CN109200290A - 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

Description

使用PVDF膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
本申请是申请号为201380061552.7、申请日为2013年10月4日、发明名称为“使用PVDF膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2013/063480的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2012年10月4日的美国临时申请号61/709,891的优先权。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2012年10月4日提交的美国临时专利申请号61/709,891的权益，其以引用方式并入本文。
电子方式递交的材料以引用方式并入
与此同时递交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表以引用方式整体并入本文并且如下识别：2013年10月3日创建的名称为“714287SequenceListing.TXT”的8，259字节的一个ASCII(文本)文件。
发明背景
用于治疗癌症和其他疾病的抗体-药物缀合物通常由三个不同的成分构成：细胞结合剂、接头和细胞毒性剂。一种常用的制造方法包括：修饰步骤，其中细胞结合剂与双官能接头反应以形成与具有反应基团的接头共价连接的细胞结合剂；纯化步骤，其中从修饰反应的其他组分纯化经修饰的抗体；缀合步骤，其中经修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应以形成从接头(使用反应基团)至细胞毒性剂的共价化学键；以及第二纯化步骤，其中从缀合反应的其他组分纯化缀合物。
最近的临床试验已显示对抗体-药物缀合物在治疗许多不同类型的癌症中有希望的作用。因此，有必要产生可以用来治疗患者的高纯度和高稳定性的缀合物。尽管在制备抗体-药物缀合物方面有进步，但是目前的方法受若干因素的限制。例如，由这些方法所产生的缀合物包含增加量的杂质，包括游离的细胞毒性剂(例如，细胞毒性剂二聚体相关种类)和/或高分子量种类(例如，二聚体和其他更高阶聚集体)。在本领域中所用的现有纯化方法，如切向流过滤和吸附色谱，不能有效地除去这些杂质而不显著降低产量和/或对于大规模的制造过程很麻烦。
因此，仍然需要制备比现有方法产生的抗体-药物缀合物更稳定且具有更高纯度的抗体-药物缀合物的改进方法。本发明提供这样一种方法。通过本文提供的发明的描述，本发明这些和其他的优点，以及另外的发明特征将会显而易见。
发明概述
本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。本发明还包括包含化学偶联至根据本文描述的方法制备的细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物。
附图中几个视图的简述
图1A-B是描述在PVDF过滤之前(图1A)和之后(图1B)，存在于抗体-SMCC-DM1缀合物反应混合物中的种类的色谱。
图2是描述在经由多个PVDF膜过滤之前和之后(x轴)，存在于抗体-SMCC-DM1缀合物反应混合物中的DM1二聚体种类的百分比(y轴)的线形图。
发明详述
本领域的普通技术人员将理解，包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂(如抗体)的缀合物(“抗体-细胞毒性剂缀合物”)通常通过以下制备：在低pH(即，pH7.0或以下)用双官能交联试剂修饰抗体，纯化具有与其结合的接头的抗体，使细胞毒性剂与其结合的具有接头的抗体缀合，以及纯化抗体-细胞毒性剂缀合物。最近，已经开发了通过使稳定地结合到细胞结合剂的接头的量最大化并且使导致缀合不稳定的不需要的副反应减至最少来产生稳定性提高的缀合物的方法。例如，已开发了这样的方法，其中用于制备所述缀合物的方法在一个步骤中(参见，例如，在美国专利申请公开号2012/0253021中描述的方法)和/或在高pH(例如，pH7或更高)(参见，例如，在国际专利申请公开号WO 2012/135522中描述的方法)下进行，从而增加具有与其稳定结合的接头的细胞结合剂的希望的种类的水平并且减少不希望的反应产物(例如，具有与其不稳定结合的接头的细胞结合剂)的水平。虽然这样的方法产生稳定性提高的缀合物，但是已经发现这些方法产生具有增加的杂质水平的缀合物，所述杂质如游离细胞毒性剂(例如，细胞毒性剂二聚体相关种类)和/或高分子量种类(如二聚体和其他更高阶聚集体)。本领域中使用的现有纯化方法，如切向流过滤和吸附色谱，不能有效地除去这些杂质而不显著降低产量和/或对于大规模的制造过程很麻烦。
令人惊奇地发现，聚二氟乙烯(PVDF)膜可用于从含有细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中除去至少一部分的杂质。具体来说，意外地发现，通过使混合物经过PVDF膜可有效地和高效率地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中除去游离细胞毒性剂(例如，细胞毒性剂二聚体相关种类)。因此，本发明提供用于制造纯度和稳定性提高的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜。
本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。PVDF膜可用于除去通常存在于包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物中的各种杂质。例如，PVDF膜可用于除去选自以下的一种或多种杂质：细胞毒性剂二聚体、细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集体、游离细胞毒性剂、未缀合的接头及其混合物。
在一个实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的细胞毒性剂二聚体，并且PVDF膜从混合物除去细胞毒性剂二聚体的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的细胞结合剂细胞毒性剂的聚集体，并且PVDF膜从混合物除去细胞结合剂细胞毒性剂的聚集体的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的游离细胞毒性剂，并且PVDF膜从混合物除去游离细胞毒性剂的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的未缀合的接头，并且PVDF膜从混合物除去未缀合的接头的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
在优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的经由接头(例如，DM1-MCC-DM1、DM1-SPP-DM1或DM1-CX1-1-DM1)彼此化学偶联的细胞毒性剂二聚体，并且PVDF膜从混合物除去经由接头(例如，DM1-MCC-DM1、DM1-SPP-DM1或DM1-CX1-1-DM1)彼此化学偶联的细胞毒性剂二聚体的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含作为杂质的没有经由接头(例如，DM1-DM1)彼此化学偶联的细胞毒性剂二聚体，并且PVDF膜从混合物除去没有经由接头(例如，DM1-DM1)彼此化学偶联的细胞毒性剂二聚体的一些部分以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
当包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜时，与使混合物经过PVDF膜之前混合物中一种或多种杂质的水平相比，所产生的纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含水平降低的至少一种或多种杂质。例如，与使混合物经过PVDF膜之前混合物中一种或多种杂质的水平相比，PVDF膜除去混合物中至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的一种或多种杂质。在一个实施方案中，与使混合物经过PVDF膜之前混合物中一种或多种杂质的水平相比，PVDF膜除去混合物中约10％至约100％、约10％至约90％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约100％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约100％(例如，约60％至约90％、约70％至约90％)、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、或约95％至约100％(例如，约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、约99％至约100％、约95％至约96％、约95％至约97％、约95％至约98％或约95％至约99％)的一种或多种杂质。
在一个实施方案中，在使混合物经过PVDF膜之前调整包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物的pH。包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物的pH优选为约4至约9(例如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6.5至约7.5、约7至约8、约8至约9、约4.5至约6或约4.5至约5)。在一些实施方案中，混合物的pH为约6至约6.5(例如，pH5.5至7、pH5.7至6.8、pH5.8至6.7、pH5.9至6.6或pH6至6.5)、pH为约6或以下(例如，pH为约4至6、约4至约5.5、约4至约4.5、约4至约5、约5至6)，或者pH为约6.5或更高(例如，pH为6.5至约9、约6.5至约7、约7至约9、约7.5至约9或6.5至约8)。在一个实施方案中，混合物的pH大于7.5(例如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)。例如，混合物的pH可以为pH 7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9。在另一实施方案中，混合物的pH为约4.8(例如，约4.5至约5、约4.6至约5或约4.7至约4.9)。
多种PVDF膜是本领域已知的，并且在可以用于根据本文所述的发明。在一个实施方案中，PVDF膜的孔径是0.22微米。在另一实施方案中，PVDF膜的孔径是0.45微米。在另一实施方案中，PVDF膜是孔径为0.45和0.22微米(即，双层0.45/0.22微米孔径的膜孔径的膜)的双层膜。
在一些实施方案中，PVDF膜经γ照射。在另一实施方案中，PVDF膜未经γ照射。
许多用于制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法已被描述(参见，例如，美国专利申请公开号2012/0253021；国际专利申请公开号WO 2012/135522；美国专利5,208,020；美国专利6,441,163；美国专利7,811,572；美国专利申请公开号2006/0182750；美国专利申请公开号2008/0145374；和美国专利申请公开号2011/0003969)。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中将修饰反应和缀合反应组合成单个步骤，随后是纯化步骤(即，在美国专利申请公开号2012/0253021中描述的一步法)，并且其中该方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之前或之后经过PVDF膜。一步法包括使细胞结合剂(例如，抗体)与细胞毒性剂接触，以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质(例如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物，其中所述细胞结合剂经由接头与细胞毒性剂化学偶联。然后使第二混合物经历纯化以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在纯化步骤之前、在纯化步骤之后或两者，使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物经过PVDF膜。
一步反应优选在约4至约pH9的pH(例如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，反应在约6至约8的pH(例如，pH为约6、约6.5、约7、约7.5或约8)下进行。
在一个实施方案中，反应在约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9的pH下进行。在另一实施方案中，反应在约7.5至约9、约7.5至约8.5、约7.5至约8、约7.8至约9、约7.8至约8.5、约7.8至约8、约8至约9、约8至约8.5或约8.5至约9的pH下进行。在另一实施方案中，反应在约7.8的pH(例如，pH7.6至8.0、pH7.7至7.9)下进行。在另一实施方案中，修饰反应在约8的pH(例如，pH7.8至8.2或pH7.9至8.1)下进行。
在另一实施方案中，反应在大于7.5的pH(例如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)下进行。
在一个实施方案中，接触通过以下实现：提供细胞结合剂，然后使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包括细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包括细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与双官能交联试剂接触。例如，在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，将细胞毒性剂加入到反应容器中(从而接触细胞结合剂)，然后将双官能交联试剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中(从而接触包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物)。在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并且在将细胞结合剂提供至容器后立即将细胞毒性剂加入到反应容器中。在另一实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并且在将细胞结合剂提供至容器后一段时间间隔之后将细胞毒性剂加入到反应容器中(例如，将细胞结合剂提供至空间后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1天或更长时间)。可以迅速(即，在短的时间间隔内，如约5分钟、约10分钟)或缓慢(如通过使用泵)加入细胞毒性剂。
可以在使细胞结合剂与细胞毒性剂接触后立即或者在使细胞结合剂与细胞毒性剂接触后稍后的某个时间点(例如，约5分钟至约8小时或更长时间)，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联试剂接触。例如，在一个实施方案中，在将细胞毒性剂加入到包含细胞结合剂的反应容器中后立即将双官能交联试剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中。可选地，可以在使细胞结合剂与细胞毒性剂接触后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长时间使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联试剂接触。
在另一实施方案中，细胞毒性剂和双官能剂经由多个循环(例如，1、2、3、4、5个或更多个循环)加入。例如，本发明提供包括以下步骤的方法：a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包括细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物；然后使第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质(例如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物，其中细胞结合剂经由接头与细胞毒性剂化学偶联；b)使第二混合物与细胞毒性剂接触，以形成第三混合物；然后在pH为约4至约9下使第三混合物与双官能交联试剂接触，以提供第四混合物；以及c)纯化第四混合物，以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，在步骤a)后在一段时间间隔之后(例如，约1小时、约2小时、约3小时或更长时间)进行步骤b)。在另一实施方案中，可以在进行步骤c)前重复步骤b)若干次(例如，1、2、3、4次或更多)。在起始步骤b)后在一段时间间隔之后(例如，约1小时、约2小时、约3小时或更长时间)进行附加步骤b)。
