MX2009000709A - Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer. - Google Patents

Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.

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Fabienne Parker
Jiawen Han
Daniel Tavares
Chonghui Zhang
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Abstract

Anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos modificados en superficie, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos derivados y conjugados de los mismos con agentes citotóxicos, los cuales se fijan específicamente a los receptores Eph de clase A y los inhiben, antagonizan los efectos de los factorews de crecimiento sobre el crecimiento y supervivencia de células tumorales y los cuales tienen actividad agonista. Dichos anticuerpos y fragmentos de ellos pueden utilizarse en el tratamiento de tumores que expresan niveles elevados de receptores Eph de clase A, tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, carcinoma ovárico, sarcoma sinovial y cáncer pancreático y dichos anticuerpos derivados pueden utilizarse en el diagnóstico y formación de imágenes de tumores que expresan niveles elevados de receptores Eph de clase A. También se proporcionan conjugados citotóxicos que contienen un agente de fijación a células y un agente citotóxico, composiciones terapéuticas que contienen el conjugado, métodos para utilizar los conjugados en la inhibición del crecimiento celular y el tratamiento de enfermedad y un estuche que contiene el conjugado citotóxico descritos, son todos modalidades de la invención. En particular, el agente de fijación a células es un anticuerpo monoclonal y fragmentos de fijación a epítopo de éste que reconoce y se fija a los receptores Eph de clase A.

Description

ANTICU ERPO ANTAGONISTA CONTRA EPHA2 PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER Campo de la invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales murinos nuevos anti-Eph o fragmentos de éstos y versiones de éstos humanizadas o modificadas en superficie. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales nuevos o fragmentos de éstos y versiones de éstos humanizadas o modificadas en superficie, que interaccionan con la familia del receptor EphA y que actúan como antagonistas. Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos anti-receptor EphA2 que inhiben las funciones celulares del receptor EphA2. Aún más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos anti-receptor EphA2 que antagonizan el crecimiento y la supervivencia de células tumorales y que carecen de actividad agonista. La presente invención está dirigida además a conjugados citotóxicos que comprenden un agente de fijación a células y un agente citotóxico, composiciones terapéuticas que comprenden el conjugado, métodos para la utilización de los conjugados en la inhibición del crecimiento celular y el tratamiento de enfermedades y un estuche que comprende el conjugado citotóxico. En particular, el agente de fijación a células es un anticuerpo monoclonal , o un fragmento de éste que se fija al epítopo y una versión de éste humanizada o modificada en superficie que reconoce y se une a la familia de receptores EphA. Antecedentes de la invención Los receptores con actividad tirosina quinasa juegan un papel diverso en el crecimiento y diferenciación celular durante las repuestas fisiológicas normales y en la transformación oncogénica y la progresión tumoral . Los receptores Eph son una familia única de receptores con actividad tirosina quinasa (RTK), la más grande en el genoma, que consiste en al menos 1 6 receptores que interaccionan con nueve ligandos efrina unidos a la membrana (Pasquale, E. B . et al. , 2005 , Nature Reviews Mol. Cell Biol. , 6. 462-475). Pueden dividirse en dos grupos, clase A y B , en base a la homolog ía de secuencia y la afinidad de unión (Pasquale, E . B . et al. , 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol. , 6: 462-475). La clase A de receptores Eph interacciona con múltiples ligandos de la familia de la efrina A, un grupo de proteínas de membrana unidas por glicosil-fosfatidilinositol (GPI ), mientras que la clase B de receptores Eph se unen a ligandos efrina B , una familia de proteínas transmembrana. La unión de los receptores Eph a sus ligandos induce la agrupación de los receptores, la activación de la actividad quinasa y la trans-fosforilación posterior de los dominios citoplasmáticos en residuos tirosina, creando sitios de acoplamiento para varias proteínas de señalización (Kullander, K. y Klein, R. , 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol. , 3: 475-486; Noren , N . K. y Pasquale, E . B . , 2004, Cell signal., 16: 655-666). El cáncer es una enfermedad caracterizada por proliferación incontrolada, que resulta de una transducción de las señales aberrante. Las formas más peligrosas de cáncer son células malignas que tienen la capacidad de diseminarse, bien por crecimiento directo en el tejido adyacente mediante invasión , o mediante implantación en sitios distantes por metástasis. Las células metastásicas han adquirido la capacidad de liberarse del tumor primario, translocarse a sitios distantes a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático y colonizar microentornos distantes y extraños. Ahora resulta claro que las moléculas Eph también tienen una función en estados patológicos tales como el cáncer. En particular, la sobreexpresion del receptor EphA2 se ha mostrado en cánceres de ovario, mama, próstata , pulmón , colon, esófago, células renales, cuello del útero y melanoma. Se ha sugerido que EphA2 es un regulador positivo del crecimiento y supervivencia celulares en las células malignas (Landen , C. N . et al. , 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1 1 79-1 1 87). También se ha descrito una función de EphA2 en la metástasis, ya que la sobreexpresion de EphA2 sola es suficiente para transformar células epiteliales de mama en el fenotipo maligno (Zelinski et al. , 2001 , Cáncer Res. , 61 : 2301 -2306), e incrementa la metástasis espontánea de sitios distantes (Landen , C. N . et al. , 2005 , Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1 1 79-1 1 87). Además, cada vez más evidencias sugieren que EphA2 está implicado en la angiogénesis tumoral (Ogawa et al. , 2000, Oncogene, 19: 6043-6052; Cheng et al. 2002, Mol. Cáncer Res. , 1 : 2-1 1 ; Cheng et al. , 2003, Neoplasia, 5 (5): 445-456; Dobrzanski et a/. , 2004, Cáncer Res. , 64: 91 0-91 9). Se ha demostrado que la fosforilación de EphA2 está asociada a su abundancia. El EphA2 fosforilado en tirosina se internaliza rápidamente y se degrada, mientras que el EphA2 no fosforilado muestra una velocidad de recambio reducida y, por lo tanto, se acumula en la superficie celular. Actualmente se cree que esta clase de modelo puede contribuir a la alta frecuencia de sobreexpresión de EphA2 en el cáncer (Landen , C. N . er al. , 2005 , Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1 1 79-1 1 87). Sin embargo, la realidad puede ser más compleja, ya que datos recientes parecen indicar que existe un papel para las funciones dependientes e independientes de la quinasa de EphA2 en la progresión tumoral (Fang W. B . , 2005, Oncogene, 24: 7859-7868). Se han desarrollado anticuerpos agonistas que promueven la fosforilación en tirosina y la internalización de EphA2, resultando finalmente en la inhibición del crecimiento de las células tumorales (Dodge-Zantek ef al. , 1 999, Cell Growth & Differ. , 10: 629-638; WO 01 /1 21 72, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/1 01 764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642). Estos anticuerpos están dirigidos frente al dominio extracelular de EphA2. Debido a que estos anticuerpos agonistas no inhiben sino que estimulan la fosforilación del receptor EphA2 y las señales posteriores, estos anticuerpos pueden no ser eficaces en tumores que se aprovechan de la actividad quinasa de EphA2. Por otra parte , se ha propuesto la utilización de agentes antagonistas, incluyendo anticuerpos (WO 2004/092343), pero no se ha descrito ningún anticuerpo antagonista en ese trabajo. Más aún , se propuso que dichos anticuerpos estimulan , en lugar de inhibir, la proliferación celular. La solicitud WO 2006/084226 describe anticuerpos que ni incrementan ni disminuyen la actividad quinasa de EphA2 pero que son capaces de impedir la proliferación de las células tumorales. Sin embargo, no existe ninguna indicación en ese trabajo de que estos anticuerpos impidan la unión de efrinaAl al receptor e inhiban la fosforilación de EphA2 inducida por efrinaAl . En lugar de esto, pueden influir en la proliferación de las células tumorales a través de un mecanismo totalmente diferente, por ejemplo, impidiendo la agrupación de los receptores posterior a la unión de efrinaAl . El experto en la técnica podría, por lo tanto, no haber concluido que estos anticuerpos son antagonistas, sino que su mecanismo de acción no está claro. Por lo tanto, existe una necesidad de anticuerpos nuevos antagonistas anti-EphA2 , que se unan a los dominios extracelulares del receptor EphA2, inhibiendo su activación por el ligando efrina A1 e inhibiendo el crecimiento de las células tumorales dependiente de la quinasa de EphA2. Dichos anticuerpos antagonistas deberían ser útiles para el tratamiento del cáncer. Breve descripción de la invención De acuerdo con esto, es un objeto de la invención proporcionar agentes que se unan específicamente a la clase A de los miembros de la familia de receptores Eph, tales como EphA2 y que inhiban la actividad celular del receptor antagonizando el receptor. Así, la presente invención incluye anticuerpos o fragmentos de éstos que reconocen el receptor EphA2, preferiblemente humano y que funcionan como antagonistas de dicho receptor. El receptor EphA2 tiene una función en el desarrollo y crecimiento de tumores y también se ha implicado en la metástasis. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. En algunas otras modalidades, los anticuerpos de la invención son capaces de impedir la migración de células cancerosas metastásicas. En las modalidades preferidas, la célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon , cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical , cáncer de próstata , cáncer de pulmón , carcinoma sinovial y cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado y otros carcinomas. En otra modalidad , los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la angiogénesis. Mientras los anticuerpos anti-EphA2 descritos en la técnica anterior eran principalmente agonistas (por ejemplo, WO 03/094859, WO 2004/014292 , WO 2004/101 764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642), esta invención comprende anticuerpos que reconocen dicho receptor y que tienen una actividad agonista m ínima, o, preferiblemente, que carecen de cualquier actividad agonista frente al receptor. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención no estimulan la fosforilación en tirosina de EphA2. Los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la unión de un ligando, preferiblemente efrina A1, al receptor EphA2. En algunas modalidades, son capaces de inhibir la fosforilación en tirosina de EphA2. En otra modalidad, la fosforilación en tirosina de EphA2 se inhibe mediante los anticuerpos de la invención incluso en presencia de efrinaAI. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden bloquear la señalización mediada por EphA2; en particular, son capaces de inhibir la fosforilación de Akt dependiente de EphA2. Esta invención también proporciona anticuerpos que se unen al receptor EphA2 con una KD de 0.3 x 10"9 M o menor. Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales. Los fragmentos que se fijan al epítopo tales como los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, o Fv están incluidos en el alcance de esta invención. Se prefieren los anticuerpos anti-EphA2 monoclonales. En una modalidad más preferida, se proporcionan anticuerpos murinos seleccionados de 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, que están totalmente caracterizados en la presente memoria con respecto a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, secuencias de ADNc de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, identificación de sus CDR (regiones determinantes de la complementariedad), identificación de sus aminoácidos de superficie y medios para su expresión en forma recombinante. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales murinos anti-EphA2 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 y EphA2-N 1 y EphA2-N2 se han depositado bajo el Tratado de Budapest el 1 6 de junio, 2006 y el 3 de mayo, 2007, respectivamente, en la American Type Culture Collection , 1 0801 University Boulevard , Manassas, Virginia 20 1 0-2209 , EEUU , con los números de registro PTA-7660 , PTA-7661 , PTA-7662 , PTA-8407 y PTA-8408, respectivamente. La presente invención incluye el anticuerpo monoclonal murino anti-EphA2 seleccionado de 37.3D7, 37.1 F5 , 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 y versiones modificadas en superficie o humanizadas de los anticuerpos 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 en los que los residuos expuestos en la superficie de los marcos de la región variables de los anticuerpos, o sus fragmentos de unión al epítopo, se han reemplazado tanto en las cadenas ligeras como pesadas, para hacerlos más semejantes a superficies conocidas de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de éstos de unión al epítopo de la presente invención presentan propiedades mejoradas ya que son menos inmunógenos (o totalmente no inmunógenos) que las versiones murinas en sujetos humanos a los que se administran. Así, las diferentes versiones de los anticuerpos humanizados 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 ; y EphA2-N2 y los fragmentos de éstos de unión al epítopo de la presente invención reconocen específicamente el receptor EphA2 y no son inmunógenos para un ser humano. Las versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 de la presente invención están completamente caracterizadas en la presente memoria respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, secuencias de ADN de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, identificación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), identificación de sus residuos de aminoácidos de superficie del marco de la región variable y descripción de un medio para su expresión en forma recombinante. Esta invención también contempla la utilización de conjugados entre conjugados citotóxicos que comprenden ( 1 ) un agente de fijación a células que reconoce y se une al receptor EphA, tal como el receptor EphA2 y (2) un agente citotóxico. En los conjugados citotóxicos, el agente de fijación a células tiene una alta afinidad por el receptor EphA (por ejemplo, el receptor EphA2) y el agente citotóxico tiene un alto grado de citotoxicidad para las células que expresan el receptor EphA, de manera que los conjugados citotóxicos de la presente invención forman agentes eliminadores eficaces. En una modalidad preferida, el agente de fijación a células es un anticuerpo anti-EphA2 (por ejemplo, 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 , o EphA2-N2) o un fragmento de éste que se fija al epítopo, más preferiblemente un anticuerpo anti-EphA2 humanizado (por ejemplo, 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 , o EphA2-N2) o un fragmento de éste que se fija al epítopo, en el que un agente citotóxico se une covalentemente, directamente o a través de un conector escindible o no escindible, al anticuerpo o al fragmento de éste que se fija al epítopo. En las modalidades más preferidas, el agente de fijación a células es los anticuerpos humanizados 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 ; y EphA2-N2 o un fragmento de éstos que se fija al epítopo y el agente citotóxico es un taxol , maitansinoide, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, CC-1065 o un análogo de CC-1065. En las modalidades preferidas de la invención , el agente de fijación a células es el anticuerpo anti-EphA2 humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 , o EphA2-N2 y el agente citotóxico es un compuesto maitansina, tal como DM 1 o DM4. La presente invención también comprende la utilización de fragmentos de anticuerpos anti-EphA2 que retienen la capacidad de unirse al receptor EphA2. En otro aspecto de la invención , se contempla la utilización de equivalentes funcionales de los anticuerpos anti-EphA2. La presente invención también incluye un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el receptor EphA2. En las modalidades preferidas, el método para inhibir el crecimiento de la célula que expresa el receptor EphA2 se produce in vivo y resulta en la muerte de la célula, aunque también se incluyen las aplicaciones in vitro y ex vivo.
La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-EphA2 o un conjugado anticuerpo anti-EphA2-agente citotóxico y un veh ículo o excipientes aceptables farmacéuticamente. En algunas modalidades, la composición terapéutica comprende un segundo agente terapéutico. Este segundo agente terapéutico puede elegirse del grupo que comprende los antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos ( HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDG F), o receptor HER2. La presente invención incluye además un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer utilizando la composición terapéutica. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer metastásico. En particular, la célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical , cáncer de próstata, cáncer de pulmón , carcinoma sinovial y cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de h ígado y otros carcinomas. En las modalidades preferidas, el conjugado citotóxico comprende un anticuerpo anti-EphA2 y un agente citotóxico. En las modalidades más preferidas, el conjugado citotóxico comprende un conjugado anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2-DM 1 , anticuerpo humanizado 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2-DM4, un conjugado anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2-taxano, o un conjugado anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2-derivado de tomaimicina y el conjugado se administra junto con un vehículo o excipientes aceptables farmacéuticamente. En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-EphA2 se utilizan para detectar la proteína EphA2 en una muestra biológica. En una modalidad preferida, dichos anticuerpos se utilizan para determinar los niveles de EphA2 en un tejido tumoral . La presente invención también incluye un estuche que comprende un anticuerpo anti-EphA2 o un conjugado anticuerpo anti-EphA2-agente citotóxico e instrucciones para su utilización. En las modalidades preferidas, los anticuerpos anti-EphA2 son los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2, el agente citotóxico es un compuesto maitansina, tal como DM 1 o DM4, un taxano, un derivado de leptomicina, o un derivado de tomaimicina y las instrucciones son para utilizar los conjugados en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer. El estuche también puede incluir componentes necesarios para la preparación de una formulación aceptable farmacéuticamente, tal como un diluyente si el conjugado está en estado liofilizado o en forma concentrada y para la administración de la formulación. A no ser que se indique otra cosa, todas las referencias y patentes citadas en la presente memoria se incorporan mediante referencia.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra el análisis de la fijación específica de anticuerpos anti-EphA2 a células que sobreexpresan EphA2 humano (células 300-1 9/hu-EphA2) mediante análisis FACS. La Figura 1 A muestra los datos para el anticuerpo 37.3D7, la Figura 1 B para el anticuerpo 37.1 F5 y la Figura 1 C para el anticuerpo 53.2H 1 1 , respectivamente. La Figura 2 muestra la fijación específica del anticuerpo purificado 37.3D7 a células de cáncer pancreático humano BxPC3, células de cáncer de mama humano M DA-MB-231 y células de cáncer de colon humano HT-29. Se muestran los histogramas del análisis FACS . La Figura 3 muestra las curvas de fijación para los anticuerpos 37.3D7 (Figura 3A), 37.1 F5 (Figura 3B) y 53.2H 1 1 (Figura 3C) establecidas con células murinas 300-1 9 que sobreexpresan EphA2 humano (300-1 9/hu-EphA2). La Figura 4 muestra la fijación específica de los anticuerpos purificados 37.3D7 y 53.2H 1 1 a células que sobreexpresan EphA2. Se muestran los histogramas del análisis FACS . La Figura 4A muestra los datos para células que sobreexpresan EphA2 murino (300-1 9/mu-EphA2) y la Figura 4B muestra los datos para células que sobreexpresan EphA2 de rata (300-1 9/rata-EphA2). La Figura 5A muestra la fijación específica de los anticuerpos purificados 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 a células epiteliales de riñon de mono VERO. Se muestran los histogramas del análisis FACS.
La Figura 5B muestra las curvas de fijación para los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 establecidas con células epiteliales de riñon de mono VERO. La Figura 6 muestra la inhibición de la unión de efrinaAl biotinilada a células de cáncer de mama humano M DA-M B-231 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 . La Figura 7A muestra la inhibición de la fosforilación de EphA2 estimulada por efrinaAl en células de mama M DA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7 y 37.1 F5. La Figura 7B muestra la inhibición de la fosforilación de EphA2 estimulada por efrinaAl en células de mama M DA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H 1 1 . La Figura 7C muestra la inhibición de la fosforilación de Akt estimulada por efrinaAl en células pancreáticas CFPAC-1 por los anticuerpos 37.3D7 y 37.1 F5. Las Figura 8A y B muestran la estimulación de la fosforilación de EphA2 por efrinaAl y la ausencia de estimulación de la fosforilación de EphA2 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 en células de mama M DA-MB-231 . Las Figura 9A-9D muestran la inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados por suero de células de colon HT-29 (9A), células de colon LoVo (9B), células pancreáticas CFPAC-1 (9C) y células de melanoma UACC-257 (9D) por los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H 1 1 . La Figura 1 0A muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por suero de células pancreáticas BxPC3 por el anticuerpo 37.3D7. La Figura 1 0B muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por suero de células de colon LoVo por el anticuerpo 53.2H 1 1 . La Figura 1 0C muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por EG F de células de colon LoVo por el anticuerpo 53.2H 1 1 . La Figura 1 1 A muestra la curva de fijación del anticuerpo 37.3D7 a células H UVEC. La Figura 1 1 B muestra la curva de fijación del anticuerpo 37.1 F5 a células H UVEC. La Figura 12 muestra la inhibición del crecimiento y supervivencia de células H UVEC estimulados por VEGF por el anticuerpo 37.3D7. La Figura 1 3 muestra la inhibición de la fosforilación de Akt inducida por VEGF por el anticuerpo 37.3D7 en células HUVEC. La Figura 1 4 muestra el efecto del tratamiento con el anticuerpo 37.3D7 en el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de colon HT-29 en ratones. El efecto se compara con el de un anticuerpo anti-EG FR y un anticuerpo lgG 1 control sin unión . La Figura 1 5A muestra la inhibición del crecimiento de células de tumor de próstata PC3 por hu37.3D7-SPDB-DM4. La Figura 1 5B muestra la inhibición del crecimiento de células de tumor de próstata PC3 por hu53.2H 1 1 -SPDB-DM4.
La Figura 1 6A muestra el efecto del tratamiento con hu37.3D7-SPDB-DM4 en el crecimiento de xenoinjerto de tumor de mama MDA-M B-231 en ratones. La Figura 16B muestra el efecto del tratamiento con hu53.2H 1 1 -SPDB-DM4 en el crecimiento de xenoinjerto de tumor de mama MDA-MB-23 en ratones. Descri pción detallada de la invención En la presente memoria se proporcionan nuevos agentes capaces de unirse específicamente a los receptores EphA y antagonizar dichos receptores. En particular, los presentes inventores han descubierto nuevos anticuerpos que se unen específicamente a los receptores EphA en la superficie celular. Mientras que los anticuerpos conocidos previamente que se fijan específicamente al receptor EphA también lo activan incluso en ausencia de sus ligandos, los anticuerpos o fragmentos de la presente invención preferiblemente carecen de cualquier actividad agonista. Por otra parte, presentan la capacidad única de inhibir las funciones celulares del receptor incluso en presencia de sus ligandos, una característica de la que carecen totalmente los anticuerpos que se unen a EphA2 conocidos previamente. Además, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antagonistas de la presente invención inhiben el crecimiento y/o la migración de células tumorales humanas, y/o la angiogénesis, tres propiedades que no se podían prever en vista de la técnica anterior (Landen , C. N . et al. , 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1 1 79-1 1 87; WO 01 /1 21 72; Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "receptor Eph" se refiere a una tirosina quinasa que pertenece a la familia de receptores Eph (revisado en Pasquale, E. B . et al. , 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol. , 6, 462-475). La "clase A de la familia de receptores Eph" o "receptores EphA" tal y como se utiliza en la presente memoria interaccionan preferiblemente con ligandos unidos por glicosilfosfatidilinositol (GPI ) (de la subclase A de efrina, que comprende actualmente cinco ligandos). Los receptores EphA específicos incluyen : EphA1 (también denominado Eph y Esk); EphA2 (también denominado Eck, mEck, Myk2, Sek2); EphA3 (también denominado Hek, Mek4, Tyro4 y Cek4); EphA4 (también conocido como Hek8, Sek1 , Tyrol y Cek8); EphA5 (también denominado Hek7, Bsk, Ehk1 , Rek7 y Cek7); EphA6 (también denominado mEhk2 y Ehk2); EphA7 (también denominado Hek1 1 , Mdk1 , Ebk, Ehk3); y EphA8 (también denominado Eek y mEek) y variantes naturales de éstos. El receptor Eph preferido en la presente memoria es el "receptor EphA2", que comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como en los números de registro de Genbank NM_004431 (EphA2 humano), NM_01 01 39 (EphA2 murino), o NXM_345596 (EphA2 de rata). El término "ligando Eph" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a una proteína que se une a y opcionalmente activa (por ejemplo, estimula la autofosforilación de), un receptor Eph . Un ligando Eph preferido es "efrinaAl ", que se une al receptor EphA2 y comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como en el registro de Genbank N M_004428 (efrina humana A1 ). El término "antagonista" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula que es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de una molécula diana, tal como un receptor EphA. Los antagonistas pueden actuar interfiriendo en la unión de un receptor a un ligando y viceversa, disminuyendo la fosforilación de EphA2, y/o incapacitando o matando a las células que han sido activadas por un ligando. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones receptor-ligando o puede reducir sustancialmente dichas interacciones. Todos estos puntos de intervención de un antagonista deben considerarse para los propósitos de esta invención . Así, en el alcance de la invención están incluidos antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen al receptor EphA, al ligando Eph o a un complejo de un receptor Eph y un ligando Eph; variantes o derivados de la secuencia de aminoácidos de un receptor EphA o ligando EphA que antagonizan la interacción entre un receptor EphA y un ligando EphA; receptor EphA soluble o ligando EphA soluble, opcionalmente fusionado con una molécula heteróloga tal como una región de inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoadhesina); un complejo que comprende un receptor EphA en asociación con un ligando EphA; secuencias peptídicas sintéticas o nativas que se unen al receptor EphA o al ligando EphA. El término "agonista" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier compuesto, incluyendo una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, conjugado, molécula grande, molécula pequeña, capaz de activar una o más de las actividades biológicas de la molécula diana. Los agonistas de EphA actúan estimulando la fosforilación de la proteína, desencadenando de esta manera la degradación de dicha proteína. Así, en una modalidad preferida la presente invención proporciona, entre otras características, anticuerpos monoclonales anti-EphA, anticuerpos humanizados anti-EphA y fragmentos de los anticuerpos anti-EphA. Cada uno de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención , se diseña para reconocer y uni rse específicamente al receptor EphA2 y actúa como un antagonista del receptor EphA2. Más aún , los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antagonistas de la invención tienen las propiedades únicas de ser capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales humanas, y/o la migración de células cancerosas metastásicas, y/o la angiogénesis. Un receptor EphA preferido unido por los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antagonistas de la invención es el receptor EphA2. Un receptor EphA2 preferido es EphA2 humano. El receptor EphA2 pertenece a una familia de receptores en los que, después de la unión del ligando, se incrementa la fosforilación de su cola citoplásmica para interaccionar con varias proteínas adaptadores y señalizadoras, lo que da lugar a la activación de diferentes rutas de señalización celular posteriores (Kullander, K. y Klein, R. , 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol. , 3: 475-486; Noren, N . K. y Pasquale, E. B. , 2004, Cell signal., 16: 655-666). Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "señalización mediada por EphA2" se refiere a todos los eventos celulares que se producen en respuesta a la unión del ligando a EphA2. Mientras que los anticuerpos descritos en la técnica anterior actúan como agonistas del receptor EphA2 , y, en particular, incrementan la fosforilación en tirosina de la proteína EphA2, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención carecen preferiblemente de cualquiera de dichas propiedades agonistas. En particular, son incapaces de estimular la fosforilación de EphA2 por sí mismos. Por otra parte, esta invención proporciona los primeros anticuerpos anti-EphA2 antagonistas reales. En una modalidad , los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención pueden inhibir la unión de un ligando a un receptor EphA. En una modalidad preferida, se impide la unión de efrinaAl a EphA2 mediante los anticuerpos y fragmentos de éstos proporcionados por esta invención . De manera extraordinaria, en otra modalidad , los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la fosforilación en tirosina del receptor EphA2, incluso en presencia de efrinaAl . Más aún, dichos anticuerpos y fragmentos de éstos son capaces de inhibir la señalización mediada por EphA2. En particular, puede evitarse la fosforilación de Akt dependiente de efrinaAl por los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención .
Anticuerpos El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo tal como IgG , IgM , IgA, IgD, e IgE , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos y fragmentos de anticuerpos. Un anticuerpo reactivo con un antígeno específico puede generarse mediante métodos recombinantes tales como selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fagos o similares, o mediante inmunización de un animal con el antígeno o un ácido nucleico que codifica el antígeno. Un anticuerpo típico está comprendido por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son las principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Se refieren habitualmente como CDR1 , CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N terminal . Las partes más altamente conservadas de las regiones variables se denominan "regiones marco". Tal y como se utiliza en la presente memoria, "VH" o "VH" se refiere a la región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' , o F(ab' )2. La referencia a "VL" o "VL" se refiere a la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena ligera de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' , o F(ab' )2. Un "anticuerpo policlonal" es un anticuerpo que se ha producido entre o en presencia de uno o más, anticuerpos no idénticos diferentes. En general , los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en presencia de otros muchos linfocitos B que producen anticuerpos no idénticos. Habitualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un animal inmunizado. Un "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente memoria, es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos excepto por mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades muy pequeñas. Estos anticuerpos están dirigidos frente a un único epítopo y son, por lo tanto, altamente específicos. Un "epítopo" es el sitio en el antígeno al que se une un anticuerpo. Puede estar formado por residuos contiguos o por residuos no contiguos que se aproximan mucho por el plegamiento de una proteína antigénica. Los epítopos formados por aminoácidos contiguos se retienen típicamente en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por aminoácidos no contiguos se pierden típicamente bajo dicha exposición . Tal y como se utiliza en la presente memoria , el término "KD" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo/antígeno particular. La presente invención se realiza a partir de anticuerpos murinos anti-EphA2, en la presente memoria 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H1 1 ; EphA2-N 1 ; y EphA2-N2, que están completamente caracterizados con respecto a las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, identificación de las CDR, identificación de los aminoácidos de superficie y medios para su expresión en forma recombinante. Las secuencias primarias de aminoácidos y ADN de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 ; y EphA2-N2 y de las versiones humanizadas, se describen en la presente memoria. Los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 están producidos por hibridomas denominados respectivamente 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 y depositados bajo el Tratado de Budapest el 1 6 de junio, 2006 y el 3 de mayo, 2007, respectivamente, en la American Type Culture Collection, 1 0801 University Boulevard , Manassas, Virginia 201 10-2209, EEUU , con los números de registro PTA-7660, PTA-7661 PTA-7662, PTA-8407 y PTA-8408, respectivamente. El alcance de la presente invención no está limitado a anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. En lugar de esto, todos los anticuerpos y fragmentos que se fijan específicamente al receptor EphA2 y que antagonizan la actividad biológica del receptor, pero que carecen de actividad agonista, se encuentran en el alcance de la presente invención. Así, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden diferir de los anticuerpos 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 ; y EphA2-N2 o de los derivados humanizados en las secuencias de aminoácidos de su esqueleto, CDR, cadena ligera y cadena pesada, e incluso así se encuentran en el alcance de la presente invención. En una modalidad , esta invención proporciona anticuerpos o fragmentos de éstos que se fijan al epítopo que comprenden una o más CDR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 1 1 , 1 2, 1 3, 14, 1 5, 16, 1 7, 1 8, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuencíales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 1 , 2, 3, 7, 8, 9, 1 3, 14, 1 5, 61 , 62, 63, 67, 68 y 69 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuencíales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 4, 5, 6, 1 0, 1 1 , 1 2, 16, 1 7 , 1 8, 64, 65, 66, 70, 71 y 72.
En una modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención comprenden tres CDR que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ I D NOS: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6. En una modalidad aún más preferida , se proporciona un anticuerpo 37.3D7, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS: 1 , 2 y 3 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS: 4, 5 y 6. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención comprenden tres CDR que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ I D NOS: 7, 8, 9, 1 0, 1 1 y 1 2. En una modalidad aún más preferida, se proporciona un anticuerpo 37.1 F5, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS : 10, 1 1 y 12. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención comprenden tres CDR que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ I D NOS: 1 3, 14, 1 5, 1 6, 1 7 y 1 8. En una modalidad aún más preferida, se proporciona un anticuerpo 53.2H 1 1 , que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 13, 14 y 15 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 16, 17 y 18. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención comprenden tres CDR que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 61, 62, 63, 64, 65 y 66. En una modalidad aún más preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N1, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 61, 62 y 63 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 64, 65 y 66. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención comprenden tres CDR que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 67, 68, 69, 70, 71 y 72. En una modalidad aún más preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N2, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 67, 68 y 69 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 70, 71 y 72.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden una VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 74 y 76. En una modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 37.3D7 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 20. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 37.1 F5 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 22. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 53.2H11 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 24. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N1 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 74. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N2 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 76. En otra modalidad preferida, los anticuerpos de la invención comprenden una VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 78 y 80. En una modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 37.3D7 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 26. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 37.1 F5 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 28. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo 53.2H 1 1 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ I D NO 30. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N 1 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ I D NO 78. En otra modalidad preferida , se proporciona un anticuerpo EphA2-N2 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ I D NO 80. Anticuerpos Humanizados o Modificados en Superficie 37.3D7. 37.1 F5: 53.2H 1 1 : EphA2-N 1 ; y EphA2-N2 Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene una secuencia mínima obtenida de inumunoglobulina no humana. Un "anticuerpo quimérico", tal y como se utiliza en la presente memoria , es un anticuerpo en el que la región constante, o una parte de ésta, está alterada, reemplazada, o intercambiada, de manera que la región variable está unida a la región constante de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. "Anticuerpo quimérico", también se refiere a un anticuerpo en el que la región variable, o una parte de ésta , está alterada, reemplazada, o intercambiada, de manera que la región constante está unida a la región variable de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. El objetivo de la humanización es una reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenógeno, tal como un anticuerpo murino, para su introducción en un ser humano, a la vez que se mantienen intactas la afinidad y especificidad de fijación del anticuerpo frente al antígeno. Los anticuerpos humanizados, o anticuerpos adaptados para evitar el rechazo de otros mamíferos, pueden producirse utilizando varias tecnologías tales como modificación en superficie e injerto de CDR. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la tecnología de modificación en superficie utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estad ístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variables del anticuerpo para que se asemejen a las superficies de anticuerpos conocidos del anfitrión diana. Las estrategias y métodos para la modificación en superficie de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos en un anfitrión diferente están descritos en la Patente de EEU U 5.639.641 , que se incorpora en la presente memoria en su totalidad mediante referencia. Brevemente, en un método preferido, ( 1 ) se generan alineamientos de posiciones de un conjunto de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos para dar lugar a un conjunto de posiciones expuestas en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera en el que las posiciones de alineamiento para todas las regiones variables son al menos aproximadamente idénticas en un 98%; (2) se define un conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera para un anticuerpo de roedor (o fragmento de éste); (3) se identifica un conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera que es el más idéntico al conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de roedores; (4) el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera definido en la etapa (2) se sustituye con el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera definido en la etapa (3), excepto los residuos de aminoácidos que están en el intervalo de 5 Á de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo de roedores; y (5) se produce el anticuerpo de roedores humanizado que tiene especificidad de fijación. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando varias técnicas diferentes incluyendo injerto de CDR (EP 0 239 400; WO 91 /09967; Patentes de EEUU Nos. 5.530.101 ; y 5.585.089), recubrimiento o modificación en superficie (EP 0 592 1 06; EP 0 51 9 596; Padlan E. A. , 1 991 , Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M . et al. , 1 994, Proteln Engineering 7(6): 805-814; Roguska M .A. er al. , 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 91 :969-973), e intercambio de cadenas (Patente de EEUU No. 5.565.332). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse mediante varios métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de exposición en fagos. Véanse también las Patentes de EEUU Nos. 4.444.887, 4.71 6.1 1 1 , 5.545.806 y 5.81 4.31 8; y las publicaciones de solicitud de patente internacional números WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/1 6654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91 /1 0741 (dichas referencias se incorporan mediante referencia en su totalidad). La presente invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos, que reconocen el receptor EphA2 y actúan como antagonistas. En otra modalidad , los anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que se fijan al epítopo tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que expresa el receptor EphA2. En una modalidad más, el anticuerpo humanizado o fragmento de éste que se fija al epítopo tiene la capacidad adicional de inhibir la migración de una célula cancerosa metastásica que expresa el receptor EphA2. Una modalidad preferida de dicho anticuerpo humanizado es un anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 o EphA2-N2, o un fragmento de éste que se fija al epítopo. En modalidades más preferidas, se proporcionan versiones modificadas en superficie o humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 y EphA2-N2 en las que los residuos expuestos en la superficie del anticuerpo o sus fragmentos se reemplazan tanto en las cadenas ligeras como pesadas para que se asemejen más a superficies de anticuerpos humanos conocidas. Los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 y EphA2-N2 o los fragmentos de éstos que se fijan al epítopo de la presente invención tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5; y 53.2H 1 1 o los fragmentos de éstos que se fijan al epítopo reconocen específicamente el receptor EphA2. Más preferiblemente, los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 o los fragmentos de éstos que se fijan al epítopo tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula que expresa el receptor EphA2. Las versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 también están completamente caracterizadas en la presente memoria respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, secuencias de ADN de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, identificación de las CDR, identificación de sus aminoácidos de superficie y descripción de un medio para su expresión en forma recombinante. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado a los anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. En lugar de esto, todos los anticuerpos y fragmentos que se fijan específicamente al receptor EphA2 están incluidos en la presente invención . Preferiblemente, los anticuerpos y fragmentos que se fijan específicamente al receptor EphA2 antagonizan la actividad biológica del receptor. Más preferiblemente, dichos anticuerpos carecen además de actividad agonista. Así , los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo que se fijan al epítopo de la presente invención pueden diferir del anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2 o de los derivados humanizados de éstos, en las secuencias de aminoácidos de su esqueleto, CDR, y/o cadena ligera y cadena pesada, e incluso así se encuentran dentro del alcance la presente invención. Las CDR de los anticuerpos 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2 se identifican mediante modelado y se han predicho sus estructuras moleculares. De nuevo, aunque las CDR son importantes para el reconocimiento del epítopo, no son esenciales para los anticuerpos y fragmentos de la invención. De acuerdo con esto, se proporcionan anticuerpos y fragmentos que tienen propiedades mejoradas, producidos, por ejemplo, mediante maduración de la afinidad de un anticuerpo de la presente invención .
Se han identificado los genes de la l ínea germinal de la cadena ligera lgN ? y J K de ratón y los genes germinales de la cadena pesada IgVh y Jh de los que es probable que derivaran 37.3D7 , 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2, como se describe en la sección experimental de los Ejemplos. Dichas secuencias de los genes de la l ínea germinal son útiles para identificar mutaciones somáticas en los anticuerpos, incluyendo en las CDR. Las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 y las secuencias de sus CDR no se conocían previamente y se muestran en esta solicitud . Dicha información puede utilizarse para producir versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2. Estos anticuerpos anti-EphA humanizados o sus derivados también pueden utilizarse como el agente de fijación a células de la presente invención .
Por lo tanto, en una modalidad , esta invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmento de éste que se fija al epítopo que comprende una o más CDR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 1 2, 1 3, 14, 1 5, 1 6, 1 7, 1 8, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72. En una modalidad preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 1 , 2 , 3, 7, 8, 9, 1 3, 14, 1 5, 61 , 62, 63, 67, 68 y 69 y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 4, 5, 6, 1 0, 1 1 , 1 2, 1 6, 1 7, 18 , 64, 65, 66, 70, 71 y 72. En una modalidad adicional preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 1 , 2 y 3 y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 4, 5 y 6. En otra modalidad adicional preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 7, 8 y 9 y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 10, 1 1 y 1 2. En otra modalidad adicional preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 1 3, 14 y 1 5 y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ I D NOS: 1 6, 1 7 y 1 8. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS: 61 , 62 y 63 y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS: 64, 65 y 66. En otra modalidad más preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS : 67, 68 y 69 y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ I D NOS: 70, 71 y 72. En una modalidad , esta invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que comprenden una VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS : 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43 y 45. En una modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1 D7 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 32, 34 y 36. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1 F5 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS : 37 y 38. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 53.2H 1 1 que comprende una VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 40, 42, 43 y 45. En otra modalidad, esta invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que comprenden una VL que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS: 47, 48, 49, 50 y 52. En una modalidad preferida , se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1 D7 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ I D NO 47. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1 F5 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ I D NOS : 48 , 49 y 50. En otra modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 53.2H 1 1 que comprende una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ I D NO 52.
Los anticuerpos humanizados 37.3D7 y los fragmentos de éstos que se fijan al epítopo de la presente invención también pueden incluir sustitución de los residuos de aminoácidos de la cadena ligera y/o pesada en una o más posiciones definidas por los residuos grises en la Tabla 1A y 1B que representan los residuos de superficie del marco murino que se han cambiado del residuo murino original al residuo correspondiente de superficie del marco en el anticuerpo humano, 28E4. Los residuos con asterisco (*) en la Tabla 1B corresponden a las retromutaciones murinas en las variantes humanizadas de la cadena pesada 37.3D7 (SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO:36). Los residuos de las retromutaciones están próximos a CDR y se eligieron como se describe en la patente de EEUU No. 5.639.641 o de manera análoga a la selección de residuos que han resultado, en intentos previos de humanización, en una disminución de la afinidad de unión al antígeno (Roguska et al., 1996, Protein Engf.;9(10): 895-904; publicaciones de solicitud de patente de EEUU 2003/0235582 y 2005/0118183). De forma similar, los anticuerpos humanizados 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2 y fragmentos de éstos que se fijan al epítopo de la presente invención también pueden incluir sustitución de residuos de aminoácidos de la cadena ligera y/o pesada. Polinucleótidos. vectores v células anfitrionas Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-EphA2 de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. En una modalidad preferida , un único ácido nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2 y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. En otro aspecto de esta invención , se proporcionan polinucleotidos que codifican polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ I D NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 12, 1 3, 14, 1 5, 1 6, 1 7, 1 8, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72 , 74, 76, 78 y 80. En una modalidad preferida, el polinucleótido de la invención se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 19, 21 , 23, 25, 27 , 29, 31 , 33, 35, 39, 41 , 44, 46, 51 , 73, 75, 77 y 79. La invención no está limitada a dichos polinucleotidos per se sino que también incluye todos los polinucleotidos que presentan al menos un 80 % de identidad con dichos polinucleotidos. La invención proporciona vectores que comprenden los polinucleotidos de la invención . En una modalidad , el vector contiene un polinucleótido que codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2. En otra modalidad , dicho polinucleótido codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de polinucleótido que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de éstos.
Con el fin de expresar la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos anti-EphA2 de la invención, los polinucleótidos que codifican dichas cadenas pesadas y/o ligeras se insertan en vectores de expresión de manera que los genes están unidos de manera operativa a secuencias de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de EBV y todos los demás vectores que el experto en la técnica sabrá que son convenientes para asegurar la expresión de dichas cadenas pesadas y/o ligeras. El experto en la técnica se dará cuenta de que los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden clonarse en diferentes vectores o en el mismo vector. En una modalidad preferida, dichos polinucleótidos se clonan en el mismo vector. Los polinucleótidos de la invención y los vectores que comprenden estas moléculas pueden utilizarse para la transformación de una célula anfitriona de mam ífero adecuada, o cualquier otro tipo de célula anfitriona conocida por el experto en la técnica. La transformación puede realizarse mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona. Dichos métodos son muy conocidos para el experto en la técnica e incluyen transformación mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación , encapsulación del polinucleótido en liposomas, inyección biolística y microinyección directa de ADN en núcleos.
Fragmentos de Anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos de longitud completa discutidos anteriormente, así como fragmentos que se fijan al epítopo. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "fragmentos de anticuerpo" incluyen cualquier parte de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo de longitud completa, denominados de manera general "fragmentos que se fijan al epítopo". Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fv unidos por disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden una región VL o VH. Los fragmentos que se fijan al epítopo, incluyendo los anticuerpos de cadena única, pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios CH1 , CH2 y CH3. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpos contienen las seis CDR del anticuerpo completo, aunque también son funcionales los fragmentos que contienen menos de todas estas regiones tal como tres, cuatro o cinco CDR. Además, los fragmentos pueden ser o pueden combinar miembros de una cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG , IgM , IgA, IgD, o IgE y las subclases de éstas. Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse mediante degradación proteol ítica, utilizando enzimas tales como papaína (fragmentos Fab) o pepsina (fragmentos F(ab')2). Los fragmentos "FV de cadena única" ("scFv") son fragmentos que se fijan al epítopo que contienen al menos un fragmento de una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) unida a al menos un fragmento de una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo (VL). El conector puede ser un péptido corto, flexible seleccionado para asegurar que se produce el plegamiento tridimensional apropiado de las regiones (VL) y (VH) una vez que se han unido con el fin de mantener la especificidad de fijación a la molécula diana del anticuerpo completo del que se obtiene el fragmento del anticuerpo de cadena única. El extremo carboxilo terminal de la secuencia (VL) o (VH) puede unirse covalentemente mediante un conector al extremo del aminoácido de una secuencia complementaria (VL) o (VH). Los fragmentos de anticuerpos de cadena única de la presente invención contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones variables o determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos completos descritos en esta especificación , pero que carecen de algunos o de todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpos de cadena única pueden , por lo tanto, solucionar algunos de los problemas asociados con la utilización de anticuerpos que contienen una parte de o todo un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos de cadena única normalmente no presentan interacciones no deseadas entre moléculas biológicas y la región constante de la cadena pesada, u otra actividad biológica no deseada. Además, los fragmentos de anticuerpos de cadena única son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y pueden tener, por lo tanto, una mayor pemeabilidad capilar que los anticuerpos completos, lo que permite que los fragmentos de anticuerpos de cadena única se localicen y se unan a sitios de unión de antígenos diana más eficazmente. Además, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse en una escala relativamente grande en células procariotas, facilitando así su producción. Es más, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos de cadena única hace que sea menos probable que provoquen una respuesta inmune en un receptor que los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante clonación molecular, biblioteca de exposición de anticuerpos en fagos o técnicas similares muy conocidas por el experto en la técnica. Estas proteínas pueden producirse, por ejemplo, en células eucariotas o células procariotas, incluyendo bacterias. Los fragmentos que se fijan al epítopo de la presente invención también pueden generarse utilizando varios métodos de exposición en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de exposición en fagos, los dominios funcionales del anticuerpo se exponen en la superficie de las partículas del fago que contienen las secuencias de polinucleótido que las codifican. En particular, dicho fago puede utilizarse para exponer dominios que se fijan al epítopo expresados de un repertorio o de una biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Los fagos que expresan un dominio que se fija al epítopo que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse utilizando, por ejemplo, un antígeno marcado unido o capturado en una superficie o lecho sólido. Los fagos utilizados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos incluyendo los dominios de unión de fd y M13 expresados a partir de fagos con los dominios del anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizados con disulfuro fusionados por recombinación con la proteína del fago del gen III o gen VIII. Los ejemplos de métodos de exposición en fagos que pueden utilizarse para obtener los fragmentos que se fijan al epítopo de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman eí al., 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames eí al., 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic eí al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton eí al., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; solicitud PCT No. PCT/GB91/01 34; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de EEUU Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria mediante referencia en su totalidad . Después de la selección del fago, las regiones del fago que codifican los fragmentos pueden aislarse y utilizarse para generar los fragmentos que se fijan al epítopo mediante expresión en un anfitrión elegido, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias, utilizando tecnolog ía de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe con detalle más adelante. Por ejemplo, también pueden utilizarse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab' )2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax ef al. , 1 992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al. , 1 995, AJRI, 34: 26-34; y Better et al. , 1988, Science, 240: 1041 -1043; incorporándose dichas referencias mediante referencia en su totalidad . Los ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fv y anticuerpos de cadena única incluyen los descritos en las patentes de EEUU Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston ef al. , 1 991 , Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu et al. , 1 993, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 90: 7995-7999; Skerra ef al. , 1 988, Science, 240 : 1 038-1 040. Equ ivalentes Funcionales En el alcance de la invención también están incluidos los equivalentes funcionales del anticuerpo anti-EphA y el anticuerpo humanizado anti-receptor EphA2. El término "equivalentes funcionales" incluye anticuerpos con secuencias homologas, anticuerpos quiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en los que cada equivalente funcional está definido por su capacidad para unirse al receptor EphA2. El experto en la técnica entenderá que existe una superposición entre el grupo de moléculas denominado "fragmentos de anticuerpo" y el grupo denominado "equivalentes funcionales." Los métodos para producir equivalentes funcionales son conocidos por el experto en la técnica y están descritos, por ejemplo, en la Solicitud PCT WO 93/21 31 9, Patente Europea No. EP 0239400; Solicitud PCT WO 89/09622; Patente Europea No. EP 0338745; y Solicitud de Patente Europea EP 0332424, que se incorporan en sus totalidades respectivas mediante referencia. Los anticuerpos con secuencias homologas son aquellos anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homolog ía de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-EphA y un anticuerpo humanizado anti-EphA de la presente invención . Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA y del anticuerpo humanizado anti-EphA de la presente invención. "Homología de secuencia" tal y como se aplica a una secuencia de aminoácidos en la presente memoria se define como una secuencia con al menos aproximadamente 90% , 91 % , 92% , 93% , ó 94% de homología de secuencia y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% , 96% , 97% , 98% , ó 99% homología de secuencia con otra secuencia de aminoácidos, determinada, por ejemplo, mediante el método de búsqueda FASTA según Pearson y Lipman, 1 988, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 2444-2448. Un anticuerpo quimérico es uno en el que diferentes partes de un anticuerpo se obtienen a partir de diferentes especies de animales. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable obtenida a partir de un anticuerpo monoclonal murino emparejada con una región constante de una inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Morrison , 1 985, Science, 229: 1 202 ; Oi et al. , 1 986, BioTechniques, 4: 214; Gillies et al. , 1 989, J. Immunol. Methods, 125: 1 91 -202; patentes de EEU U Nos. 5,807,71 5; 4,81 6,567; y 4,81 6,397, que se incorporan en la presente memoria mediante referencia en su totalidad . Las formas humanizadas de los anticuerpos quiméricos se obtienen sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón , en un dominio marco humano, por ejemplo, véase la Pub. PCT No. W092/22653. Los anticuerpos quiméricos humanizados tienen preferiblemente regiones constantes y regiones variables distintas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) obtenidas sustancialmente o exclusivamente a partir de las regiones del anticuerpo humano correspondiente y CDR obtenidas sustancialmente o exclusivamente a partir de un mamífero distinto de un ser humano. Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, fragmentos bivalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes y mru (véanse las revisiones por Winter, G . y Milstein , C 1991 , Nature, 349: 293-299; Hudson, P .J . , 1999, Current Opinión in Immunology, 1 1 : 548-557), cada uno de los cuales tienen capacidad para unirse al antígeno. En el fragmento de cadena única Fv (scFv), los dominios VH y VL de un anticuerpo están unidos mediante un péptido flexible. Típicamente, este péptido conector tiene una longitud de aproximadamente 5 residuos de aminoácidos. Si el conector es mucho más pequeño, por ejemplo 5 aminoácidos, se forman fragmentos divalentes, que son d ímeros divalentes scFv. Si el conector se reduce a menos de tres residuos de aminoácidos, se forman estructuras triméricas y tetraméricas que se denominan fragmentos trivalentes y tetravalentes. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, típicamente la CDR2 de la cadena pesada que tiene un reconocimiento y unión específicos suficientes como para poder utilizarse de manera independiente. Dicho fragmento se denomina unidad de reconocimiento molecular o mru . Varios de estos mrus pueden unirse con péptidos conectores cortos, formando por lo tanto una proteína de unión artificial con una mayor avidez que un único mru . Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos modificados mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación , acetilación , pegilación, fosforilación , amidación , derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, degradación proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína , etc. La unión covalente no impide al anticuerpo generar una respuesta anti-idiotípica. Estas modificaciones pueden realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, degradación qu ímica específica, acetilación , formilación , síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los equivalentes funcionales pueden producirse intercambiando diferentes CDR en diferentes cadenas en diferentes marcos. Así, por ejemplo, son posibles diferentes clases de anticuerpo para un conjunto de CDR dado mediante sustitución de diferentes cadenas pesadas, en el que, por ejemplo, pueden producirse tipos e isotipos de anticuerpos lgG 1 -4, IgM , lgA1 -2, Ig D, e IgE. De manera similar, los anticuerpos artificiales en el alcance de la invención pueden producirse incluyendo un conjunto de CDR dado en un marco completamente sintético. Los equivalentes funcionales pueden producirse mediante mutación, deleción y/o inserción en las secuencias de la región variable y/o constante que flanquean un conjunto de CDR particular, utilizando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica . Los fragmentos de anticuerpo y los equivalentes funcionales de la presente invención comprenden aquellas moléculas con un nivel detectable de fijación a EphA, cuando se comparan con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2. Un nivel detectable de unión incluye todos los valores en el intervalo de al menos 10-100%, preferiblemente al menos 50%, 60% ó 70%, más preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% de la afinidad de unión del anticuerpo murino 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 a EphA. Anticuerpos Mejorados Las CDR son muy importantes para el reconocimiento del epítopo y la unión del anticuerpo. Sin embargo, pueden realizarse cambios en los residuos que comprenden las CDR sin interferir con la capacidad del anticuerpo de reconocer y unirse a su epítopo correspondiente. Por ejemplo, pueden realizarse cambios que no afectan al reconocimiento del epítopo, pero que incrementan la capacidad de fijación del anticuerpo al epítopo. Así, también están incluidas en el alcance de la presente invención versiones mejoradas de anticuerpos murinos y humanizados, que también reconocen y se unen específicamente a EphA, preferiblemente con una afinidad incrementada. Numerosos estudios han examinado los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en diferentes posiciones en la secuencia de un anticuerpo, tomando como base el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, sus propiedades tales como unión y nivel de expresión (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392-403; Rader, C. er al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 95: 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539). En estos estudios, se generaron equivalentes del anticuerpo primario cambiando las secuencias de los genes de la cadena pesada y ligera en las regiones CDR1, CDR2, CDR3, o marco, utilizando métodos tales como mutagénesis dirigida a sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis en cásete, PCR tendente a error, transposición de secuencias de ADN, o cepas mutadoras de E. coli (Vaughan, T. J. ef al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539; Adey, N. B. ef al., 1996, Capítulo 16, p. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. ef al., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han resultado en afinidades mejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. ef al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 89: 3576-3580; Boder, E. T. ef al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 97: 10701-10705; Davies, J. y Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169-179; Thompson, J. ef al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 77-88; Short, M. K. ef al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 16365-16370; Furukawa, K. ef al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 27622-27628). Mediante una estrategia dirigida similar para cambiar uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo, las secuencias de anticuerpo descritas en esta invención pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos anti-EphA con funciones mejoradas, incluyendo afinidad mejorada por EphA. Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: ( 1 ) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos y (4) confieren o modifican otras propiedades físico-quimicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del dominio o de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazamiento no debe romper una hélice que está presente en la secuencia parental , o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica están descritos en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton , Ed. , W. H . Freeman and Company, Nueva York ( 1 984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J . Tooze, eds. , Garland Publishing , Nueva York, N . Y. ( 1991 )); y Thornton et al. , 1 991 , Nature, 354: 1 05, que se incorpora cada una en la presente memoria mediante referencia. Los anticuerpos mejorados también incluyen aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan mediante técnicas estándar de inmunización animal , formación de hibridomas y selección para detectar anticuerpos con características específicas. La presente invención también incluye conjugados citotóxicos. Estos conjugados citotóxicos comprenden dos componentes principales, un agente de fijación a células y un agente citotóxico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "agente de fijación a células" se refiere a un agente que reconoce y se une específicamente a los receptores EphA en la superficie celular. En una modalidad , el agente de fijación a células reconoce específicamente el receptor EphA de manera que permite a los conjugados actuar de manera dirigida con pocos efectos secundarios que resultan de la unión no específica. En otra modalidad , el agente de fijación a células de la presente invención también reconoce específicamente el receptor EphA de manera que los conjugados estarán en contacto con la célula diana durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir a la parte del fármaco citotóxico del conjugado actuar en la célula, y/o proporcionar a los conjugados un tiempo suficiente como para ser internalizados por la célula. En una modalidad preferida, los conjugados citotóxicos comprenden un anticuerpo anti-EphA como agente de fijación a células, más preferiblemente el anticuerpo monoclonal murino anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2. En una modalidad más preferida, el conjugado citotóxico comprende un anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2 o un fragmento de éste que se fija al epítopo. El anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2 es capaz de reconocer específicamente un receptor EphA, tal como EphA2 y dirige al agente citotóxico hacia una célula o tejido anormal , tal como células cancerosas, de una manera dirigida. El segundo componente de los conjugados citotóxicos de la presente invención es un agente citotóxico. El término "agente citotóxico" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que reduce o bloquea la función , o crecimiento, de células y/o produce la destrucción de células. En modalidades preferidas, el agente citotóxico es un taxoide, un maitansinoide tal como DM 1 o DM4, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, un profármaco, CC-1065 o un análogo de CC-1 065. En modalidades preferidas, los agentes de fijación a células de la presente invención están unidos covalentemente, directamente o a través de un conector escindióle o no escindible, al agente citotóxico. Los agentes de fijación a células, agentes citotóxicos y conectores se discuten con más detalle a continuación. Agentes de fijación a células La eficacia de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de fijación a células apropiado. Los agentes de fijación a células pueden ser de cualquier clase actualmente conocida, o que llegue a conocerse, e incluye péptidos y no péptidos. El agente de fijación a células puede ser cualquier compuesto que pueda unirse a una célula, de manera específica o no específica. Generalmente, éstos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia que se une a células. Los ejemplos más específicos de agentes de fijación a células que pueden usarse incluyen: - anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab" y F(ab')2, Fv (Parham , 1983, J. Immunol. , 131 :2895-2902; Spring et al. , 1 974, J. Immunol. , 1 13: 470-478; Nisonoff et al. , 1 960, Arch. Biochem. Biophys. , 89: 230-244). Preferiblemente, se utiliza un anticuerpo humanizado anti-EphA como el agente de fijación a células de la presente invención. Más preferiblemente el anticuerpo humanizado anti-EphA se selecciona de anticuerpos humanizados o modificados en superficie 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H 1 1 ; EphA2-N 1 y EphA2-N2. Agentes Citotóxicos En otra modalidad , el anticuerpo humanizado o un fragmento de éste que se fija al epítopo puede conjugarse con un fármaco, tal como un maitansinoide o un derivado de tomaimicina, para formar un profármaco que tiene una citotoxicidad específica frente a células que expresan el antígeno dirigiendo el fármaco hacia el receptor EphA2. Los conjugados citotóxicos que comprenden dichos anticuerpos y un fármaco pequeño altamente tóxico (por ejemplo, maitansinoides, taxanos, derivados de tomaimicina, un derivado de leptomicina, CC-1065 y análogos de CC-1 065) pueden utilizarse como un terapéutico para el tratamiento de tumores, tales como tumores de mama y de ovario. El agente citotóxico utilizado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que resulta en la muerte de una célula, o induce la muerte celular, o de alguna manera disminuye la viabilidad celular. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoide, un profármaco, derivados de tomaimicina, taxoides, un derivado de leptomicina, CC-1 065 y análogos de CC-1 065, definidos a continuación. Estos agentes citotóxicos se conjugan con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, equivalentes funcionales, anticuerpos mejorados y sus análogos como se describe en la presente memoria. Los conjugados citotóxicos pueden prepararse mediante métodos in vitro. Con el de fin de unir un fármaco o profármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo conector. En la técnica son muy conocidos los grupos conectores adecuados e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles y grupos esterasa lábiles. Los grupos conectores preferidos son grupos disulfuro y grupos tioéter. Por ejemplo, pueden construirse conjugados utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco. Maitansinoides Entre los agentes citotóxicos que pueden utilizarse en la presente invención para formar un conjugado citotóxico, están los maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y son altamente tóxicos para las células de mamíferos. Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados están descritos en las patentes de EEU U Nos. 4,424,21 9; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,31 5,929; 4,331 ,598; 4,361 ,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322 ,348; 4,371 , 533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; y 5,846,545. Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado incluyen: ( 1 ) C-1 9-descloro (patente de EEUU No. 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de ansamitocina P2); (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetil) +/-C-1 9-descloro (patentes de EEUU Nos. 4.361 .650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o descloración utilizando LAH); y (3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (Pat. de EEUU No 4.294.757) (preparado por acilación utilizando cloruros de acilo). Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen: (1) C-9-SH (patente de EEUU No. 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente de EEUU No. 4,331 ,598); (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de EEUU No. 4,450,254) (preparado de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente de EEUU No. 4,364,866) (preparado por la conversión de maitansinol por Streptomyces); (5) C-15-metoxi (patentes de EEUU Nos. 4,313,946 y 4,315,929) (aislado de Trewia nudiflora); (6) C-18-A/-desmetilo (patentes de EEUU Nos. 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y (7) 4,5-desoxi (patente de EEUU No 4.371.533) (preparado por la reducción tricloruro de titanio/LAH de maitansinol). En una modalidad preferida, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), denominado formalmente A/2'-desacetil-/V2'-(3-mercapto-1 -oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 está representado por la fórmula estructural siguiente (I): En otra modalidad preferida, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol N2 -desacetil-A/-2 (4-metil-4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina como el agente citotóxico. DM4 está representado por la fórmula estructural siguiente (II): En modalidades adicionales de la invención, pueden utilizarse otras maitansinas, incluyendo maitansinoides que contienen tiol y disulfuro que presentan una mono o dialquil sustitución en el átomo de carbono que presenta el átomo de azufre. Éstos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi, o C-20 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que presenta un grupo sulfhidrilo, en el que el átomo de carbono del grupo acilo que presenta la funcionalidad ti oí tiene uno o dos sustituyentes, siendo estos sustituyentes CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tienen de 1 a 1 0 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además en el que uno de los sustituyentes puede ser H y en el que el grupo acilo tiene una cadena lineal con una longitud de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo de azufre. Dichas maitansinas adicionales incluyen compuestos representados por la fórmula (I I I ): Y' representa o)p(C=C)qAr(CR5 R6)m Du(CR1 1 = CR1 2)r(C=C)sBt( en la que: R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 -10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; R3. R4, R5, Re, R7, Re. R9. R10. R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de I, m, n, o, p, q, r, s y t no son cero en ningún momento; y Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo. Las modalidades preferidas de la fórmula (III) incluyen los compuestos de fórmula (III) en la que: Ri es metilo, R2 es H y Z es H. Ri y R2 son metilo y Z es H. R1 es metilo, R2 es H y Z es -SCH3.
Ri y R2 son metilo y Z es -SCH3. Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (IV-L), (IV-D), o (IV-D.L) (IV-L) (IV-D) (IV en las que: Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRi R2SZ, en la que: Ri y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; R3. R4. R5. R6. Rzy Re son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5 y además n puede ser 0; Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y May representa un maitansinoide que presenta la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo. Las modalidades preferidas de las fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) incluyen los compuestos de las fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D.L) en las que: Ri es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1, n es 0 y Z es H. R^ y R2 son metilo, R5, R6, R7, Re son cada uno H, I y m son 1, n es 0 y Z es H. Ri es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1 , n es 0 y Z es -SCH3. Ri y R2 son metilo, R5, R6, R7, Re son cada uno H, I y m son 1, n es 0 y Z es -SCH3. Preferiblemente el agente citotóxico está representado por la fórmula (IV-L). Dichas maitansinas adicionales también incluyen los compuestos representados por la fórmula (V): (V) en la que: Y representa (CR7R8),(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, en la que: Ri y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; R3, R4. 5> R6, R7 y Re son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5 y además n puede ser 0; y Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo. Las modalidades preferidas de la fórmula (V) incluyen los compuestos de fórmula (V) en la que: RT es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; I y m son cada uno 1 ; n es 0; y Z es H. R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7, Re son cada uno H, I y m son 1; n es 0; y Z es H. es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1 , n es 0 y Z es -SCH3. Ri y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, I y m son 1, n es 0 y Z es -SCH3. Dichas maitansinas adicionales incluyen además los compuestos representados por la fórmula (Vl-L), (Vl-D), o (VI-D.L): (Vl-L) (Vl-D) (Vl-D, L) en las que: Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, en la que: Ri y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, Re, R7 y Re son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo cíclico lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m y ri son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5 y además n puede ser 0; Z2 es SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y May es un maitansinoide. Dichas maitansinas adicionales también incluyen los compuestos representados por la fórmula (VII): en la que: Y2' representa (CR7R8),(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11 = CR12)r(C=C)sBt( en la que: R y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; A, B y D son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; R3, R4, R5, R6, R7l R8, R9l R10, R^ y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de I, m, n, o, p, q, r, s y t no son cero en ningún momento; y Z2 es SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo. Las modalidades preferidas de la fórmula (VII) incluyen los compuestos de fórmula (VII) en la que: Ri es metilo, R2 es H. Los maitansinoides mencionados anteriormente pueden conjugarse con un anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 o un homólogo o fragmento de éste, en el que el anticuerpo se une al maitansinoide utilizando la funcionalidad tiol o disulfuro que está presente en el grupo acilo de una cadena lateral de aminoácidos acilada que se encuentra en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo del maitansinoide y en el que el grupo acilo de la cadena lateral de aminoácidos acilada tiene su funcionalidad tiol o disulfuro localizada en un átomo de carbono que tiene uno o dos sustituyentes, siendo dichos sustituyentes CH3, C2H5) alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además uno de los sustituyentes puede ser H y en el que el grupo acilo tiene una cadena lineal con una longitud de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo de azufre. Un conjugado preferido de la presente invención es el que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (VIII): en la que: Y ' representa CR3R4)nCRi R2S- en la que: A, B y D, son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; R3, R4> R5, R6, R7, R8) R9, R10, Rn y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y I, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de I, m, n, o, p, q, r, s y t no son cero en ningún momento. Preferiblemente, Ri es metilo, R2 es H, o , y R2 son metilo. Un conjugado aún más preferido de la presente invención es el que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (IX-L), (IX-D), o (IX-D.L): (IX-L) (IX-D) (IX-D.L) en la que: Y, representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1 R2S-, en la que: Ri y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo y además R2 puede ser H; R3> R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; I, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5 y además n puede ser 0; y May representa un maitansinol que presenta la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C- 5 hidroxi o C-20 desmetilo. Las modalidades preferidas de las fórmulas (IX-L), (IX-D) y (IX-D,L) incluyen los compuestos de las fórmulas (IX-L), (IX-D) y (IX-D.L) en las que: es metilo, R2 es H, o R, y R2 son metilo, R es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y Rs son cada uno H; I y m son cada uno 1; n es 0, RT y R2 son metilo; R5, Re, 7 y s son cada uno H; I y m son 1; n es 0. Preferiblemente el agente citotóxico está representado por la fórmula (IX-L). Un conjugado preferido más de la presente invención es el que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2- N1 o EphA2-N2 o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (X): en la que los sustituyentes son como se han definido para la fórmula (IX) anterior. Especialmente preferidos son cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, en los que R es H, R2 es metilo, R5> R6> R7 y R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1 y n es 0. Además son especialmente preferidos cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, en los que RT y R2 son metilo, Rs, R6. 7 y e son cada uno H, I y m son 1 y n es 0. Además, se prefiere el estereoisómero L-aminoacilo. Cada uno de los maitansinoides mostrados en la solicitud de patente de EEUU en tramitación número 10/849,136, presentada el 20 de mayo de 2004, también pueden utilizarse en el conjugado citotóxico de la presente invención. La descripción completa de la solicitud de patente de EEUU número 10/849,136 se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Grupos conectores que contienen disulfuro Con el fin de unir el maitansinoide al agente de fijación a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2, el maitansinoide comprende un residuo conector. La porción conectora contiene un enlace químico que permite la liberación de maitansinoides completamente activos en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son muy conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces ácido lábiles, enlaces fotolábiles, enlaces peptidasa lábiles y enlaces esterasa lábiles. Se prefieren los enlaces disulfuro. La porción conectora también comprende un grupo qu ímico reactivo. En una modalidad preferida, el grupo químico reactivo puede unirse covalentemente al maitansinoide a través de una porción conectora con enlace disulfuro. Los grupos químicos reactivos particularmente preferidos son /V-succinimidil ésteres y /V-sulfosuccinimidil ésteres. Los maitansinoides particularmente preferidos que comprenden un residuo conector que contiene un grupo químico reactivo son C-3 ésteres de maitansinol y sus análogos en los que la porción conectora contiene un enlace disulfuro y el grupo químico reactivo comprende un /V-succinimidil o /V-sulfosuccinimidil éster. Muchas posiciones de los maitansinoides pueden servir como posición para unir químicamente la porción conectora. Por ejemplo, es esperable que sean útiles la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-1 5 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi . Sin embargo, se prefiere la posición C-3 y la posición C-3 del maitansinol es especialmente preferida. Aunque la síntesis de ésteres de maitansinol que tienen un residuo conector se describe en términos de residuos conectores con enlace disulfuro, un experto en la técnica entenderá que los residuos conectores con otros enlaces químicos (como se ha descrito anteriormente) también pueden utilizarse con la presente invención, así como otros maitansinoides. Los ejemplos específicos de otros enlaces químicos incluyen enlaces ácido lábiles, enlaces fotolábiles, enlaces peptidasa lábiles y enlaces esterasa lábiles. La descripción de la Patente de EEUU No. 5,208,020, incorporada en la presente memoria, muestra la producción de maitansinoides que presentan dichos enlaces. La síntesis de maitansinoides y derivados de maitansinoide que tienen un residuo disulfuro que presenta un grupo reactivo está descrita en las Patentes de EEUU Nos. 6,441 , 1 63 y 6,333,41 0 y en la Solicitud de EEUU No, 1 0/1 61 ,651 , cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Los maitansinoides que contienen el grupo reactivo, tal como DM 1 , se hacen reaccionar con un anticuerpo, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2, para producir conjugados citotóxicos. Estos conjugados pueden purificarse mediante HPLC o mediante filtración en gel . Numerosos esquemas excelentes para producir dichos conjugados anticuerpo-maitansinoide se proporcionan en la patente de EEU U No. 6,333,41 0 y en las solicitudes de EEU U Nos. 09/867,598, 1 0/161 ,651 y 1 0/024,290, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria en su totalidad . En general , una disolución de un anticuerpo en tampón acuoso puede incubarse con un exceso molar de maitansinoides que tienen un residuo disulfuro que presenta un grupo reactivo. La mezcla de reacción puede inactivarse mediante la adición de amina en exceso (tal como etanolamina, taurina, etc. ). El conjugado maitansinoide-anticuerpo puede purificarse mediante filtración en gel . El número de moléculas de maitansinoide unidas por molécula de anticuerpo puede determinarse midiendo espectrofotométricamente la proporción de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se prefiere una media de 1 -10 moléculas de maitansinoide/molécula de anticuerpo. Los conjugados de los anticuerpos con fármacos maitansinoide puede evaluarse por su capacidad de suprimir la proliferación de varias líneas celulares no deseadas in vitro. Por ejemplo, para evaluar la citotoxicidad de estos compuestos pueden utilizarse l íneas celulares tales como la línea de carcinoma epidermoide humano A-431 , la l ínea celular de cáncer de pulmón de células pequeñas SW2, la línea de tumor de mama humano SKBR3 y la línea celular de linfoma de Burkitt Namalwa. Las células que se quieren evaluar pueden exponerse a los compuestos durante 24 horas y las fracciones de células supervivientes se pueden medir en ensayos directos por métodos conocidos. Los valores de Cl50 pueden calcularse después a partir de los resultados de los ensayos. Grupos conectores q ue contienen PEG Los maitansinoides también pueden unirse a los agentes de fijación a células utilizando grupos conectores PEG , como se muestra en la solicitud de EEUU No. 10/024,290. Estos grupos conectores PEG son solubles tanto en agua como en disolventes no acuosos y pueden utilizarse para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de fijación a células. Los grupos conectores PEG ejemplares incluyen conectores PEG hetero-bifuncionales que se unen a agentes citotóxicos y agentes de fijación a células en extremos opuestos de los conectores a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional en un extremo y un éster activo en el otro extremo. Como ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico utilizando un grupo conector PEG, se hace referencia de nuevo a la Solicitud de EEU U No. 1 0/024.290 para detalles específicos. La síntesis empieza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que presentan un residuo PEG reactivo con un agente de fijación a células, lo que resulta en el desplazamiento del éster activo terminal de cada residuo PEG reactivo por un residuo de aminoácido del agente de fijación a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2, para proporcionar un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos unidos covalentemente a un agente de fijación a células a través de un grupo conector PEG.
Taxanos El agente citotóxico utilizado en los conjugados citotóxicos según la presente invención también puede ser un taxano o derivado de éste. Los taxanos son una familia de compuestos que i ncluye pacl itaxel (taxol ), un producto natural citotóxico y docetaxel (Taxotere) , un derivado semi-sintético , dos compuestos que se utilizan ampliamente en el tratamiento del cáncer. Los taxanos son tóxicos para el huso mitótico q ue inhi ben la despol imerización de la tubulina , lo que resulta en la muerte celular. Aunque el docetaxel y el paclitaxel son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividad antitumoral es limitada debido a su toxicidad no específica frente a las células normales. Además, los compuestos como el paclitaxel y el docetaxel por sí mismos no son suficientemente potentes como para utilizarse en conjugados con agentes de fijación a células. Un taxano preferido para util izarse en la preparación de los conjugados citotóxicos es el taxano de fórmula (XI ): Los métodos para sintetizar taxanos que pueden utilizarse los conjugados citotóxicos de la presente invención, junto con los métodos para conjugar los taxanos con un agente de fijación a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 o EphA2-N2, están descritos con detalle en las patentes de EEUU Nos. 5,416,064, 5,475,092, 6,340,701 , 6,372,738 y 6,436,931 y en las solicitudes de EEUU Nos. 10/024,290, 10/1 44,042, 1 0/207,81 4, 1 0/210, 1 1 2 y 1 0/369,563. Derivados de tomaimicina El citotóxico según la presente invención también puede ser un derivado de tomaimicina. Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1 ,4]benzodiacepinas (PBD), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biológicas por medio de la unión covalente al N2 de la guanina en el surco menor del ADN . Las PBD incluyen varios agentes de unión al surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81 . Los derivados de tomaimicina nuevos que retienen una alta citotoxicidad y que pueden unirse eficazmente a agentes de fijación a células están descritos en la Solicitud I nternacional No. PCT/IB2007/0001 42, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Los complejos agente de fijación a células-derivado de tomaimicina permiten la medida total de la acción citotóxica de los derivados de tomaimicina que se van a aplicar de forma dirigida sólo contra las células no deseadas, evitando por lo tanto los efectos secundarios debidos al daño en las células sanas que no son diana.
El agente citotóxico según la presente Invención comprende uno o más derivados de tomaimicina, unidos a un agente de fijación a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2- N1 o EphA2-N2, a través de un grupo conector. El grupo conector es parte de un residuo químico que está unido covalentemente a un derivado de tomaimicina mediante métodos convencionales. En una modalidad preferida, el residuo químico puede estar unido covalentemente al derivado de tomaimicina mediante un enlace disulfuro. Los derivados de tomaimicina útiles en la presente invención tienen la fórmula (XII) mostrada a continuación: — representa un enlace sencillo opcional; representa un enlace sencillo o un enlace doble; con la condición de que cuando representa un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H y W y W\ iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, un éter tal como - OR, un éster (por ejemplo un acetato), tal como -OCOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N 10 y C1 1 son una parte del ciclo, -SH , un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -S03 -, una sulfonamida tal como -N RSOOR, una amina tal como -N RR', opcionalmente amina cíclica tal que N 1 0 y C1 1 son una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR' , una amida tal como -N RCOR, un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido; Preferiblemente W y W son iguales o diferentes y son OH , Orne, Oet, N HCON H2, SMe; y cuando representa un enlace doble, U y U' están ausentes y W y W representan H ; ¦ R1 , R2, R 1 \ R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre un Haluro o Alquilo sustituido opcionalmente con uno o más Hal , CN , N RR', CF3, OR, Arilo, Het, S(0)qR, o R1 y R2 y R1 ' y R2' forman juntos un grupo que contiene un enlace doble =B y =B' respectivamente. Preferiblemente, R1 y R2 y R1 ' y R2' forman juntos un grupo que contiene un enlace doble =B y =B' respectivamente. B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquenilo que está sustituido opcionalmente con uno o más Hal , CN , N RR' , CF3, OR, Arilo, Het, S(0)qR o B y B' representan un átomo de oxígeno. Preferiblemente, B=B' . Más preferiblemente, B=B'= =CH2 o =CH-CH3, ¦ X, X' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre uno o más-O-, -NR-, -(C=0)-, -S(0)q-. Preferiblemente, X=X'. Más preferiblemente, X=X'=0. ¦ A, A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo que contiene opcionalmente un átomo de oxígeno, un átomo de nitrógeno o un átomo de azufre, estando cada uno de ellos sustituido opcionalmente con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(0)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo. Preferiblemente, A=A'. Más preferiblemente, A=A' = alquilo lineal no sustituido. ¦ Y, Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR; Preferiblemente, Y=Y'. Más preferiblemente, Y=Y'=OAIquilo, más preferiblemente OMetilo. ¦ T es -NR-, -O-, -S(0)q-, o un grupo arilo, cicloalquilo, un grupo heterocíclico o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellos sustituido opcionalmente con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(0)qR, y/o conector(es), o un alquilo ramificado, sustituido opcionalmente con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(0)qR y/o conector(es), o un alquilo lineal sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(0)qR y/o conector(es). Preferiblemente, T es un grupo arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, más preferiblemente fenilo o piridilo, sustituido opcionalmente con uno o más conectores.
Dicho conector comprende un grupo de unión . Los grupos de unión adecuados son muy conocidos en la técnica e incluyen grupos tiol , sulfuro , disulfuro, grupos tioéter, gru pos ácido lábiles, grupos fotolábiles , grupos peptidasa lábiles y grupos esterasa lábiles. Se prefieren los grupos disulfuro y tioéter. Cuando el grupo de unión es un grupo que contiene tiol , sulfuro (o el denomi nado tioéter -S-) o disulfuro (-S-S-), la cadena lateral que tiene el grupo tiol , sulfuro o disulfuro puede ser lineal o ramificada , aromática o heterocícl ica. El experto en la técnica puede identificar fácilmente cadenas laterales adecuadas. Preferiblemente, dicho conector es de fórmula: -G-D-(Z)p-S-Z' en la que G es un enlace sencillo o un enlace doble, -O-, -S- o -N R-; D es u n enlace sencillo o -E-, -E-N R-, -E-N R-F-, -E-O-, -E-O-F- , -E-N R-CO-, -E-N R-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-N R-C-S-, -E-N R-CS-F-; en el que E y F son iguales o diferentes y se eligen independientemente de -(OCH2CH2)iAlquilo(OCH2CH2 )j-, Alquilo(OCH2CH2 )i-Alquilo-, -(OCH2CH2)i-, (OCH2CH2 )iCicloalquilo(OCH2CH2)j-, (OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j- , (OCH2CH2)iArilo(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)i Heteroarilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo-(OCH2CH2)iAlquilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo-(OCH2CH2)i-, -Alquilo-(OCH2CH2 )iCicloalqui lo(OCH2CH2 )j-, Alquilo(OCH2CH2)i Heterocíclico(OCH2CH2)j-, -Alquilo-(OCH2CH2)iAr¡lo(OCH2CH2)j-, Alqu¡lo(OCH2CH2)iHeteroarilo(OCH2CH2)j-, -Cicloalquil-Alquilo-, -Alquil-Cicloalquilo-, -Heterocíclico-Alquilo-, -Alquil-Heterocíclico-, -Alquil-Arilo-, -Aril-Alquilo-, -Alquil-Heteroarilo- , -Heteroaril-Alquilo-lineales o ramificados; en donde i y j , iguales o diferentes, son números enteros y se eligen independientemente entre 0, 1 a 2000; Z es -Alquil- lineal o ramificado; p es 0 ó 1 ; Z' representa H, un grupo protector de tiol tal como COR, R20 o SR20, en el que R20 representa H , metilo, Alquilo, Cicloalquilo sustituido opcionalmente, arilo, heteroarilo o un grupo heterocíclico, con la condición de que cuando Z' es H , dicho compuesto esté en equilibrio con el compuesto correspondiente formado por ciclación intramolecular producida por la adición del grupo tiol -SH al enlace ¡mina -NH= de una de las porciones de PBD. ¦ n , n' , iguales o diferentes, son 0 ó 1 . ¦ q es 0, 1 ó 2. ¦ R, R' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H , Alquilo, Arilo, estando cada uno de ellos sustituido opcionalmente con Hal , CN , N RR' , CF3, R, OR, S(0)qR, Arilo, Het; o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente, o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros. Los compuestos de fórmula general (XII) que tienen isómeros geométricos y estereoisómeros también son una parte de la invención. Se sabe que el enlace doble N-10, C-11 de los derivados de tomaimicina de fórmula (XII) puede convertirse fácilmente y de manera reversible en los aducios de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucleófilos. Este proceso es reversible y puede regenerar fácilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente de deshidratación, en un disolvente orgánico no prótico, en vacío o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 1983, J. Antibiotics, 36 . 276). Así, los derivados reversibles de los derivados de tomaimicina de fórmula general (XIII) también pueden utilizarse en la presente invención: en la que A, X, Y, n, T, ?', ?', ?', n', R1, R2, R1\ R2" son como se han definido en la fórmula (XII) y W, W son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en OH, un éter tal como -OR, un éster (por ejemplo un acetato), tal como -OCOR, -COOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -S03-, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR', una amida tal como -NRCOR, -NRCONRR', un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido. Preferiblemente, W y W son iguales o diferentes y son OH, Orne, Oet, NHC0NH2, SMe.
Por lo tanto, los compuestos de fórmula (XIII) pueden considerarse como solvatos, incluyendo el agua cuando el disolvente es agua; estos solvatos pueden ser particularmente útiles. En una modalidad preferida, los derivados de tomaimicina de la invención se seleccionan del grupo que consiste en: 8,8'-[1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4] benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-metoxi-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metox¡-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[1 ,5-pentanodiilbis(oxi)]-b¡s[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8'-[1 ,4-butanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- metox¡-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[3-metil-1 ,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4] benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[2,6-piridindiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[4-(3-tert-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridindiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(3-aminopropiloxi)-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi- ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8'-[5-(N-metil-3-tert-butoxicarbonilaminopropil)-1 ,3-bencenodiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino) propiloxi]-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-acetiltiometil-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi- ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - éster tert-butílico de ácido bis-{2-[(S)-2-metilen-7-metoxi- 5-0X0-1 ,3,11a-tetrah¡dro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzod¡acepin-8-¡loxi]-et¡l}-carbámico 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1 ,5-pentanodiilbis(oxi)]-b¡s[(S)-2-metilen-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-p¡rrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-4-mercapto-4,4-dimetilbutanoil)am¡no-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1 ,3-bencenod¡ilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-met¡l-N-(2-mercapto-2,2-d¡metilet¡l)amino-1 ,3-bencenodiil(met¡lenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8,-[5-(N-met¡l-N-(2-metildit¡o-2,2-dimet¡letil)am¡no-1 ,3-bencenodiil(met¡lenox¡)]-bis[7-metox¡-2-metilen-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8,-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)-pentanamido-etox¡)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-d¡metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(2-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanam¡do-etoxi)-benceno-3,5-dimet¡l)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzod¡acepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-met¡ldisulfanil)-pentanamido-propoxi)-p¡r¡d¡n-2,6-d¡met¡l)-diox¡]-b¡s[(S)-2-et-(E)-¡liden-7-dimetoxi- 1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzod¡acepin-5-ona] 8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-butoxi)-piridin-2,6-dimetM)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-¡liden-7-dimetox¡-1 ,2,3,11a-tetrahid ro-pirrolo[2,1-c3[ ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8,-[(1-(2-{2-[2-(4-metM-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil- pentanoMamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[( 1 -(2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi )-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-amino]-propil)-piridin-2 ,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2 , 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] - 8,8'-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1 -(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] así como los correspondientes derivados mercapto, o sus sales, hidratos, o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente, o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros. Los compuestos preferidos son los de fórmula: o en la que X, X' , A, A' , Y, Y' , T, n, n' son como se han definido anteriormente. Los compuestos de fórmula (XI I ) pueden prepararse de diferentes formas muy conocidas para los expertos en la técnica. Los compuestos pueden sintetizarse, por ejemplo, por aplicación o adaptación de los métodos que se describen a continuación, o variaciones de los mismos que puedan apreciarse por los expertos en la técnica. Las modificaciones y sustituciones apropiadas serán muy obvias y se conocerán bien o podrán obtenerse fácilmente a partir de la bibliografía científica por los expertos en la técnica. En particular, dichos métodos pueden encontrarse en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1 999. Los métodos para sintetizar los derivados de tomaimicina que pueden utilizarse en la invención están descritos en la Solicitud Internacional No. PCT/IB2007/0001 42. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante diferentes rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se sintetizan fácilmente mediante técnicas muy conocidas para el experto en la técnica (véanse, por ejemplo, WO 00/1 2508, WO 00/1 2507, W0 2005/0401 70, WO 2005/085260, FR1 51 6743, M . Morí et al. , 1986, Tetrahedron, 42: 3793-3806). Las moléculas de conjugado de la invención pueden formarse usando cualquier técnica. Los derivados de tomaimicina de la invención pueden unirse a un anticuerpo u otro agente de fijación a células a través de un conector ácido lábil o un conector fotolábil . Los derivados pueden condensarse con un péptido que tenga una secuencia adecuada y, posteriormente, unirse a un agente de fijación a células para producir un conector peptidasa lábil . Los conjugados pueden prepararse de manera que contengan un grupo hidroxilo primario, que puede succinilarse y unirse a un agente de fijación a células para producir un conjugado que pueda escindirse por esterasas intracelulares para liberar el derivado libre. Preferiblemente, los derivados se sintetizan de manera que contengan un grupo tiol libre o protegido y después uno o más derivados que contienen disulfuro o tiol se unen covalentemente al agente de fijación a células a través de un enlace disulfuro o un enlace tioéter. En los documentos USP 5,416,064 y USP 5,475,092 se describen numerosos métodos de conjugación. Los derivados de tomaimicina pueden modificarse para proporcionar un grupo amino libre y luego unirse al anticuerpo o a otro agente de fijación a células mediante un conector ácido lábil o un conector fotolábil . Los derivados de tomaimicina con un grupo amino o carboxilo libre pueden condensarse con un péptido y, posteriormente, unirse a un agente de fijación a células para producir un conector peptidasa lábil . Los derivados de tomaimicina con un grupo hidroxilo libre en el conector pueden succinilarse y unirse a un agente de fijación a células para producir un conjugado que puede ser escindido por esterasas intracelulares para liberar el fármaco libre. Lo más preferi blemente, los derivados de tomaimici na se tratan para crear un grupo tiol libre o protegido y luego los d ímeros de tomai micina que contienen disulfuro o tiol se unen al agente de fijación a cél ulas mediante enlaces disulfuro . Preferiblemente, los conjugados derivado de tomaimici na-anticuerpo monoclonal o derivado de tomaimicina-agente de fijación a células son los que están unidos mediante un enlace d isulfuro, como se ha indicado anteriormente, que son capaces de liberar los derivados de tomaimicina. Dichos conj ugados de unión a células se preparan mediante métodos conocidos tales como por modificación de anticuerpos monoclonales con piridil-ditiopropionato de succinimidilo (SP DP) (Carlsson ef al. , 1 978 , Biochem. J. , 173:723-737). El g rupo tiopiridilo resultante después se desplaza por tratamiento con derivados de tomaimicina que contienen tiol para produci r conjugados unidos por enlaces disulfu ro. Alternativamente, en el caso de los arilditio-derivados de tomaimicina , la formación del conjugado de unión a células se realiza por desplazamiento directo del aril-tiol del derivado de tomai micina por grupos sulfhidrilo previamente introd ucidos en las moléculas del anticuerpo. Los conjugados que contienen de 1 a 1 0 fármacos de derivado de tomaimicina unidos mediante un puente disulfuro se preparan fácilmente por cualquier método. Más específicamente, se trata una disolución del anticuerpo modificado por ditio-nitropiridilo a una concentración de 2.5 mg/ml en tampón de fosfato potásico 0.05 M , a pH 7.5 , que contiene E DTA 2 mM , con el derivado de tomaimicina que contiene tiol ( 1 .3 eq . molares/grupo ditiopiridilo). La liberación de la tio-nitropiridina del anticuerpo modificado se sigue espectrofotométricamente a 325 nm y se completa en aproximadamente 1 6 horas. El conjugado derivado de tomaimicina-anticuerpo se purifica y se libera del fármaco sin reaccionar y de otro material de bajo peso molecular mediante filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300. El número de residuos de derivado de tomaimicina unidos por molécula de anticuerpo se puede determinar midiendo la relación entre la absorbancia a 230 nm y a 275 nm . Por este método se pueden unir mediante enlaces disulfuro una media de 1 -1 0 moléculas de derivado de tomaimicina/molécula de anticuerpo. El efecto de la conjugación en la afinidad de unión a las células que expresan el antígeno puede determinarse utilizando los métodos descritos previamente por Liu et al. , 1996, Proc. Nati. Acad. Sc¡. U. S. A. , 93: 8618-8623. La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados con anticuerpo frente a l íneas celulares se puede medir por retro-extrapolación de las curvas de proliferación celular como se describe en Goldmacher eí al. , 1 985, J. Immunol., 135:3648-3651 . La citotoxicidad de estos compuestos frente a l íneas celulares adherentes puede determinarse mediante ensayos clonogénicos como se describe en Goldmacher eí al. , 1 986, J. Cell Biol. , 102: 1 312-1 319. Derivados de leptomicina El citotóxico según la presente invención también puede ser un derivado leptomicina. Según la presente invención, "derivados de leptomicina" se refiere a los miembros de la familia de la leptomicina como se define en Kalesse et al. (2002, Synthesis 8: 981-1003), e incluye: leptomicinas, tales como leptomicina A y leptomicina B, calistatinas, ratjadones tales como ratjadon A y ratjadon B, anguinomicinas tales como anguinomicina A, B, C, D, kasusamicinas, leptolstatina, leptofuraninas, tales como leptofuranina A, B, C, D. Se prefieren los derivados de la leptomicina A y B. Más específicamente, los derivados de la invención tienen la fórmula (I): en la que: Ra y Ra' son H o -Alk; preferiblemente Ra es -Alk, preferiblemente metilo y Ra' es H ; R17 es alquilo sustituido opcionalmente con OR, CN, NRR', perfluoroalquilo; preferiblemente, R17 es alquilo, más preferiblemente metilo o etilo; R9 es alquilo sustituido opcionalmente con OR, CN, NRR', perfluoroalquilo; preferiblemente, R9 es alquilo, más preferiblemente metilo; X es -O- o -NR-; preferiblemente, X es -NR-; Y es _u-, -NR-U-, -O-U-, -NR-CO-U-, -U-NR-CO-, -U-CO-, -CO-U- ; preferiblemente, cuando X es -O-, y es -U-, -NR-U-, -U-NR- CO-; en donde U se elige entre -Alk- lineal o ramificado, - Alk(OCH2CH2)m-, -(OCH2CH2)m-Alk-, -Alk(OCH2CH2)m-Alk-, (OCH2CH2)m-, -Cicloalquilo-, -Heterocíclico-, -Cicloalquil-Alk-, -Alk- Cicloalquilo-, -Heterocíclico-Alk-, -Alk-Heterocíclico-; en la que m es un número entero elegido entre 1 a 2.000; preferiblemente, U es -Alk- lineal o ramificado, Z es -Alk-; n es 0 ó 1 ; preferiblemente n es 0; T representa H, un grupo protector de tiol tal como Ac, R o SRi, en el que Ri representa H, metilo, Alk, Cicloalquilo, arilo o grupo heterocíclico sustituido opcionalmente, o T representa en la que: Ra, Ra', R17, R9, X, Y, Z, n se definen como anteriormente; preferiblemente, T es H o.SRi, en el que Ri representa Alk, más preferiblemente metilo; R, R' idénticos o diferentes son H o alquilo; Alk representa un alquilo lineal o ramificado; preferiblemente Alk representa (-(CH2.q (CH3)q)p- en el que p representa un número entero de 1 a 10; y q representa un número entero de 0 a 2; preferiblemente, Alk representa -(CH2)- o -C(CH3)2-. o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente, o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros. Los compuestos preferidos pueden elegirse de: (2-Metilsulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E>12E,16Z,18E)-(R)-6-Hidroxi-3,5, 7,9,11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico - Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2, 10, 12, 16,18-pentaenoico] (2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11, 15, 17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico (2-Metildisulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5, 7,9,11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico (2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2, 10, 12, 16,18-pentaenoico - (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi--3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente, o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros. Con el fin de unir el derivado a un agente de fijación a células, el derivado debe incluir un residuo (grupo conector) que permita a los derivados unirse a un agente de fijación a células a través de un enlace tal como un enlace disulfuro, un enlace sulfuro (o llamado en la presente memoria tioéter), un grupo ácido lábil, un grupo fotolábil, un grupo peptidasa lábil, o un grupo esterasa lábil. Los derivados se preparan de manera que contienen un residuo necesario para unir el derivado de leptomicina a un agente de fijación a células, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un grupo ácido lábil, un grupo fotolábil, un grupo peptidasa lábil, o un grupo esterasa lábil. Con el fin de aumentar más la solubilidad en disoluciones acuosas, el grupo conector puede contener un espaciador de polietilenglicol. Preferiblemente, se utiliza una unión sulfuro o disulfuro porque el entorno reducido de la célula diana resulta en la degradación del sulfuro o disulfuro y en la liberación de los derivados con un incremento asociado de la citotoxicidad. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante diferentes rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se sintetizan fácilmente mediante técnicas muy conocidas por el experto en la técnica. Los métodos para sintetizar los derivados de leptomicina que pueden utilizarse en los conjugados citotóxicos de la presente invención , junto con los métodos para conjugar dichos derivados de leptomicina a agentes de fijación a células tales como anticuerpos, están descritos con detalle en la Solicitud de Patente Europea No . 06290948.6, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Análogos de CC-1065 El agente citotóxico utilizado en los conjugados citotóxicos según la presente invención también puede ser CC-1 065 o un derivado de éste. CC-1065 es un antibiótico anti-tumoral potente aislado a partir del medio de cultivo de Streptomyces zelensis. CC-1 065 es aproximadamente 1 .000 veces más potente in vitro que los fármacos anti-cancerígenos utilizados habitualmente, tales como doxorrubicina, metotrexato y vincristina (B .K. Bhuyan et al. , 1 982 , Cáncer Res. , 42, 3532-3537). CC-1065 y sus análogos están descritos en las Patentes de EEU U Nos. 6,372 ,738, 6,340,701 , 5,846,545 y 5,585,499. La potencia citotóxica de CC-1 065 se ha correlacionado con su actividad alquilante y su actividad de unión al ADN e intercalación en el ADN . Estas dos actividades residen en partes separadas de la molécula. Así, la actividad alquilante está contenida en la subunidad de ciclopropapirroloindol (CPI) y la actividad de unión al ADN reside en las dos subunidades de pirroloindol. Aunque CC-1065 tiene ciertas características atractivas como agente citotóxico, tiene limitaciones en el uso terapéutico. La administración de CC-1065 a ratones produjo una hepatotoxicidad retardada que dio lugar a mortalidad en el día 50 después de una única dosis intravenosa de 12.5 pg/kg (V. L. Reynolds et al., 1986, J. Antibiotics, XXIX: 319-334). Esto ha estimulado los esfuerzos para desarrollar análogos que no produzcan una toxicidad retardada y se ha descrito la síntesis de análogos más simples modelados sobre CC-1065 (M.A. Warpehoski er al., 1988, J. Med. Chem., 31: 590-603). En otra serie de análogos, el residuo CPI se reemplazó por un residuo ciclopropabenzindol (CBI) (D.L. Boger er al., 1990, J. Org. Chem., 55: 5823-5833; D.L. Boger ef al., 1991, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120). Estos compuestos mantienen ¡n vitro la elevada potencia del fármaco parental sin causar toxicidad retardada en ratones. Al igual que CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen al surco menor del ADN de un modo covalente para causar la muerte celular. Sin embargo, la evaluación clínica de los análogos más prometedores, Adozelesin y Carzelesin, ha producido resultados decepcionantes (B.F. Foster et al., 1996, Investigational New Drugs, 13: 321-326; I. Wolff et al., 1996, Clin. Cáncer Res., 2: 1717-1723). Estos fármacos manifiestan efectos terapéuticos débiles a causa de su elevada toxicidad sistémica.
La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1 065 se puede mejorar mucho cambiando la distribución in vivo mediante liberación dirigida en el sitio del tumor, lo que resulta en una toxicidad menor en tejidos no diana y, por lo tanto, menor toxicidad sistémica. Con el fin de lograr este objetivo, se han descrito conjugados de análogos y derivados de CC-1 065 con agentes de fijación a células que se dirigen específicamente a células tumorales (Patentes de EEU U; 5,475,092 ; 5,585,499; 5,846,545). Estos conjugados presentan típicamente una alta citotoxicidad específica para la diana in vitro y una actividad anti-tumoral excepcional en modelos de xenoinjertos de tumores humanos en ratones (R.V. J . Chari er al. , 1995 , Cáncer Res. , 55: 4079-4084). Recientemente, se han descrito profármacos de análogos de CC-1 065 con solubilidad incrementada en medio acuoso (Solicitud de Patente Europea No. 06290379.4). En estos profármacos, el grupo fenólico de la parte alquilante de la molécula está protegido con una funcionalidad que convierte al fármaco en estable después de almacenarlo en una disolución acuosa ácida y confiere al fármaco una solubilidad en agua incrementada comparada con el análogo sin proteger. El grupo protector se escinde fácilmente in vivo a pH fisiológico para proporcionar el correspondiente fármaco activo. En los profármacos descritos en EP 06290379.4, el sustituyente fenólico está protegido como un ácido sulfónico que contiene carbamato de fenilo que posee una carga a pH fisiológico y así tiene una solubilidad en agua incrementada. Con el fin de aumentar más la solubilidad en agua se puede introducir un espaciador opcional de polietilenglicol en el conector entre la subunidad de indolilo y el enlace escindible tal como un grupo disulfuro. La introducción de este espaciador no altera la potencia del fármaco. Los métodos para sintetizar los análogos de CC-1065 que pueden utilizarse en los conjugados citotóxicos de la presente invención , junto con los métodos para conjugar los análogos con agentes de fijación a células tales como anticuerpos, están descritos con detalle en EP 06290379.4 (cuyo contenido se incorpora en la presente memoria mediante referencia) y en las Patentes de EEUU Nos. 5,475,092, 5,846, 545, 5,585,499, 6,534,660 y 6,586,61 8 y en las Solicitudes de EEUU Nos. 1 0/1 1 6,053 y 10/265,452. Otros Fármacos Los fármacos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, clorambucil , caliqueamicina, tubulisina y análogos de tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y análogos de dolastatina también son adecuados para la preparación de los conjugados de la presente invención . Las moléculas de fármaco también pueden unirse a las moléculas de anticuerpo mediante una molécula transportadora intermedia tal como albúmina sérica. Los compuestos de Doxarrubicina y Danorrubicina, como se describen , por ejemplo, en la Patente de EEUU No. 6,630, 579, también pueden ser agentes citotóxicos útiles. Composición Terapéutica La invención también se refiere a una composición terapéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente. En una modalidad , dicha composición farmacéutica es para el tratamiento del cáncer, incluyendo los siguientes, pero sin limitarse a ellos: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñon, hígado, pulmón , ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides y piel ; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de la línea linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de la l ínea mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal , incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal , incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarama y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular tiroide y teratocarcinoma y otros cánceres todavía por determinar en los que se EphA se expresa de manera predominante. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se utilizan para el tratamiento de cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñon , páncreas, ovario, cuello del útero y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, sarcoma, cabeza y cuello, glioma, gástrico, hígado y otros carcinomas en los que se expresa EphA. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. En otra modalidad , dicha composición farmacéutica se refiere a otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injertos tales como rechazo de trasplante renal , rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardiaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad de injerto contra anfitrión ; infecciones virales tales como infección por mV, infección por VI H , SI DA etc. ; e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amibiasis, esquistosomiasis y otras determinadas por un experto en la técnica. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen : una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención y - un vehículo aceptable farmacéuticamente, que puede ser inerte o activo fisiológicamente. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "vehículos aceptables farmacéuticamente" incluye todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos y semejantes que son compatibles fisiológicamente. Los ejemplos de veh ículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incl uyen uno o más de agua , disolución salina , disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa , glicerol , etanol y semejantes, así como una combinación de éstos. En muchos casos, será preferible inclui r en la composición agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes, o cloruro sódico. En particular, los ejemplos relevantes de veh ículo adecuado incluyen: ( 1 ) disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH ~ 7.4, conteniendo o no aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano , (2 ) disol ución sali na al 0.9% (cloruro sódico al 0.9% p/v (NaCI)) y (3) dextrosa al 5% (p/v); y también puede contener un antioxidante tal como tri ptami na y un agente estabil izante tal como Tween 20. Las composiciones de la presente memoria también pueden contener un agente terapéutico más, según sea necesario para el trastorno particular que se está tratando. Preferiblemente, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención y el compuesto activo adicional tend rán actividades complementarias, q ue no se perjudiquen entre sí . En una modalidad preferida , el agente terapéutico adicional es un antagonista del factor de crecimiento de fibroblastos ( FG F), factor de crecim iento de hepatocitos ( HG F), factor tisular (TF), proteína C , proteína S , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDG F), o receptor H E R2. Las composiciones de la invención pueden estar en diferentes formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación l íquidas , semi-sólidas y sólidas, aunque la forma preferida depende del modo de administración pretendido y de la aplicación terapéutica . Las composiciones típicamente preferidas están en la forma de disoluciones inyectables o para infusión . El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, i ntramuscular, intraperitoneal , subcutáneo). En una modalidad preferida , las composiciones de la invención se administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo . En otra modalidad preferida, se inyectan por vía intramuscular, subcutánea , intra-articular, intrasinovial , intratumoral , peritumoral , intralesional , o perilesional , para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Las composiciones estériles para la administración parenteral pueden prepararse incorporando el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conj ugado de anticuerpo de la presente invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, seguido de esterilización mediante microfiltración . Como disolvente o veh ículo , puede utilizarse agua, disolución salina , disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa , glicerol , etanol y semejantes , así como una combinación de éstos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes, o cloruro sódico. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. Las composiciones estériles para la administración parenteral también pueden prepararse en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento de su utilización en agua estéril o en cualquier otro medio inyectable estéril . El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención también puede administrarse oralmente. Como composiciones sólidas para la administración oral pueden utilizarse comprimidos, pastillas, polvos (cápsulas de gelatina, sobres) o gránulos. En estas composiciones, el ingrediente activo según la invención se mezcla con uno o más diluyentes inertes tales como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo una corriente de argón . Estas composiciones también pueden comprender sustancias diferentes de los diluyentes, por ejemplo, uno o más lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un colorante, un recubrimiento (comprimidos recubiertos con azúcar) o un glaseado. Como composiciones líquidas para la administración oral , pueden utilizarse disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires aceptables farmacéuticamente que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol , glicerol , aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas a los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, saporíferos o estabilizantes. Las dosis dependen del efecto deseado, la duración del tratamiento y la vía de administración utilizada; generalmente son entre 5 mg y 1 ,000 mg por d ía oralmente para un adulto con dosis unitarias en el intervalo de 1 mg a 250 mg de la sustancia activa. En general , el médico determinará la dosis adecuada dependiendo de la edad , peso y cualquier otro factor específico del sujeto que se va a tratar. Métodos terapéuticos de utilización En otra modalidad , la presente invención proporciona un método para inhibir la actividad del receptor EphA2 mediante la administración de un anticuerpo que antagoniza dicho receptor EphA2 , a un paciente que lo necesita. Cualquiera de los tipos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, o conjugados citotóxicos de la invención, pueden utilizarse terapéuticamente. La invención incluye así la utilización de anticuerpos antagonistas anti-EphA2, fragmentos de éstos, o conjugados citotóxicos de éstos como medicamentos. En una modalidad preferida, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados citotóxicos de la invención se utilizan para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una modalidad más preferida, una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente y que contiene un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado citotóxico de la invención , se utiliza para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una modalidad, el trastorno es un cáncer. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y conjugados citotóxicos de la invención también pueden utilizarse para tratar la neovascularización de dicho tumor canceroso. Según esto, las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento o prevención de diferentes cánceres, incluyendo los siguientes, pero sin limitarse a ellos: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroide y piel ; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de la l ínea linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de la línea mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal , incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma , seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarama y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular tiroide y teratocarcinoma y otros cánceres todavía por determinar en los que se EphA se expresa de manera predominante. En una modalidad preferida, el cáncer es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñon, páncreas, útero, ovario, cuello del útero y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, sarcoma, cabeza y cuello, glioma, gástrico, hígado y otros carcinomas en los que se expresa EphA. En otra modalidad , dicha composición farmacéutica se refiere a otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoi nmunes, tales como lu pus sistémico , artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injertos tales como rechazo de trasplante renal , rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardiaco y rechazo de trasplante de médula ósea ; enfermedad de injerto contra anfitrión ; infecciones virales tales como i nfección por mV, infección por VI H , S I DA etc. ; e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amibiasis, esquistosomiasis y otras determinadas por un experto en la técnica . De manera similar, la presente invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de poblaciones cel ulares seleccionadas que comprende poner en contacto las células d iana , o tejido que contiene las células diana , con una cantidad eficaz de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención , o un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o agente terapéutico que comprende un conjugado citotóxico, bien solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos. El método para inhibir el crecimiento de poblaciones cel ulares seleccionadas puede ponerse en práctica in vitro, in vivo o ex vivo. Tal y como se utiliza en la presente memoria , "inhibi r el creci miento" significa ralentizar el crecimiento de una célula , d isminuir la viabilidad cel ular, prod ucir la muerte de una cél ula , lisar una cél ula e i nducir la muerte celular, en u n periodo de tiempo corto o largo . Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para destruir células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para destruir células T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD); tratamientos de cultivos celulares para matar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para destruir variantes que expresan un antígeno indeseado. Las condiciones de la utilización no clínica in vitro las determina fácilmente el experto en la técnica. Los ejemplos de utilización clínica ex vivo son para eliminar células tumorales o células linfoides de la médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento del cáncer o en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, o para eliminar células T y otras células linfoides de médula ósea autóloga o alogénica o de tejidos antes del trasplante para prevenir la enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD). El tratamiento puede realizarse como sigue. Se recoge la médula ósea del paciente o de otro individuo y se incuba en medio que contiene suero al que se añade el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones varían de aproximadamente 1 0 µ? a 1 pM , durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, las determinará fácilmente un experto en la técnica. Después de la incubación , las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por infusión i .v. según métodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como un curso de quimioterapia ablativa o irradiación de todo el cuerpo entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de la médula ósea tratadas se conservan congeladas en nitrógeno l íquido usando un equipo médico convencional . Para la utilización clínica in vivo, el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo que se fija al epítopo, o el conjugado citotóxico de la invención se proporcionarán como disoluciones que se han ensayado para determinar su esterilidad y niveles de endotoxinas. Los ejemplos de protocolos adecuados para la administración de los conjugados citotóxicos son los siguientes. Los conjugados se administran semanalmente durante 4 semanas como un bolo i .v. cada semana. Las dosis del bolo se proporcionan en 50 a 1 00 mi de disolución salina normal a la que pueden añadirse 5 a 10 mi de albúmina de suero humano. Las dosis serán de 1 0 pg a 1 00 mg por administración , i.v. (intervalo de 100 ng a 1 mg/kg por día). Más preferiblemente, las dosis variarán de 50 pg a 30 mg. Lo más preferiblemente, las dosis variarán de 1 mg a 20 mg. Después de cuatro semanas de tratamiento, el paciente puede continuar recibiendo el tratamiento semanalmente. El experto en la técnica puede determinar los protocolos clínicos específicos con respecto a la vía de administración, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc. , cuando lo permita la situación clínica. Diagnóstico Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención también pueden utilizarse para detectar EphA2 en una muestra biológica in vitro o in vivo. En una modalidad , el anti-EphA2 de la invención se utiliza para determinar el nivel de EphA2 en un tejido o en células obtenidas del tejido. En una modalidad preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una modalidad preferida del método, el tejido es un tumor o una biopsia de éste. En una modalidad preferida del método, en primer lugar se obtiene un tejido o una biopsia de éste de un paciente y los niveles de EphA2 en el tejido o biopsia pueden determinarse en un inmunoensayo con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención. El tejido o biopsia de éste puede congelarse o fijarse. El mismo método puede utilizarse para determinar otras propiedades de la proteína EphA2, tal como su nivel de fosforilación en tirosina, niveles en la superficie celular, o localización celular. El método descrito anteriormente puede utilizarse para diagnosticar un cáncer en un sujeto que se sabe o sospecha que tiene un cáncer, en el que el nivel de EphA2 determinado en dicho paciente se compara con el de un sujeto o estándar de referencia normal. Dicho método puede utilizarse para determinar si un tumor expresa EphA2, lo que puede sugerir que el tumor responderá bien al tratamiento con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el tumor es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata , riñon, páncreas, útero, ovario, cuello del útero y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, sarcoma, glioma, gástrico, hígado, cabeza y cuello u otros carcinomas en los que se expresa EphA2 y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA2 se expresa de manera predominante. La presente invención proporciona además anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y fragmentos de éstos que se fijan al epítopo que se marcan además para utilizarse en aplicaciones de investigación o diagnósticas. En modalidades preferidas, el mareaje es un mareaje radiactivo, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen o un ion metálico. También se proporciona un método para el diagnóstico en el que dichos anticuerpos o fragmentos de éstos que se fijan al epítopo marcados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene cáncer y se determina o evalúa la distribución del mareaje en el cuerpo del sujeto. Estuche La presente invención también incluye estuches que comprenden, por ejemplo, un conjugado citotóxico descrito e instrucciones para la utilización del conjugado citotóxico para matar tipos celulares particulares. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para utilizar los conjugados citotóxicos in vitro, in vivo o ex vivo. Típicamente, el estuche tendrá un compartimento que contiene el conjugado citotóxico. El conjugado citotóxico puede estar en forma liofilizada, en forma líquida, o en otra forma adecuada para incluirse en un estuche. El estuche también puede contener elementos adicionales necesarios para llevar a la práctica el método descrito en las instrucciones del estuche, tal como disolución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinarse con el conjugado citotóxico antes de administrarlo a un paciente y medios que faciliten la administración del conjugado a un paciente. Ejemplos Ejemplo 1 Generación de Hibridomas de Anticuerpo Monoclonal Anti-EphA2 Se inmunizaron cuatro ratones BALB/c VAF con células 300-1 9 transfectadas con EphA2 humano, una l ínea celular pre-B obtenida de un ratón BALB/c. Las células transfectadas de manera estable que sobreexpresan el antígéno se generaron mediante transfección de células 300-19 con el ADNc de longitud completa de EphA2 humano y se seleccionaron los clones con una alta expresión mediante citometría de flujo. El clon 4-6, un clon que expresa fuertemente el receptor EphA2 humano en la superficie celular, se seleccionó como inmunógeno para la inmunización de ratones y para el cribado de anticuerpos en los hibridomas. Las células transfectadas con EphA2 se mantuvieron en el medio de selección que contiene G41 8 a una concentración final de 1 mg/mL y se analizaron regularmente para detectar la expresión de EphA2 utilizando un anticuerpo disponible comercialmente. Se les inyectaron subcutáneamente a los ratones Balb/c aproximadamente 5x1 06 células 300-1 9 transfectadas con EphA2 en 200 µ?_ de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) por ratón. Las inyecciones se realizan cada 2-3 semanas mediante protocolos de inmunización estándar utilizados en ImmunoGen, Inc. Tres días antes de la fusión celular, los ratones se reforzaron intraperitonealmente una vez más con la misma dosis de antígeno y se sacrificaron para la preparación de células de bazo según los protocolos estándar para los procedimientos de utilización de animales en el día de la fusión celular. Se recogió el bazo del ratón inmunizado en condiciones quirúrgicas estériles y se trituró entre dos portaobjetos microscópicos estériles y fríos para obtener una suspensión de células separadas en medio RPMI-1640. Los esplenocitos se sedimentaron y se lavaron dos veces con medio RPMI-1640 antes de la fusión celular. Las células del bazo se mezclaron y se fusionaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. et al., 1979. J. Immunol., 123: 1548-1550) utilizando polietilen glicol-1500 como fusógeno (Roche 783 641). Después de la fusión celular y centrifugación, las células se suspendieron en medio RPMI-1640 completo (200 mL) que contiene suplemento hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT) (Sigma H-0262) y se plaquearon en diez placas de 96 pocilios de fondo plano (Corning-Costar 3596, 200 µ? de suspensión celular por pocilio). Después de incubar a 37°C, 5% C02 durante 5 días, se eliminaron 100 µ? del sobrenadante del cultivo de cada pocilio de las placas y se reemplazaron por un volumen igual de medio RPMI-1640 completo que contiene suplemento hipoxantina-ti midina ( HT) (Sigma H-01 37). La incubación (en una atmósfera de 5% C02 a 37° C) se continuó hasta que los clones de hibridoma hubieron formado colonias lo suficientemente grandes para cri bar el anticuerpo. En el d ía 1 0 después de la fusión cuando las células de hibridoma hubieron crecido hasta la mitad de la confluencia en los pocilios y el sobrenadante hubo cambiado a un color naranja , los sobrenadantes de los hibridomas se muestrearon de las placas de fusión para el cribado de anticuerpos mediante inmu noensayos. Para el cribado preliminar, los sobrenadantes de hibridomas se analizaron en células transfectadas con EphA2 frente a las células 300-1 9 párenteles mediante citometría de flujo . Las células se tiñeron con 50 iL de sobrenadante de hibridoma, seguido de incubación con conjugado de IgG de cabra anti-ratón-fluoresceína ( H+L) y se analizaron mediante citometría de flujo con un equipo Becton Dickinson FACSCal ibur o FACSArray. Los clones de hi bridoma que resultaron positivos para las células transfectadas con EphA2 pero negativos para las células 300-1 9 se seleccionaron , expandieron , congelaron para almacenarlos, o subclonaron mediante diluciones limitantes para obtener una población monoclonal . Los anticuerpos específicos secretados por las cél ulas de hibridoma se isotiparon utilizando reactivos de isotipado disponi bles comercialmente (Roche 1 493027). En base a los datos de citometría de fl ujo , se identificaron y seleccionaron 29 clones de hibridoma , que fueron reactivos específicamente con células transfectadas con EphA2 humano pero no con las células 300-19 párenteles, de la inmunización de ratones con antígenos EphA2 humanos. Ejemplo 2 Caracterización de la Unión de los Anticuerpos Anti-EphA2. 37.3D7. 37.1F5. 53.2H11. EphA2-N1 y EphA2-N2. La fijación específica de cada uno de los anticuerpos anti-EphA2 purificados, 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 se demostró mediante separación de células activada por fluorescencia (FACS) utilizando células que sobreexpresan EphA2 humano y mediante la utilización de células que no expresan EphA2 (FIGURA 1A, B y C). La incubación del anticuerpo 37.3D7, o del anticuerpo 37.1 F5 o del anticuerpo 53.2H11 (60 nM) en 100 µ? de tampón FACS frío (1mg/mL BSA en medio MEM de Dulbecco) se realizó utilizando células que sobreexpresan EphA2 y células que no expresan EphA2 en una placa de 96 pocilios de fondo redondo en hielo. Después de 1 h, las células se sedimentaron mediante centrifugación y se lavaron con tampón FACS frío y se incubaron con el conjugado anticuerpo IgG de cabra anti-ratón-FITC (100 µ?, 6 g/ml en tampón FACS) en hielo durante 1 h. Las células se sedimentaron, se lavaron y se resuspendieron en 200 iL de disolución de formaldehído al 1% en PBS. Las muestras de células se analizaron utilizando un lector FACSCalibur (BD Biosciences). Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células que sobreexpresan EphA2 humano con el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 1 , en contraste con un desplazamiento insignificante después de la incubación de las células que no expresan EphA2 humano con el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 1 (figura 1 A, 1 B y 1 C), lo que demuestra que los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 se unían selectivamente a EphA2 humano. El anticuerpo anti-EphA2 utilizado como control positivo, B2D6 (Upstate), mostró un desplazamiento de la fluorescencia similar después de incubaciones con células que sobreexpresaban EphA2 humano (figura 1 A). También se observó un fuerte desplazamiento de la fluorescencia mediante el ensayo FACS utilizando 37.3D7 y células de cáncer humano, tal como células de cáncer de mama humano M DA-MB-231 , células de cáncer de colon humano HT-29, células de cáncer pancreático humano BxPC3, lo que muestra que el anticuerpo 37.3D7 se une a EphA2 humano en la superficie de células tumorales humanas (figura 2). También se obtuvieron datos similares utilizando los anticuerpos 37.1 F5 y 53.2H 1 1 con líneas celulares tumorales humanas. Las constantes de disociación aparentes (KD) para la unión de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 a EphA2 humano en la superficie de las células se determinaron mediante ensayos FACS de la unión del anticuerpo a diferentes concentraciones a las células que sobreexpresan EphA2 humano y a células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (figura 3). Los valores de KD se estimaron mediante regresión no lineal para la unión a un sitio. Las curvas de fijación proporcionaron los valores aparentes de KD de 0.3 nM para el anticuerpo 37.3D7, 0.07 nM para el anticuerpo 37.1 F5 y 0.14 nM para el anticuerpo 53.2H 1 1 (figuras 3A, 3C y 3E). Utilizando el mismo protocolo experimental, se determinaron los valores aparentes de kD de 0.18 nM y 0.05 nM para EphA2-N 1 y EphA2-N2, respectivamente. Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células que sobreexpresan EphA2 murino o EphA2 de rata con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H 1 1 , en contraste con un desplazamiento insignificante después de la incubación de células que no expresan EphA2 murino o EphA2 de rata con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H 1 1 (FIGURA 4), lo que demuestra que los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H1 1 también se unen a EphA2 murino y EphA2 de rata. También se observó un fuerte desplazamiento de la fluorescencia mediante el ensayo FACS utilizando el anticuerpo 37.3D7 o 37.1 F5 o 53.2H 1 1 con células epiteliales de mono (Cercopithecus aethiops) VERO (FIGURA 5A), lo que muestra que 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 también se unen a EphA2 de mono. Los valores aparentes de KD se estimaron mediante regresión no lineal para la unión a un sitio. Las curvas de fijación mediante el ensayo FACS proporcionaron valores de KD de 0, 1 5 nM para 37.3D7, 0.05 nM para 37.1 F5 y 0.07 nM para 53.2H 1 1 en células de mono (figura 5B, 5D y 5F). Ejemplo 3 Inhibición de la Unión de Efrina A1 a células MDA-MB-231 por los Anticuerpos 37.3D7. 37.1 F5. 53.2H1 1 . EphA2-N1 v EphA2-N2 La unión de efrinaAl a células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se inhibió por los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 (FIGURA 6). Las células MDA-MB-231 se incubaron con o sin 5 pg/mL del anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 1 durante 2 h, seguido de incubación con 100 ng/mL de efrinaAl biotinilada durante 30 min a 4°C. Las células se lavaron dos veces con medio sin suero para eliminar la efrinaAl biotinilada sin unir y se Usaron en tampón 50 mM HEPES, pH 7,4, que contiene N P-40 al 1 % e inhibidores de proteasas. Se recubrieron placas de ELISA lmmulon-2HB con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-EphA2 (D7, Upstate) y se utilizaron para capturar el EphA2 y la biotina-efrinaAl unida del lisado. La unión del anticuerpo recubierto al dominio citoplásmico C terminal de EphA2 no interfirió con la unión de biotina-efrina A1 al dominio extracelular de EphA2. Los pocilios se lavaron, se incubaron con conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano, se lavaron de nuevo y se revelaron con el sustrato ABTS/H202. La inhibición de la unión de efrinaAl a las células M DA-MB-231 por 5 pg/mL del anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 fue esencialmente cuantitativa; la señal fue prácticamente equivalente a la de la señal de fondo del ELISA obtenida utilizando un control que carecía de biotina-efrina A1 (Fig 6A, 6B y 6C). Tanto EphA2-N 1 como Epha2-N2 fueron capaces de inhibir la unión de efrinaAl humana a células MDA-MB-231 igual que 37.3D7. Ejemplo 4 Inhibición de la Señalización Celular Mediada por EphA2 por los Anticuerpos 37.3D7.37.1F5.53.2H11. EphA2-N1 y EphA2-N2 El tratamiento de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 con el anticuerpo 37.3D7, o 37.1F5 inhibió completamente la señalización intracelular del receptor EphA2 como se muestra mediante la inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 (figura 7A) y mediante la inhibición de la fosforilación de efectores posteriores tal como Akt (figura 7B). El tratamiento de células de cáncer pancreático CFPAC-1 con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11 inhibió completamente la señalización intracelular del receptor EphA2 como se muestra mediante la inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 (figura 7C). En las figuras 7A y 7C, las células mamarias MDA-MB-231 o las células pancreáticas CFPAC-1 se crecieron en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con suero durante 3 días y se cultivaron en medio sin suero durante 12-14 h. Las células desprovistas de suero se trataron con 15 pg/mL del anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11 o con IgG! control durante 2 h, seguido de estimulación con 1 pg/mL de efrina A1-Fc (R&D) durante 10 min a 37°C. Las células se Usaron en tampón de lisis enfriado en hielo que contiene inhibidores de proteasas y fosfatases (50 mM tampón HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 1 mM ortovanadato sódico, 100 mM fluoruro sódico, 10 mM pirofosfato sódico, 2.5 mM EDTA, 10 µ? leupeptina, 5 µ? pepstatina, 1 mM PMSF, 5 mM benzamidina y 5 pg/mL aprotinina). Los Usados se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-EphA2 D7 (Upstate) acoplado a lechos de proteína A/G. El EphA2 inmuno-precipitado se resolvió en un gel de poliacrilamida con SDS y transferencia Northern con anticuerpo monoclonal específico de fosfotirosina, 4G 10 (Cell Signaling Technology). Para evaluar el nivel de la proteína EphA2 en cada muestra inmunoprecipitada, la misma membrana se volvió a ensayar con anticuerpo anti-EphA2 , D7 (Upstate). La utilización de un anticuerpo control mostró que no existía inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 estimulada por efrina A1 (Figura 7C). Por el contrario, se obtuvo una inhibición completa de la autofosforilación del receptor EphA2 estimulada por efrinaAl después de tratamiento con el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 1 (Figura 7A y 7C). La activación estimulada por efrina A1 de los efectores posteriores, tal como Akt, también se inhibió en células MDA-MB-231 por el anticuerpo 37.3D7 o 37.1 F5, como se muestra utilizando transferencias Western de los Usados y anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfo-Ser473 Akt (Cell Signaling Technology) (figura 7B). Los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H 1 1 no estimularon por sí mismos la autofosforilación de EphA2 en células de cáncer de mama humano M DA-MB-231 , en contraste con el efecto estimulador de efrinaAl sobre la autofosforilación de EphA2 en células MDA-MB-231 (figura 8A y 8B). Se obtuvieron datos similares con el anticuerpo 37.1 F5 utilizando células M DA-MB-231 . En la FIGU RA 8, las células MDA-MB-231 se crecieron en medio regular con suero durante 3 d ías y se cultivaron en medio sin suero durante 1 2-1 4 h. Las células desprovistas de suero se trataron con 1 pg/mL de efrinaA1 -Fc ó 1 5 Mg/mL de anticuerpo 37.3D7 o 53.2H1 1 durante 10 min. Los Usados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-EphA2 , D7 (Upstate). Después de separar en un gel de poliacrilamida con SDS, la transferencia se ensayó con el anticuerpo anti-fosfotirosina, 4G 10 (Cell Signaling Technology) y con el anticuerpo anti-EphA2 D7 (Upstate). Se obtuvieron resultados similares tanto con EphA2-N 1 como con EphA2-N2 en células de cáncer de mama humano M DA-M B-231 , ya que ningún anticuerpo estimula la autofosforilación de EphA2 por sí mismo, mientras que cada uno de ellos impide la fosforilación del receptor EphA2 dependiente de efrinaAL Los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H 1 1 , EphA2-N 1 y EphA2-N2 son, por lo tanto, únicos entre todos los anticuerpos anti-EphA2 conocidos ya que inhiben eficazmente la señalización intracelular de EphA2 estimulada por efrinaAL Ejemplo 5 Inhibición del Crecimiento v Supervivencia Estimu lados por Suero de Células Tumorales Humanas por los Anticuerpos 37.3D7 v 53.2H 1 1 Se analizaron diferentes líneas celulares tumorales humanas en condiciones sin suero para determinar su respuesta de crecimiento y supervivencia al suero en presencia del anticuerpo 37.3D7 o 53.2H 1 1 . Se plaquearon aproximadamente 3.000 células/pocilio en una placa de 96 pocilios en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con suero, que se reemplazó por medio sin suero al día siguiente. Después de un día de crecimiento en medio sin suero, las células se incubaron con 15 pg/mL del anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11 o IgGi control seguido de la adición de suero para obtener una concentración final de 1% ó 1.5% de suero. Se dejó que las células crecieran durante 3 días más. Se añadió una disolución de MTT [bromuro de 3-(4, 5)-dimetiltiazol-2-il-2,3-difeniltetrazolio; 25 µ?_ de una disolución 5 mg/mL en PBS] y las células se volvieron a poner en el incubador durante 2-3 h. El medio se eliminó y se reemplazó por 100 µ?_ de DMSO, se mezcló y se determinó la absorbancia de la placa a 545 nm. Diferentes líneas celulares tumorales humanas mostraron una respuesta de crecimiento y supervivencia después de la adición de suero que fue inhibida significativamente por el anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11. Como ejemplos, se muestran los descubrimientos con las líneas celulares tumorales de colon, HT-29, LoVo; la línea celular tumoral pancreática, CFPAC-2, BxPC3; y de melanoma UACC-257. El anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia estimulados por el suero de células de cáncer de colon humano HT-29 (FIGURA 9A). En otro experimento, el anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia estimulados por suero de células de cáncer pancreático humano BxPC3 de una manera dependiente de la dosis con un valor de Cl50 de 4 nM (FIGURA 10A). Además, el anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia estimulados por suero de células de cáncer de colon humano LoVo (figura 9B), células de cáncer pancreático humano CFPAC-1 (figura 9C) y células de cáncer de melanoma UACC-257 (figura 9D) y el anticuerpo 53.2H1 1 inhibió el crecimiento y supervivencia estimulados por suero o EGF de células LoVo de una manera dependiente de la dosis con un valor de Cl50 de 2 nM (figura 1 0B y 1 0C). En la figura 1 0, los valores de DO545 para muestras tratadas con 0% de suero se ajustaron al 1 00% de inhibición y el 0% de inhibición se ajustó utilizando muestras tratadas con 1 ,5% de suero o 1 0 ng/ml de EGF. Ninguno de los anticuerpos anti-EphA2 mostrados previamente tiene actividades inhibidoras sobre el crecimiento dependiente del anclaje (monocapa) de células tumorales humanas. Por lo tanto , los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H 1 1 son únicos en su capacidad de inhibir el crecimiento dependiente del anclaje (crecimiento en monocapa) de células tumorales humanas. Ejemplo 6 Inhibición de la Señalización Celular Mediada por VEGF v del Crecimiento y Supervivencia Estimulados por VEGF de Células Endoteliales de Vena de Cordón Umbilical H umano (HUVEC) por el Anticuerpo 37.3D7. 37.1 F5 y 53.2H 1 1 Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células HUVEC con el anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H 1 1 mediante análisis FACS, lo que indica que los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H 1 1 se unen a los receptores EphA2 expresados en células HUVEC. Las constantes de disociación aparentes (KD) para la unión de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 a EphA2 en la superficie de las células se determinaron a partir de las curvas de fijación establecidas con ensayos de unión FACS realizados a diferentes concentraciones y se muestran en la FIGURA 11. Se estimó un valor de KD = 0.3 nM para el anticuerpo 37.3D7 mediante regresión no lineal para la unión a un sitio (FIGURA 11), que es similar al valor de KD de la unión del anticuerpo 37.3D7 a células cancerosas humanas. De manera similar, se obtuvo un valor de KD = 0.01 nM para el anticuerpo 37.1 F5 y un valor de KD = 0.06 nM para el anticuerpo 53.2H11. Esto indica que los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 se unen específicamente a las células HUVEC a través del receptor EphA2. El anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia de HUVEC inducidos por VEGF. La actividad es similar o mejor que la de Avastin®, un anticuerpo anti-VEGF bloqueante (Genentech) (figura 12). Un anticuerpo anti-EphA2 agonista no inhibió el crecimiento y supervivencia de HUVEC inducidos por VEGF (FIGURA 12). En la figura 12, las células HUVEC se crecieron en medio EBM-2 con suero y suplementos de célula endotelial (EC) (Clonetics) durante 3 días. Las células se cultivaron en medio sin suero más suplementos de crecimiento EC sin VEGF durante 12-14 h. Después de estar sin suero, las células se estimularon con 5 ng/mL de VEGF más 0.4% de suero con o sin los anticuerpos indicados (100 pg/mL). Los efectos de los anticuerpos sobre el crecimiento y supervivencia de las células HUVEC inducidos por VEGF se determinaron 3 días después de la adición de los anticuerpos y VEGF utilizando el ensayo MTT como se describe en el Ejemplo 5. El porcentaje de inhibición del crecimiento y supervivencia mediados por VEGF por los anticuerpos se muestra en la figura 1 2. Los valores de DO545 para las muestras tratadas con vehículo se ajustaron al 0% de inhibición y el 1 00% de inhibición se ajustó utilizando muestras sin VEGF. El hecho de que el tratamiento de las células HUVEC con el anticuerpo 37.3D7 inhibe la señalización intracelular del receptor EphA2 se mostró determinando la inhibición de la fosforilación de sus efectores tal como Akt. La inhibición es similar a la de Avastin®, un anticuerpo anti-VEGF bloqueante (Genentech) (FIGURA 1 3). El anticuerpo anti-EphA2 agonista no inhibe la fosforilación de Akt inducida por VEG F en las células H UVEC. En la FIGURA 1 3, las células HUVEC se pusieron durante 12-1 4 h en medio sin suero más suplementos EC sin VEGF. Las células se trataron con anticuerpos (20 g/mL) durante 1 h antes de la adición de VEGF ( 1 00 ng/mL). Las células se Usaron 1 5 min después de la adición de VEGF y las inmunotransferencias se analizaron con los anticuerpos indicados. Ejemplo 7 Supresión del Crecimiento del Xenoinjerto de Cáncer de Colon Humano HT-29 en Ratones por el Anticuerpo 37.3D7 (figura 14) Se establecieron xenoinjertos de cáncer de colon humano HT-29 en ratones SCI D mediante la inyección subcutánea de 2 x 1 06 células HT-29. Cuando los ratones mostraron xenoinjertos de tumores HT-29 palpables (50 mm3), se trataron con el anticuerpo 37.3D7 o con un anticuerpo control (IgG ( 1 mg/ratón, i. v. , dos veces por semana) o con PBS solo ( 1 00 pL/ratón, i . v. , dos veces por semana). El crecimiento de los tumores se ralentizó significativamente mediante el tratamiento con el anticuerpo 37.3D7 comparado con un tratamiento con el anticuerpo control o PBS solo. No se observó toxicidad del anticuerpo 37.3D7, en base a determinaciones de los pesos de los ratones. Ejemplo 8 In hibición de metástasis mamarias tempranas M DA-MB-231 por el anticuerpo anti-EphA2 hu53.2H 1 1 Se evaluó la actividad anti-tumoral del anticuerpo anti-EphA2 hu532H 1 1 a un nivel de dosis frente a tumor mamario temprano MDA-MB-231 implantado subcutáneamente en ratones SCI D hembra. También se investigó el efecto de este anticuerpo en la invasión del tumor M DA-M B-231 en los nodulos linfáticos axial e inguinal superficiales. Para llevar esto a cabo, se administró hu532H 1 1 a 40 mg/kg/adm mediante vía iv, en los d ías 1 , 5, 8, 12, 1 5, 1 9, 22 y 26 después del implante del tumor. El grupo control no se trató. Para la evaluación de la actividad anti-tumoral de hu532H 1 1 , los animales se pesaron diariamente y los tumores se midieron 2-3 veces por semana mediante un soporte corrector. Los pesos de los tumores se calcularon utilizando la fórmula masa (mg) = [longitud (mm) x anchura (mm)2]/2. La actividad antitumoral se evaluó según 3 criterios: 1 ) incluyendo T/C, definido como el peso medio del tumor (mg) de un grupo tratado dividido por el peso medio del tumor del control no tratado; 2) la determinación del retraso del crecimiento del tumor (T-C), en el que T se define como el tiempo medio en d ías requerido para los tumores del grupo de tratamiento para alcanzar 750 mg y C es el tiempo medio para los tumores del grupo control para alcanzar el mismo tamaño y 3) la muerte de la célula tumoral se define como Iog10 de la muerte celular (bruto) = [valor T-C en días]/(Td x 3,32). T-C se ha definido anteriormente y Td es el tiempo en el que el volumen del tumor se duplica en d ías de los tumores control , que se estima a partir de la línea recta mejor ajustada a partir de un gráfico log-lineal de crecimiento de los tumores del grupo control en crecimiento exponencial (intervalo 100-1 ,000 mg). En un estudio paralelo, los animales se trataron como se ha descrito anteriormente y en el día 28 después del implante del tumor todos los ratones se sacrificaron y se recogieron los nodulos linfáticos axilares e inguinales (tamaño medio del tumor en el grupo control = 1 .558 mg). Se utilizó el anticuerpo humano Ki67 para identificar específicamente las células tumorales M DA-MB-231 en los nodulos linfáticos mediante inmunotinción. El área superficial de las metástasis de los nodulos linfáticos se calculó (media de 2 secciones) como S = área superficial de Ki67 humano x 1 00 / área superficial del nodulo linfático. Eficacia en tumor primario: hu532H 1 1 se toleró bien a 40 mg/kg/adm (dosis total 320 mg/kg) con un cambio de +8.9% en el peso corporal en el día 27.
Esta dosis retardó el crecimiento tumoral del tumor primario (T/C = 27% y 1.0 log de muerte celular bruta), aunque el tumor no respondió a terapia. Actividad anti-metastásica: hu532H11 indujo una reducción de la superficie de las metástasis (> 50 %) tanto en los nódulos linfáticos axilares como inguinales. En conclusión, en ratones que presentan tumor mamario MDA-MB-231, hu532H11 retrasa el crecimiento del tumor primario tratado en un estadio temprano del desarrollo del tumor (T/C = 27% y 1.0 log de muerte celular bruta) y reduce la superficie de las metástasis (> 50 %) tanto en los nódulos linfáticos axilares como inguinales. En otro estudio, la actividad de un anticuerpo anti-EphA2 puede evaluarse en el modelo de "metástasis" de hígado de cáncer de colon humano HT29. El anticuerpo murino anti-EphA2 53.2H11 se administra iv, dos veces por semana, desde el día 4 después del implante intraesplénico de células HT29 en ratones SCID hembra (n = 20 ratones por grupo para animales que no presentan tumores (NTBA), tratados y control). En el día 50, 3 días después de la 13° administración de anti-EphA2, los ratones se necropsiaron y se pesaron sus bazos e hígados para evaluar la masa tumoral en el sitio del tumor primario (bazo) o en el sitio de la metástasis (hígado). También se evaluó el número de metástasis. Los datos se analizaron utilizando herramientas estadísticas conocidas por el experto en la técnica.
El tratamiento con anti-EphA2 a 40 mg/kg/iny (dosis total de 520 mg/kg) se tolera bien . Peso del tumor primario (bazo): Se observa una diferencia significativa en el peso del bazo entre los ratones NTBA y control implantados, siendo éstos mayores. No existe una diferencia significativa entre el peso del bazo de los ratones control implantados y el de los ratones tratados con anti-EphA2. Peso de las metástasis (hígado): el peso del hígado de los ratones control implantados es significativamente mayor que el peso del hígado de NTBA; por otra parte, es significativamente menor en los ratones tratados con anti-EphA2 que en los ratones control implantados. Número de metástasis hepáticas: no se observa una diferencia significativa entre los ratones control implantados y los ratones tratados con anti-EphA2. En conclusión, el implante intraesplénico de adenocarcinoma de colon humano HT-29 induce significativamente un incremento del peso del hígado debido a la carga metastásica tumoral. El tratamiento con anti-EphA2 es capaz de disminuir significativamente la carga metastásica tumoral como se observa por la reducción del peso del hígado de los ratones implantados sin verse afectado el número de metástasis contadas en el hígado. Ejemplo 9 Clonación y Secuenciación de las Cadenas Ligera v Pesada del Anticuerpo 37.1 F5.
Preparación de ARN a partir de células de hibridoma q ue produce el anticuerpo 37.1 F5 Las preparaciones de ARN total se obtuvieron a partir de 5 x 106 células de hibridoma, que producen anticuerpo 37.1 F5, utilizando el estuche RNeasy miniprep de Qiagen. Brevemente, 5 x 106 células se sedimentaron y se resuspendieron en 350 µ?_ de tampón RLT (que contiene 1 % de ß-mercaptoetanol). La suspensión se homogeneizó pasándola a través de una aguja y jeringa de calibre 21 .5 aproximadamente 1 0 - 20 veces o hasta que dejó de ser viscosa. Se añadió etanol (350 pL de etanol acuoso al 70% ) al homogenado, que se mezcló bien . La disolución se transfirió a una columna de centrifugado, situada en un tubo de recogida de 2 mL y se centrifugó a >8.000 x g durante 1 5 segundos. La columna se lavó dos veces con 500 pL de tampón RPE, se transfirió a un tubo nuevo y se eluyó con 30 pL de agua sin ARNasa y una centrifugación de 1 minuto. El eluato (30 pL) se puso de nuevo en la columna para una segunda elución de centrifugado de 1 minuto. Una alícuota del eluato de 30 pL se diluyó con agua y se utilizó para determinar la absorción UV a 260 nm para la cuantificación del ARN . Preparación de ADNc con la reacción de la Transcriptasa Inversa LEU El ADNc de la región variable del anticuerpo 37.1 F5 se generó a partir del ARN total utilizando el estuche Superscriptl l de Invitrogen. Se siguieron exactamente los protocolos del estuche, utilizando hasta 5 pg de ARN total de las mini prep de Qianeasy.
Brevemente, el ARN , 1 µ?_ de cebadores aleatorios y 1 µ?_ de mezcla de dNTP se llevaron hasta 12 µ?_ con agua destilada estéril sin ARNasa y se incubó a 65 °C durante 5 minutos. La mezcla se puso en hielo durante al menos 1 minuto. Después, se añadieron 4 µ?_ de tampón de reacción 5 x, 2 µ?_ de 0.1 M DTT y 1 µ?_ de RNasaOUT y la mezcla se incubó a 25 ° durante 2 minutos en un ciclador térmico MJ Research . El ciclador térmico se detuvo de manera que se pudo añadir 1 µ?_ de enzima Superscripti l y se volvió a poner en marcha durante 10 minutos adicionales a 25 °C antes de cambiar a 55 °C durante 50 minutos. La reacción se inactivo con calor calentando hasta 70 °C durante 1 5 min y el ARN se eliminó mediante la adición de 1 L ARNasa H e incubando a 37 °C durante 20 minutos. Reacciones de PCR degenerada El procedimiento para la primera ronda de reacción de PCR degenerada en el ADNc obtenido a partir de células de hibridoma se basó en los métodos descritos en Wang et al. (2000; J Immunol Methods. ; 233(1 -2): 1 67-77) y Co ef al. ( 1 992; J Immunol. ; 148(4): 149-54). Los cebadores para esta ronda (Tabla 2) contienen sitios de restricción para facilitar la clonación en los plásmidos pBluescriptII . Los componentes de la reacción de PCR (Tabla 3) se mezclaron en hielo en tubos de PCR de pared fina y después se transfirieron a un ciclador térmico MJ research precalentado y detenido a 94 °C. Las reacciones se realizaron utilizando un programa obtenido de Wang et al. (2000; J Immunol Methods. ; 233( 1 - 2): 1 67-77), como sigue: Nombre: Wang45 1 . 94°C 3:00 min 2. 94°C 0: 1 5 seg 3. 45°C 1 :00 min 4. 72°C 2:00 min 5. Ir a 2 29 veces 6. 72°C 6:00 min 7. 4°C hasta el final 8. final Las mezclas de la reacción de PCR se corrieron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1 % , se escindieron las bandas de 300 a 400 pb, se purificaron utilizando mini columnas de ADN de Zymo y se mandaron a Agencourt Biosciences para la secuenciación . Los cebadores de PCR 5' y 3' respectivos se utilizaron como cebadores de secuenciación para generar los ADNc de la región variable de 37.1 F5 a partir de ambas direcciones. Clonación de la secuencia del extremo 5' Debido a que los cebadores degenerados utilizados para clonar las secuencias de ADNc de la región variable de la cadena ligera y pesada de 37.1 F5 alteran las secuencias del extremo 5' , se necesitaron trabajos de secuenciación adicionales para descifrar las secuencias completas. La secuencia de ADNc preliminar obtenida mediante los métodos descritos anteriormente se utilizó para buscar en el sitio NCBI IgBlast (http://www.ncbi . nlm .nih.gov/iqblast/) las secuencias de la l ínea germinal murina de las que se deriva la secuencia de 37.1 F5. Se diseñaron cebadores de PCR (Tabla 4) para hibridar con la secuencia líder del anticuerpo murino de manera que una nueva reacción de PCR pudiera proporcionar el ADNc completo de la región variable, sin alteraciones debidas a los cebadores de PCR. Las reacciones de PCR, las purificaciones de las bandas y la secuenciación se realizaron como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de la línea germinal de las que probablemente derivan la cadena ligera y la cadena pesada de mu37.1 F5, son accesibles con los números de registro de Genbank M US IGKVR3 y AF303839, respectivamente. Análisis peptídico para la confirmación de la secuencia La información de la secuencia de ADNc de la región variable se combinó con la secuencia de la región constante de la l ínea germinal para obtener secuencias de ADNc del anticuerpo de longitud completa. Los pesos moleculares de la cadena pesada y de la cadena ligera se calcularon y se compararon con los pesos moleculares obtenidos mediante análisis LC/MS del anticuerpo murino 37.1 F5. La Tabla 5 proporciona la masa calculada de las secuencias de ADNc de 37.1 F5 LC y HC junto con los valores determinados mediante LC/MS. Las determinaciones del peso molecular son consistentes con las secuencias de ADNc tanto de la cadena ligera como pesada de 37.1 F5. Se utilizó esencialmente el mismo método para clonar las cadenas ligera y pesada de 37.3D7 y 53.2H 1 1 . Los números de registro de Genbank de las secuencias de la línea germinal de las que probablemente derivan la cadena ligera y la cadena pesada de 37.3D7, son respectivamente MM U23121 7 y AF303868. Para 53.2H 1 1 , son respectivamente MM U231 196 y AF303833; para EphA2-N 1 , K021 61 y J00488 respectivamente; y para EphA2-N2, AJ231 222 y J00488 respectivamente. Ejemplo 10 Inhibición del crecimiento de cél ulas tumorales que expresan EphA2 por 37.3D7-SPDB-DM4 humanizado y 53.2H 1 1 -SPDB-DM4 humanizado Los anticuerpos 37.3D7 humanizado y 53.2H 1 1 humanizado se conjugaron con L-DM4 N2 deacetil-N2 (4-metil-4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina utilizando el conector SPDB (ácido 4-[2-piridilditio]butanoico N-hidroxisuccinimda éster). Brevemente, el anticuerpo se modificó a 8 mg/mL con un exceso molar de 5.5 ó 6.5 veces de SPDB para hu53.2H 1 1 y hu37.3D7 respectivamente. La reacción se realizó en el Tampón A (50 mM KP¡/50 mM NaCI/2 mM EDTA, pH 6,5, 95% v/v) con EtOH (5% v/v) durante 90 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo modificado se purificó mediante una columna desaladora SephadexG25 con el Tampón A. Después, el anticuerpo modificado se hizo reaccionar con un exceso molar de 1 ,7 veces de DM4 sobre el conector SPDB . La reacción se realizó a 2.5 mg/mL del anticuerpo en el Tampón A (97% v/v) y DMA (dimetilacetamida, 3% v/v) a temperatura ambiente durante 20 horas.
El conjugado se purificó mediante una columna desaladora SephadexG25 con 10 mM Histidina, 130 mM Glicina, 5% sacarosa, pH 5,5. La proporción del fármaco respecto al anticuerpo fue 4,0 para hu37.3D7-SPDB-DM4 y 3,1 para hu53.2H11 -SPDB-DM4. Los efectos de hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu53.2H11 -SPDB-DM4 en el crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 se ensayó en primer lugar utilizando el ensayo de proliferación celular in vitro WST-8 ((2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Catálogo# CK04-11, Dojindo Molecular Technogies, Inc). Se analizaron numerosas líneas celulares tumorales. Se plaquearon aproximadamente 2.000 células/pocilio en una placa de 96 pocilios en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con 10% de suero en presencia de diferentes concentraciones de hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H11 -SPDB-DM4. Se dejó que las células crecieran durante 5 días. Se añadió una disolución de WST-8 [20µ? de disolución] y las células se volvieron a poner en el incubador durante 2-3 h. Se determinó la absorbancia de la placa a 450 nm y 650 nm. En los experimentos se utilizaron dos grupos control. 0% de supervivencia es el control sólo con el medio. 100% de supervivencia es el control sólo con las células. Para el análisis de los datos, los valores de A650 nm (longitud de onda de referencia) se restaron en primer lugar de los valores A450 nm correspondientes. Después, los valores A450 nm de cada muestra se normalizaron restando a los valores A450 nm el control de fondo (sólo medio). Las fracciones supervivientes se calcularon mediante los valores A450 normalizados de las muestras divididos por los valores A450 normalizados de los controles sólo con células (100% de supervivencia-0% de supervivencia). Los valores log [Ab-DM4] se representaron en el eje de las x y las fracciones supervivientes se representaron en el eje y. Hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu53.2H11-SPDB-DM4 inhibieron significativamente el crecimiento de células tumorales humanas que expresan EphA2, incluyendo células de tumor de próstata PC3, células de tumor de mama MDA-MDA-MB-231 , células de melanoma WM-115, células de melanoma A375 y células de tumor de colon LoVo. Como ejemplo, se muestran los descubrimientos con las células de tumor de próstata PC3. El hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H1 -SPDB-DM4 inhibió fuertemente el crecimiento de las células PC3 de una manera dependiente de la dosis con un valor Cl50 similar de 0.02 nM (figuras 15A y 15B). La potencia de los conjugados estuvo correlacionada con los niveles de expresión de EphA2. Se requirió una concentración 50 veces mayor de hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H 1-SPDB-DM4 para inhibir el crecimiento de las células SK-Mel28 (valores CI50: 1.3 nM y >5 nM, respectivamente; FIGURA 15A y 15B), que expresaban un nivel casi indetectable de EphA2 en la superficie celular (determinado mediante datos de FACS no mostrados) (FIGURA 15A y 15B). Por lo tanto, los resultados de los ensayos de inhibición del crecimiento in vitro demostraron la capacidad de los conjugados antagonistas de anticuerpo anti-EphA2 para inhibir específicamente el crecimiento de líneas celulares tumorales que expresan EphA2. Se analizaron los efectos de hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu53.2H 1 1 -SPDB-DM4 en el crecimiento de xenoinjertos tumorales que expresan EphA2. Se muestra como ejemplo un estudio utilizando el modelo de xenoinjerto de tumor de mama M DA-MB-231 . Los xenoinjertos de cáncer de mama humano M DA-M B-231 se establecieron en ratones hembra CB 1 7 SCI D de 5 semanas de edad mediante la inyección subcutánea de 1 x 1 07 células M DA-MB-231 . Cuando los xenoinjertos de tumores MDA-MB-231 estaban establecidos (tamaño medio de 83 mm3), los ratones se trataron con una única inyección i. v. de hu3D7-SPDB-DM4 o hu2H 1 1 -SPDB-DM4 o PBS. Las dosis de los anticuerpos fueron 1 5mg/kg de peso corporal del ratón, 7.5mg/kg de peso corporal del ratón y 3.25 mg/kg de peso corporal del ratón. Los crecimientos de los tumores MDA-M B-231 se inhibieron completamente por los conjugados de anticuerpo hu3D7-SPDB-DM4 o hu2H 1 1 -SPDB-DM4 a todas las concentraciones ensayadas excepto a 3.25 mg/kg de hu2H 1 1 -SPDB-DM4, lo que muestra el retraso marcado del crecimiento de las células tumorales respecto al control de PBS (FIGU RA1 6A y 1 6B). Los volúmenes medios de los tumores en cada grupo (6 ratones por grupo) se muestran en las FIGU RA 1 6A y B . En resumen, tanto hu3D7-SPDB-DM4 como hu2H 1 1 -SPDB-DM4 tienen potentes actividades inhibidoras del crecimiento de tumores que expresan EphA2 in vivo. No se observaron toxicidades de ninguno de los conjugados de anticuerpo, en base a las determinaciones del peso corporal. Tablas Tabla 1 A: Los residuos de superficie del marco de la cadena ligera de mu37.3D7 y los residuos correspondientes en la misma posición Kabat en el anticuerpo humano 28E4. Los residuos que son diferentes y que por lo tanto están cambiados en el anticuerpo hu37.3D7 están en recuadros sombreados. 80 S S 81 E E 1 00 S G 1 07 K K 1 08 R R Tabla 1 B: Los residuos de superficie del marco de la cadena pesada de mu37.3D7 y los residuos correspondientes en la misma posición Kabat en el anticuerpo humano 28E4. Los residuos que son diferentes y que por lo tanto están cambiados en el anticuerpo hu37.3D7 están en recuadros sombreados. Los residuos con asterisco (*) están retromutados al residuo de mu37.3D7 en una o más variantes de hu37.3D7.
Tabla 2: Los cebadores utilizados para las reacciones de PCR degenerada se basan en los que aparecen en Wang et al., 2000 excepto HindKL (SEQ ID NO: 58) que se basa en Co et al. 1992. Las bases mixtas se definen como sigue: H=A+T+C, S=g+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+g, W=A+T, V = A+C+G.
Cebador Secuencia BamlgGI GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTG (SEQ ID NO: 53) GC lgG2Abam GGAGGATCCCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA (SEQ ID NO: 54) EcoMH CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 55) EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWG (SEQ ID NO: 56) G SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 57) HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGAT (SEQ ID NO: 58) ACAGTTGGTGC Tabla 3: Las mezclas de la reacción de PCR de la cadena ligera y pesada para la clonación de las secuencias de ADNc de la región variable de 37.1 F5.
Mezcla de Reacción de la Mezcla de Reacción de la Cadena Ligera Cadena Pesada 5 µ? de tampón de reacción de 5 µ? de tampón de reacción de PCR 10 X (Roche) PCR 10 X (Roche) 4 µ? de mezcla de dNTP 10mM 4 µ? de mezcla de dNTP 10mM (2.5mM cada uno) (2.5mM cada uno) 2 µ? de Molde (reacción de RT) 2 µ? de Molde (reacción de RT) 5 µ? de cebador izquierdo 2.5 µ? de cebador izquierdo SadMK 10 µ? EcoMHI 10 µ? 5 µ? de cebador derecho 2.5 µ? de cebador izquierdo HindKL 10 µ? EcoMH2 10 µ? 5 µ? de DMSO 5 µ? de cebador derecho 0.5 µ? de Polimerasa Taq BamlgG 10 µ? (Roche) 5 µ? de DMSO 23.5 ul de H?0 destilada estéril 0.5 µ? de Polimerasa Taq (Roche) 23.5 ul de H?0 destilada estéril 50 µ? Total 50 µ? Total Tabla 4: Los cebadores de la secuencia líder del extremo 5' murino utilizados para la segunda ronda de reacciones de PCR de 37.1 F5. Los cebadores del extremo 3' son idénticos a los utilizados en las reacciones de la primera ronda ya que ceban las secuencias respectivas de la región constante. Cebador Secuencia Cadena Ligera Líder 38SB13 LC GACAGACACACTCCTGCTATGGG (SEQ ID NO: 59) Cadena Pesada Líder 5F85 HC GCAGAATTCATGGGATGGAGCYGGATCTTTCT (SEQ ID NO: 60) Tabla 5: Los pesos moleculares del ADNc calculados y determinados por LC/MS de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo murino 37.1 F5.
Cadena Ligera Cadena Pesada ADNc LC/MS Diferencia ADNc LC/MS Diferencia 37.1F5 24.031 24.029 2 Da 49.316 49.333 17 Da Da Da Da Da

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo o un fragmento de éste que se fija al epítopo que se une específicamente a un receptor EphA2 y que es un antagonista de dicho receptor. 2. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es un anticuerpo monoclonal . 3. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2 o Fv. 4. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. 5. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de inhibir la migración de una célula cancerosa. 6. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque dicha célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un cáncer de mama, cáncer de colon , cáncer de endometrio , carcinoma de ovario, osteosarcoma , cáncer cervical , cáncer de próstata, cáncer de pulmón , carci noma sinovial y cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico , cáncer de hígado y otros carcinomas . 7. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de i nhibir la angiogénesis. 8. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo carece de actividad agonista . 9. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo no estimula la fosforilación en tirosina de EphA2. 1 0. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al ep ítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de inhibi r la unión de un ligando a dicho receptor. 1 1 . El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al ep ítopo de la reivindicación 1 0 , caracterizado porque dicho ligando es efrinaAl . 1 2. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de inhibi r la fosforilación en tirosina de EphA2. 1 3. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 1 2 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al ep ítopo es capaz de inhibi r la fosforilación en tirosina de EphA2 en presencia de efrinaAL 1 4. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es capaz de inhibi r la señalización mediada por EphA2. 1 5. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 1 4, caracterizado porq ue la señalización mediada por EphA2 es un incremento de la fosforilación de Akt. 1 6. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque d icho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo se une a EphA2 con una KD de 3 x 1 0"1 0 M o menor. 1 7. El anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho receptor EphA2 es hu mano. 1 8. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72. 19. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 78 y 80. 20. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 74 y 76. 21. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1, 2 y 3 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 4, 5 y 6. 22. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 21 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D N O: 26. 23. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 21 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO:20. 24. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D N OS: 7 , 8 y 9 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determi nantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de ami noácidos representadas por las S EQ I D NOS : 1 0 , 1 1 y 1 2. 25. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 24 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena l igera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO: 28. 26. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 24 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO: 22. 27. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -20 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera , en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de ami noácidos representadas por las SEQ I D NOS : 1 3, 1 4 y 1 5 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determi nantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS : 1 6 , 1 7 y 1 8. 28. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 27, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO: 30. 29. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 27 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al ep ítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada q ue tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO: 24. 30. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera , en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS : 61 , 62 y 63 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determi nantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D N OS : 64, 65 y 66. 31 . Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 30, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO: 78. 32. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 30 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO:74. 33. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -20 , caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determi nantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D N OS: 67 , 68 y 69 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determi nantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las S EQ I D NOS : 70 , 71 y 72. 34. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivind icación 33, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de ami noácidos que consiste en la SEQ I D NO : 80. 35. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 33, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ I D NO:76. 36. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo es un anticuerpo murino o fragmento de éste que se fija al epítopo y es producido por un hibridoma denominado 37.3D7 , en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7660; un hibridoma denominado 37.1 F5, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7661; un hibridoma denominado 53.2H11, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7662; un hibridoma denominado EphA2-N1, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8407; o un hibridoma denominado EphA2-N2, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8408. 37. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o un fragmento de éste que se fija al epítopo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 38. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72. 39. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOS : 47 , 48, 49 , 50 y 52. 40. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al ep ítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al ep ítopo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOS: 32, 34, 36, 37, 38 , 40 , 42, 43 y 45. 41 . Un anticuerpo h umanizado o mod ificado en superficie o fragmento de éste que se fija al ep ítopo según cualquiera de las reivind icaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera , en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS : 1 , 2 y 3 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las S EQ I D NOS : 4, 5 y 6. 42. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivi nd icación 41 , caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ I D NO: 47. 43. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivind icación 41 , caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del g rupo que consiste en las SEQ I D NOS: 32 , 34 y 36. 44. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -40, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera , en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS : 7 , 8 y 9 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las S EQ I D NOS : 1 0, 1 1 y 1 2. 45. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivind icación 44, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOS: 48, 49 y 50. 46. Un anticuerpo humanizado o mod ificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 44 , caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las S EQ I D N OS: 37 y 38. 47. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -40 , caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera , en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS : 1 3, 1 4 y 1 5 y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la com plementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ I D NOS: 16, 17 y 18. 48. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 47, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ I D NO: 52. 49. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según la reivindicación 47, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOS: 40, 42, 43 y 45. 50. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -40, caracterizado porque dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera y dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 61 , 62 y 63 y dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 64, 65 y 66. 51 . Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al ep ítopo según cualquiera de las reivind icaciones 1 -40 , caracterizado porq ue dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo com prende al menos una cadena pesada y al menos una cadena l igera y dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de ami noácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 67 , 68 y 69 y dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 70, 71 y 72. 52. Un anticuerpo humanizado o modificado en superficie o un fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque d icho anticuerpo humanizado o modificado en superficie o fragmento de éste que se fija al epítopo se selecciona de un grupo que consiste en hu37.3D7, hu37.1 F5 , hu53.2H 1 1 , hu EphA2-N 1 y hu EphA2-N2. 53. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de éste que se fija al ep ítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -52 unido a un agente citotóxico . 54. El conjugado de la reivindicación 53, caracterizado porque dicho agente citotóxico se selecciona del grupo q ue consiste en un maitansinoide, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, un profármaco, un taxoide, CC-1065 y un análogo de CC-1 065. 55. El conjugado de la reivindicación 53, caracterizado porque dicho agente citotóxico es la maitansina DM 1 de fórmula: 56. El conjugado de la reivindicación 53, caracterizado porque dicho agente citotóxico es la maitansina DM4 de fórmula: 57. El conjugado de la reivindicación 53, caracterizado porque dicho agente citotóxico es un derivado de tomaimicina seleccionado del grupo que consiste en: 8,8'-[1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-metoxi-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c] [1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[1 ,5-pentanodiilb¡s(ox¡)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[1 ,4-butanodiilbis(ox¡)]-bis[(S)-2-et-(E)-¡l¡den-7-metox¡-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[3-metil-1,5-pentanod¡ilb¡s(ox¡)]-b¡s[(S)-2-et-(E)-¡liden-7-metox¡-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[2,6-pirid¡nd¡ilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-il¡den-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[4-(3-tert-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridindiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahid ro-5H-p¡rrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(3-aminopropilox¡)-1 ,3-bencenodiilbis(metilenox¡)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11 a-tetrah¡dro-5H-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-metil-3-tert-butoxicarbonilaminopropil)- ,3-bencenodiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-5H-p¡rrolo[2,1-c][1 ,4]benzod¡acepin-5-ona] 8,8'-{5-[3-(4-met¡l-4-metildisulfanil-pentanoilam¡no)propilox¡]-1 ,3-bencenodiilb¡s(metilenox¡)}-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi- 1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-acet¡ltiometil-1 ,3-bencenodiilbis(metMenoxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] éster tert-butílico de ácido bis-{2-[(S)-2-metilen-7-metoxi-5-oxo-1 ,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-8-iloxi]-etil}-carbámico 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1 ,5-pentanod¡ilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-4-mercapto-4,4-dimetilbutanoil)amino-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][ ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1 ,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-mercapto-2,2-dimetiletil)amino-1 ,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-metilditio-2,2-dimetiletil)amino-1 ,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8,-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)-pentanamido-etoxi)-piridin-2,6-dimetil )-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 1 a-tetrahidro-pirrolo[2, 1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1 -(2-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-propoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-butoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3, 1 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5- ona] 8,8·-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-??T??-4-G??T??(1?8???3??-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][ ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetM)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona] 8,8'-[(1-(4-metil-4-metildisulfanM)-pentanamido)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1 ,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1 ,4]benzodiacepin-5-ona]. 58. El conjugado de la reivindicación 53, caracterizado porque el agente citotóxico es un derivado de leptomicina seleccionado del grupo que consiste en: (2-Metilsulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-Hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9, 11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo- 3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico] (2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11, 15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico (2-Metildisulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9, ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico (2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi--3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico. 59. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-52, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 53-58 y un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. 60. Un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-52, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 53-58, para utilizarse como medicamento. 61 . El uso de un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -52 , o de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 53-58, para fabricar un medicamento para tratar cáncer. 62. El uso de la reivindicación 61 , caracterizada porque dicho cáncer es un cáncer metastásico. 63. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 61 -62, caracterizada porque dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo, o dicho conjugado inhibe la neovascularización tumoral . 64. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 61 -63, caracterizada porque dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon , cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical , cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado y otros carcinomas. 65. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 61 -64, que comprende además el uso de un agente terapéutico adicional en la fabricación de la misma composición o de una composición diferente. 66. El uso según la reivindicación 65, caracterizada porque el agente terapéutico adicional es un antagonista del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), o receptor HER2. 67. Un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto que se sabe o se sospecha que tiene un cáncer, dicho método comprende: a) Poner en contacto células de dicho paciente con un anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo, b) Medir la fijación de dicho anticuerpo o fragmento de éste que se fija al epítopo a dichas células, y c) Comparar la expresión de la parte (b) con la de un sujeto o patrón de referencia normal. 68. El método de la reivindicación 67, en el que dicho cáncer es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial y cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado y otros carcinomas. 69. El método de la reivindicación 68, caracterizado porque dichas células están en tejido congelado o fijado o son células de dicho paciente. 70. Un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 y 80. 71. Un polinucleótido según la reivindicación 70, caracterizado porque dicho polinucleótido tiene una secuencia que presenta una homología de al menos el 80 % con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77 y 79. 72. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 70 y 71. 73. Una célula anfitriona que comprende un vector de la reivindicación 72. 74. Una línea celular de hibridoma caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en la línea celular de hibridoma denominada 37.3D7 en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7660; la línea celular de hibridoma denominada 37.1F5, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7661; la línea celular de hibridoma denominada 53.2H11, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7662; la línea celular de hibridoma denominada EphA2-N1, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8407; o la línea celular de hibridoma denominada EphA2-N2, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8408.
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