CN108601848A - 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法 - Google Patents
用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108601848A CN108601848A CN201780009779.5A CN201780009779A CN108601848A CN 108601848 A CN108601848 A CN 108601848A CN 201780009779 A CN201780009779 A CN 201780009779A CN 108601848 A CN108601848 A CN 108601848A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- cytotoxic agent
- agent
- ala
- linker compounds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 C[C@@](C(*c1cc(COc(c(OC)c2)cc(*C[C@]3N4c5ccccc5C3)c2C4=*)cc(COc(cc(c2c3)NC(*)[C@](Cc4ccccc44)N4C2=O)c3OC)c1)=O)NC([C@](C)NC(CCCCC(O)ON(C(CC1)=O)C1=O)=O)=* Chemical compound C[C@@](C(*c1cc(COc(c(OC)c2)cc(*C[C@]3N4c5ccccc5C3)c2C4=*)cc(COc(cc(c2c3)NC(*)[C@](Cc4ccccc44)N4C2=O)c3OC)c1)=O)NC([C@](C)NC(CCCCC(O)ON(C(CC1)=O)C1=O)=O)=* 0.000 description 8
- JAPMJSVZDUYFKL-UHFFFAOYSA-N C1C2C1CCC2 Chemical compound C1C2C1CCC2 JAPMJSVZDUYFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFYLKBQSHZQIHI-UHFFFAOYSA-N CNc(cc(c(OC)c1)OCc2cc(I)cc(CO)c2)c1C([n]1c2ccccc2cc1)=O Chemical compound CNc(cc(c(OC)c1)OCc2cc(I)cc(CO)c2)c1C([n]1c2ccccc2cc1)=O SFYLKBQSHZQIHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/13—Labelling of peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
- A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
- A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
Abstract
本发明提供一种用于制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的新方法。所述方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与所述细胞结合剂形成共价键的反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂‑接头化合物在4至9之间的pH下在具有高离子强度的缓冲溶液存在下反应,其中所述细胞结合剂包含与具有胺反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂‑接头化合物形成共价键的赖氨酸ε–NH2基团。本发明还包括根据本文中描述的方法制备的细胞结合剂‑细胞毒性剂缀合物。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年2月5日提交的美国临时申请号62/292,018的申请日的权益,其每一者的全部内容(包括所有附图、式、说明书和权利要求)均以引用方式并入本文。
发明技术
已显示吲哚啉并苯并二氮杂二聚体化合物的抗体-药物缀合物(ADC)在体内具有高效力和/或高治疗指数(最大耐受剂量与最小有效剂量之比)。吲哚啉并苯并二氮杂二聚体化合物通常是疏水性的,并且可能在缀合反应过程中影响抗体的稳定性。在某些情况下,缀合反应具有非常低的反应收率,这对于大规模生产ADC是不理想的。
鉴于上述情况,对于开发用于制备适于大规模生产的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法存在尚未满足的需求。
发明概述
本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的新型且有效的方法。
在一个实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在具有高离子强度的缓冲溶液存在下反应。
在另一个实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在具有7.3至8.4的pH的缓冲溶液中反应。
在又一个实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在高浓度缓冲液存在下反应。
已令人惊讶地发现,当吲哚啉并苯并二氮杂二聚体化合物和抗体的缀合反应在具有高离子强度的缓冲溶液中在7.3与8.4之间的pH下进行时,该缀合反应的效率与缀合反应通过具有低离子强度的缓冲溶液在较高pH下进行时相比明显更高。本发明的方法提供了具有高纯度和/或稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。
本发明还涉及使用本文所述的方法制备的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
发明详述
本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的新方法。
在第一实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在具有高离子强度的缓冲溶液存在下反应。
如本文所用,溶液的“离子强度”是溶液中离子的浓度。它是溶液中存在的所有离子的浓度的函数。离子强度(I)可以使用以下方程来计算:
Ci是溶液中存在的离子i的摩尔浓度,zi是它的电荷数量,并且对溶液中的所有离子求和。当溶液的阳离子和阴离子分别携带+1和-1电荷时,离子强度等于溶液的浓度。
在一个实施方案中,缓冲溶液的离子强度在20mM与500mM之间,优选在20mM与200mM之间、25mM与150mM之间、50mM与150mM之间、50mM与100mM之间或100mM与200mM之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的离子强度在60mM与90mM之间,或70mM与80mM之间。在又一个实施方案中,缓冲溶液的离子强度为75mM。在另一个实施方案中,缓冲溶液的离子强度为100mM至160mM或介于120mM与140mM之间。在又一个实施方案中,缓冲溶液的离子强度为130mM。
在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.1与8.7之间,优选在7.3与8.7之间、7.1与8.5之间、7.3与8.4之间、7.6与8.4之间、7.7与8.3之间、7.8与8.2之间。在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.9与8.1之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.0。在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.5与8.9之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.6与8.8之间。在又一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.7。
在第二实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在具有7.3至9.0的pH的缓冲溶液中反应。
在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.3与8.4之间、7.6与8.4之间、7.7与8.3之间或7.8与8.2之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.9与8.1之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.0。在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.5与8.9之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.6与8.8之间。在又一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.7。
在第1具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有20mM与200mM之间的离子强度和7.1与8.5之间的pH。
在第2具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与150mM之间的离子强度和7.6与8.4之间的pH。
在第3具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与100mM之间的离子强度和7.7与8.3之间的pH。
在第4具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有60mM与90mM之间的离子强度和7.8与8.2之间的pH。
在第5具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有70mM与80mM之间的离子强度和7.9与8.1之间的pH。
在第6具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有75mM的离子强度和8.0的pH。
在第7具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与200mM之间的离子强度和7.8与8.9之间的pH。
在第8具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有110mM与150mM之间的离子强度和8.5与8.9之间的pH。
在第9具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有120mM与140mM之间的离子强度和8.6与8.8之间的pH。
在第10具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有130mM的离子强度和8.7的pH。
本领域已知的任何合适的缓冲溶液均可用于本发明的方法中。合适的缓冲溶液包括例如但不限于柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。
在第11具体实施方案中,对于在第一或第二实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10具体实施方案中描述的方法,缓冲溶液选自MES((2-(N-吗啉代)乙磺酸))缓冲液、双-三甲烷(2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)缓冲液、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)缓冲液、ACES(N-2-氨基乙磺酸)缓冲液、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))、MOPSO(β-羟基-4-吗啉丙磺酸)缓冲液、双-三丙烷(1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷)缓冲液、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、DIPSO、(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸或N,N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)缓冲液、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris或2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)缓冲液、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水合物)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、三甲基甘氨酸(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)缓冲液、gly-gly、二甘氨酸(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)缓冲液、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))缓冲液、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸)缓冲液、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)缓冲液、TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)缓冲液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)缓冲液以及它们的组合。在一个实施方案中,缓冲液选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水合物)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、TES(N-[三(羟甲基)]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液以及它们的组合。
在第12具体实施方案中,对于第一或第二实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10具体实施方案中所述的方法,缓冲溶液为EPPS缓冲液。在一个优选的实施方案中,缓冲溶液是75mM EPPS缓冲液。
在第13具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有7.8与8.9之间的pH的50mM至200mM EPPS缓冲液。
在第14具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有7.8与8.2之间的pH的60mM至90mM EPPS缓冲液。
在第15具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有7.9与8.1之间的pH的70mM至80mM EPPS缓冲液。
在16具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有8.0的pH的75mM EPPS缓冲液。
在第17具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有8.5与8.9之间的pH的110mM至150mM EPPS缓冲液。
在第18具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有8.6与8.8之间的pH的120mM至140mM EPPS缓冲液。
在19具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液是具有8.7的pH的130mM EPPS缓冲液。
在第三实施方案中,本发明的方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与该细胞结合剂形成共价键的反应性基团(例如,胺反应性基团)的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在高浓度缓冲液存在下反应。
在一个实施方案中,缓冲液的浓度在20mM与750mM之间。在另一个实施方案中,缓冲液的浓度在20mM与500mM之间、20mM与200mM之间、25mM与150mM之间、50mM与150mM之间、50mM与100mM之间、100mM与200mM之间或100mM与150mM之间。
在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.3与8.9之间、7.3与8.4之间、7.6与8.4之间、7.7与8.3之间或7.8与8.2之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在7.9与8.1之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.0。在一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.5与8.9之间。在另一个实施方案中,缓冲溶液的pH在8.6与8.8之间。在又一个实施方案中,缓冲溶液的pH为8.7。
在第20具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有20mM与200mM之间的浓度和7.1与8.5之间的pH。
在第21具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与150mM之间的浓度和7.6与8.4之间的pH。
在第22具体实施方案中,对于第一或第二实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与100mM之间的浓度和7.7与8.3之间的pH。
在第23具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有60mM与90mM之间的浓度和7.8与8.2之间的pH。
在第24具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有70mM与80mM之间的浓度和7.9与8.1之间的pH。
在第25具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有75mM的浓度和8.0的pH。
在第26具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有50mM与200mM之间的浓度和7.8与8.9之间的pH。
在第27具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有110mM与150mM之间的浓度和8.5与8.9之间的pH。
在第28具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有120mM与140mM之间的浓度和8.6与8.8之间的pH。
在第29具体实施方案中,对于第三实施方案中描述的方法,缓冲溶液具有130mM的浓度和8.7的pH。
在一个实施方案中,用于本发明方法中的缓冲溶液可以进一步包含惰性盐以维持缓冲液的离子强度。在一个实施方案中,缓冲溶液进一步包含氯化钠。
在一个实施方案中,对于上述本发明的方法,细胞结合剂与细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物之间的反应在少量有机溶剂存在下进行。更具体地说,有机溶剂是二甲基乙酰胺(DMA)。有机溶剂(例如,DMA)可以以缓冲溶液和有机溶剂的总体积的1体积%-20体积%、1-15体积%、2-15体积%、5-15体积%、8-12体积%或10-20体积%的量存在。在一个实施方案中,有机溶剂(例如,DMA)以缓冲溶液和有机溶剂的总体积的10体积%的量存在。在另一个实施方案中,有机溶剂(例如,DMA)以缓冲溶液和有机溶剂的总体积的15体积%的量存在。
