CN113454108A - 包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 - Google Patents
包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113454108A CN113454108A CN202080010483.7A CN202080010483A CN113454108A CN 113454108 A CN113454108 A CN 113454108A CN 202080010483 A CN202080010483 A CN 202080010483A CN 113454108 A CN113454108 A CN 113454108A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- shiga toxin
- amino acid
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 509
- 239000012636 effector Substances 0.000 title claims abstract description 291
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 214
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 209
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title claims description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 443
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 418
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 410
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 226
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 224
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 199
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 102
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 96
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 92
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 65
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 60
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 46
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 46
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 39
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 24
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 24
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 abstract 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 255
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 250
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 248
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 246
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 243
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 243
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 200
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 151
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 126
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 109
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 83
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 102100034047 Heat shock factor protein 4 Human genes 0.000 description 64
- 101001016879 Homo sapiens Heat shock factor protein 4 Proteins 0.000 description 64
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 54
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 47
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 42
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 40
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 40
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 40
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 40
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 40
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 36
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 26
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 25
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 24
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 23
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 21
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 21
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 17
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 14
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 13
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 101100438926 Macaca fascicularis CD38 gene Proteins 0.000 description 10
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 9
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 9
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 7
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 102200056168 rs371443644 Human genes 0.000 description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NGNQZCDZXSOVQU-UHFFFAOYSA-N 8,16,18,26,34,36-hexahydroxyhentetracontane-2,6,10,14,24,28,32-heptone Chemical compound CCCCCC(O)CC(O)CC(=O)CCCC(=O)CC(O)CC(=O)CCCCCC(O)CC(O)CC(=O)CCCC(=O)CC(O)CC(=O)CCCC(C)=O NGNQZCDZXSOVQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000939689 Araneus ventricosus U2-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 4
- 101000633673 Buthacus arenicola Beta-insect depressant toxin BaIT2 Proteins 0.000 description 4
- 101000654318 Centruroides noxius Beta-mammal toxin Cn2 Proteins 0.000 description 4
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 101001028695 Chironex fleckeri Toxin CfTX-2 Proteins 0.000 description 4
- -1 L and D isomers) Chemical class 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 4
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 229960002204 daratumumab Drugs 0.000 description 4
- CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N darunavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1[C@@H]2CCO[C@@H]2OC1)C1=CC=CC=C1 CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N 0.000 description 4
- 229960005107 darunavir Drugs 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 description 3
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 description 3
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 description 3
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 description 3
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 3
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108010091769 Shiga Toxin 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220636115 Zinc finger and BTB domain-containing protein 34_G46R_mutation Human genes 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 3
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 3
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 102200058597 rs121912631 Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 3
- 102220583987 28S ribosomal protein S10, mitochondrial_D58R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241001148231 Acinetobacter haemolyticus Species 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- 101000835996 Caenorhabditis elegans Slit homolog 1 protein Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 102220579879 Ceramide-1-phosphate transfer protein_F50R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 230000008341 ER-associated protein catabolic process Effects 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- 101000671638 Homo sapiens Vesicle transport protein USE1 Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102220515626 Pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase 2_Y77S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220524118 Pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase domain-containing protein 1_D47R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101150104869 SLT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 2
- 102220506570 Small ubiquitin-related modifier 2_K11R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220608724 Suppressor of cytokine signaling 2_D53R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102220635522 Vacuolar protein sorting-associated protein 33A_S33R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102100040106 Vesicle transport protein USE1 Human genes 0.000 description 2
- 101150011439 abr1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000012042 bayesian logistic regression model Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 2
- 102220359228 c.35C>G Human genes 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010013 cytotoxic mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 102200000898 rs104894496 Human genes 0.000 description 2
- 102220229124 rs1064795659 Human genes 0.000 description 2
- 102200081901 rs137854510 Human genes 0.000 description 2
- 102200081477 rs1554102559 Human genes 0.000 description 2
- 102220005174 rs33952850 Human genes 0.000 description 2
- 102200158802 rs34017450 Human genes 0.000 description 2
- 102220289974 rs757282628 Human genes 0.000 description 2
- 102220075938 rs768714949 Human genes 0.000 description 2
- 102220081547 rs863223734 Human genes 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- FZNWJRXTACKOPU-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylthioethyl)malic acid Chemical compound CSCCC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FZNWJRXTACKOPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000018667 ADP-ribosyl Cyclase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010027122 ADP-ribosyl Cyclase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102100024365 Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 229940124295 CD38 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 102220586060 Chemerin-like receptor 2_K11A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220628221 Coagulation factor IX_N48I_mutation Human genes 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 101000648230 Escherichia phage 933W Shiga-like toxin 2 subunit A Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000192016 Finegoldia magna Species 0.000 description 1
- 102220532888 GTP-binding protein Rheb_D60I_mutation Human genes 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-REOHCLBHSA-N L-selenocysteine Chemical compound [SeH]C[C@H](N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220594472 Lipid droplet-regulating VLDL assembly factor AUP1_D58I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150057659 Mlac1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010060880 Monoclonal gammopathy Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100000406 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) abr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102220633909 PRKCA-binding protein_L49A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000002774 Paraproteinemias Diseases 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 102220510059 Phosphomevalonate kinase_R84M_mutation Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 102220466415 Protein phosphatase 1B_R55A_mutation Human genes 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 101150111022 STX1A gene Proteins 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710117498 Shiga-like toxin 1 subunit A Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 102000011362 Thioredoxin domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001669 Thioredoxin domains Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 102220359803 c.10G>A Human genes 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 102000021178 chitin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011157 chitin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030583 endoplasmic reticulum localization Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical class [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000002473 ribonucleic acid immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 102200049904 rs1071645 Human genes 0.000 description 1
- 102200032056 rs111033630 Human genes 0.000 description 1
- 102220002513 rs121908938 Human genes 0.000 description 1
- 102220007621 rs137853162 Human genes 0.000 description 1
- 102220340766 rs1555191832 Human genes 0.000 description 1
- 102200071029 rs202003795 Human genes 0.000 description 1
- 102200118306 rs33919924 Human genes 0.000 description 1
- 102220005276 rs33919924 Human genes 0.000 description 1
- 102220005175 rs33961886 Human genes 0.000 description 1
- 102220209172 rs782296172 Human genes 0.000 description 1
- 102220064446 rs786205841 Human genes 0.000 description 1
- 102220076183 rs796052896 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 1
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/25—Shigella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
- C12Y302/02022—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2) rRNA N-glycosylase (3.2.2.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供结合蛋白(“CD38结合蛋白”),其各自包含(1)用于细胞靶向的CD38结合区和(2)志贺菌毒素A亚基效应子多肽(“志贺菌毒素效应子多肽”)。CD38结合蛋白的志贺菌毒素效应子多肽组分可包含相对于野生型志贺菌毒素序列的突变组合,其中所述突变组合提供(1)去免疫和/或(2)蛋白酶敏感性降低;其中每个志贺菌毒素效应子多肽保留一种或多种志贺菌毒素功能,例如刺激细胞内化、指导细胞内按路线发送、催化活性和/或强效的细胞毒性。CD38结合蛋白可以有一种或多种用途,例如选择性杀死特定的表达CD38的细胞类型;并且更通常地,用于诊断和治疗涉及CD38表达细胞的癌症和病症,例如,CD38阳性造血系统癌症,如多发性骨髓瘤。
Description
I.相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月6日提交的美国临时申请号62/945,107、2019年12月6日提交的美国临时申请号62/945,106和2019年1月23日提交的美国临时申请号62/795,633的权益,每个文件均通过引用整体纳入本文。
II.以电子方式提交的文本文件的描述
以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体纳入本文:序列表的计算机可读格式副本(文件名:MTEM_009_01WO_SeqList_ST25 UPDATED 23JAN 2020.txt,记录日期为2020年1月23日,文件大小238kb)。
III.技术领域
本发明涉及结合蛋白(每个结合蛋白是“CD38结合蛋白”),其各自包含(1)CD38结合区或结构域和(2)志贺菌毒素A亚基效应子多肽(“志贺菌毒素效应子多肽”)。
IV.背景技术
以下包括可能有助于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与本发明相关,也不承认本文具体或隐含引用的任何出版物或文件是现有技术。
CD38在患有多发性骨髓瘤的受试者中的恶性浆细胞上高度表达。多发性骨髓瘤是浆细胞的血液恶性肿瘤,涉及浆细胞过度增殖,导致终末器官损伤。在多发性骨髓瘤中,恶性浆细胞可通过产生称为M蛋白(也称为骨髓瘤蛋白或单克隆蛋白)的异常免疫球蛋白,导致单克隆丙种球蛋白病或血浆中异常高水平的M蛋白而导致疾病。此外,恶性浆细胞会在骨髓中积累,从而挤出健康细胞。
期望具有用作治疗分子来治疗多种疾病(例如造血系统癌症)CD38结合蛋白,这些疾病可以通过选择性杀死CD38表达细胞或将有益剂选择性递送至CD38表达细胞中而被治疗。期望具有表现出低抗原性和/或免疫原性、低脱靶毒性和强效的中靶(on-target)细胞毒性的细胞毒性、CD38结合、细胞靶向蛋白。例如,希望具有包含细胞毒性志贺菌毒素A亚基衍生组分的CD38结合蛋白,其具有1)降低的不期望的抗原性和/或免疫原性的可能性(例如通过突变)和/或2)降低的非特异性毒性的可能性(例如通过改善的稳定性),同时维持对CD38表达细胞的强效细胞毒性。此外,希望具有表现出低抗原性和/或免疫原性、低脱靶毒性、高稳定性和/或将货物递送至表达CD38的靶细胞的能力的治疗性和/或诊断性CD38结合蛋白。
V.发明概述
如本文所述,本发明提供了CD38结合融合蛋白,其包含至少一个志贺菌毒素A亚基效应子多肽和至少一个CD38结合域,以及任选的接头。
因此,在一些方面,本发明提供了CD38结合融合蛋白,其包含:a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):1)包含SEQ ID NO:34的序列的vHCDR1;2)包含SEQ ID NO:35的序列的vHCDR2;和3)包含SEQ ID NO:36的序列的vHCDR3;和c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):1)包含SEQ ID NO:31的序列的vLCDR1;2)包含SEQID NO:32的序列的vLCDR2;和3)包含SEQ ID NO:33的序列的vLCDR3。
在进一步的实施方案中,CD38结合融合蛋白包含SEQ ID NO:79的序列。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:43的序列的VL和包含SEQID NO:44的序列的VH。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白具有a)VL,其包含SEQ ID NO:43的序列,或与SEQ ID NO:43具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%氨基酸同一性的序列,和b)VH,其包含SEQ ID NO:44的序列,或与SEQ ID NO:44具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:41的序列的VL和包含SEQID NO:44的序列的VH。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白具有VL和VH,所述VL包含SEQ ID NO:41的序列,或与SEQ ID NO:41具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%氨基酸序列同一性的序列,所述VH包含SEQ ID NO:44的序列,或与SEQ ID NO:44具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白包含:a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):1)包含SEQ ID NO:22的序列的vHCDR1;2)包含SEQ IDNO:23的序列的vHCDR2;和3)包含SEQ ID NO:24的序列的vHCDR3;和c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):1)包含SEQ ID NO:19的序列的vLCDR1;2)包含SEQ ID NO:20的序列的vLCDR2;和3)包含SEQ ID NO:21的序列的vLCDR3。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:37的序列的VL和包含SEQ ID NO:38的序列的VH。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有VL和VH,所述VL包含SEQ ID NO:37的序列,或与SEQ ID NO:37具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%氨基酸序列同一性的序列,所述VH包含SEQ ID NO:37的序列,或与SEQ ID NO:37具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白包含:a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):1)包含SEQ ID NO:28的序列的vHCDR1;2)包含SEQ IDNO:29的序列的vHCDR2;和3)包含SEQ ID NO:30的序列的vHCDR3;和c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):1)包含SEQ ID NO:25的序列的vLCDR1;2)包含SEQ ID NO:26的序列的vLCDR2;和3)包含SEQ ID NO:27的序列的vLCDR3。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:39的序列的VL和包含SEQID NO:40的序列的VH。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白具有VL和VH,所述VL包含SEQ ID NO:39的序列,或与SEQ ID NO:39具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%氨基酸序列同一性的序列,所述VH包含SEQ ID NO:40的序列,或与SEQ ID NO:40具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽和CD38结合结构域之间的第一接头。在一些实施方案中,第一接头是蛋白质接头,并且可以是约1至约40个氨基酸。在一些实施方案中,第一接头包含SEQ ID NO:70的序列。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有第一接头,所述第一接头包含SEQ ID NO:70-75中任一项的序列,或与SEQ ID NO:70-75具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白包含位于VH和VL之间的第二接头。在一些实施方案中,该第二接头包含序列(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:195),其中n等于1、2、3、4或5,在一些实施方案中n=1。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白从其N-到C-末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VH-第二接头-VL。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白从其N-到C-末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VL-第二接头-VH。
在另外的方面,CD38结合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:46的序列的志贺菌毒素A亚基效应子多肽。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白具有志贺菌毒素A亚基效应子多肽,所述志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQ ID NO:45-69中任一项的序列,或与SEQ ID NO:45-69具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。
在另外的方面,权利要求1的CD38结合融合蛋白,其中志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQ ID NO:46的序列,VL包含SEQ ID NO:43的序列,并且VH包含SEQ ID NO:44的序列。
在进一步的方面,CD38结合融合蛋白与SEQ ID NO:79的序列具有至少95%的氨基酸序列同一性。
在另外的方面,本发明的CD38结合融合蛋白是同型二聚体。在一些实施方案中,同型二聚体包含两个相同的多肽,每个多肽包含SEQ ID NO:79的序列。在一些实施方案中,同型二聚体包含两个相同的多肽,每个多肽包含与SEQ ID NO:79具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,至少约90%、95%或98%的CD38结合融合蛋白是同型二聚体的形式。
在一些方面,本发明提供了本发明的CD38结合融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)的组合物。
在进一步的方面,本发明提供了编码CD38结合融合蛋白的核酸,以及包含所述核酸的表达载体,以及包含本文所述核酸和/或表达载体的宿主细胞。类似地,本发明提供了包括在表达CD38结合融合蛋白的条件下培养具有核酸和/或表达载体的宿主细胞,并回收所述蛋白质。在一些实施方案中,通过将CD38结合融合蛋白与细菌蛋白质L接触来纯化蛋白。在一些情况下,蛋白质L是分离自或源自大消化链球菌(P.magnus),其可与树脂缀合。
在另外的方面,本发明提供了治疗多发性骨髓瘤的方法,包括向有需要的受试者施用本发明的CD38结合融合蛋白。
VI.附图简述
图1A-1B:图1A和图1B中提供了说明性CD38靶向分子的示意图,每个分子包含至少一个CD38结合区和至少一个志贺菌毒素A亚基效应子。在图1A中,CD38结合区通常是scFv,它包含由接头隔开的抗CD38VH和VL结构域,scFv位于志贺菌毒素组分的N端或C端。在一个示例性的CD38靶向分子中,CD38结合区是scFv,并且显示scFv参与与相邻scFv的分子间可变结构域交换(图1B,左下)。图1A-1B中说明性分子的描绘是为了说明本发明的有限组实施方案的结构特征的某些总体布置。应当理解,这些说明性分子不旨在也不应被解释为完全确定本发明分子的任何结构特征和/或组分的排列。图1A-1B的示意图中所示的特征的相对大小、位置或数量已被简化。图1A-1B中的示意图不旨在准确描绘关于本发明任何实施方案中分子结构的相对大小的任何信息。
图2:图2显示了五十一种CD38靶向分子池中各种分子对CD38阳性H929人骨髓瘤细胞的代表性CD50值。如图所示,CD38靶向分子可以是任一方向,即VH-VL或VL-VH。灰色方块代表池中的另外的成员。1x103pM的筛选临界值由垂直虚线表示,其中左侧的CD50值比截断值(cutoff)更强效,而右侧的CD50值比截断值更弱。在该测定中,52种测试分子中未展示出20,000pM或更低的CD50的任何一种分子不包括在图2中。一些最强效的测试分子在CD38靶向分子家族#6和#7中。
图3A-3C:图3A-3C显示了使用不同浓度的CD38靶向分子#3和#4的代表性细胞毒性测定。CD38靶向参考分子#1和不具有靶向结构域的志贺效应子多肽分别用作阳性和阴性对照。CTM#3和CTM#4显示出对CD38阳性H929细胞(图3A)和MOLP-8细胞(图3B)的浓度依赖性细胞毒性。通过比较对CD38阳性H929和MOLP-8细胞的细胞毒活性(图3A-3B)与对CD38阴性U266细胞的细胞毒活性(图3C)来研究对表达CD38的细胞的细胞毒性的特异性。CTM#3和CTM#4在测试条件下均未对U266细胞表现出显著的细胞毒活性(图3C)。
图4A-4B:图4A-4B显示了使用人细胞(图4A)或非人灵长类动物(图4B)细胞测试的CD38靶向分子#1、#2和#4的代表性细胞毒性测定。BLCL-C162是一种表达恒河猴CD38的恒河猴细胞系。CD38靶向参考分子#1和不具有靶向结构域的志贺效应子多肽分别用作阳性和阴性对照。CTM#1、CTM#2和CTM#4显示出对CD38阳性MOLP-8细胞(图4A)和CD38阳性BLCL-C162细胞(图4B)的浓度依赖性细胞毒性。请注意,恒河猴和食蟹猴中CD38的序列是相同的。
图5:图5显示了CD38靶向分子#4在无细胞体外蛋白质翻译测定中的浓度依赖性蛋白质合成抑制活性;蛋白质合成抑制是本文所述志贺菌毒素的一种活性。CD38靶向参考分子#1和不具有靶向结构域的志贺效应子多肽用作阳性对照。与阳性对照参考分子相比,CTM#4以浓度依赖性方式降低了通过相对发光单位(RLU)测量的荧光素酶蛋白质合成。
图6A-6B:在图6A-6B中,CD38靶向分子(CTM#2、CTM#3和CTM#4)与重组人CD38蛋白(图6A)或重组食蟹猴CD38蛋白(图6B)的结合特性是用酶联免疫吸附测定(ELISA)结合测定来确定的。分子CD38靶向分子#2(SEQ ID NO:77)、CD38靶向分子#3(SEQ ID NO:78)和CD38靶向分子#4(SEQ ID NO:79)各自与人和食蟹猴CD38结合,而CD38靶向参考分子#1(SEQ IDNO:83)与人CD38结合(图6A)但不与食蟹猴CD38结合(图6B)。
图7:图7显示了CD38的3维蛋白质结构图,以及CD38中由CD38靶向分子#4结合的关键残基的位置,其是通过使用人CD38胞外结构域表位作图(mapping)诱变来确定的。在图7中,关键表面可及接触残基F216和L262以红色显示,关键结构残基L124和L230以紫色显示,参与二硫键对的关键结构残基C119/C201和C254/C275以灰色显示。
图8A-8H:图8A-8H显示了在达雷木单抗(daratumumab)存在下,各种说明性CD38靶向分子(CTM#1、CTM#2、CTM#4、CTM#7和家族#5的CTM)对表达CD38的细胞的细胞毒活性。使用人骨髓瘤H929细胞(图8A))、人淋巴瘤ST486细胞(图8B)和人多发性骨髓瘤MOLP-8细胞(图8C)测量0.5μg/Ml CTM#1、CTM#7或家族#5的CD38靶向分子对用系列稀释的达雷木单抗(daratumumab)预处理的CD38阳性细胞的细胞毒活性。使用CD38阳性人淋巴瘤ST486细胞(图8D),人多发性骨髓瘤MOLP-8细胞(图8E)测量所施用的稀释系列的CTM#1、CTM#7或家族#5的CTM对用10?g/mL达雷木单抗预处理的细胞的细胞毒活性。使用人骨髓瘤H929细胞或人多发性骨髓瘤MOLP-8细胞测量的向暴露于50μg/mL达雷木单抗的表达人CD38的细胞施用的CTM#4稀释系列的细胞毒活性(图8F)。图8G显示了CTM#4对暴露于系列浓度的达雷木单抗并在施用CTM#4后48小时测量的人骨髓瘤MOLP-8细胞的代表性CD50值(nM)。图8H显示了向用一系列浓度的达雷木单抗处理的人多发性骨髓瘤MOLP-8细胞施用的CTM#4稀释系列,在暴露于CTM#4后48小时后的细胞毒活性和CD50值(nM)。在图8H中,在具体的达雷木单抗浓度(nM)处的CTM#4的CD50值(nM)显示在下表中。CTM#4的细胞毒活性在达雷木单抗的存在下得以保留,在达雷木单抗浓度约为10,000nM时CD50值适度变化。
图9:图9显示BALB/c小鼠体重随时间的变化,所述小鼠在12天内被施用1毫克/千克体重(mg/kg)的CD38靶向分子#3或CD38靶向分子#4达六次剂量。由于接受CTM#3的一半小鼠在第12天的最后一次预定剂量之前死亡,因此在第12天之前停止CTM#3组的给药。
图10:图10显示了血清抗药免疫球蛋白G的量,其是使用适用于血清样品的溶液内ELISA测定法测量的,其中该血清样品取自与去免疫化较少的CD38靶向对照分子(SEQ IDNO:84)相比,施用CTM#1、CTM#2或CD38靶向参考分子#1的小鼠。每只小鼠施用0.25mg/kg的相应CD38靶向分子,每周3次持续两周,然后在第4周和第5周再施用每周3次,在5周的期间总共12次剂量。在研究的给药阶段和给药结束后的不同时间点收集小鼠血清。
图11A-11D:图11A-11D显示了在人类癌症的体内异种移植小鼠模型中人类肿瘤随时间的生长。向小鼠注射表达低量和高量CD38的人骨髓瘤肿瘤细胞(LP1细胞,图11A;H929细胞,图11B;MM1.S细胞,图11C;MOLP-8细胞,图11D),并施用CD38靶向分子#4或仅运载体(vehicle)的阴性对照。蓝色表示仅赋形剂对照的测量值;所有其他数据均为不同剂量(例如1.5、3、4.5、5、6、9、10或12mg/kg)和施用方案(例如,每两周一次,BIW;每周一次,QW;或每隔一周一次,Q2W)的CTM#4的数据。
图12:图12A显示接受用说明性CD38靶向分子治疗的癌症的弥散性异种移植小鼠模型中的平均生物发光信号。图12A显示MM1.S-luc弥散性多发性骨髓瘤小鼠模型中的平均生物发光信号。图12B显示了在异种移植肿瘤细胞中使用萤光素酶活性的生物发光成像收集的小鼠图像:仅施用运载体的小鼠在其全身广泛地表现出强烈信号,而施用CD38靶向分子#4(CTM#4)的小鼠通过这种方法似乎没有可检测的MM1.S-luc肿瘤细胞。在10只小鼠中有10只观察到肿瘤完全消除。图12C显示了在DDaudi-luc弥散性异种移植小鼠模型中的平均生物发光信号。图12C显示了在异种移植肿瘤细胞中使用萤光素酶活性的生物发光成像收集的小鼠图像:仅施用运载体的小鼠在其全身广泛地表现出强烈信号,而施用CD38靶向参考分子#1的小鼠在相关研究日表现出减少的信号。
图13:图13图示了在非变性条件下通过尺寸排阻层析法(SEC)分析的CTM#4的样品制剂中存在的蛋白质种类的大小和比例。对于SEC分析,将流经SEC柱后洗脱的材料在280纳米(nm)波长处的紫外(uv)光的吸光度以毫吸光度单位(mAU)对以分钟为单位的洗脱时间(min)进行绘图。使用软件来鉴定280nm迹线中的各个峰以及每个峰在280nm处紫外光的最大吸光度的洗脱时间。以18.81分钟为中心的峰(#2)代表CTM#4的非共价同型二聚体形式,其包含1014个氨基酸残基,理论分子量为约110kDa,而以17.38分钟为中心的峰(#1)代表一个或多个更高分子量的物质,例如CTM#4的多聚体和/或聚集体。单个峰的纯度可以通过将该峰的面积除以样品的总峰面积来计算。大约25分钟处的峰代表了由缓冲液洗脱引起的紫外光吸光度的预期信号。
图14A-14B:图14A是说明性CD38靶向分子例如CTM#4的示意图。CTM#4包含连续多肽,该多肽包含通过蛋白质接头融合的工程化去免疫化(DI)志贺菌毒素亚基A效应子多肽(SLT-1A)和抗CD38单链可变片段(scFv)。图14B是显示说明性CD38靶向分子例如CTM#4的潜在作用机制的示意图,该潜在作用机制涉及通过细胞表面CD38特异性结合至表达CD38的细胞,内化到这些靶细胞中;从核内体到高尔基体,然后到内质网,然后到胞质溶胶以逆行途径进行细胞内自选路径(self-routing);以及一旦在胞质溶胶中,核糖体不可逆的酶促失活导致靶细胞死亡。CTM#4的这种假定作用机制与患者的免疫功能状态无关。
图15:图15显示CTM#4在原代细胞培养物中杀死源自患者的多发性骨髓瘤细胞。图15显示了施用CTM#4的浓度(Conc)系列之后的总多发性骨髓瘤细胞存活百分比和和CTM#4针对多发性骨髓瘤细胞样品的CD50值(nM),该样品是通过骨髓穿刺(BMA)从六个不同患者(010、011、012、013、014和015)获得的,其中所述患者包括来自达雷木单抗抗性患者(#13)的一个样品。在图15中,表格的中间列报告了患者样品中MM细胞的CD38受体密度。在CTM#4施用后48小时,在广泛的CD38表达水平内(例如1.4至67.5×105个CD38分子/细胞的CD38细胞表面密度),观察到CTM#4对原代多发性骨髓瘤细胞的强效细胞毒性(例如,CD50值为3.5至8.5nM)。
图16:图16显示了在体外向人多发性骨髓瘤细胞施用CTM#4后,使用实时Glo测定法测量的细胞成活力的时间进程研究的结果。图16显示了跨来自多发性骨髓瘤细胞组的不同细胞类型(ANBL-6、NCI-H929、RMPI-8226和MOLP-8)及在非多发性骨髓瘤对照细胞系(HCT116)中,随时间的CTM#4 CD50值(ng/mL)。在图16中,表格在底部两行(CTM#4或CD38TM4)中报告了CD50值(pM)。在图16中,表格报告了细胞表面CD38的表达水平并将该值在CD38表达行中表征为高或中。
图17:图17显示了用人多发性骨髓瘤MM1.S细胞接种小鼠以形成弥散性异种移植物并用CTM#4处理后,肿瘤体积的时间过程。小鼠每周(QW)或每隔一周(Q2W)用CTM#4治疗一次,并且任选地与多发性骨髓瘤的美国现行护理标准(SOC)共同治疗。
图18A-18B:图18A-18B显示了在施用CTM#4的稀释系列之后,使用流式细胞术对人全血(左图)和食蟹猴全血中的总自然杀伤(NK)细胞计数进行的离体分析。显示了在该测定中消除一半NK群体的所计算的CTM#4浓度(CD50)。
图19:图19显示人多发性骨髓瘤ANBL-6细胞对CTM#4施用的剂量-反应曲线和结果的表格总结。将ANBL-6细胞与CTM#4连续孵育48或72小时,或暴露于CTM#4 2小时,洗涤并保存在不含CTM#4的培养基中直至48或72小时时间点。图19显示了在四种测试条件下,CTM#4对ANBL-6细胞的CD50值:在48小时时间点,不清洗的情况下为0.03nM且清洗2小时为0.16nM;在72小时时间点,不清洗的情况下为0.01nM且清洗2小时为0.1nM。
图20:图20是显示针对归类为具有复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的患者的CTM#4单一疗法临床研究的第一阶段的设计的示意图。研究设计包括剂量递增阶段(第1部分)和扩展阶段(第2部分)。在这两个部分中,患者均进行治疗直至发生进展性疾病(PD)、不可接受的毒性或退出。
图21:图21是说明CTM#4单一疗法临床研究的给药方案的示意图。剂量递增将从50μg/kg CTM#4开始,然后根据在治疗周期1中观察到的剂量限制性毒性(DLT)的数量如图21所示进行。在评估50μg/kg剂量后,通过具有超剂量控制的贝叶斯逻辑回归模型(BLRM)连同考虑其他可用的非DLT安全性、临床效力、药代动力学(PK)和药效学(PD)数据,将获知后续剂量递增和最大耐受剂量(MTD)决定。
图22A-22B:图22A列出了CTM#4单一疗法临床研究的主要和次要目标,并且图22B列出了其探索性目标。
图23A-23D:图23A和图23B显示在抗CD38抗体达雷木单抗、HB-7、AT13-5及OKT-10存在下,CD38结合蛋白(包括CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83))与表达CD38的MOLP-8细胞的结合。图23C显示CD38结合蛋白(包括CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83))与表达CD38的MOLP-8细胞的竞争性结合。所有信号均通过流式细胞术检测。图23D是总结在抗CD38抗体达雷木单抗、HB-7、AT13-5、OKT-10及抗CD38结合scFv(左第一列)存在下,CD38结合蛋白(顶列)的结合的表格。如图23A-D中所用:CD38TM1融合蛋白是指包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的CD38结合融合蛋白;CD38TM2融合蛋白是指包含SEQ ID NO:229序列的CD38结合融合蛋白;CD38TM3融合蛋白是指包含SEQ ID NO:230序列的CD38结合融合蛋白。
图24A和24B分别显示了通过IMAC柱和蛋白L(Pro-L)柱纯化CTM#3和CTM#4。MW标记指示分子量标记所在的位置。CD38TM3的VH和VL不结合标准单克隆抗体纯化树脂(蛋白A或蛋白L),并且使用His-tag和IMAC柱进行纯化(图24A)。为了使纯化更容易,通过框架突变对为λ轻链的CD38TM3轻链进行修饰,使得其能够结合至蛋白质L,从而容许在没有额外标签的情形下进行亲和纯化。得到的CD38TM4能够与蛋白L结合,并因此可以通过蛋白L亲和力进行纯化。
