JPH08510642A

JPH08510642A - ゲロニンおよび抗体から成る免疫毒素

Info

Publication number: JPH08510642A
Application number: JP6525727A
Authority: JP
Inventors: マークディー．ベター、; ステファンエフ．キャロル、; ゲイリーエム．スタドニッカ、
Original assignee: ゾマコーポレイション
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 1996-11-12
Also published as: CA2162689A1; EP0700444B1; WO1994026910A1; CA2162689C; DE69432412T2; ATE236258T1; AU6912294A; EP0700444A1; DE69432412D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｉ型リボソーム失活性蛋白質（ＲＩＰ）および標的分子に対するジスルフィド結合につき利用しうるシステインを持ったＲＩＰの同族体をコードする精製および分離されたポリヌクレオチドを提供する。これらポリヌクレオチドを含むベクターおよびこれらベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。ＲＩＰおよびＲＩＰ同族体は、遺伝子融合生成物および免疫結合体を含む本発明による細胞毒性治療剤の成分として使用するのに特に適している。本発明による細胞毒性治療剤もしくは免疫毒素は、薬剤の第２成分の特定結合能力によりＲＩＰ成分が標的とする任意の細胞種類を選択的に排除すべく用いることができ、たとえば自己免疫病、癌および移植組織−対−宿主病のような特定の細胞種類の排除を目標とする病気の処置に適している。

Description

【発明の詳細な説明】ゲロニンおよび抗体から成る免疫毒素発明の利用分野本特許申請は、同時出願中の米国特許出願連続番号08/064,691号（1993年５月 12日提出）の一部継続であり、後者は同時出願中の米国特許出願連続番号07/988 ,430号（1992年12月９日提出）の一部継続であり、これはまた出願中の米国特許出願連続番号07/901,707号（1992年６月19日）の一部継続であり、さらにこれはすでに破棄されている米国特許出願連続番号07/787,567号（1991年11月４日提出）の一部継続である。本発明は一般的には、細胞毒性療法薬の成分として有用な物質に関する。より具体的には、本発明はリボソーム不活性化蛋白、リボソーム不活性化蛋白の類似体、このような蛋白や類似体をエンコードするポリヌクレオチドでその一部はターゲティング分子と複合するように特異的に修飾されたポリヌクレオチド、ならびにリボソーム不活性化蛋白をエンコードするポリヌクレオチドのターゲティング分子をエンコードするポリヌクレオチドへの遺伝子融合に関する。発明の背景リボソーム不活性化蛋白（RIP）は、高級植物に遍在する蛋白のクラスを含んで成る。ただし、このような蛋白は細菌からも単離されている。RIPは、真核蛋白合成の阻害物質となる可能性がある。特異的アデニン塩基のN-グリコシド結合は、真核リボソームの28S rRNAのひじょうによく保存されたループ領域にあるRIPによって加水分解により切断され、それにより翻訳が不活性化される。植物RIPは２種類に分けられる（スティルペらによるFEBS Lett．195巻１・２号）１〜８頁（1986年））。Ｉ型蛋白はそれぞれリボソーム不活性化活性を有する単一のペプチド鎖から成るのに対して、II型蛋白はそれぞれ、細胞結合特性を有するＢ鎖にジスルフィド結合した基本的にはＩ型蛋白と等価のＡ鎖で構成される。ゲロニン、dodecandrin、tricosanthin、tricokirin、bryodin、Mirabilis 抗ウイルス蛋白（MAP）、オオムギ・リボソーム不活性化蛋白（BRIP）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（PAP）、saporin、luffins、momordinがＩ型RIPの例であり、リシンおよびアブリンがII型RIPの例である。様々なリボソーム不活性化蛋白についてアミノ酸配列情報が報告されている。Ｉ型RIP、細菌性RIP、およびII型RIPのＡ鎖の間では、RIP活性部位の三次構造は少なくとも保存されているようである。多くの場合、一次構造との相同性も見つかる。レディらによるJ．Biol．Chcm．259巻24号15252〜15256頁（1984年）およびその他の報告では、RIP２つの型は進化的に関連があることを示唆している。Ｉ型植物リボソーム不活性化蛋白は、細胞毒療法の成分として使用するのに特に適していることがある。RIPは、生体内で特定の細胞型にRIPを運んでその細胞を選択的に殺すことができるようにしてくれるターゲティング物質に共役させることができる。標準的には、ターゲティング物質（たとえば抗体）はジスルフィド結合で毒素に結合し、これは生体内で還元され、蛋白毒素が運搬物質の交代から分離して細胞内で活性化できるようにする。標的となる細胞毒蛋白のもう１つの産生方法は、ターゲティング部分をエンコードする遺伝子に融合する細胞毒蛋白をエンコードする遺伝子を発現させることである。こうしてできた蛋白産物は、たとえば１本以上の抗体の鎖に結合する細胞毒蛋白を含有する１ないし複数のポリペプチドから成る。パスタンらはScience 254巻1173〜1177頁（1991年）でこのような様々な遺伝子融合について論じている。ただし、これらの融合蛋白は、ジフテリア毒素また緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）エキソトキシンＡの配列を使って構築されており、この二種の毒素のいずれも細菌由来のADP-リボシルトランスフェラーゼである。これらの蛋白毒素は、RIPの場合とは異なる機序によって細胞を中毒化し、蛋白合成を阻害すると報告されている。さらに、ジフテリア毒素およびエキソトキシンＡは構造的にRIPとは異なり、RIPと似たアミノ酸配列はほとんど示さない。一般に、ジフテリア毒素またはエキソトキシンＡで作られる融合蛋白は動物では免疫原性かつ毒性であり、細胞内での産生量は比較的少ない。細胞毒性物質のもう１つの産生方法は、ターゲティング部分をエンコードする遺伝子に融合されるRIPをエンコードする遺伝子を発現させることである。こうしてできた蛋白産物は、たとえば１本以上の抗体の鎖に結合したRIPを含有する単一のポリペプチドである。Ｉ型RIPのゲロニンなど一部のRIPの主な入手源は稀少な植物材料なので、RIP をエンコードする遺伝子のクローンを作成して、蛋白の組み換え産生できるようにすることが望ましい。また、ターゲティング分子に容易に共役でき、しかも大部分のＩ型RIPはターゲティング物質と共役するための天然の部位（すなわち利用可能なシステイン残基）を持たないので本来の生物学的活性を保持しているような、天然蛋白の類似体を開発することも望ましい。その代わりとして、毒性部分としてＩ型RIPを、ターゲティング部分として抗体物質を含有する遺伝子融合産物を開発することも望ましい。本発明は、新しいヒト化したあるいは人間工学的に作られた抗体、および様々な毒素に共役もしくは融合させることができるこのような抗体を産生する方法ももたらす。このような共役または融合は、自己免疫疾患および癌を含め様々な疾病状態の治療に有用である。マウス抗体のアミノ酸を抗体の人間での形態における類似位置で通常発生するアミノ酸で置換することに関しては複数の報告がある。遺伝子的に設計したマウス／ヒト・キメラ抗体について書いた、たとえばユングハウスらによるCancer Res．50 巻1495〜1502頁（1990年）、その他の発表文献を参照されたい。遺伝子工学の技術を使えば、マウスの超可変相補性決定領域（以下“CDR”という）からの遺伝子情報を、ヒトモノクロナール抗体のCDRをエンコードするDNAの代わりに挿入して、マウスCDRを持つヒト抗体をエンコードする構造物を生成することもできる。ジョーンズらによるNature 321巻522〜525頁（1986年）を参照されたい。このような“CDR-grafted”抗体における蛋白構造分析を利用して、失われた抗原結合能力を回復するためのマウス残基を“add back”（戻し追加する）ことができ、これについてはクリーンらがProc．Natl．Acad．Sci．（USA）86巻1002 9〜10033頁（1989年）に、コウらがProc Nat．Acad．Sci．（USA）88巻2869〜28 73頁（1991年）に述べている。ただし、CDR-graftingの結果、こうして作られるヒト化した抗体の特異的結合活性が弱まるか、あるいは完全になくなってしまうことが頻繁にある。前述のように、Ｉ型RIPをエンコードするクローン化された遺伝子、ターゲティング分子に容易に共役できるＩ型RIPの類似体、またＩ型RIPを構成する遺伝子融合産物、特にそのような遺伝子融合がヒト化抗体部分をも構成する場合の遺伝子融合産物のための技術が必要とされている。発明の要約本発明は、Ｉ型RIPをエンコードする純化され単離されたポリヌクレオチド、ターゲティング分子へのジスルフィド結合に利用できるシステインを有するＩ型 RIP、ならびにＩ型RIPを含んで成る融合産物を提供する。ポリヌクレオチドから成るベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。純化され単離された天然配列ゲロニン（SEQ ID NO：11）をエンコードするポリヌクレオチド、ならびにATCC受託番号68721として寄託されているタイプのゲロニンをエンコードするベクターを含む宿主細胞を提供する。さらに、天然配列オオムギリボソーム不活性化蛋白をエンコードする純化され単離されたポリヌクレオチド、およびmomordinIIをエンコードする純化され単離されたポリヌクレオチドも提供する。上記のポリヌクレオチドの一部は、ゲロニン（SEQ ID NO：２）または別のRIP を含んで成る本発明の融合蛋白、およびその抗原結合部分を含んで成る抗原またはフラグメントをエンコードする。ゲロニンを含んで成る融合蛋白のこれに代わる複数の形式も本発明では企図している。たとえば、融合蛋白はFabまたは単鎖抗体など１価抗体に融合される単一RIPを含有することがある。その代わりに、融合蛋白の多価の形が作られ、単価の形よりも大きな活性を持つことがある。本発明の好ましい実施例では、ゲロニンは抗体のカルボキシル末端またはアミノ末端、あるいはその抗原結合部のいずれかに融合させることができる。やはり本発明の好ましい実施例では、抗体またはその抗原結合部を含むフラグメントは、he3抗体、he3-Fab、he3 Fd、単鎖抗体、またはhe3カッパフラグメントでもよい。抗体およびその抗原結合部は、リンカー・ペプチド、できればSEQ ID NO：56に示されている志賀毒素様毒素のペプチド部分、あるいはSEQ ID NO：57に示されている家兎筋肉アルドラーゼまたはヒト筋肉アルドラーゼのペプチド部分を使ってゲロニンに融合することができ、その例はここで参考文献として挙げているイッツォらによるEur．J．Biochem 174巻569〜578頁（1988年）に報告されている。ここでのＩ型植物RIPの類似体とは、天然蛋白のリボソーム負活性化活性を共有するけれども、天然型RIP蛋白のアミ酸配列とはある程度異なり、ただしその相違の程度は他のＩ型植物RIPのアミノ酸配列との相違ほどではないような、天然発生したのではないポリペプチドのことである。本発明に基づく好ましい類似体は、そのアミノ酸配列のうちSEQ ID NO：１の251の位置から類似体のカルボキシル末端の位置までに相当する位置にあるシスルフィド結合に利用できるシステインをそれぞれ持っているＩ型RIPの類似体である。SEQ ID NO：１は、リシンＡ鎖のアミノ酸配列を表す。本発明に基づく他の好ましい類似体は、天然配座で蛋白表面にあり、リボソーム不活性化蛋白の自然の折り返しや生物学的活性を損なわないような類似体における位置でジスルフィド結合に利用できるシステインをそれぞれ持っているＩ型RIPである。本発明では細菌性RIPの類似体も考えている。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体を提供し、この類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合のために自然では利用できない位置に対応するアミノ酸−で分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有し、またそのシステインは、類似体のアミノ酸配列の中でSEQ ID NO ：１の259の位置に対応する位置で、あるいは類似体のアミノ案配列でSEQ ID ND ：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までに対応する位置にある。本発明に基づく類似体は、ゲロニンの類似体でもよい。本発明に基づくゲロニンの類似体では、システインは類似体の244位置からカルボキシル末端位までの位置、より好ましくは類似体の247位置から類似体のカルボキシル末端位までの位置、また最も好ましくは類似体のアミノ酸配列の244、247または248の位置にある。これらの類似体では、44および50のIｃ位にあるゲロニンシステイン残基がアラニンなどのシステイン以外の残基で置き換えられていることが好ましい。本発明に基づく類似体は、オオムギ・リボソーム不活性化蛋白の類似体でもよい。できれば、このような類似体のシステインは、類似体の256位置からカルボキシル末端位までの位置、より好ましくは類似体の260位置から類似体のカルボキシル末端位までの位置にある。これらの領域でも最も好ましいシステインの位置は、類似体のアミノ酸配列の256、270または277の位置である。本発明に基づく類似体は、momordinIIの類似体もよい。発明に基づく類似体、類似体のアミノ酸配列で、SEQ ID NO：１の259から１アミノ酸以内の位置に相当する位置にシステインを有することができる。このような類似体は、ゲロニンの類似体、オオムギ・リボソーム不活性化蛋白、またはmo mordinIIのいずれの類似体でもよい。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体をエンコードするポリヌクレオチドを提供し、この類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合のために自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置で分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有し、またそのシステインは、類似体のアミノ酸配列の中でSEQ ID NO：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までに対応する位置にある。ポリヌクレオチドはゲロニンの類似体をエンコードし、できればその類似体ではシステインは類似体のアミノ酸配列の中で244の位置から類似体のカルボキシル末端位までに相当する位置にあり、より好ましくはシステインはその類似体の247の位置から同類似体のカルボキシル末端位までの位置にあり、最も好ましくはシステインはその類似体のアミノ酸配列の244、247または248の位置にある。本発明に基づくポリヌクレオチドは、44および50の位置の天然のゲロニンシステイン残基がアラニンなどシステイン以外の残基で置換されているゲロニン類似体をエンコードするのが好ましい。本発明に基づくポリヌクレオチドは、オオムギ・リボソーム不活性化蛋白の類似体をコンコードし、好ましくはこの類似体でシステインは類似体の256の位置から同類似体のカルボキシル末端位までの位置にあり、より好ましくはシステインは類似体の260の位置から同類似体のカルボキシル末端位までの位置にあり、最も好ましくはシステインは類似体のアミノ酸配列の256、270または277の位置にある。本発明に基づくポリヌクレオチドは、momodinIIの類似体をエンコードすることができる。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、この類似体は１型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合のために自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置で分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有し、またそのシステインは、類似体のアミノ酸配列の中でSEQ ID NO：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までに対応する位置にある。本発明はさらに、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体をエンコードするＤＮＡベクターを含む宿主細胞を提供し、この類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合のために自然では利川できない位置に対応するアミノ酸位置で分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有し、またそのシステインは、類似体のアミノ酸配列の中でSEQ ID NO：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までに対応する位置にある。このような宿主細胞では、ベクターはゲロニンの類似体、特にシステインがその類似体のアミノ酸配列の247の位置にあるような、たとえばATCC受託番号69009として寄託されているような宿主細胞におけるような類似体をエンコードできる。本発明に基づく宿主細胞には、オオムギ・リボソーム不活性化蛋白をエンコードするベクトルを含むことができ、特に好ましいのは、277の位置にシステインがあるBRIP類似体を含有する宿主細胞で、たとえば、1991年10月２日にAmerican Type Culture Collection（12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852）にA TCC受託番号68722として寄託された宿主細胞である。特に好ましいのは原核細胞宿主細胞で、これはこの種の細胞は真核細胞に比べて作用またはRIPに対して感受性が弱いからである。本発明は、細胞に特異的に結合する分子にシステインを通じたジスルフィド結合により結合されたＩ型リボソーム不苛性か蛋白の類似体を含む細胞に対して毒性を有する物質も提供し、ここでシステインは類似体のＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合のために自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置にあり、またシステインはSEQ ID NO：１の２５１のIc位から類似体のカルボキシル末端位に対応する位置のアミノ酸配列にある。この物質にはゲロニンの類似体を含むことができ、好ましくはその類似体ではシステインは類似体の247の位置からカルボキシル末端位までの位置にあり、より好ましくはシステインは類似体のアミノ酸配列の 247または248の位置にある。44および50の位置の天然のゲロニンシステイン残基がアラニンなどのシステイン以外の残基で置換されている類似体を含む物質が好ましい。本発明に基づく物質は、オオムギ・リボソーム不活性蛋白の類似体を含み、できればその類似体ではシステインがその類似体の260の位置からカルボキシル末端位までの位置にあり、より好ましくはシステインは類似体の270の位置からカルボキシル末端位にあり、また最も好ましくはシステインは類似体のアミノ酸配列の256、270または277の位置にある。本発明に基づく物質は、momordinIIの類似体を含むことができる。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白が抗体に結合している物質を提供し、具体的にはこの抗体はH65抗体または抗体フラグメントで、より具体的にはキメラおよび人間工学的に作成した抗体フラグメントからなる部類から選択した抗体フラグメント、さらに具体的にいえばFa b抗体フラグメント、Fab'抗体フラグメントまたはF(ab')2抗体フラグメントである。本発明に基づく物質は、Fab抗体フラグメント、Fab'抗体フラグメントまたはF(ab')2抗体フラグメントから成る部類から選択したキメラまたは人間工学的に作成した抗体フラグメントを含むことが何よりも好ましい。本発明に基づくＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体作製方法は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に天然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置において（たとえばRIPをエンコードする天然DNA配列の部位指向突然変異によって、あるいはRIP類似体をエンコードするDNA配列の化学的合成によって）置換される分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有する、Ｉ型リボソーム不活性過融合蛋白またはＩ型RIP（特にゲロニン）をエンコードするポリヌクレオチドを、適当な宿主細胞の中で発現させるステップから成り、ここでシステインは、類似体のアミノ酸配列で、SEQ ID NO：１の251の位置から同類似体のカルボキシル末端位に対応する位置にある。本発明に基づく産物は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置で置換された分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有するＩ型リボソーム不活性化蛋白をエンコードするポリヌクレオチドを、適当な宿主細胞で発現させるステップを含む方法の産物であり、ここでシステインは、類似体のアミノ酸配列でSEQ ID NO：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル端末位置までの位置にある。本発明は、細胞に特異的に結合する分子にシステインを通じてＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体を結合させる段階を含み、細胞に対して毒性を有する物質を調製する方法を提供し、ここでその類似体はＩ型リボソーム不活性蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そのシステインは類似体のアミノ酸配列でSEQ ID NO：１の251に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までの位置にある。本発明に基づくと、特定細胞の排除を目標とするような疾患の治療方法には、その疾患を有する患者に、Ｉ型RIP（特にゲロニン融合したもの）またはＩ型リボソーム不活性化蛋白で、システインを通じてその細胞に特異的に結合する分子に結合するものを含む細胞に対して毒性を有する物質を治療有効量で投与するステップを含み、ここで当該類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そのシステインは同類似体のアミノ酸配列でSEQ ID NO：１の251の位置に対応する位置から類似体のカルボキシル末端位までにある。本発明の免疫毒素複合体に有用な標的細胞としては、癌細胞、自己免疫細胞、ウイルス感染細胞などの病理的細胞が含まれるが、これに限定はされない。このような病理的細胞は、本発明の抗体またはその他のターゲティング物質で、遺伝子工学的技術または化学的架橋によりRIPに結合しているものの標的となることができる。特に有用な標的としては、腫瘍関連抗原（たとえば癌細胞で）、細胞分化マーカー（たとえば自己免疫細胞で）、寄生虫特異抗原、細菌特異抗原、およびウイルス特異抗原がある。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体も提供し、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置、およびその天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上の位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを持っており、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する。このような融合蛋白または類似体は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白がゲロニンであり、類似体ができればゲロニンの類似体で、そこでシステインは1992年６月９日にATCC受託番号69008としてAmerican Type Culture Collection（12301 Par klawn Drive，Rockville，MD 20852）により寄託された宿主細胞中のベクターにエンコードされているように、類似体のアミノ酸配列の10の位置にある。このようなglonin類似体としてはこの他に、システインがゲロニン類似体のアミノ酸配列の60、103、146、184または215の位置にあるものがある。これらの類似体で、44および50の位置のゲロニンシステイン残基がアラニンなどシステイン以外の残基で置き換えられていることが好ましい。本発明はさらに、単一のシステインしか含まないようなＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体を提供する。のような類似体はゲロニンの類似体でよいが、できればその類似体では単一のシステインが類似体のアミノ酸配列の10、44、50または247の位置にあるのが好ましいが、システインは本発明で定められている他の位置にあってもよい。本発明は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白の類似体をエンコードするポリヌクレオチドを提供するが、この類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置、およびその天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上の位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを持っており、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する。本発明に基づくＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体作製方法は、Ｉ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に天然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置において置換された分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを有するＩ型リボソーム不活性化蛋白をエンコードするポリヌクレオチドを、適当な宿主細胞の中で発現させるステップから成り、でシステインは、その天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上のアミノ酸位置に対応する位置にあり、またその類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する本発明は、細胞に特異的に結合する分子にシステインを介したジスルフィド結合により結合されたＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体を含む細胞に対して毒性を有する物質を提供し、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置、およびその天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上の位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合に利用できるンステインを持っており、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する。本発明に基づく細胞に対して毒性を有する物質の作製方法は、細胞に特異的に結合する分子にシステインを通じたジスルフィド結合により結合されたＩ型リボソーム不活性化蛋白の類似体を結合させるステップを含み、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置、およびその天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上の位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを持っており、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する。本発明に基づく特定細胞の排除を目標とするような疾患の治療方法は、当該細胞に対して毒性を有する物質をその疾患を有する患者に治療有効量で投与するステップを含み、当該物質は細胞に特異的に結合する分子にシステインを通じたジスルフィド結合により結合されたＩ型リボソーム不活性化蛋白に融合したＩ型RI Pまたは同蛋白の類似体を含み、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白における分子間ジスルフィド結合に自然では利用できない位置に対応するアミノ酸位置、およびその天然配座におけるリシンＡ鎖の表面上の位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合に利用できるシステインを持っており、その類似体はＩ型リボソーム不活性化蛋白のリボソーム不活性化活性を保持する。本発明のRIP類似体は、細胞毒療法薬の成分として利用するのに特に適している。本発明に基づく細胞毒は、in vivoで使用して、２番目の成分の特異的結合能によってRIP成分が標的とする細胞タイプを選択的に排除することができる。細胞毒を生成するには、RIP類似体をキメラおよびCDR ｇrafted抗体を含むモノクロナール抗体、ならびに抗体領域／フラグメント（たとえば、Fab、Fab'、F(a b')2、単鎖抗体、およびFvまたは単一可変領域）に共役させる。遊離システイン残基を含むように遺伝し工学的に作製したモノクロナール抗体に共役したRIPの類似体も、本発明の対象範囲に入る。本発明で有用なFab'フラグメントおよびＦ(ab')2フラグメントの例については、ここでも参考文献として挙げてある、同時出願中で共同所有の米国特許出願連続番号07,/714,175号（1991年６月14日提出）および1989年２月９日発行の国際出版物番号WO 89/009999に述べられている。本発明のRIP類似体は、たとえばここで述べるhe3抗体など、人化したまたは人間工学的に作製した抗体に共役または融合させるのが好ましい。このような人化した抗体は、マウス抗体H65（SEQ ID NO：123および124）などマウス抗体の可変領域から構築することもできる。特に本発明に基づくRIP類似体は、he3人間工学的作製抗体の軽鎖および重鎖の可変領域（それぞれ、SEQ ID NO：125および126 ）またはそのフラグメントに共役または融合することができる。まったく変化していないhe3免疫グロブリンを産生する細胞系は、ATCC受託番号HB11206としてAm erican Type Culture Collecion（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852）に寄託された。本発明に基づくRIPは、抗体以外のターゲティング物質、たとえば特定の表面炭水化物を有する細胞に結合するレクチン、ホルモン、リンホカイン、成長因子あるいはその他のポリペプチドで特定の受容体を有する細胞に特異的に結合するものとも共役させることができる。RIPを含む免疫複合体は、免疫毒素複合体ということもできる。免疫毒素複合体は、免疫複合体ではなく融合蛋白で構成されることもある。本発明は、抗体の抗原結合部（たとえば、抗体の軽鎖または端を切り取った重鎖、あるいは単鎖抗体）、またはこれまでに列挙されたターゲティング物質でＩ型RIPに結合しているものの遺伝子融合を提供する。抗体の抗原結合部またはそのフラグメントは、単鎖抗体、Fabフラグメント、またはF(ab')2フラグメントを含んで成ることが好ましい。活性抗体は一般に、三次元折りたたみパターンが保存されており、この折りたたみパターンを維持している抗体は結合の特異性を保持していると予想される。このような抗体は、本発明に従って融合蛋白に組み込むときに、標的酵素的活性を保持すると予想される。時として、細胞毒性成分が細胞内で放出されるようにするために、RIPなど細胞毒性成分を含んで成る免疫毒素複合体を切断可能なリンカー（すなわちジスルフィド、酸敏感リンカー、および似たようなもの）を介してターゲティング物質に付着させる必要がある。このように細胞内で放出されると、細胞毒性成分は付着した抗体が持っている可能性のある負の動力学的作用または立体効果によって妨害されずに機能を果たすことができる。したがって、本発明の遺伝子融合は、上述のリンカー蛋白をエンコードするDNAセグメントを介して、抗体をエンコードする遺伝子の5'末端または3'末端のいずれかに融合したRIP遺伝子を含んで成ることがある。リンカーを使用する場合、そのリンカーは、ジスルフィド結合に関与し、プロテアーゼ感受アミノ酸配列を含むループ（たとえばSEQ ID NO： 56に示す大腸菌（E.coli）志賀毒素様毒素のセグメント）あるいは複数のカテプシン切断部位を含むセグメント（たとえば、SEQ ID NO：57に示す家兎筋肉アルドラーゼのセグメント、ヒト筋肉アルドラーゼのセグメント、またはSEQ ID NO：141または142などカテプシン切断部位を含む合成ペプチド）を形成する、２つのシステイン残基を含むポリペプチドをエンコードすることが好ましい。ここに例示するようなカテプシン切断部位を含んで成るリンカーは、RMAのC-末端20アミノ酸を含む。ただし、この配列はヒト筋肉アルドラーゼとは１つのアミノ酸しか異ならず、ヒトまたはその他の入手源から得た筋肉アルドラーゼを下記に述べるような方法でリンカーとして使用することも考えている。融合遺伝子のＩ型RIP部分は、ゲロニン、BRIPまたはmom ordinIIをエンコードすることが好ましい。同様に、融合遺伝子の抗体部分は、抗体Fabフラグメントの鎖の１つ（たとえばカッパまたはFd）をエンコードする配列を含み、また融合遺伝子は他のFab遺伝子とともに宿主細胞で同時発現されるか、あるいは抗体部分が単鎖抗体をエンコードする配列を含んでいることが好ましい。この代わりとして、本発明の融合蛋白が分子量が小さくても（約55kDa）酵素的活性を完全に維持していることから、このような融合をリンカーなしで構築し、しかもなお細胞毒活性を保有していることも可能である。