CN105208876A

CN105208876A - 离子交换膜的从细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中去除杂质的用途

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Publication number: CN105208876A
Application number: CN201380061514.1A
Authority: CN
Inventors: X·李; W·程
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2012-10-04
Filing date: 2013-10-04
Publication date: 2015-12-30
Also published as: JP2015535215A; HK1213148A1; US20150307596A1; CA2886996A1; SG11201502430QA; AU2013326897A1; IL238111A0; RU2015116883A; MX2015004258A; IN2015DN03203A; EP2903450A4; WO2014055893A1; EP2903450A1

Abstract

本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

Description

离子交换膜的从细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中去除杂质的用途

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2012年10月4日提交的美国临时专利申请No.61/709,871的权益，所述专利通过引用并入。

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发明背景

可用于治疗癌症和其它疾病的抗体-药物缀合物通常由三种不同的元件组成：细胞结合剂；接头；和细胞毒性剂。常用的制造方法之一包括：修饰步骤，其中细胞结合剂与双官能接头反应以形成共价连接于具有反应性基团的接头的细胞结合剂；纯化步骤，其中修饰的抗体从修饰反应的其它组分中纯化；缀合步骤，其中修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应以形成所述接头(使用反应性基团)至细胞毒性剂的共价化学键，以及第二纯化步骤，其中所述缀合物从缀合反应的其它组分中纯化。

最近的临床试验已经示出抗体-药物缀合物在治疗许多不同类型的癌症中的有希望的作用。因此，需要生产可用于治疗患者的高纯度且高稳定性的缀合物。尽管在制备抗体-药物缀合物中取得进步，但当前的方法受若干因素的限制。例如，由这些方法产生的缀合物包含增加量的杂质，所述杂质包括游离细胞毒性剂(如，细胞毒性剂二聚体相关的物质)和/或高分子量物质(如，二聚体和其它更高阶聚集物)。在本领域中利用的当前纯化方法，诸如正切流动过滤和吸附色谱法，不能高效地去除这些杂质而未显著降低产量和/或对于大规模生产工艺为难处理的。

因此，仍需要制备比由当前方法产生的抗体-药物缀合物更稳定且纯度更高的改善的方法。本发明提供此类方法。本发明的这些和其它优势以及另外的发明特征将从本文提供的发明描述中显而易见。

发明概述

本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。本发明还包括包含化学偶联至根据本文所述的方法制备的细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物。

发明详述

本领域普通技术人员将理解包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂(诸如抗体)的缀合物(“抗体-细胞毒性剂缀合物”)通常通过以下制备：在低pH(即，pH7.0或以下)下用双官能交联剂修饰抗体，纯化具有结合至其的接头的抗体，将细胞毒性剂缀合至具有结合至其的接头的抗体，以及纯化所述抗体-细胞毒性剂缀合物。最近，已经通过使稳定结合至细胞结合剂的接头的量最大化并且使导致缀合物不稳定的不期望的副反应最小化开发了产生增强稳定性的缀合物的方法。例如，已经开发了这样的方法，其中用于制备缀合物的方法在一个步骤中(参见，如，在美国专利申请公布No.2012/0253021中所述的方法)和/或在高的pH(如，pH7或以上)(参见，如，国际专利申请公布No.WO2012/135522中所述的方法)下进行以便增加具有稳定结合至其的接头的细胞结合剂的期望物质的水平并降低不期望的反应产物(如，具有不稳定结合至其的接头的细胞结合剂)的水平。尽管此类方法产生增强稳定性的缀合物，但已经发现这些方法产生具有增加水平的杂质(诸如游离细胞毒性剂(如，细胞毒性剂二聚体相关的物质)和/或高分子量物质(如，二聚体和其它更高阶聚集物))的缀合物。本领域利用的当前纯化方法，诸如正切流动过滤和吸附色谱法，不能高效地去除这些杂质而未显著降低产量和/或对于大规模生产工艺为难处理的。

令人惊讶地发现离子交换色谱膜可用于从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中去除至少部分杂质。特别地，出乎意料地发现，通过使混合物经历离子交换色谱膜，游离细胞毒性剂(如，细胞毒性剂二聚体相关的物质)可有效地且高效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中去除。因此，本发明提供用于制备增加纯度和稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜。

本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物去除至少部分杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。离子交换色谱膜可用于去除通常见于包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物的多种杂质。例如，离子交换色谱膜可用于去除一种或多种选自细胞毒性剂二聚体、细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物、游离细胞毒性剂、未缀合接头以及它们的混合物的杂质。

在一个实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的细胞毒性剂二聚体，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的细胞毒性剂二聚体以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的细胞结合剂细胞毒性剂的聚集物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的游离细胞毒性剂，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的游离细胞毒性剂以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的未缀合接头，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的未缀合接头以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

在优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的彼此通过接头(如，DM1-MCC-DM1；DM1-SPP-DM1；或DM1-CX1-1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂二聚体，并且离子交换色谱膜从混合物中去除彼此通过接头(如，DM1-MCC-DM1；DM1-SPP-DM1；或DM1-CX1-1-DM1)化学偶联的一些部分的细胞毒性剂二聚体以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的彼此未通过接头(如，DM1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂二聚体，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的彼此未通过接头(如，DM1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂二聚体以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

当包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜时，所得纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含的至少一种或多种杂质水平与在使混合物经历离子交换色谱膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较有所降低。例如，与在使混合物经历离子交换色谱膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较，离子交换色谱膜去除混合物中的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的一种或多种杂质。在一个实施方案中，与在使混合物经历离子交换色谱膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较，离子交换色谱膜去除混合物中的约10％至约100％、约10％至约90％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约100％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约100％(如，约60％至约90％、约70％至约90％)、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％(如，约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、约99％至约100％、约95％至约96％、约95％至约97％、约95％至约98％或约95％至约99％)的一种或多种杂质。

在一个实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜之前，调节包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物的pH。包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物的pH优选为约4至约9(如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6.5至约7.5、约7至约8、约8至约9、约4.5至约6或约4.5至约5)。在一些实施方案中，混合物的pH为约6至约6.5(如，pH为5.5至7、pH为5.7至6.8、pH为5.8至6.7、pH为5.9至6.6或pH为6至6.5)，pH为约6或以下(如，pH为约4至6、约4至约5.5、约4至约4.5、约4至约5、约5至6)或pH为约6.5或以上(如，pH为6.5至约9、约6.5至约7、约7至约9、约7.5至约9或6.5至约8)。在一个实施方案中，混合物的pH大于7.5(如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)。例如，混合物的pH可为pH7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9。在另一实施方案中，混合物的pH为约4.8(如，约4.5至约5、约4.6至约5或约4.7至约4.9)。

多种离子交换色谱膜为本领域已知的并且可根据本文所述的发明使用。在一个实施方案中，离子交换色谱膜为阴离子交换膜，诸如Q膜。在另一实施方案中，离子交换色谱膜为阳离子交换膜，诸如S膜。在一个实施方案中，离子交换色谱膜为内毒素去除交换膜。Q、S和内毒素(E)膜可商购获得，例如，来自PallCorporationandSartoriusStedimBiotech。

在优选实施方案中，离子交换色谱膜为阴离子交换膜(如，Q膜)。阴离子交换膜为带正电荷的微孔膜。在一个实施方案中，带正电荷的阴离子交换部分为季铵基团。在一个实施方案中，带正电荷的微孔膜包含多孔基底和具有悬垂阳离子基团的交联的涂料(参见例如，美国专利No.6,780,327、6,851,561、7,094,347、7,223,341、7,396,465中描述的那些)。在一个实施方案中，多孔基底为亲水的(如，聚醚砜或交联的纤维素基质)。在另一实施方案中，阳离子基团为季铵基团。在另一实施方案中，阴离子交换膜为包含多孔的聚醚砜基底和具有悬垂季铵基团的交联的涂料的带正电荷的微孔膜。

已经描述了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的多种方法(参见，如，美国专利申请公布No.2012/0253021；国际专利申请公布No.WO2012/135522；美国专利5,208,020；美国专利6,441,163；美国专利7,811,572；美国专利申请公布No.2006/0182750；美国专利申请公布No.2008/0145374；和美国专利申请公布No.2011/0003969)。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中将修饰反应和缀合反应组合成单步骤，随后为纯化步骤(即，美国专利申请公布No.2012/0253021中描述的一步方法)，并且其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之前或纯化步骤之后经历离子交换色谱膜。一步方法包括使细胞结合剂(如，抗体)与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质(如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物，其中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂。然后第二混合物经历纯化以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物在纯化步骤之前，纯化步骤之后或纯化步骤之前和纯化步骤之后经历离子交换色谱膜。

一步反应优选在pH为约4至约pH9(如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，反应在pH为约6至约8(如，pH为约6、约6.5、约7、约7.5或约8)下进行。

在一个实施方案中，反应在pH为约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9下进行。在另一实施方案中，反应在pH为约7.5至约9、约7.5至约8.5、约7.5至约8、约7.8至约9、约7.8至约8.5、约7.8至约8、约8至约9、约8至约8.5或约8.5至约9下进行。在另一实施方案中，反应在pH为约7.8(如，pH为7.6至8.0或pH为7.7至7.9)下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约8(如，pH为7.8至8.2或pH为7.9至8.1)下进行。

在另一实施方案中，反应在pH大于7.5(如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)下进行。

在一个实施方案中，接触通过以下实现：提供细胞结合剂，然后使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂与细胞毒性剂的第一混合物与双官能交联剂接触。例如，在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，将细胞毒性剂加入至反应容器(从而接触细胞结合剂)，然后将双官能交联剂加入至包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中(从而接触包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物)。在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并在向容器提供细胞结合剂之后立即将细胞毒性剂加入至反应容器中。在另一实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并在向容器提供细胞结合剂之后的时间间隔(如，在向空间提供细胞结合剂之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1天或更久)后将细胞毒性剂加入至反应容器中。可迅速地(即，短的时间间隔内，诸如约5分钟，约10分钟)或缓慢地(诸如通过使用泵)加入细胞毒性剂。