在一个实施方案中,对于上述本发明的方法,使反应进行2分钟至1周、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至8小时、5小时至15小时、6小时至14小时、4小时至8小时、5小时至7小时、1小时至5小时、1小时至4小时、1小时至2小时、30小时分钟至2小时、5分钟至30分钟或2小时至5小时。在一个实施方案中,使反应进行2小时至6小时或3小时至5小时。在一个实施方案中,使反应进行1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时等。在另一个实施方案中,使反应进行4小时。
细胞结合剂与细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物之间的反应可以在任何合适的温度下进行。在一个实施方案中,该反应可以在10℃至50℃、10℃至40℃或10℃至30℃的温度下进行。在另一个实施方案中,该反应可以在15℃至30℃、20℃至30℃、15℃至25℃、16℃至24℃、17℃至23℃、18℃至22℃或19℃至21℃的温度下进行。在又一个实施方案中,该反应可以在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃进行。
由细胞结合剂与细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物之间的缀合反应形成的缀合物可能具有在储存时或在缀合反应完成与纯化步骤之间的时间中形成高分子量物质的倾向。为了减轻高分子量物质的形成,可以在缀合反应后添加猝灭溶液以稳定缀合物。
在第30具体实施方案中,上述第一、第二或第三实施方案中(例如,在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29具体实施方案中)描述的方法进一步包括以下步骤:在细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂反应后,添加具有高离子强度的猝灭溶液。
也在第30具体实施方案中规定,该方法进一步包括以下步骤:在细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂反应后,添加包含高浓度缓冲液的猝灭溶液。
在一个实施方案中,猝灭溶液具有200mM与3000mM之间、200mM与2000nM之间、200mM与1000mM之间、500mM与1000mM之间、550mM与1000mM之间或600mM与1000mM之间的离子强度。在另一个实施方案中,猝灭溶液具有700mM与1000mM之间的离子强度。在另一个实施方案中,猝灭溶液具有900mM的离子强度。
在另一个实施方案中,猝灭溶液包含浓度在200mM与3000mM之间、200mM与2000mM之间、200mM与1000mM之间、500mM与1000mM之间、550mM与1000mM之间或600mM与1000mM之间的缓冲液。在另一个实施方案中,猝灭溶液具有浓度在700mM与1000mM之间的缓冲液。在另一个实施方案中,猝灭溶液具有浓度为750mM的缓冲液。
在另一个实施方案中,在细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂反应后,将猝灭溶液与反应混合物混合,并且在混合后,缓冲液的最终浓度在150mM与750mM之间、150mM与600mM之间、200mM与500nM之间、200mM与400nM之间、250mM与350mM之间。
在一些实施方案中,猝灭溶液中的缓冲液与细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂的缀合反应中使用的缓冲液相同。
因此,本文所述的猝灭溶液可以包含缓冲液、盐或其组合。可以使用任何合适的缓冲液或盐。示例性缓冲液包括但不限于MES((2-(N-吗啉代)乙磺酸))缓冲液、双-三甲烷(2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)缓冲液、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)缓冲液、ACES(N-2-氨基乙磺酸)缓冲液、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))、MOPSO(β-羟基-4-吗啉丙磺酸)缓冲液、双-三丙烷(1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷)缓冲液、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、DIPSO、(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸或N,N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)缓冲液、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris或2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)缓冲液、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水合物)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、三甲基甘氨酸(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)缓冲液、gly-gly、二甘氨酸(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)缓冲液、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))缓冲液、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸)缓冲液、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)缓冲液、TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)缓冲液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)缓冲液以及它们的组合。在一个实施方案中,缓冲液选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水合物)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、TES(N-[三(羟甲基)]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液以及它们的组合。示例性盐包括但不限于NaCl、KCl和组氨酸盐酸盐。在一个实施方案中,猝灭溶液包含EPPS。在另一个实施方案中,猝灭溶液包含EPPS和组氨酸盐酸盐。
在一个实施方案中,猝灭溶液具有5与9之间、5与7之间或5与6之间的pH。在另一个实施方案中,猝灭溶液具有5.5的pH。
在一个实施方案中,与反应混合物混合之前的猝灭溶液包含750mM EPPS和150mM组氨酸盐酸盐。
在一个实施方案中,猝灭溶液包含EPPS和组氨酸盐酸盐,并且在猝灭溶液与反应混合物混合之后,所得混合物包含200mM至400mM EPPS和40至60mM组氨酸盐酸盐。在一个实施方案中,所得混合物包含250mM至350mM EPPS和40至60mM组氨酸盐酸盐。在又一个实施方案中,所得混合物包含300mM至350mM EPPS和45mM至55mM组氨酸盐酸盐。
在一个实施方案中,使根据本发明的方法制备的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物接受纯化步骤。就此而言,可以使用以下方法将细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物从混合物的其他组分(例如,游离的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物和反应副产物)中纯化:切向流过滤法(TFF)(这是一种基于膜的切向流过滤方法)、非吸附色谱法、吸附色谱法、吸附过滤法、选择性沉淀法、或任何其他合适的纯化方法以及它们的组合。
在本发明的一个实施方案中,使用单一纯化步骤(例如,TFF)纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。优选地,使用单一纯化步骤(例如,TFF)将缀合物纯化并转变成合适的制剂。在本发明的另一个实施方案中,使用两个连续的纯化步骤纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。例如,缀合物可以首先通过选择性沉淀法、吸附过滤法、吸收色谱法或非吸收色谱法纯化,然后用TFF纯化。本领域普通技术人员将会认识到,细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化使得能够分离包含与细胞毒性剂化学偶合的细胞结合剂的稳定缀合物。
任何合适的TFF系统均可用于纯化,包括Pellicon型系统(Millipore,Billerica,Mass.)、Sartocon盒式系统(Sartorius AG,Edgewood,N.Y.)、TangenX盒(TangenXTechnology Corporation,Shrewsbury,MA)和Centrasette型系统(Pall Corp.,EastHills,N.Y.)
可以使用任何合适的吸附色谱树脂进行纯化,其中树脂可以保留细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并允许洗脱杂质或保留杂质并允许洗脱细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。优选的吸附色谱树脂包括羟基磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱法以及它们的组合。合适的羟基磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟基磷灰石(CHT I型和II型,Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)、HA Ultrogel羟基磷灰石(Pall Corp.,East Hills,N.Y.)和陶瓷氟磷灰石(CFT I型和II型,Bio-RadLaboratories,Hercules,Calif.)。合适的HCIC树脂的例子为MEP Hypercel树脂(PallCorp.,East Hills,N.Y.)。合适的HIC树脂的实例包括丁基琼脂糖、己基琼脂糖、苯基琼脂糖和辛基琼脂糖树脂(均得自GE Healthcare,Piscataway,N.J.)以及Macro-prep甲基和Macro-Prep叔丁基树脂(Biorad Laboratories,Hercules,Calif.)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖、CM-琼脂糖和Q-琼脂糖树脂(全部得自GE Healthcare,Piscataway,N.J.)和Unosphere S树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。合适的混合模式离子交换剂的实例包括Bakerbond ABx树脂(JT Baker,Phillipsburg N.J.)合适的IMAC树脂的实例包括螯合琼脂糖树脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)和Profinity IMAC树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。合适的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖树脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)和Affi-gel蓝色树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。合适的亲和树脂的实例包括蛋白A琼脂糖树脂(例如,MabSelect,GEHealthcare,Piscataway,N.J.),其中细胞结合剂是抗体,以及凝集素亲和树脂,例如扁豆凝集素琼脂糖树脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.),其中细胞结合剂带有适当的凝集素结合位点。或者,可以使用细胞结合剂特异性抗体。这种抗体可以固定在例如琼脂糖4快速流树脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)上。合适的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂(Grace Vydac,Hesperia,Calif.)。
任何合适的非吸附色谱树脂都可以用于纯化。合适的非吸附性色谱树脂的实例包括但不限于SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100,SEPHACRYLTM树脂(例如,S-200和S-300)、SUPERDEXTM树脂(例如,SUPERDEXTM 75和SUPERDEXTM 200),树脂(例如,P-6、P-10、P-30、P-60和P-100)以及本领域普通技术人员已知的其他树脂。
通过本文描述的方法制备的缀合物可以在合适的制剂缓冲液中配制。
通过本发明的方法制备的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有相当高的纯度和稳定性。在本发明的一个方面,相当高纯度的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有以下特征中的一个或多个:(a)低于25%、低于20%、低于15%(例如,低于或等于15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的抗体片段化,(b)大于90%(例如,大于或等于91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%),优选大于95%的缀合物物质是单体的,(c)缀合物制备物中的未缀合的接头水平低于约10%(例如,低于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)(相对于总接头),(d)低于10%的缀合物物质被交联(例如,低于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%),(e)游离细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物的量低于约2%(例如,低于或等于约1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或0%)(相对于总细胞毒性剂的mol/mol),(f)低于约10%、低于约5%(例如,低于或等于约4%、3%、2%、1%或0%)的高分子量物质;和/或(g)储存时游离细胞毒性剂的水平无实质性增加(例如在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后)。游离细胞毒素水平的“实质性增加”意味着在一定的储存时间(例如,约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年)后,游离细胞毒性剂水平的增加小于约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.1%、约1.2%、约1.3%、约1.4%、约1.5%、约1.6%、约1.7%、约1.8%、约1.9%、约2.0%、约2.2%、约2.5%、约2.7%、约3.0%、约3.2%、约3.5%、约3.7%或约4.0%。
如本文所用,术语“未缀合的接头”是指与双功能交联试剂共价连接的细胞结合剂,其中细胞结合剂不通过双功能交联试剂的接头共价偶合至细胞毒性剂(即,“未缀合的接头”可以由CBA-L表示,其中CBA表示细胞结合剂而L表示双功能交联剂。相比之下,细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示,其中D表示细胞毒性剂)。
如本文所用,术语“高分子量物质”或“HMW”是指分子量较高的含抗体或含缀合物的物质。高分子量物质可以是二聚体、三聚体、通过抗体或缀合物的聚集形成的其他高级低聚物或它们的组合。可以鉴定高分子量物质并通过SEC-HPLC测定其量。
在一个实施方案中,在细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物中细胞毒性剂与细胞结合剂的平均摩尔比(即,DAR)为1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、1.5至5、2至7或3至5。在另一个实施方案中,DAR为1.5至3.5、2至3、2.1至2.9、2.2至2.8、2.3至2.7或2.4至2.6。在另一个实施方案中,通过本发明的方法制备的缀合物的DAR为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.5、2.7、2.8、2.9或3.0。在一个实施方案中,DAR为2.5。在另一个实施方案中,DAR为2.7。
DAR值可以通过本领域已知的任何方法来测定。在一个实施方案中,DAR值可以分别使用抗体和细胞毒性剂的波长处的吸光度值通过UV/Vis光谱测定。或者,DAR值可以通过质谱法和/或HPLC来测定。
细胞结合剂
为了用于本发明的方法中,细胞结合剂可以是与细胞结合的任何合适的试剂,该细胞通常且优选为动物细胞(例如人类细胞)。细胞结合剂优选为肽或多肽。合适的细胞结合剂包括例如抗体(例如单克隆抗体及其片段),干扰素(例如α、β、γ),淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6),激素(例如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素),生长因子和集落刺激因子如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess,Immunology Today 5:155-158(1984)),营养物转运分子(例如转铁蛋白),维生素(例如叶酸)和任何其他特异性结合细胞表面上的目标分子的药剂或分子。
