KR20150100848A - 항-lamp1 항체와 항체 약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

항-lamp1 항체와 항체 약물 접합체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20150100848A
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cancer
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이브 보다
프란시스 블랑쉐
베아트리체 카메론
타릭 답두비
안느-마리 르페브르
마갈리 마티외
안나 메리노-트리고
마노엘 누네
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Abstract

인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 리소좀 결합 막 단백질 1 (lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1) 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 그리고 성장 저해제에 접합되거나 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 암 치료를 위한 항체 또는 면역접합체의 용도뿐만 아니라, LAMP1 항체, 상기 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 그리고 진단 도구로서의 상기 항체의 용도가 제공된다. 나아가, 본 출원은 암세포에서 LAMP1 유전자 증폭 또는 획득을 검출하도록 하여 암 환자가 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는지를 결정하도록 한다. 따라서, 암세포를 포함하는 암 환자의 생물학적 시료에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하고; LAMP1 유전자 카피 수 획득의 존재를 기초로 하여 환자를 선택하는 것을 포함하는, 시험관 내 암 환자 선택 방법이 제안된다. 나아가, 암세포에서 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 환자의 암 치료용 항-LAMP1 치료제가 제공된다.

Description

항-LAMP1 항체와 항체 약물 접합체 및 이의 용도{ANTI-LAMP1 ANTIBODIES AND ANTIBODY DRUG CONJUGATES, AND USES THEREOF}
인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)의 리소좀 결합 막 단백질 1(lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1)과 특이적으로 결합하는 항체, 그리고 성장 저해제에 접합되거나 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 암 치료를 위한 항체 또는 면역접합체의 용도뿐만 아니라, LAMP1 항체, 상기 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 그리고 진단 도구로서의 상기 항체의 용도가 제공된다. 나아가, 본 출원은 암세포에서 LAMP1 유전자 증폭 또는 획득을 검출하도록 하여 암 환자가 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는지를 결정하도록 한다. 따라서, 암세포를 포함하는 암 환자의 생물학적 시료에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하고; LAMP1 유전자 카피 수 획득의 존재를 기초로 하여 환자를 선택하는 것을 포함하는, 시험관 내 암 환자 선택 방법이 제안된다. 나아가, 암세포에서 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 환자의 암 치료용 항-LAMP1 치료제가 제공된다.
CD107 항원 유사 패밀리 구성원 A(CD107a)로도 알려져 있는 LAMP1(Lysosome-associated membrane protein 1)은 단일 통과 I형 막 단백질(single-pass type I membrane protein)로, LAMP 패밀리에 속한다. LAMP2는 이러한 패밀리의 가장 밀접한 구성원이며, 양 단백질은 리소좀 막 내의 가장 풍부한 당단백질이다(Sawada, R. et al., 1993, J Biol Chem 268: 12675-12681).
별도의 유전자에 의해 암호화되며, LAMP1은 염색체 13q34 상에 위치하고, LAMP2는 Xq24-25 상에 위치하지만, 이들 단백질은 1차 구조에서 유사하며, 약 36%의 서열 상동성을 나타낸다(Mattei, M.G. et al., 1990, J Biol Chem 265:7548-7551). LAMP1과 LAMP2는 대략 40kDa의 폴리펩티드 코어로 이루어진다. LAMP1과 LAMP2 둘 다는 C 말단을 통해 리소좀 막에 고정되며, 리소좀의 루멘 쪽으로, 광범위하게 글리코실 기와 결합된, 가장 큰 부분을 노출한다. 두 단백질은 가장 심하게 글리코실 기가 결합된 세포 단백질로, 그 질량의 약 50%가 탄수화물이며, 이러한 당화가 리소좀 산도를 유지하고, 리소좀 막을 자가 소화로부터 보호하는 열쇠인 것으로 여겨진다. 그러나 이러한 두 가지의 고도로 글리코실 기가 결합된 단백질, 특히 LAMP1의 완전한 생물학적 기능은 여전히 설명될 필요가 있다(Fukuda, M., 1991, J Biol Chem, 266:21327-21330; Winchester, B., 2001, European Journal of Paediatry Neurology, 5:11-19; Gasnier, B., 2009 Biochimica et Biophysica Acta 1793:636-649).
LAMP1은 후기 엔도솜과 리소좀에서 고도로 발현되어, 이들 두 세포 소기관에 대해 LAMP1을 마커로서 지정한다(Cook, N.R. et al., 2004, Traffic, 5 (9): 685-699). 따라서, LAMP1에 대한 문헌 대부분은 세포 내 섭취, 음세포작용 또는 포식작용에 관한 것이다(Cook, N.R. et al., 2004, Traffic, 5 (9): 685-699).
LAMP1과 LAMP2 대다수는 리소좀에 존재하지만, 일부 LAMP1과 LAMP2 면역 반응성은 원형질 막에서도 낮은 수준으로 관찰된다. 원형질 막에서 발견되는 LAMP1은 총 LAMP1의 1-2%만을 나타낸다. 이는 예를 들어, 말초 혈액 림프구(Holcombe, R.F. et al. 1993, Clin Immunol Immunopathol. 67(1): 31-39)와 혈소판(Silverstein, R.L. and Febbraio, M., 1992, Blood 80: 1470-1475)에 대해 사실이다.
LAMP1과 LAMP2의 증가된 세포 표면 발현은 종양 세포주, 예를 들어, 고도의 전이성 대장 암종 L4 세포(Saitoh, O. et al., 1992, J Biol Chem 267: 5700-5711)에서, 인간의 전이 중 흑색종 A2058, HT1080(인간 섬유 육종), CaCo-2(인간대장-선암종) 세포에 대해, 그리고 대장결장 신생물(Furuta, K. et al., 2001, J Pathol 159 (2): 449-455)에서 관찰된 바 있다.
LAMP1이 위치한 염색체 영역 13q34는 최근 인간 유방암에서 CUL4A, LAMP1, TFDP1 및 GAS6를 아우르는 더 큰 앰플리콘을 포함하는, 증폭 이벤트와 연관 지어진 바 있다(Abba, Martin C. et al.; Cancer Res 2007; 4104). TFDP1 및 아마도 CUL4A는 위에 언급된 출판물에서 증폭 현상을 추진시키는 가장 중요한 유전자로 확인되었다. 특히, 공개적으로 이용 가능한 유방암 유전자 발현(마이크로어레이) 데이터 세트의 분석은 TFDP1 과발현이 에스트로겐 수용체(ER) 음성 및 고등급 유방암종뿐만 아니라, 더 짧은 전체 생존기간(overall survival), 무재발 생존기간(relapse-free survival) 및 무전이 기간(metastasis-free interval)과 관련이 있음을 보여주었다. 역으로, LAMP1 발현은 종양 등급과 유의미하게 연관성을 보여주지 않았다. 결국, Abba 등은 LAMP1 증폭이 인간 유방암 세포에서 LAMP1 과발현으로 번역되었다고 보고하지 않았다.
LAMP1의 11개 아미노산 세포질 꼬리는 7개의 아미노산 링커 서열과 4개 아미노산 길이의 티로신 모티프(YQTI)를 함유한다. 막에 대한 이 모티프 간격의 작은 변화는 초기/선별 엔도솜에서 선별을 극적으로 손상시킨다. 상기 티로신 모티프 내의 돌연변이는 LAMP1의 어댑터 단백질과의 결합에 영향을 나타내어, 손상된 선별도 초래하는 것으로 나타났다(Obermuller, S. et al., 2002, Journal of Cell Science 115: 185-194; Rohrer, J. et al., 1996, Journal of Cell Biology 132(4): 565-576). 따라서, 상이한 암세포주에서 LAMP1의 비정상적인 세포 표면 발현은 세포질 꼬리에서의 돌연변이와 관련이 있을 수 있으나, 그 기전은 여전히 불분명하다. 나아가, 세포질 꼬리에서의 특정 점 돌연변이는 원형질 막 축적을 초래한다고 밝혀진 바 있다(Gough, N.R. et al., 1999, Journal of Cell Science 112 (23): 4257-4269).
LAMP1이 엔도솜과 리소좀의 마커라는 사실 때문에, 다수의 상업적으로 이용 가능한 항-LAMP1 항체들이 연구 목적으로 개발되었다. 이러한 항체들은 다클론성이거나 단일 클론성이며, 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯(WB), 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 면역침강(IP) 및 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)와 같은 일부 생화학적 적용에 제한되었다.
또한, LAMP1 단백질은 종양 세포의 세포막에서 검출된 바 있다.
E. Venetsanakos(WO 2005/012912)는 LAMP1이 대장암 세포의 표면에서 발현되지만, 정상적인 대장 세포의 표면에서는 발현되지 않음을 시사하였고, 항-LAMP1 항체를 통하여 LAMP1에 대한 세포독성제를 표적으로 함으로써 종양 성장이 감소될 수 있을 것이라고 제안하였다. 그러나 Venetsanakos는 항-LAMP1 항체 또는 이의 세포독성제 또는 세포정지제와의 접합체의 제조 또는 그의 가설을 뒷받침하는 어떠한 데이터도 기술하지 않았다. 사실, Venetsanakos의 초기 기록 이래 10년이 지났지만, 여태까지 항-LAMP1 항체나 항-LAMP1 치료법에서 면역접합체로서의 이의 용도는 전혀 임상적 개발에 진입하지 못했다. 따라서, 암 치료를 위한 항-LAMP1 항체 또는 면역접합체에 대한 요구가 매우 크다.
정의
본 출원에 사용된 "LAMP1"는 LAMPA, CD107a 또는 LGP120으로도 알려져 있는 당단백질 패밀리의 구성원인 "리소좀 결합 막 단백질 1(Lysosomal associated membrane protein 1)"을 가리킨다. LAMP1은, 아래 실시예 5에 제시된 비 종양성 시료와 비교한 인간 종양성 시료에 대한 단백질 발현 데이터에 따르면, 대장 선암종, 위장관 종양(소장, 직장, 이하선), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 위, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)뿐만 아니라 피부, 후두 및 연조직 종양의 세포 표면에서 발현된다.
인간 유전자 LAMP1은 염색체 13q34(113,951,469 - 113,977,441) 상에서 발견되고, 26,273 kb의 총 길이를 나타낸다.
신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, 전체 길이의 인간 LAMP1을 부호화하는 cDNA의 참조 서열은 등록번호 NM_005561.3 하에 유전자 은행(GenBank) 데이터베이스로부터 이용 가능하고(서열 번호 23), 신호 펩티드(위치 1-28번)를 포함하는, 대표적인 단백질 서열은 NP_005552.3 하에 이용 가능하다(서열 번호 24). 인간 LAMP1을 부호화하는 유전자의 엑손 4에 상응하는, 서열 번호 24의 136-188번 위치의 아미노산을 누락하는, LAMP1의 하나의 잠재적인 이소형이 보고된 바 있다. 적어도 60명의 개체로 이루어진 백인 집단에서 같은 것을 나타내는 SNP(synonymous SNP)는 전혀 확인된 바 없다.
인간 LAMP1의 오르소로그(ortholog)와 관련하여, 인간 LAMP1은 마우스 LAMP1(NP_034814, 서열 번호 25)과 랫트 LAMP1(NP_036989, 서열 번호 26) 각각에 대해 66% 서열 동일성을 공유하고, 인간 및 히말라야 원숭이(Macaca mulatta) LAMP1(XP_001087801, 서열 번호 27)은 96% 서열 동일성을 공유한다.
히말라야 원숭이로부터의 LAMP1의 서열(서열 번호 27) 및 필리핀 원숭이의 예상 서열(서열 번호 39)은 99%까지 동일하고, 상기 서열들은 히말라야 원숭이 LAMP1(서열 번호 27)의 11번 위치에서, 즉, 신호 펩티드에서, 하나의 추가적인 류신 차이가 있다. 따라서, 히말라야 원숭이와 필리핀 원숭이로부터의 성숙한 LAMP1 서열들은 동일하다.
LAMP 패밀리 중에서 가장 근접한 구성원은 LAMP 2(P13473, 인간 LAMP2, 가용성 LAMP2 단백질 서열 번호 40)이다. 인간 LAMP1 및 LAMP2 단백질은 약 36% 서열 동일성을 공유하며, 일부 보존된 당화 자리를 포함한다.
"도메인"은 일반적으로 서열 상동성을 기초로 하여 정의된, 단백질의 임의의 부위일 수 있으며, 종종 특정한 구조적 또는 기능적 실체와 관련이 있다. LAMP1의 도메인 조직화는 현재까지 전체적으로 공개된 바 없다.
인간 LAMP1은 417개 아미노산 잔기 및 절단 가능한 신호 펩티드에 상응하는 28개 아미노 말단 잔기로 이루어져 있다. LAMP1의 주요 부분은 리소좀의 루멘 쪽에 존재하며, N-글리칸으로 심하게 당화되어 있다. LAMP1은 18개의 잠재적인 N-당화 자리를 함유하며, 이 중 5개는 폴리-N-아세틸락토사민 글리칸이 차지한다(Carlsson, S.R. and Fukuda, M., 1990, J. Biol. Chem. 265(33): 20488-20495). 그것들은 대부분이 O-글리칸에 연결되어 있는 프롤린과 세린이 풍부한 힌지 유사 구조에 의해 분리된 두 개의 도메인으로 무리를 이루고 있다. LAMP1은 COOH 말단 근처에 24개의 소수성 아미노산으로 이루어지는 하나의 막관통 도메인을 보유하고 있으며, COOH 말단 끝에 11개의 아미노산 잔기로 구성된 짧은 세포질 세그먼트를 함유한다.
LAMP1의 두 도메인, "제1 루멘 도메인"과 "제2 루멘 도메인"의 명명법은 그 본래의 부위인 리소좀 내에서의 LAMP1의 배향을 기초로 한다. 그럼에도 불구하고, LAMP1이 세포 표면에서 발현될 때, 두 개의 루멘 도메인은 세포 외 도메인이 되며, 따라서 세포 표면에서 노출된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 "세포 외"는 아래에 정의된 LAMP1 및/또는 이의 변이형의 제1 및/또는 제2 루멘 도메인(들)을 포함하는 LAMP1 단백질 구성체를 지칭한다. NP_005552.3(서열 번호 24)에 따른 인간 LAMP1의 도메인 조직을 실시예 6.1에서 매핑하였으며, 이는 본 문서에서 다음과 같이 이용될 것이다.
인간 LAMP1 도메인에 대한 설명
LAMP1 도메인 NP_005552(서열 번호 24)에서의 위치
펩티드 신호 Met1-Ala28
제1 루멘 도메인 Ala29-Arg195
루프 1, L1 Ala29-Leu100
루프 2, L2 Thr101-Arg195
힌지 Pro196-Thr227
제2 루멘 도메인 Asn228-Met382
루프 3, L3 Asn228-Ile309
루프 4, L4 Leu310-Met382
막관통 도메인 Leu383-Gly406
리소좀 표적화 모티프 Arg407-Ile417
따라서, 인간 LAMP1의 제1 내지 제3 루프로 이루어지는 도메인은 서열 번호 24의 29-309번 위치에 있는 아미노산들로 이루어진다.
예상 서열(서열 번호 39)에 따른 필리핀 원숭이 LAMP1의 도메인 조직은 다음과 같다.
필리핀 원숭이 LAMP1 도메인에 대한 설명
LAMP1 도메인 NP_005552(서열 번호 24)에서의 위치
펩티드 신호 Met1-Ala26
제1 루멘 도메인 Ala27-Arg193
루프 1, L1 Ala27-L98
루프 2, L2 Thr99-Arg193
힌지 Pro194-Thr225
제2 루멘 도메인 Asn226-Met380
루프 3, L3 Asn226-Thr307
루프 4, L4 Leu308-Met380
막관통 도메인 Leu381-Gly404
리소좀 표적화 모티프 Arg405-Ile415
따라서, 필리핀 원숭이 LAMP1의 제1 내지 제3 루프로 이루어지는 도메인은 서열 번호 39의 27-307번 위치에 있는 아미노산들로 이루어진다.
인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 전체 길이 단백질의 서열 정렬을 도 1에 나타내었다.
인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1의 루프 부위 4는 임의의 당화 자리를 함유하지 않으며, 이는 LAMP1의 루프 1-3으로부터 루프 4를 구별짓는다.
루프 1-4는 1차 아미노산 서열로부터 정의되었으며, 실시예 6.1에서 매핑되었으나, LAMP1의 3D 구조로부터는 그렇지 않았는데, 본 작업 전에 구조가 풀리지 않았기 때문이다.
"부호화 서열" 또는 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 생성물을 "암호화하는" 서열은 발현 시, 그 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 생산을 가져오는 뉴클레오티드 서열로, 즉, 이러한 뉴클레오티드 서열은 그 폴리펩티드, 단백질 또는 효소를 위해 아미노산 서열을 암호화한다. 단백질의 부호화 서열은 개시 코돈(보통 ATG) 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. DNA에 존재하는 발현 생성물을 암호화하는 부위는 "부호화 DNA 서열" 또는 "CDS"라 한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 특이적인 단백질(예컨대, 항체)에 대한 참조는 자연적인 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드뿐만 아니라, 변이형 및 그의 기원 또는 제조 방식과는 무관한 변형된 형태를 포함할 수 있다. 자연적인 아미노산 서열이 있는 단백질은 자연으로부터 얻어진 것과 동일한 아미노산 서열이 있는 단백질이다. 그러한 자연적인 서열의 단백질은 자연으로부터 분리될 수 있거나, 일반적인 재조합 및/또는 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 자연적인 서열의 단백질은 구체적으로 자연 발생적인 절단된 형태 또는 가용성 형태, 자연 발생적인 변이형 형태(예컨대, 대안적으로 스플라이스된 형태), 자연 발생적인 대립 형질의 변이형 및 번역 후 변형을 포함하는 형태를 아우른다. 자연적인 서열의 단백질은 당화, 또는 인산화, 또는 일부 아미노산 잔기의 기타 변형과 같은 번역 후 변형을 수반하는 단백질을 포함한다.
본 출원에 사용된 용어 "마커"는 존재를 확인하고, 아마도 생물학적 시료에서 표적 유전자 및/또는 단백질의 발현을 정량할 수 있게 하는 임의의 생물학적, 화학적 또는 물리학적 수단을 지칭한다. 이러한 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 유리하게도, 본 발명에 따른 마커는 유전적 마커 및/또는 단백질 마커이다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 단백질 또는 효소들 전부 또는 일부분을 포함하는 아미노산들의 특정 서열을 암호화하거나 이에 상응하는 DNA 서열을 의미하며, 예를 들어, 이러한 유전자가 발현되는 조건을 결정하는, 프로모터 서열과 같은 조절성 DNA 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 구조적 유전자가 아닌 일부 유전자들은 DNA로부터 RNA로 전사될 수 있지만, 아미노산 서열로 번역되지는 않는다. 다른 유전자들은 구조적 유전자의 조절자로서, 또는 DNA 번역의 조절자로서 기능할 수 있다. 특히, 용어 유전자는 단백질을 암호화하는 게놈 서열, 즉, 조절자, 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 위해 의도될 것일 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "카피 수 변이", "카피 수 변이형" 및 "CNV"는 차별없이 이용되며, 1 kb 이상의 DNA 세그먼트를 지칭하고, 참조 게놈과 비교할 때, 가변적인 카피 수로 존재한다. 문헌에서 발견되는 용어 "구조적 변이형", "듀플리콘 (duplicon)", "인델 ( indel )", "중간체 규모의 구조적 변이형(intermediate-sized structural variant, ISV )", "저 카피 반복(low copy repeat, LCR)", "복합자리 변이형(multisite variant, MSV)", "파라로거스 서열 변이형( paralogous sequence variant, PSV)", "부분 중복(segmental duplication)", "염색체간 중복(interchromosomal duplication)", 및 "염색체내 중복( intrachromosomal duplication)"은 본 출원에서 용어 "CNV"에 포함된다.
나아가, 카피 수 변이는 단일 유전자를 지칭하거나, 유전자들의 연속된 세트를 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 "유전자 수"는 세포에 존재하는 유전자들의 수를 설명한다. 2배체 생물체에서는, 정상 상태에서, 각각의 핵 서열의 두 개 카피가 게놈에 자연적으로 존재하고, 따라서, 카피 수(CN)는 = 2이다. 특히, 게놈은 각 유전자에 대해 두 개의 대립유전자를 나타내고, 한 쌍의 상동 염색체의 각 염색체 상에 하나씩 존재한다(성 염색체에 위치한 유전자는 제외).
본 출원에서 단어 "유전자 수"와 "유전자 카피 수"는 서로 교체 가능하게 이용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 서열의 "카피"는 상기 서열에 동일한 서열을 포괄하지만, 상기 서열의 대립유전자 변이형도 아우른다.
DNA 카피 수 및 그에 따른 DNA 카피 수 변화를 측정하는 한 가지 예는 어레이 기반의 CGH이며, 이는 게놈 전반에 걸친 DNA 카피 수 변화를 측정하는 고처리 기법이다. 시험 및 참조 시료의 DNA 단편 또는 "클론"은 매핑된 어레이 단편에 혼성화된다. 참조에 대한 시험의 로그2 강도 비율은 카피 수에서 유전자 전체 수준의 프로파일에 대한 유용한 정보를 제공한다.
"로그2" 또는 "로그2 비율" 값은 세포 게놈에서 유전자 또는 DNA 단편의 카피 수를 기술하는 데에 이용된다. 이상적인 상황에서, 정상적인(카피 변이 중성) 클론의 로그2 비율은 log2(2/2) = 0이고, 단일 카피 소실은 log2(1/2) = -1이고, 단일 카피 획득은 log2(3/2) = 0.58이다. 다중 카피 획득 또는 증폭은 log2(4/2), log2(5/2),...의 값들을 나타낼 것이다.
본 출원에 사용된 용어 서열의 "획득"은 일반적으로 대상자의 이배체 게놈에서 상기 서열의 ≥　2.5(대안적으로 로그2 비율≥ 0.32)인 카피 수의 존재를 지칭한다. 이러한 ≥ 2.5 카피는 게놈에 인접할 수 있거나, 게놈 상에 존재하지 않을 수 있다. 특히, 그것들은 한 쌍의 염색체의 상이한 부위에, 또는 게놈의 별도의 염색체 쌍들에 속하는 염색체 상에 존재할 수 있다.
따라서, 용어 "유전자 카피 수 획득"은 대상자의 이배체 게놈에서 특정 유전자의 ≥2.5 카피 수(대안적으로는 로그2 비율 ≥ 0.32)의 존재를 지칭한다. 카피 수 = 2.5일 때, 카피 수를 정의하는 데 이용되는 세포의 50%는 이배체 생물체에서 보통 2 카피의 유전자를 함유하고, 카피 수를 정의하는 데 이용되는 세포의 50%는 보통 2 카피와 상기 유전자의 1개의 추가적인 카피를 더 함유한다(상기 유전자의 총 3 카피).
용어 서열의 "저 획득"은 일반적으로 대상자의 이배체 게놈에서 상기 서열의 ≥　2.5, 그러나 <5(대안적으로 0.32≤ 로그2 비율 <1.32)인 카피 수의 존재를 지칭한다. 용어 "증폭", "Amp", 또는 "고 획득"은 본 출원에서 대상자의 이배체 게놈에서 특정 서열의 ≥5, 또는 대안적으로 로그2 ≥ 1.32인 카피 수의 존재를 지칭한다. 따라서, 용어 "유전자 수 증폭"은 대상자의 이배체 게놈에서 특정 유전자의 ≥　5 카피 수의 존재를 지칭한다.
본 출원에서 사용된 "서열의 단편"은 상기 서열, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 일부분에 해당한다. 상기 단편은 바람직하게는 적어도 10 bp 길이이다. 더욱 바람직하게는 상기 단편은 적어도 15 bp 길이, 특히, 적어도 20 bp 길이이다. 가장 바람직하게는, 상기 단편은 적어도 25 bp 길이, 적어도 30 bp 길이, 특히 적어도 33 bp 길이이다. 위의 서열의 단편은 특히 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 참조 서열의 "돌연변이된 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)을 포함하는 서열을 지칭하는데, 이때, 상기 돌연변이된 서열은 참조 서열과 적어도 75% 동일하다. 서열 동일성의 백분율은 최적으로 정렬된 돌연변이된 서열을 참조 서열과 비교하고, 양 서열에서 동일한 핵산 염기(예컨대, A, T, C, G, U, 또는 I)가 발생하는 위치의 수를 결정하여 합치된 위치의 수를 획득하고, 합치된 위치의 수를 참조 서열의 위치 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산된다. 바람직하게는, 돌연변이된 서열은 참조 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 동일하다.
바람직하게는 참조 서열의 상기 돌연변이된 서열은 상기 참조 서열의 대립유전자 변이형이다. 본 출원에 사용된 "대립유전자 변이형"은 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 둘 이상의 대안적인 형태들 중 임의의 것을 의미한다.
"참조 서열과 적어도 85% 동일한" 서열은 그 전체 길이에, 참조 서열의 85% 이상, 특히, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열이다.
"서열 동일성"의 퍼센티지는 비교창 위에 최적으로 정렬된, 두 개의 서열들을 비교함으로써 결정될 수 있는데, 이때, 비교창의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 두 서열들의 최적 정렬에 대해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 틈)을 포함할 수 있다. 이러한 퍼센티지는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 합치된 위치의 수를 얻고, 합치된 위치의 수를 비교창에서의 전체 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센티지를 얻음으로써 계산된다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 전체적인 쌍별 정렬, 예컨대, Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 알고리즘을 이용하여 수행한다. 서열 동일성의 퍼센티지는 예를 들어, BLOSUM62 매트릭스와 함께, 프로그램 Needle 및 다음 매개변수들 gap-open=10, gap-extend=0.5을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 비슷한 화학적 성질(예컨대, 전하, 또는 소수성)을 나타내는 곁사슬 R이 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적인 성질을 실질적으로 바꾸지 않을 것이다. 비슷한 화학적 성질을 나타내는 곁사슬이 있는 아미노산 집합들의 예는 1) 지방족 곁사슬: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 곁사슬: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 곁사슬: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 곁사슬: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 곁사슬: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 곁사슬: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황 함유 곁사슬: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존적 아미노산 치환 집합들은 아미노산 크기를 기초로 하여 정의될 수도 있다. 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신-트립토판, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.
"항체"는 두 개의 중쇄가 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된 자연적인 또는 통상적인 항체일 수 있다. 두 가지 유형의 경쇄, 람다(l)와 카파(k)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 다섯 가지 주요한 중쇄 부류(또는 이소형)가 있다. 각각의 쇄는 별개의 서열 도메인을 함유한다. 경쇄는 두 개의 도메인 또는 부위인 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 네 개의 도메인, 하나의 가변 도메인(VH)과 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 집합적으로 CH라 지칭됨)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 부위는 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(CH)의 불변 부위 도메인은 항체 사슬 결합, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)와의 결합과 같은, 중요한 생물학적 성질을 부여한다. Fv 단편은 면역 글로불린의 Fab 단편의 N 말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분들로 이루어진다. 이러한 항체의 특이성은 항체 결합 자리 및 항원 결정기 사이의 구조적인 상보성에 있다. 항체 결합 자리는 주로 과가변 또는 상보성 결정 부위(CDR)로부터 유래하는 잔기들로 이루어진다. 때때로, 비 과가변 또는 프레임워크 부위(FR)로부터의 잔기들은 전반적인 도메인 구조에 영향을 미치고, 따라서 결합 자리에 영향을 미친다. 상보성 결정 부위 또는 CDR은 자연적인 면역 글로불린 결합 자리의 자연적인 Fv 부위의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열들을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L, 그리고 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로 지칭되는 각각 세 개의 CDR을 가지고 있다. 따라서, 통상적인 항체 항원 결합 자리는 중쇄 및 경쇄 V 부위의 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는, 여섯 개의 CDR을 포함한다.
"프레임워크 부위"(FR)는 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉, 단일한 종에서 상이한 면역 글로불린들 가운데 상대적으로 보존된 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 부위의 그러한 부분들을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄들은 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 그리고 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 지칭되는 각각 네 개의 FR을 가지고 있다.
본 출원에 사용된 "인간 프레임워크 부위"는 자연 발생적인 인간 항체의 프레임워크 부위와 실질적으로 동일한 (약 85% 이상, 특히, 95%, 97%, 99% 또는 100%) 프레임워크 부위이다.
본 발명의 맥락에서, 면역 글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 CDR/FR 정의는 IMGT 정의를 기초로 하여 결정된다(Lefranc, M.P. et al., 2003, Dev Comp Immunol, 27(1):55-77; www.imgt.org).
본 출원에 사용된 용어 "항체"는 통상적인 항체 및 이의 단편뿐만 아니라, 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 특히, 단일 도메인 항체의 가변 중쇄 및 키메라, 인간화, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 의미한다.
또한, 본 출원에 사용된 항체 또는 면역 글로불린은 더욱 최근에 기술된 바 있으며, 상보성 결정 부위가 단일 도메인 폴리펩티드의 일부분인 항체인 "단일 도메인 항체"를 포함한다. 단일 도메인 항체의 예로는 중쇄 항체, 자연적으로 경쇄가 없는 항체, 통상적인 네 개의 사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 유전자 공학으로 제조된 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려져 있는 자연 발생적인 단일 도메인 항체일 수 있다. 특히, 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 단봉 낙타, 라마, 알파카 및 구아나코는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산한다. 낙타과 중쇄 항체들은 CH1 도메인도 없다.
경쇄가 없는 이러한 단일 도메인 항체들의 가변 중쇄는 당해 분야에서 "VHH" 또는 "나노바디"로 알려져 있다. 통상적인 VH 도메인과 비슷하게, VHH는 네 개의 FR과 세 개의 CDR을 함유한다. 나노바디는 통상적인 항체에 비해 장점이 있다. 나노바디는 IgG 분자들보다 약 10배 작고, 그 결과, 적절히 접힌 기능적인 나노바디는 시험관 내 발현에 의해 생산될 수 있으며, 높은 수율을 달성한다. 나아가, 나노바디는 매우 안정적이며, 단백질 가수분해효소의 작용에 대해 저항성을 나타낸다. 나노바디의 성질 및 생산은 Harmsen 및 De Haard HJ가 검토한 바 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).
본 출원에 사용된 용어 "단일클론성 항체" 또는 "mAb"는 단일 아미노산 조성물의 항체 분자를 지칭하는데, 이는 특정 항원을 대상으로 하며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 단일클론성 항체는 B 세포의 단일 클론 또는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있지만, 재조합될 수도 있다. 즉, 단백질 공학에 의해 생산될 수도 있다.
용어 "키메라 항체"는 유전자 공학에 의해 제조된 항체를 지칭하는데, 이는 가장 광범위한 의미에서, 하나의 항체로부터의 하나 이상의 부위 및 하나 이상의 다른 항체(들)로부터의 하나 이상의 부위를 함유한다. 특히, 키메라 항체는 비 인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을, 다른 항체의, 특히 인간 항체의, CH 도메인 및 CL 도메인과 함께 포함한다. 비 인간 동물로서, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 등과 같은 임의의 동물이 이용될 수 있다. 또한, 키메라 항체는 적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 특이성을 나타내는 다중특이적인 항체를 지칭할 수도 있다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 마우스 기원의 가변 도메인 및 인간 기원의 불변 도메인을 보유한다.
용어 "인간화 항체"는 시작시에는 전체적으로 또는 부분적으로 비 인간 기원이고, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위하여 특히, 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 부위의, 특정 아미노산을 교체하도록 변형된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 도메인은 대부분의 경우 인간 CH 및 CL 도메인이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 인간 기원의 불변 도메인을 가진다.
(통상적인) 항체의 "단편"은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디, 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체들을 포함한다. 또한, 통상적인 항체의 단편은 중쇄 항체 또는 VHH와 같은 단일 도메인 항체일 수 있다.
용어 "Fab"는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 나타내는 항체 단편으로, 이때, IgG를 단백질 분해효소 파파인과 함께 처리하여 얻어진 단편들 중에서, H 사슬의 N 말단 측의 약 절반과 전체 L 사슬이 이황화 결합을 통해 서로 결합되는 항체 단편을 의미한다.
용어 "F(ab')2"는 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 지칭하는데, 이는 IgG를 단백질가수분해효소인 펩신으로 처리함으로써 얻어진 단편들 중에서 힌지 부위의 이황화 결합을 통해 결합된 Fab보다 약간 더 크다.
단일 사슬 Fv("scFv") 폴리펩티드는 공유적으로 연결된 VH::VL 헤테로이량체로서, 이는 일반적으로 펩티드를 암호화하는 링커에 의해 연결된 유전자들을 암호화하는 VH 및 VL을 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. 본 발명의 인간 scFv 단편은 특히, 유전자 재조합 기법을 이용하여, 적절한 입체구조로 유지된 CDR들을 포함한다. 2가 및 다가 항체 단편들은 1가 scFv들의 회합에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 2가의 sc(Fv)2와 같은 펩티드 링커에 의해 1가의 scFv들을 결합시킴으로써 형성될 수 있다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로이량체이다. "(dsFv)2"는 펩티드 링커에 의해 결합된 두 개의 dsFv를 의미한다.
용어 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 단일 분자 내에 두 개의 항체들의 항원 결합 자리를 조합시킨 항체를 의미한다. 따라서, BsAb들은 동시에 두 개의 상이한 항원들과 결합할 수 있다. 예를 들어 EP 2 050 764 A1에 기술된 바와 같이, 결합 성질과 작동인자 기능들의 원하는 세트를 갖춘 항체 또는 항체 유도체들을 설계, 변형 및 생산하기 위하여 증가하는 빈도로 유전 공학이 이용되고 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 단일 분자 내에 둘 이상의 항체들의 항원 결합 자리를 조합시킨 항체를 의미한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원 결합 자리가 있는 작은 항체 단편들을 지칭하는데, 이러한 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인들 사이에서의 짝지음을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 이러한 도메인들은 다른 사슬의 상보적인 도메인들과 짝을 이루도록 강제되어 두 개의 항원 결합 자리를 생성한다.
용어 "하이브리도마"는 비 인간 포유동물을 항원으로 면역화하여 제조된 B 세포를 마우스 등으로부터 유래된 골수종 세포와 세포 융합시킴으로써 얻어지는 세포를 의미하며, 이는 항원 특이성을 나타내는 원하는 단일클론성 항체를 생산한다.
폴리펩티드(즉, 본 발명의 항체) 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 때 "정제된" 및 "분리된"은, 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자의 실질적인 부존재 하에 지시된 분자가 존재함을 의미한다. 본 출원에 사용된 용어 "정제된"은 특히 동일한 유형의 생물학적 거대분자가 중량을 기준으로 적어도 75%, 85%, 95%, 또는 98%가 존재함을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 암호화하는 "분리된" 핵산 분자는 대상 폴리펩티드를 암호화하지 않는 다른 핵산 분자들이 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다. 그러나 이러한 분자는 조성물의 기본적인 특성에 유해하게 영향을 미치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "대상자"는 설치류, 고양이, 개 및 영장류와 같은 포유동물을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 대상자는 인간이다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "포함하는"은 구체적으로 언급된 모든 특징뿐만 아니라, 선택적, 추가적, 불특정한 특징들을 포괄하는 것으로 해석된다. 본 출원에 사용된 용어 "포함하는"의 사용은 구체적으로 언급된 특징 이외의 특징들이 존재하지 않는(즉, "~ 으로 이루어지는(consisting of)") 구현예도 개시한다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "및/또는"은 문법적인 접속사로서, 그것이 연결하는 사례들 중 하나 이상이 발생할 수 있음을 포괄하는 것으로 해석되는 접속사이다. 예를 들어, 문장 "생물학적 시료에서 표적 유전자 및/또는 단백질의 발현을 정량하는"은 표적 유전자(mRNA)의 발현 또는 단백질의 발현이 정량될 수 있음 또는 표적 유전자(mRNA) 및 단백질의 발현이 함께 정량될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 단어 "서열 번호 1의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 5의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인"은 "서열 번호 1의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인" 또는 "서열 번호 5의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인" 또는 "서열 번호 1의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 5의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인"으로 해석된다.
용어 "암", "신생물", "종양" 및 "암종"은 본 출원에서, 상대적으로 자율적인 성장을 나타내어, 세포 증식 제어의 유의미한 상실을 특징으로 하는 이상 성장 표현형을 나타낼 수 있는 세포들을 지칭하는 데에 서로 교체 가능하게 이용된다. 일반적으로, 본 출원에서 검출 또는 치료를 위한 관심 세포로는 전암성(예컨대, 양성), 악성, 전이성 및 비 전이성 세포를 포함한다.
면역접합체
치료적 목적을 위해, 항체 약물 접합체로서 이용하기 위한 최적의 특징을 갖춘 항체, 즉, 암 세포의 표면에 존재하는 표적을 특이적으로 인식하고, 상기 표적에 일단 결합되면, 효율적으로 내재화를 촉발시킬 수 있는 항체를 제조하는 것이 유리하다.
본 발명자들은 대장 종양 세포 또는 폐 종양 세포에 대한 항체를 발생시키고, 그에 따른 클론들을 대상으로, 종양 세포 및 비 종양 조직에 대해 차등을 두는 결합에 대해 스크리닝하였다.
본 발명자들은 이러한 방식으로 종양 조직을 비 종양 조직으로부터 구별하는 항체들을 확인하였다. 특히 ADC의 형태로, 치료적 응용에 필수적인 예상 특징들을 충족하는 그러한 항체들 중 세 가지(소위 항체 "MAb1", "MAb2" 및 "MAb3")를 선택하였다. 이들 세 가지 항체는 암 세포에서 세포 표면에 발현된 LAMP1에 대해 높은 결합 친화도(나노몰 범위 내)를 나타냈다. 나아가, 이들 세 가지 항-LAMP1 항체는 실시예 4.4 및 4.3에 나타난 바와 같이 LAMP1/항-LAMP1 항체 복합체의 내재화를 촉발시키는 능력이 높게 나타났다.
본 발명자들은 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된, MAb1, MAb2, MAb3으로부터 유래된 키메라 항체(chMAb1, chMAb2, chMAb3)가 실시예 8.1.7 및 8.1.8에 나타난 바와 같이 네이키드(naked) 항체보다 인간 LAMP1 또는 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대해 높지만 약간 상이한 결합 친화도를 보여준다는 점을 증명하였다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 맥락의 면역접합체는 재조합 세포주의 세포 표면에 발현된 전체 길이 인간 LAMP1 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대해 친화도(EC50)를 나타내며, 이때, 이러한 세포주는 HCT116일 수 있고, 유동 세포계수법을 통해 측정된 겉보기 친화도는 ≤ 30nM, 예를 들어, ≤20nM 또는 ≤ 15nM이다.
전체 길이 인간 LAMP1 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대한 친화도(EC50)를 측정하는 방법은 "항체"장에서 더 설명된다.
본 발명자들은 추가적으로, 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된, MAb1으로부터 유래된 키메라 항체(chMAb1)가, 게놈 DNA에 LAMP1을 부호화하는 DNA 서열의 안정적인 통합을 함유하고 표면 상에 LAMP1을 발현하는 인간 HCT116 종양 세포에 대해, 시험관 내에서 세포독성 활성을 유도함을 증명하였다.
나아가, 본 발명자들은, 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된, MAb1으로부터 유래된 인간화 항체들(huMAb1_1, huMAb1_2, huMAb1_3)이, 게놈 DNA에 LAMP1을 부호화하는 DNA 서열의 안정적인 통합을 함유하는 인간 HCT116 종양 세포에 대해, 시험관 내에서 세포독성 활성을 유도함을 증명하였다.
또한, 본 발명자들은 면역접합체 DM4-SPDB-chMAb1가 실시예 10.1.1에 기술된 바와 같이, 단일 주사로, 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 이용될 때, 환자 CR-LRB-010P로부터 유래된 원발성 인간 대장 선암종 이종 이식편을 가지고 있는 마우스의 생체 내에서 뚜렷한 항-종양 활성을 유도함을 보여주었다.
나아가, 본 발명자들은 이러한 면역접합체가 실시예 10.1.2에 기술된 바와 같이, 단일 주사로, 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 이용될 때, 환자 LUN-NIC-0014로부터 유래된 원발성 인간 폐 종양 이종 이식편을 가지고 있는 마우스의 생체 내에서 뚜렷한 항-종양 활성을 유도함을 보여주었다.
또한, 본 발명자들은 면역접합체 DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb3이 실시예 10.2 내지 10.4에 나타난 바와 같이, 상이한 환자에서 유래된 이종 이식편에서 뚜렷한 항-종양 활성을 유도함을 보여주었다.
예를 들어, 면역접합체 DM4-SPDB-huMAb1_1은 실시예 10.2.2 및 10.2.3에 기술된 바와 같이, 단일 주사로, 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2.5 mg/kg, 또는 1.25 mg/kg의 용량으로 이용될 때, 환자로부터 유래된 원발성 인간 침습성 관암종 이종 이식편 및 원발성 인간 폐 종양 이종 이식편에서, 생체 내에서 뚜렷한 항-종양 활성을 유도함이 밝혀졌다.
또한, 면역접합체 DM4-SPDB-chMAb2와 DM4-SPDB-chMAb3은 실시예 10.3.2와 10.4에 기술된 바와 같이, 단일 주사로, 각각 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg, 2.5 mg/kg 및 1.25 mg/kg의 용량으로 이용될 때, 환자로부터 유래된 원발성 인간 침습성 관암종 이종 이식편의 쥐 모델에서, 생체 내에서 뚜렷한 항-종양 활성을 유도하였다.
종합하면, 처음으로, 이러한 결과들은 LAMP1을 암 치료를 위한 치료적 표적으로서 타당하게 밝혀준다.
따라서, 본 발명은,
a) 인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LAMP1 단백질에 결합하고,
b) 적어도 하나의 성장 저해제와 연결되거나 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
본 출원 전체에 걸쳐 기술된 바와 같은 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 결합하는 임의의 항체(예컨대, MAb4, 이의 단편, 또는 이의 키메라 또는 인간화 버전)이 본 발명에 따른 면역접합체에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "접합체", "면역접합체", "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 동일한 의미를 가지고 상호교환가능하다.
차별 없이 사용할 수 있는 "성장 저해제” 또는 "항-증식제"는 세포, 특히, 종양 세포의 성장을 시험관 내 또는 생체 내에서 저해하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 저해제는 특히 세포독성제 또는 방사성 동위원소를 나타낸다.
“방사성 동위원소”라는 용어는 암을 치료하는데 적절한 방사성 동위원소, 예를 들어, At211, Ac225, Bi212, Bi213, Pb212, Er169, I131, I124, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu의 방사성 동위원소, 예를 들어 Lu177를 포함하는 것으로 의도된다. 일반적으로 이러한 방사성 동위원소는 주로 베타-방사선을 방출한다. 일 구현예에서, 방사성 동위원소는 알파 방출 동위원소이고, 보다 정확하게는 알파 방사선을 방출하는 토륨 227(Th227)이다. 본 발명에 따른 면역접합체는 출원 WO2004/091668에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 방사성 동위원소는 At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu의 방사성 동위원소로 이루어진 군, 예를 들어, At211, Er169, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Lu의 방사성 동위원소, 및 Th227로부터 선택된다.
본 출원에서 사용된 용어 "세포독성제”는 세포의 기능을 저해하거나 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. "세포독성제”라는 용어는 화학요법제, 효소, 항생제, 및 소분자 독소 또는 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소(이의 단편 및/또는 변이형을 포함함) 및 아래에 기술된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 탁소이드 또는 탁산, 빈카-알칼로이드, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 예를 들어, DM1 또는 DM4, 크립토피신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체와 같은 항-튜불린제; DNA 알킬화제, 예를 들어, 토메이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, CC-1065 또는 CC-1065 유사체; 렙토마이신 유도체, 토포이성질화효소 II 저해제, RNA 중합효소 II 저해제, 예를 들어 알파-아마니틴에 있는 화합물의 약물 또는 전구약물이다.
제1 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 정의되지 않은 방사성 동위원소, 화학요법 약물, 단백질 또는 렉틴이 아니고, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 아브린, 리신 및 이들 각각의 A 사슬들, 독소루비신, 시스플라스틴, 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188, 비스무트-212, 탁솔, 5-플루오로우라실, VP-16(에토포시드), 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비스-클로로에틸니트로소우레아(BCNU), 미토마이신, 시클로포스파미드, 및 TNF 및 TNF-β와 같은 사이토카인도 아니다.
이러한 제1 구현예에 따르면, 본 발명은, 특히,
a) 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 결합하고,
b) 다음과 같은 적어도 하나의 성장 저해제에 연결되거나 접합되는 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
(i) 미국자리공 항바이러스 단백질의 것 이외의 효소; 블레오마이신 및 미토마이신 이외의 항생제; 박테리아, 곰팡이 또는 동물 기원의 독소 또는 아브린 및 리신 이외의 식물 기원의 독소(이의 단편 및/또는 변이형 포함); DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 파클리탁셀(탁솔) 이외의 탁소이드 또는 탁산, 빈데신, 빈크리스틴 및 빈블라스틴 이외의 빈카 알칼로이드, 크립토피신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체와 같은 항튜불린제에 있는 화합물의 약물 또는 전구약물; BCNU 및 시클로포스파미드 이외의 DNA 알킬화제, 예를 들어, 토메이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, CC-1065 또는 CC-1065 유사체; 렙토마이신 유도체; 독소루비신(아드리아마이신) 및 에토포시드 이외의 토포이성질화효소 II 저해제, RNA 중합효소 II 저해제, 예를 들어 알파-아마니틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포독성제, 또는
(ii) At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu의 방사성 동위원소, 예를 들어, Lu177 및 Th227로부터 선택된 방사성 동위원소.
일 구현예에서, 방사성 동위원소는 At211, Er169, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Lu의 방사성 동위원소, 및 Th227로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 제1 구현예에서, 항체는 특히 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인에 결합할 수 있는데, 인간 LAMP1 단백질의 제1 내지 제 3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Ile309로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 39의 아미노산 Ala27 내지 Thr307로 이루어진다.
제2 구현예에 따르면, 본 발명은 면역접합체에 관한 것으로서, 항체가 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인에 결합하되, 인간 LAMP1 단백질의 제1 내지 제 3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Ile309로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 39의 아미노산 Ala27 내지 Thr307로 이루어진다.
따라서, 제2 구현예에 따르면, 면역접합체는,
a) 인간 LAMP1 단백질의 제1 내지 제 3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Ile309로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 39의 아미노산 Ala27 내지 Thr307로 이루어지는, 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인에 결합하고,
b) 상기 적어도 하나의 성장 저해제에 연결되거나 접합되는 항체를 포함한다.
필수적이지는 않더라도, 상기 제2 구현예에서, 적어도 하나의 성장 저해제는 정의되지 않은 방사성 동위원소, 화학요법 약물, 단백질 또는 렉틴, 특히, 미국자리공 항바이러스 단백질, 아브린, 리신 및 이들 각각의 A 사슬들, 독소루비신, 시스플라스틴, 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188, 비스무트-212, 탁솔, 5-플루오로우라실, VP-16(에토포시드), 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, BCNU, 미토마이신, 시클로포스파미드, 및 TNF 및 TNF-β와 같은 사이토카인과는 다를 수 있다.
따라서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu의 방사성 동위원소, 예를 들어 Lu177, 및 Th227으로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소, 예를 들어, At211, Er169, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Lu의 방사성 동위원소, 예를 들어, Lu177, 및 Th227 또는 상기 제1 구현예에 정의된 세포독성제일 수 있다.
상기 제1 및 제2 구현예에서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 특히 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 예를 들어, DM1 또는 DM4, 토메이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, 크립토피신 유도체, 렙토마이신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 또는 CC-1065 또는 CC-1065 유사체, RNA 중합효소 II 저해제, 예를 들어, 알파-아마니틴에 있는 화합물의 약물 또는 전구 약물일 수 있다.
일 구현예에서, 적합한 토메이마이신은 토메이마이신 이량체이다. 상기 토메이마이신 이량체는, 예를 들어, (2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일) 비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4] 디아제핀-5(11aH)-온)이다.
(2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일) 비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4] 디아제핀-5(11aH)-온)의 구조는 아래와 같다.
Figure pct00001
본원에 사용된 "메이탄시노이드”는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체를 나타낸다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 저해하는 약물로서, 포유동물 세포에 매우 독성이 높다.
적합한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 포함한다.
적합한 메이탄시놀 유사체의 예는 변형된 방향족 고리를 가지는 것들 및 다른 위치에 변형을 가지는 것들을 포함한다. 적합한 메이탄시놀 유사체는 미국 특허 번호 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545에 개시되어 있다.
변형된 방향족 고리를 가지는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:
(1) C-19-데클로로(미국 특허 번호 4,256,746)(안사마이토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨);
(2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 번호4,361,650 및 4,307,016)(스트렙토마이세스 또는 액티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조); 및
(3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 번호 4,294,757)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조).
다른 위치에 변형을 가지는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:
(1) C-9-SH(미국 특허 번호 4,424,219)(H2S 또는 P2S5로의 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨);
(2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 번호 4,331,598);
(3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 번호 4,450,254)(노카디아(Nocardia)로부터 제조됨);
(4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 번호 4,364,866)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨);
(5) C-15-메톡시(미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 분리됨);
(6) C-18-N-데메틸(미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및
(7) 4,5-데옥시(미국 특허 번호 4,371,533)(메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조됨).
특정한 일 구현예에서, 본 발명의 세포독성 접합체는, 공식적으로 N 2' -데아세틸-N 2' -(3-머캅토-1-옥소프로필-메이탄신으로 명명된 티올을 함유하는 메이탄시노이드(DM1)를 세포독성제로 활용한다. DM1은 하기 구조 식 (I)로 나타낸다:
Figure pct00002
다른 구현예에서, 본 발명의 세포독성 접합체는, 공식적으로 N 2 ’-데아세틸-N 2 ’-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신으로 명명된, 티올을 함유하는 메이탄시노이드(DM4)를 세포독성제로 활용한다. DM4은 하기 구조 식 (II)로 나타낸다:
Figure pct00003
(II).
본 발명의 추가의 구현예에서, 황 원자를 지니는 탄소 원자 상에 단일 또는 이-알킬 치환을 지니는 티올 및 디설파이드 함유 메이탄시노이드를 포함하는 다른 메이탄신이 사용될 수 있다. 이러한 메이탄신은 C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 데스메틸에 방해를 받는 설프히드릴기를 지니는 아실기를 가지는 아실화된 아미노산 곁사슬을 가지되, 티올 기능성을 지니는 아실기의 탄소 원자가 하나 또는 두 개의 치환기를 가지고, 상기 치환기는 1 내지 10종의 시약 및 용액 내 존재하는 임의의 응집체를 가지는 CH3, C2H5, 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐인 메이탄시노이드를 포함한다.
이러한 세포독성제 및 접합의 방법의 예는 참조로서 포함된 출원 WO2008/010101에 더 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항체는 적어도 하나의 성장 저해제에 직접적으로 또는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커를 통해 공유적으로 부착된다.
본원에 사용된 "링커”는 공유 결합을 포함하는 화학적 모이어티 또는 폴리펩티드를 약물 모이어티에 공유적으로 부착하는 원자의 사슬을 의미한다.
