镓和铊化合物。通过使用中间官能团，诸如螯合剂如2-苄基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其类似物和前述任一种的功能等同物(参见Leyton J等人，Clin Cancer Res14:7488-96(2008))，可以直接地或间接地掺入检测促进剂。
存在技术人员已知的用于将各种检测促进剂掺入、附着和/或缀合至蛋白、特别是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域的众多标准技术(Wu A，Methods 65:139-47(2014))。类似地，存在技术人员已知的众多成像方案，诸如在医学领域中常用的非侵入性体内成像技术，例如：计算机体层摄影术成像(CT扫描)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声和x-射线计算机体层摄影术成像(关于综述，参见Kaur S等，CancerLett 315:97-111(2012))。
生产或制备包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的药物和/或诊断组合物
任何本发明的分子(诸如，例如，本发明的细胞靶向分子)的药用盐或溶剂化物同样也在本发明的范围内。
本发明情形中的术语“溶剂化物”是指在溶质(在本情况下，根据本发明，为本发明的分子或其药用盐)和溶剂之间形成的限定的化学计量的复合物。相关的溶剂可以是，例如，水、乙醇或另一种药用的、通常为小分子有机物种，如，但不限于，乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这种溶剂化物通常被称为水合物。
本发明的分子或其盐可以被配制为为储存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物通常包含在药用载体中的治疗有效量的本发明的分子或其盐。术语“药用载体”包括任何标准药物载体。用于治疗用途的药用载体是制药领域中公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro，编，1985)。如在本文中所使用的，“药用载体”包括任何和所有生理学上可接受的，即相容的，溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂、和吸收延缓剂等。药用载体或稀释剂包括在适用于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、和经皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药用载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的即时制备的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的适合的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的适合的混合物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过维持分散液情况下所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在某些实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据所选择的给药途径，可以将本发明的细胞靶向分子或其他药物成分包衣在用于保护所述分子免受当通过特定给药途径施用于患者时活性分子可能会遇到的低pH和其他天然失活条件的作用影响的物质中。
本发明的药物组合物的制剂可以以单位剂型方便地提供并且可以通过任何在药学领域内公知的方法制备。以这种形式，将组合物分为含有适合量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，包装含有离散量的制剂，例如，小包片剂、胶囊、和小药瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊、扁胶囊(cachet)、或片剂本身，或者其可以是适合数量的这些包装形式中的任何一种。其可以以单剂量可注射形式，例如以笔(pen)的形式提供。可以将组合物配制为用于任何适合的施用途径和方式。皮下或经皮施用方式可以特别适用于在本文中所描述的本发明的药物组合物和治疗性分子。
本发明的药物组合物还可以含有辅助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，以及通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止存在微生物。组合物中的等渗剂，如糖类、氯化钠等，也可以是合乎需要的。此外，通过包含延缓吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射药物形式的延长的吸收。
本发明的药物组合物还任选地包含药用抗氧化剂。示例性的药用抗氧化剂是：水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在另一个方面中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的不同的分子或任何前述各项的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种药用载体。
治疗性组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他规则结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何适合的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，根据本领域内公知的制剂化学，可以维持适当的流动性。在某些实施方案中，等渗剂，例如糖类，多元醇如甘露糖醇、山梨醇，或氯化钠可以是在组合物中合乎需要的。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生可注射组合物的延长吸收。
用于皮内或皮下施用的溶液或悬浮液通常包括下列各项中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非发挥性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸、柠檬酸或磷酸；以及张力(tonicity)调节剂如，例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠，或者具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。此类制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小药瓶中。
通过以所需的量将本发明的分子以及上述成分中的一种或组合加入适合的溶剂中，当需要时，继之以进行灭菌微过滤，可以制备无菌可注射溶液。通过将活性分子加入至含有分散介质和其他成分(如上述那些)的无菌赋形剂中，可以制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。
当将治疗有效量的本发明的分子设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，粘合剂将会是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。考虑到适合的pH、等渗性、稳定性等，用于制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法属于本领域技术。除了粘合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选的药物组合物将含有等渗赋形剂，如氯化钠注射液、林格注射液(Ringer's injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液、或在本领域中已知的其他赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂、或对本领域技术人员来说公知的其他添加剂。
如在本文中其他地方描述的，本发明的分子或其组合物(例如，药物或诊断组合物)可以用保护所述分子免于快速释放的载体来制备，如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于制备这种制剂的方法被授予了专利或是本领域技术人员通常已知的(参见，例如，Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems(Robinson J，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978))。
在某些实施方案中，可以将本发明的组合物(例如，药物或诊断组合物)配制成确保在体内的所需分布。例如，血脑屏障排除许多大型和/或亲水性化合物。为了将本发明的治疗性分子或组合物靶向至特定的体内位置，例如，可以将它们配制在可以包含被选择性地运输至特定细胞或器官的一个或多个结构部分的脂质体中，从而增强靶向药物递送。示例性的靶向结构部分包括叶酸或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性剂蛋白A受体；p120联蛋白等。
药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的成分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微粒系统的例子是微球、微粒、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒(参见例如Honda M等人，Int JNanomedicine 8:495-503(2013)；Sharma A等人，Biomed Res Int 2013:960821(2013)；Ramishetti S，Huang L，Ther Deliv 3:1429-45(2012))。使用对离子敏感的聚合物，诸如，例如，脂质体、泊洛沙姆407和羟磷灰石，可以制备控释制剂。
本发明的药物组合物可以使用本领域已知的技术制备，以使所产生的组合物包含乳剂、脂质体、niosomes、聚合的纳米颗粒和/或固体液体纳米颗粒(SLNs)(例如，参见Lakshmi P等人，Venereal Leprol 73:157-161(2007)；A Revolution in Dosage FormDesign and Development，Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems(Sezer A，ed.，InTech，2012)).
通常，包含脂质体的药物组合物包含分散在水性介质中的脂质体(例如，参见Li S等人，J Control Release 126:77–84(2008)；Li S等人，Mol Ther 16:163-9(2008)；ChenY等人，J Invest Dermatol 130:2790-8(2010)；Chen Y等人，J Biol Chem 285:22639-50(2010))。脂质体和纳米颗粒在它们的制备过程中通过结合免疫球蛋白结构域、受体和/或配体而可以是细胞靶向的(例如，参见Khan D等人，Chemical Biology and Drug Design71:3–7(2008)；Rezler E等人，Journal of the American Chemical Society 129:4961-72(2007)；Khan D，Journal of Cancer Science and Therapy 2:58-62(2010)；van derMeel R等人，J Control Release 159:281-9(2012)；Sada S等人，Curr Cancer CrugTargets 15:71-86(2015))。
通常，SLNs包含脂质，诸如石蜡和可生物降解的甘油酯(例如，参见Attama A等人，Int J Pharm 304:4-10(2005))。可以使用熟练的技术人员已知的方法，诸如，例如，通过使用纳米颗粒形式的脂质-治疗剂缀合物，用本发明的分子(例如，细胞靶向分子)负载SLNs(例如，参见Müller R等人，Eur J Pharm Biopharm 41:62-9(1995)；Friedrich I等人，IntJ Pharm 305:167-75(2005)；Schubert MA等人，Eur J Pharm Sci 27:226-36(2006)；Attama A等人，Eur J Pharm Biopharm 64:294-306(2006)；Attama A，Müller-Goymann C，Int J Pharm 322:67-78(2006)；Attama A等人，Int J Pharm 355:307-13(2008)；AttamaA等人，J Drug Deliv Sci Technol 18:181-8(2008)；Attama A等人，Current Eye Res34:698-705(2009)；美国专利8,663,692)。具体地，SLNs可以掺和亲水性化合物，所述亲水性化合物包含与细胞靶向性结合区连接的志贺毒素来源的多肽(例如，参见Müller R等人，Eur J Pharm Biopharm 41:62-9(1995))。可以设计包含HPMA共聚物的SLNs，以在细胞内在化后靶向亚细胞区室(例如，参见Jensen K等人，J Control Release 87:89-105(2003))。
VII.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的分子以外，编码本发明的多肽和蛋白或其功能部分的多核苷酸也在本发明的范围内。术语“多核苷酸”是术语“核酸”的等同物，二者均包括脱氧核糖核酸(DNAs)的聚合物、核糖核酸(RNAs)的聚合物、利用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同系物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。例如，考虑RNA密码子的第三位中可容忍的但是作为不同的RNA密码子编码相同氨基酸的摆动性(wobble)(参见Stothard P，Biotechniques 28:1102-4(2000))，公开的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性细胞靶向分子的多核苷酸。
在一个方面中，本发明提供编码本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或分子(例如，多肽或蛋白)、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括，例如，编码与包含所述蛋白的氨基酸序列中的一个的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上的同一性的多肽的核酸序列。本发明还包括包含与编码本发明的分子的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或多肽、或其片段或衍生物的多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者任何这种序列的反义序列或互补序列。
本发明的多核苷酸(耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或蛋白)的衍生物或类似物包括，尤其是，具有与本发明的多核苷酸、耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽或蛋白基本同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子，例如与相同尺寸的多核苷酸或多肽序列相比，或者当与比对的序列(其中所述比对由本领域中已知的计算机同源性程序进行)相比时，至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％、或甚至99％的同一性(并且优选的同一性为80-99％)。示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8for UNIX，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，Adv.Appl.Math.2:482-9(1981)的算法。还包括能够与编码本发明的蛋白的序列的互补序列在严格条件下杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，NewYork，NY，U.S.，1993))，以及以下。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明还提供包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。可以使用本领域内公知的材料和方法将能够编码本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或蛋白的多核苷酸插入至包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体在内的已知载体中以产生表达载体。这种表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如pTxb1和pIVEX2.3)中产生预期的本发明的志贺毒素效应子多肽和/或蛋白所需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的包含具体的多核苷酸的表达载体对本领域普通技术人员来说是公知的，可以是使用常规实验确定的，或者可以是购买的。