然后，包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物可与双官能交联剂在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后立即接触或在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后某个较迟点(laterpoint)(如，约5分钟至约8小时或更久)接触。例如，在一个实施方案中，在将细胞毒性剂加入至包含细胞结合剂的反应容器中之后立即将双官能交联剂加入至包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中。或者，在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更久，包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物可与双官能交联剂接触。

在另一实施方案中，通过多个循环(如，1、2、3、4、5或更多个循环)加入细胞毒性剂和双官能剂。例如，本发明提供了包括以下步骤的方法：a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物；然后使第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质(如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物，其中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂；b)使第二混合物与细胞毒性剂接触以形成第三混合物；然后使第三混合物与双官能交联剂在pH为约4至约9下接触以提供第四混合物；以及c)纯化第四混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，在步骤a)之后的时间间隔(如，约1小时、约2小时、约3小时或更久)后进行步骤b)。在另一实施方案中，在进行步骤c)之前，可将步骤b)重复若干次(如，1、2、3、4或更多次)。可在起始步骤b)之后的时间间隔(如，约1小时、约2小时、约3小时或更久)后进行另外的步骤b)。

在另一实施方案中，在完成加入细胞毒性剂之前加入双官能交联剂。例如，在一个实施方案中，在时间间隔(如，经约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更久)内将细胞毒性剂连续地加入至细胞结合剂中以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物。在结束加入细胞毒性剂之前，将双官能交联剂加入至包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中，条件是任何时间，细胞毒性剂摩尔过量于双官能交联剂。在一个实施方案中，在时间间隔内(如，经约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更久)连续地加入双官能交联剂。

在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后，使反应进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更久(如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的第二混合物，所述缀合物包含通过接头化学偶联至细胞毒性剂和一种或多种杂质的细胞结合剂；(b)使第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(c)在步骤(b)之后使纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从杂质中进一步纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与纯化的第二混合物相比，纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少。本文所述的任何纯化方法可用于发明方法中。在优选实施方案中，利用正切流动过滤、吸附色谱法或非吸附色谱法作为纯化步骤。

在本发明的一个实施方案中，使细胞结合剂与双官能交联剂(即，修饰反应)接触产生包含具有结合至其的接头的细胞结合剂和一种或多种杂质(如，反应物和其它副产物)的第一混合物。在本发明的一些实施方案中，第一混合物包含具有稳定和不稳定结合至其的接头的细胞结合剂和一种或多种杂质(如，反应物和其它副产物)。在一段时间内于正常储存条件(范围可为几个月至几年)下当接头和细胞结合剂之间的共价键大体上未变弱或断裂时，接头“稳定地”结合至细胞结合剂。相比之下，在一段时间内于正常储存条件(范围可为几个月至几年)下当接头和细胞结合剂之间的共价键大体上变弱或断裂时，接头“不稳定地”结合至细胞结合剂。

修饰反应优选在pH为约4至约pH9(如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，修饰反应在pH为约6至约8(如，pH为约6、约6.5、约7、约7.5或约8)下进行。

在一个实施方案中，修饰反应在pH为约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约7.5至约9、约7.5至约8.5、约7.5至约8、约7.8至约9、约7.8至约8.5、约7.8至约8、约8至约9、约8至约8.5或约8.5至约9下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约7.8(如，pH为7.6至8.0或pH为7.7至7.9)下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约8(如，pH为7.8至8.2或pH为7.9至8.1)下进行。

在另一实施方案中，修饰反应在pH大于7.5(如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)下进行。例如，发明方法包括使细胞结合剂与双官能交联剂在pH为7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9的溶液中接触。

在本发明的一个实施方案中，从修饰反应期间产生的杂质(如，反应物和副产物)中纯化修饰的细胞结合剂通过使修饰反应产生的混合物(即，第一混合物)经历纯化过程进行。在这方面，可使用正切流动过滤(TFF)(如，基于膜的正切流动过滤方法)、非吸附色谱法、吸附色谱法、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它合适的纯化方法以及它们的组合纯化第一混合物。与根据本发明纯化之前的第一混合物相比，该第一纯化步骤提供了纯化的第一混合物，即，增加浓度的具有结合至其的接头的细胞结合剂和减少量的未结合的双官能交联剂。优选地，使用正切流动过滤或吸附色谱法(如，离子交换色谱法，诸如陶瓷羟磷灰石)纯化第一混合物。

在纯化第一混合物以获得具有结合至其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物之后，通过使在第一纯化的混合物中具有结合至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以形成第二混合物，其中产生包含通过接头化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂和一种或多种杂质(如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物。

任选地，可以省略修饰的细胞结合剂的纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，包含具有结合至其的接头的细胞结合剂以及反应物和其它副产物的第一混合物未经历纯化方法。在此类情况下，细胞毒性剂可以与交联剂同时添加或在将交联剂加入至细胞结合剂之后的某个较迟点如，1、2、3或更多小时加入细胞毒性剂。通过使修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应，修饰的细胞结合剂缀合于细胞毒性剂(如，类美坦素(maytansinoid))，其中缀合步骤导致稳定的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、不稳定的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、未缀合的细胞毒性剂(即，“游离的”细胞毒性剂)、反应物和副产物的混合物的形成。

缀合反应优选地在pH为约4至约pH9(如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6.0至约7或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，缀合反应在pH为约6至约6.5(如，pH为5.5至7、pH为5.7至6.8、pH为5.8至6.7、pH为5.9至6.6或pH为6至6.5)，pH为约6或以下(如，pH为约4至6、约4至约5.5、约5至6)或pH为约6.5或以上(如，pH为6.5至约9、约6.5至约7、约7至约9、约7.5至约9或6.5至约8)下进行。在一个实施方案中，缀合反应在pH为约4至pH小于6或在pH大于6.5至9下进行。当缀合步骤在pH为约6.5或以上进行时，一些含有巯基的细胞毒性剂可易于通过二硫键形成而二聚化。在一个实施方案中，可能需要从反应混合物中去除微量金属和/或氧以及任选加入抗氧化剂或使用具有更多反应性离去基团的接头或加入多于一等份的细胞毒性剂以允许在此类情况下有效的反应。

在缀合步骤之后，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历纯化步骤。在这方面，可使用正切流动过滤(TFF)(如基于膜的正切流动过滤方法)、非吸附色谱法、吸附色谱法、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它合适的纯化方法以及它们的组合纯化缀合混合物。本领域普通技术人员将理解缀合步骤之后的纯化使能够分离包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的纯化的缀合物，其中与纯化步骤之前的缀合物相比，缀合物包含杂质的量有所减少。在一个实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后且纯化步骤之前经历离子交换色谱膜以便在纯化之前从混合物去除至少部分杂质。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之后经历离子交换色谱膜以便去除在纯化之后混合物中剩余的至少部分杂质。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括修饰步骤之后的第一纯化步骤和缀合步骤之后的第二纯化步骤，其中所述方法包括在第二纯化步骤之前或之后使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使细胞结合剂与双官能交联剂接触以将接头共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物，(b)使第一混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合，从而制备具有结合至其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，(c)通过使在纯化的第一混合物中具有结合至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以制备包含含有通过接头化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂和一种或多种杂质的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的第二混合物，(d)使第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(e)在步骤(d)之后使纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以进一步从杂质中纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，从而制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少。

本文描述的任何纯化方法可用于发明方法。在本发明的一个实施方案中，正切流动过滤(TFF，也称为交叉流动过滤、超滤和渗滤)和/或吸附色谱树脂用于纯化步骤。例如，发明方法可包括在修饰步骤之后使用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用TFF的第二纯化步骤。或者，发明方法可包括在修饰步骤之后使用吸附色谱法的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用吸附色谱法的第二纯化步骤。发明方法还可包括在修饰步骤之后使用吸附色谱法的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用TFF的第二纯化步骤或在修饰步骤之后使用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用吸附色谱法的第二纯化步骤。

在本发明的一个实施方案中，非吸附色谱法用作纯化步骤。例如，发明方法可包括在修饰步骤之后使用非吸附色谱法的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用非吸附色谱法的第二纯化步骤。

在另一实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物在修饰反应之后且缀合反应之前未经历纯化，其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜。当省略修饰的细胞结合剂的纯化时，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括修饰步骤、缀合步骤以及缀合步骤之后的第一纯化步骤，其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在第一纯化步骤之前或之后经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使细胞结合剂与双官能交联剂接触以将接头共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物，(b)通过使第一混合物中具有结合至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂反应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以制备包含含有通过接头化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，(c)使第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(d)在步骤(c)之后使纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从杂质中进一步纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少，并且其中包含在步骤(a)中制备的具有结合至其的接头的细胞结合剂(以及反应物和其它副产物)的第一混合物未在步骤(b)之前经历纯化方法。本文描述的任何纯化方法可用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附色谱法或非吸附色谱法用作缀合反应之后的纯化步骤。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中所述方法包括将预先形成的细胞毒性剂-接头化合物缀合于细胞结合剂，如美国专利6,441,163和美国专利申请公布No.2011/0003969及2008/0145374所述，随后进行纯化步骤，其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之前或之后经历离子交换色谱膜。本文描述的任何纯化方法可用于发明方法。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附色谱法或非吸附色谱法用作纯化步骤。

在一个实施方案中，细胞毒性剂-接头化合物通过使细胞毒性剂与包含接头的双官能交联剂接触以将细胞毒性剂共价连接至接头来制备。在细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂接触之前，细胞毒性剂-接头化合物任选地经历纯化。

在本发明的一个实施方案中，本文描述的发明方法(如，一步方法)包括缀合步骤之后的两个单独的纯化步骤。当发明方法包括缀合步骤之后的两个单独的纯化步骤时，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物可在纯化步骤之前或纯化步骤之后的任一者或两者经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。本文描述的任何纯化方法可用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附色谱法、非吸附色谱法或它们的组合用作缀合反应之后的纯化步骤。

在一个实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜(如，Q膜或S膜)之前，使混合物经历纯化。在一个实施方案中，在使混合物经历纯化之前，使混合物经历离子交换色谱膜。在另一实施方案中，在使混合物经历纯化之前和之后，使混合物经历离子交换色谱膜。在另一实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜之前和之后，使混合物经历纯化膜。