이러한 접합체는 시험관 내 방법에 의해 제조될 수 있다. 약물 또는 전구약물을 항체에 연결시키기 위해, 연결기(linking group)가 사용된다. 적합한 연결기는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 디설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광 불안정기, 펩티다제 불안정기 및 에스테라제 불안정기를 포함한다. 본 발명의 항체의 세포독성제 또는 성장 저해제와의 접합은, 이에 제한되지는 않으나, N-석신이미딜 피리딜디티오부티레이트(SPDB), 부탄산 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르(니트로-SPDB), 4-(피리딘-2-일디설파닐)-2-설포-부티르산(설포-SPDB), N-석신이미딜(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), SNPP (N-석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)펜타노에이트), 석신이미딜 (N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미도티올레인(IT), 이미도에스테르의 이작용 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)-헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오로 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함하는 이작용 단백질 커플링제를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 등(1987)이 기술한 바와 같이 제조될 수 있다. 1-이소티오시아나토벤질 메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합하기 위한 예시적인 킬레이트제이다(WO 94/11026).
링커는 세포 내에서 세포독성제 또는 성장 저해제의 방출을 용이하게 하기 위한 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 에스테라제 불안정 링커, 광불안정 링커 또는 디설파이드 함유 링커(예컨대, 미국 특허 번호 5,208,020 참조)가 사용될 수 있다. 링커는 또한 몇몇 사례에서 더 나은 허용성을 야기할 수 있는 "절단 가능하지 않은 링커"(예를 들어, SMCC 링커)일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 및 세포독성 또는 성장 저해 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 링커 펩티드(접합체의 원하는 성질을 파괴하지 않음)를 암호화하는 부위에 의해 구분되는 접합체의 두 개의 부분을 암호화하는 각각의 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 폴리펩티드를 전구약물(예컨대, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물(예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 번호4,975,278 참조)로 전환하는 전구약물 활성화 효소에 접합시킴으로써 의존적 효소 매개 전구약물 치료법에서도 또한 사용될 수 있다. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 구성요소는 전구약물을 더욱 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소는, 이에 제한되지는 않으나, 인산염을 함유하는 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 알칼라인 포스파타제; 황산염을 함유하는 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 아릴설파타제; 비독성 플루오로시토신을 항암 약물 5-플루오로우라실로 전환하는 데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드를 함유하는 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 단백질 가수분해제, 예를 들어, 세라티아 단백질 가수분해제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신(예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환하는 데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 당화 전구약물을 유리 전구약물로 전환하는 데 유용한 탄수화물 절단 효소, 예를 들어, O-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; P-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 P-락타마제; 및 각각, 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 질소 아민에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함한다. 효소는 본 발명의 폴리펩티드에 당해 분야에 잘 알려진 기술, 예를 들어 위에서 논의된 이종이중작용 가교 시약의 사용을 통해 공유적으로 결합할 수 있다.
상기 제1 및 제2 구현예에 따르면, 본 발명의 접합체에서, 성장 저해제는 메이탄시노이드, 특히 DM1 또는 DM4일 수 있다.
이러한 접합체에서, 항체는 상기 적어도 하나의 성장 저해제에 연결기에 의해 접합된다. 특히, 상기 연결기는 절단 가능하지 않은 링커, 예를 들어, SPDB, 설포-SPDB, 또는 SMCC이다.
특히, 접합체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
i) 식 (III)의 항체-SPDB-DM4 접합체
Figure pct00004
ii) 식 (IV)의 항체-설포 SPDB-DM4 접합체
Figure pct00005
iii) 식 (V)의 항체-SMCC-DM1 접합체
Figure pct00006
추가의 일 구현예에서, 본 발명의 접합체에서, 성장 저해제는 토메이마이신, 예를 들어, 토메이마이신 이량체, 예를 들어, (2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일) 비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4] 디아제핀-5(11aH)-온)일 수 있다.
이러한 접합체에서, 항체는 상기 적어도 하나의 성장 저해제에 연결기, 예를 들어 SNPP에 의해 접합된다.
따라서, 일 구현예에서, 접합체는 항체-SNPP-(2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일)일 수 있다.
일반적으로, 접합체는 다음의 단계를 포함하는 과정에 의해 수득될 수 있다:
(i) 세포 결합제(예컨대, 본 발명에 따른 항체)의 선택적 완충 수용액을 링커 및 세포독성 화합물의 용액에 접촉시키기;
(ii) (i)에서 형성된 접합체를 반응하지 않은 세포 결합제로부터 선택적으로 분리하기.
세포 결합제의 수용액은, 예를 들어, 인산 칼륨, 아세트산염, 시트르산염 또는 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(허피스 완충액)과 같은 완충액으로 완충될 수 있다. 완충액은 세포 결합제의 성질에 의존한다. 세포독성 화합물은 유기 극성 용매, 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸아세트아미드(DMA) 중 용액에 존재한다.
반응 온도는 대개 20 내지 40도 사이로 구성된다. 반응 시간은 1 내지 24시간으로 변할 수 있다. 세포 결합제와 세포 독성제 사이의 반응은 굴절계 및/또는 UV 검출기를 구비한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 모니터링될 수 있다. 만일 접합체 수율이 너무 낮다면, 반응 시간을 연장할 수 있다.
단계 (ii)의 분리를 수행하기 위해 다수의 상이한 크로마토그래피 방법이 당업자에 의해 사용될 수 있다: 접합체는, 예컨대, SEC, 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, IEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화도 크로마토그래피, 혼합 지지체 크로마토그래피, 예를 들어, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제될 수 있다. 투석 또는 정용여과에 의한 정제도 또한 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용된 "응집체"라는 용어는 2종 이상의 세포 결합제 사이에 형성될 수 있는 결합을 의미하며, 상기 제제가 변형되거나 접합에 의한 것이 아니다. 응집체는 다수의 매개변수(예를 들어, 용액 내 세포 결합제의 높은 농도, 용액의 pH, 높은 전단력, 결합된 이량체의 숫자 및 이들의 소수성 특성, 온도)의 영향 하에 형성될 수 있고(Wang, L. and Gosh, R., 2008, J. Membr Sci . 318: 311-316 및 그 안에 인용된 참조를 참조); 이러한 매개변수 중 일부의 상대적인 영향은 명확하게 확립되지 않았다는 것을 주지한다. 단백질 및 항체의 경우에, 당업자는 Cromwell, M.E 등(2006, AAPS Jounal 8(3): E572-E579)을 참조할 것이다. 응집체 내 내용물은 SEC(Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480 참조)와 같은 당업자에게 잘 알려진 기술로 결정될 수 있다.
단계 (i) 또는 (ii) 이후, 접합체를 함유하는 용액은 크로마토그래피, 한외여과 및/또는 정용여과의 추가적인 단계(iii)를 거칠 수 있다.
접합체는 이러한 단계의 종료 시 수용액 내에서 회수된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 접합체는 DAR UV에 의해 측정된 1 내지 10, 예를 들어 2 내지 5, 특히 3 내지 4의 범위인 "약물-대 항체 비율"(또는 "DAR")을 특징으로 한다. 이러한 비율은 일반적으로 메이탄시노이드 분자를 포함하는 접합체의 경우이다.
DAR 숫자는 접합을 위해 사용되는 실험 조건(성장 저해제/항체 비율, 반응 시간, 용매 및 (만일 존재한다면) 공동용매의 성질과 같음)에 따라 사용되는 약물(즉, 성장 저해제) 및 항체의 성질에 의해 달라질 수 있다. 따라서, 항체 및 성장 저해제 사이의 접촉은 상이한 약물 대 항체 비율에 의해 서로 다른 몇몇 접합체; 선택적으로 있는 그대로의 항체; 선택적으로 응집체를 포함하는 혼합물을 야기할 수 있다. 결정된 DAR은 따라서 평균 값이다.
본원에서 DAR UV로 일컫어지는 DAR을 결정하기 위해 사용될 수 있는 방법은 실질적으로 정제된 접합체의 용액의 흡광도의 비율을 λD 및 280 nm에서 분광학적으로 측정하는 데 있다. 280 nm는 단백질 농도, 예를 들어 항체 농도를 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 파장이다. 파장 λD는 약물을 항체로부터 구분하는 것을 가능하게 하도록 선택되는데, 즉, 당업자에게 이미 알려진 바와 같이, λD는 약물이 높은 흡광도를 가지는 파장이고, λD는 약물 및 항체의 흡광도 피크 내의 실질적인 중첩을 피하기 위하여 280 nm로부터 충분히 떨어져 있다. λD는 메이탄시노이드 분자의 경우 252 nm가 되도록 선택될 수 있다. DAR 계산의 방법은 문헌(Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science)으로부터 유래하였다.
λD(AλD) 및 280 nm(A280)에서의 접합체에 대한 흡광도는 고전적인 분광광도계 기기("DAR 매개변수"의 계산을 가능하게 할 수 있음)를 사용하여 측정된다. 흡광도는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
AλD = (cD x εDλD) + (cA x εAλD)
A280 = (cD x εD280) + (cA x εA280)
여기서,
● cD 및 cA는 각각 약물 및 항체의 용액 내 농도이고
● εDλD 및 εD280은 각각 λD 및 280 nm에서의 약물의 몰 흡광 계수이고
● εAλD 및 εA280 은 각각 λD 및 280 nm에서 항체의 몰 흡광 계수이다.
두 개의 미지수를 가지는 이러한 두 개의 등식의 풀이는 다음의 등식을 야기한다:
cD = [(εA280 x AλD) - (εAλD x A280)] / [(εDλD x εA280) - (εAλD x εD280)]
cA = [A280 - (cD x εD280)] / εA280 .
다음으로, 평균 DAR을 항체의 농도에 대한 약물의 농도의 비율로부터 계산한다: DAR = cD / cA.
본 발명에 따른 면역접합체에서, 항체는 특히 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 특이적이다.
항체는 특히 키메라 또는 인간화 항체이다. 항체는 또한 항체 단편, 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다.
특히 본 발명의 면역접합체에 포함되는 것으로 고려되는, 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 하기 "항체" 섹션에서 더 자세히 기술된다.
항체
본 발명자들은 인간 LAMP1에 특이적으로 결합하고 비종양 조직으로부터 종양을 구분하는 4종의 항체(소위 항체 "MAb1", "MAb2", "MAb3" 및 "MAb4")를 확인하였다. 항체 MAb1, MAb2, MAb3는 최초로 세포 외에서 발현되는 LAMP1의 검출을 가능하게 하고, 이에 따라, 비암성 조직으로부터 암성 조직을 구분하기 위해 AFA(알코올 포르말린 아세트산 고정제) 및 동결-OCT(최적 절삭 온도) 검체에 대하여 IHC 분석을 수행하는 것을 가능하게 하였다.
그러나 환자 치료 전이나 환자 치료 중에 병원 또는 바이오뱅크로부터 얻은 종양 조직의 IHC 분석은 일상적으로 포르말린으로 고정된 파라핀 포매(FFPE) 시료에서 수행된다. MAb1, MAb2 및 MAb3이 동결-OCT 및 AFA(알코올 포르말린 아세트산 고정제) 시료 포맷에서 LAMP1 막 강화를 가능하게 하지만, 이들은 FFPE 포맷에서는 LAMP1 강화의 검출을 이끌 수 없다. 하나의 이유는 아마도 단백질의 복잡성과 조합된 포르말린 고정제의 효과일 것이다. 본 발명자들은 FFPE 포맷 상의 IHC 실험에 추가로 사용될 수 있고 따라서 본원에 제시된 방법의 FFPE 종양 바이오뱅크 및 FFPE 병원 시료에 대해 적용할 수 있는 단일클론 항체 MAb4의 생성을 가능하게 하는 펩티드를 발견하였다.
이러한 4종의 항체는 암 세포에서 세포 표면에 발현되는 LAMP1에 높은 결합 친화도(나노몰 범위 이내)를 나타내었다. 또한, 실시예 4.4에 나타낸 바와 같이, 적어도 항-LAMP1 MAb1, MAb2 및 MAb3 항체는 LAMP1/항-LAMP1 항체 복합체의 내재화를 촉발하는 높은 능력을 나타내었다.
추가적으로, 4종의 항체는 필리핀 원숭이 LAMP1과는 교차 반응하지만, 인간 LAMP2 단백질과는 어떠한 교차 반응성도 나타내지 않는다.
인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프, 특히 인간 LAMP1의 제1 루멘 도메인에 대해 항체 MAb1, MAb2 및 MAb3의 결합 자리가 매핑되어 있다. 보다 구체적으로, MAb1의 결합 자리는 루프 1 및 2에 매핑되었고, MAb2 및 MAb3의 결합 자리는 루프 1에 매핑되었다. 항체 MAb1 및 MAb2는 인간 LAMP1에 대한 결합에 대하여 서로 경쟁하지 않는다. 따라서, LAMP1 상에서 적어도 2개의 에피토프가 본 발명의 항체와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제3 내지 제4 루프로 이루어진 도메인, 특히 인간 LAMP1의 제4 루프에 대해 항체 MAb4의 결합 자리가 매핑되어 있다. 보다 구체적으로, 항체 MAb4는 서열 번호 82 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 아미노산 360 내지 375를 포함하는 루프 4의 부위에 결합한다.
본 발명자들은 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 대하여 유도된 이러한 단일클론 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 서열을 결정하였다.
소위 항체 "MAb1”은 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYSQKFKDKATLTADKSSSTTYMQLSRLTSEDSAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVSVSA(서열 번호 1, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인으로서, FR1-H은 아미노산 위치 1 내지 25에 걸쳐 있고, CDR1-H은 아미노산 위치 26 내지 33(서열 번호 2)에 걸쳐 있고, FR2-H는 아미노산 위치 34 내지 50에 걸쳐 있고, CDR2-H는 아미노산 위치 51 내지 58(서열 번호 3)에 걸쳐 있고, FR3-H는 아미노산 위치 59 내지 96에 걸쳐 있고, CDR3-H는 아미노산 위치 97 내지 107(서열 번호 4)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 108 내지 118에 걸쳐 있는 도메인, 및
- 서열 DIQMTQSPPSLSASLGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKGPRLLIHDTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK(서열 번호 5, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인으로서, FR1-L는 아미노산 위치 1 내지 26에 걸쳐 있고, CDR1-L는 아미노산 위치 27 내지 32(서열 번호 6)에 걸쳐 있고, FR2-L는 아미노산 위치 33 내지 49에 걸쳐 있고, CDR2-L은 아미노산 위치 50 내지 52에 걸쳐 있고, FR3-L은 아미노산 위치 53 내지 88에 걸쳐 있고, CDR3-L은 아미노산 위치 89 내지 96(서열 번호 7)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 97 내지 106에 걸쳐 있는 도메인.
소위 항체 "MAb2"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYFNPSSGYPEYNQKFKDKTTLTADKSSNTAFIQLNSLTSEDSAVYYCSRGYYYGSRGYALDFWGQGASVTVSS(서열 번호 8, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인으로서, FR1-H는 아미노산 위치 1 내지 25에 걸쳐 있고, CDR1-H는 아미노산 위치 26 내지 33(서열 번호 9)에 걸쳐 있고, FR2-H는 아미노산 위치 34 내지 50에 걸쳐 있고, CDR2-H는 아미노산 위치 51 내지 58(서열 번호 10)에 걸쳐 있고, FR3-H는 아미노산 위치 59 내지 96에 걸쳐 있고, CDR3-H는 아미노산 위치 97 내지 111(서열 번호 11)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 112 내지 122에 걸쳐 있는 도메인, 및
- 서열 NIVLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDINGNTFMHWYQQKPGQSPKLVIYAASNIESGVPARFSGSGSSTDFTFTIDPVEADDVATYYCQQFNIEDPWTFGGGTKVEIK(서열 번호 12, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 군의 경쇄의 가변 도메인으로서, FR1-L은 아미노산 위치 1 내지 26에 걸쳐 있고, CDR1-L은 아미노산 위치 27 내지 36(서열 번호 13)에 걸쳐 있고, FR2-L은 아미노산 위치 37 내지 53에 걸쳐 있고, CDR2-L은 아미노산 위치 54 내지 56에 걸쳐 있고, FR3-L은 아미노산 위치 57 내지 92에 걸쳐 있고, CDR3-L은 아미노산 위치 93 내지 101(서열 번호 14)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 102 내지 111에 걸쳐 있는 도메인.
항체 MAb2의 변이형(본원에서, "MAb2Can"으로 지칭됨)도 또한 중쇄의 가변 도메인 내 A116T의 치환 및 경쇄의 가변 도메인 내 V9A, V51L, I58L, S72G 및 A108T의 치환으로 표준 잔기를 도입함으로써 생성하였다.
소위 "항체 MAb2 Can"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYFNPSSGYPEYNQKFKDKTTLTADKSSNTAFIQLNSLTSEDSAVYYCSRGYYYGSRGYALDFWGQGTSVTVSS(서열 번호 15)로 이루어진 군의 중쇄의 가변 도메인
- 서열NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDINGNTFMHWYQQKPGQSPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTFTIDPVEADDVATYYCQQNIEDPWTFGGGTKLEIK(서열 번호 16)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인.
"MAb2Can" 및 "MAb2"는, 키메라 형태 하에, 인간 LAMP1에 대하여 동일한 친화도를 가진다(표 13 참조).
소위 항체 "MAb3"은 다음을 포함한다:
- 서열 Q QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGESRYADDFKGRFALSLETSASTAYLQINNLENEDMATYFCAREDYYGNSPWFFDVWGAGTTVTVSS(서열 번호 42, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인으로서, FR1-H는 아미노산 위치 1 내지 25에 걸쳐 있고, CDR1-H는 아미노산 위치 26 내지 33(서열 번호 43)에 걸쳐 있고, FR2-H는 아미노산 위치 34 내지 50에 걸쳐 있고, CDR2-H는 아미노산 위치 51 내지 58(서열 번호 44)에 걸쳐 있고, FR3-H는 아미노산 위치 59 내지 96에 걸쳐 있고, CDR3-H는 아미노산 위치 97 내지 111(서열 번호 45)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 112 내지 122에 걸쳐 있는 도메인, 및
- 서열 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCNASQGINKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEPEDIATYYCQQYTKLPFTFGSGTKLEIK(서열 번호 46, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인으로서, FR1-L은 아미노산 위치 1 내지 26에 걸쳐 있고, CDR1-L은 아미노산 위치 27 내지 32(서열 번호 47)에 걸쳐 있고, FR2-L은 아미노산 위치 33 내지 49에 걸쳐 있고, CDR2-L은 아미노산 위치 50 내지 52에 걸쳐 있고, FR3-L은 아미노산 위치 53 내지 88에 걸쳐 있고, CDR3-L은 아미노산 위치 89 내지 97(서열 번호 48)에 걸쳐 있는, 도메인.
MAb3("MAb3 VL R24 R93")의 변이형은 일반적으로 다음의 아미노산 치환을 MAb3의 VL 서열 내에 도입함으로써 생성되었다: N24R 및 K93R. 따라서, MAb3 VL_R24_R93의 경쇄 가변 도메인은 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQGINKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEPEDIATYYCQQYT R LPFTFGSGTKLEIK(서열 번호 51)(MAb3의 VL과 비교하여 돌연변이된 잔기를 밑줄친 문자로 나타냄)로 이루어진다.
MAb3 VL_R24_R93의 CDR3-L은 따라서 QQYTRLPFT(서열 번호 52)로 이루어진다.
소위 항체 "MAb4"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARYRSYDWYFDVWGAGTTVTVSS(서열 번호 88, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인으로서, FR1-H 은 아미노산 위치 1 내지 25에 걸쳐 있고, CDR1-H은 아미노산 위치 26 내지 33(서열 번호 83)에 걸쳐 있고, FR2-H은 아미노산 위치 34 내지 50에 걸쳐 있고, CDR2-H은 아미노산 위치 51 내지 58(서열 번호 84)에 걸쳐 있고, FR3-H은 아미노산 위치 59 내지 96에 걸쳐 있고, CDR3-H은 아미노산 위치 97 내지 108(서열 번호 85)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 109 내지 119에 걸쳐 있는 도메인, 및
- 서열 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRVSGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSNPYTFGGGTKLEIK(서열 번호 89, CDR은 굵은 글씨로 나타냄)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인으로서, FR1-L은 아미노산 위치 1 내지 26에 걸쳐 있고, CDR1-L은 아미노산 위치 27 내지 32(서열 번호 86)에 걸쳐 있고, FR2-L은 아미노산 위치 33 내지 49에 걸쳐 있고, CDR2-L은 아미노산 위치 50 내지 52에 걸쳐 있고, FR3-L은 아미노산 위치 53 내지 88에 걸쳐 있고, CDR3-L은 아미노산 위치 89 내지 97(서열 번호 87)에 걸쳐 있고, FR4-H는 아미노산 위치 98 내지 107에 걸쳐 있는, 도메인.
항체는 또한 인간화 항체 또는 인간화 항체의 단편일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 임의의 위에서 정의된 항체의 인간화로부터 초래될 수 있다.
항체 서열의 인간화를 위한 다수의 방법들이 당해 분야에 알려져 있는데, 예를 들어 Almagro & Fransson에 의한 리뷰((2008) Front Biosci. 13: 1619-1633)를 참조한다. 하나의 통상적으로 사용되는 방법은 CDR 그래프팅, 또는 항체 재성형으로서, 공여자 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열을 상이한 특이성의 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드 내로 그래프팅하는 것을 수반한다. CDR 그래프팅은 결합 특이성 및 친화도, 및 이에 따른 모 항체의 생물학적 활성을 낮출 수 있고, 모 항체의 결합 특이성 및 친화도를 보유하기 위해 CDR이 그래프팅된 항체의 선택된 위치에 역돌연변이가 도입될 수 있다. 가능한 역돌연변이의 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 입수가능한 정보를 사용하여 수행될 수 있다. CDR 그래프팅 및 역돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술은 표면치환(resurfacing)으로, 비인간 기원의 비표면 노출 잔기는 보유하는 반면 표면 잔기는 인간 잔기로 변경하는 것이다. 다른 대안적인 기술은 "유도되는 선택"(Jespers, L.S. et al., 1994, Biotechnology 12(9): 899-993)으로 알려져 있고, 쥐 항체로부터 모 항체의 에피토프 및 결합 특성을 보존하는 완전한 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 출원 WO2009/032661에 개시된 분자 동역학 계산에 기반한 인간화 기술이 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 인간화 항체는 또한 "표면치환" 항체로 일컫어질 수 있다.
키메라 항체에 대해서, 인간화는 통상적으로 가변 부위 서열의 프레임워크 부위의 변형을 수반한다.
CDR의 일부인 아미노산 잔기는 통상적으로 인간화와 관련하여 변형되지 않을 것이지만, 일정 경우에서는 개별적인 CDR 아미노산 잔기를 변형하는 것, 예를 들어, 당화 자리, 탈아미드화 자리, 원치 않는 시스테인 잔기, ADC의 경우 라이신 잔기를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. N-결합 당화는 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 내(여기서, X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) 아스파라긴 잔기에 대한 올리고당 사슬의 부착에 의해 발생한다. N-당화 자리의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기 중 하나를 상이한 잔기로, 특히 보존적 치환의 방식으로 돌연변이화시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자들에 의존하여 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly 내에 존재하는 경우 특히 탈아미드화되기 쉽고, Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열 내에서는 덜하다. 이러한 탈아미드화 자리, 특히 Asn-Gly이 CDR 서열 내에 존재하는 경우, 따라서, 연루된 잔기 중 하나를 제거하기 위해 통상적으로 보존적 치환으로 이러한 자리를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. ADC의 경우, mAb에 대한 세포독성의 부착은 라이신 곁사슬 잔기에 대한 공유 결합을 통하여 제조될 수 있다. 이러한 입체 장애는 항원에 대한 mAb의 결합을 방해할 수 있다. 따라서, 라이신 잔기를, 통상적으로는 아르기닌 보존적 치환에 의해 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 연루된 잔기 중 하나를 제거하기 위한 CDR 서열 내에서의 치환이 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명자들은 실시예 7.2.1 및 본원의 아래에 기술된 분자 동역학 궤적(4D 인간화 프로토콜) 및/또는 CDR 그래프팅에 기반하여 인간화 항체 "huMAb1_1", "huMAb1_2", "huMAb1_3"를 더 생성하였다.
따라서, 일 구현예에서, 항-LAMP1 항체는, 본 발명의 문맥 내에서, CDR 그래프팅 및/또는 분자 동역학 궤적(4D 인간화 프로토콜)에 기반하여 수득된 인간화 항-LAMP1 항체이다.
따라서, 일 구현예에서, 인간화 항-LAMP1 항체 "huMAb1_1"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYSQKFQGKATLTADTSTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVTVSS(서열 번호 53)으로 이루어진 중쇄 사슬의 가변 도메인(VH1) 및
- 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKAPRLLIHDTSTLQSGVPSRFSGSGSGRDYTLTISNLEPEDFATYYCLQYDNLWTFGGGTKVEIK(서열 번호 56)으로 이루어진 huMAb1_1의 경쇄의 가변 도메인(VL1).
인간화 항체 "huMAb1_2"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYSQKFQDRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDSAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVSVSS(서열 번호 54)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인(VH2)
- 서열 DIQMTQSPPSLSASVGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQDKPGKGPKLLIHDTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK(서열 번호 57)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인(VL2).
인간화 항체 "huMAb1_3"는 다음을 포함한다:
- 서열 QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTNYNIHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYAQKFQGRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDTAVYYCVRANWDVAFAYWGQGTLVTVSS(서열 번호 55)로 이루어진 중쇄의 가변 도메인(VH3)
- 서열 DIQMTQSPSSLSASVGGKVTITCKASQDIDRYMAWYQQKPGKGPKLLIHDTSTLQPGVPSRFSGSGSGRDYSLTISSLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIK(서열 번호 58)로 이루어진 경쇄의 가변 도메인(VL3).
본 발명은 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
“친화도”는, 이론적으로, 전체 항체 및 항원의 평형 관계에 의해 정의된다. 친화도는 표면 플라스몬 공명으로 결합 및 해리 속도를 측정하는 방법 또는 면역화학 검정법(ELISA, FACS)에서 EC50을 측정하는 방법과 같은 다양한 알려진 방법들에 의해 평가될 수 있다. 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA)은 액체 시료 또는 젖은 시료 내에서 물질, 대개 항원의 존재를 검출하기 위해 고체상 효소 면역검정법을 사용하는 생화학 검정법이다. 시료로부터의 항원은 표면에 부착된다. 그런 다음, 추가의 특이적인 항체가 표면 위에 적용되고, 따라서 항체는 항원에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 효소에 연결되고, 마지막 단계에서, 효소의 기질을 함유하는 물질이 첨가된다. 이어지는 반응은 검출가능한 신호, 가장 흔하게는 기질 내 색상 변화를 생성한다. 형광 활성 세포 분류(FACS)는 생물학적 세포의 이종 혼합물을 특이적인 광 산란 및 각 세포의 형광 특성에 기반하여 한 번에 1가지 세포씩, 2종 이상의 용기에 분류하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 검정법에서, EC50은 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정법)에 의한 항원의 정의된 농도 또는 FACS(형광 활성 세포 분류)에 의해 항원을 발현하는 세포에 대하여 일부 명시된 노출 시간 이후 기준값과 최대값 사이의 절반의 반응을 유도하는 항체의 농도이다.
항원 1(Ag1)에 결합하는 단일클론 항체는 EC50들이 두 개의 항원에 대하여 유사한 범위 이내인 경우에 항원 2(Ag2)에 대해 "교차 반응성”이다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단일클론 항체는 Ag1의 친화도에 대한 Ag2의 친화도의 비율이 10 미만(특히, 5, 2, 1 또는 0.5)인 경우 Ag2에 교차 반응성이며, 2종의 항원에 대한 친화도는 동일한 방법으로 측정된다.
Ag1에 결합하는 단일클론 항체는 2종의 항원에 대한 친화도가 매우 상이한 경우 Ag2에 "유의하게 교차 반응하지 않는다." Ag2에 대한 친화도는 결합 반응이 매우 저조한 경우에는 측정할 수 없다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단일클론 항체는, 동일한 실험 설정 및 동일한 항체 농도에서 Ag2에 대한 단일클론 항체의 결합 반응이 Ag1에 대한 동일한 단일클론 항체의 결합 반응의 5% 미만인 경우에 Ag2에 유의하게 교차-반응하지 않는다. 실질적으로, 사용되는 항체 농도는 EC50 또는 Ag1로 수득되는 포화도 안정기에 도달하기 위해 요구되는 농도일 수 있다.
단일클론 항체는 Ag2에 유의하게 교차 반응하지 않는 경우에 Ag1에 "특이적으로 결합한다."
본 발명에 따른 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 특이적으로 결합한다. 항체는 인간 LAMP2(서열 번호 40)과 유의하게 교차 반응하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 세포 주의 세포 표면에서 발현되는 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대하여 친화도(EC50)를 가지되, 세포 주는 HEK293 및/또는 HCT116일 수 있고, 유동세포계수법을 통해 측정된 겉보기 친화도는 70 nM 이하, 예를 들어, ≤60 nM, ≤ 50 nM, ≤ 45 nM, ≤ 40 nM, ≤ 35 nM, ≤ 30 nM, ≤ 25 nM, ≤ 20 nM, = 15 nM 또는 ≤ 10 nM이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 세포 주의 세포 표면에서 발현되는 전장 인간 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대하여 친화도(EC50)를 가지되, 세포 주는 HCT116 일 수 있고, 유동세포계수법을 통해 측정된 겉보기 친화도는 20 nM 이하, 특히 ≤10 nM, ≤ 8 nM 또는 ≤ 7 nM이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 세포 주의 표면에서 발현되는 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대하여 친화도(EC50)를 가지되, 세포 주는 HEK293일 수 있고, 유동세포계수법을 통해 측정된 겉보기 친화도는 50 nM 이하, 예를 들어 ≤40 nM 또는 ≤ 35 nM이다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 HEK293 세포에서 발현되는 전체 정제된 인간 LAMP1(서열 번호 28)에 대하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 측정된 KD를 가지며, 70 nM 이하, 예를 들어, ≤60 nM, ≤ 50 nM, ≤ 40 nM, ≤ 30 nM, ≤ 20 nM 또는 ≤ 10 nM이다.
결정을 위한 표면 플라스몬 공명의 사용은 당업자에게 알려져 있다. 일 실시예에서, 예를 들어 쥐, 키메라 또는 인간화 항-LAMP1 mAb의 결합 역학은 통상적으로 BIAcore 2000(BIAcore Inc., Uppsala, NJ)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정법으로 결정하였다. 따라서, 예를 들어, CM5 BIAcore 생물센서 칩을 기기 내에 도킹하고, 예를 들어 70 μL의 1:1 NHS/EDC로 상온에서 활성화하였다. 통상적으로, 마우스 항-α인간 Fc IgG1(BIAcore #BR-1008-39) 및 토끼 항-α쥐 Fc IgG1(BIAcore #BR-1008-38)(1 M 아세테이트 완충액 중 50 μg/mL, pH5)을 모든 유동 세포 내 활성화된 칩 상에 고정시켰다. 고정화는 예를 들어 10 μL/분의 유속으로 포화될 때까지 수행하였다. 그런 다음 칩을, 예를 들어, 70 μL의 에탄올아민-HCl, pH 8.5의 주입으로 차단하고, 항-α인간 Fc IgG1에 대해 3 M MgCl2로의 1회의 세척 및 항-α쥐 Fc IgG 1에 대해 10 mM 글리신-HCl pH 1.7로의 1회의 세척이 이어졌다. 예를 들어, 항-LAMP1 mAb의 LAMP1에 대한 결합을 측정하기 위해, 항체를 BIAcore 러닝 완충액(HBS-EP) 중 1 내지 5 μg/mL로 사용하였다. 항원, 예를 들어, (실시예 6.2에 기술된 바와 같이 생성된 서열 번호 28 단백질)을, 예를 들어, 1 내지 256 nM로 주입하였다. 주입기 완료 후, 해리를 BIAcore 러닝 완충액 내에서 동일한 유속으로 통상적으로 600초 간 모니터링하였다. 표면을 통상적으로, 예를 들어 2 x 5 μL 3 M MgCl2(2 x 30 s) 또는 항-α인간 Fc IgG1 및 항-α쥐 Fc IgG1에 대하여 1 x 30 μL 10 mM 글리신-HCl pH 1.7(180 s)을 사용한 주입들 사이에서 재생성하였다. 개별적인 센서그램은 통상적으로 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 원숭이에서 수행되는 독성 연구에 사용될 수 있으며, 이러한 연구로부터 얻어진 독성 프로파일은 인간에서의 예상되는 잠재적 부작용에 관련된다.
대안적으로, 또는 나아가, 본 발명에 따른 항체는 진행성 인간 원발성 대장 종양 CR-IGR-034P의 표면에 발현된 LAMP1에 대하여 친화도(EC50)를 가지고 유동세포계수법에 의해 측정된 ≤50nM, ≤40nM, 특히, ≤30nM, ≤20nM 또는 ≤ 5 nM이다.
항체 결합능 또는 ABC는 세포 표면 항원을 정량화한 것이다. ABC는 QIFIKIT®(BIOCYTEX의 등록 상표명)을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 상이한 기원의 많은 환자들로부터 유래한 이종이식편(≥ 20.000, 특히 ≥ 50.000, ≥ 100.000, ≥ 150.000 ABC) 및 종양 세포 주, 특히 Colo205, SW480 또는 LS174T와 같은 대장 종양 세포(≥ 1.500, ≥ 2.500, ≥ 4.000 ABC)에 대해 높은 ABC를 가진다.
대안적으로, 또는 나아가, 본 발명에 따른 항체는 LAMP1을 세포 막으로 재순환시키거나 내재화하는 능력을 가진다. 특히, 본 발명에 따른 항체에 결합될 때, 암 세포의 막에서 LAMP1의 분자는 세포 막에서 적어도 1, 4, 7, 또는 9회의 재순환을 거칠 수 있는 능력을 가진다. 다시 말해, 암 세포의 표면에 발현되는 하나의 분자의 LAMP1은 본 발명에 따른 항체의 적어도 2, 5, 8, 또는 10개의 분자에 의해 결합되고 이에 따라 내재화될 수 있다. 다시 말하자면, 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 적어도 2, 5, 8, 또는 10개의 분자는 암 세포의 표면에 발현된 하나의 분자의 LAMP1에 의해 내재화된다.
내재화는 예를 들어 내재화 점수를 결정하거나 형광 기반 ?칭법에 의해 분석될 수 있다.
내재화 점수(IS)는 전체 세포의 강도에 대한 세포 내 형광 강도의 비율로 정의된다. 내재화 점수는 영상 유동세포계측기 ImageStreamx(공급자 Amnis® Corporation, 2505 Third Avenue, Suite 210, Seattle, WA 98121-1480, www.amnis.com)을 사용하여 기술한 바와 같이 측정될 수 있다. 점수가 높을수록, 세포 내 형광 강도가 크다. Amnis(www.amnis.com 참조)에 의해 기술된 바와 같이, 세포의 내부는 세포의 막에 해당하는 마스크의 침식으로 정의된다. 점수는 세포 크기에 따라 변하지 않으며, 농축된 밝은 부위 및 작고 어두운 점을 수용할 수 있다. 비율은 {-inf, inf} 사이의 값들의 동역학 범위를 증가시키기 위해 로그 스케일로 매핑된다. 막의 두께(픽셀)는 어떠한 픽셀이 세포의 경계 및 막 부위를 정의하기 위해 사용되는지를 결정한다. 사용자는 세포의 내부를 포함하는 명시 야상, 픽셀로 나타낸 막의 두께 및 관심 있는 형광 채널에 기반하여 '내부' 마스크를 공급한다. 세포는 외부(B) 및 내부(I)의 두 개의 부위로 나누어진다. 사용자는 마스크로서 내부 부위를 공급한다. 외부 부위는 다음에 의해 결정된다: 1. 막 두께에 의해 내부 마스크를 확장 2. 1과 관심 있는 채널의 대상 마스크를 조합. 3. 외부 부위는 마스크 2와 동일하고 내부 마스크와는 동일하지 않다. 다음으로, 각 부위에서 픽셀의 상위사분위수의 평균 강도를 결정한다. 내재화 점수(IS)를, 그런 다음, 다음과 같이 계산한다:
Figure pct00007
여기서,
Figure pct00008
mI = I 내 상위사분위수 픽셀의 평균 강도, mB = B 내 상위사분위수 픽셀의 평균 강도,
pI = I 내 상위사분위수 픽셀의 피크 강도, pB = B 내 상위사분위수 픽셀의 피크 강도.
트렌스페린의 경우(Williams A. et al., 1996, Biomembranes, 4:255-287), 저자는 세포를 얼음에 방치하였을 때 0의 IS를 수득하였고, 세포를 37에서 1시간 동안 항온배양하였을 때 0.9의 IS를 수득하였다.
본 발명의 항체에 대하여, 본 발명자들은 37에서의 내재화 점수(IS)가 4에서보다 10배 더 높다는 것을 보여주었다. 항체의 내재화가 4에서는 일어나지 않기 때문에, 4에서 수득된 내재화 점수는 세포 표면에서의 LAMP1 분자의 밀도를 반영한다. 4에서보다 10배 높은 37에서의 IS 매개변수는 따라서 LAMP1 단백질이 세포 막에서 빠르고 반복적으로 재순환된다는 것을 의미한다. 다시 말해, 본 발명에 따른 항체는 세포 표면의 LAMP1 단백질의 밀도로부터 계산된 능력보다 훨씬 더 높은, 매우 높은 내재화능을 가진다.
내재화의 정량화는 또한 형광 기반 ?칭법으로 수행할 수 있다. 특히, 표적 항원의 내재화를 분석하기 위한 형광 기반 Alexa488-?칭법이 기술되어 있다(Frejd et al. 2010, International Journal of Oncology, 36: 757-763). 상기 기술에 따르면, 내재화는 하기의 식을 따라 37에서 ?치된 세포(세포내 구획 단독)의 평균 형광 강도(MFI) 값을 ?치되지 않은 세포(세포 표면 및 세포내 구획 모두)의 MFI 값으로 나누어서 계산한다:
내재화된 분획의 백분율:
Figure pct00009
Alexa488-라벨링된 화합물로 4에서 항온배양한 세포를 대조군으로 사용하였는데, 이는 항체의 내재화가 4℃에서는 일어나지 않기 때문이다.
본 발명자들은 ?칭 후에, 4시간 후 37에서 라벨링된 세포(세포 표면 및 세포내 구획 모두)로부터 측정된 Alexa488-MAb1의 총 형광이 4에서 라벨링된 세포(세포 표면)의 형광보다 10배 더 높다는 것을 보여주었다(실시예 4.4). 따라서, 이러한 결과는 또한 LAMP1 단백질이 세포 막에서 빠르고 반복적으로 재순환된다는 것을 나타낸다.
이에 따라, 본 발명자들은 최초로 LAMP1이 항체의 내재화를 매개하는 수용체로서 작용할 수 있다는 것을 보여주었고, 특이적 내재화 항체의 유용성이 암 세포의 내부에 특이적으로 전달될 독소, 약물 또는 단범위 동위원소를 표적으로 하는 신규 치료법을 개발하는 것을 도울 수 있을 것이라는 것을 시사한다.
나아가, 본 발명자들은 종합적으로 실시예 4.4로부터의 결과는 각 LAMP1 분자가 실험 과정 중에 세포 막에서의 재순환을 통해 몇몇(적어도 평균적으로 최대 10개) 내재화 순환주기에 관련된다는 것을 나타낸다는 것을 보여줄 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의, 특히, 제1 내지 제3 루프에 있는 도메인에 특이적으로 결합한다. 인간 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Ile309에 의해 정의되고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인은 서열 번호 39의 아미노산 서열 Ala27 내지 Thr307에 의해 정의된다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인에 특이적으로 결합한다.
인간 LAMP1의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 24의 위치 Ala29 내지 Arg195의 아미노산에 의해 정의되고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 39의 위치 Ala27 내지 Arg193의 아미노산에 의해 정의된다. 보다 구체적으로, 항체는 가용성 세포외 도메인(예컨대, 인간 LAMP1(서열 번호 24)에 대하여 아미노산 Ala29-Met382 또는 필리핀 원숭이 LAMP1(서열 번호 39)에 대하여 Ala27-Met380)으로 발현되거나 세포 주(예를 들어, HT29, Colo205 및 HCT116, HEK293 세포 주)의 표면에 재조합적으로 발현된 막-고정 전장 LAMP1 단백질로 발현되는지에 관계없이 인간 및 필리핀 원숭이 제1 루멘 도메인에 차별 없이 결합할 수 있다. 본 발명자들은, 본원의 실시예 4.8에 기술된 바와 같이, MAb1이 인간 LAMP1의 루프 2에 해당하는 서열 번호 24의 아미노산 101 내지 195, 예를 들어 서열 번호 24의 아미노산 101 내지 110(서열 번호 72), 144 내지 157(서열 번호 73) 및 174 내지 188(서열 번호 74)에 결합한다는 것을 입증하였다. MAb1의 결합 자리가 서열 번호 24의 루프 1에 위치한 아미노산 Asn35, Cys80, Gly 81, Glu83, Asn84을 더 포함한다는 것을 결정학적으로 추가로 확인하였다.
따라서, MAb1은, 또한, 인간 LAMP1의 루프 1에 해당하는 서열 번호 24의 위치 29 내지 100의 아미노산, 예를 들어 서열 번호 24의 위치 35 내지 84의 아미노산(서열 번호 97)으로 이루어진 부위 또는 서열 번호 24의 위치 80 내지 84 아미노산 및 서열 번호 24의 Asn35로 이루어진 2개의 부위에도 결합한다.
나아가, MAb2 및 MAb3는 인간 LAMP1의 루프 1에 해당하는 서열 번호 24의 아미노산 29 내지 100(서열 번호 77)에 결합하는데, 예를 들어, MAb2 및 MAb3는 서열 번호 24의 아미노산 29 내지 41(서열 번호 75) 및 68 내지 80(서열 번호 76)에 결합한다.
추가의 항체에서, 본 발명의 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제2 루멘 도메인, 예를 들어 제4 루프에 특이적으로 결합한다.
인간 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 24의 위치 Leu310 내지 Met382의 아미노산으로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 39의 위치 Leu 308 내지 Met380로 이루어진다.
보다 구체적으로, 항체는 서열 번호 82로 이루어진 인간 LAMP1의 아미노산 360 내지 375를 포함하는 루프 4의 부위에 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 비당화 형태 또는 당화 형태인지에 관계없이 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질에 차별 없이 특이적으로 결합한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음에 결합하는 항체에 관한 것이다:
- 각각, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 및 서열 번호 74 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 2의 3개의 부위 및 선택적으로 추가로 서열(서열 번호 97)로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 1; 또는
- 각각, 서열 번호 75 및 서열 번호 76 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 1의 2개의 부위; 또는 76,
- 서열 번호 82 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 4의 부위.
또한, 본 발명자들은, 실시예 6.5에 기술된 바와 같이, 서열 번호 24의 잔기 R146, D150, K152, R106, A108, N181, S182, S183, R186 및 G187을 MAb1와 상호작용할 가능성이 있는 것으로 확인하였다. 본 발명자들은 서열 번호 24의 잔기 A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75, 및 R77를 MAb2 및/또는 MAb3와 상호작용할 가능성이 있는 것으로 추가로 확인하였다. 이러한 잔기들은 실시예 6.6에 기술된 바와 같이 hLAMP1_ΔGYQTI로부터 유래된 LAMP1 서열에서 알라닌 잔기에 의해 개별적으로 교체되고, pXL5626에 개별적으로 암호화된다. 본 발명자들은 LAMP1 단백질에서 서열 번호 24의 위치 I149, D150 및 R186에서의 알라닌 돌연변이의 경우 MAb1에 대한 결합의 소실을 관찰하였고, 이는 이러한 위치들이 LAMP1에 대한 MAb1의 결합에 중요하다는 것을 나타낸다. 또한, 서열 번호 24의 위치 G38 및 D70에서의 알라닌 돌연변이의 경우 LAMP1 단백질 내 Ala 치환으로 인해 MAb3에 대한 LAMP1의 결합의 소실이 입증되었고, 이는 이러한 위치가 LAMP1에 대한 MAb3의 결합에 중요하다는 것을 나타낸다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음에 결합하는 항체에 관한 것이다:
- 서열 번호 24의 아미노산 I149, D150 및 R186, 또는
- 서열 번호 24의 아미노산 G38 및 D70, 또는
본 발명은 또한 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인에 결합하기 위해 소위 Mab1, Mab2, MAb2Can, MAb3, MAb3 VL_R24_R93, huMAb1_1 및 huMAb1_2, huMAb1_3으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 즉
(i) 서열 번호 1의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 5의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(ii) 서열 번호 8의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 12의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(iii) 서열 번호 15의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 16의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(iv) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 46의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(v) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 51의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(vi) 서열 번호 53의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 56의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(vii) 서열 번호 54의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 57의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는
(viii) 서열 번호 55의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 58의 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인에 결합하기 위하여 경쟁한다. 예를 들어, 본 발명은,
- 각각, 서열 번호 72, 서열 번호 73 및 서열 번호 74 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 2의 3개의 부위; 또는
- 각각, 서열 번호 75 및 서열 번호 76 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 1의 2개의 부위에 결합하기 위해,
적절하게, 위의 i~viii)에 정의된 바와 같은 경쇄의 가변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인을 포함하는 (즉, 위의 i 및 vi~viii)에 따라 정의된 항체에 대해 루프 2의 상기 3개의 부위를 가지거나 ii~v)에 따라 정의된 항체에 대해 루프 1의 상기 2개의 부위에 가지는) 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
일 구현예에서, 경쟁은 본 명세서의 실시예 4.8에 기술된 바와 같이 ELISA의 사용에 의해 결정되는데, 경쟁은 2종의 경쟁 항체가 용액 내에 유사한 몰 농도로 존재할 때, 흡수로 평가하는 mAb 대조군 단독에 비교하여 신호의 80% 미만인 신호에 의해 정의되며, 경쟁은 80% 미만, 예를 들어, _70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만의 신호에 의해 정의된다.
소위 MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3_VLR24-R93, huMAb1_1, huMAb1_2 및 huMAb1_3(이하에서 "참조" 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 가변 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체와 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어진 도메인, 특히 제1 루멘 도메인에 결합하기 위해 경쟁하는 항체의 능력은, 예를 들어, 경쟁적 ELISA에 의해 용이하게 분석될 수 있고, 이때 항원(즉, LAMP1의 제1 내지 제3 루프, 또는 제1 루멘 도메인을 포함하는 인간 또는 필리핀 원숭이 LAMP1의 단편을 포함하거나 이의 단편으로 이루어진 폴리펩티드, 특히 실시예 6.3에 제시된 것과 같은 인간 및 시노몰구스 기원으로부터의 LAMP1의 제1 도메인을 함유하는 단백질)은 고체 지지체에 결합하고, 후보 항체 및 참조 항체를 각각 함유하는 2종의 용액이 첨가되고, 항체는 항원에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다. 그런 다음, 항원에 결합된 참조 항체의 양을 측정하여, 음성 대조군에 대해 측정하였을 때, 항원에 결합된 참조 항체의 양과 비교할 수 있다. 후보 항체의 존재 하에서 결합된 참조 항체의 양이 음성 대조군의 존재 하에서의 결합된 참조 항체의 양과 비교할 때 감소되었음은 후보 항체가 참조 항체와 경쟁하였음을 나타낸다. 편리하게도, 참조 항체를 (예컨대, 형광으로) 표지하여, 결합된 참조 항체의 검출을 용이하게 할 수 있다. 후보 및/또는 참조 항체의 단계별 희석액으로 반복된 측정을 수행할 수 있다.
다른 실시예에서, MAb1과 MAb2 또는 MAb3 사이의 결합 경쟁은 통상적으로 2종의 항-LAMP1 mAb 사이에서 플레이트 상에 코팅된 재조합 인간 LAMP1을 사용한 ELISA에 의해 측정된다(실시예 6.2에 기술된 바와 같음). 간략하게, 통상적으로 2종의 mAb를, 예를 들어 0.06 및 15 mg/L의 농도로 동시에 첨가하였는데, 통상적으로 0.06 mg/L의 농도는 EC50에 가깝다. 2종의 mAb가 상이한 Fc 도메인(인간 또는 쥐)을 가지도록 MAb 포맷을 선택하였다. mAb 결합의 개별적인 측정은 통상적으로 Fc에 대한 mAb의 고유의 특이적 결합에 의해 (예를 들어, 페록시다제-AffiniPure 염소 항-인간 IgG Ab, Fcγ 단편 특이적(Jackson 109-035-098) 또는 페록시다제-AffiniPure 염소 항-마우스 IgG Ab, Fcγ 단편 특이적(Jackson 115-035-164)을 사용하여) 수행할 수 있다. 결과는 동일한 농도에서 mAb 단독으로부터 수득한 값의 백분율로서 보고되었다.
특히, 본 발명에 따른 항체는 소위 항-LAMP1 항체 MAb1, MAb2 및 MAb3 중 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 항체는 소위 항-LAMP1 항체 MAb1, MAb2, MAb3 및 MAb3 VL_R24_R93 중 하나의 중쇄의 CDR 서열, 또는 중쇄 및 경쇄의 CDR 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 다음을 포함할 수 있다:
(i) 서열 번호 2 서열의 CDR1-H 또는 서열 번호 2로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 번호 3 서열의 CDR2-H 또는 서열 번호 3으로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 및 서열 번호 4 서열의 CDR3-H 또는 서열 번호 4로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열; 및/또는
서열 번호 6 서열의 CDR1-L 또는 서열 번호 6으로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 DTS의 CDR2-L 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 DTS로부터 상이한 서열 및 서열 번호 7의 CDR3-L 또는 서열 번호 7로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열; 또는
(ii) 서열 번호 9의 CDR1-H 또는 서열 번호 9로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 번호 10의 CDR2-H 또는 서열 번호 10으로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 번호 11의 CDR3-H 또는 서열 번호 11로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열; 및/또는
서열 번호 13의 CDR1-L 또는 서열 번호 13으로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 AAS의 CDR2-L 또는 AAS로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 및 서열 번호 14 서열의 CDR3-L 또는 서열 번호 14로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열; 또는
(iii) 서열 번호 43 서열의 CDR1-H 또는 서열 번호 43으로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 번호 44의 CDR2-H 또는 서열 번호 44로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 및 서열 번호 45 서열의 CDR3-H 또는 서열 번호 45로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열; 및/또는
서열 번호 49의 CDR1-L 또는 서열 번호 47로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 서열 YTS의 CDR2-L 또는 YTS로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열, 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52 서열의 CDR3-L 또는 서열 번호 48 또는 서열 번호 52로부터 하나의 아미노산 치환에 의해 상이한 서열.
추가의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 소위 항-LAMP1 항체 MAb4의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 항체는 소위 항-LAMP1 항체 MAb4의 중 경쇄의 CDR 서열, 또는 중쇄 및 경쇄의 CDR 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 서열 번호 83의 CDR1-H, 서열 번호 84의 CDR2-H, 서열 번호 85의 CDR3-H, 서열 번호 86의 CDR1-L, 서열 NAK의 CDR2-L 및 서열 번호 87의 CDR3-L을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명의 항체는 서열 번호 98 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 99의 서열의 서열인 경쇄(즉, 실시예 17.2.3에 기술된 MAb4의 중쇄 및/또는 경쇄)를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 본 항체는 키메라, 인간화 또는 항체 단편일 수 있다.