如在本文中所使用的，术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元线性或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放阅读框、和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因此，在本发明上下文中，编码志贺毒素效应子多肽和/或包含单个多肽链的蛋白(例如与志贺毒素效应子多肽遗传重组的scFv)的表达载体至少包括用于该单个多肽链的表达单元，而编码包含例如两个以上多肽链(例如与包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽连接的包含VL结构域的一条链和包含VH结构域的第二链)的表达载体包括至少两个表达单元，各自用于所述蛋白的两条多肽链中的每一个。对于本发明的多链蛋白的表达，用于每条多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体中(例如，可以利用已经向其中引入用于每条多肽链的表达载体的单一宿主细胞实现表达)。
能够引导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是在本领域内公知的。表达载体通常包括，但不限于下列各项中的一种或多种：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为在本领域内公知的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是在本领域中已知的。
术语“宿主细胞”是指可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类、或哺乳动物细胞)。可以使用在本领域中已知的标准技术来实现包含本发明的多核苷酸或能够产生本发明的分子(例如，多肽或蛋白)的宿主细胞系的创建和分离。
在本发明的范围内的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和/或蛋白可以是在本文中所描述的多肽和蛋白的变体或衍生物，其是这样产生的：通过改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸来修饰编码多肽和/或蛋白的多核苷酸以可以使其更适用于实现所需性质，如通过宿主细胞的更优的表达。
VIII.固定在固体基底上的本发明的分子
本发明的某些实施方案包括固定在固体基底上的本发明的分子(例如，耐受蛋白酶切割的细胞毒性分子或细胞靶向分子)或其任意效应子片段。本文考虑的固体基底包括，但不限于，微珠、纳米颗粒、聚合物、基质物质、微阵列、微量滴定平板或本领域已知的任意固体表面(例如，参见US 7,771,955)。按照这些实施方案，使用熟练的技术人员已知的技术可以将本发明的分子共价或非共价连接到固体基底上，诸如，例如，珠子、颗粒、或平板上。固定的本发明的分子可以用于使用本领域已知的技术的筛选应用(例如，参见Bradbury A等人，Nat Biotechnol 29:245-54(2011)；Sutton C，Br J Pharmacol 166:457-75(2012)；Diamante L等人，Protein Eng Des Sel 26:713-24(2013)；Houlihan G等人，J ImmunolMethods 405:47-56(2014))。
可以固定本发明的分子的固体基底的非限制性实例包括：微珠、纳米颗粒、聚合物、纳米聚合物、纳米管、磁珠、顺磁性珠、超顺磁性珠、链霉抗生物素蛋白包被的珠子、反相磁珠、羧基封端的珠子、肼封端的珠子、硅石(sodium silica)珠和亚氨二醋酸(IDA)–改性的珠子、醛–改性的珠子、环氧-活化的珠子、二氨基二丙胺(DADPA)-改性的珠子(具有伯胺表面基团的珠子)、可生物降解的聚合物珠子、聚苯乙烯基底、氨基-聚苯乙烯颗粒、羧基-聚苯乙烯颗粒、环氧-聚苯乙烯颗粒、二甲基氨基-聚苯乙烯颗粒、羟基-聚苯乙烯颗粒、着色的颗粒、流式细胞术颗粒、磺酸盐-聚苯乙烯颗粒、硝基纤维素表面、强化的硝基纤维素膜、尼龙膜、玻璃表面、活化的玻璃表面、活化的石英表面、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、基于聚丙烯酰胺的基底、聚氯乙烯基底、聚甲基丙烯酸甲酯基底、聚(二甲基硅氧烷)基底、和包含能够形成共价连接的光反应性物种诸如(诸如氮烯，聚炔，和羰自由基)的光聚合物。可以固定本发明的分子的固体基底的其他实例常用于分子展示系统，诸如，例如，细胞表面、噬菌体和病毒颗粒。
IX.递送装置和试剂盒
在某些实施方案中，本发明涉及一种装置，其包含用于递送给受试者的本发明的物质的一种或多种组合物，诸如药物组合物。因而，包含本发明的一种或多种物质组合物的递送装置可以用于通过多种递送方法给患者施用本发明的物质的组合物，所述递送方法包括：静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用；或通过本领域技术人员公知的其他方式。
试剂盒也在本发明范围内，所述试剂盒包含本发明的物质的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如，标准品、标志物等)。试剂盒典型地包括标签，所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)或用于诊断患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的分子、组合物或有关方法的治疗策略做出应答的群体的试剂和其他工具。
X.使用本发明的分子-包括本发明的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽、细 胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物的方法
通常，本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物，它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病患，诸如某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症、或在本文中提及的其他病理学状况。因此，本发明提供了使用本发明的分子(包括耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽，细胞靶向分子，药物组合物和诊断组合物)的方法，其用于靶向杀死细胞，用于将另外的外源物质递送进靶向细胞中，用于标记靶向细胞的内部，用于收集诊断信息，和用于治疗如本文中所述的疾病、病症和病患。
具体地，本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了使用由特征在于特定的多肽序列的多肽或蛋白组成的本发明的分子及其药物组合物的方法。例如，在SEQ ID NOs:4-61中的任一个多肽序列可以具体地用作在下述方法中使用的细胞靶向分子的成分。
本发明提供了杀伤细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使体外或体内细胞与本发明的分子或药物组合物接触。在使一个或多个细胞与要求保护的物质的组合物之一接触以后，本发明的分子和药物组合物可以用于杀伤特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如包含癌细胞、受感染的细胞和/或血液细胞的混合物。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的癌细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如移植前组织。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀伤细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如用于治疗目的的施用前组织材料。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于选择性地杀伤被病毒或微生物感染的细胞，或以其他方式选择性地杀伤表达特定细胞外靶标生物分子(诸如细胞表面生物分子)的细胞。本发明的分子和药物组合物具有多种应用，包括，例如，用于从体外或体内组织除去不希望的细胞类型，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，用作抗病毒剂，用作抗寄生虫剂，和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。
在某些实施方案中，当施用给受试者中(诸如需要治疗的患者中)的体外或体内细胞群体时，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物(单独地或与其他化合物或药物组合物组合地)可以表现出有效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和力结合区使酶活性志贺毒素区域的递送靶向癌细胞型，可以将该有效的细胞杀伤活性限于特异性地和选择性地杀伤生物体内的特定细胞类型，诸如某些癌细胞、赘生性细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞或受感染的细胞。
本发明提供了一种杀伤有此需要的患者中的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用至少一种本发明的细胞毒性分子或其药物组合物。
本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与癌症或肿瘤细胞物理连接的细胞外生物分子而杀死患者中的癌细胞和/或肿瘤细胞。术语“癌细胞”或“癌性细胞”表示以异常加速和/或不受调节的方式生长和分裂的各种赘生性细胞，且是技术人员显而易见的。术语“肿瘤细胞”包括恶性的和非恶性的细胞(例如，非癌性的、良性的肿瘤细胞、非癌性的“癌症”干细胞、肿瘤干细胞、恶性癌症前起始细胞、肿瘤起始细胞、或肿瘤发生细胞，它们可以产生变成恶性肿瘤和/或癌细胞但本身不能转移的子细胞(参见，例如，Martinez-Climent J等人，Haematologica 95:293-302(2010))。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病患。赘生性细胞通常与下述中的一种或多种相关：失调的生长，分化的缺失，局部组织侵入，血管生成，和转移。可能受益于本发明的方法和组合物的、由癌细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。
本发明可以用于杀伤癌症干细胞，其通常缓慢分裂并且耐受癌症治疗，如化疗，和辐射。例如，急性骨髓白血病(acute myeloid leukemias，AMLs)可以利用本发明杀伤AML干细胞和/或休眠的AML祖细胞进行治疗(例如，参见Shlush L等人，Blood 120:603-12(2012))。癌症干细胞通常过表达细胞表面靶标，诸如CD44和CD200，其可以用于靶向本发明的治疗分子(例如，参见Kawasaki B等人，Biochem Biophys Res Commun 364:778-82(2007)；Reim F等人，CancerRes 69:8058-66(2009))。
本发明的细胞毒性分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与免疫细胞物理连接的细胞外生物分子而杀死患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。
本发明的细胞毒性分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与受感染的细胞物理连接的细胞外生物分子而杀死患者中受感染的细胞。
为了以下目的利用本发明的细胞毒性分子或其药物组合物是在本发明范围内：从取自患者的分离的细胞群体离体除去B-细胞和/或T细胞。在一个非限制性实施例中，所述细胞毒性分子可以用在用于预防器官和/或组织移植排斥的方法中，其中在移植本发明的细胞毒性分子或其药物组合物之前灌注供体器官，以便净化器官的不需要的供体B-细胞和/或T-细胞。
为了以下目的利用本发明的细胞毒性分子或其药物组合物也是在本发明范围内：净化患者细胞群体(例如骨髓)的恶性的、肿瘤性的、或在其他方面不希望的B-细胞和/或T-细胞，然后将除去了B-细胞和/或T-细胞的物质重新输入患者中
为了以下目的利用本发明的细胞毒性分子或其药物组合物也是在本发明的范围内：消耗来自供体细胞群体的B-细胞、NK细胞和/或T-细胞，在经历骨髓或干细胞移植的患者中，作为针对移植物-抗-宿主病的预防，并且诱导耐受性(例如，参见Sarantopoulos S等人，Biol Blood Marrow Transplant 21:16-23(2015))。
本发明的细胞毒性分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与受感染的细胞物理连接的细胞外生物分子而杀死患者中受感染的细胞。
另外，本发明提供了治疗患者中疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的细胞毒性分子或其药物组合物。可以使用该方法治疗的预见到的疾病、病症或病患包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。施用“治疗上有效剂量”的本发明的分子或组合物可以导致疾病症状的严重程度的降低，无疾病症状阶段的频率和持续时间的增加，或由疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。
本发明的分子或组合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的哺乳动物的类型、和在考虑中的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员众所周知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳效力，并且可以取决于医学领域的技术人员众所周知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其他因素。最适用于人类用途的剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导，并且可以在适当地设计的临床试验中确认。通过常规方式，在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案，可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员已知的。
可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、阴道或透皮(例如，乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或借助于透皮贴剂)。“肠胃外施用”典型地与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位连通，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。
关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.0001-100毫克(mg)/千克(kg)受试者体重(mg/kg)，并且更通常为0.01-5mg/kg受试者体重。示例性剂量可以是0.25mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至六个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。
本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其他标志物，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的分子或组合物的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用，其中将分子或组合物每两至四周施用一次达六个剂量，然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。
使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种施用途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的，施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的分子、药物组合物和诊断组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。在其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