图25A-25D:图25A-25D显示了适合用作CD38靶向分子的组分的各种说明性CD38靶向部分的序列。图25A提供了CD38结合区家族#1和CD38结合蛋白#1(CD38TM1)的序列。图25B提供了CD38结合区家族#2和CD38结合蛋白#2(CD38TM2)的序列。图25C提供了CD38结合区家族#3和CD38靶向部分#3(CD38TM3)的序列。图25D提供了CD38结合区家族#3和CD38靶向部分#4(CD38TM4)的序列。如图25D所示,CD38TM3 VL结构域的前21个氨基酸被CD38TR1的VL结构域的前22个氨基酸取代,其是Kappa轻链以衍生CD38TM4的VL结构域。CDR序列加下划线。
图26:图26显示了由两个相同scFv形成的双抗体的X射线结构图解,每个scFv从N-到C-末端含有VH-GGGGS-VL,其中VH和VL来自CD38TM4。一条scFv链(链A)的VH与另一条scFv链(链B)的VL复合以形成CD38结合结构域。
VII.具体实施方式
本发明提供了CD38结合蛋白及其组合物的各种实施方案,其中每个CD38结合蛋白包含(1)至少一个志贺菌毒素A亚基效应子多肽,其衍生自志贺菌毒素家族的至少一个成员的A亚基,和(2)至少一个CD38结合区,其能够特异性结合CD38分子的细胞外部分,任选地具有接头,如下所述。对于本发明的每个CD38结合蛋白,至少一个结合区与志贺菌毒素A亚基效应子多肽是异源的,例如免疫球蛋白型结合区。
A.定义
本发明的这些和其他特征、方面和优点将通过以下说明、所附权利要求和附图更好地理解。本发明的前述要素可以单独组合或自由移除以形成本发明的其他实施方案,在下文中没有反对这种组合或移除的任何声明。
为了更容易理解本发明,下面定义了一些术语。在本发明的详细描述中可以找到另外的定义。
如说明书和所附权利要求书中所使用的,术语“一”,“一个”和“该”包括单数和复数个所指对象,除非上下文另外明确指出。
如在说明书和所附权利要求中使用的,术语“和/或”在提及两种物质A和B时,是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中所用,术语“和/或”在提及多于两种物质例如A、B和C时,是指A、B或C中的至少一种,或A、B或C的任意组合的至少一种(每种物质具有单一或多种可能性)。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”是指物理上包含多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。例如,蛋白质可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个多肽。在蛋白质包含多于一个多肽的实施方案中,蛋白质的多肽可以彼此相同或不同。蛋白质可以是单体或多聚体,例如二聚体、三聚体、四聚体等。
“肽”是大小小于总计约15至20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”是指一系列氨基酸或氨基酸残基,其根据长度物理上包含肽或多肽。有时,本文所用的“残基”意在表示蛋白质中的位置及其相关的氨基酸同一性。除非另有说明,本文公开的多肽和蛋白质序列从左到右书写,代表它们从氨基末端到羧基末端的顺序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或多肽序列包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体),并且除非另有限制,还包括可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物,例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸羟丁赖氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。
本文中的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸置换、插入和/或缺失,或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如,修饰可以是附接到蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸置换、插入和/或缺失。为清楚起见,除非另有说明,氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸,例如在DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。
本文中的“氨基酸置换”或“置换”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地,在一些实施方案中,置换是针对不是在特定位置处天然存在的氨基酸,或者不是在生物体内或在任何生物体中天然存在的氨基酸。例如,置换N297A是指变体多肽,在这种情况下是Fc变体,其中位置297处的天冬酰胺被丙氨酸取代。为清楚起见,经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸置换”;也就是说,尽管产生了编码相同蛋白质的新基因,但如果该蛋白质在其开始的特定位置具有相同的氨基酸,则不是氨基酸置换。
关于肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸残基的短语“保守置换”是指肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸组成的变化,其基本上不改变整个肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的功能和结构(参见Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company,New York(2nd ed.,1992)))。
如本文所用,“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸序列。例如,-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。此外,233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所用,“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中特定位置处去除氨基酸序列。例如,E233-或E233#、E233()或E233del表示位置233处谷氨酸的缺失。此外,EDA233-或EDA233#表示从位置233处开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用,“蛋白质”是指至少两个共价附接的氨基酸,其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基包含天然存在的氨基酸和肽键,或合成的肽模拟物结构,即“类似物”,例如类肽(参见Simon等人,PNAS USA 89(20):9367(1992),通过引用全部纳入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如不是由DNA编码的氨基酸);正如本领域技术人员所理解的那样。例如,出于本发明的目的,高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是合成氨基酸,并且可以使用D-和L-(R或S)构型的氨基酸。本发明的变体可以包括修饰,所述修饰包括使用例如由Schultz及其同事开发的技术掺入的合成氨基酸的使用,包括但不限于由Cropp&Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30,Anderson等人,2004,Proc Natl Acad SciUSA 101(2):7566-71,Zhang等人,2003,303(5656):371-3,和Chin等人,2003,Science 301(5635):964-7描述的方法,其通过引用整体纳入。此外,多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
本文中的“野生型或WT”是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列,包括等位基因变异。WT蛋白具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
如本文所用,“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中,与亲本蛋白质相比,蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰,例如,与亲本相比,约一到约七十个氨基酸修饰,并且在一些实施方案中,约一到约五个氨基酸修饰。如下所述,在一些实施方案中,亲本多肽(例如Fc亲本多肽)是人野生型序列,例如来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区,尽管具有变体的人序列也可作为“亲本多肽”。在一些实施方案中,本文的蛋白质变体序列与亲本蛋白质序列具有至少约80%的同一性,并且在一些实施方案中与亲本蛋白质序列具有至少约90%同一性、至少约95%、至少约95%或至少约99%的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。
本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”是指一组六个互补决定区(CDR),当作为多肽序列的一部分存在时,其特异性结合本文所述的靶抗原。因此,“抗CD38抗原结合结构域”结合本文所概述的CD38抗原。如本领域已知的,这些CDR通常作为第一组可变重CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻CDR(vlCDR或VLCDR)存在,每组包含三个CDR:对于重链,是vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3,和对于轻链,是vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。如本领域所理解的,CDR在每一重链可变区和轻链可变区中由框架区隔开:对于轻链可变区,这些是(VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4,并且对于重链可变区,它们是(VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4。
本发明的抗原结合域可以以多种格式体现,例如Fab、Fv和scFv。在“Fab”格式中,这组6个CDR由两个不同的多肽序列贡献,重链可变区(vh或VH;包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和轻链可变区(vl或VL;包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3),其中VH的C末端附接到重链CH1结构域的N末端,并且VL的C端附接到恒定轻结构域的N末端(从而形成轻链)。重链可变区和轻链可变区一起形成Fv,如本文所述,其可以是scFv或Fab。因此,在一些情况下,抗原结合结构域的六个CDR由VH和VL贡献。在scFv格式中,VH和VL通常通过使用本文概述的接头共价附接到单个多肽序列中,其可以是(从N端开始)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
如本文所用,“Fab”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可指独立的此区域,或在全长抗体或抗体片段背景中的此区域。
如本文所用,“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”是指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。本领域技术人员将理解,这些由两个结构域(可变重结构域和可变轻结构域)组成。
本文中的“单链Fv”或“scFv”是指共价连接到可变轻结构域的可变重结构域,通常使用如本文所述的scFv接头,以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域可以处于从N末端到C末端的任一方向(vh-接头-vl或vl-接头-vh)。通常,接头是本领域公知的和上文所述的scFv接头。
术语“抗体”以最广泛的含义使用并且包括例如完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白的抗原结合部分或与免疫球蛋白相关或源自免疫球蛋白的抗原结合蛋白。完整的抗体结构单元通常包含四聚体蛋白。每个四聚体通常由两对相同的多肽链组成,每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50至70kDa的分子量)。人免疫球蛋白轻链可分类为具有κ或λ轻链。在一些实施方案中,本发明提供了抗体结构,其包含通常基于IgG类的抗原结合结构域(例如抗体重链和/或轻链),该IgG类具有若干亚类,包括但不限于IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。一般来说,IgG1具有不同的同种异型,在356(D或E)、IgG2和358(L或M)处具有多态性。本文描述的序列使用356D/358M同种异型,但其他同种异型也包括在本文中。即,本文所包括的包含IgGl Fc结构域的任何序列可以具有356E/358L替代356D/358M同种异型。IgG4的使用频率高于IgG3。
应该注意的是,IgGl具有不同的同种异型,在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文描述的序列使用356D/358M同种异型,但其他同种异型也包括在本文中。即,本文所包括的包含IgGl Fc结构域的任何序列可以具有356E/358L替代356D/358M同种异型。
因此,本文所用的“同种型”是指由其恒定区的化学和抗原性特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。如本文所用,“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”是指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的、经比对的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如,因为IgG1在EU位置296处包含酪氨酸而IgG2包含苯丙氨酸,所以IgG2中的F296Y置换被认为是IgG亚类修饰。类似地,因为IgG1在位置241处具有脯氨酸,而IgG4在那里具有丝氨酸,所以具有S241P的IgG4分子被认为是IgG亚类修饰。注意亚类修饰在本文中被认为是氨基酸置换。
如本文所用,“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含抗体中除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如,CHl)以外的恒定区以及在一些情况下部分铰链的多肽。对于IgG,Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)以及CH1(Cγ1)和CH2(Cγ2)之间的下铰链区。尽管Fc区的边界可有所变化,但通常将人IgG重链Fc区定义为包括残基C226或P230至其羧基末端,其中编号是根据如Kabat中的EU索引。因此,IgG背景中的“CH”结构域为如下:“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置231-340,并且“CH3”指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。因此,“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域,和任选的铰链结构域(铰链-CH2-CH3)。在一些实施方案中,如下文更充分地描述的,对Fc区进行氨基酸修饰,例如以改变与一种或多种Fc?R受体或与FcRn受体的结合。
本文中的“重恒定区”是指人IgG抗体的CHl-铰链-CH2-CH3部分。
“轻恒定区”是指κ或λ的CL结构域。
如本文所用,“可变结构域”意指免疫球蛋白中包含一个或多个Ig结构域的区域,该一个或多个Ig结构域实质上由分别构成κ、λ及重链免疫球蛋白遗传基因座的V?(V.κ)、V?(V.λ)和/或VH基因中任一编码。因此,“可变重结构域”包含(VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4,“可变轻结构域”包含(VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4。
每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区,在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区,重链和轻链的每个V结构域聚集了三个环,以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(以下简称“CDR”),其中氨基酸序列的变异最为显著。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间在序列上有很大差异的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反,V区由下述组成:称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的延伸段,其由称为“高变区”的变化极大的较短区域隔开,每个高变区的长度为9-15个氨基酸或更长。
每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”,“CDR”)和四个FR组成,从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区通常涵盖来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1;“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1;“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基;Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如,轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3),以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3);Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。本发明的具体CDR描述如下。
如本领域技术人员将理解的,CDR的确切编号和位置在不同编号系统之间可以不同。然而,应当理解,可变重链和/或可变轻链序列的发明包括相关(固有)CDR的发明。因此,每个可变重区的发明是vhCDR(例如,vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的发明,并且每个可变轻区的发明是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的发明。
CDR编号的有用比较如下(表4),参见Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003):
表1.抗体CDR命名法
在本说明书中,在提及可变结构域中的残基(大约轻链可变区的残基1-107及重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统,且EU编号系统用于Fc区(例如Kabat等人,同上(1991))。
本发明提供了大量不同的CDR集。在这种情况下,“全CDR集”包含三个可变轻链CDR和三个可变重链CDR,例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可分别是更大的可变轻结构域或可变重结构域的一部分。此外,如本文更全面概述的,当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时),可变重链和可变轻链结构域可以在分开的多肽链上,或者在scFv序列的情况下则在单一多肽链上。
CDR有助于抗体的抗原结合位点或更具体地表位结合位点的形成。
“表位”是指与抗体分子可变区中称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子群,通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单一抗原可具有多于一个表位。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基,例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基;换言之,氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于,在变性溶剂存在下,不与前者结合但与后者结合。。
“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定抗原或表位是指与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可(例如)通过确定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量,该对照分子通常是具有类似结构但不具有结合活性的分子。例如,特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定。
如本文所用,术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合率,而如本文所用,术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离率。如本文所用,术语“KD”旨在指解离常数,其由KD与Ka之比(即KD/Ka)获得并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域中充分建立的方法来确定。在一些实施方案中,确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离振子共振,例如通过使用生物传感器系统如系统。在一些实施方案中,抗体的KD是通过生物层干涉法确定的。在一些实施方案中,KD是使用流式细胞术用抗原表达细胞测量的。在一些实施方案中,KD值是用固定抗原测量的。在其他实施方案中,KD值是在抗体(例如,亲本小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体)固定的情况下测量的。在一些实施例中,KD值以二价结合模式测量。在其他实施方案中,KD值以单价结合模式测量。对特定抗原或表位的特异性结合可以(例如)通过抗体对抗原或表位的KD为至少约10- 7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、至少约10-13M、至少约10-14M来展示。通常,特异性结合抗原的抗体的KD为对照分子相对于该抗原或表位的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
相对于蛋白序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性,且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后,候选序列中的氨基酸残基与特定(亲代)序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以用本领域技术人员熟知的各种方式实现,例如,使用公众可获得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一个特定的程序是在美国预授权公开号20160244525的段落[0279]至[0280]所概述的ALIGN-2程序,在此通过引用纳入本文。针对核酸序列的另一种近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics,2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)标准化的评分矩阵,可以将该算法应用于氨基酸序列。
执行此算法以确定序列同一性百分比的实例是由Genetics Computer Group(Madison,WI)在“BestFit”实用应用程序中提供的。该方法的默认参数描述于WisconsinSequence Analysis Package Program Manual,第8版(1995)(可获自Genetics ComputerGroup,Madison,WI)中。在本发明的上下文中建立百分比同一性的另一种方法是使用版权由爱丁堡大学所有的MPSRCH程序包,该程序包是由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行的。从这套包中,可以使用Smith-Waterman算法,其中默认参数用于评分表(例如,空位开放罚分为12,空位延伸罚分为1,且空位为6)。从生成的数据中,“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其他合适的程序是本领域公知的,例如,另一种比对程序是BLAST,使用默认参数。例如,可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准;过滤器=无;strand=二者;截止=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;分类依据=高评分;数据库=非冗余;GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以通过在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi前面输入http://的网址找到。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和亲本氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“发明序列”的长度或亲本序列的长度,以最短者为准。结果以同一性百分比表示。
术语“核酸”包括具有多于一个核苷酸的任何形式的RNA或DNA分子,包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”包括呈单链核酸形式的寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸的排序。
本文所用的术语“启动子”包括与待转录的核酸序列例如编码所需分子的核酸序列可操作地连接的DNA序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游,并为RNA聚合酶和其他转录因子的特异性结合提供位点。
“载体”能够将基因序列转移到靶细胞。通常,“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导感兴趣基因的表达并且能够将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体,这可以通过将该载体的全部或一部分进行基因组整合,或瞬时或可遗传地将该载体维持为染色体外元件来完成。因此,该术语包括克隆和表达运载体,以及整合载体。
本文所用的术语“调节元件”包括控制核酸序列表达的某些方面的核苷酸序列。调节元件的实例示例性地包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、聚腺苷酸化信号(pA)、启动子、增强子、转录终止序列和上游调控结构域,其有助于核酸序列的复制、转录和/或转录后加工。在某些情况下,调节元件还可以包括顺式调节DNA元件以及转座元件(TE)。本领域普通技术人员能够在不超过常规实验的情况下在表达构建体中选择和使用这些和其他调节元件。表达构建体可以使用遗传重组方法或使用众所周知的方法合成产生。
“控制元件”或“控制序列”是参与有助于多核苷酸的功能性调节的分子相互作用的核苷酸序列,其中所述功能性调节包括多核苷酸的复制(replication)、复制(duplication)、转录、剪接、翻译或降解。该调节可能会影响该过程的频率、速度或特异性,并且本质上可以是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包括例如转录调节序列,例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(在3’方向)的编码区转录的DNA区域。
出于本发明的目的,当提及多肽或多肽区域时,短语“源自”是指所述多肽或多肽区域包含最初在“亲本”蛋白质中发现的氨基酸序列,并且其现在可以包含一些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排或相对于原始多肽或多肽区域的其他改变,只要“亲本”分子的一些功能及结构实质上保守即可。技术人员将能够使用本领域已知的技术,例如蛋白质序列比对软件,鉴定所述多肽或多肽区域所源自的亲本分子。
出于本发明的目的,关于志贺菌毒素多肽序列或志贺菌毒素衍生多肽,术语“野生型”通常是指在活物种(例如病原菌)中发现的天然存在的志贺菌毒素蛋白质序列,其中该志贺菌毒素蛋白序列是最常出现的变体之一。这与不常出现的志贺菌毒素蛋白质序列形成对比,不常出现的志贺菌毒素蛋白质尽管仍然是天然存在的,但在对至少包括一种志贺菌毒素蛋白变体的该物种的统计上强大数量的天然存在的个体生物体进行采样时,在该物种的个体生物体中发现不到1%。天然分离物在其天然环境以外的克隆扩增(不管该分离物是否是包含生物序列信息的生物体或者分子)不会改变天然需求,只要该克隆扩增不引入在该物种的天然群体中不存在的新的序列变种和/或不改变序列变体彼此之间的相对比例即可。
如本文所用,术语“缔合的”、“缔合”、“连接的”或“连接”是指分子的两个或更多个组分被结合、附接、连接或以其他方式偶联以形成单个分子的状态或通过在两个分子之间产生缔合、连接、附接和/或任何其他连接而使两个分子相互缔合以形成单个分子的行为。例如,术语“连接的”可以指两个或多个组分通过一个或多个原子相互作用来缔合从而形成单个分子,并且其中原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两个组分之间共价缔合的非限制性实例包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两个分子组分之间的非共价缔合的非限制性实例包括离子键和氢键。
为了本发明的目的,术语“连接的”是指两个或多个分子组分通过一个或多个原子相互作用来缔合从而形成单个分子,并且其中原子相互作用包括至少一个共价键。出于本发明的目的,术语“连接”是指产生如上所述的连接分子的行为。
出于本发明的目的,术语“融合的”是指通过至少一个作为肽键的共价键缔合的两个或更多个蛋白质组分,而不管该肽键是否涉及羧酸基团的碳原子的参与或涉及另一碳原子,诸如?-碳、?-碳、?-碳、?-碳等。融合在一起的两个蛋白质组分的非限制性实例包括例如氨基酸、肽、或通过肽键与多肽融合使得所得分子是单个连续多肽的多肽。出于本发明的目的,术语“融合”是指产生如上所述的融合分子(例如由遗传区域的重组融合产生的融合蛋白,其在翻译时产生单个蛋白质分子)的行为。
符号“::”意指在其之前及之后的多肽区域物理连接在一起以形成连续多肽。
如本文所用,术语“表达(expressed、expressing或expresses)”及其语法变体是指将多核苷酸或核酸翻译成蛋白质。表达的蛋白质可以保留在细胞内、成为细胞表面膜的组分或分泌到细胞外空间。
如本文所用,在至少一个细胞表面表达显著量的细胞外靶标生物分子的细胞是“靶标阳性细胞”或“靶标+细胞”并且是与特定的细胞外靶标生物分子物理偶联的细胞。
如本文所用,符号“?”是能够与符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区的简写。符号“?”用于指免疫球蛋白型结合区的功能特征,基于其与该符号后的生物分子结合的能力,结合亲和力由10-5或更低的解离常数(KD)描述。
如本文所用,术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别指任何抗体VH或VL结构域(例如人VH或VL结构域)以及至少保留相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如源自天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域包含被三个CDR或抗原结合区(ABR)中断的“框架”区。框架区用于排列CDR或ABR以特异性结合抗原表位。从氨基末端到羧基末端,VH和VL结构域均包含以下框架(FR)和CDR区或ABR区:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4;或者,类似地,FR1、ABR1、FR2、ABR2、FR3、ABR3和FR4。如本文所用,术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”用于分别指VH结构域中的CDR1、2或3,并且术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”用于分别指VL结构域中的CDR1、2或3。如本文所用,术语“HABR1”、“HABR2”或“HABR3”用于分别指VH结构域中的ABR1、2或3,并且术语“LABR1”、“LABR2”或“LABR3”用于分别指VL结构域中的CDR1、2或3。对于骆驼科动物VHH片段、软骨鱼的IgNAR、VNAR片段、一些单结构域抗体及其衍生物,存在着包含以下相同基本排列的单重链可变结构域:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。如本文所用,术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”可用于分别指单重链可变结构域中的CDR1、2或3。
出于本发明的目的,术语“效应子”是指提供生物学活性,诸如细胞毒性,生物信号传导,酶催化,亚细胞自选路径和/或导致变构效应的分子间结合和/或一个或多个因子的募集。
出于本发明的目的,短语“志贺菌毒素效应子多肽”、“志贺菌毒素效应子多肽区域”和“志贺菌毒素效应子区域”是指源自志贺菌毒素家族成员的至少一个志贺菌毒素A亚基的多肽或多肽区,其中所述多肽或多肽区域能够表现出至少一种志贺菌毒素功能。例如,SEQ ID NO:45-69源自StxA和SLT-1A。
出于本发明的目的,志贺菌毒素效应子功能是由源自志贺菌毒素A亚基的多肽区域赋予的生物活性。志贺菌毒素效应子功能的非限制性实例包括促进细胞进入;脂质膜变形;促进细胞内化;刺激网格蛋白介导的内吞作用;将细胞内按路线发送至各种细胞内区室,例如高尔基体、内质网和胞质溶胶;引导货物的细胞内自选路径;抑制核糖体功能;抑制蛋白质合成、催化活性,例如N-糖苷酶活性和催化抑制核糖体;减少蛋白质合成,诱导半胱天冬酶活性,激活效应子半胱天冬酶,实现细胞抑制作用和细胞毒性。志贺菌毒素催化活性包括例如核糖体失活、蛋白质合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。志贺菌毒素是核糖体灭活蛋白(RIP)。RIP可以使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和olyA)和病毒核酸脱嘌呤(参见例如Barbieri L等人,Biochem J 286:1-4(1992);Barbieri L等人,Nature 372:624(1994);Ling J等人,FEBSLett 345:143-6(1994);Barbieri L等人,Biochem J 319:507-13(1996);Roncuzzi L,Gasperi-Campani A,FEBS Lett 392:16-20(1996);Stirpe F等人,FEBS Lett 382:309-12(1996);Barbieri L等人,Nucleic Acids Res 25:518-22(1997);Wang P,Tumer N,Nucleic Acids Res 27:1900-5(1999);Barbieri L等人,Biochim Biophys Acta 1480:258-66(2000);Barbieri L等人,J Biochem 128:883-9(2000);Brigotti M等人,Toxicon39:341-8(2001);Brigotti M等人,FASEB J 16:365-72(2002);Bagga S等人,J Biol Chem278:4813-20(2003);Picard D等人,J Biol Chem 280:20069-75(2005))。一些RIP显示出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等人,Antimicrob Agents Chemother 37:835-8(1993);Au T等人,FEBS Lett 471:169-72(2000);Parikh B,Tumer N,Mini Rev MedChem 4:523-43(2004);Sharma N等人,Plant Physiol 134:171-81(2004))。在体外和体内均观察到志贺菌毒素催化活性。志贺菌毒素效应子活性测定的非限制性实例测量各种活性,例如蛋白质合成抑制活性、脱嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋DNA松弛活性和核酸酶活性。
如本文所用,志贺菌毒素效应子功能的保留是指在相同条件下与野生型志贺菌毒素效应子多肽对照(例如志贺菌毒素A1片段)或包含野生型志贺菌毒素效应子多肽(例如志贺菌毒素A1片段)的CD38结合蛋白相比,能够表现出一定水平的志贺菌毒素功能活性,如通过具有再现性的适当定量测定法所测量的。对于核糖体失活或核糖体抑制的志贺菌毒素效应子功能,例如通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法,保留的志贺菌毒素效应子功能在体外环境中表现出10,000pM或更低的IC50。对于靶标阳性细胞杀伤测定中细胞毒性的志贺菌毒素效应子功能,保留的志贺菌毒素效应子功能表现出1,000nM或更低的CD50,具体取决于细胞类型及其适当的细胞外靶标生物分子的表达,如例如通过使用技术人员已知的和/或本文所述的测定法所示的。
对于本发明的目的,关于核糖体抑制的术语“等效”是指经验测量的核糖体抑制活性水平,如通过具有再现性的适当定量测定法所测量的,该定量测定法在相同条件下在参考分子(例如第二CD38结合蛋白或第三CD38结合蛋白)10%或更小的活性内可再现。
对于本发明的目的,关于细胞毒性的术语“等效”是指经验测量的细胞毒性水平,如通过具有再现性的适当定量测定法所测量的,该定量测定法在相同条件下在参考分子(例如第二CD38结合蛋白或第三结合蛋白)10%或更小的活性内可再现。
如本文所用,关于细胞毒性的术语“减弱的”是指在相同条件下,分子表现出的CD50是参考分子表现出的CD50的10倍至100倍之间。
在确定志贺菌毒素效应子功能活性的水平时,不应考虑不准确的IC50和CD50值。对于某些样品,由于无法收集准确曲线拟合所需的数据点,可能无法获得IC50或CD50的准确值。例如,理论上,如果在给定样品的浓度系列中没有分别发生超过50%的核糖体抑制或细胞死亡,则IC50和CD50都无法确定。如在对来自说明性志贺菌毒素效应子功能测定(诸如下文实施例中所描述的测定)的数据的分析中所描述的,不足以准确拟合曲线的数据不应被视为实际志贺菌毒素效应子功能的代表。
未能检测志贺菌毒素效应子功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠和/或蛋白质稳定性,而不是缺乏细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺菌毒素效应子功能的测定可能不需要很多本发明的多肽以测量大量志贺菌毒素效应子功能活性。如果根据经验确定效应子功能低下或无效应子功能的根本原因与蛋白质表达或稳定性有关,则本领域技术人员可能能够使用本领域已知的蛋白质化学和分子工程技术补偿此类因素,使得可以恢复和测量志贺菌毒素功能性效应子活性。作为实例,不适当的基于细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列来补偿;并且不适当的多肽折叠和/或稳定性可能受益于稳定的末端序列,或稳定分子三维结构的非效应区的补偿性突变。
一些志贺菌毒素效应子功能不容易测量,例如亚细胞按路线发送功能。例如,没有常规的定量测定法来区分志贺菌毒素效应子多肽的细胞毒性和/或传递异源表位的失败是否是由于不适当的亚细胞按路线发送,但在有测试可用的时候,则可以分析志贺菌毒素效应子多肽与合适的野生型志贺菌毒素效应子多肽相比的任何显著水平的亚细胞按路线发送。然而,如果本发明的结合蛋白的志贺菌毒素效应子多肽组分展现与野生型志贺菌毒素A亚基构建体相当或等效之细胞毒性,则推断至少在所测试之条件下,亚细胞按路线发送活性水平分别与野生型志贺菌毒素A亚基构建体的亚细胞按路线发送活性水平相当或等效。
当用于个别志贺菌毒素功能的新测定变得可用时,可分析志贺菌毒素效应子多肽和/或包含志贺菌毒素效应子多肽的结合蛋白的任何水平的那些志贺菌毒素效应子功能,诸如与功能性敲除志贺菌毒素效应子多肽相比,其活性在野生型志贺菌毒素效应子多肽活性1000倍或100倍或更小以内或展现3倍至30倍或更大的活性。
仅通过在细胞毒性测定中观察分子的细胞毒性活性水平即可推断出足够的亚细胞按路线发送,其中所述细胞毒性测定是诸如基于T细胞表位呈递或基于涉及细胞溶质和/或内质网定位的靶标底物的毒素效应子功能的细胞毒性测定。
如本文所用,“显著”志贺菌毒素效应子功能的保留是指如通过具有再现性的适当定量测定所测量的,志贺菌毒素功能活性的水平与野生型志贺菌毒素效应子多肽对照(例如志贺菌毒素A1片段)相当。对于体外核糖体抑制,显著的志贺菌毒素效应子功能的IC50为300pM或更低,取决于测定中使用的核糖体来源(例如细菌、古细菌或真核生物(藻类、真菌、植物或动物)来源)。与催化破坏的SLT-1A1-251双突变体(Y77S/E167D)表现出的大约100,000pM的IC50相比,这是显著更大的抑制。对于实验室细胞培养物中的靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性,显著志贺菌毒素效应子功能展示出100nM、50nM、30nM或更小的CD50,这取决于结合区的靶标生物分子及细胞类型,特别是该细胞类型的表达和/或适当的细胞外靶标生物分子和/或由被评估分子靶向的细胞外表位的细胞表面呈递。与单独的没有细胞靶向结合区的志贺菌毒素A亚基(或野生型志贺菌毒素A1片段)(其CD50为100-10,000nM,取决于细胞系)相比,这对适当的靶标阳性细胞群具有显著更大的细胞毒性。
出于本发明的目的和关于本发明分子的志贺菌毒素效应子功能,术语“合理的活性”是指相对于包含天然(或野生型)志贺菌毒素的分子,展现至少中等水平(例如在11倍至1,000倍内)的如本文所定义的志贺菌毒素效应子活性,其中志贺菌毒素效应子活性系选自:内化效率、至胞质溶胶的亚细胞按路线发送效率、通过靶细胞递送的表位呈递、核糖体抑制和细胞毒性。对于细胞毒性,志贺菌毒素效应子活性的合理水平包括在野生型志贺菌毒素构建体的1,000倍以内,例如当野生型志贺菌毒素构建体展现0.5nM的CD50时(例如包含野生型志贺菌毒素A1片段的结合蛋白),其展现500nM或更小的CD50。
出于本发明的目的和关于本发明分子的细胞毒性,术语“最佳”是指志贺菌毒素催化结构域介导的细胞毒性水平是在包含野生型志贺菌毒素A1片段(例如志贺菌毒素A亚基或其一些截短的变体)和/或天然(或野生型)志贺菌毒素的分子的细胞毒性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍内。
应当注意,即使志贺菌毒素效应子多肽的细胞毒性相对于野生型志贺菌毒素A亚基或其片段降低,在实践中,使用减毒的志贺菌毒素效应子多肽的应用可能比使用野生型志贺菌毒素效应子多肽相同有效或更有效,因为最高功效的变体可能表现出不期望的效果,这些效果在细胞毒性功效降低的变体中被最小化或减少。野生型志贺菌毒素非常强效,其能够在仅1个毒素分子到达中毒细胞的胞质溶胶之后或也许在仅40个毒素分子已内化至中毒细胞中之后杀死中毒细胞。与野生型志贺菌毒素效应子多肽相比,具有即便显著降低的志贺菌毒素效应子功能(诸如亚细胞按路线发送或细胞毒性)的志贺菌毒素效应子多肽,对于实际应用(诸如涉及靶向细胞杀伤、货物分子递送和/或检测特定细胞及其亚细胞区室的应用)可能仍然足够强效。此外,一些活性降低的志贺菌毒素效应子多肽可能特别适用于将分子货物(例如额外的外源材料)递送至CD38阳性靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室。
关于分子的细胞毒活性的术语“选择性细胞毒性”是指CD38靶标阳性细胞群(例如靶向细胞类型)和非靶向旁观者细胞群(例如CD38靶标阴性细胞类型)之间的相对细胞毒性水平,它可以表示为靶向细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(CD50)相对于非靶向细胞类型的CD50的比率,以提供细胞毒性选择性的量度或对靶向细胞相对于非靶向细胞的杀伤选择性的指示。
给定的细胞外靶标生物分子(或给定靶标生物分子的细胞外表位)的细胞表面呈递和/或密度可能影响一些结合蛋白最适合使用的应用。细胞之间给定靶标生物分子的细胞表面呈递和/或密度的差异可能在定量和定性地改变给定结合蛋白的细胞内化效率和/或细胞毒性效力。给定靶标生物分子的细胞表面呈递和/或密度在靶标生物分子阳性细胞之间或甚至在细胞周期或细胞分化的不同点的相同细胞上可能有很大差异。给定靶标生物分子及/或给定靶标生物分子的一些细胞外表位在特定细胞或细胞群上的总细胞表面呈递可以使用技术人员已知的方法确定,例如涉及荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术的方法。
如本文所用,关于多肽内的多肽区或特征,术语“破坏”及其语法变体是指该区域内或构成所破坏特征的至少一个氨基酸的改变。氨基酸改变包括各种突变,例如改变多肽的氨基酸序列的缺失、倒位、插入或置换。氨基酸改变还包括化学改变,例如改变氨基酸官能团中的一个或多个原子或向氨基酸官能团添加一个或多个原子。
如本文所用,“去免疫化”是指在施用于受试者(例如人类受试者)后,与参考分子(例如野生型肽区域、多肽区域或多肽)相比降低的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括与参考分子相比,尽管引入了一个或多个从头抗原性和/或免疫原性表位,但总体抗原性和/或免疫原性潜力降低。对于一些实施方案,“去免疫化”是指分子在施用于哺乳动物后,与其所源自的“亲本”分子(例如野生型志贺菌毒素A1片段或包含野生型志贺菌毒素A1片段的结合蛋白)相比,表现出降低的抗原性和/或免疫原性。在一些实施方案中,与参考“亲本”分子相比,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽在相同条件下通过相同测定法测量能够表现出比参考分子的抗原性降低约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的相对抗原性,其中所述测定法为例如技术人员已知的和/或本文描述的测定法如定量ELISA或蛋白质印迹分析。在一些实施方案中,与参考“亲本”分子相比,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽在相同条件下通过相同测定法测量能够表现出比参考分子的免疫原性降低约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约97%、约99%或更多的相对免疫原性,其中所述测定法为例如技术人员已知的和/或本文描述的测定法,例如在给定时间点接受肠胃外施用分子后哺乳动物体内产生的抗分子抗体的定量测量。
说明性结合蛋白的相对免疫原性是使用在一段时间内重复肠胃外施用后针对结合蛋白的体内抗体反应的测定来确定的。
出于本发明的目的,短语“B-细胞和/或CD4+T-细胞去免疫化”是指分子在施用于哺乳动物后,具有降低的关于B细胞抗原性或免疫原性和/或CD4+T细胞抗原性或免疫原性的抗原性和/或免疫原性潜能。对于一些实施方案,“B细胞去免疫化”是指分子在施用于哺乳动物后,与其所源自的“亲本”分子(例如野生型志贺菌毒素A1片段)相比,表现出降低的B细胞抗原性和/或免疫原性。对于一些实施方案,“CD4+T细胞去免疫化”是指分子在施用于哺乳动物后,与其所源自的“亲本”分子(例如野生型志贺菌毒素A1片段)相比,表现出降低的CD4+T细胞抗原性和/或免疫原性。
关于志贺菌毒素效应子多肽中的B细胞表位、CD4+T细胞表位、B细胞表位区或CD4+T细胞表位区的术语“内源性”是指存在于野生型志贺菌毒素A亚基中的表位。
出于本发明的目的,短语“CD8+T细胞超免疫化”是指当分子存在于活体受试者(例如人类受试者)内的有核细胞内时,该分子具有关于CD8+T细胞抗原性或免疫原性的增加的抗原性和/或免疫原性潜力。通常,由于固有特征或作为本发明CD38结合蛋白的组分,CD8+T细胞免疫分子能够细胞内化到有核细胞的早期核内体区室。
出于本发明的目的,术语“异源性”例如与内源性相反,意指具有不同来源,例如异源性志贺菌A亚基多肽不是作为天然志贺菌毒素的任何A亚基的一部分天然发现的。本发明的融合蛋白包含非异源性组分,例如志贺菌毒素和抗CD38抗原结合结构域。
关于本发明结合蛋白的多肽组分的术语“嵌入的”及其语法变体是指用不同的氨基酸在多肽区域内的一个或多个氨基酸的内部取代,以产生与起始多肽区共享相同氨基酸残基总数的新的多肽序列。因此,术语“嵌入的”不包括任何额外氨基酸、肽或多肽组分与起始多肽的任何外部末端融合,也不包括任何额外氨基酸残基的任何额外内部插入,而是仅包括对现有氨基酸的置换。内部取代可以仅通过氨基酸残基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位来实现。如果使用了一个或多个氨基酸的插入,则必须在插入旁边缺失相等数量的近端氨基酸以产生嵌入的肽。这与关于本发明结合蛋白的多肽组分的术语“插入”的使用相反,该术语是指在多肽内部插入一个或多个氨基酸,导致与起始多肽相比具有增加数量的氨基酸残基的新多肽。
关于本发明的结合蛋白的多肽组分的术语“插入的”及其语法变体是指在多肽内插入一个或多个氨基酸,导致与起始多肽相比具有增加数目的氨基酸残基的新多肽序列。就本发明结合蛋白的多肽组分而言,短语“部分插入”、“嵌入和插入”及其语法变体是指所得多肽的长度增加,但增加量少于相当于整个插入多肽长度的氨基酸残基数量的情形。无论插入是“纯的”还是“部分的”,其均包括任何先前描述的插入,即使不邻近多肽内插入位点的其他多肽区域缺失而导致最终多肽的总长度减少,这是因为最终多肽仍包含在多肽区域内的T细胞表位-肽的一个或多个氨基酸的内部插入。
出于本发明的目的,关于本发明结合蛋白的志贺菌毒素效应子多肽区域的位置的短语“邻近氨基末端”是指这样的距离:其中志贺菌毒素效应子多肽区域的至少一个氨基酸残基在结合蛋白的氨基末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个(例如多至18-20个)氨基酸残基内,只要结合蛋白能够表现出本文所述的适当水平的志贺菌毒素效应子功能活性(例如,一定水平的细胞毒性效力)即可。因此,对于本发明的一些实施方案,在氨基末端融合至志贺菌毒素效应子多肽的任何氨基酸残基不应降低任何志贺菌毒素效应子功能(例如,通过空间阻碍志贺菌毒素效应子多肽区域氨基末端附近的结构),使得志贺菌毒素效应子多肽的功能活性降低至本文所需的适当活性水平以下。
出于本发明的目的,关于本发明的结合蛋白内的志贺菌毒素效应子多肽区与另一组分(例如细胞靶向、结合区、分子部分和/或额外的外源性材料)相比的位置的短语“更邻近氨基末端”是指志贺菌毒素效应子多肽的氨基末端的至少一个氨基酸残基与其他参考组分相比更靠近本发明的结合蛋白的线性多肽组分的氨基末端的位置。
出于本发明的目的,短语“源自志贺菌毒素家族成员的一个A亚基的活性酶结构域”是指具有通过催化核糖体失活机制抑制蛋白质合成的能力。天然存在的志贺菌毒素的酶活性可以通过抑制蛋白质翻译的能力来定义,该能力是通过使用技术人员已知的测定法来测定的,其中所述测定法例如是在活细胞不存在下涉及RNA翻译的体外测定法或涉及活细胞中RNA翻译的体内测定法。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定,志贺菌毒素酶活性的效力可以通过观察针对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(诸如核糖体切口测定)来直接评价,及/或通过观察核糖体功能和/或蛋白质合成的抑制来间接评价。