본 발명의 항체에서, 하나의 개별적인 아미노산은 위의 CDR 서열 중 하나 이상(특히, 하나)에서 치환, 특히 보존적 치환에 의해 변경될 수 있다.이러한 변경은 항체의 인간화와 관련되어, 예를 들어, 당화 자리 또는 탈아미드화 자리를 제거하기 위한 것일 수 있다. 다른 변경은 또한 CDR 내 라이신을 제거하기 위한 것일 수 있는데, 이는 라이신 곁사슬을 통한 세포독성에 대한 공유적 부착이 ADC의 경우 항원의 결합을 방해할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 서열 번호 48 및 서열 번호 52는 그들의 5번 위치에서의 하나의 아미노산 치환으로 인해 상이해진 CDR3-L 서열이다.
일 구현예에 따르면, 항체는 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 2 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 4 서열의 CDR3-H; 및/또는
서열 번호 6 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 7 서열의 CDR3-L; 또는
(ii) 서열 번호 9 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10 서열의 CDR2-H, 서열 번호 11 서열의 CDR3-H; 및/또는
서열 번호 13 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L, 및 서열 번호 14의 CDR3-L; 또는
(iii) 서열 번호 43 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 45 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 47 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52 서열의 CDR3-L.
특히, 항체는 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 2 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3 서열의 CDR2-H, 서열 번호 4 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 6 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 7 서열의 CDR3-L; 또는
(ii) 서열 번호 9 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10 서열의 CDR2-H, 서열 번호 11 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 13 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L, 및 서열 번호 14 서열의 CDR3-L; 또는
(iii) 서열 번호 43 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44 서열의 CDR2-H, 서열 번호 45 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 47 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52 서열의 CDR3-L, 또는
(iv) (i), (ii), 또는 (iii)에 정의된 바와 같은 항체의 단편.
본 발명자들은 재조합 Fab를 실시예 7.3.1에 기술된 프로토콜에 따른 비당화 LAMP1 단백질과의 복합체 내에서 루프 1 및 루프 2에 결합하는 것으로 확인된 huMAb1_1로부터 결정화하였다. LAMP1과 복합체화된 huMab1_1의 3차원 구조의 결정에 기반하여, 그의 CDR의 대부분은 위에서 언급된 Al-Lazikini, Lesk 및 Chothia 등의 문헌((1997) J.Mol.Biol.273:927-948)에 참조된 특이적 표준 구조와 결합할 수 있다. 결정 구조는 상기 표준 구조를 파괴하지 않으면서 CDR 내로 도입될 수 있는 돌연변이의 결정을 가능하게 하였다. 상기 표준 구조의 파괴는 변형된 결합 행동을 초래할 수 있다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 따라서, 결정학적 구조를 분석함으로써, 루프가 표준 구조 κ2B을 유지하는 한 CDR1-L 내에 위치한 서열 번호 68의 Q27 및 D28이 임의의 아미노산에 의해 교체될 수 있고, 서열 번호 68의 I29는 동등한 소수성 잔기, 예를 들어 Leu 또는 Val으로 교체될 수 있다는 것을 확인하였다. CDR2-L 내에 위치한 서열 번호 68의 T51 및 서열 번호 68의 S52는, T51의 경우에는 Ser에 의해 그리고 S52의 경우는 이러한 루프가 고전적인 γ-턴 구조를 유지하는 한 임의의 아미노산에 의해 교체될 수 있다. CDR3-L 내에 위치한 서열 번호 68의 잔기 D92, N93, L94는 루프가 표준 구조 λ1B를 유지하는 한 임의의 아미노산에 의해 교체될 수 있다. 나아가, 루프가 표준 구조 1을 유지하는 한, CDR-1H 내에 위치한 서열 번호 69의 G26은 임의의 아미노산에 의해, CDR-1H 내에 위치한 서열 번호 69의 Y27은 페닐알라닌에 의해, CDR-1H 내에 위치한 서열 번호 69의 T30은 임의의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. CDR-3H 내에 위치한 서열 번호 69의 잔기 D102, V103 및 A104는 유사한 크기 및 성질인 임의의 아미노산으로 교체될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 각각, 서열 번호 72, 서열 번호 73 및 서열 번호 74 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 2의 3개의 부의에 결합하고 다음을 포함하는 항체를 제공한다:
a) 서열 X1X2X3DRY(서열 번호 93)으로 이루어진 CDR1-L(X1 및 X2 각각은 임의의 아미노산이고, X3은 Ile, Leu 및 Val으로부터 선택됨); 및
서열 DX1X2로 이루어진 CDR2-L(X1은 T 또는 S로부터 선택되고, X2는 임의의 아미노산임); 및
서열 LQYX1X2X3WT로 이루어진 CDR3-L(X1, X2 및 X3은 임의의 아미노산); 및/또는
b) 서열 X1X2IFX3NYN(서열 번호 82)으로 이루어진 CDR1-H(X1 및 X3 각각은 임의의 아미노산이고, X2 는 Tyr 또는 Phe로부터 선택됨); 및 서열 번호 3으로 이루어진 CDR2-H; 및
서열 VRANWX1X2X3FAY(서열 번호 84)로 이루어진 CDR3-H(X1, X2, X3, 각각은 임의의 아미노산임).
일 구현예에서, 상기 항체는 루프 2에 결합하는 능력을 보유한다.
당업자는 본 정의에 따른 항체가 각각 서열 번호 72, 서열 번호 73 및 서열 번호 74 서열로 이루어진 인간 LAMP1의 루프 2의 3개의 부위에 결합하는 능력을 유지하고 따라서 파괴된 표준 구조로 고통받지 않는지를 규명하기 위한 방법을 알고 있다.
본 발명은 또한 위에서 정의된 바와 같이 소위 항-LAMP1 항체 MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3 VL_R24_R93, huMAb1_1 및 huMAb1_2, huMAb1_3, 예를 들어 MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3 VL_R24_R93 중 하나의 적어도 중쇄의 가변 도메인 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 더 포함하는 항체를 제공한다.
따라서 본 발명은, 특히, 다음을 포함하는 항체에 관한 것이다:
(i) 서열 번호 1 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 5 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
(ii) 서열 번호 8 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인, 및/또는 서열 번호 12 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
(iii) 서열 번호 15 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 16 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
(iv) 서열 번호 42 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 51 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인, 또는
(v) 서열 번호 53 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 56 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
(vi) 서열 번호 54 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 57 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
(vii) 서열 번호 55 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 58 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 항-LAMP-1 항체에 관한 것이다:
(i) 서열 번호 2 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 4 서열의 CDR3-H; 및/또는
서열 번호 6 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 7 서열의 CDR3-L; 또는
(ii) 서열 번호 9 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10 서열의 CDR2-H, 서열 번호 11 서열의 CDR3-H; 및/또는
서열 번호 13 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L, 및 서열 번호 14 서열의 CDR3-L; 또는
(iii) 서열 번호 43 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 45 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 47 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L, 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52 서열의 CDR3-L; 또는
(iv) 서열 번호 83 서열의 CDR1-H, 서열 번호 84 서열의 CDR2-H, 서열 번호 85 서열의 CDR3-H, 및/또는
서열 번호 86 서열의 CDR1-L, 서열 NAK의 CDR2-L, 및 서열 번호 87 서열의 CDR3-L; 또는 서열 번호 60 서열의 중쇄 또는 서열 번호 59 서열의 경쇄 서열; 또는
(v) 서열 번호 62 서열의 중쇄 또는 서열 번호 61 서열의 경쇄; 또는
(vi) 서열 번호 64 서열의 중쇄 서열 또는 서열 번호 63 서열의 경쇄.
예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 서열은 참조 서열 서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51, 53, 56, 54, 57, 55, 58, 예를 들어 서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51으로부터, 적절하게는, 하나 이상의 아미노산 치환(들), 특히, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(들) 및/또는 표준 잔기를 가지는 치환(들)에 의해 상이해질 수 있다.
특히, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 서열은 참조 서열 서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51, 53, 56, 54, 57, 55, 58, 예를 들어 서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51로부터 보존적 아미노산 치환(들)에 의해서만 상이해질 수 있다.
서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51, 53, 56, 54, 57, 55, 58, 예를 들어, 서열 번호 1, 5, 8, 12, 15, 16, 42, 46 또는 51 서열과 비교하여 서열 변경은 특히 필수적으로 하나 이상의 프레임워크 영역 부위 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H 내에 존재할 것이다.
그러나 하나 이상의 CDR 내 아미노산 치환도 또한 가능하다.
본 발명은 또한 위에서 정의된 바와 같은 적어도 소위 항-LAMP1 MAb4항체 중 하나의 경쇄의 가변 도메인 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 더 포함하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 특히 서열 번호 88 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 89 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체는 특히 통상적인 항체, 특히 통상적인 단일클론 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 IgG 또는 이의 단편을 포함하거나 IgG 또는 이의 단편으로 이루어진다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 각각 쥐 항체 및 쥐 항체의 단편일 수 있다.
이러한 항체는 또한 키메라 항체일 수 있고, 특히 쥐/인간 항체, 예컨대, 중쇄 및 경쇄의 쥐 가변 도메인 및 인간 항체로부터의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체일 수 있다. 항체는 이러한 항체의 단편일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 다음과 같다:
a) 서열 번호 17 서열의 중쇄 서열 및/또는 서열 번호 18 서열의 서열인 경쇄(즉, 실시예 7에 기술된 바와 같은 chMAb1의 중쇄 및/또는 경쇄)를 포함하거나 이로 이루어진 키메라 항체; 또는
b) 서열 번호 19 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 20 서열의 서열인 경쇄(즉, 실시예 7에 기술된 바와 같은 chMAb2의 중쇄 및/또는 경쇄)를 포함하거나 이로 이루어진 키메라 항체; 또는
c) 서열 번호 21 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 22 서열의 서열인 경쇄;(즉, 실시예 7에 기술된 바와 같은 chMAb2Can의 중쇄 및/또는 경쇄)를 포함하거나 이로 이루어진 키메라 항체; 또는
d) 서열 번호 49 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 50 서열의 서열인 경쇄 서열;(즉, chMAb3의 중쇄 및/또는 경쇄)를 포함하거나 이로 이루어진 키메라 항체; 또는
e) 서열 번호 49 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 81 서열의 서열인 경쇄;(즉, chMAb3_VLR24-R93의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하거나 이로 이루어진 키메라 항체; 또는
f) a), b), c), d) 및 e)에 정의된 키메라 항체의 단편.
본 발명의 항체는 또한 인간화 항체일 수 있다. 따라서, 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 다음을 포함하거나 다음으로 이루어진다:
i) 서열 번호 60 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 59의 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(즉, 실시예 7.2에 기술된 huMAb1_1의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는
ii) 서열 번호 62 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 61 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(즉, 실시예 7.2에 기술된 huMAb1_2의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는
iii) 서열 번호 64 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및/또는 서열 번호 63 서열의 서열 또는 이에 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(즉, 실시예 7.2에 기술된 huMAb1_3의 중쇄 및/또는 경쇄).
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 추가의 일 구현예에서, 상기 인간화 항체는 재표면화 기술을 통해 수득된다. 이러한 항체들도 또한 "재표면화된" 항체로 일컫어진다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 단일 도메인 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 특히, 단일 도메인 항체 단편은 위에 기술된 항체들의 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H를 포함하는 가변 중쇄(VHH)로 이루어질 수 있다. 이러한 항체는 또한 중쇄 항체, 즉, 경쇄가 없는 항체일 수 있으며, 이는 CH1 도메인을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다.
또한, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 낙타과의 단일 도메인 항체의 프레임워크 부위 및 선택적으로 낙타과의 단일 도메인 항체의 불변 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 및 디아바디로 이루어지는 군으로부터 선택된, 항체 단편, 특히, 인간화 항체 단편일 수 있다.
또한, 이러한 항체는 항체 단편들로부터 형성된 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있으며, 적어도 하나의 항체 단편은 본 발명에 따른 항체 단편이다. 다중특이적 항체들은 예를 들어, EP 2 050 764 A1 또는 US 2005/0003403 A1에 기술된 다가 단백질 복합체이다.
본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 (a) 소위 MAb1, MAb2, MAb2Can, MAb3, MAb3_VLR24-R93 항체 중 하나의 표적이 되는 인간/필리핀 원숭이 LAMP1 상의 제1 내지 제3 루프, 특히 제1 루멘 도메인 및 (b) 적어도 하나의 다른 항원에 대하여 특이성을 가질 수 있다. 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 다른 항원은 인간 또는 필리핀 원숭이 LAMP1 패밀리 구성원이 아니고, 특히 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP2 중 적어도 하나 또는 전부가 아니다. 다른 구현예에 따르면, 적어도 하나의 다른 항원은 소위 MAb1, MAb2, MAb2 Can 및 MAb3 항체 중 하나에 의해 표적화되는 상기 제1 내지 제3 루프, 특히 제1 루멘 도메인이 아닌 인간 필리핀 원숭이 LAMP1 상의 에피토프일 수 있다.
상기 항체들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 임의의 기법에 의해 생산될 수 있다. 특히, 상기 항체들은 이하에 기술된 기법으로 생산된다.
본 발명에 따른 항체 및 이의 단편들은 분리된(예컨대, 정제된) 형태로 이용될 수 있거나, 막 또는 지질 소포체(예컨대, 리포좀)와 같은 벡터에 함유될 수 있다.
본 발명의 항체는 상술된 특징의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.
핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
본 발명의 추가적인 대상은 위에 정의된 본 발명의 항체를 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 서열에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자로서, 이는 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적절한 벡터에 포함될 수 있다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질 전환시켜 도입시킨 서열의 발현(예컨대, 전사 및 번역)을 촉진하기 위하여 DNA 또는 RNA 서열(예컨대, 외래 유전자)이 숙주 세포로 도입될 수 있게 하는 전달 매체를 의미한다.
따라서, 본 발명의 추가적인 대상은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
그러한 벡터는 대상자에 투여 시 상기 폴리펩티드의 직접적인 발현을 유발하기 위하여 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 인간 사이토메갈로바이러스의 인핸서 및 프로모터(Nelson, J., 1996 J. Virology 70: 3207-3986), SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami, T. and Itoh, S. et al., 1987, J Biochem. 101(5): 1307-1310), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y. et al., 1987, Biochem Biophys Res Commun. 149: 960-968), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터(Mason, J.O. et al., 1985, Cell 41: 479-487) 및 인핸서(Gillies, S.D. et al., 1983, Cell 33: 717-728) 등을 포함한다.
인간 항체 C 부위를 암호화하는 유전자가 삽입되고 발현될 수 있는 한 임의의 동물 세포용 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(Miyaji, H. et al., 1990, Cytotechnology 3(2): 133-140), pAGE103(Mizukami, T. and Itoh, S. et al., 1987, J Biochem. 101(5): 1307-1310), pHSG274(Brady, G. et al., 1984, Gene 27(2): 223-232), pKCR(O'Hare, K. et al., 1981, Proc Natl Acad Sci USA. 78(3): 1527-1531), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji, H. et al., 1990, Cytotechnology 4: 173-180) 등을 포함한다.
플라스미드의 다른 예로는 복제 원점을 포함하는 복제 플라스미드 pCEP5 또는 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 삽입 플라스미드(integrative plasmid)를 포함한다.
바이러스 벡터의 다른 예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 패키징 세포를 형질감염시킴으로써 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 이용한 일시적인 형질감염에 의한 것과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 기법에 의해 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 그러한 복제 결함 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 추가적인 대상은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질 전환된 세포에 관한 것이다.
용어 "형질 전환"은 "외래"(즉, 외인성) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포로 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 부호화된 단백질 또는 효소를 생산하도록 하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아들이고 발현하는 숙주 세포는 "형질 전환되었다".
본 발명의 핵산은 적절한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 항체를 생산하는 데에 이용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은 예컨대, 벡터에 의해 전달된 외래 DNA에 의해 부호화되고 숙주 세포로 도입된 단백질의 발현을 위한, 숙주 세포 및 적절한 조건 하에서 양립 가능한 벡터를 의미한다.
흔한 발현 시스템으로는 대장균 숙주 세포와 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포와 배큘로바이러스 벡터 및 포유동물 숙주 세포와 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예로는 (세균과 같은) 원핵 세포 및 (효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등과 같은) 진핵 세포를 제한 없이 포함한다. 구체적인 예로는 대장균, 클루이베로마이세스 또는 사카로미세스 효모, 포유동물 세포주(예컨대, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포, HEK293 세포 등)뿐만 아니라, (예컨대, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등으로부터 생산된) 초대 또는 확립된 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 또한, 예로는 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(이하 "DHFR 유전자"라 지칭함)가 결여된 CHO 세포(Urlaub, G. et al.; 1980, Proc Natl Acad Sci USA. 77(7): 4216-4220), 랫트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"라 지칭함) 등을 포함한다. YB2/0 세포가 관심 있는 것인데, 이는 이 세포에서 발현될 때 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 증진되기 때문이다.
특히, 인간화 항체의 발현을 위해, 발현 벡터는 항체 중쇄를 암호화하는 유전자 및 항체 경쇄를 암호화하는 유전자가 별도의 벡터 상에 존재하는 유형 또는 두 유전자들이 동일한 벡터에 존재하는 유형(탠덤형) 중 어느 하나일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 사이의 균형에 있어서는, 텐덤형의 인간화 항체 발현 벡터가 바람직하다(Shitara, K. et al., 1994, J Immunol Methods. Jan. 3:167(1-2):271-8). 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예로는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 위에 기술된 재조합 핵산 또는 벡터를 수용성(competent) 세포로 시험관 내 또는 생체 외 도입하기, (ii) 얻어진 재조합 숙주 세포를 시험관 내 또는 생체 외 배양하기 및 (iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하기로 이루어지는 단계들을 포함한다.
이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체의 생산에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 생산 방법
본 발명의 항체는 제한 없이, 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기법과 같은, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법에 의해, 단독으로 또는 조합하여, 생산될 수 있다.
원하는 서열의 아미노산 서열을 앎으로써, 당업자는 폴리펩티드 생산을 위한 일반 기법에 의해, 상기 항체 또는 면역 글로불린 사슬을 용이하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 그것들은, 특히, 상업적으로 이용 가능한 (미국 캘리포니아 주 포스터시티의 어플라이드 바이오시스템즈가 제조한 것과 같은) 펩티드 합성 기구를 이용하고, 제조업체의 설명서에 따라, 잘 알려져 있는 고체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 면역 글로불린 사슬은 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 재조합 DNA 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들 단편들은 원하는 (폴리)펩티드를 암호화하는 DNA 서열들을 발현 벡터에 도입하고, 원하는 폴리펩티드를 발현할 적절한 진핵 또는 원핵 숙주로 그러한 벡터들을 도입한 후, DNA 발현 생성물로서 획득할 수 있으며, 그것들은 나중에 숙주로부터 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 분리될 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 (i) 본 발명에 따라 형질 전환된 세포를 배양하기; (ii) 상기 항체 또는 폴리펩티드를 발현시키기; 및 (iii) 발현된 항체 또는 폴리펩티드를 회수하기로 이루어지는 단계들을 포함한다.
인간화 또는 키메라 항체를 생산하기 위한 방법은 통상적인 재조합 DNA와 관련되고, 유전자 형질감염 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다(Morrison, S.L. 및 Oi, V.T., 1984, Annu Rev Immunol 2: 239-256 및 특허 문헌 US5,202,238; 및 US5,204, 244 참조).
특정한 일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 이전에 기술된 바와 같이 쥐 VL 및 VH 도메인들을 암호화하는 핵산 서열을 획득하고, 그것들을 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 암호화하는 유전자들이 있는 동물 세포용 발현 벡터로 삽입하여 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 발현 벡터를 동물 세포로 도입하여 부호화 서열을 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체는 앞서 기술된 바와 같은 인간화 VL 및 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 수득하고, 핵산 서열을 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 암호화하는 유전자를 가지는 동물 세포용 발현 벡터에 삽입함으로써 인간화 항체를 제작하고, 발현 벡터를 동물 세포에 도입합으로써 코딩 서열을 발현시켜 생산할 수 있다.
인간화 또는 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 그것은 인간 면역 글로불린 중쇄에 속하는 임의의 부위일 수 있지만, IgG 부류의 것들이 적합하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은, IgG 부류에 속하는 하위 부류 중 임의의 하나가 이용될 수도 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL로서, 그것은 인간 면역 글로불린 경쇄에 속하는 임의의 부위일 수 있고, 카파 부류 또는 람다 부류의 것들이 이용될 수 있다.
항체는 예를 들어, 출원 WO2009/032661에 개시된 기법, CDR 그래프팅(EP 239,400; PCT 공개 WO91/09967; 미국 특허번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 재표면화(EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka, G.M. et al., 1994, Protein Eng. 7(6): 805-814;, Roguska, M.A. et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(3): 969-973) 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허번호 5,565,332)를 포함하는, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들을 이용하여 인간화될 수 있다. 그러한 항체의 제조를 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 공지되어 있다(유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 출원 WO 96/02576 참조).
본 발명의 항체는, 예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 혼합-모드 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리된다.
본 발명의 Fab는 LAMP1과 특이적으로 반응하는 항체를 파파인과 같은 단백질 가수분해효소로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 Fab는 항체의 Fab의 양 사슬을 암호화하는 DNA 서열들을 원핵 발현용 또는 진핵 발현용 벡터에 삽입하고, 이러한 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 LAMP1과 특이적으로 반응하는 항체를 단백질 가수분해효소인 펩신으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 아래에 기술된 Fab'을 결합시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 Fab'은 LAMP1과 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 디티오트레이톨과 같은 환원제로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 Fab'는 항체의 Fab' 사슬을 암호화하는 DNA 서열들을 원핵 발현용 벡터 또는 진핵 발현용 벡터에 삽입하고, 이러한 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포에 도입하여 발현을 수행함으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 scFv는 이전에 기술된 CDR 또는 VH 및 VL 도메인들의 서열들을 취하여, scFv 단편을 암호화하는 DNA를 구축하고, 이러한 DNA를 원핵 또는 진핵 발현 벡터에 삽입한 다음, 이러한 발현 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포로 도입하여 scFv를 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 인간화 scFv 단편을 생성하기 위하여, CDR 그래프팅이라는 잘 알려져 있는 기술을 이용할 수 있는데, 이는 본 발명에 따른 상보성 결정 부위(CDR)를 선택하고, 그것들을 공지된 3차원 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크 상에 그래프팅시키는 것을 수반한다(예컨대, W098/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494 참조).
LAMP1에 대해 유도된 단쇄 항체 또는 VHH는 예를 들어 (a) 낙타과에 속하는 포유동물을 LAMP1 또는 이의 단편으로 면역화하여 LAMP1에 대한 항체(및 특히 중쇄 항체)를 유발하는 단계; (b) 이에 따라 면역화된 낙타과로부터의 생물학적 시료를 수득하는 단계로서, 상기 시료는 LAMP1에 대하여 유도된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 포함하는 것인 단계; 및 (c) LAMP1에 대하여 유도된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 상기 생물학적 시료로부터 회수(예컨대, 분리)하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 적합한 단쇄 항체 또는 VHH는 또한 소위 항체 MAb1, MAb2, MAb2Can,MAb3, huMAb1_1 및 huMAb1_2, huMAb1_3, 예를 들어, MAb1, MAb2, MAb2Can,MAb3으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프, 특히 제1 루멘 도메인에 결합하기 위해 경쟁하는 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열에 대한 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 포함하는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 항체의 변경
본 출원에 기술된 항체들의 아미노산 서열 변경(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 성질들을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체들의 구조 및 그것들을 암호화하는 DNA 서열들에 변화 및 변경이 이루어질 수 있으며, 또한 바람직한 특성을 나타내는 기능적인 항체 또는 폴리펩티드가 얻어질 수 있다.
폴리펩티드의 아미노 서열들의 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 상호적인 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수친수 아미노산 지수가 단백질에 미치는 중요성은 일반적으로 당해 기술 분야에서 이해된다. 아미노산의 상대적인 소수친수 특징은 그 결과에 따른 단백질의 2차 구조에 기여하며, 결과적으로 이러한 단백질과 다른 분자들, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호 작용을 정의한다고 받아들여진다. 각각의 아미노산은 그것들의 소수성 및 전하 특성을 기초로 하여 소수친수 지수를 할당받았으며, 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
본 발명의 추가적인 대상은 또한 본 발명의 폴리펩티드들의 기능-보존적 변이형들을 포괄한다.
예를 들어, 특정 아미노산은 주목할 만한 활성의 손실 없이 단백질 구조에 있어서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호적 능력 및 속성은 그것의 생물학적 기능적 활성을 정의하므로, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열 내에서, 그리고 물론 그것의 서열을 암호화하는 DNA에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 유사한 성질을 나타내는 단백질을 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 서열들, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열들에서, 그것들의 생물학적 활성의 주목할 만한 손실 없이 다양한 변화들이 이루어질 수 있다고 예상된다.
특정 아미노산이 비슷한 소수친수 지수 또는 점수를 나타내는 다른 아미노산들로 치환될 수 있으며, 또한 비슷한 생물학적 활성을 나타내는 단백질을 초래할 수 있다는, 즉, 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 획득할 수 있다는 점은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드에서, 항원에 대한 결합의 유의미한 손실 없이 치환될 수 있는 모든 아미노산을 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 접근법과 같은 잘 확립된 기술들을 이용하는 것도 가능하다. 그러한 잔기들은 중성인 것으로 간주될 수 있는데, 그것들은 항원 결합 또는 항체의 구조 유지에 관여하지 않기 때문이다. 이러한 중성 위치들 중 하나 이상은 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 주요 특징들을 변경시키지 않고 알라닌 또는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
따라서, 위에서 개략적으로 설명한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 곁사슬 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그것들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 전술한 특징들 중 몇 개를 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌과 리신; 글루탐산과 아스파르트산; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신을 포함한다.
예컨대, 항체의 항원 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포 독성(CDC)을 증진시키기 위하여, 본 발명의 항체를 효과기 기능에 대하여 변경하는 것 또한 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 부위에 도입될 수 있는데, 이에 의해 이 부위에 사슬 내 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 하여 생성된 호모이량체 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 살해 및/또는 항체 의존적 세포성 세포 독성(ADCC)을 나타낼 수 있다(Caron, P.C. et al., 1992, J Exp Med. 176(4): 1191-1195 및 Shopes B., 1992, J Immunol. 148(9): 2918-2922).
본 발명의 항체의 다른 유형의 아미노산 변경은, 즉, 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 자리를 추가함으로써, 항체의 본래의 당화 패턴을 바꾸는 데에 유용할 수 있다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다) 중 어느 하나의 존재는 가능성 있는 당화 자리를 생성한다. 항체에 대한 당화 자리의 추가 또는 제거는 아미노산 서열이 위에 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록(N 결합 당화 자리) 아미노산 서열을 바꿈으로써 편리하게 달성된다.
다른 유형의 본 발명의 항체의 변경은 CDR 내 라이신을 제거하기 위한 것일 수 있거나, CDR에 공간적으로 가까울 수 있는데, 이는 라이신 곁사슬 잔기를 통한 세포독성에 대한 공유적 부착이 ADC의 경우 항원에 대한 결합을 방해할 수 있기 때문이다.
또 다른 유형의 변경은 잠재적으로 분해 생성물 또는 항체 제제의 이질성을 초래하므로 인실리코(in silico) 또는 실험적으로, 확인된 서열들의 제거를 수반한다. 예로써, pH 및 표면 노출과 같은 인자들에 따라 아스파라긴 및 글루타민 잔기들의 탈아미드화가 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기들은 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 특히 탈아미드화에 약하고, Asn-Ala와 같은 다른 디펩티드 서열에서는 더 낮은 정도로 탈아미드화에 약하다. 따라서, 그러한 탈아미드화 자리, 특히 Asn-Gly이 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드에 존재할 때, 전형적으로 보존적 치환에 의해 이러한 자리를 제거하여 관련된 잔기들 중 하나를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 관련된 잔기들 중 하나 이상을 제거하기 위한 서열에서의 그러한 치환 또한 본 발명에 의해 포괄되도록 의도된다.
또 다른 유형의 공유적 변경은 항체에 대해 화학적으로 또는 효소적으로 글리코시드를 결합시키는 것을 수반한다. 이러한 절차는 N- 또는 O-결합 당화를 위하여 당화 능력이 있는 숙주 세포에서 항체를 생산할 것을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 결합 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프히드릴 기, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 그것들과 같은 유리 하이드록실 기, (e) 페닐알라닌, 또는 티로신의 그것들과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 WO87/05330에 기술되어 있다.
항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 항체를 트리플루오로메탄설폰산 화합물 또는 균등한 화합물에 노출시킬 것을 요구한다. 이러한 처리는 항체는 온전하게 두면서, 연결하는 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고는 대부분의 또는 모든 당들의 절단을 가져온다. 화학적 탈당화는 Sojahr H. 등(1987, Arch Biochem Biophys. 259(1): 52-57) 및 Edge, A.S. 등(1981, Anal Biochem. 118(1): 131-137)에 의해 기술된 바 있다. 항체의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura, NR. 등(1987, Methods Enzymol 138: 350-359)이 기술한 바와 같이, 다양한 엔도- 및 엑소글리코시다아제를 이용하여 달성될 수 있다.
또 다른 유형의 항체의 공유적 변경은 항체를 다양한 비 단백질성 고분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 미국 특허번호 4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 연결하는 것을 포함한다.
약학적 조성물
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로, 생분해 가능한 고분자와 같은 지효성 매트릭스와 조합되어 치료적 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 항체 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의약용의, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 면역접합체에 관한 것이다.
"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용 가능한"은 적절히, 포유동물, 특히 인간에 투여될 때, 부반응, 알레르기 반응 또는 기타 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조물을 지칭한다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 투여계획은 당연히, 치료되는 병태, 병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 달려 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소용, 경구, 비경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 안구 내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
특정한 일 구현예에서, 이러한 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 약학적으로 허용 가능한 용제를 함유한다. 이들은, 특히, 등장성, 멸균, 식염수 용액(모노나트륨 또는 디나트륨 인산염, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 그러한 염들의 혼합물) 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가 시 주사 가능한 용액의 조성을 허용하는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있다.
투여에 이용되는 용량은 다양한 매개변수들의 함수로, 그리고 특히, 이용되는 투여 방식의 함수, 관련된 병리학의 함수, 또는 대안적으로 원하는 치료 지속기간의 함수로 조정될 수 있다.
약학적 조성물을 제조하기 위하여, 본 발명의 유효량의 항체 또는 면역접합체가 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태로는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 임기 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 쉽게 주사가능한 정도까지 유체로 존재해야 한다. 그것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물을 함유하는, 용매 또는 분산매일 수 있다. 예를 들어, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 레시틴과 같은 코팅제의 이용에 의해, 그리고 계면활성제, 안정화제, 동결보호제 또는 항산화제의 이용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 항세균제 및 항진균제에 의해 초래될 수 있다. 여러 경우에 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
멸균성의 주사 가능한 용액은 필요에 따라, 위에 열거된 몇개의 기타 성분들과 함께, 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 성분을 도입한 후, 여과 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산매 및 위에서 언급된 것들로부터 필요한 기타 성분들을 함유하는 멸균 용제에 도입하여 제조된다. 멸균성의 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법으로, 이는 활성 성분의 분말에 더하여, 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분을 생산한다.
제형화할 때, 용액들은 투여 제형에 적합한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 이러한 제형들은 위에 기술된 주사 가능한 용액 유형과 같이 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 등도 이용될 수 있다.
수용액으로 비경구 투여 시, 예를 들어, 이러한 용액은 필요에 따라 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성이 되도록 하여야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균성의 수성 매질은 본 개시의 관점에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 등장성의 NaCl 용액 1 mL에 용해되거나, 피하 주입액 1000 mL에 부가되거나, 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 1035~1038쪽 및 1570~1580쪽 참조). 치료되는 대상자의 상태에 따라 투여량의 약간의 변이가 필수적으로 일어날 것이다. 투여를 책임지는 사람은 어떠한 경우에도 개별적인 대상자를 위한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 용량당 약 0.01 내지 100 밀리그램 정도를 포함하도록 치료적 혼합물 내에 제형화될 수 있다.
치료적 방법 및 용도
본 발명자들은 LAMP1의 제1 내지 제3 루프, 특히 LAMP1의 제1 루멘 도메인에 대하여 유도된 항체, 특히 MAb1 및 MAb2 및 Mab3이 LAMP1 수용체-항체 복합체를 결합 후 능동적으로 내재화 시킬 수 있고, 아마도 피복구(coated pit)에 의해 축적시킬 수 있다는 것을 보여준다. 내재화 항체 MAb1, MAb2 및 Mab3은 초기 엔도좀으로 국소화되었고, 이어서 리소좀 구획으로 이동하였고 리소좀 구획에 축적되었다.
ImageStream 다중스펙트럼 영상화 유동세포계수법(Amnis corp)은 내재화 항체가 리소좀 구획에 축적된다는 것을 밝혔다. MAb1, MAb2 및 MAb3으로 4℃에서 항온배양한 살아 있는 Colo205 세포의 면역형광 분석은 구분되는 원형질 막 염색을 보여주었다. MAb1, MAb2 및 MAb3으로의 37℃에서의 세포의 항온배양에서는 4시간의 항온배양 후 원형질 막 및 세포내 소낭 둘 다에서 라벨링이 나타났다. 세포 내 형광(37℃에서 측정됨)을 나타내는 내재화 점수(IS)가 세포 표면에서의 형광(4℃에서 측정됨)보다 10배 더 높기 때문에, LAMP1 단백질이 세포 표면에서 빠르게 재순환한다는 것을 의미한다. 종합하면, 우리의 결과는 최초로 LAMP1이 항체의 내재화를 매개하는 수용체로서 작용할 수 있다는 것을 보여주고, 특이적 내재화 항체의 유용성이 암 세포의 내부에 특이적으로 전달될 독소, 약물 또는 단범위 동위원소를 표적으로 하는 신규 치료법의 개발에 도움이 될 수 있다는 것을 시사한다.
또한, 본 발명자들은 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된 본 발명에 따른 항체가 유전체 DNA 내에 LAMP1을 암호화하는 DNA 서열의 안정적인 통합을 함유하는 인간 HCT116 종양 또는 HEK293 세포 상(개별적인 클론은 세포 표면에 상이한 강도의 LAMP1을 제시함) 세포독성 활성을 시험관 내에서 유도한다는 것을 보여주었다.
다른 실시예 9.4에서, 본 발명자들은 세포독성 토메이마이신 이량체와 조합된 본 발명에 따른 항체가 시험관 내에서 세포독성 활성을 유도한다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 실시예 10.1.1에 기술된 바와 같이 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된 항체가 종양 이식 후 17일째에 단회 주사로 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 사용될 때. 환자로부터 유래된 원발성 인간 대장 선암종 이종이식편의 쥐 모델에서 현저한 생체 내 항 종양 활성을 유도한다는 것을 보여준다.
나아가, 본 발명자들은 또한 실시예 10.1.2에 기술된 바와 같이 이러한 면역접합체가 종양 이식 후 26일째에 단회 주사로 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 사용될 때 환자로부터 유래된 원발성 인간 폐 종양 이종이식편의 쥐 모델에서 현저한 생체 내 항-종양 활성을 유도한다는 것을 보여준다.
본 발명자들은 또한 실시예 10.2 내지 10.4에 나타낸 바와 같이 DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-chMAb2, DM4-SPDB-chMAb3의 면역접합체가 상이한 암 이종이식편 모델의 상이한 쥐 모델에서 현저한 생체 내 항-종양 활성을 유도한다는 것을 보여준다.
예를 들어, 면역접합체 DM4-SPDB-huMAb1_1는 실시예 10.2.2 및 10.2.3에 기술된 바와 같이 단회 주사로 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 사용될 때 환자로부터 유래된 원발성 인간 폐 종양 이종이식편 및 원발성 인간 침습성 관 암종 이종이식편에서 현저한 생체 내 항-종양 활성을 유도한다는 것을 보여주었다.
또한, 면역접합체 DM4-SPDB-chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb3은 실시예 10.3.2 및 10.4에 기술된 바와 같이 단회 주사로 각각 10 mg/kg, 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg, 2.5 mg/kg 및 1.25 mg/kg의 용량으로 사용될 때 환자로부터 유래된 원발성 인간 침습성 관 암종 이종이식편에서 현저한 항 종양 활성을 유도한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체, 또는 약학적 조성물은 암 치료에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 암 세포 내 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 환자에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-LAMP1 치료제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 암 세포 내 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 상기 환자는 본 발명에 따른 암을 가지는 환자를 선택하는 시험관 내 방법에 의해 선택될 수 있다. 특히, 이러한 용도는 암 세포 내 상기 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 환자를 본 발명에 따른 암을 가지는 환자를 선택하는 방법에 의해 선택하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 암을 가지는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
a) 본 발명에 따른 암을 가지는 환자를 선택하는 시험관 내 방법에 의해 항- LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 암을 가지는 환자를 선택하는 것; 및
b) 상기 선택된 환자에게 항-LAMP1 치료법을 투여하는 것.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 항-LAMP1 치료법을 위해 암을 가지는 환자를 선택하는 방법에 관한 것이다:
(a) 암 세포를 포함하는 암을 가지는 환자의 생물학적 시료 내에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하는 것; 및
(b) 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 경우 상기 환자에게 항-LAMP1 치료법을 투여하는 것.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다:
(a) 암 세포를 포함하는 암을 가지는 환자의 생물학적 시료 내에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하는 것; 및
(b) 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 경우 상기 환자에게 항-LAMP1 치료법을 투여하는 것.
본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물로 치료되는 암은 세포 표면 상에 LAMP1를 발현하는 암, 특히, 동일한 조직 기원의 정상적인(즉, 비 종양성) 세포에 비해, 세포 표면 상에 LAMP1를 과발현하는 암이다.
암세포에 의한 LAMP1의 발현은 예를 들어, 다음 섹션 "진단적 용도"에서 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 항체를 이용하여, 그리고 특히, 예를 들어 실시예 5에 기술된 바와 같이, 면역조직화학적 방법에 의해, 용이하게 분석할 수 있다.
특히, 암은 대장 선암종일 수 있지만 또한 피부, 후두 및 연조직 종양뿐 아니라 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장, 위 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)일 수도 있고, 예를 들어 암은 피부, 후두, 또는 연조직 종양뿐 아니라 대장 선암종, 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 위장관 종양은 소장 종양, 직장 종양 및/또는 귀밑샘 종양이다.
일 구현예에서, 생식 기관 종양 위장관 종양은 폐 종양, 간 종양, 췌장 종양, 위 종양 및 신장 종양이다.
일 구현예에서, 생식 기관 종양은 유방 종양, 난소 종양 또는 전립선 종양이다.
본 발명에 따른 마우스 항-인간 LAMP1 항체를 이용하여 면역조직화학에 의해 인간 종양 패널을 스크리닝한 결과는 실제로 실시예 5에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 이러한 유형의 암에서 항체 염색을 보여주었다.
특히, LAMP1을 발현하는 인간 종양성 세포는 대장, 위, 직장, 폐 편평세포 암종, 유방 침습성 관 및 소엽성 암종 및 전립성 선암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 종양은 실제로 세포의 50% 초과가 세포 막에서의 LAMP1 발현에 대해 양성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(실시예 5 참조).
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 단독으로 또는 임의의 적절한 성장 저해제와 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이전에 기술된 바와 같이, 성장 저해제, 세포독성제, 또는 전구약물 활성화 효소와 접합되거나 결합될 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 상기 성장 저해제, 세포독성제, 또는 전구약물을, 표면에 LAMP1를 발현하거나 과발현하는 암성 세포에 대해 표적화하는 데 유용할 수 있다.
또한, 치료적 단일클론성 항체가 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 보유하는 세포들의 고갈을 초래할 수 있음은 잘 알려져 있다. 이러한 고갈은 항체 매개 세포성 세포독성, 보체 의존적 세포 용해 및 항체에 의해 표적화된 항원을 통해 제공된 신호를 통한 종양 성장의 직접적인 항종양 저해라는 적어도 세 가지의 메커니즘을 통해 매개될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 동족 항원에 결합된 항체에 보체 시스템의 첫 번째 요소가 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예컨대, Gazzano-Santoro 등(1997)에 기술된 바와 같은 CDC 분석법이 수행될 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예컨대, 자연살해(NK) 세포, 호중성 백혈구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비 항체들이 이러한 세포독성 효과기 세포들로 하여금 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합하여, 이후에 그러한 표적 세포를 살해할 수 있게 하는 세포 독성의 형태를 지칭한다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것과 같은 시험관 내 ADCC 검정법이 또한 고려될 수 있다. 카바트 등(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991)에 기술된 명명법에 따른 D265A 돌연변이와 같은 특이적 돌연변이가 Fc□R에 대한 결합 및 ADCC를 유의하게 감소시킨다는 것이 당업자에게 알려져 있다(Lund et al., J. Immunol., 157:4963-4969, 1996; Shields et al., J. Biol. Chem., 276(1): 6591-6604, 2001).
일 실시예에서, 예를 들어, huIgG1 내 서열 번호 56의 266A 돌연변이는 위에서 언급된 D265A 돌연변이에 해당하고, 따라서 Fc□R들에 대한 결합 및 ADCC를 유의하게 감소시킨다.
따라서, 본 발명의 대상은 치료적으로 유효한 양의, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료방법에 관한 것이다.
"항체-의존성 세포 식세포작용" 또는 "ADCP"는 일정 세포독성 세포(예컨대, 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합한 항체가 이러한 세포독성 효과기 세포를 항원을 지니는 표적 세포에 특이적으로 결합시킬 수 있고, 이어서 식세포작용으로 표적 세포를 살상할 수 있는 세포독성의 형태를 지칭한다. 관심 있는 분자의 ADCP 활성을 평가하기 위해, McEarchem 등의 문헌(2007, Blood 109:1185)에 기술된 바와 같은 시험관 내 ADCP 검정.
본 발명의 맥락에서, 본 출원에 사용된 용어 "치료(treating 또는 treatment)"는 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행의 저해, 또는 예방을 의미한다. 본 출원에 사용된 용어 "암 치료(treating cancer)"는 종양의 악성 세포의 성장 및/또는 상기 종양으로부터의 전이 진행의 저해를 의미한다. 또한, 그러한 치료는 종양 성장의 퇴행, 즉, 측정 가능한 종양의 크기의 감소를 초래할 수 있다. 특히, 그러한 치료는 종양 또는 전이의 완전한 퇴행을 초래한다.
본 발명에 따르면, 용어 "환자" 또는 "이를 필요로 하는 환자"는 악성 종양에 영향을 받거나 영향을 받을 가능성이 높은 인간 또는 비 인간 포유동물을 의도한 것이다. 특히, 상기 환자는 LAMP1를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명, 예를 들어 아래에 기술된 방법에 따른 항체 또는 면역접합체에 민감하다고 결정된 환자일 수 있다.
위에 개시된 "항-LAMP1 치료법"은 LAMP1을 표적화하는 치료제에 관련된 치료법이다. 본 발명에 따르면, "LAMP1을 표적화하는 치료제" 또는 "항- LAMP1 치료제"라는 용어는 LAMP1에 결합하고 세포독성 또는 세포분열 억제 활성을 가지는 제제를 기술한다.
본 출원에서 사용된 "결합제"라는 용어는 LAMP1에 대하여 특이적 결합 활성을 나타내는 분자를 지칭한다. 이러한 결합 분자는, 예를 들어, 거대 분자 및 유기 소분자를 포함하는 다양한 상이한 유형의 분자를 포함할 수 있다. 소분자 결합제는, 예를 들어, 수용체 리간드, 길항제 및 아고니스트를 포함할 수 있다. 대분자는, 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질, 폴리펩티드 결합제를 암호화하는 핵산, 렉틴, 탄수화물 및 지질을 포함할 수 있다. 용어는 결합 기능이 유지되는 한 제제의 도메인 및 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 도메인의 경계는 결합 활성이 유지되는 한 주요하지 않다. 결합제가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질인 구체적인 구현예에서, 이러한 결합 단백질은 단량 또는 다량 종을 포함할 수 있다. 이종체 결합 단백질은 다량 결합 단백질의 구체적인 예시이다. 다량 결합 단백질을 언급할 때 용어는 폴리펩티드의 조립 및 조립된 복합체의 결합 기능이 유지되는 한 서브유닛의 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 이종체 결합 단백질은, 예를 들어 항체 및 이의 단편, 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 부분을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 항-LAMP1 치료제는 항-LAMP1 항체 또는 항-LAMP1 항체 및 적어도 하나의 성장 저해제를 포함하는 면역접합체이다.
본 발명의 폴리펩티드의 "치료적으로 유효한 양"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 이익/위험 비율로, 상기 암 질병을 치료하는 데 충분한 폴리펩티드의 양을 의미한다. 그러나 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 전체적인 1일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적으로 유효한 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 폴리펩티드의 활성; 이용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 이용된 특정 폴리펩티드의 배출 속도; 치료 지속기간; 이용된 특정 폴리펩티드와 조합하여 또는 동시에 이용된 약물; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 기술 분야의 통상적인 지식 내에서 잘 알려져 있다. 본 발명의 다른 목적은 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
특히, 폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물은 악성 종양의 전이 진행을 억제하기 위하여 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 악성 종양 치료(예컨대, 애쥬반트 치료법) 및/또는 전이성 종양의 성장 감소를 위한 임의의 기타 치료적 전략과 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 이용한 치료의 효능은 생체 내에서, 예를 들어, 암의 마우스 모델에서, 그리고 예컨대, 실시예 10에서 정의된 바와 같은, 치료군과 대조군 사이의 종양 부피 변화, 종양 퇴행 %, 부분적인 퇴행 및/또는 완전 퇴행을 측정하여, 용이하게 분석할 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 위의 "항체" 섹션에 더 기술된 바와 같이 인간 LAMP1에 특이적으로 결합하고 위의 비종양 조직으로부터 종양 조직을 구분하는 본 출원인에 의해 개발된 항-LAMP1 항체(소위 항체 "MAb1", "MAb2","MAb3", huMAb1_1 및 huMAb1_2, huMAb1_3) 중 하나이다.
진단적 용도
본 발명에 따른 항체는 일부 LAMP1 발현은 비 종양 세포의 막에서 발생하지만, 위 상피 세포, 식도 상피 세포, 유방 상피 세포, 전립선 상피 세포, 고환 상피 세포에 제한되고, 일부 세포로 제한된다는 것을 밝혔다. 그럼에도 불구하고, 비-종양 시료의 막에서의 LAMP1발현에 대한 우세함 및 평균 강도는 종양에서 발견되는 것보다 낮다.
대신, LAMP1은 대장 선암종보다 피부, 후두, 및 연조직 종양뿐 아니라 위장관 암종(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 위, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)을 포함하는 다양한 다른 암종, 예를 들어, 피부, 후두, 및 연조직 종양뿐 아니라 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)의 표면에서 높게 발현된다. 따라서, LMAP1은 일정한 암의 마커를 구성하고 이에 따라 항암치료법의 효과를 나타내거나 질환의 재발을 검출하기 위해 사용될 가능성을 가진다.
특히, LAMP1은 대장, 직장, 폐 편평 세포 암종, 위, 유방 침습성 관 및 소엽 암종, 및 전립성 선암종 세포, 보다 구체적으로, 대장, 직장, 폐 편평 세포 암종, 유방 침습성 관 및 소엽 암종, 및 전립성 선암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암종의 표면에 높게 발현한다.
위의 챕터 '항체'에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 세포외 발현된 LAMP1을 검출하는 것을 최초로 허용하고 따라서 (최적 절삭 온도로부터) 동결-OCT 검체, 및 AFA(알코올 포르말린 아세트산 고정제)에 대하여 IHC 분석을 수행하게 하는 항체 MAb1, MAb2, MAb3 및 FFPE 포맷 내 LAMP1 강화를 가능하게 하고 따라서 비암성 조직으로부터 암 조직을 구분하는 것을 가능하게 하는 MAb4를 개발하였다.
바람직한 일 구현예에서, 치료제에 대한 환자의 민감성을 결정하고, 항암 치료법의 효능을 모니터링하거나, 치료 후 질병의 재발을 검출하기 위하여, LAMP1를 발현하는 종양을 표적으로 하는 치료법의 맥락에서 본 발명의 항체는 분석법의 구성요소로서 이용된다. 특히, 본 발명의 동일한 항체는 치료제의 성분으로서 그리고 진단 분석법의 구성요소로서 이용된다.
따라서, 본 발명의 추가적인 대상은 대상자에서 LAMP1 발현을 생체 내에서 검출하기 위한 용도, 또는 대상자의 생물학적 시료에서 LAMP1 발현을 생체 외에서 검출하기 위한 용도를 위한 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다. 상기 검출은 종양 세포에서 표면 단백질 LAMP1의 발현을 검출함으로써, 특히
a) 대상자에서 암의 존재 진단, 또는
b) LAMP1를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 면역접합체에 대한 암 환자의 민감도 결정, 또는
c) 특히 본 발명에 따른 면역접합체를 이용한 치료법에 대하여, 항-LAMP1 암치료법의 효능 모니터링 또는 항-LAMP1 암치료법 후의 암 재발 검출
을 의도한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 항체는 시험관 내 또는 생체 외 용도를 위한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 이용하여, LAMP1는 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료에서 시험관 내 또는 생체 외에서 검출될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 용도는 생체 내 용도일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 대상자에게 투여되며, 항체-세포 복합체가 검출되고/검출되거나 정량되고, 그것에 의해 상기 복합체의 검출은 암을 나타낸다.
또한, 본 발명은
a) 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히 항체가 상기 생물학적 시료와의 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
c) 결합된 항체의 측정된 수준, 암을 나타내는 대조군과 비교하였을 때의 결합된 항체의 증가된 수준을 비교하여 암의 존재를 검출하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 대상자에서 암의 존재를 검출하는 시험관 내 또는 생체 외 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암 환자의 LAMP1를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 면역접합체에 대한 민감도를 시험관 내 또는 생체 외에서 결정하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은
a) 암 환자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
c) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하며, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 LAMP1를 표적으로 하는 치료제에 민감한 환자를 나타낸다.
위의 방법에서, 상기 대조군은 정상, 비 암성, 동일한 유형의 생물학적 시료일 수 있고, 참조값이 동일한 유형의 정상적인 생물학적 시료 내 항체 결합 수준의 대표값을 결정하였다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 피부, 후두, 및 연조직 종양뿐 아니라 대장 선암종, 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)과 같은 LAMP1을 발현하는 암을 진단하는 데 유용하다.
또한, 본 발명은
a) 항-LAMP1 암 치료를 받는 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
c) 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 항-LAMP1 암 치료법의 효능을 시험관 내 또는 생체 외에서 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 감소된 수준은 상기 항-LAMP1 암 치료법의 효능을 나타낸다.
상기 방법에서, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 상기 항-LAMP1 암 치료법의 비효율성을 나타낸다.
상기 대조군은 특히 분석에 제출된 생물학적 시료와 동일한 유형의 생물학적 시료이나, 항-LAMP1 암 치료법 과정 중에, 이전에 시간에 맞춰 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료이다.