利用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种，可以施用本发明的治疗性分子和药物组合物。例如，在一个实施方案中，可以利用无针皮下注射装置施用本发明的药物组合物。在本领域中具有可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子，包括例如，用于受控速率递送的可植入微量输液泵；用于穿过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和其他这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。
本发明的分子、细胞靶向分子或药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其他治疗剂或诊断剂联合施用。联合治疗可以包括与至少一种其他治疗剂组合的本发明的细胞毒性分子或其药物组合物，所述其他治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病患而选择。其他这样的药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一个或多个信号传导途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性处理方案中互补的或在其他方面有益的类似调节治疗剂。
用本发明的细胞靶向分子或药物组合物对患者的治疗优选地导致被靶向的细胞的细胞死亡和/或被靶向的细胞的生长抑制。这样，本发明的细胞毒性分子和包含它们的药物组合物将可用在治疗多种病理学病症(其中杀死或除去靶细胞可能是有益的，例如尤其是癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和受感染的细胞)的方法中。本发明提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞病症(包括瘤形成、过度活跃的B-细胞和过度活跃的T-细胞)的方法。
在某些实施方案中，本发明的分子和药物组合物可以用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、生长异常、免疫病症和微生物感染。在另一个方面，以上离体方法可以与以上体内方法组合以提供治疗或预防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于实现免疫耐受的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者(诸如人)中的恶性病或肿瘤和其他血细胞相关癌症的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的细胞毒性分子或药物组合物。
本发明的分子和药物组合物具有多种用途，包括，例如，用于除去不希望的B-细胞和/或T-细胞，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，用作抗病毒剂，用作抗微生物剂，和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。本发明的分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或造成癌症或肿瘤细胞的死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或传播。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物用于治疗B-细胞-、浆细胞-、T-细胞或抗体-介导的疾病或病症，诸如例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、人免疫缺陷病毒相关的疾病(Human Immunodeficiency Virus-related diseases)、淀粉样变性、溶血性尿毒症综合征、结节性多发性动脉炎、多关节炎、脓毒性休克、克罗恩病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、哮喘、舍格伦综合征、移植物抗宿主病、移植排斥、糖尿病、血管炎、硬皮病和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)。
在另一个方面，本发明的分子和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂——意味着它们能够治疗和/或预防微生物致病感染(诸如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物造成)的获得、发展或后果。
提供对由B-细胞和/或T-细胞介导的疾病或病患的预防或治疗的方法在本发明的范围内，所述预防或治疗包括向患者施用本发明的细胞毒性分子或其药物组合物，用于杀伤所述患者中的B-细胞和/或T-细胞的目的。该用法与准备或调理患者用于骨髓移植、干细胞移植、组织移植或器官移植相容，而无论移植的物质的来源，例如人或非人来源。
提供通过用本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物对宿主B细胞和/或T细胞的靶向性细胞杀伤的骨髓接受体在本发明的范围内，用于预防或治疗宿主抗移植物疾病。
本发明的分子、细胞靶向分子和药物组合物可以用在治疗癌症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的分子、细胞靶向分子或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，正在治疗的癌症选自由下述组成的组：骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)和子宫癌。
本发明的分子和药物组合物可以用在治疗免疫病症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞毒性分子或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，所述免疫病症与炎症有关，所述炎症与选自由以下组成的组的疾病有关：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多发性动脉炎、多关节炎，银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的分子作为药物组合物或药物的成分，所述药物组合物或药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染。例如，可以用这样的药物治疗在患者的皮肤上呈现的免疫病症，以尝试减少炎症，。在另一个实施例中，可以用这样的药物治疗皮肤肿瘤，以尝试减小肿瘤大小或完全消除肿瘤。
本发明的某些细胞毒性分子、药物组合物和诊断组合物可以用在分子神经外科应用中，诸如免疫损伤(immunolesioning)和神经元示踪(关于综述，参见，Wiley R，Lappi D，Adv Drug Deliv Rev 55:1043-54(2003)。例如，可以从各种配体(诸如神经递质和神经肽)选择或衍生出靶向结构域，其通过结合神经元表面受体(诸如神经元回路特异性的G-蛋白连接的受体)而靶向特定神经元细胞类型。类似地，所述靶向结构域可以选自或源自结合神经元表面受体的抗体。因为志贺毒素效应子多肽能够稳健地指导它们自身的逆向轴突运输，本发明的某些细胞毒性分子可以用于杀死在远离细胞体的细胞毒性分子注射部位处表达所述细胞外靶标的神经元(参见Llewellyn-Smith I等人，J Neurosci Methods 103:83-90(2000))。这些神经元细胞类型特异性的靶向本发明的细胞毒性分子用在神经科学研究中，诸如用于阐明感觉的机制(参见例如Mishra S,Hoon M,Science 340:968-71(2013))，和建立神经变性疾病(诸如帕金森病和阿尔茨海默病)的模型系统(参见例如Hamlin A等人，PLoS One e53472(2013))。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物标记或检测细胞型内部的方法，所述细胞型诸如，例如，赘生性细胞和/或免疫细胞型。基于本发明的某些分子进入特定细胞型的能力和在细胞内经由逆行的细胞内转运的路径，可以标记特定细胞型的内部区室用于检测。这可以在生物体(例如，患者)内原位细胞上在体内进行，或在从生物体取出的细胞和组织(例如，活组织检查样品)上在体外进行。
为了关于疾病、病患和/或病症的信息收集的目的，在本发明的某些实施方案中是使用本发明的分子(例如，细胞毒性分子或细胞靶向分子)、多肽、蛋白、药物组合物和/或诊断组合物检测细胞类型的存在的方法。所述方法包括使细胞与诊断足够量的本发明的细胞毒性分子接触以通过测定或诊断技术检测所述细胞毒性分子。短语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定或诊断技术提供充分检测和准确测量的量。通常，对于完整生物体内诊断应用而言，诊断足够量是每位受试者在0.1mg至100mg本发明的检测促进剂连接的细胞靶向分子/千克受试者之间的非累积剂量。典型地，在这些信息收集方法中使用的本发明的分子(例如细胞靶向分子)的量将尽可能地低，前提条件是，它仍然是诊断足够量。例如，对于在生物体中的体内检测，施用给受试者的本发明的细胞毒性分子、细胞靶向分子、药物组合物或诊断组合物的量将可行地尽可能地低。
与检测促进剂组合的本发明的某些分子的细胞类型特异性的靶向提供检测细胞并获取其图像的方式，所述细胞与本发明的分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接。使用本发明的分子和/或诊断组合物对细胞的成像可以通过本领域已知的任意合适的技术在体外或在体内执行。使用本领域已知的各种方法，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品，可以收集诊断信息。本文中使用的术语“样品”表示任意数目的物品，但不限于，流体诸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活组织检查操作得到的组织。例如，通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(诸如直接的、荧光的和生物发光的成像)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声、x-射线计算机体层摄影术和前述技术的组合，多种检测促进剂可以用于非侵入性体内肿瘤成像(关于综述，参见Kaur S等人，Cancer Lett 315:97-111(2012))。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的分子或药物组合物作为诊断组合物标记或检测癌症、肿瘤和/或免疫细胞型的内部的方法(例如，参见，Koyama Y等人，ClinCancer Res 13:2936-45(2007)；Ogawa M等人，Cancer Res 69:1268-72(2009)；Yang L等人，Small 5:235-43(2009))。基于本发明的某些分子、细胞靶向分子和药物组合物进入特定细胞型并通过逆向细胞内转运在细胞内路线递送的能力，特定细胞型的内部区室被标记而用于检测。这一方法可以在患者体内进行，包括在原位细胞上进行，例如，在疾病部位进行，和/或在从生物体取下的细胞上在体外进行，例如，在活组织检测材料上进行。
本发明的诊断组合物可以用于表征潜在可能通过本发明的相关组合物治疗的疾病、病症或病患。本发明的物质的某些组合物可以用于确定患者是否属于响应利用本文所述的本发明的分子、组合物或相关方法的治疗性策略或充分适合使用本发明的递送装置的组。
可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物，以便更好地表征它，诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病病症或感染的表型评估可以帮助在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发时，可以使用本发明的某些方法来分辨是局部还是系统性问题。
本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗剂的应答，无论治疗剂的类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断的某些实施方案可以用于测量肿瘤大小的变化、抗原阳性细胞群体(包括数目和分布)的变化、和/或监测与已经施用给患者的疗法所靶向的抗原不同的标志物(参见Smith-Jones P等人，Nat.Biotechnol 22:701-6(2004)；Evans M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:9578-82(2011))。
用于检测细胞型的存在的方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病患的信息，诸如例如，骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)、子宫癌、AIDS、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症(autism)、心脏发生(cardiogenesis)、克罗恩病、糖尿病、红斑(erythematosus)、胃炎(gastritis)、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、淋巴增生性障碍(lymphoproliferativedisorders)、多发性硬化、重症肌无力(myasthenia gravis)、神经炎症(neuroinflammation)、结节性多发性动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus)、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增殖、炎症、白细胞激活、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B-细胞前淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、天然杀伤细胞白血病、结节边缘B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤、原发性渗出性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤(TCL)、重链病、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(MDS)、郁积型多发性骨髓瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。
在某些实施方案中，本发明的分子或其药物组合物用于诊断和治疗，或仅用于诊断。
下述选择性的细胞毒性的细胞靶向分子的非限制性实施例进一步举例说明了本发明，所述选择性的细胞毒性的细胞靶向分子包含来源于志贺毒素家族成员的A亚基的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽和能够结合与特定细胞型物理连接的细胞外靶标生物分子的结合区。
实施例
下述实施例证明了本发明的某些实施方案。然而，应该理解，关于本发明的条件和范围，这些实施例仅是用于举例说明的目的，并不是旨在，也不应该任意解释为是完全限定性的。除了另外详细说明，实施例使用标准技术进行，所述标准技术是本领域技术人员公知的、常规的。
下述实施例描述了出乎意料的发现：尽管A1片段在其羧基端共价连接相对大尺寸(即，尺寸大于28千道尔顿(kDa))的分子结构部分，破坏在志贺毒素A1片段羧基端的保守的弗林蛋白酶切割基序没有降低细胞靶向性的、志贺毒素A亚基来源的构建体的细胞毒性。这是令人惊讶的，原因在于认为志贺毒素中毒过程需要使志贺毒素A1片段与所有其他大分子结构部分释放，诸如，例如，与志贺毒素A2片段和志贺毒素B亚基五聚体释放。这是令人惊讶的，原因在于认为志贺毒素中毒过程需要使催化性志贺毒素A1片段与其靶向性亚基释放。这是令人惊讶的，原因在于认为最佳的志贺毒素中毒过程需要使志贺毒素A1片段与所有其他大分子结构部分释放，以呈递由ERAD系统识别的疏水羧基端结构域，从而有效地将释放的A1片段从内质网逆转运到细胞溶胶中，在细胞溶胶中，宿主细胞核糖体被催化失活。
如下述实施例中所证明的，包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽区的示例性的细胞靶向分子对靶细胞的细胞毒性等于包含弗林蛋白酶切割敏感的志贺毒素效应子多肽区的细胞靶向分子的细胞毒性。类似地，包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的示例性细胞靶向分子的选择性杀伤与它们的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞的选择性细胞毒性等于包含弗林蛋白酶切割敏感性志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子的细胞毒性。本发明的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子有效地：1)进入靶细胞；2)按路线将它们的耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽发送到细胞溶胶中；3)使核糖体失活；和4)杀伤靶细胞。另外，在施用给哺乳动物后，与包含弗林蛋白酶切割敏感性志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子相比，所述示例性的细胞靶向分子表现出改善的体内毒性。