このような低分子量融合は、より大型の融合、たとえばIgG分子を含む融合ほどには動力学的また立体の障害を受けにくい。したがって、RIPの活性化を容易にするために融合からRIPを切り離す必要はない。本発明は、リボソーム不活性化蛋白抗体の部分を含んで成る蛋白または免疫毒素複合体を純化する方法で、蛋白含有溶液を陰イオン交換カラムを通過させる、フロースルーを蛋白Ｇカラムに注入する、蛋白Ｇカラムから蛋白を溶出するというステップから成る方法も提供する。の方法はさらに、陰イオン交換カラムのフロースルーを直接蛋白Ｇカラムに注入するのではなく、陰イオン交換カラムのフロースルーを陽イオン交換カラムに注入する、陽イオン交換カラムを問題の蛋白を溶出するのに有効な溶離液に曝露する、さらに溶出した蛋白を蛋白Ｇカラムに注入するというステップから成ることもある。本発明に基づく免疫複合体および融合蛋白（免疫融合）を含む免疫毒素複合体は、特定の細胞タイプを排除することが目標となる疾患の治療、たとえば自己免疫疾患、癌、移植片宿主疾患の治療に適している。免疫毒素複合体は、免疫抑制を起こしたり、ヒト免疫不全ウイルスなどのウイルスによる感染を治療するのに使用するのにも適している。本発明に基づく特に詳しく示したポリヌクレオチド配列は、E.coli MC1061のプラスミドpING3731（G274株と命名）およびE．coli E104のプラスミドpING3803（G275株と命名）の挿入断片であり、これらは1991年10月２日に、前者は受託番号68721として、後者は受託番号38722として、American Type Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland）に寄託された。本発明の例証となるさらなるポリヌクレオチド配列としては、E．coli E104プラスミドのpING3746（G277株と命名）およびE．coli E104のプラスミドpING3737（G276株と命名）の挿入断片があり、いずれも1992年６月９日に前者は受託番号69008として、後者は受託番号69009 としてATCCに寄託された。、本発明を例証するポリヌクレオチド配列としてはこの他さらに、E．coli E104のプラスミドpING3747（G278株と命名）、E．coli E1 04のプラスミドpING3754（G279株と命名）、E．coli E104のプラスミドpING3758 （G280株と命名）、およびE．coli E104のプラスミドpING3759（G281株と命名）の挿入断片があり、これらのプラスミドはいずれも1992年10月27日に、それぞれ受託番号69101、69102、69103、69104としてATCCに寄託された。前述のように、RIPはhe3のようにヒト化されたあるいは人間工学的に作製された抗体に共役または融合されることが好ましい。したがって本発明では、ヒトCD 5細胞分化マーカーに特異的に反応するヒト化抗体可変領域を含んで成る新しい蛋白も提供する。本発明では特に、SEQ ID NO：95および96のそれぞれに示されているhe3の軽鎖および重鎖の可変領域を含んで成る蛋白を提供する。一定のhe3蛋白をエンコードするDNAは、SEQ ID NO：67および68に示してある。本発明の好まし実施例では、ヒト化抗体可変領域を含んで成る蛋白は、ATCC H B 11206として寄託されている完全な状態のhe3免疫グロブリンである。また本発明の好ましい実施例では、ヒト化抗体可変領域を含んで成る蛋白は、 FabまたはＦ(ab')2あるいはFabフラグメントでもある。本発明に基づく蛋白は、ここに示してあり、またここに参考文献として挙げてあるスタドニッカらによる同時出願された共同所有の米国特許出願17/808,464号に示されている方法によって作製することができ、またこのような方法で作成された修飾抗体可変領域は、ヒトへの治療的投与に単独で使用することもできれば、ベターらによる共同所有で同時出願の米国特許出願07/787,567号に示されている免疫複合体の一部として使用することもできる。本発明は、免疫毒素複合体および免疫融合を作製するのに有用な修飾抗体可変領域を作製する方法も提供し、この方法では、当該領域の抗原に対する本来の親和性を損なうことなく、しかも異種に関する免疫原性を抑えるように修飾可能な対象抗体可変領域のアミノ酸を決定する。、ここでの「対象抗体可変領域」とは、決定を行う対象の抗体のことをいう。、この方法は、以下のステップから成る。修飾使用とする対照抗体可変領域の対象軽鎖および対象重鎖のアミノ酸配列を決定する。多数のヒト軽鎖および重鎖アミノ酸配列を使って対象軽鎖および重鎖を相同性により配列する。対象軽鎖および重鎖配列の中で、対象可変領域の抗原に対する本来の親和性を損なう可能性が最も少なく、しかも一方では対象抗体可変領域の界面領域になく、また対象抗体可変領域の相補性決定領域または抗原結合領域になく、しかもアミノ酸が抗体を含有する溶媒に曝露されるような領域にあるアミノ酸をそれぞれ選択することで免疫原性を抑えるようなアミノ酸配列を同定する。こうして同定した残基で、同定したアミノ酸が大多数のアミノ酸と異なる場合に、多数のヒト軽鎖および重鎖アミノ酸配列に高度または中等度に保存されている残基と整列する残基それぞれを変化させる。別の配列グループ、たとえば図１Ａおよび１Ｂに示す配列グループを使って配列を決定することもでき、この分野の技術に精通したものであればこれから適当な変更を決定することができる。本発明はさらに、多数のヒト軽鎖および重鎖アミノ酸配列を図10Ａおよび10Ｂのヒト共通配列から選択する方法も提供する。一般に、上記の方法に基づく人間工学は、モノクロナール抗体が一般に有効である様々な疾患の治療に利用することができる。ただし、ヒト化抗体には、治療を受けた患者での免疫原性反応を軽減できるというさらなる利点がある。本発明の他の側面および応用については、以下に記す本発明の詳しい説明を検討すれば、この分野の技術に精通している者であればわかるであろう。図面の簡単な説明図１はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖（ＲＴＡ）のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、ゲロニンのアミノ酸配列（配列同定番号：２）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸を示す；図２はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、ＢＲＩＰのアミノ酸配列（配列同定番号：３）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸を示す；図３はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、モモルジンＩＩ（ＭＯＭＯＩＩ）のアミノ酸配列（配列同定番号：４）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸配列を示す；図４はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、ルフィンのアミノ酸配列（配列同定番号：５）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸を示す；図５はコンピュータが作製したリンンＡ‐鎖（ＲＴＡ）のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、αトリコサンチン（ＴＲＩＣＨＯ）のアミノ酸配列（配列同定番号：６）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸を示す；図６はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、モモルジンＩ（ＭＯＭＯＩ）のアミノ酸配列（配列同定番号：７）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸を示す；図７はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、Mirabilis抗ウイルスたんぱく（ＭＡＰ）のアミノ酸配列（配列同定番号：８）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐ 鎖と該Ｉ型ＲＩＰにおいて不変のアミノ酸配列を示す；図８はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱくである、アメリカヤマゴボウの種子からの抗ウイルスたんぱく（ＰＡＰＳ）のアミノ酸配列（配列同定番号：９）であり、星印を付けた位置がリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰ）において不変のアミノ酸を示す；図９はコンピュータが作製したリシンＡ‐鎖のアミノ酸配列（配列同定番号：１）とＩ型リボソーム不活化たんぱく、サポリン６（ＳＡＰ６）のアミノ酸配列（配列同定番号：１０）であり、星印を付けた位置はリシンＡ‐鎖と該Ｉ型ＲＩＰ）において不変のアミノ酸を示す；図１０Ａと１０Ｂは、ヒト抗体可変領域の各々軽鎖［ｈＫ１（ヒトκ軽鎖小群１）、ｋＨ３（ヒトκ軽鎖小群３）、ｈＫ２（ヒトκ軽鎖小群２）、ｈＬ１（ヒトλ軽鎖小群１）、ｈＬ２（ヒトλ軽鎖小群２）、ｈＬ３（ヒトλ軽鎖小群３）、ｈＬ６（ヒトλ軽鎖小群６）、ｈＫ４（ヒトκ軽鎖小群４）、ｈＬ４（ヒト軽鎖小群４）、ｈＬ５（ヒトλ軽鎖小群５）］、および重鎖［ｈＨ３（ヒト重鎖小群３）、ｈＨ１（ヒト重鎖小群１）、ｈＨ２（ヒト重鎖小群２）］の小群についてのコンセンサスアミノ酸配列である；図１１は、Ｈ６５マウスモノクローナル抗体可変領域の軽鎖と重鎖の修飾されたＶ／Ｊ領域をコードする遺伝子の構築において使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す；図１２Ａと１２Ｂは、ヒト抗体ＥＵ、ヒト抗体ＴＡＣ、本発明に従って修飾されたヒト抗体ＴＡＣ（ｐｒｏｐ）と別の方法に従って修飾されたヒト抗体ＴＡＣ（Ｑｕｅ）の可変領域の各々ヒト軽鎖コンセンサスｈＫ１および重鎖コンセンサスｈＨ１の配列と、軽鎖および重鎖配列である。実施例３つの植物Ｉ型ＲＩＰをコードする遺伝子のヌクレオチド配列およびその遺伝子を含む発現ベクターが本発明によって提供される。最初の植物ＲＩＰ、ゲロニンは、東アジアの熱帯林に原生するトウダイグサ属（Euphorbiaceae）の植物である Gelonium multiflorumの種子によって産生され、２番目の植物ＲＩＰ、ＢＲＩＰは一般的な穀類である大麦によって合成される。３番目の植物ＲＩＰは Momordica balsaminaの種子において産生される。ＢＲＩＰの類似体も本発明によって提供される。該類似体を分子間のジスルフィド結合に関与するシステインを含むように遺伝的に設計し、架橋結合因子によるＲＩＰの非特異的な化学誘導を行わずに抗体分子に結合した。本発明のＩ型ＲＩＰ類似体は免疫毒素の成分としての使用にあたって天然たんぱくに比べ明白な利点を提供する。代表的に遊離システインを持たない天然たんぱくに遊離スルフヒドリル基を導入する化学的処理は、アミノ酸側鎖の非選択的修飾に関わる。この非選択性は、しばしば異なるＲＩＰ分子上の異なる部位に結合した抗体（すなわち複合体の異質個体群）を生じ、また抗体がＲＩＰの重要な領域内あるいはその近く（たとえば活性部位あるいは細胞膜を越えた転座に関わる領域）に結合するとＲＩＰ活性の低下をもたらす。これに対し、本発明に従ったＲＩＰ類似体は、類似体の特異的残基へのジスルフィド結合を通して単一の抗体に結合し、免疫複合体のバッチごとの変動の低下と、場合によっては特性が増強された（たとえばより大きな細胞毒性あるいは可溶牲）免疫複合体を生じると考えられる。Ｉ型植物ＲＩＰ、ならびにシガおよびシガ様毒素のＡ鎖のような細菌性ＲＩＰはリシンＡ鎖と相同であり、本発明において有用である。Ｉ型ＲＩＰは、ＲＩＰの主要なアミノ酸配列を天然リシンＡ鎖のアミノ酸配列と比較することによって定義され、これによりＲＩＰ中のシステインの置換部位も同定されうる。後者の三次構造は Katzinら，proteins，10：251-259（1991 ）に述べられており、これは参考文献として本文中に包含される。アミノ酸配列は、リシンＡ鎖とＩ型植物ＲＩＰが９個の不変のアミノ酸を共通して有するＩ型ＲＩＰを定義する。リシン配列に基づくと、不変のアミノ酸はチロシン21、アルギニン29、チロシン80、チロシン123、ロイシン144、グルタミン酸177、アラニン178、アルギニン180、およびトリプトファン211である。リシンＡ鎖はＩ型ＲＩＰの三次元構造のためのモデルとして使用しうる。その主要配列をリシンＡ鎖の主要配列と比較した時［Schwartzらが「たんぱくの配列と構造地図５、補遺３」、National Biomedical Research Foundation，Washington，D． C.（1978）のp.353-358で述べているようにDayhoff突然変異データマトリックス（ＭＤＭ−７８）を用いて、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム、ＰＡＬＩＧＮ（Intell igenetics，Inc.，Mountain View，Caliornia）によって実行される、Myersら， CABIOS COMMUNICATIONS，４（1）：11-17（1988）の配列アルゴリズムに従って］、リボソーム不活化活性と９個の不変アミノ酸は有しているが、結合に使用しうるシステインを持たないたんぱくが、本文中でＩ型ＲＩＰと定義され、本発明において有用であると期待される。「対応する」とは、本文中では、２つのアミノ酸配列をMyersら（前出）の戦略によって比較した時一線になるアミノ酸の位置を指す。Ｉ型ＲＩＰ：ゲロニン、ＢＲＩＰ、モモルジンII、ルフィン［Isalamら，Agri cultural Biological Chem.，54（5）：1343-1345（1991）参照］、αトリコサンチン［Chowら，J．Biol．Chem.，265：8670-8674（1990）参照］、モモルジンＩ［Hoら，BBA,1088：311-314（1991）参照］、Mirabilis抗ウイルスたんぱく［ Habukaら，J．Biol．Chem.，264（12）：6629-6637（1989）参照］、アメリカヤマゴポウの種子から分離した抗ウイルスたんぱく［Kungら，Agric．Biol．Chem. ，54（12）：3301-3318（1990）参照］、およびサポリン［Benattiら，Eur．J． Biochem.，183：465-470（1989）参照］の主要アミノ酸配列は、上述したように Myersら（前出）のアルゴリズムに従って、各々リシンＡ鎖の主要配列［Halling ら，Nucleic Acids Res.，13： 8019-8033（1985）参照］と個々に対応する。図１〜９は、システイン残基が置換されている可能性のあるＩ型ＲＩＰのアミノ酸の位置を予測するために使用しうる。システイン置換のための好ましいアミノ酸は、分子の表面上にあって、システインと置換した場合にたんぱくの固有のひだ形成に干渉しない、なんらかの溶媒と接触可能なアミノ酸を含む。そのようなアミノ酸を含むリシンＡ鎖の領域はカルボキシル末端領域である。置換にあたって避けるべきアミノ酸は、プロリンのように固有のたんぱくひだ形成に必須であるアミノ酸、および溶媒接触不能のアミノ酸である。同時に避けるべきであるのは、ＲＩＰ間で不変の９個のアミノ酸と、Katzinら（前出）の図６に示したようなリシンＡ鎖の活性部位を含む領域内あるいはその近くのアミノ酸である。従って、Ｉ型ＲＩＰにとっての置換の好ましい領域は、溶媒接触可能であるそれらのカルボキシル末端領域であり、II型ＲＩＰのＡ鎖とＢ鎖がジスルフィド結合によって自然に結合しているカルボキシル末端領域に対応する。実施例に示すように、システインはＩ型ＲＩＰのアミノ酸配列中の位置において、配列同定番号：１の２５１位に対応する位置から、該Ｉ型ＲＩＰのカルボキシル末端の位置に置換され、酵素活性を保持しながら且つジスルフィド架橋能力を獲得したＲＩＰ類似体を生じる。システイン置換の好ましい位置の１つは、リシンＡ鎖の２５９位のシステインに対応する位置の近くである。本発明のためには、免疫毒素は毒素‐抗体融合物および免疫複合体をその例とする種類の化合物から成る。免疫毒素は、ヒト自己免疫疾患の治療、および癌のような特定細胞種の除去を目標とする疾患の治療における使用に特に適する。たとえば、免疫毒素による自己免疫疾患の治療は１９８９年８月１０日公開のInte rnational Publication No．WO89/06968に述べられており、これは参考文献として本文中に包含される。治療処方において、免疫毒素は単独で、あるいは２つ以上の免疫毒素、他の治療薬、次のものを含むがそれらに限定されない組成等：免疫抑制薬、耐性誘発薬、増強薬および副作用軽減薬、を含むカクテルとして患者に投与されうる。特に好ましいのは宿主のアレルギー反応を抑制する上で有用な免疫抑制薬である。好ましい免疫抑制薬はプレドニゾン、プレドニゾロン、DECADRON（Merck，Sharp & Dohme，West Point，Pennsylvania）、シクロフォスファミド、サイクロスポリン、6‐メルカプトプリン、メトトレキセート、アザチオプリンおよびi.v.γグロブリンあるいはそれらの組合せを含む。好ましい増強薬はモネンシン、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、アマンタジンおよびクロロキンを含む。これらの薬剤はすべて、Physician's Desk Reference，41版、発行人Edward R．Barnhart，New Jersey（1987）に開示されているような一般に認められている有効用量範囲内で投与される。Patent Cooperation Treaty（ＰＣＴ）の１９８９年８月１０日公開の特許出願WO 89/069767は、免疫抑制薬としての免疫毒素の投与を開示しており、参考文献として本文中に包含される。本発明の免疫毒素は、注射用あるいは局所製剤のいずれかに製剤されうる。、非経口剤型が知られており、本発明における使用、好ましくは筋肉内あるいは静脈内投与のための使用に適している。、治療的に有効な量の免疫毒素を含有する剤型は滅菌溶液、懸濁液、あるいは凍結乾燥形態であり、任意に安定薬あるいは賦形剤を含む。凍結乾燥組成は、網状赤血球溶解産物検定において測定した時生物学的活性が２０ng/ml以下である、およそ宿主の体重の０.０１mg/kgから１０m g/kgまでのレベルの適当な希釈液、たとえば注射用蒸留水、生理食塩水、０.３％グリシン等で還元される。代表的に、本発明の免疫毒素を含む薬剤組成は、患者の約０.０１mg/kgから約５mg/kgまでの範囲の治療的に有効な用量で投与される。本発明の免疫毒素を含む薬剤組成の好ましい治療的有効用量は、順次患者用量上昇療法において、各々１時間かけて投与される毎日の静脈内注入により数日間から２週間にわたって投与される患者の、約０.０１mg/kgから約０.５mg/kg体重までの範囲である。本発明に従った免疫毒素組成は、皮膚科用賦形剤中に治療有効濃度の免疫毒素を含めることにより、局所治療用の局所製剤に製剤しうる。投与すべき免疫毒素の量ならびに局所製剤中の免疫毒素濃度は、選択する賦形剤、患者の臨床状態、全身毒性および製剤中の免疫毒素の安定性に依存する。それ故、医師は、製剤中に適切な濃度の免疫毒素を含有する適切な製剤を用いること、ならびに当該患者あるいは同様の患者に関する臨床経験に応じて投与すべき適切な製剤の量を知っている。局所製剤のための免疫毒素の濃度は、約０.１mg/mlから約２５mg/mlまでより大きい範囲である。代表的に、局所製剤のための免疫毒素の濃度は約１mg/mlから約２０mg/mlまでより大きい範囲である。、本発明に従った免疫毒素の固形分散剤ならびに可溶化製剤も使用しうる。賦形剤中で使用すべき正確な濃度は、治療反応を最大にするため控えめな実験操作に従う。たとえば、皮膚炎症の治療における１％w/wヒドロゲル賦形剤に関しては約１０mg免疫毒素／１００ｇ賦形剤以上が有用と考えられる。、適当な賦形剤は、ゲルの他に、鉱油、石油等を用いた水中油型あるいは油中水型乳剤である。本発明に従った免疫毒素は、経皮的治療系［Barry，Dcrmatological Formulat ions，p.181（1983）およびその中で引用されている文献］を使用することにより任意に局所投与することができる。そのような局所供給送達系は低分子量薬剤の経皮的投与のためにデザインされると考えられるが、それらは経皮的供給送達を行うことができる。さらに、そのような系は免疫毒素あるいはその誘導体、ならびに速度を調節する微小孔膜の適切な選択によって関連する治療たんぱくの投与に容易に適合させうる。全身あるいは局所供給送達のための免疫毒素の局所製剤は、非経口投与のための上述したような賦形剤ならびにコソルベント、界面活性剤、油、湿潤薬、皮膚軟化薬、防腐薬、安定剤および抗酸化薬などの局所製剤において使用される他の賦形剤を使用し、含有することができる。薬理的に許容される緩衝剤、たとえばトリスあるいはリン酸緩衝液も使用しうる。局所製剤はまた任意に、免疫毒素あるいは他の作用物質の経皮的浸透を促進する作用物質のような、増強剤、界面活性剤、促進剤、吸着促進剤あるいは浸透促進剤と様々に称される１個あるいはそれ以上の作用物質を含みうる。そのような作用物質は、望ましくは、当業者には既知であろう次の特徴の一部あるいは全部を有していなければならない：薬理的に不活性であること、体液あるいは電解質喪失を促進しないこと、免疫毒素と適合性である（不活化しない）こと、およびクリーム、ゲルあるいは所望する他の局所供給送達系に製剤しうること。本発明に従った免疫毒素はまた、エアロゾルによって投与し、肺への限局された供給送達を達成することもできる。これは、免疫毒素を含む水性エアロゾル、リポゾーム製剤あるいは固形粒子を調製することによって達成される。通常、水性エアロゾルは従来の製薬的に許容される担体および安定剤と共に免疫毒素の水溶液あるいは懸濁液を製剤することによって作られる。担体と安定剤は個々の免疫毒素についての必要条件に応じて異なるが、代表的には次のものを含む非イオン性界面活性剤（Twccn、Pluronic、あるいはポリエチレングリコール）；血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチンのような無害のたんぱく；グリシンのようなアミノ酸；ならびに緩衝剤、塩、糖あるいは糖アルコール。製剤はまた、粘液溶解薬ならびに気管支拡張薬を含んでもよい。製剤は無菌である。エアロゾルは一般に等張液から調製される。粒子は任意に通常の肺界面活性物質を含む。選択的に、本発明の免疫毒素は、参考文献として本文中に包含される steine rら、米国特許第４,９２５,６７３号が述べているプロテイノイド被包のような供給送達系によって経口投与することができる。代表的に、本発明に従った免疫毒素の治療的に有効な経口用量は、１日当り約０.０５mg/kg体重から約５０mg/k g体重までの範囲である。好ましい有効用量は、１日当り約０.０５mg/kg体重から約５mg/kg体重までの範囲である。本発明に従った免疫毒素は、筋肉内、皮下、髄腔内あるいは腹腔内注射、あるいは血管空隙内、特に関節内への注射、たとえば約１μg/cc関節液／日以上の用量の関節腔内注射によって、局所的ではなく全身的に投与することができる。用量は、十分に医師の技術範囲内であるような、使用する特異的免疫毒素の特性、たとえばその活性と生物学的半減期、製剤中の免疫毒素の濃度、投与部位と投与速度、対象となる患者の臨床耐性、患者が罹患している疾患等に依存するであろう。本発明の免疫毒素は溶液として投与しうる。溶液のｐＨはｐＨ５〜９.５、好ましくはｐＨ６.５〜７.５の範囲内でなければならない。免疫毒素あるいはその誘導体は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン‐ＨＣｌあるいはクエン酸塩等のような適当な製薬的に許容される緩衝剤を含む溶液でなければならない。緩衝剤濃度は１〜１００mMの範囲内でなければならない。免疫毒素溶液はまた、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムのような塩を５０〜１５０mMの濃度で含んでもよい。アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミンあるいはプロタミンの塩のような安定剤の有効用量を含んでもよく、免疫毒素を含む溶液あるいはそれから溶液を調製する組成に加えてもよい。免疫毒素の全身投与は毎日実施することができ、血管内注入も許容されるが、一般には筋肉内注射による。投与はまた鼻腔内あるいは他の非腸管外経路によっても行うことができる。本発明の免疫毒素はまた、マイクロスフェア、リポゾームあるいは血液を含めた特定組織中に設置した他の微粒子供給送達系を通して投与することもできる。局所製剤は毎日皮膚あるいは粘膜に直接適用し、好ましくはその後閉塞する、すなわち包帯、ポリオレフィンフィルムあるいは局所製剤に対して不透過性の他のバリアをかぶせることによって保護する。以下の実施例は本発明の実施を例証するが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。。本出願は次のように幅広く構成されている。本出願の最初の部分は、実例ＲＩＰであるゲロニンの調製、発現および特性を教授する。２番目の部分はヒトが設計した抗体の調製を教授する。本出願の３番目の部分は、ＲＩＰと抗原結合部を含む抗体あるいはそのフラグメントから成る免疫複合体の構築と特性を述べる。４番目の部分は、ＲＩＰと抗原結合部を含む抗体あるいはそのフラグメントから成る免疫融合たんぱくの調製と特性に関する。本出願の５番目の部分は、ＲＩＰである大麦のリボソーム不活化たんぱくの調製と特性を教授し、本発明の最後の局面はＲＩＰ、モモルジンの調製と特性を述べる。特に、実施例１はＲＩＰ、ゲロニンの調製に関する。実施例２では、ゲロニンの発現と精製を含めて、ゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築を教授する。結合に使用しうるシステイン残基を有するゲロニン遺伝子の構築を実施例３で述べ、実施例４はゲロニンに関して実施した網状赤血球溶解産物の結果を示す。実施例５は、本発明の免疫毒素において使用するためのヒトが設計した抗体の構築を教授し、実施例６はｈｅ３遺伝子の形質移入、それらの遺伝子の発現、およびその産物の精製を示す。次に実施例７はゲロニン免疫複合体の調製を教授する。全細胞死滅検定の方法と結果を実施例８に示す。ゲロニン免疫複合体の種々の特性を実施例９で述べ、実施例１０および１１は２種類の免疫複合体の薬物動態を教授する。実施例１２および１３は、それぞれ本発明の免疫複合体の免疫原性およびそれらの免疫複合体のin v ivoでの効果を述べる。ゲロニンの免疫融合をコードする遺伝子の構築を実施例１４、１５、１６、１７および１８において教授する。実施例１９は、本発明の免疫融合において使用するための代替的カテプシン開裂リンカーを示す。免疫複合体をコードする種々の遺伝子の発現と精製を実施例２０に示し、それらの作用特性を実施例２１に示す。ＲＩＰであるＢＲＩＰをコードする遺伝子の構築およびその発現と特性を実施例２２、２３および２４において教授する。最後に、モモルジンをコードする遺伝子の構築および発現に関するモモルジンの特性を実施例２５において教授する。実施例１ゲロニンの調製本発明に従ったゲロニン遺伝子のクローニングは、その比較的まれな天然供給源、G．Multiflorumの種子からＲＩＰ遺伝子産物を精製する必要性を取り除く。クローニングは同時に、事前の化学誘導なしで抗体に結合しうるゲロニン類似体の開発を可能にし、さらにゲロニン遺伝子融合産物の開発も可能にする。 A．G．Multiflorumの種子からのＲＮＡの調製 Ausubel ら、eds．Current Protocls in Molecular Biology，Wiley & Sons， 1989に述べられている植物ＲＮＡの調製ための方法を修正して、Geloniumの種子（Dr．Michacl Rosenblum，M.D．Anderson Cancer Center，Houston，Texas）から全ＲＮＡを調製した。簡単に述べると、種子４.０グラムを、液体窒索であらかじめ冷却しておいた（−７０℃）乳鉢と乳棒で微粉末に粉砕した。粉末を、ＴＬＥ（０.２Ｍトリス、０.１ＭＬｉＣｌ，５mM ＥＤＴＡｐＨ８.２）で平衡させたフェノール８.５mlと共に粉砕緩衝液（０.１８Ｍトリス、０.０９ＭＬｉＣｌ，４.５mM ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，ｐＨ８.２）２５mlに加えた。Poly tron ＰＴ１０３５（No.５設定）を用いて混合物を均質化した。クロロホルム８.５mlを加えて混合し、５０℃で２０分間インキュベートした。混合物を、あらかじめ４℃に冷却しておいたロータにおいて３０００ｇで２０分間遠心分離し、水相を新しい管に移した。フェノール８.５mlを加え、次にクロロホルム８.５ mlを加えて、混合物を再び遠心分離にかけた。この抽出を３回繰り返した。次に 1/3容量の８ＭＬｉＣｌを加えて水相中のＲＮＡを沈降させ、４℃で１６時間インキュベートした。次に、ＲＮＡを４℃で２０分問遠心分離してペレット化した。ペレットを２ＭＬｉＣｌ５mlで洗浄し、遠心分離にかけて、水２ml中に懸濁した。０.３ＭになるようにＮａＯＡｃを加え、２倍容量のエタノールを加えてＲＮＡを沈降させた。該ＲＮＡを７０％エタノール中−７０℃で保存した。Ｂ．ｃＤＮＡの作製２つの方法によって全Gelonium ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。最初の方法は、ｃＤＮＡライブラリー構築システムキットLibrarian II（Invitrogen）を用いて細菌発現プラスミドｐｃＤＮＡIIにおいてｃＤＮＡライブラリーを作製するものであった。全ＲＮＡ約５μｇを任意のプライマーとオリゴ‐ｄＴの１：１混合物で最初のストランドｃＤＮＡに変換した。ＤＮＡポリメラーゼ１による２番目ののストランド合成は、システムの製造業者の指示に従って実施した。二本鎖ｃＤＮＡをＢｓｔＸ１リンカーに連結し、サイズ分割した。約５００塩基対より大きい断片をキットに含まれている発現ベクターに連結した。個々のベクターを、高能率コンピテント細胞への形質転換によって、あるいはエレクトロコンピテント細胞への電気穿孔法によって大腸菌内に導入した。電気穿孔法は、電圧８５０Ｖ、パルスの長さ５mSで、Dowerら、Nucleic Acids Res.，16:6127-6145（198 8）の方法に基づきＢＴＸが勧めているように０.５６μFlatpack細胞においてＢＴＸ１００ユニット（ＢＴＸ，San Diego，CA）によって実施した。。生じるライブラリーは約１５０,０００のコロニーから成っていた。第二の方法は、Perkin‐Elmer‐Cetusが販売しているＲＮＡ‐ＰＣＲキットを用いてｃＤＮＡを作製するものであった。全Gelonium ＲＮＡ約１００ngをｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。Ｃ．ゲロニンたんぱく配列の決定天然ゲロニンたんぱくの部分配列を、Applied Biosystems ４７０Ａ型たんぱくシーケンサーを使用し、製造業者の指示に従って、自動エドマン分解を用いた直接アミノ酸配列分析によって決定した。ゲロニンのたんぱく分解ペプチド断片（全ＲＮＡと同じバッチの種子から分離した）の配列を決定した。Ｄ．ゲロニン遺伝子のクローニング３つのオーバーラップするゲロニンｃＤＮＡ断片をクローンし、３つの断片から合成ゲロニン遺伝子を構築した。１．ベクターｐＩＮＧ３８２３においてゲロニンの中央のアミノ酸をコードする断片のクローニングゲロニンの部分アミノ酸配列に基づく変性ＤＮＡプライマーを用いて Perkin ‐Elmer‐Cetusキットで作製したｃＤＮＡの断片をＰＣＲ増幅した。プライマーのデジェネラシーを最小限に抑えることのできるゲロニンアミノ酸配列の領域に基づいて６個のプライマーをデザインした。適当なプライマーの対をゲロニン遺伝子断片の増幅に関して試験した。所望するＤＮＡサイズの産物をアガロースゲル上でエチジウムブロマイド染色したＤＮＡバンドとして同定し、そのＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、その後アガロースゲルから精製した。gelo‐７および gelｏ‐５と命名したプライマーから成るプライマー対だけが所望する大きさの比較的純枠な産物を生じた。変性プライマーｇelo‐７およびgelo‐５の配列を、ＩＵＰＡＣヌクレオチド記号を用いて以下に示す。プライマーgelo‐７はゲロニンのアミノ酸８７−９７に対応し、プライマーgelo ‐５はアミノ酸２２６−２３６に対応する。プライマーgelo‐７およびgelo‐５で作製した平滑末端ＤＮＡ断片（ゲロニンのアミノ酸８７−２３６に対応する）をｐＵＣ１８（ＢＲＬ，Gaithersuburg，Maryland）中にクローンした。。挿入部のＤＮＡ配列を決定し、その結果得られたＤＮＡ配列に基づいて演繹したアミノ酸配列は、実験的に決定したゲロニンのアミノ酸配列と一致した。このゲロニン断片を含むクローンをｐＩＮＧ３７２６と称した。クローンｐＩＮＧ３７２６の挿入部を３２Ｐで標識し、１５０,０００メンバーのGelonium ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。ライブラリーにハイブリダイズした１つのクローンだけを２倍に平板培養した。このクローンをライブラリーから精製し、そのＤＮＡ配列を決定した。該クローンはゲロニンの２７０個のアミノ酸の内１８５個（残基２５２０９）をコードする断片を含み、ｐＩＮＧ３８２３と称した。２．ゲロニンのＮ末端アミノ酸をコードする断片のクローニングｐＩＮＧ３７２６中のゲロニン遺伝子断片について決定した配列に基づき、正確なオリゴヌクレオチドプライマーを、５’ゲロニン遺伝子断片を増幅するための変性プライマーおよび３’ゲロニン遺伝子断片を増幅するための非特異的プライマーとの連結において使用するＰＣＲ増幅プライマーと命名した。Perkin‐El mer‐Cetus ＲＮＡ‐ＰＣＲキットを用いて作製したｃＤＮＡを増幅した。ゲロニン遺伝子の５’末端を増幅するため、変性プライマーgelo‐１および正確なプライマーgelo‐１０によるＰＣＲ増幅を実施した。該プライマーを以下に示す。プライマーgelo‐１はゲロニン遺伝子のアミノ酸１−１１に対応し、プライマー gelo‐１０はアミノ酸１２６−１３３に対応する。反応からの産物をgelo‐１（配列同定番号：１６）およびgelo‐１１（ゲロニンのアミノ酸１１９−１２５をコードする配列を含む正確なプライマー）で増幅し、反応産物に特異性を与えた。プライマーgelo‐１１の配列を以下に示す。内部プローブによるハイブリダイゼーションは、所望する特異的ゲロニンＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。その断片をｐＵＣ１８中にクローンし、作製したベクターをｐＩＮＧ３７２７と称した。該断片を配列決定したが、変性プライマーgelo‐１の部分に対応する断片の領域（最初の２７個のヌクレオチド）が、プライマーgelo‐１が最初に基づいていたアミノ酸配列を生じるように翻訳されなかったことが明らかになった。