또한, 본 발명은
(a) 항-LAMP1 암 치료를 완료한 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
(b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
(c) 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 항-LAMP1 암 치료법 후의 암 재발을 시험관 내 또는 생체 외에서 검출하는 방법에 관한 것으로, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 항-LAMP1 암 치료법 이후의 암 재발을 나타낸다.
상기 대조군은 특히 분석에 제출된 생물학적 시료와 동일한 유형의 생물학적 시료이나, 항-LAMP1 암 치료 완료시 또는 완료 후, 이전에 시간에 맞춰 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료이다.
상기 항-LAMP1 암 치료법은 특히 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 사용하는 치료법이다. 상기 항-LAMP1 암 치료법은 LAMP1을 발현하는 암, 특히, 피부, 후두, 및 연조직 종양뿐 아니라 대장 선암종, 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장, 위 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소, 및 전립선)을 표적으로 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 형광성 분자, 방사성 분자 또는 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 표지와 같은, 검출 가능한 분자 또는 물질로 라벨링될 수 있다.
본 발명에 따른 항체와 관련하여, 본 출원에 사용된 용어 "라벨링된"은 방사성 물질 또는 형광단(예컨대, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5))과 같은 검출 가능한 물질을 폴리펩티드에 결합(즉, 물리적으로 연결)시키는 것에 의한 항체의 직접적인 라벨링뿐만 아니라, 검출 가능한 물질과의 반응성에 의한 폴리펩티드의 간접적인 라벨링을 포함하고자 한 것이다.
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 방사성 분자로 라벨링될 수 있다. 예를 들어, 방사성 분자는, 이에 제한되지는 않으나, 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 I123, I124, I125, In111, Re186, Re188, Tc99, 및 양전자 방사 단층 촬영을 위한 동위 원소, 예를 들어 Zr89, I124, Ga68 또는 Cu64를 포함한다.
"생물학적 시료"는 대상자로부터 얻어진 다양한 샘플 유형을 포괄하며, 진단 또는 모니터링 분석법에 이용될 수 있다. 생물학적 시료는 혈액 및 기타 생물학적 기원의 액체 시료, 생체 검사 시료 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손과 같은 고체 조직 시료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 생물학적 시료는 임상적 시료, 배양물 중의 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 시료, 특히 종양 시료를 포괄한다.
특히, 생물학적 조직은 동결-OCT(최적 절삭 온도) 또는 AFA(아세트산 포르말린 알코올) 시료로 제조될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 유리하게는 조직 시료를 수집하고 보관하기 위해 병원에서 사용되는 형식인 AFA 시료 상에서 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하거나 결정하는 것은, 예를 들어 FACS 또는 IHC와 같은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은
a) 검출 가능하게 라벨링된 본 발명에 따른 항체를 환자에 투여하기;
b) 영상화에 의해 환자에서 상기 검출 가능하게 라벨링된 항체의 국재성을 검출하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 대상자에서 암의 존재를 생체 내에서 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 암의 다단화(예컨대, 방사선 영상 촬영)에 유용할 수 있다. 그것들은 단독으로 또는 다른 암 마커들과 조합하여 이용될 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "검출" 또는 "검출된"은 대조군을 참조하여 또는 대조군 참조 없이 (수준을 측정하는) 정성적 및/또는 정량적 검출을 포함한다.
본 발명의 내용에서, 본 출원에 사용된 용어 "진단(diagnosing)"은 다수의 수집된 데이터로부터 대상자에 영향을 미치는 병리학을 확인하기 위해 의도된, 의학적 상태의 본질을 결정하는 것을 의미한다.
상기 방법에서, 암은 LAMP1을 발현하는 암, 특히, 피부, 후두, 및 연조직 종양뿐 아니라, 대장 선암종, 위장관 종양(소장, 직장, 귀밑샘), 생명 유지 기관 종양(폐, 간, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)이다.
암을 가지는 환자를 선택하는 방법
본 발명은 다음을 포함하는 암을 가지는 환자를 선택하는 시험관 내 방법에 관한 것이다:
a) 암 세포를 포함하는 암을 가지는 환자의 생물학적 시료 내에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하기; 및
b) LAMP1 유전자 카피 수 획득의 존재에 기반하여 환자를 선택하기.
일 구현예에서, 상기 방법은 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 암을 가지는 환자를 선택하기 위한 것이고, 상기 환자는 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 경우 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 것으로 선택된다. 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하지 않는 경우, 환자는, 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 종양 세포의 표면에서 LAMP1의 발현 또는 과발현이 LAMP1 유전자 카피 수 획득 외 다른 원인을 가질 수 있기 때문에, LAMP1의 세포 표면 발현의 검출에 기반하여 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 것으로 선택될 수 있다.
LAMP1 유전자 획득은 초점 체세포 획득 또는 증폭, 13q에 대한 체세포 대부위 획득 또는 증폭, 체세포 염색체 2배, 체세포 염색체 3배 또는 배수성에 관련될 수 있다. LAMP1 유전자 카피 수 획득 또는 증폭은 더 큰 앰플리콘 내에 포함된다. 본 출원에서 사용된 용어 "앰플리콘"은 다수의 선형 카피를 형성하는 유전체의 세그먼트를 지칭한다. 본 발명에 따르면, LAMP1 유전자 카피 수 획득을 야기하는 카피 수 변화를 거칠 수 있는 앰플리콘은 본원에서 LAMP1 앰플리콘이라고 불릴 것이다.
상기 " LAMP1 증폭"은 378 kb 및 34.2 MB 사이로 측정될 수 있는 DNA 부위를 포함한다. 상기 "LAMP1 획득"은 523 kb 및 95.8 MB 사이로 측정될 수 있는 DNA 부위를 포함한다.
일 구현예에서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 인간 염색체 13(NC_000013)상 염기 113785387로부터 염기 114240314까지 적어도 454 kb를 포함하는 대장 PDX에서 LAMP1 앰플리콘의 CNV에 의해 나타낼 수 있다. 상기 최소 LAMP1 앰플리콘은 LAMP1 외 다른 유전자, 예를 들어, 유전자 ADPRHL1 , CUL4A , DCUNID2 , GRTP1 , LAMP1 , LOC100130463, PCID2 , PRO7 , TFDP1 , TMCO3 및 F10를 함유한다.
다른 구현예에서, 상기 LAMP1 앰플리콘은 적어도 유전자 ADPRHL1 , ATP11A , ATP4B, CUL4A , DCUN1D2 , F10, F7, FAM70B , FLJ41484 , FLJ44054 , GAS6 , GRK1 , GRTP1, LAMP1 , LINC00552 , LOC100128430 , LOC100130463 , LOC100506063 , LOC100506394, MCF2L , MCF2L -AS1, PCID2 , PROZ , RASA3 , TFDP1 및 TMCO3C13orf35을 포함한다.
추가의 일 구현예에서, LAMP1 앰플리콘은 인간 염색체 13(NC_000013) 상의 염기 19,296,544로부터 염기 115,107,245까지의 95.8 Mb를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 뉴클레오티드의 위치는 NCBI 인간 유전체 서열(Build 37, Feb 2009)에 따라 지시된다. 당업자에게 유전체 서열은 한 개체로부터 다른 개체에서 다양하다는 것이 알려져 있다. 따라서, LAMP1 앰플리콘에 대하여 본원에 정의된 위치는 사용된 인간 유전체 서열에 따라 약간 변할 수 있다. 따라서, 유전체 서열 및 뉴클레오티드 위치를 비교하기 위한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
당업자로부터 잘 공지되어 있는 생물학적 시료 내 LAMP1 유전자 카피 수 변화의 존재를 결정하는 것을 허용하는 다수의 방법들이 존재한다. 이러한 방법들은, 제한없이, 마커 서열에 특이적인 DNA 프로브를 가지는 혼성화 방법, 예를 들어, 비교적 유전체 혼성화(CGH), 매트릭스-CGH, 어레이-CGH, 올리고뉴클레오티드 어레이, 대표적 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(ROMA), SNP 유전자형분석(genotyping)을 위한 고속 처리 기술, 예를 들어, Affymetrix SNP 칩, 및 정량적 PCR과 같은 증폭법을 포함한다.
특히, 상기 마커 LAMP1 유전자 카피 수 변화의 존재는 증폭, LAMP1 유전자 또는 LAMP1 앰플리콘 내 포함되는 유전자에 특이적인 DNA 프로브로의 혼성화에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 형광 제자리 혼성화(FISH), 비교 유전체 혼성화(CGH), 신세대 시퀀싱(New generation sequencing, NGS) 및/또는 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 구현된다.
따라서, 본 발명은 LAMP1 유전자 카피 수 획득이 FISH, CGH, NGS 및/또는 PCR로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 결정되는 방법에 관한 것이다.
정량적 PCR의 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 실시간 PCR, 경쟁적 PCR 및 방사성 PCR을 포함한다. 예를 들어, DNA 카피 수를 열거하기 위한 정량적 PCT 방법은 미국 특허 6,180,349에 기술되어 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 서열에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 증폭에 적합한 조건 하에 상기 표적 서열에 어닐링하고 DNA 합성의 개시 점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 통상적으로 증폭에서 최대 효율을 위한 단일 가닥이다. 특히, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머의 길이는 온도, 프라이머의 서열을 포함하는 몇몇 인자들에 의존하지만, 증폭 생성물의 합성을 개시하기에 충분히 길어야 한다. 일 구현예에서, 프라이머의 길이는 15 내지 35개 뉴클레오티드이다. 프라이머는 증폭 생성물의 검출, 고정화, 또는 조작을 가능하게 하는 추가적인 특징을 더 함유할 수 있다. 프라이머는 프라이머 및 표적-서열로 이루어진 혼성체에 특이적 형광 성질을 부여하는 공유적으로 결합된 형광 염료 또는 이중 가닥 DNA/RNA와 상호작용하여 형광 성질을 변화시킬 수 있는 비공유적으로 결합된 형광 염료를 더 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 형광 염료는, 예를 들어, SYBR-그린 또는 에튬 브로마이드이다.
본원에 사용된 "한 쌍의 프라이머" 또는 "프라이머 쌍"은 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭의 분야에서 흔히 사용되는 하나의 정방향 및 하나의 역방향 프라이머를 지칭한다.
본 출원에서 사용된 "프로브"는 염기-특이적 방식으로 핵산의 상보적 서열에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 핵산은 검출가능한 모이어티로 라벨링될 수 있다. 다양한 라벨링 모이어티가 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 모이어티는, 예를 들어, 방사성 화합물, 검출가능한 효소(예컨대, 호스 래디쉬 페록시다제(HRP)), 또는 발색, 형광, 화학적발광 또는 전기화학발광 신호와 같은 검출가능한 신호를 생성하는 임의의 다른 모이어티일 수 있다. 검출가능한 모이어티는 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 프로브는 길이에서 약 5 내지 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 약 20 내지 40개의 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 프로브는 33개의 뉴클레오티드를 포함한다.
당업자에게 공지된 바와 같은 용어 "혼성화하다" 또는 "혼성화"는 적합한 조건 하, 즉 엄격한(stringent) 조건 하, 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 핵산 분자의 결합을 지칭한다.
본 출원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격 조건"은 결정된 수준의 상보성을 가지는 핵산들 사이에서 결합 쌍을 생성하기에 적합하지만, 상기 결정된 수준보다 열등한 상보성을 나타내는 핵산들 사이에서는 결합 쌍의 형성에 적합하지 않은 조건에 해당한다. 엄격한 조건은 혼성화 및 세척 조건의 조합이고 서열 의존적이다. 이러한 조건들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 변경될 수 있다(Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). 일반적으로, 고 엄격 조건은 열적 용해점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록, 예를 들어 완벽한 염기-쌍 이중체의 Tm에 가까운 온도로 선택된다(Andersen, Nucleic acid Hybridization, Springer, 1999, p. 54). 혼성화 절차는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌(Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D.,Seidman, J.G., Smith, J. A., Struhl, K. eds. (1998) Current protocols in molecular biology. V.B. Chanda, series ed. New York: John Wiley & Sons)에 기술되어 있다.
고 엄격 조건은 통상적으로 5x SSC/5x 덴할트 용액(Denhardt's solution)/1.0% SDS 내 약 50℃ 내지 약 68℃에서의 혼성화 및 0.2x SSC/0.1% SDS 내 약 60℃ 내지 약 68℃에서의 세척에 관련된다.
일 구현예에서, 본 발명은 암 세포 내 평균 LAMP1 유전자 카피 수가 2.5 이상인 방법에 관한 것이다. 특히, 암 세포 내 평균 LAMP1 유전자 카피 수가 2.5 이상이고 5 미만일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 암 세포 내 평균 LAMP1 유전자 카피 수가 5 이상인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 LAMP1이 환자의 암 세포의 표면에서 발현되는지를 결정하는 것을 더 포함할 수 있고, i) 상기 환자는 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하고 환자의 상기 암 세포가 그들의 표면에 LAMP1을 발현하는 경우 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 것으로 선택되거나 ii) 환자의 상기 암 세포가 그들의 표면에 LAMP1을 발현하지 않는 경우 상기 환자는 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 없는 것으로 선택된다.
당업자로부터 잘 공지되어 있는 바와 같이 LAMP1이 암 세포의 표면에 발현되거나 동일한 조직 기원의 정상 세포(즉, 비종양)와 비교하여 과발현되는지를 결정하는 것을 가능하게 하는 다수의 방법들이 존재한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 제한없이, IHC, 웨스턴 블롯(WB), 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 면역형광(IF), 면역침강(IP) 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 포함한다.
일 구현예에서, 면역조직화학(IHC)은 LAMP1이 암 세포의 표면에 발현되거나 과발현되는지를 결정하기 위해 사용된다.
암 세포에 의한 LAMP1의 발현은, 예를 들어, 실시예 3에 기술된 항-LAMP1 항체를 사용하여 용이하게 분석할 수 있다.
본 발명자들은 LAMP1 획득이 대장결장 선암종, 위, 간, 폐(선암종 및 편평), 유방(기저, BRCA, LUMA, LUMB 및 HER2), 난소, 두경부, 신장(신장 뇌하수체, 신장 신투명세포 암종, 신장 신유두괴사), 세포 암종, 자궁경부 편평 세포, 췌장, 전립선, 방광요로상피종양, 신경교종(저등급 신경교종 및 다형성아교모세포종), 자궁, 갑상선, 백혈병, 림프종, 식도, 흑색종, 연조직 육종을 포함하는 28개의 종양 유형에서 검출된다는 것을 보여주었다. 높은 획득 또는 증폭은 유방, 자궁경부, 대장결장, 아교모세포종, 두경부, 간, 폐, 신경교종, 난소, 위 및 자궁암에서 검출된다.
따라서, 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 환자는 대장결장, 위, 간, 폐, 유방, 난소 및 두경부, 신장, 췌장, 전립선, 자궁, 신경교종, 방광, 갑상선 암 및 백혈병, 림프종, 식도, 흑색종 및 연조직 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 예를 들어, 대장결장, 위, 간, 폐, 난소, 두경부, 신장, 췌장, 전립선, 자궁, 신경교종, 방광, 갑상선 암 및 백혈병, 림프종, 식도, 흑색종 및 연조직 육종을 가지고 있다.
추가의 일 구현예에서, 환자는 유방, 자궁경부, 대장결장, 아교모세포종, 두경부, 간, 폐, 신경교종, 난소, 위, 및 자궁 암으로 이루어진 군; 또는 특히 자궁경부, 대장결장, 아교모세포종, 두경부, 간, 폐, 신경교종, 난소, 위, 갑상선 및 자궁암으로 이루어진 군; 또는 더욱 구체적으로 대장 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가지고 있다.
LAMP1 유전자 카피 수 획득 및 LAMP1의 높은 발현은 대장, 폐, 간, 췌장, 신장, 유방, 난소, 전립선, 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 표면에서 검출될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 암은 대장, 폐, 간, 췌장, 신장, 난소, 전립선, 위암, 예를 들어, 대장, 폐, 간, 췌장, 신장, 난소, 전립선, 위암으로부터 선택될 수 있다.
또한, LAMP1 유전자 카피 획득은 방광, 유방, 대장, 폐, 위 및 난소암 내 LAMP1 mRNA 발현에 상호관련된다. 대장, 위 및 폐 종양 PDX의 경우 LAMP1 유전자 카피 수 획득/증폭 및 종양 세포의 원형질 막에서의 LAMP1의 발현 사이에서 유의한 연관이 나타난다.
따라서, 본 발명의 방법의 추가의 일 구현예에서, 환자는 유방, 대장, 폐, 위, 및 난소로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가지고 있다. 다른 구현예에서, 환자는 대장, 폐, 위 및 난소로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가지고 있다.
"항-LAMP1 치료법"은 LAMP1을 표적으로 하는 치료제에 관련된 치료법이다. 일 구현예에서, 이러한 항-LAMP1 치료법은 항-LAMP1 항체 또는 면역접합체이다. 항-LAMP1 치료법은 이하에서 더 상세히 기술된다.
암은, 특히, 방광, 자궁경부, 대장결장, 아교모세포종, 두경부, 신장, 간, 폐, 신경교종, 난소, 췌장, 전립선, 위, 갑상선, 자궁암일 수 있다. 암의 다른 예는, 특히, 대장결장 또는 폐암이다.
키트
마지막으로, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 키트도 제공한다. 본 발명의 항체를 함유하는 키트는 표면 단백질 LAMP1의 검출, 또는 치료적 분석법 또는 진단적 분석법에서 용도를 찾는다. 본 발명의 항체는 고체 지지체, 예컨대, 조직 배양 플레이트 또는 비즈(예컨대, 세파로오스 비즈)에 결합된 폴리펩티드 또는 항체를 함유할 수 있다. 시험관 내에서 표면 단백질 LAMP1의 검출 및 정량을 위한 항체를 함유하는 키트가 예컨대, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 제공될 수 있다. 이러한 검출에 유용한 항체는 형광 또는 방사성 라벨과 같은 라벨과 함께 제공될 수 있다.
본 발명은 하기의 도면들 및 실시예들의 견지에서 더 예시될 것이다.
서열의 간략한 설명
서열 번호 1은 "MAb1" 항체의 VH 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 2 내지 4는 "MAb1" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 5는 "MAb1" 항체의 VL 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 6 및 7은 "MAb1" 항체의 CDR1-L, CDR3-L의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 8은 "MAb2" 항체의 VH 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 9 내지 11은 "MAb2" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 12는 "MAb2" 항체의 VL 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 13 및 14는 "MAb2" 항체의 CDR1-L, CDR3-L의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 15는 소위 "Mab2Can" 항체의 VH 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 16은 소위 "Mab2Can" 항체의 VL 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 17은 키메라 항체 "chMAb1" 항체의 중쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 18은 키메라 항체 "chMAb1" 항체의 경쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 19는 키메라 항체 "chMAb2" 항체의 중쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 20은 키메라 항체 "chMAb2" 항체의 경쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 21은 키메라 항체 "chMAb2Can" 항체의 중쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 22는 키메라 항체 "chMAb2Can" 항체의 경쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 23은 GenBank 데이터베이스로부터 수탁 번호 NM_005561.3하에 입수가능한 전장 인간 LAMP1의 DNA 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 24는 GenBank 데이터베이스로부터 NP_005552.3하에 입수가능한 전장 인간 LAMP1의 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 25는 GenBank 데이터베이스로부터 NP_034814하에 입수가능한 전장 마우스 LAMP1의 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 26은 GenBank 데이터베이스로부터 NP_036989하에 입수가능한 전장 랫트 LAMP1의 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 27은 GenBank 데이터베이스로부터 XP_002723509하에 입수가능한 전장 히말라야 원숭이(Macaca mulatta) LAMP1의 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 28은 C-말단 6개의 아미노산 His 태그가 이어지는, 펩티드 신호가 없는 인간 LAMP1 세포외 도메인 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 29는 6개의 아미노산 His 서열을 포함하는 C-말단 태그가 이어지는, 펩티드 신호가 없는 시노몰구스 원숭이 LAMP1 세포외 도메인 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 30은 C-말단 6개의 아미노산 His 태그가 이어지는, 펩티드 신호 없이 LAMP1의 마우스 루프 1 부위 및 LAMP1의 인간 루프 2~4를 포함하는 인간 및 마우스 LAMP1 키메라의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 31은 C-말단 6개의 아미노산 His 태그가 이어지는, 펩티드 신호 없이 LAMP1의 마우스 루프 1~2 부위 및 LAMP1의 인간 루프 3~4를 포함하는 인간 및 마우스 LAMP1 키메라의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 32는 6개의 아미노산 His 서열을 포함하는 C-말단 태그가 이어지는, 펩티드 신호 없이 LAMP1의 인간 루프 1~2 부위 및 LAMP1의 마우스 루프 3~4를 포함하는 인간 및 마우스 LAMP1 키메라의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 33은 6개의 아미노산 His 서열을 포함하는 C-말단 태그가 이어지는, 펩티드 신호 없이 LAMP1의 인간 루프 1~3 부위 및 LAMP1의 마우스 루프 4를 포함하는 인간 및 마우스 LAMP1 키메라의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 34는 6개의 아미노산 His 서열을 포함하는 C-말단 태그가 이어지는, 펩티드 신호가 없는 마우스 LAMP1 세포외 도메인의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 35는 "MAb1" 항체의 경쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 36은 "MAb1" 항체의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 37은 "MAb2" 항체의 경쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 38은 "MAb2" 항체의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 39는 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)의 예상 전장 LAMP1 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 40은 C-말단 10개의 아미노산 His태그가 이어지는, 펩티드 신호가 없는 인간 LAMP2 세포외 도메인의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 41은 인간 LAMP2의 전장 단백질 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 42는 "MAb3" 항체의 VH 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 43 내지 45는 "MAb3" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 46은 "MAb3" 항체의 VL 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 47 및 48은 "MAb3" 항체의 CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 49는 키메라 항체 "chMAb3" 항체의 중쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 50은 키메라 항체 "chMAb3" 항체의 경쇄의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 51은 항체 "MAb3 VL_R24_R93"의 경쇄의 가변 도메인의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 52는 항체 "MAb3 VL_R24_R93"의 CDR3-L의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 53은 인간화 항체 "huMAb1_1" 항체의 VH1 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 54는 인간화 항체 "huMAb1_2" 항체의 VH2 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 55는 인간화 항체 "huMAb1_3" 항체의 VH3 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 56은 인간화 항체 "huMAb1_1" 항체의 VL1 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 57은 인간화 항체 "huMAb1_2" 항체의 VL2 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 58은 인간화 항체 "huMAb1_3" 항체의 VL3 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 59는 "huMAb1_1" 항체의 경쇄 변이형 1 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 60은 "huMAb1_1" 항체의 중쇄 변이형 1 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 61은 "huMAb1_2" 항체의 경쇄 변이형 2 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 62는 "huMAb1_2" 항체의 중쇄 변이형 2 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 63은 "huMAb1_3" 항체의 경쇄 변이형 3 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 64는 "huMAb1_3" 항체의 중쇄 변이형 3 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 65는 36A 및 95A 돌연변이를 가지는 음성 대조군 "huMAb1_negA" 항체의 경쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 66은 101A 돌연변이를 가지는 음성 대조군 "huMAb1_negA" 항체의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 67은 266A 돌연변이를 가지는 음성 대조군 "huMAb1_negB" 항체의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 68은 결정화를 위한 재조합 huMAb1_1의 경쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 69는 C 말단 His-태그를 포함하는 결정화를 위한 재조합 huMAb1_1의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 70은 절단가능한 티오레독신(trx A) 태그, His-태그 및 트롬빈 절단 자리를 가지는 LAMP1의 인간 루프 1~2 부위의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 71은 태그되지 않은 hLAMP1-29-195의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 72는 서열 번호 24의 아미노산 101 내지 110에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 73은 서열 번호 24의 아미노산 144 내지 157에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 74는 서열 번호 24의 아미노산 174 내지 188에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 75는 서열 번호 24의 아미노산 29 내지 41에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 76은 서열 번호 24의 아미노산 68 내지 80에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 77은 서열 번호 24의 아미노산 29 내지 100에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 78은 서열 번호 24의 아미노산 97 내지 110에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 79는 서열 번호 24의 아미노산 173 내지 189에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 80은 서열 번호 70의 아미노산 132 내지 302에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 81은 키메라 항체 "chMAb3 VL_R24_R93"의 경쇄의 서열을 나타낸 것이다. 서열 번호 82는 서열 번호 24의 아미노산 360 내지 375에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 83 내지 85는 "MAb4" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 86 및 87은 "MAb4" 항체의 CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 88은 "MAb4" 항체의 VH1서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 89는 "MAb4" 항체의 VL1 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 90은 서열 번호 24의 아미노산 47 내지 61에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 91은 서열 번호 24의 아미노산 140 내지 155에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 92는 서열 번호 24의 아미노산 307 내지 321에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 93은 결정학을 사용하여 표준(canonical) 구조에 중요하고 따라서 인간 LAMP1의 결합에 중요한 것으로 확인된 잔기에 기반하여 MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/ huMAb1_3 항체 패밀리의 CDR1-L에 대한 공통 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 94는 결정학을 사용하여 표준 구조에 중요하고 따라서 인간 LAMP1의 결합에 중요한 것으로 확인된 잔기에 기반하여 MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/huMAb1_3 항체 패밀리의 CDR3-L에 대한 공통 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 95는 결정학을 사용하여 표준 구조에 중요하고 따라서 인간 LAMP1의 결합에 중요한 것으로 확인된 잔기에 기반하여 MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/huMAb1_3 항체 패밀리의 CDR1-H에 대한 공통 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 96은 결정학을 사용하여 표준 구조에 중요하고 따라서 인간 LAMP1의 결합에 중요한 것으로 확인된 잔기에 기반하여 MAb1/huMAb1_1/ huMAb1_2/huMAb1_3 항체 패밀리의 CDR3-H에 대한 공통 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 97은 서열 번호 24의 아미노산 35 내지 84에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 98은 "MAb4" 항체의 경쇄 서열을 나타낸 것이다.
서열 번호 99는 "MAb4" 항체의 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
도 1: 인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LAMP1 전장 단백질의 서열 정렬.
도 2: 단일클론 마우스 항체 Mab1 및 MAb2을 사용한 FACS 분석으로부터 유래한 LAMP1의 발현 프로파일.
도 3: 인간 LAMP1 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1과 MAb1의 반응성.
도 4: LAMP1에 대한 결합에 대한 MAb1(키메라)과 MAb2(쥐)의 경쟁 평가. 2차 항 hFc를 2차 항체 항-인간 Fc로, 그리고 2차 항 mFc를 2차 항체 항-마우스 Fc로 사용함.
도 5: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-chMAb1 접합체의 1차 인간 대장 선암종 CR-LRB-010P에 대한 항종양 활성의 평가.
도 6: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-chMAb1 접합체의 1차 폐 종양 LUN-NIC-0014에 대한 항종양 활성의 평가.
도 7: DM4-SPDB-chMAb1 접합체의 HRMS 데이터.
도 8: a) 카피 수 변화기 카테고리에 의한 LAMP1의 RNA 발현 강도의 상자도 b) 대장 종양 상에서 LAMP1 mRNA 발현에 따른 LAMP1 카피 수의 도표. 점은 개별적인 mRNA 발현을 나타내고, 막대는 평균값에 상응한다.
도 9: LAMP1 mRNA 및 카피 수 변화 데이터의 Sperman 상관 분석.
도 10: 연조직 육종(a), 코푸스(Corpus) 자궁내막양 암종(b) 및 유방 침습성 암종(c)에서의 카피 수 변화에 의한 RNA 발현 강도 및 LAMP1의 상자도.
도 11: a) 대장 종양 PDX에 대한 LAMP1 막 발현에 의한 LAMP1 카피 수의 막대그래프(IHC 카테고리 점수화) 및 b) 폐 및 위 종양 PDX에 대한 LAMP1 막 발현에 의한 LAMP1 카피 수의 막대그래프(IHC 카테고리 점수화).
도 12: 3종의 PDX(CR-IGR-034P, LUN-NIc-014 및 BRE-IGR-0159)에 대한 발현 프로파일 oMAb1, 2 및 3.
도 13: 파라토프의 일부인 Fab1의 잔기(즉, 항원 원자의 4A 내 원자들을 가지는 잔기)들을 보여주는 시각적 도면.
도 14: Fab1에 대한 에피토프를 형성하는 hLAMP1의 잔기(즉, 항원 원자의 4A 내 원자들을 가지는 잔기)들을 보여주는 시각적 도면.
도 15: hLAMP1 잔기들의 중첩 및 cLAMP1에 상응하는 G187E의 모델을 보여주는 시각적 도면. 187번 위치에 글리신으로부터 글루타민으로의 돌연변이를 수용하기 위해 필요한 hLAMP1의 Lys151, 및 Fab1-LC의 Tyr32의 배향의 차이가 표시되어 있다.
도 16: Fab1의 중쇄 잔기의 중첩 및 서열 번호 53의 중쇄 서열 내 I28Q 돌연변이 및 LAMP1과의 상호작용을 가지는 Fab1의 모델을 보여주는 시각적인 도면.
도 17: Fab1의 중쇄 잔기의 중첩 및 서열 번호 53의 중쇄 서열 내 N55R 돌연변이 및 LAMP1과의 상호작용을 가지는 Fab1의 모델을 보여주는 시각적인 도면.
도 18: DM4-SPDB-huMAb1_3 접합체의 HRMS 데이터.
도 19: DM4-SPDB-huMAb1_1 접합체의 HRMS 데이터.
도 20: DM4-SPDB-huMAb1_2접합체의 HRMS 데이터.
도 21: DM4-SPDB-chMAb2 접합체의 HRMS 데이터.
도 22: DM4- SPDB - chMAb3 VLR24 -R93 접합체의 HRMS 데이터.
도 23: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-huMAb1_1의 원발성 인간 대장 선암종 CR-LRB-010P에 대한 항종양 활성의 평가.
도 24: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-huMAb1_1의 인간 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159에 대한 항종양 활성의 평가.
도 25: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-huMAb1_1의 원발성 1차 인간 폐 종양 LUN-NIC-0070에 대한 항종양 활성의 평가.
도 26: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-chMAb2의 원발성 인간 대장 선암종 CR-LRB-010P에 대한 항종양 활성의 평가.
도 27: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-chMAb2의 인간 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159에 대한 항종양 활성의 평가.
도 28: SCID 암컷 마우스에서 DM4-SPDB-chMAb3의 인간 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159에 대한 항종양 활성의 평가.
도 29: chMAb1, chMAb2 및 chMAb3에 의해 매개되는 시험관 내 ADCC의 시각적인 도면.
도 30: a) HCT hu LAMP1 클론 8 LAMP1 항원 밀도: 160000 b) HCT hu LAMP1 클론 4 LAMP1 항원 밀도: 2000 및 c) HCT hu LAMP1 클론 12 LAMP1 항원 밀도: 5000을 이용한 LAMP1 항원 밀도에 대한 시험관 내 ADCC 의존성의 시각적인 도면.
도 31: chMAb1 및 DM4-SPDB-chMAb1(a) 또는 chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb2(b)의 시험관 내 ADCC 비교.
도 32: huMAb1_1에 의해 매개되는 시험관 내 ADCC.
도 33: DM4-SPDB-huMAb1_1에 의해 매개되는 시험관 내 ADCC.
도 34: a) Mab1_1이 없는 대식세포 및 표적 세포 및 b) 대식세포 및 표적 세포 및 Mab1_1을 이용한 ADCP의 유동세포계수 분석.
도 35: huMAb1_negB의 시험관 내 ADCP.
도 36: huMAb1_negA에 대한 시험관 내 ADCP의 소실.
도 37: (2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일) 비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4] 디아제핀-5(11aH)-온)DM4-SPDB-chMAb2 접합체를 이용하여 SNPP로 변형된 huMAb1_1 접합체의 HRMS.
도 38: 다클론 토끼 rAb4 항체를 이용한 인간 유방 암종 및 대장 선암종 환자로부터 유래된 이종이식 CR-LRB-010P의 FFPE 시료에 대한 면역조직학적 염색(IHC). 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행하였다. 또한, 다른 관계없는 항체는 음성이거나 세포내 면역염색을 나타내었다.
도 39: 1 μg/mL로 다클론 토끼 rAb4 항체를 이용한 FFPE 포맷에서의 면역세포화학(ICC).
도 40: 선암종 환자 유래 이종이식 CR-LRB-010P의 FFPE 시료에 대한 하이브리도마 88LAMP1-2로부터 수득된 MAb4로의 면역조직학적 염색(IHC). 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행하였다.
도 41: LAMP1(흑색) 또는 LAMP2(회색)에 대한 MAb4의 ELISA에 의한 결합 친화도.
실시예
실시예 1: 환자 유래 종양 이종 이식편(PDX)의 제조
실시예 1.1: CR - LRB -010P, CR - LRB -003P 및 CR - IGR -034P PDX의 제조
환자 수술 중에 수집된 종양 시료로부터 직접적으로 유래된 대장결장암 모델의 대규모 수집물이 개발되었다. 환자 유래 대장결장암 종양은 3개소의 의료 센터: 퀴리 연구소(Curie Institute, 프랑스 파리), 구스타브 로시 연구소(Gustave Roussy Institute, 프랑스 빌레쥐프) 및 라히부와지에르 병원(Lariboisiere Hospital, 프랑스 파리)에서 환자의 고지에 입각한 동의 후에 수집되었다. 수술 직후(평균 절제 후 1시간), 2개의 단편을 10 mmol/L HEPES, 4.5 g/L 글루코오스, 1 mmol/L 피루브산 나트륨, 200 U/mL 페니실린, 200 mg/mL 스트렙토마이신, 200 mg/mL 겐타마이신, 5 mg/mL 시프로플록사신, 20 mg/mL 메트로니다졸, 25 mg/mL 반코마이신 및 2.5 mg/mL 펀지존을 함유하는 DMEM 또는 이식을 위해 나노마이코퓰리틴(Nanomycopulitine, 앱시스(Abcys))이 있는 DMEM을 포함하는 배양 배지에 옮겼다. 환자 수술 후 2 내지 24시간 후에, 종양 시료를 2마리의 스위스 누드 마우스에 이식하였다. 작은 단편들(50 mm3)을 마취시킨 마우스(자일라진/케타민 또는 이소플루레인 프로토콜) 견갑골 영역으로 또는 옆구리에 피하 이식하였다. 적어도 주 1회 종양 성장을 측정하였고, 종양이 800 내지 1500 mm3의 부피에 이를 때, 각각의 주어진 종양의 일련의 단편 이식편들을 3 내지 5마리의 스위스 누드 마우스 또는 CB17-SCID(3계대 후) 마우스에 이식하였다(Julien, S. 2012, Clin. Cancer Res. 18(19):5314-5328).
실시예 1.2: LUN - NIC -0014 PDX 및 LUN - NIC -0070 PDX의 제조
비소세포 폐 암종 시료는 CHU 파스퇴르(CHU Pasteur, 프랑스 니스)에서 환자의 고지에 입각한 동의 후에 수집되었다. 수술 직후, 환자 종양 한 점을 AQIX 배지에 옮겨 사노피(Sanofi, 프랑스 슈흐 쎈느)로 보냈다. 환자 수술 이후 24 내지 48시간 후, 종양 시료를 2-5마리의 CB17-SCID 마우스에 이식하였다. 작은 단편들(50 mm3)을 마우스 옆구리에 피하 이식하였다. 적어도 주 1회 종양 성장을 지켜보았고, 종양이 800 내지 1500 mm3의 부피에 이를 때, 각각의 주어진 종양의 일련의 단편 이식편들을 5 내지 10마리의 CB17-SCID(3계대 후) 마우스에 이식하였다.
실시예 1.3: BRE - IGR -0159 PDX의 제조
유방 암종 시료는 구스타브 로시 연구소(프랑스 빌레쥐프)에서 환자의 고지에 입각한 동의 후에 수집되었다. 수술 직후(평균 수술 후 1시간), 4개의 단편을 DMEM, 페니실린, 스트렙토마이신 및 이식을 위해 펀지존을 포함하는 배양 배지에 옮겼다. 환자 수술 후 최대 12시간 후에, 종양 시료(단편들 약 50 mm3)를 4마리의 BALB 누드 마우스의 지방 패드에 이식하였다. 적어도 주 1회 종양 성장을 지켜보았고, 사노피(Sanofi, 프랑스 슈흐 쎈느)로 보냈다. 종양이 800 내지 1500 mm3의 부피에 이를 때, 각각의 주어진 종양의 일련의 단편 이식편들을 3 내지 5마리의 BALB 누드 마우스 또는 CB17-SCID 마우스(3계대 후)에 이식하였다.
실시예 2: 단일 클론성 마우스 항 LAMP1 항체의 생성 및 1차 스크리닝
면역화를 위해 실시예 1에 언급된 원발성의 분해된 종양 CR-LRB-010P 또는 CR-LRB-003P 또는 LUN-NIC-0014을 이용하여, 그리고 융합을 위해 P3X63-Ag8.653 골수종 세포를 이용하여 이전에 기술된 바와 같이, 면역화, 융합 및 스크리닝을 기본적으로 수행하였다. Wennerberg A.E 등(1993, Am. J. Pathol. 143(4): 1050-1054)이 기술한 전통적인 방법을 이용하여, 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스(S082342; 찰스 리버 연구소(Charles River Labs), 미국 메인 주 하버) 각각은 41일의 과정에 걸쳐 3회의 면역 조치를 받았다. 항원을 마우스의 배쪽 자리에 복강 내 투여하였다. 마지막 주사 후 3일째에, 마우스를 희생시키고, 비장을 무균적으로 분리하고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다. 비장으로부터 림프구를 방출시키고, 단일 세포 현탁액을 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 P3X63-AG8.653 골수종 세포와 융합시키기 전에 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 융합 후, 세포 혼합물을 37℃에서 16-24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그에 따른 세포 조제물을 선택적인 반고체 매질에 옮기고, 100 mm 페트리 플레이트상에 무균적으로 플레이팅하고, 37℃에서 배양하였다. 선택 개시 후 10일째에 플레이트를 대상으로 하이브리도마 성장을 조사하고, 보이는 콜로니를 집어 200 ㎕의 성장 배지를 함유하는 96웰 플레이트에 놓았다. 96웰 플레이트를 37℃에서 2~4일 동안 인큐베이터에 보관하였다.
포획 항원으로서 항-마우스 카파 경쇄 항체(베틸(Bethyl) #A90-119A)를 이용하여 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)에 의해 IgG 생산을 위한 1차 스크리닝을 수행하였다. PBS 내 0.5 μg/웰의 마우스 카파 경쇄 항체로 플레이트를 코팅하고, 100 μL/웰의 1차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37에서 1시간 동안 배양하고, 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS(PBS-T)로 5회 세척하였다. 그런 다음, 호스래디쉬 퍼록시다아제(피어스(Pierce) #31349)와 접합된 염소 항-마우스 IgG(Fc)의 1:50000 희석액 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 암소에서 1시간 동안 37에서 배양한 후, 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450의 파장에서 판독하였다. 쥐 IgG, C 카파 이소형의 항체를 추가적인 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 3: 면역 조직 화학법(IHC)에 의한 하이브리도마 스크리닝
종양 조직 CR-LRB-010P에 대해 얻어진 개별적인 하이브리도마 상층액을 면역 종양(CR-LRB-010P), 인간 비 종양성 대장 및 인간 비 종양성 피부의 동결 박편을 함유하는 매크로어레이 슬라이드 상에서 IHC로 스크리닝하였다. 비 종양성 대장 및 피부의 (최적 절단 온도로부터의) 동결 OCT 시료는 수술 사례(애스터랜드(Asterand), 유에스 바이오맥스(US Biomax), 스트라스부르 병원과 같은 상업적인 공급원)로부터 획득하였다. 자동화된 면역 염색은 벤타나 디스커버리(Ventana Discovery) 및 디스커버리 XT 자동화 시스템(벤타나 메디컬 시스템즈(Ventana Medical Systems, Inc), 미국)을 이용하여 수행하였다.
동결된 10 μm 크라이오스탯 절편을 1차 항원으로서 IgG 배양 상층액(미지의 농도, 인산염 완충 식염수 PBS 내 1/3 희석액)과 함께 37에서 40분 동안 배양하였다. 배양 배지를 음성 대조군으로 이용하였다. 4분 동안 글루타르알데히드(0.9% w/v 내 0.05%)로 후고정 단계를 행하였다. 2차 항체 애피니퓨어(Affinipure) 토끼 항-마우스 IgG(315-005_008, 잭슨 이뮤노서치 레버러토리즈(Jackson Immunosearch Laboratories, Inc.), 미국)를 4.8 μg/mL로 이용하고, 37에서 12분 동안 배양하였다. 제조사의 설명서에 따라 울트라맵 레드(UltraMap Red) 발색 검출 키트로 8분 동안 면역 염색을 행하였다. 이후에 크라이오스탯 절편을 헤마톡실린 II(790-2208, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국) 및 블루잉 시약(760-2037)으로 4분 동안 대비염색시켰다. 염색된 슬라이드를 건조시키고, 커버퀵(Coverquick) 2000 봉입제(라보노드(Labonord), Ref 05547530)를 이용하여 커버글래스로 봉하였다.
mAb로 면역 염색된 박편들을 현미경(니콘 이클립스(Nikon Eclipse) E400)으로 분석하였다. 면역 조직 화학 스크리닝 후, 관심 클론들을 종양성 대장 세포 영역들과 반응성을 나타내지만, 대장 점막의 정상적인 상피 세포와는 반응성을 나타내지 않는 것들로서 확인하였다. MAb1 항체는 종양 관련된 반응성의 증거를 나타냈고, 상피의 인간 비 종양성 세포에 대해 음성이었다.
MAb2 및 MAb3에 대해 비슷한 결과가 얻어졌다. 이러한 IHC 결과를 기초로 하여, MAb1 MAb2 및 MAb3을 추가적인 평가(MAb1에 대해 비 종양성 및 종양성 조직에 대한 광범위한 IHC 특성 분석을 포함)를 위해 정제하였다.
실시예 4: mAb 특성 분석
항체 MAb1 MAb2 및 MAb3을 대상으로, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 FACS에 의해 인간 원발성 분해 대장 종양에 대한 세포 표면 결합을 분석하였다.
EC50 값으로 표현된 겉보기 친화도를 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 추정하였다.
항체를 발현하는 마우스 하이브리도마를 T500 플라스크에 생성시키고, 성장 7일 후에 조정 배지를 수집하였다. 항체를 조정 배지를 단백질-G 컬럼을 통과시켜 정제하고, 세척하고, 글리신/HCl 100 mM pH 2.7 완충액으로 용리시켰다. 용리액을 멸균 여과 전에 PBS에 대해 투석시키고, 4에 보관하였다.
실시예 4.1: 유동 세포계수법에 의한 인간 원발성 대장 종양 PDX에 대한 항체 MAb1 및 MAb2의 겉보기 친화도
진행된 인간 원발성 대장 종양 CR-IGR-034P를 마우스에서 환자 유래된 이종 이식편으로부터 획득하였다. 종양 CR-IGR-034P를 IV형 콜라게나아제(인비트로젠(Invitrogen); #17104-019) 및 데옥시리보뉴클레아제 I(인비트로젠; #18047-019)을 이용하여 4에서 1시간 동안 효소적으로 해리시켰다. 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하는 Viacount 애플리케이션으로 세포 생존능력을 추정하였다. 겉보기 친화도 추정을 위해, CR-IGR-034P 종양 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(High Bind plate, MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 μL/웰의 항체를 4에서 45분 동안 분석용 희석제에 20 μg/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 μL/웰의 알렉사647과 접합된 염소 항-마우스 IgG(인비트로젠; #A2135) 또는 알렉사488과 접합된 염소 항-인간 IgG(인비트로젠; # A11013)를 4에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 μl/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. 진행된 인간 원발성 대장 종양 CR-IGR-034P으로 얻어진 EC50 값을 표 3으로 작성하였다.
CR-IGR-034P으로 얻어진 EC50
MAb1 MAb2 MAb3
CR-IGR-034P 5 nM 14 nM 6 nM
제조사의 설명서에 따라 마우스 IgG 캘리브레이터 키트(바이오사이텍스(Biocytex) #7208) 또는 인간 IgG 캘리브레이터 키트(바이오사이텍스 #CP010)를 이용하여 항체의 항체 결합 능력을 결정하였다. 항체 MAb1 및 MAb2 각각에 대해 CR-IGR-034P 상에서 230 000 및 180 000의 항체 결합 능력이 측정되었다.
실시예 4.2: 항체들은 다양한 암세포와 결합한다
MAb1 및 MAb2 항체들은 다양한 암세포와 결합한다 & 항체 결합 능력의 결정
항체들은 다양한 종양 세포와 결합할 수 있음을 실시예 4.1에 기술된 조건을 이용하여 유동 세포계수법으로 확인하였다. 종양 세포 패널은 상이한 기원 및 종양 세포주로부터의 환자 유래 종양 이종 이식편을 포함한다. 도 2는 발현 프로파일을 도시하고 있고, 표 4는 항체 결합 능력 결과를 요약한 것이다.
환자 유래 이종 이식편에 대한 FACS에 의한 항체 결합 능력

항체 결합 능력(ABC)
MAb1 MAb2
PDX /기원
CR-LRB-003P/대장결장 22 000 25 000
CR-LRB-010P/대장결장 95,000 140,000
CR-IGR-034P/대장결장 180,000 230,000
OVA-IGR-0022/난소 60,000 67,000
STO-IND-006/위 64,000 90,000
LUN-NIC-025/폐 27,000 33,000
LUN-NIC-014/폐 102,000 104,000
세포주/기원
Colo205/대장 4,000 6,000
SW480/대장 1,700 2,500
LS174T/대장 3,600 6,000
단일 클론성 항체 MAb1 및 MAb2는 대장결장, 난소, 위 및 폐 기원의 몇몇 PDX에서 높은 ABC를, 그리고 대장 기원의 PDX에서보다 세포주에서 더 낮은 ABC를 초래했다.
MAb3 항체들은 다양한 암세포와 결합한다
대장(CR-IGR-034P), 폐(LUN-NIC-014P) 및 유방(BRE-IGR-0159) 표시물로부터의, 진행된 인간 원발성 종양들을 실시예 1에 기술된 바와 같이 마우스에서 환자 유래의 이종 이식편(PDX)으로부터 획득하였다. PDX들을 IV형 콜라게나아제(인비트로젠(Invitrogen); #17104-019) 및 데옥시리보뉴클레아제 I(인비트로젠; #18047-019)을 이용하여 4℃에서 1시간 동안 효소적으로 해리시켰다. 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하는 Viacount 애플리케이션으로 세포 생존능력을 추정하였다. 종양 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 μL의 항체를 4℃에서 45분 동안 20 μg/ml로 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 μL의 알렉사488과 접합된 염소 항-인간 IgG(인비트로젠; # A11013)를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 μl/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. 평균 형광을 기록하고, 도 12에 나타낸 그래프로 작성하여 세 개의 PDX에 대한 세 가지 mAb들의 발현 프로파일을 도시하였다. 도 12에 제시된 결과는 MAb3이 Mab1과 Mab2와 마찬가지로, 대장, 폐 및 유방 기원으로부터의 상이한 환자 유래 이종 이식편과 결합함을 보여준다.
실시예 4.3: 이미지스트림 ( ImageStream ) 다중스펙트럼 영상화 유동 세포계수기(암니스 사( Amnis corp.))에 의한 LAMP1을 발현하는 대장 Colo205 종양 세포와 결합 후의 MAb1 , MAb2 및 MAb3의 내재화 점수
독자 생존 가능한 Colo205 세포들(5×105개 세포)을 6웰 플레이트의 웰 안에 시딩하고, 10 μg/ml의 알렉사플루오르488이 라벨링된 항체 MAb1 또는 알렉사플루오르488이 라벨링된 항체 MAb2 또는 알렉사플루오르488이 라벨링된 항체 MAb3와 함께 37℃/5% CO2(또는 음성 대조군을 위해 얼음 위에서 4℃)에서 4시간 동안 배양하였다. 세포들을 5분 동안 400 g에서 PBS 1% BSA 로 원심분리하여 세척하였다. 세포를 100 μL의 Perm/Fix 완충액을 이용하여 얼음 위에서 20분 동안 고정시키고, 투과 가능하게 만들었다. 세포를 400 g에서 5분 동안 1 mL의 Perm/Fix 완충액으로 원심분리하여 세척하였다.
내재화된 항체들이 리소좀에 축적되는지를 시험하기 위하여, mAb와 알렉사플루오르647 라벨링된 CD107a(리소좀 마커)의 동시 흡수를 수행하였다. 10 μg/mL의 라벨링된 알렉사플루오르647 항-CD107a 항체를 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 배양 후, 원심분리(400 g, 5분) 전에, 1 mL Perm/Wash 세포 완충액을 첨가하여 세척하였다. 세포를 얼음 위에서 20분 동안 200 μL 1% 포름알데히드로 고정시키기 전에, 상층액을 플레이트로부터 털어냈다. 세포의 형광도를 내재화 특성을 이용하여 이미지스트림 다중스펙트럼 영상화 유동 세포계수기(암니스 사(Amnis corp.))로 분석하였다. 각 실험 조건에 대해 5000개 이벤트가 얻어졌고, 상응하는 이미지를 IDEAS 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
형광 기반의 이미지스트림 영상화 유동 세포계수기에 의한 내재화 점수
mAb 내재화 점수(IS) 4, 4시간 내재화 점수(IS) 37, 4시간
MAb1 0.22 2.22
MAb2 0.19 2.24
MAb3 0.11 1.56
표 5에 나타난 바와 같이 단일 클론성 항체 MAb1 MAb2 및 MAb3는 Colo205 세포주에서 높은 내재화 점수를 초래했다.
실시예 4.4: 항- 알렉사488 항체 이용에 의한 알렉사488의 ?칭 , 내재화된 MAb1 분획의 세포 유동계수법 및 계산.
알렉사488이 라벨링된 MAb1(66nM)을 37℃ 또는 4℃에서 4시간 동안 완전 배지에서 6 x105개 Colo205 세포와 배양하였다. 세포를 차가운 원심분리기에서 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척하고, 얼음처럼 차가운 PBS에 희석시킨 500 nM ?칭 항-알렉사488 항체에 재현탁시켰다. 모든 관을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 세척하지 않고, 모든 세포를 실온에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드 2 부피에 고정시켰다. 파라포름알데히드를 PBS에서 1회 세척에 의해 제거하고, 세포를 PBS에 재현탁시키고, 유동 세포계수기(구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템)에서 분석하였다.
내재화 양성 대조군 실험을 알렉사488이 라벨링된 트랜스페린(600nM)으로 동시에 행하였다.
관당 5 x 104개 세포의 유동 세포계수법 측정값으로부터 얻어진 평균 형광 강도를 모든 계산에 이용하였다. 식에 기술된 바와 같이 37℃에서 ?치된 세포(세포 내 구획만)의 MFI 값을 ?치되지 않은 세포(세포 표면 및 세포 내 구획 모두)의 MFI 값으로 나누어 내재화를 계산하였다:
내재화된 분획의 백분율:
Figure pct00010
4℃에서 알렉사488이 표지된 화합물과 배양된 세포를 대조군으로 이용하였는데, 이는 항체의 내재화가 4℃에서는 유의미하게 발생하지 않기 때문이다.
37℃에서 4시간 후, 알렉사488-MAb1으로부터의 총 세포 형광의 약 97.0%는 세포 내였다. 그에 비해, 알렉사488-트랜스페린으로부터의 총 세포 형광의 약 98.5%가 세포 내였다. 트랜스페린은 Colo205 세포에 의해 매우 효율적으로 내재화된다고 알려져 있다.
?칭 후, 37℃에서 라벨링된 세포(세포 표면 및 세포 내 구획)로부터 측정된 알렉사488-MAb1의 형광은 4℃에서 라벨링된 세포(세포 표면)의 그것보다 10배 더 높았다. 4℃에서 세포 표면에서 측정된 알렉사488-MAb1의 형광은 항원 밀도에 비례하기 때문에, 종합된 위의 모든 결과는 각 LAMP1 분자가 실험 과정 중에 세포 막에서 재순환을 통해 여러(평균 10회) 내재화 사이클에 연루된다는 점을 나타낸다.
표 6에 나타난 바와 같이, 우리의 결과는 최초로 LAMP1이 세포 표면으로의 수용체 재순환을 통해 항체의 내재화를 매우 효율적으로 매개하는 수용체로서 기능할 수 있음을 보여주며, 특정 내재화 항체의 이용 가능성이 표적 독소, 약물 또는 단기의 동위원소가 암세포의 내부로 특이적으로 전달되게 하는 신규한 치료적 방법을 개발하는 데 도움이 될 수 있음을 시사한다.
유동 세포계수법에 의한 내재화 측정치
mAb 4 4 ?처 37 37 ?처
MFI, 알렉사488-MAb1 16.89 4.46 172.14 167.08
MFI, 알렉사488-트랜스페린 35.78 8.98 1228 1210
실시예 4.5: MAb1 , MAb2 및 MAb3 항체 항원 표적의 정제 및 확인
MAb1, MAb2 및 MAb3의 항원 표적은 제조사의 설명서에 따라 피어스 클래식(Pierce Classic) IP 키트(#26146)를 이용하여 인간 원발성 대장 종양 CR-LRB-010P 또는 CR-IGR-034P에 의해 풍부해진 막 분획으로부터 정제된다.
풀 다운된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 단백질을 질산은으로 염색하였다. 염색된 밴드를 겔-내 트립신 소화(in-gel tryptic digestion)시키고, 용리된 펩티드를 오비트랩(Orbitrap) 벤치탑 질량 분광분석기(써모(Thermo)) 상에서 탠덤 MS(LC-MS/MS)로 분석하였다. 마스코트(Mascot, 매트릭스 사이언스(Matrix Science)) 데이터베이스 검색 엔진과 함께, 미가공 MS/MS 데이터 분석은 LAMP1을 나타냈다.
이러한 표적은 실시예 6.2에 나타난 바와 같이 재조합 인간 LAMP1과 함께 ELISA로 확인하였다(서열 번호 28). 얻어진 EC50을 표 7과 표 11로 작성하였다.
재조합 인간 LAMP1(서열 번호 28의 29-382)에 대한 ELISA 값에 의해 결정된 EC50
항체 EC 50
MAb1 0.18 nM
MAb2 0.25 nM
실시예 4.6: LAMP1에 대한 특이성
LAMP2는 LAMP1에 대해 35% 서열 동일성을 나타내는 LAMP 패밀리의 가장 가까운 구성원이다. MAb1, MAb2 및 MAb3 항체들의 LAMP1에 대한 특이성을 평가하기 위하여, 이전에 기술된 동일한 코팅 조건을 이용하여 C 말단에 10개의 His 태그가 있는 재조합 인간 LAMP2(서열 번호 40)(R&D 시스템즈(Systems) 6228-LM)으로 96웰 플레이트를 코팅하였다. 항-LAMP1 항체들을 플레이트에 첨가하고, 호스래디쉬 퍼록시다아제(시그마; #A9044)와 접합된 토끼 항-마우스 IgG를 이용하여 검출하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다. MAb1, MAb2 및 MAb3 항체와 LAMP2와의 어떠한 결합도 검출되지 않았다.
실시예 4.7: 시노몰구스 원숭이 LAMP1과의 교차 반응성
항체 MAb1을 ELISA에 의해 영장류 LAMP1 단백질과 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 실시예 6.2에 기술된 바와 같이, 인간 LAMP1의 세포 외 도메인(서열 번호 24의 Ala29-Met382) 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1(서열 번호 39의 Ala27-Met380)을 준비하였다. 플레이트를 시노몰구스 원숭이 LAMP1 단백질(서열 번호 29)로 코팅하고, 항체 MAb1을 플레이트에 첨가하고, 호스래디쉬 페록시다아제(시그마; #A9044)가 접합된 토끼 항-마우스 IgG로 검출하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다. MAb1에 대해 도 3에 나타낸 바와 같이, 양 단백질에 대한 결합 친화도는 동일한 범위 내였다.
또한, 항체 MAb1을 재조합 HEK293 세포의 표면에 발현된 인간 LAMP1 및 영장류 LAMP1 단백질과 결합하는 능력에 대해 FACS에 의해 평가하였다. LAMP1을 부호화하는 DAN 서열인 참조서열 NM_005561.3(서열 번호 23)을 내부에서 클로닝하였다. 히말라야 원숭이 LAMP1의 CDS인 참조서열 XP_001087801(서열 번호 27)도 내부에서 클로닝하였다. 히말라야 원숭이와 필리핀 원숭이로부터의 성숙한 LAMP1의 예상 서열들은 99%까지 동일하며, 상기 서열은 히말라야 원숭이(서열 번호 27)의 11번 위치, 즉, 신호 펩티드에서, 하나의 추가적인 류신이 다르다. 히말라야 원숭이와 필리핀 원숭이의 성숙한 LAMP1 단백질은 동일하다. 다라서, 다음 실시예에 사용된 분비된 LAMP1은 시노몰구스 원숭이를 지칭한다. 양 CDS를 CMV 인핸서/프로모터 및 SV40 polyA 신호 하에서 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 제조사의 설명서에 따라 프리스타일(FreeStyle™) 맥스 293 발현 시스템을 이용하여 인간 LAMP1 또는 시노몰구스 LAMP1 플라스미드로 HEK293 세포(인비트로젠; #K9000-10)를 일시적으로 형질감염시켰다. 인간 LAMP1 형질감염 HEK293 세포와 시노몰구스 LAMP1 형질감염 HEK293 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 μL/웰의 항체 MAb1을 4℃에서 45분 동안 분석용 희석제에 20 μg/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 μL/웰의 알렉사647과 접합된 염소 항-마우스 IgG(인비트로젠; #A2135)를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 μl/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. MAb1에 대해 HEK293의 세포 표면에 일시적으로 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 LAMP1 각각에 대해 14 및 44 nm의 EC50으로, 결합 친화도는 동일한 범위 내였다.
항체 MAb1을 재조합 HCT116 안정적인 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 및 영장류 LAMP1 단백질들에 결합하는 능력에 대해 FACS에 의해 평가하였다. 세포의 게놈 DNA에서 인간 또는 시노몰구스 LAMP1 CDS의 안정적인 통합을 가능하게 하는 렌티바이러스 벡터에 의해 HCT116 세포를 감염시켰다. 상이한 밀도의 인간 또는 시노몰구스 LAMP1 세포 표면 국소화를 나타내는 개별적인 클론들이 HCT116 감염된 세포들의 풀로부터 유래되었다. 인간 또는 시노몰구스 LAMP1을 발현하는 HCT116 세포를 웰당 200 000개로 96웰 플레이트에 플레이팅하고, MAb1을 4℃에서 1시간 동안 분석용 희석제에 40 μg/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 2회 세척하였다. 100 μL/웰의 알렉사488과 접합된 염소 항-인간 IgG(인비트로젠; #A11013)를 4℃에서 1시간 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 2회 세척하였다. 원심분리 및 100 μl 고정 용액(PBS 내 포름알데히드 4%)에 재현탁시킨 후 항체 결합을 평가하였다. 갤럭시(Galaxy®) 유동 세포계수 시스템(파텍(Partec))을 이용하여 시료를 판독하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. 항체 MAb1은 재조합 HCT116의 세포 표면에서 발현된 인간 및 시노몰구스 LAMP1과 비슷한 친화도 및 각각 4.9 및 5.5 nM의 EC50으로 결합한다.
항체 MAb2를 재조합 HCT116 안정적인 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 및 영장류 LAMP1 단백질들에 결합하는 능력에 대해 FACS에 의해 평가하였다. 재조합 HCT116 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 μL/웰의 항체 MAb2를 4℃에서 45분 동안 분석용 희석제에 20 μg/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 μL/웰의 알렉사647과 접합된 염소 항-마우스 IgG(인비트로젠; #A2135)를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 μl/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. 항체 MAb2는 재조합 HCT116의 세포 표면에서 발현된 인간 및 시노몰구스 LAMP1과 비슷한 친화도 및 MAb2에 대해 각각 6.3 및 6.6 nM의 EC50으로 결합한다.
따라서, MAb1과 MAb2는 비슷한 친화도로 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 결합한다.
항체 MAb3을 각각 HCT116 또는 HEK293 안정 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 및 영장류 LAMP1 단백질들에 결합하는 능력에 대해 유동 세포계수법에 의해 평가하였다. HCT116 안정 클론을 위에 기술된 바와 같이 얻었다. 세포의 게놈 DNA에서 인간 또는 시노몰구스 LAMP1 CDS의 안정적인 통합을 가능하게 하는 렌티바이러스 벡터에 의해 HEK293 세포를 감염시켰다. 상이한 밀도의 시노몰구스 LAMP1 세포 표면 국소화를 나타내는 개별적인 클론들이 HEK293 감염된 세포들의 풀로부터 유래되었다. 프로토콜은 위의 실시예에 기술된 바와 같다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. 항체 MAb3은 HCT116 또는 HEK293의 표면에서 발현된 인간 및 시노몰구스 LAMP1과 비슷한 친화도 및 각각 7.6 및 4.0 nM의 EC50으로 결합한다.
따라서, MAb1, MAb2 및 MAb3은 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1에 대해 비슷한 친화도로 결합한다.
실시예 4.8: 본 발명에 따른 MAb 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항- LAMP1 H4A3 사이의 결합 경쟁
다음 실시예는 ELISA에 의하여 LAMP1 위의 에피토프에 대한 mAb들의 경쟁에 관한 정보를 제시한다. 그것은 실시예 6에 기술된 바와 같이 에피토프 결합 자리에서 얻어진 데이터를 확인시켜주며, 상업적으로 이용 가능한 항-LAMP1 mAb와의 비교를 가능하게 하였다.
MAb1 및 MAb2 사이의 결합 경쟁
LAMP1과의 결합에 대해 MAb2(쥐) 및 MAb1(키메라) 사이의 경쟁을 ELISA로 분석하였고, 이를 도 4에 도시하였다. 어떠한 경쟁도 관찰되지 않았다.
MAb1 및 MAb2 또는 MAb3 사이의 결합 경쟁
두 개의 항-LAMP1 mAb들 사이의 경쟁 실험을 (실시예 6.2에 기술된 바와 같이) 플레이트 상에 코팅된 재조합 인간 LAMP1을 이용한 ELISA로 수행하였다. 간략하게는, 두 개의 mAb들을 0.06 및 15 mg/L의 농도로 동시에 첨가하였고, 이때, 0.06 mg/L의 농도는 EC50과 근접하다. 두 개의 mAb들이 상이한 Fc 도메인들(인간 또는 쥐)을 가지도록 MAb 포맷을 선택하였다. mAb 결합의 개별적인 측정은 (Fcγ 단편 특이적인 페록시다아제-애피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-인간 IgG Ab(잭슨 109-035-098), 또는 Fcγ 단편 특이적인 페록시다아제-애피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-마우스 IgG Ab(잭슨 115-035-164)과 함께) Fc에 대한 그것들의 고유한 특이적인 결합에 의해 특이적으로 수행할 수 있다. 결과를 동일한 농도의 mAb 단독으로부터 얻어진 값의 백분율로서 보고하였다. 표 8 참조.
chMAb1 및 MAb2 또는 MAb3 사이의 경쟁
시료 ID 첨가된 mAb mAb 농도 2차 Ab mAb대조군 단독과 비교한 신호의 백분율
1 chMAb1
+ MAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 80%
2 chMAb1
+ MAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 100%
chMAb1 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 100%
chMAb1 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 0%
MAb2 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb2 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
3 chMAb1
+ MAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 80%
4 chMAb1
+ MAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 90%
MAb3 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
시료 ID 첨가된 mAb mAb 농도 2차 Ab mAb대조군 단독과 비교한 신호의 백분율
MAb3 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
5 chMAb1
+ MAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 10%
6 chMAb1
+ MAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 90%
MAb1 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb1 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
MAb1은 MAb2 또는 MAb3과 경쟁하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, MAb1에 대한 LAMP1 에피토프 결합 자리는 MAb2 또는 MAb3에 대한 에피토프 결합 자리와 중첩되지 않는다.
H4A3 및 MAb1 또는 MAb2 또는 MAb3 사이 및 MAb2 및 MAb3 사이의 결합 경쟁
항-LAMP1 H4A3(바이오레전드(BioLegend) 328602) 및 MAb1, Mab2, 또는 MAb3 사이 및 MAb2 및 MAb3 사이의 경쟁 실험을 위의 실시예 B4.81에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과를 동일한 농도의 mAb 단독으로부터 얻어진 값의 백분율로서 보고하였다. 표 9 참조.
H4A3 및 chMAb1 또는 chMAb2 또는 chMAb3 사이의 경쟁
시료 ID 첨가된 mAb mAb 농도 2차 Ab mAb 대조군 단독과 비교한 신호의 백분율
1 H4A3
+ chMAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 96%
H4A3
+ chMAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 98%
chMAb1 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 100%
chMAb1 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 0%
H4A3 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
H4A3 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
MAb1
+ chMAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 96%
MAb1
+ chMAb1		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 28%
MAb1 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb1 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
2 H4A3
+ chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 100%
H4A3
+ chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 57%
chMAb2 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 100%
chMAb2 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 0%
MAb2
+chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 100%
MAb2
+chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 9%
MAb2 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb2 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
3 H4A3
+ chMAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 100%
H4A3
+ chMAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 11%
chMAb3 15 mg/L 항-인간 IgG-HRP 100%
chMAb3 15 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 0%
MAb3
+ chMAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 100%
MAb3
+ chMAb3		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 15%
MAb3 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb3 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
4 MAb3
+ chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-인간 IgG-HRP 99%
MAb3
+ chMAb2		 0.06 mg/L
15 mg/L		 항-마우스 IgG-HRP 58%
MAb3 0.06 mg/L 항-인간 IgG-HRP 0%
MAb3 0.06 mg/L 항-마우스 IgG-HRP 100%
H4A3은 LAMP1과의 결합에 대해 MAb3과 경쟁하고, Mab2와 부분적으로 경쟁하고, MAb1과 경쟁하지 않는 것으로 나타났다.
MAb2와 MAb3은 LAMP1과의 결합에 대해 부분적으로 경쟁하는 것으로 나타났다.
실시예 5: 인간 비 종양성 및 종양성 조직에 대한 정제된 MAb1의 면역 조직 화학(IHC) 특성 분석
비 종양성 및 종양성 조직에 대한 광범위한 IHC 특성 분석에 의한 추가적인 평가 및 항체 검증을 위해 단일 클론성 항체 MAb1을 정제하였다. 따라서, 상업적인 조직-마이크로-어레이 또는 전체 크라이오스탯 절편으로부터의 대규모 패널의 인간 비 종양성 및 종양성 조직을 동결 OCT(최적 절단 온도) 또는 아세틱 포르말린 알코올(AFA) 또는 포르말린 환자 유래 인간 이종 이식편으로서 LAMP1 면역 반응성에 대해 시험하였다. 이용된 PDX 시료를 실시예 1에 기술하였다.
AFA 포맷에 대한 면역 염색법
벤타나 자동화 기기(디스커버리 XT, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)를 이용하여 전통적인 IHC를 수행하였다. 절편에서 밀랍을 제거하고, 아비딘 및 비오틴 블로킹 시약(Endogenous Block, 벤타나, 760-050)과 함께 배양한 후, Serum Block 배양(벤타나 760-4212)을 수행하였다. 그런 다음, 쥐의 단일 클론성 항체 MAb1을 37℃에서 1시간 동안 4 μg/mL의 최종 농도로 배양하였다. 4분 동안 글루타르알데하이드(NaCl 0.9% w/v 내 0.05%)로 후고정 단계를 행하였다. 비오틴이 부착된 2차 염소 항-마우스 IgG2a를 37℃에서 12분 동안 배양하였다(서던 바이오테크(Southern Biotech), Ref 1080-08 및 벤타나 희석제 내에 1/200 희석액). 제조사의 설명서에 따라 DAB 맵 발색 검출 키트로 면역 염색을 행하였다. 헤마톡실린 II(790-2208, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)와 함께 대조염색 단계를 크라이오스탯 절편에 적용하고, 블루잉 시약을 4분 동안 적용하였다(760-2037). 염색된 슬라이드를 건조시키고, 커버퀵 2000 봉입제(라보노드, Ref 05547530)를 이용하여 커버글래스로 봉하였다. 본 연구에 이용된 음성 대조군은 1차 항체의 생략 및 IgG2a 이소형(PBS 내 최종 농도 1 μg/mL)의 이용에 있다.
PFA 포맷에 대한 면역 염색법
벤타나 자동화 기기(디스커버리 XT, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)를 이용하여 전통적인 IHC를 수행하였다. 절편에서 밀랍을 제거하고, 항원 회수 세포 조정 1(CC1) 완충액(ref 950-123 벤타나)을 52분 동안 적용하였다. 절편을 아비딘 및 비오틴 블로킹 시약(Endogenous Block, 벤타나, 760-050) 및 Serum Block 시약(벤타나 760-4212)과 배양하였다. 그런 다음, 쥐의 단일 클론성 항체 MAb1을 37℃에서 1시간 동안 4 μg/mL의 최종 농도로 배양하였다. 4분 동안 글루타르알데하이드(NaCl 0.9% w/v 내 0.05%)로 후고정 단계를 행하였다. 비오틴이 부착된 2차 염소 항-마우스 IgG2a를 37℃에서 12분 동안 배양하였다(서던 바이오테크, Ref 1080-08 및 벤타나 희석제 내에 1/200 희석액). 제조사의 설명서에 따라 DAB 맵 발색 검출 키트로 면역 염색을 행하였다. 헤마톡실린 II(790-2208, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)와 함께 대조염색 단계를 크라이오스탯 절편에 적용하고, 블루잉 시약을 4분 동안 적용하였다(760-2037). 염색된 슬라이드를 건조시키고, 커버퀵 2000 봉입제(라보노드, Ref 05547530)를 이용하여 커버글래스로 봉하였다.
본 연구에 이용된 음성 대조군은 1차 항체의 생략 및 IgG2a 이소형(PBS 내 최종 농도 1 μg/mL)의 이용에 있다.
동결-OCT 포맷에 대한 면역 염색법
아비딘 및 비오틴 블로킹(Endogenous Block, 벤타나, 760-050) 후, 동결 절편을 37℃에서 32분 동안 (인산염 완충 식염수, PBS 내에 (인간 시료에 대해) 최종 농도 1 μg/mL 및 (원숭이 시료에 대해) 1 및 5 μg/mL의) 쥐 단일 클론성 항체 MAb1과 배양하였다. 4분 동안 글루타르알데하이드(0.9% w/v 내 0.05%)로 후고정 단계를 행하였다. 비오틴이 부착된 2차 염소 항-마우스 IgG2a를 37℃에서 12분 동안 배양하였다(서던 바이오테크, Ref 1080-08 및 벤타나 희석제 내에 1/200 희석액). 제조사의 설명서에 따라 DAB 맵 발색 검출 키트로 면역 염색을 행하였다. 헤마톡실린 II(790-2208, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)와 함께 대조염색 단계를 크라이오스탯 절편에 적용하고, 블루잉 시약을 4분 동안 적용하였다(760-2037). 염색된 슬라이드를 건조시키고, 커버퀵 2000 봉입제(라보노드, Ref 05547530)를 이용하여 커버글래스로 봉하였다.
본 연구에 이용된 음성 대조군은 1차 항체의 생략 및 IgG2a 이소형(PBS 내 최종 농도 1 μg/mL)의 이용에 있다.
데이터 분석
스캔 스코프(Scan Scope) XT 시스템(아페리오 테크놀로지스(Aperio Technologies), 미국 캘리포니아 주 비스타)을 이용하여 정제된 쥐 항체 MAb1으로 면역 염색된 절편들을 스캔하고 x20의 배율로 디지털화하였다. 그런 다음, 이미지 스코프 소프트웨어(v10.2.2.2319 아페리오 테크놀로지스)를 이용하여 디지털화된 영상들을 캡쳐하였다.
염색 평가는 몇몇 매개변수들을 포함하였다: 조직학적인 반응성 자리(세포질, 핵 또는 막), 반응성 세포의 주요 종류, 염색 강도 및 세포 염색 빈도. 양성 시료들을 1 내지 3의 강도 등급으로 점수화했다. 강도 범위를 음성(0), 약함(1), 보통(2) 및 강함(3)으로 설명하였다. 세포 빈도는 면역 염색된 세포의 백분율이고, 시료에 의해 중간값으로서 조직학자의 관찰에 의해 추정되었다. 세포 빈도는 5개 카테고리로 정리된다: 1(0-5%), 2(6-25%), 3(26-50%), 4(51-75%) 및 5(76-100%).
전체 발현을 올레드 점수(Allred score, AS) 설명에 따라 계산하였다. AS는 강도 및 비율 점수를 더하여 0-8 범위의 총점을 얻음으로써 획득하였다. AS는 최대 전체 점수의 백분율로 보고되었고, 5개의 카테고리로 분류된다: 매우 낮음(0-25%), 약함(26-50%), 보통(51-75%) 및 높음(76-100%). 유병률은 표시에 대한 양성 사례들의 백분율로 정의되었다.
기초적인 기술 통계학은 마이크로소프트 엑셀 2003으로 계산되었다. 각 표시에 대해, 사례의 수, 양성 사례 수, 유병률, 강도 점수 평균, 빈도 평균 및 올레드 점수가 기술되었다.
비 종양성 조직 분포
전체적으로, 실험 데이터는 비 종양성 성인 조직의 세포에 대한 LAMP1의 IHC 패턴이 대부분 세포질성임을 보여준다.
LAMP1은 중요 기관, 위장관, 생식, 비뇨기, 내분비, 림프 및 피부, 근육, 눈, 척수와 같은 기타 기관을 포함하는 대규모 패널의 조직들의 세포질에서 발현되었으며, 심장, 간, 췌장, 폐 및 신장 같은 주요 기관에서는 막 염색이 전혀 관찰되지 않았다.
그러나 막에서 일부 LAMP1 발현이 발생하였으나, 위 상피 세포, 식도 상피 세포, 유방 상피 세포, 전립선 상피 세포, 고환 상피 세포에 제한되었다(표 10).
그럼에도 불구하고, 비 종양성 시료의 막에서의 LAMP1 발현에 대한 유병률 및 평균 강도는 종양에서 발견된 것들보다 낮았다.
인간 비 종양성 시료에서 LAMP1 면역 염색 - 막 패턴
비 종양성 조직
조직
종류 		N 유병률
세포질 		유병률%
세포질 		유병률
막 		유병률%
막(평균) 		강도
막(평균) 		% +
세포
막(평균) 		세포
종류
위 28 28/28 100% 3/28 11% 2 16 상피 세포
식도 17 16/17 94% 2/17 12% 2.5 5 상피 기저 세포
유방 17 17/17 100% 6/17 35% 1.5 15 상피 세포
전립선 26 26/26 100% 1/26 4% 2 5 상피 세포
고환 14 14/14 100% 5/14 36% 2.2 12 생식+라이디히
종양성 조직 분포
인간 종양성 조직에서 MAb1 또는 MAb2를 이용하는 면역 조직 화학적 패턴은 항원이 종양성 조직의 세포질 및/또는 막에 위치함을 증명한다. 막 패턴을 보여주는 인간 종양성 시료에 대한 단백질 발현 데이터는 LAMP1 항원이 대장 선암종에 제한되지 않음을 보여준다. 위장관 종양(소장, 결장, 이하선), 중요 기관 종양(폐, 간, 위, 췌장 및 신장), 생식 기관 종양(유방, 난소 및 전립선)뿐만 아니라, 피부, 후두 및 연조직 종양들을 포함하는 다양한 기타 암종(표 11).
Figure pct00011
50% 초과의 막 빈도를 나타내는 시료(양성 세포)의 백분율을 기초로 한 LAMP1 발현 수준 측면에서 종양 표시의 순위를 나타냈다.
이러한 매개변수를 기초로, 제1 종양 표시는 대장, 결장, 폐 편평세포 암종, 유방 침습성 관암종 및 소엽암종, 위 선암종 및 전립선 선암종이었다.
추가적으로, 막에서 25-50%의 양성 세포를 나타내는 표시는 관련 있는 표시로 간주될 수 있으며, 소장 선암종, 이하선 선암종, 폐 선암종, 난소 선암종, 피부 악성 흑색종 및 후두 편평세포 암종을 포함한다(표 11).
또한, LAMP1 면역 염색은 다음의 종양 표시에서는 검출되지 않았다: 폐 소세포 암종(0/3), 식도 편평세포 암종(0/11), 자궁경부 편평세포 암종(0/3), 자궁 내막 선암종(0/3), 외음 편평세포 암종(0/6), 고환 정상피종(0/4), 고환 태생성 암종(0/1), 방광 이행세포 암종(0/1), 갑상선 유두상 선암종(0/3) 및 구강의 뮐러 혼합 종양(0/5).
실시예 6- 결합 자리 확인
본 실시예에서, LAMP1 도메인을 정의하고, 인간-쥐 하이브리드 LAMP1 단백질을 설계하여 LAMP1에 대한 항-LAMP1 mAb들의 결합 자리의 특성 분석을 가능하게 하는 분비된 LAMP1 단백질뿐만 아니라 막 결합 LAMP1 단백질을 생성하였다.
실시예 6.1: LAMP1 도메인의 정의
CD107a라고도 하는 LAMP1은 리소좀 연관 막 단백질 1이다. 그것은 약 120 kDa의 막관통 I형 단백질이다. 이러한 단백질은 18개의 N-당화 자리와 6개의 O-당화 자리가 있는 고도로 당화된 단량체이다. 그것은 힌지에 의해 분리된 두 개의 루멘 도메인으로 이루어져 있다. 각각의 루멘 도메인은 두 개의 루프를 정의하는 두 개의 이황화 다리를 가지고 있다. 참조서열 NP_005552.3(서열 번호 24)에 따르면, LAMP1의 상이한 도메인들은 표 1에 나타난 바와 같이 매핑되었다. 구조적 정보 및 특히 베타 가닥과 인간 및 마우스 LAMP1 사이의 아미노산 차이를 기초로 하여, 몇 가지 하이브리드 LAMP1 분자를 설계하였다.
실시예 6.2: LAMP1 단백질의 재조합 세포외 도메인의 제조
항원의 높은 수준의 당화는 LAMP1 상의 항-LAMP1 mAb의 결합 자리를 결정하는 데 특이적인 접근법을 요구하였다. LAMP1 단일 클론성 항체인 MAb1과 MAb2는 마우스 LAMP1 단백질에 대해 어떠한 결합도 나타내지 않는다. 이러한 결합의 부재를 이용하여, 인간 구성체 내의 LAMP1 도메인들(루프1 - 루프 4) 중 하나 또는 여럿이 쥐의 대응물로 교체된 여러 가지 키메라 LAMP1 단백질들을 설계하였다. 일단 항체의 결합 자리가 쥐의 대응물로 교체되면, 이러한 결합의 부재는 항체 결합 측의 확인을 허용하였다.
따라서, 표 12에 간략히 서술된 바와 같이 각각의 cDNA의 발현을 허용하는 플라스미드로 인간 배아 신장 HEK293 세포에서 일시적인 발현에 의해 인간, 시노몰구스 원숭이(c) 및 쥐(m) 기원의 LAMP1의 세포 외 단백질 도메인 또는 쥐와 인간 LAMP1 도메인들 사이의 하이브리드를 제조하였다.
각각의 발현 플라스미드를 293펙틴(fectin)™(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 복합체를 이루게 하고, 현탁액 배양된 293-F 세포(HEK293 세포로부터 유래됨)에서 형질감염 후 8일 후, 상응하는 가용성 단백질을 IMAC(GE 헬스케어(Healthcare))로 정제하여 단백질 배치를 생성하였다.
LAMP1 단백질의 재조합 세포 외 도메인에 대한 설명
단백질 명칭 단백질 도메인에 대한 설명 서열 번호
LAMP1::his태그 인간 LAMP1 (29-382) 서열 번호 28
cLAMP1::his태그 시노몰구스 LAMP1 (27-380) 서열 번호 29
mLAMP1_L1_LAMP1_L234::his태그 루프 1: 마우스 LAMP1 (25-94)
루프 2-4: 인간 LAMP1 (101-382)		 서열 번호 30
mLAMP1_L12_LAMP1_L34::his태그
 루프 1-2: 마우스 LAMP1 (25-189)
루프 3-4: 인간 LAMP1 (196-382)		 서열 번호 31
LAMP1_L12_mLAMP1_L34::his태그 루프 1-2: 인간 LAMP1 (29-195)
루프 3-4: 마우스 LAMP1 (190-369)		 서열 번호 32
LAMP1_L123_mLAMP1_L4::his태그
 루프 1-3: 인간 LAMP1 (29-309)
루프 4: 마우스 LAMP1 (299-369)		 서열 번호 33
mLAMP1::his태그 마우스 LAMP1 (25-369) 서열 번호 34
실시예 6.3: ELISA에 의한 결합 친화도 및 에피토프 결정
실시예 6.2에 기술된, 분비된 LAMP1 단백질들을 이용하여, ELISA에 의해 항-LAMP1 mAb에 대한 결합 도메인을 확인하였다. MAb1은 LAMP1의 루프 2를, MAb2는 LAMP1의 루프 1을, 각각 약 0.2와 0.3 nM의 LAMP1에 대한 EC50으로 인식한다.
쥐 또는 키메라 하이브리드 mAb들에 대해 얻어진 EC50 (nM)
단백질 인간 LAMP1
마우스 LAMP1 루프1:mLAMP1
루프2 - 4:hLAMP1 		루프1 - 2:mLAMP1
루프3 - 4:hLAMP1 		루프1 - 2:hLAMP1
루프3 - 4:mLAMP1 		루프1 - 3:hLAMP1
루프4:mLAMP1
항체
MAb1 0.18 결합 없음 0.15 결합 없음 0.18 0.16
MAb2 0.25 결합 없음 결합 없음 결합 없음 0.25 0.25
chMAb1 0.12 결합 없음 0.11 결합 없음 0.11 0.11
chMAb3 0.11 결합 없음 결합 없음 결합 없음 0.12 0.11
실시예 6.4: LAMP1 막관통 단백질의 발현
세포 내 리소좀을 표적으로 하는 모티프 GYQTI가 결실되고, 5-Ala 반복 서열로 교체된 LAMP1의 전체 부호화 서열을 암호화하는 포유동물 플라스미드로부터 일시적인 발현 후에 상이한 LAMP1 단백질들을 HEK293 세포의 세포막에서 발현시켰다. 포유동물 플라스미드는 실시예 6.2에 기술된 재조합 LAMP1을 생산하는 데 사용한 플라스미드와 비슷한 발현 신호를 가지고 있었다. 표 14는 실시예 6.3에서 ELISA에 의해 가용성 LAMP1 단백질로 얻어진 결과를 확인하고, 나아가 항-LAMP1 mAb의 결합 도메인들을 특성 분석하기 위하여 설계되었던 모든 플라스미드를 나열한 것이다.
LAMP1 막관통 단백질에 대한 설명
플라스미드 암호화된 단백질 LAMP1 막관통 단백질에 대한 짧은 설명 /
서열 번호 24에 따른 아미노산 위치
pXL5626 hLAMP1_ΔGYQTI 인간 LAMP1
pXL5668 LAMP1_mL1_hL234_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1에 쥐, L2 내지 L4에 인간
pXL5669 LAMP1_hL12_mL34_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1 및 L2에 인간, L3 및 L4에 쥐
pXL5719 hLAMP1_ΔglycaninL1_ΔGYQTI L1에 37, 45, 62, 76 및 84 위치에서 N>Q의 치환이 있는 인간 LAMP1
pXL5720 hLAMP1_ΔglycaninL2_ΔGYQTI L2에 103, 107, 121, 130, 165 및 181 위치에서 N>Q의 치환이 있는 인간 LAMP1
pXL5988 LAMP1_mL1_hL2_mL34_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1, L3 및 L4에 쥐
L2에 인간
pXL5997 LAMP1_hL1_mL2_hL34_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1, L3 및 L4에 인간
L2에 쥐
pXL5990 LAMP1_mseq6_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1; L2에 97 내지 110 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5991 LAMP1_mseq7_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 110 내지 128 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5992 LAMP1_mseq8_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 128 내지 144 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5993 LAMP1_mseq9_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 144 내지 157 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5994 LAMP1_mseq10_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 157 내지 173 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5995 LAMP1_mseq11_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 173 내지 189 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL5996 LAMP1_mseq12_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에 189 내지 196 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL6009 mLAMP1_ΔGYQTI 쥐 LAMP1
pXL6012 LAMP1_mseq1_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1에 29 내지 41 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL6013 LAMP1_mseq2_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1에 41 내지 56 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL6014 LAMP1_mseq3_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1에 56 내지 68 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL6015 LAMP1_mseq4_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1에 68 내지 80 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
pXL6017 LAMP1_mseq5_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L1/L2에서 80 내지 97 위치의 쥐 서열을 제외한 인간 서열
플라스미드 암호화된 단백질 LAMP1 막관통 단백질에 대한 짧은 설명 /
서열 번호 24에 따른 아미노산 위치
pXL6041 mLAMP1_hseq6-11_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에서 91 내지 104 및 L2에서 167 내지 183 위치의 인간 서열을 제외한 쥐 서열
pXL6047 mLAMP1_hseq6_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에서 91 내지 104 위치의 인간 서열을 제외한 쥐 서열
pXL6048 mLAMP1_hseq11_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에서 167 내지 183 위치의 인간 서열을 제외한 쥐 서열
pXL6092 mLAMP1_hseq6-9-11_ΔGYQTI 하이브리드 LAMP1
L2에서 91 내지 104 및 138 내지 151 및 167 내지 183 위치의 인간 서열을 제외한 쥐 서열
실시예 6.5: 유동 세포계수법에 의한 결합 친화도 및 에피토프 결정
실시예 6.4에서 기술된 각각의 발현 플라스미드를 실시예 6.2에서 간략히 설명한 프로토콜을 이용하여 현탁액에 배양된 293-F 세포 내에서 293펙틴(fectin)™ 과 복합체를 이루게 하였다. 형질감염 후 2일 후, 실시예 4.7에 언급된 바와 같이 세포를 처리하고, 유동 세포계수법(구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT)으로 분석하고, 평균 형광도를 기록하였다. 이 형광도는 결합의 반 정량적 평가를 나타낸다.
플라스미드 pXL5626, pXL5668, pXL5669, pXL5719 및 pXL5720로 얻어진 결과를 표 15에 요약하였다.
유동 세포계수법에 의한 LAMP1 단백질 상으로의 huMAb1_1, chMAb1, chMAb2 및 chMAb3의 결합 (평균 형광도)
플라스미드 pXL5626 pXL5668 pXL5669 pXL5719 pXL5720
단백질 hLAMP1_ΔGYQTI LAMP1_mL1_ hL234_ΔGYQTI LAMP1_hL12_mL34_ΔGYQTI hLAMP1_Δglycan inL1_ΔGYQTI hLAMP1_Δglycan
inL2_ΔGYQTI
huMAb1 _1 864
결합		 1112
결합		 934
결합		 1103
결합		 528
결합
chMAb1 1047
결합		 1059
결합		 1484
결합		 1113
결합		 1006
결합
chMAb2 1025
결합		 6
결합 없음		 814
결합		 458
결합		 958
결합
chMAb3 640
결합		 21
결합 없음		 764
결합		 706
결합		 765
결합
이러한 첫 번째의 막 결합 LAMP1 단백질과의 친화도 데이터 세트(표 15)는 분비된 LAMP1 단백질과의 실시예 6.3에서 보고한 ELISA 데이터와 일치한다. MAb1은 hLAMP1(서열 번호 24)의 L2 101번 내지 195번의 hLAMP1와 결합하고, MAb2 및 MAb3은 hLAMP1의 L1 29번 내지 100번 위치의 hLAMP1과 결합한다. 또한, 이러한 데이터는 세 개 중 어떠한 항-LAMP1도 글리코토프(glycotope)와 결합하지 않음을 보여주었는데, 이는 MAb1이 L2가 N-당화 자리가 전혀 없도록 조작된 LAMP1과 결합하고, MAb2와 MAb3은 L1이 N-당화 자리가 전혀 없도록 조작된 LAMP1과 결합하기 때문이다. 플라스미드 pXL5626, pXL5988, pXL5669, pXL5990 내지 pXL5997로 얻어진 결과를 표 16에 요약하였다.
유동 세포계수법에 의한 LAMP1 단백질 상으로의 huMAb1_1 및 chMAb2의 결합 (평균 형광도)
플라스미드 단백질 huMAb1 _1 chMAb2
pXL5626 hLAMP1_ΔGYQTI 1412
결합		 1498
결합
pXL5988 LAMP1_mL1_hL2_mL34_ΔGYQTI 1180
결합		 10
결합 없음
pXL5997 LAMP1_hL1_mL2_hL34_ΔGYQTI 25
결합 없음		 1167
결합
pXL5990 LAMP1_mseq6_ΔGYQTI 11
결합 없음		 1721
결합
pXL5991 LAMP1_mseq7_ΔGYQTI 1400
결합		 1412
결합
pXL5992 LAMP1_mseq8_ΔGYQTI 1440
결합		 1688
결합
pXL5993 LAMP1_mseq9_ΔGYQTI 545
결합		 1461
결합
pXL5994 LAMP1_mseq10_ΔGYQTI 1414
결합		 1555
결합
pXL5995 LAMP1_mseq11_ΔGYQTI 16
결합 없음		 1378
결합
pXL5996 LAMP1_mseq12_ΔGYQTI 1303
결합		 1365
결합
밸러스트 LAMP1 없음 1
결합 없음		 1
결합 없음
플라스미드 pXL5626, pXL6041, pXL6047, pXL6048 및 pXL6009로 얻어진 결과를 표 17에 요약하였다.
유동 세포계수법에 의한 LAMP1 단백질 상으로의 MAb1 및 MAb2의 결합 (평균 형광도)
실험 1 실험 2
플라스미드 단백질 MAb1 MAb2 MAb1
pXL5626 hLAMP1_ΔGYQTI 1748
결합		 1183
결합		 551
완전 결합
pXL6041 mLAMP1_hseq6-11_ΔGYQTI 680
결합		 28
결합 없음		 211
결합
pXL6047 mLAMP1_hseq6_ΔGYQTI 7
결합 없음		 25
결합 없음		 3
결합 없음
pXL6048 mLAMP1_hseq11_ΔGYQTI 6
결합 없음		 28
결합 없음		 2
결합 없음
pXL6092 mLAMP1_hseq6-9-11_ΔGYQTI 미실행 미실행 499
완전 결합
pXL6009 mLAMP1_ΔGYQTI 4
결합 없음		 21
결합 없음		 2
결합 없음
플라스미드 pXL5626, pXL6012 내지 pXL6015, pXL6017 및 pXL6009로 얻어진 결과를 표 18에 요약하였다.
유동 세포계수법에 의한 LAMP1 단백질 상으로의 MAb1 , MAb2 및 MAb3의 결합 (평균 형광도)
플라스미드 단백질 MAb1 MAb2 MAb3
pXL5626 hLAMP1_ΔGYQTI 914
결합		 757
결합		 749
결합
pXL6012 LAMP1_mseq1_ΔGYQTI 1027 105
낮은 결합		 2.8
결합 없음
pXL6013 LAMP1_mseq2_ΔGYQTI 990
결합		 694
결합		 803
결합
pXL6014 LAMP1_mseq3_ΔGYQTI 888
결합		 694
결합		 674
결합
pXL6015 LAMP1_mseq4_ΔGYQTI 891
결합		 27
결합 없음		 3
결합 없음
pXL6017 LAMP1_mseq5_ΔGYQTI 846
결합		 629
결합		 721
결합
pXL6009 mLAMP1_ΔGYQTI 13
결합 없음		 27
결합 없음		 3
결합 없음
표 16에 기술된 막 결합 LAMP1 단백질과의 친화도 데이터는 MAb1이 hLAMP1(서열 번호 24)의 L2 위치 101번 내지 195번의 LAMP1과 결합함을 증명하였다(pXL5626, pXL5988 및 pXL5997). 더욱 구체적으로는 MAb1은 97번 내지 110번 또는 173번 내지 189번 위치의 인간 LAMP1 잔기들이 쥐 LAMP1 잔기들로 교체된 하이브리드 LAMP1 단백질과 결합하지는 않지만, MAb1은 L2에서 110번 내지 173번 또는 189번 내지 196번의 인간 LAMP1 잔기들이 쥐 LAMP1 잔기들로 교체된 하이브리드 LAMP1 단백질과 결합한다. 또한, 144번 내지 157번 위치의 인간 LAMP1 잔기들이 쥐 LAMP1 잔기들로 교체될 때, 중요한 일부 결합이 상실된다. 또한, 표 17의 실험 1에 보고된 데이터는 97번 내지 110번 위치 및 173번 내지 189번 위치의 잔기들이 동시에 결합의 일부를 복원하는 데 필요함을 보여주었다. 표 17의 실험 2에 보고된 데이터는 루프 2에서 91번 내지 104번 위치 및 138번 내지 151번 위치 및 167번 내지 183번 위치의 잔기들이 동시에 MAb1의 완전 결합을 복원하는 데에 필요함을 보여주었다.
막 결합 LAMP1 단백질과의 유동 세포계수법에 의해 얻어진 이러한 친화도 데이터 세트(표 15, 16, 17 및 18) 및 실시예 6.3에서 기술된 분비된 LAMP1 단백질과의 ELISA 결과로부터, 다음의 결론이 도출될 수 있다:
MAb1은 LAMP1의 L2 101번 내지 195번 위치와 결합하고, MAb2 및 MAb3은 LAMP1의 L1 29번 내지 100번 위치와 결합한다.
세 가지 항-LAMP1 중 어떠한 것도 글리코토프와 결합하지 않는데, 이는 MAb1은 L2가 N-당화 자리를 갖지 않도록 조작된 LAMP1과 결합하고, MAb2와 MAb3은 L1이 N-당화 자리를 갖지 않도록 조작된 LAMP1과 결합하기 때문이다.
MAb1은 97번 내지 110번 위치의 인간 LAMP1 잔기들(서열 번호 78) 또는 173번 내지 189번 위치의 인간 LAMP1 잔기들(서열 번호 79)이 쥐 LAMP1 잔기들로 교체된 하이브리드 LAMP1 단백질과 결합하지 않는다. 그러나 그것은 L2의 110번 내지 173번 위치 또는 189번 내지 196번 위치의 인간 LAMP1 잔기들이 쥐의 LAMP1 잔기들로 교체된 하이브리드 LAMP1 단백질과는 결합한다.
MAb1은 L2 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용하고, 더욱 구체적으로는 MAb1은 101번 내지 110번 위치(서열 번호 72) 및/또는 174번 내지 188번 위치(서열 번호 74)의 서열 및 어느 정도는 144번 내지 157번 위치(서열 번호 73)의 서열 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용한다. 따라서, 우리는 이러한 결과들 및 쥐와 인간 서열들 사이의 아미노산 차이들로부터 R146, D150, K152, R106, A108, N181, S182, S183, R186 및 G187 중에서 인간 LAMP1 잔기들이 MAb1과 상호 작용할 가능성이 높다는 점을 추론할 수 있다.
MAb2는 L1 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용하고, 더욱 구체적으로는 MAb2는 68번 내지 80번 위치(서열 번호 76)의 서열 및 어느 정도는 29번 내지 41번 위치(서열 번호 75)의 서열 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용한다. 따라서, 우리는 이러한 결과들 및 쥐와 인간 서열들 사이의 아미노산 차이들로부터 A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75 및 R77 중에서 인간 LAMP1 잔기들이 MAb2와 상호 작용할 가능성이 높다는 점을 추론할 수 있다.
MAb3은 L1 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용하고, 더욱 구체적으로는 MAb3은 29번 내지 41번 위치(서열 번호 75)의 서열 및/또는 68번 내지 80번 위치(서열 번호 76)의 서열 내에 위치한 아미노산들과 상호 작용한다. 따라서, 우리는 이러한 결과들 및 쥐와 인간 서열들 사이의 아미노산 차이들로부터 A29, M30, M32, G36, A40, S69, D70, T72, V74, L75 및 R77 중에서 인간 LAMP1 잔기들이 MAb3과 상호 작용할 가능성이 높다는 점을 추론할 수 있다.
실시예 6.6: Ala 스캔에 의한 에피토프 결합에 관련된 개별적인 아미노산 결정
실시예 6.5에서 확인되고, β-가닥 구조에 관련되지 않은 개별적인 잔기들을, hLAMP1_ΔGYQTI로부터 유래되고 플라스미드 pXL5626(실시예 6.4)에서 암호화된 LAMP1 서열에서 알라닌 잔기로 개별적으로 교체하였다. pXL5626로부터 총 21개의 플라스미드가 제작되어(표 19 참조), 일시적인 형질감염 후에 HEK293 세포의 세포막에서 LAMP1 발현을 분석하는 데 이용되었다. 형질감염 후 2일 후, 세포들을 처리하고, 실시예 4.7에 언급된 바와 같이 유동 세포계수법(구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT)으로 분석하고, 평균 형광도를 기록하였다. 이러한 형광도는 결합에 대한 반 정량적인 평가를 나타낸다. pXL5626으로부터 암호화된 대조군 단백질에 비해 평균 형광도가 50% 초과하여 감소할 때, 결합의 상실을 표 19에 보고하였다.
Ala 스캔 LAMP1 막관통 단백질과의 항-LAMP1 mAb에 대한 결합의 상실
플라스미드 hLAMP1 _ ΔGYQTI에서
돌연변이의 위치 		MAb1에 대한 결합 MAb3에 대한 결합
pXL5626 없음
pXL6058 G36A
pXL6065 N37A
pXL6059 G38A 결합 상실
pXL6060 L67A
pXL6066 P68A
pXL6067 S69A
pXL6069 D70A 결합 상실
pXL6072 N107A
pXL6073 A108T
pXL6080 T109A
pXL6070 I149A 결합 상실
pXL6085 D150A 결합 상실
pXL6071 K151A
pXL6079 Y178A
pXL6074 L179A
pXL6075 S180A
pXL6076 N181A
pXL6077 F184A
pXL6081 R186A 결합 상실
pXL6082 G187A
LAMP1 단백질에서 Ala 치환으로 인한 I149, D150 및 R186 위치에서의 MAb1에 대한 결합의 상실은 이러한 위치들이 LAMP1에 대한 MAb1의 결합에 중요함을 나타낸다.
LAMP1 단백질에서 Ala 치환으로 인한 G38 및 D70 위치에서의 MAb3에 대한 결합의 상실은 이러한 위치들이 LAMP1에 대한 MAb2 결합에 중요함을 나타낸다.
실시예 7: mAb 서열들의 결정
실시예 7.1: mAb 서열들의 결정 및 키메라 mAb들의 생성
mAb의 가변 도메인들의 서열을 하이브리도마로부터 회수하고, 발현 벡터로 클로닝하여 클로닝된 mAb들이 최초의 쥐 mAb들과 동일한 특성을 나타내는지를 확인하였다.
단일 클론성 항체들의 가변 도메인들을 암호화하는 cDNA를 다음과 같이 획득하였다. cDNA를 100개의 하이브리도마 세포들 및 가변 부위와 불변 도메인을 암호화하는 cDNA의 5'-말단에 위치한 올리고뉴클레오티드로부터 RT-PCR(인비트로젠의 전사효소 SuperScript III 및 핀자임스(Finnzymes)의 중합효소 Phusion)에 의해 회수하고 시퀀싱하였다.
하이브리도마의 고분별능 질량 분광분석법( HRMS ):
전기분무 양성 모드(ES+)에서 워터스(Waters) Synapt G2 TOF 시스템 상에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: 컬럼: UPLC MassPrep 20 μm　　2.1×5 mm; 용매: A: H2O + 0.1% 포름산: B; CH3CN　+ 0.1% 포름산; 컬럼 온도: 80℃; 유속 0.2 mL/분; 기울기 용리(10분): 10% B 30초; 10부터 50% B까지, 7분 10초 내; 8분: 90% B; 8분 30초: 10% B; 10분: 10% B. LC/MS 분석 전에 시료를 Gdn.HCL 6M/DTT 1M 내에서 37℃에서 30분 환원시켰다.
유래된 아미노산 서열들은, 표 20의 중쇄 및 경쇄(LC, HC)의 N 말단 시퀀싱 및 질량 분광분석법(LC/MS)에 의한, 하이브리도마로부터 유래된 정제된 mAb들에 대해 얻어진 데이터와 일치하는 정보를 제공하였다. GenomeQuest로부터의 특허 받은 서열들에서는 동일한 서열들이 발견되지 않았다.
하이브리도마로부터의 항-LAMP1 mAb들의 질량 분광분석법
질량( Da )
클론 ID 쇄 배치로부터 LC/MS에 의한 질량 서열로부터 회수된 인실리코 ( in silico ) 값
MAb1 LC 23587 23587
HC (G0F) 50700 50700
MAb2 LC 23911 23911
HC (G0F) 50702 50704
MAb3 LC 23725+N-글리칸들로 인한 더 큰 질량 23723
HC (G0F) 50852 50848
가변 도메인 VH 및 VL의 핵산 서열들을 각각 인간 IgG1 또는 인간 C 카파 불변 도메인을 부호화하는 서열들과 융합하여 발현 벡터들 내로 클로닝한 다음, 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 293-F 세포들 내로 일시적인 발현에 의해 키메라 mAb의 배치를 생성하였다. 단백질 A 친화도 크로마토그래피(MabSelect, GE 헬스케어)에 의해 배치들을 정제하였다. 용리액을 멸균 여과 전에 PBS에 대해 투석시키고, 4℃에서 보관하였다.
LAMP1에 대한 친화도는 표 21에서 LAMP1과의 ELISA에 의해 얻어진 EC50에 의해 설명된 쥐 및 키메라 mAb들에 대해 비슷하게 유지되었다.
쥐 하이브리도마 및 상응하는 키메라 mAb에 대해 얻어진 EC50 (nM)
쥐 하이브리도마 mAb에 대해 얻어진 EC 50 키메라 mAb에 대해 얻어진 EC 50
클론 ID hLAMP1 클론 ID hLAMP1
MAb1 0.18 nM chMAb1 0.12 nM (분석법 A)
0.12 nM (분석법 B)
MAb2 0.25 nM chMAb2 0.12 nM (분석법 A)
chMAb2can 0.12 nM (분석법 A)
chMAb3 0.12 nM (분석법 B)
chMAb3VL_R24_R93 0.11 nM (분석법 B)
위에 기술된 데이터를 기초로, HC와 LC의 아미노산 서열들을 검증하였다.