出于本发明的目的,术语“志贺菌毒素A1片段区域”是指基本上由志贺菌毒素A1片段组成和/或源自志贺菌毒素的志贺菌毒素A1片段的多肽区域。
出于本发明的目的,关于结合蛋白的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”通常是指结合蛋白的多肽链(例如,单一的、连续的多肽链)的最后一个氨基酸残基。结合蛋白可包含多于一个多肽或蛋白,因此,本发明的结合蛋白可包含多个氨基末端和羧基末端。例如,结合蛋白的“氨基末端”可以由代表多肽氨基末端的多肽链的第一个氨基酸残基定义,其通常特征在于起始氨基酸残基,所述起始氨基酸不与涉及该起始氨基酸残基的伯氨基或涉及作为N-烷基化α氨基酸残基类成员的起始氨基酸残基的等效氮的任何氨基酸残基具有肽键。类似地,结合蛋白的“羧基末端”可以由代表多肽羧基末端的多肽链的最后一个氨基酸残基定义,该最后一个氨基酸残基的特征通常在于最终氨基酸残基,该最终氨基酸残基不具有通过肽键连接至其伯羧基的α-碳的任何氨基酸残基。
出于本发明的目的,关于多肽区域的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”是指该区域的区域边界,无论额外的氨基酸残基是否由该区域外的肽键连接。换言之,多肽区域的末端与该区域是否与其他肽或多肽融合无关。例如,包含两个蛋白质区域的融合蛋白(例如包含肽或多肽和志贺菌毒素效应子多肽的结合区)可具有如下志贺菌毒素效应子多肽区:其中羧基末端在该志贺菌毒素效应子多肽区的氨基酸残基残基251处终止,尽管存在涉及残基251至位置252处代表另一蛋白质区域(例如结合区域)开始的氨基酸残基的肽键。在这个实例中,志贺菌毒素效应子多肽区域的羧基末端是指残基251,它不是融合蛋白的末端,而是代表内部的区域边界。因此,对于多肽区域,术语“末端”、“氨基末端”和“羧基末端”用于指多肽区域的边界,无论该边界是物理末端还是嵌入较大多肽链内部的位置。
出于本发明的目的,短语“志贺菌毒素A1片段的羧基末端区域”是指源自天然存在的志贺菌毒素A1片段的多肽区域,该区域以疏水性残基(例如StxA-A1和SLT-1A1的V236以及SLT-2A1的V235)开始,之后为疏水性残基,且该区域以在志贺菌毒素A1片段多肽之间保守的弗弗林蛋白酶切割位点终止且在天然志贺菌毒素A亚基中A1片段与A2片段之间的接合处终止。出于本发明的目的,志贺菌毒素A1片段的羧基末端区域包括源自志贺菌毒素A1片段多肽的羧基末端的肽区域,例如,包含志贺菌毒素A1片段的羧基末端或基本上由其组成。源自志贺菌毒素A1片段的羧基末端的肽区的非限制性实例包括如下天然定位的氨基酸残基序列:自Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中的位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或251;和自SLT-2A(SEQ ID No:3)中的位置235至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250。
出于本发明的目的,关于连接分子部分及/或结合区域的短语“邻近A1片段多肽的羧基末端”是指在距离定义志贺菌毒素A1片段多肽的最后一个残基的氨基酸残基1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个氨基酸残基内。
出于本发明的目的,短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”包括连接和/或融合至A1片段衍生区域的羧基末端中的氨基酸残基的大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如,免疫球蛋白型结合区域),例如源自天然定位在Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中的位置236至251或SLT-2A(SEQ ID No:3)中的235至250中的任一处的氨基酸残基的氨基酸残基。出于本发明的目的,短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”还包括连接和/或融合至A1片段衍生区域的羧基末端中的氨基酸残基的大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如,免疫球蛋白型结合区域),例如A1片段衍生区域和/或志贺菌毒素效应子多肽中最后一个氨基酸羧基末端的氨基酸残基。出于本发明的目的,短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”还包括大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如,免疫球蛋白型结合区),其在物理上阻止A1片段衍生区域的羧基末端的细胞识别,例如由真核细胞的ERAD机制识别。
出于本发明的目的,包含含有至少40个氨基酸的多肽且连接(例如融合)至包含A1片段衍生区域的志贺菌毒素效应子多肽区的羧基末端的结合区(诸如免疫球蛋白型结合区)是“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
出于本发明的目的,包含含有至少40个氨基酸的多肽且连接(例如融合)至包含A1片段衍生区域的志贺菌毒素效应子多肽区的羧基末端的结合区(诸如免疫球蛋白型结合区)是“阻碍A1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
出于本发明的目的,术语“志贺菌毒素家族成员的A1片段”是指在弗林蛋白酶切割位点处由弗林蛋白酶进行蛋白水解后,志贺菌毒素A亚基的剩余氨基末端片段,该弗林蛋白酶切割位点在志贺菌毒素A亚基之间是保守的且定位在野生型志贺菌毒素A亚基中的A1片段与A2片段之间。
出于本发明的目的,短语“A1片段区域羧基末端处的弗林蛋白酶切割基序”是指在志贺菌毒素A亚基之间保守且桥接天然发生志贺菌毒素A亚基中A1片段与A2片段之间的接合处的特异性弗林蛋白酶切割基序。
出于本发明的目的,短语“邻近A1片段区域的羧基末端的弗林蛋白酶切割位点”是指在距A1片段区域或A1片段衍生区域中定义最后一个氨基酸残基的氨基酸残基少于1、2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸残基的距离内具有氨基酸残基的任何可识别的弗林蛋白酶切割位点,其包括位于A1片段区域或A1片段衍生区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序,诸如在邻近A1片段衍生区域与分子的另一组分(诸如本发明的结合蛋白的分子部分)的连接的位置。
如本文所用,术语“附加的CD38靶向治疗剂”是指靶向CD38以产生治疗效果或益处的附加治疗剂(例如,分子)。这种额外的CD38靶向治疗剂与结合蛋白互补,并且在其CD38靶向活性上不与结合蛋白直接竞争。额外的CD38靶向治疗剂可包含干扰CD38信号传导的抗CD38抗体或小分子抑制剂、基本上由其组成或由其组成。例如,额外的CD38靶向治疗剂可包含抗CD38抗体疗法、基本上由其组成或由其组成,该抗CD38抗体疗法所结合的抗原决定簇不与结合蛋白所结合的抗原决定簇重叠,或其结合CD38分子的方式是在结合时,额外CD38靶向治疗剂不会阻止本发明的结合蛋白对该CD38分子的结合。例如,额外的CD38靶向治疗剂可包含抗CD38单克隆抗体疗法(诸如达雷木单抗)、基本上由其组成或由其组成。
出于本发明的目的,短语“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是指(i)如本文第I-B部分所述的特定弗林蛋白酶切割基序和(ii)包含突变和/或截短的弗林蛋白酶切割基序,所述突变和/或截短可以赋予分子与参考分子相比降低的弗林蛋白酶切割,例如可再现地观察到弗林蛋白酶切割较在相同条件下的相同测定中所观察到的参考分子的弗林蛋白酶切割降低30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或更低(包括无切割情况下的100%)。与参考分子相比的弗林蛋白酶切割百分比可表示为感兴趣分子的切割:未切割材料除以参考分子的切割:未切割材料的比率(例如,参见WO 2015/191764;WO 2016/196344)。合适的参考分子的非限制性实例包括一些包含如本文所述的野生型志贺菌毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的分子。
就本发明而言,短语“弗林蛋白酶切割抗性”是指分子或其特定多肽区可再现地展现少于以下的弗林蛋白酶切割:(i)野生型志贺菌毒素A亚基中志贺菌毒素A1片段的羧基末端或(ii)构建体的志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端,其中天然定位在A1与A2片段之间接合处的天然弗林蛋白酶切割位点未受破坏;如通过技术人员可获得的任何可用方式所测定的,包括通过使用本文所述的方法。
出于本发明的目的,短语“源自志贺菌毒素家族成员的A亚基的活性酶结构域”是指能够经由基于志贺菌毒素酶活性的核糖体的催化失活来抑制蛋白质合成的多肽结构。分子结构表现出蛋白质合成抑制活性和/或核糖体催化失活的能力可以使用本领域技术人员已知的各种测定来观察,例如涉及活细胞不存在下的RNA翻译测定的体外测定或涉及活细胞核糖体的体内测定。例如,使用技术人员已知的测定,基于志贺菌毒素酶活性的分子的酶活性可以通过观察针对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(诸如核糖体切口测定)来直接评价,和/或通过观察核糖体功能、RNA翻译和/或蛋白质合成的抑制来间接评价。
如本文所用,关于志贺菌毒素效应子多肽,“组合”描述包含两个或更多个亚区的志贺菌毒素效应子多肽,其中每个亚区包含以下中的至少一种,例如,(1)内源性表位或表位区域的破坏;(2)在A1片段区域的羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序。
如本文中使用的关于本发明的分子,“结合蛋白”与“CD38结合蛋白”或“CD38结合分子”或“CD38结合融合蛋白”可互换使用。所有上述分子类型包括各种“CD38结合蛋白”。通常,本发明的蛋白质在本文中称为“CD38结合融合蛋白”,其包含CD38结合结构域(在本文中也称为“抗CD38抗原结合结构域”(ABD)和任选的接头,如本文更充分阐述的)和志贺菌毒素A亚基效应子多肽”,具有任选接头,如本文更充分描述的。
B.引言
本发明提供了一类结合蛋白,其结合CD38并包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽(具有任选的接头;本文称为“CD38结合融合蛋白”)。本发明的CD38结合融合蛋白可用于例如(1)作为抑制CD38表达细胞生长的分子,(2)作为杀死CD38表达细胞的细胞毒性分子,(3)在其他细胞中选择性地杀死特定CD38阳性细胞类型,(4)作为将货物分子递送至CD38表达细胞内部的无毒递送运载体,(5)作为诊断分子,用于涉及CD38表达细胞的疾病及病况的诊断、预后或表征,以及(6)作为治疗分子,用于治疗涉及CD38表达细胞的多种疾病、病症及病况,诸如一些血液癌症,包括造血系统癌症(如多发性骨髓瘤)及CD38阳性细胞生长病症。在一些实施方案中,CD38结合蛋白可用于治疗有需要的受试者中的非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性髓性白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和慢性髓性白血病(CML)。在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白可用于治疗有需要的受试者中的复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白可用于治疗有需要的受试者中的黑色素瘤。
志贺菌毒素A亚基效应子多肽为工程化改造的新结合蛋白提供强健且有力的支架(参见例如WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344,WO 2017/019623,WO 2018/106895和WO 2018/140427)。CD38结合免疫球蛋白衍生片段作为细胞靶向部分与志贺菌毒素A亚基效应子多肽的缔合使得能够工程化改造靶向CD38表达细胞的治疗和诊断分子。
C.CD38结合融合蛋白的通用结构
本发明的CD38结合融合蛋白可以包含(1)能够特异性结合与细胞表面缔合的CD38的细胞外部分的结合区;和(2)包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽的志贺菌毒素效应子多肽区域(本文称为“志贺菌毒素效应子多肽”)。在一些实施方案中,本发明的结合蛋白包含两个或更多个相同的CD38结合区和两个或更多个志贺菌毒素效应子多肽区,无论是相同的还是不同的。本发明的CD38结合融合蛋白的一个非限制性实例是融合至免疫球蛋白型结合区的志贺菌毒素效应子多肽,该免疫球蛋白型结合区包含在与细胞表面缔合时特异性结合至CD38的细胞外部分的单链可变片段;或以上所提及者的同型二聚体,如下文更充分阐述的。
在一些实施方案中,本发明结合蛋白的志贺菌毒素A亚基效应子多肽将产生两种或更多种性质的结构元件组合在单一分子中,诸如具有以下能力:1)与缺少该特定元件组合的分子变体相比,表现出降低的抗原性和/或免疫原性,2)与缺少该特定元件组合的分子变体相比,表现出减少的蛋白酶切割,3)与缺少该特定元件组合的分子变体相比,对多细胞生物表现出降低的非特异性毒性,和/或4)表现出强效的细胞毒性。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合融合蛋白是单体。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白是同型二聚体。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白是包含两个相同多肽的同型二聚体。在一些实施方案中,单体CD38结合融合蛋白包含SEQ ID NO:233的序列,或与其具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列。
1.CD38结合区域
在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白包含结合区(也称为“结合结构域”或“抗原结合结构域(ABD)),所述结合区包含免疫球蛋白型多肽(例如VH和VL),其中所述多肽能够表现出与CD38和/或存在于诸如哺乳动物(例如人、非人灵长类动物、小鼠等)中的CD38表达细胞或CD38阳性细胞的细胞的细胞表面上的CD38的特异性及高亲和性结合。
本发明提供了多个CD38结合结构域。CD38结合结构域的特定CDR描述如下。如上所述,CDR的确切编号和位置在不同编号系统之间可能不同。然而,应当理解重链可变区和/或轻链可变区的发明包括其中所存在的CDR的发明。因此,每个重链可变区的发明是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的发明,并且每个轻链可变区的发明是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的发明。
本发明提供了包含新的CD38结合结构域的结合蛋白。此类抗原结合域(ABD)能够结合人和食蟹猴CD38蛋白。图25A-D描绘了四种不同的结合蛋白,其包含能够结合人和食蟹猴CD38的四种不同的抗CD38 ABD。在一些实施方案中,重链可变区和轻链可变区例如在两条不同的多肽链上以Fab格式排列,在一些实施方案中,重链可变区和轻链可变区融合在一起以形成如本文通常概述的scFv。或者,如图1所示和下面更详细的描述,来自已经二聚化的两个CD38结合融合蛋白单体的CD38结合结构域然后彼此缔合;即来自一条单体多肽链的一个VH与来自另一条单体多肽链的VL缔合,反之亦然,使得在非共价缔合的同型二聚体中形成两个抗CD38结合结构域,其也包含两个志贺菌组分。
本文还包括在一个或多个CDR和/或框架区中具有氨基酸修饰的抗CD38 ABD。如本文所述,在一些实施方案中,6个CDR的集合可具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰(其中发现氨基酸置换尤其有用)。CDR可以具有氨基酸修饰(例如在CDR集合中1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰(换言之,只要该6个CDR集合中的变化总数小于6个氨基酸修饰,则可修饰CDR,其中CDR的任何组合发生变化;例如在vlCDR1中可有一个变化,在vhCDR2中可有两个变化,在vhCDR3中无变化等)。在一些实施方案中,每个CDR具有不超过单个氨基酸置换。在一些实施方案中,避免vhCDR3中的氨基酸置换。在一些情况下,可以增加对人和食蟹猴CD38之一或二者的结合亲和力,而在其他实施方案中,可以降低该结合亲和力。在这些实施方案中,保留与人和食蟹猴CD38的结合。用于测试抗CD38抗原结合结构域与本文所概述的VH和VL序列相比是否含有突变的合适的测定法是本领域中已知的,诸如Biacore测定或实施例1、2或3中所概述的结合测定。
在一些实施方案中,本文所概述的抗CD38 ABD还可在可变重链框架区和可变轻链框架区之一或两者的框架区中具有氨基酸修饰(再次,发现氨基酸置换尤其有用),只要框架(不包括CDR)与人种系序列保持至少约80%、约85%或约90%的同一性即可。因此,例如,如本文所述的相同CDR可以与来自人种系序列的不同框架序列组合,只要框架区与人种系序列保持至少80%、至少85%或至少90%的同一性即可。
在另一方面,本发明提供了CD38结合结构域,其包括上面列出的重链可变区和轻链可变区的变体。重链可变区与本文的“VH”序列可具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性,和/或包含1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个氨基酸变化。轻链可变区与本文的“VL”序列可具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性,和/或包含1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个氨基酸变化。在这些实施方案中,本发明包括这些变体,只要抗原结合结构域仍然结合人和食蟹猴CD38。用于测试抗CD38抗原结合结构域与本文所概述的VH和VL序列相比是否含有突变的合适的测定法是本领域中已知的,诸如Biacore测定和实施例1、2或3的那些测定。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TMl(图25A),并且包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO:109具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列,其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:113具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TMl(图25A),并且包括包含SEQ IDNO:110的vhCDRl、包含SEQ ID NO:111的vhCDR2、包含SEQ ID NO:112的vhCDR3、包含SEQ IDNO:114的vlCDRl、包含SEQ ID NO:115的vlCDR2和包含SEQ ID NO:116的vlCDR3。在一些实施方案中,这样的6个CDR中的一个或多个具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰。在实施方案中,任何单个CDR包含不超过1或2个氨基酸置换,并且修饰的抗CD38抗原结合结构域保留与人CD38的结合。
在一些实施方案中,CD38TM1的CD38结合结构域(图25A)具有在SEQ ID NO:109中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域。
在一些实施方案中,CD38TM1的CD38结合结构域(图25A)具有在SEQ ID NO:113中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38TMl的CD38结合结构域(图25A)具有在SEQ ID NO:109中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域和在SEQ ID NO:113中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TMl(图25A)并且具有含有SEQ ID NO:109的VH和含有SEQ ID NO:113的VL。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM2(图25B),并且包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO:117具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列,其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:121具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM2(图25b),并且包括包含SEQ IDNO:118的vhCDRl、包含SEQ ID NO:119的vhCDR2、包含SEQ ID NO:120的vhCDR3、包含SEQ IDNO:122的vlCDRl、包含SEQ ID NO:23的vlCDR2和包含SEQ ID NO:124的vlCDR3。在一些实施方案中,这样的6个CDR中的一个或多个具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰。在实施方案中,单个CDR包含不超过1或2个氨基酸置换,并且修饰的抗CD38抗原结合结构域保留与人和/或食蟹猴CD38的结合。
在一些实施方案中,CD38TM2的CD38结合结构域(图25B)具有在SEQ ID NO:117中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域。
在一些实施方案中,CD38TM1的CD38结合结构域(图25A)具有在SEQ ID NO:121中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38TM2的CD38结合结构域(图25B)具有在SEQ ID NO:117中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域和在SEQ ID NO:121中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM2(图25B)并且具有含有SEQ ID NO:117的VH和含有SEQ ID NO:121的VL。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM3(图25C),并且包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO:101具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列,其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:105具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM3(图25C),并且包括包含SEQ IDNO:102的vhCDRl、包含SEQ ID NO:103的vhCDR2、包含SEQ ID NO:104的vhCDR3、包含SEQ IDNO:106的vlCDRl、包含SEQ ID NO:7的vlCDR2和包含SEQ ID NO:108的vlCDR3。在一些实施方案中,这样的6个CDR中的一个或多个具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰。在实施方案中,单个CDR包含1或2个氨基酸置换,并且修饰的抗CD38抗原结合结构域保留与人和/或食蟹猴CD38的结合。
在一些实施方案中,CD38TM3的CD38结合结构域(图25C)具有在SEQ ID NO:101中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域。
在一些实施方案中,CD38TM3的CD38结合结构域(图25C)具有在SEQ ID NO:105中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38TM3的CD38结合结构域(图25C)具有在SEQ ID NO:101中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域和在SEQ ID NO:105中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM3(图25C)并且具有含有SEQ ID NO:101的VH和含有SEQ ID NO:105的VL。
在一些实施方案中,本发明中CD38结合结构域是CD38TM4(图25D),其包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO:101具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列,其中所述轻链可变区具有与SEQ IDNO:125具有至少80%(例如,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM4(图25D),并且包括包含SEQ IDNO:102的vhCDRl、包含SEQ ID NO:3的vhCDR2、包含SEQ ID NO:104的vhCDR3、包含SEQ IDNO:106的vlCDRl、包含SEQ ID NO:107的vlCDR2和包含SEQ ID NO:108的vlCDR3。在一些实施方案中,这样的6个CDR中的一个或多个具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰。在实施方案中,单个CDR包含1或2个氨基酸置换,并且修饰的抗CD38抗原结合结构域保留与人和/或食蟹猴CD38的结合。
在一些实施方案中,CD38TM4的CD38结合结构域(图25D)具有在SEQ ID NO:101中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域。
在一些实施方案中,CD38TM1的CD38结合结构域(图25A)具有在SEQ ID NO:125中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38TM4的CD38结合结构域(图25D)具有在SEQ ID NO:101中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VH结构域和在SEQ ID NO:125中具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸变化的VL结构域。
在一些实施方案中,CD38结合结构域是CD38TM4(图25D)并且具有含有SEQ ID NO:101的VH和含有SEQ ID NO:125的VL。
除本文中针对每个CD38结合结构域的重链和轻链可变区和/或CDR中所述的序列变体以外,也可改变重链和/或轻链可变区的框架区。在一些实施方案中,在与表4中所述的框架区序列保持至少80%、85%、90%或95%同一性的框架区中进行变化,同时使6个CDR保持不变且保持与人类和/或食蟹猴CD38的结合。
在一些实施方案中,在框架区和6个CDR二者中进行变化,同时保持CD38结合结构域与人类和/或食蟹猴CD38的结合。在这些实施方案中,CDR可以具有氨基酸修饰(例如在6个CDR集合中1、2、3、4或5个氨基酸修饰,即,只要该6个CDR集合中的变化总数小于6个氨基酸修饰,则可修饰CDR,其中CDR的任何组合发生变化;例如在vlCDR1中可有一个变化,在vhCDR2中可有两个变化,在vhCDR3中无变化等)。
a.CD38结合结构域的格式
如图1所示和本文所述,本发明的CD38结合域包含VH和VL结构域,它们可以位于不同的多肽链上或位于单个多肽链上。应该注意的是,在一些实施方案中,VH和VL可以形成scFv,其中例如CD38结合融合蛋白是单体。在如本文所述和图1所示的一些情况下,VH和VL位于单个多肽链上,但它们之间的接头太短而不能允许进行分子内缔合,并因此形成包含两个抗CD38结合区和2个志贺菌组分的同型二聚体。在其他实施方案中,VH和VL之间的接头足够长以允许scFv形成,因此蛋白质融合体是单体。
在一些实施方案中,组合物包含含有本文所述的CD38结合结构域的scFv。scFvs与人和食蟹猴CD38结合,并包含通过scFv接头连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,CD38结合结构域从其N-到C-末端包含VH-接头-VL。在一些实施方案中,CD38结合结构域从其N-到C-末端包含VL-接头-VH。
2.志贺菌毒素效应子多肽组分
本发明的结合蛋白包含至少一种源自志贺菌毒素A亚基的志贺菌毒素效应子多肽。志贺菌毒素效应子多肽是源自志贺菌毒素家族的志贺菌毒素A亚基成员的多肽,其能够表现出一种或多种志贺菌毒素功能(参见例如Cheung M等人,Mol Cancer 9:28(2010);WO2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344,WO 2017/019623,WO 2018/106895和WO2018/140427)。志贺菌毒素的功能包括,例如,增加细胞内化、引导自核内体区室至胞质溶胶的亚细胞按路线发送、避免细胞内降解、使核糖体催化失活(防止蛋白质合成)及实现细胞生长抑制和/或细胞毒性效应。
蛋白质毒素的志贺菌毒素家族是由结构和功能相关的各种天然毒素组成,例如志贺菌毒素、志贺菌样毒素1和志贺菌样毒素2(Johannes L,W,Nat Rev Microbiol8:105-16(2010))。志贺菌毒素家族的全毒素成员含有选择性地结合一些宿主细胞表面上存在的特定鞘糖脂的靶向结构域和一旦在细胞内部便能够使核糖体永久失活的酶结构域(Johannes L,W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺菌毒素家族的成员共享有相同的整体结构和作用机制(Engedal N等人,Microbial Biotech 4:32-46(2011))。例如,Stx、SLT-1和SLT-2在无细胞系统中显示出难以区分的酶活性(Head S等人,J BiolChem 266:3617-21(1991);Tesh V等人,Infect Immun 61:3392-402(1993);Brigotti M等人,Toxicon 35:1431–1437(1997))。
志贺菌毒素家族涵盖从痢疾杆菌(S.dysenteriae)血清型1分离的真志贺菌毒素(Stx)、从肠出血性大肠杆菌血清型分离的志贺样菌毒素1变体(SLTl或Stxl或SLT-1或Slt-I),和从肠出血性大肠杆菌的血清型中分离的志贺菌样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx只有一个氨基酸残基不同,两者都被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxin)或Vero毒素(Verotoxin)(VT)(O’Brien A,Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在一级氨基酸序列水平上彼此仅约53-60%相似,但它们共享志贺菌毒素家族成员所共有的酶活性和细胞毒性机制(Johannes L,W,Nat Rev Microbiol8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺菌毒素,例如已定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d和Stx2a–g(ScheutzF等人,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。志贺菌毒素家族的成员并非天然地局限于任何细菌物种,因为志贺菌毒素编码基因可以通过水平基因转移在细菌物种之间传播(Strauch E等人,Infect Immun 69:7588-95(2001);Bielaszewska M等人,Appl Environ Micrbiol 73:3144-50(2007);Zhaxybayeva O,Doolittle W,Curr Biol 21:R242-6(2011))。作为种间转移的实例,在从人类受试者分离的溶血性不动杆菌(A.haemolyticus)菌株中发现了志贺菌毒素(GrotiuzG等人,J ClinMicrobiol 44:3838-41(2006))。一旦志贺菌毒素编码多核苷酸进入新的亚种或物种,据推测,志贺菌毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力而产生轻微的序列变异,同时仍保持该志贺菌毒素家族成员共有的细胞毒性机制(参见ScheutzF等,JClin Microbiol50:2951-63(2012))。
在如下更充分描述的本发明CD38结合蛋白的一些实施方案中,志贺菌毒素A亚基效应子多肽组分包含至少以下志贺菌毒素效应子多肽亚区的组合:(1)去免疫化亚区域,和(2)志贺菌毒素A1片段区域羧基末端附近的蛋白酶切割抗性亚区。
在一些实施方案中,CD38结合蛋白包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽,其包含SEQID NO:45-69中任一项的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQID NO:46的序列。
a.在特定实施方案中有用的志贺菌毒素组分
如本领域中所描述的,存在多种志贺菌毒素组分可用于与下文所概述的本发明的CD38结合区组合。具体而言,2019年1月23日提交的美国临时申请第62/795,633号的实施方案#1至#11的全部内容通过引用具体纳入本文。
(i)野生型志贺菌毒素组分
在一些实施方案中,可以使用诸如表20的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中描述的野生型志贺菌毒素效应子多肽,(参见例如WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2017/019623,其全部内容通过引用纳入本文,特别是野生型序列的序列和片段,例如在WO2017/019623的第[21]段中引用的那些)。
(ii)具有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺菌毒素组分
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽在其志贺菌毒素A1片段区的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序(参见例如WO2015/191764,在此通过引用以其整体明确纳入,特别是第[8]、[9]段以及被破坏的基序和包括被破坏的基序的毒素多肽的序列)。在这方面特别有用的实施方案是SEQ ID NO:46。
志贺菌毒素家族成员的志贺菌毒素A亚基在其A1片段区域的羧基末端包含对于志贺菌毒素功能重要的保守弗林蛋白酶切割位点。技术人员可以使用标准技术和/或通过使用本文的信息来鉴定弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割位点。
志贺菌毒素细胞毒性模型在于弗林蛋白酶在中毒细胞中对志贺菌毒素A亚基的细胞内蛋白水解处理对于以下至关重要:1)从志贺菌全毒素的剩余部分释放A1片段,2)通过暴露A1片段羧基末端中的疏水性结构域使A1片段自内质网逃脱,及3)A1片段的酶促活化(参见Johannes L,W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺菌毒素A1片段自中毒细胞内质网中A2片段及志贺菌全毒素的其余组分的有效释放对于至胞质溶胶的有效细胞内按路线发送、最大酶活性、有效核糖体失活及实现最佳细胞毒性至关重要,即与野生型志贺菌毒素相当(例如,参见WO 2015/191764及其中的参考文献)。
在志贺菌毒素中毒期间,A亚基在保守精氨酸残基(例如StxA及SLT-1A中位置251处的精氨酸残基和Stx2A及SLT-2A中位置250处的精氨酸残基)的羧基键处由弗林蛋白酶以蛋白水解方式切割。志贺菌毒素A亚基的弗林蛋白酶切割发生在核内体和/或高尔基体区室中。弗林蛋白酶是一种特殊的丝氨酸内切蛋白酶,其在所检查的所有人类组织中由众多种细胞类型表达,且由大多数动物细胞表达。弗林蛋白酶切割包含通常集中在最小二元共有基序R-x-(R/K/x)-R(SEQ ID NO:181)上的可及基序的多肽。志贺菌毒素家族成员的A亚基包含保守的、暴露于表面的、延伸的环结构(例如StxA和SLT-1A中的242-261,以及SLT-2中的241-260),其具有由弗林蛋白酶切割的保守S-R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:182)基序。弗林蛋白酶诱导的StxA切割需要定位于StxA中氨基酸残基242-261处的表面暴露的延伸环结构,包括侧接最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R(SEQ ID NO:183)的特征。
志贺菌毒素A亚基和志贺菌毒素效应子多肽中的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点可由技术人员使用标准方法和/或通过使用本文的信息来鉴定。弗林蛋白酶切割最小的共有基序R-x-x-R(SEQ ID NO:183)(Schalken J等人,J Clin Invest 80:1545-9(1987);Bresnahan P等人,J Cell Biol 111:2851-9(1990);Hatsuzawa K等人,J BiolChem 265:22075-8(1990);Wise R等人,Proc Natl Acad Sci USA 87:9378-82(1990);Molloy S等人,J Biol Chem 267:16396-402(1992))。与此一致,许多弗林蛋白酶抑制剂包含含有基序R-x-x-R(SEQ ID NO:183)的肽。弗林蛋白酶合成抑制剂的实例是包含肽R-V-K-R(SEQ ID NO:190)的分子(Henrich S等人,Nat Struct Biol 10:520-6(2003))。通常,可以预测包含表面可及的二元氨基酸基序(其中具有两个带正电荷的氨基酸,氨基酸由两个氨基酸残基隔开)的肽或蛋白质对弗林蛋白酶切割敏感,其中切割发生在基序中最后一个碱性氨基酸的羧基键处。
由弗林蛋白酶切割的底物中的共有基序已鉴别为具有一定程度的特异性。已经描述了包含二十个连续氨基酸残基的区域的弗林蛋白酶切割位点基序,其可使用SSchechterI,Berger,A,Biochem Biophys Res Commun 32:898-902(1968)中所阐述的命名法标记为P14至P6’(Tian S等人,Int J Mol Sci 12:1060-5(2011))。根据该命名法,弗林蛋白酶切割位点是在指定为P1的氨基酸残基的羧基键处,并且弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基在从该参考P1残基朝向氨基末端之方向上编号为P2、P3、P4等。利用符号P2’、P3’、P4’等从P1参考残基朝向羧基末端对基序中氨基酸残基进行编号。使用此命名法,P6至P2’区描绘了由弗林蛋白酶的酶结构域结合的弗林蛋白酶切割基序的核心底物。两个侧翼区域P14至P7和P3’至P6’通常富含极性氨基酸残基,以增加对位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的可及性。
一般的弗林蛋白酶切割位点通常由对应于P4-P3-P2-P1(SEQ ID NO:192)的共有基序R-x-x-R(SEQ ID NO:183)描述;其中“R”代表精氨酸残基(见上文表1),短划线“-”代表肽键,小写的“x”代表任何氨基酸残基。然而,其他残基和位置可能有助于进一步定义弗林蛋白酶切割基序。略微更精细的弗林蛋白酶切割位点共有基序通常被报道为共有基序R-x-[K/R]-R(SEQ ID NO:191)(其中斜杠“/”表示“或”,并将相同位置的替代氨基酸残基分开),该共有基序对应于P4-P3-P2-P1(SEQ ID NO:192),这是因为观察到弗林蛋白酶对含有该基序的切割底物具有强烈偏好。
除了最小的弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R(SEQ ID NO:183),已经描述了在某些位置具有某些氨基酸残基偏好的更大的弗林蛋白酶切割基序。通过比较各种已知的弗林蛋白酶底物,已经表征了20个氨基酸残基长的弗林蛋白酶切割位点基序中的氨基酸残基的某些物理化学特性。弗林蛋白酶裂解基序的P6到P2’区域描绘了核心弗林蛋白酶切割位点,该位点与弗林蛋白酶的酶促结构域物理相互作用。两个侧翼区域P14到P7和P3'到P6'通常是亲水的,富含极性氨基酸残基,以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的表面可及性。
通常,从位置P5到P1的弗林蛋白酶切割基序区域倾向于包含具有正电荷和/或高等电点的氨基酸残基。特别是,标记弗林蛋白酶蛋白水解位置的P1位置通常被精氨酸占据,但其他带正电荷的氨基酸残基可出现在该位置。位置P2和P3倾向于被柔性氨基酸残基占据,特别是P2倾向于被精氨酸、赖氨酸或有时被非常小的柔性氨基酸残基如甘氨酸占据。P4位置倾向于被弗林蛋白酶底物中带正电荷的氨基酸残基占据。然而,如果P4位置被脂肪族氨基酸残基占据,则带正电荷的官能团的缺乏可以通过位于P5和/或P6位置的带正电荷的残基来补偿。位置P1'和P2'通常被脂肪族和/或疏水性氨基酸残基占据,P1'位置最常被丝氨酸占据。
两个亲水的侧翼区域倾向于被极性、亲水且具有较小氨基酸官能团的氨基酸残基占据;然而,在某些经验证的弗林蛋白酶底物中,侧翼区域不包含任何亲水性氨基酸残基(参见Tian S,Biochem Insights 2:9-20(2009))。
在志贺菌毒素A1片段和A2片段之间的接合处的天然志贺菌毒素A亚基中发现的20个氨基酸残基的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点在某些志贺菌毒素中得到了很好的表征。例如,在StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:1)中,该弗林蛋白酶切割基序天然定位于L238至F257,而在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中,该弗林蛋白酶切割基序天然定位于V237至Q256。基于本文所述的氨基酸同源性、实验和/或弗林蛋白酶切割测定,技术人员可以鉴定其他天然志贺菌毒素A亚基或志贺菌毒素效应子多肽中的弗林蛋白酶切割基序,其中所述基序是实际的弗林蛋白酶切割基序或预计会在真核细胞内弗林蛋白酶切割这些分子后产生A1和A2片段。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺菌毒素A1片段衍生的多肽和(2)在志贺菌毒素A1片段衍生多肽羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序。志贺菌毒素A1片段衍生多肽的羧基末端可由技术人员通过使用本领域已知的技术来鉴定,例如通过使用蛋白质序列比对软件来鉴定(i)与天然志贺菌毒素保守的弗林蛋白酶切割基序、(ii)与天然志贺菌毒素保守的表面暴露的延伸环和/或(iii)可由ERAD系统识别的主要为疏水性的氨基酸残基的延伸段(即疏水性“补丁”)。
本发明的结合蛋白的蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽(1)可在其志贺菌毒素A1片段区域的羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序和/或(2)在其志贺菌毒素A1片段区域的羧基末端和/或源自志贺菌毒素A1片段羧基末端的区域包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的各种改变,诸如翻译后修饰、氨基酸官能团中一或多个原子的改变、向氨基酸官能团添加一个或多个原子、与非蛋白质部分的缔合和/或与氨基酸残基、肽、多肽的连接以诸如产生分支的蛋白质结构。
使用本文所述的、WO 2015/191764中所述的/或技术人员已知的方法,可从天然或非天然的志贺菌毒素效应子多肽和/或志贺菌毒素A亚基多肽产生抗蛋白酶切割的志贺菌毒素效应子多肽,其中所得分子仍保持一或多种志贺菌毒素A亚基功能。
出于本发明的目的,就弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序而言,术语“破坏”或“受破坏的”是指与野生型志贺菌毒素A亚基或源自仅包含野生型多肽序列的野生型志贺菌毒素A亚基的多肽的弗林蛋白酶切割相比,天然弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的改变(诸如突变),其导致志贺菌毒素A1片段区域或其所衍生的可鉴别区域的羧基末端附近的弗林蛋白酶切割减少。弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的改变包括弗林蛋白酶切割基序中的突变,例如弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基末端截短,以及翻译后修饰,其例如作为涉及将分子偶联或连接至氨基酸残基的官能团的糖基化、白蛋白化(albumination)等的结果。因为弗林蛋白酶切割基序包含大约二十个氨基酸残基,理论上,涉及这二十个位置中任何一个的一个或多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短可能导致降低弗林蛋白酶切割敏感性(Tian S等人,Sci Rep 2:261(2012))。弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的破坏可能会或可能不会增加对其他蛋白酶(例如,哺乳动物血管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶)切割的抗性。技术人员可以使用本领域已知的技术测试给定破坏对给定蛋白酶切割敏感性的影响。
出于本发明的目的,“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是包含源自20个氨基酸残基区域的一个或多个氨基酸残基的改变的弗林蛋白酶切割基序,该20个氨基酸残基区域代表在天然志贺菌毒素A亚基中发现的在志贺菌毒素A1片段与A2片段区域之间接合处且经定位使得志贺菌毒素A亚基的弗林蛋白酶切割会产生A1和A2片段的保守的弗林蛋白酶切割基序;其中与参考分子相比,该受破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验上可再现的方式展示降低的弗林蛋白酶切割,该参考分子包含融合至羧基末端多肽的野生型志贺菌毒素A1片段区域,该羧基末端多肽的大小足够大以能使用技术人员已知的和/或本文所述的适当测定法来监测弗林蛋白酶切割。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的实例是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换,包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的置换。此外,弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可由突变破坏,该突变包含通过添加共价连接的结构对氨基酸的修饰,该共价连接的结构掩蔽该位点或基序中的至少一个氨基酸,诸如由于聚乙二醇化、小分子佐剂的偶联和/或位点特异性白蛋白化所致。
如果弗林蛋白酶切割基序已由突变和/或非天然氨基酸残基的存在而被破坏,则某些受破坏的弗林蛋白酶切割基序可能不容易被识别为与任何弗林蛋白酶切割基序相关;然而,志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端将是可识别的,并将定义弗林蛋白酶切割基序未受破坏的情况下该弗林蛋白酶切割基序所处的位置。例如,与志贺菌毒素A亚基和/或志贺菌毒素A1片段相比,由于羧基末端截短,受破坏的弗林蛋白酶切割基序可包含弗林蛋白酶切割基序的少于20个氨基酸残基。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺菌毒素A1片段衍生多肽和(2)在志贺菌毒素A1片段多肽区域的羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序;其中与参考分子(例如包含A1片段的羧基末端和/或A1与A2片段之间的保守弗林蛋白酶切割基序的野生型志贺菌毒素多肽)相比,该志贺菌毒素效应子多肽(和包含它的任何结合蛋白)具有更强的弗林蛋白酶切割抗性。例如,一个分子与参考分子相比的弗林蛋白酶切割的降低可通过以下来确定:使用WO2015/191764中描述的体外弗林蛋白酶切割测定法,该测定法是使用相同条件进行,且接着对从切割产生的任何片段的带密度进行定量,以定量地测量弗林蛋白酶切割的变化。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,志贺菌毒素效应子多肽在体外和/或体内对弗林蛋白酶切割更具抗性。
一般而言,通过将本发明的结合蛋白与使其弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽被包含志贺菌毒素A1片段的野生型志贺菌毒素效应子多肽替代的相同分子进行比较来测试本发明结合蛋白的蛋白酶切割敏感性。在一些实施方案中,与包含在羧基末端融合至肽或多肽的野生型志贺菌毒素A1片段的参考分子相比,包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序的本发明的CD38结合融合蛋白展示体外弗林蛋白酶切割降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或更多。
已经描述了几种弗林蛋白酶切割基序破坏。例如,将最小R-x-x-R基序(SEQ IDNOL:183)中的两个保守精氨酸突变为丙氨酸完全阻止了弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶样蛋白酶的加工(参见例如Duda A等人,J Virology 78:13865-70(2004))。由于弗林蛋白酶切割位点基序包含大约二十个氨基酸残基,因此理论上,涉及一个或多个这二十个氨基酸残基位置中任一的某些突变可以消除弗林蛋白酶切割或降低弗林蛋白酶切割效率(参见例如Tian S等,Sci Rep 2:261(2012))。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合融合蛋白包含源自志贺菌毒素家族成员的至少一个A亚基的志贺菌毒素效应子多肽,其中志贺菌毒素效应子多肽在源自志贺菌毒素A亚基的保守、高度可及的蛋白酶切割敏感环的一个或多个氨基酸中包含破坏。例如,在StxA和SLT-1A中,这个高度可及的蛋白酶敏感环天然定位于氨基酸残基242至261,而在SLT-2A中,该保守环天然定位于氨基酸残基241至260。基于多肽序列同源性,技术人员可以在其他志贺菌毒素A亚基中鉴定这种保守的、高度可及的环结构。该环中氨基酸残基的某些突变可降低环内某些氨基酸残基对蛋白水解切割的可及性,并且这可能降低弗林蛋白酶切割敏感性。