これはプライマーのデジェネラシーを考慮すると意外ではなかった。該断片を、正確なプライマーgelo‐１１（配列同定番号：１８）およびgelo‐５’（ゲロニンの最初の１６個のアミノ酸をコードするのに加えてゲロニン遺伝子の５’末端の上流に延びる）によって Gelonium ｃＤＮＡから再増幅した。プライマーgelo‐５’の配列を以下に示す。生じるＤＮＡ断片はゲロニンの最初の１２５個のアミノ酸をコードしている。配列の大半は天然ゲロニン遺伝子と同じであるが、該ＤＮＡ断片の最初の３２個のヌクレオチドが異なると考えられる。本出願のため、このＮ末端断片をＧＥＬ１ ‐１２５断片と称する。３．ゲロニンのＣ末端アミノ酸をコードする断片のクローニングゲロニンの３’末端ならびに３’非翻訳配列を増幅するため、正確なプライマーｇelo‐９およびＸＥ‐ｄＴによるＰＣＲ増幅を実施した。プライマーの各々の配列を以下に示す。プライマーgelo‐９はゲロニンのアミノ酸１０７−１１３に対応する。プライマーＸＥ‐ｄＴは、３’オリゴｄＴ部分と制限部位HindIIIおよびXhoＩを含む５’ 部分から成り、ポリＡを含むｃＤＮＡをプライムする。該反応産物を正確なプライマーgelo‐８とＸＥで再び増幅した。プライマーgelo‐８およびＸＥの配列を以下に示す。プライマーgelo‐８はゲロニンのアミノ酸１１５−１２０をコードする配列から成り、プライマーＸＥは、HindIIIおよびXhoＩ制限部位を含むＸＥ‐ｄＴプライマーの５’部分に対応する。、内部プローブとのハイブリダイゼーションは、所望するゲロニン遺伝子断片が増幅されたことを確認した。次にその断片を２つの異なる方法によってｐＵＣ１８中にクローンした。最初は、平滑末端断片としてｐＵＣ１８のSmaＩ部位にクローンし（生じるベクターをｐＩＮＧ３７２８と称した）、２番目は、EcoRＩからHindIIIまでの断片としてｐＵＣ１８にクローンした（このベクターをｐＩＮＧ３７２９と称した）。両方のベクターの挿入部を配列決定した。ｐＩＮＧ３７２８の挿入部はゲロニンのアミノ酸１１４−２７０をコードし、ｐＩＮＧ３７２９の挿入部はゲロニンのアミノ酸１８４−２７０プラス他の３’配列をコードする。４．オーバーラップするゲロニンＤＮＡ断片の合成ゲロニン遺伝子への構築ゲロニン遺伝子のＣ末端の2/3を再構築するため、ベクターｐＩＮＧ３７２９をSspＩ（１つのSspＩ部位はベクター内に位置し、２番目はベクター中の挿入部の終止コドンの約８０塩基対下流に位置する）で切断し、生じる自由末端に Xh oＩリンカー（８塩基対、New England Biolabs）を連結した。その後ＤＮＡをXh oＩおよびEcoRＩで切断し、作製した、ゲロニンのアミノ酸１８５−２７０をコードする３５０塩基対の断片を分離した。この３５０塩基対の断片を、ｐＩＮＧ３７３０と称する中間ベクター中の、ゲロニンのアミノ酸３７−１８５をコードするｐＩＮＧ３８２３からのNcoＩから EcoRＩまでの断片の近くに連結し、このようにしてゲロニン遺伝子の末端の８７％（アミノ酸３７−２７０）を再構築した。次に、断片ＧＥＬ１‐１２５をSmaＩおよびNcoＩで切断して、ゲロニンのアミノ酸１−３６をコードする断片を生じ、それをｐＩＮＧ３７３０のNcoＩからXho Ｉまでの断片と共にベクターｐＩＣ１００に連結した。［ｐＩＣ１００は、pelB リーダー配列の上流の３７塩基対がないことを除いて、参考文献として本文中に含まれる、Bettcrら，Science，240:1041-1043（1988）が述べたｐＩＮＧ１５００と同じである。３７塩基対はSphＩおよびEcoRＩによるｐＩＮＧ１５００の消化、Ｔ４ポリメラーゼによる処理、およびベクターの再連結によって除去した。この操作は、他の好ましくない制限部位を除去しながらベクター内にEcoRＩ部位を再構築した。］連結の前に、ベクターｐＩＣ１００をあらかじめSstＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、XhoＩで切断しておいた。かかる連結は完全なゲロニンを遺伝子を含む新しいベクターを創出し、これをプラスミドｐＩＮＧ３７３１と命名して、１９９１年１０月２日に受入れ番号６８７２１としてAmerican Type Culture Collection，12301 Park lawn Drive，Rockville，Maryland 20852に委託した。ゲロニン遺伝子の完全なＤＮＡ配列は配列同定番号：１１に示されている。実施例２Ａ．ゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築 Ervinia Carotovora pelBリーダー配列、およびSalmonella typhimurium araB プロモーターに連結したゲロニン遺伝子を含む最初の大腸菌発現ベクターを構築した。araBプロモーターを含む基礎ベクターは、参考文献として本文中に含まれる、１９９１年７月２日発行の共有米国特許第５,０２８,５３０号に述べられている。araBプロモーターを含むベクターをEcoRＩおよびXhoＩで切断した。次に２つのＤＮＡ断片をプロモーターのすぐ下流に縦列連結した。プロモーターの近くに連結した断片は、 SstＩ消化、Ｔ４ポリメラーゼ処理、およびE．carotovoraのPelB遺伝子のリーダー配列を含むｐＩＣ１００ベクターのEcoRＩによる消化から誘導した１３１塩基対の断片であった。翻訳したリーダー配列は、細胞質膜を通しての各々のたんぱく分泌のためのシグナルである。リーダー配列の下流に連結した断片は、完全なゲロニン遺伝子を含むｐＩＮＧ３７３１からのSmaＩからXhoＩまでの断片であった。従って、該発現ベクターはpclBリーダー配列およびaraBプロモーターに連結したゲロニン遺伝子を含む。このプラスミドをｐＩＮＧ３７３３と称する。第二の発現ベクターは、ゲロニンの１９個のＣ末端アミノ酸をコードするゲロニン遺伝子配列を含まないことを除いて、最初のものと同様にして構築される。ゲロニン遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ゲロニンのアミノ酸配列の決定のために作製したいずれのペプチド断片においても検出されなかった１９残基のＣ末端部分を予測した。これらの１９個のアミノ酸は、翻訳後に成熟毒素から開裂される、すなわち天然たんぱく中には存在しないペプチド断片であると考えられる。同様のＣ末端アミノ酸断片が植物毒素αトリコサンチンにおいて同定された［Chowら、 J．Biol．Chem.，265:8670-8674(19900］。それ故、Ｃ末端断片を持たない発現産物は興味深い。ゲロニンの１９個のＣ末端アミノ酸を含まないゲロニン発現ベクターの構築のために、ＰＣＲを用いて該遺伝子の３’末端を増幅し、変化させた。ｐＩＮＧ３７２８をプライマーgelo‐１４とgelo‐９（配列同定番号２０）で増幅した。プライマーgelo‐１４の配列を以下に示す。Ｇｅｌｏ‐１４（配列同定番号：２４）５’ＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＧＡ３’。ゲロニンのアミノ酸２４５−２５６に対応するプライマーgelo‐１４は、ゲロニンの末端の１９個のアミノ酸をコードする配列の前で遺伝子の転写を停止させる終止コドン（プライマー配列の下線部）をゲロニン遺伝子配列に導入し、同時に該終止コドンのすぐ下流にXhｏＩ部位を導入する。該ＰＣＲ産物をXh oＩとEcoRＩで切断し、その結果生じる、ゲロニンのアミノ酸１８５−２５１をコードする２０８塩基対の断片をアガロースゲルから精製した。この断片を、ゲロニンのアミノ酸３７−１８５をコードするｐＩＮＧ３８２３からのNcoＩ EcoR Ｉまでの断片の近くに連結し、プラスミドｐＩＮＧ３７３２を作製した。変化した３’末端を持つゲロニン遺伝子を含む最終的な発現ベクターｐＩＮＧ３７３４を、ｐＩＮＧ３７３２からのゲロニンのアミノ酸３７−２５１をコードするNco ＩからXhoＩまでの断片をｐＩＮＧ３７３３に置換することによって作製した。Ｂ．天然ゲロニンの５’末端の同定逆ＰＣＲを用いて成熟ゲロニン遺伝子の５’末端をコードするｃＤＮＡクローンを同定した。全G．multiflorum ＲＮＡ５μｇを、Gelo‐１１（配列同定番号：１８）をプライマーとし、Superscript Plasmid System（B R L，Gaithersbur g，Maryland）を用いてｃＤＮＡに変換した。ゲロニンのｃＤＮＡを自己連結して共有結合形循環ＤＮＡを作製し、連結したＤＮＡをオリゴヌクレオチドGelo‐ ９（配列同定番号：２０）およびGelo‐１６でＰＣＲによって増幅した。プライマーGelo‐１６の配列を以下に示す。該ＰＣＲ産物をアガロースゲル上でサイズ分割し、３００塩基対より大きいＤＮＡをSmaＩで切断したｐＵＣ１８にクローンした。いくつかのクローンをプライマーGelo‐１８で配列決定した。Gelｏ‐１８の配列を以下に示す最大のゲロニン特異的挿入部を持つと同定されたクローンをｐＩＮＧ３８２６と命名した。、ｐＩＮＧ３８２６のＤＮＡ配列は、ゲロニン発現プラスミドｐＩＮＧ３７３３およびｐＩＮＧ３７３４には必ずしも存在しない天然成熟ゲロニン遺伝子の最初の３２個のヌクレオチドを含んだ。天然ゲロニン遺伝子の完全なＤＮＡ配列は配列同定番号：１１に示されている。Ｃ．天然の５’末端を持つゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築天然５’配列を持ったゲロニン遺伝子を含む発現ベクターｐＩＮＧ３７３３およびｐＩＮＧ３７３４（上述）の誘導体を次のようにして作製した。ゲロニンの５’末端をＰＣＲプラィマーGelo‐１６（配列同定番号：２４）およびGelo‐１７によってｐＩＮＧ３８２６から増幅した。Gelo‐１７の配列を以下に示す。２８５塩基対のＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼで処理し、NcoＩで切断した。、生じる１００塩基対の５’末端ＤＮＡ断片をアガロースゲルから分離し、ｐＩＣ１００からの１２０塩基対のpelBリーダー断片（SstＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、PstＩで切断）の近くに連結し、PstＩおよびNcoＩで消化したｐＩＮＧ３７３３あるいはｐＩＮＧ３７３４のいずれかに連結した。生じるプラスミドｐＩＮＧ３８２４およびｐＩＮＧ３８２５は、pelBリーダーに連結された、 araBプロモーターの転写制御下でのそれぞれ天然ゲロニン遺伝子全体および天然ゲロニン遺伝子から１９個のアミノ酸カルボキンル延長部を除いたものを含む。ｐＩＮＧ３７３４およびｐＩＮＧ３８２５における１９個のアミノ酸カルボキシル延長部を持たない遺伝子構築物は、本出願において「組換えゲロニン」と称されるたんぱく産物をコードする。Ｄ．組換えゲロニンの精製組換えゲロニンを次の工程によって精製した大腸菌発酵肉汁を濃縮し、ＤＣ１０ユニットでのＳ１０Ｙ１０（Amicon）を用いてｐＨ７.０の１０mMリン酸ナトリウムに緩衝液交換した。濃縮し、緩衝液交換した物質をＣＭ５２カラム（１００ｇ，５×１０）に入れた。カラムを開始緩衝液１Ｌで洗浄し、開始緩衝液（総容量７５０ml）中０−３００mMのＮａＣｌ勾配で溶出した。分画を含む純粋ゲロニンをプールし（溶出は１００−２５０mM ＮａＣｌであった）、Amicon ＹＭ１０膜で濃縮し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.０で平衡させ、−２０℃で凍結保存した。Blue Toyopearlクロマトグラフィーを用いてさらなる精製ステップを試みた。しかしながら、この方法は物質の純度上昇をもたらさず、開始物質の約５０％の喪失を生じた。実施例３結合に利用できるシステイン残基を有するゲロニン遺伝子の組み立て野生型ゲロニン蛋白は４４位および５０位に、内因性ジスルフィド結合によって結合しているシステイン残基２個を有する。本蛋白には、各抗体または他の各蛋白への結合に直接利用できる遊離のシステイン残基を含有しない。異なる３種類のアプローチによって、結合に利用できる遊離システイン残基を含有するゲロニンの各類縁体を作り出した。１つのアプローチでは、ゲロニンの一次配列に沿った種々の残基をシステイン残基と置き替え、奇数のシステイン残基を含む一連の類縁体を作りだした。別のアプローチでは、システイン残基２個のうちの１個をアラニンと置き替え、鎖内ジスルフィド結合を欠くが、ただ１個の非対システインを含有する分子を作り出した。さらに別のアプローチでは、両内因性システインをアラニンと置き替え、しかも３番目の非システイン残基をシステインと置き替えて、ただ１個の非対システインを有する類縁体を作り出した。１５種類のゲロニン類縁体を構築した。ゲロニンの非ンステイン残基１０個がシステイン残基と置換する標的であった。ガロニンのアミノ酸配列と天然のアミノ酸配列との比較およびリシンＡ鎖の三次構造（図１参照）から、これらの位置は分子の表面であり、結合に利用できると考えられた。１０種類のゲロニン類縁体は各々、リジン₁₀、アスパラギン₆₀、イソロイシン₁₀₃、アスパラギン酸₁₄₆、アルギニン₁₈₄、セリン₂₁₅、アスパラギン₂₃₉、リジン₂₄₄、アスパラギン酸₂₄₇ 、およびリジン₂₄₈の各残基１個の代わりに置換されたシステインを含み、その類縁体を、それぞれＧｅｌ_C10 、Ｇｅｌ_C60、Ｇｅｌ_C103、Ｇｅｌ_C146、Ｇｅｌ_C184、Ｇｅｌ_C215,、Ｇｅｌ_C ₂₃₉ 、Ｇｅｌ_C244、Ｇｅｌ_C247およびＧｅｌ_C248と表した。内因性ジスルフィド結合に参加する天然のゲロニンシステインの１個が非システイン残基と置き替わった２種類のゲロニン類縁体を構築した。詳細には、５０位のシステインをアラニン残基と置き換えて、４４位におけるジスルフィド結合に利用できるシステインを有するゲロニン類縁体（Ｇｅｌ_A50(C44)と表す、ＳＥＱＩＤ番号９９に示す）を作り出した。Ｇｅｌ_A50(C44)類縁体は、以前はＧｅｌ_C44と表された（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の、同時係属米国特許出願、出願番号第０７／９８８，４３０号を参照されたい）。逆に、４４位のシステインをアラニン残基と置き換えると、ジスルフィド結合に利用できるシステインを５０位に有する類縁体が生じた（Ｇｅｌ_A44(C50)と表す、ＳＥＱＩＤ番号１００に示す）。Ｇｅｌ_A44(C50)類縁体は、以前はＧｅｌ_C5 ₀ と表さればれていた（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の、同時係属米国特許出願、出願番号第０７／９８８，４３０号を参照されたい）。したがって、前述の１２種類の類縁体の組み合わせた連続は、成熟ゲロニン蛋白の全長にわたる。天然のゲロニン・システインを両者ともアラニンで置き換えた別のゲロニン類縁体（Ｇｅｌ_A44A50 ＳＥＱＩＤ番号１０１に示す）を構築した。Ｇｅｌ_A44A50類縁体は、以前はＧｅｌ_C44A _C50A と表されていた。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の、同時係属米国特許出願、出願番号第０７／９８８，４３０号を参照されたい）。天然の両システインの代わりにアラニン残基を置換し、さらに１０位の天然のリジンの代わりにシステイン残基を置換するか（Ｇｅｌ_C10A44A50、ＳＥＱＩＤ番号１１０に示す）、２４７位における天然のアスパレートの代わりにシステイン残基を置換した（ゲル_C247A44A50、ＳＥＱＩＤ番号１１１に示す）、それ以外の２種類の類縁体を構築した。制限フラグメント操作または合成オリゴヌクレオチドを使用するオーバーラップ拡張ＰＣＲによりコンビナント・ゲロニンの変異休を構築した。ＰＣＲに使用するプライマーの配列を以下に記載する。各々の突然変異原性プライマー配列において、システイン残基であれアラニン残基であれ、変化したアミノ酸に対応する各ヌクレオチドに下線を加えた。（１）詳細には、プライマーＨＩＮＤＩＩＩ−２（ｐＩＮＧ３７３４またはｐＩＮＧ３８２５のベクター部分に位置するプライマー）、Ｇｅｌｏ−９およびＧｅｌｏ −８とともに突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−３−２およびＧｅｌｏＣ−４を使用するＰＣＲによりゲロニンのアミノ酸２４７（通常は、リシンＡ−鎖における２５９位のシステインに相当するアスパラギン酸が占拠している）にシステインを導入した。Ｇｅｌｏ−３−２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２を使用し、ＧｅｌｏＣ−４およびＧｅｌｏ−９による併発反応で、鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３４）を増幅した。これらの反応生成物を混合し、外プライマーＧｅｌｏ−８およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、精製し、３部分連鎖反応でプラスミドｐＩＮＧ３８２５内に挿入した。、Ｇｅｌ_C247変異体（ＳＥＱＩＤ番号１０２）のＤＮＡアミノ酸配列を確認した。Ｇｅｌ_C247をコード化している配列を含むプラスミドをｐＩＮＧ３７３７と表し、１９９２年６月９日に、ＡＴＣＣ受け入れ番号第６９００９号として、Americ an Type Culture Collection（アメリカ培養コレクション）、１２３０１ Parkl awn Drive，Rockville，MD 20852に寄託した。（２〜３）同じ様式で、類縁体Ｇｅｌ_C248（ＳＥＱＩＤ番号１０３）を生じさせるに突然変異原性オリゴヌクレオチドＧｅｌｏＣ−１およびＧｅｌｏＣ−２を使用してゲロニンの２４８位のアミノ酸（リジン）の代わりにシステイン残基を導入し、プラスミドｐＩＮＧ３７４４において類縁体Ｇｅｌ_C239（ＳＥＱＩＤ番号１０４）を生じさせるにプライマーＧｅｌｏＣ−９およびＧｅｌｏＣ−１０を使用してアミノ酸２３９位（通常はリジンが占拠している）にシステイン残基を導入した。（４）また同じ様式で、ｐＩＮＧ３７３６と表されるプラスミドにおいて類縁体Ｇｅｌ_C244（ＳＥＱＩＤ番号１０５）を生成させるために突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−５およびＧｅｌｏＣ−６を使用してシステイン残基をゲロニンのアミノ酸２４４（リジン）に導入した。本変異体は、プラスミドｐＩＮＧ３８２５ではなくプラスミドｐＩＮＧ３７３４を鋳型ＤＮＡとして使用するＰＣＲによって調製した。したがって、本変異体はプラスミドｐＩＮＧ３７３７、プラスミドｐＩＮＧ３７４１、プラスミドｐＩＮＧ３７４４と同じＮ−末端ゲロニン・アミノ酸配列をコード化しているが、天然のゲロニン５’末端ヌクレオチドの代わりに、ＰＣＲプライマー誘導性５’−末端ヌクレオチド３２個を含んでいる。（５）類似した手法によりゲロニンの１０位にアミノ酸（通常はリジンが占拠している）の代わりにシステイン残基を導入した。突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−１３およびＧｅｌｏＣ−１４を使用し、ｐＩＮＧ３８２４ａｒａＢ２（ベクター・プライマー）およびＧｅｌｏＣ−１４でし増幅し、さらに別個の反応で、ＧｅｌｏＣ−１３およびＧｅｌｏ−１１で増幅することによってシステインを導入した。以上の反応の各生成物を混合し、外プライマーａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１で増幅した。ＰＣＲ生成物をＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断し、精製し、ｐＩＮＧ３８２５に戻しクローン化して、ｐＩＮＧ３７４６と表されるプラスミドに類似体Ｇｅｌ C10（ＳＥＱいＤ番号１０６）を生じさせ、１９９２年６月９日に、ＡＴＣＣ受け入れ番号第６９００８号として、American Type Culture Collection（アメリカ培養コレクション）、１２３０１Parklawn Drive ，Rockville，MD 20852に寄託した。（６）Ｇｅｌ_C10変異体の場合と同じ様式で、オリゴａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１とともに２種類の突然変異原性オリゴ、ＧｅｌｏＣ−１５およびＧｅｌｏＣ−１６を使用してゲロニンの６０位のアスパラギンをシステイン残基で置換した。Ｇｅｌ_C60（ＳＥＱＩＤ番号１０７）類縁体をコード化しているプラスミドをｐＩＮＧ３７４９と表した。（７）プライマーａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２とともに突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２０およびＧｅｌｏＣ−２１を使用し、ＰＣＲによってアミノ酸１０３（イソロイシン）にシステインを導入した。ＧｅｌＣ−２１およびａｒａＢ２で鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を増幅し、別個にＧｅｌｏＣ− ２０およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。以上の反応の各生成物を混合髭、外プライマーａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物をＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで切断し、精製し、ＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで消化したｐＩＮＧ３８２５に挿入した。残基１０３のシステインを配置するのに使用した各オリゴヌクレオチドも、クローン化遺伝子で確認したＡｆｌＩＩＩ制限部位を導入した。Ｇｅｌ_C103（ＳＥＱＩＤ番号１０８）類縁体を含むプラスミドをｐＩＮＧ３７６０と表した。（８）類似した戦術で１４６位（アスパラギン酸）にシステインを導入した。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２２およびＧｅｌｏ−１４で増幅し、別個に突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２３およびＧｅｌｏ−１９で増幅した。、以上の反応の各生成物を混合し、Ｇｅｌｏ −１９およびＧｅｌｏ−１４で増幅した。、反応生成物をＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断すると、３部分連鎖反応でｐＩＮＧ３８２５に挿入することが可能である。、残基１４６のシステイン配置に使用した各オリゴヌクレオチドも、クローン化遺伝子で確認することができるＮｄｅＩ制限部位を導入した。（９）ゲロニンの１８４位（通常はアルギニンが占拠している）にシステインを導入するため、鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧＧ３７３３）を突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２５およびａｒａＢ−２で増幅し、別個に突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２４およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。以上の反応の各生成物を混合し、ａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１４で増幅した。。反応生成をＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで切断し、ＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで予め消化したｐＩＮＧ３８２５に挿入した。。残基１８４のシステインを配置するのに使用した各オリゴヌクレオチドも、クローン化遺伝子で確認されたＮｓｉＩ制限部位を導入した。Ｇｅｌ_C184（ＳＥＱＩＤ番号１０９）変異体をコード化している配列を含むプラスミドをｐＩＮＧ３７６１と表した。（１０）類似した戦術で２１５位（セリン）にシステインを導入することも可能である。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ−２７およびａｒａＢ２で増幅し、別個に突然変異原性プライマーＧｅｌｏＣ −２６およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。以上の反応の各生成物を混合し、ａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物をＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩで切断すると、３部分連鎖反応でｐＩＮＧ３８２５に挿入することも可能である。（１１）天然のゲロニン・システイン残基２個のうちの１個を、５０位のシステインをアラニンと置き換えることによって、遊離システイン残基を有する別のゲロニン変異体を生じさせた。プラスミドｐＩＮＧ３８２４をブライマーＧＥｌｏＣ−１７およびＧｅｌｏ−１１でっ増幅し、同時発生的に別個の反応でプライマーＧｅｌｏＣ−１９およびａｒａＢ２で増幅した。各反応生成物を混合し、ａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１で増幅した。本生成物をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐＩＮＧ３８２５のベクター部分に戻しクローン化してｐＩＮＧ３７４７（ＡＴＣＣ６９１０１）を生じさせた。この類縁体はＧｅｌ_A50(C44)と表され、４４位アミノ酸のシスルフィド結合に利用できるシステインを含んでいた。４４位にただ１個のシステインを有するゲロニン類縁体を生成するために、ゲロニンの活性を崩壊しない、アラニン以外の非システイン残基を天然のゲロニンの５０位に挿入することも可能である。（１２）プライマーａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２とともに突然変異原性オリゴヌクレオチドＧｅｌｏＣ−２８およびＧｅｌｏＣ−２９を使用してｐＩＮＧ３７３３天然の４４位のシステインをアラニンに変えたゲロニン変異体を構築した。増幅したＤＮＡをＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ゲロニンベクターにクローン化して、ｐＩＮＧ３７５６を生じさせた。生成した変異体をＧｅｌ_A44(C50) と表した。５０位にただ１個のシステインを有するゲロニン類縁体を生成するために、ゲロニンの活性を崩壊しない、アラニン以外の非システイン残基を４４位に挿入することも可能である。（１３）プライマーａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１とともに突然変異原性オリゴヌクレオチドＧｅｌｏＣ−１７およびＧｅｌｏＣ−１８を使用し、ｐＩＮＧ３８２４のオーバーラップＰＣＲによって、ゲロニンの４４位のシステインと５０位のシステインの両者をアラニン残基に変えたゲロニン変異体を構築した。天然のゲロニン蛋白同様、本類縁体には結合に利用できるシステイン残基がない。本類縁体をコード化しているプラスミドをｐＩＮＧ３７５０と表した。生成した類縁体をＧｅｌ_A44A50（ＳＥＱＩＤ番号１０１）と表した。システイン残基を持たないゲロニン類縁体を生成するために、ゲロニンの活性を崩壊しない、アラニン以外の非システイン残基を、４４位と５０位の両位で置換することも可能である。（１４）プラスミドｐＩＮＧ３８２４、ｐＩＮＧ３７５０およびｐＩＮＧ３７３７から３重突然変異体Ｇｌｏｎｉｎ_C247A44A50（ＳＥＱＩＤ番号１１１）を構築した。本変異体は２４７位に導入されたシステインを有するが、４４位と５０位の天然の両システイン残基はアラニンで置き換えられている。本類縁体の場合、抗体へのジスルフィド結合は唯一のシステイン残基でのみ保証されるため、本類縁体は好適である。プラスミドｐＩＮＧ３８２４をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロース・ゲルでベクター・フラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３７５０をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＩＮＧ３７３７をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断した。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは４４位および５０位にアラニンをコード化しているが、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントは２４７位にシステインをコード化している。これらの各フラグメントを精製し、ＮｃｏＩからＸｈｏＩベクターフラグメントに結合させた。結果として生じたプラスミドをｐＩＮＧ３７５２と名付けた。（１５）先に構築した各プラスミドから組み立てることによって、３重突然変異体Ｇｅｌｏｎｉｎ_C10A44A50（ＳＥＱＩＤ番号１１０）も構築した。この場合、ｐＩＮＧ３７４６はＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断したが、ｐＩＮＧ３７５０はＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断した。アガロース・ゲルによる電気泳動法で各挿入フラグメントを精製し、そのフラグメントをＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化したベクター・フラグメント内に結合させた。結果として生じたベクターをｐＩＮＧ３７５３と表した。Ｇｅｌ_C10A44A50類縁体は、以前はＧｅｌ_C10CA44AC50Aと表されていた（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の、同時係属米国特許出願、出願番号第０７／９８８，４３０号を参照されたい）。構築した各ゲロニン変異体を大腸菌菌株Ｅ１０４にトランスフォームした。アラビノースを含む細菌培養に導入する際に、培養上澄のゲロニン・ポリペプチドをゲロニン特異的抗体で検出することができた。プラスミドｐＩＮＧ３７３４およびｐＩＮＧ３８２５によるゲロニンの発現レベルと、任意のゲロニン変異体による発現レベルの間に有意差は認められなかった。各蛋白は、大腸菌内で約１ｇ／ｌのレベルで産生された。実施例４網赤血球ライゼート・アッセイ PressらがImmunol．Letters，14:37-41（1986）に記述した網赤血球溶解物アッセイ（ＲＬＡ）を使用して、ゲロニンおよびリコンビナント・ゲロニン類縁体がイン・ビトロで蛋白合成を阻害する能力を試験した。本アッセイは、ウサギ赤血球細胞溶解物由来の内因性グロビンｍＲＮＡを使用して無細胞経における蛋白合成阻害を測定する。トリチウム標識ロイシン（３Ｈ−Leu）の取り込み低減を毒素濃度の関数として測定した。１μg/ml〜１pg/mlの範囲にわたって、標準毒素（ＲＴＡ３０と略される、３０ｋＤ型リシンＡ鎖）、天然のグロビン、リコンビナント・ゲロニン（ｒＧｅｌｏｎｉｎまたはｒＧｅｌ）およびゲロニン類縁体の系列対数希釈を試験した。サンプルを３重に試験し、氷上で調製し、３７℃で３０分間インキュベートし、続いてInotec Trace９６カスケード・イオン化カウンターで計数を行った。非阻害サンプルと比較することにより、５０％蛋白合成阻害（ＩＣ₅₀）に相当する毒素のピコモル濃度（pM）を算出した。下記の表１からわかるように、リコンビナント・ゲロニンおよびその類縁体のほとんどは天然のゲロニンに匹敵する活性を示した。類縁体の一部（Ｇｅｌ_C239など）では、ＲＬＡ活性は消失していた。実施例５イムノトキシン構築のためのヒト工作抗体本発明によるイムノトキシン構築に使用するための抗体は、高値のヒト・アミノ酸含量およびヒトＣＤ５細胞分化マーカーに対する高アフィニティを示すｈｅ３やそのフラグメントなど、人間化した抗体であってもよい。ｈｅ３はマウスＨ６５抗体の人間化型である（Ｈ６５は本発明による人間化抗体の調製に使用する好適モノクローナル抗体であり、メリーランド州ＲockvilleのAmerican Type Cu lture Collection（アメリカ培養コレクション、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）に寄託して受け入れ番号ＨＢ９３８６号を与えられたハイブリドーマ細胞株ＸＭＭＬＹ−Ｈ６５（Ｈ６５）により産生される）。本発明に使用する人間化抗体は、両可変領域で以下に記述する低リスク変化と中等度リスク変化の両者が行われたネズミＨ６５抗体の人間型を使用して本明細書に開示された通りに調製される。このような人間化型抗体類は免疫原性が低く、ヒトの自己免疫疾患の治療における治療的有用性がある。例えば、同抗体類はＨ６５などの既存の治療的モノクローナル抗体よりアフィニティが高いため、同じ治療効果を得るために本発明のＨ６５抗体ＣＤ５抗体より低用量でｈｅ３抗体を投与することが可能である。ｈｅ３など、人間化抗体は外来抗体の免疫原性低減に有用であり、免疫複合体の一部として使用するとき、効能が増強することになる。本発明に従い、イムノトキシンの成分として使用される人間化抗体可変領域の構築は、（１）抗原に対する本領域の生来のアフィニティを低減させないが、異型種に関して免疫原性を低減させて修飾することが可能な抗体可変領域のアミノ酸残基を同定するステップと、（２）同定された、異型種に投与するのに有用な残基に修正を加えた抗体可変領域を調製するステップを含む方法に基づくものであってもよい。本発明の方法は各アミノ酸が本領域の構造に関与していることを予言する、本明細書に記載されている抗体可変領域のモデルに基づくものである。古典的抗体フレームワーク領域全体とヒト抗体由来のものとの置き換えを擁護する、抗体を人間化する他の方法と違って、本明細書に記載されている方法はヒト残基を抗原結合活性に重要ではなく、たぶん免疫厳正刺激因子に曝露されている位置の抗体可変領域のみに導入する。本法は、可変領域の天然の内部構造を十分に保持するように設計されているため、修飾された領域の抗原結合能は天然の領域に比べて低減していない。中等度のリスク残基がマウス残基からヒト残基に変換されているヒト共通配列を、ライン標識したｈＫ１（すなわち、ヒトκ鎖の小群１およびｈＨ３（すなわち、ヒト重鎖の小群３）として図１０Ａおよび１０Ｂに示す。「結合」および「埋没」ラインにおける保存およびリスクに関する図中の符号は以下の通りである。ペアをなしている最初の符号（リガンド結合）＋抗原結合ループに対する影響が少ないか直接の影響がなく、置換された場合には低リスクである ○ 抗原結合ループ構造に間接的に関与、変化を受けた場合には中等度のリスクである。− 抗原結合コンフォメーションまたは抗原接触に直接関与、修飾を受けた場合にはリスクは大きいペアをなしている２番目の符号（免疫原性／構造）＋溶媒に極めて影響されやすく、免疫原性が高く、置換された場合には低リスクである ○ 部分的に埋没されている、中等度の免疫原性、変化を受けた場合には中等度のリスクである − サブユニットの疎水性コアに完全に埋没している、低免疫原性、変化を受けた場合には高リスクである＝サブユニット間の界面に完全に埋没している、低免疫原性、修飾を受けた場合には高リスクであるペアの意味＋＋低リスク溶媒に極めて影響をうけやすく、免疫原性が高いが、特異的抗原結合に対する影響は少ないか皆無である ○＋、＋○、○○ 中等度のリスク軽度の免疫原性、いいかえれば抗原結合との間接的関連全ての−または＝高リスクサブユニット・コア／界面内に埋没している、いいかえれば抗原結合に強く関与しているが、免疫原性潜在能は低いライン標識した“ｍｏｄ”、点（．）は中等度のリスクで「マウス」から「ヒト」に突然変化する可能性がある残基を表す。このような中等度リスクの位置は２９ある。マウス残基は、生涯の５０％の以上、１３１の位置でヒト共通残基と適合する（１０２の位置は９０〜１００％適合し、２９の位置は５０〜９０％適合する）。これらの位置は変化を受けなかった。図１２Ａおよび１２Ｂにおけるライン標識したＭ／Ｈは、マウス配列とヒト配列の間で顕著に異なる９１の位置を示す（すなわち、生涯の５０％未満に、ヒト配列がマウス残基を有する）。Ｍ／Ｈラインにおいてｍで表される、中等度のリスクの位置は、「マウス」のままであったが、Ｈまたはｈと表示されているものはヒトに変化した。すでにヒト様であるかｍ先に人間化された２５の低リスク位（実施例２に前述されている）は、Ｍ／Ｈラインで“＾”と記述されている。最後に、マウス残基およびヒト残基が適合しなかった５４の高リスク位は、Ｍと表示され、「マウス」を維持している。マウス配列とヒト配列が異なる中等度のリスク位に１５の差が発生した。これらの位置のうち１０（図６のＭ／Ｈライン上、“Ｈ”と表されている）では、マウス残基はヒト共通アミノ酸と並んでいる。従って、その位置におけるマウス残基は、保存されているヒト残基に変わるものとして同定される。マウス配列とヒト配列が異なる中等度のリスク位（“ｍ”と表される）では、マウス残基は中等度に保存されているヒト共通アミノ酸と並んでいる。しかし、マウス残基は、他の実際のヒト抗体配列における位置で確認されるため［Kabat ら、sequence of proteins of Immunoglobulin Interrest，Fourth Edition，U. S．Department of Health and Human Services，Public Health Servi ce，Nat ional Institutes of Health(1987)」、その位置は「マウス」が保持されるものとして同定される。の特定の配列にこのような位置はないが、他の抗体にこのような位置が発生する可能性がある。４つの中等度のリスク位（“ｈ”と表されている）で、マウス残基は中等度に保存されているヒト共通アミノ酸と並んでいるが、マウス残基は前記Kabatら、S equence of Proteins of Immunoglobulin Interestの実際のヒト抗体配列におけるその位置で確認されない。したがって、その位置は「ヒト」に変わるものとして同定される。マウス配列とヒト配列が異なる１つの中等度リスク位（“ｍ”と表される）で、マウス残基は保存が不十分なヒト共通アミノ酸と並んでいる。したがって、その位置は「マウス」が保持されるものとして同定される。Ａ．中等度リスク重鎖発現ベクターの組み立て中等度リスク残基を含む人間化Ｈ６５重鎖を、下記の戦術組み立てた。中等度リスク発現ベクターを中間ベクターから組み立てた。図１２に開示され、ＨＵＨ −Ｇ１１、ＨＵＨ−Ｇ１２、ＨＵｈ−Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ４、ＨＵＨ−Ｇ５、およびＨＵＨ−Ｇ６で標識された６種類のオリゴヌクレオチド配列（オリゴ）を（ＨＵＨ−Ｇ１１およびＨＵＨ−Ｇ１２の配列は、ＳＥＱＩＤ番号１３１および１３２に記述し、ＨＵＨ−Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ４、ＨＵＨ−Ｇ５、およびＨＵＨ−Ｇ６はＳＥＱＩＤ番号１３７〜１４０に記述されている）ＰＣＲで組み立てた。各ＤＮＡ１μgとの１００μl反応において、合成ヒト抗体遺伝子を含む各オリゴヌクレオチドをペアで混合し（ＨＵＨ−Ｇ１１＋ＨＵＨ−Ｇ１２、ＨＵＨ−Ｇ３＋ＨＵＨ−Ｇ４、およびＨＵＨ−Ｇ５＋ＨＵＨ−Ｇ６）−上記の通り満たした。各反応生成物の一部をペアで混合し（ＨＵＨ−Ｇ１１、ＨＵＨ−Ｇ１２＋ＨＵＨ −Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ４＋ＨＵＨ−Ｇ５、６）、２．５ＵのＴａｇを加え、上記の通り、サンプルを再度インキュベートした。等量のＨＵＨ−Ｇ１１、ＨＵＨ−Ｇ１２、ＨＵＨ−Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ４反応生成物をＨＵＨ−Ｇ３、ＨＵＨ−Ｇ４、ＨＵＨ−Ｇ５、ＨＵＨ−Ｇ６生成物と混合し、続いて上記の通り、０．５ugのプライマーＨ６５Ｇ−２ＳおよびＨ６５−Ｇ２を使するＰＣＲによりＶ−Ｊ領域を組み立てた。反応生成物をＳａｌＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、Rodinsonら、Hum．Antibod．Hybridomas 2:84（1991）の重鎖について記載されているものに類似した発現ベクター内でクローン化し、ｐＩＮＧ４６１７が生成した。、本プラスミドをSquenase（ＵＳＢ，Cleveland）で配列決定すると、残基２個が変化していた（２８８位におけるＧ−Ａおよび３１２位におけるＡ−Ｔ、リーダー配列の始めから番号をつけた）。ｐＩＮＧ４６１２由来の領域の置換によって正確な可変領域が回復され、予想されたｐＩＮＧ４６１９のＶ−領域配列が生じた。オリゴＨＵＨ−Ｇ１３、ＨＵＨ−Ｇ１４、ＨＵＨ−Ｇ１５およびＨＵＨ−Ｇ１６（図１１およびＳＥＱＩＤ番号１３３〜１３６）のＰＣＲ組み立てにより、他の、中等度リスク変化を含む中間ベクターを構築した。オリゴＨＵＨ−Ｇ１３＋ＨＵＨ−Ｇ１４およびＨＵＨ−Ｇ１５＋ＨＵＨ−Ｇ１６を混合し、１０mM ＫＣｌ、２０mM ＴＲＩＳｐＨ８．８、１０mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₂、２mM ＭｇＳＯ₄ 、０．１％ TritonX−１００、１００ng/ml ＢＳＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および２単位ンのベント（Vent）ポリメラーゼ（New England Biotabs）を含む、総量１００μ ｌの反応において、ベントポリメラーゼを満たした。反応混合物を９４℃で１分間インキュベートし、続いて５０℃で２分間、さらに７２℃で２０分間インキュベートした。反応生成物（４０μｌ）を混合し、オリゴヌクレオチドＨ６５−Ｇ１３およびＨ６５−Ｇ２ならびに同一反応緩衝液中のベントポリメラーゼで増幅し、９４℃で１時間変性させることにより２５サイクル間増幅した。反応生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、続いてＡｃｃＩで消化した。アガロース・ゲルで２７４塩基対（ｂｐ）フラグメントを精製し、１４１ｂｐの、ｐＩＮＧ４６１９由来のＳａｌＩからＡｃｃＩまでのフラグメントと一緒に結合させ、ＳａｌＩおよびＳｍａｌでｐＵＣ１８を切断するとｐＩＮＧ４６２０が生じた。ｐＩＮＧ４６２０は中等度リスクＨ６５重鎖のシグナル配列全体、Ｖ−領域、およびＪ−領域を含む。ｐＩＮＧ４６２０由来のＳａｌＩからＢｓｔＥＩＩまでのフラグメントを前記同一発現ベクターにクローリングすることにより、中等度リスクＨ６５重鎖の最終的発現ベクター、ｐＩＮＧ４６２１を組み立てた。Ｂ．中等度リスク軽鎖発現ベクターの組み立てＳＨ６５Ｋ−１（ＳＥＱＩＤ番号１１７）、ＨＵＨ−Ｋ７（ＳＥＱＩＤ番号１１９）、ＨＵＨ−Ｋ６（ＳＥＱＩＤ番号１１８）、ＨＵＨ−Ｋ８（ＳＥＱＩＤ番号１２０）、ＨＵＨ−Ｋ４（ＳＥＱＩＤ番号１２１）およびＨＵＨ−Ｋ５（ＳＥＱＩＤ番号１２２）の６種類のオリゴヌクレオチドから、軽鎖の中等度リスク人間化ＶセグメントおよびＪセグメントを組み立てた。オリゴヌクレオチドをＯＣＲプライマーＨ６５Ｋ−２ＳおよびＪＫ１−ＨｉｎｄＩＩＩで増幅した。合成人間化抗体遺伝子を含むオリゴヌクレオチドをペアで混合し（ＳＨ６５Ｋ− １＋ＨＵＨ−Ｋ７、ＨＵＨ−Ｋ６＋ＨＵＨ−Ｋ４＋ＨＵＨ−Ｋ５）、中等度重鎖の場合に記述した通りにベント・ポリメラーゼとともにインキュベートした。各反応生成物の一部（４０μｌ）をペアで混合し（ＳＨ６５Ｋ−１／ＨＵＨ−Ｋ７＋ＨＵＨ−Ｋ６、ＨＵＨ−Ｋ８、ＨＵＨ−Ｋ６＋ＨＵＨ−Ｋ８＋ＨＵＨ−Ｋ４、ＨＵＨ−Ｋ５）、前記の通りに満たした。次に、前述の通りに全長遺伝子をＰＣＲプライマーＨ６５Ｋ−２ＳおよびＪＫ１−ＨｉｎｄＩＩＩならびにベント・ポリメラーゼで２５サイクル間、増幅することによって軽鎖遺伝子を組み立てた。組み立てたＶ／Ｊ領域をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロース・ゲルによる電気泳動法で精製し、軽鎖抗体発現ベクターｐＩＮＧ４６３０に組み立てた。実施例６ｈｅ３遺伝子のトランスフェクションおよび発現生成物の精製Ａ．３抗体産生のためのマウス・リンパ系細胞の安定したトランスフェクション細胞株Ｓｐ２／０（アメリカ培養コレクション受け入れ番号ＣＲＬ１５８１号）をDulbeccoの改良型イーグル培地（Modified Eagle Medium）＋４．５g/lのグルコース（ＤＭＥＭ、Gibco）＋１０％ウン胎仔血清中で成育させた。培地にグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Irvine Scientific，Irvine，Cal ifornia）を補足した。 Potter，H．ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，81:7161（1986）のエレクトロポレーション法を使用した。トランスフェクション後、細胞を完全ＤＭＥＭ中で２４〜４８時間回復させ、選択培地の存在下、９４ウェル・プレートのウェル当たり１０，０００〜５０，０００細胞を播種した。ヒスチジノール（Histidin ol、Sigma）選択は１．７１μg/mlであり、ミコフェノリン酸（mycophenolic ac id、Calbiochem）は６μg/ml＋０．２５mg／mlキサンチン（Sigma）であった。、エレクトロポレーション法はＳｐ２／０細胞の場合、１〜１０×１０^-5のトランスフェクション頻度を与える。ｐｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化によってｈｅ３軽鎖発現プラスミドｐＩＮＧ４６３０を直線化し、Ｓｐ２／０細胞にトランスフェクトすると、ミコフェノリン酸耐性クローンが得られ、軽鎖合成用に選別した。４．９〜７．５μg/lを分泌するトップ産生サブクローンのうち４つを２種類のプールに合併し（２クローン／プール）、中等度リスク重鎖を含むプラスミドｐＩＮＧ４３６２１を各プールにトランスフェクトした。ヒスチジノールで選択した後、最軽鎖と最重鎖を産生するクローン、Ｓｐ２／０ −４６３０および４６２１クローンＣ１７０５およびＣ１７１８、は、Ｔ２５フラスコ内の成育過剰培地中に１０_-7Ｍデキサメタゾンが存在する条件下で、それぞれ約１５および２２μg/μlの抗体を分泌した。クローンＣ１７１８を、１９９２年１２月１日に、ＡＴＣＣＨＢ１１２０６号として、American Type Cultur e Collection（アメリカ培養コレクション）、１２３０ Parklawn Drive，Rock ville，MD 20852に寄託した。最高の産生体は、クローンＣ１７１８の制限希釈サブクローニングによって産生されるクローンＣ１７１８のサブクローンである。Ｂ．組織培養で分泌されるｈｅ３抗体の精製１０mMＨＥＰＥＳ、１×グルタミン−ペン−ストレプ（Glutamine-Pen-Strep 、Irvine Scientifc #9316）を補足した培地ＨＢ１０１（Hana Biologics）＋１％ウン胎仔血清中で、Ｓｐ２／０−４６３０＋４６２１クローンＣ１７０５細胞を成育させた。使用した培地を約５，０００×ｇで２０分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡで抗体レベルを測定した。細胞培養上澄約２００mlを蛋白Ａ−カラム（Si gma Chemicals）に負荷し、ＰＢＳ（０．１５ＭＮａＣｌ、５mMリン酸ナトリウム、１mMリン酸カリウム、緩衝液ｐＨ７．２）で平衡化した。ステップｐＨ勾配（ｐＨ５．５、４．５、および２．５）でｈｅ３抗体を溶出した。ｈｅ３抗体を含む（収率９％）がウシ抗体を含まない分画を１ＭＴｒｉｓｐＨ８．５で中和し、セントリコン３０（Centricon、Amicon ）により１０培に濃縮し、ＰＢＳで１０培希釈し、セントリコン３０で再度１０倍に濃縮し、ＰＢＳで１０培希釈し、最後に１０培に濃縮した。抗体を０．２５ ml部分標本の形で、−２０℃で保存した。Ｃ．ＣＤ５に対するｈｅ３ＩｇＧＩｇＧのアフィニティ測定競合結合アッセイで、表面にＣＤ５を発現するＭｏｌｔ−４Ｍ細胞およびＩ₁₂ ₅ 標識キメラＨ６５ＩｇＧを使用して、ＣＤ５に対するｈｅ３ＩｇＧのアフィニティを決定した。ｈｅ３ＩｇＧ源としてクローンＣ１７０５およびＣ１７１８の培養上澄及び、Ｃ１７０５の精製ＩＧＧを使用した。本アッセイのため、１０μlのラクトペルオキシダーゼ−グルコース・オキシダーゼ固定ビーズ（Enzymobedas BioRad）、１００μlのＰＢＳ、１．０mCiのＩ¹²⁵ （Amersham，IMS30）、５０μlの５５ｍＭｂ−Ｄ−グルコースに、２３℃ で４５分間曝露することによって、２０μgのキメラＨ６５ＩｇＧ（ＣＨ６５ＩｇＧ）をヨウ素標識した。１０５ｍＭのナトリウム・メタビスルファイト２０μlおよび１２０mMのヨウ化カリウムを加えて反応を止め、続いて１分間遠沈してビーズをペレット化させた。ＰＢＳ（１３７mMのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１mMのＮａ₂ＨＰＯ₄、２．６８mMのＫｃｌ、ｐＨ７．２〜７．４）と０．１％ＢＳＡを使用し、７mlのセファデックスＧ２５を使用するゲル濾過で¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧを精製した。ＴＣＡ沈殿で¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧ回収および比活性を決定した。下記のように競合結合を実施した。氷冷ＤＨＢ結合バッファー中（Dubellcoの改良型イーグル培地（Gibco、３２０-１９６５ＰＪ）、１．０％ＢＳＡおよび１０mMHepes、ｐＨ７．２〜７．４）でＭｏｌｔ−４Ｍ細胞１００μlを２回洗浄した。同じバッファーに細胞を再懸濁し、ウェル当たり３×１０⁵個の細胞を９６個のＶ−底ウェル（Costar）で平板培養し、Beckman JS 4.2ローターを使用して１，００rpmで５分間遠沈することにより４℃でペレット化させた、ＤＨＢ中、２培濃縮した０．１nM¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧ５０μlを各ウェルに加え、最終抗体濃度１００nM−０．００１７nMで、ＤＨＢ中、２培濃縮したｃＨ６５ＩｇＧまたは人間化抗体５０μlと競合させた。ｈｅ３ＩｇＧを発現するＳｐ２／０クローンＣ１７１８の培養上澄から人間化抗体を得た。キメラ抗体を標準として使用するＥＬＩＳＡで上澄中の抗体濃度を確定した。結合を４℃で５時間進行させ、１，０００rpmで５分間遠沈することによりＤＨＢ結合バッファー２００μlで３回洗浄することにって結合を終結させ、精製した標本中の抗体濃度を決定した。全てのバッファーおよび操作は４℃であった。１．０ＭＮａＯＨ１００μl中に細胞を可溶化し、CobraII自動ガンマカウンター（Packard）でカウントすることにより、放射能を測定した。重みつき非直線最小二乗曲線適合プログラム、MacLig and、Munson，Analyt．Biochcm.，107:220（1980）の”コンピューター・プログラムLigand”のMacintosh版で結合実験のデータを解析した。客観的統計学的基準（Ｆ，検定、超和平方原理）を使用して適合性の良さを評価し、モデル間の識別を行った。非特異的結合は、誤差に従属するパラメータとして処理し、同時に他のパラメータに当てはめた。図１１は、競合結合アッセイにおけるＭｏｌｔ−４Ｍ細胞上のＣＤ５に対するｈｅ３およびＣＨ６５の結合を示すデータを提供する。、以上の結果から、ｈｅ３ＩｇＧで行われた中等度リスク変化により、標的であるＣＤ５に対して、この抗体のキメラ・マウス−ヒト型（ｃＨ６５）よりアフィニティが高い抗体を生じることが立証される。実施例７ゲロニン免疫複合体の調製本発明のゲロニン類似体をマウス型H65（ATCC HB9286）抗体、キメラ型H65（cH65）抗体、cH65抗体ドメイン（cFab、cFab′およびcF(ab ´)₂のフラグメントを含む）、ヒト型抗体およびヒト型抗体ドメインと種々に複合させた。こうした抗体および抗体ドメインはすべてヒトＴ細胞決定基CD5と特異的に反応する。米国Patent Application Serial No.07/306,433（前述）およびInternational Publication No.WO 89/06968（前述）に記載された方法に従い、H65抗体を調製および精製した。キメラ型H65抗体の調製には、参考として引用したRobinsonらの「ヒト抗体とハイブリドーマ」2:84-93（1991）に記戦された方法と同一の方法を使用した。キメラ型H65のFab、Fab´およびF(ab´)2タンパク質の調製には、参考として引用したBetterらの「Proc.Nat.ACad.Sci」(USA)90 :457-461（1993）に記載された方法を使用した。さらにhe3ヒト型抗体の調製には、参考として引用した米国Patent Application Serial No．07/808,464に記載されている方法を用いた。Ａ．H65抗体との複合反応スルフヒドリル基を検出するために、DTT0.1-2mMにより室温で30-60分間インキュベートして、ゲロニン類似体の不対システイン残基を還元した後、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩を行った。特にGelc₂₄₈類似体（3.8mg/ml）はDTT 2mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M ：NaCl 0.25M：pH7.5の緩衝系で60分間インキュベートした。Gel_C244変異体（7. 6mg/ml）は DTT 2mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M：NaCl 0.25M：pH 7.5の緩衝系で30 分間インキュベートした。Gel_C247類似体（4mg/ml）はDTT 2mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M：NaCl 0.5M：pH 7.5の緩衝系（EDTA 0.5mM添加）で30分間インキュベートした。Gelc₂₃₉変異体（3.2mg/ml）はDTT 2mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M：NaCl 0.5M：pH 7.5の緩衝系（EDTA 0.5mM添加）で30分間インキュベートした。Gel_A50(C44)類似体（4.2mg/ml）はDTT 0.1mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M：NaCl 0.1M：pH 75の緩衝系（EDTA 0.5mM添加）で30分間インキュベートした。さらに、Gel_C10変異体（3.1mg/ml）はDTT 1mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M：NaCl 0.1M：pH 7.5の緩衝系（EDTA 1mM添加）で20分間インキュベートした。 DTNBと反応させることによって遊離スルフヒドリル基の存在を確認し、平均値 1.4±0.65 SH/分子を求めた。還元していない場合には、遊離SH基は検出されなかった。参考として引用したGoffらの「Bioconjugate Chem.」1：381-386（1990）およびCarrollらの米国特許第5,093,475号に記載されているように、反応スルフヒドリル基を誘導するために、リシン残基部位において束縛リンカー5-メチル-2-イミノチオレイン（M2IT）でH65抗体およびキメラ型H65抗体を化学修飾した。特に、Gel_C248およびGel_C244との複合は、18倍のM21TおよびDTNB 2.5mMを使用して、TEOA 25mM：NaCl 150mM：pH 8の緩衝系でマウスH65抗体4mg/mlを23℃で１時間der ivitizeした。この反応によって得られたリンカー数は１抗体当たり1.9であり、 DTNB検定によって確認した。 Gel_C247およびGel_C239との複合は、20倍のM2ITおよびDTNB 2.5mMを使用して、 TEOA 25mM：NaCl 150mM：pH 8の緩衝系でH65抗体4.7mg/mlを23℃で50分間derivi tizeしたこの反応によるリンカー数は１抗体当たり1.6であり、DTNB検定によって確認した。 Gcl_A50(C44)との複合は、20倍のM2ITおよびDTNB 2.5mMを使用して、TEOA 25mM ：NaCl 150mM：pH 8の緩衝系でH65抗体5.8mg/mlを23℃で30分間derivitizeした。この反応によるリンカー数は１抗体当たり1.5であり、DTNB検定によって確認した。 Gel_C10との複合は、10倍のM2ITおよびDTNB 2.5mMを使用して、TEOA 25mM：NaC l 150mM：pH 8の緩衝系でH65抗体2.2mg/mlを23℃で１時間derivitizeした。この反応によって得られたリンカー数は１抗体当たり1.4であり、DTNB検定によって確認した。マウスH65抗体と同様の方法でキメラ型H65抗体の複合を調製した。最初に組換えゲロニンによる免疫複合体の調製について両方法の有効性を比較した。まずDTT 2mMを添加して、組換えゲロニンの生ジスルフィド結合を室温で3 0分間還元した。Sephadex GF-05LSカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって還元ゲロニンを再分離し、DTNB検定によって遊離スルフヒドリル基を確認した。この結果、遊離スルフヒドリル基1.4が検出された。つぎに、この還元ゲロニンをH65 -(M2IT)-S-S-TNB（1.8TNB基/Ｈ65）と反応させた。この条件下では、還元ゲロニンとチオール活性化H65抗体間の複合はほとんど調製できなかった。これに対して、まず組換えゲロニンおよびH65抗体をクロスリンカーM2ITでder ivitize（ゲロニン-(M2IT)-SHおよびH65-(M2IT)-S-S-TNBを生成）した後に両者を混合した場合、良好な収率（毒素／抗体率1.6）でH65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-ゲロニンの複合を調製することができる。この複合の最初の材料（ゲロニン-(M2IT )-SHおよびH65-(M2IT)-S-S-TNB）はリンカー/タンパク質率がそれぞれ1.2および 1.4であった。マウス型H65抗体またはキメラ型H65抗体と複合させる以前に、生ゲロニンを同一方法で誘導した。複合させるため、還元ゲロニン類似体をH65-(M2IT)-S-S-TNBと混合した。類似体に応じて、以下の複合反応を行った。５倍モル数のGel_C248（23mg/6ml）にH65 -M2IT-TNB 23mg/7.2mlを室温で２時間混合し、さらに４℃で18時間（一晩）混合した。５倍モル数のGel_C244（23mg/3ml）にH65−M2IT-TNB 23mg 7.3mlを室温で３時間混合し、さらに４℃で18時間（一晩）混合した。５倍モル数のGel_C247（9 mg/2.25ml）にH65-M2IT-TNB 9mg/2.8mlを室温で２時間混合し、さらに４℃で５日間混合した。５倍モル数のGel_C239（9mg/2.6ml）にH65-M2IT-TNB 9mg/2.8mlを室温で２時間混合し、さらに４℃で３日間混合した。5.6倍モル数のGel_A50(C44) （13.44m g/3.2ml）にH65-M2IT TNB 12mg/1.9mlを室温で4.5時間混合し、さらに４℃で一晩混合した。５倍モル数のGel_C10（11mg/3.5ml）にH65-M2IT-TNB 11mgを室温で４時間混合し、さらに４℃で一晩混合した。複合後に、抗体の不反応M2ITリンカーをリンカーと同モル数のシステアミンでクエンチした（室温で15分間）。クエンチした反応溶液をゲル濾過カラムに添加した［Gel_C248、Gel_C247、Gel_C244およびGel_C239にはSephadex G150カラム（Pha rmacia）、Gel_A50(C44)およびGel_C10にはAcA-44カラム（IBF Biotecnics,France ）を使用］ゲル濾過カラムを通過させた後、トリスアミノメタン10mM、NaCl 0.1 5M、pH7で溶離した。各カラムの最初のピークに、トリスアミノメタン10mM、NaC l 30mM、pH7でBlue Toyopearl 樹脂（Tosohaas，Philadelphia,Pennsylvania）を添加し、生成物をトリスアミノメタン10mM、NaCl 0.5M、pH7.5で溶離した。最終複合生成物の試料に5%非還元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PA GE）を実施し、クーマシー染色した後、Shimadzuレーザーデンシトメーターを使用して、１抗体当たりの毒素数（T/A比）を定量した。各類似体複合の最終生成物の収率は、Gel_C248：17mg（T/A比 1.6）、Gel_C247：1.1mg（T/A比 1）、Gel_C244 ：4.5mg（T/A比 1.46）、Gel_C239：2.9mg（T/A比 2.4）、Gel_CA50(C44)： 7.3mg（T/A比 1.22）ならびにGel_C10：6.2mg（T/A比 1.37）であった。複合効率（例えば遊離抗体から免疫複合体への転換）は、 Gel_C244（10%未満）に比べてGel_C10、Gel_A50(C44)、Gel_C239、Gel_C247およびGel_C248 （80%未満）で著明に高かった。Ｂ．キメラ型抗体およびヒト型抗体とのゲロニン免疫複合体類似体Gel_C247およびGel_A50(C44)を種々のキメラ型抗体［cH65Fab、cH65Fab′ およびcH65F(ab´)2］ならびに「ヒト工学」抗体［he1 Fab、he2-Fab、he3-Fab 、he1 Fab´およびhe1 F(ab´)2］のフラグメントにも複合させた。Internation al Publication No．WO 89/00999（前述）に記載された方法を用いて、キメラ型 H65抗体フラグメントを調製した。例５に前述した方法を使用して、ヒト型に工学したH65抗体フラグメント（H65抗体配列のヒトへの抗原性低下を目的とした選択的マウスコード化アミノ酸置換法を参照）の種々の領域をコード化するDNA配列を、配列ID番号69（he1およびhe2のカッパ鎖）、配列ID番号71（he2およびhe3 のガンマ鎖）ならびに配列ID番号72（he3のカッパ鎖）で決定した。ヒト工学FabおよびFab´のフラグメントをGelc247およびGel_A50(C44)に複合する場合と同一の方法（後述）で、キメラ型H65抗体フラグメントをGel_C247に複合した。（i）he1 Fab-Gel_C247 TEOA 25mM、NaCl 250mM、pH8の緩衝系でhe1-Fabを透析し、M2ITクロスリンカーでderivitizeする以前に6.8mg/mlに濃縮した。リンカー反応用に、DTNB2.5mM を添加して20倍のモル数で〜M2ITを使用した。室温で30分間反応させた後、GF05（ゲル濾過樹脂）で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2M、pH7.5で平衡させた。DT NB検定によって、1.8リンカー数/Fabを求めた。Gel_C247との複合以前に、hel Fa b-M2IT-TNBを3.7mg/mlに濃縮した。複合用の反応スルフヒドリル基を定量するために、DTT 1mMおよびEDTA 0.5mM を使用して、リン酸ナトリウム10mM、NaCl 0.3MでGelC24712.8mg/mlを20分間処理した後、GF05で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2M、pH7.5で平衡させた。DTNB検定を使用して、GelC247中の遊離チオール基含量が0.74モル/Gel_C247 モルであることを求めた。活性化抗体と複合させる以前に、ゲロニンを8.3mg/ml に濃縮した。 Gel_C247の遊離チオール基と修飾he1 Fab-M2IT-TNB間の複合反応条件を以下に示す。５倍モル数のゲロニン類似体を活性化he1-Fab-M2IT-TNBに添加し（両タンパクともに、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2M、pH7.5の緩衝系）、反応混合物を室温で3.5時間インキュベートし、さらに４℃で一晩インキュベートした。、複合後に、リンカーと同モル数のシステアミンにより、非処理M2ITリンカーを室温で15分間クエンチした。クエンチ反応溶液をゲル濾過カラム（G-75）に添加した後、トリスアミノメタン10mM、NaCl 150mM、pH７で平衡させた。このカラムの最初のピークをトリスアミノメタン10mMでNaCl 30mMに希釈し（pH7）、Blue Toy opearlを添加した。この生成物をトリスアミノメタン10mM、NaCl 0.5M、pH7.5で溶離した。（ii）he1 Fab´-Gel_C247 同様にTEOA 25mM、NaCl 400mM、pH8緩衝系でhc1-Fab´フラグメントを透析し、M2ITクロスリンカーでderivitizeする以前に2.9mg/mlに濃縮した。リンカー反応用に、DTNB2.5mMを添加して20倍のモル数でM2ITを使用した。室温で30分間反応させた後、GF05（ゲル濾過樹脂）で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2 M、pH7.5で平衡させた。DTNB検定によってリンカー数1.6/Fab´を求めた。Gel_C2 ₄₇ との複合以前に、he1 Fab´-M2IT-TNBを3.7mg/mlに濃縮した。複合用の遊離チオール基を定量するために、DTT 1mMおよびEDTA 0.5mMを使用して、リン酸ナトリウム10mM、NaCl 0.1MでGel_C247 77mg/mlを30分間処理した後、GF05で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2M、pH7.5で平衡させた。DTNB 検定を使用して、Gel_C247中の遊離SH基含量を1.48モル/Gel_C247モルと定量した。活性化he1 Fab´-M2IT-TNBと複合させる以前に、Gel_C247を10mg/mlに濃縮した。 Gel_C247の遊離チオール基と修飾he1 Fab-M2IT-TNB間の複合反応条件を以下に示す。5.7倍モル数のゲロニンを活性化he1-Fab-M2IT-TNBに添加し、最終NaCl濃度を0.25Mにした。反応混合物を室温で1.5時間インキュベートし、さらに４℃で１週間インキュベートした。複合後に、リンカーと同モル数のシステアミンにより、不反応M2ITリンカーを室温で15分間クエンチした。クエンチ反応溶液をゲル瀘過カラム（AcA54）に添加した後、トリスアミノメタン10mM、NaCl 250mM、pH7.5で平衡させた。、このカラムの最初のピークをトリスアミノメタン10mMでNaCl 20mMに希釈し（pH7）、トリス10mM、NaCl 2 0mM、pH7で平衡させたBlue Toyopearlを添加した。カラムをトリス10mM、NaCl 1 mM、pH7.5で洗浄し、生成物をトリス10mM、NaCl 1M、pH7.5で溶離した。（iii）he2-Fab Gel_A50(C44) TEOA 25mM、NaCl 400mM、pH8の緩衝系でhe2-Fabを一晩透析し、M2ITクロスリンカーでderivitizeする以前に13.3mg/mlに濃縮した。リンカー反応用に、DTNB 2.5mMを添加して20倍のモル数で、M2ITを使用した。、室温で20分間反応させた後、GF05-LS（ゲル濾過）カラムで脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2Mに 0.02%アジ化ナトリウムを添加して平衡させた。DTNB検定によってリンカー数1.7 /Fabを求めた。この時点で、he2 Fab濃度を5.2mg/mlにした。複合用の反応チオール基を定量するために、DTT 5mMおよびEDTA 0.5mMを使用して、リン酸ナトリウム10mM、pH7でGelA50（C44）8.33mg/mlを30分間処理した後、GF05-LS樹脂で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.1Mに0.02%アジ化ナトリウム添加EDTAを加えて、pH7.5で平衡させた。DTNB検定を使用して、Gel_A50(C44)中の遊離SH基含量を求めた（0.83モル/ Gel_C247モル）。活性化he2 Fabと複合させる以前に、ゲロニンを11.4mg/mlに濃縮した。 Gcl_A50(C44)の遊離チオール基と修飾he2 Fab-M2IT-TNBの複合反応条件を以下に示す。３倍モル数のゲロニン類似体を活性化he2-Fab-M2IT-TNBに添加した（両タンパク質ともリン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.1M、pH7.5緩衝系であったが、このゲロニン溶液は他にEDTA 0.5mMも含有していた）。反応混合物を元の体積の半分に濃縮した後、室温で４時間インキュベートし、さらに４℃で72時間インキュベートした。複合後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、複合効率を70-75%と算定した。複合後に、リンカーと同モル数のシステアミンにより、不反応M2ITリンカーを室温で15分間クエンチした。クエンチ反応溶液をゲル濾過カラム（G-75）に添加した後、トリス10mM、NaCl 0.15M、pH7で平衡させた。このカラムの最初のピークをトリスアミノメタン10mMでNaCl 30mMに希釈して（pH7）、Blue Toyopearl（ TosoHaas）カラムに添加した。生成物をトリス10mM、NaCl 1M、pH7.5で溶離した。（iv）he3-Fab Gel_A50(C44) 同様にTEOA 25mM、NaCl 0.25M、pH8の緩衝系でhe3-Fabを一晩透析し、M2ITクロスリンカーでderivitizeする以前に5mg/mlに濃縮した。リンカー反応用に10倍のモル数で、M2ITを使用し、DTNB 2.5mMを添加した。室温で45分間反応させた後、GF05 -LS（ゲル濾過）カラムで脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.2Mに0.02%アジ化ナトリウムを添加して平衡させた。DTNB検定によって、リンカー数1/Fab-M2 IT-TNBを求めた。この時点で、he3-Fab濃度を5.3mg/mlとした。複合用の反応チオール基を明らかにするために、DTT5mMおよびEDTA 0.5mMを使用して、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.1M、pH7.5でGel_A50(C44) 7.8mg/mlを30 分間処理した後、GF05-LS樹脂で脱塩し、リン酸ナトリウム0.1M、NaCl 0.1Mに0. 02%アジ化ナトリウムを添加して、pH7.5で平衡させた。DTNB検定を使用して、Ge l_A50(C44)中の遊離SH基含量を求めた（0.66モル/Gelc247モル）。、活性化he3-F abと複合する以前に、ゲロニンを5.2mg/mlに濃縮した。 Gel_A50(C44)の遊離チオール基とhe3-Fab-M2IT-TNB間の複合反応条件を以下に示す。５倍モル数のゲロニン類似体を活性化he3-Fab-M2IT-TNBに添加した（両タンパク質ともリン酸ナトリウム0.1m、NaCl 0.1M、pH7.5）。反応混合物を室温で２時間インキュベートし、さらに４℃で72時間インキュベートした。複合後、SD S-PAGEによって複合効率を70-75%と算定した。複合後に、リンカーと同モル数のシステアミンにより、過剰M2ITリンカーを室温で15分間クエンチした。クエンチ反応溶液をGammaBind G（固定化タンパク質Ｇ親和性樹脂、Genax，Gaithersburg，Marylandより入手）に添加した後、リン酸ナトリウム10mM、NaCl 0.15M、pH7で平衡させた。これをNaOAc 0.5Mで溶離し、トリスで中和した。さらにトリス10mM、NaCl 0.15M、pH7で一晩透析した後、トリス10mM でNaCl 30mMに希釈し（pH7）、Blue Toyopearl（TosoHaas）カラムに添加した。生成物をトリス10mM、NaCl 1M、pH7.5で溶離した。実施例８細胞障害総合試験急性リンパ白血病Ｔ細胞ライン（HSB2細胞）と人の末梢血流単球細胞（PBMC）において、ゲロニン、ゲロニン類を調整した免疫共役体の細胞障害性分析を行った。H65抗体（H65-RTA）と抗体フラグメントのリシンＡ鎖の免疫共役体も試験した。米国特許出願番号07/306,433記載事項と国際出版番号89/06968記載事項に従い、リシンＡ鎖（RTA）とH65-RTA共役体（H65-RTA）の調整および精製を行った。簡単に説明すると、HSB2細胞に免疫毒素を添加・保温し、免疫毒素下のタンパク質の合成の抑制を測定し、免疫毒素を添加していない対照細胞と比較する。標準免疫共役体H65-RTA（SPDPがRTAに結合したH65誘導体）、H65ゲロニン、H65-r ゲロニン、H65-免疫共役体フラグメント、ゲロニン免疫共役体の各サンプルをルシンの無いRPMIで片対数濃度に希釈し、範囲2000〜0.632ng/mlとする。マイクロ滴定プレートのウェルに、１ウェル当たり1x10⁵の HSB2を滴下し、全希釈液を三回滴下する。HSB2プレートを、37℃で20時間保温し、採取前に³H-Leuを４時間照射する。InotecTrace 96カスケード電離カウンターでサンプルを測定する。対照サンプルと比較し、細胞毒素がタンパク質の生成を結果的に50%抑制する（IC₅₀）ピコモル濃度（pM）を計算する。異なる量の細胞毒素・毒素類を含む共役体を一般化するため、共役体IC₅₀値（pM）に各共役体によって異なる毒素／抗体率を掛けて、細胞毒性データをピコモル毒性量（pM T）に変換する。 Fishwildらの免疫に関する臨床と実験（Clin.andExp.Immunol.,）、86：506-5 13（1991年）に基づきPBMC試験を行い、PBMC免疫共役体の保温を合計90時間行った。保温の最後16時間に³H-チミジンを添加し、完了後免疫共役体による遺伝子合成抑制量を測定した。HSB2細胞とPBMC細胞に対するH65とキメラH65抗体共役体の活動を下の表２に示す。純粋ゲロニン、ゲロニン再結合物質、非修飾ゲロニンを調整した共役体に比べ、ゲロニン類免疫共役体の多くが著しく、HSB2細胞に対するIC₅₀値が低く、細胞毒性度が高かった。人のPBMSに対しては、ゲロニン類共役体は最低、純粋ゲロニン、ゲロニン再結合物質以上の効力であった。しかし、重要なのは、共役体の中（例、Gel_C10、Gel_A50(C44)、Gel_C247）には、純粋ゲロニン、ゲロニン再結合物質に比べPBMSに対しはるかに効果的、細胞毒性度も上回るものがある事である。 HSB2細胞とPBMC細胞に対するH65抗体フラグメント共役体の活性を、下の表３と表４に示す。表４の細胞毒性度は、試験中最大免疫毒素濃度（１μg/ml）での HSB2細胞においてのタンパク質合成抑制率%を示す。表３のデータから、１価（FabまたはFab'）のフラグメントが異なる型のゲロニンに共役結合したものの方が、RTA共役体に比べ効果が高い事がわかる。表４では人間工学的ゲロニン-Fab共役体が大変高い細胞毒性を示す事がわかる。実施例９ゲロニン免疫共役体の特性Ａ．溶解度再結合ゲロニンとゲロニン類は純粋ゲロニン、RTA30に比べ、溶解度が高い。さらに、この免疫共役体は純粋ゲロニン、RTA30を調整した免疫共役体に比べ、やはり溶解度が高い。特にキメラFabフラグメントで調整した再結合ゲロニン／ゲロニン類の共役体の高い溶解度は注目に値する。Ｂ．ジスルフィド結合安定性分析 RIPを目的分子（抗体等）に結合するジスルフィド結合の安定性は、生体内での免疫共役体の寿命に影響する事が知られている（添付の ThorpeらのCancer res.，47:5924-5931,1987年を参照のこと）。例えば、体外で還元され、容易にジスルフィド結合が切断する共役体は動物モデルにおいて安定度と効果が低い（添付のThorpeらのCancerRes.，48:6396-6403,1988年を参照のこと）。そこで、純粋ゲロニン、再結合ゲロニン、ゲロニン類で調整した免疫共役体のジスルフィド結合の生体外での安定性分析を、WawrzyczakらによるCancer Res. ，50:7519-7526（1990年）（参照として添付）に記載と類似する方法で行った。グルタチオン濃度を増加し、共役体を１時間37℃で保温し、iodoacetamideとの反応終了後、遊離RIPの量をTosoHaas TSK-G2000SWカラム付のサイズ分離HPLCで分析測定する。高濃度の2-mercaptoethanolで遊離した（100%遊離を測定するため）RIP量を比較し、RIP（RC₅₀）を50%遊離するのに必要なグルタチオン濃度を計算する。H65 抗体共役体の分析結果を下の表５に示す。以上の結果から、異なるゲロニンタンパク質とH65抗体のジスルフィド結合の安定性は大きく差がある。生体外試験結果では、Gel_C10とGel_C239を除いて、ほとんどのゲロニン類で、二重結合化学共役体よりも少し不安定であった。しかし、Gel_C239類の安定性は特に高かった。 H65抗体フラグメント共役体の分析結果を下の表６に示す。表５と表６に示したRC₅₀の結果から、各免疫毒素の特定のRIP類成分が、生体外で免疫毒素ジスルフィド結合の安定性を左右すると思われる。実施例１０ H65抗体の共役体の薬学動態性 H65抗体全体に結合したゲロニン類Gel_C247、Gel_A50(C44)、Gel_C10の薬学動態性をラットにおいて研究した。0.1mg/kgの¹²⁵I標識化免疫共役体H65-(M2IT)-S-S -Gel_C247、H65-(M2IT)-S-S-Gel_A50(C44)、H65-(M2IT)-S-S-Gel_C10のIVボーラスを体重134〜148gの雄のSprague-Dawleyラットに投与する。3、15、30、45分後と 1.5、2、4、6、8、18、24、48、72、96時間後に血清サンプルを採取した。各サンプルの放射線活性度（cpm/ml）を測定し、SDS-PAGEを行い免疫共役体全体の放射線活性度の割合を測定する。免疫共役体が関連した、コンピュータープログラムPCNONLIN（SCI Software、Lexington、Kentucky）を使って血清の放射線活性度を分析した。下の表７に免疫共役体の薬学動態性パラメータを示す。その表で、各値の標準エラーと、誤差の１方法分析を示し、ICは免疫共役体で（共役体の部分であるゲロニン変異体の略語を下に明示）、ｎは研究に使った動物数、Vcは分布の中心体積、Clはクリアランス、MRTは全身平均滞留時間、αは免疫共役体のα半減期、βはβ半減期である。 Gel_C247共役体はα半減期とβ半減期がそれぞれ2.3時間と20時間で、合計滞留時間平均は17時間であった。72および96時間点では、この血清サンプルのSDS-PA GEGelに対する放射線活性に関連し、免疫共役体の溶解度が低かったため分析から除外した。生体外研究でGel_C10免疫共役体のジスルフィド結合の安定性が高いことがわかったが、これは生体内での半減期がcys₂₄₇型に比べ長いためと思われる。Gel_C10 免疫共役体のβ半減期は約33時間で、Gel_C247共役体の20時間にくらべ長かった。合計平均滞留時間もまたGel_C10の方がずっと長かった（42時間対Gel₂₄₇では17 時間）。さらに、Gel_C10免疫共役体のクリアランスは2.5ml/時/kgで、Gel_C247免疫共役体に比べ（11ml/時/kg）で約４倍少なかった。生体外のジスルフィド結合の安定性データからわかるように、Gel_A50(C44)免疫共役体のクリアランスはGel_C10 とGel_C247免疫共役体の間であった。この研究から、Gel_A50(C44)共役体の特性は、Gel_C247免疫共役体に比べよりGe l_C10共役体に類似しているが、H65に結合したGel_C10類共役体は、H65に結合した GeL_A50(C44)とGel_C247類共役体に比べ、生体内で安定性が高いと言える（MRT値が長く、クリアランス率が高い）。実施例１１共役体のH65抗体フラグメントに対する薬学動態性人間工学的H65 Fabフラグメントに結合したGel_C247とGel_A50(C44)の薬学動態性をラットで研究した。0.1mg/kgの¹²⁵I標識化免疫共役体he1 H65 Fab-Gel_C247 、he2 H65 Fab-Gel_A50(C44)、he3 H65 Fab-Gel_A50(C44)のIVボーラスを、体重15 0〜180gの雄のSprague-Dawleyラットに投与した、3、5、15、20、30、40分後と1 、1.5、3、6、8、18、24、32、48、72時間後に血清サンプルを採取し、ウサギ抗ゲロニン抗体を捕獲抗体として、ビオチン標識化ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体を第二の抗体として使い、ELISAで分析した。分析の結果を下の表８に示す。表では、各値の標準エラーを示し、ICは免疫共役体で、ｎは研究に使用した動物数、Vc は分布の中心体積、Clはクリアランス、MRTは全身平均滞留時間、αは免疫共役体のα半減期、βはβ半減期である。 he1 H65 Fab-Gel_C247、he2 H65 Fab-Gel_A50(C44)、he3 H65 Fab-Gel_A50(C44) の３つの免疫共役体を比較すると、薬学動態性は大変類似しており、特にELISA 分析曲線で得たパラメータで、同等のα半減期とβ半減期、平均滞留時間、クリアランスを持つ。これは、全体の抗体免疫共役体のカウンターパートに対し対照的で、Gel_C247免疫共役体のクリアランス（11ml/kg/時間）はGel_A50(C44)免疫共役体（4ml/kg/時間）に比べ３倍である。これから、Fabフラグメントとゲロニンをつなぐジスルフィド結合の切断はFab免疫共役体の血清クリアランスでは、全体の抗体免疫共役体に比べそれ程重要ではない事がわかる。実施例１２免疫共役体の免疫原性異系交配のSwiss/Websterマウスに、RTA、RTA30、再結合ゲロニンを調整したマウスH65抗体共役体を繰り返し投与する（各投与0.2mg/kg）。投与サイクルは、１日目、２日目に各動物に投与を行い、28日目と29日目に投与を繰り返す。各動物に、これを５サイクル行う。各投与期間後、１週間と３週間に血液を採取し、血液中の抗RIP抗体量をELISAで測定し、各サイクルのピーク滴定濃度を測定すると表９のようになる。第１回の投与サイクル直後から、RTAとRTA30は強い反応を示し、実験中ずっと高かった。反対に、ゲロニン共役体では、５サイクルの投与後でも、免疫反応はない。共役体を、Complete Freund Adjuvantと混合し、マウスに腹腔内投与すると、数週間後、抗-RTA、RTA-30抗体を容易に検出できる。このデータは、抗ゲロニン抗体は生成されると、ELISA分析で検知でき、再結合ゲロニンはRTAに比べ動物での免疫原性がずっと低い事が示唆される。例１３免疫接合体の生体内効率ヒトの末梢血液のリンパ球（ＰＢＬ）を再構成して厳密に結合した免疫不全のマウスモデルを利用して、ゲロニン類似体Ｇｅｌ_C247およびＧｅｌ_A50(C44)からなる種々の免疫接合体の生体内効率を評価した。ＣＤ５抗原を発現させるヒトの血液細胞を枯渇させる能力について免疫接合体を試験した。Ａ．ヒトのＰＢＬと細胞分離健康な提供者から集められたlymphapheresis試料（HemaCare社、Sherman Oaks ，CA）又は静脈の血液試料（スタンフォード大学血液銀行、Palo Alto，CA）からヒトの末梢血液細胞を得た。フィコール-ハイパック密度勾配遠心分離（Ficol l-Paque（登録商標）、Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を用いてＰＢＬの血液細胞を豊富にし、その後ＰＢＳで４回洗った。２回目の洗浄の際にＲＢＣを溶解させる緩衝液（１６μＭの塩化アンモニウム、１ｍＭの炭酸水素カリウム、１２.５μＭのＥＤＴＡ）で残りの赤血球を溶解させた。トリパンブルー色素排除によって評価された最終的な懸濁液中の細胞生存度は９５％よりも高かった。Ｂ．動物およびヒトのＰＢＬ転移ＣＢ.１７scid/scid（ＳＣＩＤ）マウスは、Taconic（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入するか、あるいは病原体のない特殊な動物用施設において無菌状態下で繁殖させた（最初の繁殖用の数ペアは、ハナ・バイオロジーズ（Ha na Biologics，カリフォルニア州アラメーダ）から入手した）。動物は上部にフィルタを設けたかごに入れ、予防的な抗生物質処理を行わなかった。かご、寝わら、食物および水は使用前に高圧滅菌した。動物のすべての取扱いは層流フード内で行った。マウスＩｇレベルを決定するために、処理されないＳＣＩＤマウスから血を抜き取った。また、ヒトのＩｇおよびｓＩＬ−２Ｒを定量するために、ヒトのＰＢＬを注入したマウスから様々な間隔で血を抜き取った。逆軌道の静脈洞からヘパリン添加したチューブ内に採血した。血液試料は３００×ｇで１０分間遠心分離し、血漿を集めて−７０℃で貯蔵した。マウスおよびヒトのＩｇは、標準サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。簡単に言えば、平坦な底部の微小滴定量のプレート（MaxiSorp Immuno-Plates，Nunc，Roskilde．Denmark）を、４℃で一晩中、ｐＨ９.６の炭酸水素塩緩衝液中において、ヤギの抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Zymed Laboratories，Inc.，カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）又はヤギの抗ヒトＩｇｓ（Tago,Inc.，カリフォルニア州バーリンゲーム）で被覆した。プレートは、室温で２時間、ｐＨ７.５のトリス緩衝剤塩類溶液（ＴＢＳ）中のＢＳＡで遮断し、次いで、３７℃で１時間、ＴＢＳ／１％ＢＳＡ／０.０５％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０中において標準又は連続的に希釈した試料で培養した。使用した標準は、モノクローナルマウスＩｇＧ２ａ（ＩＮＤ１抗メラノーマ、ＸＯＭＡ社、カリフォルニア州バークレー）およびポリクローナルヒトＩｇ（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）であった。その後、プレートをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗い、アルカリ性ホスファターゼ接合したヤキの抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ又はヤギの抗ヒトＩｇｓ（Caltag Laboratories，カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を用いて、３７℃で１時間培養した。培養に続いて、４０５ｎｍの吸収測定により、ｐＨ９.８の１０％ジエタノールアミン緩衝液中のｐ−ニトロリン酸フェニル（シグマ社）を用いて検出した。正常なＢＡＬＢ／ｃマウスからの血漿は、マウスのＩｇのＥＬＩＳＡ中の正制御として使用した。天然のＳＣＩＤマウス又は正常なＢＡＬＢ／ｃマウスからの血漿試料は、検出可能なレベルのヒトのＩｇを有しなかった。ヒトのｓＩＬ-２Ｒは、製造者の指示により、ＥＬＩＳＡセット（Immunotech S.A.，フランス、Marseille）を使用して定量化した。低血漿レベルのマウスのＩｇ（＜１０μｇ／ｍｌ）を有する５〜７週間の老年のマウスを、２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドのｉ.ｐ.注入で予め調整した。２日後、これらを０.８ｍｌのＰＢＳ中に懸濁した２５〜４０×１０⁶の新たに分離したヒトのＰＢＬでｉ.ｐ.注入した。Ｃ．免疫接合体の処理ヒトのＰＢＬの移植後約２週間経過後にＳＣＩＤマウスの血を抜き取った。検出不能（＜１０ｐＭ）又は低血漿レベルのヒトのｓＩＬ-２Ｒを有するマウスはこの研究から排除した。検出可能であるが低レベルのヒトのｓＩＬ−２Ｒの除外についての締切りは、各研究について実験的に決定し、約２０ｐＭであった。残りのマウスは、グループに分けて、５日連続で毎日、ｉ.ｖ.大丸薬（０.２ｍｇ／ｋｇ）として賦形剤又は免疫接合体を投与した。動物は、組織中のヒトのＴ細胞および血漿中のヒトのｓＩＬ-２Ｒの定量化の処理の中断後１日経過後に屠殺した。Ｄ．組織の収集およびＰＢＬ減少の分析逆軌道の静脈洞からヘパリン添加したチューブ内に血液を集めた。次いで、頸部の関節をはずすことによってマウスを殺し、脾臓を無菌処理して除去した。無菌のガラス製の顕微鏡スライドのつや消し端部の間で脾臓を押しつぶすことによって、脾臓細胞の単細胞の懸濁液をＨＢＳＳ内に作った。ＲＢＣを溶解させる緩衝液を用いて血液および脾臓細胞から赤血球を除去した。その後、細胞を計数のためにＰＢＳ内に再び懸濁させた。次いで、流動細胞測定法を用いて、Ａｇ表現について、回収した細胞を試験した。種々のＦＩＴＣ−又はフィコエリトリンに（ＰＥ）接合した抗体（Becton-Dic kinson，Mountain View，CA）の飽和量により、氷上で３０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％のアジ化ナトリウム１００μｌ内に２０万〜５０万個の細胞を培養した。染色用に使用した抗体は、ＨＬｅ-１-ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１ａｎｔｉ-ＣＤ４５）、Ｌｅｕ２-ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１ａｎｔｉ-ＣＤ８）、Ｌｅｕ３ＰＥ（ＩｇＧ１ａｎｔｉ-ＣＤ４）およびＬｅｕＭ３-ＰＥ（ＩｇＧ２ａａｎｔｉ-ＣＤ１４）などであった。次いで、細胞を冷却した緩衝液で洗い、０.３７％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ内に固定した。対数増幅器を用いてＦＡＣｓｃａｎ（Becton-Dickinson）上で試料を分析した。正細胞を定量化するための領域は、天然のＳＣＩＤマウスから得られた細胞の染色に基づいて設定された。ＳＣＩＤ組織から回収されたヒトＡｇ-正細胞の絶対数は、正細胞の割合（％）に各々の組織試料から回収された細胞の総数を乗じることによって決定した。血液中の白血球の総数は１.４ｍｌ／マウスの理論血液容量を用いて算出した。ＳＣＩＤマウス組織中のヒト細胞の正確な定量化の検出限界は０.０５％であった。処理グループ間のすべての統計学上の比較は、Mann-Whit ney U testを用いて行った。ｐ値が０.０５よりも小さい場合に緩衝液制御グループと著しく異なるように処理グループを決定した。その結果を以下の表１０に示す。この表において、「＋」は制御との著しい相違を示し、「−」は微小な相違を示し、「ＮＴ」は接合体が試験されなかったことを示している。ＣＤ５プラス（XOMA社、カリフォルニア州バークレー）は、ＲＴＡに化学的に結合したマウスＨ６５抗体であり、正制御である。ＯＸ１９抗体（European Collection of A nimal Cell Cultures #84112012）は、ヒトＣＤ５と架橋反応しないマウスの抗ラットＣＤ５抗体である。ＯＸ１９Ｆａｂ−Ｇｅｌ_C247は、負制御免疫結合体である。すべてのゲロニン免疫接合体は、ＳＣＩＤマウスモデル中でヒト細胞を枯渇させることができた。例１４化学的抗体を有するゲロニン免疫融合の構造Ｈ６５の端を切り取った重鎖遺伝子（Ｆｄ又はＦｄ'）、Ｈ６５軽鎖遺伝子（カッパー）に融合した自然に連続するゲロニン遺伝子を含む幾つかの遺伝学的構造物を組み立てた。この例では、Ｈ６５Ｆｄ、Ｆｄ'およびＨ６５軽鎖は化学的構造物である。Ｈ６５Ｆｄ配列は、マウスのＨ６５重鎖可変領域（Ｖ）、接合領域（Ｊ）およびヒトのＩｇＧ₁不変領域（Ｃ）などのドメイン１領域を符号化し且つ軽鎖ＩｇＧ₁と結合したシステインを含むヌクレオチドからなり、カルボキシル末端の配列ＳＣＤＫＴＨＴ（SEC ID NO：130）を有する。Ｈ６５Ｆｄ'の配列は、ヒトのＩｇＧ₁重鎖のヒンジ領域から残さＣＰＰの付加を有するＨ６５Ｆｄ配列であり、他のヒトＩｇＧ₁重鎖およびそのＦ（ａｂ'）₂に結合したシステイン残さを含んでいる（ベター（Better）らの「Proc．Nat．Acad．Sci．（米国）、90：457-461頁（199 3年）」参照）。Ｈ６５軽鎖配列は、マウスのＨ６５軽鎖可変領域（Ｖ）、接合領域（Ｊ）およびヒトのカッパー領域（Ｃ_k）を符号化するヌクレオチドからなる。Ｈ６５ＦｄのＶ領域およびＪ領域のＤＮＡ配列と、ｐｅｌＢリーダーに連結されたカッパーフラグメント遺伝子は、それぞれ受入番号（Accession No.）M90468およびM90 467に基づいて、GenBank（ロスアラモス・ナショナル・ラボラトリーズ、ニューメキシコ州ロスアラモス）から入手できる。遺伝子融合の幾つかは、Ｈ６５Ｆａｂフラグメント遺伝子の５'末端に連結されたゲロニン遺伝子を含み、他の遺伝子融合はＨ６５Ｆａｂフラグメント遺伝子の３'末端に連結されたゲロニン遺伝子を含んでいた。ジスルフィド結合に関与してプロテアーゼ感受性アミノ酸配列を含むループ（輪状構造）を形成する２つのシステイン残さを含む、大腸菌のシグマ状の毒素（ＳＬＴ）（SEQ ID NO：56）のペプチドセグメント、又はうさぎの筋肉のアルドラーゼ（幾つかの潜在的なカテプシン切断部位を含むSEQ ID NO：57におけるような（ＲＭＡ））のペプチドセグメントを符号化するＤＮＡリンカーを構造物中のゲロニン遺伝子と抗体遺伝子との間に挿入した。あるいはペプチドリンカーセグメントを用いないでゲロニン遺伝子とＨ６５Ｆａｂフラグメント遺伝子との間に直接融合を行った。以下に示す表１１は、各々の遺伝子融合の説明的な名称について述べ、遺伝子融合および各々が指定される適用部分を含む表現プラスミドを示している。また、各々のプラスミドは、（表１１のかっこ内に示す）Ｆａｂフラグメント遺伝子を含み、これらによって各々の特別な遺伝子融合が同時に表現されている。ヒンジ領域（Ｆｄ'）からのシステインの細胞含有物は、遺伝子融合の表現生成物の１価のＦａｂ'又は２価のＦ（ａｂ'）₂の品種の電位形成を許容する。Ａ．抗体遺伝子のカルボキシル末端におけるゲロニンの融合（ｉ）Ｆｄ::ＳＬＴ::ゲロニン（カッパー）２３個のアミノ酸のＳＬＴリンカー配列を有するＨ６５Ｆｄ鎖の３'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＶＫ１、ｐＩＮＧ３７３１（ATCC 687 21）およびｐＩＮＧ４０００からの３片の連結反応において組み立てた。プラスミドｐＶＫ１は、ＳＬＴリンカー配列および幾つかのＨ６５Ｆｄ'にフレーム内で連結されたＦｄ遺伝子と、ベター（Better）らの「Proc．Nat．Acad．Sci．（米国）、457-461頁（1993年）」に示されるｐＩＮＧ３２１７のおけるようなカッパー遺伝子モジュールとを含んでいる。ただし、カッパー領域とＦｄ'領域は逆向きになっている。プラスミドｐＩＮＧ３７３１はゲロニン遺伝子と含み、ｐＩＮＧ４０００は、２シストロン・メッセージ（dicistronic message）としてａｒａＢプロモーターの制御の下で各々ｐｅｌＢリーダー配列に結合したＨ６５カッパー遺伝子およびＦｄ'遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＶＫ１は、鎖内ジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残さによって結合されたＳＬＴ遺伝子のプロテアーゼ感受性セグメントに、ヒトＩｇＧＦｄ不変領域の３'末端をフレーム内で連結するように設計した。ＳＬＴ遺伝子セグメント（システイン残さによって結合されたＳＬＴからの２０個のアミノ酸とクローニングを容易にするために導入された３個のアミノ酸とを加えたもの）は、２つのオリゴヌクレオチド、ＳＬＴリンカー１およびＳＬＴリンカー２から組み立てた。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＰｓｔＩ結合端およびＸｈｏＩ結合端を含みＰｓｔＩ部位を破壊してＸｈｏＩ部位を維持するベクター（ｐＩＮＧ３１８５）中に結合した。プラスミドｐＩＮＧ３１８５は、Ｆｄ遺伝子の３' 末端に工学的ＰｓｔＩ部位を含み、Ｆｄ遺伝子の下流にＸｈｏＩ部位を含んでいた。この結合の生成物ｐＶＫ１は、フレーム内にＳＬＴリンカーセグメントを有する（ｐｅｌＢリーダーに融合される）Ｈ６５Ｆｄ遺伝子を含み、ＳＬＴリンカーの３'末端に２つの制限部位、ＦｓｐＩおよびＳｃａＩを含んでいた。プラスミドｐＶＫ１をＳａｕＩおよびＳｃａＩで消化し、アガロースゲル上の電気泳動によってＦｄ不変ドメインの一部およびＳＬＴ遺伝子の全体を含む２１７ｂｐフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３７３１をＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、７６０ｂｐゲロニン遺伝子を同様に精製した。プラスミドｐＩＮＧ４０００を、ＳａｕＩおよびＸｈｏＩで消化し、カッパー遺伝子の全体およびＦｄ遺伝子の一部を含むベクターセグメントも精製した。これらの３つのＤＮＡフラグメントの結合により、Ｆｄ::ＳＬＴ::ゲロニン（カッパー）遺伝子融合ベクターを含むｐＩＮＧ４４０６を生じた。（ii）カッパー::ＳＬＴ::ゲロニン（Ｆｄ）２５個のアミノ酸ＳＬＴリンカー配列（システイン残さによって結合したＳＬＴからの２０個のアミノ酸とクローニングを容易にするために導入した５個のアミノ酸とを加えたもの）によるＨ６５カッパー鎖へのゲロニン遺伝子の融合をｐＩＮＧ３７３１（ATCC 68721）およびｐＩＮＧ３７１３内のＤＮＡセグメントから組み立てた。プラスミドｐＩＮＧ３７１３は、Ｈ６５Ｆｄとカッパー遺伝子が、カッパー遺伝子の３'末端においてフレーム内でクローニングされるＳＬＴリンカーセグメントを含む２シストロン転写単位内で結合される表現ベクターである。プラスミドは次のように構成される。Ｈ６５Ｆｄおよびカッパー遺伝子を含むプラスミド源において、ＥａｇＩ部位は、符号化されたアミノ酸配列を変えることなく部位が指示された突然変異誘発によってカッパー遺伝子の３'末端に配置された。ｐＶＫ１からのＳＬＴ遺伝子セグメントは、カッパー遺伝子の３'末端におけるＥａｇＩ部位へのフレーム内連鎖のために、プライマーＳＬＴ-ＥａｇＩ-５' およびＳａｌＩによって拡大した。１４０ｂｐＰＣＲ生成物をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＳＬＴ遺伝子セグメントを含む７５ｂｐフラグメントをプラスミド源内のＦｄ遺伝子およびカッパー遺伝子に隣接してクローニングし、ｐＩＮＧ３７１３を生成した。ゲロニンへの遺伝子融合を行うために、ＳｃａＩおよびＸｈｏＩでｐＩＮＧ３７１３を切断し、Ｆｄ遺伝子およびカッパー::ＳＬＴ融合を含むベクターフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３７３１をＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ゲロニン遺伝子を含むＤＮＡフラグメントも精製した。これらの２つのフラグメントの結合の生成物であるｐＩＮＧ４４０７は、Ｆｄおよびカッパー::ＳＬＴ::ゲロニン遺伝子を含んでいる。（iii）Ｆｄ::ＲＭＡ::ゲロニン（カッパー）２１個のアミノ酸のＲＭＡリンカー配列（ＲＭＡからの２０個のアミノ酸とクローニングを容易にするために導入された１個のアミノ酸とを加えたもの）によるＨ６５Ｆｄ鎖の３'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＳＨ４、ｐＩＮＧ３７３１（ATCC 68721）およびｐＩＮＧ４０００からの３片の連結反応において組み立てた。プラスミドｐＳＨ４は、ＲＭＡリンカー配列にフレーム内で連結したＦｄ遺伝子を含んでいる。ＲＭＡ遺伝子セグメントを、以下のような重複拡大ＰＣＲによってＦｄの３'末端に連結した。Ｆｄ遺伝子の３'末端（不変領域）は、プライマーＫＢＡ-γ２およびＲＭＡＧ-１を有するプラスミド源からのＰＣＲによって拡大した。すべてのヒトのＩｇＧ₁抗体の不変領域はこの領域と同一であるので、どのようなＦｄ不変領域も使用することができる。この反応の生成物を、最初の反応の拡大した生成物にアニーリングしたプライマーＲＭＡ-７６と混合し、その混合物をプライマーＫＢＡ-γ２およびＲＭＡＫ -２で拡大した。ＰＣＲ生成物は、ＲＭＡ遺伝子セグメントにフレーム内で連結したＦｄ不変領域の一部を含んでいた。また、この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質にフレーム内で融合するのに有用なＳｃａＩ制限部位、およびその後のクローニングのためのＸｈｏＩ部位を含んでいた。このＰＣＲ生成物をＳａｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、Ｆｄ遺伝子の残余に隣接して結合し、ｐＳＨ４を生成した。Ｆｄ::ＲＭＡ::ゲロニン、カッパー遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、ｐＳＨ４をＳａｕＩおよびＳｃａＩで切断し、Ｆｄ::ＲＭＡセグメントを精製した。プラスミドｐＩＮＧ３７３１をＳｍａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ゲロニン遺伝子を含む７６０ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。また、ｐＩＮＧ４０００をＳａｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、ベクターを精製した。これらのフラグメントの結合の生成物であるｐＩＮＧ４４０８は、Ｆｄ::ＲＭＡ:: ゲロニンおよびカッパー遺伝子を含んでいた。（iv）カッパー::ＲＭＡ::ゲロニン（Ｆｄ）２１個のアミノ酸のＲＭＡリンカー配列によるＨ６５カッパー鎖の３'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＳＨ６、ｐＩＮＧ４４０８（上記段落を参照）およびｐＩＮＧ３７１３からの３片の連結反応において組み立てた。プラスミドｐＳＨ６は、ＲＭＡリンカー配列にフレーム内で連結されたカッパー遺伝子を含んでいる。ＲＭＡ遺伝子セグメントは、以下のような重複拡大ＰＣＲによってカッパーの３'末端に連結された。カッパー遺伝子の３'末端（不変領域）は、プラスミドＫＢＡ-Ｋ２およびＲＭＡＫ-１を有するプラスミド源からのＰＣＲによって拡大した。この反応の生成物を、最初の反応の拡大生成物にアニーリングされたプライマーＲＭＡ-７６（SEQ ID NO：81）と混合し、この混合物をプライマーＫＢＡ-Ｋ２およびＲＭＡＫ-２で拡大した。ＰＣＲ生成物は、ＲＭＡ遺伝子セグメントにフレーム内で連結したカッパー不変領域の一部を含んでいた。また、この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質へのフレーム内融合に有用なＳｃａＩ制限部位と、その後のクローニングのためのＸｈｏＩ部位も含んでいた。このＰＣＲ生成物をＳｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、カッパー遺伝子の残余に隣接して結合して、ｐＳＨ６を生成した。カッパー::ＲＭＡ::ゲロニンおよびＦｄ遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、ｐＳＨ６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断し、カッパー不変領域およびＲＭＡリンカー（ＰｓｔＩＲＭＡリンカーセグメントはＰｓｔＩ部位を含む）セグメントの一部を含むＤＮＡフラグメントを精製した。プラスミドｐＩＮＧ４４０８をＰｓｔＩおよびＳａｌＩで切断し、ＲＭＡリンカーのセグメント、ゲロニン遺伝子、およびベクターセグメント内のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３３１３をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ベクターを精製した。これらの３つのフラグメントの結合の生成物であるｐＩＮＧ４４１０は、カッパー::ＲＭＡ::ゲロニンおよびＦｄ遺伝子を含んでいた。Ｂ．抗体遺伝子のアミノ末端におけるゲロニンの融合（ｉ）ゲロニン::ＳＬＴ::Ｆｄ’（カッパー）２５個のアミノ酸のＳＬＴリンカー配列（システイン残さによって結合されたＳＬＴからの２０個のアミノ酸とクローニングを容易にするために導入された５つのアミノ酸とを加えたもの）によるＨ６５Ｆｄ'鎖の５'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＩＮＧ３７４８と、ｐＩＮＧ３２１７と、ｐＩＮＧ３２１７中のＦｄ'遺伝子の可変領域であるＨ６５重鎖可変領域（Ｖ_B）遺伝子セグメントを符号化するＰＣＲフラグメントからの３片の連結反応において組み立てた。プラスミドｐＩＮＧ３７４８は、ＳＬＴリンカー配列にフレーム内で連結されたゲロニン遺伝子を含み、ｐＩＮＧ３２１７は、２シストロン転写単位内にＨ６５Ｆｄ'とカッパー遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＩＮＧ３８２５（例２を参照）をＰＣＲプライマーｇｅｌｏ３'- Ｅａｇおよびｇｅｌｏ-９で拡大し、ＰＣＲ突然変異誘発によってゲロニン遺伝子の３'末端にＥａｇＩ制限部位を導入した。ＰＣＲ生成物をＢｃｌＩおよびＥａｇＩで切断し、５６ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。プラスミドｐＩＮＧ３７１３をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＳＬＴリンカーを含む７７ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。ＥａｇＩフラグメントへの５６ｂｐＢｃｌＩと、ＸｈｏＩフラグメントへの７７ｂｐＥａｇＩを、ＢｃｌＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＩＮＧ３８２５中に結合し、ＳＬＴリンカー配列にフレーム内で連結したゲロニン遺伝子を含むｐＩＮＧ３７４８を生成した。ゲロニン::ＳＬＴ::Ｆｄ'およびカッパー遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、プライマーＨ６５-Ｇ１およびＨ６５-Ｇ２を有するｐＩＮＧ３２１７からのＰＣＲによってＨ６５Ｖ_Bを拡大し、生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＮｄｅＩで消化した。Ｈ６５重鎖のＶ領域の５'末端を含む１７６ｂｐフラグメントを精製した。同時にｐＩＮＧ３２１７をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｆｄ'遺伝子の一部およびカッパー遺伝子の全部を含む１３０７ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。これらの２つのフラグメントを、ゲロニン::ＳＬＴ::Ｆｄ'遺伝子およびカッパー遺伝子を含むｐＩＮＧ３７５４（ATCC 69102）を産出する３片の連結反応においてＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＩＮＧ３７４８に結合した。（ii）ゲロニン::ＳＬＴ::カッパー（Ｆｄ'）２５個のアミノ酸のＳＬＴリンカー配列によるＨ６５カッパー鎖の５'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＩＮＧ３７４８（上記を参照）と、ｐＩＮＧ４０００と、Ｈ６５軽鎖可変領域（Ｖ_L）遺伝子セグメントを符号化するＰＣＲフラグメントからの３片の連結反応において組み立てた。ゲロニン::ＳＬＴ::カッパー遺伝子およびＦｄ'遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、Ｈ６５Ｖ_LフラグメントをプライマーＨ６５-Ｋ１およびＪＫ１-ＨｉｎｄＩＩＩを有するｐＩＮＧ３２１７からのＰＣＲによって拡大し、生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。軽鎖Ｖ領域を含む３０６ｂｐフラグメントを精製した。同時に、ｐＩＮＧ４０００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、カッパー不変領域およびＦｄ'遺伝子の全部を含む１１７９ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。これらの２つのフラグメントを、ゲロニン::ＳＬＴ::カッパー遺伝子およびＦｄ遺伝子を含むｐＩＮＧ３７５７を産出する３片の連結反応においてＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＩＮＧ３７４８に結合した。（iii）ゲロニン::ＲＭＡ::Ｆｄ'（カッパー）２４個のアミノ酸のＲＭＡリンカー配列（ＲＭＡからの２０個のアミノ酸とクローニングを容易にするために導入された４個のアミノ酸とを加えたもの）によるＨ６５Ｆｄ'鎖の５'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＩＮＧ３７５５と、ｐＩＮＧ３２１７と、Ｈ６５Ｖ_B遺伝子セグメントを符号化するＰＣＲフラグメントからの３片の連結反応において組み立てた。プラスミドｐＩＮＧ３７５５は、ＲＭＡリンカー配列にフレーム内で連結したゲロニン遺伝子を含み、ｐＩＮＧ３２１７は、２シストロン転写単位内においてＨ６５Ｆｄ'遺伝子およびカッパー遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＩＮＧ３７５５を、ＲＭＡリンカー遺伝子セグメントに連結したゲロニン遺伝子を含むように組み立てた。ＲＭＡリンカー遺伝子セグメントは、プライマーＲＭＡ-ＥａｇＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ-２を有するｐＳＨ₄からＰＣＲによって拡大した。１９８ｂｐＰＣＲ生成物をＥａｇＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その結果生ずる１５３ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。このＲＭＡ遺伝子セグメントを、ｐＩＮＧ３７４８からＥａｇＩまでのＰｓｔＩとｐＩＮＧ３８２５からＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントまでのＰｓｔＩにより、ゲロニンに隣接してクローニングした。この３片の結合の生成物はｐＩＮＧ３７５５であった。ゲロニン::ＲＭＡ::Ｆｄ'遺伝子、カッパー遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、プライマーＨ６５-Ｇ１（SEQ ＩD NO：84）およびＨ６５- Ｇ２（SEQ ID NO：85）を有するｐＩＮＧ３２１７からのＰＣＲによってＨ６５Ｖ_Bを拡大し、生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＮｄｅＩで消化した。重鎖Ｖ領域の５'末端を含む１８６ｂｐフラグメントを精製した。同時にｐＩＮＧ３２１７をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｆｄ'遺伝子の一部およびカッパー遺伝子の全部を含む１３０７ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。これらの２つのフラグメントを、ゲロニン::ＲＭＡ::Ｆｄ'遺伝子およびカッパー遺伝子を含むｐＩＮＧ３７５９（ATCC 69104）を産出する３片の連結反応においてＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＩＮＧ３７５５に結合した。（iv）ゲロニン::ＲＭＡ::カッパー（Ｆｄ'）２４個のアミノ酸のＲＭＡリンカー配列によるＨ６５カッパー鎖の５'末端へのゲロニン遺伝子の融合を、プラスミドｐＩＮＧ３７５５と、ｐＩＮＧ４０００と、Ｈ６５Ｖ_L遺伝子セグメントを符号化するＰＣＲフラグメントからの３片の連結反応において組み立てた。ゲロニン::ＲＭＡ::カッパー遺伝子およびＦｄ'遺伝子を含む遺伝子融合ベクターを組み立てるために、プラスミドＨ６５Ｋ-１（SEQ ID NO：86）およびＪＫ１-ＨｉｎｄＩＩＩを有するｐＩＮＧ３２１７からのＰＣＲによってＨ６５Ｖ_L セグメントを拡大し、生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。軽鎖Ｖ領域の５'末端を含む３０６ｂｐフラグメントを精製した。同時にｐＩＮＧ４０００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、カッパー不変領域およびＦｄ'遺伝子の全部を含む１１７９ｂｐＤＮＡフラグメントを精製した。これらの２つのフラグメントは、ゲロニン::ＲＭＡ::カッパーおよびＦｄ'遺伝子を含むｐＩＮＧ３７５８（ATCC 69103）を産出する３片の連結反応においてＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化した。Ｃ．抗体遺伝子のアミノ末端におけるゲロニンの直接融合（ｉ）ゲロニン::Ｆｄ'（カッパー）ゲロニン遺伝子の直接融合をｐＩＮＧ３７５４から組み立てた。ｐＩＮＧ３７５４をＢｇｌＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターセグメントを精製した。同時にｐＩＮＧ３７５４をＥａｇＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＢｇｌＩＩで切断し、ゲロニン遺伝子セグメントを精製した。また、ｐＩＮＧ３７５４をＦｓｐＩおよびＸｈｏＩで切断し、Ｆｄおよびカッパー遺伝子セグメントを精製した。これらのフラグメントは３片の連結反応において組み立てられ、カッパー遺伝子と共同してＦｄ 'へのゲロニンの直接遺伝子融合を含むｐＩＮＧ３３３４を生成した。実施例１５ｈｅ３Ｆａおよびゲロニンｈｅ３Ｆａｂ免疫融合ｂの調製以下の部分は、人間工学的ｈｅ３Ｆａｂタンパク質の構造と、ｈｅ３Ｆｄおよびκ鎖へのゲロニンの免疫融合について詳述するものである。Ａ．ｈｅ３−Ｆａｂ発現プラスミドｈｅ３重鎖のＶ領域は、プライマーＨ６５−Ｇ３すなわちＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６）およびＨ６５Ｇ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：８５）でプラスミドｐＩＮＧ４６２１（ｐＩＮＧ４６２１については、上記実施例５において十分に説明してある）からＰＣＲ増幅された。増幅は、噴気孔ポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＩａｂｓ）を使用して、９４℃での１分間の変性と、５０℃での２分間のアニーリングと、７２℃での３分間の重合とを含む２５サイクルにわたって実施された。このＰＣＲ生成物をポリヌクレオチドキナーゼで処理し、ＢｓｔＥＩＩで消化したところ、Ｖ領域ＤＮＡが精製された。次に、精製後のＤＮＡフラグメントをｐＩＣ１００に配位子結合し、これをＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＢｓｔＥＩＩで切断した。次に、このようにして得られたフラグメントを、ｐＩＮＧ３２１８（Ｆａｂ´遺伝子を有する）から得られたＢｓｔＥＩＩフラグメントに配位子結合し、ｐｅｌＢリーダー配列とこのようにして得られたＰＣＲ生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製した。次に精製後のフラグメントをｐＩＣ１００にクローン化し、これをまずＳｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで消化しながら、３５３塩基対のＨｊｎｄＩＩＩ−ＸｈoＩフラグメントでｐＩＮＧ３２１７からのκ定常部をコード化した。このようにして得られたプラスミドは、枠内でｐｅｌＢリーダーと結合したｈｅ３κ配列を有するｐＩＮＧ４６２７であった。ａｒａＢプロモーターの転写調節下でｐｅｌＢ結合し結合したｈｅ３Ｆｄ遺伝子を有するｐＩＮＧ４６２３を作製した。次に、ｈｅ３ κＶ領域を、実施例５において上述し、ここでは参考に挙げておく共同所有の係属中米国出願第０７／８０８，４６４号において説明されているような方法で、６個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してアッセンブルした。たｈｅ３κ遺伝子およびＦｄ遺伝子を有するプラスミドｐＩＮＧ４６２８を、ｐＩＮＧ４６２３およびｐＩＮＧ４６２７から以下のようにしてアッセンブルした。まず、関連のないκ遺伝子とＦｄ遺伝子ｐＮＲＸ−２に対する発現ベクターを、プラスミド複製、テトラサイクリン耐性マーカー、ａｒａＢ転写調節およびＦｄ定常部の３´末端に関する全ての特徴を有するベクターフラグメントを残してＳａｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。［プラスミドｐＮＲＸ−２は、ｐＩＮＧ３１０４から得られるＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片（ここでは参考に挙げておく国際特許公開第ＷＯ９０／０２５６９号に記載されている）を有する］この断片は、ｐＩＮＧ３１０４の、複製、耐性および転写調節についての特徴を有し、ｐＩＮＧ１４４４から得られる、Ｆｄ定常部の３´末端を有するＸｈｏＩ- ＳａｕＩＤＮＡ断片（ここでは参考に挙げておく国際特許公開第ＷＯ８９／００９９９号に記載されている）に結合している。］次に、ｐＩＮＧ４６２３をＰｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＳａｕＩで消化した後、ｐｅｌＢ：：Ｆｄ遺伝子配列を単離した。プラスミドｐＩＮＧ４６２７をＸhｏＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐｅｌＢ：：Ｆｄ遺伝子配列およびｐＮＲＸ−２ベクターフラグメントに配位子結合してｈｅ３−Ｆａｂ発現ベクターｐＩＮＧ４６２８を生成した。このプラスミドは２個のＸｈｏＩ部位を有している。一方は κ遺伝子とＦｄ遺伝子との間に位置しており、他方はＦｄ遺伝子の終始コドンよりも４塩基対下流に位置していた。 κ遺伝子とＦｄ遺伝子との間にＸｈｏＩ部位のないベクターであるｐＩＮＧ４６３３を構築した。ｐＩＮＧ４６３３をアッセンブルするために、ｐＩＮＧ４６２３をＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＳａｕＩで消化した。次に、ｐｅ１Ｂ：：κ遺伝子配列を単離して精製した。次に、ｐＮＲＸ−２ベクターフラグメントおよびｐｅｌＢ：：Ｆｄ遺伝子配列を精製後のｐｅｌＢ：：κ 遺伝子配列に配位子結合して、ｐＩＮＧ４６３３を形成した。ｐＩＮＧ４６３３およびｐＩＮＧ４６２８はいずれもｈｅ３−Ｆａｂ用の細菌発現ベクターであって、それぞれ、Ｌ−アラビノースを使用しての宿主細胞の誘導時にジシストロンメッセージとして発現されるｈｅ３Ｆｄ遺伝子とκ遺伝子とをする。さらに、ｐＩＮＧ４６２８は２個のＸｈｏＩ制限部位を有する。一方はＦｄ終始コドンの４塩基対後に位置し、他方はκ遺伝子の３´末端とＦｄ遺伝子の５´末端との間の遺伝子間領域に位置していた。プラスミドｐＩＮＧ４６３３には遺伝子間領域にＸｈｏＩが存在しない。Ｂ．ｈｅ３Ｆａｂの精製プラスミドｐＩＮＧ４６２８およびｐＩＮＧ４６３３をＥ．ｃｏｌｉＥ１０４に形質転換した。アラビースで細菌培養を誘導し、ｈｅ３Ｆａｂを含有している無細胞うわずみを濃縮して、ｐＨ６．８、２０ｍＭのＨＥＰＥＳに濾過した。次にこの試料をＣＭＳｐｈｅｒａｄｅｘカラム（２．５×３ｃｍ）に仕込み、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭのＮａCｌ、ｐＨ６．８中で平衡化した。このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８で溶出した。溶出液を２アリコートに分け、それぞれを別々にタンパク質Ｇ（バイオプロセッシング）カラム（２．５×２．５ｃｍ）に仕込んでこのカラムから溶出させた。このタンパク質Ｇカラムを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８中で平衡化し、１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０で試料を溶出した。これら２種類の溶出液を混合し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８で２回希釈した。希釈後の溶出液をフェニルセファロース高置換高速フロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（２．５×３．３ｃｍ）に仕込み、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８中で平衡化した。次に、このカラムを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．６ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８で溶出した。Ｃ．ゲロニン：：ＲＭＡ：：ｈｅ３κ、ｈｅ３Ｆｄ融合リンカーを介してｈｅ３Ｆａｂに融合した自然配列ゲロニン遺伝子を含む他の遺伝的構造物をアッセンブルした。ゲロニン：：ＲＭＡ：：ｈｅ３κ、Ｆｄを有する融合を、プラスミドｐＩＮＧ３７５５、ｐＩＮＧ４６３３、ｐＩＮＧ４６２８からのＤＮＡからアッセンブルした。ｐＩＮＧ４６３３およびｐＩＮＧ４６２８については、いずれも一連の工程においてアッセンブルを行った。これによって、ｈｅ３の重Ｖ領域および軽Ｖ領域は個々に枠内でｐｅｌＢリーダーに結合した。次に、細菌発現ベクターのａｒａＢプロモーターの調節下で重Ｖ領域および軽Ｖ領域をジシストロン発現ベクターにて一緒にしした。ゲロニン：：ＲＭＡ：：ｈｅ３κ、ｈｅ３Ｆｄ融合のアッセンブリーは、プラスミドｐＩＮＧ３７５５、ｐＩＮＧ４６３３、ｐＩＮＧ４６２８からの３つのＤＮＡフラグメントを構築することによって達成された。このうち最初のフラグメントは、これらの部位の間で４塩基対を切り出すＳｃａＩとＸｈｏＩでｐＩＮＧ３７５５を消化することによって作製された。結果として得られたベクターフラグメントを精製した。上記融合を構築するために使用される２つ目のフラグメントは、ＡｓｅＩ（Ｖ_Lにおいて切断）およびＸｈｏＩで切断されたプラスミドｐＩＮＧ４６３３から得られ、このようにして得られた、κおよびＦｄ遺伝子の３ ´末端断片を有する１４０４塩基対のフラグメントを精製した。κ可変領域コード化配列の５´末端を有する３つ目のフラグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーであるＨｕｋ−７およびｊｋｌ−ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＩＮＧ４６２８に含まれるＰＣＲ増幅Ｖ_L 遺伝子から調製された。このようにして得られた３２２塩基対のＰＣＲ増幅ＶＬフラグメントをＴ４ポリメラーゼで処理し、ＡｓｅＩで消化し、Ｖ_Lの５末端を有する８６塩基対のフラグメントを精製した。上記において生成された３種類のフラグメントを一緒に配位子結合してｐＩＮＧ３７６４を形成した。ｐＩＮＧ３７６４の直接ＤＮＡ配列決定によってＰＣＲ増幅Ｖ領域のＤＮＡ配列を確認した。Ｄ．ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３κ、ｈｅ３Ｆｄ融合ゲロニン：：ＳＬＴを有するｐＩＮＧ３７４８から生成されたフラグメントとすぐ上でセクションＡにおいて説明したｐＩＮＧ４６３３およびｐＩＮＧ４６２８フラグメントを配位子結合することで、ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３κ、ｈｅ３Ｆｄ融合を構築した。このｐＩＮＧ３７４８フラグメントは、ｐＩＮＧ３７５５についてすぐ上で説明したようにＳｃａＩおよびＸｈｏＩを使用して生成されたものである。得られたベクターはｐＩＮＧ３７６３と指定された。Ｅ．ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３Ｆｄ、ｈｅ３κ融合を有する発現ベクターの構築２つの工程において、プラスミドｐＩＮＧ３８２５、ｐＩＮＧ４６２８、ｐＩＮＧ４６３９、ｐＩＮＧ３２１７［ここでは参考にあげておくBetter et al.著 Proc．Natl．Acad．Sci．（USA），90:457-461（1993）］、およびｐＩＮＧ４６２７からのＤＮＡ断片から、ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３Ｆｄ、ｈｅ３κ融合を有する発現ベクターを構築した。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでｐＩＮＧ３８２５を消化し、ゲロニン遺伝子の３´末端を有する６５４塩基対のフラグメントと、ゲロニン遺伝子の５末端を有するフラグメントとを生成し、これらを精製した。次に、ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩでｐＩＮＧ４６３９を消化し、ゲロニン遺伝子の３´末端とこれによるＶ_Hの５´末端とを有する９０３塩基対のフラグメントすなわちＳＬＴリンカーを精製した。最後に、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩでｐＩＮＧ４６２８を切断することで、Ｆｄ遺伝子の３´末端を有する５２３塩基対のフラグメントを得、これを精製した。次に、これら３種類のフラグメントを配位子結合し、ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３Ｆｄ融合をコード化する遺伝子を有するプラスミドｐＩＮＧ３７６５を形成した。３種類のベクターフラグメントを使用して、（ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｈｅ３Ｆｄ断片およびｈｅ３κ断片を含む）最終発現ベクターをアッセンブルした。プラスミドｐＩＮＧ３７６５をＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、（テトラサイクリン耐性マーカーをコード化する２６５塩基対のフラグメントを放出する）ＮｈｅＩで切断し、このようにして得られたベクターフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ４６２８の構築用には、枠内でｐｅｌＢリーダーと結合したｈｅ３κ遺伝子を有するプラスミドｐＩＮＧ４６２７を使用した。プラスミドｐＩＮＧ４６２７をＰｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、さらにＳｓｔＩで消化した。このようにして得られた、κ遺伝子を有する７２６塩基対のフラグメント（３´末端における４０塩基対を除く）を精製した。次に、プラスミドｐＩＮＧ３２１７をＳｓｔＩおよびＮhｅＩで切断し、κ遺伝子の３´末端およびテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む下流部分を有する３１８塩基対のフラグメントを得、これを精製した。上述した３種類のフラグメントを配位子結合することで、最終発現ベクターであるｐＩＮＧ３７６７が生成された。Ｆ．ゲロニン：：ＲＭＡ：ｈｅ３Ｆｄ融合を有する発現ベクターの構築２つの工程において、プラスミドｐＩＮＧ３８２５、ｐＩＮＧ４６２８、ｐＩＮＧ３２１７およびｐＩＮＧ４６２７からゲロニン：：ＲＭＡ：：ｈｅ３Ｆｄ、ｈｅ３κ融合発現ベクターを構築した。使用したクローン化方法は、ｐＩＮＧ４６３９の代わりにｐＩＮＧ４６３８を使用したこと以外はｐＩＮＧ３７６７を生成する上で使用したものと同一である。実施例１６において後述するように、プラスミドｐＩＮＧ４６３８はｐＩＮＧ４６３９とは異なっている。ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ融合をコード化する中間ベクターは指定されたｐＩＮＧ３７６６であり、最終発現ベクターは指定されたｐＩＮＧ３７６８であった。実施例１６ゲロニン−単鎖抗体融合自然配列ゲロニン遺伝子も人間工学的ｈｅ３Ｈ６５可変領域の単鎖形に融合した。ゲロニン遺伝子は、融合遺伝子のＮ末端あるいはＣ末端に位置しており、ＳＬＴまたはＲＭＡリンカ−ペプチドはゲロニンと抗体ドメインとの間に位置し、ゲロニンのサイトゾル放出を伴う融合タンパク質の細胞間処理を可能にしていた。Ａ．ゲロニン：：ＲＭＡ：：ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）ゲロニン：：ＳＬＴ：：ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）、ゲロニン：：ＲＭＡ：：ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）、ゲロニン：：ＳＬＴ：：ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）の構築ｈｅ３Ｈ６５可変ドメインの単鎖抗体（ＳＣＡ）形を先に構築した遺伝子からアッセンブルした。このＳＣＡ断片は、１５アミノ酸可変性ペプチド：［（Ｇｌｙ）₄ｓｅｒ］₃を介して一方の鎖（重鎖あるいは軽鎖）のＶおよびＪ断片全体と結合した他方の鎖（重鎖あるいは軽鎖）のＶおよびＪ領域全体からなっていた。このペプチドは、Huston et al.著、Proc．Natl．Acad．Scj．USA，85:5879-5883（1988）；Glockshuber et al.著、Biochemistry，29:1362-1367（1990）；およびChead1e et al.著、Molecular Immunol.，29:21-30（1992）に記載されているものと同一である。ＳＣＡを２つの配向すなわちＶ−Ｊ_κ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_γ，およびＶ- Ｊ_γ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_κにアッセンブルした。各ＳＣＡ断片をアッセンブルした後、ゲロニンに融合した。ＳＣＡ断片Ｖ−Ｊ_κ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_γのアッセンブル用に、プライマーＨＵＫ−７およびＳＣＦＶ−１を使用し、１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．８で２０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₂、２ｍＭのＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００を１００ｎｇ／ｍｌ、各ｄＮＴＰのＢＳＡを２００μＭおよび噴気孔ポリメラーゼ２単位（New England Biolabs，Beverle y，Massahusetts）を総容積１００μｌ中に含む反応においてＰＣＲによってｐＩＮＧ４６２７から得られたｈｅ３Ｖ／Ｊκ配列を有する３５２塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅した。同時に、プライマーＳＣＦＶ−２およびＳＣＦＶ−３を使用して、ｐＩＮＧ４６２３からのｈｅ３重鎖Ｖ／Ｊγ断片を増幅し、４００塩基対のフラグメントを生成した。これらの反応で得られた生成物を混合し、アウトサイドプライマーＨＵＫ−７およびＳＣＦＶ−３で増幅した。この反応の生成物をＴ４ポリメラーゼで処理した後、ＸｈｏＩで切断した。次に、このようにして得られた７２８塩基対のフラグメントをアガロースゲル上での電気泳動によって精製した。このフラグメントをベクターｐＩＮＧ３７５５およびｐＩＮＧ３７４８に配位子結合（実施例１０を参照）し、それぞれＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化した。このようにして得られたベクターｐＩＮＧ４６３７およびｐＩＮＧ４４１２は、それぞれゲロニン：：ＲＭＡ：：ＳＣＡＶ−Ｊ_κ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_γ融合遺伝子およびゲロニン：：ＳＬＴ：：ＳＣＡＶ−Ｊ_κ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃ ：：Ｖ−Ｊ_γ融合遺伝子を有する。予めＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで消化したｐＩＣ１００に７２８塩基対のフラグメントも配位子結合し、ｐＩＮＧ４６３５を生成した。このプラスミドは、枠内でＶ −Ｊ_κ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−ＪＪ_γ遺伝子に結合したｐｅｌＢリーダー配列を有する。このｐＩＮＧ４６３５におけるｐｅｌＢ：：ＳＣＡ遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントとして切り出し、細菌発現ベクターにクローン化してｐＩＮＧ４６４０を生成した。同様に、噴気孔ポリメラーゼを使用したＰＣＲによってプライマーＳＣＦＶ− ５およびＳＣＦＶ−６でｐＩＮＧ４６２７を増幅してｈｅ３Ｖ／Ｊκ配列を有する３６７塩基対のフラグメントを生成し、プライマーＨＥ６５−Ｇ３およびＳＣＦＶ−４でｐＩＮＧ４６２３を増幅してｈｅ３ γ Ｖ／Ｊ配列を有する３８５塩基対のフラグメントを生成することで、ＳＣＡＶ−Ｊγ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−Ｊκをアッセンブルした。これらの反応で得られた生成物を混合し、Ｈ６５−Ｇ３およびＳＣＦＶ−６で増幅した。この７３７塩基対の生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで切断した。（ＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化した）ｐＩＮＧ３７５５およびｐＩＮＧ３７４８への配位子結合を行うことで、ｐＩＮＧ４６３８におけるゲロニン：：ＲＭＡ：：ＳＣＡｖ−Ｊ_γ：：［（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_κ遺伝子融合およびｐＩＮＧ４６３９におけるゲロニンｓＬＴ：：ｓＣＡＶ−Ｊ_γ：：［（ＧＩｙ）₄Ｓｅｒ］₃：：Ｖ−Ｊ_κ遺伝子融合のアッセンブリが得られた。これらのベクターｐＩＮＧ４６３７、ｐＩＮＧ４４１２、ｐＩＮＧ４６３８およびｐＩＮＧ４６３９を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｅ１０４に形質転換し、アラビノースで誘導した。ゲロニン特異抗体を用いたウェスタンブロットによって、予想通りの分子量のタンパク質生成物が同定された。Ｂ．ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）：：ＳＬＴ：：ゲロニンベクターの構築予め構築したプラスミドｐＩＮＧ４６４０（ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）を有する）、ｐＩＮＧ４４０７（κ：：ＳＬＴ：：ゲロニン、Ｆｄを有する）、およびｐＩＮＧ３１９７からの制限フラグメントを使用して、ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）：：ＳＬＴ：：ゲロニン融合を有する発現ベクターをアッセンブルした。まず、プラスミドｐＩＮＧ４６４０をＢｓｐＨＩで切断し、ｄＣＴＰのみの存在下でＴ４ポリメラーゼで充填し、ヤエナルヌクレアーゼ（ＭＢＮ）で処理して突出を除去すると共に平滑末端を生成し、ＥｃｏＲＩで切断した。このようにして得られた８４９塩基対のフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ４４０７から得られたＳＬＴ含有フラグメントをＥａｇＩで切断して切り出し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑化し、ＸｈｏＩで切断し、得られた約８５０塩基対のフラグメントを精製した。これら２つのフラグメントを一緒にｐＩＮＧ３１９７に配位子結合し、これをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで処理してｐＩＮＧ４６４２を生成した。ＢｓｐＨＩ−Ｔ４−ＭＢＮ／ＥａｇＩ結合部のＤＮＡ断片から、予想されたコドンのうち２個が欠如していたが融合タンパク質は枠内にあることが証明された。Ｃ．ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）：：ＳＬＴ：：ゲロニンベクターの構築プラスミドｐＩＮＧ４６３６（ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）用のＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター）およびｐＩＮＧ４４０７から得られたＤＮＡを使用して、ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）：：ＳＬＴ：：ゲロニン融合を含有する発現ベクターをアッセンブルした。プラスミドｐＩＮＧ４６３６をＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、得られたベクターフラグメントを精製した。同時に、ＳＣＦＶ−７すなわち５ＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）およびＨ６５−Ｇ１３すなわちＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ３´（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３）プライマーを使用してのＰＣＲ用の鋳型としてｐＩＮＧ４６３６を使用した。増幅後の精製物をＥａｇＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、これによって得られた約３８０塩基対のフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＩＮＧ４４０７をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで切断し、約８５０塩基対のフラグメントを得、これを精製した。上記の３種類のフラグメントを一緒に配位子結合し、ｐＩＮＧ４６４３を生成した。Ｄ．ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H）：：ＲＭＡ：：ゲロニンベクターの構築ｐＩＮＧ４６４０、ｐＩＮＧ４４０８［実施例１４Ａ（ｉｉｉ）］およびｐＩＮＧ３８２５（実施例２Ｃ）から得られたＤＮＡを使用して、ＳＣＡ（Ｖ_L−Ｖ_H ）ＲＭＡ：：ゲロニン融合を含有する発現ベクターをアッセンブルした。プラスミドｐＩＮＧ４６４０をＳａｌＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、得られた約７００塩基対のベクターフラグメント（テトラサイクリン耐性物質を含有）を精製した。次に、ｐＩＮＧ３８２５をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲロニン遺伝子の３´末端および隣接するベクター配列を含有する約１３４４塩基対のフラグメントを得た。このフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＩＮＧ４４０８をオリゴヌクレオチドプライマーすなわちＲＭＡ−Ｇ３５´ＴＣＴＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡ３´（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）およびｇｅｌｏ−１０でＰＣＲ増幅した。このようにして得られたＰＣＲ精製物をＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏＩで切断し、Ｖ_Hの３´末端、ＲＭＡおよびゲロニン遺伝子の５´末端を含有する約１８０塩基対のフラグメントを生成し、これを精製した。上記の３種類のフラグメントを配位子結合し、最終発現ベクターであるｐＩＮＧ４６４４を生成した。Ｅ．ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）：：ＲＭＡ：：ゲロニンベターの構築ｐＩＮＧ４６３６、ｐＩＮＧ４４１０およびｐＩＮＧ３８２５から得られたＤＮＡを使用して、ＳＣＡ（Ｖ_H−Ｖ_L）：：ＲＭＡ：：ゲロニンを含有する発現ベクターを構築した。プラスミドｐＩＮＧ４６３６をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたベクターフラグメントを精製した。次に、ｐＩＮＧ３８２５をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断し、このようにして得られた、ゲロニン遺伝子の３´末端およびテトラサイクリン耐性をコード化する隣接のベクター配列を含有する１３４４塩基対のフラグメントを精製した。最後に、ｐＩＮＧ４４１０をプライマーＲＭＡ−Ｇ４すなわち５´ ＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡ３´（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５）とｇｅｌｏ−１０とでＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで切断し、Ｖ_Lの３´−末端、ＲＭＡおよびゲロニンの５´末端を含有する１８０塩基対のフラグメントを得、これを精製した。上記の３種類のフラグメントを一緒に配位子結合し、最終発現ベクターであるｐＩＮＧ４６４５を生成した。制限酵素ＥａｇＩおよびＦｓｐＩを使用し、ｐＩＮＧ４４１２におけるＳＬＴリンカーを欠失させて離脱可能リンカーのないゲロニン：：ＳＣＡ融合を構築することもできる。これらの部位において消化を行い、プラスミドを再配位子結合することで、ＳＬＴ配列を枠内で欠失させることができる。実施例１７多価免疫融合免疫融合の多価形を構築することもできる。Ａ．（ゲロニン：：ＲＭＡ：：κ、Ｆｄ´）₂および（ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ´、κ）₂現ベクターの構築ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域から得られた２つのシステイン残基がＦｄタンパク質のカルボキシル末端に含まれるのであれば細菌Ｆａｂ発現ベクターによって、Ｆ（ａｂ´）₂を生成することができる［Better et al．著、Prｏc．Natl．Acad． Sci．USA，90:457-461（1993）］。F（ａｂ´）₂のような二価構造を形成し得るゲロニン融合タンパク質を発現するために、ｈｅ３Ｆｄ´（２Ｃ）ヒンジ領域（Better et al.上述）を発現ベクターｐＩＮＧ３７６４にクローン化（実施例１５Ｃ）し、融合タンパク質ゲロニン：：ＲＭＡ：：κ、Ｆｄをコード化する。プラスミドｐＩＮＧ３７６４をＸｈｏＩおよびＢｓｕ３６１で切断し、免疫融合遺伝子およびベクター配列を含有する約７５００塩基対のフラグメントを精製した。ｈｅ３ F（ａｂ´）₂をコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６２９もＢｓｕ３６ＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｈｅ３Ｆｄ´（２Ｃ）遺伝子断片を含有する約２００塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。これら２つのＤＮＡフラグメントを配位子結合し、（ゲロニン：：ＲＭＡ：：κ、Ｆｄ´）₂をコード化するｐＩＮＧ３７７５を生成した。融合タンパク質（ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ ´、κ）₂をコード化する発現ベクターも作製した。Ｂ．ゲロニン：：ＲＭＡ：：ＦｄおよびゲロニンＲＭＡ：：Ｋ融合の両方を含有するベクターの構築ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄおよびゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｋ融合を有するプラスミドを構築するために、プラスミドｐＩＮＧ３７６４［実施例１５（ｂ）において上述］をＢｓｇＩおよびＳａｕＩで消化し、プラスミド複製官能基すなわちゲロニン：：ＲＭＡ：：ＫとＦｄの3´末端とを含有する５．７塩基対のフラグメントを単離して精製した。プラスミドｐＩＮＧ３７６８［実施例１５（Ｅ）において上述］をＳａｕＩで消化すると共にＰｓｔＩで部分的に消化し、ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄを含有する１．５塩基対のフラグメントを精製した。最後に、ｐＩＮＧ４０００［実施例１４において上述］をＢｓｇＩおよびＰｓｔＩで消化し、κ遺伝子の３´末端を含有する３５０塩基対のフラグメントを生成した。このフラグメントを精製し、上述した５．７塩基対、１．５塩基対、３５０塩基対の各フラグメントを一緒に配位子結合し、ゲロニン：：ＲＭＡ：：ｋおよびゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ融合を含有するｐＩＮＧ３７７０を形成した。Ｃ．ゲロニン：：ＳＬＴ：：ＦｄおよびゲロニンＳＬＴ：：ｋ融合の両方を含有するベクターの構築プラスミドｐＩＮＧ３７７２は上記融合を含有し、以下のようにして構築された。プラスミドｐＩＮＧ３７６３［実施例１５（Ｄ）において上述］をＢｓｇＩおよびＳａｕＩで消化し、複製官能基、ゲロニン：：ＳＬＴ：：ｋの５´末端およびＦｄの３´末端を含有する５．７塩基対のフラグメントを生成して精製した。次に、プラスミドｐＩＮＧ３７６７［上記実施例１５（Ｄ）において説明］をＳａｕＩおよびＰｓｔＩで消化し、ゲロニンＳＬＴ：：Ｆｄ融合の５−末端を含有する１．５塩基対のフラグメントを生成した。このフラグメントを精製し、ｐＩＮＧ４０００［上記実施例１４において説明］をＢｓgＩおよびＰｓｔＩで消化した。このようにして得られた３５０塩基対のフラグメントを精製し、上述した５．７塩基対、１．５塩基対、３５０塩基対の各フラグメントを配位子結合してｐＩＮＧ３７７２を形成した。Ｄ．多価融合の発現当業者間で周知の技術によってｐＩＮＧ３７７０およびｐＩＮＧ３７７２の両方をＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ１０４）細胞に形質転換し、アラビノースで誘導した。形質転換後の細胞培養から得られたうわずみ液を濃縮したものについて、ウサギ抗ゲロニン抗血清を使用してウェスタンブロット分析によって分析した。両プラスミドからの形質転換細胞は、２個のゲロニンを有するＦａｂ分子（約１０５ｋＤ）について予想された大きさの反応性バンドをゲル上に生成した。これらの結果は、Ｆｄ鎖およびκ鎖の両方が別々にゲロニンに融合した一価のＦａｂを有する融合タンパク質が生成されることと矛盾しない。ｐＩＮＧ３７７５、ｐＩＮＧ３７７０およびｐＩＮＧ３７７２を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株を発酵槽中で成長させ、融合タンパク質生成物を精製した。上記Be tter et al.において説明されているようにして、ｐＩＮＧ３７７５から発現した（ゲロニン：：ＲＭＡ：：κ、Ｆｄ´）₂を精製した。実施例１８リンカーなしで免疫融合をコード化する発現ベクターの構築ゲロニンおよびジシストロンｈｅ３Ｆａｂあるいは単鎖抗体の直接融合をコード化する発現ベクターを以下のようにして構築した。Ａ．Ｖ_HＶ_L：：ゲロニンＶ_HＶ_L：：ＳＬＴ：：ゲロニン融合タンパク質をコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６４２（実施例１６Ｂ）をＦｓｐＩおよびＮｃｏＩで切断し、ゲロニン遺伝子の５´末端を含有する約１００塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。Ｖ_H Ｖ_L：：ＳＬＴ：：ゲロニン融合タンパク質をコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６４３（実施例１６Ｃ）をＥａｇＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＰｓｔＩで切断した。Ｖ_HＶ_L遺伝子断片をコード化する約８５０塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ４６４２およびｐＩＮＧ４６４３から得られたＤＮＡフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断したｐＩＮＧ４６４４（実施例１６Ｄ）から得られたベクターＤＮＡフラグメントに配位子結合し［このプラスミドはゲロニン遺伝子の残りに寄与するか？］、Ｖ_HＶ_L：：ゲロニン直接遺伝子融合をコード化するｐＩＮＧ３７８１を生成した。Ｂ．Ｖ_LＶ_H：：ゲロニンｈｅ３ＳＣＡ遺伝子ＶＬＶＨをコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６４０をＢｓｐＨＩで切断し、ヌクレオチドｄＣＴＰのみの存在下にてＴ４ポリメラーゼで処理し、ヤエナルヌクレアーゼで処理して残っている５´突出を除去した後、ＥｃｏＲＩで切断した。次に、ｈｅ３Ｖ_LＶ_H遺伝子を含有する約８００塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。直接融合Ｖ_HＶ_L：：ゲロニンをコード化するプラスミドｐＩＮＧ３７８１をＥａｇＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理した後、ＸｈｏＩで消化した。次に、ゲロニン遺伝子をコード化する約８００塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。ｐＩＮＧ４６４０およびｐＩＮＧ３７８１から得られたこれら２種類のＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＩＮＧ３７６７から得られたベクターＤＮＡに配位子結合し、アガロースゲル上で精製した。このようにして得られたプラスミドであるｐＩＮＧ３３４８は、Ｖ_LＶ_H：：ゲロニン融合タンパク質をコード化した。融合結合部におけるＤＮＡ配列を直接ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｃ．ゲロニン：：Ｖ_HＶ_L ３´末端において工学的ＥａｇＩ部位を有するゲロニン遺伝子を含有するプラスミドｐＩＮＧ３７５５［実施例１４Ｂ（ｉｉｉ）］をＥａｇＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＮｃｏＩで消化した。ゲロニン遺伝子の３´末端を含有する約６５０塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。融合ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｖ_HＶ_Lをコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６３９（実施例１６Ａ）をＸｈｏＩで切断した後、ＦｓｐＩで部分的に消化した。次に、ｈｅ３Ｖ_HＶ_L遺伝子を全て含有する約７３０塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル中において精製した（ＶＨ遺伝子断片に単一のＦｓｐＩ制限部位が発生し、精製後のｈｅ３Ｖ_HＶ_L遺伝子を約６６０塩基対の不完全な遺伝子断片から分離した）。ｐＩＮＧ３７５５およびｐＩＮＧ４６３９から得られた２種類のＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩプラスＸｈｏＩで消化したベクターｐＩＮＧ３８２５に配位子結合し、アガロースゲル上で精製した。ゲロニン：：Ｖ_HＶ_L融合タンパク質をコード化するプラスミドｐＩＮＧ３３５０が生成された。融合結合部におけるＤＮＡ配列を直接ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｄ．ゲロニン：：Ｖ_LＶ_H ｈｅ３Ｖ_LＶ_H単鎖抗体遺伝子をコード化するプラスミドｐＩＮＧ３３３６をＳｓｔＩおよびＡｓｅＩで切断し、Ｖ_LＶ_Hの３´末端および下流のベクター配列を含有する約５５００塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。（ｐＩＮＧ３３３６は、Ｖ_LＶ_H遺伝子がカルボキシル末端において枠内で６個のヒスチジン残基をコード化すること以外はｐＩＮＧ４６４０と同一である。プラスミドｐＩＮＧ４６２７（実施例１５Ａ）は、ＶＨ遺伝子断片のＰＣＲ増幅用の基質として作用した。プラスミドｐＩＮＧ４６２７を２個のオリゴヌクレオチドプライマーＨＵＫ−７（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）およびＪＫｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８７）で増幅し、得られた生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＡｓｅＩで切断し、Ｖ_Lの５´末端を含有する８６塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３３３６およびｐＩＮＧ４６２７から得られたＤＮＡフラグメントを、ＥａｇＩによる消化、Ｔ４ポリメラーゼによる処理、さらにはこれに続くＳｓｔＩによる消化によって生成されたｐＩＮＧ３７５５の約２３５０塩基対のＤＮＡフラグメントに配位子結合した。このようにして得られた、ゲロニン：：Ｖ_LＶ_H遺伝子融合を含有するベクターをｐＩＮＧ４６５２と命名した。ｐＩＮＧ４６５２のＤＮＡ配列を配位子結合部において確認した。Ｅ．ゲロニン：：κ、Ｆｄゲロニン：：κ、Ｆｄをコード化する直接遺伝子融合も３種類のプラスミドから得られたＤＮＡ断片からアッセンブルした。プラスミドｐＩＮＧ３７６４（実施例１５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、κ遺伝子およびＦｄ遺伝子の３´末端をコード化する約１２００塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。ｈｅ３ＳＣＡ遺伝子Ｖ_LＶ_Hへのゲロニンの直接遺伝子融合をコード化するプラスミドｐＩＮＧ４６５２をＢｇＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ゲロニン遺伝子の３´末端およびκのＶ_L領域をコード化する約８５０塩基対のＤＮＡフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３７６４およびｐＩＮＧ４６５２から得られたＤＮＡフラグメントを、ＢｇＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＩＮＧ３８２５から得られたベクターフラグメント（実施例２Ｃ）に配位子結合し、ゲロニン：：κ、Ｆｄをコード化するｐＩＮＧ３７８４を生成した。Ｆ．ゲロニン：：Ｆｄ、κ 融合タンパク質ゲロニン：：ＲＭＡ：．Ｆｄ、κをコード化するプラスミドｐＩＮＧ３７６８（実施例１５Ｆ）をＮｄｅＩおよびＮｈｅＩで切断し、そのベクターのｈｅ３Ｆｄ遺伝子の大部分、ｈｅ３ κ遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含有するＤＮＡ断片を精製した。上記Ｃにおいて説明したプラスミドｐＩＮＧ３３５０をＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで切断し、ゲロニン遺伝子に結合したｈｅ３Ｆｄ遺伝子の５´末端を含有するＤＮＡフラグメントを精製した。ｐＩＮＧ３３５０およびｐＩＮＧ３７６８から得られたＤＮＡフラグメントを、ＮｈeＩおよびＰｓｔＩで切断したｐＩＮＧ４６３３（実施例１６Ｄ）から得られたベクターフラグメントに配位子結合し、ｐＩＮＧ３７８９を生成した。プラスミドｐＩＮＧ３７８９は、融合タンパク質ゲロニン：：Ｆｄ、κをコード化する。実施例１９他のカテプシン離脱可能リンカーここで説明するＲＭＡリンカー用に選択したウサギ筋肉アルドラーゼの断片は、カテプシンで消化されやすいペプチド配列を含有することが知られている。その他のカテプシン離脱可能タンパク質断片は、細胞間切断用の効果的な標的であり、２種類の特定のアミノ酸が本発明の付加免疫融合における離脱可能リンカーとして含まれた。これらは、アミノ酸配列ＫＰＡＫＦＦＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１（”ＣＣＦ”）およびＫＰＡＫＦＬＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２）（”ＣＣＬ”）である。これらのペプチド断片をコード化する２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。各合成プライマーにおいて１個のヌクレオチド部分に縮重を導入し、ＣＣＦおよびＣＣＬの異なっている特定のアミノ酸部分において適切なアミノ酸がコード化されるようにした。２種類のオリゴヌクレオチドは、５´−ＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＣＧＧＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴ（Ａ／Ｃ）ＣＧＴＣＴＧＡＧＴ−３´（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３）および５−ＡＣＴＣＡＧＡＣＧ（Ｇ／Ｔ）ＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＧＣ−３´（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４）である。次に、これらのオリゴヌクレオチドリンカーを使用し、ゲロニン：：ＣＣＬ：：κ、Ｆｄ；ゲロニン：：ＣＣＦ：：κ、Ｆｄ；ゲロニン：：ＣＣＦＶ_LＶ_H；およびゲロニン：：ＣＣＬ：：Ｖ_HＶ_Lをコード化する融合遺伝子発現ベクターのファミリーをアッセンブルした。融合蛋白質の抗原結合ドメインが融合のＮ末端にあり、Ｖ_LＶ_H：：ＣＣＬ：：ゲロニンなどの免疫融合をコード化する発現ベクターを生成する融合ベクター中にはＣＣＬおよびＣＣＦリンカーも含まれていた。ＣＣＬおよびＣＣＦリンカーを有する融合タンパク質のいくつかを、Ｔ細胞系ＨＳＢ２およびＰＢＭＣの細胞障害について試験し、ＲＭＡリンカーを含有する融合タンパク質と活性について比較を行った。実施例２０ゲロニン免疫融合の発現および精製Ａ．ゲロニン免疫融合の発現構成について実施例１５で説明したゲロニン遺伝子融合の各々を、アラビノース誘導Ｅｃｏｌｉ菌株Ｅ１０４において各遺伝子融合の対Ｈ６５Ｆａｂ遺伝子で同時発現させた。ＥＬＩＳＡによって誘導培養のうわずみ液に遺伝子融合の発現生成物が検出された。一般的に、プレートに抗体認識ゲロニンを塗布した。培養うわずみ液を塗布し、ホースラディッシュのペルオキシダーゼに結合した抗体認識ヒトκで結合Ｆａｂを検出した。ゲロニンと化学的に抱合されたＨ６５Ｆａｂフラグメントが使用した菌株であった。抗体認識κあるいは抗体認識Ｆｄのいずれかをプレートに塗布することを必要とするか、あるいは抗ヒトκではなく抗ヒトＦｄを用いた検出工程を必要とする他のＥＬＩＳＡプロトコルでも同様の結果を得ることができた。このアッセイでは、ゲロニン、κおよびＦｄを含有する、適宜アッセンブルした融合タンパク質のみが検出された。関連のない鎖は検出されなかった。Ｅ．ｃｏｌｉＥ１０４中に発現ベクターｐＩＮＧ４４０６、４４０７、４４０８および４４１０を含有する誘導培養から得られた融合タンパク質を約２０〜２５ｎｇ／ｍｌに濃縮した。ｐＩＮＧ３７５４、３３３４、３７５８および３７５９（ｐＩＮＧ３７５７はない）の誘導時に発現する融合タンパク質は、これよりもかなり高い濃度である約１００〜５００ｎｇ／ｍｌで発現した。抗ヒトκあるいは抗ゲロニン抗体のいずれかを使用したウェスタンブロットの免疫染色によって、濃縮Ｅ．ｃｏｌｉ培養うわずみ液中に約７０，０００Ｋｄの融合タンパク質が検出された。ｐＩＮＧ３７５４（ＡＴＣＣ６９１０２）から得られたゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄ´（κ）融合タンパク質を誘導した１０Ｌの発酵肉汁から精製した。Ｓ１０Ｙ１０カートリッジ（Amicon）およびＤＣ１０濃縮器を使用して、１０Ｌの発酵肉汁を濃縮し、ｐＨ７．０、１０ｍＭのリン酸緩衝液に緩衝液交換した。濃縮したうわずみ液をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＤＥ５２カラム（２０×５ｃｍ）を通過させることによってうわずみ液を精製した。次に、このフロースルーをさらに精製し、１０ｍＭのリン酸緩衝液中においてＣＭ５２（５×１０ｃｍ）でのカラムクロマトグラフィによって濃縮した。０〜０．２ＭのＮａＣｌ二液グラジェントを使用して融合タンパク質を溶出し、この融合タンパク質を含有している画分をプールしてタンパク質Ｇカラム（１ｍｌ）に仕込んだ。ｐＨ５．５、０．２Ｍのクエン酸ナトリウム０．２Ｍ、次にｐＨ４．５の酢酸ナトリウム、最後にｐＨ２．５、０．２Ｍのグリシンを使用して融合タンパク質をタンパク質Ｇから溶出させた。ＣＭ５２１カラムの工程をなくし、ＤＥ５２カラムをｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した以外は同様の方法で、ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ´（κ）およびゲロニン：：ＲＭＡ：：κ（Ｆｄ´）融合タンパク質を発酵肉汁から精製した。融合タンパク質は等質性には精製されなかった。次に、３種類の精製融合タンパク質の各々をＲＬＡアッセイにおいて活性についてアッセイし、Ｔ細胞系ＨＳＢ２に対する細胞障害についてもアッセイした。（Ｔ細胞は、Ｈ６５抗体によって認識されるＣＤ５抗原を発現する。）ＲＬＡアッセイについては実施例４において説明したように実施した。このアッセイの結果を以下の表１２に挙げておく。実施例６において説明したように完全細胞障害アッセイにおいて２種類の融合タンパク質を試験した（表１３）。表１３に示されるように、融合タンパク質は活性であった。ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄ（κ）は２個のＴ細胞系すなわちＨＳＢ２およびＣＥＭを殺し、Ｈ６５に化学的に結合させたゲロニンの場合よりもＩＣ₅₀はそれぞれ２倍および１０倍高かった。結果については以下の表１３を参照のこと。同表では、各試料における融合タンパク質の量に対してＩＣ₅₀値が調節されている。これらの融合タンパク質は、末梢血液単核細胞について同様の活性を呈した（データは示されず）。Ｂ．免疫融合の精製（ｉ）ｃＨ６５Ｆａｂ´を有する免疫融合ｐＨ７．０、１０ｍＭのリン酸ナトリウムにおいて平衡化したＣＭ Spherade x（Sepacor）カラム（５ｃｍ×３ｃｍ）に無細胞うわずみ液を通すことによって、このうわずみ液からｃＨ６５Ｆａｂ´フラグメントを有する免疫融合を精製した。免疫融合タンパク質はカラムに結合し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出する。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６で溶出液を２倍に希釈し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０において平衡化したフェニルセファロース高速フロー（Pharmaia）カラム（２．５×３．５ｃｍ）に仕込んだ。次に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０でこのカラムを洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．９Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で溶出させた。ＹＭ１０膜を取り付けたAmicon撹拌セル中でフェニルセファロース溶出液を容量２〜４ｍｌまで濃縮した。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＳ−２００（Pharmacia）カラム（３．２×３８ｃｍ）に濃縮後の試料を仕込んだ。このカラムを同じ緩衝液中でランし、画分を収集した。所望の分子量の融合タンパク質を含有している画分を混合した。例えば、適当なカラム画分を選択することによって、ｐＩＮＧ３７５８によってコード化される一価（ゲロニン−Ｆａｂ´）および二価（ゲロニン２−Ｆ（ａｂ´）₂形の両方が精製された。（ｉｉ）ｈｅ３Ｆａｂを有する免疫融合フェニルセファロースカラムを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で溶出した以外は上記と同様にしてｈｅ３Ｆａｂを有する免疫融合を精製した。（ｉｉｉ）ＳＣＡを有する免疫融合リン酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ７．０で平衡化したＣＭ Spheradexカラム（５×３ｃｍ）に無細胞うわずみ液を通した。単鎖抗体はカラムに結合し、これを１０ｍＭのリン酸ナトリウム、４５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄する。次に、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で融合タンパク質を溶出させる。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６で溶出液を２倍に希釈し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０において平衡化したブチルセファロース高速フロー（Ph armaia）カラム（２．５×４．１ｃｍ）に仕込んだ。次に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０でこのカラムを洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０で溶出させた。ＹＭ１０膜を取り付けたAmicon撹拌セル中でブチルセファロース溶出液を容量２〜４ｍｌまで濃縮した。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＳ−２００（ Pharmacia）カラム（３．２×３８ｃｍ）に濃縮後の試料を仕込んだ。このカラムを同じ緩衝液中でランし、画分を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっていくらかの画分を分析し、最終生成物についてどの画分が一緒にプールされるか判断した。実施例２１ゲロニン免疫融合の活性何らかのＲＩＰを有する免疫融合を構築するにあたって考慮対象となるのは、融合タンパク質の成分の標的となる酵素活性が融合の結果として失われるかもしれないということである。例えば、抗体のアミノ末端へのＲＩＰの付加によって、抗体の抗原結合（相補性決定領域）に影響したり、活性部位において立体障害が発生したりする場合がある。同様に、抗体あるいは抗原部分の付加によってＲＩＰの活性が妨害される場合もある。例えば、ジスルフィド架橋によって抗体と化学的に抱合したＲＩＰは、一般に還元剤の非存在下では不活性である。本発明の免疫融合において上記の内容を評価するために、のようなタンパク質をアッセイに供してその酵素活性、結合活性、細胞障害活性を測定した。Ａ．網状赤血球溶菌液アッセイ上述した網状赤血球溶菌液アッセイ（ＲＬＡ）を使用してゲロニンを有する免疫融合の酵素活性をアッセイした。実施例４において説明したように、ＲＬＡアッセイは、ウサギ赤血球細胞溶菌液から得られた内在性グロブリンｍＲＮＡを使用して無細胞系におけるタンパク質合成の阻害を測定するものである。トリチウム化されたロイシン（³Ｈ−Ｌｅｕ）の含有量の減少を毒素濃度の関数として測定した。標準的な毒素（リシンＡ鎖の３０ｋＤ形態；ＲＴＡ３０と略す）、未変性ゲロニン、組換えゲロニン（ｒゲロニンあるいはｒgel）およびゲロニン類似物の連続対数希釈を、１μｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌの範囲について試験した。同一試料を３つ用意して試験し、氷上にて調製し、３７℃で３０分間保温した後、Inotec Trace 96 カスケードイオン化カウンターで計数した。未阻害試料と比較することでピコモル濃度の毒素（ｐＭ）が求められたが、これはタンパク質合成の５０％阻害（ＩＣ₅₀）に対応するものであった。本発明の様々な免疫毒素についての代表的なデータを以下の表１４に挙げておく。先に述べた予想とは対照的に、本発明のゲロニン免疫融合は、実施例４に示す未変性および組換えゲロニンの活性に匹敵する酵素活性を呈する。これは、還元可能（ＳＬＴ）あるいは非還元可能（ＲＭＡ）のいずのリンカーを使用して得た融合についてもあてはまった。Ｂ．免疫融合の結合活性本発明によるいくつかの免疫融合のＣＤ陽性細胞に結合するための標識抗体に競合する能力について、これらの免疫融合をアッセイした。表１５に示すような３種類の異なる方法によって免疫融合のＫｄを推定した。第１のＫｄ推定値（表１５におけるＫｄ₁）は、ここでは参考に挙げておくKnebel et al．著、Cytomet ry Suppl.，１:68（1987）に報告されている手順に基づいて、ＭＯＬＴ−４Ｘ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８２）と結合するための蛍光標識Ｈ６５ＩｇＧとの競合によって得られた。第２のＫｄ測定値（表１５におけるＫｄ₂）は、以下のようにＭＯＬＴ−４Ｍ細胞に結合させるために¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧを有する免疫融合の競合についてのスキャッチャード分析によって得られた。キメラＨ６５ IｇＧ（ｃＨ６５ＩｇＧ）のアリコート２０μｇをラクトペルオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼ固定化ビード（Enzymobeads，BioRad）１００μｌ、ＰＢＳ１００μｌ、１．０ｍＣｉＩ¹²⁵（Amersham，IMS30）、５５ｍＭｂ−Ｄ−グルコース５０μｌに２３℃で４５分間晒すことでヨウ化した。１０５ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウム２０μｌおよび１２０ｍＭのヨウ化カリウムを添加することでこの反応をクエンチングした後、１分間遠心分離してビードをペレット化した。ＰＢＳ（ｐH７．２〜７．４で、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、８．１ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、２．６８ｍＭのＫＣｌ）プラス０．１％ＢＳＡで溶出したsephadex Ｇ２５の７ｍｌのカラムを使用したゲル濾過によって¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧを精製した。¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧ回収率および特異活性をＴＣＡ沈降によって測定した。競合結合を以下のようにして実施した。ＭＯＬＴ−４Ｍ細胞１００μｌを氷冷ＤＨＢ結合緩衝液（DubellcoのEagle変法媒質（Gibco，320-1695PJ）、１．０％ＢＳＡおよび１０mＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２〜７．４）中にて２回洗浄した。同じ緩衝液中で細胞を再懸濁させ、９６個のＶ底ウェル（Costar）にて１ウェルあたり細胞３×１０⁵個で塗布し、BeckmanＪＳ４．２ロータ使用した１，０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって４℃でペレット化し、ＤＨＢ中の２Ｘ濃縮した０．１ｎＭの¹²⁵Ｉ−ｃＨ６５ＩｇＧ５０μｌを各ウェルに添加し、最終タンパク質濃度を１００ｎＭ−０．００１７ｎＭとして、ＤＨＢ中の２Ｘ濃縮したｃＨ６５ＩｇＧ５０μｌと競合させた。吸光度（Ａ₂₈₀と、融合タンパク質については１．０、Ｆａｂについては１．３、ゲロニンに抱合したＦａｂについては１．２２の吸光係数を使用して）を測定することで、アッセイ後のタンパク質の濃度を求めた。また、ウシ血清アルブミンを標準として使用したＢＣＡアッセイ（Piere Chemical）によってもタンパク質濃度を求めた。４℃で５時間、結合を自然に進行させ、１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってＤＨＢ結合緩衝液２００μｌで細胞を３回洗浄することで終了させた。すべての緩衝液および作業は４℃とした。細胞を１．０ＭのＮａＯＨ１００μｌに可溶化し、Cobra II自動γカウンター（Packard）で計数することで放射線活性を求めた。ここでは参考に挙げておくMunson著、Analyt．Biochem.，170:220 （1980）に基づいてコンピュータプログラム「Ligand」の加重非線形最小二乗曲線あてはめプログラムであるMacLigandのマッキントッシュ版によって、結合実験において得られたデータを分析した。最後に、先のパラグラフにおいて説明したように実施された別々の競合結合アッセイから得られたＥＤ₅₀値を検討することによってＫｄ（表中のＫｄ₃）を推定した。測定値をすべて以下の表１５に挙げておく。表１５に示す結果から、ＦａｂおよびＳＣＡ抗体形はＲＩＰと融合しても実質的な結合活性を保持していることが示唆される。Ｃ．比較細胞障害アッセイ本発明による融合タンパク質および免疫抱合物を比較細胞障害アッセイに使用した。２種類のアッセイを実施した。一方はＴ細胞系ＨＳＢ２を標的にしており、他方は上記実施例６によるロイシン活性化末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を標的にしている。これらのアッセイの結果を以下の表１６ａ、１６ｂおよび１６ｃに示す。表１６ａ、１６ｂおよび１６ｃに示される結果から、ゲロニン免疫融合の活性は変化し得るということが分かる。概して、ＩＣ₅₀中間すなわち平均値が２０００ｐＭ毒素未満の本発明の免疫融合は、強い活性を呈するが、ＩＣ₅₀値が５００ｐＭ毒素以下の免疫融合はかなり活性が高いと考えられる。まとめると、表１６ａ、１６ｂおよび１６ｃの結果から、特定の細胞系を殺すために最適な融合タンパク質は標的細胞によって様々であることが分かる。実施例２２ＢＲＩＰの調製ＢＲＩＰは、免疫毒素成分の魅力的な候補となり得る特徴を有する。ＢＲＩＰは、肝臓における取込量が少なくin ViVoにおける循環残留時間の長い自然に非グリコシル化したタンパク質である。さらに、ＢＲＩＰはリシンのＡ鎖よりも動物における毒性が低く免疫原性も低い。ＢＲＩＰ遺伝子のクローン化およびＥ．ｃｏｌｉ発現系における組換えＢＲＩＰの発現は、未変性ＢＲＩＰをオオムギから直接生成する必要性をなくし、抗体に対する抱合用に利用できるシステイン残基と抱合し得るＢＲＩＰの類似物の成熟を可能にする。Ａ．ＢＲＩＰの精製およびＢＲＩＰに対するポリクローナル抗体の生成真珠色のオオムギ粉から未変性ＢＲＩＰを精製した。抽出緩衝液（１０ｍＭのＮａＯＨ₄、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１６リットルを使用して４℃で２０時間かけて小麦粉４ｋｇを抽出した。沈降物を遠心分離によって除去し、充填Ｓ−Sepharose（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を添加してＢＲＩＰを吸収させた。４℃で２０時間混合した後、この樹脂を自然に硬化させ、抽出緩衝液で数回洗浄した後、２．６×４０ｃｍのカラムに充填した。充填後、流出液の吸光度がゼロに近づくまでこのカラムを抽出緩衝液（１５０ｍｌ／ｈ）で洗浄した。次に、抽出緩衝液中の０．０２５〜０．３ＭのＮａＣｌの二液グラジェントでＢＲＩＰを溶出し、画分５ｍｌを収集した。ＢＲＩＰ含有ピーク（カラム画分のウェスタン分析によって同定）をプールし、約２０ｍｌまで濃縮し、次に１０ｍＭのＮａＰＯ₄、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（１０ｍｌ／ｈｒ）で平衡化した２．６×１００ｃｍｌのSephacryl S-200HR（Pharmacia）カラム上でクロマトグラフに供した。ＢＲＩＰ含有ピークを再度プールし、濃縮し、−７０ ℃で保存した。このようにして得られた精製ＢＲＩＰタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクーマシー染色タンパク質バンドの移動度に基づく分子量約３０，０００ダルトンであった。このアミノ酸組成は、Asano et al.著、Carlsberg Res．Comm.，49 :619-626（1984）と矛盾していなかった。ウサギを精製ＢＲＩＰで免疫感作してポリクローナル抗血清を生成した。Ｂ．ＢＲＩＰ遺伝子のクローン化相λ発現ベクターλＺＡＰＩＩにおける発芽中のオオムギ種から調製したｃＤＮＡ発現ライブラリーをStratagene，La Jolla，CAから購入した。約７００，０００相溶菌を抗ＢＲＩＰポリクローン抗血清でスクリーニングし、６個の免疫活性溶菌を同定した。１つの溶菌を選択し、これに含有されるｃＤＮＡをＥｃｏＲＩでλＺＡＰＩＩから切り出し、ｐＵＣ１８にサブクローン化してベクターｐＢＳ１を生成した。ｃＤＮＡ挿入断片をSequenase（United States Biochemical， Cleavland，Ohio）で配列決定した。未変性ＢＲＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１２とした。未変性ＢＲＩＰ遺伝子をコード化するこのｃＤＮＡを確認するために、このｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）において発現させた。上述したウサギ抗ＢＲＩＰ抗血清を使用したウエスタン分析によってプラスミドで形質転換したＩＰＴＧ誘導細胞においてＢＲＩＰタンパク質を検出した。Ｃ．ＢＲＩＰ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターの構築ＢＲＩＰ遺伝子を含有するオオムギｃＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列に結合し、ａｒａＢプロモーターによる調節下で細菌分泌ベクターに導入した。ｐｅｌＢリーダー配列に結合したＢＲＩＰ遺伝子を含有する中間ベクターを生成した。プラスミドｐＢＳ１をＮｃｏＩで切断しヤエナルヌクレアーゼで処理し、ＢａｍＨＩで切断し、ＢＲＩＰのアミノ酸１〜２５６に対応する７６０塩基対のフラグメントをアガロースゲルから精製した。同時に、ｐＵＣ１８ベクタープライマー（ＮＥＢやＢＲＬによって販売されているReverse(R)プライマーと同一であるが、Cyclone Model 8400ＤＮＡ配列決定装置によって合成した）および特異的なプライマーである３’Ｘｈｏを使用したＰＣＲ増幅によってｐＢＳ１におけるＢＲＩＰ遺伝子の３’末端の下流に独特なＸｈｏＩ部位を誘導した。各プライマーの配列は以下の通りである。プライマーＢＲＩＰ３’Ｘｈｏは、ＢＲＩＰ遺伝子の最後の８塩基対、終止コドンおよびＢＲＩＰ遺伝子の下流のいくつかの塩基対に対応する部分の他、結果として得られるＰＣＲフラグメントにＸｈｏＩ部位を導入する部分を含む。ＰＣＲ反応生成物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＢＲＩＰ遺伝子の３’末端を含有する８７塩基対のフラグメントを５％アクリルアミドゲル上で精製した。これら７６０塩基対と８７塩基対の精製ＢＲＩＰフフラグメントを、ｐｅｌＢリーダー配列に隣接するベクターｐＩＮＧ１５００において配位子結合した。ｐＩＮＧ１５００は予めＳｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで切断して精製しておいたものである。ｐｅｌＢリーダーの結合部およびＢＲＩＰ遺伝子の５’末端におけるＤＮＡ配列を配列決定分析によって確認した。このベクターをｐＩＮＧ３３２１−１とした。ＢＲＩＰ遺伝子を誘導可能なａｒａＢプロモーターの調節下におくことによって最終発現ベクターをアッセンブルした。プラスミドｐＩＮＧ３３２１−１をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐｅｌＢリーダーに結合したＢＲＩＰ遺伝子をアガロースゲルから精製した。ａｒａＢプロモーターを含有する発現ベクターｐＩＮＧ３２１７をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＢＲＩＰ遺伝子に配位子結合した。この発現ベクターをｐＩＮＧ３３２２とした。発酵槽におけるプラスミドをｐＩＮＧ３３２２を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞のアラビノース誘導によって、組換えＢＲＩＰ１リットルあたり約１００ｍｇが生成された。Ｅ．ｃｏｌｉ生成ＢＲＩＰは、オオムギ種から直接精製されたＢＲＩＰと同一の特性を呈する。Ｄ．遊離システイン残基と類似のＢＲＩＰの構築ＢＲＩＰタンパク質はシステイン残基を全く含有しておらず、抗体や他のタンパク質に対するジスルフィド連鎖を形成し得る、直接利用できる残基も全く含有していない。タンパク質のＣ末端付近に遊離システイン残基を含有する、組換えＢＲＩＰの類似物を生成した。ＢＲＩＰタンパク質の３種類の残基をアミノ酸置換の標的とした。リシンＡ鎖（図２参照）の周知の三次構造とＢＲＩＰのアミノ酸配列を比較することで、分子の表面付近において３つの位置を利用できる可能性があることが示唆された。３種類のＢＲＩＰ類似物は、未変性タンパク質のセリン₂₇₇、アラニン₂₇₀、ロイシン₂₅₆の場所に置換されたシステインを含み、それぞれＢＲＩＰ_c277（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２７）、ＢＲＩＰ_c270（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８）およびＢＲＩＰ_c256（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２９）として指定された。（１）ＢＲＩＰ遺伝子の’３末端をアミノ酸の変化を確認するＤＮＡ断片で置換することによってＢＲＩＰ_C277類似物を発現可能なプラスミドベクターを構築した。ｐＢＳ１から得られたＢＲＩＰ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１８にサブクローン化し、プライマーＯＢＭ２（ＢＲＩＰ遺伝子のヌクレオチド−１１〜＋８に対応）およびＯＭＢ４（ＢＲＩＰのアミノ酸２６４〜２８０およびＢＲＩＰの終止コドンに対応し、未変性ＢＲＩＰのセリン₂₇₇に対する未変性コドンに対するシステインコドンの置換を含む）を使用して、ＰＣＲによって一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）を増幅した。プライマーＯＢＭ２およびＯＢＭ４の配列を以下に示す。この中で、下線を付したヌクレオチドは置換システインをコード化する。位置２７７におけるアミノ酸に対するコドンがシステインコドンに代わっているＢＲＩＰ遺伝子を含有するフラグメントを増幅した。このフラグメントをｐＣＵ１９（ＢＲＬ）のＳｍａＩ部位にクローン化し、生成されたプラスミドをｐＭＢ２２とした。ｐＭＢ２２をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカー（Clonetech，Palo Alto，CA）をベクターに配位子結合した。ＸｈｏＩを使用した続く消化および再配位子結合によってベクターｐＩＮＧＭＢ２Ｘを生成した。改変アミノ酸でＢＲＩＰの３’末端をコード化するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片ｐＭＢ２Ｘから切り出し、このフラグメントを５％アクリルアミドゲル上で精製した。このフラグメントを、ｐｅｌＢリーダー配列およびＢＲＩＰの最初の２５６個のアミノ酸をコード化する配列とを含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと一緒に、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＩＮＧ３３２２への三片の配位子結合において置換した。このようにして得られた、ＢＲＩＰ_c277類似物を含有するベクターをｐＩＮＧ３８０３と指定した（ＡＴＣＣ寄託番号６８７２２）。（２）アミノ酸置換を導入するためのＰＣＲを使用して、位置２５６に遊離システインを有するＢＲＩＰ類似物を構築した。発現プラスミドｐＩＮＧ３３２２の一部をプライマーＢＲＩＰ−２５６およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。各プライマーの配列は以下の通りである。プライマーＢＲＩＰ−２５６のヌクレオチド４−２１はＢＲＩＰのアミノ酸２５６〜２６２をコード化し、一方、下線を付したヌクレオチドは、未変性ＢＲＩＰタンパク質の対応する位置においてロイシンに置換されるシステインを特異化する。プライマーＨＩＮＤＩＩＩ−２はプラスミドの一部に対応する。ＢＲＩＰ類似物のカルボキシル末端部分をコード化するＰＣＲ生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで切断し、得られたフラグメントを５％アクリルアミドゲル上で精製した。同時に、プラスミドｐＩＮＧ３３２２をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐｅｌＢリーダー配列およびＢＲＩＰの最初の２５６個のアミノ酸をコード化する配列を含有するフラグメントを精製した。これら２種類のフラグメントをｐＩＮＧ３３２２にアッセンブルしなおし、類似のＢＲＩＰ_C256をコード化する遺伝子を生成した。このプラスミドをｐＩＮＧ３８０１とした。（３）位置２７０にシステインを有するＢＲＩＰ類似物もＰＣＲを使用して生成した。発現プラスミドｐＩＮＧ３３２２の一部をプライマーＢＲＩＰ−２７０およびＨＩＮＤＩＩＩ−２プライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）で増幅した。プライマーＢＲＩＰ−２７０の配列を以下に示す。プライマーＢＲＩＰ−２７０は、残基２７０以外はＢＲＩＰのアミノ酸２６８〜２７６に対応する。位置２７０に対応するプライマーのコドンは、未変性ＢＲＩＰの対応する位置に存在するアラニンの代わりにシステインを特異化する。このＰＣＲ生成物をＴ４ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで切断し、類似物のカルボキシル末端部分をコード化する５１塩基対のフラグメントを５％アクリルアミドゲル上で精製した。このフラグメント（ＢＲＩＰ_c270のアミノ酸２６８〜２７６に対応）を、プラスミドｐＩＮＧ３３２２から得られたＳｓｔＩＩ−ＭｓｃＩ（ＢＲＩＰアミノ酸２１７〜２６７に対応）から得られた中間の１５１塩基対のＢＲＩＰ制限フラグメントと、ｐＩＮＧ３３２２から得られた、ＢＲＩＰ遺伝子の残りを含有するＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩから得られた制限フラグメントと共に三片配位子においてクローン化した。生成されたプラスミドはＢＲＩＰＣ２７０をコード化する遺伝子を含有し、これをｐＩＮＧ３８０２とした。Ｅ．組換えＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ類似物の精製濃縮発酵肉汁から調製したこと以外は基本的に未変性ＢＲＩＰについて説明したものと同じようにして、組換えＢＲＩＰ（ｒＢＲＩＰ）および遊離システイン残基を有するＢＲＩＰ類似物を精製した。ｒＢＲＩＰについて、１０リットルの発酵バッチからの濃縮肉汁を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に交換し、Sephacryl S-200カラムに仕込み、２０〜５００ｍＭのＮａＣｌ二液グラジェントで溶出した。プールしたｒＢＲＩＰをBlue Toyopearl(R)カラム（TosoHaas）上でさらに精製し、２０ｍＭのＮａＣｌに仕込み、２０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配において１０ｍＭのＴｒｉｓ中でｐＨ７．５にて溶出した。ＢＲＩＰ類似物について、濃縮発酵肉汁を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５中でＣＭ５２カラム（Whatma n）に仕込み、０〜０．３ＭのＮａＣｌ二液グラジェントで溶出した。さらなる精製は、Blue Toyopearl(R)カラム上にてクロマトグラフィによってなされた。Ｆ．網状赤血球溶菌液アッセイｒＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ類似物の、in vitroにおいてタンパク質合成を阻害する能力を、実施例１において説明したような網状赤血球溶菌液アッセイによって試験した。標準的な毒素（ＲＴＡ３０）、未変性ＢＲＩＰ、ｒＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ類似物の連続対数希釈を１μｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲について試験した。非阻害試料と比較することで、タンパク質合成の５０％阻害（ＩＣ50）に対応する毒素のピコモル濃度（ｐＭ）を求めた。アッセイの結果を以下の表１７に示す。ＲＬＡ結果から、ＢＲＩＰ類似物は、組換えおよび未変性のＢＲＩＰ毒素に匹敵するリボソーム不活性化活性を呈することが分かる。類似物はいずれも未変性ＢＲＩＰのタンパク質合成を阻害する本来の能力を保持しており、これらの位置でのアミノ酸置換はタンパク質の折り畳みおよび活性には影響しないことが示唆される。実施例２３ＢＲＩＰ免疫結合体の作成原ＢＲＩＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）と４Ａ２［モリシマ等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２９巻、第１０９１頁（１９８２）］およびＨ６５抗体［ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９２８６から入手］との、それぞれＴ−細胞決定子ＣＤ７およびＣＤ５を認識する免疫結合体を作成した。リシンＡ−鎖（ＲＴＡ）と４Ａ２およびＨ６５抗体との免疫結合体を比較として作成した。Ｈ６５抗体およびリシンＡ−鎖、並びにＲＴＡ免疫結合体をも、米国特許出願第０７／３０６，４３３号（上記）および国際特許公開ＷＯ８９／０６９６８号に記載された方法により作成すると共に精製した。原ＢＲＩＰの免疫結合体を作成するため、抗体（４Ａ２もしくはＨ６５）と原ＢＲＩＰとの両者を立体障害リンカー５−メチル−２−イミノチオラン（Ｍ２ＩＴ）によりリジン残基にて化学的に改変してゴッフ等、バイオコンジュゲート・ケミストリー、第１巻、第３８１〜３８６頁（１９９０）に記載されたように反応性スルフヒドリル基を導入した。先ず最初にＢＲＩＰ（３ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＭのＭ２ＩＴおよび１ｍＭのＤＴＮＢと共に２５ｍＭのトリエタノールアミンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で２５℃にて３時間にわたり培養した。次いで得られたＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢをセファデックスＧＦ−０５ＬＳカラムで脱塩し、導入されたチオール基の個数を０．１ｍＭのＤＴＴの添加により定量した。平均して、各ＢＲＩＰ分子は０．７ＳＨ／モルを含有した。トリエタノールアミン緩衝液における４Ａ２もしくはＨ６５抗体（４ｍｇ／ｍＬ）を同様にＭ２ＩＴ（０．３ｍＭ）およびＤＴＮＢ（１ｍＭ）と共に２５℃にて３時間培養した。次いで抗体−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢを脱塩し、ＴＮＢ：抗体の比を決定した。結合体を作成するため、ＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ −Ｓ−ＴＮＢを最初に２５℃における１時間の０．５ｍＭＤＴＴでの処理によりＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−ＳＨまで還元し、セファデックス（登録商標）ＧＦ −０５ＬＳのゲル濾過により脱塩して還元剤を除去し、次いで抗体−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢと混合した。２５℃にて３時間培養すると共にさらに４℃にて１８時間の後、結合体をＡｃＡ４４（ＩＢＦ）およびブルー・トヨパール（登録商標）での順次のクロマトグラフィーにより精製した。最終生成物の試料を５％の非還元性ＳＤＳＰＡＧＥで処理し、クーマシー染色し、次いでシマズ社レーザー濃度計で走査して抗体１個当りの毒素の個数を定量した。遊離システインを含有するＢＲＩＰ同族体をも同様に４Ａ２およびＨ６５抗体に結合させた。これら同族体を５０ｍＭＤＴＴにより２５℃にて２時間または４℃にて１８時間にわたり処理してシステインの反応性スルフヒドリル基を露出させ、次いで脱塩した。遊離スルフヒドリルの存在をＤＴＮＢとの反応により証明した［エルマン等、アーカイブ・バイオケミカル・バイオフィジークス、第８２巻、第７０〜７７頁（１９５９）］。Ｍ２ＩＴにより上記のように誘導された４Ａ２もしくはＨ６５抗体を１：５の比における還元ＢＲＩＰ同族体と共に室温にて３時間培養し、次いで４℃にて１晩置いた。免疫結合体Ｈ６５−ＢＲＩＰ_C256、４Ａ２−ＢＲＩＰ_C256、Ｈ６５−ＢＲＩＰ_c277を２５ｍＭのトリエタノールアミンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）にて作成する一方、免疫結合体Ｈ６５−ＢＲＩＰ_c270、４Ａ２−ＢＲＩＰ_c270および４Ａ２−ＢＲＩＰ_C277とを０．１Ｍ燐酸ナトリウムおよび１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）にて作成した。結合の後、１０μＭのメルカプトエチルアミンを２５℃で１５分間かけて添加し、抗体における未反応Ｍ２ＩＴリンカーをクエンチした。クエンチ（反応停止）された反応溶液を迅速にゲル濾過カラム（ＡｃＡ４４）に充填して未結合リボソーム−失活性蛋白を除去した。ノウレス等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１６０巻、第４４０頁（１９８７）と同様な方法を用い、ブルー・トヨパール（登録商標）樹脂における軟質ゲル親和性クロマトグラフィーにより精製を完結した。最終生成物の試料を５％非還元ＳＤＳＰＡＧＥで処理し、クーマシー染色し、次いでシマズ社レーザー濃度計で走査して抗体１個当りの毒素の個数を定量した。結合効率はＢＲＩＰ_C277（７８％）につき他の２種の同族体、すなわちＢＲＩＰ_C270 およびＢＲＩＰ_C256（これらはそれぞれ約１０％であった）のいずれよりも実質的に大であった。さらにＢＲＩＰ_C277生成物はポリ結合体であり、すなわちモノ結合体であるＢＲＩＰ_c270およびＢＲＩＰ_c256生成物とは異なり単一の抗体に結合した数個のＢＲＩＰ分子で構成された。実施例２４ＢＲＩＰ免疫結合体の性質Ａ．全細胞死滅分析原ＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ同族体の免疫結合体を、実施例１に記載した全細胞死滅分析によりＨＳＢ２細胞における蛋白合成の抑制能力につき試験した。標準的免疫結合体Ｈ６５−ＲＴＡ（ＲＴＡに結合したＳＰＤＰで誘導されたＨ６５）および４ＭＲＴＡ（ＲＴＡに結合したＭ２ＩＴで誘導された４Ａ２抗体）、並びにＢＲＩＰ免疫結合体の各試料をロイシンなしにＲＰＭＩで２０００〜０．６３２ｎｇ／ｍＬの範囲の半対数濃度にて希釈した。全希釈物を３反復にて、１×１０⁵ＨＳＢ２細胞を含有するミクロタイタープレートに添加した。ＨＳＢ２プレートを３７℃にて２０時間培養し、次いでＨ³−Ｌｅｕで４時間処理した後、回収した。各試料をイノテク・トレース９６型カスケードイオン化カウンタで計数した。未処理試料と比較することにより、蛋白合成の５０％抑制（ＩＣ₅₀）をもたらした免疫結合体のピコモル毒素濃度（ｐＭＴ）を計算した。分析結果を下表１８に示す。ＢＲＩＰ同族体の結合体はリシン結合体比較よりも効力が低かった（データ示さず）。免疫毒素含有の抗体４Ａ２およびＢＲＩＰ_C270もしくはＢＲＩＰ_C277同族体は、免疫毒素含有の原ＢＲＩＰと対比して標的細胞に対し匹敵する或いは増大した比細胞毒性を示した。４Ａ２−ＢＲＩＰ_c256は４Ａ２−ＢＲＩＰよりも活性が低かったのに対し、４Ａ２−ＢＲＩＰ_c270および４Ａ２−ＢＲＩＰ_c277は活性が３〜４倍高い。同様に、ＢＲＩＰ_C277に対するＨ６５の免疫結合体は原ＢＲＩＰに対するＨ６５の免疫結合体よりも標的細胞に対し高い毒性を示す。したがって、適する位置に利用可能なシステイン残基を有するＢＲＩＰ誘導体に対する抗体の結合は、原ＢＲＩＰとの結合体と比較して標的細胞に対し向上した比毒性を有する免疫毒素をもたらす。Ｂ．ジスルフィド結合の安定性分析原ＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ同族体で作成した免疫結合体を、実施例１に記載したジスルフィド結合の安定性分析により検査した。要するに、結合体を増加濃度のグルタチオンと共に３７℃にて１時間培養し、イオドアセタミドとの反応を終了した後に、遊離ＲＩＰ量をトソハースＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷカラムでのサイズ−エクスクルージョンＨＰＬＣにより定量した。高濃度の２−メルカプトエタノールにより放出されたＲＩＰ量（１００％放出を決定するため）との比較により、ＲＩＰの５０％を放出するのに要するグルタチオンの濃度（ＲＣ₅₀）を計算した。下表１９に示すように、ＢＲＩＰ_C270もしくはＢＲＩＰ_C277で作成された結合体はＲＴＡ結合体または原ＢＲＩＰで作成された結合体のいずれれよりも顕著に安定であった。これら予想外の結果は、本発明によるタイプＩのＲＩＰ同族体で作成された結合体がインビボにて向上した安定性と効能とを有することを示唆する。実施例２５モモルジンおよびその同族体の作成モモルジカ属の植物は、タイプＩのＲＩＰであるモモルジンもしくはモモルカリンとして知られた多数の関連蛋白質を産生する。モモルジンＩＩをコードする遺伝子をモモルジカ・バルサミナ（Momordica balsamina）の種子からクローン化させた。Ａ．Ｍ．バルサミナＲＮＡの作成ＲＮＡは全て４ｇのＭ．バルサミナ種子からアウスウベル等（上記）に記載したように作成した。ポリＡ含有ＲＮＡを１ｍｇの全ＲＮＡからオリゴー（ｄＴ） −セルロースでのクロマトグラフィーにより作成した。４０ｍｇのオリゴー（ｄＴ）−セルロース７型（ファルマシア社）を０．１ＮＮａＯＨに添加し、使捨てカラム（ビオラド社）に注ぎ入れた。このカラムを溶出液がｐＨ５．５になるまで水洗し、次いで１×充填用緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ７．０）により溶出液がｐＨ７．０になるまで洗浄した。１ｍｇの全ＲＮＡを３００μＬの水に懸濁させ、６５℃まで５分間加熱し、次いで３００μＬの２×充填用緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳ）を添加した。ＲＮＡをカラムに充填し、流過液を６５℃まで再加熱し、室温まで冷却し、次いでカラムに再充填した。カラムに結合したｍＲＮＡを０．５ｍＬの１×充填用緩衝液で５回および０．５ｍＬの０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。ポリＡ含有ＲＮＡをカラムから０．５ｍＬの２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳにより２回溶出させた。Ｂ．保存物作成ポリＡ含有Ｍ．バルサミナＲＮＡからのｃＤＮＡ保存物をスーパースクリプト・プラスミド・システム（ＢＲＬ社、ガイサースブルク、メリーランド州）により細菌発現プラスミドで作成した。ｃＤＮＡを２μｇのポリＡ含有ＲＮＡから合成し、寸法分画し、ＮｏｔＩで切断し、次いでベクターの製造業者（ＢＲＬ社）により推奨されるように発現ベクターｐＳＰＯＲＴに結合させた。Ｃ．モモルジンＩＩ遺伝子のクローン化モモルジンＩＩの最初の２７アミノ酸をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによりＭ．バルサミナｃＤＮＡから増大させた。最初のストランドｃＤＮＡを１００ｎｇのポリＡ含有ＲＮＡからＲＮＡ−ＰＣＲキット（パーキン・エルマー・セタス社）で作成した。２種の部分縮退プライマーを、リー等、エキスペリエンシア、第３６巻、第５２４〜５２７頁（１９８０）に記載されたようにモモルジンＩＩの最初の２７アミノ酸のアミノ酸配列に基づき合成した。モモルジンＩＩのアミノ酸１〜２７のアミノ酸配列はモモルジンＩのアミン酸１〜１７と５２％相同性であるため［フー等、ＢＢＡ、第１０８８巻、第３１１〜３１４頁（１９９１）］、縮退プライマーにおける幾つかのコドン配列はモモルジンＩ遺伝子における対応のアミノ酸およびコドンの優先性に対する相同性に基づいた。プライマーモモ−３およびモモ−４の配列をＩＵＰＡＣヌクレオチド記号により下記に示す。得られた８１ｂｐのＰＣＲ生成物を５％アクリルアミドゲルで精製し、ｐＵＣ１８のＳｍａｌ部位にクローン化させた。３種のクローン候補を配列決定し、１種のクローンｐＭＯ１１０を同定し、これはモモルジンＩＩのＮ−末端２７アミノ酸をコードした。ｐＭＯ１１０モモルジンＩＩＤＮＡ断片の配列に基づきモモルジンＩＩｃＤＮＡ保存物をスクリーニングすべくハイブリッド化プローブを設計した。プライマーモモ−５の配列を下記に示す。プライマーモモ−５は成熟モモルジンＩＩのアミノ酸９〜１８に対応する。プライマーにおける下線を施したヌクレオチドは、モモルジンＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列に正確に整合すると予想された。この配列は高度にＡ／Ｔ−リッチであると共にモモルジンＩＩ遺伝子に弱くハイブリダイズするので、このプライマーにはさらに隣接ヌクレオチドも含まれた。塩基３および３０（線外）はそれぞれモモルジンＩＩのアミノ酸９（アラニン）および１８（イソロイシン）の「ウォブル」位置（すなわちコドンにおける第三ヌクレオチド）に存在し、原遺伝子におけるヌクレオチド塩基と同一であってはならない。ｐＳＰＯＲＴにおける９０，０００種類のｃＤＮＡ保存物をｐ³²−キナーゼ処理のモモ−５でスクリーニングし、８種の有望な候補クローンを同定した。１種のクローンｐＩＮＧ３６１９を配列決定し、これは部分的にモモルジンＩＩの予想Ｎ−末端２７残基に対応する転写解読枠を有する。完成モモルジン遺伝子は２８６個のアミノ酸を有し、その最初の２３個は予想されるリーダー信号である（成熟モモルジンＩＩは２６３残基である）。モモルジンＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１３にて示す。Ｄ．モモルジンＩＩ遺伝子を含有する発現ベクターの作成モモルジンＩＩ遺伝子のための細菌発現ベクターを作成した。２種のＰＣＲプライマーを合成し、その一方（モモ−９）は成熟モモルジンＩＩアミノ酸配列の＋１残基から開始し、他方はモモルジンＩＩのＣ−末端（モモ−１０）で開始してＸｈｏＩ制限部位を導入する：ｐＩＮＧ３６１９をモモ−９およびモモ−１０で拡大させ、生成物をＴ４−ポリメラーゼで処理し、ＸｈｏＩで切断し、次いでアガロースゲルで精製した。この遺伝子断片を、ＳｓｔＩ切断とＴ４−ポリメラーゼ処理とＥｃｏＲＩ切断とにより発生させたｐＩＣ１００からＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断されたａｒａＢ発現ベクター中へ１３１ｂｐのｐｅＩＢリーダー断片と一緒に結合させた。この３片結合の生成物を配列決定して、ｐｅＩＢ接合およびモモルジンＩＩコード化配列が正確であることを証明した。モモルジンＩＩ発現プラスミドｐＩＮＧ３６２１を含有する細胞のアラビノース誘導はイー・コリにてモモルジンＩＩの産生をもたらす。Ｅ．モモルジンＩＩの同族体モモルジンＩＩは、抗体に結合させるべく利用しうる天然システインを持たない。抗体に結合する遊離システインを有するモモルジンの同族体を作成することができる。システイン残基を置換するのに適すると思われる位置は、リシンＡ−鎖システイン₂₅₉に近い位置としておよび溶剤に達しうるモモルジンＩＩの最後の２６アミノ酸を含む位置として第３図から同定することができる。たとえばモモルジンＩＩの位置２４２におけるアルギニンは位置２５９におけるリシンＡ−鎖システインと整列し、置換の好適な標的である。モモルジンＩＩのための他の好適な置換位置は、位置２４１におけるセリンおよび位置２４３におけるアラニンを包含する。以上、本発明を好適実施例につき説明したが、本発明の範囲内において多くの改変および改良をなしうることが当業者には了解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 8828−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 15/09 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＣ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＡＤＵ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣＣ０７Ｈ 21/04 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スタドニッカ、ゲイリーエム. アメリカ合衆国 90404 カリフォルニア州サンタモニカバークレーストリート 1504

Claims

【特許請求の範囲】１．ｈｅ３抗体における抗原結合性部分のアミノもしくはカルボキシ末端に融合したゲロニンからなる融合蛋白質。２．前記融合蛋白質が前記ゲロニンおよび前記抗体部分を結合する切断可能なペプチドセグメントを欠如する請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。３．Ｖ_LＶ_E−ゲルである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。４．Ｖ_EＶ_L−ゲルである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。５．ゲル−Ｖ_EＶ_Lである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。６．ゲル−Ｖ_LＶ_Eである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。７．ゲル：：κ，Ｆｄである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。８．ゲル：：Ｆｄ，κである請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。９．抗体における抗原結合性部分のアミノもしくはカルボキシ末端に融合したゲロニンからなり、さらに前記ゲロニンと前記抗体部分との間にペプチドセグメントＣＣＬをも含む融合蛋白質。１０．抗体における抗原結合性部分のアミノもしくはカルボキシ末端に融合したゲロニンからなり、さらに前記ゲロニンと前記抗体部分との間にペプチドセグメントＣＣＦをも含む融合蛋白質。１１．融合蛋白質（ゲル：：ＲＭＡ：：κ，Ｆｄ′）₂。１２．融合蛋白質（ゲル：：ＲＭＡ：：Ｆｄ′，κ）₂。１３．融合蛋白質ゲロニン：：ＲＭＡ：：κ，Ｆｄ。１４．融合蛋白質ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ，κ。１５．融合蛋白質ゲロニン：：ＳＬＴ：：κ，Ｆｄ。１６．融合蛋白質ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄ，κ。１７．融合蛋白質Ｖ_EＶ_L：：ＳＬＴ：：ゲロニン。１８．融合蛋白質Ｖ_LＶ_E：：ＳＬＴ：：ゲロニン。１９．融合蛋白質Ｖ_EＶ_L：：ＲＭＡ：：ゲロニン。２０．融合蛋白質Ｖ_LＶ_E：：ＲＭＡ：：ゲロニン。２１．請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。２２．請求の範囲第２１項に記載の融合蛋白質で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。