下述实施例显示，尽管存在相对大的羧基端免疫球蛋白型结合区(用于细胞靶向)，破坏示例性的细胞毒性的细胞靶向分子的志贺毒素A亚基来源的多肽中的保守的弗林蛋白酶切割事件没有削弱这些细胞靶向分子的细胞毒性。这些相对大的羧基端结构部分物理上覆盖志贺毒素A1片段效应子多肽区的羧基端，并且可能有害地发挥作用将志贺毒素A1片段效应子多肽束缚在内质网膜中的靶标生物分子上，或另外干扰对于将A1片段效应子多肽有效地细胞内路线递送到中毒细胞的细胞溶胶是重要的分子机制。该实施例还表明，破坏志贺毒素A亚基效应子多肽中蛋白酶切割敏感性的、表面暴露的环的弗林蛋白酶切割的突变允许将细胞靶向分子改造为具有改善的体内耐受性同时保留与包含野生型志贺毒素A1片段区的细胞靶向分子一样强效且有效的志贺毒素细胞毒性。
实施例1.包含耐受弗林蛋白酶的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞毒性的细胞靶向分子(SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2)
产生耐受弗林蛋白酶的志贺毒素A亚基效应子多肽，并作为细胞靶向分子的成分进行检测，所述细胞靶向分子分别还包含细胞靶向性免疫球蛋白型结合区。为了在志贺毒素效应子多肽中改造进入蛋白酶耐受性，向来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的志贺毒素效应子多肽(包含SLT-1A的氨基酸1-251)中引入两个氨基酸残基置换，R248A和R251A。该耐受弗林蛋白酶切割的R248A和R251A双重突变体构建体在此处称为“SLT-1A-FR”(对于耐受SLT-1A弗林蛋白酶的)。使用单一残基置换R248A产生第二耐受弗林蛋白酶切割的突变体构建体，此处称为“SLT-1A-FR-2”。第三耐受弗林蛋白酶切割的突变体构建体，在此处称为“SLT-1A-FR-3”，包含单一残基置换R251A。预测在弗林蛋白酶共有基序区240-256核心中的最小的弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R的突变破坏该区域对弗林蛋白酶和其他蛋白酶(诸如，例如，前蛋白转化酶和泛宿主性蛋白酶)的蛋白水解的敏感性。包含弗林蛋白酶切割位点的R248A/R251A破坏的志贺毒素效应子多肽SLT-1A-FR用于产生示例性的细胞靶向分子。
构建示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2，使它们分别包含含有破坏的弗林蛋白酶切割位点的催化的志贺毒素A亚基效应子多肽区和细胞靶向性结合区。在SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2中，志贺毒素效应子多肽融合在相对大的羧基端结合区上。在细菌系统中生产SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2并且通过柱层析纯化。结合区scFv-1和scFv-2是单链的可变片段，它们分别以高亲和力结合特定的细胞表面靶向生物分子，所述靶向生物分子与特定的人癌症细胞的表面以及与特定的人癌症细胞物理连接。
检测包含SLT-1A-FR的示例性的细胞靶向分子的弗林蛋白酶蛋白水解敏感性
在包含羧基端细胞靶向性结合区的融合蛋白的分子情形中，检测为破坏弗林蛋白酶切割将蛋白酶切割敏感区域240-256突变后的志贺毒素效应子多肽的弗林蛋白酶切割敏感性。为了评估弗林蛋白酶切割SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2的能力，将在磷酸缓冲盐水(PBS)中的纯化的蛋白样品与弗林蛋白酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)以0.5个弗林蛋白酶活性单位(U)/微克(μg)样品蛋白一起在弗林蛋白酶切割缓冲液(100毫摩尔(mM)HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，pH 7，1mM CaCl2)中在30或37摄氏度(℃)温育25-30小时(hrs)。对照样品不与弗林蛋白酶在相同缓冲液中在4、30或37℃温育。将多至蛋白样品在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯氨酰胺凝胶上在变性条件下电泳，并且用考马斯染色(图2和3)。
图2和3显示了凝胶的图片，其中泳道编号，并且包含表示哪条泳道上样何种蛋白样品的图例：包含野生型志贺毒素效应子多肽(SLT-1A-WT)或破坏的弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应子多肽(SLT-1A-FR或SLT-1A-FR-2)的细胞靶向蛋白。标记为“L”的泳道显示蛋白分子量梯子的迁移模式，以及单个梯子蛋白条带的以kDa为单位的大致尺寸，其用作内部分子量参比，以允许估测编号泳道中的蛋白尺寸。该图例表示蛋白样品的预处理条件：以摄氏度(℃)为单位的温度，持续时间，以及是否加入任何弗林蛋白酶，标示为弗林蛋白酶活性单位量/微克(标示为“U/μg弗林蛋白酶”)或零单位的“无弗林蛋白酶”。
图2和3显示SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2耐受人弗林蛋白酶切割。在该测定中检测的细胞靶向蛋白尺寸均为55-57kDa，并且包含连接在羧基端接头上的约28kDa的志贺毒素效应子多肽(对于SLT-1A-WT和SLT-1A-FR二者尺寸相同)和结合区，它们一起在尺寸上约为28-29kDa。如果弗林蛋白酶切割发生在SLT-1A的表面暴露的、延伸的环242-251中，那么预测的结果将是两条接近相等分子量的蛋白条带，每条约为28kDa。如果弗林蛋白酶切割精确地发生在SLT-1A-WT::scFv-1或SLT-1A-WT::scFv-2中野生型(WT)支架的位置251处的精氨酸的羧肽键处，那么两条得到的蛋白条带应该具有27.5kDa的关于SLT-1A(野生型(WT)或FR)的分子量和关于SLT-1A-FR::scFv-1的28.8kDa或关于SLT-1A-FR::scFv-2的27.6kDa的第二条带。
图2显示在该测定中，在所检测的条件下，SLT-1A-FR::scFv-1在体外不被人弗林蛋白酶蛋白水解。如预测的，包含野生型志贺毒素效应子多肽的对照蛋白SLT-1A-WT::scFv-1被人弗林蛋白酶切割(图2)；然而，SLT-1A-FR::scFv-1耐受该酶(比较图2中的泳道3和6)。
在该测定中，在几种不同的温度，SLT-1A-FR::scFv-2也耐受弗林蛋白酶切割(图3)。图3显示在该测定中，在所检测的条件下，诸如在4°至37℃范围内的温度，SLT-1A-FR::scFv-2在体外不被人弗林蛋白酶蛋白水解。
另外，在该测定中，在4℃，细胞靶向性融合蛋白SLT-1A-FR-2::scFv-2耐受弗林蛋白酶切割。
使用该体外弗林蛋白酶切割分裂测定，在志贺毒素效应子多肽区的除248-251之外的任何弗林蛋白酶切割位点，诸如，例如，在SLT-1A互补物中在天然位于220至223的区域中的弗林蛋白酶切割位点处，没有观察到细胞靶向融合蛋白的弗林蛋白酶蛋白水解。
因此，使在弗林蛋白酶共有基序区核心中的最小的弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R突变破坏该区域对体外人弗林蛋白酶的蛋白水解的敏感性。
检测包含SLT-1A-FR的细胞靶向分子的核糖体抑制活性
本发明的分子全都包含来源于至少一个志贺毒素A亚基的催化结构域。使用体外核糖体抑制测定，检测耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽SLT-1A-FR的酶活性。使用SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2，在羧基端细胞靶向性结合区的分子情形中，检测SLT-1A-FR的核糖体失活活性。
使用
Figure BDA0003274689110001321
快速连接转录/翻译试剂盒(
Figure BDA0003274689110001322
Quick Coupled Transcription/Translation Kit，L1170 Promega Madison，WI，U.S.)，以无细胞体外蛋白翻译测定，确定SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2的核糖体失活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(L4821Promega Madison，WI，U.S.)和
Figure BDA0003274689110001323
Quick Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备一系列待测细胞靶向分子(包含SLT-1A-WT或SLT-1A-FR的蛋白)的10倍稀释液，并且为每个稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物成分。将在稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后，将荧光素酶测定试剂(Catalog#E1483，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)加入到所有试验样品中，并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。
通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析，确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，使用Prism软件在主题剂量-响应-抑制下的log(抑制剂)相对于反应(三个参数)的函数[Y＝底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]，计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。
计算来自一个或多个实验的包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽(SLT-1A-FR)区和野生型(WT)对照蛋白的每种蛋白的IC50并且显示在表1中。包含耐受弗林蛋白酶切割的SLT-1A-FR的构建体表现出强效的核糖体抑制作用，该抑制作用与野生型对照(诸如野生型SLT-1A1片段(SLT-1A1-WT))相当(表1)。SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2在体外表现出与野生型志贺毒素A1片段相当的核糖体失活活性。
表1.耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽在体外表现出与蛋白酶切割敏感性志贺毒素效应子多肽相等的核糖体抑制作用
多肽 核糖体抑制IC<sub>50</sub>(pM)
仅有SLT-1A1-WT 158
SLT-1A-WT::scFv-1 107
SLT-1A-FR::scFv-1 131
SLT-1A-WT::scFv-2 101
SLT-1A-FR::scFv-2 187
检测示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2的细胞毒 性
使用熟练的技术人员已知的细胞杀伤测定，确定包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽SLT-1A-FR的示例性的细胞靶向分子的细胞毒性。通过比较示例性的细胞靶向分子诊断表达靶标的细胞的细胞毒性与非靶向性的野生型志贺毒素效应子对照(SLT-1A-WT)的细胞毒性，确定特异性的细胞毒性。通过比较针对表达靶标的细胞相对于不结合细胞靶向分子的结合区的靶标生物分子的细胞的细胞毒性，确定选择性的细胞毒性。选择在至少一个细胞表面表达显著量的scFv-1或scFv-2的细胞外靶标生物分子的细胞，即，是结合区靶标生物分子阳性的细胞(细胞系A、B、C和D对scFv-1的靶标阳性，细胞系E、F和G对scFv-2的靶标阳性)。选择在任意细胞表面不表达显著量的scFv-1的任意细胞外靶标生物分子和/或在任意细胞表面不表达显著量的scFv-2的任意细胞外靶标生物分子的细胞，即，对结合区scFv-1和scFv-2中的一个或两个的任意靶标都是靶标生物分子阴性的细胞。
直接比较包含野生型SLT-1A(SLT-1A-WT)或耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽(SLT-1A-FR)的几乎相同的细胞靶向蛋白的细胞毒性，以区分由提供弗林蛋白酶切割耐受性的两个点突变引起的细胞毒性中的任意差别。预测，与包含通过蛋白水解切割，特别通过内切蛋白酶弗林蛋白酶可以从羧基端结构部分释放的SLT-1A-WT的细胞靶向分子相比，包含羧基端被相对大的结构部分覆盖的SLT-1A-FR的细胞靶向分子的细胞毒性将降低(参见Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999))。
将示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2的细胞毒性、特异性的细胞毒性和相对的细胞毒性与包含野生型志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子进行比较。
将某些人肿瘤细胞(包括细胞系A-G的细胞)涂布在384-孔平板的20微升(μL)细胞培养基中(对于贴壁细胞，2x103个细胞/孔，在蛋白加入前那天涂布，或者，对于悬浮细胞，7.5x103个细胞/孔，在蛋白加入同一天涂布)。在适当的缓冲液中制备一系列待检测的细胞靶向分子的10倍稀释液，并且将5μL稀释液或缓冲液对照加入到细胞中。仅包含细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与所述细胞靶向分子或仅与缓冲液在37℃和百分之五(％)二氧化碳(CO2)气氛中温育3天。在某些实施方案中，将细胞样品与所述细胞靶向分子或仅与缓冲液温育1小时或2小时。然后，用缓冲液冲洗洗掉未内在化的细胞靶向分子。使用
Figure BDA0003274689110001341
发光细胞存活力测定(Catalog#G7573，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)，按照供应商的使用说明，利用发光读数确定总细胞存活或存活力百分数。
使用下述式子计算实验细胞的存活力百分数：(测试RLU–平均的培养基RLU)/(平均的细胞RLU-平均的培养RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中绘制Log多肽浓度相对于存活力百分数，并且log(抑制剂)相对于响应(3个参数)分析用来确定所检测的蛋白的半最大细胞毒性浓度(CD50)。计算关于包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽或野生型对照志贺毒素效应子多肽的每种细胞靶向蛋白的CD50。
SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2针对多种表达靶标的人肿瘤细胞系的细胞毒性显示在表2中，表示为以纳摩尔(nM)为单位的细胞靶向蛋白浓度的半最大细胞毒性值(CD50)。令人惊讶地，包含SLT-1A-WT和SLT-1A-FR的细胞靶向蛋白都表现出相似的细胞毒性(图4-5；表2)，而包含SLT-1AFR的细胞靶向蛋白的细胞毒性有注意得到的减少，预测是志贺毒素A1片段任何时候都不能有效地从所有其他结构部分(诸如，例如，细胞靶向性结合区和4.5kDa A2片段)释放的结果(参见Garred
Figure BDA0003274689110001352
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110001353
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。
表2.耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽表现出与弗林蛋白酶可切割的、野生型志贺毒素效应子多肽相等的细胞毒性
Figure BDA0003274689110001351
包含SLT-1A-FR的细胞靶向蛋白的CD50值与包含SLT-1A-WT的细胞靶向蛋白的CD50值相当(表2)。包含SLT-1A-WT和SLT-1A-FR的细胞靶向蛋白都强效杀伤表达靶标的细胞，但在相同的剂量不杀伤相当的百分数的靶标阴性细胞(对于靶标阴性细胞的CD50值对于这些数据不提供信息，原因在于，当在最高的检测浓度没有细胞存活力相当大的降低时，不能产生准确的曲线)。总结在表2中的结果表明作为细胞靶向分子的成分的SLT-1A-FR和SLT-1A-WT相当的细胞毒性。SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2二者都与包含弗林蛋白酶切割敏感性的野生型志贺毒素A1片段区的相关细胞靶向分子一样是细胞毒性的。图示了包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽SLT-1A-FR的蛋白的特异性细胞毒性的一个实例：细胞毒性针对表达靶标的人肿瘤细胞(图4)，但是不针对靶标阴性的人肿瘤细胞(图5)。