在一些实施方案中,本发明的分子包含志贺菌毒素效应子多肽,其包含破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序在志贺菌毒素A亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感环中包含突变。在一些实施方案中,本发明的分子包含志贺菌毒素效应子多肽,该多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序在志贺菌毒素A亚基的该蛋白酶敏感环中包含突变,该突变降低环中某些氨基酸残基的表面可及性,使得弗林蛋白酶切割敏感性降低。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽的受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含就共有氨基酸残基P1和P4(诸如最小弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)的位置1和4中的氨基酸残基)之一或两者的存在、位置或官能团而言的破坏。例如,将最小弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R(SEQ ID NO:183)中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基序并阻止在该位点的弗林蛋白酶切割。类似地,将最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R(SEQ ID NO:183)中的一个或两个精氨酸残基氨基酸残基置换为技术人员已知的任何非保守氨基酸残基将降低基序的弗林蛋白酶切割敏感性。特别地,精氨酸氨基酸残基置换为缺乏正电荷的任何非碱性氨基酸残基(例如,A,G,P,S,T,D,E,Q,N,C,I,L,M,V,F,W和Y)将导致受破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽的受破坏的弗林蛋白酶切割基序包括共有氨基酸残基P4和P1之间的间隔中的破坏(就中间氨基酸残基的数目不是两个而言),并且,因此,将P4和/或P1更改为不同的位置并消除P4和/或P1命名。例如,最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基置换。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内包含一个或多个氨基酸残基置换,例如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基R248被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任何不带正电荷的氨基酸残基置换;并且,对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基Y247被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任何不带正电荷的氨基酸残基置换。
在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未受破坏的、最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180),但包含受破坏的侧翼区,例如天然定位在例如241-247和/或252-259的弗林蛋白酶切割基序侧翼区中的一个或多个氨基酸残基中的氨基酸残基置换。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的P1-P6区域中的一个或多个氨基酸残基的置换;将P1’突变为庞大的氨基酸,例如R、W、Y、F和H;并且将P2’突变为极性和亲水性氨基酸残基;并且将位于弗林蛋白酶切割基序的P1’-P6’区域的一个或多个氨基酸残基置换为一个或多个巨大的疏水性氨基酸残基。
在一些实施方案中,弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序内至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含以下氨基酸序列的破坏:所述氨基酸序列天然定位在志贺菌样毒素1(SEQ ID NO:1)或志贺菌毒素(SEQ ID NO:2)的A亚基的氨基酸249-251处或志贺菌样毒素2(SEQ ID NO:3)的A亚基的氨基酸247-250处或保守志贺菌毒素效应子多肽和/或非天然志贺菌毒素效应子多肽序列中的等效位置处。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,该破坏包含弗林蛋白酶切割基序内至少一个氨基酸的缺失。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,该破坏包含在蛋白酶切割基序区域内至少一个氨基酸的插入。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,该破坏包含氨基酸倒位,其中至少一个倒位氨基酸在蛋白酶基序区内。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,该破坏包含突变,例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰侧链的氨基酸。
在本发明的CD38结合融合蛋白的一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序内的九个、十个、十一个或更多个羧基末端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点或最小弗林蛋白酶切割基序。换言之,一些实施方案在A1片段区域的羧基末端缺少弗林蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内包含一个或多个氨基酸残基缺失和置换,例如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基R248被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任何不带正电荷的氨基酸残基置换;并且,对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基Y247被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任何不带正电荷的氨基酸残基置换。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基末端截短。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内包含一个或多个氨基酸残基缺失和置换,例如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基R248被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任何不带正电荷的氨基酸残基置换;并且,对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位的氨基酸残基Y247被任何不带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任何不带正电荷的氨基酸残基置换。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内的氨基酸置换以及羧基末端截短二者,例如,对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸位置249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大,并且在适当的情况下,包含用任何不带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基R248和/或R251;并且对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸位置248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大,并且在适当的情况下,包含用任何不带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基Y247和/或R250。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基的插入,只要所插入的氨基残基不产生新的弗林蛋白酶切割位点即可。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸残基的插入破坏了最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)中精氨酸残基之间的天然间隔,例如在249或250且由此在R248与R251之间包含一个或多个氨基酸残基插入的StxA和SLT-1A衍生多肽;或在248或249且由此在Y247与R250之间包含一个或多个氨基酸残基插入的SLT-2A衍生多肽。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和羧基末端截短两者。在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基置换二者。在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基缺失二者。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基末端截短。
在一些实施方案中,包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺菌毒素效应子多肽通过肽键直接融合到包含氨基酸、肽和/或多肽的分子部分,其中融合结构涉及单一的连续多肽。在这些融合实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序之后的氨基酸序列不应在融合接合处产生新的弗林蛋白酶切割位点。
任何上述蛋白酶切割抗性的、志贺菌毒素效应子多肽亚区和/或受破坏的弗林蛋白酶切割基序可以单独使用或与本发明的每个单独实施方案(包括本发明的方法)组合使用。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽可在志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端处包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽不包含任何已知的补偿结构,其中所述补偿结构可在志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端附近提供弗林蛋白酶切割。适用于本发明的受破坏的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点的非限制性实例描述于WO 2015/191764中。
某些弗林蛋白酶切割基序破坏在本文中是通过参考序列表中所提供的天然志贺菌毒素A亚基的特定氨基酸位置来指示的,应注意,天然存在的志贺菌毒素A亚基包括在其氨基末端含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式,所述信号序列被去除以产生成熟志贺菌毒素A亚基并且可被技术人员识别。此外,某些包含突变的某些弗林蛋白酶切割基序破坏在本文中通过以下来指示:参考天然存在于天然志贺菌毒素A亚基内特定位置的特定氨基酸(例如R表示精氨酸残基)(例如R251表示在从氨基末端起位置251处的精氨酸残基),之后为在所讨论的特定突变中置换该残基的氨基酸(例如R251A代表在从氨基末端起氨基酸残基251处丙氨酸对精氨酸的氨基酸置换)。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽在志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,并且此类实施方案在本文中称为“弗林蛋白酶切割抗性”或“蛋白酶切割抗性”的志贺菌毒素效应子多肽来描述它们相对于野生型志贺菌毒素A亚基和/或野生型志贺菌毒素A1片段融合蛋白的特性。
在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺菌毒素A亚基组成。
在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含最小弗林蛋白酶切割位点共有基序中的一个或两个精氨酸残基经A、G或H的氨基酸残基置换(相对于野生型志贺菌毒素多肽)。在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,该破坏包含弗林蛋白酶切割基序区域内的氨基酸置换,其中该置换发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的氨基酸处:SEQ ID NO:3的氨基酸247、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸248、SEQ ID NO:3的氨基酸250、SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸251,或保守志贺菌毒素效应子多肽和/或非天然志贺菌毒素效应子多肽序列中的等效位置。在一些实施方案中,置换是针对任何非保守氨基酸并且置换发生在天然定位的氨基酸残基位置处。在一些实施方案中,突变包含选自由以下各项组成的组的氨基酸置换:R247A、R248A、R250A、R251A,或保守志贺菌毒素效应子多肽和/或非天然志贺菌毒素效应子多肽序列中的等效位置。
在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含缺失突变。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变,该突变是天然定位在StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的247-252的区域或天然定位在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的246-251的区域的缺失;天然定位在StxA(SEQID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的244-246的区域或天然定位在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中的243-245的区域的缺失;或天然定位在StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:3)中的253-259的区域或天然定位在SLT-2A(SEQ ID No:3)中的252-258的区域的缺失。
在一些实施方案中,蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含与野生型志贺菌毒素A亚基相比羧基末端截短的突变,该截短导致弗林蛋白酶切割基序中一个或多个氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含羧基末端截短,该截短在最小切割位点Y/R-x-x-R(SEQ ID NO:180)内缺失一个或多个氨基酸残基,诸如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置250,249,248,247,246,245,244,243,242,241,240或更小;并且对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置249,248,247,246,245,244,243,242,241或更小。在可能的情形下,一些实施方案包括受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含任何上述突变的组合。
在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含作为弗林蛋白酶切割基序的部分羧基末端截短的突变;然而,本发明的一些CD38结合融合蛋白不包含作为整个20个氨基酸残基弗林蛋白酶切割基序的完全羧基末端截短的受破坏的弗林蛋白酶切割基序。例如,一些志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含在StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中多至天然位置240处的志贺菌毒素A1片段区域的部分羧基末端截短,但在位置239或更小处没有羧基末端截短。类似地,一些志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中多至天然位置239处的志贺菌毒素A1片段区域的部分羧基末端截短,但不是在位置238或更小处的羧基末端截短。在弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽的最大羧基末端截短中,仍然存在包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序(弗林蛋白酶切割基序的位置P14和P13)的突变。
在一些其他实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含作为弗林蛋白酶切割基序的完全或部分羧基末端截短的突变。例如,某些志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含在StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中多至天然位置236或在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中多至235处的志贺菌毒素A1片段区域的完全羧基末端截短。例如,某些细胞毒性降低的志贺菌毒素效应子多肽包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含在StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中天然位置240或SLT-2A(SEQ ID NO:3)中239处以外的志贺菌毒素A1片段区域的完全羧基末端截短。细胞毒性降低的志贺菌毒素效应子多肽可用于将外源性材料递送至细胞和/或特定亚细胞区室中。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内的氨基酸残基置换以及羧基末端截短二者,例如,对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大,并且在适当的情况下,包含用任何不带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基R248和/或R251;并且对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大,并且在适当的情况下,包含用任何不带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基Y247和/或R250。在一些实施方案中,包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序的截短的志贺菌毒素效应子多肽还包含弗林蛋白酶切割基序(位置P9、P8及/或P7处的氨基酸残基)以维持最佳细胞毒性。
在一些实施方案中,与野生型志贺菌毒素A亚基相比,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个内部氨基酸残基缺失的突变。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)内具有一个或多个氨基酸残基缺失的突变。例如,StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽包含天然定位氨基酸残基R248和/或R251的内部缺失,其可以与周围残基例如249、250、247、252等的缺失组合;且SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽包含天然定位氨基酸残基Y247和/或R250的内部缺失,其可以与周围残基例如248、249、246、251等的缺失组合。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含四个连续氨基酸残基的缺失突变,其突变使最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)缺失,例如StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽缺少R248-R251和SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽缺少Y247-R250。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在侧接核心弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基中具有一个或多个氨基酸残基缺失的突变,例如SLT-1A或StxA中氨基酸244-247和/或氨基酸252-255的缺失。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含与野生型志贺菌毒素A亚基相比整个表面暴露的蛋白酶切割敏感环的内部缺失的突变,诸如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位氨基酸残基241-262的缺失;且对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,天然定位氨基酸残基240-261的缺失。
在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序中的内部氨基酸残基缺失的突变和与野生型志贺菌毒素A亚基相比羧基末端截短的突变二者。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)中的氨基酸残基缺失的突变和与野生型志贺菌毒素A亚基相比羧基末端截短的突变二者。例如,蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽可包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序,该基序包含仍具有氨基酸残基247和/或252的截短的StxA或SLT-1A多肽中天然定位氨基酸残基248-249和/或250-251或仍具有氨基酸残基246和/或251的截短的SLT-2A中氨基酸残基247-248和/或249-250的缺失的突变。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含具有以下的突变:与野生型志贺菌毒素A亚基相比,使最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)缺失的四个连续氨基酸残基的缺失,和羧基末端截短,例如,对于StxA和SLT-1A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大且缺少R248-R251;并且对于SLT-2A衍生的志贺菌毒素效应子多肽,截短终止于天然氨基酸残基位置251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大并且缺少Y247-R250。
在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺菌毒素A亚基的突变,该一个或多个突变改变天然定位在志贺菌毒素A亚基(SEQ IDNO:1-2和4-6)的氨基酸248-251或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3和7-18)的氨基酸247-250的区域或志贺菌毒素A亚基或其衍生物的等效区域中的至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中,受破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个相对于野生型志贺菌毒素A亚基的突变。在一些实施方案中,最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)和/或R-x-x-R(SEQ IDNO:183)表示。
(iii)具有羧基末端内质网滞留/回收信号基序的志贺菌毒素组分
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含KDEL家族成员的羧基末端内质网滞留/回收信号基序,例如WO2018/140427的段落[52]及WO2015/138435的段落[28]、[107]至[113]中所述的,所有这些都通过引用明确纳入。
(iv)去免疫化的志贺菌毒素A亚基效应子多肽
在一些实施方案中,结合蛋白的志贺菌毒素效应子多肽是去免疫化的,例如,与野生型志贺菌毒素、野生型志贺菌毒素多肽和/或仅包含野生型多肽序列的志贺菌毒素效应子多肽相比而言。志贺菌毒素效应子多肽和/或志贺菌毒素A亚基多肽,无论是否天然存在,都可以通过本文描述的,WO2015/113005、WO2015/113007、WO2016/196344和WO2018/140427中所述的,和/或技术人员已知的方法去免疫化,其中所得分子保留一种或多种志贺菌毒素A亚基功能。去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽可包含至少一个假定的内源性表位区域的破坏,以在向受试者(诸如人受试者)施用志贺菌毒素效应子多肽后,降低该多肽的抗原性及/或免疫原性潜力。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含内源性表位或表位区域例如B细胞和/或CD4+T细胞表位的破坏。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含至少一个本文描述的内源性表位区域的破坏,其中在将多肽施用于受试者后,所述破坏降低志贺菌毒素效应子多肽的抗原性和/或免疫原性潜力,并且其中志贺菌毒素效应子多肽能够展示一种或多种志贺菌毒素A亚基功能,例如显著水平的志贺菌毒素细胞毒性。
如本文所用,关于表位区的术语“受破坏的”或“破坏”是指表位区域中至少一个氨基酸残基的缺失;两个或更多个氨基酸残基的倒位,其中至少一个倒位的氨基酸残基在表位区域内;至少一个氨基酸插入到表位区域中;以及表位区域中至少一个氨基酸残基的置换。由突变引起的表位区域破坏包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸进行的氨基酸置换。或者,表位区域可以被突变破坏,所述突变包括通过添加掩蔽表位区域中至少一个氨基酸的共价连接的化学结构对氨基酸的修饰,参见(例如)聚乙二醇化(参见Zhang C等人,BioDrugs 26:209-15(2012),小分子佐剂(Flower D,Expert Opin Drug Discov 7:807-17(2012),和位点特异性白蛋白化(Lim S等人,J Control Release 207-93(2015))。
一些表位区域和破坏在本文中是通过参考序列表中所提供的天然志贺菌毒素A亚基的特定氨基酸位置来指示的,应注意,天然存在的志贺菌毒素A亚基可包括在其氨基末端含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式,所述信号序列被去除以产生成熟志贺菌毒素A亚基并且可被技术人员识别。此外,一些表位区域破坏在本文中通过以下来指示:参考天然存在于天然志贺菌毒素A亚基内特定位置的特定氨基酸(例如S代表丝氨酸残基)(例如S33代表在从氨基末端位置33处的丝氨酸残基),之后为在所讨论的特定突变中置换该残基的氨基酸(例如S33I代表在从氨基末端起氨基酸残基33处异亮氨酸对丝氨酸的氨基酸置换)。
在一些实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含本文提供的至少一个表位区域的破坏。在一些实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含WO2015/113005或WO2015/113007中描述的至少一个表位区域的破坏。
在一些实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含含有至少一个氨基酸序列破坏的全长志贺菌毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-2A(SEQ ID NO:3)),其中所述氨基酸序列选自由以下各项组成的天然定位氨基酸的组:SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1-15;SEQ ID NO:3的氨基酸3-14;SEQ ID NO:3的氨基酸26-37;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸27-37;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸39-48;SEQ ID NO:3的氨基酸42-48;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸53-66;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸94-115;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸141-153;SEQ ID NO:3的氨基酸140-156;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸179-190;SEQ ID NO:3的氨基酸179-191;SEQ ID NO:3的氨基酸204;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸205;SEQ ID NO:3的氨基酸210-218;SEQ ID NO:3的氨基酸240-258;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸243-257;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸254-268;SEQ ID NO:3的氨基酸262-278;SEQ ID NO:3的氨基酸281-297;和SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸285-293或志贺菌毒素A亚基多肽、保守志贺菌毒素效应子多肽亚区域和/或非天然志贺菌毒素效应子多肽序列中的等效位置。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含截短的志贺菌毒素A亚基。志贺菌毒素A亚基的截短可能导致整个表位区域的缺失,而不影响志贺菌毒素效应子功能。展示出显著酶活性的最小志贺菌毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等人,Infect Immun 62:956-60(1994))。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基末端截短为氨基酸1–251可去除两个预测的B细胞表位区域、两个预测的CD4阳性(CD4+)T细胞表位和预测的不连续B细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端截短至75-293去除至少三个预测的B细胞表位区域和三个预测的CD4+T细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端和羧基末端二者截短至75-251缺失至少五个预测的B细胞表位区域;四个假定的CD4+T细胞表位;和一个预测的不连续的B细胞表位。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含具有至少一个突变的全长或截短的志贺菌毒素A亚基,例如B或T细胞表位区域中的缺失、插入、倒位或置换。在一些实施方案中,多肽包含破坏,所述破坏包含表位区域内至少一个氨基酸的缺失。在一些实施方案中,多肽包含破坏,所述破坏包含表位区域内至少一个氨基酸的插入。在一些实施方案中,多肽包含破坏,所述破坏包含氨基酸的倒位,其中至少一个倒位氨基酸在表位区域内。在一些实施方案中,多肽包含破坏,所述破坏包含突变,例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰侧链的氨基酸。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含与天然序列相比具有一或多个突变的全长或截短的志贺菌毒素A亚基,或基本上由其组成,该亚基包含选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸置换:A,G,V,L,I,P,C,M,F,S,D,N,Q,H和K。在一些实施方案中,多肽包含与天然序列相比具有单一突变的全长或截短的志贺菌毒素A亚基,其中置换选自:D置换为A,D置换为G,D置换为V,D置换为L,D置换为I,D置换为F,D置换为S,D置换为Q,E置换为A,E置换为G,E置换为V,E置换为L,E置换为I,E置换为F,E置换为S,E置换为Q,E置换为N,E置换为D,E置换为M,E置换为R,G置换为A,H置换为A,H置换为G,H置换为V,H置换为L,H置换为I,H置换为F,H置换为M,K置换为A,K置换为G,K置换为V,K置换为L,K置换为I,K置换为M,K置换为H,L置换为A,L置换为G,N置换为A,N置换为G,N置换为V,N置换为L,N置换为I,N置换为F,P置换为A,P置换为G,P置换为F,R置换为A,R置换为G,R置换为V,R置换为L,R置换为I,R置换为F,R置换为M,R置换为Q,R置换为S,R置换为K,R置换为H,S置换为A,S置换为G,S置换为V,S置换为L,S置换为I,S置换为F,S置换为M,T置换为A,T置换为G,T置换为V,T置换为L,T置换为I,T置换为F,T置换为M,T置换为S,Y置换为A,Y置换为G,Y置换为V,Y置换为L,Y置换为I,Y置换为F,和Y置换为M。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含与天然氨基酸残基序列相比具有一个或多个突变的全长或截短的志贺菌毒素A亚基,或基本上由其组成,该亚基包含免疫原性残基和/或表位区域内的至少一个氨基酸置换,其中至少一个置换发生在选自以下的天然定位氨基酸群组:SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8;SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的9;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的45;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的53;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的58;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的94;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的110;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的112;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的185;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的187;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198;SEQ ID NO:3的204;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205;SEQ ID NO:3的241;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247;SEQ ID NO:3的247;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248;SEQ ID NO:3的250;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的251;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265;和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含具有免疫原性残基和/或表位区域内的至少一个置换的全长或截短的志贺菌毒素A亚基,或基本上由其组成,其中相对于定位在以下天然位置中之一处的天然氨基酸,至少一个氨基酸置换为非保守氨基酸(例如,参见下表3):SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的4;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的9;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47;SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的56;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的61;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的105;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的154;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的180;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的185;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的187;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的198;SEQ ID NO:3的204;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205;SEQ IDNO:3的241;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247;SEQ IDNO:3的247;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248;SEQ ID NO:3的250;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的251;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265;和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含全长或截短的志贺菌毒素A亚基或基本上由其组成,该亚基具有选自以下的至少一个氨基酸置换:K1置换为A,G,V,L,I,F,M或H;T4置换为A,G,V,L,I,F,M或S;D6置换为A,G,V,L,I,F,S,Q或R;S8置换为A,G,V,I,L,F或M;T8置换为A,G,V,I,L,F或M;T9置换为A,G,V,I,L,F,M或S;S9置换为A,G,V,L,I,F或M;K11置换为A,G,V,L,I,F,M或H;T12置换为A,G,V,I,L,F,M,S或K;S12置换为A,G,V,I,L,F或M;S33置换为A,G,V,L,I,F,M或C;S43置换为A,G,V,L,I,F或M;G44置换为A或L;S45置换为A,G,V,L,I,F或M;T45置换为A,G,V,L,I,F或M;G46置换为A或P;D47置换为A,G,V,L,I,F,S,M或Q;N48置换为A,G,V,L,M或F;L49置换为A,V,C或G;Y49置换为A,G,V,L,I,F,M或T;F50置换为A,G,V,L,I或T;A51置换为V;D53置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;V54置换为A,G,I或L;R55置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;G56置换为A或P;I57置换为A,G,V或M;L57置换为A,V,C,G,M或F;D58置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;P59置换为A,G或F;E60置换为A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,T或R;E61置换为A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M或R;G62置换为A;R84置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;V88置换为A或G;I88置换为A,V,C或G;D94置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;S96置换为A,G,V,I,L,F或M;T104置换为A,G,V,L,I,F,M或N;A105置换为L;T107置换为A,G,V,L,I,F,M或P;S107置换为A,G,V,L,I,F,M或P;L108置换为A,V,C或G;S109置换为A,G,V,I,L,F或M;T109置换为A,G,V,I,L,F,M或S;G110置换为A;S112置换为A,G,V,L,I,F或M;D111置换为A,G,V,L,I,F,S,Q或T;S112置换为A,G,V,L,I,F或M;D141置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;G147置换为A;V154置换为A或G;R179置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;T180置换为A,G,V,L,I,F,M或S;T181置换为A,G,V,L,I,F,M或S;D183置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;D184置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;L185置换为A,G,V或C;S186置换为A,G,V,I,L,F或M;G187置换为A;R188置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;S189置换为A,G,V,I,L,F和M;D197置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;D198置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;R204置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R205置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;C242置换为A,G或V;R247置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;S247置换为A,G,V,I,L,F或M;Y247置换为A,G,V,L,I,F或M;R248置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R250置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R251置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;D264置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;G264置换为A;和T286置换为A,G,V,L,I,F,M或S。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽包含全长或截短的志贺菌毒素A亚基或基本上由其组成,该亚基具有至少一个以下氨基酸置换:K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A或D264A,G264A,T286A和/或T286I。可将这些表位破坏性置换进行组合以形成每个表位区域具有多个置换和/或多个表位区域受破坏同时仍保持志贺菌毒素效应子功能的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽。例如,在可能的情形下,可将天然定位的K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A或D264A,G264A,T286A和/或T286I的置换与天然定位的残基K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A或D264A,G264A,T286A和/或T286I的置换进行组合,以产生本发明的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽。
本文描述的任何去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽亚区和/或表位破坏性突变可以单独使用或组合使用,并且进一步与本发明的CD38结合蛋白的每个单独实施方案(包括它们在本发明方法中的用途)组合使用。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽可以基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺菌毒素A亚基组成。志贺菌毒素A亚基的截短可导致整个表位和/或表位区域、B细胞表位、CD4+T细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失,而不影响志贺菌毒素效应子功能,例如催化活性和细胞毒性。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基末端截短为氨基酸1–251去除两个预测的B细胞表位区域、两个预测的CD4阳性(CD4+)T细胞表位和预测的不连续B细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端截短至75-293去除至少三个预测的B细胞表位区域和三个预测的CD4+T细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端和羧基末端二者截短至75-251缺失至少五个预测的B细胞表位区域;四个推定的CD4+T细胞表位;和一个预测的不连续的B细胞表位。
在一些实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽可以包含全长或截短的志贺菌毒素A亚基或基本上由其组成,该亚基在所提供的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中具有至少一个突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽),例如缺失、插入、倒位或置换。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含含有突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽)的破坏,该突变包括内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内至少一个氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含破坏,其中所述破坏包含在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内至少一个氨基酸残基的插入。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含含有氨基酸残基倒位的破坏,其中至少一个倒位氨基酸残基是在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含含有突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽)的破坏,该突变例如氨基酸置换、氨基酸置换为非标准氨基酸和/或具有化学修饰侧链的氨基酸残基。如本文所述适用于使用的去免疫化的志贺菌毒素效应子亚区的非限制性实例描述于WO2015/113005、WO2015/113007、WO2015/191764、WO2016/196344和WO/187204中。
在其他实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含短于全长志贺菌毒素A亚基的截短的志贺菌毒素A亚基,其中至少一个氨基酸残基在天然定位的B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中被破坏。
为了产生去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽,原则上通过各种方式修饰所提供的表位区域中的任何氨基酸残基可导致表位的破坏,例如相对于野生型志贺菌毒素多肽,代表缺失、插入、倒位、重排、置换和侧链的化学修饰的修饰。然而,修饰某些氨基酸残基和使用某些氨基酸修饰更有可能成功降低抗原性和/或免疫原性,同时保持一定水平的志贺菌毒素效应子功能。例如,末端截短和内部氨基酸置换是优选的,因为这些类型的修饰保持志贺菌毒素效应子多肽中氨基酸残基的总体间距,因此更可能保持志贺菌毒素效应子多肽的结构和功能。
在本发明的一些实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含SLT-1A(SEQID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸75至251或基本上由其组成,其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。在一些其他实施方案中,去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至241或基本上由其组成,其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。实施方案是去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽,其包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至251或基本上由其组成,其中至少一个氨基酸残基在所提供的天然定位的表位区域中被破坏。实施方案是志贺菌毒素效应子多肽,其包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至261,其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。
有许多不同的内部氨基酸置换可用于产生本发明的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽。在表位区域内使用的可能的置换氨基酸中,预测以下置换氨基酸残基最有可能降低表位的抗原性和/或免疫原性:G、D、E、S、T、R、K和H。除了甘氨酸外,这些氨基酸残基都可以归类为极性和/或带电残基。在可能置换的氨基酸中,预计以下氨基酸A,G,V,L,I,P,C,M,F,S,D,N,Q,H和K最有可能降低抗原性和/或免疫原性,同时保留显著水平的志贺菌毒素效应子功能,这取决于所置换的氨基酸。通常,置换应该将极性和/或带电荷的氨基酸残基改变为非极性和不带电荷的残基(参见例如WO2015/113007)。此外,减少氨基酸残基的R基功能性侧链的整体大小和/或长度可能对表位破坏是有益的(参见例如WO2015/113007)。然而,尽管置换的这些通用性最有可能赋予表位破坏,但是由于目的是保留显著的志贺菌毒素效应子功能,因此如果置换氨基酸与所置换的氨基酸相似,则该置换氨基酸更有可能保留志贺菌毒素效应子功能,诸如类似大小的非极性和/或不带电残基置换极性和/或带电残基。
在WO2015/113007中,根据经验测试了许多突变对各种志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白的志贺菌毒素效应子功能的影响。表2总结了WO2015/113007和WO2016/196344中描述的结果,其中氨基酸置换(单独或与一个或多个其他置换组合)不阻止志贺菌毒素效应子功能的强效水平的展示。表2使用WO2016/196344中描述的表位区域编号方案。
表2志贺菌毒素效应子多肽中的氨基酸置换