在细胞结合剂是抗体的情况下,其与作为多肽或糖表位(glycotope)的抗原结合,并且可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。示例性抗原包括:如肾素之类的分子;生长激素,包括人生长激素和牛生长激素;生长激素释放因子;甲状旁腺激素;促甲状腺激素;脂蛋白;α-1抗胰蛋白酶;胰岛素A链;胰岛素B链;胰岛素原;促卵泡激素;降钙素;促黄体激素;胰高血糖素;凝血因子如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性假性血友病因子(von Willebrands factor);抗凝血因子如蛋白C;心房利钠因子;肺表面活性剂;纤溶酶原激活物,如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA);蛙皮素;凝血酶;造血生长因子;肿瘤坏死因子α和β;脑啡肽;RANTES(受激活调节正常T细胞表达和分泌因子);人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白,如人血清白蛋白;苗勒管(Muellerian)抑制性物质;松弛素A链;松弛素B链;松弛素原;小鼠促性腺激素相关肽;微生物蛋白质,如β-内酰胺酶;DNA酶;IgE;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA),如CTLA-4;抑制素;激活素;血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子受体;蛋白质A或D;类风湿因子;神经营养因子如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3、4、5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-β;血小板衍生生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β,包括TGF-.β.1、TGF-.β.2、TGF-.β.3、TGF-.β.4或TGF-.β.5;胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II);des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I);胰岛素样生长因子结合蛋白;EpCAM;GD3;FLT3;PSMA;PSCA;MUC1;MUC16;STEAP;CEA;TENB2;EphA受体;EphB受体;叶酸受体;FOLR1;间皮素;crypto;αvβ6;整联蛋白;VEGF、VEGFR;EGFR;成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(例如,FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4);转铁蛋白受体;IRTA1;IRTA2;IRTA3;IRTA4;IRTA5;CD蛋白如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138、CD152、鸟苷酸环化酶C(GCC)或结合到一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体,其公开于美国专利申请公布号2008/0171040或美国专利申请公布号2008/0305044并且整体以引用方式并入;促红细胞生成素;骨诱导因子;免疫毒素;骨形态发生蛋白(BMP);干扰素,如干扰素α、β和γ;集落刺激因子(CSF),例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白细胞介素(IL),例如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶;T细胞受体;表面膜蛋白;衰变加速因子;病毒抗原,比如HIV包膜的一部分;转运蛋白;归巢受体;地址素;调节蛋白;整联蛋白,如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM;肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体;内皮因子;c-Met;IGF1R;前列腺抗原如PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2和STEAP1;LGR5;B7H4;以及任何上列多肽的片段。在一个实施方案中,抗原不是GCC。
另外,与髓样细胞结合的GM-CSF可以用作针对来自急性骨髓性白血病的病变细胞的细胞结合剂。与活化的T细胞结合的IL-2可以用于预防移植物排斥反应、用于治疗和预防移植物抗宿主病以及用于治疗急性T细胞白血病。与黑素细胞结合的MSH可以作为针对黑素瘤的抗体而用于治疗黑素瘤。叶酸可用于靶向在卵巢肿瘤和其他肿瘤上表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞状细胞癌,如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向成神经细胞瘤和其他肿瘤类型。
乳腺癌和睾丸癌可以分别用作为细胞结合剂的雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)成功靶向。
如本文所用的术语“抗体”是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段(如Fab、Fab'、F(ab')2)、dsFv、sFv、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、前抗体(probody)(Parham,J.Immunol.,131:2895-2902(1983);Spring等人J.Immunol.,113:470-478(1974);Nisonoff等人Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244(1960),Kim等人,Mol.Cancer Ther.,7:2486-2497(2008),Carter,Nature Revs.,6:343-357(2006),美国专利号8,399,219)或可以结合细胞表面上的抗原(例如,其含有互补决定区(CDR))的免疫球蛋白嵌合体。任何合适的抗体都可以用作细胞结合剂。本领域的普通技术人员将会认识到,选择合适的抗体将取决于待靶向的细胞群。在这方面,在特定细胞群(通常且优选病变细胞群)中选择性表达的细胞表面分子(即,抗原)的类型和数量将决定用于本发明组合物的适当抗体的选择。细胞表面表达谱对于多种细胞类型(包括肿瘤细胞类型)均是已知的,或者如果未知,则可以使用常规分子生物学和组织化学技术来确定。
抗体可以是多克隆或单克隆的,但最优选是单克隆抗体。如本文所用,“多克隆”抗体是指通常包含在免疫动物的血清中的抗体分子的异质群体。“单克隆”抗体是指针对特定抗原具有特异性的抗体分子的均质群体。单克隆抗体通常由B淋巴细胞(“B细胞”)的单个克隆产生。单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的多种技术获得,包括标准杂交瘤技术(参见例如Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511-519(1976),Harlow and Lane(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)以及C.A.Janeway等人(编辑),Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York,N.Y.(2001))。简而言之,产生单克隆抗体的杂交瘤方法通常涉及向任何合适的动物(典型且优选为小鼠)注射抗原(即,“免疫原”)。随后处死动物,从其脾中分离的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。制备杂交细胞(即,“杂交瘤”),其在体外无限增殖并持续分泌具有所需特异性的高滴度抗体。可使用本领域已知的任何适当方法来鉴定产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤细胞。此类方法包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹分析和放射免疫测定。筛选杂交瘤细胞的群体以分离各个克隆,每个克隆分泌针对抗原的单种抗体物质。因为每个杂交瘤都是与单个B细胞融合而来的克隆,所以它产生的所有抗体分子在结构上都是相同的,包括它们的抗原结合位点和同种型。单克隆抗体还可以使用包括EBV-杂交瘤技术(参见例如Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2):361-67(1984)以及Roder等人,Methods Enzymol.,121:140-67(1986))、噬菌体载体表达系统(参见例如Huse等人,Science,246:1275-81(1989))或包含抗体片段如Fab和scFv(单链可变区)的噬菌体展示文库(参见例如美国专利号5,885,793和5,969,108以及国际专利申请公布号WO 92/01047和WO 99/06587)在内的其他合适的技术产生。
单克隆抗体可从任何合适的动物中分离或产生,但优选在哺乳动物,更优选小鼠或人,最优选人中产生。用于在小鼠中产生抗体的方法是本领域技术人员熟知的并且在本文中进行描述。关于人抗体,本领域的普通技术人员将会理解,多克隆抗体可从用适当抗原接种或免疫的人受试者的血清中分离。或者,可以通过在非人动物如小鼠中调整已知的用于产生人抗体的技术来产生人抗体(参见例如美国专利号5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公布号2002/0197266A1)。
尽管是人类治疗应用的理想选择,但人抗体,特别是人单克隆抗体通常比小鼠单克隆抗体更难产生。然而,小鼠单克隆抗体当施用于人时诱导快速宿主抗体应答,这可能会降低抗体-细胞毒性剂缀合物的治疗或诊断潜力。为了避免这些复杂问题,单克隆抗体优选不被人免疫系统识别为“外来的”。
为此,噬菌体展示可用于产生抗体。就此而言,可使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库(参见例如Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(2001))。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体以用于与所需抗原的特异性结合,并且重构包含所选可变区的完整人抗体。将编码重构抗体的核酸序列引入合适的细胞系,如用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞中,使得具有单克隆抗体特性的人抗体由细胞分泌(参见例如Janeway等人,同上;Huse等人,同上;以及美国专利号6,265,150)。或者,可以从对于特定人重链和轻链免疫球蛋白基因而言为转基因的小鼠中产生单克隆抗体。此类方法在本领域中是已知的,并且在例如美国专利号5,545,806和5,569,825以及Janeway等人,同上中进行了描述。
最优选地,抗体是人源化抗体。如本文所用,“人源化”抗体是这样一种抗体:其中将形成抗体的抗原结合环的小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体分子的框架上。由于小鼠和人抗体框架的相似性,本领域普遍认可的是,该方法产生与人抗体在抗原性上相同但与CDR序列所来源的小鼠单克隆抗体结合相同抗原的单克隆抗体。用于产生人源化抗体的方法在本领域中是熟知的,并且在例如Janeway等人,同上,美国专利号5,225,539、5,585,089和5,693,761,欧洲专利号0239400B1以及英国专利号2188638中进行了详细描述。人源化抗体也可以使用美国专利号5,639,641以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235:959-973(1994)中描述的抗体表面重构技术来产生。尽管用于本发明组合物的缀合物中的抗体最优选是人源化单克隆抗体,但如上所述的人单克隆抗体和小鼠单克隆抗体也在本发明的范围内。
具有至少一个抗原结合位点并因此识别并结合存在于目标细胞表面上的至少一种抗原或受体的抗体片段也在本发明的范围内。在这方面,完整抗体分子的蛋白水解裂解可产生保持识别和结合抗原的能力的多种抗体片段。例如,用木瓜蛋白酶这种蛋白酶来限制性消化抗体分子通常会产生三个片段,其中两个是相同的并且被称为Fab片段,因为它们保留亲本抗体分子的抗原结合活性。用胃蛋白酶裂解抗体分子通常产生两个抗体片段,其中一个保留抗体分子的两个抗原结合臂,并因此被称为F(ab')2片段。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab')2片段产生称为Fab'片段的片段。可以使用常规重组DNA技术(参见例如Janeway等人,同上)产生这样的单链可变区片段(sFv)抗体片段:该片段由包含经由合成肽与抗体轻链的V结构域连接的抗体重链的可变(V)结构域的截短Fab片段组成。类似地,可以通过重组DNA技术(参见例如Reiter等人,Protein Engineering,7:697-704(1994))制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。然而,本发明上下文中的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。可以采用识别并结合所需细胞表面受体或抗原的任何合适的抗体片段。抗体片段进一步在例如Parham,J.Immunol.,131:2895-2902(1983),Spring等人,J.Immunol.,113:470-478(1974)以及Nisonoff等人,Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244(1960)中进行了描述。可以使用本领域已知的任何合适的方法例如放射免疫测定(RIA)、ELISA、Western印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定法来测定抗体-抗原结合(参见例如Janeway等人,同上和美国专利申请公布号2002/0197266A1)。
另外,抗体可以是嵌合抗体或其抗原结合片段。所谓“嵌合”是指抗体包含从至少两个不同物种获得或衍生的至少两种免疫球蛋白或其片段(例如,两种不同的免疫球蛋白,例如与鼠免疫球蛋白可变区组合的人免疫球蛋白恒定区)。抗体还可以是结构域抗体(dAb)或其抗原结合片段,比如骆驼抗体(参见例如Desmyter等人,Nature Struct.Biol.,3:752,(1996))或鲨鱼抗体,比如新抗原受体(IgNAR)(参见例如Greenberg等人,Nature,374:168(1995)和Stanfield等人,Science,305:1770-1773(2004))。
在本发明的上下文中可以使用任何合适的抗体。例如,单克隆抗体J5是特异于普通急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)的鼠IgG2a抗体(Ritz等人,Nature,283:583-585(1980)),并且可用于靶向表达CALLA的细胞(例如急性淋巴细胞白血病细胞)。单克隆抗体MY9是特异性结合CD33抗原的鼠IgG1抗体(Griffin等人,Leukemia Res.,8:521(1984)),并且可用于靶向表达CD33的细胞(例如急性骨髓性白血病(AML)细胞)。在某些实施方案中,MY9抗体的N端或C端残基被移除。
类似地,单克隆抗体抗B4(也称为B4)是结合B细胞上的CD19抗原的鼠IgG1抗体(Nadler等人,J.Immunol.,131:244-250(1983)),并且可用于靶向表达CD19的B细胞或病变细胞(例如,非霍奇金淋巴瘤细胞和慢性淋巴母细胞白血病细胞)。N901是一种鼠单克隆抗体,它与神经内分泌起源的细胞(包括小细胞肺肿瘤)上发现的CD56(神经细胞粘附分子)抗原结合,可用在与针对神经内分泌起源的细胞的靶向药物形成的缀合物中。J5、MY9和B4抗体优选在用作缀合物的一部分之前被表面重构或人源化。在例如Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-73(1994)中描述了抗体的表面重构或人源化。
另外,单克隆抗体C242与CanAg抗原结合(参见例如美国专利号5,552,293),并且可以用于将缀合物靶向表达CanAg的肿瘤,例如结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。HuC242是单克隆抗体C242的人源化形式(参见例如美国专利号5,552,293)。产生HuC242的杂交瘤以ECACC标识号90012601保藏。HuC242可以使用CDR移植方法(参见例如美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762)或表面重构技术(参见例如美国专利号5,639,641)来制备。HuC242可用于将缀合物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞,比如结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌细胞。
为了靶向卵巢癌和前列腺癌细胞,可以使用抗MUC1抗体作为缀合物中的细胞结合剂。抗MUC1抗体包括例如抗HMFG-2(参见例如Taylor-Papadimitriou等人,Int.J.Cancer,28:17-21(1981))、hCTMO1(参见例如van H等人,Cancer Res.,56:5179-5185(1996))和DS6。前列腺癌细胞也可以通过使用抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为细胞结合剂例如J591而用缀合物靶向(参见例如Liu等人,Cancer Res.,57:3629-3634(1997))。此外,通过使用抗-Her2抗体例如曲妥珠单抗(trastuzumab)作为细胞结合剂,可以用缀合物靶向表达Her2抗原的癌细胞,例如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。表达表皮生长因子受体(EGFR)及其变体(如III型缺失突变体EGFRvIII)的细胞可以通过使用抗EGFR抗体而用缀合物靶向。抗EGFR抗体在国际专利申请号PCT/US11/058,385和PCT/US11/058,378中进行了描述。抗EGFRvIII抗体在美国专利号7,736,644和7,628,986以及美国申请公布2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中进行了描述。与胰岛素样生长因子受体结合的抗IGF-IR抗体如美国专利号7,982,024中所述的那些抗体也可用在缀合物中。与CD27L、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整联蛋白、CD37、叶酸、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、内皮素和Her3结合的抗体也可以用在缀合物中。
在一个实施方案中,抗体选自huN901、huMy9-6、huB4、huC242、抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、huDS6、国际专利申请公布WO 2010/124797中描述的抗间皮素抗体(诸如MF-T)、美国专利申请公布2010/0093980中描述的抗cripto抗体(诸如huB3F6)、美国专利申请公布2007/0183971中描述的抗CD138抗体(诸如huB-B4)、国际专利申请号PCT/US11/058,385和PCT/US11/058,378中描述的抗EGFR抗体(诸如EGFR-7)、美国专利号7,736,644和7,628,986以及美国专利申请公布2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中描述的抗EGFRvIII抗体、国际专利申请公布WO 2011/039721和WO 2011/039724中描述的人源化EphA2抗体(如2H11R35R74)、国际专利申请公布WO 2008/047242中描述的抗CD38抗体(诸如hu38SB19)、国际专利申请公布WO 2011/106528和美国专利申请公布2012/0009181中描述的抗叶酸抗体(例如huMov19)、美国专利号5,958,872、6,596,743和7,982,024中描述的抗IGF1R抗体、美国专利申请公布2011/0256153中描述的抗CD37抗体(例如,huCD37-3)、美国申请公布2006/0127407中描述的抗整联蛋白αvβ6抗体(例如CNTO95)以及国际专利申请公布WO 2012/019024中描述的抗Her3抗体。在一个实施方案中,细胞结合剂是与FGFR2结合的抗体或其抗原结合片段(例如,在US2014/030820中描述的那些,其全部教导以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中,细胞结合剂是与FGFR2和FGFR4结合的抗体或其抗原结合片段(例如,在US 2014/301946中描述的那些,其全部教导以引用方式并入本文)。
特别优选的抗体是本文所述的人源化单克隆抗体。实例包括但不限于huN901、huMy9-6、huB4、huC242、人源化单克隆抗Her2抗体(例如曲妥珠单抗)、比伐珠单抗、西罗珠单抗、CNTO95、huDS6和利妥昔单抗(参见例如美国专利号5,639,641和5,665,357;美国临时专利申请号60/424,332(其与美国专利号7,557,189)相关;国际(PCT)专利申请公布WO 02/16401;Pedersen等人,同上;Roguska等人,同上;Liu等人,同上;Nadler等人,同上;Colomer等人,Cancer Invest.,19:49-56(2001);Heider等人,Eur.J.Cancer,31A:2385-2391(1995);Welt等人,J.Clin.Oncol.,12:1193-1203(1994)和Maloney等人,Blood,90:2188-2195(1997))。其他人源化单克隆抗体在本领域中是已知的并且可以与本发明结合使用。
在一个实施方案中,细胞结合剂是huMy9-6或在美国专利号7,342,110和7,557,189(以引用方式并入本文)中描述的其他相关抗体号。