使用实验室动物检测示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR:: scFv-2的体内耐受性
检测不同剂量的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2的耐受性，它们分别包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基效应子多肽区。使用小鼠来确定在不同剂量的示例性的细胞靶向分子耐受的明显的不利作用的程度。使用目的在于测量最大耐受剂量的鼠剂量发现确定治疗耐受性，以告知体内功效研究的起始剂量。在Charles River实验室(Charles River Laboratories International，Inc.，Morrisville，NC，U.S.)，以表3所述的四次分开的研究，进行耐受性研究。对于每次研究，将具有严重的联合免疫缺陷(SCID)的雌性C.B-17SCID小鼠按相似的平均体重分组。以0.25-5.00毫克/kg体重/次注射(mg/kg/inj)范围的剂量，向小鼠施用测试药剂或赋形剂对照，并且注射一周实施三次，持续一周或两周。在整个研究期间监测体重和临床迹象。使用实验室动物的体内耐受性研究的结果总结在表3中。表3表示每组小鼠的数目，施用的样品，注射剂量，以mg/kg/只小鼠(mg/kg/只小鼠)为单位的累积剂量，观察到的治疗相关的死亡的次数(死亡)和每组的死亡的平均日期。
表3.鼠耐受性研究证明示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2在0.25-2.50mg/kg/inj范围内的剂量在体内被充分耐受
Figure BDA0003274689110001371
在研究#1中，与赋形剂对照一起检测细胞靶向分子SLT-1A-WT::scFv-1。在研究的第1、3和5天，将小鼠给药赋形剂对照、1.25或2.50mg/kg/inj的SLT-1A-WT::scFv-1。在研究1中，所有用SLT-1A-WT::scFv-1治疗的小鼠在第三次剂量后两天开始具有治疗相关的死亡。在研究#1中，来自施用了1.25mg/kg/inj SLT-1A::WT-scFv-1的组的小鼠在研究的第7、8、9和10天死亡(每天一只小鼠)，来自施用了2.50mg/kg/inj SLT-1A-WT::scFv-1的组的小鼠在第7天(三只小鼠)或第8天(一只小鼠)死亡。在施用了赋形剂对照的组的所有小鼠都存活到研究结束。
在研究#2中，小鼠如研究#1中一样施用SLT-1A-WT::scFv-1，但是使用的是较高的最大剂量5.00mg/kg/inj。在研究#2中，对于如研究#1一样施用了SLT-1A-WT::scFv-1的小鼠发生相似的结果；然而，在研究#2中，由于在两个最高剂量组中的小鼠的治疗相关的死亡，在这些组中的小鼠仅接受两次注射。图6显示利用Kaplan-Meier图对来自施用了2.50mg/kg/inj SLT-1A-FR::scFv-1的组的小鼠(研究#2)与施用了SLT-1A-WT::scFv-1的小鼠(研究#1)的存活的比较。
在研究3中，小鼠与研究#1的剂量方案相似施用赋形剂对照或示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1，但是使用较低的剂量0.25mg/kg/inj。小鼠在研究的第1、3和5天用0.25，1.25或2.50mg/kg/inj SLT-1A-FR::scFv-1给药。所有施用了SLT-1A-FR::scFv-1的小鼠存活到研究#3结束时。观察到体重的剂量-依赖性的减少；然而，在研究#3中，对于SLT-1A-FR::scFv-1，观察到最大耐受剂量。最高检测剂量组(施用了2.50mg/kg/inj SLT-1A-FR::scFv-1)具有仅13.1％体重减少的最低值。这些结果证明SLT-1A-FR::scFv-1在0.25-2.50mg/kg/inj范围内的重复剂量在体内被良好地耐受。这些结果还证明，在所检测的条件下，SLT-1A-FR::scFv-1比SLT-1A-WT::scFv-1更好地被耐受。
在研究4中，小鼠以0.25、1.00或2.00mg/kg/次注射施用赋形剂对照或示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2，每周三次，持续两周(共六次剂量)。所有施用了SLT-1A-FR::scFv-2的小鼠存活到研究#4结束时，并且在研究过程中没有注意到不利的临床观察。研究#4延长到第32天，并且，对于所有包括施用了SLT-1A-FR::scFv-2的小鼠的组，观察到平均体重高于起始体重的80％。这些结果证明SLT-1A-FR::scFv-2在0.25-2.00mg/kg/inj范围内的重复剂量在体内被良好耐受。
与包含蛋白酶敏感性的野生型志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子的耐受性(研究#1和#2)相比，包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的示例性的细胞靶向分子在包括0.25-2.50mg/kg/inj范围内的重复剂量的剂量表现出改善的耐受性(研究#3和#4)。
对本发明这两种示例性的细胞靶向分子观察到的改善的体内耐受性表明，与包含弗林蛋白酶切割敏感性的志贺毒素效应子多肽的母本分子相比，可以将高得多的剂量的本发明的细胞毒性分子安全地施用给哺乳动物。
尽管保留与几乎相同的包含野生型志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子的相等的细胞毒性，但是包含耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽的示例性的细胞靶向分子在哺乳动物中表现出改善的耐受性，即，由于有害作用减少的改善的毒性模式。该改善的毒性模式可能是由于与分子整体提高的蛋白酶耐受性相关的非特异性细胞毒性的减少导致。这些结果还表明破坏弗林蛋白酶切割基序可能赋予整个细胞靶向分子提高的稳定性。另外，分子对蛋白水解的耐受性可能改善其对生物体施用的药物代谢动力学模式。
使用动物模型在体内检测示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2的靶向细胞 毒性和功效
使用弥散的人肿瘤异种移植模型确定示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2在携带人肿瘤的小鼠中的体内功效。在该异种移植模型中使用组成型表达荧光素酶并且表现出scFv-2的靶标的细胞表面表达的人肿瘤细胞。
在研究的第0天，将具有严重的联合免疫缺陷(SCID)的CB.17SCID小鼠静脉内用在200微升(μL)PBS中的2.5x 106个hTum-Luc肿瘤细胞(Molecular Imaging，Ann Arbor，MI，U.S.)攻击。在细胞注射后5分钟拍摄验证性生物发光图片(confirmatory bioluminescentimage，BLI)，并且间隔小鼠分成四组，每组十只小鼠(N＝10只小鼠)。在肿瘤细胞攻击后第0(植入后1小时)、2、4、7、9和11天，四个组中的小鼠通过腹膜内施用接受赋形剂对照(0mg/kg/inj)或剂量为0.05、0.50或2.00mg/kg/inj的SLT-1A-FR::scFv-2。在第14、18和21天，使用Caliper IVIS 50光学成像系统(Perkin Elmer，Waltham，MA，U.S.)测量生物发光。
在所有的剂量水平，所述示例性的细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2减少小鼠中的人肿瘤负荷。该研究的结果报道在图7和表4中。在该研究中，对于所有四个组，样品大小(n)是10只小鼠/组。图7显示基于人肿瘤细胞的荧光素酶报道子的表达通过随时间的生物发光/个体小鼠测定的肿瘤负荷。个体小鼠由图表中绘制的每种符号表示，即，空心三角形，实心三角形，空心圆形，或实心正方形。Y-轴是个体小鼠的总生物发光信号，其表示肿瘤负荷，单位是百万个光子/秒(光子/秒)，并且X-轴是注射剂量，其在0-2毫克SLT-1A-FR::scFv-2/千克体重/次注射的范围内。表4报告在不同时间点(研究日14、18、21和28)每个组中小鼠的平均BLI和平均值的标准误差(SEM)。
表4.鼠异种移植研究证明示例性的细胞毒性分子SLT-1A-FR::scFv-2在体内是有效的
Figure BDA0003274689110001401
这些结果表明SLT-1A-FR::scFv-2能够显著减少用人肿瘤细胞攻击的SCID小鼠中的人肿瘤负荷。与赋形剂对照相比，包括施用示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2的小鼠的所有组都表现出显著较少的总生物发光(图7和表4)。在施用范围在0.05-2.00mg/kg/inj之内的SLT-1A-FR::scFv-2剂量的小鼠中观察到这一作用(图7和表4)。观察到的肿瘤抑制作用是剂量依赖性的，原因在于施用了0.05mg/kg/inj SLT-1A-FR::scFv-2的小鼠表现出一些肿瘤生长(通过BLI测量)，而施用了0.50或2.00mg/kg/inj SLT-1A-FR::scFv-2的小鼠没有展现出肿瘤生长(表4，图7)。
这些结果表明示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2为：1)在体内有效地抑制肿瘤生长，除此之外，还表现出2)与包含弗林蛋白酶切割敏感性SLT-1A-WT的细胞靶向分子相等的细胞毒性；和3)与几乎相同的包含SLT-1A-WT的细胞靶向分子相比，在更高剂量的改善的耐受性。
总结
包含在最小的弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R中的突变的示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2不被人弗林蛋白酶蛋白水解，而是表现出与包含野生型志贺毒素A亚基区的细胞靶向蛋白相当的特异性的细胞毒性。示例性的细胞靶向分子SLT-1A-FR::scFv-2有效地抑制哺乳动物模型中的人肿瘤生长。另外，与包含野生型志贺毒素A亚基区的母本分子相比，SLT-1A-FR::scFv-1和SLT-1A-FR::scFv-2都表现出改善的耐受性。
SLT-1A-FR::scFv-1、SLT-1A-FR::scFv-2和SLT-1A-FR-2::scFv-2(它们分别包含含有弗林蛋白酶切割破坏突变(R248A和/或R251A)的志贺毒素效应子多肽)的特性表明弗林蛋白酶切割基序在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的环中的其他破坏可能提供相同的特性，诸如，例如，与包含野生型志贺毒素A亚基区的分子相等的细胞毒性和改善的体内耐受性模式。
在包含志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞靶向分子中与R248A和R251A相似的突变可以提供相似的结构和功能。例如，扰乱志贺毒素A亚基中保守的弗林蛋白酶切割共有基序S-R/Y-x-x-R的任意突变将导致弗林蛋白酶切割耐受性，但是不干扰细胞毒性。特别地，将精氨酸置换为任意缺少正电荷的非碱性氨基酸残基(诸如，例如，A，G，P，S，T，D，E，Q，N，C，I，L，M，V，F，W和Y)的氨基酸残基置换可以用于产生本发明的分子的志贺毒素效应子多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序。类似地，弗林蛋白酶切割基序内干扰最小的弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的志贺毒素A亚基截短和内部缺失可以用于产生具有相似的结构和功能的志贺毒素效应子多肽。
总之，可以使用耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基来源的多肽和大于28kDa的羧基端附近的结构部分产生没有任何细胞毒性降低的细胞毒性分子。这是令人惊讶的发现，原因在于，对于最佳细胞毒性，在适当的亚细胞区室中，志贺毒素需要在该弗林蛋白酶切割位点的蛋白水解加工(参见，例如，Garred
Figure BDA0003274689110001421
等人，Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred
Figure BDA0003274689110001422
等人，J Biol Chem 270:10817-21(1995)；Lea N等人，Microbiology 145:999-1004(1999)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。
实施例2.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和特异性针对CD20的羧基端结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αCD20连接的SLT-1A-FR)
在该实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区αCD20-抗原来源于识别人CD20的免疫球蛋白型结构域(参见，例如，Haisma H等人，Blood 92:184-90(1999)；Geng S等人，Cell Mol Immunol 3:439-43(2006)；Olafesn T等人，Protein Eng Des Sel 23:243-9(2010))，其包含能够结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白型结合区。CD20在多种癌细胞型，诸如B细胞淋巴瘤细胞、多毛细胞白血病细胞、B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞和黑素瘤细胞上表达。另外，CD20是治疗某些涉及过度活跃的B细胞的自身免疫疾病、病症和病患的治疗剂的有吸引力的靶标。
细胞毒性的细胞靶向分子“SLT-1A-FR::αCD20”的构建、产生和纯化
将免疫球蛋白型结合区αCD20和耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽连接在一起，形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码αCD20-抗原-结合蛋白SLT-1A-FR::αCD20(参见，例如，SEQ ID NOs:50，51，52和53)的多核苷酸来生产融合蛋白。使用如在以前的实施例中所述的细菌的和/或无细胞的蛋白翻译系统完成SLT-1A-FR::αCD20细胞毒性分子的表达。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“SLT-1A-FR::αCD20”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术测定，确定了本实施例的细胞毒性分子对CD20+细胞和CD20-细胞的结合特性。使用Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA，U.S.)，利用Prism软件在主题结合-饱和下的一个位点结合的函数[Y＝Bmax*X/(KD+X)]计算Bmax和KD。Bmax以MFI报道的最大特异性结合。KD是平衡结合常数，以nM报道。SLT-1A-FR::αCD20对CD20+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100纳摩尔(nM)范围内的KD，而在该测定中不存在与CD20-细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A-FR::αCD20细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A-FR::αCD20对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用CD20+细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“SLT-1A-FR::αCD20”的 细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用CD20+细胞确定了SLT-1A-FR::αCD20的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用CD20-细胞作为CD20+细胞的对比，确定了SLT-1A-FR::αCD20的选择性细胞毒性特征。对于CD20+细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达CD20的细胞的CD50是在细胞表面上表达CD20的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性分子“SLT-1A-FR::αCD20”的体内效应