在另一实施方案中，在完全加入细胞毒性剂之前加入双官能交联试剂。例如，在一个实施方案中，在一段时间间隔内(例如，在约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更长时间内)将细胞毒性剂连续加入到细胞结合剂以形成包含所述细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物。在完成细胞毒性剂的加入之前，将双官能交联试剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中，条件是在任何时候细胞毒性剂比双官能交联试剂摩尔过量。在一个实施方案中，在一段时间间隔内(例如，在约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更长时间内)连续加入双官能交联试剂。
使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与所述双官能交联试剂接触后，允许反应进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6个小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更长时间(例如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由接头与细胞毒性剂化学偶联的细胞结合剂；(b)使第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(c)使步骤(b)后的纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以从杂质进一步纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于纯化的第二混合物，纯化的第三混合物包含减少量的杂质。本文描述的任何纯化方法可以在本发明的方法中使用。在优选的实施方案中，切向流过滤、吸附色谱或非吸附色谱用作纯化步骤。
在本发明的一个实施方案中，使细胞结合剂与双官能交联试剂接触(即，修饰反应)产生第一混合物，所述第一混合物包含具有与其结合的接头的细胞结合剂和一种或多种杂质(例如，反应物和其他副产物)。在本发明的一些实施方案中，第一混合物包含具有与其稳定和不稳定结合的接头的细胞结合剂和一种或多种杂质(例如，反应物和其他副产物)。当在正常储存条件下经过一段时间(其范围可为数月至数年)接头和细胞结合剂之间的共价键基本上不减弱或断开时，接头与细胞结合剂“稳定地”结合。与此相反，当在正常储存条件下经过一段时间(其范围可为数月至数年)接头和细胞结合剂之间的共价键基本上减弱或断开时，接头与细胞结合剂“不稳定地”结合。
修饰反应优选在约4至约pH9的pH(例如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，修饰反应在约6至约8的pH(例如，pH为约6、约6.5、约7、约7.5或约8)下进行。
在一个实施方案中，修饰反应在约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9的pH下进行。在另一实施方案中，修饰反应在约7.5至约9、约7.5至至约8.5、约7.5至约8、约7.8至约9、约7.8至约8.5、约7.8至约8、约8至约9、约8至约8.5或约8.5至约9的pH下进行。在另一实施方案中，修饰反应在约7.8的pH(例如，pH7.6至8.0或pH 7.7至7.9)下进行。在另一实施方案中，修饰反应在约8的pH(例如，pH7.8至8.2或pH7.9至8.1)下进行。
在另一实施方案中，修饰反应在大于7.5的pH(例如，pH为7.6至约9、7.7至约9、约7.8至约9、约7.9至约9、7.6至约8.5、7.6至约8、7.7至约8.5、7.7至约8、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约8至约9或约8至约8.5)下进行。例如，本发明的方法包括在pH为7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9的溶液中使细胞结合剂与双官能交联试剂接触。
在本发明的一个实施方案中，通过使修饰反应产生的混合物(即，第一混合物)经历纯化过程从修饰反应过程中产生的杂质(例如，反应物和副产物)纯化修饰的细胞结合剂。在这方面，第一混合物可以使用切向流过滤(TFF)，例如，基于膜的切向流过滤法、非吸附色谱、吸附色谱、吸附过滤、或选择性沉淀、或任何其他合适的纯化方法及其组合进行纯化。相较于根据本发明纯化前的第一混合物，第一纯化步骤提供纯化的第一混合物，即，浓度增加的具有与其结合的接头的细胞结合剂和减少量的未结合的双官能交联试剂。优选地，第一混合物使用切向流过滤或吸附色谱(例如，离子交换色谱，如陶瓷羟磷灰石)纯化。
在纯化第一混合物以获得具有与其结合的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物后，通过使具有与其结合的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂在纯化的第一混合物中缀合，以便形成第二混合物，其中产生包含经由接头与细胞毒性剂化学偶联的细胞结合剂和一种或多种杂质(例如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的第二混合物。
任选地，修饰的细胞结合剂的纯化可以省略。因此，在本发明的一个实施方案中，包含具有与其结合的接头的细胞结合剂以及反应物和其他副产物的第一混合物不经历纯化处理。在这种情况下，细胞毒性剂可以与交联试剂同时加入或在稍后的某个时间点(例如在交联试剂加入到细胞结合剂后1、2、3个或更多小时)加入。通过使修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂(例如，美登素)缀合，其中缀合步骤导致形成稳定的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物、不稳定的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物、未缀合的细胞毒性剂(即“游离”细胞毒性剂)、反应物和副产物的混合物。
缀合反应优选在约4至约pH9的pH(例如，pH为约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5、约6.0至约7或约6.5至约7.5)下进行。在一些实施方案中，缀合反应在约6至约6.5的pH(例如，pH5.5至7、pH 5.7至6.8、pH 5.8至6.7、pH5.9至6.6或pH 6至6.5)、约6或以下的pH(例如，pH为约4至6、约4至约5.5、约5至6)或者约6.5或更高的pH(例如，pH为6.5至约9、约6.5至约7、约7至约9、约7.5至约9或6.5至约8)下进行。在一个实施方案中，缀合反应在约4至pH小于6的pH下或在大于6.5至9的pH下进行。当在约6.5或更高的pH下进行缀合步骤时，由于二硫键形成，一些含巯基的细胞毒性剂可易于二聚化。在一个实施方案中，从反应混合物中除去痕量金属和/或氧，以及任选地加入抗氧化剂或使用具有更高反应性的离去基团的接头，或在多于一种的等分试样中加入细胞毒性剂，可能需要允许在这种情况下有效的反应。
在缀合步骤后，使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历纯化步骤。在这方面，缀合混合物可以使用切向流过滤(TFF)，例如，基于膜的切向流过滤法、非吸附色谱、吸附色谱、吸附过滤、或选择性沉淀、或者任何其他合适的纯化方法及其组合进行纯化。本领域的普通技术人员将理解，在缀合步骤后的纯化使包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的纯化的缀合物分离，其中与纯化步骤之前的缀合物相比，该缀合物具有减少量的杂质。在一个实施方案中，使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后和纯化步骤之前经过PVDF膜，以便在纯化步骤前从混合物除去至少一部分的杂质。在另一实施方案中，使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤后经过PVDF膜，以便除去纯化步骤后残留在混合物中的至少一部分的杂质。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，该方法包括在修饰步骤后的第一纯化步骤和缀合步骤后的第二纯化步骤，其中该方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在第二纯化步骤之前或之后经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质。在一个实施方案中，本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使细胞结合剂与双官能交联试剂接触，以共价连接接头与细胞结合剂，从而制备包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的第一混合物，(b)使第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，从而制备具有与其结合的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，(c)通过使具有与其结合的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH约4至约9的溶液中反应，使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂在纯化的第一混合物中缀合，以便制备包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由接头与细胞毒性剂化学偶联的细胞结合剂，(d)使第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(e)使步骤(d)后纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以进一步从杂质中纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于纯化的第二混合物，纯化的第三混合物包含减少量的杂质。
本文描述的任何纯化方法可以在本发明的方法中使用。在本发明中的一个实施方案中，在纯化步骤中使用切向流过滤(TFF，也称为交叉流过滤、超滤和渗滤)和/或吸附色谱树脂。例如，本发明的方法可包括修饰步骤后使用TFF的第一纯化步骤以及缀合步骤后使用TFF的第二纯化步骤。可选地，本发明的方法可包括修饰步骤后使用吸附色谱的第一纯化步骤以及缀合步骤后使用吸附色谱的第二纯化步骤。本发明的方法也可以包括修饰步骤后使用吸附色谱的第一纯化步骤以及缀合步骤后使用TFF的第二纯化步骤或者修饰步骤后使用TFF的第一纯化步骤以及缀合步骤后使用吸附色谱的第二纯化步骤。
在本发明的一个实施方案中，非吸附色谱用作纯化步骤。例如，本发明的方法可包括修饰步骤后使用非吸附色谱的第一纯化步骤以及缀合步骤后使用非吸附色谱的第二纯化步骤。
在另一实施方案中，本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中不使包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的第一混合物在修饰反应之后和缀合反应之前经历纯化，并且其中该方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜。当省略修饰的细胞结合剂的纯化时，本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，该方法包括修饰步骤、缀合步骤和在缀合步骤后的第一纯化步骤，其中该方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在第一纯化步骤之前或之后经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质。在一个实施方案中，本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使细胞结合剂与双官能交联试剂接触以共价连接接头与细胞结合剂，从而制备包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的第一混合物，(b)通过使具有与其结合的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂反应，使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂在第一混合物中缀合，以制备包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由接头与细胞毒性剂化学偶联的细胞结合剂，(c)使第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及(d)使步骤(c)后纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以进一步从杂质纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于纯化的第二混合物，纯化的第三混合物包含减少量的杂质，并且其中不使第一混合物在步骤(b)之前经历纯化处理，所述第一混合物包含步骤(a)中制备的具有与其结合的接头的细胞结合剂(以及反应物和其它副产物)。本文描述的任何纯化方法可以用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选的实施方案中，切向流过滤、吸附色谱或非吸附色谱用作缀合反应之后的纯化步骤。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，其中该方法包括使预形成的细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂缀合，如在美国专利6,441,163和美国专利申请公开号2011/0003969和2008/0145374中所述，随后是纯化步骤，并且其中该方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之前或之后经过PVDF膜。本文描述的任何纯化方法可以在本发明的方法中使用。在优选的实施方案中，切向流过滤、吸附色谱或非吸附色谱用作纯化步骤。
在一个实施方案中，通过使细胞毒性剂与包含接头的双官能交联试剂接触以共价连接细胞毒性剂与接头来制备细胞毒性剂-接头化合物。细胞毒性剂-接头化合物任选地在细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂接触之前进行纯化。
在本发明的一个实施方案中，本文描述的本发明的方法(例如，一步法)在缀合步骤后包括两个单独的纯化步骤。当本发明的方法在缀合步骤后包括两个单独的纯化步骤时，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物可在任一纯化步骤或两个纯化步骤之前或者纯化步骤之后经过PVDF膜以从混合物除去至少一部分的杂质。本文描述的任何纯化方法可以用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选的实施方案中，切向流过滤、吸附色谱、非吸附色谱或其组合用作缀合反应之后的纯化步骤。
任何合适的TFF系统可用于纯化，包括用Pellicon型系统(Millipore,Billerica,MA)、Sartocon Cassette系统(Sartorius AG,Edgewood,NY)和Centrasette型系统(PallCorp.,East Hills,NY)。