在另一个实施方案中,细胞结合剂是美国专利号8,557,966和9,133,275中描述的抗叶酸受体抗体。这些专利中的每一个的教导整体以引用方式并入本文。
在另一个实施方案中,细胞结合剂是特异性结合人叶酸受体1(FOLR1)的人源化抗叶酸抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含:(a)包含GYFMN(SEQ ID NO:1)的重链CDR1;包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO:2)的重链CDR2;和包含YDGSRAMDY(SEQID NO:3)的重链CDR3;以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQ ID NO:4)的轻链CDR1;包含RASNLEA(SEQ ID NO:5)的轻链CDR2;和包含QQSREYPYT(SEQ ID NO:6)的轻链CDR3;其中Xaa1选自K、Q、H和R;Xaa2选自Q、H、N和R;以及Xaa3选自G、E、T、S、A和V。优选地,重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO:7)。
在另一个实施方案中,抗叶酸抗体是特异性结合人叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段,其包含具有以下氨基酸序列的重链:
在另一个实施方案中,抗叶酸抗体是由2010年4月7日保藏于ATCC并具有ATCC保藏号PTA-10772和PTA-10773或10774的质粒DNA编码的人源化抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中,抗叶酸抗体是包含与QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:24)至少约90%、95%、99%或100%相同的重链可变结构域和与DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPG QQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:9)或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIIS CKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:10)至少约90%、95%、99%或100%相同的轻链可变结构域的人源化抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中,细胞结合剂是与GCC特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含SED ID NO:11-16的CDR序列。在一个实施方案中,抗GCC抗体具有分别与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18至少95%相同的VH和VL序列。在另一个实施方案中,抗GCC抗体具有分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的VH和VL序列。在又一个实施方案中,抗GCC抗体包含SEQ ID NO:19的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列。在一个实施方案中,抗GCC抗体包含重链氨基酸序列,该重链氨基酸序列代替IgG1的重链(SEQ ID NO:19)中的ELLG,这对于将FcγRIIIb与PVA结合而言是重要的;并且还包含SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列,
在一个实施方案中,细胞结合剂不是抗GCC抗体或其抗原结合片段。
尽管细胞结合剂优选是抗体,但细胞结合剂也可以是非抗体分子。合适的非抗体分子包括例如干扰素(例如α、β或γ干扰素)、淋巴因子(例如白细胞介素2(IL-2)、IL-3、IL-4或IL-6)、激素(例如胰岛素)、生长因子(例如EGF、TGF-α、FGF和VEGF)、集落刺激因子(例如G-CSF、M-CSF和GM-CSF(参见例如Burgess,Immunology Today,5:155-158(1984))、生长抑素和转铁蛋白(参见例如O'Keefe等人,J.Biol.Chem.,260:932-937(1985))。例如,与髓样细胞结合的GM-CSF可以用作细胞结合剂以靶向急性骨髓性白血病细胞。此外,与活化的T细胞结合的IL-2可以用于预防移植物排斥反应、用于治疗和预防移植物抗宿主病以及用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子(EGF)可用于靶向鳞状细胞癌,如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向成神经细胞瘤细胞和其他肿瘤细胞类型。
在某些实施方案中,可用于本发明的方法中的细胞结合剂(例如,抗体)包含游离胺-NH2基团(例如,在一个或多个赖氨酸残基上的ε氨基),其可以与具有胺反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物形成共价键。
细胞毒素或细胞毒性剂-接头化合物
如本文所用,“细胞毒性剂”是指导致细胞死亡、诱导细胞死亡或降低细胞活力的任何化合物。在一个实施方案中,细胞毒性剂是苯并二氮杂二聚体化合物。在另一个实施方案中,细胞毒性剂是吲哚啉并苯并二氮杂二聚体化合物。优选地,吲哚啉并苯并二氮杂二聚体化合物具有可与细胞结合剂上的胺基团(例如,赖氨酸胺基团)形成共价键的胺反应性基团。
在某些实施方案中,细胞毒性剂可以与具有胺反应性基团的接头反应以形成具有附连到其上的胺反应性基团的细胞毒性剂-接头化合物。然后所得的细胞毒性剂-接头化合物可以与细胞结合剂反应以形成细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。
如本文所用,术语“胺反应性基团”是指能够容易地与胺基团反应以形成共价键的官能团。在一个实施方案中,胺反应性基团是反应性酯基。反应性酯基的实例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如,2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如,2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如,4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。在一个实施方案中,反应性酯基是N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯。
在第31具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐,其中:
L由下式表示:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E(A1);或
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1(A3);
其中:
R5为-H或(C1-C3)烷基;
P为氨基酸残基或含有2至20个氨基酸残基的肽;
Ra和Rb每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或带电荷取代基或可电离基团Q(优选地,Q为–SO3M);
m为1至6的整数;并且
Zs1选自下式中的任一个:
其中:
q为1至5的整数;
M为-H或阳离子;并且
-C(=O)E表示反应性酯基。
在第32具体实施方案中,对于上述式(I)或(II)的化合物,Ra和Rb均为H;并且R5为H或Me;而其余的变量如第31具体实施方案中所述。
在第33具体实施方案中,对于上述式(I)或(II)的化合物,P为含有2至5个氨基酸残基的肽;而其余的变量如第31或32具体实施方案中所述。在一个实施方案中,肽可被蛋白酶裂解,优选可被肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解。在另一个实施方案中,P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ IDNO:21)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:22)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:23)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met和Met-Ala。优选地,P为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第34具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
在第35具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中,对于本文所述的化合物(例如,第31、32、33、34或35具体实施方案中所述的化合物),由-C(=O)E表示的反应性酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如,2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如,2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如,4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。更具体地说,反应性酯基由下式表示:
其中U为H或-SO3M。甚至更具体地说,反应性酯基由下式表示:
在第36具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式表示:
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中,对于在第36实施方案中描述的方法,结构式(Ie)的化合物通过使(IIe)的化合物与磺化剂反应而制备。在一个具体实施方案中,磺化剂为NaHSO3或KHSO3。在另一个具体实施方案中,对于在第36实施方案中描述的方法,结构式(Ie)的化合物通过以下方式制备:使(IIe)的化合物与磺化剂原位反应,不进行纯化,然后使结构式(Ie)的化合物与细胞结合剂反应。在一个实施方案中,式(IIe)的化合物与磺化剂(例如,NaHSO3或KHSO3)之间的磺化反应在1.9至5.0、2.9至4.0、2.9至3.7、3.1至3.5、3.2至3.4的pH下在水溶液中进行。在一个具体实施方案中,磺化反应在pH 3.3下在水溶液中进行。在一个实施方案中,磺化反应在二甲基乙酰胺(DMA)和水中进行。
在第37具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式表示:
或其药学上可接受的盐。
在第38具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐,其中:
Rx1和Rx2独立地为(C1-C6)烷基;
Re1为-H或(C1-C6)烷基;
Re2为-(CH2-CH2-O)n-Rk;
n为2至6的整数;
Rk为-H或-Me;
Zs1选自下式中的任一个:
其中:
q为1至5的整数;
M为-H或阳离子;并且
-C(=O)E表示反应性酯基。
在第39具体实施方案中,对于由结构式(III)、(IV)、(V)和(VI)表示的化合物,Re1为H或Me;Rx1和Rx2独立地为-(CH2)p-(CRfRg)-,其中Rf和Rg各自独立地为-H或(C1-C4)烷基;并且p为0、1、2或3;而其余的变量如上文在第38具体实施方案中所述。优选地,Rf和Rg是相同或不同的,并且选自-H和-Me。
在第40具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
在第41具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
在第42具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
在第43具体实施方案中,对于本文所述的本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐
在某些实施方案中,由上述结构式(I)、(III)或(V)表示的化合物通过分别使上述结构式(II)、(IV)或(VI)的化合物与磺化剂反应而制备。
如本文所用,“磺化剂”是可以实现以下转化的试剂。
在一个实施方案中,磺化剂为NaHSO3。
在某些实施方案中,由结构式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)表示的化合物通过分别使由结构式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)表示的化合物与磺化剂反应而制备。
在某些实施方案中,由结构式(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的化合物通过分别使由结构式(IVa)、(IVb)或(IVc)表示的化合物与磺化剂反应而制备。
在某些实施方案中,由结构式(Va)、(Vb)或(Vc)表示的化合物通过分别使由结构式(VIa)、(VIb)或(VIc)表示的化合物与磺化剂反应而制备。
在某些实施方案中,对于上述本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、38、39、40、41或43具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由结构式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示,并且所述方法进一步包括使细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物与磺化试剂反应。在一个实施方案中,磺化剂为NaHSO3或KHSO3。
在某些实施方案中,对于上述本发明的方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、38、39、40、41或43具体实施方案中所述的方法),细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由结构式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示,并且所述方法进一步包括使由结构式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在磺化试剂存在下反应。在一个实施方案中,磺化剂为NaHSO3或KHSO3。
在某些实施方案中,由结构式(IIIa)、(IIIb)、(Va)或(Vb)表示的化合物通过使由以下结构式之一表示的化合物:
或其药学上可接受的盐与由以下结构式之一表示的接头化合物反应而制备:
在某些实施方案中,结构式(IIIc)或(Vc)的化合物通过使由以下结构式表示的化合物:
或其药学上可接受的盐与以下结构式的接头化合物反应而制备:
在一个实施方案中,对于本文所述的化合物(例如,(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(Va)、(Vb)、(Vc)、(VI)、(VIa)、(VIb)或(VIc)),M为-H、Na+或K+。在一个实施方案中,M为Na+或K+。在另一个实施方案中,M为Na+。在又一个实施方案中,M为K+。
其他合适的细胞毒性剂包括例如美登木素生物碱(maytansinoid)和可缀合的安丝菌素(ansamitocin)(参见例如2011年11月3日提交的国际专利申请号PCT/US11/59131,和美国专利号9,090,629)、紫杉烷类(taxoid)、CC-1065和CC-1065类似物,以及尾海兔素(dolastatin)和尾海兔素类似物。在本发明的具体实施方案中,细胞毒性剂是美登木素生物碱,包括美登醇和美登醇类似物。美登木素生物碱是抑制微管形成并对哺乳动物细胞具有高度毒性的化合物。合适的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳环的那些和在其他位置具有修饰的那些。此类美登木素生物碱在例如美国专利号4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545和6,333,410中进行了描述。
具有经修饰的芳环的美登醇类似物的实例包括:(1)C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过安莎霉素(ansamytocin)P2的LAH还原而制备),(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属(Streptomyce)脱甲基化或使用放线菌属(Actinomyce)脱氯而制备),(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(--OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化而制备)。
具有芳环以外的位置修饰的美登醇类似物的实例包括:(1)C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应而制备),(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598),(3)C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属(Nocardia)制备),(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过链霉菌属将美登醇转化而制备),(5)C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)分离),(6)C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌属对美登醇进行脱甲基化而制备)和(7)4,5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原而制备)。
在本发明的具体实施方案中,可用于本发明的方法中的细胞毒性剂是含巯基的美登木素生物碱DM1,也称为N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。DM1的结构如下所示:
在本发明的另一个具体实施方案中,可用于本发明的方法中的细胞毒性剂是含巯基的美登木素生物碱DM1,也称为N2'-脱乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素。DM4的结构如下所示:
其他美登木素生物碱可用于本发明的上下文中,包括例如在具有硫原子的碳原子上带有单烷基或二烷基取代的含硫醇和二硫键的美登木素生物碱。特别优选的是在C-3位具有以下部分的美登木素生物碱:(a)C-14羟甲基、C-15羟基或C-20脱甲基官能团,和(b)具有带受阻巯基的酰基的酰化氨基酸侧链,其中带有硫醇官能团的酰基的碳原子具有一个或两个取代基,所述取代基为具有1至10个碳原子的直链或支链烷基或烯基,具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基,苯基,取代的苯基或杂环芳族基团或杂环烷基,并且另外其中取代基之一可以是H,并且其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。
为了可以更充分地理解本文所述的发明,示出以下实施例。应当理解这些实例仅为了说明的目的,并且不应解释为以任何方式限制本发明。
本发明还包括通过本文所述的任何方法(例如,在第一、第二或第三实施方案或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43具体实施方案中所述的方法)制备的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。
在一个实施方案中,通过本发明的方法制备的缀合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐,其中CBA-NH2为细胞结合剂;M为-H或药学上可接受的阳离子,如Na+或K+;并且r是1至10的整数。
实施例
实施例1.
化合物1a:
向(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇(1.01g,6.59mmol)在无水二甲基甲酰胺(16.48mL)和无水四氢呋喃(16.48ml)中的经搅拌溶液加入4-甲基-4-(甲基二硫烷基)戊酸(1.281g,6.59mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.53g,13.19mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.081g,0.659mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。将反应物用饱和氯化铵溶液猝灭,并用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。将有机萃取物用水和盐水洗涤,然后经无水硫酸钠干燥。将溶液过滤并真空浓缩,并将所得残余物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化,得到呈白色固体的化合物1a(0.70g,收率32%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6:δ9.90(s,1H),7.43(s,2H),6.93(s,1H),5.16(t,2H,J=5.7Hz),4.44(d,4H,J=5.7Hz),2.43(s,3H),2.41-2.38(m,2H),1.92-1.88(m,2H),1.29(s,6H)。MS(m/z),实测值330.0(M+1)+。
化合物1b:
向化合物1a(219mg,0.665mmol)在无水二氯甲烷(6.65mL)的经冷却(-10℃)溶液加入三乙胺(463μl,3.32mmol),然后滴加甲磺酸酐(298mg,1.662mmol)。将混合物在-10℃下搅拌2小时,然后将混合物用冰水猝灭并用冷的乙酸乙酯(2×30mL)萃取。将有机萃取物用冰水洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩,得到粗二甲磺酸酯。
将粗二甲磺酸酯(227mg,0.467mmol)和IGN单体A(303mg,1.028mmol)溶于无水DMF(3.11mL)中。添加碳酸钾(161mg,1.169mmol)并将混合物在室温下搅拌18小时。添加去离子水并将所得的沉淀物过滤且用水冲洗。将固体重新溶于二氯甲烷中并用水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥,过滤,并浓缩。将粗残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化,得到化合物1b(227mg,收率36%)。MS(m/z),实测值882.5(M+1)+。
化合物1c:
向化合物1b(227mg,0.167mmol)在无水1,2-二氯乙烷(3.346mL)中的悬浮液加入三乙酰氧基硼氢化钠(37.3mg,0.167mmol)。将混合物在室温下搅拌一小时,然后用饱和氯化铵溶液猝灭。将混合物用二氯甲烷萃取并用盐水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥,过滤并浓缩。将粗残余物通过RP-HPLC(C18,水/乙腈)纯化。将含有所需产物的级分用二氯甲烷萃取,用无水硫酸镁干燥,过滤并浓缩,得到化合物1c(35mg,收率19%)。MS(m/z),实测值884.3(M+1)+。
化合物1d:
向化合物1c(18mg,0.017mmol)在乙腈(921μL)和甲醇(658μL)中的溶液加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(17.51mg,0.060mmol)(用在磷酸钠缓冲液(132μL,0.75M,pH 6.5)中的饱和碳酸氢钠溶液(0.2mL)中和。将混合物在室温下搅拌3.5小时,然后用二氯甲烷和去离子水稀释。将有机层分离,用盐水洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩,得到粗硫醇。MS(m/z),实测值838.3(M+1)+。
将来自步骤5的粗硫醇(15.5mg,0.018mmol)溶于2-丙醇(1.23mL)中。添加去离子水(617μL)和亚硫酸氢钠(5.77mg,0.055mmol)并将混合物在室温下搅拌五小时。将反应物在丙酮/干冰浴中冷冻、冻干,并通过RP-HPLC(C18,去离子水/乙腈)纯化。将含有所需产物的级分冷冻并冻干,得到化合物(12S,12aS)-9-((3-(4-巯基-4-甲基戊酰氨基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苄基)氧基)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-12-磺酸(化合物1d)(6.6mg,收率39%)。MS(m/z),实测值918.2(M-1)-。
实施例2
6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯即化合物90的合成。
步骤1:将(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酸(5g,22.40mmol)和(S)-2-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(4.48g,24.64mmol)溶于无水DMF(44.8mL)中。添加EDC·HCl(4.72g,24.64mmol)、HOBt(3.43g,22.40mmol)和DIPEA(9.75mL,56.0mmol)。在氩气和室温下搅拌反应物过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释,然后用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩。将粗油状物经由硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯)纯化,得到化合物2a(6.7g,收率85%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.31(m,5H),6.53-6.42(m,1H),5.42-5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48-4.41(m,1H),4.32-4.20(m,1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J=6.8Hz),1.38(d,3H,J=7.2Hz)。
步骤2:将化合物2a(6.7g,19.12mmol)溶于甲醇(60.7mL)和水(3.03mL)中。将该溶液用氩气吹扫五分钟。缓慢添加钯碳(湿,10%)(1.017g,0.956mmol)。将反应物在氢气氛围下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土过滤、用甲醇冲洗并浓缩。将其与甲醇和乙腈共沸,并将所得的油状物直接置于高真空下得到化合物2b(4.02g,收率97%),其直接用于下一步。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.78-7.63(m,1H),4.49-4.42(m,1H),3.55-3.50(m,1H),1.73(s,2H),1.48(s,9H),1.39(d,3H,J=7.2Hz),1.36(d,3H,J=6.8Hz)。
步骤3:将化合物2b(4.02g,18.59mmol)和单甲基己二酸酯(3.03mL,20.45mmol)溶于无水DMF(62.0mL)。添加EDC·HCl(3.92g,20.45mmol)、HOBt(2.85g,18.59mmol)和DIPEA(6.49mL,37.2mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷/甲醇(150mL,5:1)稀释,且用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将其经硫酸钠干燥、过滤并汽提。将该化合物与乙腈(5x)共沸,然后在35℃下在高真空下泵吸,得到化合物2c(6.66g,收率100%)。粗料不经纯化即用于下一步。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.75(d,1H,J=6.8Hz),6.44(d,1H,J=6.8Hz),4.52-4.44(m,1H),4.43-4.36(m,1H),3.65(s,3H),2.35-2.29(m,2H),2.25-2.18(m,2H),1.71-1.60(m,4H),1.45(s,9H),1.36(t,6H,J=6.0Hz)。
步骤4:将化合物2c(5.91g,16.5mmol)在TFA(28.6mL,372mmol)和去离子水(1.5mL)中在室温下搅拌三小时。将反应混合物用乙腈浓缩并置于高真空下,得到呈粘性固体的粗化合物2d(5.88g,100%收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.21(d,1H,J=6.8Hz),6.81(d,1H,J=7.6Hz),4.69-4.60(m,1H),4.59-4.51(m,1H),3.69(s,3H),2.40-2.33(m,2H),2.31-2.24(m,2H),1.72-1.63(m,4H),1.51-1.45(m,3H),1.42-1.37(m,3H)。
步骤5:将化合物2d(5.6g,18.52mmol)溶于无水二氯甲烷(118mL)和无水甲醇(58.8mL)。添加(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇(2.70g,17.64mmol)和EEDQ(8.72g,35.3mmol),并将反应物在室温下搅拌过夜。将溶剂汽提并添加乙酸乙酯。将所得浆液过滤,用乙酸乙酯洗涤并在真空/N2下干燥,得到化合物2e(2.79g,收率36%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.82(s,1H),8.05,(d,1H,J=9.2Hz),8.01(d,1H,J=7.2Hz),7.46(s,2H),6.95(3,1H),5.21-5.12(m,2H),4.47-4.42(m,4H),4.40-4.33(m,1H),4.33-4.24(m,1H),3.58(s,3H),2.33-2.26(m,2H),2.16-2.09(m,2H),1.54-1.46(m,4H),1.30(d,3H,J=7.2Hz),1.22(d,3H,J=4.4Hz)。
步骤6:将化合物2e(0.52g,1.189mmol)和四溴化碳(1.183g,3.57mmol)溶于无水DMF(11.89mL)。添加三苯基膦(0.935g,3.57mmol)并将反应物在氩气下搅拌四小时。将反应混合物用DCM/MeOH(10:1)稀释并用水和盐水洗涤,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。将粗料通过硅胶色谱法(DCM/MeOH)纯化,得到化合物2f(262mg,收率39%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.01(s,1H),8.11(d,1H,J=6.8Hz),8.03(d,1H,J=6.8Hz),7.67(s,2H),7.21(s,1H),4.70-4.64(m,4H),4.40-4.32(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.58(s,3H),2.34-2.26(m,2H),2.18-2.10(m,2H),1.55-1.45(m,4H),1.31(d,3H,J=7.2Hz),1.21(d,3H,J=7.2Hz)。
步骤7:将二溴化物化合物2f和IGN单体化合物A溶于DMF。添加碳酸钾并在室温下搅拌过夜。将水加入反应混合物中以沉淀产物。将浆液在室温下搅拌,然后过滤并在真空/N2下干燥。将粗料通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化,得到化合物2g(336mg,收率74%)。LCMS=5.91分钟(15分钟方法)。MS(m/z):990.6(M+1)+。
步骤8:将二亚胺化合物2g溶于1,2-二氯乙烷。将硼氢化钠(OAC)3(STAB)加入反应混合物中并在室温下搅拌1小时。将反应物用CH2Cl2稀释并用饱和NH4Cl溶液猝灭。将各层分离并用盐水洗涤,经Na2SO4干燥并浓缩。将粗料经由RPHPLC(C18柱,乙腈/水)纯化,得到化合物2h(85.5mg,收率25%)。LCMS=6.64分钟(15分钟方法)。MS(m/z):992.6(M+1)+。
步骤9:将化合物2h溶于1,2-二氯乙烷。将三甲基锡醇(trimethylstannanol)加入反应混合物中并在80℃下加热过夜。然后将反应混合物冷却至RT并用水稀释。用1M HCl将含水层酸化至pH~4。将混合物用CH2Cl2/MeOH萃取。将合并的有机层用盐水洗涤,经Na2SO4干燥并浓缩。使粗料通过硅胶塞,得到化合物2i(48.8mg,收率80%)。LCMS=5.89分钟(15分钟方法)。MS(m/z):978.6(M+1)+。
步骤10:在室温下将EDC·HCl加入酸性化合物2i和N-羟基琥珀酰胺在CH2Cl2中的经搅拌溶液。将反应混合物搅拌2小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释,并用水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥,过滤并浓缩。将粗料经由RPHPLC(C18柱,乙腈/水)纯化,得到6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯即化合物2j(8.2mg,收率30%)。LCMS=6.64分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1075.4(M+1)+。
实施例3
缀合:先前的方案
将AbX,一种人抗GCC抗体,5F9(具有SEQ ID NO:19的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:20的轻链氨基酸序列)在缀合之前缓冲液交换到pH 8.5的15mM HEPES中。然后使用化合物(IIe)的磺化形式制备AbX-(Ie)缀合物。首先通过化合物(IIe)与5倍摩尔过量的亚硫酸氢钠和50mM琥珀酸盐(pH 5.0)在90/10有机物:水溶液中在环境温度下温育3小时、然后在4℃下过夜温育而使化合物(Ie)磺化。然后使用在15mM HEPES(pH 8.5)中的2.0mg/mL的AbX抗体,并基于抗体以指定的摩尔过量添加化合物(Ie)来进行缀合反应(关于代表性缀合,参见表1)。缀合反应具有15mM HEPES(pH8.5)和DMA的最终90/10的水性:有机组成,并在25℃的水浴中温育4小时,然后纯化到制剂缓冲液(10mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5%蔗糖、0.01%Tween-20、50μM亚硫酸氢钠,pH6.2)中。
表1
缀合:优化的方案
探索了包括等渗强度、电导率、pH、反应浓度和化合物(Ie)摩尔当量在内的各种参数以优化所需AbX-(Ie)缀合物的收率。从这些研究中得出利用75mM EPPS(pH8.0)缓冲液的优化方案。类似于标准平台方案,使用化合物(Ie)即化合物(IIe)的磺化形式(如前一章节中所述而制备)制备了AbX-(Ie)缀合物。使用在75mM EPPS(pH 8.0)中的2.0mg/mL的AbX抗体,并基于抗体以指定的摩尔过量添加化合物(Ie)来进行优化的缀合反应(关于代表性缀合,参见表2)。缀合反应具有75mM EPPS(pH8.0)和DMA的最终90/10的水性:有机组成,并在25℃的水浴中温育4小时,然后纯化到制剂缓冲液(10mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5%蔗糖、0.01%Tween-20、50μM亚硫酸氢钠,pH6.2)中。
表2
如表2所示,与使用pH 8.5下的具有较低离子强度的缓冲液的先前方案相比,用涉及使用pH 8.0下的具有较高离子强度的缓冲液的方案使缀合收率从24%增至64%,增加了约2倍。
纯化
使用用20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5%蔗糖、0.01%Tween-20和50μM亚硫酸氢钠(pH 6.2)平衡的Sephadex G-25NAP柱纯化AbX-(Ie)缀合反应混合物。使用0.22μm PVDF注射器过滤器过滤经纯化的缀合物,并在4℃下针对新制剂缓冲液透析过夜,然后使用新制剂缓冲液在环境温度下透析4小时。在分析之前使用0.22μm PVDF注射器过滤器对缀合物进行再过滤。
分析方法:
使用280nm和330nm处的吸光度值通过UV/Vis测定经纯化的缀合物样品中抗体和细胞毒性剂(D)的浓度。由于抗体和细胞毒性剂两者都在280nm处吸收,因此需要二项式方程来考虑总信号中归因于每个部分的那部分信号。只有细胞毒性剂吲哚啉并苯并二氮杂(IGN)在330nm处吸收,因此该波长处的浓度仅可归因于细胞毒性剂。表3中列出了缀合部分的消光系数值。
使用下列代数表达式对抗体和细胞毒性剂组分进行定量,该代数表达式考虑了每种成分在各波长处的贡献:
CD=A330/ε330nm IGN
CAb=(A280-(ε280nm IGN/ε330nm IGN)x A330)/ε280nm Ab
Ax是在X nm波长处的吸光度值,而CAb是抗体(即AbX)的摩尔浓度,以及CD是细胞毒性剂的摩尔浓度。作为上述摩尔浓度的比率来计算细胞毒性剂:Ab之比(DAR)。使用表3中列出的分子量计算AbX和细胞毒性剂的mg/mL(g/L)浓度。
表3
测定单体缀合物的百分比
使用尺寸排阻色谱法(SEC)经由HPLC分析来测定纯化的AbX-细胞毒性剂样品中单体缀合物的百分比。将大约10-100μg的AbX-细胞毒性剂缀合物进样到具有附连的SEC柱(TSK GEL G3000SWxl 5μm,7.8mm x 30cm,部件号08541;推荐的保护柱TSK GEL,4cm,部件号08543,TOSOH Biosciences,King of Prussia,PA)并用400mM高氯酸钠、50mM磷酸钠、5%异丙醇的等度流动相以0.5mL/min运行的HPLC仪器上。在280nm和330nm波长处采集30分钟的吸光度信号。
AbX抗体单体通常在约17分钟时洗脱,而AbX-细胞毒性剂缀合物单体通常以约17分钟和约19分钟时的双重峰洗脱。高分子量物质(HMW,例如二聚体、聚集体)和低分子量物质(LMW,例如片段)通常分别在约12和约24分钟时洗脱。
从17分钟峰(或17/19双重峰)的280nm峰面积计算单体抗体(或缀合物)%,并与所有组合的蛋白质峰的面积进行比较。
还通过以下方式确定单体峰上的DAR:将280nm和330nm信号的峰面积代入以上章节中所示的CD和CAb方程中的A280和A330空间,然后除以CD/CAb。
测定未缀合的细胞毒性剂的百分比
经由使用串联SEC和C-18反相柱(“双柱”)的UPLC分析法测定存在于纯化的缀合物样品中的未缀合的细胞毒性剂(“游离药物”)的量。将两根Waters Acquity UPLC ProteinBEH SEC柱(1.7μm,4.6x 30mm,部件号186005793,Waters Corporation,Milford,MA)串联连接以将完整缀合物与游离药物分离,然后将其引导至Waters Cortecs UPLC C-18柱(2.1x 50mm,部件号186007093)以分离和定量游离的CDA物质。通过以下方式制备缀合物:用乙腈(ACN)稀释至20%(v/v)ACN,进样到柱系列(25μL)上,并根据表4中列出的梯度运行:
表4
时间(分钟) | 流量(mL/min) | %A | %B |
0.0 | 0.35 | 70 | 30 |
1.0 | 0.35 | 70 | 30 |
8.0 | 0.35 | 20 | 80 |
9.0 | 0.35 | 5 | 95 |
10.0 | 0.35 | 5 | 95 |
10.1 | 0.35 | 70 | 30 |
11.0 | 0.35 | 70 | 30 |
12.0 | 0.35 | 70 | 30 |
13.5 | 0.35 | 70 | 30 |
14.0 | 0.35 | 95 | 5 |
20.0 | 0.35 | 95 | 5 |
21.0 | 0.0 | 95 | 5 |
表7:流量=0.35ml/min;运行时间=12.5分钟;C-18柱温=30℃;流动相=A:0.1%(v/v)的TFA水溶液,B:0.1%(v/v)TFA的ACN溶液
将柱在2.2分钟时从在线SEC转移到C-18并在14.0分钟时转回在线SEC。在265nm处采集信号。使用来源于化合物(Ie)的标准曲线,使用下式从2.2-14.0分钟窗口中发现的峰计算样品中存在的游离药物的量:
Ng游离=(AUC265nm+11805)/4888
游离CDA%=ng游离/ng进样
实施例4.
根据实施例3中描述的方案制备人源化抗体Ab1和鼠抗体即鼠My9-6与化合物(Ie)的缀合物。结果示于表5中。
表5
如表5所示,与使用pH 8.5下的具有低离子强度的缓冲液进行的缀合相比,使用pH8下的高离子强度缓冲液进行的缀合导致反应收率显著增加。
<---------->
实施例5
使用实施例3中描述的利用75mM EPPS pH 8.0缓冲液的方案来制备5F9-PVAdG-(Ie)缀合物。5F9-PVAdG抗体含有代替IgG1的重链(SEQ ID NO:9)中的ELLG的氨基酸取代,这对于将FcγRIIIb与PVA结合而言是重要的,PVA是在IgG2中在类似位置处的高度保守氨基酸(Vidarsson等人,IgG subclasses and allotypes:from structure to effectorfunctions,Frontiers in Immunology,5(520):1-17(2014))。
使用在75mM EPPS(pH 8.0)中的2.0mg/mL的5F9PVAdG抗体,并基于抗体以指定的摩尔过量添加化合物(IIe)的磺化形式来进行缀合反应(关于代表性缀合,参见表6)。缀合反应具有75mM EPPS(pH8.0)和DMA的最终90/10的水性:有机组成,并在25℃的水浴中温育4小时,然后纯化到制剂缓冲液(10mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5%蔗糖、0.01%Tween-20、50μM亚硫酸氢钠,pH6.2)中。
使用用10mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5%蔗糖、0.01%Tween-20和50μM亚硫酸氢钠(pH 6.2)平衡的Sephadex G-25HiPrep柱纯化5F9-PVAdG-(Ie)缀合反应混合物。在分析之前使用0.22μm PVDF注射器过滤器对缀合物进行过滤。
表6
实施例6
优化的磺化
使化合物(IIe)如下磺化生成化合物(Ie)。向3.75mL的50mM琥珀酸钠pH3.3溶液中加入6.11mL的量的DMA。混合并在水浴中平衡至10℃后,添加1.39mL 21.5mM的化合物(IIe)在DMA中的储备溶液(30.0μmol化合物(IIe))并混合。在此添加之后,将3.75mL的20mM亚硫酸氢钠水溶液(2.5当量,75μmol)引入反应中。混合后,使反应在10℃下进行15.5小时,并立即用于下一步而无需纯化。反应混合物的液相色谱(反相)分析表明92.4%转化为化合物(Ie),剩余2.4%未反应的化合物(IIe)。
缀合后猝灭
为了确定缀合后离子强度的增加导致高分子量(HMW)物质的形成减少的条件,进行了以下优化。在22℃下将5F9抗体(2mg/mL)与3.8摩尔当量的化合物(Ie)缀合80-90分钟。缀合反应的最终组成由130mM EPPS(pH 8.7)和15%体积的DMA构成。在缀合反应完成后,立即将等分试样用指定体积的猝灭溶液稀释,如表7所示。在保持在22℃下后,监测指定时间的HMW物质百分比的变化。基于这一发现,选择使用300、500或700mM EPPS猝灭溶液进行2倍稀释,使用750mM EPPS进行1.4-1.6倍稀释,以及使用750mM EPPS/150mM组氨酸盐酸盐进行1.4-1.6倍稀释。在以下缀合实施例中,采用使用750mM EPPS/150mM组氨酸盐酸盐进行的1.5倍稀释。表7描述了猝灭溶液对粗5F9-(Ie)缀合物的稳定性的影响。将粗5F9-(Ie)缀合物与不同的猝灭溶液一起温育持续规定的时间量,并通过尺寸排阻色谱法测定分子量物质百分比的变化。
表7
*通过从表中指定的时间的实验%HMW减去在t=0分钟时的适当对照的HMW%进行计算。
优化的缀合和纯化
在配有顶置式搅拌器的含有325mL 130mM EPPS(pH 8.7)的1L夹套玻璃反应器中加入68.6mL DMA。在混合并将溶液平衡至22℃后,将100mL10.0mg/mL的5F9抗体在130mMEPPS(pH8.7)中的溶液引入反应器中并使其混合15分钟。随后将12.8mL的2mM化合物(Ie)溶液(25.5μmol,3.7当量的5F9抗体;使用前述优化的磺化方案制备)引入反应溶液中。在22℃下搅拌60分钟后,将250mL含有150mM组氨酸盐酸盐和750mM EPPS的水溶液转移到反应容器中。在充分混合后,将该材料通过Millipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μM过滤器过滤。然后通过用TangenX 0.02m2HyStream 30kD Sius LSN TFF盒超滤来浓缩粗反应混合物,达到2.5mg/mL的计算出的蛋白质体积浓度。浓缩步骤后,将溶液针对4.8L 50mM组氨酸、6.7w/v(重量/体积)%蔗糖、0.1v/v(体积/体积)%聚山梨醇酯-80、50μM亚硫酸氢钠pH5.5缓冲液渗滤。渗滤后,将聚山梨醇酯-80以0.1v/v(体积/体积)%聚山梨醇酯-80的最终浓度加入渗余物溶液中,并用Millipore Optiscale 47Express SHC0.5/0.2μM过滤器过滤所得溶液。在2-8℃下储存2天后,通过添加必需体积的额外的50mM组氨酸、6.7w/v%蔗糖、0.1v/v%聚山梨醇酯-80、50μM亚硫酸氢钠pH 5.5缓冲液,将溶液稀释至1.0mg/mL缀合物。然后将该溶液通过Millipore Optiscale 47Durapore 0.22μM过滤器过滤,得到818mL1.0mg/mL的缀合物。通过UV/vis测得的最终缀合物的DAR为2.6,通过SEC测得单体占97.4%且HMW占2.5%。该产物的最终收率为82%。
分析:
使用280nm和330nm处的吸光度值通过UV/Vis测定经纯化的缀合物样品中抗体和细胞毒性剂(Ie)的浓度。由于抗体和细胞毒性剂两者都在280nm处吸收,因此需要二项式方程来考虑总信号中归因于每个部分的那部分信号。只有细胞毒性剂吲哚啉并苯并二氮杂(IGN)在330nm处有吸收,因此该波长处的浓度仅可归因于细胞毒性剂。本实施例中使用的缀合部分的消光系数值在280和330nm处分别为34150和16270M-1cm-1。
使用下列代数表达式对抗体和细胞毒性剂组分进行定量,该代数表达式考虑了每种成分在各波长处的贡献:
CD=A330/ε330nm IGN
CAb=(A280–(ε280nm IGN/ε330nm IGN)X A330)/ε280nm Ab
Ax是Xnm波长处的吸光度值,而CAb是抗体(即AbX)的摩尔浓度,并且CD是细胞毒性剂的摩尔浓度。作为上述摩尔浓度的比率来计算细胞毒性剂:Ab之比(DAR)。使用144887g/mol的分子量计算AbX的mg/mL(g/L)浓度。
Claims (119)
1.一种制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法,所述方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与所述细胞结合剂形成共价键的反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在具有高离子强度的缓冲溶液存在下反应,其中所述细胞结合剂包含与具有胺反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物形成共价键的赖氨酸ε–NH2基团。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.3与8.7之间。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.3与8.4之间。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.6与8.4之间。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.7与8.3之间。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.8与8.2之间。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在7.9与8.1之间。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在8.0。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在8.5至8.9之间。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述pH在8.6至8.8之间。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述pH为8.7。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述缓冲溶液具有20mM至500mM的离子强度。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有50mM至100mM的离子强度。
14.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有60mM至90mM的离子强度。
15.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有70mM至80mM的离子强度。
16.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有75mM的离子强度。
17.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有100nM至200mM的离子强度。
18.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有100nM至160nM的离子强度。
19.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有120nM至140nM的离子强度。
20.如权利要求12所述的方法,其中所述缓冲溶液具有130nM的离子强度。
21.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液具有7.8至8.9之间的pH和50mM与200mM之间的离子强度。
22.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液具有7.8至8.2之间的pH和70mM与80mM之间的离子强度。
23.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液具有8.0的pH和75mM的离子强度。
24.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液具有8.5至8.9之间的pH和120mM至140mM之间的离子强度。
25.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液具有8.7的pH和130mM的离子强度。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述缓冲溶液选自由以下组成的组:MES((2-(N-吗啉代)乙磺酸))缓冲液、双-三甲烷(2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)缓冲液、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)缓冲液、ACES(N--2-氨基乙磺酸)缓冲液、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))、MOPSO(β-羟基-4-吗啉丙磺酸)缓冲液、双-三丙烷(1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷)缓冲液、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、DIPSO、(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸或N,N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)缓冲液、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris或2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)缓冲液、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水合物)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、三甲基甘氨酸(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)缓冲液、gly-gly、二甘氨酸(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)缓冲液、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))缓冲液、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸)缓冲液、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)缓冲液、TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)缓冲液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)缓冲液以及它们的组合。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述缓冲溶液是EPPS缓冲液。
28.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液是具有7.8与8.9之间的pH的50mM至200mM EPPS缓冲液。
29.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液是具有7.8与8.2之间的pH的70mM至80mM EPPS缓冲液。
30.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液是具有8.0的pH的75mM EPPS缓冲液。
31.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液是具有8.5与8.9之间的pH的120mM至140mM EPPS缓冲液。
32.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲溶液是具有8.7的pH的130mM EPPS缓冲液。
33.一种制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法,所述方法包括使细胞结合剂与细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在pH为7.3至9.0的缓冲溶液中反应的步骤,其中所述细胞结合剂包含与具有胺反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物形成共价键的赖氨酸ε–NH2基团。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述缓冲溶液的pH在7.3与8.4之间。
35.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在7.6与8.4之间。
36.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在7.7与8.3之间
37.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在7.8与8.2之间。
38.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在7.9与8.1之间。
39.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在8.0。
40.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在8.5与8.9之间。
41.如权利要求33所述的方法,其中所述pH在8.6与8.8之间。
42.如权利要求33所述的方法,其中所述pH为8.7。
43.一种制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法,所述方法包括以下步骤:使细胞结合剂与具有能够与所述细胞结合剂形成共价键的反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在4至9之间的pH下在高浓度缓冲溶液存在下反应,其中所述细胞结合剂包含与具有胺反应性基团的细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物形成共价键的赖氨酸ε–NH2基团。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液的浓度在20mM与750mM之间、20mM与500mM之间、20mM与200mM之间、25mM与150mM之间、50mM与150mM之间、50mM与100mM、100mM与200mM之间或100mM与150mM之间。
45.如权利要求43或44所述的方法,其中所述pH在7.3与8.9之间、7.3与8.4之间、7.6与8.4之间、7.7与8.3之间、7.8与8.2之间、8.5与8.9之间或8.6与8.8之间。
46.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有20mM与200mM之间的浓度和7.1与8.5之间的pH。
47.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有50mM与150mM之间的浓度和7.6与8.4之间的pH。
48.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有50mM与100mM之间的浓度和7.7与8.3之间的pH。