使用动物模型确定细胞毒性分子SLT-1A-FR::αCD20对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性分子在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植物肿瘤的效应，所述异种移植物肿瘤由向这些小鼠注射在它们的细胞表面上表达CD20的人赘生性细胞产生。
实施例3.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和特异性针对HER2的羧基端结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽区源自如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区是来源于骆驼科抗体(VHH)蛋白5F7的单结构域可变区的αHER2 VHH，如在美国专利申请公开2011/0059090中所述。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区和耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽连接在一起以形成细胞毒性的细胞靶向分子(例如，参见，SEQ ID NO:54)。在该实施例中，将编码从蛋白5F7来源的αHER2-VHH可变区的多核苷酸与本领域已知的编码接头的多核苷酸在框架内和与编码志贺毒素效应子多肽(其包含SEQ ID NO:22的氨基酸)的多核苷酸在框架内克隆。产生“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的变体，使得所述结合区任选地位于志贺毒素效应子多肽的氨基端附近，且任选地包含KDEL家族的羧基端内质网信号基序('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。使用如在前述实施例中所述的细菌的和/或无细胞的蛋白翻译系统，完成“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子变体的表达。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术测定，确定本实施例的细胞毒性分子对HER2+细胞和HER2-细胞的结合特征。“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”变体对HER2+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与HER2-细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”变体对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用HER2+细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αHER2-VHH连接的 SLT-1A-FR”的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用HER2+细胞确定“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”变体的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用HER2-细胞作为HER2+细胞的对比，确定“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于HER2+细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达HER2的细胞的CD50是在细胞表面上表达HER2的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”的 体内效应
使用动物模型来确定细胞毒性分子“与αHER2-VHH连接的SLT-1A-FR”对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性分子在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植物肿瘤的效应，所述异种移植物肿瘤由向这些小鼠注射在它们的细胞表面上表达HER2的人赘生性细胞产生。
实施例4.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于抗体αEB抗原的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αEB连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子区是源自如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区αEB抗原来源于针对EB抗原的单克隆抗体(Fang C等人，J Immunol Methods 287:21-30(2004))，其包含能够结合被EB病毒感染的人细胞或表达EB抗原的转化细胞的免疫球蛋白型结合区。所述EB抗原在多个细胞类型上表达，诸如被EB病毒感染的细胞和癌细胞(例如淋巴瘤和鼻咽癌细胞)。另外，EB感染与其他疾病(例如，多发性硬化)有关。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αEB连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αEB-抗原和耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽连接到一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码αEB-抗原-结合蛋白“SLT-1A-FR::αEB::KDEL”的多核苷酸来生产融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。使用如在前述实施例中所述的细菌的和/或无细胞的蛋白翻译系统，完成“SLT-1A-FR::αEB::KDEL”细胞毒性分子的表达('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEB连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术测定，确定了本实施例的细胞毒性分子对EB抗原阳性细胞和EB抗原阴性细胞的结合特征。“与αEB连接的SLT-1A-FR”对EB抗原阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与EB抗原阴性细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αEB连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与αEB连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEB连接的SLT-1A-FR”的 细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定使用EB抗原阳性细胞确定“与αEB连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用EB抗原阴性细胞作为EB抗原阳性细胞的对比，确定“与αEB连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于EB抗原阳性细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达EB抗原的细胞的CD50是在细胞表面上表达EB抗原的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEB连接的SLT-1A-FR”的体内效 应
使用动物模型来确定细胞毒性分子“与αEB连接的SLT-1A-FR”对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性分子在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植物肿瘤的效应，所述异种移植物肿瘤由向这些小鼠注射在它们的细胞表面上表达EB抗原的人赘生性细胞产生。
实施例5.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于抗体α利什曼原虫-抗原的细胞毒性的细胞靶向分子(与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区α利什曼原虫抗原(αLeishmania-antigen)来源于使用本领域已知的技术制备的抗体，所述抗体针对存在于携带细胞内锥虫原生动物的人细胞上的细胞表面利什曼原虫抗原(参见Silveira T等人，Int J Parasitol31:1451-8(2001)；Kenner J等人，J Cutan Pathol 26:130-6(1999)；Berman J和Dwyer，Clin Exp Immunol 44:342-348(1981))。
细胞毒性的细胞靶向分子“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区α利什曼原虫抗原和志贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码利什曼原虫抗原结合蛋白SLT-1A-FR::α利什曼原虫::KDEL的多核苷酸产生融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。SLT-1A-FR::α利什曼原虫::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对利什曼原虫抗原阳性细胞和利什曼原虫抗原阴性细胞的结合特征。“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”对利什曼原虫抗原阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与利什曼原虫抗原阴性细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α利什曼原虫连接的SLT- 1A-FR”的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用利什曼原虫抗原阳性细胞确定“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用利什曼原虫抗原阴性细胞作为利什曼原虫抗原阳性细胞的对比，确定“与α利什曼原虫连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于利什曼原虫抗原阳性细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达利什曼原虫抗原的细胞的CD50是在细胞表面上表达利什曼原虫抗原的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
实施例6.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于免疫球蛋白型结合区α神经降压肽受体的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与α神经降压肽受体结合的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区α神经降压肽受体(αNeurotensinR)来源于DARPinTM(GenBank登记号:2P2C_R)或结合人神经降压肽受体的单克隆抗体(Ovigne J等人，Neuropeptides 32:247-56(1998))。神经降压肽受体由多种癌细胞表达，诸如乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤和胰腺癌细胞。
细胞毒性的细胞靶向分子“与α神经降压肽受体结合的SLT-1A-FR”的构建、生产和 纯化
将免疫球蛋白型结合区α神经降压肽受体和贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码神经降压肽受体结合蛋白SLT-1A-FR::α神经降压肽受体::KDEL的多核苷酸产生融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。SLT-1A-FR::α神经降压肽受体::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”的体外特 征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对神经降压肽受体阳性细胞和神经降压肽受体阴性细胞的结合特征。“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”对神经降压肽受体阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与神经降压肽受体阴性细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α神经降压肽受体连接的 SLT-1A-FR”的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定使用神经降压肽受体阳性细胞确定“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用神经降压肽受体阴性细胞作为神经降压肽受体阳性细胞的对比，确定“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于神经降压肽受体阳性细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达神经降压肽受体的细胞的CD50是在细胞表面上表达神经降压肽受体的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A- FR”的体内效应
使用动物模型来确定细胞毒性分子“与α神经降压肽受体连接的SLT-1A-FR”对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性分子在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植的肿瘤的效应，所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达神经降压肽受体)而产生。
实施例7.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于免疫球蛋白型结合区αEGFR的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αEGFR连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。结合区αEGFR来源于AdNectinTM(GenBank登记号:3QWQ_B)、AffibodyTM(GenBank登记号:2KZI_A；美国专利8,598,113)或抗体，它们都与一种或多种人表皮生长因子受体结合。表皮生长因子受体的表达与人癌细胞相关，诸如，例如，肺癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αEGFR与志贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码EGFR结合蛋白SLT-1A-FR::αEGFR::KDEL的多核苷酸产生融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。SLT-1A-FR::αEGFR::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对EGFR+细胞和EGFR-细胞的结合特征。“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”对EGFR+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与EGFR-细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEGFR连接的SLT-1A-FR” 的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定使用EGFR+细胞确定“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用利EGFR-细胞作为利什曼原虫抗原阳性细胞的对比，确定“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于EGFR+细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达EGFR的细胞的CD50是在细胞表面上表达EGFR的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”的体内 效应
使用动物模型来确定细胞毒性分子“与αEGFR连接的SLT-1A-FR”对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性分子在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植的肿瘤的效应，所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达EGFR(s))而产生。