MAb1의 LC 및 HC 서열들은 각각 서열 번호 35 및 서열 번호 36으로 나타내었다.
MAb2의 LC 및 HC 서열들은 각각 서열 번호 37 및 서열 번호 38로 나타내었다.
CDR 부위에 대한 서열들은 IMGT 명명법을 이용하여 단백질 서열들로부터 추론하였다.
chMAb1의 LC 및 HC 서열들은 각각 서열 번호 18 및 서열 번호 17로 나타내었고, chMAb2의 LC 및 HC 서열들은 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 19로 나타내었다. chMAb3의 LC 및 HC 서열들은 각각 서열 번호 49 및 서열 번호 50으로 나타내었다.
중요한, 정준(canonical) 잔기들을 클론 MAb2 내로 VL 상의 A9, L51, L58, G72 및 L108 위치에, VH 서열 상의 T116 위치에 도입하여, MAb2can을 생성하였다. MAb2can의 VH 및 VL의 상응하는 아미노산 서열들은 각각 서열 번호 15 및 서열 번호 16이다. chMAb2can의 VH 및 VL의 서열들은 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 22로 나타내었다.
클론 chMAb2can의 배치를 클론 chMAb2에 상응하는 배치와 동일한 조건에서 생성하였다. 이는 FR 내의 점 돌연변이가 결합에 어떠한 영향도 미치지 않고서도 이루어질 수 있으나, 더욱 중요하게는 생산 공정에 대한 대안을 제공할 수 있다는 점을 강조한다.
클론 chMAb3_VLR24-R93의 배치를 클론 chMAb3에 상응하는 배치와 동일한 조건에서 생성하였다. 이는 CDR 내의 점 돌연변이가 결합에 어떠한 영향도 미치지 않고서도 이루어질 수 있음을 강조한다.
SPR에 의한 LAMP1에 대한 친화도:
비아코어(BIAcore) 2000(BIAcore Inc., 미국 뉴저지 주 웁살라)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 쥐, 키메라 또는 인간화 항-LAMP1 mAb들의 결합 동역학을 결정하였다. 간략하게는, CM5 비아코어 바이오센서 칩을 기기에 도킹시키고, 실온에서 1:1 NHS/EDC 70 μL로 활성화시켰다. 마우스 항-α인간 Fc IgG1(비아코어 #BR-1008-39) 및 토끼 항-α쥐 Fc IgG1(비아코어 #BR-1008-38)(1M 아세트산염 완충액 pH5 내 50 μg/mL)을 모든 흐름 셀에서 활성화된 칩 상에 고정시켰다. 고정은 포화될 때까지 10 μL/분의 유속으로 수행하였다. 그런 다음, 칩을 70 μL의 에탄올아민-HCl, pH 8.5 주입으로 블로킹시키고, 항-α인간 Fc IgG1에 대해 3M MgCl2로 1회 세척, 항-α쥐 Fc IgG1에 대해 10 mM 글리신-HCl pH 1.7로 1회 세척하였다. 항-LAMP1 mAb들의 LAMP1에 대한 결합을 측정하기 위하여, 항체들을 비아코어 전개 완충액(HBS-EP)에 1-5 μg/mL로 이용하였다. 항원(실시예 6.2에 기술된 바와 같이 생산된 서열 번호 28 단백질)을 1 내지 256 nM 주입하였다. 주입 단계 완료 후, 600초 동안 동일한 유속으로 비아코어 전개 완충액에서 해리를 모니터링하였다. 주입들 사이에 2 x 5 μL MgCl2 3M(2 x 30초) 또는 항-α쥐 Fc IgG1을 위해 1 x 30 μL 10 mM 글리신-HCl pH 1.7(180초)를 이용하여 표면을 재생하였다. BIA 평가 소프트웨어를 이용하여 개별적인 센서그램을 분석하였다.
쥐, 키메라 또는 인간화 mAb에 대한 LAMP1과의 친화도를 표 22에 보고하였다. 그것은 MAb 포맷과는 무관한 것으로 나타났다.
MAb1은 4.8 내지 8.2 nM 범위의 KD로 LAMP1과 결합한다.
MAb2는 63.5 내지 68.8 nM 범위의 KD로 LAMP1과 결합한다.
MAb3은 4.7 내지 7.2 nM 범위의 KD로 LAMP1과 결합한다.
상업적으로 이용 가능한 항-LAMP1 mAb(H4A3(바이오레전드 328602)은 유의미하게 더 높은 KD를 나타내어, 약 100 nM의 Kd로, Mab1, Mab 2 및 MAb 3보다 더 낮은 결합 효율성을 나타낸다.
쥐, 키메라 또는 인간화 mAb에 대한 LAMP1에 대한 결합 동역학
Mab k a ( M - 1 .s -1 ) k d ( s -1 ) K D ( nM)
Mab1 14.8E+04 0.71E-03 4.8
huMAb1_1 19.1E+04 1.57E-03 8.2
chMAb2can 7.21E+04 4.96E-03 68.8
Mab2 6.33E+04 4.02E-03 63.5
chMAb3VL_R24_R93 17.3E+04 1.25E-03 7.2
MAb3 24.2E+04 1.13E-03 4.7
쥐 H4A3
(바이오레전드 328602)		 5.80E+04 6.09E-03 105
실시예 7.2: MAb1으로부터 유래된 인간화 변이형의 획득 및 특성 분석
본 실시예에서는, 쥐의 모 IgG MAb1의 인간화 변이형을 인실리코로 설계하였다. 그 결과에 따른 huMAb1 변이형들을 생산하여, 키메라 chMAb1과 유사한 특성을 제공하였다.
실시예 7.2.1 인간화 항- LAMP1 huMAb1의 설계
CDR 그래프팅을 기초로 한 인간화
본 접근법은 모 쥐 MAb1의 CDR들을 관련 있는 인간 FR들로 이식하는 데에 있다. 쥐 MAb1의 가변 가벼운 부위 및 무거운 부위를 IMGT 정보 시스템(Lefranc et al. Nucl. Acids. Res. 2009, 37:D1006-D1012)으로부터의 인간 배선 서열들과 비교하여, 인간화 MAb1 부위(huMAb1)의 기초로 기능할 인간 가벼운 및 무거운 가변 서열들을 선택하였다.
마우스 경쇄 가변 부위는 인간 배선 카파 경쇄 IGKV1-27에 대해서 V 부위에 걸쳐 68.8% 동일성과 FR 단독 내에서만 74.7%를 나타냈다. 결합 부위(joining region)의 경우, 마우스 J 부위는 인간 배선 IGKJ4에 대해 90% 동일성을 나타냈다. 결과적으로, 76.4%의 전체 배선성 지수(global germinality index, FR에 대해서만 계산된 동일성)가 주어진 인간 J 부위 IGKJ4와 결합된 인간 V 부위 IGKV1-27이, 마우스 MAb1 경쇄의 인간화를 위한 인간 수령체 서열들로 선택되었다. 그런 다음, 이것은 항-LAMP1 MAb1 경쇄의 인간화 변이형의 기초가 되었으며, 이는 쥐 MAb1 Vk 부위의 CDR 및 인간 IGKV1-27_ IGKJ4 부위의 FR을 포함하였다.
마우스 중쇄 가변 부위는 V 부위에 걸쳐 65.3% 동일성 및 인간 무거운 가변 배선 IGHV1-69에 대해 FR 단독 내에서만 70.0% 동일성을 나타냈다. 결합 부위의 경우, 마우스 J 부위는 인간 무거운 결합 배선 IGHJ4에 대해 78% 동일성을 나타냈다. 결과적으로, 71.4%의 전체 배선성 지수(FR에 대해서만 계산된 동일성)가 주어진 인간 배선 J 부위 IGHJ4와 결합된 인간 배선 V 부위 IGHV1-69가, 쥐 MAb1 무거운 부위의 인간화를 위한 인간 수령체 서열들로 선택되었다. 그런 다음, 이것은 항-LAMP1 MAb1 중쇄의 인간화 변이형의 기초가 되었으며, 이는 쥐의 MAb1 Vh 부위의 CDR 및 인간 IGHV1-69_ IGHJ4 부위의 FR을 포함하였다.
그러나 일부 FR 잔기들도 항체의 생물학적 활성에 중요한데, 그것들이 CDR들의 입체배좌 및 이에 따른 항원 결합에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 모 항체의 결합 특이성 및 친화도를 보유하기 위하여 FR이 그래프팅된 항체의 선택된 위치에 쥐 아미노산에 대한 역 돌연변이가 도입될 수 있다. 따라서, 설계 공정의 다음 단계는 이들 아미노산 잔기들 중 임의의 것이 CDR 루프의 입체배좌 또는 배향을 변경할 가능성이 있는지를 결정하기 위하여 인간화 변이형의 단백질 서열들을 연구하는 것이었다. 쥐 항체 및 인간화 항체 모두의 가변 부위들의 3D 상동성 모델을 악셀리스 소프트웨어사(Accelrys Software Inc.)의 디스커버리 스튜디오(Discovery studio) 3.1의 모델 항체 프레임워크 프로토콜을 이용하여 구축하였다.
쥐 MAb1의 VL 및 VH 서열들을 단백질 데이터베이스(PDB)(Berman et al. Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242)와 비교하였다.
PDB 식별번호 2ADF의, 항혈전 단일 클론 항체 82D6A3의 구조적 모델을 경쇄에 대해 주형으로 이용하였고(경쇄 프레임워크에 대해 96.6% 동일성), PDB 식별번호 3D85의, 중화 FAB와 복합체를 이룬 IL-23의 구조적 모델을 중쇄에 대한 주형으로 이용하였다(중쇄 프레임워크에 대해 83.5% 동일성).
동일한 방식으로, 인간화 변이형(인간 FR 및 쥐 CDR)의 VL 및 VH 서열들을 단백질 데이터베이스(PDB)(Berman et al. Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242)와 비교하였다. PDB 식별번호 3AAZ의 모델을 경쇄에 대해 주형으로 이용하였고(경쇄 프레임워크에 대해 86.6% 동일성), PDB 식별번호 3KDM의 모델을 중쇄에 대해 주형으로 이용하였다(중쇄 프레임워크에 대해 84.3% 동일성)(모든 PDB 참조번호는 2013년 11월 26일 이용 가능한 PDB 식별번호를 지칭한다).
양 3D 상동성 모델인 쥐 MAb1과 인간화 버전을 비교하였고, 마우스 버전로부터 인간 버전으로의 각각의 아미노산 치환을 주의깊게 살폈다. 마우스 잔기의 인간 잔기로의 치환이 CDR의 입체배좌에 영향을 줄 수 있는 위치에서 이루어졌을 때, 쥐 잔기에 대한 역 돌연변이를 수행하였다.
분자 동역학 궤도(Molecular dynamic trajectory)를 기초로 한 인간화(4D 인간화 프로토콜)
이후, (그래프팅 프로토콜에 대한 위의 섹션에서 기술한 바와 같이) 쥐 MAb1의 3D 상동성 모델의 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 일반화 보른 속용매(Generalized Born implicit solvent)에서 1.1 나노 초(ns) 동안 500K 온도로 단백질 백본에 대한 제한 하에서 수행하였다. 이러한 첫 번째 MD 실행으로부터 마지막 1 나노 초 동안 매 100 피코 초(ps)마다 10개의 다양한 입체배좌를 추출하였다. 그런 다음, 이들 다양한 입체배좌를 대상으로 단백질 백본에 대한 제한 없이, 300K 온도에서, 2.3 ns 동안 각각 MD 시뮬레이션을 수행하였다. 10회의 MD 실행 각각에 대해, MD 궤적으로부터의 매 ps마다 1개씩의 마지막 2,000 스냅샷을 참조 메도이드(medoid) 위치와 비교하여 각 쥐 MAb1 아미노산에 대해 평균 제곱근 편차(rsmd)를 계산하는 데에 이용하였다. 주어진 아미노산의 10개의 개별적인 MD 실행에 대한 평균 rmsd를 모든 MAb1 쥐 아미노산들의 전체 평균 rmsd와 비교하여, MD 중에 보이는 것처럼 아미노산이 충분히 유연한 경우, B 세포 수용체와 상호 작용할 가능성이 높으며 면역 반응의 활성화를 담당할 가능성이 높다고 간주하기로 한다. 쥐 MAb1 항체에서 CDR 및 이의 5Å 바로 인접한 것들을 제외한, 28개 아미노산이 유연한 것으로 확인되었다.
그런 다음, 분자 역동학 시뮬레이션의 20 나노 초(10 x 2 ns) 동안, 60개의 가장 유연한 쥐 MAb1 아미노산들의 운동을 49개의 인간 3D 상동성 모델(이들 각각에 대해서는 동일한 MD 시뮬레이션이 실행되었다)의 상응하는 유연한 아미노산의 운동과 비교하였다. 이러한 49개의 인간 모델은 7개의 인간 경쇄(즉, vk1, vk2, vk3, vk4, v람다1, v람다2, v람다3)의 대표적인 패널을 7개의 인간 중쇄(즉, vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)의 대표적인 패널과 체계적으로 조합하여 구축되었다.
쥐 MAb1 항체의 유연한 아미노산과 비교하여, vk1-vh1b 조합은 이의 유연한 아미노산의 가장 높은 4D 유사성을 나타냈다. 따라서, 이 모델을 유연한 아미노산을 초점으로 하는 MAb1 항체를 인간화하는 데 이용하였다. 쥐 Mab1과 vk1-vh1b 아미노산 사이의 쌍별 아미노산 회합을 위하여, 2가지 상응하는 상동성 모델의 알파 탄소들의 최적 3D 중첩을 기초로 하여 두 서열들을 정렬시켰다.
또한, 그에 따른 인간화 MAb1 항체의 안정성을 향상시키기 위하여, CDR을 제외한, 그것들의 각각의 정준 서열에 대해, 낮은 발생 빈도를 나타내는 경쇄 및 중쇄의 아미노산들은 본래 가장 빈번하게 발견된 아미노산들로 돌연변이되도록 제안된다(ΔΔGth > 0.5 kcal/mol; Monsellier et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). LC 및 HC에 대한 공통적인 돌연변이들의 제1 목록은 가장 근접한 인간 모델에서 발견된 아미노산들로 한정되었다(즉, vk1-vh1b). 이러한 돌연변이들 중 어느 것도 "버니어(Vernier)" 구역(Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499)에 위치하고 있지 않다. 항-LAMP1 MAb1 항체를 잠재적으로 안정화하기 위한 이러한 공통적인 돌연변이들을 고려하는 데 있어서 다른 기준들이 고려된다. 이러한 기준들은 표면에서의 소수친수성의 긍정적인 변화 또는 예측된 돌연변이의 안정화를 기초로 한 분자 역학이다. 문헌 (Bedouelle, H. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593; Steipe B. J. Mol. Biol. 1994, 240, 188-192)에서 성공적이었다고 보고된 안정화 돌연변이가 고려되었다.
그에 따른 인간화 VL 및 VH 부위
양 접근법, CDR 그래프팅 및 4D 프로토콜을 기초로 하여, 가변 경쇄에 대해 3개의 버전(VL1, VL2 및 VL3) 및 가변 중쇄에 대해 3개의 버전(VH1, VH2 및 VH3)이 제안되었다. 각 인간화 MAb1 VL 및 VH 변이형에서 돌연변이된 아미노산 잔기들의 특정 조합을 각각 표 23과 표 24에 기재하였다. 인간화 VH 및 VL 도메인의 완전한 아미노산 서열을 표 25에 기재하였다.
가변 경쇄 부위에 대해:
서열 번호 56의 인간화 VL1 변이형은 서열 번호 5의 마우스 서열과 비교할 때 총 12개의 돌연변이를 나타낸다. 이러한 변이형은 6개의 역 돌연변이가 이루어진 인간 배선 IGKV1-27_IGKJ4 서열들의 프레임워크로부터 유래하는데, 이는 그것들이 mAb 구조, CDR 입체배좌에 부정적인 영향을 미치고, 따라서 그 표적에 대한 결합에 부정적인 영향을 미친다고 의심되기 때문이다. 또한, 43번 및 83번 위치의 아미노산의 경우, IGKV1 배선에 존재하는 더욱 빈번한 아미노산에서의 돌연변이(A43 및 F83)가 바람직했다.
서열 번호 57의 인간화 VL2 변이형은 2개의 돌연변이를 나타내는데, 이들은 쥐 MAb1 경쇄의 비 CDR의 가장 유연한 아미노산들과 vk1 인간 경쇄 서열 사이의 직접적인 비교로부터 유래한다.
서열 번호 58의 인간화 VL3 변이형은 VL2로부터 유래하며, 공통적이고(vk1 서열) 잠재적으로 안정화하는 6개의 새로운 돌연변이를 포함한다.
huMAb1의 개별적인 인간화 경쇄들에서 돌연변이된 아미노산 잔기들의 특정한 조합, 따라서, huMab1_1, huMab1_2 및 huMab1_3의 VL을 표 23에 기재하였다.
항-LAMP1 MAb1 항체의 VL 변이형의 돌연변이
마우스 MAb1
VL 		HuMab1 _1 (VL1) HuMAb1 _2 (VL2) HuMAb1 _3 (VL3)
P9 S9 S9
L15 V15 V15 V15
G17 D17
K18 R18
D38 Q38
G43 A43
R45 K45 K45
P56 S56
I58 V58 V58
S72 T72
F73 L73 L73
S74 T74 T74
N77 S77
I83 F83
L103 V103
가변 무거운 부위에 대해:
VH1 변이형(서열 번호 53)은 마우스 서열(서열 번호 1)과 비교하여 총 15개 잔기들의 치환을 나타낸다. 이러한 변이형은 9개의 역 돌연변이가 이루어진 인간 배선 IGHV1-69_IGHJ4 서열들의 프레임워크로부터 유래하는데, 이는 그것들이 mAb 구조, CDR 입체배좌에 부정적인 영향을 미치고, 따라서 그 표적에 대한 결합에 부정적인 영향을 미친다고 예상되기 때문이다. 또한, CDR들 근처의 서열 번호 1의 K74를 T로 돌연변이시켜, 접합 공정에 의해 표적화되는 경우의 잠재적인 문제를 예상하였다.
VH2 변이형은 7개의 돌연변이를 나타내는데, 이는 6개의 돌연변이는 쥐 MAb1 중쇄의 비 CDR의 가장 유연한 아미노산들과 vh1b 인간 중쇄 서열 사이의 직접적인 비교로부터 도출되고, 여기에 서열 번호 1의 K74의 T로의 돌연변이를 더한 것으로, 접합 공정에 의해 표적화되는 경우의 잠재적인 문제를 예상한다.
VH3 변이형은 VH2로부터 유래하며, 공통적이고(vh1b 서열) 잠재적으로 안정화하는 7개의 새로운 돌연변이를 포함한다.
huMAb1의 개별적인 인간화 경쇄들에서 돌연변이된 아미노산 잔기들의 특정한 조합, 따라서, huMab1_1, huMab1_2 및 huMab1_3의 VH를 표 24에 기재하였다.
항-LAMP1 MAb1 항체의 VH 변이형의 돌연변이
마우스 MAb1
VH 		HuMab1 _1
(VH1) 		HuMab1 _2 (VH2) HuMab1 _3 (VH3)
Q5 V5 V5 V5
L11 V11
V12 K12
A16 S16
M20 V20
K38 R38
K39 Q39
S40 A40
S61 A61
K65 Q65 Q65 Q65
D66 G66 G66
K67 R67 R67
K74 T74 T74 T74
S76 T76
Q82 E82 E82 E82
R85 S85 S85 S85
T87 R87
S91 T91 T91
S115 T115 T115
A118 S118 S118 S118
그에 따른 인간화 서열들을 대상으로 면역 에피토프 데이터 베이스(Immune Epitope Data Base, IEDB)((PLos Biol (2005) 3(3)e91) http://www.immuneepitope.org)에 대해 서열 유사성을 블라스트하여, 서열들 중 어느 것도 열거된 임의의 공지된 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 함유하고 있지 않음을 확인하였다.
인간화 VH 및 VL 도메인들의 완전한 아미노산 서열들을 표 25에 기재하였다.
인간화 항-LAMP1 항체들의 VH 및 VL 아미노산 서열
VH 또는 VL 변이형 서열 서열 번호
huMAb1_1 VH1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTN
YNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYSQ
KFQGKATLTADTSTSTTYMELSSLRSEDTAVY
YCVRANWDVAFAYWGQGTLVTVSS		 서열 번호 53
huMAb1_2 VH2 QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTN
YNIHWVKKSPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYSQ
KFQDRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDSAVY
YCVRANWDVAFAYWGQGTLVSVSS		 서열 번호 54
huMAb1_3 VH3 QVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYIFTN
YNIHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNGDAPYAQ
KFQGRATLTADTSSSTTYMELSSLTSEDTAVY
YCVRANWDVAFAYWGQGTLVTVSS		 서열 번호 55
VH 또는 VL 변이형 서열 서열 번호
huMAb1_1 VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIDRY
MAWYQDKPGKAPRLLIHDTSTLQSGVPSRFS
GSGSGRDYTLTISNLEPEDFATYYCLQYDNLW
TFGGGTKVEIK		 서열 번호 56
huMAb1_2 VL2 DIQMTQSPPSLSASVGGKVTITCKASQDIDRY
MAWYQDKPGKGPKLLIHDTSTLQPGIPSRFS
GSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLW
TFGGGTKLEIK		 서열 번호 57
huMAb1_3 VL3 DIQMTQSPSSLSASVGGKVTITCKASQDIDRY
MAWYQQKPGKGPKLLIHDTSTLQPGVPSRFS
GSGSGRDYSLTISSLEPEDIATYYCLQYDNLW
TFGGGTKLEIK		 서열 번호 58
실시예 7.2.2: 세 개의 인간화 항- LAMP1 huMAb1 변이형의 생산 및 특성 분석
실시예 7.2.1에 기술된 인간화 가변 VH 및 VL 도메인들을 암호화하는 상응하는 핵산 서열들을 Geneart에서 합성하고, 각각 인간 IgG1 또는 인간 C카파 불변 도메인과 융합하여 발현 벡터 내로 클로닝한 다음, 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 293-F 세포 내에서 일시적인 발현에 의해 인간화 mAb의 배치를 생성하였다. 세 개의 mAb를
- LC1(VL1-huCk)(서열 번호 59) 및 HC1(VH1-huIgG1)(서열 번호 60)을 함유하는 huMAb1_1,
- LC2(VL2-huCk)(서열 번호 61) 및 HC2(VH2-huIgG1)(서열 번호 62)를 함유하는 huMAb1_2,
- LC3(VL3-huCk)(서열 번호 63) 및 HC3(VH3-huIgG1)(서열 번호 64)을 함유하는 huMAb1_3이라 지칭하였다.
음성 대조군을 생성하고, huMAb1_negA라 지칭하였다. 그것은 LCnegA(VL1_36A-95A-huCk)(서열 번호 65) 및 HCnegA(VH1_101A-huIgG1)(서열 번호 67)을 함유한다.
또 다른 대조군을 생성하고, huMAb1_negB라 지칭하였다. 그것은 LC1(VL1-huCk)(서열 번호 59) 및 HCnegB(VH1-huIgG1_266A)(서열 번호 68)를 함유한다. huIgG1에서 돌연변이 266A는 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991)에 기술된 명명법에 따라 D265A 돌연변이에 해당한다. 그것은 FcγR에 대한 결합 및 ADCC를 유의미하게 감소시킨다고 보고되었다(Lund et al., J. Immunol., 157:4963-4969, 1996　; Shields et al., J. Biol. Chem., 276(1): 6591-6604, 2001).
또한, FcγR I, II 및 III에 대한 결합의 유의미한 감소는 재조합 단백질과의 ELISA에 의해서도 검증되었다(재조합 인간 FcγRI / CD64 참조번호 1257-FC-050, 재조합 인간 FcγRIIA / CD32a 참조번호 1330-CD-050/CF, 재조합 인간 FcγRIIIa/ CD16a, 참조번호 4325-FC-050, 이 모두는 R&D 시스템으로부터 얻었다).
배치를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(MabSelect, GE 헬스케어). 용리액을 멸균 여과 전에 PBS에 대해 투석시키고, 4℃에서 보관하였다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 고분별능 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 데이터는 아미노산 서열들로부터 회수된 인실리코 값과 일치하였다. 표 26 참조.
인간화 항-LAMP1 mAb의 질량 분광분석법
질량( Da )
mAb ID 쇄 배치로부터 LC/MS에 의한 질량 서열로부터 회수된 인실리코 값
huMAb1_1 LC1 23483 Da 23483 Da
HC1 (G0F) 50219 Da 50219 Da
huMab1_2 LC2 23375 Da 23376 Da
HC2 (G0F) 50209 Da 50209 Da
huMAb1_3 LC3 23318 Da 23318 Da
HC3 (G0F) 50176 Da 50175 Da
huMAb1_negA LCnegA 23277 Da 23277 Da
HCnegA
(G0F)		 50103 Da 50104 Da
huMAb1_negB LC1 23484 Da 23484 Da
HCnegB
(G0F)		 50175 Da 50175 Da
실시예 6.2에 기술된, 분비된 인간 LAMP1 단백질을 이용하여 인간화 항-LAMP1 mAb에 대한 결합 도메인을 ELISA에 의해 결정하였다. LAMP1에 대한 친화도는 표 27의 LAMP1과의 ELISA에 의해 얻어진 EC50에 의해 설명된 바와 같이 키메라 및 인간화 mAb에 대해 유사하게 유지되었다. huMAb1_negA로는 결합이 검출되지 않았다.
키메라 및 인간화 mAb에 대하여 LAMP1으로 얻어진 EC50 (nM)
mAb ID hLAMP1
chMAb1 0.09 nM
huMAb1_1 0.11 nM
huMAb1_2 0.11 nM
huMAb1_3 0.12 nM
huMAb1_negA 검출된 결합 없음
huMAb1_negB 0.07 nM
실시예 7.2.3: 시노몰구스 원숭이 LAMP1과의 huMAb1 _1, huMAb1 _2 및 huMAb1_3의 교차 반응성
HuMAb1_1, huMAb1_2 및 huMAb1_3 항체들을 대상으로 각각 HCT116 또는 HEK293 안정 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 또는 시노몰구스 LAMP1 단백질과 결합하는 능력을 유동 세포계수법으로 평가하였다. HCT116 안정 클론은 실시예 4.7에 기술된 바와 같이 획득하였다. HEK293 안정 클론은 실시예 4.7에 기술된 프로토콜에 따라 획득하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 추정한 EC50s을 표 28에 나열하였다.
인간 LAMP1 또는 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대한 huMAb1_1, huMAb1_2 및 huMAb1_3의 겉보기 친화도
EC 50 (nM)
EC 50s 의 비율
HCT116 huLAMP1 클론 8 HEK293 cynoLAMP1 클론 44
huMAb1_1 15.0 30.1 2.0
huMAb1_2 6.6 13.3 2.0
huMAb1_3 10.3 17.7 1.7
이러한 결과는 huMAb1_1이 2의 EC50s의 비율의 비슷한 친화도로 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 결합함을 보여준다. HuMAb1_1은 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응한다. HuMAb1_2는 2.01의 EC50s의 비율의 비슷한 친화도로 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 결합한다. HuMAb1_2는 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응한다. HuMAb1_3은 1.71의 EC50s의 비율의 비슷한 친화도로 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 결합한다. HuMAb1_3은 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응한다.
실시예 7.3: 결정학에 의한 huMAb1 _1의 에피토프 결합 자리의 확인
실시예 7.3.1: Fab1 / LAMP1 복합체의 획득
huMAb1 _1로부터 Fab의 발현 및 정제
각각 서열 번호 68의 경쇄 LC1 또는 서열 번호 69의 HC1으로부터 유래된 C 말단 His 태그가 부착된 중쇄를 암호화하는 두 가지 플라스미드를 이용하여 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들로부터 huMAb1_1로부터의 재조합 Fab(Fab1)를 얻었다. 세포 정화 후, 성장 상층액을 고정화된 금속 친화도 수지(immobilized-metal affinity resin, IMAC) 상에 적용하였다. 수지로부터 용리시킨 후, 고도로 순수한 Fab1을 함유하는 분획들을 모으고, PBS에 대해 대대적으로 투석시켰다. Fab1 용액을 4℃에서 보관하였다.
인간 비- 당화 LAMP1 -29-195의 발현 및 정제
비-당화 LAMP1 도메인을 얻기 위하여, 박테리아 발현 시스템을 이용하였다. 서열 번호 70의 인간 LAMP1 단백질의 도메인 L1-L2를 발현시키기 위하여 티오레독신 융합 단백질을 설계하였다(TrxA-His-Thr-LAMP1-29-195, 여기서 Thr은 트롬빈 절단 자리를 의미한다). 융합 단백질을 trxB - gor 결핍 대장균 균주에서 T7 프로모터를 이용하여 발현시켰다. 생물반응조 내에서 독자적인 화학적으로 정의된 배지에 재조합 균주의 높은 세포 밀도 배양을 수행하였다. 세포 페이스트로부터 프렌치 프레스 용해에 의해 융합 단백질을 추출하고, 세포 용해물을 초원심분리에 의해 정화하고, 정화된 상층액을 IMAC 컬럼 상에 적용하였다. 수지로부터 용리 후, 재조합 단백질을 함유하는 분획들을 모으고, TrxA-His을 절단하기 위하여 트롬빈 프로테아제(시그마-알드리치)를 실온에서 1시간 이용하였다. 그런 다음, 용액을 각각 트롬빈 및 유리 TrxA-His 융합 파트너를 제거하기 위하여 벤자미딘 세파로오스 컬럼(GE 헬스케어) 상에 그리고 IMAC 컬럼 상에 적용하였다. 정제된, 태그가 붙지 않은 LAMP1-29-195 도메인을 복합체 제조시까지 4℃에서 보관하였다. 태그가 붙지 않은 LAMP1-29-195 도메인의 서열은 서열 번호 71 하에 언급된다.
복합체의 제조 및 정제
재조합 Fab(Fab1)과 항원(태그가 붙지 않은 LAMP1-29-195 도메인)을 1.5:1 몰 비율로 혼합하고, 실온에서 30분 동안 배양하고, 복합체를 PBS로 평형을 이룬, 수퍼덱스(Superdex) 200 PG 컬럼(GE 헬스케어) 상에서 예비적 크기 배제에 의해 더 정제하였다. 고도로 순수한 복합체를 함유하는 분획들을 모으고, 결정학 분석시까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 7.3.2: Fab1 / LAMP1의 구조 결정
결정화 및 데이터 수집
복합체를 PBS 10 mM pH7에 12 mg/mL까지 농축시켰다. 시팅 드롭법(sitting drop method)을 이용하여 결정화를 하였다. 그것은 20% PEG3350, 200 mM NaF (조건 1) 및 20% PEG3350, 200mM DL-말산 pH 7(조건 2)에서 결정화하였다. 25% 에틸렌 글리콜을 동결 전에 동결보호제로서 포함시켰다. 빔라인 ID29 ESRF에서 양 결정체로부터 데이터 세트를 수집하였다. 결정체들은 2.37Å(조건 1) 또는 2.51Å(조건 2)에서 동일한 공간군 C2에서 회절시켰다.
구조 용액
4JGO 하에 언급되는 PDB 구조를 이용하여 Fab1의 불변 도메인의 모델을 얻었다. 가변 도메인의 모델은 마에스트로(Maestro, 슈뢰딩거(Schroedinger))에서 구축되었다.
양 데이터 세트에서 CCP4 스위트(Winn et al, Acta Cryst D67 (2011), 235-242)의 페이저(Coy et al, J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)를 이용하여 분자 교체를 수행하였으나, 조건 2에서만 성공적이었다. 초기의 정밀화 시행은 비대칭 단위체 내에 두 개의 Fab가 존재함을 확인시켜 주었다. 가변 도메인들 위에서 추가적인 밀도가 보였으나, 항원을 두기에는 너무 불완전하였다.
조건 2에서의 이전의 시행으로부터의 결과를 이용하여, 조건 1에서 제2의 분자 교체를 수행하였다. 이번에는 가변 도메인 중 하나 위에서 분명한 밀도를 볼 수 있어, Lamp1 분자의 수동 구축을 가능하게 하였다. 그런 다음, 두 복합체 사이의 비 결정학적 대칭성을 이용하여 제2의 Lamp1 분자를 구축하였다.
2.37Å에서 버스터(Buster-TNT 2.11.5, 글로벌 페이징(Global Phasing Ltd))를 이용하여 26.1%의 Rfree 및 22.6%의 Rfactor까지 정밀화하였다.
결과
유의미하게 상이한 전체 온도 인자들과 함께, 비대칭 단위체 내에는 두 가지 Fab1/LAMP1 복합체가 존재한다. 두 단백질들 사이의 상호 작용은 양 복합체에서 동일하다. 그 결과, 가장 안정적인 복합체를 분석을 위한 기준으로 삼았다.
서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Arg195에 상응하는 LAMP1의 제1 루멘 도메인은 주로 Fab1의 중쇄와 상호 작용한다. 도 13에서, 파라토프의 일부분인 Fab1의 잔기가 표시되어 있다(즉, 항원 원자들의 4A 내의 원자들이 있는 잔기들). 파라토프의 일부분인 아미노산들은 경쇄에, 더욱 정확하게는 서열 번호 68의 Asp30, Arg31 및 Tyr32이 있는 CDR1-L 및 서열 번호 68의 Asp50이 있는 CDR2-L에 배치된다. 그것들은 나아가 중쇄에, 더욱 정확하게는 서열 번호 69의 CDR1-H(Ile28, Asn31, Tyr32, Asn33), CDR2-H(Tyr52, Asn55, Asp57, Pro59), FR3 루프 (Thr74, Ser75, Ser77) 및 CDR3-H(Asn100, Trp101, Asp102, Phe105)에 배치된다.
Fab1 원자들의 4A 내의 원자들이 있는 잔기들로 결정된, Fab1에 대한 LAMP1의 에피토프를 아래 서열에 굵게/밑줄로 표시하고, 도 14에 나타내었다:
GSHMAMFMVK N GNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSS CG K EN TSDPSLVIAFGRGHTLTLNFT RNA TRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESITDIRAD IDK KYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQA Y L SN SSFS RG ETRCEQDR (서열 번호 80).
결정학에 의해 확인된 상기 에피토프는 서열 번호 24의 아미노산들 Asn35, Cys80, Gly 81, Glu83, Asn84, Arg106, Asn107, Ala108, Ile149, Asp150, Lys151, Tyr 178, Ser180, Asn181, Arg186 및 Gly187로 이루어진다.
도 1에 나타낸 정렬에서 볼 수 있는 바와 같이, 필리핀 원숭이와 호모 사피엔스 사이의 에피토프 부위에는 Gly187Glu의 서열 번호 24의 187번 위치에 오로지 하나의 잔기 차이가 있다. 이러한 돌연변이 모델을 구축하고 최소화하였다. 그 결과는, 도 15에 나타난 바와 같이 경쇄 Tyr32의 곁사슬 이동 및 LAMP1 Lys151의 가벼운 이동이 있다면 Fab1에 대한 결합이 여전히 가능함을 보여준다.
본 출원에서 얻어진 결정학적 구조를 기초로 할 때, 친화도 성숙을 위한 부위를 제안하는 것이 가능하다. 두 개의 핫 스폿은 서열 번호 53의 중쇄 서열의 아미노산 Ile28 및 서열 번호 53의 중쇄 서열의 아미노산 Asn55일 수 있다. 소수성 잔기 Ile 28을 글루타민으로 교체하는 것은 LAMP1(서열 번호 24)의 인근의 Gly81 및 Asn35의 상호 작용을 초래할 수 있고, 도 16에 나타난 바와 같이 두 단백질들 사이의 결합을 향상시킬 것이다. Asn55를 아르기닌으로 돌연변이시키는 것은 도 17에 나타난 바와 같이 LAMP1(서열 번호 24)의 Asn87, Arg106 및 Thr107에 상호 작용을 부가한다.
실시예 8: ADC의 생산 및 특성 분석
실시예 8.1: 메이탄시노이드와의 ADC 생산 및 특성 분석
DAR 계산 :
접합체는 일반적으로 항체에 공유적으로 부착된 메이탄시노이드를 1 내지 10개 분자(들)로 포함한다(소위 "약물 대 항체 비율" 또는 "DAR"). 이러한 수는 (메이탄시노이드/항체 비율, 반응 시간, 용매 및 공용매가 존재한다면 공용매의 속성과 같은) 접합에 이용되는 실험 조건과 함께, 항체 및 이용되는 메이탄시노이드의 속성에 따라 다를 수 있다. 따라서, 항체와 메이탄시노이드간의 접촉은 상이한 약물 대 항체 비율; 선택적으로 네이키드 항체; 선택적으로 응집체에 의해 서로 상이한 여러 접합체들을 포함하는 혼합물을 초래한다. 따라서, 결정되는 DAR은 평균값이다.
DAR을 결정하기 위하여 본 출원에서 이용된 방법은 실질적으로 정제된 접합체 용액의 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도 비율을 분광학적으로 측정하는 것으로 이루어진다. 특히, 상기 DAR은 항체(εA280 및 εA252)와 메이탄시노이드(εD280 = 5,180 M-1cm-1 및 εD252 = 26,159 M-1cm- 1)에 대해 각각 280 및 252 nm에서의 측정된 흡광 계수를 이용하여 분광학적으로 결정될 수 있다. 계산법은 Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science로부터 유래되며, 아래에 더욱 상세하게 기술한다:
252 nm(A252) 및 280 nm(A280)에서의 접합체에 대한 흡광도를 (DAR을 계산하기 위한) 분광분석 기기를 이용하여 측정한다. 흡광도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
A252 = (cD x εD252) + (cA x εA252)
A280 = (cD x εD280) + (cA x εA280)
이때,
cD 및 cA는 각각 메이탄시노이드 및 항체의 용액에서의 농도이다.
εD252 및 εD280은 각각 252 nm 및 280 nm에서의 메이탄시노이드의 몰 흡광 계수이다.
εA252 및 εA280은 각각 252 nm 및 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수이다.
두 개의 미지의 물질들을 이들 두 식으로 분해할 경우, 다음의 식으로 이어진다:
cD = [(εA280 x A252) - (εA252 x A280)] / [(εD252 x εA280) - (εA252 x εD280)]
cA = [A280 - (cD x εD280)] / εA280
그런 다음, 평균 DAR을 항체의 농도에 대한 약물의 농도의 비율로부터 계산한다:
DAR = cD / cA.
접합체의 탈당화 및 고분별능 질량 분광분석법( HRMS )
탈당화는 글리코시다아제에 의한 효소적 소화 기법이다. 탈당화는 50 μl의 접합체 + 10 μl의 N-글리코시다아제-F(PN Gase F) 효소(동결 건조된 효소 100유닛/ 물 100 μl)로부터 이루어진다. 매질을 볼텍싱하고, 37℃에서 하룻밤 유지시킨다. 그러면, 탈당화된 시료는 HRMS로 분석할 준비가 된다. 워터스 XEVO QTof 시스템 상에서 전기분무 양성 모드(ES+)로 질량 스펙트럼을 얻었다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: 컬럼: UPLC BEH300 C4 1.7 μm 2.1X150 mm; 용매: A: H2O + 0.1% 포름산: B; CH3CN　+ 0.1% 포름산; 컬럼 온도: 70℃; 유속 0.5 mL/분; 기울기 용리 (10분): 20% B 2분 50초 동안; 20부터 80%까지 B 2분 5초 이내; 8분 50초: 80% B; 8분 55초: 20% B; 10분: 20% B.사용 약어
DAR: 약물 항체 비율; DMA: 디메틸아세트아미드; HEPES: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산; HRMS: 고분별능 질량 분광분석법; 니트로-SPDB: 부탄산, 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-, 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르(WO2004016801 특허에 기술된 바와 같이 제조될 수 있음); RT: 실온.
완충액 내용물
- 완충액 A(pH 6.5): NaCl(50 mM), 인산 칼륨 완충액(50 mM), EDTA(2 mM)
- 완충액 HGS(pH 5.5): 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 5% (w/v), HCl(8　mM)
- PBS(pH 7.4): KH2PO4(1.03 mM), NaCl(155.17 mM), Na2HPO4-7H2O(2.97 mM)
사용 약어
DAR: 약물 항체 비율; DMA: 디메틸아세트아미드; HEPES: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산; HRMS: 고분별능 질량 분광분석법; NHS: N-하이드록시석신이미드; 니트로-SPDB: 부탄산, 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-, 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르(WO2004016801 특허에 기술된 바와 같이 제조될 수 있음); NMP: N-메틸피롤리디논; RT: 실온
실시예 8.1.1: 항체 약물 접합체( ADC )( 키메라 chMAb1 )
MAb1의 네이키드 키메라를 제조하였다. 그것은 인간 IgG1, 서열 번호 17의 서열의 중쇄 및 서열 번호 18의 서열의 경쇄를 가지고 있는 Ck 이소형이 있는 쥐 클론 MAb1으로부터 유래된 키메라 mAb(chMAb1)이다.
본 실시예에서, 절단 가능한 접합체(차별없이 DM4-SPDB-chMAb1 또는 chMAb1-SPDB-DM4라 함)를 실시예 7에 기술된 바와 같이 네이키드 chMAb1으로부터, 그리고 서열 번호 17 및 18에 상응하는 키메라 mAb의 LC 및 HC 서열들과 함께 DM4로부터 얻었다.
DM4는 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)메이탄신이라는 화학 명칭을 가지고 있다.
chMAb1의 경우, εA280=223,400 M-1cm-1이고 εA252=80,240 M-1cm-1이다.
절단 가능한 키메라 chMAb1 - SPDB -DM4 접합체의 제조 및 분석적 데이터
완충액 A 내의 8.23 mg/mL 농도의 chMAb1 항체의 용액 12.1 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 465 μL의 HEPES 1N, 1 mL DMA, 및 5.9배 몰 초과의, DMA 내의 니트로-SPDB의 15 mM 용액을 첨가한다. 실온에서 1시간 30분 후, DMA 내의 DM4 15mM 용액을 첨가하기 전에, 반응 혼합물을 PBS 완충액 17.3 mL과 DMA 1.64 mL로 희석한다.
반응 혼합물을 실온에서 2시간 40분 동안 교반한 다음, Sius-LSn 프로스트림(Prostream) 30 kd 카세트 상에서 TFF에 의해 정제한다. 시료를 600 mL의 HGS 완충액에 대해 정용 여과시키고, 농축시키고, 수집하고, 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(11 mL)을 수득한다.
최종 접합체를 분광분석적으로 분석한다. 항체(5.7 mg/mL) 분자당 4.5 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 7 참조.
실시예 8.1.2: 항체 약물 접합체(인간화 huMAb1 _3)
실시예 7.2.2에 기술된 바와 같이 네이키드 인간화 huMAb1_3을 제조하였다. 그것은 인간 IgG1 및 Ck 이소형, 서열 번호 64의 중쇄 (VH3-huIgG1) 서열 및 서열 번호 63의 경쇄 (VL3-huCk) 서열을 가지고 있는 Ck 이소형이 있는 쥐 클론 MAb1으로부터 유래된 인간화 mAb이다.
본 출원에 언급된 흡광 계수를, 항체 εA280=223,400 M-1cm-1 및 εA252=79,413 M-1cm-1에 대해, 각각 280 및 252 nm에서 측정하였다.
DM4- SPDB - huMAb1 _3 접합체의 제조
DPBS 내의 5.18 mg/mL 농도의 huMAb1_3 항체 용액 3.6 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 0.316 mL DMA 및 5.2배 몰 초과의 DMA 내 니트로-SPDB의 15 mM 용액을 첨가한다. 실온에서 2시간 15분 후, DMA 내의 니트로-SPDB의 15 mM 용액의 0.3 당량을 첨가한다. 1시간 45분 후, DMA 내의 DM4 15mM 용액을 첨가하기 전에, 반응 혼합물을 1.99 mL의 PBS 완충액 및 0.187 mL DMA로 희석한다.
반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 겔 여과로 정제하였다(이전에 완충액 HGS pH=5.5로 평형을 이루게 한, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염, 세파덱스(Sephadex) G25, GE 헬스케어). 수집한 시료를 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(9.4 mL)을 수득한다. 이 용액을 크로마소브(Chromasorb®) 밀리포어(Millipore) 0.08 mL 장치(CHRFA1PD09)에 주입한다. 수집된 시료를 아미콘(Amicon) Ultra-15 10 KD, 밀리포어(Millipore)로 농축하고, 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(4.3 mL)을 수득한다.
최종 접합체를 분광 분석적으로 분석한다. 항체(1.9 mg/mL) 분자당 3.5 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 18 참조.
실시예 8.1.3: 항체 약물 접합체(인간화 huMAb1 _1)
실시예 7.2.2에 기술된 바와 같이 네이키드 인간화 huMAb1_1을 제조하였다. 그것은 인간 IgG1 및 Ck 이소형, 서열 번호 60의 중쇄 (VH1-huIgG1) 서열 및 서열 번호 59의 경쇄 서열(VL1-huCk)을 가지고 있는 Ck 이소형이 있는 쥐 클론 MAb1으로부터 유래된 인간화 mAb이다.
흡광 계수를 항체 εA280=223,400 M-1cm-1 및 εA252=80,041 M-1cm-1에 대해, 각각 280 및 252 nm에서 측정한다.
DM4- SPDB - huMAb1 _1 접합체의 제조
DPBS 내의 4.81 mg/mL 농도의 huMAb1_1 항체 용액 3.6 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 0.321 mL DMA 및 5.0배 몰 초과의 DMA 내 니트로-SPDB의 15 mM 용액을 첨가한다. 실온에서 2시간 후, DMA 내의 니트로-SPDB의 15 mM 용액의 0.3 당량을 첨가한다. 1시간 30분 후, DMA 내의 DM4 15 mM 용액을 첨가하기 전에, 반응 혼합물을 1.59 mL의 PBS 완충액 및 0.147 mL DMA로 희석한다.
반응 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반한 다음, 겔 여과로 정제하였다(이전에 완충액 HGS pH=5.5로 평형을 이루게 한, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염, 세파덱스(Sephadex) G25, GE 헬스케어). 수집한 시료를 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 9.4 mL의 용액을 수득한다. 이 용액을 크로마소브(Chromasorb®) 밀리포어(Millipore) 0.08 mL 장치(CHRFA1PD09)에 주입한다. 수집된 시료를 아미콘(Amicon) Ultra-15 10 KD, 밀리포어(Millipore)로 농축하고, 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(4.9 mL)을 수득한다.
최종 접합체를 분광 분석적으로 분석한다. 항체(1.45 mg/mL) 분자당 3.4 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 19 참조.
실시예 8.1.4: 항체 약물 접합체(인간화 huMAb1 _2)
실시예 B7에 기술된 바와 같이 네이키드 인간화 huMAb1_2를 제조하였다. 그것은 인간 IgG1 및 Ck 이소형, 서열 번호 62의 중쇄 서열 (VH2-huIgG1) 및 서열 번호 61의 경쇄 서열 (VL2-huCk)을 가지고 있는 Ck 이소형이 있는 쥐 클론 MAb1으로부터 유래된 인간화 mAb이다.
흡광 계수를 항체 εA280=223,400 M-1cm-1 및 εA252=79,474 M-1cm-1에 대해, 각각 280 및 252 nm에서 측정한다.
DM4- SPDB - huMAb1 _2 접합체의 제조
b DPBS 내의 5.06 mg/mL 농도의 huMAb1_2 항체 용액 3.6 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 0.317 mL DMA 및 5.2배 몰 초과의 DMA 내 니트로-SPDB의 15 mM 용액을 첨가한다. 2시간 후, DMA 내의 DM4 15mM 용액을 첨가하기 전에, 반응 혼합물을 1.89 mL의 PBS 완충액 및 0.179 mL DMA로 희석한다.
반응 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반한 다음, 겔 여과로 정제하였다(이전에 완충액 HGS pH=5.5로 평형을 이루게 한, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염, 세파덱스(Sephadex) G25, GE 헬스케어). 수집한 시료를 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(9.7 mL)을 수득한다.
최종 접합체를 분광 분석적으로 분석한다. 항체(1.36 mg/mL) 분자당 4.05 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 20 참조.
실시예 8.1.5: 항체 약물 접합체( 키메라 chMAb2can )
실시예 7에 기술된 바와 같이 네이키드 키메라 chMAb2can을 제조하였다. 그것은 인간 IgG1 및 Ck 이소형을 가지고 있는 쥐 클론 MAb2로부터 유래된 키메라 mAb이다. Ck 이소형은 서열 번호 21의 중쇄 서열 및 서열 번호 22의 경쇄 서열을 가지고 있다.
흡광 계수를 항체 εA280=223,400 M-1cm-1 및 εA252= 74,417 M-1cm-1에 대해, 각각 280 및 252 nm에서 측정한다.
DM4- SPDB - chMAb2can 접합체의 제조
DPBS 내의 5.21 mg/mL 농도의 chMAb2can 항체 용액 9.2 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 0.813 mL DMA 및 5.0배 몰 초과의 DMA 내 니트로-SPDB의 15 mM 용액을 첨가한다. 실온에서 2시간 후, DMA 내의 니트로-SPDB의 15 mM 용액 0.2 당량을 첨가한다. 1시간 30분 후, DMA 내의 DM4 15mM 용액을 첨가하기 전에, 반응 혼합물을 5.17 mL의 PBS 완충액 및 0.497 mL DMA로 희석한다.
반응 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반한 다음, 겔 여과로 정제하였다(이전에 완충액 HGS pH=5.5로 평형을 이루게 한, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염, 세파덱스(Sephadex) G25, GE 헬스케어). 수집한 시료를 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(23 mL)을 수득한다.
최종 접합체를 분광 분석적으로 분석한다. 항체(1.58 mg/mL) 분자당 3.7 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 21 참조.
실시예 8.1.6: 항체 약물 접합체( 키메라 chMAb3 _ VLR24 -R93)
실시예 7에 기술된 바와 같이 네이키드 키메라 chMAb3_VLR24-R93을 제조하였다. 그것은 인간 IgG1 및 Ck 이소형, 서열 번호 49의 중쇄 서열 및 서열 번호 81의 경쇄 서열을 가지고 있는 Ck 이소형이 있는 쥐 클론 MAb3으로부터 유래된 키메라 mAb이다.
흡광 계수를 항체 εA280=234539 M-1cm-1 및 εA252= 85303 M-1cm-1에 대해, 각각 280 및 252 nm에서 측정한다.