基于WO2015/113007和WO2016/196344中的经验证据,预测志贺菌毒素A亚基中的某些氨基酸位置耐受表位破坏,同时仍保留显著的志贺菌毒素效应子功能。例如,以下天然位置耐受单独或组合的氨基酸置换,同时保留志贺菌毒素效应子功能例如细胞毒性:SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4;SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9;SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47;SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的48;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的54;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的57;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的61;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94;SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的96;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的105;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108;SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的141;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的154;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的188;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的198;SEQ ID NO:3的204;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205;SEQ ID NO:3的241;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的242;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247;SEQ ID NO:3的247;SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的248;SEQ ID NO:3的250;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251;SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265;和SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的286。
WO2015/113007和WO2016/196344中的经验数据指出其他表位破坏性置换及表位破坏性置换的组合,其可降低志贺菌毒素效应子多肽的抗原性和/或免疫原性同时保留志贺菌毒素效应子多肽展现显著志贺菌毒素效应子功能的能力,诸如上文所提及的截短及耐受置换的位置的新组合以及相关志贺菌毒素A亚基中相同位置或保守位置的新置换。
可以预见,对本文测试的置换的保守官能团的氨基酸残基的其他氨基酸置换可以降低抗原性和/或免疫原性,同时保留显著的志贺菌毒素效应子功能。例如,与以下任何置换类似的技术人员已知的其他置换可破坏内源性表位,同时维持至少一种志贺菌毒素效应子功能:K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A,或D264A,G264A,T286A和/或T286I。特别地,与以下各项类似的针对保守氨基酸残基的氨基酸置换可具有相同或类似效效果:K1A,K1M,T4I,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,N48V,N48F,L49A,A51V,D53A,D53N,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,E60I,E60T,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184F,L185V,S186A,S186F,G187A,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A,D264A,G264A,T286A和T286I。在某些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽可包含与经验测试相似的保守氨基酸置换,例如,K1置换为G,V,L,I,F和H;T4置换为A,G,V,L,F,M和S;S8置换为A,G,V,L,F和M;T9置换为A,G,L,F,M和S;S9置换为A,G,L,I,F和M;K11置换为G,V,L,I,F和M;S33置换为A,G,V,L,F和M;S43置换为A,G,V,L,I,F和M;S45置换为A,G,L,F和M;T45置换为A,G,L,F和M;D47置换为A,V,L,I,F,S和Q;N48置换为A,G,L和M;L49置换为G;Y49置换为A;D53置换为V,L,I,F,S和Q;R55置换为G,I,F,M,Q,S,K和H;D58置换为G,L,I,S和Q;P59置换为G;E60置换为A,G,V,L,F,S,Q,N,D和M;E61置换为G,I,F,S,Q,N,D,M和R;R84置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;V88置换为G;I88置换为G;D94置换为G,V,L,I,F,S和Q;S96置换为A,G,V,L,F和M;T107置换为A,G,V,L,I,F,M和S;S107置换为A,G,V,L,I,F和M;S109置换为A,G,I,L,F和M;T109置换为A,G,I,L,F,M和S;S112置换为A,G,L,I,F和M;D141置换为V,L,I,F,S和Q;V154置换为G;R179置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;T180置换为A,V,L,I,F,M和S;T181置换为A,G,V,L,F,M和S;D183置换为V,L,I,F,S和Q;D184置换为G,V,L,I,S和Q;S186置换为G,V,I,L和M;R188置换为G,V,I,F,M,Q,S,K和H;S189置换为G,V,I,L,F和M;D197置换为V,L,I,F,S和Q;D198置换为A,V,L,I,F,S和Q;R204置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;R205置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;S247置换为A,G,V,I,L,F和M;Y247置换为A,G,V,L,I,F和M;R248置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;R250置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;R251置换为G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H;D264置换为A,G,V,L,I,F,S和Q;和T286置换为A,G,V,L,I,F,M和S。
类似地,去除电荷、极性和/或减少侧链长度的氨基酸置换可以破坏表位同时保持至少一种志贺菌毒素效应子功能。在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽可包含一个或多个通过置换而被破坏的表位,所述置换使得侧链电荷去除、极性去除和/或侧链长度降低,诸如用选自以下A,G,V,L,I,P,C,M,F,S,D,N,Q,H或K的组的适当氨基酸来置换以下位置的氨基酸残基:SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的4;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的6;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的45;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的50;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的54;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的57;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的58;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的84;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的88;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96;SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的104;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的107;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141;SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的147;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154;SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的179;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的184;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185;SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的186;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188;SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的189;SEQ ID NO:3的197;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198;SEQ IDNO:3的204;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205;SEQ ID NO:3的241;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的242;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247;SEQ ID NO:3的247;SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的248;SEQ ID NO:3的250;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251;SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的264;SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265;和SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的286。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽可包含一个或多个以下氨基酸置换:K1置换为A,G,V,L,I,F,M或H;T4置换为A,G,V,L,I,F,M或S;D6置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;S8置换为A,G,V,I,L,F或M;T8置换为A,G,V,I,L,F,M或S;T9置换为A,G,V,I,L,F,M或S;S9置换为A,G,V,L,I,F或M;K11置换为A,G,V,L,I,F,M或H;T12置换为A,G,V,I,L,F,M或S;S33置换为A,G,V,L,I,F或M;S43置换为A,G,V,L,I,F或M;G44置换为A或L;S45置换为A,G,V,L,I,F或M;T45置换为A,G,V,L,I,F或M;G46置换为A或P;D47置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;N48置换为A,G,V,L或M;L49置换为A或G;F50;A51置换为V;D53置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;V54置换为A,G或L;R55置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;G56置换为A或P;I57置换为A,G,M或F;L57置换为A,G,M或F;D58置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;P59置换为A,G或F;E60置换为A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M或R;E61置换为A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M或R;G62置换为A;D94置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;R84置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;V88置换为A或G;I88置换为A,G或V;D94;S96置换为A,G,V,I,L,F或M;T104置换为A,G,V,I,L,F,M或S;A105置换为L;T107置换为A,G,V,I,L,F,M或S;S107置换为A,G,V,L,I,F或M;L108置换为A,G或M;S109置换为A,G,V,I,L,F或M;T109置换为A,G,V,I,L,F,M或S;G110置换为A;D111置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;S112置换为A,G,V,L,I,F或M;D141置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;G147置换为A;V154置换为A或G;R179置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;T180置换为A,G,V,L,I,F,M或S;T181置换为A,G,V,L,I,F,M或S;D183置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;D184置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;L185置换为A,G或V;S186置换为A,G,V,I,L,F或M;G187置换为A;R188置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;S189置换为A,G,V,I,L,F或M;D197置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;D198置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;R204置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R205置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;C242置换为A,G,V或S;S247置换为A,G,V,I,L,F或M;Y247置换为A,G,V,L,I,F或M;R248置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R250置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;R251置换为A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K或H;C262置换为A,G,V或S;D264置换为A,G,V,L,I,F,S或Q;G264置换为A;或T286置换为A,G,V,L,I,F,M或S。
此外,志贺菌毒素效应子多肽的一个表位区域中破坏表位同时保持显著志贺菌毒素效应子功能的任何氨基酸置换可与相同或不同表位中破坏表位同时保持显著志贺菌毒素效应子功能的任何其他氨基酸置换进行组合,以形成多个表位区域受破坏同时仍保持显著水平的志贺菌毒素效应子功能的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽。在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽可以包含两个或更多个上述置换的组合和/或WO2015/113007、WO2016/196344和/或WO2018/140427中描述的置换的组合。
基于WO2015/113007、WO2016/196344和WO2018/140427中描述的工作,预测志贺菌毒素A亚基中的某些氨基酸区域耐受表位破坏,同时仍保留显著的志贺菌毒素效应子功能。例如,天然定位在1–15,39–48,53–66,55–66,94–115,180–190,179–190和243-257的表位区域耐受多个氨基酸置换组合,同时不会损害志贺菌毒素酶活性及细胞毒性。
(v)具有受破坏的弗林蛋白酶切割基序的去免疫化志贺菌毒素
组合志贺菌毒素效应子多肽包含两个或更多个亚区(即非重叠亚区),其中每个亚区包含以下至少一种:(1)内源性表位或表位区域的破坏,和(2)在A1片段衍生区域的羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序。
组合志贺菌毒素效应子多肽的一些实施方案包含以下二者:(1)内源性表位或表位区域的破坏,和(2)在A1片段衍生区域的羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序。据预测,在WO 2015/113007、WO 2016/196344及WO 2018/140427中描述的任何个体的去免疫化志贺菌毒素效应子亚区(例如,参见上表2)通常可与本文所述的、WO 2015/191764中所述的和/或本领域已知的包含受破坏的弗林蛋白酶切割基序的任何志贺菌毒素效应子亚区组合,以产生用作结合蛋白组分的志贺菌毒素效应子多肽。
在组合中,志贺菌毒素效应子多肽可将其各自亚区的特征组合,所述特征是诸如弗林蛋白酶切割基序破坏、一或多个个别表位破坏和/或异源分子货物,并且这些组合有时导致免疫原性与志贺菌毒素效应子多肽的部分地去免疫化的亚区的总和相比协同降低的志贺菌毒素效应子多肽。
去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽,其在某些浓度,不表现出细胞毒性或降低的细胞毒性,例如,包含Y77S、R179A和/或E167D或在超过天然位置240的羧基末端被截短的志贺菌毒素效应子多肽仍可用作去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽,用于将外源物质递送到细胞中。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含:(i)在其志贺菌毒素A1片段区域的羧基末端处破坏的弗林蛋白酶切割基序(参见例如WO2015/191764,特此通过引用明确纳入其全部内容,特别是第[8]、[9]段以及被破坏的基序和包括被破坏的基序的毒素多肽的序列)和(ii)是去免疫化的;参见例如WO2018/140427,段落[80]及以后的“实施方案集#5”,以及段落[81]和[82],其通过引用的方式明确地纳入本文中。
b.其他结构变异
技术人员将认识到,可以对本发明的志贺菌毒素效应物多肽和结合蛋白以及编码任何前者的多核苷酸进行变异,而不减弱它们的生物活性,例如通过维持志贺菌毒素效应子多肽的总体结构和功能,诸如连同一个或多个1)降低抗原性和/或免疫原性潜力的内源性表位破坏和/或2)降低蛋白水解切割的弗林蛋白酶切割基序破坏。例如,一些修饰可以促进表达、促进纯化、改善药代动力学特性和/或改善免疫原性。此类修饰是技术人员众所周知的,并且包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点、将额外氨基酸置于任一末端以创建方便定位的限制性位点或终止密码子,以及将生化亲和标签融合到任一末端以提供方便的检测和/或纯化。改善使用微生物系统(例如原核细胞)所产生的多肽的免疫原性的常见修饰是在产生多肽后去除起始甲硫氨酸残基(其可在诸如细菌宿主系统中的产生期间甲酰化),这是因为例如N-甲酰基甲硫氨酸(fMet)的存在可诱导受试者(诸如人类受试者)中的不期望的免疫反应。
本文还提供在本发明的结合蛋白或本发明的结合蛋白的蛋白质组分的氨基和/或羧基末端包含额外的氨基酸残基,例如表位标签或其他部分的序列。额外的氨基酸残基可用于各种目的,包括例如促进克隆、促进表达、翻译后修饰、促进合成、纯化、促进检测和施用。表位标签和部分的非限制性实例是壳多糖结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、Xa因子切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、多组氨酸标签、ReAsH标签、strep标签、strep标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在一些上述实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白的多肽序列通过引入至多肽区域的一个或多个保守氨基酸置换而变化,只要所有所需的结构特征仍然存在并且志贺菌毒素效应子多肽能够单独或作为结合蛋白的组分展示出任何所需的功能即可。如本文所用,术语“保守置换”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学相似的氨基酸残基置换。实例包括具有相似特征的氨基酸残基的置换,例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸(参见例如表3)。用通常在内源性哺乳动物肽和蛋白质中未发现的残基进行保守置换的实例是用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨乙基半胱氨酸或另一碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于肽和蛋白质中表型沉默置换的进一步信息,参见例如,Bowie J等人,Science 247:1306-10(1990)。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白可包含本文所述的本发明多肽区域的功能片段或变体,其与本文所述的多肽序列相比具有至多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换,只要它包含(1)在志贺菌毒素A1片段衍生区域的羧基末端处的受破坏的弗林蛋白酶切割基序和(2)在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中受破坏的至少一个氨基酸即可,其中该受破坏的氨基酸不与受破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠。由于本发明的志贺菌毒素效应子多肽及结合蛋白的变体是通过改变一个或多个氨基酸残基或缺失或插入一个或多个氨基酸残基(诸如在结合区或志贺菌毒素效应子多肽区内)来改变本文所述多肽从而达成期望性质(诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制效果、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期),因此本发明的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白的变体是在本发明的范围内。本发明的志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白可以进一步带有或不带有信号序列。
因此,在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽包含与天然志贺菌毒素A亚基或其片段(诸如志贺菌毒素A亚基,诸如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3))具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%总体序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成,其中志贺菌毒素效应子多肽具有一种或多种与天然SLT-1A亚基相关的活性,例如靶介导的内化、催化活性和/或细胞毒活性。
在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽具有一个或多个经突变、插入或缺失以增加志贺菌毒素效应子多肽的酶活性的氨基酸残基。在一些实施方案中,志贺菌毒素效应子多肽具有一个或多个经突变或缺失以降低或消除志贺菌毒素效应子多肽的催化和/或细胞毒活性的氨基酸残基。例如,志贺菌毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒活性可能会因突变或截短而减弱或消除。
志贺菌毒素家族成员的A亚基的细胞毒性可以通过突变和/或截短而改变、降低或消除。已显示标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-72(1988);Deresiewicz R等人,Biochemistry 31:3272-80(1992);Deresiewicz R等人,Mol Gen Genet 241:467-73(1993);Ohmura M等人,Microb Pathog 15:169-76(1993);Cao C等人,Microbiol Immunol 38:441-7(1994);Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。谷氨酸-167和精氨酸-170二者的突变消除无细胞核糖体失活测定中的Slt-I A1的酶活性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在使用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一方法中,谷氨酸-167及精氨酸-170二者突变消除了在该表达水平下的Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短测定表明,残基75至268的StxA片段仍保持显著的体外酶活性(HaddadJ等人,JBacteriol 175:4970-8(1993))。含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段通过胞质溶胶中的从头表达展示显著的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达无细胞毒性,这是因为其不能逆向易位至胞质溶胶(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。
志贺菌毒素A亚基中酶活性和/或细胞毒性的最关键残基被定位到以下残基位置:天冬酰胺-75、酪氨酸-77、酪氨酸-114、谷氨酸-167、精氨酸-170、精氨酸-176和色氨酸203(Di R等人,Toxicon 57:525-39(2011))。特别是,含有谷氨酸E167至赖氨酸和精氨酸176至赖氨酸突变的Stx2A双突变构建体完全失活;而Stx1和Stx2中的许多单突变显示细胞毒性降低了10倍。此外,将Stx1A截短至1-239或1-240会降低其细胞毒性,并且类似地,将Stx2A截短为保守的疏水残基会降低其细胞毒性。志贺菌毒素A亚基中用于结合真核生物核糖体和/或真核生物核糖体抑制的最关键残基已被定位到以下残基位置:精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸233等(McCluskey A等人,PLoS One 7:e31191(2012)。然而,某些修饰可能会增加志贺菌毒素效应子多肽所展示的志贺菌毒素功能活性。例如,将Stx1A中的残基位置丙氨酸231突变为谷氨酸增加了Stx1A的体外酶活性(Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。
在一些实施方案中,源自SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的志贺菌毒素效应子多肽具有一个或多个突变的氨基酸残基,所述突变包括位置75的天冬酰胺、位置77的酪氨酸、位置114的酪氨酸、位置167的谷氨酸、位置170的精氨酸、位置176的精氨酸的置换和/或位置203的色氨酸的置换。基于现有技术,本领域技术人员将知晓这种置换的实例,例如位置75的天冬酰胺置换为丙氨酸、位置77的酪氨酸置换为丝氨酸、位置114酪氨酸置换为丝氨酸、位置167的谷氨酸置换为谷氨酸、位置170的精氨酸置换为丙氨酸、位置176的精氨酸置换为赖氨酸,位置203的色氨酸置换为丙氨酸,和/或位置231的丙氨酸置换为谷氨酸。增强或降低志贺菌毒素酶活性和/或细胞毒性的其他突变在本发明的范围内并且可以使用本文公开的众所周知的技术和测定法来确定。
3.连接组分和/或其亚组分的接头
个别的CD38结合区、志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白的组分可以通过本领域众所周知的和/或本文所述的一个或多个接头适当地彼此连接。结合区的个别多肽亚组分,例如重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、CDR和/或ABR区可以通过本领域公知的和/或本文所述的一个或多个接头适当地彼此连接。本发明的蛋白质组分,例如多链结合区,可以通过本领域公知的一个或多个接头适当地彼此连接或与其他多肽组分连接。肽组分(例如,KDEL家族内质网滞留/回收信号基序)可以通过本领域众所周知的一个或多个接头例如蛋白质接头适当地连接到本发明的另一组分。
本文中的“接头”是指将两个蛋白质结构域连接在一起的结构域接头,例如用于scFv和/或其他蛋白质和蛋白质融合结构。通常,有许多合适的接头可以使用,包括传统的肽键,它们通过重组技术产生,允许以足够的长度和灵活性重组连接两个结构域,以允许每个结构域保留其生物学功能。接头肽可主要包括以下氨基酸残基:Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽的长度应足以连接两个分子,使它们相对于彼此呈现正确的构象,从而保持所需的活性。在一些实施方案中,接头的长度为约1至约50个氨基酸。在一些实施方案中,接头的长度为约1至约30个氨基酸。在一个实施方案中,可以使用长度为1至20个氨基酸的接头,在一些实施方案中可以使用约5至约10个氨基酸或8至15个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物,包括例如(GS)n(SEQ ID NO:193)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:194)、(GGGGS)n(SEQ IDNO:195)和(GGGS)n(SEQ IDNO:196),其中n为至少1的整数(且通常为3至4),甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。或者,多种非蛋白质聚合物,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物,可用作接头。其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列,但不是CL/CH1结构域的所有残基;例如,CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头也可以源自免疫球蛋白轻链,例如C或C。接头可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链,包括例如C1、C2、C3、C4、C1、C2、C、C和C。接头序列也可以源自其他蛋白质,例如Ig样蛋白质(例如,TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列和来自其他蛋白质的其他天然序列。尽管可以使用任何合适的接头,但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物,包括例如(GS)n(SEQ ID NO:193)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:194)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:195)和(GGGS)n(SEQ ID NO:196),其中n是至少为1的整数(并且通常为2至3至4至5)。“scFv接头”通常包括这些甘氨酸-丝氨酸聚合物。
合适的接头通常是允许本发明的每个多肽组分以极类似于没有任何接头或其他组分情况下所单独产生的多肽组分的三维结构折叠的那些接头。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺少上述任何一种的接头,例如各种非蛋白质碳链,无论是支链的还是环状的。
合适的接头可以是非蛋白质的,例如,例如化学接头。本领域已知的各种非蛋白质接头可用于将细胞靶向结合区连接至本发明结合蛋白的志贺菌毒素效应子多肽组分,例如通常用于将免疫球蛋白多肽缀合至异源多肽的接头。例如,多肽区域可以使用它们的氨基酸残基和碳水化合物部分的功能侧链连接,例如羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环基。例如,二硫键和硫醚键可用于连接两个或多个多肽。此外,非天然氨基酸残基可以与其他功能性侧链例如酮基一起使用。非蛋白质化学接头的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯、S-(N-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT),N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP),琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC或MCC),磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯,4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯,磺基琥珀酰亚胺-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫基)-甲苯酰胺基)己酸酯,N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰胺基)己酸酯,磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰胺基)己酸酯,马来酰亚胺己酰基(MC),马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、3-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、α-烷基衍生物、磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])、磺基二氯苯酚、2-亚氨基噻吩、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼、埃尔曼试剂、二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。
可选择蛋白质接头以掺入本发明的重组融合结合蛋白中。对于本发明的重组融合细胞靶向蛋白,接头通常包含约1至约50个氨基酸残基。在一些实施方案中,接头可包含约5至30个氨基酸残基。通常,蛋白质接头包含具有极性、不带电荷和/或带电荷残基的大多数氨基酸残基,例如苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。蛋白质接头的非限制性实例包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE,SEQ ID NO:197)、缬氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2至4S)xAM,其中G是甘氨酸,S是丝氨酸,并且x是1到10的整数(SEQ ID NO:198)。
可以基于所需的特性来选择蛋白质接头。技术人员可以根据特定特征选择蛋白质接头,例如与相同结构域自身的活性相比,优化融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解性、药代动力学特性、药效学特性和/或在融合构建体的背景下融合结构域的活性中的一个或多个。例如,可以基于柔性、刚性和/或可切割性来选择蛋白质接头。技术人员在选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。在某些情况下,可以选择某些接头来优化表达。可以选择某些接头来促进相同多肽或蛋白质之间的分子间相互作用以形成同源多聚体,例如同型二聚体。
柔性蛋白质接头通常长度大于12个氨基酸残基并且富含小的非极性氨基酸残基、极性氨基酸残基和/或亲水性氨基酸残基,例如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。可选择柔性蛋白质接头以增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的分子内相互作用。例如,各种“GS”接头是技术人员已知的并且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成,有时呈重复单元,例如(GxS)n(SEQ ID NO:199),(SxG)n(SEQ ID NO:200),(GGGGS)n(SEQ ID NO:195)和(G)n(SEQ ID NO:201),其中x为1至6,并且n为1至30。柔性蛋白质接头的非限制性实例包括GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:202),EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:203),GSTSGSGKSSEGKG(SEQID NO:204),GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:205),GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:206),SRSSG(SEQ ID NO:207)和SGSSC(SEQ ID NO:208)。
刚性蛋白质接头通常是硬性的α-螺旋结构并且富含脯氨酸残基和/或一个或多个策略性放置的脯氨酸。可选择刚性接头以防止连接组分之间的分子内相互作用。
在本发明的CD38结合蛋白的一些实施方案中,可以使用包含一个或多个蛋白酶敏感位点的接头以提供被存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的结合蛋白的一些实施方案中,可使用不可切割的接头以在施用于脊椎动物生物体后减少不期望的毒性。
在本发明的CD38结合蛋白的一些实施方案中,使用本领域技术人员已知的任何数量的方式(包括共价和非共价连接)将CD38结合区连接至志贺菌毒素效应子多肽。
在本发明的CD38结合蛋白的一些实施方案中,分子包含结合区,该结合区是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。有许多本领域已知的适用于该目的的接头,例如15残基(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO:183)。可用于形成非共价同型二聚体结构的合适的scFv接头包括GGGS(SEQ ID NO:185),GGGGS(SEQ ID NO:186),GGGGSGGG(SEQ ID NO:187),GGSGGGG(SEQ ID NO:188),GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO:189)和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO:190)。
用于连接CD38结合蛋白的组分的合适方法可以是本领域目前已知的用于实现此目的的任何方法,只要连接基本上不妨碍结合区的结合能力,志贺菌毒素效应子多肽组分的细胞内化,和/或适当时如通过适当的测定法(包括本文所述的测定法)所测量的期望志贺菌毒素效应子功能即可。
结合蛋白的组分,例如志贺菌毒素A亚基效应子多肽和/或免疫球蛋白型CD38结合区,可以被工程改造以提供用于连接额外组分(例如额外外源性材料)的合适的附接部分(参见WO2018/106895)。
在一些实施方案中,CD38结合蛋白包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、接头和CD38结合结构域,或由其组成。接头可以是蛋白质接头,并且可以包含约1至约50个氨基酸残基。在一些实施方案中,蛋白质接头由1至50个氨基酸残基组成。在一些实施方案中,接头包含SEQ ID NO:70-75中任一项的序列,或与SEQ ID NO:70-75具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,或由其组成。在一些实施方案中,接头包含SEQ ID NO:70的序列,或由其组成。
D.出于本发明的CD38结合蛋白的目的,以下组分的特定顺序或方向不是固定的:除非特别指出,否则志贺菌毒素效应子多肽、结合区和任何任选的接头可相对于彼此或整个结合蛋白变化(例如,参见图1)。本发明的结合蛋白的组分可以以任何顺序排列,条件是结合区和志贺菌毒素效应子多肽的期望活性不被消除。在一些实施方案中,CD38结合蛋白从其N末端到C末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VH-第二接头-VL。在一些实施方案中,CD38结合蛋白从其N-至C-末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VL-第二接头-VH。CD-38结合融合蛋白的有用实施方案
如本领域技术人员将理解的,本发明的CD38结合融合蛋白可以是多种形式,如图1中大体描述的。
在一些实施方案中,如图13所示,可使用接头将野生型志贺菌毒素效应子多肽组分(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所示)连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的任一个CD38靶向部分(在本文中也称为CD38结合区或结构域)。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-D1-1(SEQID NO:47),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-D1(SEQID NO:45),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-D1-2(SEQID NO:47),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-D1-3(SEQID NO:48),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-D1-4(SEQID NO:49),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体1(SEQ ID NO:55),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体2(SEQ ID NO:56),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体3(SEQ ID NO:57),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体4(SEQ ID NO:58),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体5(SEQ ID NO:59),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体6(SEQ ID NO:60),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体7(SEQ ID NO:61),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体8(SEQ ID NO:62),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体9(SEQ ID NO:63),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体10(SEQ ID NO:64),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体11(SEQ ID NO:65),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体12(SEQ ID NO:66),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体13(SEQ ID NO:67),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体14(SEQ ID NO:68),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
在某些实施方案中,如图13所示,志贺菌毒素效应子多肽组分是SLT-1A-结合(combo)变体15(SEQ ID NO:69),其连接至选自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3和CD38TM4的CD38结合结构域。
以下实施方案更详细地描述了说明性CD38结合蛋白(包括CD38结合融合蛋白)的某些结构,所述蛋白靶向在细胞表面物理偶联至CD38的细胞,包括表达CD38的细胞。
如本领域所理解的,本发明的CD38结合融合蛋白至少包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽和CD38结合结构域,以及根据需要具有适当接头。CD38结合域通常包含VH和VL,其在正确缔合时将结合人CD38。
本发明特别有用的CD38结合蛋白包括但不限于CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76),CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77),CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78),CD38结合蛋白#4(SEQID NO:79),CD38结合蛋白#5(SEQ ID NO:80),CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:81)和CD38结合蛋白#7(SEQ ID NO:82)。
在特别有用的实施方案中,本发明的CD38结合蛋白从N端到C端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-接头-VH-接头-VL。在本实施方案中,志贺菌毒素多肽具有SEQ ID NO:46,并且VH和VL选自以下各对:SEQ ID NO:101和105;SEQ ID NO:101和125;SEQ ID NO:109和113以及SEQ ID NO:117和121。
在特别有用的实施方案中,本发明的CD38结合蛋白从N端到C端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-接头-VH-接头-VL。在本实施方案中,志贺菌毒素多肽具有SEQ ID NO:46,并且VH和VL选自以下各对:SEQ ID NO:101和105;SEQ ID NO:101和125;SEQ ID NO:109和113以及SEQ ID NO:117和121。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽和CD38结合结构域。CD38结合融合蛋白还可包含连接志贺菌毒素A亚基效应子多肽和CD38结合结构域的第一接头。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、第一接头、VH和VL。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、第一接头、VH、第二接头和VL。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、VL和VH。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、第一接头、VL和VH。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白从N末端到C末端或从C末端到N末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽、第一接头、VL、第二接头和VH。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含(i)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;(ii)VH,其包含含有SEQ ID NO:34的序列的vHCDR1、含有SEQ ID NO:35的序列的vHCDR2和含有SEQ ID NO:36的序列的vHCDR3;和(iii)VL,其包含含有SEQ ID NO:31的序列的vLCDR1、含有SEQ ID NO:32的序列的vLCDR2和含有SEQ ID NO:33的序列的vLCDR3。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白进一步包含连接(i)志贺菌毒素亚基效应子多肽和(ii)VH或(iii)VL的第一接头。在一些实施方案中,CD38结合蛋白进一步包含连接(ii)VH和(iii)VL的第二接头。在一些实施方案中,第一接头包含SEQ ID NO:70的序列。在一些实施方案中,第二接头包含SEQ ID NO:75的序列。
在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:43的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸同一性的序列。在一些实施方案中,VH包含SEQID NO:44的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸同一性的序列。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:43的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸同一性的序列,并且VH包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,VH包含SEQ ID NO:43的序列,并且VL包含SEQ ID NO:44的序列。