实施例8.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于抗体αCCR5的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αCCR5连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区αCCR5来源于针对人CCR5(CD195)的单克隆抗体(Bernstone L等人，Hybridoma 31:7-19(2012))。CCR5主要在T细胞、巨噬细胞、树突细胞和小胶质细胞上表达。另外，CCR5在人免疫缺陷病毒(HIV)的发病机制和传播中起作用。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αCCR5与志贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码αCCR5-结合蛋白SLT-1A-FR::αCCR5::KDEL的多核苷酸产生融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。SLT-1A-FR::αCCR5::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对CCR5+细胞和CCR5-细胞的结合特征。“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”对CCR5+阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与CCR5-细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αCCR5连接的SLT-1A-FR” 的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定使用CCR5+细胞确定“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用CCR5-细胞作为CCR5+细胞的对比，确定“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于CCR5+细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达CCR5的细胞的CD50是在细胞表面上表达CCR5的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的体内 效应
使用动物模型来确定细胞毒性分子“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”对从耗尽来自供体物质的T细胞的体内效应(参见Tsirigotis P等人，Immunotherapy 4:407-24(2012))。使用非人灵长动物确定“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的体内效应。当用“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”预处理捐赠的器官时，在肾移植后，在恒河猴(rhesus macaques)中分析移植物抗宿主疾病(参见Weaver T等人，Nat Med 15:746-9(2009))。在肠胃外施用不同剂量的“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”以后，观察到食蟹猴灵长类动物中外周血T淋巴细胞的体内消耗。如下试验“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”的阻断HIV感染的用途：给非人灵长类动物施用急性剂量的“与αCCR5连接的SLT-1A-FR”，以便在暴露于猿猴免疫缺陷病毒(SIV)时严格耗尽循环T-细胞(参见Sellier P等人，PLoS One 5:e10570(2010))。
实施例9.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于抗-Env免疫球蛋白结构域的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αEnv连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺毒素的A亚基(StxA)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区αEnv来源于现有的结合HIV包膜糖蛋白(Env)的抗体，诸如GP41，GP120，GP140，或GP160(参见，例如Chen W等人，J Mol Bio 382:779-89(2008)；Chen W等人，Expert Opin Biol Ther 13:657-71(2013)；van den KerkhofT等人，Retrovirology 10:102(2013))，或来源于用标准技术产生的抗体(参见PrabakaranP等人，Front Microbiol 3:277(2012))。Env是在HIV复制过程中也在被展示在HIV-感染的细胞的细胞表面上的HIV表面蛋白。尽管Env在受感染的细胞中主要在胞内体区室中表达，足够量的Env可以存在于要被本发明的高度有效的细胞毒性的细胞靶向分子靶向的细胞表面上。另外，靶向Env的细胞毒性分子可能结合HIV病毒粒子并在病毒粒子与宿主细胞的融合过程中进入新感染的细胞。
因为HIV表现出高突变率，优选的是使用结合Env的功能受限部分的免疫球蛋白结构域，诸如结合来自多个HIV毒株的Env的宽泛中和抗体所证实的(van den Kerkhof T等人，Retrovirology 10:102(2013))。因为认为在受感染的细胞的表面上存在的Env呈递空间上受限的表位(Chen W等人，J Virol 88:1125-39(2014))，优选的是，使用小于100kD且理想地小于25kD，诸如sdAb或VHH结构域。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αEnv和耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码αEnv-结合蛋白SLT-1A-FR::αEnv::KDEL的多核苷酸来生产融合蛋白('KDEL'公开为SEQ IDNO:62)。SLT-1A-FR::αEnv::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对Env+细胞和Env-细胞的结合特征。“与αEnv连接的SLT-1A-FR”对Env+阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与Env-细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αEnv连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中“与αEnv连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的 细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定使用Env+细胞确定“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用Env-细胞作为Env+细胞的对比，确定“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于Env+细胞(取决于细胞系)和/或用于感染细胞使其成为Env+的HIV毒株，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达Env的细胞的CD50是在细胞表面上表达Env的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αEnv连接的SLT-1A-FR”的体内效 应
通过向感染了猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的非人灵长动物施用“与αEnv连接的SLT-1A-FR”检测“与αEnv连接的SLT-1A-FR”抑制HIV感染的应用(参见Sellier P等人，PLoS One5:e10570(2010))。
实施例10.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于抗体αUL18的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αUL18连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。免疫球蛋白型结合区αUL18来源于使用本领域已知的技术产生的针对细胞表面巨细胞病毒蛋白UL18的抗体，所述细胞表面巨细胞病毒蛋白UL18存在于感染了巨细胞病毒的人细胞上(Yang Z，Bjorkman P，Proc Natl Acad Sci USA105:10095-100(2008))。人巨细胞病毒感染与多种癌症和炎性病症相关。
细胞毒性的细胞靶向分子“与αUL18连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αUL18与志贺毒素效应子多肽连接在一起，并添加羧基端KDEL(SEQ ID NO:62)以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码αUL18-结合蛋白SLT-1A-FR::αUL18::KDEL的多核苷酸产生融合蛋白('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。SLT-1A-FR::αUL18::KDEL细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αUL18连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞和巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞的结合特征。“与αUL18连接的SLT-1A-FR”对巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αUL18连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。“与αUL18连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αUL18连接的SLT-1A-FR” 的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞确定“与αUL18连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞作为巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞的对比，确定“与αUL18连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对于巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达巨细胞病毒蛋白UL18的细胞的CD50是在细胞表面上表达巨细胞病毒蛋白UL18的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
实施例11.包含来源于志贺样毒素1的A亚基耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和来源于针对蠕虫肠道抗原的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区α蠕虫肠道抗原来源于使用本领域已知的技术产生的针对人转铁蛋白受体的蠕虫直向同系物的抗体(参见，例如线虫基因gcp-2.1UniProt G8JYE4_CAEEL；Rosa B等人，Mol Cell Proteomics M114.046227(2015))。
细胞毒性蛋白“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”的构建、产生和纯化
将免疫球蛋白型结合区α蠕虫肠道抗原与耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽连接在一起，以及任选地将KDEL家族的羧基端内质网信号序列('KDEL'公开为SEQ ID NO:62)连接在一起，形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码SLT-1A-FR::α蠕虫肠道抗原-结合蛋白的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A-FR::α蠕虫肠道抗原细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的分子结合测定，使用纯化的重组靶蛋白，确定了本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子的结合特征。“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”对靶蛋白的KD测量为大约100nM，而在该测定中不存在于阴性对照蛋白(例如，纯化的、重组的人转铁蛋白受体)的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”细胞毒性蛋白的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用蠕虫来确定细胞毒性蛋白“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”的毒性
使用模式蠕虫确定“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”对蠕虫的毒性(参见，例如Iatsenko I等人，Toxins 2050-63(2014))。可以通过浸没向蠕虫施用纯化的“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”，或备选地通过用表达例如SLT-1A::α蠕虫肠道抗原融合蛋白的细菌喂养蠕虫而施用。
另外，向携带蠕虫和/或展示蠕虫相关疾病的实验室动物施用“与α蠕虫肠道抗原连接的SLT-1A-FR”，并且监测其蠕虫和/或寄生的蠕虫的相关症状的减少或消除，诸如蠕虫杀伤，提高的不育性，减少的产卵力和生长抑制。
实施例12.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和靶向与来自感染剂的肽复合的人主要组织相容性分子的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子(与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR)
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺毒素的A亚基(StxA)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽。结合与特定的肽复合的人主要组织相容性(MHC)分子的免疫球蛋白型结合区获自使用熟练的技术人员已知的标准技术筛选的抗体和/或免疫球蛋白型文库或由使用熟练的技术人员已知的标准技术筛选的抗体和/或免疫球蛋白型文库设计(参见Tohidkia M等人，J Drug Target 20:195-208(2012)；de Marco A，Crit RevBiotechnol 33:40-8(2013)；Wen F，Zhao H，Methods Mol Biol 1061:245-64(2013))。
例如，感染了疟疾的人细胞在其细胞表面上呈递与来自恶性疟原虫(P.falciparum)顶膜抗原-1(AMA1)的抗原复合的I类MHC分子，诸如，例如，与肽TLDEMRHFY(SEQ ID NO:137)复合的HLA-A(例如，参见Lal A等人，Infect Immun 64:1054-9(1996)；Sedegah M等人，Malar J 9:241(2010)；Schwenk R等人，Malar J 12:376(2013))。类似地，感染了结核病的人细胞在其细胞表面上呈递与来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)因子的抗原复合的I类MHC分子，所述结核分枝杆菌因子诸如，例如，CFP10，PE/PPE，Rv0288，Rv1886c，Rv3875，和TB10.4(Axelsson-Robertson R等人，Immunology 129:496-505(2010)；Axelsson-Robertson R等人，Clin Vaccine Immunol 18:125-34(2011)；Wang M等人，Immunology 132:482-91(2011)；Axelsson-Robertson R等人，PLoS One 8:e58309(2013)).