任何合适的TFF系统可以用于纯化，包括Pellicon型系统(Millipore,Billerica,MA)、SartoconCassette系统(SartoriusAG,Edgewood,NY)和Centrasette型系统(PallCorp.,EastHills,NY)。

任何合适的吸附色谱树脂可以用于纯化。优选的吸附色谱树脂包括羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱法、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及它们的组合。合适的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石(CHTI型和II型,Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)、HAUltrogel羟磷灰石(PallCorp.,EastHills,NY)和陶瓷氟磷灰石(CFTI型和II型,Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的HCIC树脂的实例为MEPHypercel树脂(PallCorp.,EastHills,NY)。合适的HIC树脂的实例包括丁基-琼脂糖、己基-琼脂糖、苯基-琼脂糖和辛基-琼脂糖树脂(均来自于GEHealthcare,Piscataway,NJ)以及Macro-prep甲基和Macro-Prep叔丁基树脂(BioradLaboratories,Hercules,CA)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖、CM-琼脂糖和Q-琼脂糖树脂(均来自于GEHealthcare,Piscataway,NJ)以及UnosphereS树脂(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的混合模式离子交换剂的实例包括BakerbondABx树脂(JTBaker,PhillipsburgNJ)。合适的IMAC树脂的实例包括螯合琼脂糖树脂(GEHealthcare,Piscataway,NJ)和ProfinityIMAC树脂(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖树脂(GEHealthcare,Piscataway,NJ)和Affi-gel蓝色树脂(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的亲和树脂的实例包括蛋白A琼脂糖树脂(如，MabSelect,GEHealthcare,Piscataway,NJ)，其中细胞结合剂为抗体和凝集素亲和树脂，如Lentil凝集素琼脂糖树脂(GEHealthcare,Piscataway,NJ)，其中细胞结合剂具有适当的凝集素结合位点。或者可以使用对细胞结合剂特异性的抗体。此类抗体可固定于，例如，琼脂糖4FastFlow树脂(GEHealthcare,Piscataway,NJ)。合适的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂(GraceVydac,Hesperia,CA)。

任何合适的非吸附色谱树脂可以用于纯化。合适的非吸附色谱树脂的实例包括但不限于SEPHADEX^TMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYL^TM树脂(如，S-200和S-300)、SUPERDEX^TM树脂(如，SUPERDEX^TM75和SUPERDEX^TM200)、树脂(如，P-6、P-10、P-30、P-60和P-100)以及本领域普通技术人员已知的其它树脂。

发明方法包括在本领域已知的任何合适的温度下进行本文描述的反应(如，修饰反应、缀合反应或一步反应)。例如，反应可在约20℃或更低(如，约-10℃(条件是，如通过存在用于溶解细胞毒性剂和双官能交联剂的有机溶剂防止溶液冷冻)至约20℃、约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)或在高温(如，约30℃至约37℃)下发生。在一个实施方案中，反应在约16℃至约24℃(如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、或约25℃)的温度下发生。

在一个实施方案中，本文描述的发明方法还包括猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂的猝灭步骤。在纯化细胞结合剂细胞毒性剂之前进行猝灭步骤。或者，在纯化细胞结合剂细胞毒性剂之后进行猝灭步骤。在一个实施方案中，发明方法包括(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物，其中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂和杂质(如，游离细胞毒性剂和反应副产物)，(b)使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜，(c)在步骤(b)之后猝灭混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂，(d)使猝灭的混合物经历离子交换色谱膜，(e)任选地保持混合物，(f)使混合物任选地经历离子交换色谱膜，以及(g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，发明方法包括(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物，其中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂和杂质(如，游离细胞毒性剂和反应副产物)，(b)使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜，(c)在步骤(b)之后任选地猝灭混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂，(d)使猝灭的混合物任选地经历离子交换色谱膜，(e)保持混合物，(f)使混合物经历离子交换色谱膜，以及(g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

在一个实施方案中，通过使混合物与猝灭剂接触猝灭混合物。如本文所用，“猝灭剂”是指与游离细胞毒性剂和/或双官能交联剂反应的试剂。

在一个实施方案中，可使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺猝灭剂，诸如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰氨基丙酸来确保猝灭细胞毒性剂中的任何未反应的基团(诸如硫醇)。猝灭步骤可有助于防止细胞毒性剂的二聚化，特别是具有未反应的硫醇基细胞毒性剂(诸如DM1)。二聚化的细胞毒性剂难于去除。猝灭步骤还可以使任何不希望的硫醇-二硫化物与天然抗体二硫化物的交换反应最小化。在用极性、带电的硫醇-猝灭剂(诸如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)猝灭时，过量的、未反应的细胞毒性剂转化成极性的、带电的、水溶性加合物，其可在纯化步骤期间容易地从共价连接的缀合物中分离。也可使用非极性和中性硫醇-猝灭剂猝灭。

在一个实施方案中，通过使混合物与和未反应的双官能交联剂反应的猝灭剂接触猝灭混合物。例如，可将亲核试剂加入至混合物以便猝灭任何未反应的双官能交联剂。亲核试剂优选地为含有亲核试剂的氨基酸，诸如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。

或者，通过将混合物的pH降低至约5.0(如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)来猝灭混合物。在另一实施方案中，通过将pH降低至小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0来猝灭混合物。或者，将pH降低至约4.0(如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至约6.0(如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)，约4.0至约5.0，约4.5(如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至约5.0。在一个实施方案中，通过将混合物的pH降低至4.8来猝灭混合物。

在优选实施方案中，在混合物与猝灭剂接触之前，允许反应(如，修饰步骤、缀合步骤或一步反应)进行至完全。在这方面，在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后约1小时至约48小时(如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或约25小时至约48小时)将猝灭剂加入至混合物中。

发明方法可以任选地包括将蔗糖加入至反应步骤(如，修饰步骤、缀合步骤或一步反应)以增加细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的溶解度和回收率。期望以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)(如，约0.1％(w/v)、1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)或20％(w/v))的浓度加入蔗糖。优选地，以约1％(w/v)至约10％(w/v)(如，约0.5％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)或约11％(w/v))的浓度加入蔗糖。另外，反应步骤也可包括加入缓冲剂。可使用本领域已知的任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，缓冲剂选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸)以及它们的组合。

在一个实施方案中，发明方法还包括一个或多个(如，一个、两个或三个)保持步骤以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头。保持步骤包括在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后，在将细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之后和/或在纯化步骤之后保持混合物。当保持步骤包括在将细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之后和/或在缀合步骤之后的纯化步骤之后保持混合物，在保持步骤之前或保持步骤之后或两者，可使混合物经历离子交换色谱膜。在一个实施方案中，方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后经历保持步骤，其中在保持步骤之后且在纯化步骤之前使混合物经历离子交换色谱膜。在另一实施方案中，方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后经历保持步骤，其中在保持步骤之后使混合物经历纯化步骤，随后使混合物经历离子交换色谱膜。在使混合物经历离子交换色谱膜之前，混合物可以任选地经历第二保持步骤。

保持步骤包括将溶液在合适的温度(如，约2℃至约37℃)维持合适的时间段(如，约1小时至约1周)以从细胞结合剂中释放不稳定结合的接头而大体上不会从细胞结合剂中释放稳定结合的接头。在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液维持在低温(如，约2℃至约10℃或约4℃)、室温(如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)或高温(如，约30℃至约37℃)下。

保持步骤的持续时间取决于保持步骤进行的温度。例如，保持步骤的持续时间可通过在高温下进行保持步骤而大量减少，其中最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性的限制。保持步骤可包括将溶液维持约1小时至约1天(如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时)、约5小时至约1周、约12小时至约1周(如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)、约12小时至约1周(如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)或约1天至约1周。

在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液在约2℃至约8℃的温度下维持至少约12小时至长达1天的时段。

保持步骤的pH值优选为约4至约9(如，约4.5至约8.5或约5至约8)。在一个实施方案中，保持步骤的pH值范围为约5至约7.5(如，约5.5至约7.5、约6至约7.5、约6.5至约7.5、约7至约7.5、约5至约7、约5至约6.5、约5至约5.5、约5.5至约7、约6至约6.5或约6至约7)。例如，保持步骤的pH值可为约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5或约9。

保持步骤可在细胞结合剂缀合于细胞毒性剂之前或之后进行。在一个实施方案中，保持步骤在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后直接进行。例如，发明方法包括在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后且在缀合之前的保持步骤。在修饰细胞结合剂之后，纯化步骤可以在保持步骤之前和/或保持步骤之后但在缀合步骤之前进行。在另一实施方案中，保持步骤在细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之后且在纯化步骤之前直接进行。在另一实施方案中，保持步骤在缀合步骤和纯化步骤以及随后的另外的纯化步骤之后进行。

在特定实施方案中，保持步骤可包括在约2℃至约室温下将混合物在pH为约5-7.5或约6.5-7.5下孵育约1小时至约1周。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括加入外源性NHS。如本文所用，“外源性NHS”是指在方法期间从外源加入NHS，并且并不指在修饰反应期间由于双功能接头的水解/氨解而产生的NHS。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括加入约0.1mM至约300mM外源性NHS。例如，发明方法包括加入约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.3mM、约1.5mM、约1.7mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.3mM、约2.5mM、约2.7mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.3mM、约3.5mM、约3.7mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.3mM、约4.5mM、约4.7mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.3mM、约5.5mM、约5.7mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.3mM、约6.5mM、约6.7mM、约6.9mM、约7.0mM、约7.1mM、约7.3mM、约7.5mM、约7.7mM、约7.9mM、约8.0mM、约8.1mM、约8.3mM、约8.5mM、约8.7mM、约8.9mM、约9.0mM、约9.1mM、约9.3mM、约9.5mM、约9.7mM、约9.9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM或约300mM外源性NHS。在一个实施方案中，发明方法包括加入约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约10mM、约1.0mM至约5mM、约1.0mM至约10mM、约5.0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、约40mM至约50mM、约50mM至约60mM、约60mM至约70mM、约70mM至约80mM、约80mM至约90mM、约90mM至约100mM、约100mM至约110mM、约110mM至约120mM、约120mM至约130mM、约130mM至约140mM、约140mM至约150mM、约150mM至约160mM、约160mM至约170mM、约170mM至约180mM、约180mM至约190mM、约190mM至约200mM、约200mM至约220mM、约220mM至约240mM、约240mM至约260mM、约260mM至约280mM或约280mM至约300mM外源性NHS。在另一实施方案中，发明方法包括加入约10mM至约200mM、约20至约150mM、约50至约150mM或约20至约100mM外源性NHS。