在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:41的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,VH包含SEQ ID NO:44的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:41的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,或由其组成,并且VH包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:41的序列,并且VH包含SEQ ID NO:44的序列或由其组成。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含(i)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;(ii)VH,其包含含有SEQ ID NO:22的序列的vHCDR1、含有SEQ ID NO:23的序列的vHCDR2和含有SEQ ID NO:24的序列的vHCDR3;和(iii)VL,其包含含有SEQ ID NO:19的序列的vLCDR1、含有SEQ ID NO:20的序列的vLCDR2和含有SEQ ID NO:21的序列的vLCDR3。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:37的序列或由其组成,并且VH包含SEQ ID NO:38的序列。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,并且VH包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白进一步包含连接(i)志贺菌毒素亚基效应子多肽和(ii)VH或(iii)VL的第一接头。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白进一步包含连接(ii)VH和(iii)VL的第二接头。
在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含(i)CD38结合蛋白,其包含(i)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;(ii)VH,其包含含有SEQ ID NO:28的序列的vHCDR1、含有SEQ IDNO:29的序列的vHCDR2和含有SEQ ID NO:30的序列的vHCDR3;和(iii)VL,其包含含有SEQID NO:25的序列的vLCDR1、含有SEQ ID NO:26的序列的vLCDR2和含有SEQ ID NO:27的序列的vLCDR3。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:39的序列,并且VH包含SEQ ID NO:40的序列。在一些实施方案中,VL包含SEQ ID NO:39的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,并且VH包含SEQ ID NO:40的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白进一步包含连接(i)志贺菌毒素亚基效应子多肽和(ii)VH或(iii)VL的第一接头。在一些实施方案中,CD38结合蛋白进一步包含连接(ii)VH和(iii)VL的第二接头。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合融合蛋白包含SEQ ID NO:76-82和228-232中任一项所示的多肽。任选地,CD38结合融合蛋白包含氨基末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白与SEQ ID NO:79-82中的任一项具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含SEQ ID NO:79的序列。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含两个相同的多肽,每个多肽包含与SEQ ID NO:79具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白包含两个相同的多肽,每个多肽包含SEQ ID NO:79的序列。在一些实施方案中,CD38结合融合蛋白由两个相同的多肽组成,每个多肽由SEQ ID NO:79的序列组成。
CD38结合融合蛋白的一般功能
本发明的CD38结合蛋白可用于涉及例如以下各项的多种应用中:细胞杀伤;细胞生长抑制;细胞内货物递送;生物信息收集;免疫反应刺激和/或健康状况的补救。在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白靶向CD38(即,是靶向CD38的分子)。本发明的CD38结合蛋白可用作治疗和/或诊断分子,例如作为细胞靶向的细胞毒性治疗分子;细胞靶向的无毒递送运载体;和/或细胞靶向的诊断分子;例如在涉及体内靶向特定CD38表达细胞类型以用于诊断或治疗多种疾病(包括与CD38表达相关的癌症和免疫病症)的应用中。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白能够结合与特定细胞类型的细胞表面缔合的CD38分子的细胞外部分并能够进入这些细胞。一旦内化在所靶向的细胞类型内,本发明的结合蛋白的一些实施方案能够将具有酶活性的、细胞毒性的志贺菌毒素效应子多肽片段按路线发送至靶细胞的胞质溶胶中并最终杀死细胞。或者,本发明结合蛋白的无毒或毒性降低的变体可用于将额外的外源材料递送到CD38阳性靶细胞中。该系统是模块化的,因为任何数量的不同志贺菌毒素效应子多肽可以与CD38结合区缔合以产生具有不同功能特征的本发明结合蛋白的变体,例如,用于涉及向受试者(诸如人受试者)施用CD38结合蛋白的应用的去免疫化效应子及特别地改善体内稳定性的蛋白酶切割敏感性降低的效应子。
E.经由志贺菌毒素A亚基细胞毒性的CD38阳性细胞杀伤
本发明的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白的一些实施方案是细胞毒性的。本发明的CD38结合蛋白的一些实施方案仅由于一种或多种志贺菌毒素效应子多肽组分的存在而具有细胞毒性。志贺菌毒素家族成员的A亚基每个都包含具有酶活性的多肽区域,一旦在真核细胞的胞质溶胶中,该区域就能够杀死真核细胞。因为志贺菌毒素家族的成员适合杀死真核细胞,源自志贺菌毒素的分子(例如包含志贺菌毒素效应子多肽的一些实施方案的CD38结合蛋白)可以展示出强效的细胞杀伤活性。
对于本发明的结合蛋白的一些实施方案,在接触与由结合蛋白的结合区所结合的CD38物理偶联的细胞(例如CD38阳性细胞)时,结合蛋白能够导致细胞死亡。对于一些实施方案,结合蛋白的CD50值小于5、小于2.5、小于1、小于0.5或小于0.25nM,其相比于非靶向的野生型志贺菌毒素效应子多肽(例如SEQ ID NO:1-18)显著更强效。例如,CD38结合蛋白包含SEQ ID NO:76、78-81和228-232中任一项,基本上由其组成,或由其组成,强效地杀死CD38表达细胞,包括表达减毒水平的CD38的细胞(参见下文实施例、表7至表9及图3),例如特征在于约0.1至约0.2nM的CD50值的那些。
对于一些实施方案,结合蛋白的CD50值小于50、小于30、小于20、小于15、小于10、小于5、小于1、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2、小于0.1ng/mL。例如,CD38结合蛋白(其包含SEQ ID NO:76、78-81和228-232中任一项,基本上由其组成,或由其组成)强效地杀死CD38表达细胞,包括表达减毒水平的CD38的细胞(参见下文实施例、表7至表9及图3),例如特征在于约0.05或0.1ng/mL的CD50值的那些。
细胞杀伤可以使用本发明的分子在靶细胞的不同条件下完成,例如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、体外培养的组织样品内的靶细胞,或体内环境中(如多细胞生物体内)的靶细胞。
在一些实施方案中,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白包含(1)去免疫化的志贺菌毒素效应亚区,(2)靠近志贺菌毒素A1片段衍生区域羧基末端的蛋白酶切割抗性区域,(3)羧基末端内质网滞留/回收信号基序;和/或(4)异源分子货物;然而,对于一些实施方案,与包含野生型志贺菌毒素A亚基多肽(例如野生型志贺菌毒素A1片段)的参考分子相比,这些结构修饰不会显著改变志贺菌毒素细胞毒性的效力。因此,去免疫化的、蛋白酶切割抗性的和/或携带分子货物的本发明的志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白可以保持强效的细胞毒性,同时提供一种或多种其他功能或特性。
结合蛋白组分可以选自现有技术或使用技术人员已知的常规方法产生(参见例如WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344,PCT/US2017/065074和WO 2018/106895)。例如,去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应子多肽已先前描述于WO2015/113007、WO2015/191764和WO2016/196344中。包含位点特异性缀合位点的志贺菌毒素效应子多肽和志贺菌毒素效应子骨架先前已在WO2018/106895中描述。
F.细胞类型之间的选择性细胞毒性
本发明的一些CD38结合蛋白在非靶向的旁观者细胞存在下用于选择性杀死特定靶细胞。通过经由细胞靶向结合区将志贺菌毒素效应子多肽靶向递送至特定的CD38阳性细胞,本发明的结合蛋白可以表现出细胞类型特异性的、受限的细胞杀伤活性,从而导致在非靶向细胞存在的情况下排他性或选择性杀死选定的细胞类型。此外,使用本发明的CD38结合蛋白对细胞毒性志贺菌毒素效应子多肽区的细胞靶向递送将细胞毒性组分在非靶向细胞存在下受限地排他性地或选择性地递送至CD38阳性靶细胞。
对于一些实施方案,本发明的结合蛋白在某些浓度下具有细胞毒性。在一些实施方案中,在将本发明的结合蛋白施用于细胞类型的混合物时,与不与任何细胞外CD38物理偶联的细胞类型相比,细胞毒性结合蛋白能够选择性地杀死与结合区所结合的细胞外CD38物理偶联的那些细胞。对于一些实施方案,本发明的细胞毒性结合蛋白能够在两种或更多种不同细胞类型的混合物中选择性地或优先地引起特定细胞类型的死亡。这使得能够将细胞毒活性靶向至相对于不表达靶标生物分子的“旁观者”细胞类型具有高优先性(诸如3倍细胞毒性效果)的特定细胞类型。或者,如果靶标生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不被靶向的细胞类型物理偶联,则结合区的靶标生物分子的表达可不仅限于一种细胞类型。这使得对特定类型细胞的靶向细胞杀死能够相对于不表达显著量的靶标生物分子或不与显著量靶标生物分子物理偶联的“旁观者”细胞类型具有高优先性,诸如3倍细胞毒性效果。
对于一些实施方案,在将细胞毒性结合蛋白施用至两种不同的细胞类型群体时,细胞毒性结合蛋白对于靶标细胞群体能够引起细胞死亡(如通过半数最大细胞毒性浓度(CD50)所定义的),其中所述靶标细胞群体成员表达细胞毒性结合蛋白结合区的细胞外靶标生物分子,引起细胞死亡的剂量较相同细胞毒性结合蛋白对其成员不表达细胞毒性结合蛋白结合区的细胞外靶标生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少三倍。
对于一些实施方案,本发明的结合蛋白对与结合区所结合的细胞外CD38物理偶联的细胞类型群体的细胞毒活性是对不与结合区所结合的任何细胞外CD38物理偶联的细胞类型群体的细胞毒活性的至少3倍。根据本发明,选择性细胞毒性可按照(a)对与结合区所结合的细胞外CD38物理偶联的特定细胞类型的细胞群体的细胞毒性对(b)对不与结合区所结合的任何细胞外CD38物理偶联的细胞类型的细胞群体的细胞毒性的比率(a/b)来定量。在一些实施方案中,细胞毒性比率指示与结合区的靶标生物分子物理偶联的细胞或细胞类型群体的选择性细胞毒性为不与结合区的靶标生物分子物理偶联的细胞或细胞类型群体的至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少750倍或至少1000倍高。
这种优先的细胞杀伤功能允许本发明的某些细胞毒性结合蛋白在各种条件下及在非靶向旁观者细胞存在下将靶细胞杀死,例如离体操作的细胞类型的混合物,具有多种细胞类型混合物的体外培养组织,或在体内在多种细胞类型的存在下(例如原位或在多细胞生物体内的天然位置)。
G.志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白的产生、制造和纯化
本文公开的志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白可以使用本领域技术人员熟知的技术产生。例如,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白可以通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或通过任何其他合适的方法来制造。因此,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白可以多种方式合成,包括(例如)包含以下的方法:(1)使用标准固相或液相方法,逐步或通过片段组装合成结合蛋白的多肽或多肽组分,并分离和纯化最终的多肽化合物产物;(2)在宿主细胞中表达编码本发明结合蛋白的蛋白质或蛋白质组分的多核苷酸,并从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物;或(3)无细胞体外表达编码本发明结合蛋白的多肽或多肽组分的多核苷酸,并回收表达产物;或通过(1)、(2)或(3)的方法的任意组合获得蛋白质组分的片段,随后接合(例如连接)肽或多肽片段以获得多肽组分,并回收多肽组分。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白或本发明的结合蛋白的蛋白质组分可以通过固相或液相肽合成的方式合成。本发明的多肽和结合蛋白可以通过标准合成方法适当地制造。因此,可通过(例如)包含以下的方法来合成肽:通过标准固相或液相方法逐步或通过片段组装来合成肽,并分离和纯化最终肽产物。在此背景中,可参考WO 1998/011125或尤其Fields G等人,Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides,Grant G,ed.,Oxford University Press,U.K.,第2版,2002)及其中的合成实例。
本发明的志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白可以使用本领域公知的重组技术来制备(生产和纯化)。一般而言,通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并从细胞培养物中纯化或回收蛋白质来制备蛋白质的方法描述于例如Sambrook J等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY,U.S.,1989);Dieffenbach C等人,PCR Primer:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,N.Y.,U.S.,1995)中。任何合适的宿主细胞均可用于产生本发明的多肽和/或结合蛋白。宿主细胞可以是用一种或多种驱动本发明多肽表达的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外,本发明的志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白可以通过修饰编码本发明的多肽或结合蛋白的多核苷酸而产生,这导致改变一个或多个氨基酸或缺失或插入一个或多个氨基酸以获得所需的特性,例如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制效果和/或改变的血清半衰期。
可以选择多种表达系统来产生本发明的多肽或CD38结合蛋白。例如,用于表达本发明结合蛋白的宿主生物体包括原核生物,例如大肠杆菌及枯草芽孢杆菌(B.subtilis);真核细胞,诸如酵母及丝状真菌(如啤酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母菌(K.lactis));藻类(如莱茵衣藻(C.reinhardtii));昆虫细胞系;哺乳动物细胞(如CHO细胞);植物细胞系;及真核生物体,诸如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)及本氏烟草(N.Benthamiana))。
因此,本发明还提供了根据上述方法和使用以下各项来产生本发明的志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白的方法:编码部分或全部的本发明多肽或本发明结合蛋白的蛋白质组分的多核苷酸、在引入至宿主细胞中时能够编码部分或全部的本发明的多肽或结合蛋白的包含本发明的至少一种多核苷酸的表达载体,和/或包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中,制备编码CD38结合蛋白的核酸,用于制备本发明的CD38结合蛋白的方法中。在一些实施方案中,制备本发明的CD38结合蛋白的方法包括将宿主细胞与编码CD38结合蛋白的核酸接触。CD38结合蛋白可以通过在表达CD38结合蛋白的条件下培养宿主细胞并回收该蛋白来产生。使用各种宿主细胞生产重组蛋白的培养条件是本领域技术人员已知的。例如,在一些实施方案中,宿主细胞可以在95℃和5%CO2气氛的培养基中维持足以表达蛋白质的时间。
当在宿主细胞或无细胞系统中使用重组技术表达蛋白质时,有利的是将期望的蛋白质与其他组分例如宿主细胞因子分离(或纯化),以获得具有高纯度或基本上均质的制剂。纯化可通过本领域熟知的方法完成,例如离心技术、萃取技术、层析和分馏技术(例如通过凝胶过滤进行尺寸分离、通过离子交换柱进行电荷分离、疏水相互作用层析、反相层析、二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE等)上的层析、层析聚焦和蛋白A琼脂糖层析以去除污染物)和沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。可以使用任何数量的生化纯化技术来增加本发明的多肽和/或结合蛋白的纯度。在一些实施方案中,本发明的多肽和结合蛋白可以任选地以同源多聚体形式(例如包含两种或更多种本发明的多肽或结合蛋白的分子复合物)纯化。
在实施方案中,本文提供的是制备如本文所述的CD38结合蛋白的方法,该方法包括在表达CD38结合蛋白的条件下培养如本文所述的宿主细胞,并回收该蛋白质。在一些实施方案中,该方法包括将CD38结合蛋白与蛋白质L接触。在一些实施方案中,蛋白质L是大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L。在一些实施方案中,蛋白质L是重组产生的。在一些实施方案中,可以使用蛋白质L片段或变体,其中所述片段或变体维持蛋白质L与κ轻链可变结构域(例如,人VκI、VκIII和VκIV亚型)的结合。在一些实施方案中,蛋白质L与树脂缀合。在一些实施方案中,蛋白质L是基质。抗体片段的蛋白质L纯化的实例描述于Royce,BioProcess International 2015;13:6中。
在以下实施例中,描述了用于产生本发明的示例性志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白的方法的非限制性实例,以及产生方法的特定但非限制性方面。
包含CD38结合融合蛋白的药物和/或诊断组合物的生产或制造
本文提供包含本发明的CD38结合蛋白的组合物。在一些实施方案中,CD38结合蛋白可以是二聚体的形式(例如,同型二聚体)。在一些实施方案中,CD38结合蛋白是CD38结合蛋白群体的成员,其中该群体的至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%的CD38结合蛋白是同型二聚体的形式。在一些实施方案中,群体的至少约90%的CD38结合蛋白是同型二聚体的形式。在一些实施方案中,群体的至少约95%的CD38结合蛋白是同型二聚体的形式。
在一些实施方案中,CD38结合蛋白是二聚体的形式(例如,同型二聚体)。在一些实施方案中,CD38结合蛋白是CD38结合蛋白群体的成员,其中该群体基本上不含单体和比二聚体更高阶的多聚体(例如,三聚体、四聚体等)。在一些实施方案中,“基本上不含”单体和比二聚体更高阶的多聚体(例如,三聚体、四聚体等)的群体具有这样的比率:二聚体对单体或比二聚体更高阶的多聚体的比率不超过约2:1至约9:1。在一些实施方案中,该比率为约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1或约9:1。
本发明的任何志贺菌毒素效应子多肽和CD38结合蛋白的药学上可接受的盐或溶剂化物在本发明的范围内。
在本发明的上下文中,术语“溶剂化物”是指在溶质(例如(in casu),根据本发明的蛋白质化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的具有限定的化学计量的复合物。当所讨论的溶剂是水时,这种溶剂化物通常被称为水合物。
本发明的多肽和蛋白质或其盐可以配制成用于储存或施用的药物组合物,其通常在药学上可接受的载体中包含有效量的本发明的分子或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药学载体。用于治疗分子的药学上可接受的载体是药学领域众所周知的,并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro,ed.,1985)中。如本文所用,“药学上可接受的载体”“包括任何和所有生理上可接受的(即相容的)的溶剂、分散介质、包衣剂、抗微生物剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
VIII.多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的多肽和结合蛋白之外,编码本发明的多肽组分和结合蛋白或其功能部分的多核苷酸也包括在本发明的范围内。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”,其各自包括以下一种或多种:脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物、使用核苷酸类似物生成的这些DNA或RNA的类似物及其衍生物、片段和同系物。本发明的多核苷酸可以是单链、双链或三链的。此类多核苷酸被特别公开以包括能够编码示例性蛋白质的所有多核苷酸,例如,考虑到已知在RNA密码子的第三位置可容忍的摆动(wobble),不同RNA密码子编码相同氨基酸(参见Stothard P,Biotechniques 28:1102-4(2000))。
一方面,本发明提供了编码本发明的志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可包括例如编码多肽的核酸序列,该多肽与包含本发明的多肽或结合蛋白的氨基酸序列之一的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更多的同一性。本发明还包括包含多核苷酸,其包含在严格条件下杂交至编码本发明的志贺菌毒素效应子多肽组分和/或结合蛋白或其片段或衍生物的多核苷酸的核苷酸序列或任何此类序列的反义或互补序列。
本发明的分子(例如CD38结合蛋白)的衍生物或类似物尤其包括具有与多核苷酸(或本发明的结合蛋白)基本上同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子,例如相对于相同大小的多核苷酸(或多肽)序列或在与比对序列(其中比对是通过本领域已知的计算机同源性程序进行)相比时具有至少约45%、约50%、约70%、约80%、约95%、约98%或甚至约99%同一性(例如80%-99%的同一性)。说明性程序是使用默认设置的GAP程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for UNIX,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison,WI,U.S.),其使用Smith T,Waterman M,Adv ApplMath 2:482-9(1981)的算法。还包括能够在严格条件下杂交至编码本发明结合蛋白的序列的互补序列的多核苷酸(参见例如Ausubel F等人,Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley&Sons,New York,NY,U.S.,1993))及下文。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以例如在Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,NY,U.S.,Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明另外提供包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。可以使用本领域众所周知的材料和方法将能够编码本发明志贺菌毒素效应子多肽组分和/或结合蛋白的多核苷酸插入已知载体,包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体,以产生表达载体。此类表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如pTxb1和pIVEX2.3)内产生本发明的志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白所必需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的包含特定多核苷酸的表达载体是本领域普通技术人员众所周知的,可以使用常规实验确定,和/或可以购买。
如本文所用,术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目的多肽并且能够在宿主细胞中提供核酸区段表达的多核苷酸片段。表达单元通常包含转录启动子、编码目的多肽的开放阅读框和转录终止子,所有这些都处于可操作的构型中。表达载体包含一个或多个表达单元。因此,在本发明的上下文中,编码包含单个多肽链的本发明志贺菌毒素效应子多肽和/或结合蛋白的表达载体至少包括该单个多肽链的表达单元,而包含例如两个或多个多肽链(例如,一条链包含VL结构域且第二链包含与毒素效应子多肽连接的VH结构域)包括至少两个表达单元,每一表达单元针对该蛋白质的该两条多肽链中的每一个。为了表达本发明的多链结合蛋白,每条多肽链的表达单位也可以分别包含在不同的表达载体上(例如,可利用其中已引入每一多肽链的表达载体的单一宿主细胞来实现表达)。
能够指导多肽和蛋白质瞬时或稳定表达的表达载体是本领域众所周知的。表达载体通常包括但不限于以下一种或多种:异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列,其中每一个都是本领域公知的。可以使用的任选的调控序列、整合序列和有用的标记是本领域已知的。
术语“宿主细胞”是指能够支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞,例如大肠杆菌或真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或哺乳动物细胞)。包含本发明的多核苷酸或能够产生本发明的多肽和/或结合蛋白的宿主细胞系的产生和分离可以使用本领域已知的标准技术来完成。
本发明范围内的志贺菌毒素效应子多肽和/或蛋白质可以是本文所述的多肽和分子的变体或衍生物,其是通过以下方式来产生:通过改变一个或多个氨基酸或缺失或插入一个或多个氨基酸来修饰编码多肽和/或结合蛋白的蛋白质组分的多核苷酸,从而使其更适于实现期望的性质,诸如宿主细胞的更优的表达。
IX.固定在固体基底(substrate)上的分子
本发明的一些实施方案包括固定在固体基底上的本发明的分子(例如本发明的结合蛋白、融合蛋白或多核苷酸)或其任何效应片段。本文公开的固体基底包括但不限于微珠、纳米颗粒、聚合物、基质材料、微阵列、微量滴定板或本领域已知的任何固体表面(参见例如US 7,771,955)。根据这些实施方案,本发明的分子可以使用技术人员已知的技术共价或非共价连接至固体基底,例如珠、颗粒或板(参见例如Jung Y等,Analyst 133:697-701(2008))。本发明的固定化分子可用于使用本领域已知技术的筛选应用(参见例如BradburyA等人,Nat Biotechnol 29:245-54(2011);Sutton C,Br J Pharmacol 166:457-75(2012);Diamante L等人,Protein Eng Des Sel 26:713-24(2013);Houlihan G等人,JImmunol Methods 405:47-56(2014))。
本发明的CD38结合融合蛋白可以固定在其上的固体基底的非限制性实例包括:微珠、纳米颗粒、聚合物、纳米聚合物、纳米管、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠、链霉亲和素包被的珠、反相磁珠、羧基封端珠、肼封端珠、二氧化硅(二氧化硅钠)珠和亚氨基二乙酸(IDA)改性珠、醛改性珠、环氧活化珠、二氨基二丙胺(DADPA)改性珠(含有伯胺表面基团)、可生物降解的聚合物珠、聚苯乙烯基底、氨基-聚苯乙烯颗粒、羧基-聚苯乙烯颗粒、环氧-聚苯乙烯颗粒、二甲氨基-聚苯乙烯颗粒、羟基-聚苯乙烯颗粒、有色颗粒、流式细胞仪颗粒、磺酸盐-聚苯乙烯颗粒、硝化纤维表面、增强硝化纤维膜、尼龙膜、玻璃表面、活化玻璃表面、活化石英表面、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、基于聚丙烯酰胺的基底、聚氯乙烯基底、聚甲基丙烯酸甲酯基底、聚(二甲基硅氧烷)基底和含有能够形成共价键的光反应性物质(诸如氮烯、碳烯和羰自由基)的光聚合物。本发明的CD38结合融合蛋白可以固定在其上的固体基底的其他实例通常用于分子展示系统,例如细胞表面、噬菌体和病毒颗粒。
X.递送装置和试剂盒
在一些实施方案中,本发明涉及一种装置,其包含一种或多种本发明的物质的组合物,例如药物组合物或诊断组合物,用于递送给有需要的受试者。因此,包含一种或多种本发明组合物的递送装置可用于通过包括以下的各种递送方法向受试者施用本发明的物质的组合物:静脉内、皮下、肌内或腹膜内注射;或通过本领域技术人员认可的其他合适方式。
同样在本发明范围内的是试剂盒,其包含至少一种本发明的物质的组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可任选地包含至少一种额外的试剂(例如标准品、标记物等)。试剂盒通常包括标签,表明试剂盒内容物的预期用途。试剂盒可进一步包括试剂和其他工具,用于检测样品或受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞),或用于诊断受试者是否属于对利用本发明的化合物、组合物或相关方法(例如本文所阐述的方法)的治疗策略有反应的群。
XI.使用CD38结合蛋白和/或其药物和/或诊断组合物的方法
一般而言,本发明的目的是提供药理学活性药剂以及包含其的组合物,其可用于预防和/或治疗与CD38过表达相关的疾病或病况,例如某些造血系统癌症,例如多发性骨髓瘤,以及与CD38阳性细胞生长失控相关的其他病况。因此,本发明提供使用本发明的多肽、CD38结合蛋白和药物组合物用于靶向杀死CD38表达细胞、用于将额外外源性材料递送至该CD38靶向细胞中、用于标记靶向细胞的内部、用于收集诊断信息的方法。
特别地,本发明的目的是提供与本领域目前已知的药剂、组合物和/或方法相比具有某些优点的此类药理学活性药剂、组合物和/或方法。因此,本发明提供了使用具有特定蛋白质序列的志贺菌毒素效应子多肽和结合蛋白及其药物组合物的方法。例如,本文所述的任何氨基酸序列可以具体用作结合蛋白的组分,该结合蛋白用于以下方法中或技术人员已知的使用结合蛋白的任何方法中,诸如WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/191764,US20150259428,WO 2016/196344,WO 2017/019623,WO 2018/106895和WO 2018/140427中所描述的各种方法。
本发明提供抑制CD38阳性细胞或CD38阳性细胞群生长的方法,其包括使细胞或细胞群在体外、离体或体内与包含细胞毒性志贺菌毒素效应子多肽的CD38结合蛋白或包含本发明的CD38细胞结合蛋白的药物组合物接触的步骤。本发明还提供了杀死CD38阳性细胞的方法,包括使细胞在体外、离体或体内与包含细胞毒性志贺菌毒素效应子多肽的CD38结合蛋白或包含本发明的CD38细胞结合蛋白的药物组合物接触的步骤。本发明的志贺菌CD38结合蛋白和药物组合物可用于在一个或多个细胞与所要求保护的物质的组合物之一接触后杀死表达CD38的细胞类型。在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白或药物组合物可用于杀死不同细胞类型混合物中的CD38过表达细胞类型。在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白或药物组合物可用于杀死不同细胞类型混合物中的CD38阳性造血系统癌细胞,例如骨髓瘤细胞。本领域技术人员可以使用本领域熟知的多种方法中的一种或多种确定CD38结合蛋白的治疗浓度或剂量。
在一些实施方案中,本发明的某些CD38结合蛋白和药物组合物在体外、离体或体内施用于需要此治疗的受试者(例如人受试者)的细胞群体时可显示强效的细胞杀伤活性。通过靶向使用高亲和力结合区域的具有酶活性的志贺菌毒素A亚基效应子多肽至特定的CD38表达细胞类型的递送,细胞杀伤活性可以被限制为特异性和选择性地杀死生物体内那些CD38表达细胞。
本发明提供杀死有需要的受试者的CD38阳性血液癌细胞的方法,该方法包括向受试者施用至少一种本发明的CD38结合蛋白或其药物组合物的步骤。在一些实施方案中,受试者之前未接受过基于CD38的疗法,例如抗CD38抗体(例如,达雷木单抗)。在一些实施方案中,受试者具有免疫能力。在一些实施方案中,受试者免疫功能不全。在一些实施方案中,受试者之前未接受过自体干细胞移植。
在一些实施方案中,受试者在施用CTM#4之前先前已经接受过一种或多种基于CD38的疗法,例如抗CD38抗体(例如,达雷木单抗)。在一些实施方案中,除了CTM#4之外,该方法进一步包括施用基于CD38的疗法,例如抗CD38抗体(例如,达雷木单抗)。
在一些实施方案中,受试者患有多发性骨髓瘤并且CD38结合蛋白是施用至受试者的第一治疗。在一些实施方案中,受试者患有多发性骨髓瘤并且在另一治疗之后或同时施用CD38结合蛋白。
在一些实施方案中,本发明的CD38结合蛋白或其药物组合物可用于通过靶向与癌细胞物理偶联的细胞外CD38来杀死受试者中的癌细胞。术语“癌细胞”或“癌的细胞”是指以异常加速和/或不受调节的方式生长和分裂的各种赘生性细胞,并且对技术人员来说是清楚的。可受益于本发明的方法和组合物的CD38阳性造血系统癌(恶性或非恶性)对技术人员来说是清楚的。赘生性细胞通常与以下一种或多种相关:不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵袭、血管生成和转移。
利用本发明的CD38结合蛋白或其药物组合物用于从由受试者移除的分离细胞群体中离体消耗CD38阳性血细胞(例如T细胞和/或B细胞)在本发明的范围内。
施用“有效剂量”的本发明组合物可导致降低疾病症状的严重程度、增加无疾病症状时期的频率和持续时间,或预防由于疾病折磨所致的损伤或失能。本发明组合物的有效量将取决于施用途径、被治疗的生物体的类型和所考虑的特定受试者的身体特征。这些因素及其与确定该量的关系是医学领域的熟练从业者所熟知的。该量和施用方法可以定制以实现最佳功效,并且可以取决于诸如体重、饮食、同时用药等因素和医学领域技术人员公知的其他因素。最适合人类使用的剂量大小和给药方案可由本发明获得的结果进行指导,并可在适当设计的临床试验中得到确认。有效剂量和治疗方案可以通过常规方法确定,在实验室动物中从低剂量开始,然后在监测效果的同时增加剂量,并系统地改变剂量方案。在确定给定受试者的最佳剂量时,临床医生可以考虑许多因素。可以由熟练的医疗保健专业人员根据需要选择和重新调整剂量,以最大化特定受试者的治疗益处。这样的考虑是技术人员已知的。
在一些实施方案中,本发明提供了治疗血液癌的方法,包括向有需要的受试者施用CD38结合蛋白或包含其的组合物。在一些实施方案中,本发明提供了治疗血液癌的方法,包括向有需要的受试者施用有效量的CD38结合蛋白或包含其的组合物。血液癌可以是例如多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性髓细胞样白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、慢性髓细胞样白血病(CML)。在一些实施方案中,血液癌是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中,骨髓瘤是复发性或难治性的。
在一些实施方案中,本发明提供了治疗与多发性骨髓瘤相关的病况的方法,包括向有需要的受试者施用CD38结合蛋白或包含其的组合物。在一些实施方案中,本发明提供了治疗与多发性骨髓瘤相关的病况的方法,包括向有需要的受试者施用有效量的CD38结合蛋白或包含其的组合物。
在一些实施方案中,本发明提供了治疗黑色素瘤的方法,包括向有需要的受试者施用CD38结合蛋白或包含其的组合物。在一些实施方案中,本发明提供了治疗黑色素瘤的方法,包括向有需要的受试者施用有效量的CD38结合蛋白或包含其的组合物。
在一些实施方案中,本方法不包括将自体干细胞移植到受试者中。
可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种,通过一种或多种合适的施用途径来施用本发明的药物组合物。本领域技术人员将理解,施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。可接受的施用途径可以指本领域已知的任何施用途径,其可由临床医师结合预期治疗或诊断用途加以考虑,例如通过肠胃外施用,这通常与在预期作用部位处的注射或与预期作用部位的连通相关(例如静脉内施用)。
本发明的药物组合物通常会在多种情况下施用于相同的受试者。基于调控受试者的血液水平或其他标记物,单次剂量之间的间隔可变化且可以规律或不规律的周期进行。
在一些实施方案中,本发明提供用于治疗哺乳动物受试者例如人类受试者中与CD38过表达相关的血细胞癌的方法,该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的细胞毒性CD38结合蛋白或药物组合物。在一些实施方案中,血细胞癌是多发性骨髓瘤(MM)。
H.CD38结合融合蛋白的制剂
本发明提供了用于药物组合物中的CD38结合蛋白,其用于治疗或预防癌症和/或下文进一步详细描述的与CD38过表达相关的病况、疾病或症状(例如血液癌,包括CD38阳性细胞的造血系统癌,如多发性骨髓瘤)。根据本发明,本发明提供了药物组合物,其包含本发明的CD38结合蛋白或其药学上可接受的盐或溶剂化物,以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中,本发明的药物组合物可包含本发明结合蛋白的同型二聚体形式。就根据本发明的药物组合物的用途而言,每种这样的疾病、病况、病症或症状被设想为单独的实施方案。本发明还提供用于根据本发明的至少一种治疗方法中的药物组合物,如下文所更详细描述的。
如本文所用,术语“受试者”是指任何生物体,通常是哺乳动物受试者,例如人和动物。术语“受试者”和“患者”可互换使用。在一些实施方案中,受试者可以是哺乳动物,例如灵长类动物(例如人或非人灵长类动物)、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、宠物(例如猫、狗等)和实验室动物(例如小鼠、兔、大鼠等)。在一些实施方案中,受试者可能表现出与CD38细胞过表达相关的至少一种病况的症状、体征和/或指征。
如本文所用,术语“治疗”及其语法变体与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。在一些实施方案中,这些术语可以指用于获得有益的或期望的临床结果的方法。该术语可指减缓病况、病症或疾病的发作或发展速度,减轻或缓和与其相关的症状,产生病况的完全或部分消退,或上述任意的一些组合。出于本发明的目的,有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻或缓和、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解,以及缓解(无论是部分还是全部),无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指相对于不接受治疗的情形下的预期存活时间延长存活。因此,需要治疗的受试者(例如人)可以是已经患有所讨论的疾病或病症的受试者。术语“治疗”包括包括相对于不存在治疗的情形,抑制或降低病理状态或症状的严重程度的增加,并不一定意味着相关疾病或病况的完全终止。
如本文所用,术语“预防”及其语法变体是指用于预防病况或疾病的发展或改变其病理学的方法。因此,“预防”可以指预防性(prophylactic)或预防的(preventive)措施。出于本发明的目的,有益的或期望的临床结果包括但不限于预防或减缓疾病的症状、进展或发展,无论是可检测的还是不可检测的。因此,需要预防的受试者(例如人)可以是尚未患有所讨论的疾病或病症的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情形减缓疾病的发作,并不一定意味着对相关疾病、病症或病况的永久预防。因此,病况的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”在某些上下文中指降低发展病况的风险或预防或延迟与病况相关的症状的发展。
如本文所用,“有效量”是有效治疗和/或预防如本文所公开的疾病、病症或病况的量。在一些实施方案中,有效量是在受试者中产生至少一种所需治疗效果的组合物(例如治疗组合物、化合物或药剂)的量或剂量,例如预防或治疗目标病况或有益地减轻与病况相关的症状。最理想的有效量是本领域技术人员为需要其的给定受试者选择的产生特定治疗的期望功效的量。该量将根据技术人员理解的多种因素而变化,包括但不限于治疗组合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、总体身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质,以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定有效量,即通过监测受试者对组合物施用的反应并相应地调整剂量来进行(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A,ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA,U.S.,19th ed.,1995))。
在一些实施方案中,本文所述的CD38结合蛋白旨在用于静脉内输注。在一些实施方案中,CD38结合蛋白在含有低温保护剂和表面活性剂的水性缓冲溶液中配制。在一些实施方案中,将本文所述的CD38结合蛋白配制在含有蔗糖作为低温保护剂和聚山梨醇酯80作为表面活性剂且pH在4.8-5.2范围内的水性柠檬酸钠缓冲液中。在一些实施方案中,将CD38结合蛋白配制在包含约1mM至约100mM柠檬酸钠的溶液中。在一些实施方案中,将CD38结合蛋白配制在包含约1mM至约300mM蔗糖的溶液中。在一些实施方案中,将CD38结合蛋白配制在包含约0.01%至约0.15%聚山梨醇酯80的水溶液的溶液中。在一些实施方案中,所述水溶液的pH范围为约4.3至约5.5。在一些实施方案中,组合物包含约20mM柠檬酸钠、约200mM蔗糖和约0.02%聚山梨醇酯80的水溶液,其中该水溶液的pH范围为约4.8至约5。在一些实施方案中,本文所述的CD38结合蛋白配制于含有200mM蔗糖及0.02%(体积/体积)聚山梨醇酯80的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中。示例性制剂列出如下:
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型呈现,并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。在这种形式中,组合物被分成含有适量活性成分的单位剂量。组合物可被配制用于任何合适的施用途径和方式。
在一些实施方案中,药物组合物包含:(i)CD38结合蛋白,其包含:(A)细胞毒性志贺菌毒素A亚基效应子多肽;(B)能够特异性结合人CD38的细胞外部分的结合区,其中所述结合区包含:(a)免疫球蛋白轻链可变区,其包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1;含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2;和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3;(b)免疫球蛋白重链可变区,其包含:含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1;含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3;以及(ii)药学上可接受的载体、赋形剂或缓冲剂。
本发明的诊断组合物包含本发明的CD38结合蛋白和一种或多种检测促进剂。当生产或制造本发明的诊断组合物时,本发明的结合蛋白可以与一种或多种检测促进剂直接或间接连接。有许多技术人员已知的标准技术用于将各种检测促进剂掺入、固定和/或缀合至蛋白质或分子的蛋白质组分,尤其是缀合至免疫球蛋白和免疫球蛋白衍生结构域。
有许多技术人员已知的检测促进剂,例如同位素、染料、比色剂、对比增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂,它们可以可操作地连接至本发明的多肽或结合蛋白用于信息收集方法,例如用于生物体疾病或病况的诊断和/或预后应用(参见例如Cai W等人,J NuclMed 48:304-10(2007);Nayak T,Brechbiel M,Bioconjug Chem 20:825-41(2009);Paudyal P等人,Oncol Rep 22:115-9(2009);Qiao J等人,PLoS ONE 6:e18103(2011);Sano K等人,Breast Cancer Res 14:R61(2012))。试剂的掺入方式使得能够在筛选、测定、诊断程序和/或成像技术中检测诊断组合物的存在。
类似地,有许多技术人员已知的成像方法,例如医学领域中常用的非侵入性体内成像技术,例如:计算机断层扫描成像(CT扫描)、光学成像(包括直接、荧光和生物发光成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、超声和X射线计算机断层扫描成像。
1.CTM#4的给药
在一些实施方案中,有效量是第一有效量并且本发明的方法进一步包括向受试者施用第二有效量。在一些实施方案中,第二有效量是后续剂量。在一些实施方案中,CTM#4的起始剂量为约665μg/kg体重,且后续剂量为约831μg/kg体重。在一些实施方案中,起始剂量为约831μg/kg体重,且后续剂量为约1039μg/kg体重。在一些实施方案中,起始剂量为约1039μg/kg体重,且后续剂量为约1299μg/kg体重。在一些实施方案中,起始剂量为约1299μg/kg体重,且后续剂量为约1624μg/kg体重。
在一些实施方案中,每周一次向受试者施用50μg/kg的CTM#4 CD38结合融合蛋白。例如,可向受试者施用CTM#4 CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向受试者施用100μg/kg的CTM#4 CD38靶向分子。例如,可向受试者施用CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向受试者施用200μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。例如,可向受试者施用CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向受试者施用335μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。例如,可向受试者施用CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向患者施用500μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。例如,可向受试者施用CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向患者施用550μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。例如,可向受试者施用CTM#4 CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每周一次向受试者施用665μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。例如,可向受试者施用CD38结合蛋白持续1、2、3、4周或更长时间。在一些实施方案中,CD38分子在第1、8、15和/或22天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用50μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用100μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用200μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用335μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用500μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用550μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
在一些实施方案中,每隔一周向受试者施用665μg/kg的CTM#4 CD38结合蛋白。在一些实施方案中,CTM#4 CD38分子在第1和15天施用至受试者。
2.治疗血液癌(包括多发性骨髓瘤)的方法
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括以50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、335μg/kg、500μg/kg或665μg/kg受试者体重的量向需要其的受试者施用CTM#4 CD38结合蛋白。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以50μg/kg受试者体重的量向需要其的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以100μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以200μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以335μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以500μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以550μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CTM#4CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,治疗CTM#4血液癌(例如,多发性骨髓瘤)的方法包括在第1天、第8天、第15天及第22天中的每一天以665μg/kg受试者体重的量向有需要的受试者施用CD38结合蛋白,其中第8天比第1天晚一周;第15天比第8天晚一周;且第22天比第15天晚一周。
在一些实施方案中,本发明提供治疗人类受试者(通常确诊为MM)的CTM#4方法,其是通过施用CTM#4细胞毒性CD38结合蛋白或包含本文所述的CTM#4细胞毒性CD38结合融合蛋白的药物组合物来进行的。
在一些实施方案中,受试者是成人患者(例如,大于或等于18岁)。在一些实施方案中,受试者是少年受试者(例如,小于18岁)。在一些实施方案中,受试者是男性。在一些实施方案中,受试者是女性。在一些实施方案中,受试者具有多发性骨髓瘤的确诊诊断。
在一些实施方案中,受试者患有复发性或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)。在一些实施方案中,RRMM人类受试者用已知赋予RRMM患者临床益处的可用疗法治疗失败、对所述可用疗法不耐受或不是其候选者。