细胞毒性的细胞靶向分子“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区αMHC-肽与耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽连接在一起，以形成细胞毒性的细胞靶向分子。例如，通过表达编码SLT-1A-FR::αMHC-肽蛋白的多核苷酸产生融合蛋白，其中所述结合区结合与来自结核分枝杆菌或恶性疟原虫的抗原性肽复合的特异性的人HLA亚型MHC分子。SLT-1A-FR::αMHC-肽细胞毒性分子的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。设计并检测特异性针对与疟疾抗原或结核分枝杆菌抗原复合的其他HLA型的结合区，以提供对人亚群的更好的覆盖。
确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”的体外特征
通过本领域已知的基于荧光的流式细胞计量术，确定了本实施例的细胞毒性分子对感染的人细胞的结合特征。“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”对抗原呈递细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范围内的KD，而在该测定中不存在与阴性对照细胞的显著结合。
在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”细胞毒性分子的核糖体失活能力。本实施例的细胞毒性分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αMHC-肽连接的SLT-1A- FR”的细胞毒性
通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用对特异性的MHC分子-肽复合物是阳性的感染的细胞和/或抗原呈递细胞，确定“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”的细胞毒性特征。另外，通过相同的一般细胞杀伤测定，确定“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”的选择性细胞毒性特征。对MHC-肽+细胞(取决于细胞系)，本实施例的细胞毒性分子的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性分子对于不在细胞表面上表达相同的MHC-肽的CD50是在细胞表面上确实存在特异性靶向的MHC-肽的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型确定细胞毒性的细胞靶向分子“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”的体 内效应
通过向疟疾感染、结核分枝杆菌、子孢子感染和肝期疟原虫寄生虫感染的动物模型施用“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”，检测“与αMHC-肽连接的SLT-1A-FR”抑制疟原虫或结核分枝杆菌感染的应用。这种类型的靶向MHC-肽复合物的治疗可以特别用于感染了结核分枝杆菌或疟原虫的、也是免疫损害的个体，诸如，例如，无脾的、T-细胞缺陷的和/或感染HIV的患者。
实施例13.包含耐受蛋白酶切割的志贺毒素效应子区和靶向不同细胞型的结合区的细胞毒性的细胞靶向分子
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽区是来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)、志贺毒素的A亚基(StxA)和/或志贺样毒素2的A亚基(SLT-2A)的耐受蛋白酶的志贺毒素效应子多肽，具有天然存在于SLT-1A和StxA的248-251或SLT-2A的247-250的氨基酸序列中的破坏的蛋白酶敏感性位点。结合区来源于这样的免疫球蛋白结构域：其来自选自表5的第1列的分子，且其结合在表5的第2列中所示的细胞外靶标生物分子。使用本领域已知的试剂和技术，任选地产生具有羧基端KDEL-型信号基序和/或检测促进剂的该实施例的示例性细胞毒性蛋白。如在前述实施例中所述，使用表达适当的细胞外靶标生物分子的细胞，检测本实施例的示例性的细胞毒性的细胞靶向分子。例如，可以使用本实施例的示例性的细胞靶向分子诊断和治疗在表5的第3列中所示的疾病、病患和/或病症。
表5.用于耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基来源的多肽的细胞靶向的不同结合区
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尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案，显而易见，可以利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发明，而不背离本发明的精神或超出权利要求的范围。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。国际专利申请公布WO2014164680 A1和WO 2014164693 A2的公开内容分别通过引用完全结合在本文中。美国专利申请公布US 2007/0298434 A1，US 2009/0156417 A1，和US 2013/0196928 A1的公开内容分别通过引用完全并入本文。专利申请系列号US62/010918的公开内容通过引用完全结合在本文中。国际PCT专利申请公开内容WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/120058,WO 2015/138435和WO 2015/138452的公开内容各自通过引用整体并入本文。关于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心，美国)的所有可电子获得的生物序列信息的完整公开内容各自通过引用整体并入本文。
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Claims (16)

1.一种细胞靶向分子，其包含：
i)结合区，其特异性结合与细胞的细胞表面物理偶联的细胞外靶标生物分子，其中所述结合区包含免疫球蛋白型结合区；和
ii)志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1至251具有至少95％同一性的氨基酸序列，
其中所述氨基酸序列具有以突变R248A和R251A为特征的破坏的弗林蛋白酶切割基序，和
其中所述氨基酸序列包含在对应于SEQ ID NO:1的第75位的氨基酸残基处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:1的第77位的氨基酸残基处的酪氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第114位的氨基酸残基处的酪氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第167位的氨基酸残基处的谷氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第170位的氨基酸残基处的精氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第176位的氨基酸残基处的精氨酸，以及在对应于SEQ ID NO:1的第203位的氨基酸残基处的色氨酸。
2.权利要求1的细胞靶向分子，其中所述结合区与所述志贺毒素效应子多肽的羧基端融合以形成单个连续多肽。
3.权利要求1或2的细胞靶向分子，其中所述免疫球蛋白型结合区包含选自以下的多肽：单结构域抗体片段，单链可变片段，抗体可变片段，互补决定区3片段，受限的FR3-CDR3-FR4多肽，Fd片段，抗原-结合片段，纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域，脂质运载蛋白，Kunitz结构域，蛋白-A来源的Z结构域，γ-B晶体蛋白来源的结构域，泛蛋白来源的结构域，Sac7d-来源的多肽，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，从骆驼科动物来源的重链抗体结构域VHH片段，从软骨鱼来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，多聚化scFv片段，双特异性的串联的scFv、双特异性微抗体，和二价纳米抗体。
4.权利要求3的细胞靶向分子，其中所述多聚化scFv片段包含双抗体、三抗体或四抗体。
5.权利要求1或2的细胞靶向分子，其中所述结合区结合选自以下的细胞外靶标生物分子：CD20，CD22，CD40，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAM，EphB2，前列腺特异性膜抗原，Cripto，内皮糖蛋白/CD105，成纤维细胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，叶酸结合蛋白，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，生腱蛋白，CD64，间皮素，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，人酪氨酸酶相关蛋白1，人酪氨酸酶相关蛋白2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，前列腺干细胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305；C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，mrp-14，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，II类MHC，CD284/TLR4，CD107/Mac3，CD195/CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282/TLR2，CD11c，CD117和CTLA-4。
6.权利要求1或权利要求2的细胞靶向分子，其包含选自以下的接头肽：蛋白酶敏感接头、环境氧化还原电位敏感接头、pH敏感接头、酸可切割接头、光可切割接头和热敏感接头。
7.权利要求1或权利要求2所述的细胞靶向分子，其包含具有氨基酸序列(GxS)n的接头肽，其中x为1至6且n为1至30。
8.权利要求7所述的细胞靶向分子，其中所述接头肽具有氨基酸序列GGGGS。
9.权利要求7所述的细胞靶向分子，其中所述接头肽具有氨基酸序列EFPKPSTPPGSSGGAP。
10.药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的细胞靶向分子和药学上可接受的赋形剂或载体。
11.编码权利要求1至9中任一项的细胞靶向分子的多核苷酸或其互补物。
12.包含权利要求11的多核苷酸的表达载体。
13.包含权利要求11的多核苷酸或权利要求12的表达载体的宿主细胞。
14.权利要求1-9任一项的细胞靶向分子、权利要求10的药物组合物、权利要求11的多核苷酸、权利要求12的表达载体或权利要求13的宿主细胞在制造药物中的用途，所述药物用于治疗患者的疾病、病症或病患。
15.权利要求14所述的用途，其中所述疾病、病症或病患选自：癌症、肿瘤、免疫病症和微生物感染。
16.权利要求14所述的用途，其中所述疾病、病症或病患选自：
骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、子宫癌、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多发性动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
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