CN103619357A - 用于制造具有改善的同质性的缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制造具有改善的同质性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包括在较低温度下进行修饰反应。本发明方法包括在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的混合物。

Description

用于制造具有改善的同质性的缀合物的方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年3月29日提交的美国临时专利申请号61/468,997和2011年3月29日提交的美国临时专利申请号61/468,981的权益，所述临时专利申请以其全文引用的方式并入本文中。
发明背景
适用于治疗癌症和其他疾病的抗体-药物-缀合物（Antibody-Drug-Conjugate，ADC）通常由三种不同的要素构成：细胞结合剂；连接子；以及细胞毒性剂。通常所用的制造方法包括修饰步骤，其中细胞结合剂与双官能连接子在室温（约20℃）或高于室温下反应以形成共价连接于具有反应性基团的连接子的细胞结合剂；和结合步骤，其中经过修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应以形成从连接子（使用反应性基团）到细胞毒性剂的共价化学键。
优化修饰步骤(细胞结合剂与连接子的反应)需要使连接子与细胞结合剂的反应最大化并且使连接子上的反应性基团与（例如）水和细胞结合剂上的反应性基团的副反应最小化。当连接子上的反应性基团是极具反应性的官能团，如马来酰亚胺时，这些副反应尤其成问题。所述副反应可能产生不合需要的反应产物，如自身交联的细胞结合剂，以及具有不能与细胞毒性剂反应的连接子的细胞结合剂。
鉴于前述内容，本领域中需要开发一种制备结合有连接子的细胞结合剂的改进方法，它产生高产量的所需种类的结合有连接子的细胞结合剂并且与大规模的制造方法相容。本发明提供了这种方法。本发明的这些和其他优势以及额外的本发明特征将从本文所提供的本发明描述中显而易见。
发明概要
本发明提供一种制备结合有连接子的细胞结合剂的方法，所述方法包括在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的混合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物；（b）对第一混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合并且从而制备结合有连接子的细胞结合剂的经过纯化的第一混合物；（c）通过在pH值为约4到约9的溶液中使结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于经过纯化的第一混合物中的结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及（d）对第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从第二混合物的其他组分中纯化经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
本发明的另一个实施方案提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物；（b）通过在pH值为约4到约9的溶液中使结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于第一混合物中的结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及（c）对第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从第二混合物的其他组分中纯化经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
本发明还包括一种包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物，它根据本文所描述的方法来制备。
发明详述
本领域技术人员应了解，包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂（如抗体）的缀合物（“抗体-细胞毒性剂缀合物”）通常通过在室温（即，约20℃或高于20℃）下用双官能交联剂修饰抗体，纯化结合有连接子的抗体，使细胞毒性剂结合于结合有连接子的抗体，并且纯化抗体-细胞毒性剂缀合物来制备。本发明通过优化修饰步骤以使连接子与细胞结合剂的反应最大化并且使不合需要的副反应最小化来对所述方法加以改进。具体来说，令人惊讶地发现在较低温度（例如，约15℃或更低温度）下进行修饰反应（细胞结合剂与连接子的反应）延长了在所需种类的结合有连接子的细胞结合剂的水平达到最大期间并且在显著水平的不合需要的反应产物形成之前的时间间隔，从而使得所述方法适合于大规模制造。因此，本发明提供了制造具有改善的同质性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包含在较低温度下进行修饰反应。
本发明提供一种制备结合有连接子的细胞结合剂的方法，所述方法包括在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的混合物。举例来说，本发明方法包括在约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃或约0℃、约-1℃、约-2℃、约-3℃、约-4℃、约-5℃、约-6℃、约-7℃、约-8℃、约-9℃或约-10℃的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触，其条件为（例如）通过存在用于溶解双官能交联剂的有机溶剂而防止溶液冻结。在一个实施方案中，本发明方法包括在约-10℃到约15℃、约0℃到约15℃、约0℃到约10℃、约0℃到约5℃、约5℃到约15℃、约10℃到约15℃或约5℃到约10℃的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触。在另一个实施方案中，本发明方法包括在约10℃的温度（例如，8℃到12℃的温度或9℃到11℃的温度）下使细胞结合剂与双官能交联剂接触。
在一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.5或更高的溶液中使细胞结合剂与双官能交联剂接触。举例来说，本发明方法包括在pH值为约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的溶液中使细胞结合剂与双官能交联剂接触。在一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.5到约9.0、约7.5到约8.5、约7.5到约8.0、约8.0到约9.0或约8.5到约9.0的溶液中使细胞结合剂与双官能交联剂接触。在另一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.8（例如，pH值为7.6到8.0或pH值为7.7到7.9）的溶液中使细胞结合剂与双官能交联剂接触。可以使用任何适合的缓冲剂。适合的缓冲剂包括（例如）柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。在一个优选实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
在一个实施方案中，本发明方法包括在具有高pH值（例如，约7.5或更高）的溶液中于低温（例如，约15℃或更低温度）下使细胞结合剂与双官能交联剂接触。在一个优选实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.8的溶液中于约10℃的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触。在另一个优选实施方案中，本发明方法包括在pH值为约8.5的溶液中于约0℃的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触。
根据本发明方法，使细胞结合剂与双官能交联剂接触会产生包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物，以及反应物和其他副产物。在本发明的一些实施方案中，第一混合物包含稳定地和不稳定地结合有连接子的细胞结合剂，以及反应物和其他副产物。当连接子与细胞结合剂之间的共价键在正常存储条件下经过一定时间段不会实质上变弱或断裂时，连接子就“稳定地”结合于细胞结合剂，所述时间段可以在几个月到几年的范围内。相比之下，当连接子与细胞结合剂之间的共价键在正常存储条件下经过一定时间段实质上变弱或断裂时，连接子就“不稳定地”结合于细胞结合剂，所述时间段可以在几个月到几年的范围内。
在本发明的一个实施方案中，从反应物和副产物中纯化经过修饰的细胞结合剂通过对第一混合物进行纯化工艺来进行。就这一点而言，可以使用切向流过滤（tangential flow filtration，TFF）（例如基于膜的切向流过滤工艺）、非吸附性色谱、吸附性色谱、吸附性过滤或选择性沉淀，或任何其他适合的纯化工艺，以及其组合来纯化第一混合物。这个第一纯化步骤提供经过纯化的第一混合物，即，与根据本发明纯化之前的第一混合物相比，结合有连接子的细胞结合剂的浓度增加和未结合的双官能交联剂的量减少。优选地，使用切向流过滤来纯化第一混合物。
在纯化第一混合物以获得结合有连接子的细胞结合剂的经过纯化的第一混合物之后，通过在pH值为约4到约9的溶液中使结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于经过纯化的第一混合物中的结合有连接子的细胞结合剂，其中产生包含以下的第二混合物：（i）经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物。
任选地，可以省略经过修饰的细胞结合剂的纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，不对包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物以及反应物和其他副产物进行纯化工艺。在这种情况下，细胞毒性剂可以与交联剂同时加入或在某个较后的时间点加入，例如在将交联剂加入到细胞结合剂中之后1、2、3小时或超过3小时的时间点加入。通过在pH值为约4到约9的溶液中使经过修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使经过修饰的细胞结合剂结合于细胞毒性剂（例如类美登素（maytansinoid）），其中结合步骤会形成稳定的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、不稳定的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、未结合的细胞毒性剂（即，“游离”细胞毒性剂）、反应物以及副产物的混合物。
结合反应优选地在约4到约pH9的pH值（例如，约4.5到约8.5、约5到约8、约5.5到约7.5或约6.0到约7的pH值）下进行。在一些实施方案中，结合反应在约6到约6.5的pH值（例如，5.5到7的pH值、5.7到6.8的pH值、5.8到6.7的pH值、5.9到6.6的pH值或6到6.5的pH值）下、约6或低于6的pH值（例如，约4到6、约4到约5.5、约5到6的pH值)下，或约6.5或更高的pH值（例如，6.5到约9、约7到约9、约7.5到约9或6.5到约8的pH值）下进行。在一个实施方案中，结合反应在约4的pH值到小于6的pH值下或在高于6.5到9的pH值下进行。当结合步骤在约6.5或更高的pH值下进行时，一些含巯基的细胞毒性剂可能倾向于通过形成二硫键而发生二聚。在一个实施方案中，可能需要从反应混合物中去除痕量金属和/或氧，以及任选地加入抗氧化剂或使用具有更具反应性的离去基的连接子，或以多于一个等分试样加入细胞毒性剂，以允许在这种情况下有效地反应。
本发明方法可以任选地包括将蔗糖加入到本发明方法中所用的结合步骤中以增加细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的溶解度和回收率。理想地，蔗糖以约0.1%（重量/体积）到约20%（重量/体积）（例如，约0.1%（重量/体积）、1%（重量/体积）、5%（重量/体积）、10%（重量/体积）、15%（重量/体积）或20%（重量/体积））的浓度加入。优选地，蔗糖以约1%（重量/体积）到约10%（重量/体积）（例如，约0.5%（重量/体积）、约1%（重量/体积）、约1.5%（重量/体积）、约2%（重量/体积）、约3%（重量/体积）、约4%（重量/体积）、约5%（重量/体积）、约6%（重量/体积）、约7%（重量/体积）、约8%（重量/体积）、约9%（重量/体积）、约10%（重量/体积）或约11%（重量/体积））的浓度加入。另外，结合反应还可以包含加入缓冲剂。可以使用本领域中已知的任何适合的缓冲剂。适合的缓冲剂包括例如柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。在一个优选实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
在结合步骤之后，对缀合物进行纯化步骤。就这一点而言，可以使用切向流过滤（TFF）（例如基于膜的切向流过滤工艺）、非吸附性色谱、吸附性色谱、吸附性过滤或选择性沉淀，或任何其他适合的纯化工艺，以及其组合来纯化结合混合物。本领域技术人员应了解，在结合步骤之后的纯化能够分离包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括在修饰步骤之后的第一纯化步骤和在结合步骤之后的第二纯化步骤。举例来说，本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物；（b）对第一混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合并且从而制备结合有连接子的细胞结合剂的经过纯化的第一混合物；（c）通过在pH值为约4到约9的溶液中使结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于经过纯化的第一混合物中的结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及（d）对第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从第二混合物的其他组分中纯化经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
在本发明的一个实施方案中，在纯化步骤中利用切向流过滤（TFF，也称为交叉流过滤、超滤以及透滤）和/或吸附性色谱树脂。举例来说，本发明方法可以包含在修饰步骤之后使用TFF的第一纯化步骤和在结合步骤之后使用TFF的第二纯化步骤。或者，本发明方法可以包含在修饰步骤之后使用吸附性色谱的第一纯化步骤和在结合步骤之后使用吸附性色谱的第二纯化步骤。本发明方法还可以包含在修饰步骤之后使用吸附性色谱的第一纯化步骤和在结合步骤之后使用TFF的第二纯化步骤，或在修饰步骤之后使用TFF的第一纯化步骤和在结合步骤之后使用吸附性色谱的第二纯化步骤。
在本发明的一个实施方案中，将非吸附性色谱用作纯化步骤。举例来说，本发明方法可以包含在修饰步骤之后使用非吸附性色谱的第一纯化步骤和在结合步骤之后使用非吸附性色谱的第二纯化步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括在结合步骤之后的单一纯化步骤。举例来说，本发明方法可以包含一种制备缀合物的方法，其中在修饰步骤之后不对混合物进行纯化。在这方面，本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物；（b）通过在pH值为约4到约9的溶液中使结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于第一混合物中的结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及（c）对第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从第二混合物的其他组分中纯化经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经连接子化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
在本发明的一个实施方案中，本发明方法在结合步骤之后包含两个独立的纯化步骤。
任何适合的TFF系统都可以用于纯化，包括Pellicon型系统（Millipore,Billerica,MA）、Sartocon Cassette系统（Sartorius AG,Edgewood,NY）以及Centrasette型系统（Pall Corp.,East Hills,NY）。
任何适合的吸附性色谱树脂都可以用于纯化。优选的吸附性色谱树脂包括羟磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱（hydrophobic chargeinduction chromatography，HCIC）、疏水性相互作用色谱（hydrophobicinteraction chromatography，HIC）、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱（immobilized metal affinitychromatography，IMAC）、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及其组合。适合的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石（I型和II型CHT；Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、HA Ultrogel羟磷灰石（Pall Corp.,East Hills,NY）以及陶瓷氟磷灰石（I型和II型CFT；Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）。适合的HCIC树脂的一个实例为MEP Hypercel树脂（Pall Corp.,East Hills,NY）。适合的HIC树脂的实例包括丁基-琼脂糖、己基-琼脂糖、苯基-琼脂糖以及辛基琼脂糖树脂（全部来自GE Healthcare,Piscataway,NJ），以及Macro-prep甲基和Macro-Prep叔丁基树脂（Biorad Laboratories,Hercules,CA）。适合的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖、CM-琼脂糖以及Q-琼脂糖树脂（全部来自GE Healthcare,Piscataway,NJ），和Unosphere S树脂（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）。适合的混合模式离子交换剂的实例包括Bakerbond ABx树脂（JT Baker,Phillipsburg NJ）。适合的IMAC树脂的实例包括螯合琼脂糖树脂（GE Healthcare,Piscataway,NJ）和Profinity IMAC树脂（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）。适合的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ）和亲和蓝胶树脂（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）。适合的亲和树脂的实例包括蛋白质A琼脂糖树脂（例如MabSelect,GE Healthcare,Piscataway,NJ），其中细胞结合剂为抗体；和凝集素亲和树脂，例如扁豆凝集素琼脂糖树脂（GE Healthcare,Piscataway,NJ），其中细胞结合剂带有适当的凝集素结合位点。或者，可以使用对细胞结合剂具有特异性的抗体。这种抗体可以被固定于（例如）琼脂糖4快速流动树脂（GE Healthcare,Piscataway,NJ）。适合的反相树脂的实例包括C4、C8以及C18树脂（Grace Vydac,Hesperia,CA）。
任何适合的非吸附性色谱树脂都可以用于纯化。适合的非吸附性色谱树脂的实例包括（但不限于）SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂（例如S-200和S-300）、SUPERDEXTM树脂（例如SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200）、
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树脂（例如P-6、P-10、P-30、P-60以及P-100），以及本领域技术人员已知的其他树脂。
在一个实施方案中，本发明方法进一步包含保持步骤以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子。保持步骤包含在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后，在使细胞毒性剂结合于结合有连接子的细胞结合剂之后，和/或在纯化步骤之后保持混合物。
保持步骤包含将溶液在适合的温度（例如，约2℃到约37℃）下维持适合的时间段（例如，约1小时到约1周）以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子，而不会从细胞结合剂中实质上释放稳定结合的连接子。在一个实施方案中，保持步骤包含将溶液维持于低温（例如，约2℃到约10℃或约4℃）下、室温（例如，约20℃到约30℃或约20℃到约25℃）下或高温（例如，约30℃到约37℃）下。
保持步骤的持续时间取决于进行保持步骤所处的温度。举例来说，保持步骤的持续时间可以实质上通过在高温下进行保持步骤而缩短，其中最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性限制。保持步骤可以包含将溶液维持约1小时到约1天（例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时)、约5小时到约1周、约12小时到约1周（例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天）、约12小时到约1周（例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天），或约1天到约1周。
在一个实施方案中，保持步骤包含将溶液在约2℃到约8℃的温度下维持至少约12小时、至多1天的时段。
保持步骤的pH值优选地为约4到约10。在一个实施方案中，保持步骤的pH值为约4或更大，但小于约6（例如，4到5.9）；或者为约5或更大，但小于约6（例如，5到5.9）。在另一个实施方案中，保持步骤的pH值在约6到约10（例如，约6.5到约9、约6到约8）的范围内。举例来说，保持步骤的pH值可以为约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。
保持步骤可以在细胞结合剂结合于细胞毒性剂之前或之后进行。在一个实施方案中，保持步骤紧接在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后进行。举例来说，本发明方法在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后并且在结合之前包含保持步骤。在修饰细胞结合剂之后，可以在保持步骤之前和/或在保持步骤之后，但在结合步骤之前进行纯化步骤。在另一个实施方案中，保持步骤紧接在细胞毒性剂结合于结合有连接子的细胞结合剂之后并且在纯化步骤之前进行。在另一个实施方案中，保持步骤在结合和纯化步骤之后进行并且之后进行额外的纯化步骤。
在具体实施方案中，保持步骤可以包含在4℃下于约6-7.5的pH值下孵育混合物约12小时到约1周，在25℃下于约6-7.5的pH值下孵育混合物约12小时到约1周，在4℃下于约4.5-5.9的pH值下孵育混合物约5小时到约5天，或在25℃下于约4.5-5.9的pH值下孵育混合物约5小时到约1天。
本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组合物的方法，其中所述组合物实质上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供一种制备实质上高纯度和高稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法。所述组合物由于缀合物的高纯度和高稳定性而可以用于治疗疾病。包含化学偶合于细胞毒性剂（如类美登素）的细胞结合剂（如抗体）的组合物描述于（例如）美国专利7,374,762中。在本发明的一个方面，实质上高纯度的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有一个或多个下列特征：（a）大于约90%（例如，大于或等于约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）、优选地大于约95%的缀合物种类为单体；（b）缀合物制剂中未结合的连接子的水平小于约10%（例如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%）（相对于总连接子）；（c）小于10%的缀合物种类经过交联（例如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%）；（d）缀合物制剂中的游离细胞毒性剂的水平小于约2%（例如，小于或等于约1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或0%）（相对于总细胞毒性剂）；和/或（e）存储后（例如，约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年或约5年后）游离细胞毒性剂的水平没有实质性增加。游离细胞毒性剂水平的“实质性增加”意味着在一定存储时间之后，游离细胞毒性剂水平的增幅小于约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.1%、约1.2%、约1.3%、约1.4%、约1.5%、约1.6%、约1.7%、约1.8%、约1.9%、约2.0%、约2.2%、约2.5%、约2.7%、约3.0%、约3.2%、约3.5%、约3.7%或约4.0%。
如本文中所用的术语“未结合的连接子”是指与双官能交联剂共价连接的细胞结合剂，其中细胞结合剂并未经双官能交联剂的连接子共价偶合于细胞毒性剂（即，“未结合的连接子”可以由CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂）。
在一个实施方案中，细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物中细胞毒性剂与细胞结合剂的平均摩尔比为约1到约10、约2到约7、约3到约5、约2.5到约4.5（例如，约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5）、约3.0到约4.0、约3.2到约4.2、约4.5到5.5（例如，约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5）。
细胞结合剂可以是结合于细胞，通常并且优选地为动物细胞（例如人类细胞）的任何适合的试剂。细胞结合剂优选地为肽或多肽或糖链（glycotope）。适合的细胞结合剂包括（例如）抗体（例如，单克隆抗体和其片段）、干扰素（例如，α、β、γ）、淋巴因子（例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-6）、激素（例如，胰岛素、TRH（促甲状腺素释放激素，thyrotropin releasing hormone）、MSH（黑素细胞刺激激素，melanocyte-stimulating hormone）、类固醇激素（如雄激素和雌激素））、生长因子和集落刺激因子（如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF（Burgess,Immunology Today5:155-158(1984)））、营养素转运分子（例如转铁蛋白）、维生素（例如叶酸），以及特异性地结合细胞表面上的靶分子的任何其他试剂或分子。
在细胞结合剂为抗体的情况下，它结合于一种抗原，所述抗原为多肽并且可以是跨膜分子（例如受体）或配体，如生长因子。示范性的抗原包括分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降血钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子vmc、因子IX、组织因子（tissue factor，TF）以及冯·维勒布兰德因子（vonWillebrands factor）；抗凝血因子，如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人类尿液型或组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）；铃蟾素（bombesin）；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶（enkephalinase）；RANTES（正常T细胞表达和分泌的调节性激活因子，regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted）；人巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1-α）；血清白蛋白，如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质（Muellerian-inhibiting substance）；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶（DNase）；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原（cytotoxicT-lymphocyte associated antigen，CTLA），如CTLA-4；抑制素（inhibin）；激活素（activin）；血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子（bone-derivedneurotrophic factor，BDNF）、神经营养素（neurotrophin）-3、神经营养素-4、神经营养素-5或神经营养素-6（NT-3、NT4、NT-5或NT-6），或神经生长因子，如NGF-β；血小板源性生长因子（platelet-derivedgrowth factor，PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子（EGF）；转化生长因子（TGF），如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II（IGF-I和IGF-II）；脱(1-3)-IGF-I（脑IGF-I）、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLR1、间皮素（mesothelin）、畸胎瘤衍化生长因子（cripto）、αvβ6、整合素（integrin）、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白质，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152，或结合于一个或多个肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体，其披露于美国专利申请公开号2008/0171040或美国专利申请公开号2008/0305044中并且以其全文引用的方式并入；促红细胞生成素(erythropoietin)；骨生成诱导因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子（CSF），例如M-CSF、GM-CSF以及G-CSF；白介素（interleukin，IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如一部分HIV包膜；转运蛋白；归巢受体（homing receptor）；地址素（addressin）；调节蛋白；整合素，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4以及VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；内皮因子（endoglin）、c-Met、IGF1R、前列腺抗原（如PCA3、PSA）、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2以及STEAP1；LGR5、B7H4，以及上文所列多肽中的任一种的片段。
另外，结合于骨髓细胞的GM-CSF可以用作针对来自急性骨髓性白血病的病变细胞的细胞结合剂。结合于经过激活的T细胞的IL-2可以用于预防移植排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主疾病，并且用于治疗急性T细胞白血病。结合于黑素细胞的MSH可以用于治疗黑素瘤，针对黑素瘤的抗体同样可以。叶酸可以用于靶向在卵巢肿瘤和其他肿瘤上表达的叶酸受体。表皮生长因子可以用于靶向鳞癌，如肺和头颈的鳞癌。生长抑素（somatostatin）可以用于靶向成神经细胞瘤和其他肿瘤类型。
乳腺癌和睾丸癌可以用分别作为细胞结合剂的雌激素（或雌激素类似物）或雄激素（或雄激素类似物）成功地靶向。
如本文中所用的术语“抗体”是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段（如Fab、Fab'、F(ab')2、dsFv、sFv）、微型抗体（minibody）、双功能抗体（diabody）、三功能抗体（tribody）、四功能抗体（tetrabody）（Parham,J.Immunol.131:2895-2902(1983)；Spring等人J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff等人Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960)；Kim等人,Mol,Cancer Ther.,7:2486-2497(2008)；Carter,Nature Revs.,6:343-357(2006)），或可以结合于细胞表面上的抗原的免疫球蛋白嵌合体（例如，其含有互补决定区（complementaritydetermining region，CDR））。任何适合的抗体都可以用作细胞结合剂。本领域技术人员应了解，适当抗体的选择将取决于有待靶向的细胞群体。就这一点而言，选择性地在特定细胞群体（通常并且优选地为病变细胞群体）中表达的细胞表面分子（即，抗原）的类型和数目将主导用于本发明组合物中的适当抗体的选择。细胞表面表达谱对于众多细胞类型（包括肿瘤细胞类型）来说是已知的，或者，如果未知的话，那么可以使用常规分子生物学和组织化学技术来测定。
抗体可以是多克隆或单克隆的，但最优选地是单克隆抗体。如本文中所用的“多克隆”抗体是指在经过免疫的动物的血清中通常所含的抗体分子的异质群体。“单克隆”抗体是指对特定抗原具有特异性的抗体分子的同质群体。单克隆抗体通常由B淋巴细胞（“B细胞”）的单一无性系产生。单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的多种技术来获得，包括标准杂交瘤技术（参看例如
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和Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511-519(1976)；Harlow和Lane(编),Antibodies:ALaboratory Manual,CSH Press(1988)；以及C.A.Janeway等人(编),Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York,NY(2001)）。简单地说，产生单克隆抗体的杂交瘤方法通常涉及用抗原（即，“免疫原”）注射任何适合的动物，通常并且优选地为小鼠。随后处死动物，并且使从它的脾中分离出的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。产生杂交细胞（即，“杂交瘤”），其无限增殖并且不断分泌高效价的在体外具有所需特异性的抗体。本领域中已知的任何适当方法都可以用于鉴别产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤细胞。所述方法包括（例如）酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白质印迹分析（Western blot analysis）以及放射免疫分析法（radioimmunoassay）。筛选杂交瘤的群体以分离出个别的无性系，每个无性系分泌针对抗原的单一抗体种类。因为每个杂交瘤是衍生自与单一B细胞融合的无性系，所以它产生的所有抗体分子在结构方面都相同，包括这些抗体分子的抗原结合位点和同型。单克隆抗体还可以使用其他适合的技术来产生，包括EBV-杂交瘤技术（参看例如Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2):361-67(1984)；以及Roder等人,Methods Enzymol.,121:140-67(1986)）、噬菌体载体表达系统（参看例如Huse等人,Science,246:1275-81(1989)），或包含抗体片段（如Fab和scFv（单链可变区））的噬菌体呈现文库（参看例如美国专利5,885,793和5,969,108；以及国际专利申请公开WO92/01047和WO99/06587）。
单克隆抗体可以从任何适合的动物中分离出或在任何适合的动物中产生，但优选地在哺乳动物中、更优选地在小鼠或人类中并且最优选地在人类中产生。在小鼠中产生抗体的方法为本领域技术人员所熟知并且描述于本文中。关于人类抗体，本领域技术人员应了解，多克隆抗体可以从经过适当抗原接种或免疫的人类受试者的血清中分离出。或者，人类抗体可以通过修改用于在非人类动物（如小鼠）中产生人类抗体的已知技术来产生（参看例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352；以及美国专利申请公开号2002/0197266A1）。
虽然理想的选择是用于在人类中进行治疗性应用，但人类抗体、特别是人类单克隆抗体，通常比小鼠单克隆抗体更难产生。然而，小鼠单克隆抗体在给予人类时诱导快速宿主抗体反应，这可能会降低抗体-细胞毒性剂缀合物的治疗或诊断潜力。为了避免这些并发状况（complication），单克隆抗体优选地不会被人类免疫系统识别成“外来的”。
为此，可以使用噬菌体呈现来产生抗体。就这一点而言，编码抗体的抗原结合可变（V）域的噬菌体文库可以使用标准分子生物学和重组DNA技术来产生（参看例如Sambrook等人(编),MolecularCloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(2001)）。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于特异性地结合于所需抗原，并且重构包含所选可变域的完全人类抗体。将编码经过重构的抗体的核酸序列引入到适合的细胞系（如用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞）中，使得具有单克隆抗体特征的人类抗体由细胞分泌出（参看例如Janeway等人,同上；Huse等人,同上；以及美国专利6,265,150）。或者，单克隆抗体可以从对于特异性人类重链和轻链免疫球蛋白基因来说是转基因的小鼠中产生。所述方法在本领域中是已知的并且描述于（例如）美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等人,同上中。
抗体最优选地是人源化抗体。如本文中所用的“人源化”抗体是如下抗体：其中小鼠单克隆抗体的互补决定区（CDR）（它们形成抗体的抗原结合环）接枝到人类抗体分子的构架上。由于小鼠和人类抗体的构架的相似性，因此本领域中一般公认这种方法产生与人类抗体的抗原性一致，但与CDR序列所来源的小鼠单克隆抗体结合相同抗原的单克隆抗体。产生人源化抗体的方法在本领域中是众所周知的并且详细描述于（例如）Janeway等人,同上；美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761；欧洲专利号0239400B1；以及英国专利号2188638中。人源化抗体还可以使用美国专利5,639,641和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235:959-973(1994)中所描述的抗体表面重塑技术来产生。虽然本发明组合物的缀合物中所采用的抗体最优选地是人源化单克隆抗体，但如上文所描述的人类单克隆抗体和小鼠单克隆抗体也在本发明的范围内。
具有至少一个抗原结合位点，并且因此识别并结合于靶细胞的表面上所存在的至少一个抗原或受体的抗体片段也在本发明的范围内。在这方面，完整抗体分子的蛋白酶剪切可以产生多种保留识别并结合抗原的能力的抗体片段。举例来说，用木瓜蛋白酶对抗体分子进行限制性消化通常产生三个片段，其中两个片段相同并且被称作Fab片段，因为它们保留了母抗体分子的抗原结合活性。用胃蛋白酶使抗体分子裂解通常产生两个抗体片段，其中一个片段保留了抗体分子的两个抗原结合臂，并且因此被称作F(ab')2片段。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab')2片段产生了被称作Fab'片段的片段。由包含经由合成肽连接于抗体轻链可变（V）域的抗体重链V域的截短的Fab片段组成的单链可变区片段（sFv）抗体片段可以使用常规重组DNA技术来产生（参看例如Janeway等人,同上）。类似地，经过二硫键稳定的可变区片段（dsFv）可以通过重组DNA技术来制备（参看例如Reiter等人,Protein Engineering,7:697-704(1994)）。然而，在本发明的背景下，抗体片段并不限于抗体片段的这些示范性的类型。可以采用识别并结合于所需细胞表面受体或抗原的任何适合的抗体片段。抗体片段进一步描述于（例如）Parham,J.Immunol.,131:2895-2902(1983)；Spring等人,J.Immunol.,113:470-478(1974)；以及Nisonoff等人,Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244(1960)中。抗体-抗原结合可以使用本领域中已知的任何适合的方法来分析，例如放射免疫分析法（RIA）、ELISA、蛋白质印迹法（Western blot）、免疫沉淀法以及竞争性抑制分析法（参看例如Janeway等人,同上；和美国专利申请公开号2002/0197266A1）。
另外，抗体可以是嵌合抗体或其抗原结合片段。“嵌合”意味着抗体包含至少两个免疫球蛋白或其片段，它们获自或衍生自至少两个不同种类（例如，两个不同免疫球蛋白，如与鼠类免疫球蛋白可变区组合的人类免疫球蛋白恒定区）。抗体还可以是域抗体（domainantibody，dAb）或其抗原结合片段，例如新型骆驼抗体（camelidantibody）（参看例如Desmyter等人,Nature Struct.Biol.,3:752,(1996)），或鲨鱼抗体（shark antibody），例如新抗原受体（IgNAR）（参看例如Greenberg等人,Nature,374:168(1995)；和Stanfield等人,Science,305:1770-1773(2004)）。
在本发明的背景下可以使用任何适合的抗体。举例来说，单克隆抗体J5是对急性成淋巴细胞性白血病共同抗原（Common AcuteLymphoblastic Leukemia Antigen，CALLA）具有特异性的鼠类IgG2a抗体（Ritz等人,Nature,283:583-585(1980)），并且可以用于靶向表达CALLA的细胞（例如，急性成淋巴细胞性白血病细胞）。单克隆抗体MY9是特异性地结合于CD33抗原的鼠类IgG1抗体（Griffin等人,Leukemia Res.,8:521(1984)），并且可以用于靶向表达CD33的细胞（例如，急性骨髓性白血病（AML）细胞）。
类似地，单克隆抗体抗B4（也称作B4）是结合于B细胞上的CD19抗原的鼠类IgG1抗体（Nadler等人,J.Immunol.,131:244-250(1983)），并且可以用于靶向B细胞或表达CD19的病变细胞（例如，非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）细胞和慢性成淋巴细胞性白血病细胞）。N901是结合于神经内分泌起源的细胞（包括小细胞肺肿瘤）上所见的CD56（神经细胞粘着分子）抗原的鼠类单克隆抗体，它可以用于缀合物中以使药物靶向神经内分泌起源的细胞。J5、MY9以及B4抗体优选地在它们用作缀合物的一部分之前经过表面重塑或人源化。抗体的表面重塑或人源化描述于（例如）Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-73(1994)中。
另外，单克隆抗体C242结合于CanAg抗原（参看例如美国专利5,552,293），并且可以用于使缀合物靶向表达CanAg的肿瘤，如结肠直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌以及胃癌。HuC242是单克隆抗体C242的人源化形式（参看例如美国专利5,552,293）。产生HuC242的杂交瘤以ECACC识别编号90012601保藏。HuC242可以使用CDR接枝法（参看例如美国专利5,585,089、5,693,761和5,693,762）或表面重塑技术（参看例如美国专利5,639,641）来制备。HuC242可以用于使缀合物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞，如结肠直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌以及胃癌细胞。
为了靶向卵巢癌和前列腺癌细胞，抗MUC1抗体可以用作缀合物中的细胞结合剂。抗MUC1抗体包括（例如）抗HMFG-2（参看例如Taylor-Papadimitriou等人,Int.J.Cancer,28:17-21(1981)）、hCTM01（参看例如van Hof等人,Cancer Res.,56:5179-5185(1996)）以及DS6。前列腺癌细胞也可以通过使用抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）作为细胞结合剂（如J591）而用缀合物靶向（参看例如Liu等人,Cancer Res.,57:3629-3634(1997)）。此外，表达Her2抗原的癌细胞，如乳腺癌、前列腺癌以及卵巢癌，可以通过使用抗HER2抗体（例如曲妥珠单抗（trastuzumab））作为细胞结合剂而用缀合物靶向。表达表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和其变体（如III型缺失突变体EGFRvIII）的细胞可以通过使用抗EGFR抗体而用缀合物靶向。抗EGFR抗体描述于国际专利申请号PCT/US11/058385和PCT/US11/058378中。抗EGFRvIII抗体描述于美国专利7,736,644和7,628,986以及美国专利申请公开2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中。结合于胰岛素样生长因子受体的抗IGF-IR抗体（如美国专利7,982,024中所描述的那些抗体）也可以用于缀合物中。结合于CD27L、畸胎瘤衍化生长因子、CD138、CD38、EphA2、整合素、CD37、叶酸、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、内皮因子以及Her3的抗体也可以用于缀合物中。
在一个实施方案中，抗体选自由以下组成的组：huN901；huMy9-6；huB4；huC242；抗HER2抗体（例如曲妥珠单抗）；比伐珠单抗（bivatuzumab）；昔洛珠单抗（sibrotuzumab）；利妥昔单抗（rituximab）；huDS6；国际专利申请公开WO2010/124797中所描述的抗间皮素抗体（如MF-T）；美国专利申请公开2010/0093980中所描述的抗畸胎瘤衍化生长因子抗体（如huB3F6）；美国专利申请公开2007/0183971中所描述的抗CD138抗体（如huB-B4）；国际专利申请号PCT/US11/058385和PCT/US11/058378中所描述的抗EGFR抗体（如EGFR-7）；美国专利7,736,644和7,628,986以及美国专利申请公开2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中所描述的抗EGFRvIII抗体；国际专利申请公开WO2011/039721和WO2011/039724中所描述的人源化EphA2抗体（如2H11R35R74）；国际专利申请公开WO2008/047242中所描述的抗CD38抗体（如hu38SB19）；国际专利申请公开WO2011/106528和美国专利申请公开2012/0009181中所描述的抗叶酸抗体（例如huMov19）；美国专利5,958,872、6,596,743和7,982,024中所描述的抗IGF1R抗体；美国专利申请公开2011/0256153中所描述的抗CD37抗体（例如huCD37-3）；美国专利申请公开2006/0127407中所描述的抗整合素αvβ6抗体（例如CNTO95）；以及国际专利申请公开WO2012/019024中所描述的抗Her3抗体。
特别优选的抗体是本文所描述的人源化单克隆抗体。实例包括（但不限于）huN901、huMy9-6、huB4、huC242、人源化单克隆抗Her2抗体（例如曲妥珠单抗）、比伐珠单抗、昔洛珠单抗、CNTO95、huDS6以及利妥昔单抗（参看例如美国专利5,639,641和5,665,357；美国临时专利申请号60/424,332（其与美国专利7,557,189相关）；国际（PCT）专利申请公开号WO02/16401；Pedersen等人,同上；Roguska等人,同上；Liu等人,同上；Nadler等人,同上；Colomer等人,Cancer Invest.,19:49-56(2001)；Heider等人,Eur.J.Cancer,31A:2385-2391(1995)；Welt等人,J.Clin.Oncol.,12:1193-1203(1994)；以及Maloney等人,Blood,90:2188-2195(1997)）。其他人源化单克隆抗体在本领域中是已知的并且可以与本发明相结合使用。
在一个实施方案中，细胞结合剂是特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗叶酸抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：（a）包含GYFMN的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY的重链CDR3；和（b）包含KASQSVSFAGTSLMH的轻链CDR1；包含RASNLEA的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H和R；Xaa2选自Q、H、N和R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A和V。优选地，重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG。
在另一个实施方案中，抗叶酸抗体是特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，它包含具有以下氨基酸序列的重链：QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
在另一个实施方案中，抗叶酸抗体是由2010年4月7日保藏于ATCC并且具有ATCC保藏编号PTA-10772和PTA-10773或10774的质粒DNA编码的人源化抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，抗叶酸抗体是人源化抗体或其抗原结合片段，它包含至少约90%、95%、99%或100%与QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS一致的重链可变域，和至少约90%、95%、99%或100%与DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR一致的轻链可变域。
虽然细胞结合剂优选地是抗体，但细胞结合剂也可以是非抗体分子。适合的非抗体分子包括（例如）干扰素（例如，α、β或γ干扰素）、淋巴因子（例如，白介素2（IL-2）、IL-3、IL-4或IL-6）、激素（例如，胰岛素)、生长因子（例如，EGF、TGF-α、FGF和VEGF）、集落刺激因子（例如，G-CSF、M-CSF和GM-CSF（参看例如Burgess,Immunology Today,5:155-158(1984)））、生长抑素以及转铁蛋白（参看例如O'Keefe等人,J.Biol.Chem.,260:932-937(1985)）。举例来说，结合于骨髓细胞的GM-CSF可以用作细胞结合剂以靶向急性骨髓性白血病细胞。另外，结合于经过激活的T细胞的IL-2可以用于预防移植排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主疾病，并且用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子（EGF）可以用于靶向鳞癌，如肺癌和头颈癌。生长抑素可以用于靶向成神经细胞瘤细胞和其他肿瘤细胞类型。
缀合物可以包含任何适合的细胞毒性剂。如本文中所用的“细胞毒性剂”是指引起细胞死亡，诱导细胞死亡，或降低细胞活力的任何化合物。适合的细胞毒性剂包括（例如）类美登素和可结合的安丝菌素（ansamitocin）（参看例如2011年11月3日提交的PCT/US11/059131）、类紫杉烷（taxoid）、CC-1065和CC-1065类似物，以及尾海兔素（dolastatin）和尾海兔素类似物。在本发明的一个优选实施方案中，细胞毒性剂是类美登素，包括美登醇（maytansinol）和美登醇类似物。类美登素是抑制微管形成并且对哺乳动物细胞极具毒性的化合物。适合的美登醇类似物的实例包括具有经过修饰的芳香环的那些类似物和在其他位置具有修饰的那些类似物。所述类美登素描述于（例如）美国专利4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545以及6,333,410中。
具有经过修饰的芳香环的美登醇类似物的实例包括：（1）C-19-脱氯（美国专利4,256,746）（通过安丝菌素P2的LAH还原来制备），（2）C-20-羟基（或C-20-脱甲基）+/-C-19-脱氯（美国专利4,361,650和4,307,016）（通过使用链霉菌（Streptomyces）或放线菌（Actinomyces）脱甲基或使用LAH脱氯来制备），以及（3）C-20-脱甲氧基,C-20-酰氧基（-OCOR）,+/-脱氯（美国专利4,294,757）（通过使用酰氯酰化来制备）。
在除芳香环以外的位置具有修饰的美登醇类似物的实例包括：（1）C-9-SH（美国专利4,424,219）（通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)，（2）C-14-烷氧基甲基（脱甲氧基/CH2OR）（美国专利4,331,598），（3）C-14-羟甲基或酰氧基甲基（CH2OH或CH2OAc）（美国专利4,450,254）（从诺卡氏菌（Nocardia）制备），（4）C-15-羟基/酰氧基（美国专利4,364,866）（通过由链霉菌使美登醇转化来制备），（5）C-15-甲氧基（美国专利4,313,946和4,315,929）（从滑桃树（Trewia nudiflora）中分离出），（6）C-18-N-脱甲基（美国专利4,362,663和4,322,348）（通过由链霉菌使美登醇脱甲基来制备），以及（7）4,5-脱氧（美国专利4,371,533）（通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备）。
在本发明的一个优选实施方案中，缀合物利用含硫醇的类美登素DM1，也称为N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，作为细胞毒性剂。DM1的结构由式（I）表示：
在本发明的另一个优选实施方案中，缀合物利用含硫醇的类美登素DM4，也称为N2'-脱乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素，作为细胞毒性剂。DM4的结构由式（II）表示：
Figure BDA0000389578430000262
在本发明的背景下可以使用其他类美登素，包括例如含硫醇和二硫键的类美登素，其在带有硫原子的碳原子上具有单烷基或二烷基取代。特别优选的是在C-3位置具有以下的类美登素：（a）C-14羟甲基、C-15羟基或C-20脱甲基官能团，和（b）具有带有受阻巯基的酰基的酰化氨基酸侧链，其中带有硫醇官能团的酰基的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且另外其中所述取代基中的一个可以为H，并且其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。
在本发明的背景下使用的额外的类美登素包括由式（III）表示的化合物：
其中Y'表示
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且其中R2也可以为H，
其中A、B、D为具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立地为0或1到5的整数，其条件为l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个在任何时候都不为0，并且
其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基，或简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式（III）的优选实施方案包括如下式（III）化合物：其中（a）R1为H，R2为甲基，并且Z为H；（b）R1和R2为甲基，并且Z为H；（c）R1为H，R2为甲基，并且Z为-SCH3；以及（d）R1和R2为甲基，并且Z为-SCH3。
这些额外的类美登素还包括由式（IV-L）、（IV-D）或（IV-D,L）表示的化合物：
Figure BDA0000389578430000281
其中Y表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且其中R2也可以为H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1到5的整数，并且另外n可以为0，
其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1到10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的环状烷基或烯基，或简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基，并且
其中May表示带有C-3处的侧链、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20脱甲基的类美登素。
式（IV-L）、（IV-D）和（IV-D,L）的优选实施方案包括如下式（IV-L）、（IV-D）和（IV-D,L）化合物，其中（a）R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为H；（b）R1和R2为甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为H；（c）R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为-SCH3；或（d）R1和R2为甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为-SCH3。
优选地，细胞毒性剂由式（IV-L）表示。
额外优选的类美登素还包括由式（V）表示的化合物：
Figure BDA0000389578430000301
其中Y表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且其中R2也可以为H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1到5的整数，并且另外n可以为0，并且
其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基，或简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式（V）的优选实施方案包括如下式（V）化合物：其中（a）R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为H；（b）R1和R2为甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为H；（c）R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为-SCH3；或（d）R1和R2为甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为-SCH3。
其他优选的类美登素包括由式（VI-L）、（VI-D）或（VI-D,L）表示的化合物：
Figure BDA0000389578430000311
其中Y2表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且其中R2也可以为H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链环状烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1到5的整数，并且另外n可以为0，
其中Z2为SR或COR，其中R为具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基，或简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基，并且
其中May为类美登素的大环结构。
额外优选的类美登素包括由式（VII）表示的化合物：
Figure BDA0000389578430000321
其中Y2'表示
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，并且另外R2可以为H，
其中A、B和D各自独立地为具有3到10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经过取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，
其中l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立地为0或1到5的整数，其条件为l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个在任何时候都不为0，并且
其中Z2为SR或-COR，其中R为具有1到10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基，或简单的或经过取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式（VII）的优选实施方案包括如下式（VII）化合物：其中R1为H并且R2为甲基。
除了类美登素以外，缀合物中所用的细胞毒性剂可以是紫杉烷（taxane）或其衍生物。紫杉烷是一类化合物，其包括细胞毒性天然产物太平洋紫杉醇（paclitaxel，）和半合成衍生物多西紫杉醇（docetaxel，
Figure BDA0000389578430000333
），这两者都被广泛用于治疗癌症。紫杉烷是抑制微管蛋白解聚，从而引起细胞死亡的有丝分裂纺锤体毒物。虽然多西紫杉醇和太平洋紫杉醇是适用于治疗癌症的药剂，但它们的抗肿瘤活性由于其对正常细胞的非特异性毒性而受限制。此外，如太平洋紫杉醇和多西紫杉醇的化合物本身对于在细胞结合剂的缀合物中使用并不充分有效。
用于制备细胞毒性缀合物的优选紫杉烷为式（VIII）的紫杉烷：
Figure BDA0000389578430000331
用于合成可以在本发明的背景下使用的紫杉烷的方法连同用于使紫杉烷结合于细胞结合剂（如抗体）的方法一起详细描述于美国专利5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6,706,708、6,716,821以及7,390,898中。
细胞毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。CC-1065是从泽耳链霉菌（Streptomyces zelensis）的肉汤培养物中分离出的有效抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外的效力是通常所用的抗癌药（如阿霉素（doxorubicin）、甲氨蝶呤（methotrexate）以及长春新碱（vincristine））的约1000倍（Bhuyan等人,Cancer Res.,42:3532-3537(1982)）。CC-1065和其类似物披露于美国专利5,585,499、5,846,545、6,340,701以及6,372,738中。CC-1065的细胞毒性效能已经与它的烷基化活性和它的DNA结合或DNA嵌入活性相关联。这两种活性存在于分子的独立部分中。在这方面，烷基化活性包含在环丙烷并吡咯并吲哚（cyclopropapyrroloindole，CPI）子单元中，并且DNA结合活性存在于CC-1065的两个吡咯并吲哚子单元中。
若干种CC-1065类似物在本领域中是已知的并且也可以用作缀合物中的细胞毒性剂（参看例如Warpehoski等人,J.Med.Chem.,31:590-603(1988)）。已经开发出一系列CC-1065类似物，其中CPI部分被环丙烷并苯并吲哚（cyclopropabenzindole，CBI）部分取代（Boger等人,J.Org.Chem.,55:5823-5833(1990)；和Boger等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1:115-120(1991)）。这些CC-1065类似物保留了母药的高体外效能，而不会在小鼠中引起迟发性毒性。如同CC-1065一样，这些化合物是共价结合于DNA的小沟以引起细胞死亡的烷基化剂。
可以通过经由靶向递送到肿瘤部位而改变体内分布，从而使得对非靶向组织的毒性较低并且由此使得全身毒性较低来大大提高CC-1065类似物的治疗功效。为此，已经产生CC-1065的类似物和衍生物与特异性地靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的缀合物（参看例如美国专利5,475,092、5,585,499以及5,846,545）。这些缀合物通常在体外展现出高标靶特异性细胞毒性，并且在小鼠的人类肿瘤异种移植模型中展现出抗肿瘤活性（参看例如Chari等人,Cancer Res.,55:4079-4084(1995)）。
合成CC-1065类似物的方法详细描述于美国专利5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,534,660、6,586,618、6,756,397以及7,329,760中。
如甲氨蝶呤、道诺霉素（daunorubicin）、阿霉素、长春新碱、长春碱（vinblastine）、美法仑（melphalan）、丝裂霉素C（mitomycinC）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、卡里奇霉素（calicheamicin）、土布莱新（tubulysin）和土布莱新类似物、倍癌霉素（duocarmycin）和倍癌霉素类似物、尾海兔素和尾海兔素类似物也可以用作本发明的细胞毒性剂。阿霉素和道诺霉素化合物（参看例如美国专利6,630,579）也可以用作细胞毒性剂。
细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物可以通过体外方法来制备。为了使细胞毒性剂连接于抗体，使用连接基团。适合的连接基团在本领域中是众所周知的并且包括二硫基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团，以及不可裂解的连接基团。
根据本发明，细胞结合剂是通过使双官能交联剂与细胞结合剂反应，从而使得连接子分子共价连接于细胞结合剂来修饰。如本文中所用的“双官能交联剂”是指具有两个反应性基团的试剂；其中一个基团能够与细胞结合剂反应，而另一个基团能够与细胞毒性剂反应以使细胞结合剂与细胞毒性剂连接，从而形成缀合物。
任何适合的双官能交联剂都可以与本发明相结合使用，只要连接子试剂分别为细胞毒性剂和细胞结合剂保留了治疗性特征（例如细胞毒性）和靶向特征，同时提供可接受的毒性概况（toxicity profile）。优选地，连接子分子使细胞毒性剂经化学键接合于细胞结合剂（如上文所描述），使得细胞毒性剂与细胞结合剂彼此化学偶合（例如共价键结）。
在一个实施方案中，双官能交联剂包含不可裂解的连接子。不可裂解的连接子是能够使细胞毒性剂（如类美登素、紫杉烷或CC-1065类似物）以稳定的共价方式连接于细胞结合剂的任何化学部分。因此，不可裂解的连接子在细胞毒性剂或细胞结合剂保持呈活性的条件下实质上抵抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解以及二硫键裂解。
在细胞毒性剂与细胞结合剂之间形成不可裂解的连接子的适合交联剂在本领域中是众所周知的。在一个实施方案中，细胞毒性剂经硫醚键连接于细胞结合剂。不可裂解的连接子的实例包括具有用来与细胞毒性剂反应的基于马来酰亚胺基或基于卤代乙酰基的部分的连接子。所述双官能交联剂在本领域中是众所周知的（参看美国专利申请公开号2010/0129314、2009/0274713、2008/0050310、2005/0169933；以及Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box117,Rockland,IL61105,USA），并且包括（但不限于）4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)（其是SMCC的“长链”类似物，LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯（AMAS）、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯（SMPH）、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯（SMPB）以及N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯（PMPI）。包含基于卤代乙酰基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯（SIAB）、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯（SIA）、溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯（SBA）以及3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯（SBAP）、双马来酰亚胺基聚乙二醇（BMPEO）、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯（BMPS）、5-马来酰亚胺基戊酸NHS、HBVS、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼·HCl（MPBH）、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯（SVSB）、二硫基双马来酰亚胺基乙烷（DTME）、1,4-双马来酰亚胺基丁烷（BMB）、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷（BMDB）、双马来酰亚胺基己烷（BMH）、双马来酰亚胺基乙烷（BMOE）、4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-SMCC）、(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-SIAB）、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-MBS）、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-GMBS）、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-EMCS）、N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-KMUS）以及4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯（磺基-SMPB）、CX1-1、磺基-Mal和PEGn-Mal。优选地，双官能交联剂为SMCC。
Figure BDA0000389578430000371
在一个实施方案中，连接试剂是可裂解的连接子。适合的可裂解的连接子的实例包括二硫化物连接子、酸不稳定连接子、光不稳定连接子、肽酶不稳定连接子以及酯酶不稳定连接子。含二硫化物的连接子为经二硫化物交换而可裂解的连接子，所述二硫化物交换可以在生理条件下发生。酸不稳定连接子为在酸性pH值下可裂解的连接子。举例来说，某些细胞内区室（如核内体和溶酶体）具有酸性pH值（pH4-5），并且提供适于使酸不稳定连接子裂解的条件。光不稳定连接子适用于体表和光可到达的许多体腔。此外，红外光可以穿透组织。肽酶不稳定连接子可以用于使细胞内部或外部的某些肽裂解（参看例如Trouet等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:626-629(1982)；和Umemoto等人,Int.J.Cancer,43:677-684(1989)）。在一个实施方案中，可裂解的连接子在温和条件下，即，在细胞内细胞毒性剂的活性不受影响的条件下裂解。
在一个实施方案中，细胞毒性剂经二硫键连接于细胞结合剂。连接子分子包含可以与细胞结合剂反应的反应性化学基团。用来与细胞结合剂反应的优选的反应性化学基团为N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。另外，连接子分子包含可以与细胞毒性剂反应形成二硫键的反应性化学基团，优选地为二硫基吡啶基。能够使细胞结合剂经由二硫键与细胞毒性剂连接的双官能交联剂在本领域中是已知的，并且包括例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）（参看例如Carlsson等人,Biochem.J.,173:723-737(1978)）、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯（SPDB）（参看例如美国专利4,563,304）、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯（SPP）（参看例如CAS登记号341498-08-6）以及N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯（磺基-SPDB）（参看例如美国专利申请公开号2009/0274713）。可以用于引入二硫基的其他双官能交联剂在本领域中是已知的并且描述于美国专利6,913,748、6,716,821以及美国专利申请公开2009/0274713和2010/0129314中，所有专利都以其全文引用的方式并入本文中。
缺乏硫原子并且形成不可裂解的连接子的其他交联剂也可以用于本发明方法中。所述连接子可以衍生自基于二羧酸的部分。适合的基于二羧酸的部分包括（但不限于）通式（IX）的α,ω-二羧酸：
HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH
（IX）
其中X为具有2到20个碳原子的直链或支链烷基、烯基或炔基，Y为带有3到10个碳原子的环烷基或环烯基，Z为经过取代或未经取代的带有6到10个碳原子的芳香基，或经过取代或未经取代的杂环基，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和n各自为0或1，其条件为l、m和n不同时都为0。
本文所披露的许多不可裂解的连接子详细描述于美国专利申请公开号2005/0169933A1中。
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应该被解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例展示了一种制造具有改善的同质性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包含在较低温度下进行修饰反应。
使用先前所描述的方法以及作为本申请的主题的改进方法，使人源化CD37-3抗体（huCD37-3）与异双官能交联剂SMCC（N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯）和类美登素DM1反应。
对于先前所描述的方法-方法A（参看例如Chari等人,U.S.5,208,020）来说，首先使huCD37-3（15mg/mL）与SMCC（相对于抗体的量为6.0倍摩尔过量，溶解于二甲基乙酰胺（DMA）中）反应，以形成经过修饰的抗体。修饰反应在20℃下于含有2mM EDTA（乙二胺四乙酸）和10%DMA的50mM磷酸钠缓冲液（pH6.7）中进行了180分钟。用1M乙酸盐猝灭反应以将pH值调节到4.5，并且使用在含有2mM EDTA的20mM乙酸钠（pH4.5）中平衡并洗脱的Sephadex G-25F树脂柱纯化经过修饰的抗体。纯化之后，用磷酸三钾缓冲液将经过修饰的抗体（5mg/mL）调节到pH5.0，并且使其与类美登素DM1（相对于抗体的量为7.2倍摩尔过量，溶解于DMA中）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在20℃下于含有2mM EDTA和5%DMA的20mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）中进行了约20小时。然后，使用在10mM琥珀酸钠（pH5.0）中平衡并洗脱的SephadexG-25F树脂柱纯化反应混合物。
对于方法B（涉及在高pH值和室温下进行修饰步骤）来说，首先使huCD37-3（15mg/mL）与SMCC（相对于抗体的量为6.0倍摩尔过量，溶解于DMA中）反应，以形成经过修饰的抗体。修饰反应在20℃下于含有2mM EDTA和10%DMA的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）中进行了50分钟。用1M乙酸猝灭反应以将pH值调节到4.5，并且使用在含有2mM EDTA的20mM乙酸钠（pH4.5）中平衡并洗脱的Sephadex G-25F树脂柱纯化经过修饰的抗体。纯化之后，用磷酸三钾缓冲液将经过修饰的抗体（5mg/mL）调节到pH5.0，并且使其与类美登素DM1（相对于抗体的量为7.2倍摩尔过量，溶解于DMA中）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在20℃下于含有2mM EDTA和5%DMA的20mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）中进行了约20小时。然后，使用在10mM琥珀酸钠（pH5.0）中平衡并洗脱的Sephadex G-25F树脂柱纯化反应混合物。
对于本发明方法-方法C（涉及在高pH值和低温下进行修饰步骤）来说，首先使huCD37-3（15mg/mL）与SMCC（相对于抗体的量为6.0倍摩尔过量，溶解于DMA中）反应，以形成经过修饰的抗体。修饰反应在10℃下于含有2mM EDTA和10%DMA的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）中进行了50分钟。用1M乙酸猝灭反应以将pH值调节到4.5，并且使用在含有2mM EDTA的20mM乙酸钠（pH4.5）中平衡并洗脱的Sephadex G-25F树脂柱纯化经过修饰的抗体。纯化之后，用磷酸三钾缓冲液将经过修饰的抗体（5mg/mL）调节到pH5.0，并且使其与类美登素DM1（相对于抗体的量为7.2倍摩尔过量，溶解于DMA中）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在20℃下于含有2mM EDTA和5%DMA的20mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）中进行了约20小时。然后，使用在10mM琥珀酸钠（pH5.0）中平衡并洗脱的Sephadex G-25F树脂柱纯化反应混合物。
通过以下方法分析由这三种方法得到的缀合物：UV光谱法用于分析缀合物浓度和类美登素与抗体的比率（MAR）；双柱反相色谱用于分析游离类美登素；质谱法用于测定未结合的连接子的水平；还原型SDS PAGE电泳用于测定不可还原性物质的水平；非还原型SDSPAGE电泳用于测定片段的水平；以及SEC-HPLC用于测定缀合物单体。
通过在UV-VIS分光光度计中测量在252nm和280nm下缀合物的吸光度并且使用在这两个波长下DM1和抗体的摩尔消光系数以计算抗体和DM1的摩尔浓度来测定浓度和类美登素与抗体的比率。
缀合物的未结合的连接子的水平通过质谱法来分析：测量个别缀合物种类（包括含有或不含未结合的连接子的缀合物）的峰面积；由含有未结合的连接子的面积的总和（以连接子的数目加权）与所有缀合物种类的面积的总和（也以连接子的数目加权）的比率来计算未结合的连接子的水平。
缀合物的不可还原性物质的水平通过还原型SDS凝胶电泳来分析：测量个别经过还原的缀合物种类（包括经过还原的轻链、经过还原的重链、经过交联的轻链-轻链、经过交联的轻链-重链等）的峰面积；由不可还原性物质的面积的总和与所有物质的面积的总和的比率来计算不可还原性物质的水平。
缀合物的单体水平通过尺寸排阻HPLC来分析：使用设定于252nm或280nm波长的吸光度检测器来测量单体、二聚体、聚集体以及低分子量物质的峰面积；由单体面积与总面积的比率来计算单体水平。
存在于缀合物中的游离类美登素的量通过双柱（HiSep和C18柱）HPLC来分析：使用设定于252nm波长的吸光度检测器来测量总游离类美登素物质（按梯度洗脱并且通过与已知标准物比较洗脱时间而鉴别）的峰面积；使用由已知量的标准物的峰面积生成的标准曲线来计算游离类美登素的量。
如下表1中所示，使用本发明方法（方法C）制造的缀合物就未结合的连接子、不可还原性物质和单体来说优于使用先前所描述的方法（方法A）制造的缀合物，也优于涉及在高pH值和室温下进行修饰步骤的方法B。
表1.通过本发明方法制造的缀合物的关键特性相较于其他方法的比较
本实施例中所描述的实验的结果证实了在低温（例如10℃）下进行修饰步骤会产生优于使用先前所描述的方法制造的缀合物的缀合物。另外，本实施例中所描述的实验的结果证实了在高pH值（例如7.5）下进行修饰步骤只有当所述修饰步骤在低温(例如10℃)下进行时才会产生具有优良质量的缀合物。
实施例2
本实施例展示了一种制造具有改善的同质性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包含在较低温度和较高pH值下进行修饰反应。
使人源化抗体与异双官能交联剂SMCC和类美登素DM1反应以制造MAR（类美登素与抗体的比率，也称为药物与抗体的比率）为约3.5的缀合物。
使用先前所描述的方法（参看例如美国专利申请公开2011/0166319和2006/0182750）以及包含在较高pH值和较低温度下进行修饰反应的本发明方法来进行反应。
使用先前所描述的方法，首先使人源化抗体（15mg/mL）与SMCC（相对于抗体的量为7.5倍摩尔过量）反应，以形成经过修饰的抗体。修饰反应在21℃下于含有2mM EDTA和5%DMA的50mM磷酸钠缓冲液（pH6.7）中进行了120分钟。用0.5M柠檬酸盐猝灭反应以将pH值调节到5.0，并且使用Sephadex G25F柱纯化经过修饰的抗体。纯化之后，使经过修饰的抗体（5mg/mL）与类美登素DM1（相对于抗体的量为5.4倍摩尔过量；相对于抗体上连接子的测得量为1.3倍过量）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在环境温度下于含有2mM EDTA和5%DMA的20mM柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）中进行了约17小时。然后，使用在10mM琥珀酸钠（pH5.0）中平衡并洗脱的Sephadex G25F树脂柱纯化反应混合物。
在本发明方法中，首先使人源化抗体（3mg/mL）与SMCC（相对于抗体的量为6.0倍摩尔过量）反应，以形成经过修饰的抗体。修饰反应在0℃下于含有2mM EDTA和5%DMA的50mM磷酸钠缓冲液（pH8.2）中进行了117分钟。用0.5M柠檬酸盐猝灭反应以将pH值调节到5.0，并且使用Sephadex G25F柱纯化经过修饰的抗体。纯化之后，使经过修饰的抗体（2.5mg/mL）与类美登素DM1（相对于抗体的量为5.2倍摩尔过量；相对于抗体上连接子的测得量为1.3倍过量）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在环境温度下于含有2mM EDTA和5%DMA的20mM柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）中进行了约20小时。然后，使用在10mM琥珀酸钠（pH5.0）中平衡并洗脱的Sephadex G25F树脂柱纯化反应混合物。
通过以下方法分析由这两种方法得到的缀合物：质谱法用于测定未结合的连接子的水平；还原型SDS PAGE电泳用于测定不可还原性物质的水平；以及SEC-HPLC用于测定缀合物单体。
如下表2中所示，使用本发明方法制造的缀合物就未结合的连接子和不可还原性物质来说优于使用先前所描述的方法制造的缀合物。
表2.通过本发明方法制造的缀合物的关键特性相较于先前方法的比较
Figure BDA0000389578430000441
本实施例中所描述的实验的结果证实了在低温（例如0℃）和高pH值（例如pH8.2）下进行修饰步骤会产生优于使用先前所描述的方法制造的缀合物的缀合物，在先前所描述的方法中修饰步骤在室温和较低pH值（例如pH6.7）下进行。
实施例3
本实施例说明了一种制造具有改善的同质性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的大规模方法，其包含在较低温度和较高pH值下进行修饰反应。
使人源化抗体与异双官能交联剂SMCC和类美登素DM1反应以制备稳定的人源化抗体-SMCC-DM1缀合物。
具体来说，使用本文所描述的本发明方法，使人源化抗体与SMCC反应，以形成经过修饰的抗体。在约10℃下于pH值为约7.8的缓冲液中在50mM磷酸钠、2mM EDTA（含7%（体积/体积）DMA）中使用摩尔过量超过抗体5.7倍的SMCC进行修饰反应，持续40分钟。修饰之后，用1M乙酸将反应混合物的pH值调节到4.5，并且使用TFF纯化经过修饰的抗体。纯化之后，使经过修饰的抗体与类美登素DM1（摩尔过量超过所结合的连接子约1.2倍）反应，以形成经过结合的抗体。结合反应在环境温度下于约5.0的pH值下在20mM乙酸钠、2.0mM EDTA（含5.0%（体积/体积）DMA）中进行了16小时。然后，使用TFF纯化反应混合物。
可以通过以下方法对缀合物进行分析：质谱法用于测定未结合的连接子的水平；还原型SDS PAGE电泳用于测定不可还原性物质的水平；以及SEC-HPLC用于测定缀合物单体。分析的结果证实了通过本发明方法制备的缀合物优于使用先前所描述的方法（参看例如美国专利申请公开2011/0166319和2006/0182750）制造的缀合物。
本文所引用的所有参考文献（包括出版物、专利申请和专利）都特此以引用的方式并入，其程度如同个别并特定地指示每个参考文献都以引用的方式并入并且在本文中以其全文阐述一样。
除非本文中另有指示或上下文明显有矛盾，否则在描述本发明的背景下（特别是在以下权利要求书的背景下）使用术语“一个（种）”和“所述”被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语（即，意味着“包括（但不限于）”）。除非本文中另有指示，否则在本文中叙述值的范围仅仅打算充当个别地提到属于所述范围的每个单独值的速记法，并且每个单独值并入本说明书中，如同它在本文中被个别地叙述一样。除非本文中另有指示或上下文另外明显有矛盾，否则本文所描述的所有方法都可以按任何适合的次序进行。除非另有要求，否则使用本文所提供的任一种和所有实施例或示范性语言（例如，“如”）仅仅打算更好地阐明本发明并且不会限制本发明的范围。本说明书中没有任何语言应该被解释为指示任何未要求的要素是实施本发明所必需的。
本文中描述本发明的优选实施方案，包括本发明者已知的用于执行本发明的最佳模式。那些优选实施方案的变化可以在本领域技术人员阅读前述描述之后变得显而易见。本发明者预期熟练的技术人员适当时采用这些变化，并且本发明者打算以除了本文特定描述以外的其他方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所许可的在所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文中另有指示或上下文另外明显有矛盾，否则呈所有可能变化形式的上述要素的任何组合都被本发明所涵盖。

Claims (77)

1.一种制备结合有连接子的细胞结合剂的方法，所述方法包括在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于所述细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触在pH值为约7.5到约9的溶液中发生。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述pH值为约7.8。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述溶液包含选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂的缓冲剂。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述接触在约-10℃到约15℃的温度下发生。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述温度为约10℃。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自由以下组成的组：抗体、干扰素、白介素2（IL-2）、白介素3（IL-3）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF以及转铁蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞结合剂为抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、昔洛珠单抗、CNTO95、huDS6、利妥昔单抗、抗CD27L、抗Her2、抗EGFR、抗EGFRvIII、畸胎瘤衍化生长因子、抗CD138、抗CD38、抗EphA2、整合素靶向抗体、抗CD37、抗叶酸、抗Her3以及抗IGFIR。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂包含N-琥珀酰亚胺酯部分、N-磺基琥珀酰亚胺酯部分、基于马来酰亚胺基的部分或基于卤代乙酰基的部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述双官能交联剂包含基于马来酰亚胺基的部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述双官能交联剂选自由以下组成的组：4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、β-马来酰亚胺基丙氧基-琥珀酰亚胺酯（BMPS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯（AMAS）、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯（SMPH）、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯（SMPB）以及N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯（PMPI）、磺基-Mal、PEG4-Mal和CX1-1。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述双官能交联剂为4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）。
17.一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括：
（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于所述细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物，
（b）对所述第一混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合并且从而制备结合有连接子的细胞结合剂的经过纯化的第一混合物，
（c）通过在pH值为约4到约9的溶液中使所述结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于所述经过纯化的第一混合物中的所述结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及
（d）对所述第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从所述第二混合物的其他组分中纯化所述经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤（a）中的所述接触在pH值为约7.5到约9的溶液中发生。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述pH值为约7.8。
22.根据权利要求17到21中任一项所述的方法，其中步骤（a）中的所述接触在约-10℃到约15℃的温度下发生。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述温度为约10℃。
24.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中所述非吸附性色谱选自由以下组成的组：SEPHADEXTM树脂、SEPHACRYLTM树脂、SUPERDEXTM树脂以及
Figure FDA0000389578420000041
树脂。
25.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中所述吸附性色谱选自由以下组成的组：羟磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱（HCIC）、疏水性相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱（IMAC）、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及其组合。
26.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中切向流过滤用于步骤（b）和（d）中。
27.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中吸附性色谱用于步骤（b）和（d）中。
28.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中非吸附性色谱用于步骤（b）和（d）中。
29.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中切向流过滤用于步骤（b）中并且吸附性色谱用于步骤（d）中。
30.根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中吸附性色谱用于步骤（b）中并且切向流过滤用于步骤（d）中。
31.根据权利要求17到30中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自由以下组成的组：抗体、干扰素、白介素2（IL-2）、白介素3（IL-3）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF以及转铁蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞结合剂为抗体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
35.根据权利要求32到34中任一项所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、昔洛珠单抗、CNTO95、huDS6、利妥昔单抗、抗CD27L、抗Her2、抗EGFR、抗EGFRvIII、畸胎瘤衍化生长因子、抗CD138、抗CD38、抗EphA2、整合素靶向抗体、抗CD37、抗叶酸、抗Her3以及抗IGFIR。
36.根据权利要求17到35中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：类美登素、紫杉烷、CC1065以及前述物质的类似物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞毒性剂为类美登素。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述类美登素包含硫醇基。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述类美登素为DM1。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述类美登素为DM4。
41.根据权利要求17到40中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂经由化学键化学偶合于所述细胞毒性剂，所述化学键选自由以下组成的组：二硫键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键、硫醚不稳定键以及酯酶不稳定键。
42.根据权利要求17到40中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂包含N-琥珀酰亚胺酯部分、N-磺基琥珀酰亚胺酯部分、基于马来酰亚胺基的部分或基于卤代乙酰基的部分。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述双官能交联剂包含基于马来酰亚胺基的部分。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述双官能交联剂选自由以下组成的组：4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、β-马来酰亚胺基丙氧基-琥珀酰亚胺酯（BMPS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯（AMAS）、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯（SMPH）、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯（SMPB）、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、磺基-Mal、PEG4-Mal和CX1-1。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述双官能交联剂为4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）。
46.根据权利要求17到45中任一项所述的方法，其中步骤（c）中的所述溶液包含蔗糖。
47.根据权利要求17到46中任一项所述的方法，其中步骤（c）中的所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。
48.根据权利要求17到46中任一项所述的方法，其中步骤（c）中的所述溶液包含选自由以下各项组成的组的缓冲剂：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
49.根据权利要求17到48中任一项所述的方法，其进一步包含
（e）在步骤a-b、步骤b-c以及步骤c-d中的至少一个之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂中释放所述不稳定结合的连接子。
50.一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括：
（a）在约15℃或更低的温度下使细胞结合剂与双官能交联剂接触以使连接子共价连接于所述细胞结合剂并且从而制备包含结合有连接子的细胞结合剂的第一混合物，
（b）通过在pH值为约4到约9的溶液中使所述结合有连接子的细胞结合剂与细胞毒性剂反应而使细胞毒性剂结合于所述第一混合物中的所述结合有连接子的细胞结合剂以制备包含以下的第二混合物：（i）经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；以及
（c）对所述第二混合物进行切向流过滤、选择性沉淀、非吸附性色谱、吸附性过滤、吸附性色谱或其组合，以从所述第二混合物的其他组分中纯化所述经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂并且从而制备经所述连接子化学偶合于所述细胞毒性剂的细胞结合剂的经过纯化的第二混合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中步骤（a）中的所述接触在pH值为约7.5到约9的溶液中发生。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述溶液包含选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂的缓冲剂。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
54.根据权利要求51到53中任一项所述的方法，其中所述pH值为约7.8。
55.根据权利要求50到54中任一项所述的方法，其中步骤（a）中的所述接触在约-10℃到约15℃的温度下发生。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述温度为约10℃。
57.根据权利要求50到56中任一项所述的方法，其中所述非吸附性色谱是选自由以下组成的组：SEPHADEXTM树脂、SEPHACRYLTM树脂、SUPERDEXTM树脂以及
Figure FDA0000389578420000081
树脂。
58.根据权利要求50到56中任一项所述的方法，其中所述吸附性色谱选自由以下组成的组：羟磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱（HCIC）、疏水性相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱（IMAC）、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及其组合。
59.根据权利要求50到58中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自由以下组成的组：抗体、干扰素、白介素2（IL-2）、白介素3（IL-3）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF以及转铁蛋白。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞结合剂为抗体。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
63.根据权利要求60到62中任一项所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、昔洛珠单抗、CNTO95、huDS6、利妥昔单抗、抗CD27L、抗Her2、抗EGFR、抗EGFRvIII、畸胎瘤衍化生长因子、抗CD138、抗CD38、抗EphA2、整合素靶向抗体、抗CD37、抗叶酸、抗Her3以及抗IGFIR。
64.根据权利要求50到63中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：类美登素、紫杉烷、CC1065以及前述物质的类似物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞毒性剂为类美登素。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述类美登素包含硫醇基。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述类美登素为DM1。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述类美登素为DM4。
69.根据权利要求50到68中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂经由化学键化学偶合于所述细胞毒性剂，所述化学键选自由以下组成的组：二硫键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键、硫醚不稳定键以及酯酶不稳定键。
70.根据权利要求50到69中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂包含N-琥珀酰亚胺酯部分、N-磺基琥珀酰亚胺酯部分、基于马来酰亚胺基的部分或基于卤代乙酰基的部分。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述双官能交联剂包含基于马来酰亚胺基的部分。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述双官能交联剂选自由以下组成的组：4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、β-马来酰亚胺基丙氧基-琥珀酰亚胺酯（BMPS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯（AMAS）、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯（SMPH）、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯（SMPB）以及N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯（PMPI）、磺基-Mal、PEG4-Mal和CX1-1。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述双官能交联剂为4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC）。
74.根据权利要求50到73中任一项所述的方法，其中步骤（b）的所述溶液包含蔗糖。
75.根据权利要求50到74中任一项所述的方法，其中步骤（b）的所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。
76.根据权利要求50到74中任一项所述的方法，其中步骤（b）的所述溶液包含选自由以下组成的组的缓冲剂：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。
77.根据权利要求50到76中任一项所述的方法，其进一步包括
（d）在步骤a-b和步骤b-c中的至少一个之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂中释放所述不稳定结合的连接子。
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