49.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有60mM与90mM之间的浓度和7.8与8.2之间的pH。
50.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有70mM与80mM之间的浓度和7.9与8.1之间的pH。
51.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有50mM与200mM之间的浓度和7.8与8.9之间的pH。
52.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有110mM与150mM之间的浓度和8.5与8.9之间的pH。
53.如权利要求43所述的方法,其中所述缓冲溶液具有120mM与140mM之间的浓度和8.6与8.8之间的pH。
54.如权利要求33-53中任一项所述的方法,其中所述缓冲溶液选自由以下组成的组:MES((2-(N-吗啉代)乙磺酸))缓冲液、双-三甲烷(2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)缓冲液、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)缓冲液、ACES(N--2-氨基乙磺酸)缓冲液、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))、MOPSO(β-羟基-4-吗啉丙磺酸)缓冲液、双-三丙烷(1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷)缓冲液、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液、DIPSO、(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸或N,N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)缓冲液、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris或2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)缓冲液、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水合物)缓冲液、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)缓冲液、三甲基甘氨酸(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)缓冲液、gly-gly、二甘氨酸(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)缓冲液、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))缓冲液、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸)缓冲液、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)缓冲液、TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)缓冲液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)缓冲液以及它们的组合。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述缓冲溶液是EPPS缓冲液。
56.如权利要求54所述的方法,其中所述缓冲溶液是75mM EPPS缓冲液。
57.如权利要求54所述的方法,其中所述缓冲溶液是130mM EPPS缓冲液。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法,其进一步包括在所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物与所述细胞结合剂反应后混合具有高离子强度的猝灭溶液的步骤。
59.如权利要求58所述的方法,其中所述猝灭溶液具有200mM与3000mM之间、200mM与2000mM之间、200mM与1000mM之间、500mM与1000mM之间、550mM与1000mM之间或600mM与1000mM之间的离子强度。
60.如权利要求58所述的方法,其中所述猝灭溶液具有700mM与1000mM之间的离子强度。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法,其中所述猝灭溶液包含EPPS。
62.如权利要求58-60中任一项所述的方法,其中所述猝灭溶液包含EPPS和组氨酸盐酸盐。
63.如权利要求1-57中任一项所述的方法,其进一步包括在所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物与所述细胞结合剂反应后混合包含高浓度缓冲液的猝灭溶液的步骤。
64.如权利要求63所述的方法,其中所述猝灭溶液中所述缓冲液的浓度在200mM与3000mM之间、200nM与2000mM之间、200mM与1000mM之间、500mM与1000mM之间、550mM与1000mM之间或600mM与1000mM之间。
65.如权利要求63或64所述的方法,其中在所述混合之后,所述缓冲液的最终浓度在150mM与750mM之间、150mM与600mM之间、200mM与500nM之间、200mM与400nM之间或250mM与350mM之间。
66.如权利要求58-65中任一项所述的方法,其中所述猝灭溶液具有5至9之间的pH。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述猝灭溶液具有5至7之间的pH。
68.如权利要求66所述的方法,其中所述猝灭溶液具有5至6之间的pH。
69.如权利要求66所述的方法,其中所述猝灭溶液具有5.5的pH。
70.如权利要求69所述的方法,其中所述猝灭溶液包含750mM EPPS和150mM组氨酸盐酸盐。
71.如权利要求58-70中任一项所述的方法,其中所述猝灭缓冲液的添加减少了高分子量物质的量。
72.如权利要求1-71中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐,其中:
L由下式表示:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E(A1);或
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1(A3);
其中:
R5为-H或(C1-C3)烷基;
P为氨基酸残基或含有2至20个氨基酸残基的肽;
Ra和Rb每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或带电荷取代基或可电离基团Q;
m为1至6的整数;并且
Zs1选自下式中的任一个:
其中:
q为1至5的整数;
M为-H或阳离子;并且
-C(=O)E表示反应性酯基。
73.如权利要求72所述的方法,其中Ra和Rb均为H;并且R5为H或Me。
74.如权利要求72或73所述的方法,其中P为含有2至5个氨基酸残基的肽。
75.如权利要求74所述的方法,其中P为可被蛋白酶裂解的肽。
76.如权利要求75所述的方法,其中P为可被肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
77.如权利要求72-74中任一项所述的方法,其中P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:21)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:22)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:23)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met和Met-Ala。
78.如权利要求77所述的方法,其中P为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
79.如权利要求72-78中任一项所述的方法,其中Q为-SO3M。
80.如权利要求72所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
81.如权利要求72所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
82.如权利要求72-81中任一项所述的方法,其中所述反应性酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如,2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如,2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如,4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述反应性酯基由下式表示:
其中U为H或-SO3M。
84.如权利要求82所述的方法,其中所述反应性酯基由下式表示:
85.如权利要求72所述的方法,其中所述细胞毒性剂由以下结构式表示:
或其药学上可接受的盐。
86.如权利要求72所述的方法,其中所述细胞毒性剂由以下结构式表示:
或其药学上可接受的盐。
87.如权利要求72-79和82-84中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由通过使结构式(II)的化合物与磺化剂反应而制备的结构式(I)表示。
88.如权利要求80和82-84中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物通过使由以下结构式之一表示的化合物:
或其药学上可接受的盐与磺化剂反应而制备。
89.如权利要求85所述的方法,其中所述细胞毒性剂通过使由下式之一表示的化合物:
或其药学上可接受的盐与磺化剂反应而制备。
90.如权利要求72-79和82-84中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由结构式(II)表示,并且其中所述方法进一步包括使所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物与磺化剂反应。
91.如权利要求72-79和82-84中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由结构式(II)表示,并且其中所述方法包括使所述细胞结合剂与由结构式(II)表示的所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物在磺化剂存在下反应。
92.如权利要求81-84和86中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括使所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物与磺化剂反应。
93.如权利要求81-84和86中任一项所述的方法,其中所述方法包括使所述细胞结合剂与所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物在磺化剂存在下反应。
94.如权利要求1-71中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐,其中:
Rx1和Rx2独立地为(C1-C6)烷基;
Re1为-H或(C1-C6)烷基;
Re2为-(CH2-CH2-O)n-Rk;
n为2至6的整数;
Rk为-H或-Me;
Zs1选自下式中的任一个:
其中:
q为1至5的整数;
M为-H或阳离子;并且
-C(=O)E表示反应性酯基。
95.如权利要求94所述的方法,其中Re1为H或Me;Rx1和Rx2独立地为-(CH2)p-(CRfRg)-,其中Rf和Rg各自独立地为-H或(C1-C4)烷基;并且p为0、1、2或3。
96.如权利要求95所述的方法,其中Rf和Rg是相同或不同的,并且选自-H和-Me。
97.如权利要求94所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
98.如权利要求94所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由下式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
99.如权利要求94-98中任一项所述的方法,其中所述反应性酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如,2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如,2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如,4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。
100.如权利要求99所述的方法,其中所述反应性酯基由下式表示:
其中U为H或-SO3M。
101.如权利要求100所述的方法,其中所述反应性酯基由下式表示:
102.如权利要求94所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
103.如权利要求94所述的方法,其中所述细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式之一表示:
或其药学上可接受的盐。
104.如权利要求94-96和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由通过使结构式(IV)的化合物与磺化剂反应而制备的结构式(III)表示。
105.如权利要求94-96和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由通过使结构式(VI)的化合物与磺化剂反应而制备的结构式(V)表示。
106.如权利要求97和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物通过使由以下结构式之一表示的化合物:
或其药学上可接受的盐与磺化剂反应而制备。
107.如权利要求97和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂-接头化合物通过使由以下结构式之一表示的细胞毒性剂:
或其药学上可接受的盐与由以下结构式之一表示的接头化合物反应而制备:
108.如权利要求102所述的方法,其中所述细胞毒性剂-接头化合物通过使具有以下结构式之一的化合物:
或其药学上可接受的盐与磺化剂反应而制备。
109.如权利要求102所述的方法,其中所述细胞毒性剂-接头化合物通过使由以下结构式表示的细胞毒性剂:
或其药学上可接受的盐与以下结构式的接头化合物反应而制备:
110.如权利要求94-96和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或所述细胞毒性剂-接头化合物由结构式(IV)或(VI)表示,并且其中所述方法进一步包括使所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物与磺化剂反应。
111.如权利要求94-96和99-101中任一项所述的方法,其中所述细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物由结构式(IV)或(VI)表示,并且其中所述方法包括使由结构式(IV)或(VI)表示的化合物在磺化试剂存在下反应。
112.如权利要求98-101和103中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括使所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物与磺化剂反应。
113.如权利要求98-101和103中任一项所述的方法,其中所述方法包括使所述细胞结合剂与所述细胞毒性剂或细胞毒性剂-接头化合物在磺化剂存在下反应。
114.如权利要求87-93和104-113中任一项所述的方法,其中所述磺化剂为NaHSO3。
115.如权利要求72-113中任一项所述的方法,其中M为-H、Na+或K+。
116.如权利要求115所述的方法,其中M为Na+。
117.如权利要求1-116中任一项所述的方法,其中所述细胞结合剂为抗体。
118.如权利要求117所述的方法,其中所述抗体为单克隆抗体。
119.如权利要求118所述的方法,其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662292018P | 2016-02-05 | 2016-02-05 | |
US62/292,018 | 2016-02-05 | ||
PCT/US2017/016344 WO2017136623A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-02-03 | Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108601848A true CN108601848A (zh) | 2018-09-28 |
Family
ID=58159509
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780009779.5A Pending CN108601848A (zh) | 2016-02-05 | 2017-02-03 | 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210299265A1 (zh) |
EP (1) | EP3411077A1 (zh) |
JP (1) | JP2019510741A (zh) |
KR (1) | KR20180105233A (zh) |
CN (1) | CN108601848A (zh) |
AU (1) | AU2017213858A1 (zh) |
CA (1) | CA3013125A1 (zh) |
MA (1) | MA47022A (zh) |
RU (1) | RU2018130108A (zh) |
SG (1) | SG11201806478PA (zh) |
TW (1) | TW201731532A (zh) |
WO (1) | WO2017136623A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2966932A1 (en) * | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Immunogen, Inc. | Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates |
US20180118811A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-05-03 | Invenra Inc. | Antibody constructs |