在一些实施方案中,RRMM受试者已经接受至少三种先前系列的MM疗法,并且对至少一种基于蛋白酶体抑制剂(PI)的疗法、至少一种基于免疫调节药物(IMiD)的疗法以及任选的至少一种基于类固醇的疗法是难治性的或不耐受的。先前系列的MM疗法可以包括一种或多种抗CD38疗法,包括但不限于达雷木单抗。
在一些实施方案中,RRMM受试者已接受至少三种先前系列的MM疗法(包括达雷木单抗),并且对达雷木单抗、至少一种基于蛋白酶体抑制剂(PI)的疗法、至少一种基于免疫调节药物(IMiD)的疗法以及任选地至少一种基于类固醇的疗法是复发性的或难治性的。
在一些实施方案中,RRMM受试者已经接受至少三种先前系列的MM疗法,并且对至少一种基于蛋白酶体抑制剂(PI)的疗法、至少一种基于免疫调节药物(IMiD)的疗法以及任选的至少一种基于类固醇的疗法是难治性的。先前系列的MM疗法不包括任何抗CD38疗法。
在一些实施方案中,RRMM受试者已接受至少两种先前系列的MM疗法(如果这两个系列之一包括基于PI的疗法和基于IMiD的疗法的组合),并且该受试者对至少一种基于PI的疗法、至少一种基于IMiD的疗法及任选地至少一种基于类固醇的疗法是难治性的。一种或多种先前系列的MM疗法可以包括抗CD38疗法,包括但不限于达雷木单抗。
在一些实施方案中,RRMM受试者已接受至少两种先前系列的MM疗法,其中这两个系列之一包括基于PI的疗法和基于IMiD的疗法的组合,并且另一系列包括达雷木单抗,并且受试者对达雷木单抗、至少一种基于PI的疗法、至少一种基于IMiD的疗法和任选的至少一种基于类固醇的疗法是复发性的或难治性的。
在一些实施方案中,RRMM受试者已接受至少两种先前系列的MM疗法(如果这两个系列之一包括基于PI的疗法和基于IMiD的疗法的组合),并且该受试者对至少一种基于PI的疗法、至少一种基于IMiD的疗法及任选地至少一种基于类固醇的疗法是难治性的。先前系列的MM疗法不包括任何抗CD38疗法。
在一些实施方案中,RRMM受试者已接受先前系列的抗CD38疗法,包括但不限于达雷木单抗,并且该受试者在用本文描述的CTM#4 CD38结合蛋白治疗期间的任何时间均对抗CD38疗法是复发性的或难治性的。
在一些实施方案中,受试者没有接受任何先前系列的MM疗法。在一些实施方案中,受试者没有接受任何先前的基于抗CD38的疗法。
在一些实施方案中,RRMM受试者包含以下标准中的至少一种,包括在血清蛋白电泳(SPEP)上的血清中M蛋白浓度>=500mg/dL(>=5g/L);在尿蛋白电泳(UPEP)上的尿中M蛋白浓度>=200mg/24h;和如果血清FLC比率异常,则通过血清FLC测定法所测量的相关游离轻链(FLC)水平>=10mg/dL(>=100毫克/升[mg/L])。
在一些实施方案中,RRMM受试者的东部肿瘤协作组(Eastern CooperativeOncology Group)(ECOG)性能状态评分为0或1。
在一些实施方案中,RRMM受试者在筛选心电图(ECG)上具有由弗雷德里克(Fridericia)方法校正的正常QT间隔(QTcF),其定义为在男性中QTcF<=450毫秒(ms)或在女性中<=470ms。
在一些实施方案中,RRMM受试者满足或基本上满足以下临床实验室标准,包括总胆红素<=1.5*正常范围的上限(ULN),患有吉尔伯特综合征(Gilbert’s syndrome)的参与者除外,在该参与者中直接胆红素必须<2.0*ULN;血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)<=2.5*ULN;使用肾脏疾病饮食修正(MDRD)方程式,估计肾小球滤过率(eGFR)>=30毫升/分钟(mL/min/1.73平方米[m^2],;绝对中性粒细胞计数(ANC)>=750/立方毫米(/mm^3)(>=1.0*10^9/升[/L]);血小板计数>=50,000/mm^3(>=75*10^9/L);血红蛋白>=7.5g/dL。
在一些实施方案中,RRMM受试者不具有以下病况中的一种或多种,包括(1)多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变(POEMS)综合征、意义未知的单克隆丙种球蛋白病、郁积型(smoldering)骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、淀粉样变性、巨球蛋白血症或免疫球蛋白M(IgM)骨髓瘤;(2)NCI CTCAE等级>=3的感觉或运动神经病变;(3)以下任何治疗/程序(包括骨髓瘤特异性疗法)的最终剂量,包括在14天内的PI及IMiD、在7天内的对骨髓瘤的皮质类固醇疗法、在14天内的对局部骨病变的放射疗法、在30天内的大手术、在90天内的自体干细胞移植;(4)已接受同种异体干细胞移植或器官移植;(5)未从先前骨髓瘤治疗或程序(化学疗法、免疫疗法、放射疗法)的不良反应(不包括脱发)中恢复至NCI CTCAE V5等级<=1或基线;(6)MM中枢神经系统(CNS)累及的临床体征;(7)任何器官的已知或疑似轻链淀粉样变性(骨髓活检中存在淀粉样蛋白而没有淀粉样变性的其他证据是可以接受的);(8)充血性心力衰竭(纽约心脏协会)等级>=II或左心室射血分数(LVEF<40%,心肌病变,活动性缺血,或任何其他不受控制的心脏病,(诸如过去6个月内的心绞痛或心肌梗塞),需要治疗(包括抗凝剂)的临床显著心律失常,或临床显著不受控的高血压;(9)需要全身性治疗的慢性或活动性感染,以及尚未完全治愈的症状性病毒感染史(例如,人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙型或丙型病毒性肝炎);(10)输注任何单克隆抗体或嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法后的全身炎症反应综合征(SIRS)/细胞因子释放综合征(CRS)反应史;和(11)需要使用剂量大于每天10毫克(mg/天)的泼尼松或等效物的全身性皮质类固醇的慢性病况。在一些实施方案中,受试者没有显著的胸膜积液或心包积液史。在一些实施方案中,受试者没有对卡那霉素或其他氨基糖苷类的超敏反应史或严重毒性反应史。
在一些实施方案中,本文所述的受试者每周一次或两次每千克体重静脉内输注1μg至1500μg的CD38结合蛋白达连续3周或更多周,诸如达4周、5周或6周。示例性剂量包括每千克体重50,100,200,335,500,550和665μg的CD38结合蛋白。示例性施用方案包括在第1、8、15和28天每周一次,持续4周;或在第1天和第15天,每两周一次,持续4周。
在本发明方法的一些实施方案中,被治疗的癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
VIII.实施例
以下实施例描述了本发明的示例性CD38结合蛋白,其包含(1)免疫球蛋白型CD38结合区;(2)去免疫化和弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素A亚基效应子多肽。说明性结合蛋白的每个CD38结合区都表现出与物理偶联到一种或多种特定细胞类型表面的人CD38靶分子的细胞外部分的高亲和力结合。说明性结合蛋白的每个志贺菌毒素A亚基效应子多肽表现出导致真核核糖体抑制的催化活性。本发明的这些说明性结合蛋白结合至由靶细胞表达且与细胞表面缔合的CD38,且随后通过内化进入靶细胞。然后,内化的结合蛋白有效地将志贺菌毒素A亚基效应子多肽组分按路线发送至胞质溶胶且由于志贺菌毒素效应子的催化活性而直接经由核糖体抑制杀死靶细胞。说明性的CD38结合蛋白能够在抗CD38抗体达雷木单抗的存在下杀死表达CD38的细胞。
A.实施例1包含去免疫化和弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素A亚基衍生多肽的CD38结合蛋白
产生并测试结合蛋白:该结合蛋白各自包含1)结合人CD38的细胞靶向结合区,和2)弗林蛋白酶切割抗性的去免疫化的志贺菌毒素效应子多肽。以前,志贺菌毒素A亚基衍生的结合蛋白已被构建并显示促进细胞内化以及其志贺菌毒素效应子多肽组分至胞质溶胶的直接细胞内按路线发送(参见例如WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344,PCT/US2017/065074和WO 2018/106895)。在本实施例中,创建了靶向细胞表面CD38的结合蛋白。如下所示,这些CD38结合蛋白在外源施用后能够特异性结合并杀死表达CD38的人类癌细胞。
1.说明性CD38结合蛋白的构建
使用本领域已知的技术,产生了说明性的CD38结合蛋白,其包含1)去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素A亚基效应子多肽,和2)由蛋白质性接头隔开的CD38结合免疫球蛋白衍生多肽(例如,参见图1A至图1B)。构建所得的细胞靶向融合蛋白,使得每个都包含连续多肽,该连续多肽包含融合至去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素A亚基效应子多肽的CD38结合免疫球蛋白衍生多肽。
在该实施例中,结合蛋白的所有志贺菌毒素效应子多肽组分源自SLT-1A(SEQ IDNO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-251,以及它们中的某些含有相对于野生型志贺菌毒素A亚基的两个或更多个氨基酸残基置换,例如去免疫化置换和/或弗林蛋白酶切割基序破坏置换(参见例如WO2015/113007、WO2015/191764和WO2016/196344)或插入三个氨基酸残基以帮助纯化。结合蛋白的说明性志贺菌毒素效应子多肽组分在SEQ ID NO:45-69中提供。对于每个说明性的CD38结合蛋白,将志贺菌毒素效应子多肽使用蛋白质接头连接到CD38结合区。
在多种功效和安全模型中筛选与去免疫化的志贺菌毒素效应子融合的CD38靶向抗体文库以鉴定候选物。首先,构建了超过50种不同的CD38结合蛋白,并筛选了体外对CD38阳性骨髓瘤和淋巴瘤细胞的靶向细胞毒性。本实施例的实验中测试的所有结合蛋白均在细菌系统中产生并使用技术人员已知的技术通过柱层析纯化,例如经由几丁质结合标签的内含肽介导的纯化(参见例如WO2016/126950的实施例1),在结合蛋白中使用多组氨酸标签,和/或使用由结合蛋白中免疫球蛋白结构域结合的细菌蛋白质,例如,使用细菌蛋白,例如蛋白质A或蛋白质L。
在该实施例中产生和测试的说明性结合蛋白包括CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76,图25A)、CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77,图25B)、CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78,图25C)、CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79、图25D)、CD38结合蛋白#5(SEQ ID NO:80)和CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:81)。
最初,产生了源自二十五组抗CD38抗体可变结构域序列的五十种CD38结合蛋白。对于每种抗CD38抗体,产生了单链可变片段(scFv),其中抗体的CD38结合结构域可变区以两个方向之一排列,即轻链(VL)更靠近氨基末端(VL-VH)或重链(VH)更靠近氨基末端(VH-VL)。将scFv与去免疫化的志贺菌毒素A亚基效应子多肽融合,以产生超过50种不同的CD38结合蛋白,用于筛选、分析和比较。每一种CD38结合蛋白包含至少一个单链可变片段作为潜在的CD38结合区。
五十种CD38结合蛋白在大肠杆菌中产生,具有内含肽-几丁质结合结构域(CBD)标签,然后用几丁质亲和和二硫苏糖醇(DTT)洗脱进行纯化(如先前在WO2016/126950中所述)。针对对CD38阳性细胞的细胞毒性筛选所得的CD38结合蛋白。本文中称为CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的参考分子也用于评估筛选结果,例如通过设置细胞毒性效力基准。
2.II.筛选CD38结合蛋白对CD38阳性细胞的细胞毒性
使用基于组织培养细胞的毒性测定来测量说明性结合蛋白的细胞毒活性。对于某些结合蛋白,确定杀死同质细胞群体中一半细胞的外源性施用结合蛋白的浓度(半数最大细胞毒性浓度)。使用细胞杀伤测定测试说明性结合蛋白的细胞毒性,该测定涉及关于每一结合蛋白结合区的靶标生物分子的靶标生物分子阳性或靶标生物分子阴性细胞。
本实施例中使用的某些表达CD38的靶细胞(MOLP-8,H929,ST486,Daudi,ANBL6,MM.1S,LP-1和RPMI8226)是可从ATCC(Manassas VA,U.S.)或DSMZ(The Leibniz DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulture)(Braunschweig,DE))获得的永生化肿瘤细胞。
细胞杀伤测定如下进行。将人肿瘤细胞系细胞接种在384孔板中的20μL细胞培养基中(通常每孔2x103个细胞)。在适当的缓冲液中制备一系列(通常为10倍稀释)待测蛋白质,并将5μL稀释液或仅缓冲液作为阴性对照加入细胞中。仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。细胞样品与蛋白质或仅缓冲液在37℃和5%二氧化碳(CO2)的气氛中孵育2到3天。使用GellTiter-发光细胞成活力测定2.0(G924A Promega Madison,WI,U.S.),根据制造商的说明,以相对光单位(RLU)为单位,使用发光读数确定总细胞存活率或成活力百分比。
使用以下等式计算实验孔的成活力百分比:(测试RLU-平均培养基RLU)÷(平均细胞RLU-平均培养基RLU)×100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中对对数蛋白质浓度对成活力百分比进行绘图,且使用对数(抑制剂)对反应(3参数)分析来确定所测试蛋白质的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。在可能的情况下计算测试的每个说明性细胞靶向蛋白的CD50值。当不能基于所测试浓度的曲线形状计算CD50值时,则将最大CD50值记录为超出最大测试值。在一些实验中,与仅缓冲液的对照相比,用最大浓度的结合蛋白处理的生物分子靶标阴性细胞在成活力方面没有表现出任何变化。
给定CD38结合蛋白的细胞毒活性的特异性是通过比较对表达显著量CD38的细胞(靶标阳性细胞)的细胞杀伤活性与对不展现任何显著量的与任何细胞表面物理偶联的CD38的细胞(靶标阴性细胞)的细胞杀伤活性来确定。这是通过以下来完成:确定给定结合蛋白对所分析结合蛋白的靶标生物分子的细胞表面表达呈阳性的细胞群体的半数最大细胞毒性浓度,且接着使用相同结合蛋白浓度范围来尝试确定对CD38结合蛋白的靶标生物分子的细胞表面表达呈阴性的细胞群体的半数最大细胞毒性浓度。在一些实验中,与“仅缓冲液”阴性对照相比,用最大量的含有志贺菌毒素的分子处理的靶标阴性细胞在成活力方面没有表现出任何变化。此外,分离的志贺菌毒素效应区多肽用作非靶向阴性对照。
表5中的数据显示了使用上述细胞杀伤测定对源自二十五个抗CD38抗体可变结构域序列的五十个CD38结合蛋白对CD38阳性肿瘤细胞的细胞毒性结果。与CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的细胞毒性相比,每个的细胞毒性显示在右侧栏中。对于每种测试的细胞类型,在六个不同的实验中分析了CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:80)的细胞毒性,并计算平均值并用于比较(例如表5中所示的倍数变化计算)。图2显示了筛选这51种CD38结合蛋白对CD38阳性H929骨髓瘤细胞的细胞毒活性的结果,如使用细胞滴度-Glo成活力测定法所测定的。额外的细胞毒性数据报告于表7-9和13-14以及图3A-3C、图4A-4B和图8A-8E中。CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)在该测定中的代表性CD50值为对于ST486细胞37pM且对于Daudi细胞44pM。
表5.CD38结合蛋白的细胞毒活性
*“dnt”(未测试)表示未针对该细胞类型收集数据
“N/A”表示当未获得精确的CD50值(例如>20,000)时,与参考相比的相对变化不适用。
使用这种细胞杀伤测定,通过细胞毒性效力将最初的50种CD38结合蛋白库缩小到18种分子。然后,选择该18种分子的子集用于进一步测试。在表6中,将来自筛选文库的共享相同CDR序列的蛋白质集合分组到家族中,例如家族#1包括蛋白质3和4,家族#2包括蛋白质49和50,家族#3包括蛋白质45和46,家族#5包括蛋白质1和2,和家族#6包括蛋白质7和8(见表2)。对于这些家族中的每一个,CD38结合区在结构上相似,具有相同的CDR序列。每个家族可以由其CDR集定义:家族#1包含由SEQ ID NO:19-24表示的6个CDR的集合,家族#2包含由SEQ ID NO:25-30表示的6个CDR的集合,家族#3包含由SEQ ID NO:31-36表示的6个CDR的集合等。
表6.包含相同CDR集合的分子形成家族
图2显示了池中各种分子对CD38阳性H929骨髓瘤细胞的代表性CD50值,某些分子标记为:1nM的筛选截止值由垂直虚线表示,其中左侧的CD50值比截止值更强效和右侧的CD50不如截止值强效。没有表现出20,000ng/mL或更小的CD50的任何分子不包括在图2中。
图2显示来自家族1-3和5-6的蛋白质在体外对CD38阳性骨髓瘤细胞表现出强效的细胞毒性,并且这些蛋白质比池中的许多其他分子更强效。来自家族1-3和5-6的CD38结合蛋白进一步表征如下。
3.选择候选者且从筛选进一步测试最佳命中
通过特别考虑到体外对CD38阳性细胞的细胞毒性效力、对人和食蟹猴CD38二者的结合亲和力、与单克隆CD38抗体的竞争以及可制造性,缩小了50种候选者的文库。随着筛选库按各种标准缩小范围,使用以下分子更详细地研究了家族1-3和5-6中的CD38结合区域:CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)、CD38-结合蛋白#2(SEQ ID NO:77)、CD38结合蛋白#3(SEQID NO:78)、CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)、CD38结合蛋白#5(SEQ ID NO:80)和CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:81)。表7显示了源自筛选的这五种说明性CD38结合蛋白的初始CD50值。家族#1包括CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76),家族#2包括CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77),家族#3包括CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78)和CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79),家族#5包括CD38结合蛋白#5(SEQ ID NO:80),和家族#6包括CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:80)。
表7.选定的CD38结合蛋白对各种CD38阳性细胞类型的细胞毒性效力
在从筛选中优化蛋白质生产和纯化某些候选物之后,进行额外的细胞杀伤测定以进一步评估和比较候选者CD38结合蛋白。CD38结合蛋白通过不同的方法纯化,例如使用蛋白A或蛋白L层析。通过在志贺菌毒素效应子多肽中引入额外的氨基酸残基或在CD38结合scFv区的轻链中引入氨基酸置换,一些CD38结合蛋白发生了改变。
使用如上所述的各种CD38结合蛋白进行细胞毒性测定并报告于表8和图3A-3C中。此外,通过用来自CD38阴性细胞系U266的细胞进行细胞毒性测定,显示了对CD38表达细胞的细胞毒性的特异性。在所测试的条件下,对CD38阴性细胞没有表现出显著的细胞毒活性(参见例如图3C及表7至表8最后一列)。
表8.所选的CD38结合蛋白对人骨髓瘤细胞系的细胞毒性
尽管CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:81)显示出CD38特异性和高细胞毒效力,但CD38结合蛋白#6(SEQ ID NO:81)的相对细胞毒活性不如许多其他候选者。
在灵长类动物细胞(人或非人灵长目动物细胞)中测试CD38结合蛋白的细胞毒活性。BLCL-C162是一种表达CD38的恒河猴细胞系。结果示于表9A至表9B、图4A(人类)及图4B(猴)中。
表9A所选的CD38结合蛋白对CD38阳性灵长目动物细胞系的细胞毒性
表9B.CD38结合蛋白#4对CD38阳性人类细胞系的细胞毒性
测量CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)对ANBL6细胞的2小时暴露,得到以约0.1nM和0.16nM的CD50值为特征的细胞毒性。
测量CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)对ANBL6细胞的2小时暴露,得到以约0.1nM和0.16nM的CD50值为特征的细胞毒性。
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在体外对全血和PBMC中的CD38阳性靶细胞具有细胞毒性,表明在该测定中红细胞的存在不抑制细胞毒性。
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在体外对多发性骨髓瘤受试者来源的样品具有细胞毒性。
测试了某些CD38结合蛋白的催化(核糖体抑制)和细胞毒活性以研究这些细胞毒分子的作用机制。CD38结合蛋白的核糖体灭活能力是使用快速偶联转录/翻译试剂盒(L1170Promega Madison,WI,U.S.)通过无细胞体外蛋白质翻译测定来确定的。该试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(L4821 Promega Madison,WI,U.S.)和Quick MasterMix。根据制造商的说明制备核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备一系列(通常为10倍)稀释液,并为每个稀释液创建一系列相同的TNT反应混合物组分。将待测分子与每种TNT反应混合物以及荧光素酶T7对照DNA结合。将测试样品在30℃下孵育1.5小时。孵育后,将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega,Madison,WI,U.S.)加入至所有测试样品中,并根据制造商的说明通过发光来测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白质的对数转换浓度与相对发光单位的非线性回归分析来确定翻译抑制水平。使用软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),使用标题剂量-反应-抑制下的log(抑制剂)对反应(三参数)的Prism软件函数[Y=底值+((顶值-底值)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算每一样品的半数最大抑制浓度(IC50)值。结果示于表10和图5中。
表10.所选CD38结合蛋白的核糖体抑制活性
CD38结合蛋白 | 蛋白合成抑制IC<sub>50</sub>(ng/mL) |
CD38结合蛋白#4 | 1.45 |
CD38靶向参考分子#1 | 1.16 |
仅志贺菌毒素效应子多肽对照 | 1.97 |
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的催化活性与单独的SLTA效应子多肽和CD38靶向参考对照分子#1相当(表10)。
4.使用细胞结合和纯化的CD38结合测定测试结合蛋白的CD38靶向
进行细胞结合亲和力测定以量化某些CD38结合蛋白对CD38表达细胞的结合亲和力。
CD38结合蛋白与重组人CD38蛋白或重组食蟹猴CD38蛋白(Sino Biological,Wayne,Pennsylvania,U.S.)的结合是用酶联免疫吸附测定(ELISA)结合测定法来确定的。将MaxisorpTM板在4℃下用PBS中的重组的人或食蟹猴CD38包被过夜。将孔洗涤并封闭,然后与一系列稀释的待测CD38结合蛋白孵育。以两步法利用检测去免疫化毒素结构域的鼠单克隆抗体、接着抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗来检测所结合的CD38结合蛋白。用TMB Ultra检测HRP信号并用酸停止反应后,用酶标仪读取ELISA信号(450纳米(nm)处的吸光度(“Abs450”))。分子CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77)、CD38结合蛋白#3(SEQID NO:78)和CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)各自与人和猴CD38二者结合,而CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)与人CD38(图6A)结合,但在该测定中不与食蟹猴CD38(图6B)结合(表11)。在其他实验中,还显示CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)与人和食蟹猴CD38蛋白结合。
表11.所选CD38结合蛋白的CD38结合亲和力
本实验中测试的所有CD38结合蛋白都以相似的结合亲和力与人CD38结合;然而,与食蟹猴CD38的结合在分子间有所不同。分子CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)、CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77)、CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78)和CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)各自与食蟹猴CD38结合。与人和食蟹猴CD38两者结合是有用的,这是因为食蟹猴动物可用作人类受试者的模型,以帮助确定、估计和理解CD38结合蛋白的体内作用和行为,例如关于药代动力学,药效学和毒理学;其中模型可通过可在相关物种(诸如人类)中翻译的结合蛋白而具有靶标结合及靶标细胞杀伤。
在另一个实验中,使用基于荧光的流式细胞术测定分析了CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的结合特性。将含有CD38阳性(CD38+)细胞(细胞系A或F)的样品悬浮在含有1%牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem,San Diego,CA,U.S.)的1X PBS中,以下称为“1XPBS+1%BSA”,并与100μL的CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的各个稀释液一起在4℃下孵育1小时。孵育一小时后,将细胞样品用1X PBS+1%BSA洗涤两次。将细胞样品在4℃下与100μL含有α-SLT-1ApAb1的1X PBS+1%BSA孵育一小时,然后再次洗涤并与100μL含有偶联至异硫氰酸荧光素(FITC)的抗兔二抗的1×PBS+1%BSA溶液一起在4℃下孵育1小时。将细胞样品用1XPBS+1%BSA洗涤两次,重新悬浮在200μL 1X PBS中,并进行基于荧光的流式细胞术,以测定被足够二抗结合的细胞百分比,该细胞百分比指示CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)与每一样品中的细胞的结合水平。所有样品的平均荧光强度单位(MFI)和相对荧光单位的数据是通过使用阴性对照细胞样品的门控数据获得的,该阴性对照细胞样品未经任何细胞靶向分子处理,但与兔多克隆抗体α-SLT-1A(pAb1)(HarlanLaboratories,Inc.Indianapolis,IN,U.S.)且接着与抗兔二抗一起孵育。积分MFI(iMFI)是通过将阳性细胞的百分比与MFI相乘来计算的。使用标题结合-饱和下的单位点结合的Prism软件函数[Y=Bmax*X/(KD+X)],使用基线校正数据计算Bmax和KD。对与两种类型的CD38+细胞结合的CD38靶向参考分子#1测量的Bmax被测量为大约100,000iMFI,且结合这些CD38+细胞的CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的KD值被测量为大约2-7nM。CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)在所述条件下的该测定中未表现出与CD38阴性的结合。
5.映射(mapping)结合蛋白的CD38结合表位
为了帮助表征来自池的CD38结合蛋白候选物,进行了进一步的CD38结合研究。由Integral Molecular,Inc.(Philadelphia,Pennsylvania,U.S.)进行了表位映射服务(通过鸟枪诱变)(具有丙氨酸扫描及额外突变以将来自人的氨基酸变为食蟹猴残基(若适当)的标准测定设置)以鉴定与CD38细胞外结构域(ECD)结合的接触残基。
测定如下进行。野生型或突变型CD38 ECD在HEK293细胞的细胞表面上表达,然后通过流式细胞术对感兴趣的CD38结合蛋白在某些氨基酸突变时结合至CD38 ECD的能力与相同的感兴趣的CD38结合蛋白与野生型CD38 ECD的结合进行比较。用一系列也靶向CD38的对照分子控制该测定法的突变,这些突变会影响分子的表达或一般折叠。表12显示了将与具有特定突变的表面表达的CD38 ECD蛋白的结合作为该CD38结合蛋白与野生型CD38结合的百分比。以粗体标记的值表示对结合蛋白的结合和表面可及性(基于公开的CD38结构细节)至关重要的氨基酸。
表12.表位映射:CD38突变对所选CD38结合蛋白结合的影响
图7显示在CD38中由CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)结合的关键残基的位置。在图7中,关键表面可及接触残基F216和L262以红色显示,关键结构残基L124和L230以紫色显示,参与二硫键对的关键结构残基C119/C201和C254/C275以灰色显示。
如上文针对CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)所述进行表位映射测定。CD38中由CD38靶向参考分子#1结合的关键残基是F216、L262、Q272和F273。
6.达雷木单抗存在下的细胞毒活性
如上所述进行细胞杀伤测定,但在抗CD38单克隆抗体达雷木单抗存在下进行,以评估达雷木单抗是否干扰所测试的CD38结合蛋白的活性。达雷木单抗是一种获批的单克隆抗体,用于治疗多发性骨髓瘤。进行细胞毒性测定以区分在达雷木单抗存在下哪些CD38结合蛋白杀死表达CD38的细胞。
在达雷木单抗的存在下测试感兴趣的CD38结合蛋白的细胞毒活性。在该实验中,细胞成活力测定是与上述类似进行的。将CD38阳性细胞铺板后,将达雷木单抗以500μg/mL开始的稀释系列(4倍稀释至2ng/mL)添加到细胞中。在加入CD38结合蛋白前1.5小时将达雷木单抗加入细胞中,并在整个实验过程中将达雷木单抗留在孔中。将CD38结合蛋白以500ng/mL的恒定浓度添加到孔中(加入达雷木单抗后1.5小时,并在整个实验过程中留在孔中),因此在达雷木单抗的最高浓度下,达雷木单抗比CD38结合蛋白过量一千倍。72小时后进行细胞成活力读数(CellTiter Glo2.0)。该测定的一些结果显示在图8A-8E中。图8A-8E显示达雷木单抗可以完全阻断CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的细胞毒活性,但对CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)和CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77)的细胞毒活性具有极低效应。关于H929和ST486细胞系,在达雷木单抗存在下,用500ng/mL CD38结合蛋白进行处理,CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的细胞毒性活性没有变化(所有细胞均被杀死)。对于CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79),CD38结合蛋白的细胞毒活性在高浓度达雷木单抗存在下降低;然而,尽管效力发生了变化,但CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)仍然能够将细胞成活力影响至在达雷木单抗存在下其他CD38结合蛋白(例如CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)及CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77))所见的水平。表13关注所选CD38结合蛋白在单克隆抗体存在下的细胞毒性活性,所述CD38结合蛋白为单一浓度(0.5μg/mL)且达雷木单抗为单一浓度(500μg/mL),单克隆抗体比CD38结合蛋白高1000倍。
图8A-8E显示CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在达雷木单抗存在下在达雷木单抗范围内对表达CD38的细胞具有强效的体外细胞毒性。
表13.在过量抗CD38单克隆抗体达雷木单抗存在下,所选CD38结合蛋白的细胞毒性
表14.在过量抗CD38单克隆抗体达雷木单抗存在下,所选CD38结合蛋白的细胞毒性
家族#5和7的CD38结合蛋白,以及CD38靶向参考分子#1,都显示出对CD38阳性MOLP-8骨髓瘤细胞和ST486淋巴瘤细胞的高功效(见表14;图8C)。
家族#5的CD38结合蛋白在达雷木单抗存在下表现出细胞毒性(见表14;图8D),其中CD50值在没有达雷木单抗存在的平行样品的10倍以内。相比之下,当靶细胞经10μg/mL达雷木单抗预处理时(达雷木单抗是在添加CD38结合蛋白的前30分钟以稀释系列(自0.2ng/mL至20,000ng/mL)添加且在整个实验中保留),CD38结合蛋白#7和CD38靶向参考分子#1的细胞毒活性被完全抑制。
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在体外对多发性骨髓瘤受试者来源的样品(包括来自先前暴露于达雷木单抗的受试者)具有细胞毒性(见表15)。从六名多发性骨髓瘤受试者收集骨髓样本,并使用常用技术进行离体培养。使用技术人员已知的常用技术评估基线时六个受试者样品中细胞上的细胞表面CD38水平,并且发现其CD38密度自137,000至6,750,000抗体结合能力单位变化(参见表15:第2列)。将CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)以一定浓度范围施用于细胞,然后将细胞培养48小时或72小时。如上所述计算CD50值,并将代表性结果报告于表15中。
表15.CD38结合蛋白#4对多发性骨髓瘤受试者来源的骨髓肿瘤细胞的细胞毒性
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)消耗在该离体受试细胞培养群组中表达广泛范围的CD38水平的各种多发性骨髓瘤肿瘤细胞。CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在治疗48小时后以0.38-0.85μg/mL的CD50浓度消耗肿瘤细胞,且在治疗72小时后以0.23-0.51μg/mL的CD50浓度消耗肿瘤细胞(一个受试者样品在72小时时间点无法在技术上评价)。
还测试了说明性CD38靶向分子与CD38的竞争性结合(见图23)。测试了CTM#1(SEQID NO:228)、CTM#2(SEQ ID NO:229)、CTM#3(SEQ ID NO:230)是否能够在抗CD38抗体达雷木单抗(Dara)、HB-7、AT13-5或OKT-10存在下结合至CD38。如图23A和23B所示,CTM#1(SEQID NO:228)和CTM#2(SEQ ID NO:229)能够在在抗CD38抗体达雷木单抗(Dara)、HB-7、AT13-5或OKT-10存在下结合至CD38,表明这些分子可结合至CD38上与达雷木单抗、HB-7、AT13-5及OKT-10所结合的表位不同的表位。CTM#3(SEQ ID NO:230)能够在OKT-10存在下但不能在达雷木单抗、HB-7及AT13-5存在下结合至CD38,表明CTM#3(SEQ ID NO:230)可以结合至CD38上与OKT-10所结合的表位不同的表位。这些结果表明,CTM#3(SEQ ID NO:230)与达雷木单抗、HB-7和AT13-5共享或部分共享CD38上的表位(例如部分重叠的表位)。
还测试了说明性CD38靶向分子与CD38表达细胞的竞争性结合(参见图23C)。将MOLP-8细胞与20μg/mL CD38靶向分子(~400nM)或对照分子(单独的志贺菌毒素A亚基效应子多肽)孵育70分钟。然后加入0.5μg/mL的抗CD38并与细胞一起孵育48小时。CD38结合是通过识别志贺菌毒素A亚基效应子多肽成分的一抗和FITC偶联的抗IgG二抗随后进行流式细胞术检测的。在减去来自仅二抗对照的信号后计算CD38靶向分子的平均荧光强度(MFI),并绘制为从单独志贺菌毒素A亚基效应子多肽作为对照测量的MFI的百分比。如图23C和23D所示,CTM#1(SEQ ID NO:228)和CTM#2(SEQ ID NO:229)以竞争性方式结合至CD38,这与其结合至CD38上的相同表位的事实一致。CTM#3(SEQ ID NO:230)以与CTM#1(SEQ ID NO:228)和CTM#2(SEQ ID NO:229)的半竞争方式结合至CD38。
7.测试人骨髓抽出物中的结合蛋白
为了进一步评估CTM#4对人多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性,从各种多发性骨髓瘤受试者(标记为010、011、012、013、014和015)获得骨髓抽出物(BMA),包括一名对达雷木单抗具有抗性的受试者(013)。BMA用渐增浓度的CTM#4(范围从约0.053到33.33μg/mL)处理。如图15所示,CTM#4对BMA肿瘤细胞具有细胞毒性,且在48小时后展示约3.5nM至8.5nM的对这些患者来源的多发性骨髓瘤细胞的CD50值且在72小时后展示约0.23μg/mL至0.51μg/mL的CD50值。未观察到CD38表达水平与CTM#4细胞毒性效力之间的严格相关性。
8.药效学模型
为了确定CTM#4细胞毒性的时间进程,使用Real Time Glo测定在各种高CD38表达(MOLP6、RPMI-8226)和中等CD38表达(ANBL6、NCI-H929)细胞系中测量在经CTM#4处理后大约72小时的细胞毒性。如图16所示,在最敏感的细胞系(例如NCI-H929)中,在8小时内观察到了成活力效应。
对于所测试的大多数多发性骨髓瘤细胞类型,CTM#4 CD50值在约48小时后达到渐近线。在图16中,表格在底部两行(CTM#4或CD38TM4)中报告了CD50值(pM)。在图16中,表格报告了细胞表面CD38的表达水平并将该值在CD38表达行中表征为高或中。CTM#4的CD38靶向部分CD38TM4的细胞毒性是在分离情况下(与志贺菌毒素效应子多肽解离)测试的,并且对于所测试的CD38TM4浓度范围,无法确定精确CD50值;然而,在该测定中,对于ANBL-6、NCI-H929、MOLP-8和HCT116细胞,CD50值被确定为大于180,000pM(图16表格,最后一行)。未观察到CD38表达水平与CTM#4细胞毒性效力之间的严格相关性。
两种细胞系NCI-H929和MOLP8展示了最短的细胞死亡诱导,在CTM#4施用的前8小时内观察到细胞毒性,其特征分别在于CD50值<0.038和0.081±0.018ng/mL。多发性骨髓瘤细胞系ANBL-6和RPMI-8226对CTM#4的敏感性低于NCI-H929和MOLP8(72小时时CD50值分别为1.949±0.0467和0.136±0.027ng/mL,并且分别在28小时和24小时诱导细胞死亡)。在本研究中,CTM#4对CD38阴性HCT 116结肠癌细胞未展示效应。
为了确定CTM#4在全血中是否有活性,用CTM#4处理人和食蟹猴全血72小时。自然杀伤(NK)细胞耗竭是使用流式细胞术在离体确定的。如图18A-18B所示,CTM#4减少人和食蟹猴全血中的NK细胞计数。
在单独的测定中,将ANBL-6多发性骨髓瘤细胞用CTM#4连续处理48或72小时,或暴露于CTM#4 2小时,洗涤,并保持在不含CTM#4的培养基中直至48或72小时的时间点。使用RealTime-Glo活力测定确定细胞成活力。如图19所示,2小时处理加冲洗导致在48小时时间点细胞毒性增加5倍,并且在72小时时间点细胞毒性增加10倍。
9.鼠模型
用于其他物种的哺乳动物受试者的鼠模型用于评估所选的CD38结合蛋白。
a.小鼠模型中的耐受性
为了评估耐受性、毒性和安全性,在12天内用各自稀释于PBS中的运载体(20mM柠檬酸钠、200mM山梨醇,pH 5.5)或CD38结合蛋白以0.25mg/kg至2mg/kg治疗BALB/C小鼠达6个剂量(第1天、第3天、第5天、第8天、第10天及第12天)。在整个研究过程中监测体重并进行临床观察。这些研究的一些结果显示在表16、表17和图9中。在平均体重减轻>20%或死亡率>10%的任何组中停止给药,动物不会被安乐死并允许恢复。在体重减轻>20%的组内,达到个体体重减轻终点的个体将被安乐死。如表16和17所示,在不同研究中测试了CD38结合蛋白。表16中提供了不同浓度下多种CD38结合蛋白的数据。此外,在第4次给药后(第8天给药后12小时)进行显示肝酶功能(天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(alkphos)和总胆红素)变化的一些临床化学测试,这些值报告在表17中。
表16.说明性CD38结合蛋白的体内比较:体重变化及研究期间死亡
表17说明性CD38结合蛋白的体内比较:临床化学
对CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78)和在CD38结合区具有相同CDR的相关分子CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在单一研究中进行了比较,并且经治疗小鼠的体重变化示于表16和图9中。尽管两者在0.5mg/kg下均能耐受,但在1mg/kg下CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)耐受性更好,如体重无变化且无死亡,而在1mg/kg下CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78)与体重减轻和3/6死亡相关(见表16)。CD38结合蛋白#3(SEQ ID NO:78)治疗组中存活的动物没有接受第六次预定剂量。两种分子之间的差异在于轻链中为促进蛋白质L纯化的氨基酸变化,令人惊讶的是其毒性更小且因此可容许较高剂量给药以及较低频率给药,这是一个显著的益处。
b.相对免疫原性
人免疫系统的哺乳动物模型用于研究某些CD38结合蛋白的免疫原性潜力。说明性结合蛋白的相对免疫原性是使用在经多周时期重复肠胃外施用后针对结合蛋白的体内抗体反应的测定来确定的(例如,参见WO 2015/113005)。溶液内ELISA用于确定对不同结合蛋白具有特异性的血清鼠抗体的相对量。
该免疫原性测定涉及使用通常指示哺乳动物中分子的相对免疫原性的小鼠。进行小鼠研究,其中BALB/c小鼠被随机分配到由每组六只小鼠组成的治疗组,并且不同治疗组中的小鼠被施用不同的结合蛋白。首先,在暴露于结合蛋白之前从每只小鼠收集血清样品。接着,通过每周三次腹膜内注射向治疗组中的每只小鼠施用每剂量样品结合蛋白0.25毫克样品分子/千克体重(mg/kg)达两周。一周未施用任何样品后,每周3次腹膜内注射每剂量样品结合蛋白0.25毫克/千克持续额外的两周,使得经五周间隔总计注射12剂结合蛋白。在五周的给药间隔期间和之后,从所有小鼠中收集血清,以使用溶液内ELISA观察靶向所施用的结合蛋白的抗体。
检测识别所施用结合蛋白的抗体的溶液内ELISA如下进行。对于每个CD38结合蛋白及其各自的小鼠治疗组,进行了不同的ELISA测定,但使用相同的通用溶液内ELISA测定设置。对于溶液内ELISA测定,将ELISA板孔用CD38重组人蛋白质包被。将小鼠治疗组中用于注射的相同结合蛋白与从该组的单一小鼠收集的血清在4℃的溶液中孵育过夜,然后使用经包被的ELISA板孔捕获所形成的任何复合物(例如包含结合蛋白和存在于血清中的抗体的复合物)。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG二抗检测包含鼠免疫球蛋白G分子(IgG)的经捕获的免疫复合物。通过添加显色HRP底物然后检测作为化学发光结果的光发射,在孔中检测HRP活性。使用酶标仪在450nm处测量HRP活性或“ELISA信号”。在减去从“无血清”阴性对照孔中测量的背景信号后,将ELISA信号值计算为吸光度值(Abs 450nm)。血清被稀释以允许吸光度值读数低于测定的饱和水平,并且对于在给定日期测量的所有治疗组中的所有小鼠,稀释比是相同的。作为对照,向小鼠施用CD38靶向对照分子#1(SEQ ID NO:84),其包含与CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:80)相同的scFv但包含去免疫化较低的志贺菌毒素效应子多肽,并用于显示抗药物抗体反应。
图10显示经两个周期的总计12剂感兴趣分子的低剂量(0.25mg/kg)施用,与包含去免疫化较低的志贺菌毒素效应子多肽和与CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:80)相同的scFv的CD38靶向对照分子(SEQ ID NO:84)相比,以下仅包含去免疫化志贺菌毒素A亚基效应子多肽组分的CD38结合蛋白的相对免疫原性:CD38结合蛋白#1(SEQ ID NO:76)、CD38结合蛋白#2(SEQ ID NO:77)和CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)。
将CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)和另一对照CD38靶向分子以0.05mg/kg的剂量静脉内施用于非人灵长目动物,持续两个周期,周期之间间隔两周(给药日第1,3,5,8,10,12;29,31,33,36,38和40天)。与包含与CD38靶向对照分子#1(SEQ ID NO:84)相同的志贺菌毒素效应子多肽的去免疫化较低的靶向CD38对照分子相比,在接受CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的动物中,任何炎症/免疫反应的严重程度都降低了(如通过球蛋白水平、IgG水平、IgA水平、中性粒细胞计数、单核细胞计数和白蛋白减少所测量的)。此外,在第6剂后可检测到CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83),而对照CD38靶向分子低于定量限,推测是由于形成更多的抗药物抗体所致。
c.功效
包含CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的二聚体的组合物在若干种皮下和弥散性人骨髓瘤异种移植鼠模型中有效。使用每周一次和每两周一次的时间表均观察到完全的肿瘤消退。此外,在免疫活性小鼠模型中,表达人CD38的同基因鼠细胞系显示对CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)治疗有反应。
(i)鼠异种移植模型:皮下LP-1
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的体内活性使用鼠异种移植模型进行评估,该鼠异种移植模型包含携带LP-1人多发性骨髓瘤异种移植物的雌性CB17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。用LP-1人多发性骨髓瘤细胞皮下接种到小鼠右侧,并且每周一次(QW)用静脉内剂量的运载体治疗、每周一次用静脉内剂量的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)治疗21天或每隔一周一次(Q2W)用静脉内剂量的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)治疗14天。CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的剂量为5、6或10mg/kg体重。
使用技术人员已知的常用技术每周两次测量肿瘤体积和体重,并且使用公式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积(MTV)。当平均肿瘤体积达到约94mm3时,将小鼠随机化至治疗组(每组n=6只小鼠)中,并按QW时间表静脉内给药运载体(磷酸盐缓冲盐水(PBS))或以QW时间表以5.0mg/kg或6.0mg/kg静脉内给药CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)或以Q2W时间表以10.0mg/kg静脉内给药CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)。接受QW施用的小鼠在第0、7、14和21天进行治疗。接受Q2W施用的小鼠在第0天和第14天进行治疗。所有治疗从第0天开始。每周两次测量肿瘤大小和体重,并且当对照肿瘤在第28天达到大约1800mm3时终止研究。
在第28天确定生长速率抑制。通过使用直至研究第28天且包括其的数据计算百分比GRI([对照组的平均生长速率-治疗组的平均生长速率]/运载体组的平均生长速率)来确定对肿瘤生长的抑制。使用应用于每组动物的指数生长率的t检验来进行治疗组和运载体之间肿瘤生长的统计比较。这些研究的一些结果显示在表18(LP-1)和图11A至图11D中。图11A-11D以图形方式显示了每组随时间(天)的平均肿瘤体积(mm3)。在涉及给药方案时,术语“BIW”在图11A至图11D中用于意指“每两周一次”。术语“AUC”代表曲线下面积。
表18.CD38结合蛋白#4在异种移植模型中杀死CD38+肿瘤细胞
在所有剂量组中均耐受治疗。在治疗和测量过程中没有动物死亡或动物被移除。所有动物都包括在第28天的分析中。
与运载体治疗相比,每周一次利用5mg/kg或6mg/kg的CD38结合蛋白#4(SEQ IDNO:79)治疗携带LP-1人多发性骨髓瘤异种移植物的雌性CB17 SCID小鼠产生显著的抗肿瘤活性。
(ii)鼠异种移植模型:皮下H929
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的体内活性使用鼠异种移植模型进行评估,该鼠异种移植模型包含携带NCI-H929人多发性骨髓瘤异种移植物的雌性非肥胖性糖尿病(NOD)严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。向小鼠右侧皮下接种NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞,并且每周一次(QW)用静脉内剂量的运载体(PBS)治疗21天或每隔一周一次(Q2W)用静脉内剂量的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)治疗14天。CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的剂量为5、6或10mg/kg体重。
使用技术人员已知的常用技术每周两次测量肿瘤体积和体重,并且使用公式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积(MTV)。当平均肿瘤体积达到约121mm3时,将小鼠随机化至治疗组(每组n=8只小鼠)中,并按QW时间表静脉内给药运载体(磷酸盐缓冲盐水(PBS))或以QW时间表以5.0、6.0或10.0mg/kg静脉内给药CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)或以Q2W时间表以10.0mg/kg静脉内给药CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)。接受QW施用的小鼠在第0、7、14和21天进行治疗。接受Q2W施用的小鼠在第0天和第14天进行治疗。所有治疗都从第0天开始。每周两次测量肿瘤大小和体重,并且当对照肿瘤在第29天达到大约1700mm3时终止研究。
在第29天确定(如上文所述)生长速率抑制。这些研究的一些结果显示在表18(H929)和图11A至图11D中。
在所有剂量组中均耐受治疗。在治疗和测量过程中没有动物死亡或动物被移除。所有动物都包括在第29天的分析中。