任何合适的吸附色谱树脂可用于纯化。优选的吸附色谱树脂包括羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配位体色谱、亲和色谱、反相色谱及其组合。合适的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石(CHT I型和II型，Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、HA Ultrogel羟磷灰石(Pall Corp.,East Hills,NY)和陶瓷氟磷灰石(CFT I型和II型，Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的HCIC树脂的实例是MEP Hypercel树脂(PallCorp.,East Hills,NY)。合适的HIC树脂的实例包括丁基琼脂糖、己基琼脂糖、苯基琼脂糖和辛基琼脂糖树脂(均来自GE Healthcare,Piscataway,NJ)以及Macro-prep Methyl和Macro-Prep t-Butyl树脂(Biorad Laboratories,Hercules,CA)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖、CM-琼脂糖和Q-琼脂糖树脂(均来自GE Healthcare,Piscataway,NJ)和Unosphere S树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的混合模式离子交换剂的实例包括Bakerbond ABx树脂(JT Baker,Phillipsburg NJ)。合适的IMAC树脂的实例包括螯合琼脂糖树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)和Profinity IMAC树脂(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖树脂(GEHealthcare,Piscataway,NJ)和亲和胶蓝色树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的亲和树脂的实例包括蛋白质A琼脂糖树脂(例如，MabSelect,GE Healthcare,Piscataway,NJ)，其中所述细胞结合剂是抗体，和凝集素亲和树脂，例如扁豆凝集素琼脂糖树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，其中细胞结合剂具有适当的外源凝集素结合位点。可选地也可使用对细胞结合剂特异性的抗体。这样的抗体可以被固定到，例如，Sepharose4Fast Flow树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。合适的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂(Grace Vydac,Hesperia,CA)。
任何合适的非吸附色谱树脂可用于纯化。合适的非吸附色谱树脂的实例包括但不限于，SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂(例如，S-200和S-300)、SUPERDEXTM树脂(例如，SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200)、BIO-树脂(例如，P-6、P-10、P-30、P-60和P-100)以及本领域普通技术人员已知的其他树脂。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的方法还包括使混合物经过离子交换色谱膜以从混合物除去至少一部分的杂质。离子交换色谱膜可以是阴离子交换膜，例如Q膜，或者阳离子交换膜，例如S膜。在一个实施方案中，离子交换色谱膜是内毒素除去交换膜。在优选的实施方案中，离子交换色谱膜是阴离子交换膜(例如，Q膜)。
阴离子交换膜是带正电荷的微孔膜。在一个实施方案中，带正电荷的阴离子交换部分是季铵基团。在一个实施方案中，带正电荷的微孔膜包括多孔基底和具有阳离子侧基的交联涂层(参见例如，在美国专利号6,780,327、6,851,561、7,094,347、7,223,341、7,396,465所述那些)。在一个实施方案中，多孔基底为亲水性的(例如，聚醚砜或交联纤维素基质)。在另一实施方案中，阳离子基团是季铵基团。在另一实施方案中，阴离子交换膜是带正电荷的微孔膜，其包括多孔聚醚砜基底和具有季铵侧基的交联涂层。
在一个实施方案中，在使混合物经过离子交换色谱膜(例如，Q膜或S膜)之前使混合物经过PVDF膜。在另一实施方案中，在使混合物经过PVDF膜之前使混合物经过离子交换色谱膜。在又一实施方案中，在使混合物经过PVDF膜之前和之后使混合物经过离子交换色谱膜。在另一实施方案中，在使混合物经过离子交换色谱膜之前和之后使混合物经过PVDF膜。
本发明的方法包括在本领域中已知的任何合适的温度下进行本文所描述的反应(例如，修饰反应、缀合反应或一步反应)。例如，反应可以在约20℃或更低(例如，约-10℃(条件是，例如，通过用来溶解细胞毒性剂和双官能交联试剂的有机溶剂的存在来防止溶液冷冻)至约20℃、约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)或者在升高的温度(约30℃至约37℃)下发生。在一个实施方案中，反应在约16℃至约24℃(例如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)的温度下发生。
在一个实施方案中，本文描述的本发明的方法进一步包括淬灭步骤，以便淬灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联试剂。淬灭步骤是在细胞结合剂细胞毒性剂的纯化前进行。可选地，淬灭步骤是在细胞结合剂细胞毒性剂的纯化后进行。在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包括所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和杂质(例如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的混合物，其中所述细胞结合剂经由接头与细胞毒性剂化学偶联，(b)使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，(c)在步骤(b)后淬灭混合物以淬灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联试剂，(d)使淬灭的混合物经过PVDF膜，(e)任选地保持混合物，(f)任选地使混合物经过PVDF膜，以及(g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，本发明的方法包括(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包括所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和杂质(例如，游离细胞毒性剂和反应副产物)的混合物，其中所述细胞结合剂经由接头与细胞毒性剂化学偶联，(b)使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，(c)任选地在步骤(b)后淬灭混合物以淬灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联试剂，(d)任选地使淬灭的混合物经过PVDF膜，(e)保持混合物，(f)使混合物经过PVDF膜，以及(g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
在一个实施方案中，通过使混合物与淬灭剂接触淬灭混合物。如本文所使用，“淬灭剂”是指与游离细胞毒性剂和/或双官能交联试剂反应的试剂。
在一个实施方案中，可使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺淬灭剂，如4-马来酰亚胺基丁酸、3-马来酰亚胺基丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰胺丙酸，以确保淬灭细胞毒性剂中任何未反应的基团(例如硫醇)。淬灭步骤可以帮助防止细胞毒性剂的二聚化，特别是具有未反应的巯基(例如DM1)的细胞毒性剂。二聚化的细胞毒性剂可以是难以除去的。淬灭步骤还可以使与天然抗体二硫基的任何不希望的硫醇-二硫化物交换反应最小化。在用极性、带电硫醇淬灭剂(如4-马来酰亚胺基丁酸或3-马来酰亚胺基丙酸)淬灭后，过量、未反应的细胞毒性剂被转化成极性、带电、水溶性加合物，所述加合物可以在纯化步骤过程中与共价连接的缀合物容易地分离。也可以使用非极性和中性硫醇淬灭剂淬灭。
在一个实施方案中，通过使混合物与淬灭剂接触淬灭混合物，所述淬灭剂与未反应的双官能交联试剂反应。例如，可以将亲核体加入到混合物中，以便淬灭任何未反应的双官能交联试剂。亲核体优选为含氨基的亲核体，如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。
可选地，通过降低混合物的pH至约5.0(例如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)淬灭混合物。在另一实施方案中，通过降低pH值至小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0淬灭混合物。可选地，将pH降低至约4.0(例如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至约6.0(例如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、约4.0至约5.0、约4.5(例如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至约5.0。在一个实施方案中，通过使混合物的pH降低至4.8淬灭混合物。
在优选的实施方案中，在使混合物与淬灭剂接触前允许反应(例如，修饰步骤、缀合步骤或一步反应)进行至完成。在这方面，使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联试剂接触后约1小时至约48小时(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或约25小时至约48小时)将淬灭剂加入到混合物。
本发明的方法可任选包括将蔗糖加入到反应步骤(例如，修饰步骤、缀合步骤或一步反应)，以增加细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的溶解度和回收率。期望地，蔗糖以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)(例如，约0.1％(w/v)、1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)或20％(w/v))的浓度加入。优选地，蔗糖以约1％(w/v)至约10％(w/v)(例如，约0.5％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)或约11％(w/v))的浓度加入。此外，反应步骤也可包括加入缓冲剂。可使用本领域已知的任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，缓冲剂选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括一个或多个(例如，一个、两个或三个)保持步骤以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头。保持步骤包括在用双官能交联试剂修饰细胞结合剂后、在使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂缀合后和/或纯化步骤后保持混合物。当保持步骤包括在使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂缀合后和/或缀合步骤之后的纯化步骤后保持混合物时，混合物可以在保持步骤之前或之后或两者经过PVDF膜。在一个实施方案中，方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤后经历保持步骤，其中使混合物在保持步骤后和纯化步骤前经过PVDF膜。在另一实施方案中，方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤后经历保持步骤，其中使混合物在保持步骤后经历纯化步骤，接着使混合物经过PVDF膜。混合物任选地可以在混合物经过PVDF膜之前经历第二保持步骤。
保持步骤包括在合适的温度(例如，约2℃至约37℃)下维持溶液一段合适的时间(例如，约1小时至约1周)，以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，而基本上不从细胞结合剂释放稳定结合的接头。在一个实施方案中，保持步骤包括在低温(例如，约2℃至约10℃或约4℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)下维持溶液。
保持步骤的持续时间取决于进行保持步骤的温度。例如，通过在升高的温度下进行保持步骤，保持步骤的持续时间可基本上减少，最高温度受限于细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的稳定性。保持步骤可以包括维持溶液约1小时至约1天(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时，约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时)、约5小时至约1周、约12小时至约1周(例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)、约12小时至约1周(例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)或约1天至约1周。
在一个实施方案中，保持步骤包括在约2℃至约8℃的温度下维持溶液至少约12小时至多达1天的时间段。
保持步骤的pH值优选为约4至约9(例如，约4.5至约8.5或约5至约8)。在一个实施方案中，保持步骤的pH值的范围为约5至约7.5(例如，约5.5至约7.5、约6至约7.5、约6.5至约7.5、约7至约7.5、约5至约7、约5至约6.5、约5至约5.5、约5.5至约7、约6至约6.5或约6至约7)。例如，保持步骤的pH值可为约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5或约9。
可以在细胞结合剂与细胞毒性剂缀合之前或之后进行保持步骤。在一个实施方案中，在用双官能交联试剂修饰细胞结合剂后立即进行保持步骤。例如，本发明的方法包括用双官能交联试剂修饰细胞结合剂之后和缀合之前的保持步骤。细胞结合剂修饰后，可以在纯化步骤之前和/或保持步骤之后，但在缀合步骤之前进行保持步骤。在另一实施方案中，保持步骤在细胞毒性剂与具有与其结合的接头的细胞结合剂的缀合之后和纯化步骤之前立即进行。在另一实施方案中，保持步骤在缀合和纯化步骤以及随后附加的纯化步骤之后进行。
在具体的实施方案中，保持步骤可以包括在pH为约5-7.5或约6.5-7.5在约2℃至约室温孵育混合物约1小时至约1周。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括加入外源NHS。如本文所用，“外源NHS”是指来自外源的在过程中加入的NHS，并且不指作为双官能接头的加氢裂解/氨基裂解的结果在修饰反应过程中产生的NHS。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括加入约0.1mM至约300mM外源NHS。例如，本发明的方法包括加入约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.3mM、约1.5mM、约1.7mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.3mM、约2.5mM、约2.7mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.3mM、约3.5mM、约3.7mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.3mM、约4.5mM、约4.7mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.3mM、约5.5mM、约5.7mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.3mM、约6.5mM、约6.7mM、约6.9mM、约7.0mM、约7.1mM、约7.3mM、约7.5mM、约7.7mM、约7.9mM、约8.0mM、约8.1mM、约8.3mM、约8.5mM、约8.7mM、约8.9mM、约9.0mM、约9.1mM、约9.3mM、约9.5mM、约9.7mM、约9.9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM或约300mM外源NHS。在一个实施方案中，本发明的方法包括加入约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约10mM、约1.0mM至约5mM、约1.0mM至约10mM、约5.0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、约40mM至约50mM、约50mM至约60mM、约60mM至约70mM、约70mM至约80mM、约80mM至约90mM、约90mM至约100mM、约100mM至约110mM、约110mM至约120mM、约120mM至约130mM、约130mM至约140mM、约140mM至约150mM、约150mM至约160mM、约160mM至约170mM、约170mM至约180mM、约180mM至约190mM、约190mM至约200mM、约200mM至约220mM、约220mM至约240mM、约240mM至约260mM、约260mM至约280mM或约280mM至约300mM外源NHS。在另一实施方案中，本发明的方法包括加入约10mM至约200mM、约20mM至约150mM、约50mM至约150mM或约20mM至约100mM外源NHS。