DM4- SPDB - chMAb3 VLR24 -R93 접합체의 제조
DPBS 내의 6.85 mg/mL 농도의 chMAb3_VLR24-R93 항체 용액 7.3 mL에, 마그네틱 교반 하에서, 7.7 mL의 PBS, 1.5 mL DMA 및 5.0배 몰 초과의 DMA 내 니트로-SPDB의 10 mM 용액을 첨가한다. 3시간 30분 후, 155 μL의 L-DM4 용액(DMA 내 15.1 mM)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반한 다음, 겔 여과로 정제하였다(이전에 완충액 HGS pH=5.5로 평형을 이루게 한, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염, 세파덱스(Sephadex) G25, GE 헬스케어). 수집한 시료를 밀렉스(Millex®) 0.22 μM PVDF 필터로 여과하여 생성물(23 mL)을 수득한다. 최종 접합체를 분광 분석적으로 분석한다. 항체(2.0 mg/mL) 분자당 3.7 DM4의 평균 DAR을 결정하였다. HRMS 데이터: 도 22 참조.
실시예 8.1.7 : 인간 LAMP1 /시노 LAMP1에 대한, DM4- SPDB - chMAb1 , DM4- SPDB -chMAb2 및 DM4- SPDB - chMAb3의 교차 반응성
DM4-SPDB-chMAb1, DM4-SPDB-chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb3을 대상으로, 각각 HCT116 또는 HEK293 안정 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 또는 시노몰구스 LAMP1 단백질들과 결합하는 능력에 대해 유동 세포계수법으로 평가하였다. HCT116 안정 클론 및 HEK293 안정 클론은 실시예 4.7의 프로토콜에 기술된 바와 같이 얻었다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 추정된 EC50s는 표 29로 작성하였다.
인간 LAMP1 또는 시노몰구스 LAMP1에 대한 DM4-SPDB-chMAb1, DM4-SPDB-chMAb2, DM4-SPDB-chMAb3의 겉보기 친화도
EC 50 (nM)
EC 50s 의 비율
HCT116 huLAMP1 클론 8 HEK293 cynoLAMP1 클론 44
DM4-SPDB-chMAb1 6.6 6.6 1.0
DM4-SPDB-chMAb2 5.5 12.8 2.3
DM4-SPDB-chMAb3 9.1 6.1 0.7
DM4-SPDB-chMAb1은 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 비슷한 친화도로 결합한다. EC50s 비율은 1이었고, 따라서 DM4-SPDB-chMAb1은 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응하였다. DM4-SPDB-chMAb2는 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 비슷한 친화도로 결합한다. EC50s 비율은 2.3이었고, 따라서 DM4-SPDB-chMAb2는 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응하였다. DM4-SPDB-chMAb3은 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 비슷한 친화도로 결합한다. EC50s 비율은 0.7이었고, 따라서 DM4-SPDB-chMAb3은 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응하였다.
실시예 8.1.8 : 인간 LAMP1 /시노 LAMP1에 대한 DM4- SPDB - huMAb1 _1의 교차 반응성
실시예 4.7의 프로토콜에서 기술된 바와 같이 얻어진, HCT116 또는 HEK293 안정 클론들의 표면에서 발현된 인간 LAMP1 또는 시노몰구스 LAMP1 단백질들과 결합하는 능력에 대해 DM4-SPDB-huMAb1_1를 대상으로 유동 세포계수법으로 평가하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 추정된 EC50s는 표 30으로 작성하였다.
인간 LAMP1 또는 시노몰구스 원숭이 LAMP1에 대한 DM4-SPDB-huMAb1_1의 겉보기 친화도
EC 50 (nM)
EC 50s 의 비율
HCT116 huLAMP1 클론 8 HEK293 cynoLAMP1 클론 44
DM4-SPDBhuMAb1_1 12.65 33.50 2.65
DM4-SPDB-huMAb1_1은 인간 및 시노몰구스 기원의 LAMP1과 2.65의 EC50s 비율로, 비슷한 친화도로 결합한다. 따라서, DM4-SPDBhuMAb1_1은 시노몰구스 LAMP1과 교차 반응한다.
실시예 8.2: 토메이마이신 이량체와의 ADC의 생산 및 특성 분석
DAR 계산:
DAR 계산은 항체에 대해(εA280=223,400 M-1cm-1 및 εA322=0 M-1cm-1) 및 토메이마이신 이량체에 대해(εD280 = 4,436 M-1cm-1 및 εD322 = 7,843 M-1cm-1) 각각 280 및 322 nm에서 측정된 흡광 계수를 이용하여, 메이탄시노이드 ADC와 비슷하게 결정된다.
( 2E,2'E,11aS,11a'S )-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2- 머캅토 -2- 메틸프로필 )( 메틸 )아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일) 비스(메틸렌))비스(옥시) ) 비스 (2- 에틸리덴 -7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4] 디아제핀 -5( 11aH )-온)이 있는, SNPP ( N-석신이미딜 4- (5-니트로-2- 피리딜디티오 ) 펜타노에이트 )로 변경 된 huMAb1 _1 접합체의 제조
2.8 ml의 완충액 A 내의 huMAb1_1의 56 mg에, 67 μL의 DMA에 용해된 SNPP (N-석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)펜타노에이트) 0.48 mg을 교반 하에서 첨가한다. 실온에서 3시간 후, 변경된 항체 용액을 둘로 분획화하고, 0.05 M 농도의 N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 0.05 M NaCl 및 pH = 8의 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 있는, 수성 완충액 내에서 사전에 평형화된, 두 개의 세파덱스 G25 컬럼(PD-10 GE 컬럼) 상에 겔 여과에 의해 정제한다. 그렇게 하여 얻어진 두 여과액을 혼합하고 균질화한 후, 변경된 항체를 니트로피리딘티올의 흡광 계수(ε280 nm= 3344 M-1 cm-1 및 ε325 nm= 10964 M-1cm- 1)을 이용하여 분광분석법으로 분석한다. 항체 분자당 평균 3.32 디티오-니트로피리딘 기가 6.28 mg/mL의 농도에서 결정되었다.
0.05 M 농도의 N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 0.05 M NaCl 및 pH = 8의 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 있는 1.5 ml의 수성 완충액 내의 위의 변경된 항체 9.4 mg에, 0.56 mL의 DMA 및 디메틸아세트아미드(DMA) 내에 용해된 1.12 mg의 (2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일)비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(11aH)-온)을 교반 하에서 첨가한다. 30℃에서 17시간 후, 0.01N HCl을 pH=6.6까지 첨가하고, 그에 따른 혼합물을, 처음에는 2 mL의 pH 6.5의 200 mM 인산 칼륨 완충액으로 평형화하고, 이어서 4 mL의 pH 6.5의 10 mM 인산 칼륨 완충액으로 평형화한, CHT 80(II형) 컬럼(20mm x 8mm I.D.) 상에서 정제한다. 주입 및 마지막 10 mM 인산염 완충액 5 mL로 세척 후, 이전의 200 mM 인산염 완충액 6 mL로 용리시킨다. 그런 다음, 그 결과에 따른 배치 2.5 mL을 10% 수크로오스를 함유하는, 10 mM 농도의 히스티딘과 함께, pH = 6.5의 수성 완충액 내에서 사전에 평형화한, 세파덱스 G25 컬럼(PD-10 GE 컬럼) 상에서 여과한다.
(2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-2,6-디일)비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(11aH)-온)의 화학적 구조는 다음과 같다:
Figure pct00012
얻어진 접합체(3.5 mL)를 분광분석법으로 분석한다. 항체 분자당 평균 2.85개의 (2E,2'E,11aS,11a'S)-8,8'-(((4-(2-(2-(2-((2-머캅토-2-메틸프로필)(메틸)아미노)에톡시)에톡시) 에톡시)피리딘-2,6-디일)비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-에틸리덴-7-메톡시-2,3-디하이드로-1H벤조[e] 피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(11aH)-온)이 1.84 mg/mL의 농도에서 결정되었다. HRMS 데이터: 도 37 참조.
실시예 9: 시험관 내 세포독성
실시예 9.1: DM4- SPDB - chMAb1의 시험관 내 세포독성
실시예 4.7에 보고된 바와 같이, 세포의 게놈 DNA에 LAMP1 CDS의 안정적인 통합을 가능하게 하는 렌티바이러스 벡터에 의해 HCT116 세포를 감염시켰다. 상이한 밀도의 LAMP1 세포 표면 국소화를 나타내는 개별적인 클론들이 HCT116 감염된 세포들의 풀로부터 유래되었다. HCT116 클론 8을 chMAb1와 DM4-SPDB-chMAb1의 EC50을 비교하는 데 이용하였다. 세포들을 96웰 플레이트에 웰당 200 000개로 플레이팅하고, MAb1 또는 DM4-SPDB-chMAb1을 4℃에서 1시간 동안 분석용 희석제에 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 2회 세척하였다. 알렉사488이 접합된 염소 항-인간 IgG(인비트로젠; # A11013) 100 μL/웰을 4℃에서 1시간 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 2회 세척하였다. 원심분리 및 100 ul 고정 용액(PBS 내 파라포름알데히드 4%)에 세포를 재현탁시킨 후 항체 결합을 평가하였다. 갤럭시(Galaxy®) 유동 세포계수 시스템(파텍)을 이용하여 시료를 판독하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. chMAb1 및 DM4-SPDB-chMAb1은 비슷한 친화도 및 각각 6.0 및 6.6 nM의 EC50으로 결합한다.
상이한 항원 밀도를 나타내는 몇몇 HCT116 클론들을 이용하여, 세포 타이터-글로(Titer-Glo) 키트(프로메가(Promega))를 이용하는 세포 생존율 평가에 의해 DM4-SPDB-chMAb1의 세포독성을 평가하였다.
HCT116-LAMP1 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃/5%CO2 대기에서 4시간 동안 부착되도록 하였다. 상이한 농도의 DM4-SPDB-chMAb1을 각 농도별로 3반복하여 시딩된 세포에 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 동일한 대기에서 96시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포 타이터-글로 시약을 실온에서 10분 동안 웰에 첨가하고, 빅터(Victor) 플레이트 판독기(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))를 이용하여 발광 신호를 측정하였다. 반 최고치 저해 농도(IC50)는 생물학적 기능을 저해하는 데 있어서의 화합물의 효능 척도이다. 그것은 바탕선과 약간의 소정 노출 시간 후의 최대치 사이의 절반의 반응으로 세포 사멸을 초래한 항체의 농도로 정의된다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 IC50 값을 추정하였다. DM4-SPDB-chMAb1은 약 0.2 nM의 IC50으로 세포를 사멸시켰다.
LAMP1을 발현하는 HCT116 세포주에 대한 DM4-SPDB-chMAb1의 세포독성
HCT116 - LAMP1 항원 밀도 세포독성 활성
IC 50 (nM)
(mean± SD; n= 3)
클론 5 451 000 0.2 ± 0.1
클론 8 160 000 0.1 ± 0.1
DM4-SPDB-chMAb1의 세포독성 IC50은 LAMP1을 많이 발현하는 HCT116의 클론에 대해 nM 이하이다.
실시예 9.2: DM4- SPDB - huMAb1 _1 DM4- SPDB - huMAb1 _2, DM4- SPDB - huMAb1 _3의 시험관 내 세포독성
실시예 9에 기술된 바와 같은, HCT116 클론 8을 DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-huMAb1_2 및 DM4-SPDB-huMAb1_3의 세포독성을 평가하는 데 이용하였다. 실시예 9에 기술된 것과 동일한 프로토콜을 적용하였다.
세 가지 구축체는 동등한 효능으로 세포를 사멸시켰다. DM4-SPDB-huMAb1_1, DM4-SPDB-huMAb1_2 및 DM4-SPDB-huMAb1_3 각각의 경우, IC50은 0.10 nM, 0.07 nM 및 0.12 nM이다.
실시예 9.3: DM4- SPDB - chMAb2 및 DM4- SPDB - chMAb3의 시험관 내 세포독성
실시예 9에 기술된 바와 같은, HCT116 클론 8을 DM4-SPDB-chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb3의 세포독성을 평가하는 데 이용하였다. 실시예 9에 기술된 것과 동일한 프로토콜을 적용하였다. 두 구축체는 동등한 효능으로 세포를 사멸시켰다. DM4-SPDB-chMAb2 및 DM4-SPDB-chMAb3 각각의 경우, IC50은 0.07 nM 및 0.06 nM이다.
실시예 9.4: 토메이마이신 이량체와의 ADC를 이용한 세포주 HCT116 및 HT29의 증식 저해 평가
급속 생장기의 HCT116(각각 HT29) 세포들을 트립신화시키고, 배양 배지(DMEM 깁코(Gibco) #11960 + 10% SVF + 2 mM 글루타민)에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 혈청을 함유하는 전체 배양 배지 내 사이토스타(Cytostar) 96웰 플레이트(GE 헬스케어 유럽, #RPNQ0163)에 3000(각각 5000)개 세포/웰의 밀도까지 시딩한다. 4시간 동안 배양한 후, 항체-세포독성제 면역접합체의 연속적인 희석액을 10-7부터 10-12 M까지의 감소하는 농도로(각 농도에 대해 2반복(각각 4반복)) 웰에 첨가한다. 세포를 3일 동안 항체-세포독성제 면역접합체의 존재 하에 5% CO2를 함유하는 대기 하에서 37℃에서 배양한다. 4번째 날, 10 μl의 14C-티미딘 용액(0.1　μCi/웰, 퍼킨 엘머 #NEC56825000)을 각 웰에 첨가한다. 마이크로베타 방사능 계수기(퍼킨 엘머)로 실험 개시 후 96시간에 14C-티미딘의 도입을 측정한다. 면역접합체로 처리된 세포에서 얻어진 수와 (배양 배지만을 처리한) 대조군 웰의 세포로 얻어진 수 사이의 비율을 결정하여, 생존 백분율의 형태로 데이터를 표현한다.
구축체는 동등한 효능으로 HCT116 및 HT29 세포들을 사멸시켰다. IC50은 HCT116에 대해 56 pM이고, HT29 세포에 대해 72 nM이다.
실시예 10: 생체 내 효능
실시예 10.1: DM4- SPDB - chMAb1의 생체 내 효능
본 실시예에서는, 절단 가능한 DM4-SPDB-chMAb1 접합체가 생체 내 효능을 초래하는 것으로 나타났다.
실시예 10.1.1 : 원발성 인간 대장 선암종 CR - LRB -010P에 대한 DM4- SPDB -chMAb1의 항종양 활성의 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-LRB-010P 종양에 대해 접합체 DM4-SPDB-chMAb1을 3가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 17일째에 DM4-SPDB-chMAb1을 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다. 20%의 체중 감량 또는 3 연속일 동안 15% 체중 감량 또는 10% 이상의 약물 사망을 가져오는 투여량을 과도하게 독한 투여량으로 간주하였다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다. 종양 부피를 2차원 종양 측정치로부터 추정하고, 다음 식(Corbett, T.H. et al., 1977, Cancer 40: 2660-2680): 종양 부피 (mm3) = [길이(mm) × 너비2(mm2)]/2에 따라 계산하였다. 1차 효능 종말점은 처리군과 대조군 사이의 바탕선으로부터의 종양 부피의 변화의 비율(ΔT/ΔC), 퍼센트 퇴행 중간값, 부분 퇴행(PR) 및 완전 퇴행(CR)이다.
각각의 치료군(T)과 대조군(C)의 종양 부피의 변화는 각 종양에 대해, 소정의 관찰일의 종양 부피로부터 1차 치료 당일의 종양 부피를 감산하여 계산한다. 치료되지 않은 대조군에 대해 중간값 ΔC를 계산하고, 치료군에 대해 중간값 ΔT를 계산한다. 그런 다음, 비율 ΔT/ΔC을 계산하고, 이전에 기술된 바와 같이 퍼센티지로 표현한다: ΔT / ΔC = (델타 T/델타 C) x 100.
이러한 용량은 ΔT/ΔC가 40% 미만일 때 치료적으로 활성이 있고, ΔT/ΔC가 10% 미만일 때 매우 활성이 있다고 간주된다. ΔT/ΔC가 0 미만인 경우, 이러한 용량은 고도로 활성이 있다고 간주되며, 퇴행 퍼센티지를 날짜에 따라 기록하였다(Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L and Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. In: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):
종양 퇴행 %는 1차 치료 첫째 날의 종양 부피와 비교하여, 소정의 관찰 시 처리군에서의 종양 부피 감소의 %로 정의된다.
소정의 시점에서 그리고 각각의 동물에 대해, 퇴행 %가 계산된다. 그런 다음, 퇴행 % 중간값을 군에 대해 계산한다.
퇴행 % (t에서) =
Figure pct00013
부분 퇴행(PR): 퇴행은, 종양 부피가 처리 개시 시 종양 부피의 50%까지 감소하는 경우, 부분적인 것으로 정의된다.
완전 퇴행( CR ): 완전 퇴행은 종양 부피 = 0 mm3일 때 달성된다(종양 부피를 기록할 수 없을 때 CR이 간주된다).
결과:
결과를 도 5 및 표 32(아래)에 제시하였다. 10.0, 5.0 및 2.5 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-chMAb1은 10 mg/kg에서 3.7%의 최대 체중 감량으로, 내성이 좋았다. 10.0 및 5.0 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-chMAb1은 매우 활성이 있었으며, 대조군에 비해 통계적으로 유의미하여(각 용량에 대해 p<0.0001), ΔT/ΔC <0 및 75%와 7%의 초기 종양 부피의 퇴행, 각각 10 mg/kg에서 5/6 PR 및 2/6 CR, 그리고 5 mg/kg에서 1/6 PR을 가져왔다. 2.5 mg/kg 이하의 투여량은 활성이 있었는데, ΔT/ΔC = 31%이고, 퇴행은 없었다.
Figure pct00014
실시예 10.1.2: 원발성 인간 폐 종양 LUN - NIC -0014에 대한 DM4- SPDB - chMAb1의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 폐 종양 LUN-NIC-0014에 대해 DM4-SPDB-chMAb1을 3가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 26일째에 DM4-SPDB-chMAb1을 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10.0, 5.0 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다. 20%의 체중 감량 또는 3 연속일 동안 15% 체중 감량 또는 10% 이상의 약물 사망을 가져오는 투여량을 과도하게 독한 투여량으로 간주하였다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다.
실시예 10-1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
10.0, 5.0 및 2.5 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-chMAb1은 2.5 mg/kg에서 3.3%의 최대 체중 감량으로, 내성이 좋았다. 10.0 및 5.0 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-chMAb1은 대조군에 비해 매우 활성이 있었으며, ΔT/ΔC <0 및 각각 81%와 65%의 초기 종양 부피의 퇴행 및 10 mg/kg에서 6/6 CR과 5 mg/kg에서 5/6 PR을 가져왔다. 2.5 mg/kg 이하의 투여량은 활성이 있었는데, ΔT/ΔC = 33%이고, 퇴행은 없었다(표 33, 도 6).
Figure pct00015
실시예 10.2: DM4- SPDB - huMAb1 _1의 생체 내 효능
실시예 10.2.1: 원발성 인간 대장 선암종 CR - LRB -010P에 대한 DM4- SPDB -huMAb1_1의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-LRB-010P 종양에 대해 DM4-SPDB-huMAb1_1을 2가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 19일째에 DM4-SPDB-huMAb1_1을 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
5.0 및 2.5 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-huMAb1_1은 2.5 mg/kg에서 4.4%의 최대 체중 감량으로, 내성이 좋았다. 5.0 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-huMAb1_1은 대조군에 비해 활성이 있고, 통계적으로 유의미하며(p<0.0001), 퇴행 없이 ΔT/ΔC=0을 가져왔다. 2.5 mg/kg 이하의 투여량은 ΔT/ΔC = 47%를 가져왔다(표 34, 도 23).
Figure pct00016
실시예 10.2.2: 원발성 침습성 관암종 BRE - IGR -0159에 대한 DM4- SPDB -huMAb1_1의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159 종양에 대해 DM4-SPDB-huMAb1_1을 4가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 17일째에 DM4-SPDB-huMAb1_1을 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 5, 2.5, 1.25 및 0.62 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
5.0 및 2.5 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-huMAb1_1은 내성이 좋았으며, 활성을 나타내, ΔT/ΔC<0 및 100%의 초기 종양 부피의 퇴행을 가져왔고, 5 mg/kg에서 6/6 CR과 2.5 mg/kg에서 4/6 CR을 가져왔다. 1.25 mg/kg 이하의 투여량은 ΔT/ΔC=30%(p=0.0015)로 활성이 있었으며, 퇴행은 없었다. 더 낮은 용량 0.62 mg/kg은 T/ΔC=86%를 가져왔다(표 35, 도 24).
Figure pct00017
실시예 10.2.3: 원발성 인간 폐 종양 LUN - NIC -0070에 대한 DM4- SPDB -huMAb1_1의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-LRB-010P 종양에 대해 DM4-SPDB-huMAb1_1을 4가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 19 종양 이식 후 35일째에 DM4-SPDB-chMAb2를 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5, 2.5 mg/kg으로, 49일째에 1.25 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
10.0, 5.0, 2.5 및 1.25 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-huMAb1_1은 내성이 좋았다. 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-huMAb1_1은 활성이 있었으며, ΔT/ΔC<0(p<0.0001) 및 100% 완전 퇴행을 나타냈다. 1.25 mg/kg 미만의 투여량은 활성이 있었고, 2.5 mg/kg ΔT/ΔC<0((p<0.0001) 및 4/6 PR이었다(표 36a) 및 b), 도 25).
Figure pct00018
실시예 10.3 : DM4- SPDB - chMAb2의 생체 내 효능
실시예 10.3.1: 원발성 인간 대장 선암종 CR - LRB -010P에 대한 DM4- SPDB -chMAb2의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-LRB-010P 종양에 대해 DM4-SPDB-chMAb2를 3가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 19일째에 DM4-SPDB-chMAb2를 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
10.0, 5.0 및 2.5 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-chMAb2는 내성이 좋았다. 10 및 5 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-chMAb2는 활성이 있었으며, 각각 ΔT/ΔC<0(p<0.0001)과 1/6 PR 및 ΔT/ΔC=10(p<0.0001)과 퇴행 없음을 나타냈다. 2.5 mg/kg 이하의 투여량은 ΔT/ΔC-=68%를 가져왔다(표 37, 도 26).
Figure pct00019
실시예 10.3.2: SCID 암컷 마우스에서 인간 원발성 침습성 관암종 BRE - IGR -0159에 대한 DM4- SPDB - chMAb2의 항종양 활성 평가
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159 종양에 대해 DM4-SPDB-chMAb2를 3가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 14일째에 DM4-SPDB-chMAb2를 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
10.0, 5.0 및 2.5 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-chMAb2는 내성이 좋았다. 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-chMAb2는 활성이 있었으며, 시험한 모든 용량에서 ΔT/ΔC<0(p<0.0001)과 100% 완전 퇴행을 나타냈다(표 38, 도 27).
Figure pct00020
실시예 10.4: SCID 암컷 마우스에서 인간 원발성 침습성 관암종 BRE - IGR -0159에 대한 DM4- SPDB - chMAb3의 항종양 활성의 효능
재료 및 방법
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 침습성 관암종 BRE-IGR-0159 종양에 대해 DM4-SPDB-chMAb3을 3가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 종양 이식 후 16일째에 DM4-SPDB-chMAb3을 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 5.0, 2.5 및 1.25 mg/kg으로 투여하였다. 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다.
실시예 10.1에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과
5.0, 2.5 및 1.25 mg/kg으로 주어진 DM4-SPDB-chMAb3은 내성이 좋았다. 5.0, 2.5 및 1.25 mg/kg으로 단독 투여 후, DM4-SPDB-chMAb3은 활성이 있었으며, 시험한 모든 용량에서 ΔT/ΔC<0(p<0.0001)과 100% 퇴행을 나타냈다(표 39, 도 28).
Figure pct00021
실시예 11 : 시험관 내 ADCC 활성
표적 세포로서 (실시예 9에 기술된 바와 같이) HCT116 huLAMP1 클론 8과 효과기 세포로서 자연 살해(NK) 세포를 이용하여 ADCC 활성을 평가하였다. 세포 용해를 측정하기 위하여 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석법을 이용하였다(R. L. Shields et al., 2001,J Biol Chem , 276: 6591-6604).
말초 혈액 단핵구 세포 분리
인산염 완충 식염수(PBS)로 혈액을 2-3배 희석하였다. 희석된 혈액 35 mL을 조심스럽게 50 mL 원뿔형 관 내의 피콜 파크 플러스(Ficoll-Paque Plus, GE 헬스케어) 15 mL 위에 층으로 쌓아 올리고, 실온에서 40분 동안 400 g에서 원심분리하였다. 계면으로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수집하고, 새로운 원뿔형 50 mL 관으로 옮겨 PBS로 2회 세척하였다.
NK 분리
밀테니(Miltenyi) NK 세포 분리 키트 프로토콜(130-092-657, 밀테니 바이오테크, Miltenyi Biotech)에 따름. PBMC를 NK 분리 완충액(107개 총 세포에 대해 40 μl의 완충액) 내에 현탁시킨 다음, 비오틴-항체 칵테일(107개 총 세포에 대해 10 μl)를 세포 현탁액에 첨가하였다. 비오틴-항체 칵테일은 NK 세포를 제외하고, 단핵 세포에 결합하는 비오틴이 결합된 항체들을 함유한다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 배양한 다음, NK-분리 완충액(107개 총 세포에 대해 30 μl의 완충액) 및 NK 세포 마이크로비드 칵테일(107개 총 세포에 대해 20 μl)를 첨가하였다. 세포-항체 혼합물을 4℃에서 10분 더 배양하였다. 다음으로, 세포를 50 mL의 NK-분리 완충액으로 1회 세척하고(400g에서 10분 동안 원심분리), 2.10E+8개 세포에 대해 1 mL의 NK-분리 완충액 내에 현탁시키고, 로딩하여 고갈 프로그램을 이용하여 자동 MACS 프로 분리기(밀테니)에 의해 분리하였다. 수거하고 모은 (NK 세포를 함유하는) 음성 분획들을 1회 세척(400g에서 10분 동안 원심분리)하고, 10% 우태아혈청, 2 mM의 L-글루타민, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 1% Hepes, 1% Na-피루브산 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 RPMI-1640에 2.5 x 106/mL로 현탁시켰다.
NK 분리
밀테니(Miltenyi) NK 세포 분리 키트 프로토콜(130-092-657, 밀테니 바이오테크, Miltenyi Biotech)에 따름. PBMC를 NK 분리 완충액(107개 총 세포에 대해 40 μl의 완충액) 내에 현탁시킨 다음, 비오틴-항체 칵테일(107개 총 세포에 대해 10 μl)를 세포 현탁액에 첨가하였다. 비오틴-항체 칵테일은 NK 세포를 제외하고, 단핵 세포에 결합하는 비오틴이 결합된 항체들을 함유한다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 배양한 다음, NK-분리 완충액(107개 총 세포에 대해 30 μl의 완충액) 및 NK 세포 마이크로비드 칵테일(107개 총 세포에 대해 20 μl)를 첨가하였다. 세포-항체 혼합물을 4℃에서 10분 더 배양하였다. 다음으로, 세포를 50 mL의 NK-분리 완충액으로 1회 세척하고(400g에서 10분 동안 원심분리), 2.10E+8개 세포에 대해 1 mL의 NK-분리 완충액 내에 현탁시키고, 로딩하여 고갈 프로그램을 이용하여 자동 MACS 프로 분리기(밀테니)에 의해 분리하였다. 수거하고 모은 (NK 세포를 함유하는) 음성 분획들을 1회 세척(400g에서 10분 동안 원심분리)하고, 10% 우태아혈청, 2 mM의 L-글루타민, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 1% Hepes, 1% Na-피루브산 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 RPMI-1640에 2.5 x 106/mL로 현탁시켰다.
ADCC 프로토콜
(아래에서 RHBP 배지라 나타낸), 0.1% BSA, 2 mM HEPES가 보충된 RPMI-1640 배지(pH 7.4)에 시험한 항체의 1.5x10-7 M부터 1.5x10-17 M까지의 10배 계단 희석액뿐만 아니라, 이소형 대조군 항체를 제조하였다. 각 항체 농도의 3반복물(triplicate)을 둥근 바닥 96웰 플레이트에 분배하였다(50 μL/웰). HCT116 huLAMP1 클론 8 세포들을 RHBP 배지에 0.075x106개 세포/mL로 현탁시키고, 항체 희석액을 함유하는 각 웰에 첨가하였다(100 μL/웰). 표적 세포 및 항체 희석액을 함유하는 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하였다. NK 세포를 세척하고, RHBP 배지에 0.75x106개 세포/mL로 현탁시킨 다음, 50 mL의 NK 세포를 각 웰에 첨가하여, 전형적으로 1개의 표적 세포에 대해 5개의 NK 세포의 비율을 가져왔다. 대조군 A는 NK 세포 대신 RHBP 배지(50 μL/웰)가 첨가된, 표적 세포만을 함유하는(첨가된 항체 및 NK 세포 없음) 웰로 이루어졌다. 대조군 B는 표적 세포의 최대 가능한 LDH 방출을 결정하기 위하여 트리톤 X-100 용액(RPMI-1640 배지, 10% 트리톤 X-100) 20 μL이 첨가된, 표적 세포만을 함유하는 (첨가된 항체 및 NK 세포 없음) 웰로 이루어졌다. 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 100 μL의 상층액을 조심스럽게 새로운 편평바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 세포독성 검출 키트(로쉐(Roche) 11644793001)로부터 새롭게 제조된 LDH 반응 혼합물(100 μL/웰)을 각 웰에 첨가하고, 암소에서 실온에서 30분 동안 배양하였다.
시료의 광학 밀도를 490 mn(OD490)에서 측정하였다. 100%의 용해는 대조군 B 웰의 OD490 값에 해당하였고, 0%의 용해는 대조군 A 웰의 OD490 값에 해당하였다. 각 시료의 특이적인 용해 퍼센트를 다음 식에 의해 결정하였다: (OD490 시료 - 대조군 A의 490) / (OD490 대조군 B - OD490 대조군 A) *100
NK 세포만을 함유하는 시료는 무시할 만한 OD490 판독치를 제공하였다.
실시예 11.1: chMAb1 , chMAb2 및 chMAb3에 의해 매개된 시험관 내 ADCC
chMAb1, chMAb2 및 chMAb3 항체들은 도 29에 나타난 바와 같이 유사하고 강한 ADCC 활성을 특이적으로 유도하였다. 이소형 대조군 항체는 어떠한 유의미한 ADCC 활성을 나타내지 않았다.
실시예 11.2: 시험관 내 ADCC의 가변성
chMAb1 또는 chMAb2의 ADCC 활성들을 정제된 NK의 몇몇 배치에 대해 평가하였는데, 각 배치는 개별적인 혈액 공여자에 해당한다. 표 40에 나타낸 바와 같이, ADCC 활성은 NK 세포들의 하나의 배치에서 다른 배치까지 달랐다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다.
분리된 NK 세포의 개별적인 배치에 대한 최대 ADCC 및 EC50
NK 배치 # 최고 ADCC 값
(최대 LDH 방출 %)		 EC50 설명
chMAb1





 67125903091 36 0.76
67125626389 51 0.05
6712562616 44 미결정 분석한 MAb의 최고 농도에 대해 높은 안정기에 이르지 못해 EC50을 결정할 수 없었음.
67130127373 33 0.009
67130127429 60 미결정 분석한 MAb의 최고 농도에 대해 높은 안정기에 이르지 못해 EC50을 결정할 수 없었음.
67130496259 20 0.6
67130494552 33 0.2
chMAb2


 67125903091 32 0.5
67125626389 52 0.1
6712562616 31 2
67130127429 61 미결정 분석한 MAb의 최고 농도에 대해 높은 안정기에 이르지 못해 EC50을 결정할 수 없었음.
실시예 11.3: LAMP1 항원 밀도에 대한 시험관 내 ADCC 의존도
동일한 NK 배치를 이용하여, 상이한 항원 밀도를 나타내는 HCT116 huLAMP1 클론들에 대해 ADCC를 분석하였다. 도 30의 데이터에 의해 설명되는 바와 같이, 항원 밀도 > 20 000이 현저한 시험관 내 ADCC 활성을 초래하는 데 필요하다.
실시예 11.4: chMAb1 및 DM4- SPDB - chMAb1 또는 chMAb2 및 DM4- SPDB - chMAb2의 시험관 내 ADCC의 비교
DM4-SPDB 접합은 chMAb1 또는 chMAb2의 ADCC 활성에 유의미하게 영향을 미치지 않았다(도 31a 및 도 31b).
실시예 11.5: huMAb1 _1에 의해 매개된 시험관 내 ADCC
ChMAb1을 참고 비교기로서 실험에 포함시켰다. 도 32에 나타난 바와 같이 HuMAb1_1은 chMAb1과 비슷한 ADCC 활성을 유도하였다.
실시예 11.6: DM4- SPDB - huMAb1 _1에 의해 매개된 시험관 내 ADCC
HuMAb1_1을 참고 비교기로서 실험에 포함시켰다. 도 33에 나타난 바와 같이, DM4-SPDB-huMAb1_1은 huMAb1과 비슷한 ADCC 활성을 유도하였다.
실시예 12: 시험관 내 ADCP 활성
표적 세포로서 상이한 LAMP1 항원 밀도를 나타내는 HCT116 huLAMP1 클론들과 효과기 세포로서 인간 대식세포를 이용하여 ADCP 활성을 평가하였다. HCT116 huLAMP1 클론들을 PKH67 형광 염료로 라벨링하였고, 대식세포를 CD14-PC7 형광 염료로 라벨링하였다.
말초 혈액 단핵구 세포 분리
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 실시예 11에 기술된 바와 같이 분리하였다.
단핵구 분리
분리된 PBMC로부터 및 밀테니 단핵구 세포 분리 키트 프로토콜(130-050-201, 밀테니 바이오테크)에 따름. CD14-마이크로비드로 라벨링한 세포들을 자동 MACS 프로 분리기(밀테니 바이오테크)의 양성 선별 프로그램을 이용하여 분리하였다. (단핵구 세포를 함유하는) 수집된 분획을 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI-1640 13.6 mL에 현탁시키고, 1회 세척하고(10분 동안 400 g에서 원심분리), 10% 우태아혈청, 1%의 열 불활성화 인간 혈청(AB; # 14-490E), 2mM의 L-글루타민 및 50 ng/mL의 GM-CSF(밀테니 바이오테크; # 130-093-866)가 보충된 RPMI-1640 64 mL에 최종 농도 106개 세포/mL로 현탁시켰다.
대식세포 분화
64 mL의 T75 플라스크(NUNC; # I56472)에 플라스크당 10 mL을 첨가하였다. 플라스크를 37℃ 5% CO2 배양기에 넣고, 거기서 세포가 8일 동안 부착되도록 하였다. 10% 우태아혈청, 1%의 열 불활성화된 인간 혈청, 2 mM의 L-글루타민 및 50 ng/mL의 GM-CSF가 보충된 RPMI-1640을 배양 4일 후에 교환하였다.
ADCP 프로토콜
대식세포를 아큐타아제(인비트로젠 스템프로(Stempro); # A111-0501)에 의해 현탁시키고, 1회 세척하고(10분 동안 400 g에서 원심분리), 6/1의 비율을 위해 1.5x106개 세포/mL 또는 3/1의 비율을 위해 0.75x106개 세포/mL의 농도로 2% 우태아혈청 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지에 현탁시켰다. 100 μL의 현탁된 대식세포를 둥근 바닥 96웰 폴리프로필렌 플레이트에 분배하였다. 공급업자의 절차(시그마-알드리치; # MIDI67-1KT)에 따라, 107개의 현탁된 표적 세포(HCT116 huLAMP1 클론 4; HCT116 huLAMP1 클론 5; HCT116 huLAMP1 클론 8 또는 HCT116 huLAMP1 클론 12)를 PKH67 형광 염료로 라벨링한 다음, 2% 우태아혈청 및 2 mM의 L-글루타민이 보충된 RPMI-1640에 5x105개 세포/ml로 현탁시켰다. 시험한 huMAb1_1의 9 x10- 8 M부터 3 x10- 12 M까지, 1/3 단계별 희석액뿐만 아니라, 이소형 대조군 항체를 2% 우태아혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에 제조하였다. 각 항체 농도의 2반복(duplicate)을 둥근 바닥 96웰 폴리프로필렌 플레이트에 분배하였다(150 μL/웰). 150 μL의 PKH67이 라벨링된 표적 세포를 항체 희석액을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 표적 세포 및 항체 희석액을 함유하는 플레이트를 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 100 μL의 혼합물(표적 세포 + 항체)를 대식세포를 함유하는 96웰 플레이트에 첨가한 다음, 이를 37℃ 5% CO2 배양기에 4시간 내지 17시간 두었다. 세포를 아큐타아제(인비트로젠 스템프로; # A111-0501)에 의해 현탁시키고, 2회 세척하고(10분 동안 400 g에서 원심분리), CD14-PC7 항체(베크만 코울터(Beckman Coulter); # PN A22331)를 함유하는 완충액(5%의 열 불활성화된 인간 혈청이 보충된 PBS)에 현탁시켰다. 4℃에서 20분 동안 배양 후, 세포들을 1회 세척하고, 250 μL의 PBS에 현탁시키고, 1회 세척하고, 50 μL의 고정 파라포름알데히드 용액(PBS, USB 내 PFA 4%; #19943)에 현탁시켰다. 시료를 세포계수분석시까지 4℃에서 보관하였다.
세포계수 분석
MACSQUANT 기기를 이용하여 시료를 분석하였다. 이중 라벨링된 세포(PKH67 양성 및 PC7 양성 세포)로서 식세포작용을 결정하였다. 얻어진 전형적인 데이터를 도 34에 나타내었다.
실시예 12.1 : huMAb1 _1에 의해 매개된 시험관 내 ADCP
두 비율의 대식세포/HCT116 huLAMP1 클론 8을 분석하였다. BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 추정하였다. HuMAb1_1은 3/1의 대식세포/표적 세포 비율로 유의미한 시험관 내 ADCP를 유도한다. 더 높은 비율, 6/1은 표 41에 나타난 바와 같이, 더 낮은 EC50 또는 더 높은 식세포작용 %를 초래하지 않았다.
huMAb1_1에 의해 매개된 시험관 내 ADCP
비율
대식세포/표적 세포 		대식세포의 배치 EC 50 (nM) 식세포작용의 최대
3/1



 67131617438 0.28 32
67131617470 0.56 39
67131354967 0.5 43
67130713495 0.47 33
67130713495 0.36 34

6/1		 67130713495 0.98 41
67130713495 0.34 40
실시예 12.2 : LAMP1 세포 표면 발현에 대한 시험관 내 ADCP 의존도
상이한 항원 밀도를 나타내는 HCT116 huLAMP1 클론에 대해 ADCP를 분석하였다. huMAb1_1에 의해 유도된 시험관 내 ADCP의 수준은 LAMP1의 항원 밀도와 관련이 있는데, 표 42로부터 추론할 수 있듯 LAMP1 항원 밀도가 감소됨에 따라 식세포작용의 최대값도 감소하였다.
LAMP1 세포 표면 발현에 대한 시험관 내 ADCP 의존도
표적 세포 항원 밀도 평균 EC 50 (nM) +/- STD 식세포작용의 최대값의 평균 ( % ) +/- STD
HCT116 huLAMP1 클론 5 300 000 0.33 +/- 0.21 45.5 +/- 15.5
HCT116 huLAMP1 클론 8 100 000 0.43 +/- 0.11 36.2 +/- 4.7
HCT116 huLAMP1 클론 4 20 000 0.73 +/- 0.17 34.0 +/- 9.1
HCT116 huLAMP1 클론 12 2500 0.65 +/- 0.49 8.7 +/- 4.1
실시예 12.3: huMAb1 _ negB에 대한 시험관 내 ADCP
(실시예 7.2에 기술된) huMAb1_negB에 의해 유도된 ADCP를 평가함으로써 FCγRIIIa 매개된 식세포작용을 평가하였다. 예상했던 대로(대식세포는 활성화를 위해 FCγRIIIa에 엄격하게 의존하지 않음), huMAb1_negB는 huMAb1_1보다 더 낮은 ADCP를 초래하였으나, huMAb1_negB가 사용될 때 ADCP는 여전히 발생했다. 얻어진 전형적인 데이터를 도 35에 나타내었다.
실시예 12.4: huMAb1 _ negA에 대한 시험관 내 ADCP
항원 특이성 매개 식세포작용을 평가하기 위하여 (실시예 B7.2에 기술된) huMAb1_negA에 의해 매개된 ADCP를 시험하였다. 도 36에 표시된 바와 같이, huMAb1_negA는 어떠한 ADCP도 유도하지 않아, huMAb1_1에 대해 얻어진 데이터의 특이성을 검증하였다.
실시예 13: LAMP1 유전자 카피 수 변화
재료 및 방법:
어레이 기반 올리고뉴클레오티드 비교를 통한 게놈 혼성화 ( aCGh )
인간 게놈 CGH 마이크로어레이 400k-(애질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아 주 산타클라라)를 이용하여 게놈 DNA를 분석하였다. 인간 CGH 2x400K 마이크로어레이를 위한 애질런트 올리고 aCGH 브라보 플랫폼 프로토콜을 이용하여, 소화, 라벨링 및 혼성화를 수행하였다. 모든 실험에서, 인간의 특성이 잘 분석된 정상 여성(NA12878) 또는 하나의 특성이 잘 분석된 정상 남성(NA10858)으로부터의 성별이 매치된 DNA를 참조 DNA로 이용하였다. 이러한 경험에 이용된 정상적인 인간 게놈 DNA는 코리엘(Coriell) 참조에 의해 상업화되어 있다.
제조사의 프로토콜(버전 6.2 2009년 10월; http://www.agilent.com)에 상세히 설명된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 aCGH 프로세싱을 수행하였다. 마이크로어레이는 참조 시료로부터 및 실험 시료로부터, 600 ng의 게놈 DNA를 필요로 했다. 어레이를 애질런트 DNA 마이크로어레이 스캐너(G2565CA)로 스캔하였다.
피쳐 추출(Feature Extraction) 소프트웨어(v10.7.3.1, 애질런트)를 이용하여 스캔한 영상으로부터 데이터를 추출하고 정규화하였다.
어레이 스튜디오(Array Studio) 소프트웨어를 이용하여 로그2 비율 및 분할(segmentation)을 생성하였다. 어레이 스튜디오, 어레이 뷰어(Array Viewer) 및 어레이 서버(Array Server) 및 모든 기타 오믹소프트(Omicsoft) 제품 또는 서비스 명칭은 오믹소프트사(Omicsoft Corporation, 미국 노스캐롤라이나 주 리서치트라이앵글파크)의 등록된 상표 또는 상표이다.
로그2 비율 분포의 집중화를 검증하고, CBS 알고리즘을 이용하여 분할을 수행하였다(Olshen et al.; Biostatistics (2004), 5(4): 557). 이상 상황 호출(aberration status calling)이 내부 잡음(게놈 상의 연속적인 프로브들에 걸친 로그2 비율 값의 편차)에 따라 각 프로파일에 대해 자동적으로 수행되었다. 모든 게놈 좌표들을 UCSC 인간 게놈 빌드 hg19 상에 확립하였다(Karolchik D et al. Nucleic Acids Res 2003, 31: 51). 각 부위 또는 유전자에 대해, 로그 비율 값 및 카피 수 변화를 이후의 분석을 위한 내부 데이터베이스에 도입하였다.
유전자 발현
진칩(GeneChip) 발현 3'-증폭 시약 키트 및 U133플러스(Plus) 진칩(GeneChip) 어레이(애피메트릭스(Affymetrix), 미국 캘리포니아 주 산타클라라)를 이용하여, 발현 분석(Expression Analysis) 시아(Cia) 플랫폼을 이용하여, 유전자 발현 분석을 수행하였다. 데이터베이스 관리, 품질 제어 및 분석을 위해 리졸버(Resolver) 소프트웨어(로제타 바이오소프트웨어(Rosetta Biosoftware), 미국 워싱턴 주 커클랜드)로 모든 데이터를 가져왔다. 각각의 mRNA는 하나 이상의 한정자에 의해 표시된다. 분석을 위해 각각의 한정자로부터의 발현 값을 환자 유래 종양 이종 이식편 종양 은행 데이터베이스(Tumor bank database)에 다운로드하였다.
동물
표준 동물 규정 및 컨소시엄의 구성원들 사이에 이동을 허용하는 엄격한 위생 관리에 따라 각 기관의 동물 시설에서 동물을 유지시켰다. 스위스-누드 및 CB17-SCID 암컷 마우스뿐만 아니라, NIH-누드 랫트를 찰스 리버 프랑스(프랑스 레 옹썽)에서 사육하였다. 실험 개시 시에 마우스 체중은 18g 이상이었고, 랫트 체중은 160g 이상이었다. 동물을 보살피는 것과 수용하는 것은 기관 가이드라인뿐만 아니라, 국내 및 유럽법 및 프랑스 삼림 및 농업부에 의해 제시된 규제 및 UKCCCR 가이드라인에 의해 요구되는 기준을 준수하였다.
시료 제조
동결 단편을 -20℃의 크라이오스탯에서 절단한 다음, 면역학적 제어 및 병리학자에 의한 종양 세포 백분율 평가를 위해 시작 및 끝 박편을 HES(헤마톡실린-에오신-사프란)으로 염색하였다. QIAamp DNA 키트 프로토콜 v01(키아젠(Qiagen), 독일 힐덴)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. RNA 추출 키아젠 프로토콜 v01을 이용하여 종양 시료로부터 총 RNA를 추출하고, RNA이지 키트(키아젠)으로 정제하였다.
PDX의 분자 특성 분석
동일한 이종이식 계대를 이용하여 PDX의 각 종양 모델의 분자 특성 분석(CGH, RNA 발현 및 IHC)을 수행하였다.
면역조직화학
LAMP1 유전자 및 이의 부위(13q34)의 게놈 카피 수 이상과 PDX(동결-Oct) 상에서의 LAMP1의 막 국소화의 단백질 수준의 변화(강함, 중간, 약함 및 음성)를 연관짓기 위하여, CGH 및 RNA 발현 특성 분성에 이용되는 PDX의 동일한 계대에 대해 특이적인 염색(mAb1)을 수행하였다.
아비딘 및 비오틴 블로킹(Endogenous Block, 벤타나, 760-050) 후, 동결 박편(동결-OCT 포맷)을 37℃에서 32분 동안 쥐 단일 클론성 항체 MAb1(인산염 완충 식염수, PBS 내 최종 농도 1 μg/mL(인간 시료에 대해) 및 1과 5 μg/mL(원숭이 시료에 대해))과 배양하였다. 4분 동안 글루타르알데히드(NaCl 0.9% w/v 내 0.05%)로 후고정 단계를 행하였다. 비오틴이 부착된 2차 염소 항-마우스 IgG2a를 37℃에서 12분 동안 배양하였다(서던 바이오테크, Ref 1080-08, 벤타나 희석제 내 1/200 희석액). 제조사의 설명서에 따라 DAB Map 발색 검출 키트로 면역 염색을 행하였다. 헤마톡실린 II(790-2208, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)로 크라이오스탯 박편에 대조염색 단계를 적용하고, 블루잉 시약(760-2037)을 4분 동안 적용하였다. 염색된 슬라이드를 건조시키고, 커버퀵 2000 봉입제(라보노드, Ref 05547530)를 이용하여 커버글래스로 봉하였다.
본 연구에 사용된 음성 대조군은 1차 항체의 생략 및 IgG2a 이소형의 사용(PBS 내 최종 농도 1 μg/mL)에 있었다.
데이터 분석을 위하여, 정제된 쥐 항체 MAb1과 면역 염색된 박편을 스캔하고, 스캔 스코프 XT 시스템(아페리오 테크놀로지스, 미국 캘리포니아 주 비스타)을 이용하여 x20 배율에서 디지털화하였다. 그런 다음, 디지털화된 이미지를 이미지 스코프 소프트웨어(v10.2.2.2319 아페리오 테크놀로지스)를 이용하여 캡쳐하였다.
양성 시료를 1 내지 3의 강도 등급으로 점수화했다. 강도 범위를 음성(0), 약함(1), 보통(2) 및 강함(3)으로 설명하였다. 세포 빈도는 면역 염색된 세포의 백분율이고, 시료에 의해 중간값으로서 조직학자의 관찰에 의해 추정되었다. 세포 빈도는 5개 카테고리로 정리된다: 1(0-5%), 2(6-25%), 3(26-50%), 4(51-75%) 및 5(76-100%).
전체 발현을 올레드 점수(Allred score, AS) 설명에 따라 계산하였다. AS는 강도 및 비율 점수를 더하여 0-8 범위의 총점을 얻음으로써 획득하였다. AS는 최대 전체 점수의 백분율로 보고되었고, 5개의 카테고리로 분류된다: 매우 낮음(0-25%), 약함(26-50%), 보통(51-75%) 및 높음(75-100%). 유병률은 표시에 대한 양성 사례들의 백분율로 정의되었다.
기초적인 기술 통계학은 마이크로소프트 엑셀 2003으로 계산되었다. 각 표시에 대해, 사례의 수, 양성 사례 수, 유병률, 강도 점수 평균, 빈도 평균 및 올레드 점수가 기술되었다.
통계적 분석
mRNA 발현 및 LAMP1 유전자 변화(획득 또는 증폭) 사이의 관계를 연구하기 위하여, 우리는 PDX 데이터에 스튜던트 검정법을 적용하여, 종양 PDX의 mRNA 발현 수준을 카피 수 변화와 또는 카피 수 변화 없이 비교하였다. 또한, 우리는 CRC PDX 및 그것들 각각의 LAMP1 유전자 및 그 부위(13q34)의 게놈 카피 수 변동 사이의 상관관계를 퍼슨 상관성 검정법으로 결정하였다.
또한, 정규화된 mRNA 발현과 카피 수 사이에서 스피어만 상관성 검정법을 이용하여 TCGA (The Cancer Genome Atlas) 데이터베이스로부터의 대규모 대장결장 환자 조직 시료들 세트(n=574)를 이용하는 상관성 분석을 수행하였다. IHC 분석에 의해 결정된 PDX 종양 세포들의 원형질 막에서의 LAMP1 발현 또는 무발현 및 카피 수 인자 변화 또는 무변화의 관계를 연구하기 위하여, 코크란-맨텔-핸젤 검정 통계학을 수행하였다. 대장 PDX를 위해, IHC 점수(음성-약함, 중간 및 강함) 대 카피 수(CN<2.5 및 CN≥2.5)를 이용하여 검정을 수행하였다. 폐와 위 PDX를 위해, IHC 점수(음성-약함, 중간-강함) 대 카피 수(CN<2.5 및 CN≥2.5)를 이용하여, 층화 코크란-맨텔-핸젤 통계학을 수행하였다. SAS 9.2(SAS 인스티튜트) 및 Everstat V6(SAS 인스티튜트를 기초로 한 사노피)을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다.
생물정보학 분석: TCGA (The Cancer Genome Atlas)의 카피 수 변화
GISTIC(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer) 방법론을 이용하여 DNA 시료를 분석한다(Beroukhim, R. et al.; Nature 2010 463, 899　;Beroukhim, R. et al.; Proc Natl Acad Sci U S A (2007); 104, 20007). 간략히 설명하자면, 데이터세트 전반에 걸쳐 평균 진폭 및 초점 증폭의 빈도에 따라 각각의 마커를 점수화하고, 게놈 전반에 걸친 마커의 무작위 순열에 의해 얻어진 점수의 분포를 비교하여 유의도 값을 산출한다. 어떠한 새로운 부위도 각 염색체 상에서 q-값 ≤ 0.25의 유의도 역치를 넘지 않을 때까지 (각 피크의 점수에 따라 평가된) 세그먼트들을 겹치게 하는 모든 피크들 중에서, 증폭된(또는 결실된) 세그먼트들과 관련된 점수를 분포시키는, 반복적인 필-오프(peel-off) 절차를 이용하여 증폭(또는 결실)의 유의미한 피크 부위를 확인한다. 마지막으로, GISTIC 점수 프로파일 내의 자동 상관성을 고려하여, 적어도 99% 확률을 나타내는 진정한 활성화 유전자(driver gene) 또는 유전자들을 함유하는 것으로 예상되는 각 피크 부위에 대해 신뢰 구간을 산출한다(TCGA Network. Nature 2008; 455: 1061).
GISTIC 출력으로부터 유전자 기반의 호출을 이용하였다. 유전자는 다음과 같이, 특이적인 역치를 이용하여, 깊은 결실, 얕은 결실, 중성 카피 수, 낮은 획득 및 높은 획득으로 정의되었다. 높은 획득은 1.32를 초과하는 로그2 비율이다. 낮은 획득은 0.3부터 높은 획득 역치까지이다. 중성 세그먼트는 -0.5 내지 0.3 사이의 카피 수를 나타낸다. 얕은 소실은 -0.5 내지 깊은 결실 역치 사이의 카피 수를 나타낸다. 깊은 결실은 -0.737 이하의 카피 수를 나타낸다.
실시예 14: LAMP1 유전자 카피 수 변화
CRC PDX 종양 시료 이용시
전체 게놈 고밀도 aCGH 400K-올리고뉴클레오티드 어레이를 이용하여 총 61개의 대장 종양 PDX를 분석하였다. 표 44에 나타낸 바와 같이, 61개 대장결장 암 PDX 중 6개(9.8%)가 높은 수준의 LAMP1 유전자 증폭을 나타내며(즉, CN ≥5 또는 로그2비율 ≥1.32), 57.4%가 LAMP1 유전자 획득을 나타낸다(즉, 2.5 ≤CN <5 또는 0.32≤ 로그2 ratio <1.32).
폐 PDX 종양 시료 이용시
전체 게놈 고밀도 aCGH 400K-올리고뉴클레오티드 어레이를 이용하여 총 35개의 폐 종양 PDX를 분석하였다. 표 45에 나타낸 바와 같이, 연구했던 하나의 폐 종양 PDX(3%)가 높은 수준의 LAMP1 유전자 증폭을 나타내며(CN=9.26), 26%가 LAMP1 유전자 획득을 나타낸다(즉, 2.5≤ CN ≤5 또는 0.32≤ 로그2 비율 <1.32).
상업적인 종양 DNA 조직 시료 이용시
또한, 식도 종양 DNA 시료(애스터랜드)에서 전체 게놈 고밀도 aCGH 400K-올리고뉴클레오티드 어레이를 이용하여 CGH 분석을 수행하였다. 표 46에 나타난 바와 같이, 연구했던 46개의 식도 종양 시료들 중 2개에서(4.3%) LAMP1 유전자의 획득 또는 증폭이 있고, 이들 중 하나(2%)는 39.81 카피와 동일한 LAMP1의 초점 증폭을 나타낸다. 이러한 높은 수준 및 LAMP1의 초점 증폭은 64세의 아시아 여성(ES01_F12)에서 검출되었다. 이러한 생검은 80%의 종양 세포를 함유한다.
TCGA (the Cancer Genome Atlas) 데이터에 의한 환자 종양 시료 이용시
TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 이용하여 카피 수 변화에 대한 후속 분석을 수행하였다. 대규모 세트의 대장결장 시료(n=574) 이용시, 결과는 내부 데이터(CRC PDX)를 이용하여 얻어진 결과들과 극히 유사하다. 대장결장 및 직장 인간 선암종 분석(암 게놈 아틀라스)은 14.4% 높은 증폭을 개시한다(HighAmp). LAMP1이 증폭된 다른 종양 유형을 검색하기 위하여 TCGA 데이터를 이용하는 후속 카피 수 이상 분석을 수행하였다. 요약하자면, LAMP1 DNA 유전자 낮은 수준의 획득(LowAmp; 로그2 비율 = 0.3 < LowAmp < 1.32) 및 높은 획득(증폭)(HighAmp, 로그2 비율 ≥ 1.32(이론적으로는, 전체 5.0 카피 이상))이 대장결장 선암종, 위, 간, 폐(선암종 및 편평), 유방(Basal, BRCA, LUMA, LUMB 및 HER2), 난소, 두경부, 신장(신장 난염성 세포, 신장 투명세포 암종, 신장 유두상 세포 암종, 자궁경부 편평세포, 췌장, 전립선, 방광 요로상피, 신경아교종(낮은 등급 신경아교종 및 다형성아교모세포종), 자궁, 갑상선, 백혈병, 림프종, 식도, 흑색종 및 연조직 육종을 포함하는, 28개 종양 유형에서 검출된다. 이들 종양 유형 중 대장결장 선암종, 위, 간, 폐, 유방, 난소, 두경부, 자궁경부 편평세포, 아교모세포종, 신경아교종, 자궁, 갑상선 및 연조직 육종을 포함하는 12개의 LAMP1 높은 획득 또는 증폭 데이터를 표 43 및 도 10a에 나타내었다.
LAMP1 게놈 이상 요약: 18개 TCGA 종양 유형
고증폭 % 평균
< 로그2 > 고증폭 		저증폭 % 평균
< 로그2 > 저증폭 		사례 수 종양
유형 		종양
0.000 0.000 16.071 0.688 56 BLCA 방광 요로
암종
1.578 2.084 9.587 0.626 824 BRCA 유방 침습성 암종
1.471 1.347 10.294 0.504 68 CESC 자궁경부
편평세포
14.460 1.892 41.463 0.714 574 COADREAD 대장 및 결장 선암종
0.536 4.495 1.964 0.642 560 GBM 아교모세포종
0.694 4.058 11.111 0.526 288 HNSC 두경부편평세포
0.000 0.000 4.090 0.516 489 KIRC 신장 투명세포
0.000 0.000 13.333 0.673 75 KIRP 신장 유두상 세포
0.694 2.018 2.083 0.462 144 LGG 낮은 등급 신경아교종
1.754 3.268 15.789 0.620 57 LIHC 간세포암종
1.132 1.661 7.925 0.471 265 LUAD 폐 선암종
1.418 4.565 6.383 0.581 282 LUSC 폐 편평세포
1.792 2.061 15.950 0.601 558 OV 혈청 난소
0.000 0.000 7.143 0.329 14 PAAD 췌장 선암종
0.000 0.000 2.000 0.475 100 PRAD 전립선 선암종
2.273 1.430 23.485 0.517 132 STAD 위 선암종
0.000 0.000 0.877 0.450 228 THCA 갑상선 선암종
0.234 2.780 7.009 0.659 428 UCEC 자궁체부 내막양 암종
로그2 = 1.32 ≤ 고증폭 < ∞ ; 로그2 = 0.32 < 저증폭 < 1.32
PDX 상에서 LAMP1 ( 13q34 ) 변화(획득/증폭)의 게놈적 정의
LAMP1 유전자 획득 또는 증폭은 초점성 체성 획득 또는 증폭, 13q 상에서의 체성 큰 주위 획득 또는 증폭, 체세포 염색체 2배성, 체세포 염색체 3배성 또는 다배수성과 관련이 있을 수 있다.
대장 종양 PDX에서, LAMP1 DNA 획득 또는 증폭은 CUL4A , LAMP1 , TFDP1 및 GAS6을 아우르는 더 큰 앰플리콘 내에 포함된다. 표 44에 나타난 바와 같이, 대장암 PDX의 경우, 평균 크기의 세그먼트는 각각 증폭 및 획득에 대해 8489.5 kb 및 49292.7 kb이다. 최소 부위는 454 kb를 아우르며, 이는 염기 113319683에서 시작하고, 염기 115107245에서 끝나며, LAMP1 이외의 유전자들을 함유한다: ADPRHL1 , CUL4A, DCUNID2 , GRTP1 , LOC100130463 , PCID2 , PRO7 , TFDP1 , TMCO3 및 F10. 대부분의 DNA 획득 또는 증폭은 적어도 유전자들 ADPRHL1 , ATP11A , ATP4B , CUL4A , DCUN1D2, F10, F7, FAM70B , FLJ41484 , FLJ44054 , GAS6 , GRK1 , GRTP1 , LAMP1 , LINC00552, LOC100128430 , LOC100130463 , LOC100506063 , LOC100506394 , MCF2L , MCF2L-AS1, PCID2 , PROZ , RASA3 , TFDP1 및 TMCO3C13orf35를 함유한다. 최대 획득 부위는 95.8 Mb(19,296,544-115,107,245)를 커버한다.
대장암 PDX에 대해 연구한 집단(LAMP1 증폭, 획득, 이배체 및 이형 소실(LAMP1 유전자의 하나의 대립유전자의 완전 또는 부분 소실)의 LAMP1 카피 수 분석에 대한 기술 분석
매개변수 세그먼트에 대한 기술적 통계학 (크기 kb)
상태 N 평균 표준 편차
이형 소실 1 41152 .
이배체 19 65768.5 31068.78
획득 35 49292.7 37513.6
증폭 6 8489.5 13016.03
폐 종양 PDX(표 45)에서, 크기 세그먼트의 평균은 획득의 경우, 14966.4 kb이다. 최소 부위는 1186 kb를 커버한다.
폐암 PDX에 대해 연구한 집단(LAMP1 증폭, 획득, 이배체, 결실 및 이형 소실(LAMP1 유전자의 하나의 대립유전자의 완전 또는 부분 소실)의 LAMP1 카피 수 분석에 대한 기술 분석
매개변수 세그먼트에 대한 기술적 통계학 (크기 kb)
상태 N 평균 표준 편차
결실 1 1460 .
이형 소실 7 44592.4 39478.32
이배체 17 26744.9 37016.96
획득 9 14966.4 31033.29
증폭 1 4874 .
식도 인간 종양에 대한 LAMP1 ( 13q34 ) 획득에 대한 게놈적 정의
식도암 DNA 시료(애스터랜드)에서, LAMP1 획득 또는 증폭은 또한 큰 앰플리콘을 포함하고 있으며, 최대 획득 부위는 4523kb(110584050 - 115107245)를 아우르고, 최소 부위는 39.81 카피 수와 동일한 LAMP1 증폭(Chr13q34)을 제시한다. LAMP1의 이러한 초점성 증폭은 378 kb를 커버하고, 10개의 유전자들 ADPRHL1 , CUL4A , F10, F7, GRTP1 , LAMP1 , LOC100130463 , PCID2 , PROZ 및 MCF2L을 포함한다.
식도암 조직에 대해 연구한 집단(LAMP1 증폭, 획득, 이배체 및 이형 소실(LAMP1 유전자의 하나의 대립유전자의 완전 또는 부분 소실)의 LAMP1 카피 수 분석에 대한 기술 분석
매개변수 세그먼트에 대한 기술적 통계학 (크기 kb)
상태 N 평균 표준 편차
소실 5 70415 29317.91
무변화 39 48109.4 37656.46
획득 1 4523 .
증폭 1 378 .
실시예 15: LAMP1 유전자 카피 수 및 mRNA 유전자 발현 사이의 관계
유전자 발현 프로파일 및 LAMP1 부위에서의 카피 수 변화에 의한 mRNA 발현 수준의 분석
CRC 종양 PDX를 이용하는, LAMP1 카피 수 변화(증폭 및 획득) 분석 이외에, LAMP1 증폭 사이의 상관관계를 CGH 분석에 의해 평가하고, mRNA(애피메트릭스 테크놀로지)를 이용하여 LAMP1 발현을 평가하였다. 피어슨 상관성 검정을 이용하는, mRNA 분석 결과(표 47)는 LAMP1 카피 수와 LAMP1 mRNA 발현 수준 사이의 높은 상관관계((r) = 0.59; p < 0.0001)를 나타내었다(도 8a). 대장 종양 PDX의 경우, LAMP1 유전자 카피 수(획득/증폭이 있거나 없는) 및 LAMP1 mRNA 발현을 비교하기 위하여 스튜던트 검정법을 수행한다. mRNA 발현 분석은 애피메트릭스 기술을 이용하여 수행하였다(표 48 및 도 8b).
CRC PDX 상에서의 LAMP1: 카피 수 변경 데이터 및 mRNA 데이터와의 상관성
종양 유형 총 모델 획득 사례의 수 >4.5 획득 사례의 수 이배체 수 이형 소실의 수 mRNA와의 상관성(r) P값
CRC PDX 58 45161.2 +/- 6987.02(Kb) (n=29)
( 50 % ) 		30710.7 +/- 11123.32 (Kb) (n=9)
(약 15.5%) 		66942.5 +/- 6795.47 (Kb) (n=19)
(약 33%) 		91670 +/- (n=1)
(<1%) 		0.59 < 0.0001
인자 카피 수에 대한 mRNA 발현의 스튜던트 t-검정법
인자 카피 수에 대한 스튜던트 t-검정법
매개변수
 평균 +/- SEM DF
 t 값
 p
<2.5 ≥2.5
RNA 강도 11785.30 +/- 496.501
(n=18)		 14987.09 +/- 486.708
(n=39)		 55 -4.04 p=0.0002
p<0.05인 경우, 인자는 매개변수에 유의미한 영향을 미친다
mRNA 발현은 LAMP1 유전자 수 변화(CN≥2.5)에 대해 유의미하게 더 높다.
CGH 분석법에 의한 LAMP1 증폭과 mRNA를 이용한 LAMP1 발현 사이의 피어슨 검정법을 이용하는 상관성 분석은, 연구한 이들 두 매개변수 사이의 유의미한 상관관계를 보여준다.
도 8a에 나타난 바와 같이, LAMP1 높은 증폭(증폭)을 나타내는 집단은 LAMP1 낮은 증폭(획득), 이배체 및 이형 소실을 나타내는 집단들보다 더 높은 mRNA 발현 수준을 보여준다.
TCGA (암 게놈 아틀라스) 데이터로부터의 더 큰 대장결장 환자 조직 시료 세트(n=574)를 이용하는 상관성 분석은 mRNA 발현과 상관관계가 있는 14.4% 증폭을 개시하였고((r) = 0.57; p<0.0001), 이 결과는 CRC PDX에 대해 관찰한 것과 극히 유사하다.
나아가, 동일한 데이터 세트를 이용하여, LAMP1 카피 수 변화 및 mRNA 발현 수준 사이의 유의미한 상관관계는 방광 요로 암종(BLCA), 유방 침습성 암종(BRCA), 폐 선암종(LUAD), 폐 편평세포(LUSC) 및 난소(OV)에 대해 명백하였다(도 9).
실시예 16: LAMP1 카피 수 변동 및 이의 LAMP1 단백질 세포막 발현 수준에 미치는 영향
LAMP1 카피 수 변화 및 면역조직화학(IHC)에 의해 검출된 단백질 세포막 발현 수준의 관련성
LAMP1 획득 및 이의 LAMP1 RNA 발현과의 관계에 대한 분석 이외에, 우리는 LAMP1 카피 수 변화(획득 또는 증폭)의 세포막 LAMP1 단백질 국소화에 대한 연관성을 대장, 폐 및 위 종양 PDX에 대한 항체 mAb1을 이용한 IHC 발현 점수법(강함, 중간, 약함 및 음성)을 이용하여 평가하였다.
아래 표 49와 표 50 및 도 11에 나타난 바와 같이, 대장, 폐 및 위 PDX 시료에서의 IHC 세포막 발현에 대한 분석은 LAMP1 단백질이 연구했던 95개 PDX 모델 중 39개(41.1%)에서 막 세포에서 발현되며, LAMP1 막 발현에 대해 양성인 이러한 PDX 시료 중 33개(39개 중 33개; 85%)가 LAMP1 획득 또는 증폭도 제시하고, 이들 대부분은 대장 PDX임을 보여준다.
대장 종양 PDX의 LAMP1 카피 수 데이터 빈도 및 IHC 점수 데이터
카피 수 빈도 IHC 총계
음성_약함 중간 강함 총계
<2.5 15 4 0 19
≥2.5 13 18 10 41
총계 28 22 10 60
폐 및 위 종양 PDX의 LAMP1 카피 수 데이터 빈도 및 IHC 점수 데이터
카피 수 빈도 종양 유형 IHC 총계
음성_약함 중간_강함
<2.5
폐 9 2 11
위 11 0 11
≥2.5
폐 5 1 6
위 3 4 7
IHC 막 발현 및 카피 수 변화 사이의 관련성을 코크란-맨텔-핸젤 통계학을 이용하여 연구하였다(표 51 및 표 52).
대장 PDX 종양 시료에서 LAMP1의 카피 수에 의한 LAMP1 IHC 막 발현의 코크란-맨텔-핸젤 통계학
(순위 점수를 기초로 한) 코크란 - 맨텔 - 핸젤 통계학
대안적인 가설 DF 값 확률
비제로 상관성 1 12.4418 0.0004
대장 종양 PDX에서, LAMP1 IHC 막 발현 및 LAMP1의 카피 수 사이의 연관성은 유의미하다.
폐 및 위 PDX 종양 시료에서 LAMP1의 카피 수에 의한 LAMP1 IHC 막 발현의 코크란-맨텔-핸젤 통계학
(순위 점수를 기초로 한) 코크란 - 맨텔 - 핸젤 통계학
대안적인 가설 DF 값 확률
비제로 상관성 1 4.5416 0.0331
종양 유형에 대해 조정한 후, LAMP1 IHC 막 발현 및 LAMP1의 카피 수 사이의 연관성은 유의미하다.
우리는 LAMP1 세포 표면 국소화의 수준(강함 및 중간)이 종양 PDX 시료에 대한 카피 수 변화와 관련이 있다고 결론을 내린다. LAMP1의 대부분의 세포 표면 국소화는 LAMP1 획득 또는 증폭의 결과로 보인다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 17: 면역조직화학(IHC)에 의한 FFPE 종양 조직에 대한 LAMP1 막 강화를 검출하기 위한 특이적인 펩티드 및 mAb
환자 치료 전 또는 치료 중에 바이오뱅크 또는 병원으로부터 종양 조직의 IHC 분석은 통상적으로 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 시료로 행해진다. 상업적으로 이용 가능한 mAb 및 이전에 기술된 세 가지 mAb(MAb1, MAb2 및 MAb3)가 LAMP1의 세포 내 검출을 허용할 수 있고, MAb1, 2 및 3을 포함하는 그것들 중 일부는 동결-OCT 및 AFA(알코올 포르말린 아세트산 고정제) 시료 포맷에서 LAMP1 막 강화의 검출을 허용할 수 있지만, 그것들 중 어느 것도 FFPE 포맷에서 LAMP1 강화의 검출을 가져올 수는 없다. 이유 중 하나는 아마도 단백질의 복잡성과 결합된, 포르말린 고정제의 영향이다. 동결된 OCT 또는 AFA에 처리된 시료들은 병원에서는 통상적으로 제조되지 않는다. 따라서, FFPE 종양 바이오뱅크 및 병원 시료들을 완전하게 그리고 신속하게 커버하게 할 수 있는 mAb를 가질 필요가 있다.
아래 실시예에서는 서열 번호 24의 360 내지 375 위치의 제2 루멘 도메인에 위치하고, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 가지고 있는 펩티드(펩티드 4)를 확인함으로써 이러한 어려움들을 극복할 수 있었음을 보여준다. 상기 펩티드는 FFPE 조직에서 LAMP1 막 강화의 검출을 가져오는 토끼 다클론성 항체 및 마우스 단일 클론성 항체의 획득을 허용하였다.
시험했고, IHC에 의해 FFPE 조직에 대해 어떠한 LAMP1 막 강화도 나타내지 않는 항LAMP1 mAb의 목록
다음 공급업체로부터 얻어진 MAb 종 클론 번호
에피토믹스(Epitomics) 토끼 ERP4204
노버스 바이올로지컬스
(Novus Biologicals)		 마우스 B-T47
바이오레전드(Biolegend) 마우스 H4A3
유나이티드 스테이츠 바이올
(United States Biol)		 마우스 5K76
산타 크루즈(Santa Cruz) 마우스 E-5
산타 크루즈(Santa Cruz) 마우스 H5G11
바이오르비트(Biorbyt) 마우스 단일 클론성
바이오르비트(Biorbyt) 토끼 단일 클론성
본 출원에 기술된 MAb
MAb1 마우스 단일 클론성
MAb2 마우스 단일 클론성
MAb3 마우스 단일 클론성
실시예 17.1: FFPE 종양 조직에 대해 LAMP1 막 강화를 가져오는 토끼 다클론성 항체의 생산
본 실시예는 인간 LAMP1 루멘 도메인 내의 펩티드 선택, 다클론성 항체의 생성 및 IHC 스크리닝을 설명한다. 그것은 서열 번호 24의 인간 LAMP1 서열 상의 360 내지 375번 위치의 아미노산에 해당하는 서열 번호 82의 특정 펩티드("펩티드 4")를 이용할 때, 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에 대한 LAMP1 막 강화의 검출을 허용하는 다클론성 항체를 획득할 실현 가능성을 증명한다.
실시예 17.1.1: 펩티드 또는 가용성 LAMP1 단백질로 토끼 면역화. 다클론성 항체의 정제.
펩티드 제조 :
N-당화 자리가 없고, 내부 시스테인이 없는 두 개의 루멘 도메인 내에서 15-16개 아미노산의 펩티드를 선택하였다. 총 네 개의 펩티드를 화학적으로 합성하고, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 운반 단백질과 결합시켰다. 필요시, 말단의 시스테인을, 그것의 티올 기를 통해 말레이미드 활성화 KLH 단백질과 짝지음이 일어나도록, 이전에 펩티드에 첨가하였다.
네 개의 선택된 펩티드에 대한 설명
서열 번호 24의 인간 LAMP1 서열 상에서의 위치 면역원 서열 번호
47-61 펩티드 1-KLH 서열 번호 90
140-155 펩티드 2-KLH 서열 번호 91
307-321 펩티드 3-KLH 서열 번호 92
360-375 펩티드 4-KLH 서열 번호 82
면역화 및 다클론성 항체의 획득
총 세 개의 토끼 면역화 프로그램을 수행하였다. 제1 프로그램에서 토끼를 서열 번호 90의 펩티드 1과 서열 번호 91의 펩티드 2로, 제2 프로그램에서 서열 번호 82의 펩티드 4와 서열 번호 92의 펩티드 3으로, 제3 프로그램에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 생산된 열 변성된 인간 LAMP1::his태그 단백질로 면역화하였다. 간략히 설명하자면, 면역화 스케줄은 네 번의 주입 및 28일 후 최종 채혈을 포함하였다. 다클론성 반응은 최종 채혈로부터의 시혈에 대한 ELISA에 의해 결정하였다.
다클론성 항체의 정제
반응성 AF-아미노TOYOPEARL을 이용하여 표 55에 기술된 각 펩티드를 짝짓고, 네 개의 친화도 크로마토그래피 컬럼을 생성하였다. 각각의 펩티드로 면역화된 토끼의 최종 채혈 혈청을 펩티드 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그런 다음, 정제된 다클론성 배치를 SDS-PAGE 및 ELISA에 의해 특성 분석하였다.
LAMP1 단백질로 면역화된 토끼에 대한 최종 채혈 혈청을 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그런 다음, 정제된 다클론성 배치를 SDS-PAGE에 의해 특성 분석하였다.
실시예 17.1.2: IHC 스크리닝 및 펩티드 4 면역화에 의해 얻어진 다클론성 rAb4(토끼 항체 4)의 확인
실시예 17.1.1에 기술된 펩티드로 생성된 토끼 다클론성 항체들을 대장 선암종 환자 유래 이종이식편 CR-LRB-010P 및 인간 유방 암종의 FFPE 시료 상에서 IHC에 의해 시험하였다. 항원 회수 절차 및 엔도젠 비오틴 블로킹 단계 후, 슬라이드를 24℃에서 1시간 동안 1차 항-항체와 배양하였다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행하였다. 제조사의 설명서에 따라, 비오틴이 없는 항-토끼 울트라맵(UltraMap™) 호스래디쉬 페록시다아제(HRP) 접합체(760-4315, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)를 2차 항체로 이용하였다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행하였다. 헤마톡실린(760-2037, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)으로 대조염색 단계를 행하고, 블루잉 시약(760-2037, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)을 적용하였다. 염색된 슬라이드를 건조시키고, 사이토실(cytoseal) XYL(8312-4, 리차드-앨런 사이언티픽, 미국)으로 커버글래스를 덮었다. 도 38에 나타난 바와 같이, 서열 번호 82의 펩티드 4로부터의 항체 면역화만이 FFPE 시료에서 LAMP1 막 강화를 나타냈다.
실시예 17.1.3: 다클론성 토끼( rAb4 ) 배치의 검증
막에서 LAMP1을 발현하거나 그렇지 않은 세포를 이용한 ICC
인간- LAMP1 및 빈 벡터 HEK 형질감염된 세포를 FFPE 포맷에서 면역세포화학(ICC)에 의해 다클론성 토끼 rAb4 항체로 시험하였다. 도 39에 나타난 바와 같이, 1 μg /mL의 다클론성 토끼 rAb4 항체를 이용하여, 높은 수준의 세포 내 및 표면 세포 LAMP1 면역염색을 얻었다 .
LAMP1 단백질에 대한 친화도
실시예 6.2에 기술된 서열 번호 28의, 분비된 LAMP1::his태그(29-382)를 이용하여 실시예 6.3에 기술된 바와 같이, ELISA에 의한 다클론성 항체 폴리 rAb4의 친화도를 결정하였다. 다클론성 토끼 항체 폴리 rAb4 는 약 3 nM의 EC50으로 LAMP1과 결합하지만, MAb1은 0.16 nM의 EC50으로 결합한다.
실시예 17.2: FFPE 종양 조직에 대해 LAMP1 막 강화를 가져오는 마우스 단일 클론성 항체의 획득 및 특성 분석
실시예 17.1.1: 마우스 면역화 및 성숙한 IgG LAMP1 -분비 하이브리도마의 선택
재조합 키메라 인간/마우스 LAMP1 단백질, 재조합 변성 인간 LAMP1 단백질 또는 재조합 인간 LAMP1 단백질을 포함하는 다양한 단백질 항원으로 면역화를 수행하였지만, 이러한 접근법은 FFPE 종양 조직 상에서 LAMP1 막 강화를 검출할 수 있는 항체를 확인하는 데에 성공적이지 못했다. 이들 접근법은 실시예 6.2에 기술된 항-LAMP1 단일클론성 항체 및 LAMP1 단백질의 생성을 위해 실시예 2에 기술된 면역화 프로토콜을 이용하였다. 대조적으로, 펩티드 4를 기초로 한 면역화 전략은 FFPE 종양 조직 상에서 LAMP1 막 강화를 검출할 수 있는 항체를 확인하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 마우스를 펩티드 4로 면역화하고, 아래 기술된 바와 같이 항-LAMP1-분비 하이브리도마를 선택하였다.
항- LAMP1 단일 클론성 항체의 생성
Kilpatrick et al.; hybridoma, 1997: volume 16, number4.에 기술된 바와 같이 RIMMS 접근법을 이용하여 약 6-8주령의 다섯 마리의 BALB/cJ 마우스(찰스 리버)를 40μg의 서열 번호 82의 펩티드 4 펩티드로 면역화하였다. 융합 파트너로서 P3X63-AG8.653 (ATCC, ref CRL-1580)를 이용한 B 세포 불멸화 및 하이브리도마 선택을 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
ELISA에 의한 항- LAMP1 항체의 선택
포획 항원으로서, 실시예 6.2에 기술된 LAMP1::his태그 단백질을 이용하는, (항-LAMP1 IgG 생산을 위해 실시예 6.3에 기술된) 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)이 1차 스크린이었다.
실시예 17.2.2: IHC 스크리닝 및 MAb4의 확인
실시예 17.1.2에서와 동일한 방식으로, 대장 선암종 환자 유래 이종이식편 CR-LRB-010P의 FFPE 시료 상에서 LAMP1 막 강화를 나타내는 마우스 단일 클론성 항체를 확인하기 위하여 하이브리도마 상층액으로 IHC 스크리닝을 수행하였다. 제조사의 설명서에 따라, 비오틴이 없는 항-마우스 울트라맵(UltraMap™) 호스래디쉬 페록시다아제(HRP) 접합체(760-152, 벤타나 메디컬 시스템즈, 미국)를 2차 항체로 이용하였다.
선택된 하이브리도마 88LAMP1-2의 상층액은 대장 선암종 환자 유래 이종이식편 CR-LRB-010P의 FFPE 시료에서 막 강화 면역 염색을 나타냈다. 도 40에 나타난 바와 같이 다른 관계없는 항체들은 음성이었거나, 세포 내 면역 염색을 나타내었다.
실시예 17.2.3: 하이브리도마 88LAMP1 -2의 검증
하이브리도마 88LAMP1 -2로부터 얻어진 Mab4의 정제 및 특성 분석
하이브리도마 88LAMP1-2를 400 mL 규모의, 5% HCS(PAA; #F05-009)가 보충된 배지 A Clonacell-Hy(스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies) # 03801)에서 생산하고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체 MAb4를 SDS-PAGE 및 질량 분광분석법에 의해 특성 분석하였다. MAb4로부터의 중쇄 및 경쇄의 질량을 실시예 7에 보고된 바와 같이 확인하였고, 아래 표 55에 보고하였다. 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열들을 실시예 7에 기술된 바와 같이 RT-PCR에 의해 하이브리도마 세포로부터 회수하였다. 중쇄 및 경쇄로부터의 상응하는 아미노산들은 MAb4로부터의 각각의 질량들과 일치하는 질량들을 가져왔다.
MAb4의 질량 특성 분석
mAb4 이소형 질량 분광분석법에 의해 얻은 질량 아미노산 서열로부터 계산된 질량
중쇄 mIgG1 (G0F) 50 169 Da 50 168 Da
경쇄 mCk 23651 Da 23 650 Da
실시예 17.3: MAb4의 시험관 내 특성 분석
실시예 17.3.1 : ELISA에 의한 인간 LAMP1 및 시노몰구스 LAMP1에 대한 겉보기 친화도
실시예 4.7에 기술된 바와 같이 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)에 의해 영장류 LAMP1 단백질과 결합하는 능력에 대해 항체 MAb4를 평가하였고, 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 EC50 값을 결정하였다. 아래 표 57에 나타난 바와 같이, 항체 MAb4는 인간 LAMP1 및 시노몰구스 LAMP1에 0.2 내지 0.4 nM 범위의 비슷한 친화도로 결합한다.
재조합 인간 LAMP1 및 시노몰구스 LAMP1에 대한, ELISA에 의해 결정된 EC50
LAMP1 단백질 EC 50
인간 LAMP1 0.39 nM
시노몰구스 LAMP1 0.22 nM
실시예 17.3.2: LAMP1에 대한 특이성
LAMP2는 LAMP1에 대해 35% 서열 동일성을 나타내는 LAMP 패밀리의 가장 근접한 구성원이다. 도 41에 나타난 바와 같이, 실시예 4.6에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 MAb4의 LAMP1 또는 LAMP2 가용성 단백질에 대한 특이성을 평가하였다. MAb4와 LAMP2의 어떠한 결합도 관찰되지 않았고, LAMP1 대 LAMP2에 대한 MAb4의 EC50 사이에 100배를 초과하는 차이가 관찰된다.
실시예 17.3.3: 유동 세포계수법에 의한 여러 암세포에 대한 항체 MAb4의 결합 및 항체 결합 능력의 결정
항체 MAb4는 실시예 4.1에 기술된 조건 하에서 유동 세포계수법에 의해 여러 종양 세포들과 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 종양 세포들의 패널은 상이한 기원의 환자 유래 종양 이종이식편들과 종양 세포주를 포함한다. 유동 세포계수법 분석으로부터 얻어진 평균 형광 강도(MFI)를 표 58에 보고하였다. 표 59는 항체 결합 능력 결과를 요약한 것이다.
환자 유래 이종이식편에 대한 FACS에 의한 평균 형광 강도
평균 형광 강도( MFI )
CR-IGR-034P / 대장결장 424
LUN-NIC-006 / 폐 162
LUN-NIC-033 / 폐 154
BRE-IGR-0159 / 유방 400
Colo205 / 대장 7
환자 유래 이종이식편에 대한 FACS에 의한 항체 결합 능력
항체 결합 능력(ABC)
MAb4
PDX /기원
CR-IGR-034P / 대장결장 260 000
LUN-NIC-006 / 폐 92 000
LUN-NIC-033 / 폐 87 000
세포주/기원
Colo205 / 대장 3000
실시예 17.3.4: 유동 세포계수법에 의한 인간 원발성 대장 종양 PDX ( CR - IGR -034P) 에 대한 항체 MAb4의 겉보기 친화도
실시예 4.1에 기술된 조건을 이용하여 유동 세포계수법에 의해 인간 원발성 대장 종양 PDX CR-IGR-034P에 대한 항체 MAb4의 겉보기 친화도를 평가하였다. MAb4와 함께 CR-IGR-034P로 얻어진 EC50은 1.3 nM이었다.
실시예 17.3.5: IHC 검증
정제된 배치로 얻어진 결과는 비정제된 MAb4로 실시예 17.2.2에서 얻어진 결과와 유사하다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> ANTI-LAMP1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> BEX 13P0588 <150> EP 12306691 <151> 2012-12-27 <150> EP 12306694 <151> 2012-12-27 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Fragment <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Lys Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ala Pro Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Asn Trp Asp Val Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody fragment <400> 2 Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr Asn 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> 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<213> Mus musculus <400> 88 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Arg Ser Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 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Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Y or F. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <400> 95 Xaa Xaa Ile Phe Xaa Asn Tyr Asn 1 5 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(8) <223> Xaa is any amino acid <400> 96 Val Arg Ala Asn Trp Xaa Xaa Xaa Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 97 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala Ala Phe 1 5 10 15 Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr Phe Asp 20 25 30 Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys Gly Lys 35 40 45 Glu Asn 50 <210> 98 <211> 443 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Arg Ser Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 210 215 220 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 260 265 270 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 290 295 300 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 405 410 415 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 420 425 430 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 99 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Asn Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

Claims (68)

  1. a) 인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LAMP1 단백질과 결합하고;
    b) 적어도 하나의 성장 저해제와 연결되거나 접합된, 항체를 포함하는 면역접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는,
    (i) 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질 이외의 효소; 블레오마이신 및 미토마이신 이외의 항생제; 박테리아, 곰팡이 또는 동물 기원의 독소 또는 아브린 및 리신 이외의 식물 기원의 독소(이의 단편 및/또는 변이형 포함); 항-튜불린제, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 파클리탁셀(탁솔) 이외의 탁소이드 또는 탁산, 빈데신, 빈크리스틴 및 빈블라스틴 이외의 빈카-알칼로이드, 크립토피신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체에 있는 화합물의 약물 또는 전구약물; BCNU 및 시클로포스파미드 이외의 DNA 알킬화제, 토메이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, CC-1065 또는 CC-1065 유사체; 렙토마이신 유도체; 독소루비신(아드리아마이신) 및 에토포시드 이외의 토포이성질화효소 II 저해제, RNA 중합효소 II 저해제, 알파-아마니틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포독성제, 또는
    (ii) At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu의 방사성 동위원소들 및 Th227로 이루어지는 군으로부터 선택된 방사성 동위원소인 것인 면역접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 본 발명에 따른 항체의 적어도 2개 분자는 암 세포의 표면에서 발현되는 LAMP1 1개 분자에 의해 내재화되는 것인 면역접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어지는 도메인과 결합하되, 인간 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어지는 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 Ala29 내지 Ile309로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 내지 제3 루프로 이루어지는 도메인은 서열 번호 39의 아미노산 Ala27 내지 Thr307로 이루어지는 것인 면역접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인과 결합하되, 인간 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 24의 Ala29 내지 Arg195 위치의 아미노산으로 이루어지며, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 39의 Ala27 내지 Arg193 위치의 아미노산으로 이루어지는 것인 면역접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인에 대한 결합에 대해,
    (i) 서열 번호 1의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 5 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (ii) 서열 번호 8의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 12 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (iii) 서열 번호 15의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 16 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (i) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 46 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (iv) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 51 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (v) 서열 번호 53의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 56 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (vi) 서열 번호 54의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 57 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (vii) 서열 번호 55의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 58 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁하는 것인 면역접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    (i) 서열 번호 2의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 2와 상이한 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 3과 상이한 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 4의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 4와 상이한 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 6의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 6과 상이한 서열의 CDR1-L, 서열 DTS 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 DTS와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 번호 7의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 7과 상이한 서열의 CDR3-L; 또는
    (ii) 서열 번호 9의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 9와 상이한 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 10과 상이한 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 11의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 11과 상이한 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 13의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 13과 상이한 서열의 CDR1-L, 서열 AAS 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 AAS와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 번호 14의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 14와 상이한 서열의 CDR3-L; 또는
    (iii) 서열 번호 43의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 43과 상이한 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 44와 상이한 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 45의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 45와 상이한 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 47의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 47과 상이한 서열의 CDR1-L, 서열 YTS 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 YTS와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52의 서열 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 서열 번호 48 또는 서열 번호 52와 상이한 서열의 CDR3-L을 포함하는 것인 면역접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환인 것인 면역접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    (i) 서열 번호 2 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3 서열의 CDR2-H, 서열 번호 4 서열의 CDR3-H, 서열 번호 6 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L 및 서열 번호 7 서열의 CDR3-L; 또는
    (ii) 서열 번호 9 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10 서열의 CDR2-H, 서열 번호 11 서열의 CDR3-H, 서열 번호 13 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L 및 서열 번호 14 서열의 CDR3-L; 또는
    (iii) 서열 번호 43 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44 서열의 CDR2-H, 서열 번호 45 서열의 CDR3-H, 서열 번호 47 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52 서열의 CDR3-L; 또는
    (iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 정의된 항체의 단편을 포함하는 것인 면역접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    (i) 서열 번호 1 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 5 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
    (ii) 서열 번호 8 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 12 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
    (iii) 서열 번호 15 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 16 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
    (iv) 서열 번호 42 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 51 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인, 또는
    (v) 서열 번호 53 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 번호 56 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
    (vi) 서열 번호 54 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 57 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
    (vii) 서열 번호 55 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 58 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인 면역접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 LAMP2(서열 번호 40)와 유의미하게 교차 반응하지 않는 것인 면역접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 재조합 세포주의 세포 표면 상에 발현된 인간 LAMP 1 및 필리핀 원숭이 LAMP1에 대하여, 유동 세포계수법을 통해 측정된 ≤ 35nM인 친화도를 나타내는 것인 면역접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체인 것인 면역접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    i) 서열 번호 17의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 18의 서열의 경쇄; 또는
    ii) 서열 번호 19의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 20의 서열의 경쇄; 또는
    iii) 서열 번호 21의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 22의 서열의 경쇄; 또는
    iv) 서열 번호 49의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 50의 서열의 경쇄, 또는
    v) 서열 번호 49의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 81의 서열의 경쇄, 또는
    vi) 서열 번호 60의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 59의 서열의 경쇄; 또는
    vii) 서열 번호 62의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 61의 서열의 경쇄; 또는
    Viii) 서열 번호 64의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 63의 서열의 경쇄를 포함하는 것인 면역접합체.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제4 루프와 결합하되, 인간 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 24의 Leu310 내지 Met382 위치의 아미노산으로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 39의 Leu 308 내지 Met380 위치의 아미노산으로 이루어지는 것인 면역접합체.
  16. 제15항에 있어서, 항체는 서열 번호 82의 서열로 이루어지는 인간 LAMP1의 아미노산 360 내지 375를 포함하는 루프 4의 부위와 결합하는 것인 면역접합체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 항체는 서열 번호 83의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 84의 서열의 CDR2-H, 서열 번호 85의 서열의 CDR3-H, 서열 번호 86의 서열의 CDR1-L, 서열 NAK의 CDR2-L 및 서열 번호 87의 서열의 CDR3-L을 포함하는 것인 면역접합체.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열 번호 88 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 89 서열의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인 면역접합체.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체인 것인 면역접합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항체 단편인 것인 면역접합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디 및 VHH로 이루어지는 군으로부터 선택된 단편인 것인 면역접합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 것인 면역접합체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 세포독성제 또는 방사성 동위원소인 것인 면역접합체.
  24. 제1항 및 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 화학치료제, 효소, 항생제, 독소, 탁소이드, 일일초(vinca), 탁산, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 토메이마이신(tomaymycin) 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, 크립토피신 유도체, 렙토마이신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 전구약물, 토포이성질화효소 II 저해제, DNA 알킬화제, 항튜불린제 및 CC-1065 또는 CC-1065 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  25. 제1항 및 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는 At211, Ac225, Bi212, Er169, I131, I124, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64, Lu의 방사성 동위원소들 및 Th227로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 저해제는,
    (i) 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질로부터의 것 이외의 효소; 블레오마이신 및 미토마이신 이외의 항생제; 박테리아, 곰팡이 또는 동물 기원의 독소 또는 아브린 및 리신 이외의 식물 기원의 독소(이의 단편 및/또는 변이형 포함); 항-튜불린제, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 파클리탁셀(탁솔) 이외의 탁소이드 또는 탁산, 빈데신, 빈크리스틴 및 빈블라스틴 이외의 빈카-알칼로이드, 크립토피신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체에 있는 화합물의 약물 또는 전구약물; BCNU 및 시클로포스파미드 이외의 DNA 알킬화제, 토메이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, CC-1065 또는 CC-1065 유사체; 렙토마이신 유도체; 독소루비신(아드리아마이신) 및 에토포시드 이외의 토포이성질화효소 II 저해제, RNA 중합효소 II 저해제, 알파-아마니틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포독성제, 또는
    (ii) At211, Ac225, Bi213, Pb212, Er169, I124, I125, In111, P32, Re186, Sm153, Sr89, Zr89, Tc99m, Ga68, Cu64 및 Lu177과 같은 Lu의 방사성 동위원소들 및 Th227로 이루어지는 군으로부터 선택된 방사성 동위원소인 것인 면역접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 저해제는 (N 2 '-데아세틸-N 2' -(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신) DM1 또는 N 2 '-데아세틸-N 2 '-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)인 것인 면역접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 직접적으로 또는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커를 통해 적어도 하나의 성장 저해제에 공유적으로 부착되는 것인 면역접합체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 피리딜디티오부티레이트(SPDB), 4-(피리딘-2-일디설파닐)-2-설포-부티르산(설포-SPDB) 및 석신이미딜 (N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 피리딜디티오부티레이트(SPDB)이고, 성장 저해제는 N 2' -데아세틸-N 2 '-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)인 것인 면역접합체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 링커는 4-(피리딘-2-일디설파닐)-2-설포-부티르산(설포-SPDB)이고, 성장 저해제는 N 2 '-데아세틸-N 2' -(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)인 것인 면역접합체.
  32. 제29항에 있어서, 상기 링커는 석신이미딜 (N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)이고, 성장 저해제는 N 2 '-데아세틸-N 2' -(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1)인 것인 면역접합체.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 3 내지 4 범위의 약물 대 항체 비율(DAR)을 특징으로 하며, DAR은 항체의 농도에 대한 약물 농도의 비율로부터 계산되는 것인 면역접합체:
    DAR = cD / cA
    (이때,
    cD = [(εA280 x A252) - (εA252 x A280)] / [(εD252 x εA280) - (εA252 x εD280)]
    cA = [A280 - (cD x εD280)] / εA280
    그리고
    εD252 및 εD280은 각각 252 nm와 280 nm에서의 약물의 몰 흡광 계수이고;
    εA252 및 εA280은 각각 252 nm와 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수이고;
    (A252) 및 A280은 각각 전형적인 분광분석 기기를 이용하여 측정한, 252 nm(A252)와 280 nm(A280)에서의 접합체에 대한 흡광도임).
  34. 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인과 결합하는 분리된 항체로서, 인간 LAMP1의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 24의 Ala29 내지 Arg195 위치의 아미노산에 의해 정의되고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인은 서열 번호 39의 Ala27 내지 Arg193 위치의 아미노산에 의해 정의되는 것인 분리된 항체.
  35. 제34항에 있어서, 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제1 루멘 도메인에 대한 결합에 대해,
    (i) 서열 번호 1의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 5 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (ii) 서열 번호 8의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 12 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (iii) 서열 번호 15의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 16 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (ii) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 46 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (iv) 서열 번호 42의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 51 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (v) 서열 번호 53의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 56 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (vi) 서열 번호 54의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 57 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
    (vii) 서열 번호 55의 서열의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 번호 58 서열의 서열인 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁하는 분리된 항체.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    (i) 서열 번호 2의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 4의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 6의 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L 및 서열 번호 7의 서열의 CDR3-L; 또는
    (ii) 서열 번호 9의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 11의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 13의 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L 및 서열 번호 14의 서열의 CDR3-L; 또는
    (iii) 서열 번호 43의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 45의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 47의 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52의 서열의 CDR3-L을 포함하는 분리된 항체.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제5항 내지 제15항에 정의된 바와 같은 분리된 항체.
  38. 인간 및 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제4 루프와 결합하는 분리된 항체로서, 인간 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 24의 Leu310 내지 Met382 위치의 아미노산으로 이루어지고, 필리핀 원숭이 LAMP1 단백질의 제4 루프는 서열 번호 39의 Leu 308 내지 Met380 위치의 아미노산으로 이루어지는 것인 분리된 항체.
  39. 제38항에 있어서, 항체는 서열 번호 82의 서열로 이루어지는 인간 LAMP1의 아미노산 360 내지 375를 포함하는 루프 4의 부위와 결합하는 분리된 항체.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 항체는 서열 번호 83의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 84의 서열의 CDR2-H, 서열 번호 85의 서열의 CDR3-H, 또는 서열 번호 86의 서열의 CDR1-L, 서열 NAK의 CDR2-L 및 서열 번호 87의 서열의 CDR3-L을 포함하는 분리된 항체.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열 번호 88의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 또는 서열 번호 89의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 분리된 항체.
  42. 분리된 항-LAMP-1 항체로서,
    (vii) 서열 번호 2의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 3의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 4의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 6의 서열의 CDR1-L, 서열 DTS의 CDR2-L 및 서열 번호 7의 서열의 CDR3-L; 또는
    (viii) 서열 번호 9의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 10의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 11의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 13의 서열의 CDR1-L, 서열 AAS의 CDR2-L 및 서열 번호 14의 서열의 CDR3-L; 또는
    (ix) 서열 번호 43의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 44의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 45의 서열의 CDR3-H; 또는
    서열 번호 47의 서열의 CDR1-L, 서열 YTS의 CDR2-L 및 서열 번호 48 또는 서열 번호 52의 서열의 CDR3-L; 또는
    (x) 서열 번호 83 서열의 CDR1-H, 서열 번호 84의 서열의 CDR2-H 및 서열 번호 85의 서열의 CDR3-H; 또는 서열 번호 86의 서열의 CDR1-L, 서열 NAK의 CDR2-L 및 서열 번호 87의 서열의 CDR3-L; 또는 서열 번호 60의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 59의 서열의 경쇄; 또는
    (xi) 서열 번호 62의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 61의 서열의 경쇄; 또는
    (xii) 서열 번호 64의 서열의 중쇄 또는 서열 번호 63의 서열의 경쇄를 포함하는 항체.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 검출 가능한 분자 또는 물질로 라벨링되는 분리된 항체.
  44. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체, 또는 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  45. 암 치료용의, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체, 또는 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제44항에 따른 약학적 조성물.
  46. 제45항에 따른 용도에 있어서, 암은 대장암 선암종, 위장관 종양, 생명 유지 기관 종양, 생식 기관 종양, 또는 피부, 후두 또는 연조직 종양인, 면역접합체, 항체 또는 약학적 조성물.
  47. 대상자의 생물학적 시료 내 LAMP1 발현을 생체 외에서 검출하기 위해 사용하기 위한 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  48. 대상자에서 LAMP1 발현을 생체 내에서 검출하기 위해 사용하기 위한 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  49. 제47항 또는 제48항에 따른 용도에 있어서, 상기 항체는 검출 가능한 분자 또는 물질로 라벨링되는 것인 항체.
  50. 제46항 또는 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도는 대상자에서 암의 존재 진단용, LAMP1를 표적으로 하는 치료제에 대한 암 환자의 감수성 결정용, 또는 항-LAMP1 암치료법의 효능 모니터링 또는 항-LAMP1 암치료법 후의 암 재발 검출용인 것인 항체.
  51. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  52. 제51항에 따른 핵산에 의해 형질전환된 숙주 세포.
  53. 항-LAMP1 치료법에 반응할 가능성이 있는 암 환자를 선택하는 시험관 내 방법으로, 상기 방법은,
    a. 암세포를 포함하는 암 환자의 생물학적 시료에서 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는지를 결정하고;
    b. LAMP1 유전자 카피 수 획득의 존재를 기초로 하여 환자를 선택하는 것을 포함하되,
    상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 경우, 상기 환자가 항-LAMP1 치료법에 대해 반응할 가능성이 있는 것으로 선택되는 방법.
  54. 제53항에 있어서, LAMP1이 환자의 암세포의 표면에서 발현되는지를 결정하는 것을 더 포함하되, i) 상기 환자가 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 경우, 및 환자의 상기 암세포가 표면에 LAMP1을 발현하는 경우, 상기 환자가 항-LAMP1 치료법에 대해 반응할 가능성이 있는 것으로 선택되는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장결장암, 아교모세포종, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 신경아교종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 갑상선암 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 자궁경부암, 대장결장암, 아교모세포종, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 신경아교종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 갑상선암 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장결장암 또는 폐암인 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포에서 평균 LAMP1 유전자 카피 수는 ≥ 2.5인 것인 방법.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포에서 평균 LAMP1 유전자 카피 수는 > 5인 것인 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 형광 제자리 혼성화(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH), 비교 유전체 혼성화(Comparative Genomic Hybridization, CGH), 신세대 시퀀싱(New Generation Sequencing, NGS) 또는 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법으로 결정되는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 비교 유전체 혼성화(CGH)에 의해 결정되는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정되는 것인 방법.
  63. 제60항에 있어서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 형광 제자리 혼성화(FISH)에 의해 결정되는 것인 방법.
  64. 제60항에 있어서, LAMP1 유전자 카피 수 획득은 신세대 시퀀싱(NGS)에 의해 결정되는 것인 방법.
  65. 암세포에서 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 환자에서 암을 치료하기 위한 용도의 항-LAMP1 치료제.
  66. 제65항에 따른 용도의 항-LAMP1 치료제로서, 암세포에서 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 상기 환자는 제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선택되는 항-LAMP1 치료제.
  67. 제65항에 따른 용도의 항-LAMP1 치료제로서, 이러한 용도는 제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 암세포에서 LAMP1 유전자 카피 수 획득을 보유하는 상기 환자를 선택하는 단계를 포함하는 것인 항-LAMP1 치료제.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 용도의 항-LAMP1 치료제로서, 상기 항-LAMP1 치료제는 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항-LAMP1 항체 또는 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른, 항-LAMP1 항체 및 적어도 하나의 성장 저해제를 포함하는 면역접합체인 항-LAMP1 치료제.
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