CA3045857A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Universita Degli Studi Magna Graecia Catanzaro | A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43 |
CN113227127A (zh) | 2018-06-05 | 2021-08-06 | 伦敦大学国王学院 | 向胃肠系统递送酬载的btnl3/8导引构建体 |
JP2021528471A (ja) * | 2018-06-26 | 2021-10-21 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | Adam9を標的とする免疫コンジュゲート、及び、その使用の方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012112687A1 (en) * | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Immunogen, Inc. | Methods of preparation of conjugates |
US20130029900A1 (en) * | 2011-06-21 | 2013-01-31 | Immunogen, Inc. | Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof |
CN103717262A (zh) * | 2011-03-29 | 2014-04-09 | 伊缪诺金公司 | 通过一步法制备类美登素抗体缀合物 |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4307016A (en) | 1978-03-24 | 1981-12-22 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Demethyl maytansinoids |
US4256746A (en) | 1978-11-14 | 1981-03-17 | Takeda Chemical Industries | Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use |
JPS55102583A (en) | 1979-01-31 | 1980-08-05 | Takeda Chem Ind Ltd | 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound |
JPS55162791A (en) | 1979-06-05 | 1980-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic c-15003pnd and its preparation |
JPS5645483A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | C-15003phm and its preparation |
EP0028683A1 (en) | 1979-09-21 | 1981-05-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotic C-15003 PHO and production thereof |
JPS5645485A (en) | 1979-09-21 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Production of c-15003pnd |
WO1982001188A1 (en) | 1980-10-08 | 1982-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same |
US4450254A (en) | 1980-11-03 | 1984-05-22 | Standard Oil Company | Impact improvement of high nitrile resins |
US4315929A (en) | 1981-01-27 | 1982-02-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method of controlling the European corn borer with trewiasine |
US4313946A (en) | 1981-01-27 | 1982-02-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora |
JPS57192389A (en) | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Takeda Chem Ind Ltd | Novel maytansinoid |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
SE9102074D0 (sv) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Kabi Pharmacia Ab | Tomour antigen specific antibody |
ES2227512T3 (es) | 1991-12-02 | 2005-04-01 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. |
CA2076465C (en) | 1992-03-25 | 2002-11-26 | Ravi V. J. Chari | Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065 |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
IL111748A0 (en) | 1993-12-03 | 1995-01-24 | Zeneca Ltd | Proteins |
US6265150B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-07-24 | Becton Dickinson & Company | Phage antibodies |
US5714352A (en) | 1996-03-20 | 1998-02-03 | Xenotech Incorporated | Directed switch-mediated DNA recombination |
US5958872A (en) | 1996-04-01 | 1999-09-28 | Apoptosis Technology, Inc. | Active survival domains of IGF-IR and methods of use |
CA2297070A1 (en) | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Morphosys Ag | Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex |
TW593241B (en) | 1999-04-20 | 2004-06-21 | Hoffmann La Roche | Carbamic acid derivatives |
WO2001058479A1 (en) | 2000-02-08 | 2001-08-16 | The Penn State Research Foundation | Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2 |
US6596503B1 (en) | 2000-08-18 | 2003-07-22 | East Carolina University | Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof |
US6333410B1 (en) | 2000-08-18 | 2001-12-25 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
HUP0302525A2 (hu) | 2001-01-05 | 2003-10-28 | Abgenix, Inc. | Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok |
US20050276812A1 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
AU2003285878B2 (en) | 2002-11-07 | 2011-04-28 | Immunogen, Inc. | Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same |
AU2004259398A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-02-03 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof |
US20060045877A1 (en) | 2004-08-30 | 2006-03-02 | Goldmakher Viktor S | Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof |
EP1817341A2 (en) | 2004-11-29 | 2007-08-15 | Seattle Genetics, Inc. | Engineered antibodies and immunoconjugates |
EA013323B1 (ru) | 2004-12-09 | 2010-04-30 | Сентокор, Инк. | Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения |
CA2600929A1 (en) | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues |
EP1914242A1 (en) | 2006-10-19 | 2008-04-23 | Sanofi-Aventis | Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer |
AU2010215761B2 (en) | 2009-02-23 | 2017-04-06 | Cytomx Therapeutics, Inc | Proproteins and methods of use thereof |
AR076284A1 (es) | 2009-04-29 | 2011-06-01 | Bayer Schering Pharma Ag | Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos |
AR078470A1 (es) | 2009-10-02 | 2011-11-09 | Sanofi Aventis | Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2 |
AR078471A1 (es) | 2009-10-02 | 2011-11-09 | Sanofi Aventis | COMPUESTOS MAITANSINOIDES Y EL USO DE ESTOS PARA PREPARAR CONJUGADOS CON UN ANTICUERPO LOS CUALES SE UTILIZAN COMO AGENTES ANTICANCERIGENOS Y EL PROCEDIMIENTO DE PREPARACIoN DE ESTOS CONJUGADOS |
SG10201501342UA (en) | 2010-02-24 | 2015-04-29 | Immunogen Inc | Folate receptor 1 antibodies and immunoconjugates and uses thereof |
MX338932B (es) | 2010-03-12 | 2016-05-06 | Immunogen Inc | Moleculas de union cd37 y sus inmunoconjugados. |
WO2012019024A2 (en) | 2010-08-04 | 2012-02-09 | Immunogen, Inc. | Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof |
BR112013010853A2 (pt) | 2010-11-03 | 2016-08-16 | Immunogen Inc | "agentes citotóxicos compreendendo derivados de ansamitocina, composição farmacêutica e uso destes" |
US9260483B2 (en) | 2011-01-10 | 2016-02-16 | Technische Universität München | Triazacyclononane-based phosphinate ligand and its use for molecular imaging |
US9498532B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-22 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
-
2017
- 2017-02-03 EP EP17707135.4A patent/EP3411077A1/en not_active Withdrawn
- 2017-02-03 WO PCT/US2017/016344 patent/WO2017136623A1/en active Application Filing
- 2017-02-03 RU RU2018130108A patent/RU2018130108A/ru not_active Application Discontinuation
- 2017-02-03 US US16/075,263 patent/US20210299265A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-03 TW TW106103674A patent/TW201731532A/zh unknown
- 2017-02-03 SG SG11201806478PA patent/SG11201806478PA/en unknown
- 2017-02-03 AU AU2017213858A patent/AU2017213858A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-03 CN CN201780009779.5A patent/CN108601848A/zh active Pending
- 2017-02-03 KR KR1020187025528A patent/KR20180105233A/ko unknown
- 2017-02-03 MA MA047022A patent/MA47022A/fr unknown
- 2017-02-03 JP JP2018540718A patent/JP2019510741A/ja active Pending
- 2017-02-03 CA CA3013125A patent/CA3013125A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012112687A1 (en) * | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Immunogen, Inc. | Methods of preparation of conjugates |
CN103687623A (zh) * | 2011-02-15 | 2014-03-26 | 伊缪诺金公司 | 细胞毒性苯并二氮杂*衍生物 |
US20140088089A1 (en) * | 2011-02-15 | 2014-03-27 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives and methods of preparation |
CN103717262A (zh) * | 2011-03-29 | 2014-04-09 | 伊缪诺金公司 | 通过一步法制备类美登素抗体缀合物 |
US20130029900A1 (en) * | 2011-06-21 | 2013-01-31 | Immunogen, Inc. | Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017136623A8 (en) | 2017-10-12 |
US20210299265A1 (en) | 2021-09-30 |
EP3411077A1 (en) | 2018-12-12 |
AU2017213858A1 (en) | 2018-08-16 |
JP2019510741A (ja) | 2019-04-18 |
KR20180105233A (ko) | 2018-09-27 |
RU2018130108A (ru) | 2020-03-06 |
SG11201806478PA (en) | 2018-08-30 |
TW201731532A (zh) | 2017-09-16 |
MA47022A (fr) | 2018-12-12 |
CA3013125A1 (en) | 2017-08-10 |
WO2017136623A1 (en) | 2017-08-10 |
RU2018130108A3 (zh) | 2020-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103717262B (zh) | 通过一步法制备类美登素抗体缀合物 | |
AU2016276751B2 (en) | CD123 antibodies and conjugates thereof | |
CN106573074B (zh) | 生物活性分子偶联物、试剂和制备方法及其治疗用途 | |
CN103619357A (zh) | 用于制造具有改善的同质性的缀合物的方法 | |
CN108601848A (zh) | 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法 | |
CN109200290A (zh) | 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物 | |
JP2015504869A (ja) | 複合体安定性を改善するためのn−ヒドロキシスクシンイミドの使用 | |
CN114222756A (zh) | 双互补位FR-α抗体和免疫缀合物 | |
KR20220041851A (ko) | 접합을 위한 폴리펩티드 복합체 및 이의 용도 | |
CN105208876A (zh) | 离子交换膜的从细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中去除杂质的用途 | |
US20200101168A1 (en) | Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180928 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |