ES2871816T3 - Anticuerpos anti-LAMP1 y conjugados anticuerpo-fármaco, y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-LAMP1 y conjugados anticuerpo-fármaco, y usos de los mismos Download PDF

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Tarik Dabdoubi
Magali Mathieu
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Anne-Marie Lefebvre
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Abstract

Un anticuerpo anti-LAMP1 o un fragmento de anticuerpo de unión a LAMP1 del mismo que comprende: una CDR1- H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4; y una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO:

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-LAMPI y conjugados anticuerpo-fármaco, y usos de los mismos
Se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a proteínas de la proteína de membrana asociada a lisosoma 1 (LAMP1) humana y de Macaca fascicularis e inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos conjugados o enlazados a un agente inhibidor del crecimiento. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos o inmunoconjugados de la invención y los anticuerpos o inmunoconjugados para uso en el tratamiento del cáncer, así como anticuerpos LAMP1, ácidos nucleicos aislados, vectores y células huésped que comprenden una secuencia que codifica dichos anticuerpos y el uso de dicho anticuerpo como una herramienta de diagnóstico. La solicitud proporciona, además, la detección de la amplificación del gen LAMP1 o un aumento en células cancerosas que conduce a la determinación de si es probable que pacientes con cáncer respondan a la terapia anti-LAMP1. Por lo tanto, se da a conocer un método in vitro de selección de pacientes con cáncer, que comprende determinar, en una muestra biológica de un paciente con cáncer que incluye células cancerosas, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1; y seleccionar al paciente basándose en la presencia de un aumento en el número de copias del gen LAMP1. Se proporciona, además, un agente terapéutico anti-LAMP1 para uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1 en células cancerosas.
La proteína de membrana asociada a lisosoma 1 (LAMP1), también conocida como miembro A de la familia similar al antígeno CD107 (CD107a), es una proteína de membrana de tipo I de paso único, que pertenece a la familia LAMP. LAMP2 es el miembro más cercano de la familia y ambas proteínas son las glicoproteínas más abundantes dentro de la membrana lisosomal (Sawada, R. et al., 1993, J Biol Chem 268: 12675-12681).
Aunque codificadas por genes separados, con LAMP1 ubicada en el cromosoma 13q34 y LAMP2 en Xq24-25, las proteínas son similares en su estructura primaria, con una homología de secuencia del -36% (Mattei, M.G. et al., 1990, J Biol Chem 265:7548 -7551). LAMP1 y LAMP2 consisten en un núcleo polipeptídico de aproximadamente 40 kDa; ambas están ancladas a través de su extremo C a la membrana lisosomal y exponen la mayor parte, ampliamente glicosilada, al lado luminal de los lisosomas. Ambas proteínas se encuentran entre las proteínas celulares más glicosiladas con -50% de su masa como hidratos de carbono y estas glicosilaciones parecen ser la clave para mantener la acidez del lisosoma y proteger las membranas lisosomales de la autodigestión. Sin embargo, la función biológica completa de estas dos proteínas altamente glicosiladas, en particular LAMP1, aún debe dilucidarse (Fukuda, M., 1991, J Biol Chem, 266:21327-21330; Winchester, B., 2001, European Journal of Paediatry Neurology, 5:11-19; Gasnier, B., 2009 Biochimica et Biophysica Acta 1793:636-649).
LAMP1 se expresa en gran medida en endosomas y lisosomas tardíos, lo que designa a LAMP1 como marcador para estos dos orgánulos (Cook, N.R. et al., 2004, Traffic, 5 (9): 685-699). Por lo tanto, la mayor parte de la bibliografía sobre LAMP1 se refiere a endocitosis, pinocitosis o fagocitosis (Cook, N.R. et al., 2004, Traffic, 5 (9): 685-699).
Aunque la mayoría de LAMP1 y LAMP2 reside en el lisosoma, también se observa algo de inmunorreactividad de LAMP1 y LAMP2 a niveles bajos en la membrana plasmática. La LAMP1 que se encuentra en la membrana plasmática representa solo el 1-2% de la LAMP1 total. Esto es cierto, por ejemplo, para los linfocitos de la sangre periférica (Holcombe, R.F. et al. 1993, Clin Immunol Immunopathol. 67(1): 31-39) y plaquetas (Silverstein, R.L. y Febbraio, M., 1992, Blood 80: 1470-1475).
Se ha observado un aumento de la expresión en la superficie celular de LAMP1 y LAMP2 en líneas de células tumorales, por ejemplo en células L4 de carcinoma de colon altamente metastásico (Saitoh, O. et al., 1992, J Biol Chem 267: 5700-5711), en melanoma metastásico humano. A2058, HT1080 (fibrosarcoma humano), células CaCo-2 (adenocarcinoma de colon humano) y en neoplasias colorrectales (Furuta, K. et al., 2001, J Pathol 159 (2): 449­ 455).
La región cromosómica 13q34 en la que está ubicada LAMP1 se ha relacionado recientemente con eventos de amplificación que incluyen un amplicón grande que implica a CUL4A, LAMP1, TFDP1, y GAS6 en el cáncer de mama humano (Abba, Martin C. et al ; Cancer Res 2007; 4104). TFDP1 y quizás CUL4A se identificaron en la publicación arriba mencionada como los genes principales que impulsan el fenómeno de amplificación. En particular, el análisis de los conjuntos de datos de expresión génica del cáncer de mama (micromatrices) disponibles públicamente indicó que la sobre-expresión de TFDP1 está asociada con carcinomas de mama de alto grado y negativos para el receptor de estrógeno (ER), así como con una supervivencia general más corta, una supervivencia sin recaídas y un intervalo libre de metástasis. Por el contrario, la expresión de LAMP1 no se correlacionó significativamente con el grado del tumor. Al final, Abba et al. no informaron que la amplificación de LAMP1 se tradujera en sobre-expresión de LAMP1 en células de cáncer de mama humano.
La cola citoplasmática de 11 aminoácidos de LAMP1 contiene una secuencia enlazadora de 7 aminoácidos y un motivo de tirosina de 4 aminoácidos de longitud (YQTI). Se demostró que pequeños cambios en la separación de este motivo con relación a la membrana perjudican drásticamente la clasificación en los endosomas tempranos/de clasificación. Se demostró que mutaciones dentro de dicho motivo de tirosina tienen un impacto en la unión de LAMP1 a proteínas adaptadoras que conducen también a una clasificación alterada (Obermüller, S. et al., 2002, Journal of Cell Science 115: 185-194; Rohrer, J. et al., 1996, Journal of Cell Biology 132(4): 565-576). Por lo tanto, la expresión anormal de LAMP1 en la superficie celular en diferentes líneas de células cancerosas podría estar relacionada con mutaciones en la cola citoplasmática, aunque el mecanismo sigue no estando claro. Además, se ha demostrado que determinadas mutaciones puntuales en la cola citoplasmática conducen a la acumulación en la membrana plasmática (Gough, N.R. et al., 1999, Journal of Cell Science 112 (23): 4257-4269).
Debido al hecho de que LAMP1 es un marcador para endosomas y lisosomas, se desarrollaron numerosos anticuerpos anti-LAMP1 comercialmente disponibles con fines de investigación. Estos anticuerpos son policlonales o monoclonales y están restringidos a algunas aplicaciones bioquímicas, tales como inmunohistoquímica (IHC), transferencias Western (WB), análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunoprecipitación (IP) y ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La proteína LAMP1 también ha sido detectada en la membrana celular de células tumorales. E. Venetsanakos (documento WO 2005/012912) sugirió que LAMP1 se expresa en la superficie de células cancerosas del colon, pero no en la superficie de células normales del colon. El documento WO2005/012912 describió que el anticuerpo monoclonal anti-LAMP1 H4A3 es capaz de detectar específicamente la expresión de LAMP1 en células cancerosas humanas y propuso que el crecimiento del tumor podría reducirse fijando como objetivo un agente citotóxico a LAMP1 a través de un anticuerpo anti-LAMP1, lo que sugiere que inmunoconjugados de este tipo podrían utilizarse. para el tratamiento de un cierto número de cánceres diferentes. El documento WO2005/012912 menciona el uso de H4A3 anti-LAMP1 como herramienta de investigación en combinación con una tinción por inmunofluorescencia y análisis confocal. Venetsanakos no describió, sin embargo, la preparación de anticuerpos anti-LAMP1 o conjugados de los mismos con un agente citotóxico o citostático ni ningún dato que apoye su hipótesis. De hecho, a pesar de que ha pasado una década desde la presentación inicial de Venetsanakos, hasta ahora no han entrado en desarrollo clínico anticuerpos anti-LAMP1 o su uso como inmunoconjugados en una terapia anti-LAMP1. Por consiguiente, existe una gran necesidad de anticuerpos o inmunoconjugados anti-LAMP1 para su uso en el tratamiento del cáncer.La presente invención se define mediante las reivindicaciones.
Definiciones
Como se usa en esta memoria."LAMP1" designa la "proteína de membrana asociada a lisosoma 1", un miembro de una familia de glicoproteínas que también se conoce como LAMPA, CD107a o LGP120. LAMP1, de acuerdo con los datos de expresión de proteínas para muestras tumorales humanas en comparación con muestras no tumorales presentadas en el siguiente Ejemplo 5, se expresa en la superficie celular de adenocarcinomas de colon, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, estómago, páncreas y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos.
El gen humano LAMP1 se encuentra en el cromosoma 13q34 (113,951,469 - 113,977,441) y tiene una longitud total de 26.273 kb.
Una secuencia de referencia del ADNc que codifica LAMP1 humana de longitud completa, incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal, está disponible en la base de datos de GenBank bajo el número de acceso NM_005561.3 (SEQ ID NO: 23) y la secuencia de proteína representativa, incluyendo el péptido señal (posiciones 1-28) está disponible bajo n P_005552.3 (SEQ ID NO: 24). Se ha informado de una isoforma potencial de LAMP1 que omitiría los aminoácidos en las posiciones 136-188 de SEQ ID NO: 24, correspondiente al exón 4 del gen que codifica LAMP1 humana. No se han identificado SNPs sinónimos en la población caucásica de al menos 60 individuos.
Con respecto a sus ortólogos, LAMP1 humana comparte 66% de identidad de secuencia con, respectivamente, LAMP1 de ratón (NP_034814, SEQ ID NO: 25) y LAMP1 de rata (NP_036989, SEQ ID NO: 26), y LAMP1 humana y de Macaca mulatta (XP_001087801, SEQ ID NO: 27) comparten una identidad de secuencia del 96%.
La secuencia de LAMP1 de Macaca mulatta (SEQ ID NO: 27) y la secuencia predicha de Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 39) son idénticas en un 99%,difiriendo dichas secuencias en una leucina adicional en la posición 11 de Macaca mulatta LAMP1 (SEQ ID NO: 27), es decir, en el péptido señal. Por consiguiente, las secuencias de LAMP1 maduro de Macaca mulatta y Macaca fascicularis son idénticas.
El miembro más cercano de la familia LAMP es LAMP 2 (P13473, LAMP2 humana, proteína LAMP2 soluble SEQ ID NO: 40). Las proteínas LAMP1 y LAMP2 humanas comparten una identidad de secuencia de -36% y comprenden algunos sitios de glicosilación conservados.
Un "dominio" puede ser cualquier región de una proteína, generalmente definida sobre la base de homologías de secuencia y, a menudo, relacionada con una entidad estructural o funcional específica. La organización del dominio de LAMP1 no se ha publicado en su totalidad hasta ahora.
LAMP1 humana consiste en 417 residuos de aminoácidos y 28 residuos amino-terminales correspondientes a un péptido señal escindible. La mayor parte de LAMP1 reside en el lado luminal del lisosoma y está fuertemente glicosilada por N-glicanos. LAMP1 contiene 18 sitios potenciales de N-glicosilación, de los cuales 5 están ocupados por poli-N-acetil-lactosamina glicanos (Carlsson, S.R. y Fukuda, M., 1990, J. Biol. Chem. 265(33): 20488-20495). Se agrupan en dos dominios separados por una estructura en forma de bisagra enriquecida con prolinas y serinas, muchas de las cuales están enlazadas a O-glicanos. LAMP1 tiene un dominio transmembrana que consiste en 24 aminoácidos hidrófobos cerca del extremo COOH y contiene un segmento citoplasmático corto compuesto por 11 residuos de aminoácidos en el extremo COOH-terminal.
La nomenclatura de los dos dominios de LAMP1, "el primer dominio luminar y el "segundo dominio luminar se basan en la orientación de LAMP1 dentro de su localización original, el lisosoma. Sin embargo, cuando LAMP1 se expresa en la superficie celular, los dos dominios luminales se convierten en dominios extracelulares y, por lo tanto, quedan expuestos en la superficie celular. Por lo tanto, en una realización, "extracelular" en el contexto de la invención se refiere a construcciones de proteína LAMP1 que comprenden el primer y/o segundo dominio(s) luminal(es) de LAMP1 como se define más adelante y/o variantes de las mismas. La organización del dominio de LAMP1 humana de acuerdo con NP_005552.3 (SEQ ID NO: 24) se ha mapeado en el Ejemplo 6.1 y se utilizará en este documento de la siguiente manera:
Tabla 1: Descripción de los dominios de LAMP1 humana
Figure imgf000004_0001
Por consiguiente, el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de LAMP1 humana consiste en aminoácidos en las posiciones 29-309 de la SEQ ID NO: 24.
La organización del dominio de LAMP1 de Macaca fascicularisde acuerdo con la secuencia predicha (SEQ ID NO: 39) es la siguiente:
Tabla 2: Descripción de los dominios de LAMP1 de Macaca fascicularis
Figure imgf000004_0002
Por consiguiente, el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de LAMP1 fascicularis consiste en aminoácidos en las posiciones 27-307 de la SEQ ID NO: 39.
En la Figura 1 se muestra un alineamiento de secuencia de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis de longitud completa.
La región de bucle 4 de LAMP1 humana y de Macaca fascicularis no contiene sitio de glicosilación alguno, lo que distingue al Bucle 4 de los Bucles 1 -3 de lAm P1.
Los Bucles 1 -4 han sido definidos a partir de la secuencia de aminoácidos primaria y han sido mapeados en el Ejemplo 6.1, pero no a partir de la estructura 3D de LAMP1, ya que la estructura no se resolvió antes de este trabajo.
Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, resulta en la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia codificante de una proteína puede incluir un codón de inicio (habitualmente ATG) y un codón de terminación. Una región que codifica un producto de expresión presente en el ADN se denomina "secuencia de ADN codificante" o "CDS".
Como se usa en esta memoria, las referencias a proteínas específicas (p. ej., anticuerpos) pueden incluir un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos nativa, así como variantes y formas modificadas independientemente de su origen o modo de preparación. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos nativa es una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la obtenida de la naturaleza. Dichas proteínas de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden preparar utilizando métodos recombinantes y/o sintéticos estándar. Las proteínas de secuencia nativa abarcan específicamente formas truncadas o solubles que se producen de forma natural, formas variantes que se producen de forma natural (p. ej., formas de corte y empalme alternativamente), variantes alélicas que se producen de forma natural y formas que incluyen modificaciones post-traducción. Una proteína de secuencia nativa incluye proteínas que siguen modificaciones post-traducción, tales como glicosilación o fosforilación u otras modificaciones de algunos residuos de aminoácidos.
Como se usa en esta memoria, el término "marcador" se refiere a cualquier medio biológico, químico o físico que permita identificar la presencia y posiblemente cuantificar la expresión de un gen y/o proteína diana en una muestra biológica. Marcadores de este tipo son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ventajosamente, los marcadores de acuerdo con la invención son marcadores genéticos y/o marcadores proteicos.
El término "gen" significa una secuencia de ADN que codifica o corresponde a una secuencia particular de aminoácidos que comprende la totalidad o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede incluir o no secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse de ADN a ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción del ADN. En particular, el término gen puede estar destinado a la secuencia genómica que codifica una proteína, es decir, una secuencia que comprende secuencias reguladoras, promotoras, intrónicas y exónicas.
Como se utiliza en esta memoria, las expresiones "variación del número de copias", "variante del número de copias" y el término "CNV" se utilizan indistintamente y se refieren a un segmento de ADN de 1 kb o mayor y presente en un número de copias variable en comparación con un genoma de referencia. Los términos y expresiones "variante estructural", "duplicón", "indel", "variante estructural de tamaño intermedio (ISV)", "repetición de bajo número de copias (LCR)", "variante multisitio (MSV)", "variante de secuencia paráloga (PSV)", "duplicación del segmento", "duplicación intercromosómica", y "duplicación intracromosómica", que se encuentran en la bibliografía, se incluyen en esta memoria en el término "CNV".
Además, la variación del número de copias puede referirse a un solo gen o incluir un conjunto contiguo de genes.
Como se utiliza en esta memoria, "número de genes" describe el número de genes presentes en la célula. En los organismos diploides, en un estado normal, dos copias de cada una de las secuencias nucleicas están presentes de forma natural en el genoma, por lo tanto, el número de copias (CN) es = 2. En particular, el genoma muestra dos alelos para cada uno de los genes, uno en cada cromosoma de un par de cromosomas homólogos (a excepción de los genes localizados en cromosomas sexuales).
En esta memoria, la expresión "número de genes" y "número de copias del gen" se pueden utilizar indistintamente.
En el contexto de la invención, una "copia" de una secuencia engloba una secuencia idéntica a dicha secuencia, pero también variaciones alélicas de dicha secuencia.
Un ejemplo para medir el número de copias de ADN y, por lo tanto, el cambio en el número de copias de ADN es el CGH basado en matrices, que es una técnica de alto rendimiento para medir el cambio en el número de copias de ADN en el genoma. Los fragmentos de ADN o "clones" de las muestras de ensayo y de referencia se hibridan con fragmentos de matriz mapeados. Las relaciones de intensidad log2 del ensayo con respecto a la referencia proporcionan información útil sobre los perfiles de todo el genoma en el número de copias.
El valor "Log2" o "relación Log2" se utiliza para describir el número de copias de un gen o un fragmento de ADN en un genoma celular. En una situación ideal, la relación log2 de clones normales (copia-variación neutral) es log2 (2/2) = 0, las pérdidas de una sola copia son log2 (1/2) = -1 y los aumentos de una sola copia son log2 (3/2) = 0,58. Múltiples aumentos o amplificaciones de copias tendrían valores de log2 (4/2), log2 (5/2), ...
Como se utiliza en esta memoria, el término "aumento" de una secuencia se refiere, en general, a la presencia de un número de copias > 2,5 (alternativamente una relación Log2 > 0,32) de dicha secuencia en el genoma diploide de un sujeto. Estas > 2,5 copias pueden ser adyacentes o no estar en el genoma; en particular, pueden estar presentes en diferentes regiones de un par de cromosomas o en cromosomas pertenecientes a distintos pares de cromosomas del genoma.
Por consiguiente, la expresión "aumento de número de copias de genes" se refiere a la presencia de >2,5 números de copias (alternativamente una relación Log2 > 0,32) de un gen específico en el genoma diploide de un sujeto. Cuando el número de copias = 2.5, el 50% de las células utilizadas para definir el número de copias contiene las 2 copias habituales del gen en un organismo diploide y el 50% de las células utilizadas para definir el número de copias contiene las 2 copias habituales y 1 copia adicional más dicho gen (en total 3 copias de dicho gen).
La expresión "aumento bajo" de una secuencia se refiere, en general, a la presencia de un número de copias > 2,5, pero < 5 (alternativamente una relación 0,32< log2 < 1,32) de dicha secuencia en el genoma diploide de un sujeto. Las expresiones "amplificación", "Amp" o o " o "aumento alto"se refieren en esta memoria a la presencia de un número de copias >5 o, alternativamente, una Log2 > 1,32, de una secuencia específica en el genoma diploide de un sujeto. Por consiguiente, la expresión "amplificación del número de genes" se refiere a la presencia de >5 números de copias de un gen específico en el genoma diploide de un sujeto
Como se utiliza en esta memoria, un "fragmento de una secuencia" corresponde a una porción de dicha secuencia, por ejemplo, de una secuencia de nucleótidos. Preferiblemente, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 10 pb. Más preferiblemente, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 15 pb, en particular una longitud de al menos 20 pb. Lo más preferiblemente, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 25 pb, al menos una longitud de 30 pb, en particular una longitud de al menos 33 pb. Un fragmento de la secuencia anterior puede ser en particular un cebador o una sonda.
En el contexto de la invención, una "secuencia mutada" de una secuencia de referencia se refiere a una secuencia que incluye inserción(es), deleción(es) o sustitución(es) de uno o más nucleótido(s), en donde dicha secuencia mutada es al menos un 75% idéntica a la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad de la secuencia se calcula comparando la secuencia mutada alineada de manera óptima con la secuencia de referencia, determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (p. e j, A, T, C, G, U o I) en ambos secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la secuencia de referencia y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. Preferiblemente, la secuencia mutada es al menos 80%, 85%, 90%, 95% idéntica a la secuencia de referencia.
Preferiblemente, dicha secuencia mutada de una secuencia de referencia es una variante alélica de dicha secuencia de referencia. Como se utiliza en esta memoria, una "variante alélica" designa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico.
Una secuencia "al menos 85% idéntica a una secuencia de referencia" es una secuencia que tiene, en toda su longitud, 85% o más, en particular 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% o 99% de identidad de la secuencia con la longitud total de la secuencia de referencia.
Se puede determinar un porcentaje de "identidad de secuencia" comparando las dos secuencias, alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia. (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica o el residuo de aminoácido en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se realiza mediante alineamiento global por pares, p. ej., utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970). El porcentaje de identidad de la secuencia se puede determinar fácilmente, por ejemplo, utilizando el programa Needle, con la matriz BLOSUM62, y los siguientes parámetros huecoabierto = 10, hueco-extendido = 0,5.
Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). . En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales de carácter básico: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores son: valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina-triptófano, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.
Un "anticuerpo" puede ser un anticuerpo natural o convencional, en el que dos cadenas pesadas están enlazadas entre sí mediante enlaces disulfuro y cada una de las cadenas pesadas está enlazada a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadenas ligeras, lambda (I) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada una de las cadenas contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios o regiones, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, a los que se alude colectivamente como CH). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento de la unión y la especificidad del antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas, tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión del complemento y unión a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están formados por residuos que provienen principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDRs). Ocasionalmente, los residuos de las regiones no hipervariables o marco (FR) influyen en la estructura global del dominio y, por lo tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs se refieren a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDRs, denominadas CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L y CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo convencional, por lo tanto, incluye seis CDRs, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera.
"Regiones marco" (FRs) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre CDRs, es decir, a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una única especie. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una cuatro FRs, denominadas FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, y FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respectivamente.
Como se utiliza en esta memoria, una "región marco humana" es una región marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85%, o más, en particular 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) a la región marco de un anticuerpo humano que se produce de forma natural.
En el contexto de la invención, la definición de CDR/FR en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se determinará basándose en la definición de IMGT (Lefranc, M.P. et al., 2003, Dev Comp Immunol. 27(1): 55-77; www.imgt.org).
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo" designa anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, así como anticuerpos de dominio único y fragmentos de los mismos, en particular anticuerpos de cadena pesada variable de dominio único y anticuerpos quiméricos, humanizados, biespecíficos o multiespecíficos.
Tal como se utiliza en esta memoria, anticuerpo o inmunoglobulina también incluye "anticuerpos de dominio único" que han sido descritos más recientemente y que son anticuerpos cuyas regiones determinantes de la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos de forma natural de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, anticuerpos de dominio único modificados por ingeniería genética. Los anticuerpos de dominio único pueden derivarse de cualquier especie, que incluye, pero no se limita a ratón, ser humano, camello, llama, cabra, conejo y animal bovino. Los anticuerpos de dominio único pueden ser anticuerpos de dominio único que se producen de forma natural conocidos como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. En particular, las especies de Camelidae, por ejemplo, el camello, el dromedario, la llama, la alpaca y el guanaco, producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadena ligera. Anticuerpos de cadena pesada de camélidos también carecen del dominio CH1.
La cadena pesada variable de estos anticuerpos de dominio único desprovistos de cadenas ligeras se conoce en la técnica como "VHH" o "nanocuerpo". De forma similar a los dominios VH convencionales, los VHH contienen cuatro FRs y tres CDRs. Los nanocuerpos tienen ventajas frente a los anticuerpos convencionales: son aproximadamente diez veces más pequeños que las moléculas de IgG y, como consecuencia, se pueden producir nanocuerpos funcionales plegados correctamente mediante expresión in vitro, al tiempo que se logra un alto rendimiento. Además, los nanocuerpos son muy estables y resistentes a la acción de las proteasas. Las propiedades y la producción de nanocuerpos han sido revisadas por Harmsen y De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov; 77(1): 13-22).
La expresión "anticuerpo monoclonal" o "mAb", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula de anticuerpo de una composición de un solo aminoácido que se dirige contra un antígeno específico, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Un anticuerpo monoclonal puede ser producido por un solo clon de células B o hibridoma, pero también puede ser recombinante, es decir, producido por ingeniería de proteínas.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo modificado que en su sentido más amplio contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En particular, un anticuerpo quimérico comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio CL de otro anticuerpo, en particular un anticuerpo humano. Como animal no humano se puede utilizar cualquier animal tal como ratón, rata, hámster, conejo o similar. Un anticuerpo quimérico también puede designar un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad por al menos dos antígenos diferentes. En una realización, un anticuerpo quimérico tiene dominios variables de origen de ratón y dominios constantes de origen humano.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que inicialmente es total o parcialmente de origen no humano y que ha sido modificado para reemplazar determinados aminoácidos, en particular en las regiones marco de las cadenas pesada y ligera, con el fin de evitar o minimizar una respuesta inmune en seres humanos. Los dominios constantes de un anticuerpo humanizado son la mayoría de las veces dominios CH y CL humanos. En una realización, un anticuerpo humanizado tiene dominios constantes de origen humano.
"Fragmentos" de anticuerpos (convencionales) comprenden una parte de un anticuerpo intacto, en particular, la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv) 2, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Un fragmento de un anticuerpo convencional también puede ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo de cadena pesada o VHH.
El término "Fab" designa un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, se unen mediante un enlace disulfuro.
El término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y una actividad de unión al antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG. con una proteasa, pepsina.
Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("scFv") es un heterodímero VH::VL enlazado covalentemente que habitualmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador que codifica péptidos. El fragmento scFv humano de la invención incluye CDRs que se mantienen en la conformación apropiada, en particular utilizando técnicas de recombinación génica. Fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFvs monovalentes o pueden generarse acoplando scFvs monovalentes mediante un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente. "dsFv" es un heterodímero VH :: VL estabilizado por un enlace disulfuro. "(dsFv) 2" designa dos dsFv acoplados por un enlazador peptídico.
La expresión "anticuerpo biespecífico" o "BsAb" designa un anticuerpo que combina los sitios de unión al antígeno de dos anticuerpos dentro de una única molécula. Por lo tanto, los BsAbs son capaces de unirse simultáneamente a dos antígenos diferentes. La ingeniería genética se ha utilizado con una frecuencia creciente para diseñar, modificar y producir anticuerpos o derivados de anticuerpos con un conjunto deseado de propiedades de unión y funciones efectoras tal como se describe, por ejemplo, en el documento EP 2050764 A1.
La expresión "anticuerpo multiespecífico" designa un anticuerpo que combina los sitios de unión al antígeno de dos o más anticuerpos dentro de una única molécula.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.
El término "hibridoma" designa una célula, que se obtiene sometiendo una célula B, preparada al inmunizar un mamífero no humano con un antígeno, a fusión celular con una célula de mieloma derivada de un ratón o similar que produce un anticuerpo monoclonal deseado que tiene una especificidad antigénica.
Por "purificado" y "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido (es decir, el anticuerpo de la invención) o una secuencia de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado", tal como se utiliza en esta memoria en particular, significa que están presentes al menos 75%, 85%, 95% o 98% en peso de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido objeto; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afecten negativamente a las características básicas de la composición.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "sujeto" designa un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. En particular, un sujeto en el contexto de la invención es un ser humano.
A lo largo de la presente solicitud, la expresión "que comprende" debe interpretarse como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las opcionales, adicionales, no especificadas. Tal como se utiliza en esta memoria, el uso de la expresión "que comprende" también describe la realización en la que no están presentes características distintas de las características específicamente mencionadas (es decir, "que consiste en").
A lo largo de la presente solicitud, el término "y/o" es una conjunción gramatical que debe interpretarse como que abarca que pueden producirse uno o más de los casos que conecta. Por ejemplo, la frase "cuantificar la expresión de un gen y/o proteína diana en una muestra biológica" indica que la expresión de un gen diana puede cuantificarse (ARNm), o la expresión de una proteína o la expresión de un gen diana (ARNm) y la proteína juntos pueden cuantificarse.
Por consiguiente, la redacción "un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 5, o una secuencia al menos 85% idéntica al mismo" debe interpretarse como "un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma" o "un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 5 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma" o "un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 5 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma".
El término "cáncer", "neoplasma", "tumor" y "carcinoma" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de modo que pueden exhibir un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. En general, las células de interés para la detección o el tratamiento en la presente solicitud incluyen células precancerosas (p. ej., benignas), malignas, metastásicas y no metastásicas.
Inmunoconjugados
Con fines terapéuticos, es ventajoso crear un anticuerpo con características óptimas para su uso como un conjugado de anticuerpo-fármaco, es decir, un anticuerpo que reconozca específicamente una diana presente en la superficie de las células cancerosas y que sea capaz de desencadenar eficazmente la internalización una vez unido a dicha diana.
Los autores de la invención produjeron anticuerpos contra células tumorales de colon o células tumorales de pulmón y rastrearon los clones resultantes para la unión diferencial a células tumorales y tejido no tumoral.
Los autores de la invención identificaron de esta manera anticuerpos que distinguen los tejidos tumorales de los no tumorales. Se seleccionaron tres de esos anticuerpos (los denominados anticuerpos "MAb1", "MAb2" y "MAb3"), cumpliendo las características esperadas necesarias para la aplicación terapéutica, en particular en forma de ADC. Esos tres anticuerpos mostraron una alta afinidad de unión (dentro del intervalo nanomolar) a la LAMP1 expresada en la superficie celular en las células cancerosas. Además, esos tres anticuerpos anti-LAMP1 mostraron una alta capacidad para desencadenar la internalización del complejo de anticuerpos LAMP1/anti-LAMP1, tal como se muestra en los Ejemplos 4.4 y 4.3.
Los autores de la invención demostraron que los anticuerpos quiméricos derivados de MAb1, MAb2, MAb3 (chMAb1, chMAb2, chMAb3), combinados con un maitansinoide citotóxico (DM4) mostraron también una afinidad de unión alta pero ligeramente diferente a LAMP1 humana o LAMP1 de mono cynomolgus y luego al anticuerpo desnudo, tal como se muestra en el Ejemplo 8.1.7 y 8.1.8.
Por consiguiente, en un ejemplo, el inmunoconjugado en el contexto de la invención tiene una afinidad (CE50) por LAMP1 humana de longitud completa y LAMP1 de mono cynomolgus expresada en la superficie de las células de una línea celular recombinante, en donde la línea celular puede ser HCT116 y la afinidad aparente medida vía citometría de flujo es < 30 nM, por ejemplo < 20 nM o < 15 nM.
Los métodos para medir la afinidad (CE50) por LAMP1 humana de longitud completa y LAMP1 de mono cynomolgus se explican con más detalle en el capítulo "anticuerpos".
Los autores de la invención demostraron, además, que un anticuerpo quimérico derivado de MAb1 (chMAb1), combinado con un maitansinoide citotóxico (DM4), induce actividad citotóxica in vitro en células tumorales HCT116 humanas que contienen una integración estable de la secuencia de ADN que codifica LAMP1 en el ADN genómico y que expresa LAMP1 en su superficie.
Además, los autores de la invención demostraron que los anticuerpos humanizados derivados de MAb1 (huMAb1_1, huMAb1_2, huMAb1_3), combinados con un maitansinoide citotóxico (DM4) inducen actividad citotóxica in vitro en células tumorales HCT116 humanas que contienen una integración estable de la secuencia de ADN codificante de LAMP1 en el ADN genómico.
También han demostrado que el inmunoconjugado DM4-SPDB-chMAb1 induce una marcada actividad antitumoral in vivo en ratones que portan el xenoinjerto de adenocarcinoma de colon humano primario derivado del paciente CR-LRB-010P, cuando se utiliza en una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg, con una sola inyección, tal como se describe en el Ejemplo 10.1.1.
Además, los autores de la invención demostraron que el inmunoconjugado induce una marcada actividad antitumoral in vivo en ratones que portan el xenoinjerto de tumor de pulmón humano primario derivado del paciente LUN-NIC-0014, cuando se utiliza en una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg, con una sola inyección, tal como se describe en el Ejemplo 10.1.2.
También han demostrado que los inmunoconjugados DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3 inducen una marcada actividad antitumoral in vivo en diferentes xenoinjertos derivados de pacientes tal como se muestra en el Ejemplo 10.2-10.4.
Por ejemplo, se demostró que el inmunoconjugado DM4-SPDB-huMAb1_1 induce una marcada actividad antitumoral in vivo en un xenoinjerto de carcinoma ductal invasivo humano primario y un xenoinjerto de tumor pulmonar primario humano derivado del paciente, cuando se utiliza en una dosis de 10 mg/kg , 5 mg/kg, 2,5 mg/kg o 1,25 mg/kg con una sola inyección, tal como se describe en los Ejemplos 10.2.2 y 10.2.3.
Además, los inmunoconjugados DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3 indujeron una marcada actividad antitumoral in vivo en un modelo murino de xenoinjerto de carcinoma ductal invasivo humano primario derivado del paciente, cuando se utilizó en una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg o 5 mg/kg, 2,5 mg/kg y 1,25 mg/kg, respectivamente, con una sola inyección, tal como se describe en los Ejemplos 10.3.2 y 10.4.
En conjunto, por primera vez, estos resultados identifican válidamente a LAMP1 como una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. Por consiguiente, la invención se refiere a un anticuerpo anti-LAMP1 o un fragmento de anticuerpo de unión a LAMP1 del mismo que comprende: una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4; y una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7.
La invención se refiere, además, a un inmunoconjugado, que comprende:
a) un anticuerpo anti-LAMP1 o un fragmento de anticuerpo de unión a LAMP1 del mismo que comprende: una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3 y una c Dr 3-H de secuencia SEQ ID NO: 4; y una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7;
b) al menos un agente inhibidor del crecimiento.
Por consiguiente, la divulgación se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que:
a) se une a proteínas LAMP1 humanas y de Macaca fascicularis; y
b) está enlazado o conjugado con al menos un agente inhibidor del crecimiento.
Un anticuerpo que se une a proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis, tal como se describe a lo largo de la presente solicitud (p. ej., MAb4, fragmentos del mismo o versión quimérica o humanizada del mismo), puede incorporarse en el inmunoconjugado de acuerdo con la invención.
Tal como se utiliza en esta memoria, "conjugado", "inmunoconjugado", "conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC" tienen el mismo significado y son intercambiables.
Un "agente inhibidor del crecimiento", o "agente antiproliferativo", que puede utilizarse indistintamente, se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula tumoral, in vitro o in vivo. Un agente inhibidor del crecimiento designa en particular un agente citotóxico o un isótopo radiactivo.
La expresión "isótopo radiactivo" pretende incluir isótopos radiactivos adecuados para el tratamiento del cáncer, tales como At211, Ac225, Bi212, Bi213, Pb212, Er169, I131, I124, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99 e isótopos radiactivos tales como Lu177. Radioisótopos de este tipo generalmente emiten principalmente radiación beta. En un ejemplo, el isótopo radiactivo es un isótopo emisor alfa, más precisamente torio 227 (Th227), que emite radiación alfa. Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar tal como se describe en la solicitud WO2004/091668.
En un ejemplo, un isótopo radiactivo se selecciona del grupo que consiste en At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125,
In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 e isótopos radiactivos de Lu, por ejemplo, de At211, Er169, I125, In111,
P32, Re186, Sm153, Sr89, isótopos radiactivos de Lu y Th227.
La expresión "agente citotóxico". tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. La expresión "agente citotóxico" pretende incluir agentes quimioterapéuticos, enzimas, antibióticos y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticáncer descritos más adelante. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un fármaco o un pro-fármaco de un compuesto que consiste en un agente anti-tubulina, tal como taxoides o taxanos, un alcaloide vinca, un maitansinoide o análogo de maitansinoide, tal como DM1 o DM4, un derivado de criptoficina, un análogo de auristatina o dolastatina; un agente alquilante de ADN, tal como un derivado de tomaimicina o pirrolobenzodiazepina, un CC-1065 o un análogo de CC-1065; un derivado de leptomicina; un inhibidor de la topoisomerasa II, un inhibidor de la ARN polimerasa II tal como alfa-amanitina.
De acuerdo con un primer ejemplo, dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento no es un isótopo radiactivo indefinido, un fármaco quimioterapéutico, una proteína o lectina, ni una proteína antiviral de hierba carmín, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, doxorrubicina, cisplatino, Yodo-131, Itrio-90, Renio-188, Bismuto-212, Taxol, 5-fluorouracilo, VP-16 (etopósido), bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, biscloroetilnitrosourea (BCNU), mitomicina, ciclofosfamida y una citoquina, tal como TNF y TNF-p. De acuerdo con este primer ejemplo, la divulgación se refiere, en particular, a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que:
a) se une a proteínas LAMP1 humanas y de Macaca fascicularis; y
b) está enlazado o conjugado con al menos un agente inhibidor del crecimiento
(i) un agente citotóxico seleccionado del grupo que consiste en enzimas distintas de la proteína antiviral de hierba carmín; antibióticos distintos de bleomicina y mitomicina; toxinas de origen bacteriano, fúngico o animal o de origen vegetal distintas de abrina y ricina, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; un fármaco o un pro-fármaco de un compuesto que consiste en un agente antitubulina, tal como un maitansinoide o un análogo de maitansinoide, tal como DM1 o DM4, un taxoide o taxano distinto de paclitaxel (Taxol), un alcaloide de la vinca distinto de vindesina, vincristina y vinblastina, un derivado de criptoficina, un análogo de auristatina o dolastatina; un agente alquilante de ADN distinto de BCNU y ciclofosfamida, tal como un derivado de tomaimicina o pirrolobenzodiazepina, un CC-1065 o análogo de CC-1065; un derivado de leptomicina; un inhibidor de topoisomerasa II distinto de doxorrubicina (adriamicina) y etopósido, un inhibidor de la ARN polimerasa II, tal como alfa-amanitina, o
(ii) un isótopo radiactivo tal como, por ejemplo, del grupo consistente en At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga18, Cu64 e isótopos radiactivos de Lu, tales como
Lu177 y Th227.
En un ejemplo, un isótopo radiactivo se selecciona del grupo que consiste en At211, Er169, I125, In111, P32, Re186, Sm153,
Sr89, isótopos radiactivos de Lu y Th227. En una realización, el anticuerpo puede unirse, en particular, a un dominio que consiste en el primer al tercer bucle de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis; en donde el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 humana consiste en los aminoácidos Ala29 a Ile309 de
SEQ ID NO: 24 y el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis consiste en los aminoácidos Ala27 a Thr307 de SEQ ID NO: 39
De acuerdo con un segundo ejemplo, la invención se refiere a un inmunoconjugado en donde el anticuerpo se une a un dominio que consiste en el primer al tercer bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis; en donde el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 humana consiste en los aminoácidos Ala29 a Ile309 de SEQ ID NO: 24 y el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis consiste en los aminoácidos Ala27 a Thr307 de SEQ ID NO: 39.
Por tanto, de acuerdo con este segundo ejemplo, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que
a) se une a un dominio que consiste en el primer al tercer bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis; en donde el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 humana consiste en los aminoácidos Ala29 a Ile309 de SEQ ID NO: 24 y el dominio que consiste en el primer al tercer
bucles de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis consiste en los aminoácidos Ala27 a Thr307 de SEQ ID NO: 39; y
b) está enlazado o conjugado con dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento.
Aunque no es obligatorio, en dicho segundo ejemplo, el al menos un agente inhibidor del crecimiento puede ser diferente de un isótopo radiactivo indefinido, un fármaco quimioterapéutico, una proteína o lectina, en particular de la proteína antiviral de hierba carmín, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, doxorrubicina, cisplatino, Yodo-131, Itrio-90, Renio-188, Bismuto-212, Taxol, 5-fluorouracilo, VP-16 (etopósido), bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, mitomicina, ciclofosfamida y una citoquina, tal como TNF y TNF-p.
Por consiguiente, dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento puede ser un isótopo radiactivo seleccionado del grupo que consiste en At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 e isótopos radiactivos de Lu, tales como Lu177 y Th227,, por ejemplo, At211, Er169, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, isótopos radiactivos de Lu, tales como Lu177 y Th227, o un agente citotóxico como se define en dicha primera realización.
En una realización, dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento puede ser, en particular, un fármaco o un pro­ fármaco de un compuesto que consiste en un maitansinoide o análogo de maitansinoide, tal como DM1 o DM4, un derivado de tomaimicina o pirrolobenzodiazepina, un derivado de criptoficina, un derivado de leptomicina , un análogo de auristatina o dolastatina, o un CC-1065 o análogo de CC-1065, un inhibidor de ARN polimerasa II tal como alfaamanitina.
En un ejemplo, una tomamicina adecuada es un dímero de tomamicina. Dicho dímero de tomamicina es, por ejemplo, (2E,2'E,11aS,11a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil) bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11 aH)-ona).
La fórmula estructural de (2E,2’E,11aS,11a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil) bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11 aH)-ona) es
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Un "maitansinoide". tal como se utiliza en esta memoria, designa maitansinoides y análogos de maitansinoides. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y que son muy tóxicos para las células de mamíferos.
Ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol.
Ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen los que tienen un anillo aromático modificado y los que tienen modificaciones en otras posiciones. Maitansinoides adecuados de este tipo se describen en las Patentes de EE.UU. N°s 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499 y 5.846.545.
Ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen un anillo aromático modificado incluyen:
(1) C-19-decloro (Pat. de EE.UU. N° 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) /- C-19-decloro (Pat. de EE.UU. N°s 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o decloración utilizando LAH); y
(3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /- decloro (Pat. de EE.UU. N° 4.294.757) (preparado por acilación utilizando cloruros de acilo).
Ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones de otras posiciones incluyen:
(1) C-9-SH (Pat. de EE.UU. N° 4.424.219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (Pat. de EE.UU. N° 4.331.598);
(3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH or CH2OAc) (Pat. de EE.UU. N° 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia) ;
(4) C-15-hidroxi/aciloxi (Pat. de EE.UU. N° 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces);
(5) C-15-metoxi (Pat. de EE.UU. N°s 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora);
(6) C-18- W-desmetilo (Pat. de EE.UU. N°s 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y
(7) 4,5-desoxi (Pat. de EE.UU. N° 4.371.533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH).
En una realización específica, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide con contenido en tiol (DM1), formalmente denominado W2-desacetil-W2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina como el agente citotóxico. DM1 está representado por la siguiente fórmula estructural (I):
Figure imgf000013_0001
En otra realización, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide DM4 con contenido en tiol, formalmente denominado W2-desacetil-W2-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM4 está representado por la siguiente fórmula estructural (II):
Figure imgf000013_0002
En ejemplos adicionales, pueden describirse otras maitansinas, incluyendo maitansinoides con contenido en tiol y disulfuro que portan una sustitución mono- o di-alquilo en el átomo de carbono que porta el átomo de azufre. Estos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que porta un grupo sulfhidrilo estéricamente impedido, en donde el átomo de carbono del grupo acilo que porta la funcionalidad tiol tiene uno o dos sustituyentes, siendo dichos sustituyentes CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 reactivos y cualquier agregado que pueda estar presente en la solución.
En la solicitud W02008/010101 se dan, además, ejemplos de estos agentes citotóxicos y de métodos de conjugación.
En algunas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo se fija covalentemente, directamente o a través de un enlazador escindible o no escindible, al al menos un agente inhibidor del crecimiento.
"Enlazador".. tal como se utiliza en esta memoria, significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que fija covalentemente un polipéptido a un resto de fármaco.
Los conjugados se pueden preparar mediante métodos in vitro. Con el fin de enlazar un fármaco o pro-fármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo de enlace. Grupos de enlace adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. La conjugación de un anticuerpo de la invención con agentes citotóxicos o agentes inhibidores del crecimiento se puede realizar utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, que incluyen pero no se limitan a piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB), éster 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-dioxo-1-pirrolidinílico del ácido butanoico (nitro-SPDB), ácido 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-butírico (sulfo-SPDB), (2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo (SPDP), SNPP (4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo), (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno ) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo (documento WO 94/11026).
El enlazador puede ser un "enlazador escindible'' que facilita la liberación del agente citotóxico o del agente inhibidor del crecimiento en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil a ácidos, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador lábil a esterasas, un enlazador fotolábil o un enlazador con contenido en disulfuro (véase, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5.208.020). El enlazador también puede ser un "enlazador no escindible" (por ejemplo, enlazador SMCC) que podría conducir a una mejor tolerancia en algunos casos.
Alternativamente, se puede preparar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo de la invención y un polipéptido inhibidor del crecimiento o citotóxico, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar en la terapia de profármacos mediada por enzimas dependientes, conjugando el polipéptido con una enzima activadora de pro-fármacos que convierte un pro-fármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico peptidílico, véase el documento WO81/01145) en un fármaco anticanceroso activo (véase, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente de EE.UU. N° 4.975.278). El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina, útil para convertir pro-fármacos con contenido en fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir pro-fármacos con contenido en sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para convertir fluorocitosina no tóxica en el fármaco contra el cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir pro-fármacos con contenido en péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas que escinden hidratos de carbono, tales como O-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; P-lactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con P-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas pueden unirse covalentemente a los polipéptidos de la invención mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales arriba comentados.
De acuerdo con algunas realizaciones, en el conjugado de la invención, el agente inhibidor del crecimiento puede ser un maitansinoide, en particular DM1 o DM4.
En un conjugado de este tipo, el anticuerpo se conjuga con dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento mediante un grupo de enlace. En particular, dicho grupo de enlace es un enlazador no escindible, tal como SPDB, sulfo-SPDB o SMCC.
En particular, el conjugado puede seleccionarse del grupo que consiste en:
i) un conjugado anticuerpo-SPDB-DM4 de fórmula (III)
Figure imgf000015_0001
¡i) un conjugado anticuerpo-sulfo-SPDB-DM4 de fórmula (IV)
Figure imgf000015_0002
(IV); y
i¡¡ un conu ado anticuerpo-SMCC-DM1 de fórmula V
Figure imgf000015_0003
En un ejemplo adicional, en el conjugado de la invención, el agente inhibidor del crecimiento puede ser tomamicina, por ejemplo un dímero de tomamicina, por ejemplo (2E,2’E,11aS,11a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil) bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11 aH)-ona).
En un conjugado de este tipo, el anticuerpo se conjuga con dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento mediante un grupo de enlace, por ejemplo, mediante SNPP.
Por consiguiente, en un ejemplo, el conjugado puede un anticuerpo-SNPP-(2E,2’E,11 aS,11 a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diilo).
En general, el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una solución acuosa opcionalmente tamponada de un agente de unión a células (p. ej., un anticuerpo de acuerdo con la invención) con soluciones de un enlazador y un compuesto citotóxico;
(ii) luego, opcionalmente, separar el conjugado que se formó en (i) del agente de unión a células que no ha reaccionado.
La solución acuosa de agente de unión a células se puede tamponar con tampones, tales como, por ejemplo, fosfato, acetato, citrato de potasio o ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfónico (tampón Hepes). El tampón depende de la naturaleza del agente de unión a células. El compuesto citotóxico está en solución en un disolvente orgánico polar, p. ej., dimetilsulfóxido (DMSO) o dimetilacetamida (DMA).
La temperatura de reacción está comprendida habitualmente entre 20°C y 40°C. El tiempo de reacción puede variar de 1 a 24 horas. La reacción entre el agente de unión a células y el agente citotóxico se puede controlar mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con un detector refractométrico y/o UV. Si el rendimiento del conjugado es demasiado bajo, se puede extender el tiempo de reacción.
El experto en la técnica puede utilizar un cierto número de métodos de cromatografía diferentes con el fin de realizar la separación de la etapa (ii): el conjugado puede purificarse, p. ej., mediante SEC, cromatografía de adsorción (tal como cromatografía de intercambio iónico, IEC), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), cromatografía de afinidad, cromatografía de soporte mixto, tal como la cromatografía en hidroxiapatita o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). También se puede utilizar la purificación por diálisis o diafiltración.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "agregados" significa las asociaciones que se pueden formar entre dos o más agentes de unión a células, siendo dichos agentes modificados o no por conjugación. Los agregados pueden formarse bajo la influencia de un gran número de parámetros, tales como una alta concentración de unión a células en la solución, el pH de la solución, altas fuerzas de cizallamiento, el número de dímeros unidos y su carácter hidrofóbico, la temperatura (véanse Wang, L. y Gosh, R., 2008, J. Membr Sci. 318: 311-316, y las referencias allí citadas); téngase en cuenta que la influencia relativa de algunos de estos parámetros no está claramente establecida. En el caso de proteínas y anticuerpos, la persona experta en la técnica se referirá a Cromwell, M.E. et al. (2006, AAPS Jounal 8(3): E572-E579). El contenido en agregados se puede determinar con técnicas bien conocidas por la persona experta, tales como SEC (véase Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).
Después de la etapa (i) o (ii), la solución con contenido en conjugado puede someterse a una etapa adicional (iii) de cromatografía, ultrafiltración y/o diafiltración.
El conjugado se recupera al final de estas etapas en una solución acuosa.
De acuerdo con un ejemplo, el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza por una "relación fármacoanticuerpo" (o "DAR") medida por DAR UV que varía de 1 a 10, por ejemplo, de 2 a 5, en particular de 3 a 4. Este es generalmente el caso de conjugados que incluyen moléculas de maitansinoide.
Este número DAR puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del fármaco (es decir, el agente inhibidor del crecimiento) utilizados junto con las condiciones experimentales utilizadas para la conjugación (tales como la relación agente inhibidor del crecimiento/anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del co-disolvente si lo hubiera). Por lo tanto, el contacto entre el anticuerpo y el agente inhibidor del crecimiento conduce a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre sí por diferentes relaciones de fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. El DAR que se determina es, por lo tanto, un valor medio.
Un método que se puede utilizar para determinar el DAR, denominado en esta memoria DAR UV consiste en medir espectrofotométricamente la relación de absorbancia de una solución de conjugado sustancialmente purificado a Ad y 280 nm. 280 nm es una longitud de onda que se utiliza generalmente para medir la concentración de proteínas, tal como la concentración de anticuerpos. La longitud de onda Ad se selecciona de manera que permita discriminar el fármaco del anticuerpo, es decir, como fácilmente conoce la persona experta, Ad es una longitud de onda en la que el fármaco tiene una alta absorbancia y Ad está lo suficientemente alejada de 280 nm como para evitar un solapamiento sustancial en los picos de absorbancia del fármaco y el anticuerpo. Ad puede seleccionarse como de 252 nm en el caso de moléculas de maitansinoide. Un método de cálculo de DAR puede derivarse de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science:
Las absorbancias para el conjugado a Ad (Aa d) y a 280 nm (A280) se miden utilizando un aparato espectrofotómetro clásico (que permite calcular el "parámetro DAR"). Las absorbancias se pueden expresar de la siguiente manera: en donde
• Cd y Ca son respectivamente las concentraciones en la solución del fármaco y del anticuerpo
• e dad y £D280 son respectivamente los coeficientes de extinción molar del fármaco a Ad y 280 nm
• ea ad y £A280 son respectivamente los coeficientes de extinción molar del anticuerpo a Ad y 280 nm.
La resolución de estas dos ecuaciones con dos incógnitas conduce a las siguientes ecuaciones:
Cü = [(EA2S0X A ad) -(EAADX A280)] / [(EDAD X EA28o) -(SAAD X ED28o)]
Ca = [A230 - (Cd X ED28o)] / SA280
El DAR promedio se calcula entonces a partir de la relación de la concentración del fármaco a la del anticuerpo: DAR = Cd / Ca .
En el inmunoconjugado de acuerdo con la invención, el anticuerpo es, en particular, específico para las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis.
El anticuerpo es, en particular, un anticuerpo quimérico o humanizado. El anticuerpo también puede ser un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis que se contemplan particularmente para ser incluidos en los inmunoconjugados de la invención se describen con más detalles en la siguiente sección de "Anticuerpos".
Anticuerpos
Los autores de la invención identificaron cuatro anticuerpos (los denominados anticuerpos "MAb1", "MAb2","MAb3" y "MAb4") que se unen específicamente a LAMP1 humana y distinguen los tejidos tumorales de los no tumorales. Los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3 permitieron por primera vez detectar LAMP1 expresada extracelularmente y, por lo tanto, realizar análisis por IHC en muestras de OCT congelada (de temperatura de corte óptima) y AFA (fijador de ácido acético, formalina y alcohol) para distinguir tejido canceroso de no canceroso.
Sin embargo, el análisis IHC de tejidos tumorales de bancos de material biológico o de hospitales antes o durante el tratamiento del paciente se realiza de forma rutinaria con muestras embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE). Aunque MAb1, MAb2 y MAb3 permiten el refuerzo de la membrana de LAMP1 en formato de muestra de OCT congelada y AFA (fijador de ácido acético, formalina y alcohol), no pueden conducir a la detección del refuerzo de LAMP1 en formato FFPE. Una de las razones es probablemente el efecto del fijador de formalina combinado con la complejidad de la proteína. Los autores de la invención descubrieron péptidos que permitieron la producción de un anticuerpo monoclonal Mab4, el cual, además, se puede utilizar para experimentos de IHC en el formato FFPE y, por lo tanto, permite la aplicación de los métodos presentados en esta memoria en bancos de material biológico de tumores FFPE y muestras de hospitales FFPE.
Esos cuatro anticuerpos mostraron una alta afinidad de unión (dentro del intervalo nanomolar) a la LAMP1 expresada en la superficie celular en células cancerosas. Además, al menos los anticuerpos anti- LAMP1 MAb1, MAb2 y Mab3 mostraron una alta capacidad para desencadenar la internalización del complejo de anticuerpos LAMP1/anti-LAMP1, tal como se muestra en el Ejemplo 4.4.
Adicionalmente, los cuatro anticuerpos tienen reactividad cruzada con LAMP1 de Macaca fascicularis, pero no muestran reactividad cruzada alguna con la proteína LAMP2 humana.
Los sitios de unión de los anticuerpos MAb1, MAb2 y MAb3 han sido mapeados en un dominio que consiste en el primer al tercer bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis, en particular en el primer dominio luminal de LAMP1 humana. Más específicamente, el sitio de unión de MAb1 fue mapeado en los bucles 1-2 y el sitio de unión de MAb2 y MAb3 fue mapeado en el bucle 1. Los anticuerpos MAb1 y MAb2 no compiten entre sí por unirse a LAMP1 humana. Por lo tanto, se ha encontrado que al menos dos epítopos de LAMP1 interactúan con los anticuerpos de la invención.
El sitio de unión del anticuerpo MAb4 ha sido mapeado en un dominio que consiste en el tercer al cuarto bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis, en particular en el cuarto bucle de LAMP1 humana. Más específicamente, el anticuerpo MAb4 se une a una región del Bucle 4 que comprende los aminoácidos 360 a 375 de LAMP1 humana que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 82.
Los autores de la invención han determinado la secuencia de cadenas pesadas y ligeras variables de estos anticuerpos monoclonales que se dirigen contra las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis.
El llamado anticuerpo "MAb1" comprende:
• un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia
QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDA
PYSQKFKDKATLTADKSSSTTYMQLSRLTSEDSAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVS VSA (SEQ ID NO: 1, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1 -H abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 25, CDR1 -H abarca las posiciones de los aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO: 2), FR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO: 3), FR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 97 a 107 (SEQ ID NO: 4) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 108 a 118 y
• un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPPSLSASLGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKGPRLLIHDTSTLQPGIP
SRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 5, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 26, CDR1 -L abarca las posiciones de los aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO: 6), FR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 89 a 96 (SEQ ID NO: 7) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 97 a 106.
El llamado anticuerpo "MAb2" comprende:
• un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYFNPSSG
YPEYNQKFKDKTTLTADKSSNTAFIQLNSLTSEDSAVYYCSRGYYYGSRGYALDFWGQ
GASVTVSS
(SEQ ID NO: 8, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO: 9), FR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO: 10), FR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 97 a 111 (SEQ Id NO: 11) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 112 a 122 y • un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia NIYLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDINGNTFMHWYQQKPGQSPKLVIYAASNIES
GVPA R FSGSGSSTD FTFTID PVEAD D VATYYCQQFNIEDPWTFGGGTKV El K
(SEQ ID NO: 12, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 27 a 36 (SEQ Id NO: 13), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 37 a 53, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 54 a 56, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 57 a 92, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 93 a 101 (SEQ ID NO: 14) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 102 a 111.
También se generó una variante del anticuerpo MAb2, denominado en esta memoria "MAb2oan", introduciendo residuos canónicos mediante la sustitución de A116T en el dominio variable de la cadena pesada y mediante la sustitución de V9A, V51L, I58L, S72G y A108T en el dominio variable de la cadena ligera.
El denominado "anticuerpo MAb2oan" comprende:
• un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia
QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYFNP
SSGYPEYNQKFKDKTTLTADKSSNTAFIQLNSLTSEDSAVYYCSRGYYYGSRGYALDF
WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 15).
• un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDINGNTFMHWYQQKPGQSPKLLIYAAS
NLESGVPARFSGSGSGTDFTFTIDPVEADDVATYYCQQNIEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 16).
Tanto "MAb2Can" como "MAb2", en forma quimérica, tienen la misma afinidad por LAMP1 humana (véase la Tabla 13).
El llamado anticuerpo "MAb3" comprende:
• un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGES
RYADDFKGRFALSLETSASTAYLQINNLENEDMATYFCAREDYYGNSPWFFDVWGAGT
TVTVSS
(SEQ ID NO: 42, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 26 a 33 (SEQ iD NO: 43), FR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO: 44), FR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 97 a 111 (SEQ ID NO: 45) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 112 a 122 y • un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCNASQGINKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSTLHSGVPS
RFSGSGSGTDYSLTINNLEP EDI ATYYCQQYTKLPFTFGSGTKLEIK
(SEQ ID NO: 46, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO: 47), FR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO: 48) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 98 a 107.
Se generó una variante de MAb3 ("MAb3 VL R24 R93") introduciendo en la secuencia VL de MAb3 las siguientes sustituciones de aminoácidos: N24R y K93R. Por consiguiente, el dominio variable de la cadena ligera de MAb3 VL_R24_R93 consiste en DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQGINKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSTLHS
GVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEPEDIATYYCQQYTRLPFTFGSGTKLEIK
(SEQ ID NO: 51) (los residuos mutados en comparación con VL de MAb3 se muestran en caracteres subrayados).
CDR3-L de MAb3 VL_R24_R93 consiste, por lo tanto, en QQYTRLPFT (SEQ ID NO: 52).
El llamado "MAb4" comprende:
• un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGG
TNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARYRSYDWYFDVWGAGTT VTVSS (SEQ ID NO: 88, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de los aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO: 83), FR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de los aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO: 84), FR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de los aminoácidos 97 a 108 (SEQ ID NO: 85) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 109 a 119 y
• un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRVSGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGV PSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSNPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 89, con CDRs mostradas en negrita), en las que FR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de los aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO: 86), FR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de los aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de los aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO: 87) y FR4-H abarca las posiciones de los aminoácidos 98 a 107.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede resultar de la humanización de cualquiera de los anticuerpos arriba definidos.
Se conocen en la técnica numerosos métodos para la humanización de una secuencia de anticuerpo; véase, p. ej., la revisión de Almagro y Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Un método comúnmente utilizado es el injerto de la CDR, o remodelación de anticuerpos, que implica el injerto de las secuencias de la CDR de un anticuerpo donante, generalmente un anticuerpo de ratón, en el armazón de marco de un anticuerpo humano de diferente especificidad. Dado que el injerto de la CDR puede reducir la especificidad y afinidad de unión y, por lo tanto, la actividad biológica del anticuerpo parental, pueden introducirse retromutaciones en posiciones seleccionadas del anticuerpo injertado con CDR con el fin de conservar la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo parental. La identificación de posiciones para posibles retromutaciones se puede realizar utilizando la información disponible en la bibliografía y en las bases de datos de anticuerpos. Una técnica de humanización alternativa al injerto de CDR y la retromutación es el acondicionamiento, en el que se conservan los residuos de origen no humano no expuestos a la superficie, mientras que los residuos de la superficie se alteran a residuos humanos. Otra técnica alternativa se conoce como "selección guiada" (Jespers, L.S. et al., 1994, Biotechnology 12(9): 899-993) y puede utilizarse para derivar de un anticuerpo murino un anticuerpo completamente humano que conserva el epítopo y las características de unión del anticuerpo parental. Puede utilizarse la técnica de humanización basada en cálculos de dinámica molecular tal como se describe en la solicitud WO2009/032661. Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos humanizados también pueden denominarse anticuerpos "acondicionados".
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización implica típicamente la modificación de las regiones marco de las secuencias de la región variable.
Los residuos de aminoácidos que forman parte de una CDR no se alterarán típicamente con relación a la humanización, aunque en determinados casos puede ser deseable alterar los residuos de aminoácidos de la CDR individuales, por ejemplo, para eliminar un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación, un residuo de cisteína no deseado. un residuo de lisina en el caso de ADC. La glicosilación ligada a N se produce mediante la fijación de una cadena de oligosacárido a un residuo de asparagina en la secuencia de tripéptidos Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La eliminación de un sitio de N-glicosilación se puede lograr mutando el residuo de Asn o de Ser/Thr en un residuo diferente, en particular mediante sustitución conservadora. La desamidación de los residuos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como el pH y la exposición de la superficie. Los residuos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor grado en otras secuencias de dipéptidos, tales como Asn-Ala. Cuando un sitio de desamidación de este tipo, en particular Asn-Gly, está presente en una secuencia de la CDR, por lo tanto, puede ser deseable eliminar el sitio, típicamente mediante sustitución conservadora para eliminar uno de los residuos implicados. En el caso de ADC, la unión de un citotóxico a mAb podría prepararse mediante enlace covalente al residuo de la cadena lateral de lisina. Este impedimento estérico puede interferir con la unión del mAb al antígeno. Por lo tanto, puede ser deseable eliminar el residuo de lisina, típicamente mediante una sustitución conservadora de arginina. La sustitución en una secuencia de CDR para eliminar uno de los residuos implicados también pretende estar abarcada por la presente invención. Los autores de la invención generaron, además, anticuerpos humanizados "huMAb1_1", "huMAb1_2", "huMAb1_3" basados en injertos de CDR y/o en Trayectorias Dinámicas Moleculares (protocolo de humanización 4D) como se describe en el Ejemplo 7.2.1 y en esta memoria más adelante.
Por consiguiente, en una realización, los anticuerpos anti-LAMP1 en el contexto de la invención son anticuerpos anti-LAMP1 humanizados obtenidos mediante injerto de CDR y/o basados en Trayectorias de Dinámica Molecular (protocolo de humanización 4D).
Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo anti-LAMP1 humanizado "huMAb1_1" comprende:
• el dominio variable (VH1) de la cadena pesada que consiste en la secuencia
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGN
GDAPYSQKFQGKATLTADTSTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCVRANWDVAFAYWGQGT
LVTVSS<SEQ ID NO : 53) y
• el dominio variable (VL1) de la cadena ligera que consiste en la secuencia
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKAPRLLIHDTSTLQ
SGVPSRFSGSGSGRDYTLTISNLEPEDFATYYCLQYDNLWTFGGGTKVEIK (SEQ ID
NO : 56).
El anticuerpo "huMAb1_2" humanizado comprende:
• un dominio variable (VH2) de la cadena pesada que consiste en la secuencia
QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDA
PYSQKFQDRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDSAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVS VSS (SEQ ID NO: 54),
y
• un dominio variable de la cadena ligera (VL2) que consiste en la secuencia
DIQMTQSPPSLSASVGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKGPKLLIHDTSTLQPGIP
SRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 57)
El anticuerpo "huMAb1_3" humanizado comprende:
• un dominio variable (VH3) de la cadena pesada que consiste en la secuencia
QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNGDA
PYAQKFQGRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDTAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 55),
y
• un dominio variable de la cadena ligera (VL3) que consiste en la secuencia
DIQMTQSPSSLSASVGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQQKPGKGPKLLIHDTSTLQPGVP
SRFSGSGSGRDYSLTISSLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 58)
La invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a proteínas LAMP1 humanas y de Macaca fascicularis.
"Afinidad"se define, en teoría, por la asociación de equilibrio entre el anticuerpo completo y el antígeno. Puede evaluarse experimentalmente mediante una diversidad de métodos conocidos, tales como medir las tasas de asociación y disociación con resonancia de plasmón de superficie o medir la CE50 en un ensayo inmunoquímico (ELISA, FACS). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es un ensayo bioquímico que utiliza un inmunoensayo enzimático en fase sólida para detectar la presencia de una sustancia, habitualmente un antígeno, en una muestra líquida o una muestra húmeda. . Los antígenos de la muestra se adhieren a una superficie. Luego, se aplica un anticuerpo específico adicional sobre la superficie para que pueda unirse al antígeno. Este anticuerpo se une a una enzima y, en la etapa final, se añade una sustancia que contiene el sustrato de la enzima. La reacción subsiguiente produce una señal detectable, más comúnmente un cambio de color en el sustrato. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células biológicas en dos o más recipientes, una célula a la vez, basado en las características específicas de dispersión de luz y fluorescencia de cada una de las células. En estos ensayos, la CE50 es la concentración del anticuerpo que induce una respuesta a mitad de camino entre la línea base y máxima después de un tiempo de exposición especificado en una concentración definida de antígeno por ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o célula que expresa el antígeno por FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia).
Un anticuerpo monoclonal de unión al antígeno 1 (Ag1) es de "reactividad cruzada" al antígeno 2 (AG2) cuando las CE50s están en un intervalo similar para ambos antígenos. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 tiene reactividad cruzada con Ag2 cuando la relación de afinidad de Ag2 a afinidad de Ag1 es igual o menor que 10 (en particular 5, 2, 1 o 0,5), midiéndose las afinidades con el mismo método para ambos antígenos.
Un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 "no presenta una reactividad cruzada significativa" con Ag2 cuando las afinidades son muy diferentes para los dos antígenos. La afinidad por Ag2 puede no poder medirse si la respuesta de unión es demasiado baja. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 no presenta una reactividad cruzada significativa con Ag2, cuando la respuesta de unión del anticuerpo monoclonal a Ag2 es menor que 5% de la respuesta de unión del mismo anticuerpo monoclonal a Ag1 en la misma configuración del experimento y en la misma concentración de anticuerpos. En la práctica, la concentración de anticuerpo utilizada puede ser la CE50 o la concentración requerida para alcanzar la meseta de saturación obtenida con Ag1.
Un anticuerpo monoclonal "se une específicamente" a Ag1 cuando no presenta una reacción cruzada significativa con Ag2.
El anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente a proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis. No presenta una reacción cruzada significativa con LAMP2 humana (SEQ ID NO: .40).
En un ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad (CE50) por LAMP1 humana y/o de mono cynomolgus, expresada en la superficie celular de una línea celular recombinante, en donde la línea celular puede ser HEK293 y/o HCT116 y la aparente afinidad medida mediante citometría de flujo es < 70nM, por ejemplo, <60nM, < 50nM, < 45nM, < 40nM, < 35nM, < 30nM, < 25nM, < 20nM, < 15nM o < 10 nM.
En un ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad (CE50) por LAMP1 humana y de mono cynomolgus de longitud completa expresada en la superficie de las células de una línea celular recombinante, en donde la línea celular puede ser HCT116 y la afinidad aparente medida vía citometría de flujo es < 20nM, en particular <10nM, < 8nM o < 7 nM.
En un ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad (CE50) por LAMP1 de mono cynomolgus expresada en la superficie de las células de una línea celular recombinante, en donde la línea celular puede ser HEK293 y la afinidad aparente medida vía citometría de flujo es < 50 nM, por ejemplo < 40 nM o < 35 nM.
En otro ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una KD para LAMP1 humana completamente purificada (SEQ ID NO 28) expresada en células HEK293 medida mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) es < 70 nM, por ejemplo < 60 nM, < 50 nM, < 40 nM, < 30 nM, < 20 nM o < 10 nM.
El uso de resonancia de plasmón de superficie para determinar es conocido por los expertos en la técnica. En un ejemplo, la cinética de unión de, por ejemplo, los mAbs anti-LAMP1 de murino, quimérico o humanizado se determinó mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie utilizando típicamente un aparato BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ). Por lo tanto, por ejemplo, se acopló un chip biosensor CM5 BIAcore en el instrumento y se activó con, por ejemplo, 70 pL de NHS/EDC 1:1 a temperatura ambiente. Típicamente, se inmovilizó un Fc de IgG1 anti­ humano de ratón (BIAcore n° BR-1008-39) y un Fc de IgG1 anti-murino de conejo (BIAcore n° BR-1008-38) (50 pg/mL en tampón acetato 1 M, pH 5) en los chips activados en todas las celdas de flujo. La inmovilización se llevó a cabo a un caudal de, por ejemplo, 10 pL/min hasta la saturación. A continuación, el chip se bloqueó mediante, por ejemplo, la inyección de 70 pL de etanolamina-HCl, pH 8,5, seguido de un lavado con MgCl23 M para Fc de IgG1 anti-humano y un lavado con glicina-HCl 10 mM pH 1,7 para Fc de IgG1 anti-murino. Para medir la unión de, por ejemplo, mAbs anti-LAMP1 a LAMP1, se utilizaron anticuerpos a razón de 1-5 pg/mL en tampón de desarrollo BIAcore (HBS-EP). El antígeno, por ejemplo (Secuencia ID N° 28, proteína producida como se describe en el Ejemplo 6.2) se inyectó, por ejemplo, de 1 a 256 nM. Una vez completada la fase de inyección, se controló la disociación en un tampón de desarrollo BIAcore al mismo caudal durante típicamente 600 s. La superficie se regeneró típicamente entre inyecciones utilizando, por ejemplo, 2 x 5 pL de MgCl23 M (2 x 30 s) o Fc de IgG1 anti-humano y 1 x 30 pL de glicina-HCl 10 mM pH 1,7 para Fc de IgG1 anti-murino (180 s). Los sensogramas individuales se analizaron típicamente utilizando el software BIAevaluation.
Por lo tanto, el polipéptido de acuerdo con la invención puede utilizarse en estudios toxicológicos realizados en monos, en los que el perfil de toxicidad obtenido de esos estudios es relevante para anticipar posibles efectos adversos en seres humanos.
Alternativamente, o además, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad (CE50) por LAMP1 expresada en la superficie del tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P y medida mediante citometría de flujo es <50 nM, <40 nM, en particular < 30 nM, < 20 nM o < 5 nM.
La capacidad de unión de anticuerpos o ABC es la cuantificación del antígeno de superficie celular. ABC se puede medir utilizando QIFIKIT® (marca registrada de BIOCYTEX). Los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen un ABC elevado en muchos xenoinjertos derivados de pacientes de diferente origen (> 20.000, en particular > 50.000, > 100.000, > 150.000 ABC) y líneas de células tumorales, en particular células tumorales de colon, tales como Colo205, SW480 o LS174T (> 1.500, > 2.500, > 4.000 ABC).
Alternativamente, o, además, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene la capacidad de internalizar y reciclar LAMP1 a la membrana celular. En particular, cuando se une a un anticuerpo de acuerdo con la invención, una molécula de LAMP1 en la membrana de la célula cancerosa tiene la capacidad de experimentar al menos 1,4, 7 o 9 reciclajes en la membrana celular. En otras palabras, una molécula de LAMP1 expresada en la superficie de una célula cancerosa puede unir y, por lo tanto, internalizar, al menos 2, 5, 8 o 10 moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención. Aún en otras palabras, de acuerdo con una realización, al menos 2, 5, 8 o 10 moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención son internalizadas por una molécula de LAMP1 expresada en la superficie de una célula cancerosa.
La internalización puede ensayarse, por ejemplo, determinando una puntuación de internalización o mediante un método de extinción basado en fluorescencia.
La puntuación de internalización (IS) se define como una relación de la intensidad de la fluorescencia dentro de la célula a la intensidad de toda la célula. Puede medirse como se describe utilizando el citómetro de flujo de formación de imágenes ImageStream* (del proveedor Amnis® Corporation, 2505 Third Avenue, Suite 210, Seattle, WA 98121­ 1480, www.amnis.com). Cuanto mayor sea la puntuación, mayor será la intensidad de la fluorescencia dentro de la célula. Como lo describe Amnis (véase www.amnis.com). el interior de la célula está definido por una erosión de una máscara que se ajusta a la membrana de la célula. La puntuación no varía con el tamaño de la célula y puede acomodar regiones brillantes concentradas y pequeñas manchas oscuras. La relación se mapea a una escala logarítmica para aumentar el intervalo dinámico a valores entre {-inf, inf}. El grosor de la membrana (en píxeles) determina qué píxeles se utilizan para definir el límite y las partes de la membrana de la célula. El usuario proporciona una máscara ‘interna’ basada en la imagen de campo claro que cubre el interior de la célula, el grosor de la membrana en píxeles y el canal fluorescente de interés. La célula se divide en 2 regiones: externa (B) e interna (I). El usuario proporciona la región interna como la máscara. La región externa está determinada por: 1. Dilatar la máscara interna por el grosor de la membrana. 2. Combinar 1 con la máscara objeto del canal de interés. 3. La región externa es igual a la máscara 2 y no a la máscara interna. A continuación, se determina la intensidad media del cuartil superior de los píxeles en cada una de las regiones. La puntuación de internalización (IS) se calcula de la siguiente manera:
Figure imgf000022_0001
en que
Ü _ m¡ m -4- r m B E PLB
mi = intensidad media de los píxeles del cuartil superior en I, mB = intensidad media de los píxeles del cuartil superior en B,
pl = Intensidad pico de los píxeles del cuartil superior en I, pB = Intensidad pico de los píxeles del cuartil superior en B.
En el caso de la transferrina, (Williams A. et al., 1996, Biomembranes, 4:255-287) los autores han obtenido una IS de 0 cuando las células se dejaron en hielo y una IS de 0,9 cuando las células se incubaron a 37°C durante una hora.
Para los anticuerpos de la invención, los autores de la misma han demostrado que las puntuaciones de internalización (IS) a 37°C eran 10 veces más altas que a 4°C. Dado que la internalización de anticuerpos no tiene lugar a 4°C, las puntuaciones de internalización obtenidas a 4°C reflejan la densidad de las moléculas LAMP1 en la superficie celular. Por tanto, un valor 10 veces mayor del parámetro IS a 37°C que a 4°C significa que la proteína LAMP1 se recicla rápida y repetidamente en la membrana celular. En otras palabras, los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen una capacidad de internalización muy alta, muy superior a la capacidad calculada a partir de la densidad de la proteína LAMP1 en la superficie celular.
La cuantificación de la internalización también se puede realizar mediante métodos de extinción basados en fluorescencia. En particular, se ha descrito un método de extinción de Alexa488 basado en fluorescencia para analizar la internalización de agentes diana (Frejd et al. 2010, International Journal of Oncology, 36: 757-763). De acuerdo con dicha descripción, la internalización se calcula como el valor de intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células extinguidas (solo compartimentos intracelulares) dividido por el valor de MFI de las células no extinguidas (tanto en la superficie celular como en los compartimientos intracelulares) a 37°C, de acuerdo con lo siguiente fórmula:
FOrcentaja de fracción internalizada: FL de célu las exting u idas a £7*0
XtOO
FL ae células no inguidas a 37"C
Las células incubadas con compuestos marcados con Alexa488 a 4°C se utilizan como un control, ya que la internalización de anticuerpos no tiene lugar a 4°C.
Los autores de la invención demostraron que después de la extinción, la fluorescencia total de Alexa488-MAb1 medida a partir de células marcadas a 37°C (tanto en la superficie celular como en los compartimientos intracelulares) fue 10 veces mayor que la fluorescencia de las células marcadas a 4°C (superficie celular) después 4 h (Ejemplo 4.4). Por consiguiente, estos resultados también indican que la proteína LAMP1 se recicla rápida y repetidamente en la membrana celular.
Por lo tanto, los autores de la invención demostraron por primera vez que LAMP1 puede funcionar como un receptor que media en la internalización de anticuerpos y sugieren que la disponibilidad de anticuerpos internalizantes específicos debería ayudar a desarrollar nuevos métodos terapéuticos para fijar como objetivo toxinas, fármacos o isótopos de corto alcance para ser suministrados específicamente al interior de las células cancerosas.
Además, los autores de la invención pudieron demostrar que los resultados del Ejemplo 4.4, tomados en conjunto, indican que cada una de las moléculas de LAMP1 está implicada en varios (al menos hasta 10 en promedio) ciclos de internalización mediante el reciclaje en la membrana celular durante el curso del experimento.
El anticuerpo de la invención se une específicamente a un dominio que consiste, en particular, en el primer al tercer bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis. El dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 humana está definido por los aminoácidos Ala29 a Ile309 de SEQ ID NO: 24 y el dominio que consiste en el primer al tercer bucles de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis está definido por los aminoácidos Ala27 a Thr307 de SEQ ID NO: 39. De acuerdo con una realización, el anticuerpo de la invención se une específicamente al primer dominio luminal de las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis.
El primer dominio luminal de LAMP1 humana está definido por los aminoácidos en las posiciones Ala29 a Arg195 de SEQ ID NO: 24, y el primer dominio luminal de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis está definido por los aminoácidos en las posiciones Ala27 a Arg193 de SEQ ID NO: 39. Más específicamente, el anticuerpo puede unirse al primer dominio luminal humano y de Macaca fascicularis indistintamente si se expresa como un dominio extracelular soluble (p. ej., los aminoácidos Ala29-Met382 para LAMP1 humano (SEQ ID NO: 24) o Ala27-Met380 para LAMP1 de Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 39)), o como una proteína LAMP1 de longitud completa anclada a la membrana expresada de manera recombinante en la superficie de una línea celular, por ejemplo la línea celular HT29, Colo205 y HCT116, HEK293. Los autores de la invención demostraron que Mab1 se une a los aminoácidos 101 a 195 de SEQ ID NO: 24 correspondientes al Bucle 2 de LAMP1 humana, por ejemplo, a los aminoácidos 101 a 110 (SEQ ID NO: 72), 144 a 157 (SEQ ID NO: 73) y 174 a 188 (SEQ ID n O: 74) de SEQ ID NO: 24 tal como se describe en esta memoria en el Ejemplo 4.8. Se ha identificado, además, mediante cristalografía, que el sitio de unión de MAb1 abarca además los aminoácidos Asn35, Cys80, Gly 81, Glu83, Asn84 ubicados en el bucle 1 de SEQ ID NO: 24.
Por consiguiente, MAb1 también se une a los aminoácidos en las posiciones 29 a 100 de SEQ ID NO: 24 correspondiente al Bucle 1 de LAMP1 humana, por ejemplo a una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 35 a 84 de SEQ ID NO: 24 (SEQ ID NO: 97), o a dos regiones que consisten en Asn35 de SEQ ID NO: 24 y aminoácidos en las posiciones 80-84 de SEQ ID NO: 24.
Además, tanto MAb2 como MAb3 se unen a los aminoácidos 29 a 100 (SEQ ID NO: 77) de SEQ ID NO: 24 correspondiente al Bucle 1 de LAMP1 humana, por ejemplo MAb2 y MAb3 se unen ambos a los aminoácidos 29 a 41 ( SEQ ID NO: 75) y 68 a 80 (SEQ ID NO: 76) de SEQ ID NO: 24.
En un anticuerpo adicional, el anticuerpo descrito se une específicamente al segundo dominio luminal de las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis, por ejemplo, al cuarto bucle.
El cuarto bucle de la proteína LAMP1 humana consiste en aminoácidos en las posiciones Leu310 a Met382 de SEQ ID NO: 24 y el cuarto bucle de la proteína LAMP1 de Macaca fascicularis consiste en aminoácidos en las posiciones Leu 308 a Met380 de SEQ ID NO: 39.
Más específicamente, el anticuerpo se une a una región del Bucle 4 que comprende los aminoácidos 360 a 375 de LAMP1 humana que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 82.
En otro ejemplo, el anticuerpo de la invención se une específicamente a proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis indistintamente, ya sea en forma no glicosilada o glicosilada.
Por consiguiente, en un ejemplo, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a:
• tres regiones del Bucle 2 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:
73 y SEQ ID NO: 74, respectivamente, y opcionalmente además de una región del Bucle1 de LAMP1 humana que consiste en la secuencia (SEQ ID NO: 97); o
• dos regiones del Bucle 1 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO:
76, respectivamente; o
• una región del Bucle 4 de LAMP1 humana que consisten en la secuencia SEQ ID NO: 82.
Además, los autores de la invención identificaron los residuos R146, D150, K152, R106, A108, N181, S182, S183, R186 y G187 de SEQ ID NO: 24 con probabilidad de interactuar con MAb1 como se describe en el Ejemplo 6.5. Además, identificaron los residuos A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75 y R77 de SEQ ID NO: 24 con probabilidad de interactuar con MAb2 y/o Mab3. Estos residuos han sido reemplazados individualmente por un residuo de alanina en la secuencia de LAMP1 derivada de hLAMP1_AGYQTI y codificada en el plásmido pXL5626 como se describe en el Ejemplo 6.6. Los autores de la invención observaron una pérdida de unión a MAb1 para mutaciones de alanina en las posiciones 1149, D150 y R186 de SEQ ID NO: 24 en la proteína LAMP1, lo que indica que estas posiciones son importantes para la unión de MAb1 a LAMP1. Además, se demostró la pérdida de unión de LAMP1 a MAb3 para mutaciones de alanina en las posiciones G38 y D70 de SEQ ID NO: 24 debido a la sustitución de Ala en la proteína LAMP1, lo que indica que estas posiciones son importantes para la unión de MAb3 a LAMP1.
Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a:
• los aminoácidos 1149, D150 y R186 de SEQ ID NO: 24, o
• los aminoácidos G38 y D70 de SEQ ID NO: 24.
La divulgación también proporciona un anticuerpo que compite por unirse a un dominio que consiste en el primer al tercer bucles de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los denominados anticuerpos Mab1, Mab2, MAb2Can, MAb3, MAb3 VL_R24_R93, huMAb1_1 y huMAb1_2, huMAb1_3 es decir:
(i) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 1 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 5 de acuerdo con la invención; o
(ii) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 8 y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia de secuencia SEQ ID NO: 12; o
(iii) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 15 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 16; o
(iv) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 42 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 46; o
(v) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 42 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 51; o
(vi) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 53 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 56 de acuerdo con la invención; o
(vii) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 54 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 57 de acuerdo con la invención; o
(viii) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 55 y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 58 de acuerdo con la invención.
En una realización, dicho anticuerpo compite por unirse al primer dominio luminal de las proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo que compite por unirse a:
• tres regiones del Bucle 2 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:
73 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; o
• dos regiones del Bucle 1 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO:75 y SEQ ID NO:
76, respectivamente,
con un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera tal como se define de acuerdo con i-viii) arriba, según sea apropiado (es decir, con dichas tres regiones del Bucle 2 para un anticuerpo como se define de acuerdo con i y vi-viii) arriba, o con dichas dos regiones del Bucle 1 para un anticuerpo como se define de acuerdo con ii-v)).
En un ejemplo, la competencia se determina mediante el uso de un ELISA tal como se describe en el Ejemplo 4.8 de la mmeoria descriptiva, en donde la competencia se define por una señal de menos del 80% de la señal en comparación con el control de mAb solo evaluado por absorción, cuando los dos anticuerpos competidores están en solución con una molaridad similar, y en donde la competencia se define por una señal de menos del 80%, por ejemplo, menos del 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%.
La capacidad de un anticuerpo de competir por la unión a un dominio que consiste en el primer al tercer bucles, en particular al primer dominio luminal, de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesada y ligera variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los denominados anticuerpos MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3_VLR24-R93, huMAb1_1, huMAb1_2 y huMAb1_3 (en adelante, un anticuerpo de "referencia") se puede analizar fácilmente, por ejemplo, mediante ELISA competitivo, en donde el antígeno (es decir, un polipéptido que comprende o consiste en un fragmento de LAMP1 humana o de Macaca fascicularis que incluye el primer al tercer bucles de LAMP1, o el primer dominio luminal, en particular una proteína que contiene el primer dominio luminal de LAMP1 de origen humano y de cynomolgus tal como se presenta en Ejemplo 6.3) se une a un soporte sólido y se añaden dos soluciones que contienen el anticuerpo candidato y el anticuerpo de referencia, respectivamente, y se deja que los anticuerpos compitan por la unión al antígeno. A continuación, puede medirse la cantidad de anticuerpo de referencia unido al antígeno y compararse con la cantidad de anticuerpo de referencia unido al antígeno cuando se mide frente a un control negativo. Una cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del anticuerpo candidato, disminuida en comparación con la cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del control negativo, indica que el anticuerpo candidato ha competido con el anticuerpo de referencia. Convenientemente, el anticuerpo de referencia puede marcarse (p. ej., de forma fluorescente) para facilitar la detección del anticuerpo de referencia unido. Se pueden realizar mediciones repetidas con diluciones seriadas del anticuerpo candidato y/o de referencia.
En otro ejemplo, la competición de unión entre MAb1 y MAb2 o Mab3 se puede medir típicamente entre dos mAbs anti-LAMP1 mediante ELISA con LAMP1 humana recombinante revestida en placa (tal como se describe en el Ejemplo 6.2). Brevemente, típicamente se añadieron dos mAbs simultáneamente a concentraciones de por ejemplo 0,06 y 15 mg/L, estando la concentración de típicamente 0,06 mg/L próxima a la CE50. El formato de mAb se eligió de modo que los dos mAbs tuvieran dominios Fc diferentes (humanos o murinos). Las mediciones individuales de la unión de mAb se podrían realizar típicamente por su unión específica única a Fc (por ejemplo, con Ab IgG Anti-Humano de Cabra Peroxidasa-AffiniPure, Específico del Fragmento Fcy (Jackson 109-035-098) o con Ab IgG Anti-Ratón de Cabra Peroxidasa-AffiniPure, Específico del Fragmento Fcy (Jackson 115-035-164)). Los resultados se expresaron como un porcentaje del valor obtenido del mAb solo a la misma concentración.
En particular, el anticuerpo de la divulgación comprende las secuencias de CDR de las cadenas pesada y/o ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-LAMP1 MAb1, MAb2 y Mab3. Más específicamente, el anticuerpo puede comprender las secuencias de CDR de la cadena pesada/ligera, o las secuencias de CDR de las cadenas pesada y ligera, de uno de los denominados anticuerpos anti-LAMP1 MAb1, MAb2, MAb3 y MAb3 VL_R24_R93.
Por consiguiente, el anticuerpo puede comprender:
(i) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 2 en una sustitución de un aminoácido, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 3 en una sustitución de un aminoácido y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 4 en una sustitución de un aminoácido; y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 6, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 6 por una sustitución de un aminoácido, una CDR2-L de secuencia DTS o una secuencia que difiere de DTS en una sustitución de un aminoácido y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 7 en una sustitución de un aminoácido de acuerdo con la invención; o
(ii) una CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 9, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 9 en una sustitución de un aminoácido, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 10, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de un aminoácido, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 11, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de un aminoácido; y/o
una CDR1 -L de secuencia SEQ ID NO: 13, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de un aminoácido, una CDR2-L de secuencia AAS o una secuencia que difiere de AAS en una sustitución de un aminoácido y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 14, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 14 en una sustitución de un aminoácido; y/o
(iii) una CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 43, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 43 en una sustitución de un aminoácido, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 44, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 44 en una sustitución de un aminoácido y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 45, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 45 en una sustitución de un aminoácido; y/o
una CDR1 -L de secuencia SEQ ID NO: 49, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 47 en una sustitución de un aminoácido, una CDR2-L de secuencia YTS o una secuencia que difiere de YTS en una sustitución de un aminoácido y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 48 o SEQ Id NO: 52, o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 52 en una sustitución de un aminoácido.
En un ejemplo adicional, el anticuerpo comprende las secuencias de CDR de las cadenas pesada y/o ligera del denominado anticuerpos Mab4 anti-LAMP1. Más específicamente, el anticuerpo puede comprender las secuencias de CDR de la cadena pesada/ligera, o las secuencias de CDR de las cadenas pesada y ligera, del denominado anticuerpo Mab4 anti-LAMP1.
Por consiguiente, el anticuerpo descrito puede comprender una CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 83, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 84, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 85, una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 86, una CDR2-L de secuencia NAK y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 87.
Además, el anticuerpo descrito puede comprender o consistir en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 98 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 99 (es decir, cadena pesada y/o ligera de MAb4 como se describe en Ejemplo 17.2.3).
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser quimérico, humanizado o un fragmento de anticuerpo.
Se contempla que un aminoácido individual se puede alterar por sustitución, en particular por sustitución conservadora, en una o más (en particular en solo una) de las secuencias de la CDR anteriores. Una alteración de este tipo puede estar destinada, por ejemplo, a eliminar un sitio de glicosilación o un sitio de desamidación, en relación con la humanización del anticuerpo. Otra alteración también podría estar destinada a eliminar una lisina en una CDR, ya que la unión covalente al citotóxico a través del residuo de la cadena lateral de lisina puede interferir con la unión al antígeno en el caso de ADC. Por ejemplo, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 52 son secuencias de CDR3-L que difieren en una sustitución de un aminoácido en su posición 5.
El anticuerpo puede comprender
(i) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4; y/o
una CDR1-L de secuencia SeQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS, y
una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7 de acuerdo con la invención; o
(ii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 9, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 11; y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-L de secuencia AAS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 14; o
(iii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 43, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 44 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 45, y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 47, una CDR2-L de secuencia YTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 52.
En particular, el anticuerpo puede comprender:
(i) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 3, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4, y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7 de acuerdo con la invención; o
(ii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 9, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 11, y/o
una CDR1-L de secuencia SeQ ID NO: 13, una CDR2-L de secuencia AAS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 14; o
(iii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 43, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 44, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 45, y/o
CDR1 -L de secuencia SEQ ID NO: 47, una CDR2-L de secuencia YTS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO:
48 o SEQ ID NO: 52.
(iv) un fragmento de anticuerpo de unión a LAMP1 de un anticuerpo como se define en (i), (ii) o (iii) de acuerdo con la invención.
Los autores de la invención cristalizaron Fab recombinante de huMAb1_1 que se identificó para unirse al bucle 1 y al bucle 2 en un complejo con la proteína LAMP1 no glicosilada de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 7.3.1. Basándose en la determinación de la estructura tridimensional de huMab1_1 en el complejo con LAMP1, la mayoría de sus CDR se pueden asociar a una estructura canónica específica como se hace referencia en Al-Lazikini, Lesk y Chothia (1997) J.Mol.Biol. 273: 927-948 arriba mencionado. La estructura cristalina permitió determinar mutaciones que pueden introducirse en las CDRs sin alterar dicha estructura canónica. Los expertos en la técnica saben que la alteración de dicha estructura canónica daría como resultado un comportamiento de unión modificado. Por lo tanto, identificaron mediante el análisis de la estructura cristalográfica que Q27 y D28 de la SEQ ID NO: 68 ubicados en CDR1-L pueden ser reemplazados por cualquier aminoácido siempre que el bucle conserve la estructura canónica k2B e I29 de SEQ ID NO: 68 puede ser reemplazado por residuos hidrófobos equivalentes, por ejemplo, Leu o Val. T51 de SEQ ID NO: 68 y una S52 de SEQ ID NO: 68, ambos ubicados en CDR2-L pueden ser reemplazados por una Ser, en el caso de T51, y por cualquier aminoácido, en el caso de S52, siempre que este bucle conserve la clásica conformación de giro Y- Los residuos D92, N93, L94 de SEQ ID NO: 68 ubicados en CDR3-L pueden ser reemplazados por cualquier aminoácido siempre que el bucle conserve la estructura canónica A1B. Además, G26 de SEQ ID NO: 69, ubicado en CDR-1H puede ser reemplazado por cualquier aminoácido, Y27 de SEQ ID NO: 69, localizado en CDR-1H por una fenilalanina, T30 de SEQ ID NO: 69 ubicado en CDR-1H por cualquier aminoácido siempre que el bucle conserve la estructura canónica 1. Los residuos D102, V103 y A104 de SEQ ID NO: 69, ubicados en CDR-3H pueden ser reemplazados por cualquier aminoácido de tamaño y propiedades similares.
Por consiguiente, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a tres regiones del Bucle 2 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, respectivamente; y comprende a) una CDR1 -L que consiste en la secuencia X1X2X3 DRY (SEQ ID NO:93), en donde cada uno de los X1 y X2 es cualquier aminoácido y X3 se selecciona de Ile, Leu y Val; y
una CDR2-L que consiste en la secuencia DX1X2 , en donde X1 a se selecciona de T o S y X2 es cualquier aminoácido; y
una CDR3-L que consiste en la secuencia LQYX1X2X3WT, en la que X1, X2 y X3 es cualquier aminoácido; y/o b) una CDR1-H que consiste en la secuencia X1X2 IFX3NYN (SEQ ID NO: 82), en donde cada uno de X1 y X3 son cualquier aminoácido y X2 se selecciona de Tyr o Phe; y una CDR2-H que consiste en SEQ ID NO: 3; y CDR3-H que consiste en la secuencia VRANWX1X2X3 FAY (SEQ ID NO: 84), en donde cada uno de los X1, X2 , X3 es cualquier aminoácido.
En un ejemplo, dicho anticuerpo conserva la capacidad de unirse al bucle 2.
El experto en la técnica conoce métodos para verificar si el anticuerpo de acuerdo con la definición conserva su capacidad para unirse a tres regiones del bucle 2 de LAMP1 humana que consisten en las secuencias SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, respectivamente, y, por lo tanto, no sufre de una estructura canónica perturbada.
La divulgación también proporciona anticuerpos como los arriba definidos que comprenden, además, al menos el dominio variable de la cadena pesada y/o el dominio variable de la cadena ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-LAMP1 MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3 VL_R24_R93, huMAb1_1 y huMAb1_2, huMAb1_3, por ejemplo MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3,MAb3 VL_R24_R93.
Por tanto, la divulgación se refiere, en particular, a un anticuerpo que comprende:
(i) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 5 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma de acuerdo con la invención; o
(ii) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 8 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 12 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma; o
(iii) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 15 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 16 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma; o
(iv) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 42 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 51 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma; o
(v) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 53 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 56 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma de acuerdo con la invención; o
(vi) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 54 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 57 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma de acuerdo con la invención; o
(vii) un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 55 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 58 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma de acuerdo con la invención.
En un ejemplo, la divulgación se refiere a un anticuerpo anti-LAMP-1 aislado que comprende:
(i) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 2, una CDR2-H de secuencia SeQ ID NO: 3 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 4; y/o
una CDR1-L de secuencia SeQ ID NO: 6, una CDR2-L de secuencia DTS, y
una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 7 de acuerdo con la invención; o
(ii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 9, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 11; y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-L de secuencia AAS y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 14; o
(iii) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 43, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 44 y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 45, y/o una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 47, una CDR2-L de secuencia YTS y una CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 52; o
(iv) una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 83, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 84, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 85, y/o
una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 86, una CDR2-L de secuencia NAK y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 87; o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 60 o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 59; o
(v) o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 62 o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 61 de acuerdo con la invención; o
(vi) o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 64 o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 63 de acuerdo con la invención.
Por ejemplo, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51,53, 56, 54, 57, 55, 58, por ejemplo de SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51 según sea apropiado, en una o más sustituciones de aminoácidos, en particular en una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o sustituciones con residuos canónicos.
En particular, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51,53, 56, 54, 57, 55, 58, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51 mediante sustituciones de aminoácidos conservadoras, únicamente.
Las alteraciones de secuencia en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51, 53, 56, 54, 57, 55, 58, por ejemplo de SEQ ID NO: 1,5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 o 51 estarán presentes,en particular,esencialmente en una o más de las regiones marco, FR1-L, FR2-L, FR3-L, f R4-L y/o FR1- H, FR2-H, f R3-H, FR4-H.
Sin embargo, también son posibles las sustituciones de aminoácidos en una o más CDRs
La divulgación también se refiere a anticuerpos como los arriba definidos que comprenden, además, al menos el dominio variable de la cadena pesada y/o el dominio variable de la cadena ligera de uno de los denominados anticuerpos Mab4 anti-LAMP1.
Por lo tanto, la divulgación se refiere, en particular, a un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 88 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o un dominio variable de cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 89 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma.
El anticuerpo de acuerdo con la invención es, en particular, un anticuerpo convencional, en particular un anticuerpo monoclonal convencional, o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
De acuerdo con un ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende o consiste en una IgG, o un fragmento de la misma.
El anticuerpo descrito y un fragmento del mismo pueden ser, respectivamente, un anticuerpo murino y un fragmento de un anticuerpo murino.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico y, en particular, un anticuerpo murino/humano, p. ej., un anticuerpo que comprende dominios variables murinos de cadenas pesadas y ligeras y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser un fragmento de un anticuerpo de este tipo.
De acuerdo con un ejemplo, el anticuerpo descrito es:
a) un anticuerpo quimérico que comprende o consiste en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 17 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 18 (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb1 como se describe en el Ejemplo 7) de acuerdo con la invención;
b) un anticuerpo quimérico que comprende o consiste en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 19 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 20; (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb2 como se describe en el Ejemplo 7); o
c) un anticuerpo quimérico que comprende o consiste en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 21 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 22; (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb2Can como se describe en el Ejemplo 7); o
d) un anticuerpo quimérico que comprende o consiste en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 49 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 50; (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb3); o
e) un anticuerpo quimérico que comprende o consiste en una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 49 y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 81; (es decir, una cadena pesada y/o ligera de chMAb3_VLR24-R93; o
f) un fragmento del anticuerpo quimérico definido en a), b), c), d) y e).
El anticuerpo de la invención también puede ser un anticuerpo humanizado. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el anticuerpo de la invención comprende, o consiste en:
i) una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 60 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 59; o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma (es decir, cadena pesada y/o ligera de huMAb1_1 como se describe en el Ejemplo 7,2); o ii) una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 62 o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 61; o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma (es decir, cadena pesada y/o ligera de huMAb1_2 como se describe en el Ejemplo 7,2); o iii) una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 64 a o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma y/o una cadena ligera de la secuencia de secuencia SEQ ID NO: 63; o una secuencia al menos 85% idéntica a la misma (es decir, cadena pesada y/o ligera de huMAb1_3 como se describe en el Ejemplo 7,2).
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado. En una realización adicional, dicho anticuerpo humanizado se obtiene mediante la tecnología de acondicionamiento. Anticuerpos de este tipo también pueden denominarse anticuerpos "acondicionados".
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo. En particular, un fragmento de anticuerpo de dominio único puede consistir en una cadena pesada variable (VHH) que comprende las CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H de los anticuerpos como se describió arriba. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo de cadena pesada, es decir, un anticuerpo desprovisto de cadena ligera, que puede contener o no un dominio CH1.
El anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo también puede comprender las regiones marco de un anticuerpo de dominio único de camélido y, opcionalmente, el dominio constante de un anticuerpo de dominio único de camélido.
El anticuerpo de acuerdo con la invención también puede ser un fragmento de anticuerpo, en particular un fragmento de anticuerpo humanizado, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticuerpo, siendo al menos un fragmento de anticuerpo un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención. Los anticuerpos multiespecíficos son complejos de proteínas polivalentes como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 2050764 A1 o US 2005/0003403 A1.
Los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos pueden tener especificidad para (a) el primer a tercer bucles, en particular para el primer dominio luminal en LAMP1 humana/de Macaca fascicularis fijado como objetivo por uno de los denominados anticuerpos MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3_VLR24-R93 y (b) al menos otro antígeno. De acuerdo con un ejemplo, el al menos otro antígeno no es un miembro de la familia LAMP1 humana o de Macaca fascicularis y, en particular, no al menos una o todas las LAMP2 humanas y de Macaca fascicularis. De acuerdo con otro ejemplo, el al menos otro antígeno puede ser un epítopo en LAMP1 de Macaca fascicularis humana distinto de dichos primero a tercero bucles, en particular el primer dominio luminal fijado como objetivo por uno de los denominados anticuerpos MAb1, MAb2, MAb2Can y MAb3.
Dichos anticuerpos pueden producirse mediante cualquier técnica bien conocida en la técnica. En particular, dichos anticuerpos se producen mediante técnicas como se describe más adelante en esta memoria.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden utilizarse en un vector aislado (p. ej., purificado) de o contenido en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (p. ej., un liposoma).
Los anticuerpos descritos pueden representar cualquier combinación de las características arriba mencionadas.
Ácidos nucleicos, vectores y células huésped recombinantes
Un objeto adicional de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que codifica un anticuerpo de la invención como se definió arriba.
Típicamente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que puede incluirse en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o vector viral.
El término "vector" y las expresiones "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen extraño) puede ser introducido en una célula huésped, con el fin de transformar al huésped y fomentar la expresión (p. ej. transcripción y traducción) de la secuencia introducida.
Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.
Vectores de este tipo pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para provocar o dirigir la expresión de dicho polipéptido tras la administración a un sujeto. Ejemplos de promotores y potenciadores utilizados en el vector de expresión para células animales incluyen potenciador y promotor de citomegalovirus humano (Nelson, J., 1996 J. Virology 70: 3207-3986), promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami, T. e Itoh, S. et al., 1987, J Biochem. 101(5): 1307-1310), promotor LTR y potenciador del virus de la leucemia de ratón Moloney (Kuwana Y. et al., 1987, Biochem Biophys Res Commun. 149: 960- 968), promotor (Mason, J.O. et al., 1985, Cell 41: 479- 487) y potenciador (Gillies, S.D. et al., 1983, Cell 33: 717-728) de la cadena H de inmunoglobulina, y similares.
Puede utilizarse cualquier vector de expresión para células animales, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifique la región C del anticuerpo humano. Ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji, H. et al., 1990, Cytotechnology 3 (2): 133-140), pAGE103 (Mizukami, T. e Itoh, S. et al., 1987, J Biochem. 101 ( 5): 1307­ 1310), pHSG274 (Brady, G. et al., 1984, Gene 27(2): 223-232), pKCR (O'Hare, K. et al., 1981, Proc Natl Acad Sci USA. 78(3): 1527-1531), pSG1 beta d2-4-(Miyaji, H. et al., 1990, Cytotechnology 4: 173-180) y similares.
Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación pCEP5, o plásmidos integradores, tales como, por ejemplo, pUC, pcDNA, pBR y similares.
Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, del virus herpes y AAV. Virus recombinantes de este tipo pueden producirse mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como transfectando células de empaquetamiento o mediante transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para producir virus recombinantes con replicación defectuosa de este tipo, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.
Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una célula que ha sido transfectada, infectada o transformada por un ácido nucleico y/o un vector de acuerdo con la invención.
El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "extraño" (es decir, extrínseco) en una célula huésped, de modo que la célula huésped expresará el gen o la secuencia introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o la secuencia introducidos. Una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido ha sido "transformada".
Los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse para producir un anticuerpo recombinante de la invención en un sistema de expresión adecuado. La expresión "sistema de expresión" significa una célula huésped y un vector compatible bajo condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por a Dn extraño transportado por el vector e introducido en la célula huésped.
Los sistemas de expresión comunes incluyen células huésped de E. coli y vectores plasmídicos, células huésped de insectos y vectores de Baculovirus, y células huésped y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células huésped incluyen, sin limitación, células procarióticas (tales como bacterias) y células eucarióticas (tales como células de levadura, células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, etc.). Ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamíferos (p. ej., células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, células HEK293, etc.), así como cultivos de células de mamíferos primarios o establecidos (p. ej., producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Ejemplos también incluyen células SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), células P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), células CHO, en las que un gen de dihidrofolato reductasa (al que se alude en adelante como "gen DHFR") es defectuoso (Urlaub, G. et al .; 1980, Proc Natl Acad Sci USA. . 77(7): 4216-4220), células YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, a las que se alude en lo sucesivo como "células YB2/0"), y similares. La célula YB2/0 es de interés, ya que la actividad ADCC de los anticuerpos quiméricos o humanizados se potencia cuando se expresa en esta célula.
En particular, para la expresión de anticuerpo humanizado, el vector de expresión puede ser de un tipo en el que existe un gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpos humanizados, la facilidad de introducción en células animales y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L de anticuerpos en células animales, se prefiere el vector de expresión de anticuerpos humanizados del tipo tándem (Shitara, K. et al., 1994, J Immunol Methods. 3 de enero: 167(1-2): 271-8). Ejemplos de vector de expresión de anticuerpos humanizados de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 y similares.
La presente divulgación también se refiere a un método para producir una célula huésped recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se describió arriba en una célula huésped competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula huésped recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo.
Células huésped recombinantes de este tipo pueden utilizarse para la producción de anticuerpos de la invención.
Métodos de producir anticuerpos de la invención
Anticuerpos de la invención se pueden producir mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.
Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina, mediante técnicas estándares para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar utilizando un método en fase sólida bien conocido, en particular utilizando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos y las cadenas de inmunoglobulina de la invención pueden sintetizarse mediante técnicas de ADN recombinante como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el (poli)péptido deseado en vectores de expresión y la introducción de vectores de este tipo en huéspedes eucarióticos o procarióticos adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir del cual pueden ser posteriormente aislados utilizando técnicas bien conocidas.
En particular, la invención describe, además, un método para producir un anticuerpo de la invención, método que comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula huésped transformada de acuerdo con la invención; (ii) expresar dicho anticuerpo o polipéptido; y (iii) recuperar el anticuerpo o polipéptido expresado.
Métodos para producir anticuerpos humanizados o quiméricos implican ADN recombinante convencional y técnicas de transfección de genes son bien conocidos en la técnica (véase Morrison, S.L. y Oi, V.T., 1984, Annu Rev Immunol 2: 239-256 y documentos de patente US 5.202.238; y US 5.204. 244).
En un ejemplo particular, se puede producir un anticuerpo quimérico de la presente invención obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH murinos tal como se describió previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpos quiméricos insertándolos en un vector de expresión para células animales que tienen genes que codifican CH de anticuerpos humanos.y CL de anticuerpos humanos, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal.
En otro ejemplo particular, se puede producir un anticuerpo humanizado de la presente invención obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH humanizados tal como se describió previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpos humanizados insertándolos en un vector de expresión para células animales que tienen genes que codifican CH de anticuerpos humanos.y CL de anticuerpos humanos, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal.
Como dominio CH de un anticuerpo humanizado o quimérico, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas pesadas de inmunoglobulina humana, pero las de la clase IgG son adecuadas y también se puede utilizar una cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG, tales como IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, como CL de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a cadenas ligeras de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar las de clase kappa o la clase lambda.
Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la técnica descrita en la solicitud WO2009/032661, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT WO91/09967; pat. de EE.IUU. N°s 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o acondicionamiento (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka, G.M. et al., 1994, Protein Eng.7(6): 805-814; Roguska, M.A. et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(3): 969-973), y transposición de cadenas (Pat. de EE.UU. N° 5.565.332). También se conoce la tecnología de ADN recombinante general para la preparación de anticuerpos de este tipo (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la Solicitud de Patente Internacional WO 96/02576).
Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de hidroxiapatito cerámica, cromatografía de modo mixto, cromatografía de exclusión por tamaño, etc.
El Fab de la presente invención se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con LAMP1 con una proteasa, tal como papaína. Además, el Fab se puede producir insertando secuencias de ADN que codifican ambas cadenas del Fab del anticuerpo en un vector para la expresión procariótica, o para la expresión eucariótica, e introduciendo el vector en células procarióticas o eucarióticas (según corresponda) para expresar el Fab.
El F(ab’)2 de la presente invención se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con LAMP1 con una proteasa, pepsina. Además, el F(ab’)2 se puede producir uniendo el Fab’ descrito más adelante mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.
El Fab’ de la presente invención se puede obtener tratando F(ab’)2 que reacciona específicamente con LAMP1 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. Además, el Fab’ se puede producir insertando secuencias de ADN que codifican cadenas del Fab’ del anticuerpo en un vector para la expresión procariótica, o un vector para la expresión eucariótica, e introduciendo el vector en células procarióticas o eucarióticas (según corresponda) para realizar la expresión.
El scFv de la presente invención puede producirse tomando secuencias de las CDRs o dominios VH y VL como se describió previamente, construyendo un ADN que codifica un fragmento scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariótico o eucariótico y luego introduciendo el vector de expresión en células procarióticas o eucarióticas (según sea apropiado) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, se puede utilizar una tecnología bien conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de acuerdo con la invención e injertarlas en un marco de fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (véanse, p. ej., los documentos WO 98/45322; WO 87/02671; US 5.859.205; US 5.585.089; US 4.816.567; EP 0173494).
El anticuerpo de cadena sencilla o VHH dirigido contra LAMP1 puede obtenerse, por ejemplo, mediante un método que comprende las etapas de (a) inmunizar a un mamífero perteneciente a Camelidae con LAMP1 o un fragmento del mismo, con el fin de provocar anticuerpos (y, en particular, anticuerpos de cadena pesada) contra LAMP1; (b) obtener una muestra biológica de los Camelidae así inmunizados, comprendiendo dicha muestra secuencias de anticuerpos de cadena pesada y/o secuencias de Vh h que están dirigidas contra LAMP1; y (c) recuperar (p. ej., aislar) secuencias de anticuerpos de cadena pesada y/o secuencias de VHh que están dirigidas contra LAMP1 de dicha muestra biológica. El anticuerpo de cadena sencilla o VHH también se pueden obtener rastreando una colección que comprende secuencias de anticuerpos de cadena pesada y/o secuencias VHH en cuanto a secuencias de anticuerpos de cadena pesada y/o secuencias VHH que compiten por la unión al primer al tercer bucles, en particular al primer dominio luminal de proteínas LAMP1 humanas y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los denominados anticuerpos MAb1, MAb2, MAb2c a n ,MAb3, huMAb1_1 y huMAb1_2, huMAb1_3, por ejemplo, MAb1, MAb2, MAb2c a n ,MAb3.
Modificación de los anticuerpos de la invención
Se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en esta memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo.
Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención y en las secuencias de ADN que los codifican, y aún así dar como resultado un anticuerpo o polipéptido funcional con características deseables.
Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, a Dn , anticuerpos, antígenos, y similares. A cada uno de los aminoácidos se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Un objeto adicional de la presente divulgación también abarca variantes conservadoras de la función de los polipéptidos de la presente invención.
Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad funcional biológica, se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, obteniendo no obstante una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que se puedan realizar diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos, sin una pérdida apreciable de su actividad biológica.
Es conocido en la técnica que determinados aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropático similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtienen una proteína biológica funcionalmente equivalente. También es posible utilizar tecnologías bien establecidas, tales como enfoques de escaneo de alanina, para identificar, en un anticuerpo o polipéptido de la invención, todos los aminoácidos que pueden sustituirse sin una pérdida significativa de unión al antígeno. Residuos de este tipo pueden calificarse como neutros, ya que no están implicados en la unión del antígeno ni en el mantenimiento de la estructura del anticuerpo. Una o más de estas posiciones neutras pueden ser sustituidas por alanina o por otro aminoácido sin cambiar las características principales del anticuerpo o polipéptido de la invención.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
También puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, p. ej., con el fin de potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, se pueden introducir residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo con ello la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una destrucción incrementada de células mediada por el complemento y/o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Caron, P.C. et al., 1992, J Exp Med. 176(4): 1191-1195 y Shopes B., 1992, J Immunol. 148(9): 2918-2922).
Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo, es decir, eliminando uno o más restos de hidratos de carbono que se encuentran en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La presencia de cualquiera de las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en que X es cualquier aminoácido excepto prolina, crea un sitio de glicosilación potencial. La adición o supresión de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación enlazados a N).
Otro tipo de modificación del anticuerpo de la invención puede ser eliminar una lisina en una CDR o especialmente cerca de una CDR, ya que la unión covalente al residuo citotóxico de la cadena lateral de lisina puede interferir con la unión al antígeno en el caso de ADC.
Otro tipo de modificación implica la eliminación de secuencias identificadas, ya sea in silico o experimentalmente, como potencialmente resultantes en productos de degradación o heterogeneidad de preparaciones de anticuerpos. Como ejemplos, la desamidación de residuos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como el pH y la exposición de la superficie. Los residuos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor grado en otras secuencias de dipéptidos, tales como Asn-Ala. Cuando un sitio de desamidación de este tipo, en particular Asn-Gly, está presente en un anticuerpo o polipéptido de la invención, puede ser deseable eliminar el sitio, típicamente mediante sustitución conservadora para eliminar uno de los residuos implicados. Sustituciones de este tipo en una secuencia para eliminar uno o más de los residuos implicados también están destinadas a ser descritas por la presente divulgación.
Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procesos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación enlazada a Nor O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares pueden fijarse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como los de fenilalanina o tirosina, (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, métodos de este tipo se describen en el documento WO87/05330.
La eliminación de cualquier resto de hidrato de carbono presente en el anticuerpo se puede realizar de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacto el anticuerpo. La desglicosilación química está descrita por Sojahr, H. et al. (1987, Arch Biochem Biophys. 259(1): 52­ 57) y por Edge, A.S. et al. (1981, Anal Biochem. 118(1): 131-137). La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en anticuerpos se puede lograr mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura, NR. et al. (1987, Methods Enzymol 138: 350-359).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende enlazar el anticuerpo a uno de una diversidad de polímeros no proteicos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera recogida en las Patentes de EE.UU. N2s 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.
Por lo tanto, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un inmunoconjugado de la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a un polipéptido o un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, para uso como un medicamento.
"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según sea apropiado. Un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación sólido, semi-sólido o líquido no tóxico de cualquier tipo.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.
En particular, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. . Éstas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de sales de este tipo), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables
Las dosis utilizadas para la administración pueden adaptarse como una función de diversos parámetros y, en particular, como una función del modo de administración utilizado, de la patología relevante o, alternativamente, de la duración deseada del tratamiento.
Para preparar composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención en un soporte o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil capacidad de utilizar una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
El soporte puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos, agentes estabilizantes, crioprotectores o antioxidantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede realizarse mediante agentes antibacterianos y antifúngicos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes arriba enumerados, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado en vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en condiciones estériles del mismo.
Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables arriba descritas, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán medios acuosos estériles que pueden emplearse a la vista de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 mL de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 mL de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando.
La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
El anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede formular dentro de una mezcla terapéutica para comprender aproximadamente 0,01 a 100 miligramos, por dosis aproximadamente.
Métodos y usos terapéuticos
Los autores de la invención han demostrado que un anticuerpo dirigido contra el primer al tercer bucles de LAMP1, en particular contra el primer dominio luminal de LAMP1, en particular MAb1 y MAb2 y Mab3, es capaz de internalizar activamente el complejo receptor-anticuerpo de LAMP1 después de unirse y acumular probablemente a través de cavidades recubiertas. Los anticuerpos internalizados MAb1, MAb2 y Mab3 se ubicaron en los primeros endosomas y posteriormente se trasladaron y se acumularon en los compartimientos lisosomales.
El citómetro de flujo de formación de imágenes multiespectrales ImageStream (Amnis corp.) revela que los anticuerpos internalizados se acumulan en los compartimientos lisosomales. El análisis de inmunofluorescencia de células Colo205 viables incubadas con MAb1, MAb2 y MAb3 a 4°C mostró una tinción distinta de la membrana plasmática. La incubación de células a 37°C con MAb1, MAb2 y MAb3 reveló el marcaje tanto de la membrana plasmática como de las vesículas intracelulares después de 4 horas de incubación. Dado que la puntuación de internalización (IS) que revela la fluorescencia dentro de las células (medida a 37°C) es 10 veces mayor que la fluorescencia en la superficie de las células (medida a 4°C), esto significa que la proteína LAMP1 se recicla rápidamente en la membrana celular. Por lo tanto, los resultados de los autores de la invención demuestran por primera vez que LAMP1 podría funcionar como un receptor que media en la internalización de anticuerpos y sugieren que la disponibilidad de anticuerpos internalizantes específicos debería ayudar a desarrollar nuevos métodos terapéuticos para fijar como objetivo toxinas, fármacos o isótopos de corto alcance para ser suministrados específicamente al interior de las células cancerosas.
Además, los autores de la invención han demostrado que un anticuerpo de acuerdo con la invención, combinado con un maitansinoide citotóxico (DM4), induce actividad citotóxica in vitro en células tumorales HCT116 o HEK293 humanas que contienen una integración estable de la secuencia de ADN codificante de LAMP1 en el ADN genómico, en donde clones individuales presentan diferentes intensidades de LAMP1 en la superficie celular.
En otro Ejemplo 9.4, los autores de la invención demostraron que un anticuerpo de acuerdo con la invención, combinado con un dímero de tomamicina citotóxico, induce actividad citotóxica in vitro. También han demostrado que un anticuerpo combinado con un maitansinoide citotóxico (DM4) induce una marcada actividad antitumoral in vivo en un modelo murino de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon humano primario derivados de un paciente, cuando se utiliza a una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg, con una única inyección el día 17 después de la implantación del tumor tal como se describe en el Ejemplo 10.1.1.
Además, también han demostrado que este inmunoconjugado induce una marcada actividad antitumoral in vivo en un modelo murino de xenoinjertos de tumor primario de pulmón humano derivado de un paciente, cuando se utiliza a una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg kg, con una única inyección el día 26 después de la implantación del tumor tal como se describe en el Ejemplo 10.1.2.
Los autores de la invención también han demostrado que los inmunoconjugados de DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-chMAb2, DM4-SPDB-chMAb3 inducen una marcada actividad antitumoral in vivo en diferentes modelos murinos de diferentes modelos de xenoinjertos de cáncer tal como se muestra en los Ejemplos 10.2- 10.4.
Por ejemplo, se demostró que el inmunoconjugado DM4-SPDB-huMAb1_1 induce una marcada actividad antitumoral vivo en un xenoinjerto de carcinoma ductal invasivo humano primario y un xenoinjerto de tumor pulmonar primario humano derivado del paciente, cuando se utiliza en una dosis de 10 mg/kg , 5 mg/kg y 2,5 mg/kg con una sola inyección, tal como se describe en los Ejemplos 10.2.2 y 10.2.3.
También, los inmunoconjugados DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3 indujeron una marcada actividad antitumoral en xenoinjerto de carcinoma ductal invasivo humano primario derivado del paciente, cuando se utilizó en una dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg o 5 mg/kg, 2,5 mg/kg y 1,25 mg/kg, respectivamente, con una sola inyección, tal como se describe en los Ejemplos 10.3.2 y 10.4.
Por tanto, polipéptidos, anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer.
La invención se refiere, además, a un agente terapéutico anti-LAMP1 para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1 en células cancerosas.
En una realización, dicho paciente que alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1 en células cancerosas ha sido seleccionado mediante el método in vitrode selección de pacientes con cáncer. En particular, el uso comprende seleccionar dicho paciente que alberga el aumento en el número de copias del gen LAMP1 en células cancerosas mediante un método de selección de pacientes con cáncer de acuerdo con la invención.
La divulgación también se refiere a un método para tratar a un paciente con cáncer, que comprende
a) seleccionar un paciente con cáncer que probablemente responda a la terapia anti-LAMP1 mediante un método in vitro de seleccionar pacientes con cáncer de acuerdo con la invención; y
b) administrar terapia anti-LAMP1 a dicho paciente seleccionado.
La divulgación se refiere, además, a un método para seleccionar un paciente con cáncer para la terapia anti-LAMP1, que comprende:
(a) determinar, en una muestra biológica de un paciente con cáncer que incluye células cancerosas, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1; y
(b) administrar a dicho paciente terapia anti-LAMP1, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1.
La divulgación también se refiere a un método para tratar el cáncer un paciente, que comprende:
(a) determinar, en una muestra biológica de un paciente con cáncer que incluye células cancerosas, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1; y
(b) administrar a dicho paciente terapia anti-LAMP1, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1.
El cáncer que se ha de tratar con anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención es un cáncer que expresa LAMP1 en la superficie celular, en particular que sobre-expresa LAMP1 en la superficie celular en comparación con células normales (es decir, no tumorales) del mismo origen tisular.
La expresión de LAMP1 por parte de células cancerosas puede ensayarse fácilmente, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de acuerdo con la invención, tal como se describe en la siguiente sección "Usos de diagnóstico", y en particular mediante un método inmunohistoquímico, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 5.
En particular, el cáncer puede ser adenocarcinomas de colon, pero también tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas, estómago y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos, por ejemplo, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma de colon, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe o tejidos blandos.
En una realización, los tumores gastrointestinales son un tumor del intestino delgado, un tumor del recto y/o un tumor de la glándula parótida.
En una realización, los tumores de órganos reproductores, los tumores gastrointestinales son tumores de pulmón, tumor de hígado, tumor de páncreas, tumor de estómago y tumor de riñón.
En una realización, los tumores de órganos reproductores son tumores de mama, de ovario o de próstata.
El rastreo de un panel de tumores humanos mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo LAMP1 anti­ humano de ratón de acuerdo con la invención mostró de hecho tinción de anticuerpos en estos tipos de cánceres tal como se describe con más detalle en el Ejemplo 5.
En particular, LAMP1 que expresa células tumorales humanas puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas de colon, estómago, recto, pulmón, carcinoma ductal y lobular invasivo de mama y células de adenocarcinoma de próstata. De hecho, se encontró que estos tumores mostraban más del 50% de células positivas para la expresión de LAMP1 en la membrana celular (véase el Ejemplo 5).
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con cualquier agente inhibidor del crecimiento adecuado.
Los anticuerpos de la invención pueden conjugarse o enlazarse a un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico o una enzima activadora de profármacos tal como se describió previamente. Los anticuerpos de la invención pueden ser de hecho útiles para fijar como objetivo dicho agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o un profármaco a las células cancerosas que expresan o sobre-expresan LAMP1 en su superficie.
También es bien conocido que los anticuerpos monoclonales terapéuticos pueden conducir al agotamiento de las células que portan el antígeno específicamente reconocido por el anticuerpo. Este agotamiento puede estar mediado por al menos tres mecanismos: citotoxicidad celular mediada por anticuerpos, lisis dependiente del complemento e inhibición antitumoral directa del crecimiento tumoral a través de señales dadas a través del antígeno fijado como objetivo por el anticuerpo.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una céluladiana en presencia de complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento a los anticuerpos que se unen a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, p. ej., tal como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997).
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que los anticuerpos secretados se unen a receptores Fc (FcRs) presentes en determinadas células citotóxicas (p. ej., células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) que permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente exterminar la célula diana. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, también se contempló un ensayo de ADCC in vitro tal como el descrito en la Patente de EE.UU. N° 5.500.362 o 5.821.337. Los expertos en la técnica conocen que mutaciones específicas, tales como la mutación D265A de acuerdo con la nomenclatura descrita por Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991) disminuyen significativamente la unión a FcziRs y ADCC (Lund et al., J. Immunol., 157:4963-4969, 1996; Shields et al., J. Biol. Chem., 276(1): 6591- 6604, 2001).
En un ejemplo, la mutación de 266A de, por ejemplo, SEQ ID NO: 56 en hulgG1 corresponde a la mutación D265A arriba mencionada y, por lo tanto, disminuye significativamente la unión a FcziRs y ADCC.
Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de este tipo de anticuerpo, inmunoconjugado o composición farmacéutica de la invención.
"Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" o "ADCP" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que los anticuerpos unidos a receptores Fc (FcRs) presentes en determinadas células citotóxicas (p. ej., macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente exterminar la célula diana mediante fagocitosis. Para evaluar la actividad de ADCP de una molécula de interés, un ensayo de ADCP in vitro, tal como el descrito en McEarchem et al., 2007, Blood 109:1185.
En el contexto de la invención, el término "tratar "o "tratamiento", tal como se utiliza en esta memoria, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de un trastorno o afección de este tipo. Por la expresión "tratar el cáncer", tal como se utiliza en esta memoria, se entiende la inhibición del crecimiento de células malignas de un tumor y/o la progresión de metástasis de dicho tumor. Un tratamiento de este tipo también puede conducir a la regresión del crecimiento del tumor, es decir, a la disminución del tamaño de un tumor medible. En particular, dicho tratamiento conduce a la regresión completa del tumor o la metástasis.
De acuerdo con la invención, el término "paciente" o la expresión "paciente que lo necesita" está destinado a un mamífero humano o no humano afectado o que probablemente se verá afectado por un tumor maligno. En particular, dicho paciente puede ser un paciente que se ha determinado que es susceptible a un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1, en particular a un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención, por ejemplo, de acuerdo con un método como se describe aquí más adelante.
Como se describió arriba, la "terapia anti-LAMP1" es una terapia que implica un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1. De acuerdo con la invención, la expresión "agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1" o "agente terapéutico anti-LAMP1" describe un agente que se une a LAMP1 y que tiene actividad citotóxica y/o citostática.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión "agente de unión" se refiere a una molécula que exhibe actividad de unión específica hacia LAMP1. Una molécula de unión de este tipo puede incluir una diversidad de diferentes tipos de moléculas, incluyendo, por ejemplo, macromoléculas y moléculas orgánicas pequeñas. Agentes de unión a moléculas pequeñas pueden incluir, por ejemplo, ligandos, antagonistas y agonistas del receptor. Las macromoléculas pueden incluir, por ejemplo, péptidos, polipéptidos y proteínas, ácidos nucleicos que codifican agentes de unión a polipéptidos, lectinas, hidratos de carbono y lípidos. Se entiende que el término incluye fragmentos y dominios del agente siempre que se mantenga la función de unión. De manera similar, los límites de los dominios no son críticos siempre que se mantenga la actividad de unión. En el ejemplo específico en el que el agente de unión es un péptido, polipéptido o proteína, proteínas de unión de este tipo pueden incluir especies monoméricas o multiméricas. Las proteínas de unión heteroméricas son un ejemplo específico de proteínas de unión multiméricas. Se entiende que cuando se hace referencia a proteínas de unión multiméricas, el término incluye fragmentos de las subunidades siempre que se conserve el ensamblaje de los polipéptidos y la función de unión del complejo ensamblado. Proteínas de unión heteroméricas incluyen, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos, tales como porciones Fab y F(ab')2.
De acuerdo con una realización, el agente terapéutico anti-LAMP1 es un anticuerpo anti-LAMP1 o un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-LAMP1 y al menos un agente inhibidor del crecimiento.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" del polipéptido de la invención se entiende una cantidad suficiente del polipéptido para tratar dicha enfermedad cancerosa, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante decidirá el uso diario total de los polipéptidos y las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz ,específico para cualquier paciente particular, dependerá de una diversidad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del polipéptido específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del polipéptido específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido dentro de la experiencia en la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. Otro objeto de la invención se refiere a un polipéptido, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de un tumor maligno.
En particular, el polipéptido, anticuerpo, inmunoconjugado o la composición farmacéutica puede utilizarse para inhibir la progresión de metástasis de un tumor maligno.
Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse en combinación con cualquier otra estrategia terapéutica para tratar un tumor maligno (p. ej., terapia adyuvante) y/o para reducir el crecimiento del tumor metastásico.
La eficacia del tratamiento con un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención se puede analizar fácilmente in vivo, por ejemplo, en un modelo de cáncer de ratón y midiendo, p. ej., cambios en el volumen del tumor entre grupos tratados y de control, % de regresión del tumor, regresión parcial y/o regresión completa tal como se define en el Ejemplo 10.
En un ejemplo, el anticuerpo es uno de los anticuerpos anti-LAMP1 desarrollados por la solicitante (los denominados anticuerpos “MAb1", "MAb2" ,"MAb3", huMAb1_1 y huMAb1_2, huMAb1_3) que se unen específicamente a LAMP1 humana y distinguen tejidos tumorales de no tumorales tal como se describe con más detalle en la sección "Anticuerpos" anterior.
Usos diagnósticos
El anticuerpo de acuerdo con la invención reveló que se producía una cierta expresión de LAMP1 en la membrana de células no tumorales, pero estaba restringida a células epiteliales del estómago, células epiteliales esofágicas, células epiteliales mamarias, células epiteliales prostáticas, células epiteliales testiculares y estaba limitada a unas pocas células. No obstante, la prevalencia y las intensidades medias de la expresión de LAMP1 en la membrana de muestras no tumorales fueron inferiores a las encontradas en los tumores.
En cambio, LAMP1 se expresa en gran medida en la superficie de una diversidad de carcinomas distintos a los adenocarcinomas de colon, incluyendo tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas, estómago y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos, por ejemplo, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y de tejidos blandos. Por lo tanto, LAMP1 constituye un marcador de determinados cánceres y, por lo tanto, tiene el potencial de utilizarse para indicar la eficacia de una terapia anticancerosa o detectar la recurrencia de la enfermedad.
En particular, LAMP1 se expresa altamente en la superficie de carcinomas seleccionados del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas de colon, recto, pulmón, carcinoma de estómago, ductal y lobular invasivo de mama y células de adenocarcinoma de próstata, más particularmente carcinoma de células escamosas de colon, recto y pulmón, carcinoma ductal y lobular invasivo de mama y células de adenocarcinoma de próstata.
Como se describió arriba en el capítulo ‘anticuerpos’’, los autores de la invención desarrollaron anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3 que permiten por primera vez detectar LAMP1 expresada extracelularmente y, por lo tanto, realizar análisis IHC en muestras de OCT congelada (de temperatura de corte óptima) y AFA (fijador de ácido acético, formalina y alcohol) y MAb4 que permiten el refuerzo de LAMP1 en formato FFPE y, por lo tanto, permiten distinguir entre tejidos cancerosos y no cancerosos.
En un ejemplo, el anticuerpo de la invención se utiliza como componente de un ensayo en el contexto de una terapia que fija como objetivo tumores que expresan LAMP1, con el fin de determinar la susceptibilidad del paciente al agente terapéutico, vigilar la efectividad de la terapia contra el cáncer o detectar la recurrencia de la enfermedad después del tratamiento. En particular, el mismo anticuerpo de la invención se utiliza tanto como componente del agente terapéutico y como componente del ensayo de diagnóstico.
Por tanto, un objeto adicional de la divulgación se refiere a un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso para detectar in vivo la expresión de LAMP1 en un sujeto, o para uso para detectar ex vivo la expresión de LAMP1 en una muestra biológica de un sujeto. Una detección de este tipo puede estar destinada, en particular, a
a) diagnosticar la presencia de un cáncer en un sujeto, o
b) determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1, en particular un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, o
c) vigilar la eficacia de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1 o detectar la recaída del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1, en particular para la terapia con un inmunoconjugado de acuerdo con la invención detectando la expresión de la proteína de superficie LAMP1 en células tumorales.
En un ejemplo, el anticuerpo está destinado a un uso in vitro o ex vivo. Por ejemplo, LAMP1 puede detectarse in vitro o ex vivo en una muestra biológica obtenida de un sujeto, utilizando un anticuerpo de la invención. El uso de acuerdo con la divulgación también puede ser un uso in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invención se administra al sujeto y se detectan y/o cuantifican complejos anticuerpo-célula, por lo que la detección de dichos complejos es indicativa de un cáncer.
La divulgación se refiere, además, a un método in vitro o ex vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica, b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
c) detectar la presencia de un cáncer comparando el nivel medido de anticuerpo unido con un control, siendo indicativo de un cáncer un nivel incrementado de anticuerpo unido en comparación con el control.
La divulgación también se refiere a un método in vitro o ex vivo para determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1, en particular a un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, método que comprende las etapas que consisten en:
a) poner en contacto una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica,
b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica con el nivel de anticuerpo unido a un control,
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de un paciente susceptible a un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1.
En los métodos anteriores, dicho control puede ser una muestra biológica normal, no cancerosa, del mismo tipo, o un valor de referencia determinado como representativo del nivel de unión del anticuerpo en una muestra biológica normal del mismo tipo. En una realización, los anticuerpos de la invención son útiles para diagnosticar un cáncer que expresa LAMP1, tal como un adenocarcinoma de colon, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos.
La divulgación se refiere, además, a un método in vitro o ex vivo para vigilar la eficacia de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1, que comprende las etapas que consisten en:
a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto sometido a terapia contra el cáncer anti-LAMP1, con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica,
b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel disminuido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de la eficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-LAMP1.
En dicho método, un nivel disminuido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de la ineficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-LAMP1.
Dicho control es, en particular, una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se obtuvo del sujeto previamente en el tiempo, durante el transcurso de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1.
La divulgación se refiere, además, a un método in vitro o ex vivo de detectar la recaída del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que tiene una terapia contra el cáncer anti-LAMP1 completada con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica,
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control,
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de una recaída del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1.
Dicho control es, en particular, una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se obtuvo del sujeto previamente en el tiempo, durante o tras la compleción de la terapia contra el cáncer anti-LAMP1.
Dicha terapia contra el cáncer anti-LAMP1 es, en particular, una terapia que utiliza un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención. Dicha terapia contra el cáncer anti-LAMP1 fija como objetivo un cáncer que expresa LAMP1, en particular un adenocarcinoma de colon, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas, estómago y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos.
En un ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden marcarse con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualesquiera otros marcadores conocido en la técnica que proporcionen (directa o indirectamente) una señal.
Como se utiliza en esta memoria, el término "marcado", con respecto al anticuerpo de acuerdo con la invención, pretende abarcar el marcaje directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable, tal como un agente radiactivo o un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o Indocianina (Cy5)) al polipéptido, así como marcaje indirecto del polipéptido por reactividad con una sustancia detectable.
Un anticuerpo de la invención puede ser marcado con una molécula radiactiva mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, moléculas radiactivas incluyen, pero no se limitan a átomos radiactivos para estudios escintigráficos, tales como I123, I124, I125, In111, Re186, Re188, Tc99, e isótopos para tomografía por emisión de positrones, tales como Zr89, I124, Ga68 o Cu64.
Una "muestra biológica" abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y se puede utilizar en un ensayo de diagnóstico o seguimiento. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tal como una muestra de biopsia, o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. Por lo tanto, las muestras biológicas abarcan muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido, en particular muestra tumoral.
En particular, los tejidos biológicos se pueden preparar como muestras de OCT congelada (temperatura de corte óptima) o AFA (fijador de ácido acético, formalina y alcohol). De hecho, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar ventajosamente en una muestra de AFA, que es un formato utilizado por los hospitales para recoger y archivar muestras de tejido.
La medición o determinación del nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica puede realizarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como FACS o IHC, por ejemplo.
La divulgación se refiere también a un método in vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
a) administrar un anticuerpo de acuerdo con la invención marcado de forma detectable a un paciente, b) detectar la ubicación de dicho anticuerpo marcado de forma detectable en el paciente mediante formación de imágenes.
Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para la representación del cáncer (p. ej., en radiografías). Pueden utilizarse solos o en combinación con otros marcadores de cáncer.
Los términos "detección" o "detectado", como se utilizan en esta memoria, incluyen detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control.
En el contenido de la divulgación, el término "diagnosticar", tal como se utiliza en esta memoria, significa la determinación de la naturaleza de una afección médica destinada a identificar una patología que afecta al sujeto a partir de una serie de datos recopilados.
En dicho método, el cáncer es un cáncer que expresa LAMP1, en particular un adenocarcinoma de colon, tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, páncreas, estómago y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como tumores de piel, laringe y tejidos blandos.
Método de selección de pacientes con cáncer
La divulgación se refiere a un método in vitro para seleccionar pacientes con cáncer, que comprende:
a) determinar, en una muestra biológica de un paciente con cáncer que incluye células cancerosas, si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1; y
b) seleccionar al paciente basándose en la presencia del aumento en el número de copias del gen LAMP1.
En un ejemplo, dicho método es para seleccionar un paciente con cáncer que probablemente responda a la terapia anti-LAMP1, y dicho paciente se selecciona como probable que responda a la terapia anti-LAMP1 si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1. Si dicho paciente no alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1, los pacientes pueden, no obstante, seleccionarse como susceptibles de responder a la terapia anti-LAMP1, basándose, por ejemplo, en que la detección de la expresión en la superficie celular de LAMP1 como expresión o sobre-expresión de LAMP1 en la superficie de las células tumorales puede tener otras causas que el aumento en el número de copias del gen LAMP1.
El aumento en el gen LAMP1 puede estar relacionado con un aumento o amplificación somática focal, un aumento o amplificación somática de región grande en 13q, una duplicación de cromosomas somáticos, una triplicación o poliploidía de cromosomas somáticos. El aumento o la amplificación en el número de copias del gen LAMP1 se incluye en un amplicón más grande. El término "amplicón" , tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un segmento del genoma que forma múltiples copias lineales. Por consiguiente, el amplicón que podría sufrir una variación en el número de copias que conduce a un aumento en el número de copias del gen LAMP1 se denominará en esta memoria amplicón LAMP1.
Dicha "amplificación de LAMP1" comprende una región de ADN que puede medir entre 378 kb y 34,2 MB. Dicho "aumento de LAMP1" comprende una región de ADN que puede medir entre 523 kb y 95,8 MB
En un ejemplo, el aumento en el número de copias del gen LAMP1 puede estar representado por la CNV de un amplicón LAMP1 en PDX de colon que comprende al menos 454 kb desde la base 113785387 a la base 114240314 en el cromosoma 13 humano (NC_000013). Dicho amplicón LAMP1 mínimo contiene otros genes además de LAMP1,, por ejemplo los genes ADPRHL1, CUL4A, DCUNID2, GRTP1, LAMP1, LOC100130463, PCID2, PRO7, TFDP1, TMCO3 y F10.
En otro ejemplo, dicho amplicón LAMP1 comprende al menos los genes ADPRHL1, ATP11A, ATP4B, CUL4A, DCUN1D2, F10, F7, FAM70B, FLJ41484, FLJ44054, GAS6, GRK1, GRTP1, LAMP1, LINC00552, LOC100128430, LOC100130463, LOC100506063, LOC100506394, MCF2L, MCF2L-AS1, PCID2, PROZ, RASA3, TFDP1 y TMCO3C13orf35.
En un ejemplo adicional, el amplicón LAMP1 comprende 95,8 Mb desde la base 19.296.544 hasta la base 115.107.245 en el cromosoma 13 humano (NC_000013).
En el contexto de la presente invención, las posiciones de los nucleótidos se indican de acuerdo con la secuencia del genoma humano NCBI (Build 37, febrero de 2009). El experto en la técnica sabe que una secuencia del genoma es variable de un individuo a otro. Por lo tanto, las posiciones definidas en esta memoria para el amplicón LAMP1 pueden cambiar ligeramente de acuerdo con la secuencia del genoma humano utilizada. Sin embargo, un experto en la técnica conoce bien métodos para comparar secuencias genómicas y posiciones de nucleótidos.
Existen numerosos métodos que permiten determinar la presencia de un cambio en el número de copias del gen LAMP1 en muestras biológicas que son bien conocidos por un experto en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a métodos de hibridación con sondas de ADN específicas de secuencias marcadoras, tales como hibridación genómica comparativa (CGH), matriz-CGH, matriz-CGH, matrices de oligonucleótidos, micromatriz de oligonucleótidos representativa (ROMA), tecnologías de alto rendimiento para el genotipado de SNP, por ejemplo chips SNP de Affymetrix, y métodos de amplificación tales como PCR cuantitativa.
En particular, la presencia de dicho cambio en el número de copias del gen LAMP1 marcador se determina mediante amplificación o mediante hibridación con sondas de ADN específicas para el gen LAMP1 o genes incluidos en el amplicón LAMP1. En un ejemplo, el método se implementa mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), secuenciación de nueva generación (NGS) y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método, en el que el aumento en el número de copias del gen LAMP1 se determina con un método seleccionado del grupo que consiste en FISH, CGH, NGS y/o PCR.
Los métodos de PCR cuantitativa son bien conocidos en la técnica e incluyen PCR en tiempo real, PCR competitiva y PCR radiactiva. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. 6.180.349 se ha descrito un método PCT cuantitativo para enumerar el número de copias de ADN.
Como se utiliza en esta memoria, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de reasociarse con una secuencia diana y servir como punto de inicio de la síntesis de ADN bajo condiciones adecuadas para la amplificación del producto de extensión del cebador que es complementario a dicha secuencia diana. El cebador es típicamente de cadena sencilla para una máxima eficacia en la amplificación. En particular, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. La longitud del cebador depende de varios factores, incluida la temperatura y la secuencia del cebador, pero debe ser lo suficientemente larga para iniciar la síntesis de productos de amplificación. En un aspecto, el cebador tiene una longitud de 15 a 35 nucleótidos. Un cebador puede contener, además, características adicionales que permitan la detección, inmovilización o manipulación del producto amplificado. El cebador puede comprender, además, colorantes fluorescentes unidos covalentemente, que confieren propiedades de fluorescencia específicas al híbrido que consiste en el cebador y la secuencia diana o colorantes fluorescentes unidos no covalentemente que pueden interactuar con el ADN/ARN de doble cadena para cambiar las propiedades de fluorescencia. Colorantes fluorescentes que se pueden utilizar son, por ejemplo, el verde SYBR o bromuro de etidio.
Un "par de cebadores" o "par cebador", tal como se utiliza en esta memoria se refiere a un cebador directo y uno inverso como se utiliza comúnmente en la técnica de la amplificación de ADN, tal como en la amplificación por PCR.
Como se utiliza en esta memoria, una "sonda" se refiere a un oligonucleótido capaz de unirse de una manera específica de base a una cadena complementaria de ácido nucleico. Una sonda se puede marcar con un resto detectable. Se conocen en la técnica diversos restos de marcaje. Dicho resto puede ser, por ejemplo, un compuesto radiactivo, una enzima detectable (p. ej., peroxidasa de rábano picante (HRP)) o cualquier otro resto capaz de generar una señal detectable tal como una señal calorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente. El resto detectable puede detectarse utilizando métodos conocidos. Una sonda puede variar en longitud de aproximadamente 5 a 100 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos, o de aproximadamente 20 a 40 nucleótidos. En un aspecto, una sonda comprende 33 nucleótidos.
Los términos "hibridar" o "hibridación." como conocen los expertos en la técnica, se refieren a la unión de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones adecuadas, a saber, en condiciones rigurosas.
La expresión "condición rigurosa" o "condición muy rigurosa", tal como se utiliza en esta memoria, corresponde a condiciones que son adecuadas para producir pares de unión entre ácidos nucleicos que tienen un determinado nivel de complementariedad, al tiempo que no son adecuadas para la formación de pares de unión entre ácidos nucleicos que muestran una complementariedad. inferior a dicho nivel determinado. Las condiciones rigurosas son la combinación de condiciones tanto de hibridación como de lavado y dependen de la secuencia. Estas condiciones pueden modificarse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica (Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York). Generalmente, las condiciones de alta rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm), por ejemplo, a una temperatura cercana a la Tm de dúplex de pares de bases perfectamente emparejadas (Andersen, Nucleic acid Hybridization, Springer, 1999, pág. .54). Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D.,Seidman, J.G., Smith, J. A., Struhl, K. eds. (1998) Current protocols in molecular biology V.B. Chanda, series ed. Nueva York: John Wiley & Sons.
Las condiciones de alta rigurosidad implican típicamente hibridar a aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 68°C en 5x SSC/5x solución de Denhardt/SDS al 1,0%, y lavar en 0,2x SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente 60°C hasta aproximadamente 68°C.
En un ejemplo, la divulgación se refiere a un método en el que el número medio de copias del gen LAMP1 en las células cancerosas es > 2,5. En particular, el número medio de copias del gen LAMP1 en las células cancerosas puede ser > 2,5 y < 5.
En un ejemplo, la divulgación se refiere a un método en el que el número medio de copias del gen LAMP1 en las células cancerosas es > 5.
La divulgación puede comprender, además, determinar si LAMP1 se expresa en la superficie de las células cancerosas del paciente, e i) dicho paciente se selecciona como probable que responda a la terapia anti-LAMP1 si dicho paciente alberga un aumento en el número de copias del gen LAMP1 y si dichas células cancerosas del paciente expresan LAMP1 en su superficie o ii) dicho paciente se selecciona como poco probable que responda a la terapia anti-LAMP1 si dichas células cancerosas del paciente no expresan LAMP1 en su superficie.
Existen numerosos métodos que permiten determinar si LAMP1 se expresa en la superficie de las células cancerosas, o se sobre-expresa en comparación con células normales (es decir, no tumorales) del mismo origen tisular, como son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, sin limitación IHC, transferencia Western (WB), análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunofluorescio (IF) inmunoprecipitación (IP) y ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
En un ejemplo, la inmunohistoquímica (IHC) se utiliza para determinar si LAMP1 se expresa o sobre-expresa en la superficie de células cancerosas.
La expresión de LAMP1 por células cancerosas puede ensayarse fácilmente, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-LAMP1 como se describe en el Ejemplo 3.
Los autores de la invención demostraron que el aumento de LAMP1 se detecta en 28 tipos de tumores, incluyendo Adenocarcionoma colorrectal, Estómago, Hígado, Pulmón (Adenocarcinoma y Escamoso) , Mama (Basal, BRCA, LUMA, LUMB y HER2), Ovario, Cabeza y Cuello, Riñón (Riñón Cromofóbico, Carcinoma de Riñón Renal de Células Claras, Riñón Renal Papilar), Carcinoma de Células, Células Escamosas de Cuello Uterino, Pancreático, Próstata, Urotelial de vejiga, Glioma (Glioma de bajo grado y Glioblastoma multiforme), Útero, Tiroides, Leucemia, Linfoma, Esofágico, Melanoma y Sarcoma de tejidos blandos. Se detecta un alto aumento o una amplificación en cáncer de mama, cervical, colorrectal, glioblastoma, de cabeza y cuello, de hígado, de pulmón, glioma, de ovario, de estómago y de útero.
Por consiguiente, en un aspecto del método, el paciente tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal, de estómago, de hígado, de pulmón, de mama, de ovario, de cabeza y cuello, de riñón, de páncreas, de próstata, de útero, de glioma, de vejiga, de tiroides. y leucemia, linfoma, esófago, melanoma y sarcoma de tejidos blandos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de estómago, de hígado, de pulmón, de ovario, de cabeza y cuello, de riñón, de páncreas, de próstata, de útero, glioma, de vejiga, de tiroides y leucemia, linfoma, esófago, melanoma y sarcoma de tejidos blandos.
En un aspecto adicional, el paciente tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cervical, colorrectal, glioblastoma, de cabeza y cuello, de hígado, de pulmón, glioma, de ovario, de estómago y de útero; o, en particular, del grupo que consiste en cáncer de cervical, colorrectal, glioblastoma, de cabeza y cuello, de hígado, de pulmón, glioma, de ovario, de estómago, tiroides y de útero; o, aún más particularmente, del grupo que consiste en cáncer de colon y pulmón.
El aumento en el número de copias del gen LAMP1 y la alta expresión de LAMP1 podrían detectarse en la superficie de cánceres seleccionados del grupo que consiste en cáncer de colon, pulmón, hígado, páncreas, riñón, mama, ovario, próstata y estómago.
Por lo tanto, en un aspecto, el cáncer puede seleccionarse de cáncer de colon, pulmón, hígado, páncreas, riñón, ovario, próstata, estómago, por ejemplo, de cáncer de colon, pulmón, hígado, páncreas, riñón, ovario, próstata, estómago.
Además, el aumento en las copias del gen LAMP1 se correlaciona con la expresión del ARNm de LAMP1 en cáncer de vejiga, mama, colon, pulmón, estómago y ovario. Se muestra una asociación significativa entre el aumento/la amplificación del número de copias del gen LAMP1 y la expresión de LAMP1 en la membrana plasmática de las células tumorales para PDX de tumores de colon, estómago y pulmón.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la paciente tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en mama, colon, pulmón, estómago y ovario. En otra realización, el paciente tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de colon, pulmón, estómago y ovario.
Una "terapia anti-LAMP1" es una terapia que implica un agente terapéutico que fija como objetivo LAMP1. En una realización, una terapia anti-LAMP1 de este tipo es un anticuerpo o inmunoconjugado anti-LAMP1. La terapia anti-LAMP1 se describe con más detalle más adelante.
El cáncer puede ser, en particular, cáncer de vejiga, de cuello uterino, colorrectal, glioblastoma, de cabeza y cuello, de riñón, de hígado, de pulmón, glioma, de ovario, de páncreas, de próstata, de estómago, de tiroides y de útero. En otro ejemplo, el cáncer es particularmente cáncer colorrectal o de pulmón.
Kits
Finalmente, la divulgación también se refiere a kits que comprenden al menos un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención encuentran uso para detectar la proteína de superficie LAMP1, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Los kits de la divulgación pueden contener un polipéptido o anticuerpo acoplado a un soporte sólido, p. ej. una placa de cultivo de tejidos o perlas (p. ej. perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen anticuerpos para la detección y cuantificación de la proteína de superficie LAMP1 in vitro, p. ej., en un ELISA o una transferencia Western. Un anticuerpo de este tipo útil para la detección se puede proporcionar con un marcador tal como un marcador fluorescente o radiactivo.
La invención se ilustrará adicionalmente a la vista de las siguientes Figuras y Ejemplos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia VH del anticuerpo "MAb1
Las SEQ ID NO: 2-4 muestran las secuencias de CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H del anticuerpo "MAb1". La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia VL del anticuerpo "MAb1".
Las SEQ ID NO: 6-7 muestran las secuencias de CDR1-L, CDR3-L del anticuerpo "MAb1".
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia VH del anticuerpo "MAb2".
Las SEQ ID NO: 9-11 muestran las secuencias de CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H del anticuerpo "MAb2". La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia VL del anticuerpo "MAb2".
Las SEQ ID NO: 13-14 muestran las secuencias de CDR1-L, CDR3-L del anticuerpo "MAb2".
La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia VH del denominado anticuerpo "Mab2Can".
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia VL del denominado anticuerpo "Mab2Can".
La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo quimérico "chMAb1".
La SEQ ID NO: 18 muestran la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "chMAb1".
La SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo quimérico "chMAb2".
La SEQ ID NO: 20 muestran la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "chMAb2".
La SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo quimérico "chMab2Can".
La SEQ ID NO: 22 muestran la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "chMab2can".
La SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de ADN de LAMP1 humana de longitud completa disponible en la base de datos GenBank bajo el número de acceso NM_005561.3.
La SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de proteínas de LAMP1 humana de longitud completa disponible en la base de datos GenBank bajo el número de acceso NP_005552.3.
La SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de proteínas de LAMP1 de ratón de longitud completa disponible en la base de datos GenBank bajo NP_034814
La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de proteínas de LAMP1 de rata de longitud completa disponible en la base de datos GenBank bajo NP_036989
La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de proteínas de LAMP1 de Macaca mulatta de longitud completa disponible en la base de datos GenBank bajo XP_002723509.
La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia del dominio extracelular de LAMP1 humana sin señal peptídica, seguida de la etiqueta His de 6 aminoácidos C-terminal.
La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia del dominio extracelular de LAMP1 mono cynomolgus sin señal peptídica, seguida de la etiqueta C-terminal que incluye la secuencia His de 6 aminoácidos.
La SEQ ID NO: 30 muestra la secuencia de una quimera LAMP1 humana y de ratón que contiene la región Bucle1 de ratón de LAMP1 y Bucles 2-4 humanos de LAMP1 sin señal peptídica, seguida de la etiqueta His de 6 aminoácidos C-terminal.
La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de una quimera LAMP1 humana y de ratón que contiene la región Bucles1-2 de ratón de LAMP1 y Bucles 3-4 humanos de LAMP1 sin señal peptídica, seguida de la etiqueta His de 6 aminoácidos C-terminal.
La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de una quimera LAMP1 humana y de ratón que contiene la región Bucles1 -2 humana de LAMP1 y Bucles 3-4 de ratón de LAMP1 sin señal peptídica, seguida de la etiqueta C-terminal que incluye una secuencia de His de 6 aminoácidos.
La SEQ ID NO: 33 muestra la secuencia de una quimera LAMP1 humana y de ratón que contiene la región Bucles1 -3 humana de LAMP1 y el Bucle 4 de ratón de LAMP1 sin señal peptídica, seguida de la etiqueta C-terminal que incluye una secuencia de His de 6 aminoácidos.
La SEQ ID NO: 34 muestra la secuencia del dominio extracelular de LAMP1 de ratón sin señal peptídica, seguida de la etiqueta C-terminal que incluye la secuencia de His de 6 aminoácidos.
La SEQ ID NO: 35 muestra la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "MAb1".
La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo "MAb1".
La SEQ ID NO: 37 muestra la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "MAb2".
La SEQ ID NO: 38 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo "MAb2".
La SEQ ID NO: 39 muestra la secuencia de la proteína LAMP1 de longitud completa predicha de Macaca fascicularis.
La SEQ ID NO: 40 muestra la secuencia del dominio extracelular de LAMP2 humana sin señal peptídica, seguida de la etiqueta His de 10 aminoácidos C-terminal.
La SEQ ID NO: 41 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa de LAMP2 humana.
La SEQ ID NO: 42 muestra la secuencia VH del anticuerpo "MAb3".
Las SEQ ID NO: 43-45 muestran las secuencias de CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H del anticuerpo "MAb3". La SEQ ID NO: 46 muestra la secuencia VL del anticuerpo "MAb3".
Las SEQ ID NO: 47 y 48 muestran las secuencias de CDR1-L y CDR3-L del anticuerpo "MAb3".
La SEQ ID NO: 49 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo quimérico "chMAb3".
La SEQ ID NO: 50 muestra la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "chMAb3".
La SEQ ID NO: 51 muestran la secuencia del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo "MAb3 VL_R24_R93".
La SEQ ID NO: 52 muestra la secuencia de CDR3-L del anticuerpo "MAb3 VL_R24_R93".
La SEQ ID NO: 53 muestra la secuencia VH1 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_1".
La SEQ ID NO: 54 muestra la secuencia VH2 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_2".
La SEQ ID NO: 55 muestra la secuencia VH3 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_3".
La SEQ ID NO: 56 muestra la secuencia VL1 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_1".
La SEQ ID NO: 57 muestra la secuencia VL2 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_2".
La SEQ ID NO: 58 muestra la secuencia VL3 del anticuerpo humanizado anticuerpo "huMAb1_3".
La SEQ ID NO: 59 muestra la secuencia de la variante 1 de cadena ligera del anticuerpo "huMAb1_1". La SEQ ID NO: 60 muestra la secuencia de la variante 1 de cadena pesada del anticuerpo "huMAb1_1". La SEQ ID NO: 61 muestra la secuencia de la variante 2 de cadena ligera del anticuerpo "huMAb1_2". La SEQ ID NO: 62 muestra la secuencia de la variante 2 de cadena pesada del anticuerpo "huMAb1_2". La SEQ ID NO: 63 muestra la secuencia de la variante 3 de cadena ligera del anticuerpo "huMAb1_3". La SEQ ID NO: 64 muestra la secuencia de la variante 3 de cadena pesada del anticuerpo "huMAb1_3". La SEQ ID NO: 65 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo de control negativo "huMAb1_negA" con las mutaciones 36A y 95A.
La SEQ ID NO: 66 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo de control negativo "huMAb1_negA" con la mutación 101A.
La SEQ ID NO: 67 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo de control negativo "huMAb1_negB" con la mutación 266A.
La SEQ ID NO: 68 muestra la secuencia de la cadena ligera del huMAb1_1 recombinante para la cristalización. La SEQ ID NO: 69 muestra la secuencia de la cadena pesada del huMAb1_1 recombinante para la cristalización que comprende una etiqueta His C-terminal.
La SEQ ID NO: 70 muestra la secuencia de una región Bucles1-2 humana de LAMP1 con una etiqueta de tiorredoxina (trx A) escindible, una etiqueta de His y un sitio de escisión de trombina.
La SEQ ID NO: 71 muestra la secuencia de hLAMP1-29-195 sin etiquetar.
La SEQ ID NO: 72 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 101 a 110 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 73 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 144 a 157 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 74 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 174 a 188 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 75 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 29 a 41 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 76 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 68 a 80 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 77 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 29 a 100 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 78 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 97 a 110 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 79 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 173 a 189 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 80 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 132 a 302 de SEQ ID NO: 70.
La SEQ ID NO: 81 muestra la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo quimérico "chMAb3 VL_R24_R93" SEQ ID NO: 82 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 360 a 375 de SEQ ID NO: 24.
Las SEQ ID NO: 83-85 muestran las secuencias de CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H del anticuerpo "MAb4". La SEQ ID NO: 86 y 87 muestran las secuencias de CDR1-L y CDR3-L del anticuerpo "MAb4".
La SEQ ID NO: 88 muestra la secuencia VH1 del anticuerpo "MAb4".
La SEQ ID NO: 89 muestra la secuencia VL1 del anticuerpo "MAb4".
La SEQ ID NO: 90 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 47 a 61 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 91 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 140 a 155 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 92 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 307 a 321 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 93 muestra una secuencia consenso para CDR1-L de la familia de anticuerpos MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/ huMAb1_3 basada en residuos identificados como importantes para la estructura canónica y, por lo tanto, la unión de LAMP1 humana utilizando cristalografía.
La SEQ ID NO: 94 muestra una secuencia consenso para CDR3-L de la familia de anticuerpos MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/ huMAb1_3 basada en residuos identificados como importantes para la estructura canónica y, por lo tanto, la unión de LAMP1 humana utilizando cristalografía.
La SEQ ID NO: 95 muestra una secuencia consenso para CDR1-H de la familia de anticuerpos MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/ huMAb1_3 basada en residuos identificados como importantes para la estructura canónica y, por lo tanto, la unión de LAMP1 humana utilizando cristalografía.
La SEQ ID NO: 96 muestra una secuencia consenso para CDR3-H de la familia de anticuerpos MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/ huMAb1_3 basada en residuos identificados como importantes para la estructura canónica y, por lo tanto, la unión de LAMP1 humana utilizando cristalografía.
La SEQ ID NO: 97 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 35 a 84 de SEQ ID NO: 24.
La SEQ ID NO: 98 muestra la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo "MAb4".
La SEQ ID NO: 99 muestra la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo "MAb4".
FIGURAS
Figura 1: alineamiento de secuencia de proteínas LAMP1 humana y de Macaca fascicularis de longitud completa.
Figura 2 : Perfil de expresión de LAMP1 derivado del análisis FACS con los anticuerpos monoclonales de ratón Mab1 y MAb2.
Figura 3 : Reactividad de MAb1 con LAMP1 humana y LAMP1 de mono cynomolgus.
Figura 4 : Evaluación de la competencia de MAb2 (murino) con MAb1 (quimérico) para unirse a LAMP1. Con el 2° anti-hFc siendo un anticuerpo secundario anti-Fc humano y el 2° anti-mFc siendo un anticuerpo secundario anti-Fc de ratón.
Figura 5 : Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado DM4-SPDB-chMAb1 contra el adenocarcinoma de colon humano primario CR-LRB-010P en ratones hembra SCID.
Figura 6 : Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado DM4-SPDB-chMAb1 contra el tumor pulmonar primario LUN-NIC-0014 en ratones hembra SCID.
Figura 7 : Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB-chMAb1.
Figura 8 : a) Gráfico de caja de la expresión de intensidad de ARN de LAMP1 por categoría de cambiador del número de copias b) Gráfico del número de copias de LAMP1 de acuerdo con la expresión de ARNm de LAMP1 en tumores de colon. Los puntos representan la expresión de ARNm individual, las barras corresponden a los valores medios.
Figura 9: Un análisis de correlación de Sperman de ARNm de LAMP1 y datos del cambio en el número de copias.
Figura 10: Diagrama de caja de expresión de intensidad de ARN y LAMP1 por cambio en el número de copias en sarcoma de tejido blando (a), carcinoma endometrioide de cuerpo (b) y carcinoma invasivo de mama (c). Figura 11: a) Histograma del número de copias de LAMP1 por expresión en membrana de LAMP1 (puntuación de categoría IHC) para PDX de tumor de colon y b) Histograma del número de copias de LAMP1 por expresión en membrana de LAMP1 (puntuación de categoría IHC) para PDXs de tumores de pulmón y estómago.
Figura 12: Perfil de expresión de MAb1,2 y 3 en tres PDXs (CR-IGR-034P, LUN-Nlc-014 y BRE-IGR-0159). Figura 13: Representación gráfica que muestra los residuos de Fab1 que forman parte del parátopo (es decir, residuos con átomos dentro de 4A de los átomos del antígeno).
Figura 14: Representación gráfica que muestra los residuos de hLAMP1 que forman el epítopo para Fab1 (es decir, residuos con átomos dentro de 4A de los átomos del antígeno).
Figura 15: Representación gráfica que muestra la superposición de los residuos de hLAMP1 y un modelo de G187E correspondiente a cLAMP1. Se indican las diferencias en la orientación de Lys151 de hLAMP1 y de Tyr32 de Fab1 -LC, necesarias para alojar la mutación de glicina a glutamina en la posición 187.
Figura 16: Representación gráfica que muestra una superposición de los residuos de cadena pesada de Fab1 y un modelo de Fab1 con la mutación I28Q en su secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y la interacción con LAMP1.
Figura 17: Representación gráfica que muestra una superposición de los residuos de cadena pesada de Fab1 y un modelo de Fab1 con la mutación N55R en su secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y la interacción con LAMP1.
Figura 18: Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB-huMAb1 3.
Figura 19: Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB-huMAb1 1
Figura 20: Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB-huMAb1_2.
Figura 21: Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB-chMAb2.
Figura 22: Datos de HRMS del conjugado DM4-SPDB- chMAb3 VLR24-R93.
Figura 23: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra el adenocarcinoma de colon humano primario CR-LRB-010P en ratones hembra SCID.
Figura 24: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra el carcinoma ductal invasivo primario humano BRE-IGR-0159 en ratones hembra SCID.
Figura 25: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra el tumor de pulmón humano primario LUN-NIC-0070 en ratones hembra SCID
Figura 26: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-chMAb2 contra el adenocarcinoma de colon humano primario CR-LRB-010P en ratones hembra SCID.
Figura 27: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-chMAb2 contra el carcinoma ductal invasivo primario humano BRE-IGR-0159 en ratones hembra SCID.
Figura 28: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-chMAb3 contra el carcinoma ductal invasivo primario humano BRE-IGR-0159 en ratones hembra SCID.
Figura 29: Representación gráfica de la ADCC in vitro mediada por chMAb1, chMAb2 y chMAb3.
Figura 30: Representación gráfica de la dependencia de ADCC in vitro de la densidad del antígeno LAMP1 con a) densidad del antígeno LAMP1 clon 8 de huLAMP1 de HCT: 160000 b) densidad del antígeno LAMP1 clon 4 de huLAMP1 de HCT: 2000 y c) densidad del antígeno LAMP1 clon 12 de huLAMP1 de HCT: 5000. Figura 31: Comparación de ADCC in vitro de chMAb1 y DM4-SPDB-chMAb1 (a) o chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb2 (b).
Figura 32: ADCC In vitro mediada por huMAb1_1.
Figura 33: ADCC In vitro mediada por DM4-SPDB-huMAb1_1.
Figura 34: Análisis de citometría de flujo de ADCP con a) macrófagos y células diana sin Mab1_1 y b) macrófagos y células diana y Mab1_1. Figura 35: ADCP In vitro de huMAb1_negB.
Figura 36: Pérdida de ADCP vitro para huMAb1_negA
Figura 37: Datos HRMS del conjugado huMAb1_1 modificado con SNPP con conjugado (2E,2’E,11aS,11 a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil) bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4] diazepin-5(11 aH)-ona)DM4-SPDB-chMAb2.
Figura 38: Tinción inmunohistoquímica (IHC) en muestra FFPE de xenoinjerto CR-LRB-010P derivado de un paciente con adenocarcinoma de colon, y carcinoma de mama humano con el anticuerpo policlonal de conejo rAb4. Los controles negativos se realizaron por omisión del anticuerpo primario. Además, otros anticuerpos irrelevantes fueron negativos o mostraron inmunotinción intracelular.
Figura 39: Inmunocitoquímica (ICC) en formato FFPE con el anticuerpo policlonal de conejo rAb4 a 1 pg/mL. Figura 40: Tinción inmunohistoquímica (IHC) en una muestra de FFPE de un xenoinjerto CR-LRB-010P derivado de un paciente con adenocarcinoma con MAb4 obtenido del hibridoma 88LAMP1-2. El control negativo se realizó por omisión del anticuerpo primario.
Figura 41: Afinidad de unión por ELISA de MAb4 hacia LAMP1 (negro) o LAMP2 (gris).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparación de xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDX)
Ejemplo 1.1: Preparación de PDXs CR-LRB-010P, CR-LRB-003P y CR-IGR-034P
Se desarrolló una gran colección de modelos de cáncer colorrectal derivados directamente de muestras de tumores recogidas durante la cirugía del paciente. El tumor de cáncer colorrectal derivado del paciente se recogió, después del consentimiento informado del paciente, en 3 centros médicos: Instituto Curie (París, Francia), Instituto Gustave Roussy (Villejuif, Francia) y Hospital Lariboisiere (París, Francia). Inmediatamente después de la cirugía (1 hora después de la resección en promedio), se transfirieron 2 fragmentos en medio de cultivo que incluía DMEM con 10 mmol/L de HEPES, 4,5 g/L de glucosa, 1 mmol/L de piruvato de sodio, 200 U/mL de penicilina, 200 mg/mL de estreptomicina, 200 mg/mL de gentamicina, 5 mg/mL de ciprofloxacina, 20 mg/mL de metronidazol, 25 mg/mL de vancomicina y 2,5 mg/mL de fungizona o DMEM con nanomicopulitina (Abcys) para el injerto. Tras 2 a 24 horas después de la cirugía del paciente, las muestras de tumor se injertaron en 2 ratones Swiss inmunológicamente deficientes. Se injertaron por vía subcutánea pequeños fragmentos (50 mm3) en la zona escapular o en el costado de ratones anestesiados. (protocolo de xilacina/ketamina o isoflurano). El crecimiento del tumor se midió al menos una vez a la semana y se realizaron injertos de fragmentos en serie de cada uno de los tumores dados en 3 a 5 ratones Swiss inmunológicamente deficientes o CB17-SCID (después de 3 pases) cuando los tumores alcanzaron un volumen de 800 a 1500 mm3. (Julien, S. 2012, Clin. Cancer Res. 18(19):5314-5328).
Ejemplo 1.2: Preparación de PDXs LUN-NIC-0014 PDX y LUN-NIC-0070
Se recogieron muestras de carcinoma de pulmón de células no pequeñas, después del consentimiento informado del paciente, en CHU Pasteur (Niza, Francia). Inmediatamente después de la cirugía, se transfirió una parte del tumor del paciente en medio AQIX y se envió a Sanofi (Vitry sur Seine, Francia). Tras 24 a 48 horas después de la cirugía del paciente, las muestras de tumor se injertaron en 2-5 ratones CB17-SCID. Se injertaron por vía subcutánea pequeños fragmentos (50 mm3) en el flanco de los ratones. El crecimiento del tumor se siguió al menos una vez a la semana y se realizaron injertos de fragmentos en serie de cada uno de los tumores dados en 5 a 10 ratones CB17-SCID (después de 3 pases) cuando el tumor alcanzó un volumen de 800 a 1500 mm3.
Ejemplo 1.3: Preparación de PDX BRE-IGR-0159
Se recogieron muestras de carcinoma de mama, previo consentimiento informado de la paciente, en el Instituto Gustave Roussy (Villejuif, Francia). Inmediatamente después de la cirugía (1 hora después de la resección en promedio), se transfirieron 4 fragmentos a medio de cultivo que incluía DMEM, penicilina, estreptomicina y fungizona para el injerto. Después de un máximo de 12 horas después de la cirugía del paciente, las muestras de tumor (fragmentos de aproximadamente 50 mm3) se injertaron en la almohadilla de grasa en 4 ratones BALB inmunológicamente deficientes. Se siguió el crecimiento del tumor al menos una vez a la semana y se envió a Sanofi (Vitry sur Seine). Se realizaron injertos de fragmentos en serie de cada uno de los tumores dados en 3 a 5 ratones BALB inmunológicamente deficientes o CB17-SCID (después de 3 pases) cuando los tumores alcanzaron un volumen de 800 a 1500 mm3.
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos anti LAMP1 de ratón monoclonales y primer rastreo
Las inmunizaciones, la fusión y el rastreo se realizaron esencialmente como se describió previamente utilizando el tumor primario desagregado CR-LRB-010P o CR-LRB-003P o LUN-NIC-0014 mencionado en el Ejemplo 1 para la inmunización y células de mieloma P3X63-Ag8.653 para la fusión. Utilizando el método clásico descrito por W e n n e r b e r g A . E . e t a l . ( 1993 , A m . J . P a t h o l . 143 ( 4 ) : 1050 - 1054 ) , r a t o n e s B A L B / c h e m b r a s d e 6 - 8 s e m a n a s d e e d a d ( S 082342 ; C h a r l e s R i v e r L a b s , B a r H a r b o r , M E ) r e c ib i e r o n c a d a u n o t r e s r o n d a s d e in m u n iz a c i ó n d u r a n t e e l c u r s o d e 41 d í a s . L o s a n t í g e n o s s e a d m in i s t r a r o n p o r v í a i n t r a p e r i t o n e a l a l s i t i o v e n t r a l d e lo s r a t o n e s . T r e s d í a s d e s p u é s d e la ú l t i m a in y e c c ió n , lo s r a t o n e s f u e r o n s a c r i f i c a d o s y lo s b a z o s s e a i s la r o n a s é p t i c a m e n t e y s e l a v a r o n c o n m e d io R P M I r e c ie n t e . L o s l i n f o c i t o s s e l i b e r a r o n d e lo s b a z o s y la s u s p e n s ió n u n i c e lu la r s e la v ó d o s v e c e s c o n m e d io R P M I a n t e s d e f u s io n a r s e c o n c é l u la s d e m ie l o m a P 3 X 63 - A G 8.653 u t i l i z a n d o p o l i e t i l e n g l i c o l . D e s p u é s d e la f u s ió n , la m e z c la d e c é l u la s s e in c u b ó e n u n a i n c u b a d o r a a 37 ° C d u r a n t e 16 - 24 h o r a s . L a p r e p a r a c i ó n d e c é l u la s r e s u l t a n t e s e t r a n s f i r i ó a u n m e d io s e m i - s ó l i d o s e l e c t i v o y s e s e m b r ó a s é p t i c a m e n t e e n p l a c a s d e P e t r i d e 100 m m y s e in c u b ó a 37 ° C . D ie z d í a s d e s p u é s d e l in ic io d e la s e l e c c ió n , s e e x a m in a r o n la s p l a c a s p a r a d e t e r m i n a r e l c r e c im ie n t o d e h i b r i d o m a , y s e r e c o g i e r o n la s c o l o n ia s v i s i b l e s y s e c o l o c a r o n e n p l a c a s d e 96 p o c i l l o s q u e c o n t e n í a n 200 g L d e m e d io d e c r e c im ie n t o . L a s p l a c a s d e 96 p o c i l l o s s e m a n t u v ie r o n e n u n a i n c u b a d o r a a 37 ° C d u r a n t e 2 a 4 d í a s .
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 3: Rastreo de hibridomas por inmunohistoquímica (IHC)
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L a s s e c c i o n e s i n m u n o t e ñ id a s c o n m A b s s e a n a l i z a r o n m e d ia n t e m ic r o s c o p i o ( N i k o n E c l ip s e E 400 ) . D e s p u é s d e l r a s t r e o i n m u n o h is t o q u í m ic o , lo s c l o n e s d e in t e r é s s e i d e n t i f i c a r o n c o m o a q u e l l o s c o n r e a c t i v id a d c o n á r e a s d e c é l u la s d e c o l o n t u m o r a l , p e r o n o c o n c é l u la s e p i t e l i a l e s n o r m a le s d e m u c o s a d e c o l o n . E l a n t i c u e r p o M A b 1 m o s t r ó e v i d e n c i a d e r e a c t i v id a d a s o c i a d a a l t u m o r y f u e n e g a t i v o e n c é l u la s e p i d é r m i c a s h u m a n a s n o t u m o r a l e s .
S e o b t u v i e r o n r e s u l t a d o s s im i la r e s c o n M A b 2 y M a b 3. E n b a s e a e s t o s r e s u l t a d o s d e I H C , M A b 1 , M A b 2 y M A b 3 s e p u r i f i c a r o n p a r a u n a e v a l u a c i ó n a d i c io n a l , i n c lu y e n d o u n a c a r a c t e r i z a c ió n e x t e n s a d e I H C e n t e j i d o s n o t u m o r a l e s y t u m o r a l e s p a r a M A b 1 .
Ejemplo 4: Caracterización de mAb
L o s a n t i c u e r p o s M A b 1 , M A b 2 y M A b 3 s e a n a l i z a r o n p a r a d e t e r m i n a r la u n ió n a la s u p e r f i c i e c e l u l a r e n e l t u m o r d e c o l o n p r im a r io d e s a g r e g a d o h u m a n o m e d ia n t e F A C S u t i l i z a n d o e l s i s t e m a d e c i t o m e t r í a d e f l u j o G u a v a ® e a s y C y t e ™ 8 H T .
L a a f in i d a d a p a r e n t e e x p r e s a d a c o m o v a l o r e s d e C E 50 s e e s t im ó u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e B I O S T @ T - S P E E D .
S e p r o d u j e r o n h ib r i d o m a s d e r a t ó n q u e e x p r e s a b a n a n t i c u e r p o s e n u n m a t r a z T 500 y s e r e c o g i e r o n lo s m e d io s a c o n d i c i o n a d o s d e s p u é s d e 7 d í a s d e c r e c im ie n t o . E l a n t i c u e r p o s e p u r i f i c ó h a c i e n d o p a s a r e l m e d io a c o n d i c i o n a d o a t r a v é s d e u n a c o l u m n a P r o t e in - G , s e la v ó y s e e l u y ó c o n t a m p ó n d e g l i c i n a / H C l 100 m M , p H 2 , 7. E l m a t e r i a l e l u id o s e d i a l i z ó f r e n t e a P B S a n t e s d e la f i l t r a c ió n e n c o n d i c io n e s e s t é r i l e s y s e a l m a c e n ó a 4 ° C .
Ejemplo 4.1: Afin idad aparente de los anticuerpos MAb1 y MAb2 p o r e l tum or de colon prim ario humano PDX p or citometría de flu jo
El tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P se obtuvo de un xenoinjerto derivado del paciente en ratones. El tumor CR-IGR-034P se disoció enzimáticamente utilizando colagenasa de tipo IV (Invitrogen; n° 17104­ 019) y desoxirribonucleasa I (Invitrogen; n° 18047-019) durante 1 h a 4°C. La viabilidad celular se estimó mediante la aplicación Viacount utilizando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Para una estimación de la afinidad aparente, se recubrieron células tumorales CR-IGR-034P a razón de 40.000 células/pocillo en una placa de alta unión de 96 pocillos (MSD L15XB-3) y se añadieron 100 pL/pocillo de anticuerpo en diluciones en serie de 2 veces a partir de 20 pg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con BSA al 1% en PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; n° A2135) o IgG anti-humana de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; n° A11013) durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con BSA al 1% en PBS. La unión del anticuerpo se evaluó después de la centrifugación y resuspensión de las células mediante la adición de 200 pl/pocillo de BSA al 1% en PBS y se leyó utilizando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOST@T-SPEED. Los valores de CE50 obtenidos con el tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: CE50 obtenida con CR-IGR-034P
Figure imgf000049_0001
La capacidad de unión de anticuerpos del anticuerpo se determinó utilizando el kit de calibrador de IgG de ratón (Biocytex n° 7208) o el kit de calibrador de IgG humana (Biocytex n° CP010) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la capacidad de unión de anticuerpos de 230 000 y 180000 para el anticuerpo MAb1 y MAb2, respectivamente, en CR-IGR-034P.
Ejemplo 4.2: Los anticuerpos se unen a m últiples células cancerosas
Los anticuerpos MAb1 y MAb2 se unen a m últiples células cancerosas y determinación de la capacidad de unión del anticuerpo
Se encontró que los anticuerpos eran capaces de unirse a múltiples células tumorales mediante citometría de flujo utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 4.1. El panel de células tumorales comprende xenoinjertos tumorales derivados del paciente de diferentes orígenes y líneas de células tumorales. La Figura 2 ilustra el perfil de expresión y la Tabla 4 resume los resultados de la capacidad de unión del anticuerpo.
T l 4: i ni n ni r r FA n x n in r riv i n
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Los anticuerpos monoclonales MAb1 y MAb2 condujeron a una ABC alta en varios PDXs de origen colorrectal, ovario, estómago y pulmón y una ABC más baja en líneas celulares que en PDXs de origen colon.
FL de célu las exting n idas a £7*0
Porcentaje de Tracción internalizada: XtOO
FL ae células no inguidas a 37"C
Las células incubadas con compuestos marcados con Alexa488 a 4°C se utilizaron como un control, ya que la internalización de anticuerpos no tiene lugar significativamente a 4°C.
Después de 4 h a 37°C, aproximadamente el 97,0% de la fluorescencia celular total de Alexa488-MAb1 era intracelular. En comparación, aproximadamente el 98,5% de la fluorescencia celular total de Alexa488-Transferrina fue intracelular. Se sabe que la transferrina es internalizada de manera muy eficiente por las células Colo205.
Después de inactivar, la fluorescencia de Alexa488-MAb1 medida a partir de células marcadas a 37°C (tanto la superficie celular como los compartimientos intracelulares) fue 10 veces mayor que la de las células marcadas a 4°C (superficie celular). Debido a que la fluorescencia de Alexa488-MAb1 medida en la superficie celular a 4°C es proporcional a la densidad del antígeno, todos los resultados anteriores tomados en conjunto indican que cada una de las moléculas de LAMP1 está implicada en varios (10 en promedio) ciclos de internalización a través del reciclaje en la membrana celular durante el curso del experimento.
Los resultados obtenidos por los autores de la invención demuestran por primera vez que LAMP1 puede funcionar como un receptor que media en la internalización de anticuerpos de manera muy eficiente a través del reciclaje del receptor a la superficie celular y sugieren que la disponibilidad de anticuerpos internalizantes específicos debería ayudar a desarrollar nuevos métodos terapéuticos para fijar como objetivo toxinas, fármacos o isótopos de corto alcance a administrar específicamente al interior de las células cancerosas, como se muestra en la Tabla 6.
T l : M i i n in rn liz i n r i m rí Fl
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Ejemplo 4.5: Purificación e identificación de la diana antígeno del anticuerpo MAb1, MAb2 y MAb3
La diana antígeno de MAb1, MAb2 y MAb3 se purifica a partir de una fracción de membrana enriquecida con tumor de colon primario humano CR-LRB-010P o CR-IGR-034P utilizando el kit Pierce Classic IP (n° 26146) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las proteínas reducidas se separaron mediante SDS-PAGE y las proteínas se tiñeron con nitrato de plata. Las bandas teñidas se sometieron a una digestión tríptica en gel, y los péptidos eluidos se analizaron mediante MS en tándem (LC-MS/MS) en un espectrómetro de masas con tapa inclinada Orbitrap (Thermo). El análisis de datos de MS/MS sin procesar con el motor de búsqueda de la base de datos Mascot (Matrix Science), reveló LAMP1.
Esta diana se confirmó mediante ELISA con la LAMP1 humana recombinante tal como se describe en el Ejemplo 6.2 (SEQ ID NO: 28). Laa CE50 obtenida se enumeran en la Tabla 7 y en la Tabla 11.
Tabla 7: CE50 determinada mediante los valores de ELISA en LAMP1 humana recombinante (29- 382 de SEQ ID
NO: 28
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Ejemplo 4.6: Especificidad para LAMP1
LAMP2 es el miembro más cercano de la familia LAMP con una identidad de secuencia del 35% con LAMP1. Para evaluar la especificidad para LAMP1 de los anticuerpos MAb1, MAb2 y MAb3, se recubrieron placas de 96 pocillos con LAMP2 humana recombinante con una etiqueta 10 His C-terminal (SEQ ID NO: 40) (R&D Systems 6228-LM) utilizando las mismas condiciones de recubrimiento descritas previamente. Se añadieron anticuerpos anti-LAMP1 a las placas y se detectaron utilizando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; n° A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo tampón TMB-H2 O2 y se leyó a una longitud de onda de 450 nm. No se detectó unión a LAMP2 con anticuerpos MAb1, MAb2 y MAb3.
Ejemplo 4.7: Reactividad cruzada con LAMP1 de mono cynomolgus
Se evaluó mediante ELISA la capacidad del anticuerpo MAb1 de unirse a la proteína LAMP1 de primates. El dominio extracelular de LAMP1 de LAMP1 humana (Ala29-Met382 de SEQ ID NO: 24) y de mono cynomolgus (Ala27-Met380 de SEQ ID NO: 39) se prepararon como se describe en el Ejemplo 6.2. La placa se revistió con proteína LAMP1 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), se añadió anticuerpo MAb1 a la placa y se detectó con IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; n° A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo tampón TMB-H2 O2 y se leyó a una longitud de onda de 450 nm. La afinidad de unión estaba en el mismo intervalo con ambas proteínas tal como se muestra en la Figura 3 para MAb1.
También se evaluó la capacidad del anticuerpo MAb1 de unirse a las proteínas LAMP1 humana y LAMP1 de primates expresadas en la superficie de células HEK293 recombinantes por FACS. Se clonó internamente la secuencia de a Dn codificante de LAMP1, RefSeq NM_005561.3 (SEQ ID NO: 23). La CDS de LAMP1 de Macaca mulatta, RefSeq XP_001087801 (SEQ ID NO: 27) también se clonó internamente. Las secuencias predichas de LAMP1 madura de Macaca mulatta y Macaca fascicularis son idénticas en un 99%, difiriendo dicha secuencia en una Leucina adicional en la posición 11 de Macaca mulatta (SEQ ID NO: 27), es decir, en el péptido señal. Las proteínas LAMP1 maduras de Macaca mulatta y Macaca fascicularis son idénticas. Por lo tanto, a la LAMP1 secretada utilizada en el siguiente ejemplo se la alude como mono cynomolgus. Ambas CDS se clonaron en plásmidos de expresión en mamíferos bajo señales de potenciador/promotor de CMV y poliA de SV40. Se transfectaron transitoriamente células HEK293 (Invitrogen; n° K9000-10) con plásmidos LAMP1 humana o LAMP1 de cynomolgus utilizando el sistema de expresión Freestyle™ MAX 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recubrieron células HEK293 transfectadas con LAMP1 humana y células HEK293 transfectadas con LAMP1 de cynomolgus a razón de 40.000 células/pocillo en una placa de alta unión de 96 pocillos (MSD L15XB-3) y se añadieron 100 pL/pocillo de anticuerpo MAb1 en diluciones seriadas de 2 veces a partir de 20 pg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con BSA al 1% en PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; n° A2135) durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con BSA al 1% en PBS. La unión del anticuerpo se evaluó después de la centrifugación y resuspensión de las células mediante la adición de 200 pl/pocillo de BSA al 1% en PBS y se leyó utilizando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOST@T-SPEED. La afinidad de unión estaba en el mismo intervalo con una CE50 de 14 y 44 nM para respectivamente LAMP1 humana y de mono cynomlogus expresada transitoriamente en la superficie celular de HEK293 para mAb1.
Se evaluó la capacidad del anticuerpo MAb1 de unirse a las proteínas LAMP1 humana y LAMP1 de primates expresadas en la superficie de clones estables HCT116 recombinantes por FACS. Las células HCT116 se infectaron con un vector lentiviral que permitió la integración estable de la CDS de LAMP1 humana o de cynomolgus en el ADN genómico de las células. Los clones individuales con diferentes densidades de ubicación de la superficie celular de LAMP1 humana o de cynomolgus se derivaron de un conjunto de células infectadas con HCT 116. Las células HCT 116 que expresan LAMP1 humana o de cynomolgus se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 200000 por pocillo y se añadió MAb1 en diluciones seriadas de 2 veces comenzando con 40 pg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 1 h a 4°C y se lavaron dos veces con BSA al 1% en PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de IgG anti­ humana de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; n° A11013) durante 1 h a 4°C y se lavó dos veces con BSA al 1% en PBS. La unión del anticuerpo se evaluó después de la centrifugación y resuspensión de las células en 100 pl de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS). Las muestras se leyeron utilizando el sistema de citometría de flujo Galaxy® (Partec). Los valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOST@T-SPEED. Anticuerpo MAb1 se une a LAMP1 humano y de cynomolgus expresada en la superficie celular de HCT116 recombinante con una afinidad similar y CE50 de 4,9 y 5,5 nM, respectivamente.
Se evaluó la capacidad del anticuerpo MAb2 de unirse a las proteínas LAMP1 humana y LAMP1 de primates expresadas en la superficie de clones estables HCT116 recombinantes por FACS. Para una estimación de la afinidad aparente, se recubrieron células HCT 116 a razón de 40.000 células/pocillo en una placa de alta unión de 96 pocillos (MSD L15XB-3) y se añadieron 100 pL/pocillo de anticuerpo en diluciones en serie de 2 veces a partir de 20 pg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con BSA al 1% en PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; n° A2135) durante 45 min a 4°C y se lavó tres veces con PBS BSA al 1%. La unión del anticuerpo se evaluó después de la centrifugación y resuspensión de las células mediante la adición de 200 pl/pocillo de PBS BSA al 1% y se leyó utilizando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOST@T-SPEED. El anticuerpo MAb2 se une a LAMP1 humana y de cynomolgus expresada en la superficie celular de HCT 116 recombinante con una afinidad similar y una CE50 de 6,3 y 6,6 nM, respectivamente para MAb2.
Por lo tanto, MAb1 y MAb2 se unen a LAMP1 de origen humano y de cynomolgus con una afinidad similar.
El anticuerpo MAb3 se evaluó mediante citometría de flujo en cuanto a su capacidad para unirse a proteínas LAMP1 humana y LAMP1 de primates expresadas respectivamente en la superficie de los clones estables de HCT116 o HEK293. Se obtuvo el clon estable de HCT116 como se describió arriba. Las células HEK293 se infectaron con un vector lentiviral que permitió la integración estable de la CDS de LAMP1 humana o de cynomolgus en el ADN genómico de las células. Los clones individuales con diferentes densidades de ubicación de la superficie celular de LAMP1 de cynomolgus se derivaron de un conjunto de células HEK293 infectadas. Protocolo como se describe en el ejemplo anterior. Valores de CE50 se calcularon utilizando el software BIOST@T-SPEED. El anticuerpo MAb3 se une a LAMP1 humana y de cynomolgus expresada en la superficie de HCT 116 o HEK293 recombinante con una afinidad similar y una CE50 de 7,6 y 4,0 nM, respectivamente.
Por lo tanto, MAb1, MAb2 y MAb3 se unen a LAMP1 de origen humano y de cynomolgus con una afinidad similar.
Ejemplo 4.8: Competencia de unión entre MAb de acuerdo con la invención y/o H4A3 anti-LAMPI disponible comercialmente
Los siguientes Ejemplos presentan información sobre la competencia de los mAbs hacia el epítopo en LAMP1 mediante ELISA. Confirmó los datos obtenidos en el sitio de unión del epítopo como se describe en el Ejemplo 6 y permitió la comparación con un mAb anti-LAMP1 comercialmente disponible.
Competencia de unión entre MAb1 y MAb2
La competencia entre MAb2 (murino) y MAb1 (quimérico) por la unión a LAMP1 se ensayó mediante ELISA y se ilustra en la Figura 4. No se observó competencia.
Competencia de unión entre MAb1 y MAb2 o MAb3
Los experimentos de competencia entre dos mAbs anti-LAMP1 se realizaron mediante ELISA con LAMP1 humana recombinante revestida en una placa (como se describe en el Ejemplo 6.2). Brevemente, se añadieron dos mAbs simultáneamente a concentraciones de 0,06 y 15 mg/L, estando la concentración de 0,06 mg/L cerca de la CE50. El formato de mAb se eligió de modo que los dos mAbs tuvieran dominios Fc diferentes (humanos o murinos). Mediciones individuales de la unión de mAb se podrían realizar específicamente por su unión específica única a Fc (con Ab IgG Anti-Humano de Cabra Peroxidasa-AffiniPure, Específico del Fragmento Fcy (Jackson 109-035-098) o con Ab IgG Anti-Ratón de Cabra Peroxidasa-AffiniPure, Específico del Fragmento Fcy (Jackson 115-035-164)). Los resultados se reseñaron como un porcentaje del valor obtenido del mAb solo a la misma concentración, véase la Tabla 8.
Tabla 8: Competencia entre chMAb1 MAb2 o MAb3
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Se encontró que MAb1 no compite con MAb2 o Mab3. Por lo tanto, el sitio de unión al epítopo LAMP1 para MAb1 no se solapa con los sitios de unión al epítopo para MAb2 o MAb3.
Competencia de unión entre H4A3 y MAb1 o MAb2 o MAb3 y entre MAb2 y MAb3
Los experimentos de competición entre H4A3 anti-LAMP1 (BioLegend 328602) y MAb1, Mab2 o MAb3 y entre MAb2 y MAb3 se realizaron como se describe arriba Ejemplo B4.81 Los resultados se reseñan como un porcentaje del valor obtenido del mAb solo a la misma concentración, véase la Tabla 9.
Tabla 9: Competencia entre H4A3 chMAb1 o chMAb2 o chMAb3
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Se encontró que H4A3 compite con MAb3, compite parcialmente con Mab2 y no compite con MAb1 por unirse a LAMP1.
Se encontró que MAb2 y MAb3 compiten parcialmente por unirse a LAMP1.
Ejemplo 5: Caracterización inmunohistoquím ica (IHC) de MAb1 purificado en tejidos no tumorales y tumorales humanos
El anticuerpo monoclonal MAb1 se purificó para una evaluación adicional y validación de anticuerpos mediante una extensa caracterización por IHC en tejidos no tumorales y tumorales. Por lo tanto, se testó la inmunorreactividad de LAMP1 en un gran panel de tejidos humanos no tumorales y tumorales de micromatrices de tejidos comerciales o secciones de criostato completo, ya sea como OCT congelada (temperatura de corte óptima) o alcohol de formalina acético (AFA) o formalina derivada del paciente. xenoinjertos humanos. Las muestras de PDX utilizadas se describieron en el Ejemplo 1.
Inmunotinción en formato AFA
La IHC clásica se realizó utilizando un instrumento automático Ventana (Discovery XT, Ventana Medical Systems, Inc, EE.UU.). Las secciones se desparafinaron y se incubaron con avidina y reactivo de bloqueo de biotina (Endogenous Block, Ventana, 760-050) seguido de incubación de Serum Block (Ventana 760-4212). A continuación, se incubó el anticuerpo monoclonal murino MAb1 a una concentración final de 4 pg/mL durante 1 hora a 37°C. Se realizó una etapa de post-fijación con glutaraldehído (al 0,05% en NaCl al 0,9% p/v) durante 4 min. El IgG2a anti-ratón de cabra secundario biotinilado se incubó durante 12 min a 37°C (Southern Biotech, Ref. 1080-08, y dilución 1/200 en diluyente de Ventana). La inmunotinción se realizó con el kit de detección cromogénica DAB Map de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aplicó una etapa de contratinción a las secciones del criostato con hematoxilina II (790-2208, Ventana Medical Systems, Inc. EE.UU.) y se aplicó reactivo de tinción de azul durante 4 min (760-2037). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos con medio de montaje Coverquick 2000 (Labonord, Ref 05547530). Los controles negativos utilizados en este estudio consistieron en la omisión del anticuerpo primario y el uso del isotipo IgG2a (concentración final 1 pg/mL en PBS).
Inmunotinción en formato PFA
La IHC clásica se realizó utilizando un instrumento automático Ventana (Discovery XT, Ventana Medical Systems, Inc, EE.UU.). Las secciones se desparafinaron y se aplicó tampón de acondicionamiento celular 1 (CC1) de recuperación de antígeno (ref. 950-123 Ventana) durante 52 min. Las secciones se incubaron con reactivo bloqueador de avidina y biotina (Endogenous Block, Ventana, 760-050) y reactivo Serum Block (Ventana, 760-4212). A continuación, se incubó el anticuerpo monoclonal murino MAb1 a una concentración final de 4 pg/mL durante 1 hora a 37°C. Se realizó una etapa de post-fijación con glutaraldehído (al 0,05% en NaCl al 0,9% p/v) durante 4 min. El IgG2a anti-ratón de cabra secundario biotinilado se incubó durante 12 min a 37°C (Southern Biotech, Ref. 1080-08, y dilución 1/200 en diluyente de Ventana). La inmunotinción se realizó con el kit de detección cromogénica DAB Map de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aplicó una etapa de contratinción a las secciones del criostato con hematoxilina II (790-2208, Ventana Medical Systems, Inc. EE.UU.) y se aplicó reactivo de tinción de azul durante 4 min (760-2037). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos con medio de montaje Coverquick 2000 (Labonord, Ref 05547530). Los controles negativos utilizados en este estudio consistieron en la omisión del anticuerpo primario y el uso del isotipo IgG2a (concentración final 1 pg/mL en PBS).
Inmunotinción en formato OCT congelada
Después del bloqueo de avidina y biotina (Endogenous Block, Ventana, 760-050), las secciones congeladas se incubaron con anticuerpo monoclonal murino MAb1 (concentración final 1 pg/mL (para muestras humanas) y 1 y 5 pg/mL (para muestras de monos) en solución salina tamponada con fosfato, PBS) durante 32 min a 37°C. Se realizó una etapa de post-fijación con glutaraldehído (al 0,05% en NaCl al 0,9% p/v) durante 4 min. El IgG2a anti-ratón de cabra secundario biotinilado se incubó durante 12 min a 37°C (Southern Biotech, Ref. 1080-08, dilución 1/200 en diluyente de Ventana). La inmunotinción se realizó con el kit de detección cromogénica DAB Map de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aplicó una etapa de contratinción a las secciones del criostato con hematoxilina II (790-2208, Ventana Medical Systems, Inc. EE.UU.) y se aplicó reactivo de tinción de azul durante 4 min (760-2037). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos con medio de montaje Coverquick 2000 (Labonord, Ref 05547530).
Los controles negativos utilizados en este estudio consistieron en la omisión del anticuerpo primario y el uso del isotipo IgG2a (concentración final 1 pg/mL en PBS).
Análisis de los datos
Secciones inmunoteñidas con anticuerpo murino MAb1 purificado se escanearon y digitalizaron a un aumento de x20 utilizando el sistema Scan Scope XT (Aperio Technologies, Vista CA). A continuación, se capturaron imágenes digitalizadas utilizando el software Image Scope (v10.2.2.2319 Aperio, Technologies).
La evaluación de la tinción incluyó varios parámetros: sitio histológico de reactividad (citoplasma, núcleo o membrana), tipo principal de célula reactiva, intensidad de tinción y frecuencia de tinción celular. Las muestras positivas se puntuaron con una escala de intensidad de 1 a 3. Los intervalos de intensidades se describieron como negativos (0), débiles (1), moderados (2) y fuertes (3). La frecuencia celular fue el porcentaje de células inmunoteñidas y fue estimada por la observación del histólogo como una mediana por muestra. La frecuencia celular se ordenó en 5 categorías: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) y 5 (76-100%).
Se calculó una expresión global de acuerdo con la descripción de Allred Score (AS). La EA se obtuvo sumando las puntuaciones de intensidad y proporción para obtener una puntuación total que oscilaba entre 0 y 8. La EA se reseñó como un porcentaje de la puntuación global máxima y se clasificó en 5 categorías: muy baja (0-25%), débil (26-50%), moderada (51-75%) y alta (75-100%). La prevalencia se definió como el porcentaje de casos positivos para la indicación.
Se calcularon estadísticas descriptivas básicas con Microsoft Excel 2003. Para cada una de las indicaciones se describió el número de casos, el número de casos positivos, la prevalencia, la media de la puntuación de intensidad, la media de frecuencia y la puntuación de Allred.
Distribución de tejido no tumoral
Globalmente, los datos experimentales demuestran que el patrón IHC de LAMP1 en células de tejidos adultos no tumorales es predominantemente citoplasmático.
LAMP1 se expresó en el citoplasma de un gran panel de tejidos, incluidos órganos vitales, gastrointestinal, reproductor, urinario, endocrino, linfoide y otros como piel, músculo, ojo, médula espinal) y no se observó tinción de membrana en órganos principales tales como corazón, hígado, páncreas, pulmón y riñón.
Sin embargo, se produjo alguna expresión de LAMP1 en la membrana, pero se restringió a células epiteliales del estómago, células epiteliales esofágicas, células epiteliales mamarias, células epiteliales prostáticas, células epiteliales testiculares (Tabla 10).
No obstante, la prevalencia y las intensidades medias de la expresión de LAMP1 en la membrana de muestras no tumorales fueron inferiores a las encontradas en los tumores.
Tabla 10 : Inmunotinción de LAMP1 en muestras humanas no tumorales - Patrón de membrana
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Distribución de tejido tumoral
El patrón inmunohistoquímico utilizando MAb1 o MAb2 en tejidos tumorales humanos demuestra que el antígeno está ubicado en el citoplasma y/o la membrana de tejidos tumorales. Los datos de expresión de proteínas para muestras tumorales humanas que muestran el patrón de membrana demuestran que el antígeno LAMP1 no está restringido a los adenocarcinomas de colon. Una diversidad de otros carcinomas, incluyendo tumores gastrointestinales (intestino delgado, recto, glándula parótida), tumores de órganos vitales (pulmón, hígado, estómago, páncreas y riñón), tumores de órganos reproductores (mama, ovario y próstata), así como piel, laringe. y tumores de tejidos blandos (Tabla 11).
Tabla 11 : Inmunotinción de LAMP1 en muestras tumorales humanas: Patrón de membrana
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TEJIDOS TUMORALES
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Prev
de Prev Intensid s Puntuaci Ne 1- 6­ 26- 51­ 76­ >
Órgano Tipo
Tumor N Mem ad Memb ón de 25 75 100 50
Mem Memb 5% 50%
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Las indicaciones tumorales se clasificaron en términos del nivel de expresión de LAMP1, basado en el porcentaje de muestras que mostraban más del 50% de frecuencia de membrana (células positivas).
Basado en este parámetro, las primeras indicaciones tumorales fueron colon, recto, carcinoma de células escamosas de pulmón, carcinoma ductal y lobular invasivo de mama, adenocarcinoma de estómago y adenocarcinoma de próstata.
Adicionalmente, las indicaciones que muestran un 25-50% de células positivas en la membrana también podrían considerarse como indicaciones relevantes, incluyendo adenocarcinoma de intestino delgado, adenocarcinoma de glándula parótida, adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de ovario, melanoma maligno de piel y carcinoma de células escamosas de laringe (T abla 11).
Además, no se detectó inmunotinción de LAMP1 en la membrana en las siguientes indicaciones tumorales: Carcinoma de células pequeñas de pulmón (0/3), carcinoma de células escamosas de esófago (0/11), carcinoma de células escamosas de cuello uterino 0/3), adenocarcinoma de endometrio (0/3), carcinoma de células escamosas de vulva (0/6), seminoma de testículos (0/4), carcinoma embrionario de testículos (0/1), carcinoma de células transicionales de vejiga (0/1), adenocarcinoma papilar de tiroides (0/3) y tumor mulleriano mixto de la cavidad oral (0/5).
Ejemplo 6: identificación del s itio de unión
En este ejemplo, se definieron los dominios LAMP1 y se diseñaron proteínas LAMP1 híbridas humanas-murinas para generar proteínas LAMP1 secretadas, así como ancladas a la membrana que permiten la caracterización del sitio de unión de los mAbs anti-LAMP1 hacia LAMP1.
Ejemplo 6.1: Definición de dominios LAMP1
LAMP1, también denominada CD107a, es la proteína de membrana asociada a lisosoma 1. Es una proteína transmembrana de tipo I de alrededor de 120 kDa. La proteína es un monómero altamente glicosilado con dieciocho sitios de N-glicosilación y seis sitios de O-glicosilación. Está compuesta por dos dominios luminales separados por una bisagra. Cada uno de los dominios luminales tiene dos puentes disulfuro que definen dos bucles. De acuerdo con RefSeq NP_005552.3 (SEQ ID NO: 24), los diferentes dominios de LAMP1 se han mapeado como se muestra en la Tabla 1. En base a la información estructural y, en particular, a las cadenas beta y a las diferencias de aminoácidos entre LAMP1 humana y de ratón se diseñaron varias moléculas LAMP1 híbridas.
Ejemplo 6.2: Preparación de dominios extracelulares recombinantes de proteínas LAMP1
El alto nivel de glicosilación del antígeno requirió un enfoque específico para determinar el sitio de unión de los mAbs anti-LAMP1 en LAMP1. Los anticuerpos monoclonales LAMP1 MAb1 y MAb2 no muestran unión alguna a la proteína LAMP1 de ratón. Esta ausencia de unión se utilizó para diseñar varias proteínas LAMP1 quiméricas, en las que uno o varios de los dominios LAMP1 (Bucle1-Bucle4) en la construcción humana fueron reemplazados por la contraparte murina. La ausencia de unión una vez que el sitio de unión del anticuerpo fue reemplazado por la contraparte murina permitió la identificación del lado de unión del anticuerpo.
Por lo tanto, los dominios de proteína extracelular de LAMP1 de origen humano, de mono cynomolgus (c) y murino (m) o híbrido entre dominios LAMP1 murino y humano se han preparado mediante expresión transitoria en células HEK293 de riñón embrionario humano con plásmidos que permiten la expresión del ADNc respectivo, tal como se esboza en la T abla 12.
Cada uno de los plásmidos de expresión se complementó con 293fectin™ (Life Technologies) y ocho días después de la transfección en células 293-F cultivadas en suspensión (derivadas de células HEK293), se purificó la proteína soluble correspondiente por parte de IMAC (GE Healthcare) para generar un lote de proteínas.
Tabla 12: Descripción de los dominios extracelulares recombinantes de proteínas LAMP1 Nombre de la proteína Descripción de dom inios de proteínas ID Secuencia
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Ejemplo 6.3: Determinación de la afinidad de unión y el epítopo por ELISA
Las proteínas LAMP1 secretadas descritas en el Ejemplo 6.2 se utilizaron para identificar el dominio de unión a mAbs anti-LAMP1 mediante ELISA. MAb1 reconoce el bucle 2 de LAMP1 y MAb2 reconoce el bucle 1 de LAMP1 con una CE50 a LAMP1 de alrededor de 0,2 y 0,3 nM, respectivamente.
T l 1 : E nM ni r mA hi ri m m rin im ri
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Ejemplo 6.4: Expresión de proteínas transmembrana LAMP1
Se expresaron diferentes proteínas LAMP1 en la membrana celular de células HEK293 después de la expresión transitoria de plásmidos de mamíferos que codifican la secuencia codificante completa de LAMP1 eliminada del motivo GYQTI que fija como objetivo lisosomas intracelulares y sustituida por una secuencia repetida de 5-Ala. Los plásmidos de mamíferos tenían señales de expresión similares a los plásmidos utilizados para producir LAMP1 recombinante descrita en el Ejemplo 6.2. La Tabla 14 que figura a continuación enumera todos los plásmidos que se diseñaron para confirmar los resultados obtenidos con la proteína LAMP1 soluble mediante el ELISA del ejemplo 6.3 y caracterizar adicionalmente los dominios de unión de los mAbs anti-LAMP1.
T l 14: D ri i n r ín r n m m r n LAMP1
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Ejemplo 6.5: Determinación de la afinidad de unión y el epítopo mediante citometría de flujo
Cada uno de los plásmidos de expresión descritos en el Ejemplo 6.4 se complementó con 293fectin™ en células 293­ F cultivadas en suspensión utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 6.2. Dos días después de la transfección, las células se procesaron, se analizaron mediante citometría de flujo (Guava® easyCyte™ 8HT) como se menciona en el ejemplo 4.7, y se registró la fluorescencia media. Esta fluorescencia representa una evaluación semicuantitativa de la unión.
Los resultados obtenidos con los plásmidos pXL5626, pXL5668, pXL5669, pXL5719 y pXL5720 se resumen en la Tabla 15.
Tabla 15: Unión de huMAb1_1, chMAb1, chMAb2 y chMAb3 sobre proteínas LAMP1 mediante citometría de flujo fluorescencia media
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Este primer conjunto de datos de afinidad (Tabla 15) con las proteínas LAMP1 ancladas a la membrana está de acuerdo con los datos de ELISA reseñados en el Ejemplo 6.3 con las proteínas LAMP1 secretadas. MAb1 se une a hLAMP1 en las posiciones L2 101 a 195 de hLAMP1 (SEQ ID NO: 24), MAb2 y MAb3 se une a hLAMP1 en las posiciones L1 29 a 100 de hLAMP1. Estos datos también demostraron que ninguno de los tres anti-LAMP1 se une a un glicótopo, ya que MAb1 se une a LAMP1, para lo cual L2 fue modificada por ingeniería genética para no tener un sitio de N-glicosilación y MAb2 y MAb3 se unen a LAMP1, para lo cual L1 fue modificada por ingeniería genética para no tener un sitio de N-glicosilación. Los resultados obtenidos con los plásmidos pXL5626, pXL5988, pXL5669, pXL5990 a pXL5997 se resumen en la Tabla 16.
T l 1 : ni n h MA 1 1 hMA 2 r r ín LAMP1 m i n i m rí fl fl r n i m i
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Los resultados obtenidos con los plásmidos pXL5626, pXL6041, pXL6047, pXL6048 y pXL6009 se resumen en la Tabla 17.
Tabla 17: Unión de MAb1 y MAb2 sobre proteínas LAMP1 mediante citometría de flujo (fluorescencia media Experimento n° 1 Experimento n° 2
Plásmido Proteína MAb1 MAb2 MAb1
pXL5626 hLAMP1_ Unión 1748 unión 1 Unión completa 551
pXL6041 mLAMP1_ Unión 680 Sin uni unión 211
pXL6047 mLAMP1_ Sin unión 7 Sin uni Sin unión 3 pXL6048 mLAMP1_ Sin unión 6 Sin uni Sin unión 2
pXL6092 mLAMP1_ No hecho No hec Unión completa 499 pXL6009 mLAMP1_
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Sin unión 4 Sin uni
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Sin unión 2
Los resultados obtenidos con los plásmidos pXL5626, pXL6012 a pXL6015, pXL6017 y pXL6009 se resumen en la Tabla 18.
Tabla 18: Unión de MAb1, MAb2 y MAb3 sobre proteínas LAMP1 mediante citometría de flujo (fluorescencia media Plásmido Proteína MAb1 MAb2 MAb3
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Los datos de afinidad descritos en la Tabla 16 con proteínas LAMP1 ancladas a membrana demostraron que MAb1 se une a LAMP1 en las posiciones L2101 a 195 de hLAMP1 (SEQ ID NO: 24) (pXL5626, pXL5988 y pXL5997). Más específicamente, MAb1 no se une a la proteína LAMP1 híbrida en donde los residuos LAMP1 humana de las posiciones 97 a 110 o de las posiciones 173 a 189 han sido sustituidos por residuos LAMP1 murinos, pero se une a la proteína LAMP1 híbrida en donde los residuos LAMP1 humanos de las posiciones 110 a 173 o de las posiciones 189 a 196 en L2 han sido sustituidos por residuos de LAMP1 murina. Se ha de señalar que también se pierde algo de unión cuando los residuos de LAMP1 humana de la posición 144 a 157 son reemplazados por los residuos de LAMP1 murina. Además, los datos presentados en la Tabla 17 Experimento N° 1 demostraron que los residuos de las posiciones 97 a 110 y de las posiciones 173 a 189 se necesitan simultáneamente para restaurar algo de la unión. Los datos presentados en la Tabla 17 del experimento N° 2 demostraron que los residuos de las posiciones 91 a 104 y 138 a 151 y 167 a 183 en el Bucle 2 se necesitan simultáneamente para restablecer la unión completa de MAb1.
A partir de estos conjuntos de datos de afinidad (Tablas 15, 16, 17 y 18) obtenidos por citometría de flujo con proteínas LAMP1 ancladas a membrana y los resultados de ELISA con las proteínas LAMP1 secretadas descritas en el Ejemplo 6.3, se podrían derivar las siguientes conclusiones:
MAb1 se une a las posiciones L2101 a 195 de LAMP1, MAb2 y MAb3 se unen a las posiciones L1 29 a 100 de LAMP1.
Ninguno de los tres anti-LAMP1 se une a un glicótopo, ya que MAb1 se une a LAMP1 para lo cual L2 fue modificado por ingeniería genética para no tener un sitio de N-glicosilación y MAb2 y MAb3 se unen a LAMP1 para lo cual L1 fue modificado por ingeniería genética para no tener un sitio de N-glicosilación.
MAb1 no se une a la proteína LAMP1 híbrida en la que los residuos LAMP1 humanos de las posiciones 97 a 110 (SEQ ID NO: 78) o de las posiciones 173 a 189 (SEQ ID NO: 79) han sido sustituidos por residuos LAMP1 murinos. Pero se une a la proteína LAMP1 híbrida, en donde los residuos de LAMP1 humana de las posiciones 110 a 173 o de las posiciones 189 a 196 en L2 han sido sustituidos con residuos de LAMP1 murina. MAb1 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de L2 y más específicamente MAb1 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de las secuencias de las posiciones 101 a 110 (SEQ ID NO: 72) y/o de las posiciones 174 a 188 (SEQ ID NO: 74)y hasta cierto punto de secuencias desde las posiciones 144 a 157 (SEQ ID NO: 73). Por lo tanto, se puede inferir de estos resultados y de las diferencias de aminoácidos entre secuencias murinas y humanas que es probable que los residuos de LAMP1 humana entre R146, D150, K152, R106, A108, N181, S182, S183, R186 y G187 interactúen con Mab1.
MAb2 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de L1 y más específicamente MAb2 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de las secuencias de las posiciones 68 a 80 (SEQ ID NO: 76) y hasta cierto punto de secuencias desde las posiciones 29 a 41 (SEQ ID NO: 75). Por lo tanto, se puede inferir de estos resultados y de las diferencias de aminoácidos entre secuencias murinas y humanas que es probable que los residuos de LAMP1 humana entre A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75 y R77 interactúen con Mab2.
MAb3 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de L1 y más específicamente MAb3 interactúa con los aminoácidos ubicados dentro de las secuencias de las posiciones 29 a 41 (SEQ ID NO: 75) y/o de las posiciones 68 a 80 (SEQ ID NO: 76). Por lo tanto, se puede inferir de estos resultados y de las diferencias de aminoácidos entre secuencias murinas y humanas que es probable que los residuos de LAMP1 humana entre A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75 y R77 interactúen con Mab3.
Ejemplo 6.6: Determinación del aminoácido individual implicado en la unión del epítopo por Ala Sean
Los residuos individuales identificados en el ejemplo 6.5 y no implicados en la estructura de la cadena p han sido reemplazados individualmente por un residuo de alanina en la secuencia de LAMP1 derivada de hLAMP1_AGYQT1 y codificados en el plásmido pXL5626 (ejemplo 6.4). Se modificaron por ingeniería genética un total de 21 plásmidos a partir de pXL5626 (véase la Tabla 19) y se utilizaron para ensayar la expresión de LAMP1 en la membrana celular de células HEK293 después de la transfección transitoria. Dos días después de la transfección, las células se procesaron, se analizaron mediante citometría de flujo (Guava® easyCyte™ 8HT) como se menciona en el ejemplo 4.7, y se registró la fluorescencia media. Esta fluorescencia representa una evaluación semicuantitativa de la unión. La pérdida de unión se reseña en la Tabla 19 cuando hay una disminución de más del 50% de la fluorescencia media en comparación con la proteína de control codificada por pXL5626.
Tabla 19: Pérdida de unión a mAb anti-LAMP1 con proteínas transmembrana LAMP1 Alascan
Plásmido Posición de la mutación en hLAMP1_AGYQTI Unión a MAb1 Unión a MAb3 pXL5626 ninguna
pXL6058 G36A
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La pérdida de unión a MAb1 en las posiciones 1149, D150 y R186 debida a la sustitución de Ala en la proteína LAMP1 indica que estas posiciones son importantes para la unión de MAb1 a LAMP1.
La pérdida de unión a MAb3 en las posiciones G38 y D70 debida a la sustitución de Ala en la proteína LAMP1 indica que estas posiciones son importantes para la unión de MAb2 a LAMP1.
Ejemplo 7: Determinación de secuencias de mAb
Ejemplo 7.1: Determinación de secuencias de mAb y generación de mAbs quiméricos.
Las secuencias de los dominios variables del mAb se recuperaron del hibridoma y se clonaron en un vector de expresión para asegurar que los mAbs clonados tuvieran las mismas características que los mAbs murinos iniciales. El ADNc que codifica los dominios variables de los anticuerpos monoclonales se obtuvo como sigue. ADNc se ha recuperado y secuenciado mediante RT-PCR (transcriptasa SuperScript III de Invitrogen y polimerasa Phusion de Finnzymes) de 100 células de hibridoma y oligonucleótidos ubicados en el extremo 5’ del ADNc que codifica las regiones variables y los dominios constantes.
Espectrometría de Masas de Alta Resolución de hibridoma (HRMS):
Los espectros de masas se obtuvieron en un sistema Waters Synapt G2 TOF en modo positivo por electropulverización (ES+). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: UPLC MassPrep 20 pm 2,1 X 5 mm; disolventes: A: H2 O ácido fórmico al 0,1% : B: CH3 CN ácido fórmico al 0,1%; temperatura de la columna: 80°C; caudal 0,2 mL/min; elución en gradiente (10 min): 10% de B durante 30 s; de 10 a 50% de B en 7 min 10 s; 8 min: 90% de B; 8 min 30 s: 10% de B; 10 min: 10% B. Las muestras se redujeron 30 min a 37°C en Gdn.HCL 6M/DTT 1M antes del análisis LC/MS.
Las secuencias de aminoácidos derivadas proporcionaron información de acuerdo con los datos obtenidos en mAbs purificados derivados del hibridoma mediante secuenciación N-terminal y espectrometría de masas (LC/MS) de las cadenas pesada y ligera (LC, HC). Tabla 20. No se encontraron secuencias idénticas en las secuencias patentadas de GenomeQuest.
T a b la 2 0 : A n á l i s i s d e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s d e m A b s a n t i - L A M P I d e h ib r i d o m a
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L a s s e c u e n c ia s d e á c i d o s n u c l e ic o s d e lo s d o m in io s v a r i a b le s V H y V L s e c lo n a r o n e n v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n e n f u s ió n c o n la s s e c u e n c ia s c o d i f i c a n t e s d e d o m in io c o n s t a n t e d e Ig G 1 h u m a n a o C k a p p a h u m a n a , r e s p e c t i v a m e n t e , p a r a lu e g o g e n e r a r lo t e s d e m A b s q u i m é r i c o s m e d ia n t e e x p r e s i ó n t r a n s i t o r i a e n c é l u la s 293 - F c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 6.2. L o s lo t e s s e p u r i f i c a r o n m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f in i d a d d e p r o t e í n a A ( M a b S e l e c t , G E H e a l t h c a r e ) . E l m a t e r i a l e l u id o s e d i a l i z ó f r e n t e a P B S a n t e s d e la f i l t r a c ió n e n c o n d i c io n e s e s t é r i l e s y a l m a c e n a m ie n t o a 4 ° C . L a a f in i d a d p o r L A M P 1 p e r m a n e c i ó s im i l a r p a r a m A b s m u r i n o s y q u i m é r i c o s i l u s t r a d o s p o r la C E 50 o b t e n i d a p o r E L I S A c o n L A M P 1 e n la T a b la 21.
T a b la 21 : C E 50 n M o b t e n i d a c o n L A M P 1 a r a h i b r i d o m a m u r i n o m A b s u i m é r i c o s c o r r e s o n d i e n t e s
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E n b a s e a lo s d a t o s a r r i b a d e s c r i t o s , s e v a l i d a r o n la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la H C y la L C .
L a s s e c u e n c ia s d e L C y H C d e M A b 1 s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 35 y S E Q ID N O : 36 , r e s p e c t i v a m e n t e .
L a s s e c u e n c ia s d e L C y H C d e M A b 2 s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 37 y S E Q ID N O : 38 , r e s p e c t i v a m e n t e .
L a s s e c u e n c ia s d e la s r e g io n e s C D R s e d e d u je r o n d e la s e c u e n c ia d e la p r o t e í n a u t i l i z a n d o la n o m e n c l a t u r a I M G T . L a s s e c u e n c ia s d e L C y H C d e c h M A b 1 s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 18 y S E Q ID N O : 17 , r e s p e c t i v a m e n t e , y la s s e c u e n c ia s d e L C y H C d e c h M A b 2 s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 19 , r e s p e c t i v a m e n t e . L a s s e c u e n c ia s d e L C y H C d e c h M A b 3 s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 49 y S E Q ID N O : 50 , r e s p e c t i v a m e n t e .
E s d e d e s t a c a r q u e s e h a n i n t r o d u c i d o r e s id u o s c a n ó n i c o s e n e l c lo n M A b 2 e n la s p o s i c i o n e s A 9 , L 51 , L 58 , G 72 y L 108 e n V L y e n la p o s i c ió n T 116 e n la s e c u e n c ia V H , p a r a g e n e r a r M a b 2 c a n . L a s c o r r e s p o n d i e n t e s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e V H y V L d e M A b 2 c a n s o n S E Q ID N O : 15 y S E Q ID N O : 16 , r e s p e c t i v a m e n t e . L a s s e c u e n c ia s d e H C y L C d e c h M A b 2 c a n s e m u e s t r a n e n S E Q ID N O : 21 y 22 , r e s p e c t i v a m e n t e .
U n lo t e d e c lo n c h M A b 2 c a n s e g e n e r ó e n la s m is m a s c o n d i c io n e s q u e e l lo t e c o r r e s p o n d i e n t e a l c lo n c h M A b 2 . E s t o r e s a l t a q u e s e p u e d e n r e a l i z a r m u t a c io n e s p u n t u a l e s e n e l F R s in im p a c t o a lg u n o e n la u n ió n , p e r o lo q u e e s m á s im p o r t a n t e , p r o p o r c io n a n u n a a l t e r n a t i v a a l p r o c e d i m i e n t o d e p r o d u c c i ó n .
U n lo t e d e c lo n c h M A b 3 _ V L R 24 - R 93 s e g e n e r ó e n la s m is m a s c o n d i c io n e s q u e e l lo t e c o r r e s p o n d i e n t e a l c lo n c h M A b 3 . E s t o r e s a l t a q u e s e p u e d e n r e a l i z a r m u t a c io n e s p u n t u a l e s e n la C D R s in im p a c t o a lg u n o e n la u n ió n .
Afin idad por LAMP1 mediante SPR:
La cinética de unión de los mAb anti-LAMPI murinos, quiméricos o humanizados se determinó mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie utilizando un BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ). Brevemente, se acopló un chip biosensor CM5 BIAcore en el instrumento y se activó con 70 gL de NHS/EDC 1:1 a temperatura ambiente. Se inmovilizaron un Fc de IgG1 anti-humano de ratón (BIAcore n° BR-1008-39) y un Fc de IgG1 anti-murino de conejo (BIAcore n° BR-1008-38) (50 gg/mL en tampón acetato 1 M, pH 5) en los chips activados en todas las celdas de flujo. La inmovilización se llevó a cabo a un caudal de 10 gL/min hasta la saturación. A continuación, el chip se bloqueó mediante inyección de 70 gL de etanolamina-HCl, pH 8,5, seguido de un lavado con MgCh 3 M para Fc de IgG1 anti-humano y un lavado con glicina-HCl 10 mM pH 1,7 para Fc de IgG1 anti-murino. Para medir la unión de mAbs anti-LAMP1 a LAMP1, se utilizaron anticuerpos a razón de 1-5 gg/mL en tampón de desarrollo BIAcore (HBS-EP). El antígeno (SEQ ID NO: 28, proteína producida como se describe en el Ejemplo 6.2) se inyectó de 1 a 256 nM. Una vez completada la fase de inyección, se controló la disociación en un tampón de desarrollo BIAcore al mismo caudal durante 600 s. La superficie se regeneró entre inyecciones utilizando, por, 2 x 5 gL de MgCl23 M (2 x 30 s) o Fc de IgG1 anti-humano y 1 x 30 gL de glicina-HCl 10 mM pH 1,7 para Fc de IgG1 anti-murino (180 s). Los sensogramas individuales se analizaron utilizando el software BIAevaluation.
La afinidad por LAMP1 por los mAbs murinos, quiméricos o humanizados se indica en la Tabla 22. Se encontró que era independiente del formato de MAb.
MAb1 se une a LAMP1 con una Kd que varía de 4,8 a 8,2 nM
MAb2 se une a LAMP1 con una Kd que varía de 63,5 a 68,8 nM
MAb3 se une a LAMP1 con una Kd que varía de 4,7 a 7,2 nM
El mAb anti-LAMP1 comercialmente disponible (H4A3 (BioLegend 328602)) tiene una Kd significativamente más alta y, por lo tanto, una eficacia de unión más baja que Mab 1, Mab 2 y MAb 3 con una Kd de alrededor de 100 nM.
T l 22: in i ni n LAMP1 r l mA m rin im ri h m niz
Figure imgf000066_0001
Ejemplo 7.2: Obtención y caracterización de variantes humanizadas derivadas de MAb1
En este ejemplo, se han diseñado in silico variantes humanizadas de IgG MAb1 parental murino. Las variantes de huMAb1 resultantes se produjeron y proporcionaron características similares a las del chMAb1 quimérico.
Ejemplo 7.2.1 Diseño del huMAb1 anti-LAMP1 humanizado
Humanización basada en e l injerto de CDR
Este enfoque consiste en el trasplante de CDRs del MAb1 murino parental en FRs humanos relevantes. Las regiones variables ligeras y pesadas de MAb1 murino se compararon con secuencias de la línea germinal humana del sistema de información IMGT (Lefranc et al. Nucl. Acids. Res. 2009, 37: D1006-D1012) para seleccionar las secuencias variables humanas ligeras y pesadas que servirían como base de las regiones MAb1 humanizadas (huMAb1).
La región variable de la cadena ligera de ratón mostró un 68,8% de identidad frente a la región V y un 74,7% de identidad dentro de las FRs solas con la cadena ligera kappa de la línea germinal humana IGKV1-27. Para la región de unión, la región J del ratón mostró un 90% de identidad con la línea germinal humana IGKJ4. En consecuencia, se han seleccionado IGKV1-27 de la región V humana combinada con IGKJ4 de la región J humana dando un índice de germinalidad global (identidad calculada sobre FRs solamente) de 76,4% como secuencias aceptoras humanas para la humanización de la cadena ligera de MAb1 de ratón. Esto se convirtió entonces en la base de la variante humanizada de la cadena ligera de Mab1 anti-LAMP1, que comprendía las CDRs de la región Vk de MAb1 murino y las FRs de las regiones IGKV1-27_ IGKJ4 humanas.
La región variable de la cadena pesada de ratón mostró un 65,3% de identidad frente a la región V y un 70,0% de identidad dentro de las FRs solas con la línea germinal variable pesada humana IGHV1-69. Para la región de unión, la región J del ratón mostró un 78% de identidad con la línea germinal de unión pesada humana IGHJ4. En consecuencia, se ha seleccionado la región V de la línea germinal humana IGHV1-69 combinada con la región J de la et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). Una primera lista de mutaciones consenso para la LC y para la HC se ha restringido a los aminoácidos que se encuentran en el modelo humano más cercano (es decir, vk1-vh1b). Ninguna de estas mutaciones está ubicada en la zona "Vernier" (Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499). Se tienen en cuenta otros criterios para considerar estas mutaciones de consenso para estabilizar potencialmente el anticuerpo Mab1 anti-LAMP1. Estos criterios son un cambio favorable de la hidropatía en la superficie o una estabilización predicha basada en la mecánica molecular del mutante. Se consideraron las mutaciones estabilizadoras reseñadas como exitosas en la bibliografía (Bedouelle, H.J. Mol . Biol. 2006, 362,580-593; Steipe B.J. Mol. Biol. 1994, 240, 188­ 192).
Regiones VL y VH Humanizadas Resultantes
En base a ambos enfoques, el injerto de CDRs y los protocolos 4D, se proponen tres versiones para la cadena ligera variable (VL1, VL2 y VL3) y tres versiones para la cadena pesada variable (VH1, VH2 y VH3). La combinación particular de residuos de aminoácidos mutados en cada una de las variantes VL y VH de MAb1 humanizado se recogen en la Tabla 23 y la Tabla 24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos completas de los dominios VH y VL humanizados se recogen en la Tabla 25.
Para la región ligera variable:
La variante de VL1 humanizada con SEQ ID NO: 56 muestra un total de 12 mutaciones en comparación con la secuencia de ratón con SEQ ID NO: 5. Esta variante se deriva de marcos de secuencias de la línea germinal humana IGKV1-27_IGKJ4 con 6 retromutaciones realizadas, porque se sospechaba que tenían un impacto negativo en la estructura del mAb, la conformación de las CDRs y, por lo tanto, en la unión a su diana. Además, para los aminoácidos en la posición 43 y 83, se prefirió la mutación en un aminoácido más frecuente presente en las líneas germinales de IGKV1 (A43 y F83).
La variante de VL2 humanizada con SEQ ID NO: 57 presenta 2 mutaciones que se derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más flexibles que no son CDR de la cadena ligera de MAb1 murino y la secuencia de la cadena ligera humana vk1.
La variante de VL3 humanizada con SEQ ID NO: 58 se deriva de VL2 e incluye 6 nuevas mutaciones que son consenso (secuencia vk1) y potencialmente estabilizadoras.
La combinación particular de residuos de aminoácidos mutados en las cadenas ligeras humanizadas individuales de huMAb1 y VL de huMab1_1, huMab1_2 y huMab1_3 se recogen en la Tabla 23.
Tabla 23: Mutaciones de las variantes VL del anticuerpo Mab1 anti-LAMP1
Figure imgf000068_0001
Para la región pesada variable:
Figure imgf000069_0001
L a v a r i a n t e V H 2 p r e s e n t a 7 m u t a c io n e s : 6 m u t a c io n e s d e r i v a d a s d e la c o m p a r a c ió n d i r e c t a e n t r e lo s a m in o á c id o s n o C D R m á s f le x i b le s d e la c a d e n a p e s a d a d e M A b 1 m u r i n o y la s e c u e n c ia d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n a v h 1 b , m á s la m u t a c ió n d e K 74 d e S E Q ID N O : 1 e n T p a r a a n t i c i p a r u n p r o b l e m a p o t e n c i a l s i s e f i j a c o m o o b j e t i v o p o r e l p r o c e s o d e c o n j u g a c i ó n .
L a v a r i a n t e V H 3 s e d e r i v a d e V H 2 e in c lu y e 7 n u e v a s m u t a c io n e s q u e s o n c o n s e n s o ( s e c u e n c i a v h 1 b ) y p o t e n c i a lm e n t e e s t a b i l i z a d o r a s .
L a c o m b in a c ió n p a r t i c u l a r d e r e s id u o s d e a m in o á c id o s m u t a d o s e n la s c a d e n a s l i g e r a s h u m a n i z a d a s i n d i v i d u a l e s d e h u M A b 1 y V H d e h u M a b 1 _ 1 , h u M a b 1 _ 2 y h u M a b 1 _ 3 s e r e c o g e n e n la T a b la 24.
T a b la 24 : M u t a c io n e s d e la s v a r i a n t e s V H d e l a n t i c u e r o M a b 1 a n t i - L A M P 1
Figure imgf000069_0003
Figure imgf000069_0002
L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s c o m p le t a s d e lo s d o m in io s V H y V L h u m a n i z a d o s s e r e c o g e n e n la T a b la 25.
T a b la 2 5 : S e c u e n c i a s d e a m in o á c id o s V H V L d e a n t i c u e r o s a n t i - L A M P 1 h u m a n i z a d o s .
Figure imgf000069_0004
Figure imgf000070_0001
Ejemplo 7.2.2: Producción y caracterización de tres variantes de huMAbl anti-LAMPI humanizadas
Las correspondientes secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y VL variables humanizados descritos en el Ejemplo 7.2.1 fueron sintetizadas en Geneart y fueron clonadas en vectores de expresión en fusión con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o la Ckappa humana, respectivamente, para luego generar lotes de mAbs humanizados mediante expresión transitoria en células 293-F tal como se describe en el Ejemplo 6.2. A los tres mAbs se les alude como -huMAM_1 que contiene LC1 (VL1-huCk) (SEQ ID NO: 59) and HC1 (VH1-hulgG1) (SEQ ID NO: 60).
• huMAb1_2 que contiene LC2 (VL2-huCk) (SEQ ID NO: 61) and HC2 (VH2-hulgG1) (SEQ ID NO: 62).
• huMAb1_3 que contiene LC3 (VL3-huCk) (SEQ ID NO: 63) and HC3 (VH3-hulgG1) (SEQ ID NO: 64).
Se generó un control negativo y se le aludió como huMAb1_negA. Contiene LCnegA (VL1_36A-95A-huCk) (SEQ ID NO: 65) y HCnegA (VH1_101A-hulgG1) (SEQ ID NO: 67).
Se generó otro control y se le aludió como huMAb1_negB. Contiene LC1 (VL1-huCk) (SEQ ID NO: 59) and HCnegB (VH1-hulgG1_266A) (SEQ ID NO: 68). La mutación 266A en hulgG1 corresponde a la mutación D265a de acuerdo con la nomenclatura descrita por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991. Se informó que disminuía significativamente la unión a FcyRs y ADCC (Lund et al., J. Immunol., 157:4963-4969, 1996; Shields et al., J. Biol. Chem., 276 (1): 6591- 6604, 2001).
También se verificó una disminución significativa en la unión a FcyRI, II y III mediante ELISA con proteínas recombinantes (FcyRII / CD64 humana recombinante referencia 1257-FC-050, FcyRIIA / CD32a humana recombinante referencia 1330-CD-050/CF, FcYRIIIa/CD16a humana recombinante, referencia 4325-FC-050, todas obtenidas de R&D System).
Los lotes se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A (MabSelect, GE Heathcare). El material eluido se dializó frente a PBS antes de la filtración en condiciones estériles y almacenamiento a 4°C. Los lotes se analizaron mediante espectrometría de masas de alta resolución como se describe en el Ejemplo 7. Los datos estaban de acuerdo con el valor in silico recuperado de las secuencias de aminoácidos, Tabla 26.
Tabla 26: Análisis de espectrometría de masas de mAbs anti-LAMP1 humanizados
Figure imgf000071_0003
La proteína LAMP1 secretada descrita en el Ejemplo 6.2 se utilizó para determinar mediante ELISA el dominio de unión a mAbs anti-LAMP1 humanizados. La afinidad por LAMP1 permaneció similar para mAbs quiméricos y humanizados tal como se ilustra por la CE50 obtenida mediante ELISA con LAMP1 en la Tabla 27. No se detecta la unión con huMAb1_negA.
Tabla 27 : CE50 (nM) obtenida con LAMP1 para mAbs quiméricos y humanizados
ID mAb hLAMP1
Figure imgf000071_0001
Ejemplo 7.2.3: Reactividad cruzada de huMAb1_1; huMAb1_2 y huMAb1_3 con LAMP1 de mono cynomolgus Los anticuerpos huMAb1_1, huMAb1_2 y huMAb1_3 se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar su capacidad de unirse a las proteínas LAMP1 humana o LAMP1 de cynomolgus expresadas respectivamente en la superficie de los clones estables de HCT116 o HEK293. Se obtuvo el clon estable de HCT116 como se describió en el Ejemplo 4.7. Se obtuvo el clon estable de HEK293 de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 4.7. Las CE50s, estimadas utilizando el software BIOST@T-SPEED, se enumeran en la Tabla 28.
Tabla 28: Afinidad aparente de huMAb1_1; huMAb1_2 y huMAb1_3 con LAMP1 humana o LAMP1 de mono c nomol us
Figure imgf000071_0002
El resultado demuestra que huMAb1_1 se une a LAMP1 de origen humano y de cynomolgus con una afinidad similar con una relación de CE50s de 2. HuMAb1_1 reacciona de forma cruzada con LAMP1 de cynomolgus. HuMAb1_2 se une a LAMP1 de origen humano y de cynomolgus con una afinidad similar con una relación de CEsüs de 2,01. HuMAb1_2 reacciona de forma cruzada con LAMP1 de cynomolgus. HuMAb1_3 se une a LAMP1 de origen humano y de cynomolgus con una afinidad similar con una relación de CE50s de 1,71. HuMAb1_3 reacciona de forma cruzada con LAMP1 de cynomolgus.
Ejemplo 7.3: Identificación del s itio de unión a l epítopo de huMAb1_1 p o r cristalografía
Ejemplo 7.3.1: Obtención del complejo Fab1/LAMP1
Expresión y purificación de Fab de huMAb 11
El Fab recombinante de huMAb1_1 (Fab1) se obtuvo de células HEK293 transfectadas de forma transitoria, utilizando dos plásmidos que codifican la cadena ligera LC1 o la cadena pesada etiquetada con His C-terminal derivada de HC1 con SEQ ID NO: 68 y 69, respectivamente. Después de la clarificación de las células, se aplicó sobrenadante de crecimiento sobre una resina de afinidad de metal inmovilizada (IMAC). Después de la elución de la resina, las fracciones que contenían Fab1 de alta pureza se agruparon y se dializaron extensamente frente a PBS. La solución de Fab1 se almacenó a 4°C.
Expresión y purificación de LAMP1-29-195 humana no glicosilada
Con el fin de obtener un dominio LAMP1 no glicosilado, se utilizó un sistema de expresión bacteriano. Se diseñó una proteína de fusión de tiorredoxina para expresar el dominio L1-L2 de la proteína LAMP1 humana con SEQ ID NO: 70 (TrxA-His-Thr-LAMP1-29-195, en que Thr significa sitio de escisión de trombina). La proteína de fusión se expresó utilizando un promotor T7, en una cepa de E. co lideficiente en trxB-gor. El cultivo de alta densidad celular de la cepa recombinante se realizó en un medio patentado químicamente definido, en un biorreactor. A partir de la pasta celular, se extrajo la proteína de fusión mediante lisis en prensa French, el lisado celular se clarificó mediante ultracentrifugación y el sobrenadante clarificado se aplicó en una columna IMAC. Después de la elución de la resina, se agruparon las fracciones que contenían la proteína recombinante y se utilizó la proteasa de trombina (Sigma-Aldrich) para escindir el T rxA-His, una hora a temperatura ambiente. A continuación, la solución se aplicó en una columna de benzamidina sefarosa (GE Healthcare) y en una columna IMAC, para eliminar la trombina y el participante en la fusión TrxA-His libre, respectivamente. El dominio LAMP1-29-195 no etiquetado purificado se almacenó a 4°C hasta la preparación del complejo. La secuencia del dominio LAMP1 -29-195 no etiquetado se referencia bajo SEQ ID NO: 71.
Preparación y purificación de los complejos
Se mezclaron Fab recombinante (Fab1) y antígeno (dominio LAMP1-29-195 no etiquetado) en una relación molar de 1,5:1, se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente y los complejos se purificaron adicionalmente mediante exclusión por tamaño preparativa en una columna Superdex 200 PG (GE Healthcare), equilibrada con PBS. Las fracciones que contenían un complejo de alta pureza se agruparon y almacenaron a 4°C hasta los ensayos de cristalografía.
Ejemplo 7.3.2: Determinación de la estructura de Fab1/LAMP1
Cristalización y recopilación de datos
El complejo se concentró a 12 mg/mL en PBS 10 mM pH 7. La cristalización se realizó utilizando el método de gota sentada. Cristalizó en PEG3350 al 20%, NaF 200 mM (cond1) y PEG3350 al 20%, ácido DL-málico 200 mM pH7 (cond2). Se incluyó etilenglicol al 25% como crioprotector antes de la congelación.
Se recopilaron conjuntos de datos de ambos cristales en la línea de haz ID29 ESRF.
Cristales difractados en el mismo grupo espacial C2 a 2,37 Á (cond1) o 2,51 Á (cond2).
Solución de estructura
Se obtuvo un modelo del dominio constante de Fab1 utilizando la estructura PDB referenciada bajo 4JG0. Se construyó un modelo del dominio variable en Maestro (Schroedinger).
El reemplazo molecular se llevó a cabo utilizando Phaser (Coy et al, J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674) del paquete CCP4 (Winn et al, Acta Cryst D67 (2011), 235-242) en ambos conjuntos de datos, pero solo tuvo éxito en cond2: una ejecución de refinamiento inicial confirmó la presencia de dos Fabs en la unidad asimétrica. Era visible una densidad adicional por encima de los dominios variables, pero demasiado parcial para colocar el antígeno.
Se llevó a cabo un segundo reemplazo molecular en cond l, utilizando los resultados de la ejecución previa en cond2. Esta vez, la densidad clara podría ser visible por encima de uno de los dominios variables, lo que permite la construcción manual de una molécula Lamp1. A continuación, se construyó la segunda molécula de Lamp1 utilizando la simetría no cristalográfica entre los dos complejos.
La estructura se refinó utilizando un aparato Buster (Buster-TNT 2.11.5, Global Phasing Ltd) a 2.37Á hasta un Rlibre de 26,1% y Rfactor 22,6%
Resultados
Hay dos complejos Fab1 / LAMP1 en la unidad asimétrica, con factores de temperatura global significativamente diferentes. Las interacciones entre las dos proteínas son idénticas en ambos complejos; en consecuencia, se tomó como referencia para el análisis el complejo más estable.
El primer dominio luminal de LAMP1 correspondiente a los aminoácidos Ala29 a Arg195 de SEQ ID NO: 24 interactúa principalmente con la cadena pesada de Fab1. En la Figura 13 se indican los residuos de Fab1 que forman parte del parátopo (es decir, residuos con átomos dentro de 4A de los átomos del antígeno). Los aminoácidos que forman parte del parátopo se localizan en la cadena ligera, más exactamente en la CDR1-L con Asp30, Arg31 y Tyr32 de SEQ ID NO: 68 y CDR2-L con Asp50 de SEQ ID NO: 68. Están localizados, además, en la cadena pesada, más precisamente en CDR1-H (Ile28, Asn31, Tyr32, Asn33), CDR2-H (Tyr52, Asn55, Asp57, Pro59), en el bucle FR3 (Thr74, Ser75, Ser77) y CDR3-H (Asn100, Trp101, Asp102, Phe105) SEQ ID NO: 69.
El epítopo de LAMP1 para Fab1, determinado como residuos con átomos dentro de 4A de los átomos de Fab1, se indica en negrita/subrayado en la secuencia que figura a continuación y se muestra en la Figura 14:
GSHMAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGK
ENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESIT DIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDR (SEQ ID
NO 80)
Dicho epítopo identificado por cristalografía consiste en los aminoácidos Asn35, Cys80, Gly 81, Glu83, Asn84, Arg106, Asn107, Ala108, Ile149, Asp150, Lys151, Tyr 178, Ser180, Asn181, Arg186 y Gly187 de SEQ ID NO : 24.
Como se puede ver en el alineamiento mostrado en la Figura 1, solo hay una diferencia de un residuo en la región del epítopo entre Macacus fascicularis y Homo sapiens: en la Posición 187 de la SEQ ID NO: 24 con Gly187Glu. Se construyó y minimizó un modelo de esta mutación: los resultados demuestran que la unión a Fab1 sigue siendo posible siempre que el movimiento de la cadena lateral de la cadena ligera Tyr32 y el ligero movimiento de LAMP1 Lys151 como se indica en la Figura 15.
Basándose en la estructura cristalográfica que se obtuvo en esta memoria, es posible sugerir regiones para la maduración por afinidad. Dos puntos calientes pueden ser el aminoácido Ile28 en la secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y el aminoácido Asn55 en la secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO: 53. Reemplazar el residuo hidrófobo Ile 28 por una glutamina podría conducir a una interacción con Gly81 y Asn35 cercanos de LAMP1 (SEQ ID: 24) y debería mejorar la unión entre las dos proteínas como se muestra en la Figura 16. La mutación de Asn55 en una Arginina añadiría interacciones a Asn87, Arg106 y Thr107 de LAMP1 (SEQ ID: 24) como se muestra en la Figura 17.
Ejemplo 8: Producción y Caracterización de ADC
Ejemplo 8.1: Producción y caracterización de ADC con un maitansinoide
Cálculo de DAR:
Un conjugado comprende generalmente de 1 a 10 molécula(s) del maitansinoide fijado covalentemente al anticuerpo (lo que se denomina "relación fármaco-anticuerpo" o "DAR"). Este número puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del maitansinoide utilizado junto con las condiciones experimentales utilizadas para la conjugación (tal como la relación maitansinoide/anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del co-disolvente si lo hubiera). Por lo tanto, el contacto entre el anticuerpo y el maitansinoide conduce a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre sí por diferentes relaciones de fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. El DAR que se determina es, por lo tanto, un valor medio.
El método utilizado en esta memoria para determinar el DAR consiste en medir espectrofotométricamente la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm de una solución del conjugado sustancialmente purificado. En particular, dicho DAR se puede determinar espectrofotométricamente utilizando los coeficientes de extinción medidos a 280 y 252 nm respectivamente para el anticuerpo (£A280 y £A252) y para el maitansinoide (£D280 = 5.180 M-1cm-1 y £D252= 26.159 M-1cm 1) . E l m é t o d o d e c á l c u lo s e d e r i v a d e A n t o n y S . D i m i t r o v ( e d ) , L L C , 2009 , T h e r a p e u t i c A n t i b o d i e s a n d P r o t o c o l s , v o l 525 , 445 , S p r i n g e r S c i e n c e y s e d e s c r i b e c o n m á s d e t a l l e m á s a d e la n t e :
L a s a b s o r b a n c ia s p a r a e l c o n j u g a d o a 252 n m ( A 252 ) y a 280 n m ( A 280 ) s e m id e n e n u n a p a r a t o e s p e c t r o f o t ó m e t r o p a r a c a l c u l a r e l D A R . L a s a b s o r b a n c ia s s e p u e d e n e x p r e s a r d e la s i g u ie n t e m a n e r a :
A252 = (Cd X CD252) (Ca X £A252)
A 28 O = (Cd X £D28o) + (Ca X £ a 2So)
e n d o n d e :
• C d y C a s o n r e s p e c t i v a m e n t e la s c o n c e n t r a c i o n e s e n la s o l u c ió n d e l m a i t a n s i n o id e y d e l a n t i c u e r p o
• £D252 y £D28 ü s o n r e s p e c t i v a m e n t e lo s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n m o la r d e l m a i t a n s i n o id e a 252 n m y 280 n m • £A252 y £A28 ü s o n r e s p e c t i v a m e n t e lo s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n m o la r d e l a n t i c u e r p o a 252 n m y 280 n m . L a r e s o lu c ió n d e e s t a s d o s e c u a c io n e s c o n d o s in c ó g n i t a s c o n d u c e a la s s i g u ie n t e s e c u a c io n e s :
Cd = [(£ A280 X A252) -(£ A252X A280)] / [(£ D252 X £ A28o) -(£ A252X £ D28o)]
Ca = [A28O -(Cd X £ D28o)] / £ A2B0
E l D A R p r o m e d io s e c a l c u la e n t o n c e s a p a r t i r d e la r e la c i ó n d e la c o n c e n t r a c i ó n d e l f á r m a c o a la d e l a n t i c u e r p o : DAR = Cd / Ca
Desglicosilación y Espectrometría de Masas de A lta Resolución de conjugados (HRMS)
L a d e s g l i c o s i l a c ió n e s u n a t é c n i c a d e d i g e s t ió n e n z i m á t i c a m e d ia n t e g l i c o s i d a s a . L a d e s g l i c o s i l a c ió n s e r e a l i z a a p a r t i r d e 50 g l d e e n z i m a c o n j u g a d a 10 g l d e N - g l i c o s i d a s a - F ( P N G a s a F ) ( 100 u n i d a d e s d e e n z i m a l i o f i l i z a d a / 100 g l d e a g u a ) . E l m e d io s e a g i t a c o n v ó r t i c e y s e m a n t ie n e u n a n o c h e a 37 ° C . L a m u e s t r a d e s g l i c o s i l a d a e s t á e n t o n c e s l i s t a p a r a s e r a n a l i z a d a e n H R M S . L o s e s p e c t r o s d e m a s a s s e o b t u v i e r o n e n u n s i s t e m a W a t e r s X E V O Q T o f e n m o d o p o s i t i v o p o r e l e c t r o p u l v e r i z a c i ó n ( E S ) . L a s c o n d i c io n e s c r o m a t o g r á f i c a s s o n la s s i g u ie n t e s : c o l u m n a : U P L C B E H 300 C 4 1 , 7 g m 2 ,1 X 150 m m ; d i s o l v e n t e s : A : H 2 O á c i d o f ó r m ic o a l 0 , 1 % : B : C H 3 C N á c i d o f ó r m ic o a l 0 , 1 % ; t e m p e r a t u r a d e la c o l u m n a : 70 ° C ; c a u d a l 0 , 5 m L / m in ; e l u c ió n e n g r a d i e n t e ( 10 m in ) : 20 % d e B d u r a n t e 2 m in 50 s ; d e 20 a 80 % d e B e n 2 m in 5 s ; 8 m in 50 s ; 80 % d e B ; 8 m in 55 s : 20 % d e B ; 10 m in : 20 % d e B .
Contenido de tampones
• T a m p ó n A ( p H 6 , 5 ) : N a C l ( 50 m M ) , t a m p ó n f o s f a t o d e p o t a s i o ( 50 m M ) , E D T A ( 2 m M )
• T a m p ó n h Gs ( p H 5 , 5 ) : h i s t i d in a (1ü m M ) , g l i c i n a ( 1 3 0 m M ) , s a c a r o s a 5 % ( p / v ) , H C l ( 8 m M )
• P B S ( p H 7 , 4 ) : K H 2 P O 4 ( 1 , 03 m M ) , N a C l ( 155 , 17 m M ) , N a 2 H P O 4 - 7 H 2 O ( 2 , 97 m M )
Abreviaturas utilizadas
D A R : R e la c ió n F á r m a c o - A n t i c u e r p o ; D M A : d i m e t i l a c e t a m id a ; H E P E S : á c i d o 4 -( 2 - h i d r o x ie t i l ) - 1 - p ip e r a z i n a -e t a n o s u l f ó n i c o ; H R M S : E s p e c t r o s c o p i a d e M a s a s d e A l t a R e s o lu c i ó n ; N i t r o - S P D B : á c i d o b u t a n o i c o , é s t e r 4 -[ ( 5 - n i t r o -2 - p i r id in i l ) d i t i o ] - 2 , 5 - d i o x o - 1 - p i r r o l i d i n ñ i l i c o ( p o d r í a p r e p a r a r s e c o m o s e d e s c r ib e e n la p a t e n t e W O 2004016801 ) ; T A : t e m p e r a t u r a a m b ie n t e .
Ejemplo 8.1.1: Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (ADC) (chMAb1 quimérico)
S e p r e p a r ó u n p r o d u c t o q u i m é r i c o d e s n u d o d e M a b 1 . E s u n m A b q u i m é r i c o ( c h M A b 1 ) d e r i v a d o d e l c lo n M A b 1 m u r i n o c o n u n a Ig G 1 h u m a n a , is o t i p o C k q u e t i e n e u n a c a d e n a p e s a d a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 17 y u n a c a d e n a l i g e r a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 18.
E n e s t e e j e m p lo , s e o b t u v o u n c o n j u g a d o e s c i n d ib le ( i n d i s t i n t a m e n t e d e n o m i n a d o D M 4 - S P D B - c h M A b 1 o c h M A b 1 -S P D B - D M 4 ) a p a r t i r d e c h M A b 1 d e s n u d o , t a l c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p lo 7 , y d e D M 4 c o n s e c u e n c ia s L C y H C d e l m A b q u i m é r i c o c o r r e s p o n d i e n t e a la S E Q . ID N O : 17 y 18.
Figure imgf000074_0001
Preparación y datos analíticos del conjugado quimérico escindible chMAb1-SPDB-DM4
A 12 ,1 m L d e u n a s o l u c ió n d e a n t i c u e r p o c h M A b 1 a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 8 , 23 m g / m L e n t a m p ó n A s e a ñ a d e n b a jo a g i t a c ió n m a g n é t i c a 465 g L d e H E P E S 1 N , 1 m L d e D M A y u n e x c e s o m o la r d e 5 , 9 v e c e s d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e n i t r o - S P D B e n D M A . D e s p u é s d e 1 h 30 a T A , la m e z c la d e r e a c c ió n s e d i l u y e c o n 17 , 3 m L d e t a m p ó n P B S y 1 , 64 m L d e D M A , a n t e s d e la a d i c ió n d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e D M 4 e n D M A .
La mezcla de reacción se agita a TA durante 2h40 y luego se purifica por TFF en casete Sius-LSn Prostream 30 kD. La muestra se diafiltra frente a 600 mL de tampón HGS, se concentra, se recoge y se filtra sobre un filtro de PVDF Millex® 0,22 pM para producir el producto (11 mL).
El conjugado final se analiza espectrofotométricamente; se determinó un DAR promedio de 4,5 DM4 por molécula de anticuerpo (5,7 mg/mL). Datos HRMS: véase la Figura 7.
Ejemplo 8.1.2: Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (huMAb1_3 humanizado)
El huMAb1_3 humanizado desnudo se preparó como se describe en el ejemplo 7.2.2. Es un mAb humanizado derivado del clon MAb1 murino con un isotipo IgG1 y Ck humano, teniendo el isotipo Ck una secuencia de la cadena pesada (VH3-hulgG1) de SEQ ID NO: 64 y una secuencia de la cadena ligera (VL3-huCk) de secuencia SEQ ID NO: 63.
Los coeficientes de extinción mencionados en este memoria se midieron a 280 y 252 nm respectivamente para el anticuerpo £a 28ü=223.400 M-1cm -1 y £a 252=79.413 M-1cm-1
Preparación del conjugado DM4-SPDB-huMAb1 3
A 3,6 mL de una solución de anticuerpo huMAb1_3 a una concentración de 5,18 mg/mL en DPBS se añaden bajo agitación magnética, 0,316 mL de DMA y un exceso molar de 5,2 veces de una solución 15 mM de nitro-SPDB en DMA. Después de 2h 15 a TA, se añaden 0,3 equivalentes de una solución 15 mM de nitro-SPDB en DMA. Después de 1 h45, la mezcla de reacción se diluye con 1,99 mL de tampón PBS y 0,187 mL de DMA, antes de la adición de una solución 15 mM de DM4 en DMA.
La mezcla de reacción se agita a TA durante 2 h y luego se purifica mediante filtración en gel (desalación HiPrep 26/10, Sephadex G25, GE Healthcare) previamente equilibrada con tampón HGS pH = 5,5. La muestra recogida se filtra sobre un filtro de PVDF Millex® de 0,22 pM para producir el producto (9,4 mL). Esta solución se inyecta en un dispositivo Chromasorb® Millipore 0.08 mL (CHRFA1PD09). La muestra recogida se concentra sobre Amicon Ultra-15 10KD, Millipore y se filtra sobre un filtro Millex® PVDF de 0.22 pM para producir el producto (4.3 mL). El conjugado final se analiza espectrofotométricamente; se determinó un DAR promedio de 3,5 DM4 por molécula de anticuerpo (1,9 mg/mL). Datos HRMS: véase la Figura 18.
Ejemplo 8.1.3: Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (huMAb1_1 humanizado)
El huMAb1_1 humanizado desnudo se preparó como se describe en el ejemplo 7.2.2. Es un mAb humanizado derivado del clon MAb1 murino con un isotipo IgG1 y Ck humano, teniendo el isotipo Ck una secuencia de la cadena pesada (VH1-hulgG1) de SEQ ID NO: 60 y una secuencia de la cadena ligera (VL1-huCk) de SEQ ID NO: 59
Los coeficientes de extinción se miden a 280 y 252 nm respectivamente para el anticuerpo £a 28o=223.400 M-1cm-1 y £A252=8ü.041 M-1cm-1
Preparación del conjugado DM4-SPDB-huMAb1 1
A 3,6 mL de una solución de anticuerpo huMAb1_1_ a una concentración de 4,81 mg/mL en DPBS se añaden bajo agitación magnética, 0,321 mL de DMA y un exceso molar de 5,0 veces de una solución 15 mM de nitro-SPDB en DMA. Después de 2 h a TA, se añaden 0,3 equivalentes de una solución 15 mM de nitro-SPDB en DMA. Después de 1 h30, la mezcla de reacción se diluye con 1,59 mL de tampón PBS y 0,147 mL de DMA, antes de la adición de una solución 15 mM de DM4 en DMA.
La mezcla de reacción se agita a TA durante 1h30 y luego se purifica mediante filtración en gel (desalación HiPrep 26/10, Sephadex G25, GE Healthcare) previamente equilibrada con tampón HGS pH = 5,5. La muestra recogida se filtra sobre un filtro de PVDF Millex® de 0,22 pM para producir 9,4 mL de solución. Esta solución se inyecta en un dispositivo Chromasorb® Millipore 0,08 mL (CHRFA1PD09). La muestra recogida se concentra sobre Amicon Ultra-15 10KD, Millipore y se filtra sobre un filtro Millex® PVDF de 0.22 pM para producir el producto (4.9 mL). El conjugado final se analiza espectrofotométricamente; se determinó un DAR promedio de 3,4 DM4 por molécula de anticuerpo (1,45 mg/mL). Datos HRMS: véase la Figura 19.
Ejemplo 8.1.4: Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (huMAb1_2 humanizado)
El huMAb1_2 humanizado desnudo se preparó como se describe en el ejemplo B7. Es un mAb humanizado derivado del clon MAb1 murino con un isotipo IgG1 y Ck humano, teniendo el isotipo Ck una secuencia de la cadena pesada (VH1-hulgG1) de SEQ ID NO: 62 y una secuencia de la cadena ligera (VL2-huCk) de SEQ ID NO: 61.
Los coeficientes de extinción se miden a 280 y 252 nm respectivamente para el anticuerpo £a 28ü=223.400 M-1cm-1 y £A252=79.474 M-1cm-1.
Preparación del conjugado DM4-SPDB-huMAb1 2
A 3 , 6 m L d e u n a s o l u c ió n d e a n t i c u e r p o h u M A b 1 _ 2 _ a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 5 , 06 m g / m L e n b D P B S s e a ñ a d e n b a jo a g i t a c ió n m a g n é t ic a , 0 , 317 m L d e D M A y u n e x c e s o m o la r d e 5 , 2 v e c e s d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e n i t r o - S P D B e n D M A . D e s p u é s d e 2 h , la m e z c la d e r e a c c ió n s e d i l u y e c o n 1 , 89 m L d e t a m p ó n P B S y 0 , 179 m L d e D M A , a n t e s d e la a d i c ió n d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e D M 4 e n D M A .
L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t a a T A d u r a n t e 1 h 30 y lu e g o s e p u r i f i c a m e d ia n t e f i l t r a c ió n e n g e l ( d e s a l a c ió n H iP r e p 26 / 10 , S e p h a d e x G 25 , G E H e a l t h c a r e ) p r e v ia m e n t e e q u i l i b r a d a c o n t a m p ó n H G S p H = 5 , 5. L a m u e s t r a r e c o g i d a s e f i l t r a s o b r e u n f i l t r o d e P V D F M i l l e x ® d e 0 , 22 p M p a r a p r o d u c i r e l p r o d u c t o ( 9 , 7 m L ) .
E l c o n j u g a d o f i n a l s e a n a l i z a e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e ; s e d e t e r m i n ó u n D A R p r o m e d io d e 4 , 05 D M 4 p o r m o lé c u la d e a n t i c u e r p o ( 1 , 36 m g / m L ) . D a t o s H R M S : v é a s e la F ig u r a 20.
Ejemplo 8.1.5: Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (chMAb2can quimérico)
E l c h M A b 2 c a n q u i m é r i c o d e s n u d o s e p r e p a r ó c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 7. E s u n m A b q u i m é r i c o d e r i v a d o d e l c lo n M A b 2 m u r i n o c o n u n i s o t i p o Ig G 1 y C k h u m a n o . E l i s o t i p o C k t i e n e u n a s e c u e n c ia d e la c a d e n a p e s a d a d e S E Q ID N O : 21 y u n a c a d e n a l i g e r a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 22.
L o s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n s e m id e n a 280 y 252 n m r e s p e c t i v a m e n t e p a r a e l a n t i c u e r p o £ a 28ü= 223 .400 M -1c m -1 y £A252= 74.417 M -1c m -1
Preparación del conjugado DM4-SPDB-chMAb2can
A 9 , 2 m L d e u n a s o l u c ió n d e a n t i c u e r p o c h M A b 2 c a n a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 5 ,21 m g / m L e n D P B S s e a ñ a d e n , b a jo a g i t a c ió n m a g n é t ic a , 0 , 813 m L d e D M A y u n e x c e s o m o la r d e 5 , 0 v e c e s d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e n i t r o - S P D B e n D M A . D e s p u é s d e 2 h a T A , s e a ñ a d e n 0 , 2 e q u i v a l e n t e s d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e n i t r o - S P D B e n D M A . D e s p u é s d e 1 h 30 , la m e z c la d e r e a c c ió n s e d i l u y e c o n 5 , 17 m L d e t a m p ó n P B S y 0 , 497 m L d e D M A , a n t e s d e la a d i c ió n d e u n a s o l u c ió n 15 m M d e D M 4 e n D M A .
L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t a a T A d u r a n t e 1 h 30 y lu e g o s e p u r i f i c a m e d ia n t e f i l t r a c ió n e n g e l ( d e s a l a c ió n H iP r e p 26 / 10 , S e p h a d e x G 25 , G E H e a l t h c a r e ) p r e v ia m e n t e e q u i l i b r a d a c o n t a m p ó n H G S p H = 5 , 5. L a m u e s t r a r e c o g i d a s e f i l t r a s o b r e u n f i l t r o d e P V D F M i l l e x ® d e 0 , 22 p M p a r a p r o d u c i r e l p r o d u c t o ( 23 m L ) .
E l c o n j u g a d o f i n a l s e a n a l i z a e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e ; s e d e t e r m i n ó u n D A R p r o m e d io d e 3 , 7 D M 4 p o r m o lé c u la d e a n t i c u e r p o ( 1 , 58 m g / m L ) . D a t o s H R M S : v é a s e la F ig u r a 21.
Ejemplo 8.1.6: Conjugado de Anticuerpo-Fármaco (chMAb3_ VLR24-R93 quimérico)
E l c h M A b 3 _ V L R 24 - R 93 q u i m é r i c o d e s n u d o s e p r e p a r ó c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 7. E s u n m A b q u i m é r i c o d e r i v a d o d e l c lo n M A b 3 m u r in o c o n u n is o t i p o Ig G 1 y C k h u m a n o , t e n ie n d o e l is o t i p o C k u n a s e c u e n c ia d e la c a d e n a p e s a d a d e S E Q ID N O : 49 y u n a c a d e n a l i g e r a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 81.
L o s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n s e m id e n a 280 y 252 n m r e s p e c t i v a m e n t e p a r a e l a n t i c u e r p o £ a 28ü= 234539 M -1c m -1 y £ A 252 = 853 ü 3 M -1c m -1.
Preparación del conjugado DM4-SPDB-chMAb3 VLR24-R93
A 7 , 3 m L d e u n a s o l u c ió n d e c h M A b 3 _ V L R 24 - R 93 a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 6 , 85 m g / m L e n D P B S s e a ñ a d e n , b a jo a g i t a c ió n m a g n é t ic a , 7 , 7 m L d e P B S , 1 , 5 m L d e D M A y u n e x c e s o m o la r d e 5 , 0 v e c e s d e u n a s o l u c ió n 10 m M d e n i t r o -S P D B e n D M A . D e s p u é s d e 3 h 30 , s e a ñ a d ie r o n 155 p L d e u n a s o l u c ió n d e L - D M 4 ( 15 ,1 m M e n D M A ) a la m e z c la d e r e a c c ió n . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó a T A d u r a n t e 1 h 30 y lu e g o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e f i l t r a c ió n e n g e l ( d e s a l a c ió n H i P r e p 26 / 10 , S e p h a d e x G 25 , G E H e a l t h c a r e ) p r e v ia m e n t e e q u i l i b r a d a c o n t a m p ó n H G S p H = 5 , 5. L a m u e s t r a r e c o g i d a s e f i l t r a s o b r e u n f i l t r o d e P V D F M i l le x ® d e 0.22 p M p a r a p r o d u c i r e l p r o d u c t o ( 23 m L ) . E l c o n j u g a d o f i n a l s e e n s a y ó e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e ; s e d e t e r m i n ó u n D A R p r o m e d io d e 3 , 7 D M 4 p o r m o lé c u la d e a n t i c u e r p o ( 2 ,0 m g / m L ) . D a t o s H R M S : v é a s e la F ig u r a 22.
Ejemplo 8.1.7: Reactividad cruzada de DM4-SPDB-chMAb1, DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3 con LAMP1 humana/LAMP1 de cyno
D M 4 - S P D B - c h M A b 1 , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 y D M 4 - S P D B - c h M A b 3 s e e v a l u a r o n m e d ia n t e c i t o m e t r í a d e f l u j o e n c u a n t o a s u c a p a c id a d d e u n i r s e a la s p r o t e í n a s L A M P 1 h u m a n a o L A M P 1 d e c y n o m o l g u s e x p r e s a d a s r e s p e c t i v a m e n t e e n la s u p e r f i c i e d e lo s c l o n e s e s t a b l e s d e H C T 116 o H E K 293. E l c lo n e s t a b l e d e H C T 116 y e l c lo n e s t a b l e d e H E K 293 s e o b t u v i e r o n c o m o s e d e s c r i b e e n e l p r o t o c o lo e n e l E j e m p lo 4.7. L a s C E s o s s , e s t im a d a s u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e B I O S T @ T -S P E E D , s e e n u m e r a n e n la T a b la 29.
T a b la 29 A f in id a d a p a r e n t e d e D M 4 - S P D B - c h M A b 1 , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 , D M 4 - S P D B - c h M A b 3 c o n L A M P 1 h u m a n a o L A M P 1 d e m o n o c y n o m o l g u s
Figure imgf000077_0001
D M 4 - S P D B - c h M A b 1 s e u n e a L A M P 1 d e o r ig e n h u m a n o y d e c y n o m o l g u s c o n u n a a f in i d a d s im i la r . L a r e la c ió n d e la s C E 50 s f u e d e 1 y , p o r lo t a n t o , D M 4 - S P D B - c h M A b 1 r e a c c io n ó d e f o r m a c r u z a d a c o n L A M P 1 d e c y n o m o l g u s . D M 4 -S P D B - c h M A b 2 s e u n e a L A M P 1 d e o r ig e n h u m a n o y d e c y n o m o l g u s c o n u n a a f in i d a d s im i la r . L a r e la c ió n d e la s C E 50 s f u e d e 2 , 3 y , p o r lo t a n t o , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 r e a c c io n ó d e f o r m a c r u z a d a c o n L A M P 1 d e c y n o m o l g u s . D M 4 - S P D B -c h M A b 3 s e u n e a L A M P 1 d e o r ig e n h u m a n o y d e c y n o m o l g u s c o n u n a a f in i d a d s im i la r . L a r e la c ió n d e la s C E 50 s f u e d e 0 , 7 y , p o r lo t a n t o , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 r e a c c io n ó d e f o r m a c r u z a d a c o n L A M P 1 d e c y n o m o l g u s .
Ejemplo 8.1.8: Reactividad cruzada de DM4-SPDB-huMAb1_1 con LAMP1 humana/LAMP1 de cyno
Figure imgf000077_0002
T a b la 30 : A f i n i d a d a a r e n t e d e D M 4 - S P D B - h u M A b 1 1 c o n L A M P 1 h u m a n a o L A M P 1 d e m o n o c n o m o l u s
Figure imgf000077_0004
D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 s e u n e a L A M P 1 d e o r ig e n h u m a n o y d e c y n o m o l g u s c o n u n a a f in i d a d s im i l a r c o n u n a r e la c ió n d e C E 50 s d e 2 , 65. P o r lo t a n t o , D M 4 - S P D B h u M A b 1 _ 1 r e a c c io n a d e f o r m a c r u z a d a c o n L A M P 1 d e c y n o m o l g u s .
Ejemplo 8.2: Producción y caracterización de ADC con un dímero de tomaimicina
Cálculo de DAR:
E l c á l c u lo d e l D A R s e d e t e r m i n a d e m a n e r a s i m i l a r a la d e A D C m a i t a n s i n o id e , u t i l i z a n d o lo s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n m e d id o s a 280 y 322 n m r e s p e c t i v a m e n t e p a r a e l a n t i c u e r p o (£A28ü= 223 .400 M -1c m -1 y £A 322= 0 M -1c m -1) y p a r a e l d í m e r o d e t o m a im ic in a ( e d 28 ü= 4.436 M -1c m -1 y £D 322= 7.843 M -1c m -1).
Preparación de un conjugado de huMAb1 1 modificado con SNPP (4-(5-n¡tro-2-p¡rid¡ld¡t¡o)pentanoato de N-succin im idilo)________ con ________ (2E,2’E, ________ 11aS, ________ 11a’S)-8.8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil)(metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2.6-diil) bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2.3-dihidro-1Hbenzoíelpirroloí 1.2-aii 1.41 diazepin-5(11aH)-ona)
A 56 m g d e h u M A b 1 _ 1 e n 2 , 8 m l d e t a m p ó n A s e a ñ a d e n 0 , 48 m g d e S N P P ( 4 -( 5 - n i t r o - 2 - p i r i d i l d i t i o ) p e n t a n o a t o d e N -s u c c i n im id i l o ) d i s u e l t o e n 67 p L d e D M A b a j o a g i t a c ió n . D e s p u é s d e 3 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , la s o l u c ió n d e a n t i c u e r p o m o d i f i c a d o s e f r a c c i o n a e n d o s y s e p u r i f i c a m e d ia n t e f i l t r a c ió n e n g e l e n d o s c o l u m n a s S e p h a d e x G 25 ( c o lu m n a P D - 10 G E ) p r e - e q u i l i b r a d a s e n u n t a m p ó n a c u o s o c o n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e á c i d o N -( 2 - h id r o x i e t i l ) -p i p e r a z i n a - N ’ - 2 - e t a n o s u l f ó n i c o ( H E P E S ) 0.05 M , N a C l 0 , 05 M y á c i d o e t i l e n d i a m i n o t e t r a a c é t i c o ( E D T A ) 2 m M d e p H = 8. D e s p u é s d e m e z c la r y h o m o g e n e iz a r lo s d o s f i l t r a d o s a s í o b t e n i d o s , e l a n t i c u e r p o m o d i f i c a d o s e e n s a y a m e d ia n t e e s p e c t r o f o t o m e t r í a u t i l i z a n d o lo s c o e f i c i e n t e s d e e x t in c i ó n d e l n i t r o p i r i d in o t i o l (£ 280 nm = 3344 M -1 c m -1 y £ 325 nm = 10964 M -1c m -1) : s e d e t e r m i n ó u n p r o m e d io d e 3 , 32 g r u p o s d i t i o - n i t r o p i r i d i n a p o r m o lé c u la d e a n t i c u e r p o a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 6 , 28 m g / m L .
Figure imgf000077_0003
del último tampón fosfato 10 mM, la elución se realiza con 6 mL del tampón fosfato 200 mM previo. A continuación, se filtran 2,5 mL del lote resultante en una columna Sephadex G25 (columna PD-10 GE) pre-equilibrada en un tampón acuoso de pH = 6,5 con una concentración de histidina 10 mM, que contiene sacarosa al 10%.
La estructural química para (2E,2’E,11aS,11a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil) (metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil)bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11 aH)-ona) es como sigue:
Figure imgf000078_0001
El conjugado obtenido (3,5 mL) se ensaya por espectrofotometría: se determinó un promedio de 2,85 de (2E,2’E,11aS,11a’S)-8,8’-(((4-(2-(2-(2-((2-mercapto-2-metilpropil) (metil)amino)etoxi)etoxi)etoxi)piridina-2,6-diil)bis(metileno))bis(oxi))bis(2-etilideno-7-metoxi-2,3-dihidro-1 Hbenzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11 aH)-ona) por molécula de anticuerpo a una concentración de 1,84 mg/mL. Datos HRMS: véase la Figura 37.
Ejemplo 9: C itotoxicidad in vitro
Ejemplo 9.1: Citotoxicidad in vitro mediada de DM4-SPDB-chMAb1
Células HCT116 se infectaron con un vector lentiviral que permitía la integración estable de la CDS de LAMP1 en el ADN genómico de las células, como se reseña en el Ejemplo 4.7. Se derivaron clones individuales con diferentes densidades de localización de la superficie celular de LAMPI a partir de un conjunto de células infectadas con HCT116. Se utilizó el clon 8 de HCT116 para comparar la CE50 de chMAb1 y DM4-SPDB-chMAb1. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 200000 por pocillo y se añadió Mab1 o DM4-SPDB-chMAb1 en diluciones seriadas de 2 veces de hasta 12 diluciones en un ensayo durante 1 h a 4°C y se lavaron dos veces con BSA al 1% en PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de IgG anti-humana de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; n° A11013) durante 1 h a 4°C y se lavó dos veces con BSA al 1% en PBS. La unión del anticuerpo se evaluó después de la centrifugación y resuspensión de las células en 100 ul de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS). Las muestras se leyeron utilizando el sistema de citometría de flujo Galaxy® (Partec). Los valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOST@T-SPEED. chMAb1 y DM4-SPDB-chMAb1 se unen con una afinidad similar y una CE50 de 6,0 y 6,6 nM, respectivamente.
Se utilizaron varios clones de HCT116 con diferentes densidades de antígeno para evaluar la citotoxicidad de DM4-SPDB-chMAb1 mediante la evaluación de la viabilidad celular utilizando el kit Cell Titer-Glo (Promega).
Células HCT116-LAMP1 se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejó que se adherieran durante 4 horas en una atmósfera de 37°C/5% de CO2. Se añadieron diferentes concentraciones de DM4-SPDB-chMAb1 a las células sembradas, por triplicado para cada una de las concentraciones. A continuación, las células se incubaron durante 96 horas en la misma atmósfera. A continuación, se añadió reactivo Cell Titer-Glo a los pocillos durante 10 min a temperatura ambiente y se midió la señal luminiscente utilizando un lector de placas Victor (Perkin-Elmer). La concentración inhibidora semi-máxima (CI50 ) es una medida de la eficacia de un compuesto en la inhibición de la función biológica. Se define como la concentración del anticuerpo que condujo a la muerte celular con una respuesta a medio camino entre el valor de referencia y el máximo después de un tiempo de exposición específico. Los valores de CI50 se estimaron utilizando el software BIOSt@T-SPEED. DM4-SPDB-chMAb1 mató células con una CI50 de alrededor de 0,2 nM.
Tabla 31: Citotoxicidad de DM4-SPDB-chMAb1 en líneas celulares HCT116 que expresan LAMP1
HCT116-LAMP1 Densidad de antígenos Actividad citotóxica CI50 (nM) (media ± DE; n= 3)
Clon 5 451 000 0,2 ± 0,1
Clon 8
Figure imgf000078_0002
160000
Figure imgf000078_0003
0,1 ± 0,1
La CI50 citotóxica de DM4-SPDB-chMAb1 es sub-nM para los clones de HCT 116 con alta expresión de LAMP1.
Ejemplo 9.2: Citotoxicidad in vitro de DM4-SPDB-huMAb1_1 DM4-SPDB-huMAb1_2, DM4-SPDB-huMAb1_3
El clon 8 de HCT116, como se describe en el Ejemplo 9, se utilizó para evaluar la citotoxicidad de DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-huMAb1_2 y DM4-SPDB-huMAb1_3. Se aplicó el mismo protocolo que se describe en el Ejemplo 9.
Las tres construcciones mataron células con una eficacia equivalente. Las CI50 son 0,10 nM, 0,07 nM y 0,12 nM para DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-huMAb1_2 y DM4-SPDB-huMAb1_3, respectivamente.
Ejemplo 9.3: Citotoxicidad in vitro de DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3
El clon 8 de HCT116, como se describe en el Ejemplo 9, se utilizó para evaluar la citotoxicidad de DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3. Se aplicó el mismo protocolo que se describe en el Ejemplo 9. Las dos construcciones mataron células con una eficacia equivalente. Las CI50 son 0,07 nM y 0,06 nM para DM4-SPDB-chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb3, respectivamente.
Ejemplo 9.4: Evaluación de la inhibición de la proliferación de las líneas celulares HCT116 y HT29 con ADC con dímero de tomaimicina
Células HCT116 (respectivamente HT29) en su fase de crecimiento exponencial se tripsinizan y se resuspenden en su medio de cultivo (DMEM Gibco n° 11960 SVF al 10% glutamina 2 mM). La suspensión celular se siembra en placas Cytostar de 96 pocillos (GE Healthcare Europe, n° RPNQ0163) en medio de cultivo completo que contiene suero hasta una densidad de 3000 (respectivamente 5000) células/pocillo. Después de la incubación durante 4 horas, se añaden diluciones sucesivas del inmunoconjugado anticuerpo-agente citotóxico a los pocillos a concentraciones decrecientes de 10-7 a 10-12 M (por duplicado (respectivamente, en cuadruplicado) para cada una de las concentraciones). Las células se cultivaron a 37°C bajo una atmósfera que contenía 5% de CO2 en presencia del inmunoconjugado anticuerpo-agente citotóxico durante 3 días. En el cuarto día, se añaden 10 gl de una solución de 14C-timidina (0,1 gCi/pocillo, Perkin Elmer n° NEC56825000) a cada uno de los pocillos. La incorporación de 14C-timidina se mide 96 horas después del inicio del experimento con un contador de radiactividad Microbeta (Perkin Elmer). Los datos se expresan en forma de un porcentaje de supervivencia determinando la relación entre las cuentas obtenidas con las células tratadas con el inmunoconjugado y las obtenidas con las células de los pocillos de control (tratadas con el medio de cultivo solo).
La construcción destruyó las células HCT116 y HT29 con una eficacia equivalente. Las Cl50 s son 56 pM para las células HCT 116 y 72 nM para las células HT29.
Ejemplo 10: Eficacia In vivo
Ejemplo 10.1: Eficacia in vitro de DM4-SPDB-chMAb1
En este ejemplo, se demostró que el conjugado DM4-SPDB-chMAb1 escindible conduce a la eficacia in vivo.
Ejemplo 10.1.1: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-chMAb1 contra el adenocarcinoma de colon humano primario CR-LRB-010P
Materiales y Métodos
El conjugado DM4-SPDB-chMAb1 se evaluó a 3 dosis frente a tumores CR-LRB-010P de colon primarios mensurables implantados por vía subcutánea en ratones SCID hembra. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Se administró DM4-SPDB-chMAb1 a 10, 5 y 2,5 mg/kg mediante una inyección de bolo intravenosa (IV), el día 17 después de la implantación del tumor. Los animales se pesaron diariamente y los tumores se midieron 2 veces cada semana con un calibre. Se consideró una dosis excesivamente tóxica una dosis que producía una pérdida de peso del 20% o una pérdida de peso del 15% durante 3 días consecutivos o un 10% o más de muertes por fármaco. Los pesos corporales de los animales incluyeron los pesos de los tumores. Los volúmenes de los tumores se estimaron a partir de mediciones de los tumores bidimensionales y se calcularon de acuerdo con la siguiente fórmula (Corbett, T.H. et al., 1977, Cancer 40: 2660- 2680): Volumen del tumor (mm3) = [Longitud (mm) x Anchura 2 (mm2)]/2. Los puntos finales primarios de eficacia son la relación de cambio en los cambios en el volumen del tumor desde el valor de referencia entre los grupos tratados y de control (AT/AC), regresión media porcentual, regresión parcial (PR) y regresión completa (CR).
Los cambios en el volumen del tumor para cada tratamiento (T) y control (C) se calculan para cada uno de los tumores restando el volumen del tumor el día del primer tratamiento del volumen del tumor el día de observación especificado. La AC mediana se calcula para el grupo de control no tratado y la AT mediana se calcula para el grupo tratado. Luego, se calcula la relación AT/AC y se expresa como un porcentaje: AT/AC = (delta T/delta C) x 100 como se describió anteriormente.
L a d o s i s s e c o n s i d e r a t e r a p é u t i c a m e n t e a c t i v a c u a n d o A T / A C e s in f e r i o r a l 40 % y m u y a c t i v a c u a n d o A T / A C e s i n f e r io r a l 10 % . S i A T / A C e s in f e r i o r a 0 , la d o s i s s e c o n s i d e r a a l t a m e n t e a c t i v a y e l p o r c e n t a j e d e r e g r e s ió n e s t á f e c h a d o ( P lo w m a n J , D y k e s D J , H o l l i n g s h e a d M , S i m p s o n - H e r r e n L y A l l e y M C . H u m a n t u m o r x e n o g r a f t m o d e l s in N C I d r u g d e v e lo p m e n t . E n : F e ib ig H H B A , e d i t o r . B a s i le a : K a r g e r . ; 1999 p 101 - 125 )
% de regresión del tumor: s e d e f in e c o m o e l % d e d i s m i n u c ió n d e l v o l u m e n d e l t u m o r e n e l g r u p o t r a t a d o e n u n d í a d e o b s e r v a c i ó n e s p e c í f i c o e n c o m p a r a c ió n c o n s u v o l u m e n e l p r im e r d í a d e l p r im e r t r a t a m ie n t o .
E n u n m o m e n t o e s p e c í f i c o y p a r a c a d a u n o d e lo s a n i m a le s , s e c a l c u la e l p o r c e n t a j e d e r e g r e s ió n . A c o n t i n u a c ió n , s e c a l c u la e l % m e d ia n o d e r e g r e s ió n p a r a e l g r u p o .
............. volumen volumen,
Ti regresión (at) = -------------- ---------------- ^x100
volumen r
Regresión parcial (PR): L a s r e g r e s io n e s s e d e f in e n c o m o p a r c ia le s s i e l v o l u m e n d e l t u m o r d i s m i n u y e a l 5 0 % d e l v o l u m e n d e l t u m o r a l in i c io d e l t r a t a m ie n t o .
Regresión completa (CR): L a r e g r e s ió n c o m p le t a s e lo g r a c u a n d o e l v o l u m e n d e l t u m o r = 0 m m 3 ( s e c o n s i d e r a C R c u a n d o n o s e p u e d e r e g i s t r a r e l v o l u m e n d e l t u m o r ) .
Resultados:
L o s r e s u l t a d o s s e p r e s e n t a n e n la F ig u r a 5 y la T a b la 32 ( q u e f i g u r a a c o n t i n u a c ió n ) . D M 4 - S P D B - c h M A b 1 a d m in i s t r a d o a 10 , 0 , 5 , 0 y 2 , 5 m g / k g f u e b ie n t o le r a d o c o n u n a p é r d i d a d e p e s o c o r p o r a l m á x im a d e 3 , 7 % a 10 m g / k g . D e s p u é s d e u n a s o l a a d m in i s t r a c i ó n a 10 , 0 y 5 , 0 m g / k g , D M 4 - S P D B - c h M A b 1 r e s u l t ó a l t a m e n t e a c t i v o y e s t a d í s t i c a m e n t e s ig n i f i c a t i v o ( p < 0 , 0001 p a r a c a d a u n a d e la s d o s i s ) , e n c o m p a r a c ió n c o n e l c o n t r o l , p r o d u c i e n d o u n a A T / A C < 0 y r e g r e s io n e s d e l v o l u m e n d e l t u m o r in ic ia l . d e 75 % y 7 % , r e s p e c t i v a m e n t e , c o n u n a P R d e 5 / 6 y u n a R C d e 2 / 6 a 10 m g / k g y u n a P R d e 1 / 6 a 5 m g / k g . L a d o s i s p o r d e b a jo d e 2 , 5 m g / k g f u e a c t i v a c o n u n a A T / A C = 31 % y s in r e g r e s io n e s .
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0003
Ejemplo 10.1.2: Evaluación de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-chMAb1 contra e l tum or de pulmón humano prim ario LUN-NIC-0014
Materiales y métodos
Figure imgf000081_0001
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e in d ic a e n e l E je m p lo 10 - 1.
Resultados
Figure imgf000081_0002
Ejemplo 10.2: Eficacia in vitro de DM4-SPDB-huMAb1_1
Ejemplo 10.2.1: Evaluación de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra e l adenocarcinoma de colon humano prim ario CR-LRB-010P
Material y método
Figure imgf000082_0001
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 a d m in i s t r a d o a 5 , 0 y 2 , 5 m g / k g f u e b ie n t o le r a d o c o n u n a p é r d i d a d e p e s o c o r p o r a l m á x im a d e 4 , 4 % a 2 , 5 m g / k g . D e s p u é s d e u n a s o l a a d m in i s t r a c i ó n a 5 , 0 m g / k g , D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 f u e a c t i v o y e s t a d í s t i c a m e n t e s ig n i f i c a t i v o ( p < 0 , 0001 ) , e n c o m p a r a c ió n c o n e l c o n t r o l , p r o d u c i e n d o u n a A T / A C = 0 s in r e g r e s io n e s . L a d o s i f i c a c ió n p o r d e b a jo d e 2 , 5 m g / k g p r o d u j o u n a A T / A C = 47 % . ( T a b l a 34 F ig u r a 23 )
T a b la 34 : E v a lu a c i ó n d e la a c t i v i d a d a n t i - t u m o r a l d e D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 c o n t r a e l a d e n o c a r c in o m a d e c o lo n h u m a n o r im a r io C R - L R B - 010 P e n r a t o n e s h e m b r a S C I D .
Figure imgf000082_0002
Ejemplo 10.2.2: Evaluación de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra e l carcinoma ductal invasivo prim ario BRE-IGR-0159
Material y método
D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 s e e v a l u ó a c u a t r o d o s i s f r e n t e a t u m o r e s B R E - I G R - 0159 d e c a r c in o m a d u c t a l i n v a s iv o p r im a r io m e n s u r a b l e s i m p l a n t a d o s p o r v í a s . c . e n r a t o n e s S C I D h e m b r a . L o s g r u p o s d e c o n t r o l s e d e j a r o n s in t r a t a r . S e a d m in i s t r ó D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 a 5 , 2 , 5 , 1 , 25 y 0 , 62 m g / k g m e d ia n t e u n a in y e c c ió n d e b o l o in t r a v e n o s a ( IV ) , e l d í a 17 d e s p u é s d e la im p l a n t a c ió n d e l t u m o r . L o s a n i m a le s s e p e s a r o n d i a r i a m e n t e y lo s t u m o r e s s e m id i e r o n 2 v e c e s c a d a s e m a n a c o n u n c a l ib r e .
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
D e s p u é s d e u n a s o l a a d m in i s t r a c i ó n a 5 , 0 y 2 , 5 m g / k g , D M 4 - S P D B - h u M A b 1 _ 1 f u e b ie n t o le r a d o y f u e a c t iv o , p r o d u c i e n d o u n a A T / A C < 0 y r e g r e s io n e s d e l v o l u m e n d e l t u m o r in ic ia l d e 100 % c o n u n a C R d e 6 / 6 a 5 m g / k g y u n a C R d e 4 / 6 a 2 , 5 m g / k g . L a d o s i f i c a c ió n p o r d e b a jo d e 1 , 25 m g / k g f u e a c t i v a c o n u n a A T / A C = 30 % ( p = 0 , 0015 ) y s in r e g r e s io n e s . L a d o s i s m á s b a j a d e 0 , 62 m g / k g p r o d u j o u n a A T / A C = 86 % ( T a b l a 35 , F ig u r a 24 ) .
Figure imgf000083_0001
Ejemplo 10.2.3: Evaluación de la actividad anti-tumoral de DM4-SPDB-huMAb1_1 contra el tumor de pulmón humano primario LUN-NIC-0070
Material y método
Figure imgf000083_0002
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
Figure imgf000083_0003
Figure imgf000084_0003
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000084_0002
T i e m p o d e d u p l i c a c ió n d e l t u m o r = 8 , 8 d í a s E l t a m a ñ o d e l t u m o r a l in i c io d e la t e r a p ia f u e d e 96 - 218 m m 3 c o n u n a c a r g a t u m o r a l m e d ia n a p o r g r u p o d e 132 - - 138 m m 3. F o r m u la c i ó n d e l f á r m a c o : T a m p ó n H i s - G l y - S a c a r o s a p H = 5 , 5 ; A n á l i s i s e s t a d í s t i c o : T e s t d e D u n n e t t f r e n t e a c o n t r o l d e s p u é s d e u n A n o v a d e d o s v í a s c o n m e d id a s r e p e t id a s r e a l i z a d a s p o r s e p a r a d o p a r a c a d a u n o d e lo s c o m p u e s t o s e n r a n g o s d e c a m b io s d e s d e e l v a l o r d e r e f e r e n c ia . S e c o n s i d e r ó s ig n i f i c a t i v a u n a p r o b a b i l i d a d in f e r i o r a l 5 % ( p < 0 , 05 ) .
T i e m p o d e d u p l i c a c ió n d e l t u m o r = 10 , 3 d í a s E l t a m a ñ o d e l t u m o r a l in ic io d e la t e r a p ia f u e d e 118 - 220 m m 3 c o n u n a c a r g a t u m o r a l m e d ia n a p o r g r u p o d e 171 - 176 m m 3. F o r m u la c i ó n d e l f á r m a c o : T a m p ó n H i s - G l y - S a c a r o s a p H = 5 , 5 ; A n á l i s i s e s t a d í s t i c o : T e s t d e D u n n e t t f r e n t e a c o n t r o l d e s p u é s d e u n A n o v a d e d o s v í a s c o n m e d id a s r e p e t id a s r e a l i z a d a s p o r s e p a r a d o p a r a c a d a u n o d e lo s c o m p u e s t o s e n r a n g o s d e c a m b io s d e s d e e l v a l o r d e r e f e r e n c ia . S e c o n s i d e r ó s ig n i f i c a t i v a u n a p r o b a b i l i d a d in f e r i o r a l 5 % ( p < 0 , 05 ) .
Ejemplo 10.3: Eficacia in vitro de DM4-SPDB-chMAb2
Ejemplo 10.3.1: Evaluación de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-chMAb2 contra e l adenocarcinoma de colon humano prim ario CR-LRB-010P
Material y método
Figure imgf000085_0001
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
D M 4 - S P D B - c h M A b 2 d a d o a 10 , 0 , 5 , 0 y 2 , 5 m g / k g f u e r o n b ie n t o le r a d o s . D e s p u é s d e u n a s o l a a d m in i s t r a c i ó n a 10 y 5 m g / k g , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 f u e a c t i v o c o n u n a A T / A C < 0 ( ( p < 0 , 0001 ) y u n a P R d e 1 / 6 y u n a A T / A C = 10 ( p < 0.0001 ) y s in r e g r e s io n e s , r e s p e c t i v a m e n t e . L a d o s i f i c a c ió n p o r d e b a jo d e 2 , 5 m g / k g p r o d u j o u n a A T / A C = 68 % . ( T a b l a 37 F i g u r a 26 )
T a b la 37 : E v a lu a c ió n d e la a c t i v i d a d a n t i - t u m o r a l d e D M 4 - S P D B - c h M A b 2 c o n t r a e l a d e n o c a r c in o m a d e c o lo n h u m a n o p r im a r io C R - L R B - 010 P e n r a t o n e s h e m b r a S C I D .
Figure imgf000085_0002
Ejemplo 10.3.2: Evaluación de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-chMAb2 contra e l carcinoma ductal invasivo prim ario humano BRE-IGR-0159 en ratones hembra SCID
Material y método
D M 4 - S P D B - c h M A b 2 s e e v a l u ó a 3 d o s i s f r e n t e a t u m o r e s B R E - I G R - 0159 d e c a r c in o m a d u c t a l i n v a s iv o p r im a r io m e n s u r a b l e s i m p l a n t a d o s p o r v í a s . c . e n r a t o n e s S C I D h e m b r a . L o s g r u p o s d e c o n t r o l s e d e j a r o n s in t r a t a r . S e a d m in i s t r ó D M 4 - S P D B - c h M A b 2 a 10 , 5 y 2 , 5 m g / k g m e d ia n t e u n a in y e c c ió n d e b o lo in t r a v e n o s a ( IV ) , e l d í a 14 d e s p u é s d e la im p l a n t a c ió n d e l t u m o r . L o s a n i m a le s s e p e s a r o n d i a r i a m e n t e y lo s t u m o r e s s e m id i e r o n 2 v e c e s c a d a s e m a n a c o n u n c a l ib r e .
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
D M 4 - S P D B - c h M A b 2 d a d o a 10 , 0 , 5 , 0 y 2 , 5 m g / k g f u e r o n b ie n t o le r a d o s . D e s p u é s d e u n a s o l a a d m in i s t r a c i ó n a 10 , 5 y 2 , 5 m g / k g , D M 4 - S P D B - c h M A b 2 f u e a c t i v o c o n u n a A T / A C < 0 ( ( p < 0 , 0001 ) y r e g r e s io n e s c o m p le t a s a t o d a s la s d o s i s t e s t a d a s . ( T a b l a 38 F ig u r a 27 )
T a b la 3 8 : E v a lu a c i ó n d e la a c t i v i d a d a n t i - t u m o r a l d e D M 4 - S P D B - c h M A b 2 c o n t r a e l c a r c in o m a d u c t a l i n v a s iv o p r im a r io h u m a n o B R E - I G R - 0159 e n r a t o n e s h e m b r a S C I D
Figure imgf000086_0002
Ejemplo 10.4: Eficacia de la actividad anti-tum oral de DM4-SPDB-chMAb3 contra e l carcinoma ductal invasivo prim ario humano BRE-IGR-0159 en ratones hembra SCID
Material y método
D M 4 - S P D B - c h M A b 3 s e e v a l u ó a 3 d o s i s f r e n t e a t u m o r e s B R E - I G R - 0159 d e c a r c in o m a d u c t a l i n v a s iv o p r im a r io m e n s u r a b l e s i m p l a n t a d o s p o r v í a s . c . e n r a t o n e s S C I D h e m b r a . L o s g r u p o s d e c o n t r o l s e d e j a r o n s in t r a t a r . S e a d m in i s t r ó D M 4 - S P D B - c h M A b 3 a 5 , 0 , 2 , 5 y 1 , 25 m g / k g m e d ia n t e u n a in y e c c ió n d e b o lo i n t r a v e n o s a ( I V ) , e l d í a 16 d e s p u é s d e la im p l a n t a c ió n d e l t u m o r . L o s a n i m a le s s e p e s a r o n d i a r i a m e n t e y lo s t u m o r e s s e m id i e r o n 2 v e c e s c a d a s e m a n a c o n u n c a l ib r e .
L a e v a l u a c i ó n d e la t o x i c i d a d y la e f i c a c i a s e r e a l i z ó c o m o s e r e s e ñ a e n e l E je m p lo 10 , 1.
Resultados
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Ejemplo 11: Activ idad ADCC in vitro
L a a c t i v i d a d d e A D C C s e e v a l u ó u t i l i z a n d o e l c lo n 8 d e h u L A M P 1 d e H C T 116 ( c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 9 ) c o m o c é l u la s d i a n a y c é l u la s a s e s i n a s n a t u r a le s ( N K ) h u m a n a s c o m o c é l u la s e f e c t o r a s . S e u t i l i z ó u n e n s a y o d e l i b e r a c ió n d e la c t a t o d e s h id r o g e n a s a ( L D H ) p a r a m e d i r la l i s is c e l u la r ( R . L . S h ie l d s e t a l . , 2001 , J B io l C h e m , 276 : 6591 - 6604 ) .
Aislam iento de células mononucleares de la sangre periférica
L a s a n g r e s e d i l u y ó 2 - 3 v e c e s c o n s o l u c ió n s a l i n a t a m p o n a d a c o n f o s f a t o ( P B S ) . S e c o l o c a r o n c u i d a d o s a m e n t e t r e i n t a y c i n c o m L d e s a n g r e d i l u i d a s o b r e 15 m L d e F i c o l l - P a q u e P lu s ( G E h e a l t h c a r e ) e n u n t u b o c ó n i c o d e 50 m L y s e c e n t r i f u g a r o n a 400 g d u r a n t e 40 m in a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a s c é l u la s m o n o n u c le a r e s d e la s a n g r e p e r i f é r i c a ( P B M C ) s e r e c o g i e r o n d e la in t e r f a z , s e t r a n s f i r i e r o n a u n n u e v o t u b o c ó n i c o d e 50 m L y s e la v a r o n d o s v e c e s c o n P B S .
Aislam iento de NK
D e a c u e r d o c o n e l p r o t o c o lo d e l k i t d e a i s l a m ie n t o d e c é l u la s N K d e M i l t e n y i ( 130 - 092 - 657 , M i l t e n y i B io t e c h ) . L a s P B M C s e s u s p e n d ie r o n e n t a m p ó n d e a i s l a m ie n t o N K ( 40 p l d e t a m p ó n p a r a 107 c é l u la s e n t o t a l ) , y lu e g o s e a ñ a d ió c ó c t e l d e b i o t i n a - a n t i c u e r p o ( 10 p l p a r a 107 c é l u la s e n t o t a l ) a la s u s p e n s ió n c e l u la r . E l c ó c t e l d e b i o t i n a - a n t i c u e r p o c o n t i e n e a n t i c u e r p o s b i o t i n i l a d o s q u e s e u n e n a la s c é l u la s m o n o n u c le a r e s , a e x c e p c ió n d e la s c é l u la s N K . L a m e z c la s e in c u b ó a 4 ° C d u r a n t e 5 m in , y lu e g o s e a ñ a d ie r o n t a m p ó n d e a i s l a m ie n t o N K ( 30 p l d e t a m p ó n p a r a 107 c é l u la s e n t o t a l ) y c ó c t e l M ic r o B e a d d e c é l u la s N K ( 20 p l p a r a 107 c é l u la s e n t o t a l ) . L a m e z c la d e c é l u la s y a n t i c u e r p o s s e in c u b ó d u r a n t e o t r o s 10 m in a 4 ° C . A c o n t i n u a c ió n , la s c é l u la s s e la v a r o n ( c e n t r i f u g a c ió n a 400 g d u r a n t e 10 m in ) u n a v e z c o n 50 m L d e t a m p ó n d e a i s l a m ie n t o N K , s u s p e n d id a s e n 1 m L d e t a m p ó n d e a i s l a m ie n t o N K p a r a 2.10 E 8 c é l u la s y s e c a r g a r o n y a i s la r o n m e d ia n t e e l s e p a r a d o r a u t o M A C S P r o ( M i l t e n y i ) u t i l i z a n d o e l p r o g r a m a d e a g o t a m ie n t o . L a s f r a c c i o n e s n e g a t i v a s r e c o g i d a s y a g r u p a d a s ( q u e c o n t i e n e n c é l u la s N K ) s e la v a r o n u n a v e z ( c e n t r i f u g a c ió n a 400 g d u r a n t e 10 m in ) y s e s u s p e n d ie r o n a 2 , 5 x 106/ m L e n R P M I - 1640 c o m p le m e n t a d o c o n s u e r o b o v i n o f e t a l a l 10 % , 2 m M d e L - g lu t a m in a , 1 % d e p e n i c i l i n a / e s t r e p t o m i c in a , 1 % d e H e p e s , 1 % d e p i r u v a t o d e s o d io y 1 % d e a m in o á c id o s n o e s e n c ia l e s .
Protocolo ADCC
S e p r e p a r a r o n d i l u c i o n e s s e r ia d a s d e 10 v e c e s , d e s d e 1 , 5 x 10 -7 M a 1 , 5 x 10 -17 M d e l a n t i c u e r p o t e s t a d o , a s í c o m o e l a n t i c u e r p o d e c o n t r o l is o t í p ic o , e n m e d io R P M I - 1640 c o m p le m e n t a d o c o n B S A a l 0 , 1 % , H E P E S 2 m M , p H 7 , 4 ( in d i c a d o
Figure imgf000088_0001
L a d e n s id a d ó p t i c a d e la s m u e s t r a s s e m id ió a 490 m n ( D O 490 ) . E l 100 % d e l i s is c o r r e s p o n d i ó a l v a l o r d e D O 490 d e lo s p o c i l l o s d e c o n t r o l B y e l 0 % d e l i s is a l v a l o r d e D O 490 d e lo s p o c i l l o s d e c o n t r o l A . E l p o r c e n t a j e d e l i s is e s p e c í f i c a d e c a d a u n a d e la s m u e s t r a s s e d e t e r m i n ó m e d ia n t e la s ig u ie n t e f ó r m u l a : ( D O 490 m u e s t r a - D O 490 c o n t r o l A ) / ( D O 490 c o n t r o l B - D O 490 c o n t r o l A ) * 100
L a s m u e s t r a s q u e c o n t e n í a n s o lo c é l u la s N K d i e r o n le c t u r a s d e D O 490 d e s p r e c i a b l e s .
Ejemplo 11.1: ADCC in vitro mediada p o r chM Abl, chMAb2 y chMAb3
L o s a n t i c u e r p o s c h M A b 1 , c h M A b 2 y c h M A b 3 i n d u je r o n e s p e c í f i c a m e n t e a c t i v i d a d e s d e A D C C p o t e n t e s y s im i la r e s t a l c o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 29. E l a n t i c u e r p o d e c o n t r o l d e is o t i p o n o t u v o a c t i v i d a d A D C C s ig n i f i c a t i v a .
Ejemplo 11.2: Variabilidad de ADCC in vitro
S e e v a l u a r o n la s a c t i v i d a d e s d e A D C C d e c h M A b 1 o c h M A b 2 p a r a v a r i o s lo t e s d e N K p u r i f i c a d a , c a d a u n o d e lo s lo t e s c o r r e s p o n d e a u n d o n a n t e d e s a n g r e i n d iv i d u a l . C o m o s e m u e s t r a e n la T a b la 40 , la s a c t i v i d a d e s d e A D C C v a r i a r o n d e u n lo t e d e c é l u la s N K a l o t r o . V a lo r e s d e C E 50 s e e s t im a r o n u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e B I O S t @ T - S P E E D .
T a b la 4 0 : M á x im o d e A D C C C E 50 a r a lo t e s in d iv i d u a l e s d e c é l u la s N K a i s la d a s
Figure imgf000088_0002
Ejemplo 11.3: Dependencia de ADCC in vitro de la densidad de antígenos LAMP1
Utilizando el mismo lote de NK, se analizó la ADCC para los clones huLAMPI de HCT116 que mostraban diferentes densidades de antígeno. Como se ilustra en los datos de la Figura 30, se requiere una densidad de antígeno > 20 000 para conducir a una actividad de ADCC in vitro perceptible.
Ejemplo 11.4: Comparación de ADCC in vitro de chMAb1 y DM4-SPDB-chMAb1 o chMAb2 y DM4-SPDB-chMAb2
La conjugación DM4-SPDB no tuvo un impacto significativo en la actividad de ADCC de chMAb1 o chMAb2 (Figura 31a y b).
Ejemplo 11.5: ADCC In vitro mediada p o r huMAb1_1
ChMAb1 se incluyó en los experimentos como un comparador de referencia. HuMAb1_1 indujo una actividad ADCC similar a chMAb1 como se muestra en la Figura 32.
Ejemplo 11.6: ADCC In vitro mediada p o r DM4-SPDB-huMAb1_1
HuMAb1_1 se incluyó en los experimentos como un comparador de referencia. DMA-SPDB-huMAb1_1 indujo una actividad de ADCC similar a huMAb1 como se muestra en la Figura 33.
Ejemplo 12: Activ idad ADCP in vitro
La actividad de ADCP se evaluó utilizando clones de huLAMP1 de HCT116 con diferentes densidades de antígeno de LAMP1 como células diana y macrófagos humanos como células efectoras. Los clones de huLAMP1 de HCT116 se marcaron con colorante fluorescente PKH67, los macrófagos se marcaron con colorante fluorescente CD14-PC7.
Aislam iento de células mononucleares de la sangre periférica
Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron como se describe en el Ejemplo 11.
Aislam iento de monocitos
A partir de PBMC aisladas y de acuerdo con el protocolo del kit de aislamiento de células NK de Miltenyi (130-050­ 201, Miltenyi Biotech). Las células marcadas con CD14-MicroBead se aislaron utilizando el programa de selección positiva del autoMACS Pro Separator (Milteny Biotech). La fracción recogida (que contiene células de monocitos) se suspendió en 13,6 mL de RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, se lavó una vez (centrifugación a 400 g durante 10 min) y se suspendió a una concentración final de 106 células/mL en 64 mL de RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, 1% de suero humano inactivado por calor (AB; n° 14-490E), 2 mM de L-glutamina y 50 ng/mL de GM-CSF (Miltenyi Biotech; n° 130-093- 866).
Diferenciación de macrófagos
Los 64 mL de monocitos aislados se añadieron a matraces T75 (NUNC; n° I56472), 10 mL por matraz. Los matraces se colocaron en una incubadora de a 37°C/5% de CO2 en donde se dejó que las células se adhirieran durante 8 días. Se cambió RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, 1% de suero humano inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina y 50 ng/mL de GM-CSF después de 4 días de incubación.
Protocolo ADCP
Los macrófagos se suspendieron con accutase (Invitrogen Stempro; n° A111 -0501), se lavaron una vez (centrifugación a 400 g durante 10 min) y se suspendieron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 2% y L-glutamina 2 mM a una concentración de 1,5 x 106células/mL para una relación de 6/1 o 0,75 x 106 células/mL para una relación de 3/1. Se distribuyeron 100 pL de macrófagos suspendidos en una placa de polipropileno de 96 pocillos de fondo redondo. 107 de las células diana suspendidas (clon 4 de huLAMP1 de HCT116; clon 5 de huLAMP1 de HCT116; clon 8 de huLAMP1 de HCT116 o clon 12 de huLAMP1 de HCT116) se marcaron mediante colorante fluorescente PKH67 siguiendo el procedimiento del proveedor (SIGMA-ALd RiCH; n° MIDI67-1KT), luego se suspendieron a razón de 5x105 células/ml en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 2% y 2 mM de L-glutamina. Se prepararon diluciones seriadas 1/3, de 9 x10-8 M a 3 x10-12 M de huMAb1_1 testado, así como del anticuerpo de control isotípico, en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 2%. Se distribuyeron duplicados de cada concentración de anticuerpo (150 pL/pocillo) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron 150 pL de células diana marcadas con PKH67 a cada uno de los pocillos que contenían diluciones de anticuerpos. La placa que contenía las células diana y las diluciones de anticuerpos se incubó durante 15 min a 37°C. Se añadieron 100 pL de mezcla (células diana anticuerpo) a la placa de 96 pocillos que contenía macrófagos, que luego se colocó durante 4 h a 17 h en una incubadora a 37°C y 5% de CO2. Las células se suspendieron mediante accutase (Invitrogen stempro; n° A111-0501), se lavaron dos veces (centrifugación a 400 g durante 10 min) y se suspendieron en tampón (PBS complementado con 5% de suero humano inactivado por calor) que contenía anticuerpo CD14-PC7 (Beckman Coulter ; n° PN A22331). Después de 20 minutos de incubación a 4°C, las células se lavaron una vez y se suspendieron en 250 pL de PBS, se lavaron una vez y se suspendieron en 50 pL de solución fijadora de paraformaldehído (PFA al 4% en PBS, USB; n° 19943). Las muestras se almacenaron a 4°C hasta el análisis por citometría.
Análisis de citometría
Las muestras se analizaron utilizando un aparato MACSQUANT. La fagocitosis se determinó como células marcadas doblemente (células positivas para PKH67 y positivas para PC7). Los datos típicos obtenidos se muestran en la Figura 34.
Ejemplo 12,1: ADCP In vitro mediada por huMAb1_1
Se analizaron dos relaciones de macrófagos/clon 8 de huLAMP1 de HCT116. Valores de CE50 se estimaron utilizando el software BIOSt@T-SPEED. HuMAb1_1 induce una ADCP in vitro significativa en una relación macrófagos/célula diana de 3/1. Una relación más alta, 6/1, no condujo a una CE50 más baja ni a un % más alto de fagocitosis como se muestra en la Tabla 41.
T l 41: AD P In vi r m i r h MA 1 1
Figure imgf000090_0001
Ejemplo 12.2: Dependencia de ADCP in vitro de la expresión en la superficie celular de LAMP1
Se analizó la ADCP para los clones huLAMP1 de HCT116 que mostraban diferentes densidades de antígeno. El nivel de ADCP in vitro inducida por huMAb1_1 está vinculado a la densidad de antígeno de LAMP1 ya que el máximo de fagocitosis disminuyó a medida que disminuía la densidad de antígeno de LAMP1 como se puede deducir de la Tabla 42.
Tabla 42: Dependencia de ADCP in vitro de la expresión en la superficie celular de LAMP1
Figure imgf000090_0002
Ejemplo 12.3: ADCP In vitro para huMAb1_negB.
La fagocitosis mediada por FCyRIIla se evaluó evaluando la ADCP inducida por huMAb1_negB (descrita en el Ejemplo 7.2). Como era de esperar (los macrófagos no dependen estrictamente de FCyRI lla para la activación), huMAb1_negB condujo a una ADCP más bajo que huMAb1_1, sin embargo, la ADCP todavía se produjo cuando se utilizó huMAb1_negB. Los datos típicos obtenidos se muestran en la Figura 35.
Ejemplo 12.4: ADCP In vitro para huMAb1_negA.
Se testó la ADCP mediada por huMAb1_negA (descrita en el Ejemplo B7.2) para evaluar la fagocitosis mediada por especificidad de antígeno. Como se muestra en la Figura 36, huMAb1_negA no indujo ADCP alguna, validando la especificidad de los datos obtenidos para huMAb1_1.
Ejemplo 13: Cambio de Número de Copias del gen LAMP1
Materiales y Métodos:
Hibridación genómica comparativa de oligonucleótidos basada en matrices (aCGH)
El ADN genómico se analizó utilizando el Human Genome CGH Microarray 400k-(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). La digestión, el marcaje y la hibridación se realizaron utilizando los protocolos de la plataforma Agilent Oligo aCGH Bravo para micromatrices Human CGH de 2 x 400 K. En todos los experimentos se utilizó como ADN de referencia ADN emparejado por sexo de una hembra normal humana bien caracterizada (NA12878) o de un varón normal bien caracterizado (NA10858). El ADN genómico humano normal utilizado en estas experiencias se comercializa por referencia de Coriell.
El procesamiento de oligonucleótidos aCGH se realizó como se detalla en el protocolo del fabricante (versión 6.2 octubre de 2009; http://www.agilent.com). La micromatriz requirió 600 ng de ADN genómico de la muestra de referencia y de la muestra experimental. La matriz se escaneó con un escáner de micromatrices de ADN de Agilent (G2565CA).
Los datos se extrajeron de las imágenes escaneadas y se normalizaron utilizando el software Feature Extraction (v10.7.3.1, Agilent).
La relación log2 y la segmentación se generaron utilizando el software Array Studio. Array Studio, Array Viewer y Array Server y todos los demás productos o nombres de servicios de Omicsoft son marcas comerciales registradas o marcas comerciales de Omicsoft Corporation, Research Triangle Park, NC, EE.UU.
Se verificó la centralización de la distribución de la relación de log2 y la segmentación se realizó utilizando el algoritmo CBS (Olshen et al.; Biostatistics (2004), 5(4): 557). La llamada de estado de aberración se realizó automáticamente para cada perfil de acuerdo con su ruido interno (variación de los valores de la relación log2 entre sondas consecutivas en el genoma). Todas las coordenadas genómicas se establecieron en el genoma humano UCSC construido hg 19 (Karolchik D et al. Nucleic Acids Res 2003, 31: 51). El valor Relación log y el Cambio del Número de Copias, para cada región o gen, se introdujo en una base de datos interna para su posterior análisis.
Expresión Génica
El análisis de expresión génica se realizó utilizando un kit de reactivos de amplificación de expresión 3’ GeneChip y matrices U133Plus GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), utilizando la plataforma de Análisis de Expresión Cia. Todos los datos se importaron al software Resolver (Rosetta Biosoftware, Kirkland, WA, EE.UU.) para la gestión de la base de datos, los controles de calidad y el análisis. Cada ARNm está representado por uno o más calificadores. El valor de expresión de cada calificador se descargó en la base de datos del Banco de Tumores de Xenoinjerto de Tumores Derivados del Paciente (base de datos del Banco de Tumores) para su análisis.
Animales
Los animales se mantuvieron en las instalaciones para animales de cada institución siguiendo la normativa animal estándar y estrictos controles sanitarios que permitían la transferencia entre los miembros del consorcio. Se criaron ratones hembra inmunológicamente deficientes Swiss y CB17-SCID, así como ratas inmunológicamente deficientes NIH en Charles River France (Les Oncins, Francia). Los pesos de los ratones superaron los 18 g y los pesos de las ratas superaron los 160 g al comienzo de los experimentos. Su cuidado y alojamiento estaban de acuerdo con las pautas institucionales, así como con las leyes y regulaciones nacionales y europeas establecidas por el Ministerio de Agricultura y Bosques de Francia y las normas requeridas por las directrices de UKCCCR.
Preparación de la muestra
Los fragmentos congelados se cortaron en un criostato a -20°C y luego las secciones iniciales y finales se tiñeron con HES (hematoxilina-eosina-azafrán) para el control histológico y la evaluación del porcentaje de células tumorales por parte de patólogos. El ADN genómico se extrajo de acuerdo con los protocolos del kit de ADN de QlAamp v01 (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN total se extrajo de las muestras de tumores y se purificó con un kit RNAeasy (Qiagen), utilizando los protocolos de extracción de ARN Qiagen v01.
Caracterización molecular de PDX
La caracterización molecular (CGH, expresión de ARN e IHC) de cada modelo tumoral de PDX se realizó utilizando el mismo pase de Xenoinjertos.
Inmunohistoquímica
Para asociar la aberración del número de copias genómicas del gen LAMP1 y su región (13q34) con cambios en los niveles de proteína (fuerte, medio, débil y negativo) de la ubicación de la membrana de LAMP1 en PDX (Oct congelada), se llevó a cabo una tinción específica (mAb1) en el mismo pase de PDX utilizado para CGH y caracterización de la expresión de ARN.
Después del bloqueo de avidina y biotina (Endogenous Block, Ventana, 760-050), las secciones congeladas (formato OCT congelada) se incubaron con anticuerpo monoclonal murino MAb1 (concentración final 1 pg/mL (para muestras humanas) y 1 y 5 pg/mL (para muestras de monos) en solución salina tamponada con fosfato, PBS) durante 32 min a 37°C. Se realizó una etapa de post-fijación con glutaraldehído (al 0,05% en NaCl al 0,9% p/v) durante 4 min. El IgG2a anti-ratón de cabra secundario biotinilado se incubó durante 12 min a 37°C (Southern Biotech, Ref. 1080-08, dilución 1/200 en diluyente de Ventana). La inmunotinción se realizó con el kit de detección cromogénica DAB Map de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aplicó una etapa de contratinción a las secciones del criostato con hematoxilina II (790-2208, Ventana Medical Systems, Inc. EE.UU.) y se aplicó reactivo de tinción de azul durante 4 min (760-2037). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos con medio de montaje Coverquick 2000 (Labonord, Ref 05547530).
Los controles negativos utilizados en este estudio consistieron en la omisión del anticuerpo primario y el uso del isotipo IgG2a (concentración final 1 pg/mL en PBS).
Para el análisis de los datos secciones inmunoteñidas con anticuerpo murino MAb1 purificado se escanearon y digitalizaron a un aumento de x20 utilizando el sistema Scan Scope XT (Aperio Technologies, Vista CA). A continuación, se capturaron imágenes digitalizadas utilizando el software Image Scope (v10.2.2.2319 Aperio, Technologies).
Las muestras positivas se puntuaron con una escala de intensidad de 1 a 3. Los intervalos de intensidades se describieron como negativos (0), débiles (1), moderados (2) y fuertes (3). La frecuencia celular fue el porcentaje de células inmunoteñidas y fue estimada por la observación del histólogo como una mediana por muestra. La frecuencia celular se ordenó en 5 categorías: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) y 5 (76-100%).
Se calculó una expresión global de acuerdo con la descripción de Allred Score (AS). La EA se obtuvo sumando las puntuaciones de intensidad y proporción para obtener una puntuación total que oscilaba entre 0 y 8. La EA se reseñó como un porcentaje de la puntuación global máxima y se clasificó en 5 categorías: muy baja (0-25%), débil (26-50%), moderada (51-75%) y alta (75-100%). La prevalencia se definió como el porcentaje de casos positivos para la indicación.
Se calcularon estadísticas descriptivas básicas con Microsoft Excel 2003. Para cada una de las indicaciones se describió el número de casos, el número de casos positivos, la prevalencia, la media de la puntuación de intensidad, la media de frecuencia y la puntuación de Allred.
Análisis estadísticos
Para estudiar la relación entre la expresión de ARNm y el cambio del gen LAMP1 (aumento o amplificación), los autores de la invención aplicaron un test de Student sobre datos de PDX para comparar los niveles de expresión de ARNm del PDX tumoral con o sin cambio en el Número de Copias. También determinaron la correlación entre los niveles de expresión de ARNm de los CRC PDXs y su respectiva variación en el número de copias genómicas del gen LAMP1 y su región (13q34) mediante una prueba de correlación de Person.
Además, se realizó un análisis de correlación utilizando un conjunto más grande de muestras de tejido colorrectal de pacientes (n = 574) de la base de datos TCGA (The Cáncer Genome Atlas) entre la expresión de ARNm normalizada y el Número de Copias utilizando una prueba de correlación de Spearman. Con el fin de estudiar la asociación de la expresión de LAMP1 o la ausencia de expresión en la membrana plasmática de células tumorales PDX determinada por análisis IHC y el cambio del factor Número de Copias o ningún cambio, se realizó una estadística de Cochran-Mantel-Haenszel. Para la PDX de colon, la prueba se realizó utilizando la puntuación IHC (Negativo-Débil, Medio y Fuerte) frente al Número de Copias (CN < 2,5 y CN > 2,5). Para las PDX de pulmón y estómago, se realizó una estadística de Cochran-Mantel-Haenszel estratificada utilizando la puntuación IHC (Negativo-Débil, Medio-Fuerte) frente al Número de copias (CN < 2,5 y CN > 2,5). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SAS 9.2; SAS Institute Inc. y Everstat V6 (Sanofi basado en SAS 9 SAS Institute Inc.).
Análisis bioinformáticos: Cambios en el número de copias en el TCGA (The Cancer Genome Atlas)
Las muestras de ADN se analizan utilizando la metodología GISTIC (siglas de Identificación Genómica de Dianas Significativas en Cáncer) (Beroukhim, R. et al.; Nature 2010463, 899 ;Beroukhim, R. et al.; Proc Natl Acad Sci U S A (2007); 104, 20007). Brevemente, cada uno de los marcadores se puntúa de acuerdo con la amplitud media y la frecuencia de amplificación focal en todo el conjunto de datos, y los valores de significancia se calculan comparándolos con la distribución de puntuaciones obtenidas mediante la permutación aleatoria de los marcadores en el genoma. Las regiones de picos significativos de amplificación (o deleción) se identifican mediante un procedimiento de despegue iterativo que distribuye la puntuación asociada con los segmentos amplificados (o eliminados) entre todos los picos que se superponen (ponderados de acuerdo con la puntuación de cada uno de los picos) hasta que ninguna nueva región cruza el umbral de significancia de valor q < 0,25 en cada uno de los cromosomas. Por último, teniendo en cuenta la autocorrelación dentro de los perfiles de puntuación GISTIC, se calcula un intervalo de confianza para cada una de las regiones pico que se predice que contiene el gen o genes impulsores verdaderos con al menos un 99% de probabilidad (TCGA Network. Nature 2008; 455 : 1061).
Se utilizaron las llamadas basadas en genes de la salida GISTIC. Los genes se definieron como poseedores de deleciones profundas, deleciones superficiales, número de copias neutras, bajo aumento y alto aumento utilizando umbrales específicos, como sigue. Los aumentos altos son relaciones log2 que superan 1,32; los aumentos bajos van desde 0,3 hasta el umbral de aumento alto; los segmentos neutros tienen números de copia entre -0,5 y 0,3; las pérdidas superficiales tienen números de copia entre -0,5 y el umbral de deleción profunda; y las deleciones profundas tienen números de copia por debajo de -0,737.
Ejemplo 14: Cambio de Número de Copias del gen LAMP1
Uso de muestras de tumores PDXs CRC
Se analizó un total de 61 PDX de tumores de colon utilizando matrices de oligonucleótidos de 400 K de aCGH de alta densidad de genoma completo. Como se indica en la Tabla 44, 6 de 61 (9,8%) PDXs de cáncer colorrectal muestran una amplificación del gen LAMP1 de alto nivel (es decir: CN > 5 o relación log2 >1,32) y el 57,4% muestra un aumento del gen LAMP1 (es decir: relación 2,5 < CN <5 o 0,32 < log2 <1,32).
Uso de muestras de tumores PDXs de Pulmón
Se analizó un total de 35 PDXs de tumores de Pulmón utilizando matrices de oligonucleótidos de 400 K de aCGH de alta densidad de genoma completo. Como se muestra en la Tabla 45; un PDX de tumor de Pulmón (3%) estudiado muestra una amplificación de alto nivel del gen LAMP1 (CN = 9.26) y el 26% muestra un aumento del gen LAMP1 (es decir: relación 2,5 < CN < 5 o 0,32 < log2 <1.32).
Uso de muestras comerciales de tejidos de ADN tumoral
El análisis de CGH se realizó también utilizando matrices de oligonucleótidos de 400 K de aCGH de alta densidad de genoma completo en las muestras de ADN del tumor esofágico (Asterand). Como se indica en la Tabla 46, hay un aumento o una amplificación del gen LAMP1 en 2 de 46 (4,3%) muestras de tumor de esófago estudiadas, una de éstas (2%) muestra una amplificación focal de LAMP1 igual a 39,81 copias. Esta amplificación focal y de alto nivel de LAMP1 se detecta en una mujer asiática (ES01_F12), de 64 años; la biopsia contiene el 80% de células tumorales.
Uso de muestras de tumores de pacientes mediante datos del Cancer Genome Atlas (TCGA)
Los siguientes análisis de los cambios en el número de Copias se realizaron utilizando los datos de TCGA (The Cancer Genome Atlas). Utilizando un conjunto más grande de muestras colorrectales (n = 574); los resultados son extremadamente similares a los obtenidos con datos internos (CRC PDX). El análisis de adenocarcinoma humano colorrectal y recto (The Cancer Genome Atlas) revela una amplificación alta del 14,4% (HighAmp). Se realizaron análisis posteriores de Alteración del Número de Copias utilizando datos de TCGA para buscar otros tipos de tumores para los que se amplificó LAMP1. En resumen, los aumentos de bajo nivel del gen de ADN LAMP1 (LowAmp; Relación Log2 = 0,3 <LowAmp <1,32) y (amplificaciones) de alto aumento (HighAmp, Relación Log2 > 1,32 (teóricamente, 5.0 copias o más en total)) se detectan en 28 tipos de tumores, incluyendo Adenocarcionoma colorrectal, Estómago, Hígado, Pulmón (Adenocarcinoma y Escamoso) , Mama (Basal, b Rc A, LUMA, LUMB y HER2), Ovario, Cabeza y Cuello, Riñón (Riñón Cromofóbico, Carcinoma de Riñón Renal de Células Claras, Riñón Renal Papilar), Carcinoma de Células, Células Escamosas de Cuello Uterino, Pancreático, Próstata, Urotelial de vejiga, Glioma (Glioma de bajo grado y Glioblastoma multiforme), Útero, Tiroides, Leucemia, Linfoma, Esofágico, Melanoma y Sarcoma de tejidos blandos, datos de alto aumento o amplificación LAMP1 de 12 de estos tipos de tumores, incluyendo adenocarcinoma colorrectal, de estómago, hígado, pulmón, mama, ovario, cabeza y cuello, células escamosas cervicales, glioblastoma, glioma, útero, tiroides y sarcoma de tejidos blandos se muestran en la Tabla 43 y la Figura 10A.
T a b la 4 4 : A n á l i s i s d e s c r i p t i v o d e LAMP1 A n á l i s i s d e l n ú m e r o d e c o p i a s d e lo s g r u p o s e s t u d i a d o s ( A m p l i f i c a c ió n , A u m e n t o , D ip lo id e y H e t e r o - p é r d id a ( p é r d id a c o m p le t a o p a r c ia l d e u n a l e lo d e l g e n LAMP1) d e LAMPIen P D X d e c á n c e r d e c o l o n .
Figure imgf000095_0001
E n lo s P D X d e T u m o r e s d e P u lm ó n ( T a b l a 45 ) , la m e d ia d e l t a m a ñ o d e lo s s e g m e n t o s e s 14966 , 4 k b p a r a e l a u m e n t o . L a r e g ió n m í n i m a c u b r e 1186 k b .
T a b la 4 5 : A n á l i s i s d e s c r i p t i v o d e LAMP1 A n á l i s i s d e l n ú m e r o d e c o p i a s d e lo s g r u p o s e s t u d i a d o s ( A m p l i f i c a c ió n , A u m e n t o , D ip lo id e y H e t e r o - p é r d id a ( p é r d id a c o m p le t a o p a r c ia l d e u n a l e lo d e l g e n LAMP1) d e LAMPIen P D X d e c á n c e r d e P u lm ó n .
Figure imgf000095_0002
Definición genómica del aumento de LAMP1 (13q34) en el cáncer de tumor de esófago humano
E n la s m u e s t r a s d e A D N d e l c á n c e r d e e s ó f a g o ( A s t e r a n d ) , e l a u m e n t o o la a m p l i f i c a c ió n d e LAMP1 t a m b ié n e s t á i n c lu i d o e n u n g r a n a m p l i c ó n , la m a y o r r e g ió n d e a u m e n t o im p l i c a 4523 k b ( 110 .584.050 a 115 .107 .245 ) y la r e g ió n m á s p e q u e ñ a p r e s e n t a u n a a m p l i f i c a c ió n d e LAMP1 ( C h r 1 3 q 3 4 ) ig u a l a u n n ú m e r o d e c o p i a s d e 3 9 , 8 1 . E s t a a m p l i f i c a c ió n f o c a l d e L A M P 1 c u b r e 3 7 8 k b e in c lu y e 10 g e n e s : ADPRHL1, CUL4A, F10, F7, GRTP1, LAMP1, LOC100130463, PCID2, PROZ y MCF2L.
T a b la 4 6 : A n á l i s i s d e s c r i p t i v o d e LAMP1 A n á l i s i s d e l n ú m e r o d e c o p i a s d e lo s g r u p o s e s t u d i a d o s ( A m p l i f i c a c ió n , A u m e n t o , D ip lo id e y H e t e r o - p é r d id a ( p é r d id a c o m p le t a o p a r c ia l d e u n a le lo d e l g e n LAMP1) d e LAMP1en t e j i d o s d e c á n c e r d e e s ó f a g o .
Figure imgf000095_0003
Ejemplo 15: Relación entre el número de copias del gen LAMP1 y la expresión del gen de ARNm
Análisis del nivel de expresión de ARNm por nivel de expresión génica y el cambio en el número de copias en la región LAMP1
A d e m á s d e l a n á l i s i s d e l C a m b i o e n e l N ú m e r o d e C o p ia s d e LAMP1 ( a m p l i f i c a c ió n y a u m e n t o ) , u t i l i z a n d o e l P D X d e t u m o r e s C R C , s e e v a l u ó la c o r r e la c i ó n e n t r e la a m p l i f i c a c ió n d e L A M P 1 m e d ia n t e a n á l i s i s C G H y la e x p r e s i ó n d e L A M P 1 u t i l i z a n d o A R N m ( t e c n o lo g í a A f f y m e t r i x ) . L o s r e s u l t a d o s d e l a n á l i s i s d e A R N m , u t i l i z a n d o e l t e s t d e c o r r e la c i ó n d e P e a r s o n ( T a b l a 4 7 ) in d ic a r o n u n a a l t a c o r r e la c i ó n ( ( r ) = 0 , 5 9 ; p < 0,0001) e n t r e lo s N ú m e r o s d e C o p ia s d e LAMP1y lo s n i v e le s d e e x p r e s i ó n d e A R N m d e LAMP1 ( F ig u r a 8 A ) . P a r a lo s P D X d e t u m o r e s d e c o l o n , s e r e a l i z a u n t e s t d e S t u d e n t p a r a c o m p a r a r e l n ú m e r o d e c o p i a s d e l g e n L A M P 1 ( c o n o s in a u m e n t o / a m p l i f i c a c ió n ) y la e x p r e s i ó n d e A R N m d e L A M P 1 . E l a n á l i s i s d e e x p r e s i ó n d e A R N m s e r e a l i z ó u t i l i z a n d o t e c n o l o g í a A f f y m e t r i x ( T a b l a 48 y F ig u r a 8 B ) .
Tabla 47: LAMP1: Datos de Alteración del Número de Copias y correlación con los datos de ARNm en PDX CRC
Figure imgf000096_0002
Tabla 48: Test t de Student de expresión de ARNm para el número de copias del factor
Test t de Student para el factor Número de Copias
P
in
Figure imgf000096_0001
2 Si p < 0.05, el factor tiene una influencia significativa en el parámetro
La expresión de ARNm es significativamente mayor para el cambio del Número de Copias de LAMP1 (CN > 2,5). El análisis de correlación, utilizando la prueba de Pearson entre la amplificación de LAMP1 mediante análisis CGH y la expresión de LAMP1 mediante el uso de ARNm, muestra una correlación significativa entre estos dos parámetros estudiados.
Como se muestra en la Figura 8a, el grupo con una alta amplificación (Amp) de LAMP1 muestra mayores niveles de expresión de ARNm que los grupos con una baja amplificación de LAMP1 (Aumento), Diploide y He-pérdida.
El análisis de correlación utilizando un conjunto mayor de muestras de tejidos de pacientes colorrectales (n = 574) de los datos de TCGA (The Cáncer Genome Atlas), reveló una amplificación del 14,4% que se correlaciona con la expresión de ARNm ((r) = 0,57; p < 0,0001), este resultado es extremadamente similar al observado en el PDX CRC. Además, utilizando el mismo conjunto de datos, se evidenció una correlación significativa del cambio en el número de copias de LAMP1 y el nivel de expresión de ARNm para: Carcinoma Urotelial de Vejiga (BLCA), Carcinoma Invasivo de Mama (BRCA), Adenocarcinoma de pulmón (LUAD), Células escamosas de pulmón (LUSC) y Ovario (OV) (Figura 9).
Ejemplo 16: Variación del número de copias de LAMP1 y su impacto en el nivel de expresión de la membrana celular de la proteína LAMP1
Asociación del cambio en el número de copias de LAMP1 y el nivel de expresión en la membrana celular de la proteína detectado por inmunohistoquímica (IHC).
Además del análisis del aumento de LAMP1 y su relación con la expresión de ARN de LAMP1, los autores de la invención evaluaron también la asociación del cambio en el número de copias de LAMP1 (aumento o amplificación) con la ubicación de la proteína LAMP1 de la membrana celular, utilizando puntuación de expresión de IHC (fuerte, media, débil y negativa) con anticuerpo mAb1 para PDXs de tumores de colon, pulmón y estómago.
Como se muestra en las Tablas 49 y 50 que figuran a continuación, y en la Figura 11, el análisis de la expresión de la membrana celular por IHC en muestras de PDX de colon, pulmón y estómago demuestra que la proteína LAMP1 se expresa en las células de membrana en 39 de los 95 modelos de PDXs (41,1%) estudiados; 33 de estas muestras de PDX positivas para la expresión de la membrana de LAMP1 (33 de 39; 85%) presentan también aumento o amplificación de LAMP1, la mayoría de ellas son PDX de Colon.
Tabla 49: Frecuencia de datos del Número de Copias de LAMP1 y datos de puntuación de IHC de PDX de tumores de colon
Figure imgf000096_0003
Tabla 50: Frecuencia de datos del Número de copias de LAMP1 y datos de puntuación de IHC de PDXs de tumores de pulmón y estómago
Figure imgf000097_0003
La asociación entre la expresión en la membrana por IHC y el cambio en el número de copias se estudió utilizando estadísticas de Cochran-Mantel-Haenszel (Tablas 51 y 52).
Tabla 51: Estadísticas de Cochran-Mantel-Haenszel de la expresión en la membrana por IHC de LAMP1 por el Número de Copias de LAMP1 en las muestras de tumor PDX de Colon.
Figure imgf000097_0004
En el PDX de tumor de Colon, la asociación entre la expresión en la membrana por IHC de LAMP1 y el Número de Copias de LAMP1 es significativa.
Tabla 52: Estadísticas de Cochran-Mantel-Haenszel de la expresión en la membrana por IHC de LAMP1 por el Número de Copias de LAMP1 en las muestras de PDX de tumores de Pulmón y Estómago.
Estadísticas de Cochran-Mantel-Haenszel (Basadas en Puntuaciones de Rango)
Hipótesis Alternativa DF Valor Prob Correlación No cero
Figure imgf000097_0002
4,5416
Figure imgf000097_0001
0,0331 Después de ajustar el tipo de tumor, la asociación entre la expresión en la membrana por IHC de LAMP1 y el Número de Copias de LAMP1 es significativa.
Los autores de la invención llegan a la conclusión de que el nivel de ubicación en la superficie celular de LAMP1 (Fuerte y medio) está asociado con el cambio en el número de copias en las muestras de PDX de tumor. La mayor parte de la ubicación de LAMP1 en la superficie celular parece ser una consecuencia del aumento o la amplificación de LAMP1.
Tabla 53: Tabla que resume el aumento del en LAMP1 la expresión de LAMP1
Figure imgf000097_0005
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000102_0003
Ejemplo 17: - Péptido específico y mAb para detectar el refuerzo en la membrana de LAMP1 en tejido tumoral FFPE mediante inmunohistoquím ica (IHC)
Figure imgf000102_0001
E n lo s e j e m p lo s s ig u ie n t e s s e d e m u e s t r a q u e f u e p o s i b le s u p e r a r la s d i f i c u l t a d e s id e n t i f i c a n d o u n p é p t i d o ( p é p t id o 4 ) u b i c a d o e n e l s e g u n d o d o m in io lu m i n a l e n la s p o s i c i o n e s 360 a 375 d e S E Q ID N O : 24 , y q u e t i e n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 82. D i c h o p é p t i d o p e r m i t ió la o b t e n c i ó n d e a n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s d e c o n e jo y a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l d e r a t ó n q u e c o n d u je r o n a la d e t e c c i ó n d e l r e f u e r z o d e la m e m b r a n a d e L A M P 1 e n t e j i d o s F F P E .
Figure imgf000102_0002
Figure imgf000103_0003
Ejemplo 17.1: Producción de anticuerpos polic lonales de conejo que condujeron a l refuerzo de la m em brana con LAM P1 en tejidos tum orales FFP E
E s t e e j e m p lo d e s c r i b e la s e l e c c ió n d e p é p t i d o s e n lo s d o m in io s lu m i n a le s d e L A M P 1 h u m a n a , la g e n e r a c ió n d e a n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s y e l r a s t r e o p o r I H C . D e m u e s t r a la v i a b i l i d a d d e o b t e n e r a n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s q u e p e r m i t a n la d e t e c c i ó n d e l r e f u e r z o d e la m e m b r a n a c o n L A M P 1 e n t e j i d o s e m b e b i d o s e n p a r a f i n a f i j a d o s c o n f o r m a l i n a c u a n d o s e u t i l i z a e l p é p t i d o e s p e c í f i c o ( ' 'p é p t id o 4 " ) d e S E Q ID N O : 82 c o r r e s p o n d i e n t e a lo s a m in o á c id o s e n la s p o s i c io n e s 360 a 375 e n la s e c u e n c ia L A M P 1 h u m a n a d e S E Q ID N O : 24.
E jem plo 17.1.1: Inm unización de conejos con péptidos o pro te ína LAM P1 soluble. Purificación de anticuerpos policlonales.
Preparación de Péptidos:
S e s e l e c c io n a r o n p é p t i d o s d e 15 - 16 a m in o á c id o s d e n t r o d e lo s d o s d o m in io s lu m i n a le s s in u n s i t io d e N - g l i c o s i la c i ó n y s in c is t e í n a in t e r n a . S e s in t e t i z a r o n q u í m ic a m e n t e u n t o t a l d e c u a t r o p é p t i d o s y s e a c o p la r o n a la p r o t e í n a d e s o p o r t e d e h e m o c i a n in a d e la p a b o c a l l a v e ( K L H ) . C u a n d o f u e n e c e s a r i o , s e a ñ a d ió p r e v ia m e n t e u n a c i s t e í n a t e r m in a l a l p é p t i d o , d e m o d o q u e s e p r o d u j e r a e l a c o p la m ie n t o a t r a v é s d e s u g r u p o t io l a la p r o t e í n a K L H a c t i v a d a c o n m a le im id a . T a b la 55 : D e s c r i p c ió n d e lo s c u a t r o p é p t i d o s s e l e c c io n a d o s
Figure imgf000103_0002
Inm unización y obtención de anticuerpos policlonales.
Figure imgf000103_0001
Purificaciones de anticuerpos policlonales.
S e u t i l i z ó A F - a m in o T O Y O P E A R L r e a c t i v o p a r a a c o p la r c a d a u n o d e lo s p é p t i d o s d e s c r i t o s e n la T a b la 55 y p a r a g e n e r a r c u a t r o c o l u m n a s d e c r o m a t o g r a f í a d e a f in i d a d . L o s s a n g r a d o s f i n a l e s d e s u e r o e n c o n e jo s in m u n iz a d o s c o n lo s p é p t i d o s r e s p e c t i v o s s e p u r i f i c a r o n m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f in i d a d d e p é p t i d o s . A c o n t i n u a c ió n , lo s lo t e s p o l i c l o n a l e s p u r i f i c a d o s s e c a r a c t e r i z a r o n m e d ia n t e S D S - P A G E y E L I S A .
E l s a n g r a d o f in a l d e s u e r o e n e l c o n e jo in m u n iz a d o c o n p r o t e í n a L A M P 1 s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f in i d a d d e p r o t e í n a G . A c o n t i n u a c ió n , e l lo t e p o l i c l o n a l p u r i f i c a d o s e c a r a c t e r i z ó m e d ia n t e S D S - P A G E .
Ejemplo 17.1.2: Rastreo p o r IH C e identificación de rA b4 p o lic lonal (A nticuerpo 4 de conejo) obtenido p or inm unización con e l péptido 4
A n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s d e c o n e jo g e n e r a d o s c o n lo s p é p t i d o s d e s c r i t o s e n e l E je m p lo 17.1.1 s e t e s t a r o n m e d ia n t e I H C e n u n a m u e s t r a d e F F P E d e x e n o in j e r t o C R - L R B - 010 P d e r i v a d o d e a d e n o c a r c in o m a d e c o lo n y c a r c in o m a d e m a m a h u m a n o . D e s p u é s d e l p r o c e d i m i e n t o d e r e c u p e r a c i ó n d e a n t í g e n o y la s e t a p a s d e b l o q u e o d e b io t i n a s
Figure imgf000104_0001
Ejemplo 17.1.3: Validación de lote de conejo po lic lona l (rAb4)
ICC con células que expresan o no LAMP1 en la membrana
Figure imgf000104_0002
Afin idad con la proteína LAMP1
S e u t i l i z ó L A M P 1 :: h i s t a g ( 29 - 382 ) s e c r e t a d o c o n S E Q ID N O : 28 d e s c r i t a e n e l E je m p lo 6.2 p a r a d e t e r m i n a r la a f in i d a d d e lo s a n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s p o l i r A b 4 m e d ia n t e E L I S A c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 6.3. E l a n t i c u e r p o p o l i c l o n a l d e c o n e jo p o l i r A b 4 s e u n e a L A M P 1 c o n u n a C E 50 d e a l r e d e d o r d e 3 n M , m ie n t r a s q u e M A b 1 s e u n e c o n u n a C E 50 d e 0 , 16 n M .
Ejemplo 17.2: Obtención y caracterización de anticuerpos monoclonales de ratón que condujeron a l refuerzo de la membrana con LAMP1 en tejidos tumorales FFPE
Ejemplo 17.1.1: Inmunización en ratón y selección de hibridoma maduro secretor de IgG LAMP1
S i b ie n s e h a n r e a l i z a d o i n m u n iz a c i o n e s c o n d i v e r s o s a n t í g e n o s p r o t e ic o s , in c lu y e n d o la p r o t e í n a L A M P 1 q u i m é r i c a r e c o m b in a n t e h u m a n a / d e r a t ó n , la p r o t e í n a L A M P 1 h u m a n a d e s n a t u r a l i z a d a r e c o m b in a n t e o la p r o t e í n a L A M P 1 h u m a n a r e c o m b in a n t e , e s t o s e n f o q u e s n o t u v ie r o n é x i t o e n la id e n t i f i c a c i ó n d e a n t i c u e r p o s c a p a c e s d e d e t e c t a r e l r e f u e r z o d e la m e m b r a n a c o n L A M P 1 e n t e j i d o s t u m o r a l e s F F P E . E s t o s e n f o q u e s u t i l i z a r o n e l p r o t o c o lo d e i n m u n iz a c i ó n d e s c r i t o e n e l E je m p lo 2 p a r a la g e n e r a c ió n d e a n t i c u e r p o s m o n o c l o n a l e s a n t i - L A M P 1 y p r o t e í n a s L A M P 1 d e s c r i t a s e n e l E je m p lo 6.2. P o r e l c o n t r a r i o , s e h a d e m o s t r a d o q u e la e s t r a t e g i a d e in m u n iz a c i ó n b a s a d a e n e l p é p t i d o 4 i d e n t i f i c a u n a n t i c u e r p o a p t o p a r a d e t e c t a r e l r e f u e r z o d e la m e m b r a n a c o n L A M P 1 e n t e j i d o s t u m o r a l e s F F P E .
P o r lo t a n t o , s e i n m u n iz a r o n r a t o n e s c o n p é p t i d o 4 y s e s e l e c c io n a r o n h ib r i d o m a s s e c r e t o r e s d e a n t i - L A M P 1 c o m o s e d e s c r i b e m á s a d e la n t e .
Generación de anticuerpos monoclonales anti-LAMP1
S e in m u n iz a r o n c in c o r a t o n e s B A L B / c J , d e a p r o x i m a d a m e n t e 6 - 8 s e m a n a s d e e d a d ( C h a r le s R iv e r ) c o n 40 p g d e l p é p t i d o 4 d e S E Q ID N O : 82 u t i l i z a n d o e l e n f o q u e R I M M S d e s c r i t o p o r K i lp a t r i c k e t a l . ; h y b r id o m a , 1997 : v o l u m e n 16 , n ú m e r o 4. L a in m o r t a l i z a c ió n d e c é l u la s B u t i l i z a n d o P 3 X 63 - A G 8.653 ( A T C C , r e f C R L - 1580 ) c o m o p a r t i c i p a n t e e n la f u s ió n y la s e l e c c ió n d e h i b r i d o m a s e r e a l i z ó c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 2.
Selección de anticuerpos anti-LAMP1 mediante ELISA
Figure imgf000104_0003
Ejemplo 17.2.2: Detección de IHC e identificación de MAb4
D e la m is m a m a n e r a q u e e n e l E je m p lo 17.1.2 , s e r e a l i z ó e l r a s t r e o p o r I H C c o n e l s o b r e n a d a n t e d e h i b r i d o m a p a r a i d e n t i f i c a r e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l d e r a t ó n q u e m u e s t r a e l r e f u e r z o d e la m e m b r a n a c o n L A M P 1 e n u n a m u e s t r a d e F F P E d e x e n o in j e r t o C R - L R B - 010 P d e r i v a d o d e u n p a c i e n t e c o n a d e n o c a r c in o m a d e c o l o n . E l c o n j u g a d o d e p e r o x i d a s a d e r á b a n o p i c a n t e ( H R P ) U l t r a M a p ™ a n t i - r a t ó n e x e n t o d e b i o t i n a ( 760 - 152 , V e n t a n a M e d ic a l S y s t e m s , I n c , E E . U U . ) s e u t i l i z ó c o m o s i s t e m a d e a n t i c u e r p o s e c u n d a r io d e a c u e r d o c o n la s r e c o m e n d a c i o n e s d e l f a b r i c a n t e .
E l s o b r e n a d a n t e d e l h i b r i d o m a s e le c c io n a d o 88 L A M P 1 - 2 m o s t r ó in m u n o t i n c ió n d e r e f u e r z o d e la m e m b r a n a e n u n a m u e s t r a d e F F P E d e l x e n o in j e r t o C R - L R B - 010 P d e r i v a d o d e u n p a c i e n t e c o n a d e n o c a r c in o m a d e c o lo n . O t r o s a n t i c u e r p o s i r r e le v a n t e s f u e r o n n e g a t i v o s o m o s t r a r o n i n m u n o t i n c ió n in t r a c e l u la r t a l c o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 40.
Ejemplo 17.2.3: Validación de l h ibridom a 88LAM P1-2
Purificación y caracterización de M ab4 obtenido de l h ibridom a 88LAM P1-2
E l h i b r i d o m a 88 L A M P 1 - 2 s e p r o d u j o e n m e d io A C l o n a c e l l - H y ( S t e m C e l l T e c h n o lo g ie s n ° 03801 ) c o m p le m e n t a d o c o n H C S a l 5 % ( P A A ; n ° F 05 - 009 ) a u n a e s c a l a d e 400 m L y s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f in i d a d d e p r o t e í n a A . E l a n t i c u e r p o M A b 4 p u r i f i c a d o s e c a r a c t e r i z ó m e d ia n t e S D S - P A G E y e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . L a s m a s a s d e c a d e n a s p e s a d a s y l i g e r a s d e M A b 4 s e i d e n t i f i c a r o n c o m o s e i n f o r m a e n e l E je m p lo 7 y s e r e s e ñ a n e n la T a b la 55 q u e f i g u r a m á s a d e la n t e . L a s s e c u e n c ia s d e á c i d o n u c l e ic o q u e c o d i f i c a n lo s d o m in io s v a r i a b le s s e r e c u p e r a r o n d e la s c é l u la s d e h i b r i d o m a m e d ia n t e R T - P C R t a l c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 7. L o s a m in o á c id o s c o r r e s p o n d i e n t e s d e la s c a d e n a s p e s a d a y l i g e r a c o n d u je r o n a m a s a s d e a c u e r d o c o n la s m a s a s r e s p e c t i v a s d e M A b 4.
T a b la 56 : C a r a c t e r i z a c i ó n d e m a s a s d e M A b 4
Figure imgf000105_0003
Ejemplo 17.3: Caracterización In vitro de M Ab4
Ejemplo 17.3.1: A fin idad aparente p o r LAM P1 hum ana y LAM P1 de cynom olgus m ediante ELISA
Figure imgf000105_0001
Ejemplo 17.3.2: Especific idad p ara LAM P1
L A M P 2 e s e l m ie m b r o m á s c e r c a n o d e la f a m i l i a L A M P c o n u n a i d e n t id a d d e s e c u e n c ia d e l 35 % c o n L A M P 1. L a e s p e c i f i c i d a d d e M A b 4 s e e v a l u ó m e d ia n t e E L I S A c o m o s e d e s c r i b e e n e l E je m p lo 4.6 , y a s e a c o n L A M P 1 o p r o t e í n a s s o l u b le s L A M P 2 , t a l c o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 41. N o s e d e t e c t ó u n a u n ió n a L A M P 2 c o n M A b 4 y s e o b s e r v a u n a d i f e r e n c i a d e m á s d e 100 v e c e s e n t r e la C E 50 d e M A b 4 h a c i a L A M P 1 f r e n t e a L A M P 2.
Ejemplo 17.3.3: Unión d e l anticuerpo M Ab4 a m últip les células cancerosas y determ inación de la capacidad de unión d e l anticuerpo p o r C itom etría de Flujo
Figure imgf000105_0002

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Figure imgf000193_0001
    2. E l a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 1 , e n d o n d e e l a n t i c u e r p o e s u n a n t i c u e r p o q u i m é r i c o o h u m a n i z a d o .
    3. E l a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 1 o 2 , e n d o n d e e l a n t i c u e r p o e s u n a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o o m u l t ie s p e c í f i c o .
    4. E l a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 o 3 , q u e c o m p r e n d e :
    ( i) u n d o m in io v a r i a b le d e la c a d e n a p e s a d a V H d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 1 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a y u n d o m in io v a r i a b le d e c a d e n a l i g e r a V L d e la s e c u e n c ia d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 5 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a ; o
    ( i) u n d o m in io v a r i a b le d e la c a d e n a p e s a d a V H d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 53 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a y u n d o m in io v a r i a b le d e c a d e n a l i g e r a V L d e la s e c u e n c ia d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 56 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a ; o
    ( i i i ) u n d o m in io v a r i a b le d e la c a d e n a p e s a d a V H d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 54 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a y u n d o m in io v a r i a b le d e c a d e n a l i g e r a V L d e la s e c u e n c ia d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 57 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a ; o
    ( iv ) u n d o m in io v a r i a b le d e la c a d e n a p e s a d a V H d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 55 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a y u n d o m in io v a r i a b le d e c a d e n a l i g e r a V L d e la s e c u e n c ia d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 58 o u n a s e c u e n c ia a l m e n o s 85 % id é n t i c a a la m is m a .
    Figure imgf000193_0002
    6. E l a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 5 , e n d o n d e e l a n t i c u e r p o s e u n e a l p r im e r d o m in io lu m in a l d e la p r o t e í n a L A M P 1 h u m a n a ; e n d o n d e e l p r im e r d o m in io lu m in a l d e la p r o t e í n a L A M P 1 h u m a n a c o n s i s t e e n a m in o á c id o s e n la s p o s i c i o n e s A l a 29 a A r g 195 d e S E Q ID N O : 24.
    7. U n i n m u n o c o n j u g a d o , q u e c o m p r e n d e :
    a ) u n a n t i c u e r p o a n t i - L A M P 1 o u n f r a g m e n t o d e a n t i c u e r p o d e l m is m o s e g ú n s e d e f in e e n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 6 ; y
    b ) a l m e n o s u n a g e n t e in h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o .
    8. E l in m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 7 , e n d o n d e d i c h o a l m e n o s u n a g e n t e i n h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o e s u n a g e n t e c i t o t ó x i c o o u n i s ó t o p o r a d ia c t i v o .
    9. E l i n m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 7 y 8 , e n d o n d e d i c h o a l m e n o s u n a g e n t e in h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o s e s e l e c c io n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n a g e n t e s q u i m i o t e r a p é u t i c o s , e n z im a s , a n t ib ió t i c o s , t o x in a s , t a x o id e s , v in c a s , t a x a n o s , m a i t a n s i n o id e s o a n á lo g o s d e m a i t a n s i n o id e s , t o m a im ic in a o d e r i v a d o s d e p i r r o lo b e n z o d ia z e p in a , d e r i v a d o s d e c r i p t o f i c i n a , d e r i v a d o s d e l e p t o m i c in a , a n á lo g o s d e a u r i s t a t i n a o d o l a s t a t i n a , p r o f á r m a c o s , in h ib i d o r e s d e t o p o i s o m e r a s a I I, a g e n t e s a l q u i l a n t e s d e A D N , a g e n t e s a n t i - t u b u l i n a y a n á lo g o s d e C C -1065 o C C - 1065.
    Figure imgf000193_0003
    11. E l in m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 7 a 10 , e n d o n d e e l a n t i c u e r p o e s t á f i j a d o c o v a l e n t e m e n t e m e d ia n t e u n e n l a z a d o r e s c i n d ib le o n o e s c i n d ib le a l a l m e n o s u n a g e n t e in h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o .
    12. E l i n m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 11 , e n d o n d e d i c h o e n l a z a d o r s e s e l e c c io n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n p i r i d i l d i t i o b u t i r a t o d e N - s u c c i n im id i l o ( S P D B ) , 4 - ( p i r i d i n - 2 - c i c l o h e x a n o - 1 - c a r b o x i l a t o ( S M C C ) .
    13. E l i n m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 11 o 12 , e n d o n d e d i c h o e n l a z a d o r e s p i r i d i l d i t i o b u t i r a t o d e N - s u c c i n im id i l o ( S P D B ) y e l a g e n t e in h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o e s N 2 - d e s a c e t i l - N 2 - ( 4 - m e t i l - 4 - m e r c a p t o - 1 - o x o p e n t i l ) -m a i t a n s i n a ( D M 4 ) .
    14. U n I n m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 7 a 13 , q u e c o m p r e n d e :
    1 ) u n a n t i c u e r p o q u e c o m p r e n d e u n a c a d e n a p e s a d a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 60 y u n a c a d e n a l i g e r a d e s e c u e n c ia S E Q ID N O : 59 ;
    2 ) u n e n l a z a d o r q u e c o n s i s t e e n p i r i d i l d i t i o b u t i r a t o d e N - s u c c i n im id i l o ( S P D B ) y
    3 ) u n a g e n t e i n h ib i d o r d e l c r e c im ie n t o q u e c o n s i s t e e n W 2 - d e s a c e t i l - W 2 - ( 4 - m e t i l - 4 - m e r c a p t o - 1 - o x o p e n t i l ) - m a i t a n s i n a ( D M 4 ) .
    15. U n a c o m p o s i c ió n f a r m a c é u t i c a q u e c o m p r e n d e u n i n m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 7 a 14 , o u n a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n u n a q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 6 , y u n s o p o r t e f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b le .
    16. U n in m u n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 7 a 14 , o u n a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 6 , o u n a c o m p o s i c ió n f a r m a c é u t i c a d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 15 , p a r a u s o e n e l t r a t a m ie n t o d e l c á n c e r .
    17. E l a n t i c u e r p o , in m u n o c o n j u g a d o o c o m p o s i c ió n f a r m a c é u t i c a p a r a u s o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 16 , e n d o n d e e l c á n c e r e s u n a d e n o c a r c in o m a d e c á n c e r d e c o l o n , t u m o r e s g a s t r o in t e s t i n a l e s , t u m o r e s d e ó r g a n o s v i t a l e s , t u m o r e s d e ó r g a n o s r e p r o d u c t o r e s o t u m o r e s d e p ie l , l a r i n g e o t e j i d o s b la n d o s .
    18. U n á c i d o n u c l e ic o a i s la d o , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c ia q u e c o d i f i c a u n a n t i c u e r p o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 6.
    19. U n a c é l u la h u é s p e d q u e h a s id o t r a n s f o r m a d a p o r u n á c id o n u c l e ic o d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 18.
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