在一些实施方案中，发明方法包括相对于修饰反应期间由于双官能接头的水解/氨解产生的NHS的量加入外源性NHS的摩尔比率。本领域普通技术人员可确定特定修饰期间产生的NHS的量，因为产生的NHS的量基本上与使用的双官能交联剂的量相同。然后，技术人员可将相对于修饰反应期间产生的NHS的量的摩尔比率的外源性NHS加入至反应混合物。在一个实施方案中，加入相对于修饰反应期间产生的NHS的量的约2至约200倍的外源性NHS。例如，发明方法包括加入相对于修饰反应期间产生的NHS的量的约2、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约100或约200倍的外源性NHS。

在一些实施方案中，发明方法包括加入相对于双官能接头的量的摩尔比率的外源性NHS。在一个实施方案中，外源性NHS与双官能交联剂的摩尔比率为约0.5至约1000(如，约1至约900、约5至约750、约50至约500、约100至约500、约0.5至约500或约100至约1000。例如，发明方法包括相对于双官能接头的量的约0.5、约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约100、约200、约300、约400、约500，约600，约700，约800，约900或约1000倍NHS。

发明方法包括在制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法期间在任何点处加入外源性NHS。例如，发明方法包括将外源性NHS加入至修饰步骤(即，其中细胞结合剂与双官能接头反应的步骤)、至缀合步骤(即，其中修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应的步骤)、至纯化步骤或任何上述步骤之间的保持步骤。在一个实施方案中，发明方法包括将外源性NHS加入至修饰步骤(即，将NHS加入至修饰反应)、至修饰步骤与纯化步骤之间的保持步骤、至修饰步骤与缀合步骤之间的保持步骤、至纯化步骤、至缀合步骤、至缀合步骤与纯化步骤之间的保持步骤和/或至两个纯化步骤之间的保持步骤。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备具有结合至其的接头的细胞结合剂的方法，所述方法包括将细胞结合剂与双官能交联剂在存在外源性NHS的情况下接触以将接头共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的混合物。

本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组合物的方法，其中所述组合物大体上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供了用于制备大体上高纯度和稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法。由于缀合物的高纯度和稳定性，此类组合物可用于治疗疾病。包含化学偶联至细胞毒性剂，诸如类美坦素的细胞结合剂，诸如抗体的组合物描述于例如，美国专利7,374,762。在本发明的一个方面，大体上高纯度的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有一种或多种以下特征：(a)大于约90％(如，大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，优选地大于约95％的缀合物物质为单体，(b)缀合物制剂或纯化的缀合物中的未缀合接头水平小于约10％(如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)(相对于总接头)，(c)小于10％的缀合物物质交联(如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)，(d)缀合物制剂或纯化的缀合物中的游离细胞毒性剂水平小于约5％、小于约3％、小于约2％(如，小于或等于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(相对于总细胞毒性剂)，(f)缀合物制剂或纯化的缀合物中的细胞毒性二聚体物质水平小于约5％、小于约3％、小于约2％(如，小于或等于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(相对于总细胞毒性剂)，和/或(e)储存时游离细胞毒性剂水平未显著增加(如，在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年或约5年之后)。游离细胞毒性剂水平的“显著增加”意指在某些储存时间之后，游离细胞毒性剂水平的增加小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.2％、约2.5％、约2.7％、约3.0％、约3.2％、约3.5％、约3.7％或约4.0％。

如本文所用，术语“未缀合接头”是指与双官能交联剂共价连接的细胞结合剂，其中细胞结合剂未通过双官能交联剂的接头共价偶联至细胞毒性剂(即，“未缀合接头”可由CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂)。

如本文所用，术语“细胞毒性剂二聚体”是指包含游离细胞毒性剂的二聚体，其中细胞毒性剂未通过接头化学偶联至细胞结合剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂二聚体通过接头彼此化学偶联(即，“细胞毒性剂二聚体”可由D-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂并且L表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂)。在另一实施方案中，细胞毒性剂二聚体未通过接头彼此化学偶联(即，“细胞毒性剂二聚体”可由D-D表示，其中D表示细胞毒性剂。相比之下，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂)。在一个实施方案中，一些细胞毒性剂二聚体通过接头彼此化学偶联而一些细胞毒性剂二聚体未通过接头彼此化学偶联(即，“细胞毒性剂二聚体”可由D-L-D和D-D表示，其中D表示细胞毒性剂并且L表示双官能交联剂)。

在一个实施方案中，当接头为SMCC并且细胞毒性剂为DM1时，细胞毒性剂二聚体为DM1-DM1二聚体和DM1-MCC-DM1二聚体。

在另一实施方案中，当接头为SPP并且细胞毒性剂为DM1时，细胞毒性剂二聚体为DM1-DM1二聚体和DM1-SPP-DM1二聚体。

在另一实施方案中，当接头为CX1-1并且细胞毒性剂为DM1时，细胞毒性剂二聚体为DM1-DM1二聚体和DM1-CX1-1-DM1二聚体。

如本文所用，术语“游离的细胞毒性剂”是指未通过接头化学偶联至细胞结合剂的任何形式的细胞毒性剂(即，“游离的细胞毒性剂”可包括但不限于单独由D表示的细胞毒性剂，由D-L表示的与接头或接头衍生物(如，水解的衍生物)偶联的细胞毒性剂以及由如上所述的D-D和D-L-D表示的细胞毒性剂二聚体)。

在一个实施方案中，游离细胞毒性剂包括DM1、MCC-DM1、氢-SMCC-DM1、SMCC-DM1、DM1-SPP、DM1-TPA、DM1-DM1、DM1-MCC-DM1和DM1-SPP-DM1。

在另一实施方案中，游离细胞毒性剂包括DM4、DM4-磺基-SPDB、水解的DM4-磺基-SPDB、DM4-SPY和DM4-磺基-TBA。

如本文所用，术语“细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物”是指彼此共价或非共价偶联的两种或更多种细胞结合剂细胞毒性剂缀合物(如，通过接头共价偶联的两种或更多种细胞结合剂细胞毒性剂缀合物)。

在一个实施方案中，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中的细胞毒性剂与细胞结合剂的平均摩尔比率为约1至约10、约2至约7、约3至约5、约2.5至约4.5(如，约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0至约4.0、约3.2至约4.2、约4.5至5.5(如，约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5)。

细胞结合剂可为结合于细胞的任何合适的试剂，所述细胞通常且优选地为动物细胞(如，人细胞)。细胞结合剂优选地为肽或多肽或糖表位(glycotope)。合适的细胞结合剂包括，例如，抗体(如，单克隆抗体及其片段)、干扰素(如，α、β、γ)、淋巴因子(如，白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、激素(如，胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、类固醇激素、诸如雄激素和雌激素)、生长因子和集落刺激因子(诸如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF))、群落刺激因子(CSF)(诸如G-CSF、M-CSF和GM-CSF)(Burgess,ImmunologyToday5:155-158(1984))、营养运输分子(如，转铁蛋白)、维生素(如，叶酸)以及特异性地结合细胞表面上的靶分子的任何其它试剂或分子。

当细胞结合剂为抗体时，它结合于抗原，所述抗原为多肽并且可以为跨膜分子(如，受体)或配体，诸如生长因子。示例性抗原包括以下分子，诸如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促滤泡激素；降血钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子诸如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病(vonWillebrands)因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿液或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌)；人体巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；抑制穆氏管(Muellerian)物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)诸如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体诸如FGFR2/4和FGFR3，表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLR1、间皮素、cripto、α_vβ₆、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白诸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152或公开于美国专利申请公布No.2008/0171040或美国专利申请公布No.2008/0305044中结合于一种或多种肿瘤相关的抗原或细胞表面受体的抗体，且该公开通过引用整体并入；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；群落刺激因子(CSF)，如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸如，例如，HIV包膜部分；转运蛋白；归巢受体；地址素(addressin)；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；内皮因子、c-Met、IGF1R、前列腺抗原诸如PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2和STEAP1；LGR5、B7H4和上面列出的多肽的任一片段。

另外，结合于骨髓细胞的GM-CSF可用作急性髓性白血病患病细胞的细胞结合剂。结合于活化T细胞的IL-2可用于预防移植排斥、用于治疗和预防移植物抗宿主病和用于治疗急性T细胞白血病。结合于黑素细胞的MSH可用于治疗黑素瘤，可以是针对黑素瘤的抗体。叶酸可用于靶向在卵巢和其它肿瘤中表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞癌，诸如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向神经母细胞瘤和其它肿瘤类型。

可分别成功地用雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)作为细胞结合剂来靶向乳腺癌和睾丸癌。

如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，任何免疫球蛋白片段，诸如Fab、Fab’、F(ab’)₂、dsFv、sFv、微型抗体、二聚体、三聚体、四聚体(Parham,J.Immunol.131:2895-2902(1983)；Spring等人J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff等.Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960),Kim等,Mol.CancerTher.,7:2486-2497(2008),Carter,NatureRevs.,6:343-357(2006))或免疫球蛋白嵌合体，其可结合于细胞表面的抗原(如，其含有互补决定区(CDR))。任何合适的抗体可用作细胞结合剂。本领域普通技术人员将理解选择适当的抗体将取决于待靶向的细胞群体。在这方面，在特定细胞群体(通常且优选为患病细胞群体)中选择性表达的细胞表面分子(即，抗原)的类型和数目将决定用于本发明组合物的适当抗体的选择。细胞表面表达概况对多种细胞类型(包括肿瘤细胞类型)为已知的，或，如果未知，则可使用常规的分子生物学和组织化学技术确定。

抗体可为多克隆或单克隆的，但是最优选为单克隆抗体。如本文所用，“多克隆”抗体是指抗体分子的异源群体，通常包含于免疫动物的血清中。“单克隆”抗体是指对特定抗原具有特异性的抗体分子的同源群体。单克隆抗体通常由B淋巴细胞(“B细胞”)的单克隆产生。单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的多种技术获得，包括标准的杂交瘤技术(参见，如，和Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511-519(1976),Harlow和Lane(编辑),Antibodies:ALaboratoryManual,CSHPress(1988)以及C.A.Janeway等.(编辑),Immunobiology,第5版.,GarlandPublishing,NewYork,NY(2001))。简而言之，产生单克隆抗体的杂交瘤方法通常牵涉任何合适的动物，通常且优选为带有抗原(即，“免疫原”)的小鼠。随后处死动物，并将分离自其脾的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。产生杂交细胞(即，“杂交瘤”)，所述细胞无限期地增殖并在体外连续地分泌具有所需特异性的高滴度的抗体。本领域已知的任何适当的方法可用于鉴定产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤细胞。此类方法包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记分析和放射免疫测定。筛选杂交瘤群体以分离单独克隆，其每个分泌对抗原特异的单一抗体。因为每个杂交瘤为来源于与单个B细胞融合的克隆，所以其产生的所有抗体分子在结构上时相同的，包括它们的抗原结合位点和同种型。也可以使用其它合适的技术产生单克隆抗体，所述技术包括EBV-杂交瘤技术(参见，如，Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2):361-67(1984)和Roder等,MethodsEnzymol.,121:140-67(1986))，噬菌体载体表达系统(参见，如，Huse等,Science,246:1275-81(1989))，或包含抗体片段，诸如Fab和scFv(单链可变区)的噬菌体展示文库(参见，如，美国专利5,885,793和5,969,108以及国际专利申请公布WO92/01047和WO99/06587)。

单克隆抗体可分离自或产于任何合适的动物，但是优选产生于哺乳动物，更优选为小鼠或人，且最优选为人。在小鼠中制备抗体的方法为本领域技术人员熟知的并且在本文进行了描述。相对于人抗体，本领域普通技术人员将理解多克隆抗体可分离自用适当抗原接种或免疫的人受试者的血清。或者，可通过采用用于在非人动物诸如小鼠中产生人抗体的已知技术产生人抗体(参见，如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公布No.2002/0197266A1)。

尽管为用于人的治疗应用的理想选择，但人抗体，特别是人单克隆抗体通常比小鼠单克隆抗体更难于产生。然而，当施用于人时，小鼠单克隆抗体诱导迅速的宿主抗体反应，这可减少抗体-细胞毒性剂缀合物的治疗或诊断潜能。为了克服这些并发症，单克隆抗体优选地未被人免疫系统识别为“外来物”。

为了这个目的，噬菌体展示可用于产生抗体。在这方面，编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体库可使用标准的分子生物学和重组DNA技术(参见，如，Sambrook等(编辑)，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001))产生。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于与所需抗原特异性结合，并重构包含选定的可变结构域的完整的人抗体。将编码重构抗体的核酸序列引入合适的细胞系，诸如骨髓瘤细胞用于杂交瘤产生，使得具有单克隆抗体特征的人抗体由细胞分泌(参见，如，Janeway等，同上，Huse等，同上和美国专利6,265,150)。或者，单克隆抗体可由对人重链和轻链免疫球蛋白基因特异的转基因小鼠产生。此类方法为本领域已知的并且描述于，例如，美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等，同上。

最优选地，抗体为人源化抗体。如本文所用，“人源化”抗体为其中小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)移植至人抗体分子的框架的抗体，所述互补决定区形成抗体的抗原结合环。由于小鼠与人抗体的框架的类似性，本领域中通常接受的是本方法产生与人抗体具有抗原同一性但与源自其中的CDR序列的小鼠单克隆抗体结合相同抗原的单克隆抗体。用于产生人源化抗体的方法为本领域熟知的并且详细描述于，例如Janeway等，同上，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利No.0239400B1和英国专利No.2188638。人源化抗体也可使用美国专利5,639,641和Pedersen等,J.MolBiol.,235:959973(1994)中所述的抗体表面重塑技术产生。虽然本发明组合物的缀合物中最优选使用的抗体为人源化单克隆抗体，但人单克隆抗体和小鼠单克隆抗体，如上所述，也在本发明的范围内。

具有至少一个抗原结合位点并且因此识别并结合靶细胞表面上存在的至少一个抗原或受体的抗体片段也在本发明的范围内。在这方面，完整抗体分子的蛋白水解裂解可产生保留识别且结合抗原的能力的多种抗体片段。例如，用木瓜蛋白酶有限消化抗体分子通常产生三个片段，其中两个为相同的并且被称为Fab片段，因为它们保留亲代抗体分子的抗原结合活性。用胃蛋白酶切割抗体分子通常产生两个抗体片段，其中之一保留抗体分子的两个抗原结合臂，并且因此被称为F(ab’)₂片段。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab’)₂片段产生被称为Fab’片段的片段。单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由包含经由合成肽连接于抗体轻链的V结构域的抗体重链的可变(V)结构域的截短的Fab片段组成，可使用常规的重组DNA技术(参见，如，Janeway等，同上)产生。类似地，二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可通过重组DNA技术制备(参见，如，Reiter等,ProteinEngineering,7:697-704(1994))。然而，在本发明的上下文中的抗体片段并不限于这些示例性类型的抗体片段。可利用识别且结合于所需细胞表面受体或抗原的任何合适的抗体片段。抗体片段进一步描述于，例如，Parham,J.Immunol.,131:2895-2902(1983),Spring等,J.Immunol.,113:470-478(1974)和Nisonoff等,Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244(1960)。抗体-抗原结合可使用本领域已知的任何合适的方法测定，诸如，例如，放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印记、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，如，Janeway等，同上，和美国专利申请公布No.2002/0197266A1)。

另外，抗体可为嵌合抗体或其抗原结合片段。“嵌合的”意指抗体包含至少两个获得自或源自至少两种不同物种(如，两种不同的免疫球蛋白，诸如与鼠免疫球蛋白可变区组合的人免疫球蛋白恒定区)的免疫球蛋白或其片段。抗体也可为域抗体(dAb)或其抗原结合片段，诸如，例如，骆驼抗体(参见，如，Desmyter等,NatureStruct.Biol.,3:752,(1996))或鲨鱼抗体，诸如，例如，新的抗原受体(IgNAR)(参见，如，Greenberg等,Nature,374:168(1995)和Stanfield等,Science,305:1770-1773(2004))。

任何合适的抗体可用于本发明的上下文中。例如，单克隆抗体J5为对常见急性成淋巴细胞性白血病抗原(CALLA)具有特异性的鼠IgG2a抗体(Ritz等,Nature,283:583-585(1980))，并且可用于靶向表达CALLA的细胞(如，急性成淋巴细胞性白血病细胞)。单克隆抗体MY9为特异性结合于CD33抗原的鼠IgGl抗体(Griffin等,LeukemiaRes.，8:521(1984))并且可用于靶向表达CD33的细胞(如，急性骨髓性白血病(AML)细胞)。

类似地，单克隆抗体抗-B4(也被称为B4)为结合于B细胞上的CD19抗原的鼠IgGl抗体(Nadler等,J.Immunol.,131:244-250(1983))，并且可用于靶向表达CD19的B细胞或患病细胞(如，非霍奇金淋巴瘤细胞和慢性成淋巴细胞性白血病细胞)。N901为结合于在神经内分泌来源的细胞(包括小细胞肺肿瘤)中发现的CD56(神经细胞粘附分子)抗原的鼠单克隆抗体，其可用于将药物靶向神经内分泌来源的细胞的缀合物中。在J5、MY9和B4抗体用作部分缀合物之前，优选地对其进行表面重塑或人源化。抗体的表面重塑或人源化描述于，例如，Roguska等,Proc.NatlAcad.Sci.USA,91:969-73(1994)。在一个实施方案中，抗-B4抗体为huB4。在另一实施方案中，抗-B4抗体包含重链和轻链，其中重链具有以下序列

QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSlSLSPGK(SEQIDNO：1)

并且轻链具有以下序列

EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWTYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO：2)。

另外，单克隆抗体C242结合于CanAg抗原(参见，如，美国专利5,552,293)，并且可用于将缀合物靶向表达CanAg的肿瘤，诸如结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。HuC242为单克隆抗体C242的人源化形式(参见，如，美国专利5,552,293)。产生HuC242的杂交瘤以ECACC识别号90012601保藏。HuC242可使用CDR-移植方法学(参见，如，美国专利5,585,089、5,693,761和5,693,762)或表面重塑技术(参见，如，美国专利5,639,641)制备。HuC242可用于将缀合物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞，诸如，例如，结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞和胃癌细胞。

为了靶向卵巢癌和前列腺癌细胞，抗-MUC1抗体可被用作缀合物中的细胞结合剂。抗-MUC1抗体包括，例如，抗-HMFG-2(参见，如，Taylor-Papadimitriou等，Int.J.Cancer，28：17-21(1981))、hCTM01(参见，如，vanHof等，CancerRes.，56：5179-5185(1996))和DS6。也可通过将抗-前列腺-特异性膜抗原(PSMA)用作细胞结合剂，诸如J591(参见，如，Liu等,CancerRes.,57:3629-3634(1997))用缀合物靶向前列腺癌细胞。而且，可通过将抗-HER2抗体，如，曲妥单抗，用作细胞结合剂用缀合物靶向表达Her2抗原的癌细胞，诸如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。可通过使用抗-EGFR抗体用缀合物靶向表达表皮生长因子受体(EGFR)及其变体的细胞，诸如III型缺失突变体，EGFRvIII。抗-EGFR抗体描述于国际专利申请No.PCT/US11/058385和PCT/US11/058378。抗-EGFRvIII抗体描述于美国专利7,736,644和7,628,986以及美国专利申请公布2010/0111979；2009/0240038；2009/0175887；2009/0156790；和2009/0155282。结合于胰岛素样生长因子受体的抗-IGF-IR抗体，诸如描述于美国专利7,982,024的那些，也可用于缀合物中。结合于CD27L、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整联蛋白、CD37、叶酸、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、内皮因子和Her3的抗体也可用于缀合物中。

在一个实施方案中，抗体选自huN901，抗-CD33抗体(如，huMy9-6)，huB4，huC242，抗-HER2抗体(如，曲妥单抗)，比伐珠单抗(bivatuzumab)，西罗珠单抗，利妥昔单抗，huDS6，描述于国际专利申请公布WO2010/124797中的抗-间皮素抗体(诸如MF-T)，描述于美国专利申请公布2010/0093980中的抗-cripto抗体(诸如huB3F6)，描述于美国专利申请公布2007/0183971中的抗-CD138抗体(诸如B-B4或人源化B-B4或nBT062)，描述于国际专利申请公布WO2012/058592和WO2012/058588中的抗-EGFR抗体(诸如EGFR-7))，描述于美国专利7,736,644和7,628,986以及美国专利申请公布2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中的抗-EGFRvIII抗体，描述于国际专利申请公布WO2011/039721和WO2011/039724中的人源化EphA2抗体(诸如2H11R35R74)；描述于国际专利申请公布WO2008/047242(诸如hu38SB19)中的抗-CD38抗体，描述于国际专利申请公布WO2011/106528和美国专利申请公布2012/0009181中的抗-叶酸受体抗体(如，huMov19形式1.0或1.6)；描述于美国专利5,958,872、6,596,743和7,982,024中的抗-IGF1R抗体；描述于美国专利申请公布2011/0256153中的抗-CD37抗体(如，huCD37-3形式1.0)；描述于美国专利申请公布2006/0127407中的抗-整联蛋白α_vβ₆抗体(如，CNT095)；以及描述于国际专利申请公布WO2012/019024中的抗-Her3抗体。在本发明的一个实施方案中，抗体不为huN901或CNTO95。在一个实施方案中，抗-CD37抗体为huCD37-3，其中抗体包含可变重链和可变轻链，其中所述可变重链具有以下序列

QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSS(SEQIDNO：3)

并且所述可变轻链具有以下序列

DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLEIKR(SEQIDNO：4)。

尽管细胞结合剂优选为抗体，但细胞结合剂也可为非抗体分子。合适的非抗体分子包括，例如，干扰素(如，α、β或γ干扰素)，淋巴因子(如，白细胞介素2(IL-2)、IL-3、IL-4或IL-6)，激素(如，胰岛素)，生长因子(如，EGF、TGF-α、FGF和VEGF)，集落刺激因子(如，G-CSF、M-CSF和GM-CSF(参见，如，Burgess,ImmunologyToday,5:155-158(1984))，生长抑素和转铁蛋白(参见，如，O’Keefe等,J.BiolChem.,260:932-937(1985))。例如，结合于骨髓细胞的GM-CSF可用作靶向急性骨髓性白血病细胞的细胞结合剂。另外，结合于活化T-细胞的IL-2可用于预防移植排斥、用于治疗和预防移植物抗宿主病和用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子(EGF)可用于靶向鳞癌诸如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向神经母细胞瘤细胞和其它肿瘤细胞类型。

缀合物可包含任何合适的细胞毒性剂。如本文所用，“细胞毒性剂”是指导致细胞死亡、诱导细胞死亡或降低细胞活力的任何化合物。合适的细胞毒性剂包括，例如，类美坦素和类美坦素类似物、紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物以及多拉司他汀和多拉司他汀类似物。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂为类美坦素，包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物。类美坦素为抑制微管形成且对哺乳动物细胞具有高毒性的化合物。合适的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳族环的那些以及在其它位置具有修饰的那些。此类类美坦素描述于，例如，美国专利4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545和6,333,410中。

具有修饰的芳族环的美登醇类似物的实例包括：(1)C-19-去氯(美国专利4,256,746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的LAH还原制备)，(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌属去甲基化或通过使用LAH脱氯制备)，以及(3)C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-去氯(美国专利4,294,757)(通过使用酰氯酰化制备)。

具有修饰除了芳族环之外的位置的美登醇类似物的实例包括：(1)C-9-SH(美国专利4,424,219)(通过美登醇与H₂S或P₂S₅的反应制备)，(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH₂OR)(美国专利4,331,598)，(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美国专利4,450,254)(由诺卡氏菌属制备)，(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4,364,866)(由链霉菌属转化美登醇制备)，(5)C-15-甲氧基(美国专利4,313,946和4,315,929)(分离自滑桃树(Trewianudiflora))，(6)C-18-N-去甲基(美国专利4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌属对美登醇去甲基化而制备)，以及(7)4,5-脱氧(美国专利4,371,533)(通过三氯化钛/美登醇的LAH还原而制备)。

在本发明的优选实施方案中，缀合物将含有硫醇的类美坦素DM1(也称为N^2’-脱乙酰基-N^2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)用作细胞毒性剂。DM1的结构由式(I)表示：

在本发明的另一优选实施方案中，缀合物将含有硫醇的类美坦素DM4(也称为N^2’-脱乙酰基-N^2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素)用作细胞毒性剂。DM4的结构由式(II)表示：

其它美登素可以用于本发明的上下文中，包括，例如，在具有硫原子的碳原子上具有单烷基取代或二烷基取代的含有硫醇和二硫化物的类美坦素。特别优选地为在C-3位置具有(a)C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基官能团，并且(b)含有具有被阻碍的巯基基团的酰基的酰化的氨基酸侧链的类美坦素，其中具有硫醇官能团的酰基的所述碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基为CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，并且其中取代基中的一者可为H，并且其中所述酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。

用于本发明的上下文中的另外的美登素包括由式(III)表示的化合物：

其中Y^’表示

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，并且其中R₂也可为H，

其中A、B、D为具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团，

其中R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁和R₁₂各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，

其中l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立地为零或1至5的整数，条件是至少l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个在任何时候不为零，并且

其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基或简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团。

式(III)的优选实施方案包括式(III)的化合物，其中(a)R₁为H，R₂为甲基并且Z为H，(b)R₁和R₂为甲基并且Z为H，(c)R₁为H，R₂为甲基，并且Z为-SCH₃，以及(d)R₁和R₂为甲基并且Z为-SCH₃。

此类另外的美登素还包括由式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D,L)表示的化合物：

其中Y表示(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，

其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可为零，

其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团，并且其中May表示在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处具有侧链的类美坦素。

式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)的优选实施方案包括式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)的化合物，其中(a)R₁为H，R₂为甲基，R₅、R₆、R₇和R₈各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为H，(b)R₁和R₂为甲基，

R₅、R₆、R₇、R₈各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为H，(c)R₁为H，R₂为甲基，R₅、R₆、R₇和R₈各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为-SCH₃，或(d)R₁和R₂为甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为-SCH₃。

优选地，细胞毒性剂由式(IV-L)表示。

另外优选的美登素也包括由式(V)表示的化合物：

其中Y表示(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可为零，并且

其中Z为H、SR或COR，其中R为具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团。

式(V)的优选实施方案包括式(V)的化合物，其中(a)R₁为H，R₂为甲基，R₅、R₆、R₇和R₈各自为H；l和m各自为1；n为0；并且Z为H，(b)R₁和R₂为甲基；R₅、R₆、R₇、R₈各自为H，l和m为1；n为0；并且Z为H，(c)R₁为H，R₂为甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自为H，l和m为1；n为0；并且Z为-SCH₃，或(d)R₁和R₂为甲基；R₅、R₆、R₇、R₈各自为H，l和m为1；n为0；并且Z为-SCH₃。

进一步优选的美登素包括由式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D,L)表示的化合物：

其中Y₂表示(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ₂，

其中R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链环状烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，

其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可为零，

其中Z₂为SR或COR，其中R为具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团，并且其中May为类美坦素。

另外优选的美登素包括由式(VII)表示的化合物：

其中Y_2’表示

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ₂，其中R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1至10个碳原子的直链支链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳族或杂环烷基基团，并且另外R₂可为H，

其中A、B、D为具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团，

其中Z₂为SR或COR，其中R为具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳族或杂环烷基基团。

式(VII)的优选实施方案包括式(VII)的化合物，其中R₁为H并且R₂为甲基。

除了类美坦素之外，缀合物中使用的细胞毒性剂可为紫杉烷或其衍生物。紫杉烷为包括紫杉醇细胞毒性天然产物和多西他赛半合成衍生物的化合物家族，它们均广泛用于治疗癌症。紫杉烷为抑制微管蛋白解聚的有丝分裂纺锤体抑制剂，从而导致细胞死亡。虽然多西他赛和紫杉醇为可用于治疗癌症的药剂，但由于其对正常细胞的非特异性毒性，所以它们的抗肿瘤活性受到限制。此外，像紫杉醇和多西他赛的化合物自身在细胞结合剂的缀合物的使用中并不是充分有效的。

用于制备细胞毒性缀合物中的优选的紫杉烷为式(VIII)的紫杉烷：

用于合成可在本发明的上下文中使用的紫杉烷的方法连同将紫杉烷缀合于细胞结合剂诸如抗体的方法详细描述于美国专利5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6,706,708、6,716,821和7,390,898。

细胞毒性剂也可为CC-1065或其衍生物。CC-1065为分离自泽耳链霉菌(Streptomyceszelensis)的培养基的有效的抗肿瘤抗生素。在体外CC-1065为比通常使用的抗癌药物，诸如多柔比星、甲氨蝶呤和长春新碱有效约1000倍(Bhuyan等,CancerRes.,42:3532-3537(1982))。CC-1065及其类似物公开于美国专利5,585,499、5,846,545、6,340,701和6,372,738。CC-1065的细胞毒性效力已经与它的烷基化活性及其DNA-结合活性或DNA-嵌入活性相关。这两种活性存在于分子的独立部分。在这方面，烷基化活性包含于环丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole)(CPI)亚基，而DNA结合活性存在于CC-1065的两个吡咯并吲哚亚基中。

若干CC-1065类似物为本领域已知的并且也可用作缀合物中的细胞毒性剂(参见，如，Warpehoski等,J.Med.Chem.,31:590-603(1988))。已经开发了一系列CC-1065类似物，其中CPI部分被环丙苯并吲哚(cyclopropabenzindole)(CBI)部分取代(Boger等,J.Org.Chem.,55:5823-5833(1990),和Boger等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1:115-120(1991))。这些CC-1065类似物保持亲本药物的高体外效力而不会引起小鼠的延迟毒性。像CC-1065，这些化合物为共价结合于DNA的小沟以引起细胞死亡的烷化剂。

CC-1065类似物的治疗效果可通过靶向递送至肿瘤位点来改变体内分布而得到很大的改善，这对非靶组织产生较低的毒性，并因此产生较低的系统毒性。为了这个目的，已经产生了含有特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的CC-1065的类似物及衍生物的缀合物(参见，如，美国专利5,475,092、5,585,499和5,846,545)。这些缀合物通常显示出高的体外靶向特异性细胞毒性并在小鼠的人肿瘤异种移植模型中显示出高的抗肿瘤活性(参见，如，Chari等,CancerRes.,55:4079-4084(1995))。

用于合成CC-1065类似物的方法详细描述于美国专利5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,534,660、6,586,618、6,756,397和7,329,760中。

诸如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利车霉素(calicheamicin)、妥布力辛(tubulysin)和妥布力辛类似物、多卡米星和多卡米星类似物、多拉司他汀和多拉司他汀类似物的药物也可用作本发明的细胞毒性剂。多柔比星(doxarubicin)和柔红霉素化合物(参见，如，美国专利6,630,579)也可用作细胞毒性剂。

细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以通过体外方法制备。为了将细胞毒性剂连接于抗体，使用了连接基团。合适的连接基团为本领域熟知的并且包括二硫化物基团、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团以及不可切割的连接基团。

根据本发明，通过使双官能交联剂与细胞结合剂反应来修饰细胞结合剂，从而产生接头分子至细胞结合剂的共价连接。如本文所用，“双官能交联剂”是指具有两个反应性基团的试剂；其中一者能够与细胞结合剂反应，而另一者能够与细胞毒性剂反应以将细胞结合剂与细胞毒性剂连接，从而形成缀合物。

任何合适的双官能交联剂可与本发明结合使用，只要接头试剂分别提供细胞毒性剂和细胞结合剂的治疗特性(如，细胞毒性)以及靶向特性的保持，同时提供可接受的毒性概况。优选地，接头分子通过化学键将细胞毒性剂连接于细胞结合剂(如上所述)，使得细胞毒性剂和细胞结合剂彼此化学偶联(如，共价键合)。

在一个实施方案中，细胞结合剂经由选自以下的化学键化学偶联至细胞毒性剂：二硫键、酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键。

在一个实施方案中，双官能交联剂包含不可切割接头。不可切割接头为能够以稳定的共价方式将细胞毒性剂，诸如类美坦素、紫杉烷或CC-1065类似物连接于细胞结合剂的任何化学部分。因此，在细胞毒性剂或细胞结合剂保持活性的条件下，不可切割接头大体上耐酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。

在细胞毒性剂与细胞结合剂之间形成不可切割接头的合适的交联剂在本领域为熟知的。在一个实施方案中，细胞毒性剂通过硫醚键化学偶联至细胞结合剂。在另一实施方案中，细胞毒性剂通过酰胺键连接于细胞结合剂。不可切割接头的实例包括用于与细胞毒性剂反应的具有基于马来酰亚胺基的部分或基于卤代乙酰基的部分的接头。此类双官能交联剂为本领域熟知的(参见美国专利申请公布No.2010/0129314、2009/0274713、2008/0050310、2005/0169933和PierceBiotechnologyInc.P.O.Box117,Rockland,IL61105,USA)并且包括但不限于4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)和N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)、3-(溴代乙酰氨基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)、双-马来酰亚胺聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)₂、BM(PEO)₃、N-(β-马来酰亚胺丙基氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、5-马来酰亚胺戊酸NHS、HBVS、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼·HCl(MPBH)、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双-马来酰亚胺乙烷(DTME)、1,4-双-马来酰亚胺丁烷(BMB)、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双-马来酰亚胺己烷(BMH)、双-马来酰亚胺乙烷(BMOE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SIAB)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺丁基氧基)硫代琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺十一烷氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMPB)、CX1-1、磺基-Mal和PEG_n-Mal。优选地，双官能交联剂为SMCC。

在一个实施方案中，连接剂为可切割接头。合适的可切割接头的实例包括含有二硫化物的接头、酸不稳定的接头、光不稳定的接头、肽酶不稳定的接头和酯酶不稳定的接头。含有二硫化物的接头为通过二硫化物交换可切割的接头，这可在生理条件下发生。酸不稳定的接头为在酸性pH下可切割的接头。例如，某些细胞内区室，诸如核内体和溶酶体，具有酸性pH(pH4-5)，并且提供适合于切割酸不稳定的接头的条件。光不稳定的接头可用于身体表面和光容易进入的许多体腔中。此外，红外光可穿透组织。肽酶不稳定的接头可用于切割细胞内侧或外侧的某些肽(参见如，Trouet等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:626-629(1982)和Umemoto等,Int.J.Cancer,43:677-684(1989))。在一个实施方案中，可切割接头在温和条件，即，细胞毒性剂的活性不受影响的细胞内的条件下切割。

在一个实施方案中，细胞毒性剂通过二硫键连接于细胞结合剂。接头分子包含可与细胞结合剂反应的反应性化学基团。在一个实施方案中，双官能交联剂包含可与细胞结合剂的赖氨酸残基形成酰胺键的反应性部分。可与细胞结合剂的赖氨酸残基形成酰胺键的反应性部分的实例包括羧酸部分和反应性酯部分，诸如N-琥珀酰亚胺酯、N-磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(如，2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。

用于与细胞结合剂反应的优选的反应性化学基团为N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。另外地，所述接头分子包含可与细胞毒性剂反应以形成二硫键的反应性化学基团，优选为二硫代吡啶基基团。能够使细胞结合剂与细胞毒性剂经由二硫键的双官能交联剂为本领域已知的并且包括，例如，3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(参见，如，Carlsson等,Biochem.J.,173:723-737(1978))、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见，如，美国专利4,563,304)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(参见，如，CAS登记号341498-08-6)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见，如，美国专利申请公布No.2009/0274713)。可用于引入二硫化物基团的其它双官能交联剂为本领域已知的并且描述于美国专利6,913,748、6,716,821及美国专利申请公布No.2009/0274713和2010/0129314，其全部通过引用整体并入本文。

不含形成不可切割接头的硫原子的其它交联剂也可用于发明方法中。此类接头可源自基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括但不限于通式(IX)的α,ω-二羧酸：

HOOC-X₁-Y_n-Z_m-COOH

(IX)，

其中X为具有2至20个碳原子的直链或支链的烷基、烯基或炔基，Y为具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z为具有6至10个碳原子的取代或未取代的芳族基团，或取代或未取代的杂环基团，其中所述杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和n各自为0或1，条件是l、m和n不同时全部为零。

本文公开的许多不可切割接头详细描述于美国专利申请公布No.2005/0169933A1。

由本发明方法产生的最终纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含细胞毒性剂、双官能交联剂和细胞结合剂。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂为DM1，双官能交联剂为SMCC，并且细胞结合剂为huCD37-3抗体。

在本发明的另一优选实施方案中，细胞毒性剂为DM1，双官能交联剂为SMCC，并且细胞结合剂为EGFR-7R抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂为DM1，双官能交联剂为SMCC，并且细胞结合剂为抗-EFGRvIII抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂为DM1，双官能交联剂为SMCC，并且细胞结合剂为抗-CD27L抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂为DM1，双官能交联剂为SMCC，并且细胞结合剂为曲妥单抗。

以下实施例进一步说明了本发明，但，当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例1

本实施例显示用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

将抗体(Ab)在pH7.5的50mMKPi，2mMEDTA中缓冲。将缓冲的Ab与10％(v/v)DMA，相对于接头(SMCC)的1.1摩尔过量的DM1和8.6摩尔当量的SMCC/摩尔Ab混合。将反应在15℃进行24小时。然后，将一半的反应混合物应用于SartobidIEXSingleSep(Q膜)，并将另一半用作对照。分析混合物(Q膜之前和之后)。结果示于下表1中。

表1

	对照	Q过滤器
			高分子量物质	0.4％	0
缀合物二聚体	2.1％	0.6％
			缀合物单体	97.0％	99.0％
低分子量物质	0.5％	0.4％
			DM1-DM1*	15.8％	6.1％
DM1-MCC-DM1*	12.3％	2.2％

*相对于总的游离DM1物质的百分比

如表1中示出，通过Q膜过滤的缀合物具有较低水平的高分子量物质(更高阶聚集物和缀合物二聚体)和较高水平的缀合物单体。另外，DM1-DM1二聚体和DM1-MCC-DM1二聚体通过Q膜高效地去除。

在本实施例中反映的实验结果显示离子交换色谱膜，特别是Q膜，可用于从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物去除至少部分杂质。特别地，Q膜从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物中高效地去除细胞毒性剂二聚体DM1-DM1和DM1-MCC-DM1。

实施例2

抗体-CX1-1-DM1缀合物如实施例1中所述制备。分析混合物(在Q膜之前和之后)。结果示于下表2中。

表2

如表2中示出，通过Q膜过滤的缀合物具有较低水平的高分子量物质(更高阶聚集物和缀合物二聚体)和较高水平的缀合物单体。

在本实施例中反映的实验结果显示可使用离子交换色谱膜，特别是Q膜以从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中去除至少部分杂质。特别地，Q膜从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物中高效地去除高分子量物质(如，缀合物的聚集物)。

实施例3

将抗体(Ab)缓冲液更换为pH7.6的15mMKPi，2mMEDTA。将缓冲液更换的Ab与5.3摩尔的DM4和4.4摩尔的磺基-SPDB/摩尔的Ab在8％(v/v)DMA中混合。反应在20℃进行20小时。使缀合混合物经历正切流动过滤用于缓冲液更换和抗体缀合物的纯化。将1克纯化的Ab-磺基-SPDB-DM4缀合物应用于Pali的MustangQCoin(PallCat#MSTA18Q16)。收集级分并用于游离类美坦素物质的分析。结果示于下表3中。

表3

如表3中所示，与未通过Q膜过滤的抗体缀合物相比，通过Q膜过滤的抗体缀合物具有较低水平的每个鉴定的游离类美坦素物质。

本实施例中反映的实验结果显示离子交换色谱膜，特别是Q膜，可用于从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中去除游离细胞毒性剂杂质。特别地，Q膜降低DM4-水解的-磺基-SPDB、DM4、DM4-SPy和DM4-磺基-TBA在包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物中的水平。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，据此通过引用并入，其程度如同每个参考文献单独地且具体地指明通过引用并入并在本文以其整体列出。

术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”以及“该/所述(the)”及在描述本发明的上下文中使用的相似的指示物(尤其在以下权利要求的上下文中)将被解释为覆盖单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式的术语(即，意指“包括，但不限于”)。除非本文另外指出，否则本文数值范围的列举仅旨在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独数值并入说明书如同其在本文单独列举。本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本发明，并且不会对除非以其它方式要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的语言不应解释为指出任何未要求保护的实施本发明的必需要素。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施该发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读上述说明时，这些优选实施方案的变更可以变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员酌情利用这些改变，并且发明人旨在以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。而且，在其所有可能的变更中，上述要素的任何组合均由本发明涵盖，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。

Claims

1.一种用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述方法依序重复两次、三次或四次。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：

(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的第一混合物，然后使所述第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含含有通过所述接头化学偶联至所述细胞毒性剂的所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物；

(b)使所述第二混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及

(c)在步骤(b)之后使所述纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与所述纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含所述杂质的量有所减少。

4.根据权利要3求所述的方法，其中在步骤(c)之前将步骤(b)依序重复两次、三次或四次。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中在步骤(c)中利用吸附色谱法。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述吸附色谱法选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱法、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及它们的组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述吸附色谱法为离子交换色谱法。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述离子交换色谱法为陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱法。

9.根据权利要求3或4所述的方法，其中在步骤(c)中利用正切流动过滤。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触通过以下实现：在反应容器中提供所述细胞结合剂，将所述细胞毒性剂加入至所述反应容器中以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的所述第一混合物，然后将所述双官能交联剂加入至所述第一混合物中。

11.根据权利要求3-10中任一项所述的方法，其还包括在步骤a-b或步骤b-c之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂中释放所述不稳定结合的接头。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将所述混合物在约2℃至约8℃的温度下保持约20小时。

13.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其还包括猝灭步骤(a)-(b)之间的所述第二混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中通过使所述第二混合物与和所述游离细胞毒性剂反应的猝灭剂接触来猝灭所述混合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述猝灭剂选自4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和碘乙酰氨基丙酸。

16.根据权利要求3-15中任一项所述的方法，其中所述方法包括

(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的第一混合物，然后使所述第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含含有通过所述接头化学偶联至所述细胞毒性剂的细胞结合剂的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物；

(b)使所述第二混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；

(c)在步骤(b)之后猝灭所述纯化的第二混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂；

(d)在步骤(c)之后使所述猝灭的混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物；

(e)保持所述纯化的第三混合物以从所述细胞结合剂中释放所述不稳定结合的接头；

(f)在步骤(c)之后使所述纯化的第三混合物经历离子交换色谱膜以从所述混合物中去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第四混合物；以及

(g)在步骤(f)之后使所述纯化的第四混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与所述纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含所述杂质的量有所减少。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤(g)中利用正切流动过滤。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：

(a)使细胞结合剂与双官能交联剂接触以将接头共价连接于所述细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物，

(b)使所述第一混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合并且从而制备具有结合至其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，

(c)通过使具有结合至其的接头的所述细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂缀合于在所述纯化的第一混合物中的具有结合至其的接头的所述细胞结合剂以制备包含含有通过所述接头化学偶联至所述细胞毒性剂的所述细胞结合剂的所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，

(d)使所述第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及

(e)在步骤(d)之后使所述纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与所述纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含所述杂质的量有所减少。

19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤(e)之前将步骤(d)依序重复两次、三次或四次。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(b)和(d)中利用吸附色谱法。

21.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(b)中利用正切流动过滤并且在步骤(d)中利用吸附色谱法。

22.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(b)中利用吸附色谱法并且在步骤(d)中利用正切流动过滤。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述吸附色谱法选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱法、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及它们的组合。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述吸附色谱法为离子交换色谱法。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述离子交换色谱法为陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱法。

26.根据权利要求18或19所述的方法，其中步骤(b)和(d)中利用正切流动过滤。

27.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(b)和(d)中利用非吸附色谱法。

28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含蔗糖。

29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。

30.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)以及它们的组合。

31.根据权利要求18-30中任一项所述的方法，所述方法还包括

(f)在步骤a-b、步骤b-c、步骤c-d和步骤d-e的至少一者之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头。

32.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：

(b)通过使所述第一混合物中具有结合至其的接头的所述细胞结合剂与细胞毒性剂反应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的所述细胞结合剂以制备包含含有通过所述接头化学偶联至所述细胞毒性剂的所述细胞结合剂的所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，

(c)使所述第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及

(d)在步骤(c)之后使所述纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与所述纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一混合物未在步骤(a)和(b)之间经历纯化。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中在步骤(d)之前将步骤(c)依序重复两次、三次或四次。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中利用吸附色谱法。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述吸附色谱法选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱法、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及它们的组合。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述吸附色谱法为离子交换色谱法。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述离子交换色谱法为陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱法。

39.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中利用正切流动过滤。

40.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中利用非吸附色谱法。

41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含蔗糖。

42.根据权利要求32-41中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。

43.根据权利要求32-41中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)以及它们的组合。

44.根据权利要求32-43中任一项所述的方法，其还包括

(e)在步骤a-b、步骤b-c和步骤c-d的至少一者之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质选自细胞毒性剂二聚体、所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物、游离细胞毒性剂、未缀合接头以及它们的混合物。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述混合物包含细胞毒性剂二聚体作为杂质，并且一些部分的所述细胞毒性剂二聚体从所述混合物中去除以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-DM1。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-MCC-DM1。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-DM1和DM1-MCC-DM1。

50.根据权利要求45所述的方法，其中所述混合物包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物作为杂质，并且一些部分的所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物从所述混合物中去除以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

51.根据权利要求45所述的方法，其中所述混合物包含游离细胞毒性剂作为杂质，并且一些部分的所述游离细胞毒性剂从所述混合物中去除以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

52.根据权利要求45所述的方法，其中所述混合物包含未缀合接头作为杂质，并且一些部分的所述未缀合接头从所述混合物中去除以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中经历所述离子交换色谱膜的所述混合物的pH为约4至约9。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述混合物的pH为约7至约8。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述混合物的pH为约7.3至约7.7。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述混合物的pH为约7.5。

57.根据权利要求53所述的方法，其中所述混合物的pH为约4.5至约5.5。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述混合物的pH为约4.8或约5。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中至少50％的所述一种或多种杂质从所述混合物中去除。

60.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中至少75％的所述一种或多种杂质从所述混合物中去除。

61.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中至少90％的所述一种或多种杂质从所述混合物中去除。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述离子交换色谱膜为阴离子交换膜。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述阴离子交换膜为Q膜。

64.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述离子交换色谱膜为阳离子交换膜。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述阳离子交换膜为S膜。

66.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述离子交换色谱膜为内毒素去除交换膜。

67.根据权利要求3-66中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在pH为约7至约9的溶液中发生。

68.根据权利要求3-66中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。

69.根据权利要求3-66中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)以及它们的组合。

70.根据权利要求3-69中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在约16℃至约24℃的温度下发生。

71.根据权利要求3-69中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在约0℃至约15℃的温度下发生。

72.根据权利要求3-71中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂为酸不稳定的接头、含有二硫化物的接头、光不稳定的接头、肽酶不稳定的接头或酯酶不稳定的接头。

73.根据权利要求3-71中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂为含有二硫化物的可切割接头。

74.根据权利要求3-71中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂为不可切割接头。

75.根据权利要求3-71中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂包含N-琥珀酰亚胺酯部分、N-磺基琥珀酰亚胺酯部分、基于马来酰亚胺基的部分或基于卤代乙酰基的部分。

76.根据权利要求73所述的方法，其中所述双官能交联剂选自3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。

77.根据权利要求74所述的方法，其中所述双官能交联剂选自4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、(β-马来酰亚胺丙基氧基-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)和N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、磺基-Mal、PEG₄-Mal以及CX1-1。

78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自抗体、干扰素、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF和转铁蛋白。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述细胞结合剂为抗体。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。

82.根据权利要求78所述的方法，其中所述细胞结合剂为选自以下的抗体：huB4、huC242、曲妥单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、huDS6、利妥昔单抗、抗-CD33抗体、抗-CD27L抗体、抗-Her2抗体、抗-EGFR抗体、抗-EGFRvIII抗体、Cripto、抗-CD138抗体、抗-CD38抗体、抗-EphA2抗体、整联蛋白靶向抗体、抗-CD37抗体、抗叶酸受体抗体、抗-Her3抗体、B-B4抗体和抗-IGFIR抗体。

83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自类美坦素、紫杉烷和CC1065。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述细胞毒性剂为类美坦素。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述类美坦素包含硫醇基团。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述类美坦素为N^2’-脱乙酰基-N^2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N^2’-脱乙酰基-N^2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。

87.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂为DM1，所述双官能交联剂为SMCC，并且所述细胞结合剂为huCD37-3抗体。

88.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂为DM1，所述双官能交联剂为SMCC，并且所述细胞结合剂为EGFR-7R抗体。

89.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂为DM1，所述双官能交联剂为SMCC，并且所述细胞结合剂为抗-EFGRvIII抗体。

90.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂为DM1，所述双官能交联剂为SMCC，并且所述细胞结合剂为抗-CD27L抗体。

91.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂为DM1，所述双官能交联剂为SMCC，并且所述细胞结合剂为曲妥单抗。