在一些实施方案中，本发明的方法包括相对于NHS的修饰反应过程中作为双官能接头的加氢裂解/氨基裂解的结果产生的NHS的量加入一定摩尔比的外源NHS。本领域普通技术人员可确定特定修饰过程中产生的NHS的量因为产生的NHS的量与使用的双官能接头的量基本上相同。本领域技术人员可随后相对于修饰反应过程中产生的NHS的量向反应混合物加入一定摩尔比的外源NHS。在一个实施方案中，相对于修饰反应过程中产生的NHS的量加入约2至约200倍的外源NHS。例如，本发明的方法包括相对于修饰反应过程中产生的NHS的量加入约2、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约100或约200倍的外源NHS。
在一些实施方案中，本发明的方法包括相对于双官能接头的量加入一定摩尔比的外源NHS。在一个实施方案中，外源NHS与双官能交联剂的摩尔比为约0.5至约1000(例如，约1至约900、约5至约750、约50至约500、约100至约500、约0.5至约500或约100至约1000。例如，本发明的方法包括相对于所述双官能接头的量约0.5、约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000倍的NHS。
本发明的方法包括在制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法过程中在任何点加入外源NHS。例如，本发明的方法包括向修饰步骤(即，在该步骤中细胞结合剂与双官能接头反应)、向缀合步骤(即，在该步骤中经修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应)、向纯化步骤或在任何上述步骤之间的保持步骤加入外源NHS。在一个实施方案中，本发明的方法包括向修饰步骤(即，将NHS加入到修饰反应)、向修饰步骤和纯化步骤之间的保持步骤、向修饰步骤和缀合步骤之间的保持步骤、向纯化步骤、向缀合步骤、向缀合步骤和纯化步骤之间的保持步骤和/或向两个纯化步骤之间的保持步骤加入外源NHS。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备具有与其结合的接头的细胞结合剂的方法，该方法包括在外源NHS存在下使细胞结合剂与双官能交联试剂接触以共价连接接头和细胞结合剂，从而制备包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的混合物。
本发明提供用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组合物的方法，其中该组合物基本上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供用于制备基本上高纯度和稳定性的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法。这样的组合物可用于治疗由于缀合物的高纯度和稳定引起的疾病。包含化学偶联至细胞毒性剂(如美登素)的细胞结合剂(如抗体)的组合物描述于，例如，美国专利7,374,762。本发明的一个方面，基本上高纯度的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物具有以下的一个或多个特征：(a)大于约90％(例如，大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)、优选大于约95％的缀合物种类是单体，(b)缀合物制剂或纯化的缀合物中未缀合的接头水平小于约10％)(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)(相对于总接头)，(c)小于10％的缀合物种类是交联的(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)，(d)缀合物制剂或纯化的缀合物中游离的细胞毒性剂水平小于约5％、小于约3％、小于约2％(例如，小于或等于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(相对于总细胞毒性剂)，(f)缀合物制剂或纯化的缀合物中细胞毒性二聚体种类水平小于约5％、小于约3％、小于约2％(例如，小于或等于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(相对于总细胞毒性剂)，和/或(e)在储存时(例如，约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年或约5年后)游离细胞毒性剂水平没有显著增加。游离细胞毒性剂水平“显著增加”是指一定储存时间后，游离细胞毒性剂水平的增加小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.2％、约2.5％、约2.7％、约3.0％、约3.2％、约3.5％、约3.7％或约4.0％。
如本文所用，术语“未缀合的接头”是指与双官能交联试剂共价连接的细胞结合剂，其中细胞结合剂没有经由双官能交联试剂的接头与细胞毒性剂共价连接(即，在“未缀合的接头”可以由CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂，并且L表示双官能交联试剂。与此相反，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂)。
如本文所用，术语“细胞毒性剂二聚体”是指包含游离细胞毒性剂的二聚体，其中细胞毒性剂没有经由接头与细胞结合剂化学偶联。在一个实施方案中，细胞毒性剂二聚体经由接头彼此化学偶联(即“细胞毒性剂二聚体”可以由D-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂并且L表示双官能交联试剂。与此相反，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂)。在另一实施方案中，细胞毒性剂二聚体没有经由接头彼此化学偶联(即，“细胞毒性剂二聚体”可以由D-D表示，其中D表示细胞毒性剂。与此相反，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联试剂)。在一个实施方案中，一些细胞毒性剂二聚体经由接头彼此化学偶联，而一些细胞毒性剂二聚体没有经由接头彼此化学偶联(即，“细胞毒性剂二聚体”可以由D-L-D和D-D表示，其中D表示细胞毒性剂并且L表示双官能交联试剂)。在一个实施方案中，当接头是SMCC并且细胞毒性剂是DM1时，细胞毒性剂二聚体是DM1-DM1二聚体和DM1-MCC-DM1二聚体。
在另一实施方案中，当接头是SPP并且细胞毒性剂是DM1时，细胞毒性剂二聚体是DM1-DM1二聚体和DM1-SPP-DM1二聚体。
在另一实施方案中，当接头是CX1-1并且细胞毒性剂是DM1时，细胞毒性剂二聚体是DM1-DM1二聚体和DM1-CX1-1-DM1二聚体。
如本文所用，术语“游离细胞毒性剂”是指没有经由接头与细胞结合剂化学偶联的细胞毒性剂的任何形式(即“游离细胞毒性剂”可以包括但不限于由D表示的单独的细胞毒性剂、与接头或接头衍生物(例如水解的衍生物)偶联的由D-L表示的细胞毒性剂和由上述D-D和D-L-D表示的细胞毒性剂二聚体)。
在一个实施方案中，游离细胞毒性剂包括DM1、MCC-DM1、氢-SMCC-DM1、SMCC-DM1、DM1-SPP、DM1-TPA、DM1-DM1、DM1-MCC-DM1和DM1-SPP-DM1。
如本文所用，术语“细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集体”是指共价或非共价地彼此偶联的两个或更多个细胞结合剂细胞毒性剂缀合物(例如，经由接头共价偶联的两个或更多个细胞结合剂细胞毒性剂缀合物)。
在一个实施方案中，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中细胞毒性剂与细胞结合剂的平均摩尔比为约1至约10、约2至约7、约3至约5、约2.5至约4.5(例如，约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0至约4.0、约3.2至约4.2、约4.5至5.5(例如，约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5)。
细胞结合剂可以是与细胞(典型地和优选地动物细胞(例如，人细胞))结合的任何合适的试剂。细胞结合剂优选地为肽或多肽或糖表位。合适的细胞结合剂包括，例如，抗体(例如，单克隆抗体及其片段)、干扰素(例如，α、β、γ)、淋巴因子(例如，白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、激素(例如，胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(促黑色素细胞激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素)、生长因子和集落刺激因子如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)如G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess,Immunology Today5:155-158(1984))、营养转运分子(例如转铁蛋白)、维生素(例如，叶酸)和特异性结合细胞表面上的靶标分子的任何其他试剂或分子。
细胞结合剂是抗体的情况下，其结合为多肽的抗原，并且可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。示例性的抗原包括这样的分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵胞激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤维蛋白溶酶原活化因子，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原活化因子(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽；RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-β；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)，如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体，如FGFR2/4和FGFR3、表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLR1、间皮素、cripto、αvβ6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80。CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152或与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，在美国专利申请公开号2008/0171040或美国专利申请公开号2008/0305044中公开，并且以引用方式整体并入；促细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，HIV包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；内皮糖蛋白、c-Met、IGF1R、前列腺抗原如PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2和STEAP1；LGR5、B7H4和任何上述所列多肽的片段。
此外，与骨髓细胞结合的GM-CSF可用作来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。与活化的T细胞结合的IL-2可用于预防移植物移植排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主病，以及用于治疗急性T细胞白血病。结合黑素细胞的MSH作为可针对黑素瘤的抗体可用于治疗黑素瘤。叶酸可用于靶向在卵巢瘤和其他肿瘤上表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞状细胞癌，如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向成神经细胞瘤和其他肿瘤类型。
乳腺癌和睾丸癌可以作为细胞结合剂分别成功地靶向与雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)
如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、dsFv、sFv、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体(Parham,J.Immunol.131:2895-2902(1983)；Spring等人J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff等人Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960),Kim等人,Mol.Cancer Ther.,7:2486-2497(2008),C arter,Nature Revs.,6:343-357(2006))，或免疫球蛋白嵌合体，其可以与细胞(例如，其包含互补决定区(CDR))表面上的抗原结合。任何合适的抗体可用作细胞结合剂。本领域的普通技术人员将理解，适合抗体的选择将取决于待靶向的细胞群。在这方面，在特定的细胞群(典型地和优选地患病细胞群)上选择性地表达的细胞表面分子(即，抗原)的类型和数目将决定本发明组合物中使用的适合抗体的选择。多种细胞类型(包括肿瘤细胞类型)的细胞表面表达谱是已知的，或者，如果未知的，可以使用常规的分子生物学和组织化学技术来确定。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但最优选是单克隆抗体。如本文所用，“多克隆”抗体是指抗体分子的异质群体，通常包含在免疫动物的血清中。“单克隆”抗体是指对特定抗原有特异性的抗体分子的同质群体。单克隆抗体通常由B淋巴细胞(“B细胞”)的单个克隆产生。单克隆抗体可以使用多种本领域技术人员已知的技术获得，包括标准的杂交瘤技术(参见，例如，和Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511-519(1976),Harlow和Lane(编),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)，以及C.A.Janeway等人(编),Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York,NY(2001))。简言之，产生单克隆抗体的杂交瘤方法通常包括用抗原(即，“免疫原”)注射任何合适的动物，典型地和优选地小鼠。随后处死动物，并且将从它的脾中分离的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。产生杂交细胞(即“杂交瘤”)，该杂交细胞在体外无限增殖并且连续分泌高滴度的具有所需特异性的抗体。本领域已知的任何合适的方法可用于鉴别产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤细胞。这样的方法包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析和放射免疫测定。筛选杂交瘤群体以分离单独的克隆，每个克隆均分泌针对抗原的单一抗体种类。因为每个杂交瘤是源自与单个B细胞融合的克隆，所以所有它所产生的抗体分子的结构(包括其抗原结合位点和同种型)相同。单克隆抗体也可以使用其他合适的技术产生，所述技术包括EBV-杂交瘤技术(参见，例如，Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2):361-67(1984)，以及Roder等人,Methods Enzymol.,121:140-67(1986))、细菌噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等人,Science,246:1275-81(1989))，或者包含抗体片段如Fab和scFv(单链可变区)的噬菌体展示文库(参见，例如，美国专利5,885,793和5,969,108，以及国际专利申请公开WO 92/01047和WO 99/06587)。
可以从任何合适的动物分离或产生单克隆抗体，但优选在哺乳动物、更优选小鼠或人、最优选人中产生。在小鼠中产生抗体的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本文中。对于人抗体，本领域的普通技术人员将理解，多克隆抗体可从用适合的抗原接种或免疫的人受试者的血清中分离。可选地，可以通过调整用于在非人动物如小鼠生产人抗体的已知技术(参见，例如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352，以及美国专利申请公开号2002/0197266A1)产生人抗体。
尽管是人体内治疗应用的理想选择，但是人抗体，特别是人单克隆抗体通常比小鼠单克隆抗体更难以产生。然而，当给人施用时小鼠单克隆抗体诱导快速宿主抗体响应，这可能降低抗体-细胞毒性剂缀合物的治疗或诊断的潜力。为了规避这些并发症，单克隆抗体优选不被人的免疫系统识别为“外来物”。
为此，噬菌体展示可用于产生抗体。在这方面，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库(参见，例如，Sambrook等人(编),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(2001))。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于特异性结合所需抗原，并且重构包含所选可变结构域的完整人抗体。将编码重构抗体的核酸序列引入合适的细胞系，如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞，使得细胞分泌具有单克隆抗体的特征的人抗体(参见，例如Janeway等人,同上，Huse等人，同上，和美国专利6,265,150)。可选地，单克隆抗体可以从转基因特定人重和轻链免疫球蛋白基因的小鼠产生。这些方法是本领域已知的并且描述于，例如，美国专利5,545,806和5,569,825，以及Janeway等人,同上。
最优选抗体是人源化抗体。如本文所用，“人源化”抗体是其中形成抗体的抗原结合环的小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)被移植到人抗体分子的构架上的抗体。由于小鼠和人抗体的构架相似性，本领域普遍接受这种方法产生单克隆抗体，所述单克隆抗体与人抗体抗原性相同，但与CDR序列源自其的小鼠单克隆抗体结合相同抗原。用于产生人源化抗体的方法是本领域熟知的并且详细描述于，例如，Janeway等人,同上,美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利号0239400B1，以及英国专利号2188638。人源化抗体还可以使用在美国专利5,639,641和Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235:959-973(1994)中描述的抗体表面重塑技术产生。尽管在本发明的组合物的缀合物中使用的抗体最优选为人源化单克隆抗体，如上所述的人单克隆抗体和小鼠单克隆抗体也在本发明的范围内。
具有至少一个抗原结合位点并因此识别和结合存在于靶细胞表面上的至少一种抗原或受体的抗体片段也包括在本发明的范围内。在这方面，完整抗体分子的蛋白水解裂解可产生多种保留识别和结合抗原的能力的抗体片段。例如，用木瓜蛋白酶限制性消化抗体分子通常产生三个片段，其中两个片段是相同的并且被称为Fab片段，因为它们保留了亲本抗体分子的抗原结合活性。用酶胃蛋白酶裂解抗体分子通常产生两个抗体片段，其中一个保留了抗体分子的两个抗原结合臂，并且因此被称为F(ab’)2片段。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab’)2片段产生称为Fab’片段的片段。可以使用常规的重组DNA技术的技术产生由截短的Fab片段组成的单链可变区片段(sFv)抗体片段，所述Fab片段包含经由合成肽与抗体轻链的V结构域连接的抗体重链可变(V)结构域(参见，例如，Janeway等人,同上)。类似地，二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术来制备(参见，例如，Reiter等人,Protein Engineering,7:697-704(1994))。然而，在本发明的上下文中的抗体片段，不限于抗体片段的这些示例性类型。可以使用识别并结合至希望的细胞表面受体或抗原的任何合适的抗体片段。抗体片段进一步描述于，例如，Parham,J.Immunol.,131:2895-2902(1983),Spring等人,J.Immunol.,113:470-478(1974),以及Nisonoff等人,Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244(1960)。抗体-抗原结合可使用本领域中已知的任何合适的方法，诸如，例如，放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定法来测定(参见，例如，Janeway等人,同上,和美国专利申请公开号2002/0197266A1)。
此外，抗体可以是嵌合抗体或其抗原结合片段。“嵌合的”是指抗体包含从至少两个不同的物种获得或来源于至少两个不同的物种的至少两个免疫球蛋白或其片段(例如，两种不同的免疫球蛋白，如与鼠免疫球蛋白可变区组合的人免疫球蛋白恒定区)。抗体也可以是结构域抗体(dAb)或其抗原结合片段，诸如，例如，骆驼科动物抗体(参见，例如，Desmyter等人,Nature Struct.Biol.,3:752，(1996))，或鲨鱼抗体，诸如，例如，新抗原受体(IgNAR)(参见，例如，Greenberg等人,Nature,374:168(1995),以及Stanfield等人,Science,305:1770-1773(2004))。
任何合适的抗体可以在本发明的上下文中使用。例如，单克隆抗体J5是对普通急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)有特异性的鼠IgG2a抗体(Ritz等人,Nature,283:583-585(1980))，并可用于靶向表达CALLA的细胞(例如，急性淋巴细胞性白血病细胞)。单克隆抗体MY9是与CD33抗原特异性结合的鼠IgG1抗体(Griffin等人,Leukemia Res.,8:521(1984))，并且可用于靶向表达CD33的细胞(例如，急性骨髓性白血病(AML)细胞)。
类似地，单克隆抗体抗B4(也称为B4)是与B细胞上的CD19抗原结合的鼠IgG1抗体(Nadler等人,J.Immunol.,131:244-250(1983))，并且可用于靶向表达CD19的B细胞或患病细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤细胞和慢性淋巴细胞白血病细胞)。N901是鼠单克隆抗体，其与发现于神经内分泌起源(包括小细胞肺肿瘤)的细胞上的CD56(神经细胞粘附分子)抗原结合，其可用于使靶药物与神经内分泌起源的细胞缀合。优选在J5、MY9和B4抗体作为缀合物的一部分使用之前使它们表面重塑或人源化。抗体的表面重塑或人源化描述于，例如，Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-73(1994)。在一个实施方案中，抗B4抗体是huB4。在另一实施方案中，抗B4抗体包含重链和轻链，其中重链具有以下序列
并且轻链具有以下序列
此外，单克隆抗体C242与CanAg抗原结合(参见，例如，美国专利5,552,293)，并且可用于使缀合物靶向表达CanAg的肿瘤，如结肠直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。HuC242是单克隆抗体C242的人源化形式(参见，例如，美国专利5,552,293)。产生HuC242的杂交瘤细胞以ECACC识别号90012601保藏。HuC242可以使用CDR移植方法(参见，例如，美国专利5,585,089、5,693,761和5,693,762)或表面重塑技术(参见，例如，美国专利5,639,641)来制备。HuC242可用于使缀合物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞，例如，结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞以及胃癌细胞。
为了靶向卵巢癌细胞和前列腺癌细胞，抗MUC1抗体可以用作缀合物中的细胞结合剂。抗MUC1抗体包括，例如，抗HMFG-2(参见，例如，Taylor-Papadimitriou等人,Int.J.Cancer,28:17-21(1981))、hCTM01(参见，例如，van Hof等人,Cancer Res.,56:5179-5185(1996))和DS6。也可以通过使用抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为细胞结合剂如J591用缀合物靶向前列腺癌细胞(参见，例如，Liu等人,Cancer Res.,57:3629-3634(1997))。此外，可以通过使用抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗)作为细胞结合剂用缀合物靶向表达Her2抗原的癌细胞，如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。可以通过使用抗EGFR抗体用缀合物靶向表达表皮生长因子受体(EGFR)及其变体(例如III型缺失突变、EGFRvIII)的细胞。抗EGFR抗体描述于国际专利申请号PCT/US11/058385和PCT/US11/058378。抗EGFRvIII抗体描述于美国专利7,736,644和7,628,986，以及美国专利申请公开2010/0111979；2009/0240038；2009/0175887；2009/0156790；和2009/0155282。与胰岛素样生长因子受体结合的抗IGF-IR抗体，如在美国专利7,982,024描述的那些，还可用于缀合物中。与CD27L、Cripto、CD138、CD38、EphA2，整联蛋白、CD37、叶酸酯、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、内皮糖蛋白和Her3结合的抗体也可以用于缀合物中。
在一个实施方案中，抗体选自huN901、抗CD33抗体(例如，huMy9-6)、huB4、huC242、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)、比伐单抗、西罗珠单抗、利妥昔单抗、huDS6、国际专利申请公开WO 2010/124797中描述的抗间皮素抗体(如MF-T)、美国专利申请公开2010/0093980中描述的抗cripto抗体(如huB3F6)、美国专利申请公开2007/0183971中描述的抗CD138抗体(如B-B4或人源化B-B4或nBT062)、国际专利申请公开WO 2012/058592和WO 2012/058588中描述的抗EGFR抗体(如EGFR-7)、美国专利7,736,644和7,628,986和美国专利申请公开2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中描述的抗EGFRvIII抗体，国际专利申请公开WO 2011/039721和WO 2011/039724中描述的人源化EphA2抗体(如2H11R35R74)；国际专利申请公开WO 2008/047242中描述的抗-CD38抗体(如hu38SB19)、国际专利申请公开WO2011/106528和美国专利申请公开2012/0009181中描述的抗叶酸受体抗体(例如，huMov19 1.0或1.6形式)；美国专利5,958,872、6,596,743和7,982,024中描述的抗IGF1R抗体；美国专利申请公开2011/0256153中描述的抗CD37抗体(例如，huCD37-3 1.0形式)；美国专利申请公开2006/0127407中描述的抗整联蛋白αVβ6抗体(例如，CNTO95)；以及在国际专利申请公开WO 2012/019024中描述的抗Her3抗体。在本发明的一个实施方案中，抗体不是huN901或CNTO95。在一个实施方案中，抗CD37抗体是huCD37-3，其中所述抗体包含可变重链和可变轻链，其中可变重链具有以下序列
并且可变轻链具有以下序列
尽管细胞结合剂优选抗体，但是细胞结合剂还可以是非抗体分子。合适的非抗体分子包括，例如，干扰素(例如，α、β或γ干扰素)、淋巴因子(例如，白介素2(IL-2)、IL-3、IL-4或IL-6)、激素(例如，胰岛素)、生长因子(例如，EGF、TGF-α、FGF和VEGF)、集落刺激因子(例如，G-CSF、M-CSF和GM-CSF(参见，例如，Burgess,Immunology Today,5:155-158(1984))、生长抑素和转铁蛋白(参见，例如，O'Keefe等人,J.Biol.Chem.,260:932-937(1985))。例如，与骨髓细胞结合的GM-CSF可用作细胞结合剂以靶向急性骨髓性白血病细胞。此外，与活化的T细胞结合的IL-2可用于预防移植物移植排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主病，以及用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子(EGF)可用于靶向鳞状细胞癌，如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向成神经细胞瘤细胞和其他肿瘤细胞类型。
缀合物可以包含任何合适的细胞毒性剂。如本文所用，“细胞毒性剂”是指导致细胞死亡、诱导细胞死亡或降低细胞活力的任何化合物。合适的细胞毒性剂包括，例如，美登素和美登素类似物、紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物，以及多拉司他汀和多拉司他汀类似物。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂是美登素，包括美登醇和美登醇类似物。美登素是抑制微管形成和对哺乳动物细胞有高度毒性的化合物。合适的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳环的那些和在其他位置具有修饰的那些。这样的美登素描述于，例如，美国专利4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545和6,333,410。
具有修饰的芳环的美登醇类似物的实例包括：(1)C-19-脱氯(美国专利4,256,746)(通过LAH还原安丝菌素(ansamytocin)P2制备)、(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)脱甲基或使用LAH脱氯制备)，和(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利4,294,757)(通过使用酰基氯酰化制备)。
在除芳环外的位置具有修饰的美登醇类似物的实例包括：(1)C-9-SH(美国专利4,424,219)(通过使美登醇与H2S或P2S5反应制备)，(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧/CH2OR)(美国专利4,331,598)，(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利4,450,254)(由诺卡氏菌属(Nocardia)制备)，(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4,364,866)(通过链霉菌属转化美登醇制备)，(5)C-15甲氧基(美国专利4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)分离)，(6)C-18-N-脱甲基(美国专利4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌属通过美登醇脱甲基制备)，和(7)4,5-脱氧(美国专利4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
在本发明的优选实施方案中，缀合物利用含硫醇的美登素DM1，也称为N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素作为细胞毒性剂。DM1的结构由式(I)表示：
在本发明的优选实施方案中，缀合物利用含硫醇的美登素DM4，也称为N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代丙基)-美登素作为细胞毒性剂。DM4的结构由式(II)表示：
其他美登素也可以在本发明的上下文中使用，包括，例如，在具有硫原子的碳原子上具有单烷基或二烷基取代的含硫醇和二硫化物的美登素。特别优选是在C-3位置(a)具有C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基官能，以及(b)具有携带阻碍巯基的酰基的酰化氨基酸侧链的美登醇，其中具有硫醇官能的酰基的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或烯基、苯基、取代苯基或杂环芳基或杂环烷基，并且进一步地，其中取代基之一可以是H，并且其中所述酰基在羰基官能和硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。
本发明的上下文中使用的另外的美登素包括由式(III)表示的化合物：
其中Y’表示
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，并且其中R2也可以是H，
其中A、B、D是具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、单一或取代的芳基、或杂环芳基、或杂环基，
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1至10碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，
其中l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立地为零或1至5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个在任何一个时间不为零，并且
其中Z是H、SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基或单一的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(III)的优选实施方案包括式(III)化合物，其中(a)R1是H，R2是甲基并且Z是H，(b)R1和R2是甲基并且Z是H，(c)R1是H，R2是甲基，并且Z是-SCH3，并且(d)R1和R2是甲基，并且Z是-SCH3。
这种另外的美登素还包括由式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)表示的化合物：
其中Y表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基或杂环烷基，并且其中R2也可以是H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可以是零，
其中Z是H、SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或烯基、或单一的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，且
其中May表示在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20脱甲基处具有侧链的美登素。
式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)的优选实施方案包括式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)的化学物，其中(a)R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n是0，并且Z是H，(b)R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m是1，n是0，并且Z是H，(c)R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n是0，并且Z是-SCH3，或(d)R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m是1，n是0，并且Z是-SCH3。
优选地细胞毒性剂由式(IV-L)表示。
另外优选的美登素还包括由式(V)表示的化合物：
其中Y表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基、或杂环烷基，并且其中R2也可以是H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可以是零，并且
其中Z是H、SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、或单一的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(V)的优选实施方案包括式(V)的化合物，其中(a)R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8各自为H；l和m各自为1；n是0；并且Z是H，(b)R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8各自为H，l和m是1；n是0；并且Z是H，(c)R1是H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n是0，并且Z是-SCH3，或(d)R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自为H，l和m是1，n是0，并且Z是-SCH3。
还进一步优选的美登素包括由式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D，L)表示的化合物：
其中Y2表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基或杂环烷基，并且其中R2也可以是H，
其中R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链环烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环芳基、或杂环烷基，
其中l、m和n各自独立地为1至5的整数，并且另外n可以是零，
其中Z2是SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、或单一的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，并且
其中May是美登素。
另外优选的美登素包括由式(VII)表示的化合物：
其中Y2’表示
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2各自独立地为CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的直链支链或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，并且另外的R2也可以是H，
其中A、B和D各自独立地为具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单一或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基，
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地为H、CH3、C2H5、具有1至10碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，
其中l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立地为零或1至5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个在任何一个时间都不为零，并且
其中Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3至10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或单一或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(VII)的优选实施方案包括式(VII)的化合物，其中R1是H并且R2是甲基。
除了美登素，缀合物中使用的细胞毒性剂可以是紫杉烷或其衍生物。紫杉烷是包括紫杉醇(一种细胞毒性的天然产物)和多西他赛(一种半合成衍生物)的化合物家族，两者都广泛用于癌症的治疗。紫杉烷是抑制微管蛋白的解聚从而导致细胞死亡的有丝分裂纺锤体毒剂。尽管多西他赛和紫杉醇是在癌症治疗中有用的试剂，但是它们的抗肿瘤活性由于它们对正常细胞的非特异性毒性而受到限制。另外，化合物如紫杉醇和多西紫杉醇本身不能充分有效地在细胞结合剂的缀合物中使用。
在细胞毒性缀合物的制备中使用的优选的紫杉烷是式(VIII)的紫杉烷：
可以在本发明的上下文中使用的用于合成紫杉烷的方法，连同用于使紫杉烷与细胞结合剂如抗体缀合的方法，详细描述于美国专利5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6,706,708、6,716,821和7,390,898。
细胞毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。CC-1065是从泽耳链霉菌(Streptomyces zelensis)的培养液中分离的强效抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外比常用的抗癌药物(如多柔比星、甲氨蝶呤和长春新碱)更强效约1000倍(Bhuyan等人,Cancer Res.,42:3532-3537(1982))。CC-1065及其类似物在美国专利5,585,499、5,846,545、6,340,701和6,372,738中公开。CC-1065的细胞毒性效力已与它的烷基化活性和它的DNA结合或DNA-嵌入活性相关联。这两种活性位于分子的单独部分。在这方面，烷基化活性包含在环丙烷并吡咯并吲哚(CPI)亚基中，并且DNA结合活性位于CC-1065的两个吡咯并吲哚亚基中。
若干CC-1065类似物是本领域已知并且也可以用作缀合物的细胞毒性剂(参见，例如，Warpehoski等人,J.Med.Chem.,31:590-603(1988))。已开发一系列的其中CPI部分被替换为环丙烷并苯并吲哚(CBI)部分的CC-1065类似物(Boger等人,J.Org.Chem.,55:5823-5833(1990),以及Boger等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1:115-120(1991))。这些CC-1065类似物维持亲本药物的高体外效力，而不会在小鼠中造成延迟毒性。像CC-1065，这些化合物是共价结合于DNA的小沟以引起细胞死亡的烷化剂。
可通过经由靶向递送到肿瘤位点改变体内分布，从而导致对非靶向组织毒性较低，因此导致全身毒性较低，极大提高CC-1065类似物的治疗功效。为此，已经产生CC-1065类似物和衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的缀合物(参见，例如，美国专利5,475,092、5,585,499和5,846,545)。这些缀合物通常显示体外高靶标特异性的细胞毒性，和在小鼠的人肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性(参见，例如，Chari等人,Cancer Res.,55:4079-4084(1995))。
合成CC-1065类似物的方法详细描述于美国专利5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,534,660、6,586,618、6,756,397和7,329,760。
药物如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C，苯丁酸氮芥、加利车霉素、tubulysin和tubulysin类似物、倍癌霉素(duocarmycin)和倍癌霉素类似物、多拉司他汀和多拉司他汀类似物也可用作本发明的细胞毒性剂。多柔比星(doxarubicin)和柔红霉素化合物(参见，例如，美国专利6,630,579)也可用作细胞毒性剂。
细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可以通过体外方法制备。为了使细胞毒性剂与抗体连接，使用连接基团。合适的连接基团是本领域熟知的，并且包括二硫基、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团以及不可裂解的连接基团。
根据本发明，通过使双官能交联试剂与细胞结合剂反应，从而导致接头分子与细胞结合剂的共价连接来修饰细胞结合剂。如本文所用，“双官能交联试剂”是指这样一种试剂，所述试剂具有两个反应基团；其中一个反应基团能够与细胞结合剂反应，而另一反应基团能够与细胞毒性剂反应，以连接细胞结合剂与细胞毒性剂，从而形成缀合物。
任何合适的双官能交联试剂可以与本发明联合使用，只要接头试剂分别提供用于保持治疗特性(例如，细胞毒性)以及细胞毒性剂和细胞结合剂的靶向特性，同时提供可以接受的毒性特征(toxicity profile)。优选地，所述接头分子经由化学键(如上所述)连接细胞毒性剂和细胞结合剂，使得细胞毒性剂和细胞结合剂彼此化学偶联(例如，共价结合)。
在一个实施方案中，细胞结合剂经由选自二硫键、酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键的化学键与细胞毒性剂化学偶联。
在一个实施方案中，双官能交联试剂包含不可裂解的接头。不可裂解的接头是能够以稳定、共价方式连接细胞毒性剂(如美登素、紫杉烷或CC-1065类似物)与细胞结合剂的任何化学部分。因此，不可裂解的接头在使细胞毒性剂或细胞结合剂保持活性的条件下基本上抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。
形成细胞毒性剂和细胞结合剂之间的不可裂解的接头的合适的交联试剂是本领域熟知的。在一个实施方案中，细胞毒性剂经由硫醚键与细胞结合剂化学偶联。在另一实施方案中，细胞毒性剂经由酰胺键与细胞结合剂连接。不可裂解的接头的实例包括具有用于与细胞毒性剂反应的基于马来酰亚胺的部分或基于卤代乙酰基的部分的接头。这样的双官能交联剂在本领域中熟知的(参见美国专利申请公开号2010/0129314、2009/0274713、2008/0050310、2005/0169933，以及Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117,Rockland,IL 61105,USA)，并且包括但不限于，N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)，其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺基酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含卤代乙酰基部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)、N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)、双-马来酰亚胺聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺基酯(BMPS)、5-琥珀酰亚胺戊酸NHS，HBVS、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)-丁酸酰肼·盐酸(MPBH)、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双-马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双-马来酰亚胺基己烷(BMH)、双-马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺己酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺十一烷酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-KMUS)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)、CX1-1、磺基-Mal和PEGn-Mal。优选地，双官能交联试剂是SMCC。
在一个实施方案中，接头试剂是可裂解的接头。合适的可裂解的接头的实例包括含二硫化物的接头、酸不稳定的接头、光不稳定的接头、肽酶不稳定的接头和酯酶不稳定的接头。含二硫化物的接头是经由可以在生理条件下发生的二硫化物交换的可裂解的接头。酸不稳定的接头是在酸性pH可裂解的接头。例如，某些细胞内区室(如内涵体和溶酶体)具有酸性pH(pH 4-5)，并提供适于裂解酸不稳定的接头的条件。光不稳定的接头在体表和光可到达的许多体腔中有用。此外，红外光可以穿透组织。肽酶不稳定的接头可以用于裂解细胞内部或外部的某些肽(参见，例如，Trouet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:626-629(1982),以及Umemoto等人,Int.J.Cancer,43:677-684(1989))。在一个实施方案中，可裂解的接头在温和的条件下裂解，即，细胞内细胞毒性剂的活性不受影响的条件下。
在一个实施方案中，细胞毒性剂经由二硫键与细胞结合剂连接。接头分子包括可以与细胞结合剂反应的反应性化学基团。在一个实施方案中，双官能交联试剂包括可以与细胞结合剂的赖氨酸残基形成酰胺键的反应部分。可与细胞结合剂的赖氨酸残基形成酰胺键的反应部分的实例包括羧酸部分和活性酯部分，如N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、硝基苯基(例如，2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基四氟苯基(例如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和五氟苯基酯。
与细胞结合剂反应的优选的反应性化学基团为N-琥珀酰亚胺基酯和/或N-磺基琥珀酰亚胺基酯。另外，接头分子包括可与细胞毒性剂反应以形成二硫键的反应性化学基团，优选二硫代吡啶基。能够经由二硫键使细胞结合剂与细胞毒性剂键连的双官能交联试剂是本领域已知的，并且包括，例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如，Carlsson等人，Biochem.J.,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见，例如，美国专利4,563,304)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如，CAS登记号341498-08-6)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见，例如，美国专利申请公开号2009/0274713)。可以用于引入二硫基的其他双官能交联试剂是本领域已知的并描述于美国专利6,913,748、6,716,821和美国专利申请公开号2009/0274713和2010/0129314中，所有这些专利以引用方式整体并入本文。
形成不可裂解的接头的缺乏硫原子的其他交联试也可以在本发明的方法中使用。此类接头可以源自基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括但不限于，在通式(IX)的α,ω-二羧酸：
HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH
(IX)，
其中X是具有2至20个碳原子的直链或支链烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原子的取代或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂环基，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和n各自独立地为0或1，条件是l、m和n不同时为零。
许多本文公开的不可裂解的接头详细描述于美国专利申请公开号2005/0169933A1。
通过本发明的方法生产的最终纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含细胞毒性剂、双官能交联剂和细胞结合剂。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂是DM1，双官能交联剂是SMCC，并且细胞结合剂是huCD37-3抗体。在本发明的另一优选实施方案中，细胞毒性剂是DM1，双官能交联剂是SMCC，并且细胞结合剂是EGFR-7R抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂是DM1，双官能交联剂是SMCC，并且细胞结合剂是抗EFGRvIII抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂是DM1，双官能交联剂是SMCC，并且细胞结合剂是抗CD27L抗体。在本发明的优选实施方案中，细胞毒性剂是DM1，双官能交联剂是SMCC，并且细胞结合剂是曲妥珠单抗。
下面的实施例进一步说明本发明，但当然不应该被解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
该实施例示出用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
抗体-SMCC-DM1缀合物通过一步法制备(如在美国专利申请公开号2012/0253021中所述)。将反应混合物通过经由PVDF过滤器连续泵送，收集滤液并且分析DM1二聚体种类。如图1所示，在PVDF过滤前存在的DM1二聚体种类，包括DM1-DM1和DM1-MCC-DM1(参见图1A)，通过PVDF过滤有效地除去(参见图1B)。
该实施例反映的实验结果表明，PVDF过滤可以有效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物除去游离细胞毒性剂，如细胞毒性剂二聚体。
实施例2
该实施例示出用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过单独的PVDF膜以及与离子交换色谱膜的组合，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
抗体-SMCC-DM1缀合物通过一步法制备(如在美国专利申请公开号2012/0253021中所述)。反应混合物经由PVDF膜滤器或PVDF膜滤器与Q膜(离子交换色谱膜)的组合过滤。如下表1中所示，PVDF膜滤器和Q膜的组合比单独的PVDF膜滤器除去更多DM1二聚体种类。
表1
该实施例反映的实验结果表明，PVDF过滤当单独使用或与Q膜组合使用时，可以有效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物除去游离细胞毒性剂，如细胞毒性剂二聚体。
实施例3
该实施例示出用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物反复经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
抗体-SMCC-DM1缀合物通过一步法制备(如在美国专利申请公开号2012/0253021中所述)。反应混合物经由PVDF膜滤器过滤两次或三次。每次过滤之前和之后测量DM1二聚体(DM1-DM1和DM1-MCC-DM1)的百分比。如图2所示，另外的PVDF膜过滤可进一步除去DM1二聚体种类。
该实施例反映的实验结果表明，PVDF过滤可以有效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物除去游离细胞毒性剂，如细胞毒性剂二聚体。
实施例4
该实施例示出用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
huN901-SPP-DM1缀合物通过一步法制备(如在美国专利申请公开号2012/0253021中所述)。简言之，使huN901抗体渗滤到修饰缓冲液(50mM磷酸钾，2mM EDTA，pH7.5)中，然后在2.5mg/ml与相对于接头1.55摩尔过量的DM1和相对于抗体7摩尔的SPP接头在50mM磷酸钾、2mM EDTA、pH 7.5的含10％(v/v)DMA的缓冲液中一起缀合，在室温下24-28小时。
然后经由0.22μm Dura孔的PVDF过滤器过滤反应混合物。PVDF过滤之前和之后通过HPLC测量反应混合物中存在的游离细胞毒性剂的量。结果示于下表3中。
表3
如表3所示，通过PVDF过滤测量到所有游离细胞毒性剂种类(即，DM1、DM1-TPA、DM1-SPP，DM1-DM1和DM1-SPP-DM1)的量减少。具体地，通过PVDF过滤两种细胞毒性剂的二聚体种类(DM1-DM1和DM1-SPP-DM1)显著减少。
该实施例反映的实验结果表明，PVDF过滤可以有效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物除去游离细胞毒性剂。
实施例5
该实施例示出用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过PVDF膜，以从混合物除去至少一部分的杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
在23℃下在16.0mg/ml的浓度下在50mM KPi、50mM KCl、2mM EDTA、pH7.5的具有5％(v/v)DMA的缓冲液中以11.0mg/g抗体的比值(4.7X摩尔比)用SPP修饰huN901抗体共计180分钟，并不断搅拌。然后在具有2mM EDTA、7.7mM柠檬酸和5％DMA的15mM KPi缓冲液中在pH 5.3 23℃下，使修饰的抗体在2.5mg/ml的浓度下与相对于初始的SPP接头1.8倍摩尔过量的DM1缀合23小时，并不断搅拌。然后经由0.22μm Dura孔的PVDF过滤器过滤反应混合物。PVDF过滤之前和之后通过HPLC测量反应混合物中存在的游离细胞毒性剂的量。结果示于下表4中。
表4
如表4所示，通过PVDF过滤测量到所有游离细胞毒性剂种类(即，DM1-TPA、DM1、DM1-DM1和DM1-SPP-DM1)的量减少。具体地，通过PVDF过滤两种细胞毒性剂的二聚体种类(DM1-DM1和DM1-SPP-DM1)显著减少。
反映该实施例的实验结果表明，PVDF过滤可以有效地从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物除去游离细胞毒性剂。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，以引用方式据此并入本文，其程度如同单独并具体地指出每个参考文献以引用方式并入，并在本文中整体阐述。
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”以及“所述”以及类似的提及应被解释为涵盖单数和复数两者，除非在本文另外地指示或明显地与上下文矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”和“含有”被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外说明，本文数值范围的列举仅旨在用作分别提及落入范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独的数值被并入说明书中，如同它在本文中被单独列举。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。任何和所有实例的使用或本文所提供的示例性语言(例如，“如”)仅旨在更好地阐明本发明而并不是对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的语言不应解释为指出任何未要求保护的实施本发明的必需要素。
本发明的优选实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读上述说明时，那些优选实施方案的变更可变得显而易见。发明人希望熟练的技术人员在适当情况下使用这样的变更，且发明人意图将本发明用于以本文具体描述以外的方式实践。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。而且，在其所有可能的变更中，上述要素的任何组合均由本发明涵盖，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。
序列表
<110> 伊缪诺金公司
<120> 使用PVDF膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
<130> 714287
<150> 61/709,891
<151> 2012-10-04
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Lys Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Asn Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Trp Gly Thr Thr Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105

Claims (98)

1.一种用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以从所述混合物除去至少一部分的所述杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法顺次重复两次、三次或四次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物经过离子交换色谱膜以从所述混合物中除去至少一部分的所述杂质。
4.如权利要求3所述的方法，其中使所述混合物经过离子交换色谱膜之前使所述混合物经过PVDF膜。
5.如权利要求3所述的方法，其中使所述混合物经过PVDF膜之前使所述混合物经过离子交换色谱膜。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的第一混合物，然后使所述第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由所述接头与所述细胞毒性剂化学偶联的所述细胞结合剂；
(b)使所述第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及
(c)使步骤(b)之后的所述纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于所述纯化的第二混合物所述纯化的第三混合物包含减少量的所述杂质。
7.如权利要求6所述的方法，其中在步骤(c)之前顺次重复步骤(b)两次、三次或四次。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中吸附色谱在步骤(c)中使用。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述吸附色谱选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配位体色谱、亲和色谱、反相色谱及其组合。
10.如根据权利要求9所述的方法，其中所述吸附色谱是离子交换色谱。
11.如根据权利要求10所述的方法，其中所述离子交换色谱是陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱。
12.如权利要求6或7所述的方法，其中切向流过滤在步骤(c)中使用。
13.如权利要求6-12中任一项所述的方法，其中通过以下实现步骤(a)中的所述接触：在反应容器中提供所述细胞结合剂，将所述细胞毒性剂加入到所述反应容器中以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的所述第一混合物，然后将所述双官能交联试剂加入到所述第一混合物中。
14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其还包括在步骤a-b或步骤b-c之间保持所述混合物以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述混合物在约2℃至约8℃的温度下保持约20小时。
16.如权利要求6-15中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)-(b)之间淬灭所述第二混合物以淬灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联试剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中通过使所述第二混合物与淬灭剂接触来淬灭所述混合物，所述淬灭剂与所述游离细胞毒性剂反应。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述淬灭剂选自4-马来酰亚胺基丁酸、3-马来酰亚胺基丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和碘乙酰胺丙酸。
19.如权利要求6-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(a)和(b)之间经过离子交换色谱膜。
20.如权利要求6-19中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(b)和(c)之间经过离子交换色谱膜。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)使细胞结合剂与双官能交联试剂接触以共价连接接头与所述细胞结合剂，从而制备包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的第一混合物，
(b)使所述第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，从而制备具有与其结合的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，
(c)通过使具有与其结合的接头的所述细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应，使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的所述细胞结合剂在纯化的所述第一混合物中缀合，以制备包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由所述接头与所述细胞毒性剂化学偶联的所述细胞结合剂，
(d)使所述第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及
(e)使步骤(d)之后的所述纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于所述纯化的第二混合物所述纯化的第三混合物包含减少量的所述杂质。
22.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(e)之前顺次重复步骤(d)两次、三次或四次。
23.如权利要求21或22的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(c)和(d)之间经过离子交换色谱膜。
24.如权利要求21或22所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(d)和(e)之间经过离子交换色谱膜。
25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中吸附色谱在步骤(b)和(d)中使用。
26.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中切向流过滤在步骤(b)中使用并且吸附色谱在步骤(d)中使用。
27.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中吸附色谱在步骤(b)中使用并且切向流过滤在步骤(d)中使用。
28.如权利要求21-27中任一项所述的方法，其中所述吸附色谱选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配位体色谱、亲和色谱、反相色谱及其组合。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述吸附色谱是离子交换色谱。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述离子交换色谱是陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱。
31.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中切向流过滤在步骤(b)和(d)中使用。
32.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中非吸附色谱在步骤(b)和(d)中使用。
33.如权利要求21-32中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含蔗糖。
34.如权利要求21-33中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含选自柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的缓冲剂。
35.如权利要求21-33中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
36.如权利要求21-35中任一项所述的方法，其还包括
(f)在步骤a-b、步骤b-c、步骤c-d和步骤d-e中的至少一个之间保持所述混合物，以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头。
37.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)使细胞结合剂与双官能交联试剂接触以共价连接接头与所述细胞结合剂，从而制备包含具有与其结合的接头的细胞结合剂的第一混合物，
(b)通过使具有与其结合的接头的所述细胞结合剂与细胞毒性剂反应，使细胞毒性剂与具有与其结合的接头的所述细胞结合剂在所述第一混合物中缀合，以制备包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由所述接头与所述细胞毒性剂化学偶联的所述细胞结合剂，
(c)使所述第二混合物经过聚二氟乙烯(PVDF)膜，以除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及
(d)使步骤(c)之后的所述纯化的第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以从所述杂质中进一步纯化所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于所述纯化的第二混合物所述纯化的第三混合物包含减少量的所述杂质。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第一混合物在步骤(a)和(b)之间在不经历纯化。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中在步骤(d)之前顺次重复步骤(c)两次、三次或四次。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(b)和(c)之间经过离子交换色谱膜。
41.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述混合物在步骤(c)和(d)之间经过离子交换色谱膜。
42.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中吸附色谱在步骤(d)中使用。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述吸附色谱选自羟磷灰石色谱、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、疏水作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配位体色谱、亲和色谱、反相色谱及其组合。
44.如根据权利要求43所述的方法，其中所述吸附色谱是离子交换色谱。
45.如根据权利要求44所述的方法，其中所述离子交换色谱是陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱。
46.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中切向流过滤在步骤(d)中使用。
47.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中非吸附色谱在步骤(d)中使用。
48.如权利要求37-47中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含蔗糖。
49.如权利要求37-48中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含选自柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的缓冲剂。
50.如权利要求37-48中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
51.如权利要求37-50中任一项所述的方法，其还包括
(e)在步骤a-b、步骤b-c和步骤c-d中的至少一个之间保持所述混合物，以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质选自细胞毒性剂二聚体、细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集体、游离细胞毒性剂、未缀合的接头及其混合物。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述混合物包含作为杂质的细胞毒性剂二聚体，并且从所述混合物除去所述细胞毒性剂二聚体的一些部分以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-DM1。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-MCC-DM1。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞毒性剂二聚体包含DM1-DM1和DM1-MCC-DM1。
57.如权利要求52所述的方法，其中所述混合物包含作为杂质的所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集体，并且从所述混合物除去所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的所述聚集体的一些部分以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述混合物包含作为杂质的游离细胞毒性剂，并且从所述混合物除去所述游离细胞毒性剂的一些部分以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
59.如权利要求52所述的方法，其中所述混合物包含作为杂质的未缀合接头，并且从所述混合物除去所述未缀合接头的一些部分以提供所述纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。
60.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其中经过PVDF膜的所述混合物的pH为约4至约9。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述混合物的pH是约7至约8。
62.如权利要求60所述的方法，其中所述混合物的pH是约8至约9。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述混合物的pH是约8.5。
64.如权利要求60所述的方法，其中所述混合物的pH是约4.5至约5.5。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述混合物的pH是约4.8。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质的至少50％从所述混合物中除去。
67.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质的至少75％从所述混合物中除去。
68.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质的至少90％从所述混合物中除去。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述PVDF膜选自0.22微米孔径的膜、0.45微米孔径的膜和双层0.45/0.22微米孔径的膜。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述PVDF膜经γ照射。
71.如权利要求6-70中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在pH为约7至约9的溶液中发生。
72.如权利要求6-70中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述溶液包含选自柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的缓冲剂。
73.如权利要求71所述的方法，其中步骤(a)中的所述溶液包含选自以下的缓冲剂：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
74.如权利要求6-73中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在约16℃至约24℃的温度下发生。
75.如权利要求6-73中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述接触在约0℃至约15℃的温度下发生。
76.如权利要求6-75中任一项所述的方法，其中所述双官能交联试剂是酸不稳定接头、含二硫化物接头、光不稳定接头、肽酶不稳定接头或酯酶不稳定接头。
77.如权利要求6-75中任一项所述的方法，其中所述双官能交联试剂是含二硫化物的可裂解的接头。
78.如权利要求6-75中任一项所述的方法，其中所述双官能交联试剂是不可裂解的接头。
79.如权利要求6-75中任一项所述的方法，其中所述双官能交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基酯部分、N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分、基于马来酰亚胺的部分或基于卤代乙酰的部分。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述双官能交联试剂选自N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述双官能交联试剂选自N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、β-马来酰亚胺基丙氧基-琥珀酰亚胺基酯(BMPS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺基酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)、磺基-Mal、PEG4-Mal和CX1-1。
82.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自抗体、干扰素、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF和转铁蛋白。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述细胞结合剂是抗体。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
86.如权利要求82所述的方法，其中所述细胞结合剂是选自以下的抗体：huB4、huC242、曲妥珠单抗、比伐单抗、西罗珠单抗、huDS6、利妥昔单抗、抗CD33抗体、抗CD27L抗体、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗EGFRvIII抗体、Cripto、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗EphA2抗体、整联蛋白靶向抗体、抗CD37抗体、抗叶酸受体抗体、抗Her3抗体、B-B4抗体和抗IGFIR抗体。
87.如权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自美登素、紫杉烷和CC1065。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登素。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述美登素包含巯基。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述美登素为N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
91.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述双官能交联剂是SMCC，并且所述细胞结合剂是huCD37-3抗体。
92.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述双官能交联剂是SMCC，并且所述细胞结合剂是EGFR-7R抗体。
93.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述双官能交联剂是SMCC，并且所述细胞结合剂是抗EFGRvIII抗体。
94.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述双官能交联剂是SMCC，并且所述细胞结合剂是抗CD27L抗体。
95.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述双官能交联剂是SMCC，并且所述细胞结合剂是曲妥珠单抗。
96.如权利要求6-18中任一项所述的方法，其中所述方法包括
(a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触，以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒性剂的第一混合物，然后使所述第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在pH为约4至约9的溶液中接触，以提供包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二混合物，所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含经由所述接头与所述细胞毒性剂化学偶联的所述细胞结合剂；
(b)使所述第二混合物经过PVDF膜，以从所述混合物除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；
(c)在步骤(b)之后淬灭所述纯化的第二混合物以淬灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联试剂；
(d)在步骤(c)之后使所述淬灭的混合物经过PVDF膜，以从所述混合物除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物；
(e)保持所述纯化的第三混合物以从所述细胞结合剂释放所述不稳定结合的接头；
(f)任选地在步骤(c)之后使所述纯化的第三混合物经过PVDF膜，以从所述混合物除去至少一部分的所述杂质，从而提供所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第四混合物；以及
(g)使步骤(f)之后的所述纯化的第四混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以从所述杂质进一步纯化所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物，从而制备所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中相较于所述纯化的第二混合物所述纯化的第三混合物包含减少量的所述杂质。
97.如权利要求96所述的方法，其中步骤(b)的所述第二混合物的pH为约8.5。
98.如权利要求97所述的方法，其中步骤(d)的所述淬灭的混合物的pH为约4.8。
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