与运载体治疗相比,每周一次利用5mg/kg或6mg/kg的CD38结合蛋白#4(SEQ IDNO:79)或每隔一周一次利用10mg/kg的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)治疗携带NCI-H929人多发性骨髓瘤异种移植物的雌性非肥胖性糖尿病(NOD/SCID)小鼠产生显著的抗肿瘤活性。
使用另外的鼠皮下异种移植模型类似于如上文所述且使用技术人员已知的技术但使用其他细胞类型(诸如MOLP8细胞)来评估CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的体内活性。这些研究的一些结果显示在表18(MOLP-8)和图11D中。
(iii)鼠异种移植模型:皮下MM1.S
CD38结合蛋白#4(CTM#4)的体内活性使用鼠异种移植模型进行评估,该鼠异种移植模型包含携带MM1.S人多发性骨髓瘤异种移植物的雌性CB17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。用MM1.S人多发性骨髓瘤细胞皮下接种到小鼠右侧,并且每周一次(QW)用静脉内剂量的运载体治疗、每周一次用静脉内剂量的CD38结合蛋白#4治疗21天或每隔一周一次(Q2W)用静脉内剂量的CD38结合蛋白#4治疗14天。CD38结合蛋白#4的剂量为5、6或10mg/kg体重。
使用技术人员已知的常用技术每周两次测量肿瘤体积和体重,并且使用公式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积(MTV)。当平均肿瘤体积达到大约94mm3时,将小鼠随机化至治疗组中并以QW时间表静脉内给药运载体(磷酸盐缓冲盐水(PBS))、以QW时间表静脉内给药CD38结合蛋白#4、以Q2W时间表静脉内给药CD38结合蛋白#4、以BIW时间表静脉内给药CD38靶向抗体(达雷木单抗,SOC)、以QW时间表静脉内给药CD38结合蛋白#4与以BIW时间表静脉内给药SOC的组合,或以Q2W时间表静脉内给药CD38结合蛋白#4与以BIW时间表静脉内给药SOC的组合。接受QW施用的小鼠在第0、7、14和21天进行治疗。接受Q2W施用的小鼠在第0天和第14天进行治疗。所有治疗都从第0天开始。每周两次测量肿瘤大小和体重,并且当对照肿瘤在第28天达到大约1800mm3时终止研究。
该研究的一些结果示于图12A-B和图17中。在两个组合组(CTM#4+SOC)中均观察到完全消退。
D.鼠异种移植模型:弥漫性
CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的体内活性使用鼠异种移植模型进行评估,该鼠异种移植模型包括携带MM1.S-Luc人多发性骨髓瘤弥散性肿瘤的雌性SCID/Beige小鼠。
使用技术人员已知的常用技术,通过尾静脉注射向SCID Beige小鼠接种MM1.S-Luc肿瘤细胞(标记有荧光素酶表达的MM1.S细胞)。使用技术人员已知的常用技术,使用生物发光成像每周一次测量每只小鼠的肿瘤负荷。在第14、21、28、35和42天以光子/秒测量肿瘤负荷,并计算每个治疗组的平均生物发光信号。在第14天,当平均生物发光信号达到每秒约1.11×107光子时,将动物随机化至治疗组中(n=8/组)。以2mg/kg每隔一天一次每周三次(间断两天)持续两周,之后间断一周(每隔一天一次×3,间断2天;给药2周,间断1周)腹膜内给药仅运载体或CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79),之后开始下一给药周期。另外,CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)以4、6和10mg/kg每周一次给药。所有组均在28天期间给药。在第14天、第16天、第18天、第21天、第23天、第25天、第35天及第37天向以每隔一天一次×3,间断2天;施用2周,间断1周时间表治疗的小鼠施用运载体(PBS)或CD38结合蛋白。在第14天、第21天、第27天及第35天治疗以每周一次时间表接受CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)的小鼠。
通过计算%T/C来确定抗肿瘤活性。百分比T/C定义为治疗组的平均生物发光信号(BLI)除以运载体组的平均生物发光(BLI)信号×100,并在第42天计算,其中一些结果显示在图12A中。在图12A中,CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)被称为“CTM#4”,此蛋白质是实验数据连同仅运载体对照中显示的唯一蛋白质。图12B还显示了使用异种移植肿瘤细胞中荧光素酶活性的生物发光成像收集的小鼠的图像:仅施用运载体的小鼠在其全身广泛地表现出强烈的信号,而施用CD38结合蛋白#4(CTM#4)(SEQ ID NO:79)的小鼠通过这种方法似乎没有可检测到的肿瘤细胞。
与运载体治疗相比,利用4mg/kg、6mg/kg或10mg/kg的CD38结合蛋白#4每周一次治疗携带MM1.S-Luc人多发性骨髓瘤弥漫性肿瘤的雌性SCID/Beige小鼠产生显著的抗肿瘤活性。在4mg/kg或更高的剂量和每周一次的施用时间表中观察到显著的抗肿瘤活性。
CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的体内活性使用鼠异种移植模型进行评估,该鼠异种移植模型包括携带Daudi-Luc人多发性骨髓瘤弥散性肿瘤的SCID/Beige小鼠。将CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)以0.5mg/kg或0.6mg/kg的剂量施用于小鼠两个周期,周期之间间隔一周(给药日第1,3,5,8,10,12;22,24,26,29,31和33天)。与仅运载体对照组相比,在接受CD38靶向参考分子#1(SEQ ID NO:83)的小鼠中注射接种Daudi-Luc细胞后4天即观察到肿瘤负荷降低(参见图12-C)。
(iv)CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)在食蟹猴中的毒性和药效学
在非人类灵长类动物中测试每周一次静脉内施用约0.2mg/kg体重至0.75mg/kg体重的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)达1至4周。在第15天和第22天观察到抗药物抗体。施用≤0.75mg/kg的CD38结合蛋白#4(SEQ ID NO:79)(QW)达2剂或4剂耐受性良好,没有相关的临床症状。在非人类灵长类动物中进行的测试表明,CD38结合蛋白#4的施用可导致循环CD38±NK细胞、B细胞和T细胞的数量减少。
B.实施例2.包含志贺菌毒素A亚基衍生多肽的CD38靶向融合蛋白
本实施例的CD38靶向融合蛋白包含含有CD38结合区的细胞靶向结合区多肽、志贺菌毒素A亚基效应子多肽及蛋白质接头(参见例如WO2015/113005、WO 2016/196344和/或PCT/US2016/043902),其是使用本领域已知的技术制备的。本实施例的一些细胞靶向融合蛋白被构建为使得各自包含含有细胞靶向结合区多肽和志贺菌毒素A亚基效应子多肽的单一连续多肽。
1.测试CD38结合区在掺入至包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽的CD38靶向融合蛋白之后对结合功能性的保留
本实施例的CD38结合蛋白的CD38结合特征通过基于荧光的流式细胞术确定。本实施例的某些CD38靶向融合蛋白对CD38阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,其中KD在0.01-100nM范围内。
2.测试在融合结合区之后CD38结合蛋白对志贺菌毒素功能的保留
测试细胞靶向蛋白在异源区域融合后对志贺菌毒素A亚基效应子功能的保留。所分析的志贺菌毒素A亚基效应子功能是:真核核糖体的催化失活、细胞毒性和通过推断的至胞质溶胶的自引导亚细胞按路线发送。
3.测试结合蛋白的核糖体抑制能力
使用核糖体抑制测定测试结合蛋白的志贺菌毒素A亚基衍生的志贺菌毒素效应子多肽区的催化活性。
本实施例的细胞靶向蛋白的核糖体失活能力是使用快速偶联转录/翻译试剂盒(L1170 Promega Madison,WI,U.S.)通过无细胞体外蛋白质翻译测定来确定的。该试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(L4821 Promega Madison,WI,U.S.)和Quick MasterMix。根据制造商的说明制备核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备待测试的志贺菌毒素衍生的细胞靶向蛋白质的一系列10倍稀释液,且为每一稀释液产生一系列一致的TNT反应混合物组分。稀释系列中的每个样品都与每种TNT反应混合物以及荧光素酶T7对照DNA组合。将测试样品在30摄氏度(℃)下孵育1.5小时。孵育后,将荧光素酶测定试剂(E1483Promega,Madison,WI,U.S.)加入至所有测试样品中,并根据制造商的说明通过发光来测量荧光素酶蛋白翻译的量。
通过总蛋白质的对数转换浓度与相对发光单位的非线性回归分析来确定翻译抑制水平。使用统计学软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),使用标题剂量-反应-抑制下的log(抑制剂)对反应(三参数)的Prism软件函数[Y=底值+((顶值-底值)/(1+10^(X–Log IC50)))]计算每一样品的半数最大抑制浓度(IC50)值。计算来自一个或多个实验的每种志贺菌毒素衍生的细胞靶向蛋白的IC50值。
4.测试CD38结合蛋白对CD38表达细胞的细胞毒性
本实施例的CD38细胞靶向融合蛋白的细胞毒性特征是通过如前面实施例中所述的通用细胞杀伤测定来确定的。本实施例结合蛋白对于黑色素瘤细胞的CD50值约为0.01–100nM,取决于细胞系。
C.实施例3:评估说明性CD38结合蛋白在复发性或难治性多发性骨髓瘤参与者中的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和功效的研究
本研究(阶段1试验)的目的是评估说明性CD38结合蛋白CD38结合蛋白#4(“CTM#4”,SEQ ID NO:79)的安全性和耐受性。该研究将确定最大耐受剂量(MTD)和/或第2阶段推荐剂量(RP2D),并将对患有复发或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)参与者进行CD38靶向分子单一疗法提供初步评估。
该研究将分两个阶段进行:剂量递增阶段(第1部分)和扩展阶段(第2部分)。该研究将招募约81至102名参与者(第1部分为39至60名参与者,第2部分为约54名参与者)。
在剂量递增阶段(第1部分)中,起始剂量水平将为50微克/千克(mcg/kg),每周一次。在对队列1的可用安全性、PK、药效学和功效数据进行审查后,随后的群组中的剂量将增加到100、200、335、500和665mcg/kg,然后在超过665mcg/kg时视需要以1.25倍增加。也可发生单独的剂量递增,其中CTM#4将每2周施用一次。
在扩展阶段(第2部分),该研究将评估两种类型的RRMM群组:达雷木单抗复发或难治性(RR)队列(每周一次和每2周一次CTM#4施用)和未接受抗CD38疗法的群组(每周一次CTM#4施用)。在审查了研究剂量递增阶段的可用安全性、功效、PK和药效学数据后,每个扩展群组的起始剂量将是第1部分中所确定的MTD/RP2D(每周一次和每2周一次)。受试者给药群组在下表19中描述。
表19:小组及干预
研究的总持续时间是大约34个月。参与者将在最后一剂研究药物后接受30天的随访,以进行随访评估。
本研究的主要结果测量将包括:
1.第1部分:总体剂量水平治疗和每个剂量水平治疗中出现的不良事件(TEAE)的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
2.第1部分:在每个剂量水平具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者人数[时间范围:直至12个月]。DLT被定义为研究者认为至少可能与研究药物治疗相关的任何事件。DLT可以是血液学或非血液学DLT。血液学DLT可以是第1周期期间发生的任何≥4级血液学TEAE,但以下例外:明显由外来原因引起的血液学AE、4级淋巴细胞减少症、持续<连续7天的4级中性粒细胞减少症(ANC<500个细胞/mm3),任何等级和持续时间的发热性中性粒细胞减少症、≥3级血小板减少症伴有临床意义的出血、任何持续时间的4级血小板减少症、≥3级毛细血管渗漏综合征或与潜在疾病明显无关的≥3级溶血(例如阴性直接库姆斯(Coombs)测试)。非血液学DLT可以是在第1周期期间发生的任何≥3级的非血液学TEAE,以下除外:明显由外来原因引起的非血液学AE、在72小时内成功逆转(4级→≤2级;3级→≤1级或基线)的无症状的实验室变化(肾脏和肝脏实验室值和4级脂肪酶/淀粉酶水平除外),可通过止吐药控制的3级恶心/呕吐,持续<72小时的3级疲劳,在7天内消退至≤1级或基线的3级ALT或AST升高,对对症治疗(例如抗组织胺、NSAID、麻醉药、IV输液)有反应而没有3级症状复发的3级IRR。
3.毒性将根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准5.0版(NationalCancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events version 5.0)(NCICTCAE 5.0)进行评估。
4.第1部分:大于或等于(>=)3级TEAE的参与者人数[时间范围:直至12个月]。>=3级的TEAE将根据NCI CTCAE 5.0进行评估。
5.第1部分:具有严重不良事件(SAE)的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
6.第1部分:由于TEAE而中断CTM#4的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
7.第1部分:具有治疗相关的剂量修改(包括剂量延迟、剂量中断及剂量降低)的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
8.第1部分:实验室值在临床上显著变化的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
9.第1部分:生命体征测量在临床上显著变化的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
10.第2部分:总体反应率(ORR)[时间范围:直至12个月]。如由国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)统一反应标准所定义的在研究期间实现部分反应(PR)或更佳反应的参与者百分比。PR为血清M蛋白降低>=50百分比(%)且24小时尿液M蛋白降低>=90%或少于(<)200毫克每(mg/)24小时(h)。如果无法测量血清和尿液M蛋白,则需要将参与和未参与的游离轻链(FLC)水平之间的差异降低>=50%来代替M蛋白标准。如果血清和尿液M蛋白和血清FLC测定无法测量,则需要骨髓浆细胞减少>=50%来代替M蛋白,前提是基线百分比>=30%。此外,如果在基线时存在,则需要软组织浆细胞瘤的大小减少>=50%。需要两次连续评估;如果进行放射照相研究,则没有已知的进展性或新骨病变的证据。
[1]本研究的次要结果测量将包括:
1.第1部分和第2部分,Cmax:CTM#4的最大观察浓度[时间范围:第1周期及第2周期,第1天:给药前,和在给药后多个时间点(直至168小时)(每一周期为28天)]。
2.第1部分和第2部分,Tmax:CTM#4达到最大观察浓度(Cmax)的时间[时间范围:第1周期及第2周期,第1天:给药前,和在给药后多个时间点(直至168小时)(每一周期为28天)]。
3.第1部分和第2部分,AUClast:CTM#4自时间0至最后可定量浓度时间的浓度-时间曲线下面积[时间范围:第1周期及第2周期,第1天:给药前,和在给药后多个时间点(直至168小时)(每一周期为28天)]。
4.第1部分:总体反应率(ORR)[时间范围:直至12个月]。ORR定义为如由IMWG统一反应标准所定义的在研究期间实现PR或更佳反应的参与者百分比。PR为血清M蛋白降低>=50%且24小时尿液M蛋白降低>=90%或<200mg/24h。若无法测量血清和尿液M蛋白,则需要参与与未参与FLC水平之间差异减少>=50%来代替M蛋白标准。如果血清和尿液M蛋白和血清FLC测定无法测量,则需要骨髓浆细胞减少>=50%来代替M蛋白,前提是基线百分比>=30%。此外,如果在基线时存在,则需要软组织浆细胞瘤的大小减少>=50%。需要两次连续评估;如果进行放射照相研究,则没有已知的进展性或新骨病变的证据。
5.第1部分:临床受益率(CBR)[时间范围:直至12个月]。CBR定义为如由IMWG统一反应标准所定义的在研究期间实现最小反应(MR)或更佳反应的参与者百分比。MR定义为血清M蛋白降低>=25%但小于或等于(<=)49%且24小时尿液M蛋白降低50%至89%。另外,若在基线时存在,则也需要软组织浆细胞瘤的大小降低25%至49%。溶骨性病变的大小或数量无增加(压缩性骨折的发生不排除反应)。
6.第1部分和第2部分:无进展存活(PFS)[时间范围:自剂量施用日直至因任何原因所致的死亡(直至12个月)]。PFS是根据IMWG标准自第一剂量日直至疾病进展(PD)日或因任何原因所致死亡日的时间。PD:以下自最低反应值增加25%:血清M组分绝对增加>=0.5克/分升(g/dL);若起始M组分>=5g/dL,则血清M组分增加>=1g/dL以定义复发;尿液M组分(绝对增加>=200mg/24h);仅在没有可测量的血清及尿液M蛋白水平的参与者中:参与和未参与FLC水平之间差异(绝对增加>10毫克/分升[mg/dL]);仅在没有可测量的血清及尿液M蛋白水平且通过FLC水平没有可测量疾病的参与者中,骨髓浆细胞%(绝对%>=10%);现有骨病变或软组织浆细胞瘤的大小发生新的或确切的增加;高钙血症的发生可仅归因于浆细胞增生性病症;需要在新疗法之前进行两次连续评价。
7.第1部分和第2部分:反应持续时间(DOR)[时间范围:自第一次记录反应日至第一次记录PD日(直至12个月)]。DOR是自第一次记录反应日至第一次记录PD日的时间。PD是以下自最低反应值增加25%:血清M组分绝对增加>=0.5g/dL;若起始M组分>=5g/dL,则血清M组分增加>=1g/dL以定义复发;尿液M组分(绝对增加>=200mg/24h);仅在没有可测量的血清和尿液M蛋白水平的参与者中:参与和未参与FLC水平之间差异(绝对增加>10mg/dL);仅在没有可测量的血清和尿液M蛋白水平且通过FLC水平没有可测量疾病的参与者中,骨髓浆细胞%(绝对%>=10%);现有骨病变或软组织浆细胞瘤的大小发生新的或确切的增加;可仅归因于浆细胞增生性病症的高钙血症的发生;需要在新疗法之前进行两次连续评价。
8.第1部分和第2部分:实现MR的参与者百分比[时间范围:直至12个月]。实现MR(定义为25%肿瘤减少)的参与者百分比。MR定义为如由IMWG统一反应标准所定义的血清M蛋白降低>=25%但<=49%且24小时尿液M蛋白降低50%至89%。
9.第1部分和第2部分:在施用CTM#4后具有抗药物抗体的参与者人数[时间范围:直至12个月]。
10.第2部分:具有DLT及其他TEAE(包括剂量修改、治疗中断及生命体征)的参与者人数[时间范围:直至12个月]。DLT被定义为研究者认为至少可能与研究药物治疗相关的任何事件。将根据NCI CTCAE 5.0评估毒性。
11.第2部分:总体存活(OS)[时间范围:自剂量施用日直至因任何原因所致的死亡(直至12个月)]。OS定义为自剂量施用日直至因任何原因所致死亡的时间。
12.第2部分:反应时间(TTR)[时间范围:自第一剂量研究治疗日至第一次记录反应日(直至12个月)]。自第一剂量研究治疗日至第一次记录反应(PR或更佳反应)日的时间。PR是血清M蛋白降低>=50%且24小时尿液M蛋白降低>=90%或降低至<200mg/24小时。如果无法测量血清和尿液M蛋白,则需要用参与和未参与的FLC水平之间的差异降低>=50%来代替M蛋白标准。如果血清和尿液M蛋白和血清FLC测定无法测量,则需要骨髓浆细胞减少>=50%来代替M蛋白,前提是基线百分比>=30%。另外,若在基线时存在,则需要软组织浆细胞瘤的大小降低>=50%。需要两次连续评估;如果进行放射照相研究,则没有已知的进展性或新骨病变的证据。
13.第2部分:实现完全反应(CR)或极佳的部分反应(VGPR)的参与者百分比[时间范围:直至12个月]。CR或VGPR是由IMWG标准定义。CR定义为血清及尿液的阴性免疫固定、任何软组织浆细胞瘤的消失及骨髓中<5%的浆细胞;在仅可通过血清FLC水平测量疾病的参与者中,除CR标准以外也需要正常FLC比率为0.26至1.65;需要两次连续评价。VGPR定义为血清及尿液M组分可通过免疫固定检测到但在电泳上检测不到或血清M组分降低>=90%加上尿液M组分<100mg/24h;在仅可通过血清FLC水平测量疾病的参与者中,除VGPR标准以外也需要参与和未参与的FLC水平之间差异减少>90%;需要两次连续评价。
[2]为参与该研究,受试者必须为18岁或以上(成人、老人),且可以是男性或女性。该研究的第1部分的额外纳入标准包括:
1.确诊为MM。
2.患有RRMM且用已知在此参与者群体中赋予临床益处的可用疗法治疗失败、对所述可用疗法不耐受或不是所述可用疗法的候选者。
3.应符合先前疗法的所有以下准则:
应对至少一种蛋白酶体抑制剂(PI)、至少一种免疫调节药物(IMiD)和至少1种类固醇是难治性的。
应接受>=3种先前系列疗法或如果那些系列中之一包括PI与IMiD的组合,则应接受至少两种先前系列疗法。
允许利用抗CD38疗法(包括达雷木单抗)进行先前治疗。
4.患有可测量疾病,其定义为以下中的至少1种:
在血清蛋白质电泳(SPEP)上血清M蛋白>=500mg/dL(>=5g/L)。
在尿蛋白质电泳(UPEP)上尿液M蛋白>=200mg/24h。
如果血清FLC比率异常,参与的FLC水平>=10mg/dL(>=100毫克/升[mg/L])的血清FLC分析结果。
5.东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group)(ECOG)体能状态评分为0或1。
6.在筛选心电图(ECG)上具有由弗雷德里克(Fridericia)方法校正的正常QT间隔(QTcF),其定义为在男性中QTcF<=450毫秒(ms)或在女性中<=470ms。
7.进入研究时符合以下临床实验室标准:
总胆红素<=1.5*正常范围上限(ULN),患有吉尔伯特综合征的参与者除外,在该参与者中直接胆红素必须<2.0*ULN。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)必须<=2.5*ULN。
估计肾小球滤过率(eGFR)>=30毫升/分钟(mL/min/1.73平方米[m2],使用肾脏疾病饮食修正(MDRD)方程式)。
中性粒细胞绝对计数(ANC)>=1000个/立方毫米(/mm3)(>=1.0*109/升[/L]);在与赞助者讨论之后,对于骨髓中具有>50%浆细胞的参与者,>=750/mm3(>=0.75*109/L)的计数可能是可接受的。
血小板计数>=75,000/mm3(>=75*109/L);在与赞助者讨论之后,对于骨髓中具有>50%浆细胞的参与者,>=50,000/mm3(>=50*109/L)的值可能是可接受的。
血红蛋白>=7.5g/dL(不允许通过输血使参与者达到此水平)。
[3]该研究的第2部分的额外纳入标准包括:
1.确诊为MM。
2.应符合先前疗法的所有以下标准:
应对至少1种PI和至少1种IMiD是难治性的或对其不耐受。
应接受>=3种先前系列疗法或如果那些系列中之一包括PI与IMiD的组合,则应接受至少两种先前系列疗法。
允许利用抗CD38疗法(包括达雷木单抗)进行先前治疗,入选未接受抗CD38疗法的扩展群组中的参与者除外。
达雷木单抗-RR群组(每周一次及每两周一次CTM#4给药):在治疗期间的任一时间,参与者必须对达雷木单抗是RR的。应注意,参与者对其他抗CD38疗法的RR不包括在内。
未接受抗CD38疗法的群组(每周一次给药):参与者必须未接受任何先前抗CD38疗法。
3.患有可测量疾病,其定义为以下中的至少1种:
在SPEP上血清M蛋白>=500mg/dL(>=5g/L)。
在UPEP上尿液M蛋白>=200mg/24小时。
倘若血清FLC比率异常,所参与的FLC水平>=10mg/dL(>=100mg/L)的血清FLC测定结果。
4.ECOG体能状态评分为0或1。
5.在筛选ECG上具有正常QTcF,其定义为在男性中QTcF<=450ms或在女性中<=470ms。
6.进入研究时符合以下临床实验室标准:
总胆红素<=1.5*ULN,患有吉尔伯特综合征的参与者除外,在该参与者中直接胆红素必须<2.0*ULN。
血清ALT和AST必须<=2.5*ULN。
使用MDRD方程式,eGFR>=30mL/min/1.73m2。
ANC>=1000mm3(>=1.0*109/L);在与赞助者讨论之后,对于骨髓中具有>50%浆细胞的参与者,>=750/mm3(>=0.75*109/L)的计数是可接受的。
血小板计数>=75,000/mm3(>=75*109/L);在与赞助者讨论之后,对于骨髓中具有>50%浆细胞的参与者,>=50,000/mm3(>=50*109/L)的值可能是可接受的。
血红蛋白>=7.5g/dL(不允许通过输血使参与者达到此水平)。
[4]若受试者符合以下标准中的一项或多项,则将其排除在研究之外:
1.患有多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变(POEMS)综合征、意义未知的单克隆丙种球蛋白病、郁积型(smoldering)骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、淀粉样变性、巨球蛋白血症或免疫球蛋白M(IgM)骨髓瘤。
2.患有NCI CTCAE等级>=3的感觉或运动神经病变。
3.在第一剂CTM#4之前,已在以下最小间隔内接受以下治疗/程序中的任一项的最终剂量:
骨髓瘤特异性疗法(包括PI及IMiD),14天。
抗CD38(a)疗法(一旦已建立MTD/RP2D,对于已接受抗CD38疗法的参与者,便可在研究的扩展阶段(第2部分)调整冲洗期),90天。
用于骨髓瘤的皮质类固醇疗法,7天。
用于局部骨病变的放射疗法,14天。
大手术,30天。
自体干细胞移植,90天。
研究性疗法,30天。
4.已接受同种异体干细胞移植或器官移植。
5.尚未从先前骨髓瘤治疗或程序(化学疗法、免疫疗法、放射疗法)的不良反应(不包括脱发)中恢复至NCI CTCAE V5等级<=1或基线。
6.具有MM中枢神经系统(CNS)累及的临床体征。
7.具有任何器官的已知或疑似轻链淀粉样变性(骨髓活检中存在淀粉样蛋白而没有淀粉样变性的其他证据是可以接受的)。
8.患有充血性心力衰竭(纽约心脏协会)等级>=II或左心室射血分数(LVEF<40%,心肌病变,活动性缺血,或任何其他不受控制的心脏病,(诸如过去6个月内的心绞痛或心肌梗塞),需要治疗(包括抗凝剂)的临床显著心律失常,或临床显著不受控的高血压。
9.具有需要全身性疗法的慢性或活动性感染,以及尚未完全治愈的症状性病毒感染病史(例如,人类免疫缺失病毒(HIV)或B型或C型病毒性肝炎)。
10.在输注任何单克隆抗体或嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法后有全身炎症反应综合征(SIRS)/细胞因子释放综合征(CRS)反应史。
11.患有需要使用剂量大于每天10毫克(mg/天)的泼尼松或等效物的全身性皮质类固醇的慢性病况。
虽然已经通过说明的方式描述了本发明的一些实施方案,但是显而易见的是,在不脱离本发明的精神或超出权利要求范围的情况下,本发明可以通过许多修改、变化和适应并且使用在本领域技术人员范围内的许多等效物或替代方案来实施。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体纳入本文,其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用整体纳入一样。国际专利申请公开WO 2014/164680,WO 2014/164693,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344,WO 2017/019623,WO 2018/106895和WO 2018/140427各自通过引用整体纳入本文。美国专利申请US2015/259428,US2016/17784和US2017/143814的发明均通过引用整体纳入本文。来自GenBank(美国国家生物技术信息中心)的关于本文引用的氨基酸和核苷酸序列的所有电子可用生物序列信息的完整发明均通过引用整体纳入本文。
表20序列
Claims (40)
1.CD38结合融合蛋白,其包含:
a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;
b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):
1)包含SEQ ID NO:34的序列的vHCDR1;
2)包含SEQ ID NO:35的序列的vHCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:36的序列的vHCDR3;和
c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):
1)包含SEQ ID NO:31的序列的vLCDR1;
2)包含SEQ ID NO:32的序列的vLCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:33的序列的vLCDR3。
2.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中CD38结合蛋白包含SEQ ID NO:79的序列。
3.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:43的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:44的序列。
4.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:43的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸同一性的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
5.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:41的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:44的序列。
6.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:41的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
7.CD38结合融合蛋白,其包含:
a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;
b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):
1)包含SEQ ID NO:22的序列的vHCDR1;
2)包含SEQ ID NO:23的序列的vHCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:24的序列的vHCDR3;和
c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):
1)包含SEQ ID NO:19的序列的vLCDR1;
2)包含SEQ ID NO:20的序列的vLCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:21的序列的vLCDR3。
8.如权利要求7所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:37的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:38的序列。
9.如权利要求7所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
10.CD38结合融合蛋白,其包含:
a)志贺菌毒素A亚基效应子多肽;
b)包含以下各项的重链可变结构域(VH):
1)包含SEQ ID NO:28的序列的vHCDR1;
2)包含SEQ ID NO:29的序列的vHCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:30的序列的vHCDR3;和
c)包含以下各项的轻链可变结构域(VL):
1)包含SEQ ID NO:25的序列的vLCDR1;
2)包含SEQ ID NO:26的序列的vLCDR2;和
3)包含SEQ ID NO:27的序列的vLCDR3。
11.如权利要求10所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:39的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:40的序列。
12.如权利要求10所述的CD38结合融合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:39的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:40的序列或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白包含在所述志贺菌毒素A亚基效应子多肽和所述CD38结合结构域之间的第一接头。
14.如权利要求13所述的CD38结合融合蛋白,其中所述第一接头是蛋白质接头。
15.如权利要求14所述的CD38结合融合蛋白,其中所述第一接头包含约1至约50个氨基酸残基。
16.如权利要求14或15所述的CD38结合融合蛋白,其中所述第一接头包含SEQ ID NO:70的序列。
17.如权利要求14或15所述的CD38结合融合蛋白,其中所述第一接头包含SEQ ID NO:70-75中任一项的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白质包含位于所述VH和所述VL之间的第二接头。
19.如权利要求18所述的CD38结合融合蛋白,其中所述第二接头包含序列(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:195),其中n等于1、2、3、4或5。
20.如权利要求19所述的CD38结合融合蛋白,其中n等于1。
21.如权利要求18至20中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述融合蛋白从其N-至C-末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VH-第二接头-VL。
22.如权利要求18至20中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述融合蛋白从其N-至C-末端包含志贺菌毒素A亚基效应子多肽-第一接头-VL-第二接头-VH。
23.如权利要求21所述的CD38结合融合蛋白,其中所述志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQ ID NO:46的序列。
24.如权利要求1至18中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQ ID NOS:45-69中任一项的序列,或与其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。
25.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述志贺菌毒素A亚基效应子多肽包含SEQ ID NO:46的序列,所述VL包含SEQ ID NO:43的序列,并且所述VH包含SEQ ID NO:44的序列。
26.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白与SEQ ID NO:79的序列具有至少95%的氨基酸序列同一性。
27.如权利要求1-26中任一项所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白是同型二聚体。
28.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白包含两个相同的多肽,每个多肽包含SEQ ID NO:79的序列。
29.如权利要求1所述的CD38结合融合蛋白,其中所述蛋白包含两个相同的多肽,每个多肽包含与SEQ ID NO:79具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%氨基酸序列同一性的序列。
30.一种核酸,其编码权利要求1至29中任一项所述的CD38结合蛋白融合物。
31.一种表达载体,其包含如权利要求30所述的核酸。
32.一种宿主细胞,其包含如权利要求31所述的表达载体。
33.一种组合物,其包含(i)如权利要求2所述的CD38结合融合蛋白和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
34.如权利要求33所述的组合物,其中至少约90%的所述CD38结合融合蛋白是同型二聚体的形式。
35.如权利要求34所述的组合物,其中至少约95%的所述CD38结合融合蛋白是同型二聚体的形式。
36.权利要求1至29中任一项所述的CD38结合融合蛋白的制备方法,包括在表达所述CD38结合融合蛋白的条件下培养如权利要求32所述的宿主细胞,并回收所述蛋白。
37.如权利要求1至29中任一项所述的CD38结合融合蛋白的纯化方法,所述方法包括将所述CD38结合融合蛋白与细菌蛋白质L接触。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述蛋白质L分离自或源自大消化链球菌(P.magnus)。
39.如权利要求37或38所述的方法,其中所述蛋白质L与树脂缀合。
40.治疗多发性骨髓瘤的方法,包括向其需要的受试者施用权利要求1至29中任一项所述的CD38结合融合蛋白或如权利要求33至35中任一项所述的组合物。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962795633P | 2019-01-23 | 2019-01-23 | |
US62/795,633 | 2019-01-23 | ||
US201962945106P | 2019-12-06 | 2019-12-06 | |
US201962945107P | 2019-12-06 | 2019-12-06 | |
US62/945,107 | 2019-12-06 | ||
US62/945,106 | 2019-12-06 | ||
PCT/US2020/014831 WO2020154531A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-01-23 | Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113454108A true CN113454108A (zh) | 2021-09-28 |
Family
ID=69726761
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080010483.7A Pending CN113454108A (zh) | 2019-01-23 | 2020-01-23 | 包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11713347B2 (zh) |
EP (1) | EP3914610A1 (zh) |
JP (1) | JP7418756B2 (zh) |
KR (1) | KR20210119421A (zh) |
CN (1) | CN113454108A (zh) |
AU (1) | AU2020213103A1 (zh) |
CA (1) | CA3127660A1 (zh) |
IL (1) | IL284810A (zh) |
MX (1) | MX2021008790A (zh) |
TW (1) | TW202043261A (zh) |
WO (1) | WO2020154531A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160111951A (ko) * | 2014-01-27 | 2016-09-27 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 포유류에 적용하기 위한 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩티드 |
CN113710324A (zh) | 2019-01-23 | 2021-11-26 | 千禧制药公司 | 抗cd38抗体 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160177284A1 (en) * | 2014-01-27 | 2016-06-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions |
CN106414503A (zh) * | 2014-03-11 | 2017-02-15 | 分子模板公司 | 包含邻近氨基酸端的志贺毒素a亚基效应子区和细胞靶向性免疫球蛋白型结合区的蛋白 |
CN107849096A (zh) * | 2015-05-30 | 2018-03-27 | 分子模板公司 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69732640T2 (de) | 1996-09-09 | 2006-01-12 | Zealand Pharma A/S | Festphasen-peptidsynthese |
US7771955B2 (en) | 2005-06-09 | 2010-08-10 | University Of Maryland | Affinity membrane for capture of a target biomolecule and formation thereof by site-directed immobilization of a capture biomolecule |
US7887801B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-02-15 | Topotarget Germany Ag | Optimized DNA and protein sequence of an antibody to improve quality and yield of bacterially expressed antibody fusion proteins |
CN102575542B (zh) | 2009-08-14 | 2014-09-10 | 尤尼弗瑞克斯I有限责任公司 | 用于排气处理装置的安装垫 |
JOP20210044A1 (ar) | 2010-12-30 | 2017-06-16 | Takeda Pharmaceuticals Co | الأجسام المضادة لـ cd38 |
KR101990341B1 (ko) | 2013-03-12 | 2019-06-19 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 세포 내재화를 유도하기 위한 cd20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법 |
EP3024460B1 (en) * | 2013-07-23 | 2020-07-22 | Immunomedics, Inc. | Method for producing antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker |
KR20160111951A (ko) | 2014-01-27 | 2016-09-27 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 포유류에 적용하기 위한 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩티드 |
US9603927B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-03-28 | Janssen Biotech, Inc. | Combination therapies with anti-CD38 antibodies |
US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
ES2864124T3 (es) | 2014-03-11 | 2021-10-13 | Molecular Templates Inc | Proteínas que comprenden regiones de unión, regiones efectoras de la subunidad A de toxina Shiga y motivos señal de localización de retículo endoplasmático carboxi terminal |
CN106604934A (zh) | 2014-06-11 | 2017-04-26 | 分子模板公司 | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 |
KR20170080675A (ko) | 2014-11-05 | 2017-07-10 | 제넨테크, 인크. | 항-fgfr2/3 항체 및 이의 이용 방법 |
CA2972151C (en) | 2015-02-05 | 2022-10-11 | Molecular Templates, Inc. | Multivalent cd20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof |
MX2018001208A (es) | 2015-07-26 | 2018-03-26 | Molecular Templates Inc | Moleculas con direccion a las celulas que comprenden efectores de la subunidad a de la toxina shiga y epitopos de celulas-t cd8+. |
CN110494443A (zh) | 2016-12-07 | 2019-11-22 | 分子模板公司 | 用于位点特异性缀合的志贺毒素a亚基效应子多肽、志贺毒素效应子支架和细胞靶向分子 |
JP7082424B2 (ja) | 2017-01-25 | 2022-06-08 | モレキュラー テンプレーツ,インク. | 脱免疫化された志賀毒素aサブユニットエフェクター及びcd8+t細胞エピトープを含む細胞標的化分子 |
US20200190138A1 (en) | 2017-02-28 | 2020-06-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein purification with protein l |
CN113710324A (zh) | 2019-01-23 | 2021-11-26 | 千禧制药公司 | 抗cd38抗体 |
-
2020
- 2020-01-23 AU AU2020213103A patent/AU2020213103A1/en active Pending
- 2020-01-23 US US16/751,144 patent/US11713347B2/en active Active
- 2020-01-23 CA CA3127660A patent/CA3127660A1/en active Pending
- 2020-01-23 KR KR1020217024877A patent/KR20210119421A/ko active Search and Examination
- 2020-01-23 EP EP20708310.6A patent/EP3914610A1/en active Pending
- 2020-01-23 JP JP2021541634A patent/JP7418756B2/ja active Active
- 2020-01-23 MX MX2021008790A patent/MX2021008790A/es unknown
- 2020-01-23 CN CN202080010483.7A patent/CN113454108A/zh active Pending
- 2020-01-23 WO PCT/US2020/014831 patent/WO2020154531A1/en unknown
- 2020-01-30 TW TW109102913A patent/TW202043261A/zh unknown
-
2021
- 2021-07-13 IL IL284810A patent/IL284810A/en unknown
-
2023
- 2023-06-09 US US18/332,366 patent/US20240092860A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160177284A1 (en) * | 2014-01-27 | 2016-06-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions |
CN106414503A (zh) * | 2014-03-11 | 2017-02-15 | 分子模板公司 | 包含邻近氨基酸端的志贺毒素a亚基效应子区和细胞靶向性免疫球蛋白型结合区的蛋白 |
CN107849096A (zh) * | 2015-05-30 | 2018-03-27 | 分子模板公司 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2021008790A (es) | 2021-08-24 |
US20240092860A1 (en) | 2024-03-21 |
TW202043261A (zh) | 2020-12-01 |
AU2020213103A1 (en) | 2021-07-29 |
KR20210119421A (ko) | 2021-10-05 |
EP3914610A1 (en) | 2021-12-01 |
US11713347B2 (en) | 2023-08-01 |
US20200231650A1 (en) | 2020-07-23 |
WO2020154531A1 (en) | 2020-07-30 |
JP2022523009A (ja) | 2022-04-21 |
IL284810A (en) | 2021-08-31 |
JP7418756B2 (ja) | 2024-01-22 |
CA3127660A1 (en) | 2020-07-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6745923B2 (ja) | 細胞内在化を誘導するためのcd20結合免疫毒素及びそれを用いる方法 | |
KR101529810B1 (ko) | 항체-약물 접합체 | |
US11142584B2 (en) | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same | |
KR20190140943A (ko) | 항-cd33 항체 제제 | |
CN112867507A (zh) | 新型抗sirpa抗体 | |
US20240092860A1 (en) | Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors | |
US11554177B2 (en) | Antibody-drug conjugates targeting human Claudin 18.2 | |
CN113045659B (zh) | 抗cd73人源化抗体 | |
CN116490614A (zh) | 一种双特异性抗体及其用途 | |
US20230406936A1 (en) | Anti-pd-l1 antibody and use thereof | |
WO2021102445A1 (en) | Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents | |
TW202300524A (zh) | 用於移除造血幹細胞的抗體藥物結合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |