JP6441232B2 - 抗ｌａｍｐ１抗体および抗体薬物コンジュゲート、ならびにその使用 - Google Patents

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Description

ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）タンパク質に特異的に結合する抗体および増殖阻害剤にコンジュゲートまたは連結された前記抗体を含むイムノコンジュゲートが提供される。本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを含む医薬組成物およびがんの処置のための該抗体またはイムノコンジュゲートの使用、ならびにＬＡＭＰ１抗体、前記抗体をコードする配列を含む単離された核酸、ベクターおよび宿主細胞ならびに診断ツールとしての前記抗体の使用も提供される。本出願はさらに、がんを有する患者が抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いかどうかの決定をもたらす、がん細胞中でのＬＡＭＰ１遺伝子増幅または増加の検出を提供する。従って、がん細胞を含むがんを有する患者の生物試料中で、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加があるかどうかを決定すること；およびＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加の存在に基づいて患者を選択することを含む、がんを有する患者を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法が提唱される。がん細胞中にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある患者におけるがんを処置するのに使用するための抗ＬＡＭＰ１治療剤がさらに提供される。
ＣＤ１０７抗原様ファミリーメンバーＡ（ＣＤ１０７ａ）としても知られる、リソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）は、ＬＡＭＰファミリーに属する１回貫通Ｉ型膜タンパク質である。ＬＡＭＰ２はそのファミリーの最も近いメンバーであり、両タンパク質ともリソソーム膜内の最も豊富な糖タンパク質である（非特許文献１）。
ＬＡＭＰ１は染色体１３ｑ３４上に位置し、ＬＡＭＰ２はＸｑ２４−２５上に位置し、別々の遺伝子によりコードされるが、それらのタンパク質はその一次構造において類似し、約３６％の配列相同性を有する（非特許文献２）。ＬＡＭＰ１およびＬＡＭＰ２は、およそ４０ｋＤａのポリペプチドコアからなる；それらは両方ともそのＣ末端を介してリソソーム膜に固定され、広くグリコシル化された最も大きいパートを、リソソームの内腔側に露出する。両タンパク質は最も重度にグリコシル化された細胞タンパク質であり、その質量の約５０％が炭水化物であり、これらのグリコシル化はリソソームの酸性度を維持し、自己分解からリソソーム膜を保護するための鍵であると考えられる。しかしながら、これらの２つの高度にグリコシル化されたタンパク質、特に、ＬＡＭＰ１の完全な生物機能は依然として解明される必要がある（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
ＬＡＭＰ１は、後期エンドソームおよびリソソーム中で高度に発現され、ＬＡＭＰ１はこれらの２つのオルガネラのためのマーカーとして指定されている（非特許文献６）。かくして、ＬＡＭＰ１に関する文献の多くは、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、または食作用に関するものである（非特許文献６）。
ＬＡＭＰ１およびＬＡＭＰ２の大部分はリソソーム中に存在するが、細胞質膜ではいくらかのＬＡＭＰ１およびＬＡＭＰ２免疫反応性も低レベルで観察される。細胞質膜中に認められるＬＡＭＰ１は、総ＬＡＭＰ１の１〜２％に過ぎない。これは、例えば、末梢血リンパ球（非特許文献７）および血小板（非特許文献８）に当てはまる。
ＬＡＭＰ１およびＬＡＭＰ２の細胞表面発現の増加は、腫瘍細胞系、例えば、高転移性結腸癌Ｌ４細胞（非特許文献９）中、ヒト転移性黒色腫Ａ２０５８、ＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫）、ＣａＣｏ−２（ヒト結腸腺癌）細胞上および結腸直腸新生物（非特許文献１０）中で観察されている。
ＬＡＭＰ１が位置する染色体領域１３ｑ３４は、ヒト乳がんにおけるＣＵＬ４Ａ、ＬＡＭＰ１、ＴＦＤＰ１、およびＧＡＳ６を含むより大きいアンプリコンを含む増幅事象と近年関連付けられてきた（非特許文献１１）。ＴＦＤＰ１およびおそらくＣＵＬ４Ａは、増幅現象を駆動する主要遺伝子として上記刊行物で同定されたものであった。特に、公共的に利用可能な乳がん遺伝子発現の分析（マイクロアレイ）のデータセットにより、ＴＦＤＰ１過剰発現がエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性および高悪性度乳癌、ならびにより短い全生存、無再発生存、および無転移間隔と関連することが示された。逆に、ＬＡＭＰ１発現は腫瘍悪性度と有意に相関しなかった。結局、Ａｂｂａらは、ＬＡＭＰ１増幅はヒト乳がん細胞におけるＬＡＭＰ１過剰発現になると報告しなかった。
ＬＡＭＰ１の１１アミノ酸の細胞質尾部は、７アミノ酸のリンカー配列および４アミノ酸長のチロシンモチーフ（ＹＱＴＩ）を含有する。膜と比較したこのモチーフの間隔の小さい変化は、初期／選別エンドソームにおける選別を劇的に悪化させることが示された。前記チロシンモチーフ内の変異は、アダプタータンパク質へのＬＡＭＰ１の結合に対する影響を有し、同様に選別の悪化をもたらすことが示された（非特許文献１２；非特許文献１３）。従って、様々ながん細胞系におけるＬＡＭＰ１の異常な細胞表面発現は、機構が依然として不明確であるとしても、細胞質尾部における変異と関連し得る。さらに、細胞質尾部におけるある特定の点変異が細胞質膜蓄積をもたらすことが示されている（非特許文献１４）。
ＬＡＭＰ１はエンドソームおよびリソソームのためのマーカーであるという事実のため、いくつかの商業的に入手可能な抗ＬＡＭＰ１抗体が研究目的で開発された。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット（ＷＢ）、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）分析、免疫沈降（ＩＰ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようないくつかの生化学的適用に限られる。
ＬＡＭＰ１タンパク質はまた、腫瘍細胞の細胞膜でも検出されている。Ｅ．Ｖｅｎｅｔｓａｎａｋｏｓ（特許文献１）により、ＬＡＭＰ１は正常な結腸細胞の表面上ではなく、結腸がん細胞の表面上で発現されることが示唆され、抗ＬＡＭＰ１抗体を介して細胞傷害剤をＬＡＭＰ１に標的化することによって、腫瘍増殖を減少させることができると提唱された。しかしながら、Ｖｅｎｅｔｓａｎａｋｏｓは、細胞傷害剤もしくは細胞増殖抑制剤を含む抗ＬＡＭＰ１抗体もしくはそのコンジュゲートの製造または彼の仮説を支持するいかなるデータも記載しなかった。実際、Ｖｅｎｅｔｓａｎａｋｏｓの初期の出願以来、１０年が経過したが、抗ＬＡＭＰ１抗体または抗ＬＡＭＰ１療法におけるイムノコンジュゲートとしてのその使用は今までのところ臨床開発に入っていない。従って、がんの処置のための抗ＬＡＭＰ１抗体またはイムノコンジュゲートの必要性が高い。
ＷＯ２００５／０１２９１２
Ｓａｗａｄａ，Ｒ．ら、１９９３、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６８：１２６７５〜１２６８１頁 Ｍａｔｔｅｉ，Ｍ．Ｇ．ら、１９９０、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６５：７５４８〜７５５１頁 Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．、１９９１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６６：２１３２７〜２１３３０頁 Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｂ．、２００１、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５：１１〜１９頁 Ｇａｓｎｉｅｒ，Ｂ．、２００９、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７９３：６３６〜６４９頁 Ｃｏｏｋ，Ｎ．Ｒ．ら、２００４、Ｔｒａｆｆｉｃ、５（９）：６８５〜６９９頁 Ｈｏｌｃｏｍｂｅ，Ｒ．Ｆ．ら、１９９３、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６７（１）：３１〜３９頁 Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｌ．およびＦｅｂｂｒａｉｏ、Ｍ．、１９９２、Ｂｌｏｏｄ ８０：１４７０〜１４７５頁 Ｓａｉｔｏｈ，Ｏ．ら、１９９２、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：５７００〜５７１１頁 Ｆｕｒｕｔａ，Ｋ．ら、２００１、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５９（２）：４４９〜４５５頁 Ａｂｂａ，Ｍａｒｔｉｎ Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；４１０４頁 Ｏｂｅｒｍｕｌｌｅｒ，Ｓ．ら、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１５：１８５〜１９４頁 Ｒｏｈｒｅｒ，Ｊ．ら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３２（４）：５６５〜５７６頁 Ｇｏｕｇｈ，Ｎ．Ｒ．ら、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１２（２３）：４２５７〜４２６９頁
定義
本明細書で用いられる場合、「ＬＡＭＰ１」は、「リソソーム結合膜タンパク質１」を指し、ＬＡＭＰＡ、ＣＤ１０７ａまたはＬＧＰ１２０としても知られる糖タンパク質ファミリーのメンバーである。ＬＡＭＰ１は、以下の実施例５に提示される非腫瘍試料と比較したヒト腫瘍試料に関するタンパク質発現データによれば、結腸腺癌、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、胃、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍の細胞表面で発現される。
ヒト遺伝子ＬＡＭＰ１は、染色体１３ｑ３４（１１３，９５１，４６９〜１１３，９７７，４４１）に見出され、全長２６，２７３ｋｂである。
シグナルペプチドをコードする配列を含む完全長ヒトＬＡＭＰ１をコードするｃＤＮＡの参照配列は、受託番号ＮＭ＿００５５６１．３（配列番号２３）の下でＧｅｎｅＢａｎｋデータベースから入手可能であり、シグナルペプチド（位置１〜２８）を含む代表的なタンパク質配列はＮＰ＿００５５５２．３（配列番号２４）の下で入手可能である。ヒトＬＡＭＰ１をコードする遺伝子のエクソン４に対応する、配列番号２４の位置１３６〜１８８のアミノ酸を失うＬＡＭＰ１の１つの潜在的なアイソフォームが報告されている。少なくとも６０人の個体の白人集団において、同義のＳＮＰは同定されていない。
そのオルソログについて、ヒトＬＡＭＰ１は、マウスＬＡＭＰ１（ＮＰ＿０３４８１４、配列番号２５）およびラットＬＡＭＰ１（ＮＰ＿０３６９８９、配列番号２６）それぞれと６６％の配列同一性を有し、ヒトおよびアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＬＡＭＰ１（ＸＰ＿００１０８７８０１、配列番号２７）は９６％の配列同一性を有する。
アカゲザルに由来するＬＡＭＰ１の配列（配列番号２７）およびカニクイザルの予測される配列（配列番号３９）は９９％同一であり、前記配列はアカゲザルＬＡＭＰ１（配列番号２７）の位置１１の１つのさらなるロイシンで、すなわち、シグナルペプチドが異なる。従って、アカゲザルおよびカニクイザルに由来する成熟ＬＡＭＰ１の配列は同一である。
ＬＡＭＰ１ファミリーの最も近いメンバーは、ＬＡＭＰ２（Ｐ１３４７３、ヒトＬＡＭＰ２、可溶性ＬＡＭＰ２タンパク質、配列番号４０）である。ヒトＬＡＭＰ１とＬＡＭＰ２タンパク質は、約３６％の配列同一性を有し、いくつかの保存されたグリコシル化部位を含む。
「ドメイン」は、一般的に配列相同性に基づいて定義されるタンパク質の任意の領域であってもよく、特異的構造的または機能的実体と関連することが多い。ＬＡＭＰ１のドメイン構造は、今までのところ完全には刊行されていない。
ヒトＬＡＭＰ１は、４１７のアミノ酸残基と切断性シグナルペプチドに対応する２８のアミノ末端残基からなる。ＬＡＭＰ１の主要ポーションはリソソームの内腔側に存在し、Ｎ−グリカンによって重度にグリコシル化されている。ＬＡＭＰ１は、１８の潜在的なＮ−グリコシル化部位を含有し、そのうちの５つはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミングリカンで占められる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｍ．、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３３）：２０４８８〜２０４９５頁）。それらは、多くがＯ−グリカンに連結されるプロリンおよびセリンに富むヒンジ様構造により隔てられる２つのドメインにクラスター化される。ＬＡＭＰ１は、ＣＯＯＨ末端近くの２４の疎水性アミノ酸からなる１つの膜貫通ドメインを有し、ＣＯＯＨ末端に１１のアミノ酸残基から構成される短い細胞質セグメントを含有する。
ＬＡＭＰ１の２つのドメイン、「第１の内腔ドメイン」および「第２の内腔ドメイン」の命名法は、その元々の局在、リソソーム内でのＬＡＭＰ１の向きに基づく。それにも拘わらず、ＬＡＭＰ１が細胞表面で発現される場合、２つの内腔ドメインは細胞外ドメインになり、従って、細胞表面に露出される。従って、一実施形態において、本発明の文脈における「細胞外」とは、以下に定義されるＬＡＭＰ１の第１および／もしくは第２の内腔ドメインを含むＬＡＭＰ１タンパク質構築物ならびに／またはそのバリアントを指す。ＮＰ＿００５５５２．３（配列番号２４）によるヒトＬＡＭＰ１のドメイン構造は、実施例６．１にマッピングされており、以下のように本文献で用いられる。
従って、ヒトＬＡＭＰ１の第１から第３のループからなるドメインは、配列番号２４の位置２９〜３０９のアミノ酸からなる。
予測される配列（配列番号３９）によるカニクイザルＬＡＭＰ１のドメイン構成は、以下の通りである。
従って、カニクイザルＬＡＭＰ１の第１から第３のループからなるドメインは、配列番号３９の位置２７〜３０７のアミノ酸からなる。
ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１完全長タンパク質の配列アラインメントを、図１に示す。
ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１のループ領域４はグリコシル化部位を含有せず、ＬＡＭＰ１のループ１〜３からループ４を区別する。
ループ１〜４は、一次アミノ酸配列から定義されており、その構造は本研究以前には解明されていなかったため、ＬＡＭＰ１の３Ｄ構造からではなく、実施例６．１にマッピングされている。
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素のような、「コード配列」または発現生成物を「コードする」配列は、発現された場合、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の生成をもたらすヌクレオチド配列である、すなわち、そのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のためのアミノ酸配列をコードする。タンパク質のためのコード配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）と停止コドンとを含んでもよい。ＤＮＡ中に存在する発現生成物をコードする領域は、「コードＤＮＡ配列」または「ＣＤＳ」と呼ばれる。
本明細書で用いられる場合、特定のタンパク質（例えば、抗体）に対する参照は、天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその起源または製造様式と無関係なバリアントおよび改変形態を含んでもよい。天然のアミノ酸配列を有するタンパク質は、自然から得られたのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質である。そのような天然配列タンパク質を、自然から単離するか、または標準的な組換えおよび／もしくは合成方法を用いて製造することができる。天然配列タンパク質は、天然に存在するトランケート形態または可溶性形態、天然に存在するバリアント形態（例えば、選択的にスプライスされた形態）、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび翻訳後改変を含む形態を特に包含する。天然配列タンパク質には、いくつかのアミノ酸残基のグリコシル化、またはリン酸化、または他の改変のような翻訳後改変を伴ったタンパク質を含む。
本明細書で用いられる用語「マーカー」とは、生物試料中の標的遺伝子および／またはタンパク質の存在を同定する、およびおそらくその発現を定量することを可能にする任意の生物学的、化学的または物理学的手段を指す。そのようなマーカーは、当業者には周知である。有利には、本発明によるマーカーは、遺伝子マーカーおよび／またはタンパク質マーカーである。
用語「遺伝子」は、１つまたはそれ以上のタンパク質の全部または一部を含み、例えば、その遺伝子が発現される条件を決定付けるプロモーター配列のような調節ＤＮＡ配列を含んでも、または含まなくてもよい、アミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれと一致するＤＮＡ配列を意味する。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、アミノ酸配列には翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む配列を意図してもよい。
本明細書で用いられる用語「コピー数変化」、「コピー数バリアント」および「ＣＮＶ」は、区別無く用いられ、参照ゲノムと比較して可変的なコピー数で存在する１ｋｂまたはそれより長いＤＮＡセグメントを指す。文献中に見出される用語「構造バリアント」、「デュプリコン」、「インデル」、「中間サイズの構造バリアント（ＩＳＶ）」、「低コピーリピート（ＬＣＲ）」、「多部位バリアント（ＭＳＶ）」、「パラログ配列バリアント（ＰＳＶ）」、「セグメント複製」、「染色体間複製」および「染色体内複製」は、本明細書では用語「ＣＮＶ」中に含まれる。
さらに、コピー数変化は単一の遺伝子を指すか、または遺伝子の連続するセットを含んでもよい。
本明細書で用いられる「遺伝子数」は、細胞中に存在する遺伝子の数を記載する。２倍体生物においては、正常状態で、２コピーの各核酸配列がゲノム中に自然に存在し、従って、コピー数（ＣＮ）は２である。特に、ゲノムは、各遺伝子の２つの対立遺伝子を示し、１つは一対の相同染色体のそれぞれの染色体上にある（性染色体上に局在する遺伝子を除く）。
ここで、用語「遺伝子数」および「遺伝子コピー数」は互換的に用いることができる。
本発明の文脈において、配列の「コピー」は、前記配列と同一である配列を包含するが、前記配列の対立遺伝子変異も包含する。
ＤＮＡコピー数および従って、ＤＮＡコピー数変化を測定するための１つの例は、ゲノムにわたるＤＮＡコピー数変化を測定するためのハイスループット技術であるアレイに基づくＣＧＨである。試験および参照試料のＤＮＡ断片または「クローン」を、マッピングされたアレイ断片にハイブリダイズさせる。試験と参照とのＬｏｇ２強度比は、コピー数におけるゲノムワイドのプロファイルに関する有用な情報を提供する。
「Ｌｏｇ２」または「Ｌｏｇ２比」値は、細胞ゲノム中の遺伝子またはＤＮＡ断片のコピー数を記述するために用いられる。理想的な状況では、正常（コピー変化中性）クローンのｌｏｇ２比は、ｌｏｇ２（２／２）＝０であり、単一コピー喪失はｌｏｇ２（１／２）＝−１であり、単一コピー増加はｌｏｇ２（３／２）＝０．５８である。多コピー増加または増幅はｌｏ２（４／２）、ｌｏｇ（５／２）などの値を有する。
本明細書で用いられる場合、配列の「増加」は、一般に、対象の２倍体ゲノム中の前記配列の２．５以上のコピー数（あるいは、Ｌｏｇ２比≧０．３２）の存在を指す。これらの２．５以上のコピーは、ゲノム上で隣接するか、またはしなくてもよい；特に、それらは、一対の染色体の異なる領域中、またはゲノムの染色体の異なる対に属する染色体上に存在してもよい。
従って、用語「遺伝子コピー数増加」とは、対象の２倍体ゲノム中の特定の遺伝子の２．５以上のコピー数（あるいは、Ｌｏｇ２比≧０．３２）の存在を指す。コピー数が２．５である場合、コピー数を定義するために用いられる細胞の５０％が２倍体生物中に通常の２コピーの遺伝子を含有し、コピー数を定義するために用いられる細胞の５０％が通常の２コピーおよびさらに１コピー多い前記遺伝子（合計３コピーの前記遺伝子）を含有する。
配列の用語「低い増加」とは、一般に、対象の２倍体ゲノム中の前記配列の２．５以上であるが、５未満のコピー数（あるいは、０．３２≦ｌｏｇ２比＜１．３２）の存在を指す。用語「増幅」、「Ａｍｐ」、または「高い増加」とは、本明細書では、対象の２倍体ゲノム中の特定の配列の５以上のコピー数、あるいは、Ｌｏｇ２≧１．３２の存在を指す。従って、用語「遺伝子数増幅」とは、対象の２倍体ゲノム中の特定の遺伝子の５以上のコピー数の存在を指す。
本明細書で用いられる場合、「配列の断片」は、前記配列、例えば、ヌクレオチド配列の一部に対応する。前記断片は、好ましくは少なくとも１０ｂｐ長である。より好ましくは、前記断片は、少なくとも１５ｂｐ長、特に、少なくとも２０ｂｐ長である。最も好ましくは、前記断片は、少なくとも２５ｂｐ長、少なくとも３０ｂｐ長、特に、少なくとも３３ｂｐ長である。上記配列の断片は、特に、プライマーまたはプローブであってもよい。
本発明の文脈において、参照配列の「変異配列」とは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む配列を指し、ここで前記変異配列は参照配列と少なくとも７５％同一である。配列同一性のパーセンテージは、最適に整列された変異配列を参照配列と比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。好ましくは、変異配列は、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％同一である。
好ましくは、参照配列の前記変異配列は、前記参照配列の対立遺伝子バリアントである。本明細書で用いられる場合、「対立遺伝子バリアント」は、同じ染色体座を占有する遺伝子の任意の２つまたはそれ以上の代替形態を指す。
「参照配列と少なくとも８５％同一である」配列は、その全長にわたって、参照配列の全長との、８５％、またはそれ以上、特に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。
「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定することができ、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両方の配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。比較のための配列の最適なアラインメントは、全体的ペアワイズアラインメントにより、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）のアルゴリズムを用いて行われる。配列同一性のパーセンテージを、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、および以下のパラメーターギャップ−オープン＝１０、ギャップ−伸長＝０．５を含むプログラムＮｅｅｄｌｅを用いて容易に決定することができる。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基により置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン−トリプトファン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
「抗体」は、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、それぞれの重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に連結される天然の、または従来の抗体であってもよい。２つの型の軽鎖、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。それぞれの鎖は異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合のような、重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端パートであり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変ポーションからなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主として超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から作られる。場合により、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基は、全体的なドメイン構造、従って、結合部位に影響する。相補性決定領域またはＣＤＲとは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと命名される３つのＣＤＲをそれぞれ有する。従って、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に置かれたアミノ酸配列、すなわち、単一の種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存された免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域のポーションを指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと命名される４つのＦＲをそれぞれ有する。
本明細書で用いられる場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一である（約８５％、またはそれ以上、特に、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）フレームワーク領域である。
本発明の文脈において、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ．ら、２００３、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５〜７７頁；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定されるべきである。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、従来の抗体およびその断片、ならびに単一ドメイン抗体およびその断片、特に、単一ドメイン抗体の可変重鎖、ならびにキメラ、ヒト化、二重特異的または多重特異的抗体を指す。
本明細書で用いられる場合、抗体または免疫グロブリンはまた、より最近記載され、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である「単一ドメイン抗体」も含む。単一ドメイン抗体の例としては、重鎖抗体、天然では軽鎖を含まない抗体、従来の４鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗体、操作された単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギおよびウシなどの任意の種から誘導することができる。単一ドメイン抗体は、軽鎖を含まない重鎖抗体として知られる天然に存在する単一ドメイン抗体であってもよい。特に、ラクダ科動物の種、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコは、天然では軽鎖を含まない重鎖抗体を生成する。ラクダ科動物の重鎖抗体は、ＣＨ１ドメインも欠く。
軽鎖を含まないこれらの単一ドメイン抗体の可変重鎖は、「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として当業界で公知である。従来のＶＨドメインと同様、ＶＨＨは４つのＦＲと３つのＣＤＲとを含有する。ナノボディは従来の抗体を超える利点を有する：それらはＩｇＧ分子よりも約１０倍小さく、結果として、高い収率を達成しながら、適切に折畳まれた機能的ナノボディをｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現により生成することができる。さらに、ナノボディは非常に安定的であり、プロテアーゼの作用に対して耐性である。ナノボディの特性および生成は、ＨａｒｍｓｅｎおよびＤｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；７７（１）：１３〜２２頁）により概説されている。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、特定の抗原を指向し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されない、単一アミノ酸組成の抗体分子を指す。モノクローナル抗体を、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一のクローンにより生成することができるが、組換えであってもよい、すなわち、タンパク質工学によって生成することもできる。
用語「キメラ抗体」とは、その最も広い意味において、１つの抗体に由来する１つまたはそれ以上の領域および１つまたはそれ以上の他の抗体に由来する１つまたはそれ以上の領域を含有する操作された抗体を指す。特に、キメラ抗体は、非ヒト動物から誘導される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと共に、別の抗体を、特に、ヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどのような任意の動物を用いることができる。キメラ抗体はまた、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する多重特異的抗体を示してもよい。ある実施形態において、キメラ抗体は、マウス起源の可変ドメインと、ヒト起源の定常ドメインとを有する。
用語「ヒト化抗体」とは、はじめは全体的または部分的に非ヒト起源のものであり、ヒトにおける免疫応答を回避するか、または最小化するために、特に、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中のある特定のアミノ酸を置き換えるように改変された抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、大体の場合、ヒトＣＨおよびＣＬドメインのものである。ある実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト起源の定常ドメインを有する。
（従来の）抗体の「断片」は、無傷抗体の一部、特に、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、抗体断片から形成される二重特異的および多重特異的抗体が挙げられる。従来の抗体の断片は、重鎖抗体またはＶＨＨのような、単一ドメイン抗体であってもよい。
用語「Ｆａｂ」は、ＩｇＧをプロテアーゼ、パパインで処理することにより得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分と全Ｌ鎖が、ジスルフィド結合により一緒に結合した、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を示す。
用語「Ｆ（ａｂ’）２」とは、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂ断片よりもわずかに大きい、ＩｇＧをプロテアーゼ、ペプシンで処理することによって断片間で得られる、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指す。
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から通常発現される共有的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖ断片は、特に、遺伝子組換え技術を用いることにより、適切なコンフォメーション中に保持されるＣＤＲを含む。二価および多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成し得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２のような、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖをカップリングさせることにより生成することができる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されるＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーによりカップリングされた２つのｄｓＦｖを示す。
用語「二重特異的抗体」または「ＢｓＡｂ」は、単一の分子内で２つの抗体の抗原結合部位を結合させる抗体を示す。かくして、ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原に同時に結合することができる。例えば、ＥＰ２０５０７６４Ａ１に記載のように、所望のセットの結合特性およびエフェクター機能を有する抗体または抗体誘導体を設計、改変および生成するために、高い頻度で遺伝子操作が用いられてきた。
用語「多重特異的抗体」は、単一の分子内で２つまたはそれ以上の抗体の抗原結合部位を結合させる抗体を示す。
用語「ダイアボディ」とは、断片が同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作出する。
用語「ハイブリドーマ」は、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫することによって調製されたＢ細胞を、抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を生成するマウスなどから誘導されるミエローマ細胞との細胞融合にかけることにより得られる細胞を示す。
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチド（すなわち、本発明の抗体）またはヌクレオチド配列を言う場合、示された分子が同じ型の他の生体高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。本明細書で用いられる用語「精製された」とは、少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、または９８重量％の同じ型の生体高分子が存在することを特に意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子とは、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかしながら、この分子は、組成物の基本的特徴に有害に影響しないいくつかのさらなる塩基または部分を含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「対象」は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、および霊長類のような哺乳動物を示す。特に、本発明による対象は、ヒトである。
本出願を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、全ての具体的に記載された特徴ならびに任意選択の、追加の、特定されない特徴を包含するものと解釈されるべきである。本明細書で用いられる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用はまた、具体的に記載された特徴以外の特徴が存在しない（すなわち、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」）実施形態も開示する。
本出願を通して、用語「および／または」は、それが接続する１つまたはそれ以上の事例が生じてもよいことを包含すると解釈されるべきである文法的接続詞である。例えば、「生物試料中の標的遺伝子および／またはタンパク質の発現を定量すること」という文は、標的遺伝子の発現を定量することができるか（ｍＲＮＡ）、またはタンパク質の発現もしくは標的遺伝子の発現（ｍＲＮＡ）と、タンパク質とを一緒に定量することができることを示す。
従って、「配列番号１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／または配列番号５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン」という表現は、「配列番号１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメイン」または「配列番号５の配列、もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン」または「配列番号１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５の配列、もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン」と解釈されるべきである。
用語「がん」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」は、相対的に自律的な増殖を示す細胞を指すように本明細書では互換的に用いられ、それらは細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示し得る。一般に、本出願における検出または処置のための対象となる細胞としては、前がん性（例えば、良性）、悪性、転移性、および非転移性細胞が挙げられる。
イムノコンジュゲート
治療目的で、抗体薬物コンジュゲートとしての使用のための最適な特徴を有する抗体、すなわち、がん細胞の表面上に存在する標的を特異的に認識し、一度、前記標的に結合したら、内在化を効率的に誘発することができる抗体を作出することが有利である。
本発明者らは、結腸腫瘍細胞または肺腫瘍細胞に対する抗体を生じさせ、腫瘍細胞および非腫瘍組織への示差的結合について、得られたクローンをスクリーニングした。
本発明者らは、このように、非腫瘍組織から腫瘍組織を区別する抗体を同定した。特に、ＡＤＣの形態での、治療的適用にとって必要な予想される特徴を満たす、３つのこれらの抗体が選択された（いわゆる抗体「ＭＡｂ１」、「ＭＡｂ２」および「ＭＡｂ３」）。これらの３つの抗体は、がん細胞中で細胞表面に発現されるＬＡＭＰ１への高い結合親和性（ナノモル濃度範囲内）を示した。さらに、これらの３つの抗ＬＡＭＰ１抗体は、実施例４．４および４．３に示されるような、ＬＡＭＰ１／抗ＬＡＭＰ１抗体複合体の内在化を誘発する高い能力を示した。
本発明者らは、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３から誘導されるキメラ抗体（ｃｈＭＡｂ１、ｃｈＭＡｂ２、ｃｈＭＡｂ３）が、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と共に、ヒトＬＡＭＰ１またはカニクイザルＬＡＭＰ１、次いで実施例８．１．７および８．１．８に示されるような裸の抗体に対する、同様に高いが、わずかに異なる結合親和性を示すことを証明した。
従って、一実施形態において、本発明の文脈におけるイムノコンジュゲートは、組換え細胞系の細胞表面に発現される完全長ヒトＬＡＭＰ１およびカニクイザルＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を有し、ここで細胞系はＨＣＴ１１６であってもよく、フローサイトメトリーにより測定される見かけの親和性は３０ｎＭ以下、例えば、２０ｎＭ以下または１５ｎＭ以下である。
完全長ヒトＬＡＭＰ１およびカニクイザルＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を測定するための方法は、「抗体」のセクションでさらに説明される。
本発明者らはさらに、ＭＡｂ１から誘導されるキメラ抗体（ｃｈＭＡｂ１）が、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と共に、ゲノムＤＮＡ中へのＬＡＭＰ１をコードするＤＮＡ配列の安定な組込みを含有し、表面上にＬＡＭＰ１を発現するヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞上でｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を誘導することを証明した。
さらに、本発明者らは、ＭＡｂ１から誘導されるヒト化抗体（ｈｕＭＡｂ１＿１、ｈｕＭＡｂ１＿２、ｈｕＭＡｂ１＿３）が、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と共に、ゲノムＤＮＡ中へのＬＡＭＰ１をコードするＤＮＡ配列の安定な組込みを含有するヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞上でｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を誘導することを証明した。
本発明者らはまた、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１が、実施例１０．１．１に記載のように、単回注射で、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐから誘導される原発性ヒト結腸腺癌異種移植片を担持するマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
さらに、本発明者らは、このイムノコンジュゲートが、実施例１０．１．２に記載のように、単回注射で、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４から誘導される原発性ヒト肺腫瘍異種移植片を担持するマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することを示した。
本発明者らはまた、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２、およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３が、実施例１０．２〜１０．４に示されるように、異なる患者由来異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
例えば、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、実施例１０．２．２および１０．２．３に記載のように、単回注射で、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または１．２５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト浸潤性腺管癌異種移植片および原発性ヒト肺腫瘍異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することが示された。
また、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３も、実施例１０．３．２および１０．４に記載のように、単回注射で、それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト浸潤性腺管癌異種移植片のマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導した。
要するに、初めて、これらの結果は、がんの処置のための治療標的としてＬＡＭＰ１を正当に同定するものである。
従って、本発明は、
ａ）ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合し；
ｂ）少なくとも１つの増殖阻害剤に連結またはコンジュゲートされている
抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。
本出願を通して記載されるように、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合する任意の抗体（例えば、ＭＡｂ４、その断片、またはそのキメラ型もしくはヒト化型）を、本発明によるイムノコンジュゲートに組み入れることができる。
本明細書で用いられる場合、「コンジュゲート」、「イムノコンジュゲート」、「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、同じ意味を有し、互換的である。
区別無く用いることができる、「増殖阻害剤」または「抗増殖剤」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞、特に、腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。増殖阻害剤は、特に、細胞傷害剤または放射性同位体を指す。
用語「放射性同位体」は、Ａｔ２１１、Ａｃ２２５、Ｂｉ２１２、Ｂｉ２１３、Ｐｂ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１３１、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｚｒ８９、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６８、Ｃｕ６４およびＬｕ１７７のようなＬｕの放射性同位体のような、がんを処置するのに好適な放射性同位体を含むことが意図される。そのような放射性同位体は一般に、主としてベータ線を放射する。ある実施形態において、放射性同位体は、アルファ放射体同位体、より正確には、アルファ線を放射するトリウム２２７（Ｔｈ２２７）である。本発明によるイムノコンジュゲートを、特許出願ＷＯ２００４／０９１６６８に記載のように製造することができる。
一実施形態において、放射性同位体は、Ａｔ２１１、Ａｃ２２５、Ｂｉ２１３、Ｐｂ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｚｒ８９、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６８、Ｃｕ６４およびＬｕの放射性同位体からなる群、例えば、Ａｔ２１１、Ｅｒ１６９、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｌｕの放射性同位体、およびＴｈ２２７から選択される。
本明細書で用いられる用語「細胞傷害剤」とは、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語「細胞傷害剤」は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および低分子毒素または細菌、菌類、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素のような毒素、例えば、その断片および／またはバリアント、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことが意図される。いくつかの実施形態において、細胞傷害剤は、抗チューブリン剤、例えば、タキソイドまたはタキサン、ビンカアルカロイド、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド類似体、例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４、クリプトフィシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体；ＤＮＡアルキル化剤、例えば、トメイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体；レプトマイシン誘導体；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、アルファ−アマニチンにある化合物の薬物またはプロドラッグである。
第１の実施形態によれば、前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、未定義の放射性同位体、化学療法剤、タンパク質もしくはレクチンでも、洋種ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシンおよびその各Ａ鎖、ドキソルビシン、シスプラチン、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、タキソール、５−フルオロウラシル、ＶＰ−１６（エトポシド）、ブレオマイシン、メトトレキサート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビス−クロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、マイトマイシン、シクロホスファミドならびにサイトカイン、例えば、ＴＮＦおよびＴＮＦ−βでもない。
この第１の実施形態によれば、本発明は特に、
ａ）ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合し；ならびに
ｂ）少なくとも１つの増殖阻害剤：
（ｉ）洋種ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質以外の酵素；ブレオマイシンおよびマイトマイシン以外の抗生物質；その断片および／もしくはバリアントを含む、アブリンおよびリシン以外の細菌、真菌、もしくは動物起源もしくは植物起源の毒素；抗チューブリン剤、例えば、メイタンシノイドもしくはメイタンシノイド類似体、例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４、パクリタキセル（タキソール）以外のタキソイドもしくはタキサン、ビンデシン、ビンクリスチンおよびビンブラスチン以外のビンカアルカロイド、クリプトフィシン誘導体、オーリスタチンもしくはドラスタチン類似体にある化合物の薬物もしくはプロドラッグ；ＢＣＮＵおよびシクロホスファミド、例えば、トメイマイシンもしくはピロロベンゾジアゼピン誘導体、ＣＣ−１０６５もしくはＣＣ−１０６５類似体以外のＤＮＡアルキル化剤；レプトマイシン誘導体；ドキソルビシン（アドリアマイシン）およびエトポシド以外のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、アルファ−アマニチンからなる群から選択される細胞傷害剤、または
（ｉｉ）Ａｔ２１１、Ａｃ２２５、Ｂｉ２１３、Ｐｂ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｚｒ８９、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６８、Ｃｕ６４およびＬｕの放射性同位体、例えば、Ｌｕ１７７およびＴｈ２２７からなる群から選択される放射性同位体
に連結またはコンジュゲートされている抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。
一実施形態において、放射性同位体は、Ａｔ２１１、Ｅｒ１６９、Ｉ１２５、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｌｕの放射性同位体、およびＴｈ２２７からなる群から選択される。
前記第１の実施形態において、抗体は特に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインに結合してもよく；ヒトＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインは配列番号２４のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ｉｌｅ３０９からなり、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインは配列番号３９のアミノ酸Ａｌａ２７〜Ｔｈｒ３０７からなる。
第２の実施形態によれば、本発明は、抗体がヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインに結合し；ヒトＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインが配列番号２４のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ｉｌｅ３０９からなり、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインが配列番号３９のアミノ酸Ａｌａ２７〜Ｔｈｒ３０７からなるイムノコンジュゲートに関する。
従って、この第２の実施形態によれば、イムノコンジュゲートは、
ａ）ヒトＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインが配列番号２４のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ｉｌｅ３０９からなり、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインが配列番号３９のアミノ酸Ａｌａ２７〜Ｔｈｒ３０７からなる、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインに結合し；
ｂ）前記少なくとも１つの増殖阻害剤に連結またはコンジュゲートされている
抗体を含む。
強制的ではないが、前記第２の実施形態において、少なくとも１つの増殖阻害剤は、未定義の放射性同位体、化学療法剤、タンパク質またはレクチン、特に、洋種ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシンおよびその各Ａ鎖、ドキソルビシン、シスプラチン、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、タキソール、５−フルオロウラシル、ＶＰ−１６（エトポシド）、ブレオマイシン、メトトレキサート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＢＣＮＵ、マイトマイシン、シクロホスファミドおよびサイトカイン、例えば、ＴＮＦおよびＴＮＦ−βとは異なっていてもよい。
従って、前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、Ａｔ２１１、Ａｃ２２５、Ｂｉ２１３、Ｐｂ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｚｒ８９、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６８、Ｃｕ６４およびＬｕの放射性同位体、例えば、Ｌｕ１７７およびＴｈ２２７からからなる群から選択される放射性同位体、例えば、Ａｔ２１１、Ｅｒ１６９、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、Ｌｕの放射性同位体、例えば、Ｌｕ１７７およびＴｈ２２７、または前記第１の実施形態で定義された細胞傷害剤であってもよい。
前記第１および第２の実施形態において、前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、特に、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド類似体、例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４、トメイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、またはＣＣ−１０６５もしくはＣＣ−１０６５類似体、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、アルファ−アマニチンにある化合物の薬物またはプロドラッグであってもよい。
一実施形態において、好適なトママイシンは、トママイシン二量体である。前記トママイシン二量体は、例えば、（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）である。
（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）の構造式は、
である。
本明細書で用いられる「メイタンシノイド」は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体を指す。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞にとって高度に毒性である薬物である。
好適なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が挙げられる。
好適なメイタンシノール類似体の例としては、改変芳香環を有するものおよび他の位置に改変を有するものが挙げられる。そのような好適なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；および第５，８４６，５４５号に開示されている。
改変芳香環を有するメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元により製造される）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いる脱メチル化またはＬＡＨを用いる脱塩素化により製造される）；ならびに
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシルクロリドを用いるアシル化により製造される）
が挙げられる。
他の位置の改変を有するメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により製造される）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨもしくはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から製造される）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの変換により製造される）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌジフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの脱メチル化により製造される）；ならびに
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により製造される）
が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれたチオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）を用いる。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）：
により表される。
別の実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンと呼ばれたチオール含有メイタンシノイドＤＭ４を用いる。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）：
により表される。
本発明のさらなる実施形態において、硫黄原子を担持する炭素原子上にモノまたはジ−アルキル置換を担持するチオールおよびジスルフィド含有メイタンシノイドを含む他のメイタンシンを用いることができる。これらのものとしては、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに、チオール官能基を担持するアシル基の炭素原子が１つまたは２つの置換基を有し、前記置換基がＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０の試薬を有する線状もしくは分枝状アルキルまたはアルケニルおよび溶液中に存在してもよい任意の凝集体である、妨害されたスルフヒドリル基を担持するアシル基を有するアシル化されたアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドが挙げられる。
これらの細胞傷害剤およびコンジュゲーション方法の例は、参照により組み入れられる特許出願ＷＯ２００８／０１０１０１にさらに与えられる。
本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも１つの増殖阻害剤に、直接的に、または切断性もしくは非切断性リンカーにより共有結合している。
本明細書で用いられる場合、「リンカー」は、ポリペプチドを薬物部分に共有的に結合させる共有結合または原子の鎖を含む化学部分を意味する。
コンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法により製造することができる。薬物またはプロドラッグを抗体に連結するために、連結基が用いられる。好適な連結基は当業界で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が挙げられる。本発明の抗体と、細胞傷害剤または増殖阻害剤とのコンジュゲーションを、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、ブタン酸４−［（５−ニトロ−２−ピリジニル）ジチオ］−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルエステル（ニトロ−ＳＰＤＢ）、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホ−酪酸（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、ＳＮＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンを、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）に記載のように製造することができる。炭素標識された１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
リンカーは、細胞中での細胞傷害剤または増殖阻害剤の放出を容易にする「切断性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、エステラーゼ不安定リンカー、光不安定リンカーまたはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）を用いることができる。リンカーはまた、いくつかの場合、より良好な許容性をもたらし得る「非切断性リンカー」（例えば、ＳＭＣＣリンカー）であってもよい。
あるいは、本発明の抗体と、細胞傷害または増殖阻害ポリペプチドとを含む融合タンパク質を、組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により隔てられたコンジュゲートの２つのポーションをコードするそれぞれの領域を含んでもよい。
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を、活性な抗がん剤（例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい）に変換するプロドラッグ活性化酵素にポリペプチドをコンジュゲートさせることによる依存的酵素媒介性プロドラッグ療法において用いることもできる。ＡＤＥＰＴにとって有用なイムノコンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害形態に変換するような方法でプロドラッグに対して作用することができる任意の酵素を含む。本発明の方法において有用である酵素としては、限定されるものではないが、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性フルオロシトシンを抗がん剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）のようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；Ｐ−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；ならびにそのアミン窒素において誘導体化された薬物を、それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼが挙げられる。上記で考察されたヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような当業界で周知の技術により、酵素を本発明のポリペプチドに共有結合させることができる。
前記第１および第２の実施形態によれば、本発明のコンジュゲートにおいて、増殖阻害剤はメイタンシノイド、特に、ＤＭ１またはＤＭ４である。
そのようなコンジュゲートにおいて、抗体は連結基によって前記少なくとも１つの増殖阻害剤にコンジュゲートされている。特に、前記連結基は、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、またはＳＭＣＣのような非切断性リンカーである。
特に、コンジュゲートを、
ｉ）式（ＩＩＩ）
の抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート；
ｉｉ）式（ＩＶ）
の抗体−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート；および
ｉｉｉ）式（Ｖ）
の抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート
からなる群から選択することができる。
さらなる実施形態において、本発明のコンジュゲート中、増殖阻害剤は、トママイシン、例えば、トママイシン二量体、例えば、（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）であってもよい。
そのようなコンジュゲートにおいて、抗体は、連結基、例えば、ＳＮＰＰによって前記少なくとも１つの増殖阻害剤にコンジュゲートされている。
従って、一実施形態において、コンジュゲートは、抗体−ＳＮＰＰ−（２Ｅ，２Ｅ’，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）であってもよい。
一般に、コンジュゲートを、
（ｉ）細胞結合剤（例えば、本発明による抗体）の場合により緩衝化された水性溶液を、リンカーおよび細胞傷害化合物の溶液と接触させる工程；
（ｉｉ）次いで、場合により、未反応の細胞結合剤から（ｉ）で形成されたコンジュゲートを分離する工程
を含む方法により取得することができる。
細胞結合剤の水性溶液を、例えば、リン酸、酢酸、クエン酸カリウムまたはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）のような緩衝液で緩衝化することができる。緩衝液は、細胞結合剤の性質に依存する。細胞傷害化合物は、有機極性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の溶液中にある。
反応温度は通常、２０〜４０℃を含む。反応時間は１〜２４時間で変化してもよい。細胞結合剤と細胞傷害剤との反応を、屈折率検出器および／またはＵＶ検出器を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりモニタリングすることができる。コンジュゲートの収量が低すぎる場合、反応時間を延長することができる。
当業者であれば、いくつかの異なるクロマトグラフィー法を用いて、工程（ｉｉ）の分離を実行することができる：コンジュゲートを、例えば、ＳＥＣ、吸着クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのような混合支持体クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。透析または透析濾過による精製を用いることもできる。
本明細書で用いられる用語「凝集体」とは、コンジュゲーションにより改変されたか、または改変されていない２つまたはそれ以上の細胞結合剤の間で形成させることができる会合を意味する。凝集体を、溶液中の高濃度の細胞結合剤、溶液のｐＨ、高い剪断力、結合した二量体の数およびその疎水性、温度のような多数のパラメータの影響下で形成させることができる（Ｗａｎｇ，Ｌ．およびＧｏｓｈ，Ｒ．、２００８、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ Ｓｃｉ．、３１８：３１１〜３１６頁、およびそこに引用される参考文献を参照されたい）；これらのパラメータのいくつかの相対的影響は明確に確立されていないことに留意されたい。タンパク質および抗体の場合、当業者であれば、Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，Ｍ．Ｅ．ら（２００６、ＡＡＰＳ Ｊｏｕｎａｌ、８（３）：Ｅ５７２〜Ｅ５７９頁）を参照するであろう。凝集体中の内容物を、ＳＥＣのような、当業者には周知の技術を用いて決定することができる（Ｗａｌｔｅｒら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２（２）：４６９〜４８０頁を参照されたい）。
工程（ｉ）または（ｉｉ）の後、コンジュゲート含有溶液を、クロマトグラフィー、限外濾過および／または透析濾過のさらなる工程（ｉｉｉ）にかけることができる。
コンジュゲートは、水性溶液中でのこれらの工程の終わりに回収される。
ある実施形態によれば、本発明によるコンジュゲートは、ＤＡＲ ＵＶによって測定される１〜１０、例えば、２〜５、特に、３〜４の範囲の「薬物抗体比」（または「ＤＡＲ」）を特徴とする。これは一般に、メイタンシノイド分子を含むコンジュゲートの場合である。
このＤＡＲ数は、コンジュゲーションのために用いられる実験条件（増殖阻害剤／抗体の比、反応時間、溶媒および存在する場合、共溶媒の性質など）と共に、用いられる抗体および薬物（すなわち、増殖阻害剤）の性質に応じて変化してもよい。かくして、抗体と増殖阻害剤との接触は、異なる薬物抗体比；場合により裸の抗体；場合により凝集体により互いに異なるいくつかのコンジュゲートを含む混合物をもたらす。かくして、決定されるＤＡＲは平均値である。
本明細書ではＤＡＲ ＵＶと呼ばれる、ＤＡＲを決定するために用いることができる方法は、λＤおよび２８０ｎｍでの実質的に精製されたコンジュゲートの溶液の吸光度の比を分光光度測定することにある。２８０ｎｍは、抗体濃度のような、タンパク質濃度を測定するために一般的に用いられる波長である。波長λＤは、薬物を抗体から識別することができるように選択される、すなわち、当業者には容易にわかるように、λＤは、薬物が高い吸光度を有する波長であり、λＤは薬物と抗体の吸光度のピークにおける実質的な重複を回避するために２８０ｎｍから十分に離れている。メイタンシノイド分子の場合、λＤを、２５２ｎｍであると選択することができる。ＤＡＲ算出の方法を、Ａｎｔｏｎｙ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編）、ＬＬＣ、２００９、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｖｏｌ ５２５、４４５頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅから誘導することができる。
λＤ（ＡλＤ）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのコンジュゲートの吸光度は、古典的な分光光度計装置を用いて測定される（「ＤＡＲパラメータ」を算出することができる）。吸光度を以下のように表すことができる：
ＡλＤ＝（ＣＤｘεＤλＤ）＋（ＣＡｘεＡλＤ）
Ａ２８０＝（ＣＤｘεＤ２８０）＋（ＣＡｘεＡ２８０）
（式中、
・ＣＤおよびＣＡはそれぞれ、薬物および抗体の溶液中での濃度であり、
・εＤλＤおよびεＤ２８０はそれぞれ、λＤおよび２８０ｎｍでの薬物のモル吸光係数であり、
・εＡλＤおよびεＡ２８０はそれぞれ、λＤおよび２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数である）。
２つの未知数を用いてこれらの２つの式を分解すると、以下の式が得られる：
ＣＤ＝［（εＡ２８０ｘＡλＤ）−（εＡλＤｘＡ２８０）］／［（εＤλＤｘεＡ２８０）−（εＡλＤｘεＤ２８０）］
ＣＡ＝［Ａ２８０−（ＣＤｘεＤ２８０）］／εＡ２８０
次いで、平均ＤＡＲを、抗体：ＤＡＲ比＝ＣＤ／ＣＡに対する薬物濃度の比から算出する。
本発明によるイムノコンジュゲートにおいて、抗体は特に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に特異的である。
抗体は、特に、キメラまたはヒト化抗体である。抗体はまた、抗体断片、または二重特異的もしくは多重特異的抗体であってもよい。
本発明のイムノコンジュゲート中に含めることを特に企図されるヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体は、以下の「抗体」のセクションでさらに詳細に説明される。
抗体
本発明者らは、ヒトＬＡＭＰ１に特異的に結合し、非腫瘍組織から腫瘍組織を識別する４つの抗体（いわゆる抗体「ＭＡｂ１」、「ＭＡｂ２」、「ＭＡｂ３」および「ＭＡｂ４」）を同定した。抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３により、細胞外で発現されたＬＡＭＰ１を初めて検出し、かくして、凍結ＯＣＴ（最適切削温度の）標本およびＡＦＡ（アルコールホルマリン酢酸固定）上でのＩＨＣ分析を実施して、非がん組織からがん組織を識別することができた。
しかしながら、生体バンクから、または患者の処置前もしくは処置中の病院からの腫瘍組織のＩＨＣ分析は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を用いて日常的に行われている。ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は凍結ＯＣＴおよびＡＦＡ（アルコールホルマリン酢酸固定）試料形式でＬＡＭＰ１膜強化を可能にするが、それらはＦＦＰＥ形式でのＬＡＭＰ１強化の検出をもたらすことはできない。その理由の１つは、おそらくタンパク質の複雑性と組み合わせたホルマリン固定の効果である。本発明者らは、ＦＦＰＥ形式でＩＨＣ実験のためにさらに用いることができるモノクローナル抗体ＭＡｂ４の生成を可能にし、かくして、ＦＦＰＥ腫瘍生体バンクおよびＦＦＰＥ病院試料に対する本明細書で提供される方法の適用を可能にするペプチドを発見した。
これらの４つの抗体は、がん細胞における細胞表面に発現されたＬＡＭＰ１に対する高い結合親和性（ナノモル濃度範囲内）を示した。さらに、少なくとも抗ＬＡＭＰ１ ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３抗体は、実施例４．４に示されるように、ＬＡＭＰ１／抗ＬＡＭＰ１抗体複合体の内在化を誘発する高い能力を示した。
さらに、４つの抗体は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応するが、ヒトＬＡＭＰ２タンパク質とはいかなる交差反応性も示さない。
抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３の結合部位は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメイン、特に、ヒトＬＡＭＰ１の第１の内腔ドメインにマッピングされている。より具体的には、ＭＡｂ１の結合部位は、ループ１〜２にマッピングされ、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３の結合部位はループ１にマッピングされた。抗体ＭＡｂ１およびＭＡｂ２は、ヒトＬＡＭＰ１への結合について互いに競合しない。従って、ＬＡＭＰ１上の少なくとも２つのエピトープが、本発明の抗体と相互作用することが見出された。
抗体ＭＡｂ４の結合部位は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第３〜第４のループからなるドメイン、特に、ヒトＬＡＭＰ１の第４のループにマッピングされている。より具体的には、抗体ＭＡｂ４は、配列番号８２の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のアミノ酸３６０〜３７５を含むループ４の領域に結合する。
本発明者らは、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に対するこれらのモノクローナル抗体の可変重鎖および軽鎖の配列を決定した。
いわゆる抗体「ＭＡｂ１」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３にまたがり（配列番号２）、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号３）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０７にまたがり（配列番号４）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１０８〜１１８にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメインと、
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２にまたがり（配列番号６）、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９６にまたがり（配列番号７）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０６にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメインと
を含む。
いわゆる抗体「ＭＡｂ２」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３にまたがり（配列番号９）、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号１０）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１１１にまたがり（配列番号１１）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１２〜１２２にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメインと、
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３６にまたがり（配列番号１３）、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３７〜５３にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５４〜５６にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５７〜９２にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置９３〜１０１にまたがり（配列番号１４）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１０２〜１１１にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメインと
を含む。
本明細書では「ＭＡｂ２Ｃａｎ」と呼ばれる、抗体ＭＡｂ２のバリアントはまた、重鎖の可変ドメイン中のＡ１１６Ｔの置換により、ならびに軽鎖の可変ドメイン中のＶ９Ａ、Ｖ５１Ｌ、Ｉ５８Ｌ、Ｓ７２ＧおよびＡ１０８Ｔの置換により標準的な残基を導入することによっても作成された。
いわゆる「抗体ＭＡｂ２Ｃａｎ」は、
− 配列
からなる重鎖の可変ドメイン、
− 配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
キメラ形態下にある「ＭＡｂ２Ｃａｎ」と「ＭＡｂ２」は両方とも、ヒトＬＡＭＰ１に対する同じ親和性を有する（表１３を参照されたい）。
いわゆる抗体「ＭＡｂ３」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３にまたがり（配列番号４３）、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号４４）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１１１にまたがり（配列番号４５）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１２〜１２２にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメインと、
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２にまたがり（配列番号４７）、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９７にまたがり（配列番号４８）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置９８〜１０７にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメインと
を含む。
ＭＡｂ３のバリアント（「ＭＡｂ３ ＶＬ Ｒ２４ Ｒ９３」）は、ＭＡｂ３のＶＬ配列中に、以下のアミノ酸置換：Ｎ２４ＲおよびＫ９３Ｒを導入することによって作成された。従って、ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３の軽鎖の可変ドメインは、
からなる。
かくして、ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３のＣＤＲ３−Ｌは、ＱＱＹＴＲＬＰＦＴ（配列番号５２）からなる。
いわゆる抗体「ＭＡｂ４」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３にまたがり（配列番号８３）、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号８４）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０８にまたがり（配列番号８５）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１０９〜１１９にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメインと、
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２にまたがり（配列番号８６）、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９７にまたがり（配列番号８７）、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置９８〜１０７にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメインと
を含む。
抗体はまた、ヒト化抗体またはヒト化抗体の断片であってもよい。例えば、本発明の抗体は、上記で定義された抗体のいずれかのヒト化から生じてもよい。
抗体配列のヒト化のためのいくつかの方法が当業界で公知である；例えば、Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３頁による概説を参照されたい。１つの一般的に用いられる方法は、ＣＤＲ移植、またはドナー抗体、一般的にはマウス抗体のＣＤＲ配列を、異なる特異性のヒト抗体のフレームワーク足場に移植することを含む抗体再形成である。ＣＤＲ移植は親抗体の結合特異性および親和性、かくして、生物活性を低下させ得るため、ＣＤＲ移植された抗体の選択された位置に復帰変異を導入して、親抗体の結合特異性および親和性を保持することができる。可能な復帰変異のための位置の同定を、文献および抗体データベース中で入手可能な情報を用いて実施することができる。ＣＤＲ移植および復帰変異に対する代替的なヒト化技術は、非ヒト起源の表面露出していない残基を保持するが、表面残基をヒト残基に変化させるリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）である。別の代替的な技術は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２（９）：８９９〜９９３頁）として公知であり、これを用いて、マウス抗体から、親抗体のエピトープおよび結合特性を保持する完全ヒト抗体を誘導することができる。特許出願ＷＯ２００９／０３２６６１に開示された分子動力学算出に基づくヒト化の技術を用いることができる。かくして、一実施形態において、ヒト化抗体を、「リサーフェシングされた」抗体と呼ぶこともできる。
キメラ抗体について、ヒト化は、典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の改変を含む。
ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は、典型的には、ヒト化に関連して変化されないが、ある特定の事例では、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させて、例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位、望ましくないシステイン残基、ＡＤＣの場合、リシン残基を除去することが望ましい場合がある。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であってよい）中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の結合により生じる。Ｎ−グリコシル化部位の除去を、特に、例えば、保存的置換により、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に変異させることにより達成することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出のような因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、脱アミド化の影響を特に受けやすく、Ａｓｎ−Ａｌａのような他のジペプチド配列中ではその程度はより低い。そのような脱アミド化部位、特に、Ａｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合、従って典型的には、関与する残基の１つを除去するための保存的置換によってその部位を除去することが望ましい場合がある。ＡＤＣの場合、ｍＡｂへの細胞傷害剤の結合を、リシン側鎖残基への共有的連結により製造することができる。この立体障害は、抗原に結合するｍＡｂを阻害し得る。従って、典型的には、アルギニン保存的置換により、リシン残基を除去することが望ましい場合がある。関与する残基の１つを除去するためのＣＤＲ配列中の置換もまた、本発明により包含されることが意図される。本発明者らはさらに、実施例７．２．１および本明細書の以下に記載されるＣＤＲ移植および／または分子力学的軌跡（４Ｄヒト化プロトコール）に基づいてヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿１」、「ｈｕＭＡｂ１＿２」、「ｈｕＭＡｂ１＿３」を作成した。
従って、一実施形態において、本発明の文脈における抗ＬＡＭＰ１抗体は、ＣＤＲ移植により、および／または分子力学的軌跡（４Ｄヒト化プロトコール）に基づいて得られるヒト化抗ＬＡＭＰ１抗体である。
従って、ある実施形態において、ヒト化抗ＬＡＭＰ１抗体「ｈｕＭＡｂ１＿１」は、
− 配列
からなる重鎖の可変ドメイン（ＶＨ１）、および
− 配列
からなるｈｕＭＡｂ１＿１の軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ１）
を含む。
ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿２」は、
− 配列
からなる重鎖の可変ドメイン（ＶＨ２）、および
− 配列
からなる軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ２）
を含む。
ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿３」は、
− 配列
からなる重鎖の可変ドメイン（ＶＨ３）、および
− 配列
からなる軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ３）
を含む。
本発明は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
「親和性」は、理論的には、全抗体と抗原との間の平衡会合により定義される。それを、表面プラズモン共鳴を用いる会合および解離速度の測定または免疫化学アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）におけるＥＣ５０の測定のような様々な公知の方法によって実験的に評価することができる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、液体試料または湿潤試料中の、物質、通常は抗原の存在を検出するための固相酵素免疫アッセイを用いる生化学アッセイである。試料由来抗原を、表面に結合させる。次いで、さらなる特異的抗体を表面上に加え、それを抗原に結合させることができる。この抗体は酵素に連結され、最終工程において、酵素の基質を含有する物質を添加する。その後の反応は、検出可能なシグナル、最も多くは、基質中での色の変化を生成する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて、１つの細胞を同時に、生物細胞の異種混合物を２つまたはそれ以上の容器中で選別するための方法を提供する。これらのアッセイにおいて、ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）による規定濃度の抗原またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による抗原を発現する細胞へのある特定の曝露時間後のベースラインと最大との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度である。
抗原１（Ａｇ１）に結合するモノクローナル抗体は、ＥＣ５０が両抗原について類似する範囲にある場合、抗原２（Ａｇ２）と「交差反応」する。本出願において、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、Ａｇ２の親和性とＡｇ１の親和性との比が１０以下（特に、５、２、１または０．５）である場合、Ａｇ２と交差反応し、その親和性は両抗原について同じ方法を用いて測定される。
Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、親和性が２つの抗原について非常に異なる場合、Ａｇ２と「有意に交差反応しない」。Ａｇ２に対する親和性は、結合応答が低すぎる場合、測定可能でなくてもよい。本出願において、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、Ａｇ２に対するモノクローナル抗体の結合応答が、同じ実験設定および同じ抗体濃度でＡｇ１に対する同じモノクローナル抗体の結合応答の５％未満である場合、Ａｇ２と有意に交差反応しない。実際には、用いられる抗体濃度は、ＥＣ５０またはＡｇ１を用いて得られる飽和プラトーに達するのに必要とされる濃度であってもよい。
モノクローナル抗体は、それがＡｇ２と有意に交差反応しない場合、Ａｇ１に「特異的に結合する」。
本発明による抗体は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合する。それは、ヒトＬＡＭＰ２（配列番号４０）と有意に交差反応しない。
一実施形態において、本発明による抗体は、組換え細胞系の細胞表面に発現されるヒトおよび／またはカニクイザルＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を有し、ここで、細胞系はＨＥＫ２９３および／またはＨＣＴ１１６であってもよく、フローサイトメトリーにより測定される見かけの親和性は、７０ｎＭ以下、例えば、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下または１０ｎＭ以下である。
一実施形態において、本発明による抗体は、組換え細胞系の細胞表面に発現される完全長ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を有し、ここで、細胞系はＨＣＴ１１６であってもよく、フローサイトメトリーにより測定される見かけの親和性は、２０ｎＭ以下、特に、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下または７ｎＭ以下である。
一例において、本発明による抗体は、組換え細胞系の細胞表面に発現されるカニクイザルＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を有し、ここで、細胞系はＨＥＫ２９３であってもよく、フローサイトメトリーにより測定される見かけの親和性は、５０ｎＭ以下、例えば、４０ｎＭ以下または３５ｎＭ以下である。
別の例において、本発明による抗体は、ＨＥＫ２９３細胞中で発現される完全に精製されたヒトＬＡＭＰ１（配列番号２８）に対するＫＤを有し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定されるＫＤは、７０ｎＭ以下、例えば、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下または１０ｎＭ以下である。
決定するための表面プラズモン共鳴の使用は、当業者には公知である。一例において、例えば、マウス、キメラまたはヒト化抗ＬＡＭＰ１ ｍＡｂの結合速度論を、典型的には、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．、Ｕｐｐｓａｌａ、ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイにより決定した。従って、例えば、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップを機器にドッキングし、例えば、室温で１：１ ＮＨＳ／ＥＤＣ ７０μＬを用いて活性化した。典型的には、マウス抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１（ＢＩＡｃｏｒｅ番号ＢＲ−１００８−３９）およびウサギ抗αマウスＦｃ ＩｇＧ１（ＢＩＡｃｏｒｅ番号ＢＲ−１００８−３８）（１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５中の５０μｇ／ｍＬ）を、全てのフローセル中の活性化されたチップ上に固定化した。固定化を、飽和するまで、例えば１０μＬ／分の流速で実行した。次いで、例えば、エタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ７０μＬの注入することによりチップをブロッキングし、次いで、抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１については３Ｍ ＭｇＣｌ２で１回の洗浄および抗αマウスＦｃ ＩｇＧ１については１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７で１回の洗浄をした。例えば、ＬＡＭＰ１への抗ＬＡＭＰ１ ｍＡｂの結合を測定するために、抗体をＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）中、１〜５μｇ／ｍＬで用いた。例えば、抗原（実施例６．２に記載のように生成される配列番号２８のタンパク質）を、例えば、１〜２５６ｎＭで注入した。注入期間の完了後、典型的には６００秒間同じ流速でＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液中で解離をモニタリングした。典型的には、表面を、例えば、抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１については２ｘ５μＬの３Ｍ ＭｇＣｌ２（２ｘ３０秒）および抗αマウスＦｃ ＩｇＧ１については１ｘ３０μＬの１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７（１８０秒）を用いて注入と注入の間で再生した。個々のセンサーグラムを、典型的には、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。
かくして、本発明によるポリペプチドを、サルにおいて実施される毒性試験において用いることができ、ここで、これらの試験から得られる毒性プロファイルは、ヒトにおける潜在的な有害効果を予測するのに関連する。
あるいは、またはさらに、本発明による抗体は、進行性のヒト原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐの表面上に発現されるＬＡＭＰ１に対する親和性（ＥＣ５０）を有し、フローサイトメトリーにより測定されるのは、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、特に、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下または５ｎＭ以下である。
抗体結合能力またはＡＢＣは、細胞表面抗原の定量である。ＡＢＣを、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）（ＢＩＯＣＹＴＥＸの登録商標）を用いて測定することができる。本発明による抗体は、異なる起源の多くの患者由来異種移植片（２０．０００以上、特に、５０．０００以上、１００．０００以上、１５０．０００以上のＡＢＣ）および腫瘍細胞系、特に、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４８０またはＬＳ１７４Ｔのような結腸腫瘍細胞（１．５００以上、２．５００以上、４．０００以上のＡＢＣ）に対する高いＡＢＣを有する。
あるいは、またはさらに、本発明による抗体は、ＬＡＭＰ１を細胞膜に内在化させ、再循環する能力を有する。特に、本発明による抗体により結合した場合、がん細胞の膜にあるＬＡＭＰ１の分子は、細胞膜で少なくとも１、４、７または９回の再循環を受ける能力を有する。換言すれば、がん細胞の表面に発現される１分子のＬＡＭＰ１を、少なくとも２、５、８または１０分子の本発明による抗体により結合させ、従って、内在化させることができる。さらに換言すれば、ある実施形態によれば、少なくとも２、５、８または１０分子の本発明による抗体は、がん細胞の表面に発現される１分子のＬＡＭＰ１により内在化される。
内在化を、例えば、内在化スコアを決定することによるか、または蛍光に基づくクエンチング法によりアッセイすることができる。
内在化スコア（ＩＳ）は、細胞内部の蛍光強度と、全細胞の強度との比として定義される。それを、イメージングフローサイトメーターＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍｘ（供給業者Ａｍｎｉｓ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２５０５ Ｔｈｉｒｄ Ａｖｅｎｕｅ、Ｓｕｉｔｅ ２１０、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ ９８１２１−１４８０、ｗｗｗ．ａｍｎｉｓ．ｃｏｍから）を用いることにより記載のように測定することができる。スコアが高くなるほど、細胞内部の蛍光強度は高くなる。Ａｍｎｉｓ（ｗｗｗ．ａｍｎｉｓ．ｃｏｍを参照されたい）により記載されたように、細胞の内部は、細胞の膜に適合するマスクの浸食により定義される。スコアは、細胞サイズに対して不変であり、濃く明るい領域および小さく薄いスポットに適合することができる。その比は｛−ｉｎｆ、ｉｎｆ｝間の値にダイナミックレンジを増加させるように対数尺度でマッピングされる。膜の厚さ（ピクセル）は、細胞の境界および膜ポーションを規定するためにどのピクセルが用いられるかを決定するものである。ユーザーは、細胞の内部、ピクセル中の膜の厚さおよび対象の蛍光チャンネルを包含する明視野画像に基づいて「内部」マスクを供給する。細胞は２つの領域：外部（Ｂ）および内部（Ｉ）に分割される。ユーザーは、マスクとして内部領域を供給する。外部領域を、１．内部マスクを膜の厚さで拡張する、２．１と、対象のチャンネルの対象マスクとを組み合わせる、３．外部領域はマスク２に等しく、内部マスクとは等しくない、によって決定する。次に、各領域中のピクセルの上位四分位点の平均強度を決定する。次いで、内在化スコア（ＩＳ）を、以下のように計算する：
（式中、
であり、
ｍＩ＝Ｉにおける上位四分位点ピクセルの平均強度であり、ｍＢ＝Ｂにおける上位四分位点ピクセルの平均強度であり、
ｐＩ＝Ｉにおける上位四分位点ピクセルのピーク強度であり、ｐＢ＝Ｂにおける上位四分位点ピクセルのピーク強度である）。
トランスフェリンの場合（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ．ら、１９９６、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、４：２５５〜２８７頁）、著者らは、細胞を氷上に静置した場合は０のＩＳおよび細胞を３７℃で１時間インキュベートした場合は０．９のＩＳを得た。
本発明の抗体について、本発明者らは、３７℃での内在化スコア（ＩＳ）が４℃でのそれよりも１０倍高いことを示した。抗体の内在化は４℃では起こらないため、４℃で得られた内在化スコアは細胞表面でのＬＡＭＰ１分子の密度を反映する。従って、４℃でのＩＳパラメータよりも３７℃でのＩＳパラメータの値が１０倍高い場合、ＬＡＭＰ１タンパク質が細胞膜で迅速かつ反復的に再循環していることを意味する。換言すれば、本発明による抗体は、細胞表面でのＬＡＭＰ１タンパク質の密度から算出される能力よりもはるかに高い、非常に高い内在化能力を有する。
内在化の定量を、蛍光に基づくクエンチング法によって実施することもできる。特に、蛍光に基づくＡｌｅｘａ４８８クエンチング法が、標的化剤の内在化を分析するために記載されている（Ｆｒｅｊｄら、２０１０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３６：７５７〜７６３頁）。前記記載によれば、内在化は、以下の式：
に従って、３７℃でのクエンチされていない細胞（細胞表面と細胞内区画との両方）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値で除算したクエンチされた細胞（細胞内区画のみ）のＭＦＩ値として算出される。
抗体の内在化は４℃では起こらないため、４℃でＡｌｅｘａ４８８標識化合物と共にインキュベートした細胞を、対照として用いる。
本発明者らは、クエンチングの後、３７℃で標識された細胞（細胞表面と細胞内区画との両方）から測定されたＡｌｅｘａ４８８−ＭＡｂ１の総蛍光は、４時間後、４℃で標識された細胞（細胞表面）の蛍光よりも１０倍高いことを示した（実施例４．４）。従って、これらの結果はまた、ＬＡＭＰ１タンパク質が細胞膜で迅速かつ反復的に再循環していることも示している。
かくして、本発明者らは、ＬＡＭＰ１が抗体の内在化を媒介する受容体として機能し、特定の内在化抗体の利用可能性ががん細胞の内部に特異的に送達しようとする毒素、薬物または短距離同位体を標的化するための新規治療方法を開発するのに役立つはずであることを示唆することができることを初めて示した。
さらに、本発明者らは、総合すれば、実施例４．４からの結果が、各ＬＡＭＰ１分子が実験経過中に細胞膜での再循環を介していくつか（少なくとも平均で最大１０）の内在化サイクルに関与すると示唆することを示すことができた。
本発明の抗体は、特に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインに特異的に結合する。ヒトＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインは、配列番号２４のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ｉｌｅ３０９により定義され、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインは、配列番号３９のアミノ酸Ａｌａ２７〜Ｔｈｒ３０７により定義される。ある実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１の内腔ドメインに特異的に結合する。
ヒトＬＡＭＰ１の第１の内腔ドメインは、配列番号２４の位置Ａｌａ２９〜Ａｒｇ１９５のアミノ酸により定義され、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１の内腔ドメインは、配列番号３９の位置Ａｌａ２７〜Ａｒｇ１９３のアミノ酸により定義される。より具体的には、抗体は、可溶性細胞外ドメイン（例えば、ヒトＬＡＭＰ１（配列番号２４）のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ｍｅｔ３８２もしくはカニクイザルＬＡＭＰ１（配列番号３９）のＡｌａ２７〜Ｍｅｔ３８０）として、または細胞系、例えば、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５およびＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３細胞系の表面に組換え的に発現される膜に固定された型完全長ＬＡＭＰ１タンパク質として区別無く発現されるヒトおよびカニクイザルの第１の内腔ドメインに結合することができる。本発明者らは、ＭＡｂ１が、ヒトＬＡＭＰ１のループ２、例えば、本明細書中、実施例４．８に記載されるように、配列番号２４のアミノ酸１０１〜１１０（配列番号７２）、１４４〜１５７（配列番号７３）および１７４〜１８８（配列番号７４）に対応する配列番号２４のアミノ酸１０１〜１９５に結合することを示した。ＭＡｂ１の結合部位が配列番号２４のループ１に位置するアミノ酸Ａｓｎ３５、Ｃｙｓ８０、Ｇｌｙ８１、Ｇｌｕ８３、Ａｓｎ８４をさらに包含することが、結晶解析によりさらに同定された。
従って、ＭＡｂ１はまた、ヒトＬＡＭＰ１のループ１、例えば、配列番号２４の位置３５〜８４のアミノ酸（配列番号９７）からなる領域、または配列番号２４のＡｓｎ３５および配列番号２４の位置８０〜８４のアミノ酸からなる２つの領域に対応する配列番号２４の位置２９〜１００のアミノ酸に結合する。
さらに、ＭＡｂ２とＭＡｂ３は両方とも、ヒトＬＡＭＰ１のループ１に対応する配列番号２４のアミノ酸２９〜１００（配列番号７７）に結合し、例えば、ＭＡｂ２とＭＡｂ３は両方とも、配列番号２４のアミノ酸２９〜４１（配列番号７５）および６８〜８０（配列番号７６）に結合する。
さらなる抗体において、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第２の内腔ドメイン、例えば、第４のループに特異的に結合する。
ヒトＬＡＭＰ１タンパク質の第４のループは、配列番号２４の位置Ｌｅｕ３１０〜Ｍｅｔ３８２のアミノ酸からなり、カニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第４のループは、配列番号３９の位置Ｌｅｕ３０８〜Ｍｅｔ３８０のアミノ酸からなる。
より具体的には、抗体は、配列番号８２の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のアミノ酸３６０〜３７５を含むループ４の領域に結合する。
別の実施形態において、本発明の抗体は、非グリコシル化またはグリコシル化形態にあるかと区別無く、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合する。
従って、ある実施形態において、本発明は、
− それぞれ配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ２の３つの領域、ならびに場合によりさらに、配列（配列番号９７）からなるヒトＬＡＭＰ１のループ１の領域；または
− それぞれ配列番号７５および配列番号７６の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ１の２つの領域；または
− 配列番号８２の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ４の領域
に結合する抗体に関する。
さらに、本発明者らは、実施例６．５に記載のようにＭＡｂ１と相互作用する可能性が高いとして配列番号２４の残基Ｒ１４６、Ｄ１５０、Ｋ１５２、Ｒ１０６、Ａ１０８、Ｎ１８１、Ｓ１８２、Ｓ１８３、Ｒ１８６およびＧ１８７を同定した。本発明者らは、ＭＡｂ２および／またはＭＡｂ３と相互作用する可能性が高いとして配列番号２４の残基Ａ２９、Ｍ３０、Ｍ３２、Ｇ３６、Ａ４０、Ｓ６９、Ｄ７０、Ｔ７２、Ｖ７４、Ｌ７５、およびＲ７７をさらに同定した。これらの残基は、実施例６．６に記載のように、ｈＬＡＭＰ１＿ΔＧＹＱＴＩから誘導され、プラスミドｐＸＬ５６２６中にコードされるＬＡＭＰ１配列中のアラニン残基により個別に置き換えられている。本発明者らは、ＬＡＭＰ１タンパク質中の配列番号２４の位置Ｉ１４９、Ｄ１５０およびＲ１８６のアラニン変異についてＭＡｂ１への結合の喪失を観察したが、これは、これらの位置がＬＡＭＰ１へのＭＡｂ１結合にとって重要であることを示している。さらに、結合の喪失は、ＬＡＭＰ１タンパク質中のＡｌａ置換のため配列番号２４の位置Ｇ３８およびＤ７０のアラニン変異についてＭＡｂ３に対してＬＡＭＰ１について証明されたが、これは、これらの位置がＬＡＭＰ１へのＭＡｂ３結合にとって重要であることを示している。
従って、ある実施形態において、本発明は、
− 配列番号２４のアミノ酸Ｉ１４９、Ｄ１５０およびＲ１８６、または
− 配列番号２４のアミノ酸Ｇ３８およびＤ７０、または
に結合する抗体に関する。
本発明はまた、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメインへの結合について、いわゆる抗体Ｍａｂ１、Ｍａｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３、ｈｕＭＡｂ１＿１およびヒトＭＡｂ１＿２、ｈｕＭＡｂ１＿３からなる群から選択される抗体、すなわち、
（ｉ）配列番号１の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｉｉ）配列番号８の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号１２の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｉｉｉ）配列番号１５の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号１６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｉｖ）配列番号４２の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号４６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｖ）配列番号４２の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５１の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｖｉ）配列番号５３の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｖｉｉ）配列番号５４の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５７の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
（ｖｉｉｉ）配列番号５５の配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５８の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体
と競合する抗体も提供する。
ある実施形態において、前記抗体は、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１の内腔ドメインへの結合について競合する。例えば、本発明は、
− それぞれ、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ２の３つの領域；または
− それぞれ、配列番号７５および配列番号７６の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ１の２つの領域
への結合について、必要に応じて、上記のｉ〜ｖｉｉｉ）に記載のように定義された重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを含む抗体（すなわち、上記のｉおよびｖｉ〜ｖｉｉｉ）に記載のように定義された抗体についてはループ２の前記３つの領域、またはｉｉ〜ｖ）に記載のように定義された抗体についてはループ１の前記２つの領域）と競合する抗体を提供する。
一実施形態において、競合は、本明細書の実施例４．８に記載のようなＥＬＩＳＡの使用により決定され、ここで、競合は２つの競合する抗体が類似するモル濃度で溶液中にある場合、吸収により評価された場合、ｍＡｂ対照のみと比較したシグナルの８０％未満のシグナルにより定義され、競合は、８０％未満、例えば、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満のシグナルにより定義される。
ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１〜第３のループからなるドメイン、特に、第１の内腔ドメインへの結合について、いわゆる抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３、ｈｕＭＡｂ１＿１、ｈｕＭＡｂ１＿２およびｈｕＭＡｂ１＿３（以後、「参照」抗体）からなる群から選択される抗体の可変重鎖および軽鎖を含む抗体と競合する抗体の能力を、例えば、抗原（すなわち、ＬＡＭＰ１の第１〜第３のループ、または第１の内腔ドメインを含む、ヒトもしくはカニクイザルＬＡＭＰ１の断片を含むか、またはそれからなるポリペプチド、特に、実施例６．３に提示されるようなヒトおよびカニクイザル起源に由来するＬＡＭＰ１の第１の内腔ドメインを含有するタンパク質）を固相支持体に結合させ、それぞれ、候補抗体と参照抗体とを含有する２つの溶液を添加し、抗体を、抗原への結合について競合させる競合的ＥＬＩＳＡによって容易にアッセイすることができる。次いで、抗原に結合した参照抗体の量を測定し、陰性対照に対して測定された場合の抗原に結合した参照抗体の量と比較することができる。陰性対照の存在下での結合した参照抗体の量と比較して減少した候補抗体の存在下での結合した参照抗体の量は、候補抗体が参照抗体と競合したことを示す。便宜上、参照抗体を標識（例えば、蛍光的に）して、結合した参照抗体の検出を容易にすることができる。反復測定を、候補および／または参照抗体の連続希釈液を用いて実施することができる。
別の例において、ＭＡｂ１と、ＭＡｂ２またはＭＡｂ３との結合競合を、典型的には、プレート上でコーティングした組換えヒトＬＡＭＰ１を用いるＥＬＩＳＡ（実施例６．２に記載のような）により２つの抗ＬＡＭＰ１ ｍＡｂ間で測定することができる。簡単に言えば、典型的には、２つのｍＡｂを、例えば、０．０６および１５ｍｇ／Ｌの濃度で同時に添加したが、典型的には０．０６ｍｇ／Ｌの濃度がＥＣ５０に近い。２つのｍＡｂが異なるＦｃドメイン（ヒトまたはマウスのいずれか）を有するようにＭＡｂ形式を選択した。ｍＡｂ結合の個々の測定を、典型的には、Ｆｃへの（例えば、ペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−０３５−０９８）またはペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｂ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−１６４）との）そのユニークな特異的結合により実施することができた。その結果を、同じ濃度のｍＡｂのみから得られた値のパーセンテージとして報告した。
特に、本発明による抗体は、いわゆる抗ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３の１つの重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ配列を含む。より具体的には、抗体は、いわゆる抗体ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３およびＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３の１つの重軽鎖のＣＤＲ配列、または重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を含んでもよい。
従って、本発明の抗体は、
（ｉ）配列番号２の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号２と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号３と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号６の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号６と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳもしくは１個のアミノ酸置換によりＤＴＳと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列番号７の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号７と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉ）配列番号９の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号９と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号１０の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１０と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号１１の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１１と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号１３の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１３と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＡＡＳもしくは１個のアミノ酸置換によりＡＡＳと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列番号１４の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１４と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉｉ）配列番号４３の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４３と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号４４の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４４と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４５の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４５と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号４９の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４７と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＹＴＳもしくは１個のアミノ酸置換によりＹＴＳと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列番号４８もしくは配列番号５２の配列もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４８もしくは配列番号５２の配列と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ
を含んでもよい。
さらなる実施形態において、本発明による抗体は、いわゆる抗ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ４の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ配列を含む。より具体的には、抗体は、いわゆる抗ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ４の重軽鎖のＣＤＲ配列、または重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を含んでもよい。
従って、本発明の抗体は、配列番号８３の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号８４の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号８５の配列のＣＤＲ３−Ｈ、配列番号８６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＮＡＫのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号８７の配列のＣＤＲ３−Ｌを含んでもよい。
さらに、本発明の抗体は、配列番号９８の配列の重鎖および／もしくは配列番号９９の配列の軽鎖（すなわち、実施例１７．２．３に記載のＭＡｂ４の重鎖および／または軽鎖）を含むか、またはそれからなっていてもよい。
一実施形態において、この抗体は、キメラ、ヒト化、または抗体断片であってもよい。
本発明の抗体において、１つの個々のアミノ酸を、上記ＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上（特に、１つのみ）における、置換、特に、保存的置換により変化させることができる。そのような変化は、例えば、抗体のヒト化と関連する、グリコシル化部位または脱アミド化部位を除去することを意図してもよい。また、リシン側鎖残基による細胞傷害剤への共有結合は、ＡＤＣの場合、抗原への結合を阻害し得るため、別の変化は、ＣＤＲ中のリシンを除去することを意図することもできる。例えば、配列番号４８および配列番号５２は、その位置５において１つのアミノ酸置換により異なるＣＤＲ３−Ｌ配列である。
ある実施形態によれば、抗体は、
（ｉ）配列番号２の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４の配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉ）配列番号９の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号１０の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号１１の配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号１３の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＡＡＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号１４の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉｉ）配列番号４３の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号４４の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４５の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは
配列番号４７の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＹＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号４８もしくは配列番号５２の配列のＣＤＲ３−Ｌ
を含む。
特に、抗体は、
（ｉ）配列番号２の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号４の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは
配列番号６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉ）配列番号９の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号１０の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号１１の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは
配列番号１３の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＡＡＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号１４の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉｉ）配列番号４３の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号４４の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号４５の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは
配列番号４７の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＹＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号４８もしくは配列番号５２の配列のＣＤＲ３−Ｌ、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）に定義された抗体の断片
を含んでもよい。
本発明者らは、実施例７．３．１に記載のプロトコールに従って非グリコシル化ＬＡＭＰ１タンパク質との複合体中のループ１およびループ２に結合すると同定されたｈｕＭＡｂ１＿１に由来する組換えＦａｂを結晶化した。ＬＡＭＰ１との複合体中のｈｕＭａｂ１＿１の三次元構造の決定に基づいて、そのＣＤＲの多くを、上記のＡｌ−Ｌａｚｉｋｉｎｉ、ＬｅｓｋおよびＣｈｏｔｈｉａ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８頁で参照されたような特定の標準構造と関連付けることができる。結晶構造により、前記標準構造を阻害することなくＣＤＲ中に導入することができる変異を決定することができた。前記標準構造の阻害は、結合挙動の改変をもたらすことが当業者には公知である。かくして、彼らは、結晶構造を分析することにより、ＣＤＲ１−Ｌ中に位置する配列番号６８のＱ２７およびＤ２８を、ループが標準構造２Ｂを保持する限り任意のアミノ酸により置き換えることができ、配列番号６８のＩ２９を、等価な疎水性残基、例えば、ＬｅｕまたはＶａｌにより置き換えることができることを同定した。配列番号６８のＴ５１および配列番号６８のＳ５２は、両方ともＣＤＲ２−Ｌ中に位置し、このループが古典的なγ−ターンコンフォメーションを保持する限り、Ｔ５１の場合、Ｓｅｒにより、Ｓ５２の場合、任意のアミノ酸により置き換えることができる。ＣＤＲ３−Ｌ中に位置する、配列番号６８の残基Ｄ９２、Ｎ９３、Ｌ９４を、ループが標準構造λ１Ｂを保持する限り、任意のアミノ酸により置き換えることができる。さらに、ループが標準構造１を保持する限り、ＣＤＲ−１Ｈ中に位置する、配列番号６９のＧ２６を任意のアミノ酸により、ＣＤＲ−１Ｈ中に位置する、配列番号６９のＹ２７をフェニルアラニンにより、ＣＤＲ−１Ｈ中に位置する、配列番号６９のＴ３０を任意のアミノ酸により置き換えることができる。ＣＤＲ−３Ｈ中に位置する、配列番号６９の残基Ｄ１０２、Ｖ１０３およびＡ１０４を、類似するサイズおよび特性の任意のアミノ酸により置き換えることができる。
従って、本発明は、それぞれ、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ２の３つの領域に結合する抗体であって、
ａ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＲＹ（配列番号９３）（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌから選択される）からなるＣＤＲ１−Ｌ；ならびに
配列ＤＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１はＴもしくはＳから選択され、Ｘ２は任意のアミノ酸である）からなるＣＤＲ２−Ｌ；ならびに
配列ＬＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＴ（式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸である）からなるＣＤＲ３−Ｌ；ならびに／または
ｂ）配列Ｘ１Ｘ２ＩＦＸ３ＮＹＮ（配列番号８２）（式中、Ｘ１およびＸ３はそれぞれ任意のアミノ酸であり、Ｘ２はＴｙｒもしくはＰｈｅから選択される）からなるＣＤＲ１−Ｈ；ならびに配列番号３からなるＣＤＲ２−Ｈ；ならびに配列ＶＲＡＮＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＡＹ（配列番号８４）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ任意のアミノ酸である）からなるＣＤＲ３−Ｈ
を含む抗体を提供する。
一実施形態において、前記抗体は、ループ２に結合する能力を保持する。
当業者であれば、定義された抗体が、それぞれ配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４の配列からなるヒトＬＡＭＰ１のループ２の３つの領域に結合するその能力を保持するかどうかを検証する方法を知っており、かくして、標準構造の阻害に悩まされない。
本発明はまた、いわゆる抗ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３、ｈｕＭＡｂ１＿１およびｈｕＭＡｂ１＿２、ｈｕＭＡｂ１＿３、例えば、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３，ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３の１つの少なくとも重鎖の可変ドメインおよび／または軽鎖の可変ドメインをさらに含む上記で定義された抗体も提供する。
かくして、本発明は、特に、
（ｉ）配列番号１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｉｉ）配列番号８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号１２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｉｉｉ）配列番号１５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号１６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号４２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号４６もしくは配列番号５１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｖ）配列番号５３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｖｉ）配列番号５４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
（ｖｉｉ）配列番号５５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号５８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン
を含む抗体に関する。
一実施形態において、本発明は、
（ｉ）配列番号２の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは
配列番号６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉ）配列番号９の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号１０の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号１１の配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号１３の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＡＡＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号１４の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｉｉ）配列番号４３の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号４４の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４５の配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／もしくは
配列番号４７の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＹＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号４８もしくは配列番号５２の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
（ｉｖ）配列番号８３の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号８４の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号８５の配列のＣＤＲ３−Ｈ、ならびに／もしくは配列番号８６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＮＡＫのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号８７の配列のＣＤＲ３−Ｌ；もしくは配列番号６０の配列の重鎖もしくは配列番号５９の配列の軽鎖；または
（ｖ）配列番号６２の配列の重鎖もしくは配列番号６１の配列の軽鎖；または
（ｖｉ）配列番号６４の配列の重鎖もしくは配列番号６３の配列の軽鎖
を含む、単離された抗ＬＡＭＰ１抗体に関する。
例えば、重鎖または軽鎖の可変ドメインの配列は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換、特に、１つもしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換および／または標準的な残基を含む置換により、配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１、５３、５６、５４、５７、５５、５８の参照配列、例えば、必要に応じて、配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１と異なっていてもよい。
特に、重鎖または軽鎖の可変ドメインの配列は、保存的アミノ酸置換のみにより、配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１、５３、５６、５４、５７、５５、５８の参照配列、例えば、配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１と異なっていてもよい。
配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１、５３、５６、５４、５７、５５、５８の配列、例えば、配列番号１、５、８、１２、１５、１６、４２、４６または５１と比較した配列変化は、特に、本質的には１つまたはそれ以上のフレームワーク領域、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌおよび／またはＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈ中に存在する。
しかしながら、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中のアミノ酸置換も可能である。
本発明はまた、いわゆる抗ＬＡＭＰ１抗体ＭＡｂ４の１つの少なくとも重鎖の可変ドメインおよび／または軽鎖の可変ドメインをさらに含む、上記で定義された抗体も提供する。
かくして、本発明は、特に、配列番号８８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／または配列番号８９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体に関する。
本発明による抗体は、特に、従来の抗体、特に、従来のモノクローナル抗体、または抗体断片、二重特異的または多重特異的抗体である。
ある実施形態によれば、本発明による抗体は、ＩｇＧ、もしくはその断片を含むか、またはそれからなる。
本発明の抗体およびその断片は、それぞれ、マウス抗体およびマウス抗体の断片であってもよい。
抗体はまた、キメラ抗体であってもよく、特に、マウス／ヒト抗体、例えば、重鎖および軽鎖のマウス可変ドメインと、ヒト抗体に由来するＣＨドメインおよびＣＬドメインとを含む抗体であってもよい。抗体は、そのような抗体の断片であってもよい。
ある実施形態によれば、本発明の抗体は、
ａ）配列番号１７の配列の重鎖および／もしくは配列番号１８の配列の軽鎖（すなわち、実施例７に記載のｃｈＭＡｂ１の重鎖および／または軽鎖）を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体；または
ｂ）配列番号１９の配列の重鎖および／もしくは配列番号２０の配列の軽鎖（すなわち、実施例７に記載のｃｈＭＡｂ２の重鎖および／または軽鎖）を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体；または
ｃ）配列番号２１の配列の重鎖および／もしくは配列番号２２の配列の軽鎖（すなわち、実施例７に記載のｃｈＭＡｂ２Ｃａｎの重鎖および／または軽鎖）を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体；または
ｄ）配列番号４９の配列の重鎖および／もしくは配列番号５０の配列の軽鎖（すなわち、ｃｈＭＡｂ３の重鎖および／または軽鎖）を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体；または
ｅ）配列番号４９の配列の重鎖および／もしくは配列番号８１の配列の軽鎖（すなわち、ｃｈＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３の重鎖および／または軽鎖）を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体；または
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）に定義されたキメラ抗体の断片
である。
また、本発明の抗体は、ヒト化抗体であってもよい。かくして、ある実施形態によれば、本発明の抗体は、
ｉ）配列番号６０の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および／もしくは配列番号５９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例７．２に記載のｈｕＭＡｂ１＿１の重鎖および／もしくは軽鎖）；または
ｉｉ）配列番号６２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および／もしくは配列番号６１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例７．２に記載のｈｕＭＡｂ１＿２の重鎖および／もしくは軽鎖）；または
ｉｉｉ）配列番号６４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および／もしくは配列番号６３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例７．２に記載のｈｕＭＡｂ１＿３の重鎖および／もしくは軽鎖）
を含むか、またはそれからなる。
一実施形態において、本発明の抗体はヒト化抗体である。さらなる実施形態において、前記ヒト化抗体は、リサーフェシング技術により得られる。また、そのような抗体を、「リサーフェシングされた」抗体と呼ぶこともできる。
本発明による抗体はまた、単一ドメイン抗体またはその断片であってもよい。特に、単一ドメイン抗体断片は、上記の抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−ＨおよびＣＤＲ３−Ｈを含む可変重鎖（ＶＨＨ）からなっていてもよい。抗体はまた、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を含まない抗体であってもよく、ＣＨ１ドメインを含有しても、または含有しなくてもよい。
単一ドメイン抗体またはその断片はまた、ラクダ科動物単一ドメイン抗体のフレームワーク領域、および場合により、ラクダ科動物単一ドメイン抗体の定常ドメインを含んでもよい。
本発明による抗体はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディからなる群から選択される、抗体断片、特に、ヒト化抗体断片であってもよい。
抗体はまた、抗体断片から形成される二重特異的または多重特異的抗体であってもよく、少なくとも１つの抗体断片は、本発明による抗体断片である。多重特異的抗体は、例えば、ＥＰ２０５０７６４Ａ１またはＵＳ２００５／０００３４０３Ａ１に記載の多価タンパク質複合体である。
本発明による二重特異的または多重特異的抗体は、（ａ）いわゆるＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３抗体の１つにより標的化されるヒト／カニクイザルＬＡＭＰ１上の第１〜第３のループ、特に、第１の内腔ドメインおよび（ｂ）少なくとも１つの他の抗原に対する特異性を有してもよい。ある実施形態によれば、少なくとも１つの他の抗原は、ヒトまたはカニクイザルＬＡＭＰ１ファミリーメンバーではなく、特に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ２の少なくとも１つまたは全部ではない。別の実施形態によれば、少なくとも１つの他の抗原は、いわゆるＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２ＣａｎおよびＭＡｂ３抗体の１つにより標的化される前記第１〜第３のループ、特に、第１の内腔ドメイン以外のヒトカニクイザルＬＡＭＰ１上のエピトープであってもよい。
前記抗体を、当業界で周知の任意の技術により生成することができる。特に、前記抗体を、以後に記載の技術により生成する。
本発明による抗体およびその断片を、単離された（例えば、精製された）形態で用いるか、または膜もしくは脂質ベシクル（例えば、リポソーム）のようなベクター中に含有させることができる。
本発明の抗体は、上記特徴の任意の組合せを表してもよい。
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、上記で定義された本発明の抗体をコードする配列を含むか、またはそれからなる核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターのような任意の好適なベクター中に含むことができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入して、宿主を形質転換し、導入される配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを意味する。
従って、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
そのようなベクターは、対象への投与の際に前記ポリペプチドの発現を引き起こすか、または指令するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでもよい。動物細胞のための発現ベクターにおいて用いられるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーター（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：３２０７〜３９８６頁）、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｔ．およびＩｔｏｈ，Ｓ．ら、１９８７、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１（５）：１３０７〜１３１０頁）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ．ら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１４９：９６０〜９６８頁）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｏ．ら、１９８５、Ｃｅｌｌ ４１：４７９〜４８７頁）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３３：７１７〜７２８頁）などが挙げられる。
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し、発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ，Ｈ．ら、１９９０、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（２）：１３３〜１４０頁）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｔ．およびＩｔｏｈ，Ｓ．ら、１９８７、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１（５）：１３０７〜１３１０頁）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ，Ｇ．ら、１９８４、Ｇｅｎｅ ２７（２）：２２３〜２３２頁）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．ら、１９８１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７８（３）：１５２７〜１５３１頁）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ，Ｈ．ら、１９９０、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１７３〜１８０頁）などが挙げられる。
プラスミドの他の例としては、複製起点ｐＣＥＰ５を含む複製プラスミド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。そのような組換えウイルスを、パッケージング細胞にヘルパープラスミドまたはウイルスをトランスフェクトするか、または一過的にトランスフェクトすることのような、当業界で公知の技術により生成することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールを、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによりトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。
用語「形質転換」は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素を生成するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外因性）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
本発明の核酸を用いて、好適な発現系中で本発明の組換え抗体を生成させることができる。用語「発現系」は、例えば、ベクターにより担持され、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための好適な条件下での宿主細胞および適合可能なベクターを意味する。
一般的な発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されるものではないが、原核細胞（細菌のような）および真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などのような）が挙げられる。具体例としては、大腸菌、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）ならびに初代または確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成される）が挙げられる。また、例として、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（本明細書では以後「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ．ら、１９８０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７（７）：４２１６〜４２２０頁）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書では以後「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）なども挙げられる。キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性がＹＢ２／０細胞中で発現された場合に増強されるため、この細胞が対象となる。
特に、ヒト化抗体の発現のために、発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子とが別々のベクター上に存在する型または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（タンデム型）のいずれかであってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞への導入の容易性、および動物細胞中での抗体ＨおよびＬ鎖の発現レベル間の平衡の点では、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ、Ｋ．ら、１９９４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊａｎ．３：１６７（１−２）：２７１〜８頁）。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
本発明はまた、本発明による抗体を発現する組換え宿主細胞を生成する方法であって、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、上記の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞中に導入すること、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、得られた組換え宿主細胞を培養することならびに（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することからなる工程を含む方法に関する。
そのような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の生成のために用いることができる。
本発明の抗体を生成する方法
本発明の抗体を、限定されるものではないが、単独の、または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術のような当業界で公知の任意の技術により生成することができる。
所望の配列のアミノ酸配列を知れば、当業者であれば、ポリペプチドの生成のための標準的な技術により、前記抗体または免疫グロブリン鎖を容易に生成することができる。例えば、それらを、特に製造業者の説明書に従って市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより製造されたものなど）を使用する周知の固相方法を用いて合成することができる。あるいは、本発明の抗体および免疫グロブリン鎖を、当業界で周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、これらの断片を、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現ベクター中への組込みおよび所望のポリペプチドを発現する好適な真核または原核宿主中へのそのようなベクターの導入後にＤＮＡ発現生成物として取得した後、周知の技術を用いてそれらを単離することができる。
特に、本発明はさらに、（ｉ）本発明による形質転換された宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）本発明の抗体またはポリペプチドを発現させること；および（ｉｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することからなる工程を含む、前記抗体を生成する方法に関する。
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含むヒト化またはキメラ抗体を生成するための方法は、当業界で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．およびＯｉ，Ｖ．Ｔ．、１９８４、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２３９〜２５６頁ならびに特許文献ＵＳ５，２０２，２３８およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい）。
特定の実施形態において、本発明のキメラ抗体を、以前に記載されたマウスＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクター中にそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞中に発現ベクターを導入することによりコード配列を発現させることによって生成することができる。
別の特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体を、以前に記載されたヒト化ＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を取得し、それらを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクター中に挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞中に導入することによってコード配列を発現させることにより生成することができる。
ヒト化またはキメラ抗体のＣＨドメインとして、それはヒト免疫グロブリン重鎖に属する任意の領域であってもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようなＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つを用いることもできる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それはヒト免疫グロブリン軽鎖に属する任意の領域であってもよく、カッパクラスまたはラムダクラスのものを用いることができる。
例えば、特許出願ＷＯ２００９／０３２６６１に開示された技術、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ、Ｇ．Ｍ．ら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７（６）：８０５〜８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａ、Ｍ．Ａ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１（３）：９６９〜９７３頁）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）などの、当業界で公知の様々な技術を用いて、抗体をヒト化することができる。そのような抗体の製造のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照されたい）。
本発明の抗体は、例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどのような、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から好適に分離される。
本発明のＦａｂを、ＬＡＭＰ１と特異的に反応する抗体を、パパインのようなプロテアーゼで処理することにより取得することができる。また、Ｆａｂを、抗体のＦａｂの両方の鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核発現のための、または真核発現のためのベクター中に挿入し、このベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、Ｆａｂを発現させることにより生成することができる。
本発明のＦ（ａｂ’）２を、ＬＡＭＰ１と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンで処理することにより取得することができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により、以下に記載のＦａｂ’を結合することにより生成することができる。
本発明のＦａｂ’を、ＬＡＭＰ１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２をジチオトレイトールのような還元剤で処理することにより取得することができる。また、Ｆａｂ’を、抗体のＦａｂ’鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核発現のためのベクター、または真核発現のためのベクター中に挿入し、このベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、その発現を行うことにより生成することができる。
本発明のｓｃＦｖを、以前に記載のようにＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの配列を取得し、ｓｃＦｖ断片をコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核または真核発現ベクター中に挿入した後、発現ベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより生成することができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を作成するために、本発明による相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを既知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワーク上に移植することを含む、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を用いることができる（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。
ＬＡＭＰ１に対する一本鎖抗体またはＶＨＨを、例えば、（ａ）ＬＡＭＰ１に対する抗体（特に、重鎖抗体）を惹起するように、ラクダ科動物に属する哺乳動物をＬＡＭＰ１またはその断片で免疫する工程；（ｂ）かくして免疫されたラクダ科動物から、ＬＡＭＰ１に対する重鎖抗体配列および／またはＶＨＨ配列を含む生物試料を取得する工程；ならびに（ｃ）前記生物試料からＬＡＭＰ１に対する重鎖抗体配列および／またはＶＨＨ配列を回収する（例えば、単離する）工程を含む方法により取得することができる。また、好適な一本鎖抗体またはＶＨＨを、重鎖抗体配列および／または重鎖抗体配列のためのＶＨＨ配列および／または第１〜第３のループ、特に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質の第１の内腔ドメインへの結合について、いわゆる抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３、ｈｕＭＡｂ１＿１およびｈｕＭＡｂ１＿２、ｈｕＭＡｂ１＿３からなる群から選択される抗体、例えば、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｃａｎ、ＭＡｂ３の可変重鎖および軽鎖を含む抗体と競合するＶＨＨ配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって取得することもできる。
本発明の抗体の改変
本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。
本発明の抗体の構造、およびそれらをコードするＤＮＡ配列中で改変および変化を作製し、依然として望ましい特徴を有する機能的抗体またはポリペプチドを得ることができる。
ポリペプチドのアミノ酸配列中に変化を作製する際に、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。タンパク質に対して相互作用的生物機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当業界で一般的に理解される。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが受け入れられている。それぞれのアミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指標を割当てた。これらのものは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドの機能保存的バリアントも包含する。
例えば、ある特定のアミノ酸を、活性を感知できるほどに失わせることなくタンパク質構造中で他のアミノ酸により置換することができる。タンパク質の相互作用能力および性質はその生物機能的活性を規定するため、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列、勿論、そのＤＮＡコード配列中で行うことができるが、それにも拘わらず、同様の特性を有するタンパク質を取得することができる。かくして、本発明の抗体配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列中で、その生物活性を感知できるほどに失わせることなく様々な変化を作製することができることが企図される。
ある特定のアミノ酸を、類似するハイドロパシー指標またはスコアを有し、依然として類似する生物活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、依然として生物機能的に等価なタンパク質を取得する他のアミノ酸により置換することができることは当業界で公知である。また、本発明の抗体またはポリペプチド中の、抗原への結合を有意に失わせることなく置換することができる全てのアミノ酸を同定するために、アラニンスキャニング手法のようなよく確立された技術を使用することもできる。そのような残基は抗原結合または抗体の構造の維持に関与しないため、それを中性として定性化することができる。これらの中性位置の１つまたはそれ以上を、本発明の抗体またはポリペプチドの主特性を変化させることなく、アラニンまたは別のアミノ酸により置換することができる。
上記に概略したように、従って、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前記特徴のいくつかを考慮に入れる例示的置換は当業者には周知であり、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
また、例えば、抗体の抗原依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することも望ましい場合がある。これを、抗体のＦｃ領域中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。あるいは、またはさらに、システイン残基をＦｃ領域中に導入することによって、この領域中での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。かくして作成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介性細胞殺傷および／または抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有してもよい（Ｃａｒｏｎ、Ｐ．Ｃ．ら、１９９２、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６（４）：１１９１〜１１９５頁およびＳｈｏｐｅｓ Ｂ．、１９９２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（９）：２９１８〜２９２２頁）。
本発明の抗体の別の型のアミノ酸改変は、すなわち、抗体中に見出される１つもしくはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体中に存在しない１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を付加することにより、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させるのに有用であり得る。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、およびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列が１つまたはそれ以上の上記トリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を変化させる（Ｎ結合グリコシル化部位について）ことによって都合良く達成される。
リシン側鎖残基を介する細胞傷害剤への共有結合は、ＡＤＣの場合、抗原への結合を阻害し得るため、本発明の抗体の別の型の改変は、ＣＤＲ中の、またはＣＤＲに空間的に近いリシンを除去することであってもよい。
別の型の改変は、分解生成物または抗体製造物の不均質性を潜在的にもたらすとしてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、または実験的に同定される配列の除去を含む。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出のような因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、脱アミド化を特に受けやすく、Ａｓｎ−Ａｌａのような他のジペプチド配列中でのその程度はより低い。そのような脱アミド化部位、特に、Ａｓｎ−Ｇｌｙが本発明の抗体またはポリペプチド中に存在する場合、従って典型的には、関与した残基の１つを除去するための保存的置換により、その部位を除去することが望ましい場合がある。関与した残基の１つまたはそれ以上を除去するための配列中でのそのような置換もまた、本発明により包含されることが意図される。
別の型の共有改変は、抗体に化学的または酵素的にカップリングするグリコシドを含む。これらの手順は、それらがＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中での抗体の生成を必要としない点で有利である。用いられるカップリング様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去を、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体を無傷のままにしながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の多くの、または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ、Ｈ．ら（１９８７、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９（１）：５２〜５７頁）およびＥｄｇｅ、Ａ．Ｓ．ら（１９８１、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８（１）：１３１〜１３７頁）により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ、Ｎ．Ｒ．ら（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １３８：３５０〜３５９頁）により記載されたように様々なエンド−およびエキソ−グルコシダーゼの使用により達成することができる。
抗体の別の型の共有改変は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載の様式での、様々な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンへの抗体の連結を含む。
医薬組成物
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、薬学的に許容される賦形剤、および場合により、生分解性ポリマーのような持続放出マトリックスと組み合わせて、治療組成物を形成させることができる。
かくして、本発明の別の目的は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、薬剤としての使用のための、本発明によるポリペプチドまたはイムノコンジュゲートに関する。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて、哺乳動物、特に、ヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、任意の型の非毒性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を指す。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、処置しようとする状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに自然に依存する。
本発明の医薬組成物を、局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化することができる。
特に、医薬組成物は、注射することができる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらのものは、特に、等張性、無菌性の塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または場合により、滅菌水もしくは生理食塩水の添加時に、注射溶液の構成を許容する乾燥、特に、凍結乾燥組成物であってもよい。
投与に用いられる用量を、様々なパラメーターの関数として、特に、用いられる投与様式、関連する病理、あるいは、所望の処置期間の関数として適合させることができる。
医薬組成物を製造するために、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートの有効量を、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解するか、または分散させることができる。
注射的使用にとって好適な医薬形態としては、滅菌水性溶液または分散物；および滅菌注射溶液または分散物の即興の製造のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合、この形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度で流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定であり、細菌および菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散物の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤、安定化剤、凍結防止剤または酸化防止剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止を、抗細菌剤および抗真菌剤によりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙された他の成分のいくつかと共に組み入れた後、滅菌濾過を行うことにより、滅菌注射溶液を製造する。一般に、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒と、上記に列挙されたものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散物を製造する。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分の粉末と、予め滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分とを得る減圧乾燥および凍結乾燥技術である。
製剤化の際に、投与量製剤と適合する様式で、および治療上有効であるような量で溶液を投与する。製剤は、上記の注射溶液の型のような様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
水性溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝化させ、液体希釈剤を最初に十分な塩水またはグルコースで等張性にするべきである。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとって特に好適である。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すると当業者には公知である。例えば、１つの投与量を、等張性ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解し、皮下注入液１０００ｍＬに添加するか、または提唱される輸注部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。投与量のいくらかの変動が処置される対象の状態に応じて必ず生じる。投与を担う人が、いずれにせよ、個々の対象のための適切な用量を決定する。
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、用量当たり約０．０１〜１００ミリグラムを含むように治療混合物内で製剤化することができる。
治療方法および使用
本発明者らは、ＬＡＭＰ１の第１〜第３のループに対する、特に、ＬＡＭＰ１の第１の内腔ドメインに対する抗体、特に、ＭＡｂ１およびＭＡｂ２およびＭＡｂ３が、おそらくコーティングされたピットにより結合および蓄積した後にＬＡＭＰ１受容体−抗体複合体を活発に内在化させることができることを示した。内在化された抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は初期エンドソームに局在化した後、輸送され、リソソーム区画中に蓄積した。
ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍマルチスペクトルイメージングフローサイトメーター（Ａｍｎｉｓ ｃｏｒｐ．）は、内在化された抗体がリソソーム区画中に蓄積することを示す。４℃でＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３と共にインキュベートした生存可能なＣｏｌｏ２０５細胞の免疫蛍光分析により、異なる細胞質膜染色が示された。３７℃でのＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３との細胞のインキュベーションにより、インキュベーションの４時間後に細胞質膜と細胞内ベシクルの両方の標識が示された。細胞内部の蛍光（３７℃で測定）を示す内在化スコア（ＩＳ）は細胞表面での蛍光（４℃で測定）よりも１０倍高いため、これは、ＬＡＭＰ１タンパク質が細胞膜で迅速に再循環していることを意味する。総合すると、本発明者らの結果は、ＬＡＭＰ１が抗体の内在化を媒介する受容体として機能し得ることを初めて示し、特定の内在化抗体の可用性が、がん細胞の内部に特異的に送達される毒素、薬物または短距離同位体を標的化するための新規治療方法を開発するのに役立つはずであることを示唆するものである。
さらに、本発明者らは、本発明による抗体が、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と共に、ゲノムＤＮＡ中にＬＡＭＰ１をコードするＤＮＡ配列の安定な組込みを含有するヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞またはＨＥＫ２９３細胞であって、個々のクローンが細胞表面上で異なる強度のＬＡＭＰ１を提示する前記細胞上、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を誘導することを示した。
別の実施例９．４において、本発明者らは、本発明による抗体が、細胞傷害性トママイシン二量体と共に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を誘導することを示した。本発明者らはまた、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と組み合わせた抗体が、実施例１０．１．１に記載のように、腫瘍埋め込み後１７日目での単回注射で１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト結腸腺癌異種移植片のマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
さらに、本発明者らはまた、このイムノコンジュゲートが、実施例１０．１．２に記載のように腫瘍埋め込み後２６日目での単回注射で１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト肺腫瘍異種移植片のマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
本発明者らはまた、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３のイムノコンジュゲートが、実施例１０．２〜１０．４に示されるように、様々ながん異種移植片モデルの様々なマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
例えば、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、実施例１０．２．２および１０．２．３に記載のように、単回注射で１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト浸潤性腺管癌異種移植片および原発性ヒト肺腫瘍異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することが示された。
また、イムノコンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３も、実施例１０．３．２および１０．４に記載のように、単回注射で、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来する原発性ヒト浸潤性腺管癌異種移植片において顕著な抗腫瘍活性を誘導する。
かくして、本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲート、または医薬組成物は、がんを処置するのに有用であり得る。
本発明はさらに、がん細胞中にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある患者におけるがんを処置するための使用のための抗ＬＡＭＰ１治療剤に関する。
ある実施形態において、がん細胞中にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある前記患者を、本発明によるがんを有する患者を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって選択した。特に、その使用は、本発明によるがんを有する患者を選択する方法によってがん細胞中にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある前記患者を選択することを含む。
本発明はまた、
ａ）本発明によるがんを有する患者を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法により抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いがんを有する患者を選択すること；および
ｂ）前記選択された患者に抗ＬＡＭＰ１療法を投与すること
を含む、がんを有する患者を処置する方法に関する。
本発明はさらに、抗ＬＡＭＰ１療法のためにがんを有する患者を選択する方法であって、
（ａ）がん細胞を含むがんを有する患者の生物試料中で、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加があるかどうかを決定すること；および
（ｂ）前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある場合、前記患者に、抗ＬＡＭＰ１療法を投与すること
を含む、方法に関する。
本発明はまた、患者におけるがんを処置する方法であって、
（ａ）がん細胞を含むがんを有する患者の生物試料中で、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加があるかどうかを決定すること；および
（ｂ）前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある場合、前記患者に抗ＬＡＭＰ１療法を投与すること
を含む、方法に関する。
本発明の抗体、イムノコンジュゲート、または医薬組成物を用いて処置されるがんは、細胞表面上でＬＡＭＰ１を発現する、特に、同じ組織源の正常（すなわち、非腫瘍）細胞と比較して細胞表面上でＬＡＭＰ１を過剰発現するがんである。
がん細胞によるＬＡＭＰ１の発現を、例えば、以下のセクション「診断的使用」に記載のような、本発明による抗体を用いることにより、特に、例えば、実施例５に記載のような免疫組織化学的方法により容易にアッセイすることができる。
特に、がんは結腸腺癌であってもよいが、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓、胃および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍であってもよく、例えば、がんは、結腸腺癌、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭または軟部組織腫瘍からなる群から選択される。
一実施形態において、消化管腫瘍は、小腸腫瘍、直腸腫瘍および／または耳下腺腫瘍である。
一実施形態において、生殖器腫瘍、消化管腫瘍は、肺腫瘍、肝腫瘍、膵腫瘍、胃腫瘍および腎腫瘍である。
一実施形態において、生殖器腫瘍は、乳房腫瘍、卵巣腫瘍または前立腺腫瘍である。
本発明によるマウス抗ヒトＬＡＭＰ１抗体を用いる免疫組織化学分析によるヒト腫瘍のパネルのスクリーニングにより、実施例５にさらに詳細に記載されるように、これらの型のがんにおける抗体染色が実際に示された。
特に、ＬＡＭＰ１を発現するヒト腫瘍細胞を、結腸、胃、直腸、肺扁平上皮癌、浸潤性乳管癌および浸潤性小葉癌および前立腺癌細胞からなる群から選択することができる。これらの腫瘍は実際、細胞膜でのＬＡＭＰ１発現について陽性である５０％を超える細胞を示すことがわかった（実施例５を参照されたい）。
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、単独で、または任意の好適な増殖阻害剤と組み合わせて用いることができる。
本発明の抗体を、以前に記載されたような増殖阻害剤、細胞傷害剤、またはプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートまたは連結することができる。本発明の抗体は、前記増殖阻害剤、細胞傷害剤、またはプロドラッグを、表面上にＬＡＭＰ１を発現するか、または過剰発現するがん性細胞に標的化するのに実際に有用であってもよい。
また、治療的モノクローナル抗体は、該抗体により特異的に認識される抗原を担持する細胞の枯渇をもたらし得ることも周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機構：抗体媒介性細胞性細胞傷害性、補体依存的溶解、および抗体により標的化される抗原を介して与えられるシグナルによる腫瘍増殖の直接的抗腫瘍阻害によって媒介され得る。
「補体依存的細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分の、その同族抗原に結合した抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７）に記載のようなＣＤＣアッセイを実施することができる。
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌抗体が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて標的細胞を殺傷することができるようにする細胞傷害性の形態を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載のもののようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣアッセイも企図された。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）により記載された命名法に従うＤ２６５Ａ変異のような特定の変異は、Ｆｃ ＲおよびＡＤＣＣへの結合を有意に低下させることが当業者には公知である（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９６３〜４９６９頁、１９９６；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（１）：６５９１〜６６０４頁、２００１）。
一例において、ｈｕＩｇＧ１中の、例えば、配列番号５６の２６６Ａの変異は、上記のＤ２６５Ａ変異に対応し、かくして、Ｆｃ ＲおよびＡＤＣＣへの結合を有意に低下させる。
かくして、本発明の目的は、治療上有効量の本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置するための方法に関する。
「抗体依存的細胞食作用」または「ＡＤＣＰ」とは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、マクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した抗体が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を担持する標的細胞に特異的に結合させ、続いて、食作用により標的細胞を殺傷することができる細胞傷害性の形態を指す。対象の分子のＡＤＣＰ活性を評価するために、ＭｃＥａｒｃｈｅｍら、２００７、Ｂｌｏｏｄ １０９：１１８５頁に記載のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＰアッセイ。
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「処置すること」または「処置」は、そのような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の１つもしくはそれ以上の症状の進行を逆転させること、軽減すること、阻害すること、またはそれを防止することを意味する。本明細書で用いられる用語「がんを処置すること」は、腫瘍の悪性細胞の増殖および／または前記腫瘍からの転移の進行の阻害を意味する。そのような処置はまた、腫瘍増殖の退縮、すなわち、測定可能な腫瘍サイズの減少ももたらし得る。特に、そのような処置は、腫瘍または転移の完全な退縮をもたらす。
本発明によれば、用語「患者」または「それを必要とする患者」は、悪性腫瘍に罹患したか、または罹患する可能性があるヒトまたは非ヒト哺乳動物を意図する。特に、前記患者は、ＬＡＭＰ１を標的とする治療剤、特に、本発明による、例えば、以下に記載の方法による抗体またはイムノコンジュゲートに対して感受性であると決定された患者であってもよい。
上記で開示されたように、「抗ＬＡＭＰ１療法」は、ＬＡＭＰ１を標的化する治療剤を含む療法である。本発明によれば、用語「ＬＡＭＰ１を標的化する治療剤」または「抗ＬＡＭＰ１治療剤」は、ＬＡＭＰ１に結合し、細胞傷害活性および／または細胞増殖抑制活性を有する薬剤を記載する。
本明細書で用いられる用語「結合剤」とは、ＬＡＭＰ１に対する特異的結合活性を示す分子を指す。そのような結合分子は、例えば、高分子および小有機分子などの、様々な異なる型の分子を含んでもよい。小分子結合剤は、例えば、受容体リガンド、アンタゴニストおよびアゴニストを含んでもよい。高分子は、例えば、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ポリペプチド結合剤をコードする核酸、レクチン、炭水化物および脂質を含んでもよい。この用語は、結合機能が保持される限り、薬剤の断片およびドメインを含むことが理解される。同様に、結合活性が維持される限り、ドメインの境界は重要ではない。結合剤がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である特定の例において、そのような結合タンパク質は、単量体または多量体種を含んでもよい。異種結合タンパク質は、多量体結合タンパク質の具体例である。多量体結合タンパク質を言う場合、この用語は、ポリペプチドの集合および集合した複合体の結合機能が保持される限り、サブユニットの断片を含むことが理解される。異種結合タンパク質としては、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ポーションのような抗体およびその断片が挙げられる。
ある実施形態によれば、抗ＬＡＭＰ１治療剤は、抗ＬＡＭＰ１抗体または抗ＬＡＭＰ１抗体と少なくとも１つの増殖阻害剤とを含むイムノコンジュゲートである。
本発明のポリペプチドの「治療上有効量」とは、任意の医学的処置に適用可能な合理的なリスク／ベネフィット比で、前記がん疾患を処置するためのポリペプチドの十分な量を意味する。しかしながら、本発明のポリペプチドおよび組成物の１日当たりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療上有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；用いられる特定のポリペプチドの活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；用いられる特定のポリペプチドの投与の時間、投与経路、および排出の速度；処置の持続期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて用いられる、またはそれと同時に存在する薬物；ならびに医学業界において周知の同様の因子などの様々な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまでその投与量を徐々に増加させることは、当業者には周知である。本発明の別の目的は、悪性腫瘍の処置における使用のための本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。
特に、ポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物を、悪性腫瘍の転移の進行を阻害するために用いることができる。
本発明のポリペプチドを、悪性腫瘍を処置するため（例えば、アジュバント療法）、および／または転移性腫瘍の増殖を減少させるための任意の他の治療戦略と組み合わせて用いることができる。
本発明による抗体またはイムノコンジュゲートを用いる処置の効能を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、がんのマウスモデル上で、および例えば、実施例１０に定義されるような処置群と対照群との間の腫瘍体積の変化、腫瘍退縮、部分的退縮および／または完全な退縮（％）を測定することにより、容易にアッセイすることができる。
一実施形態において、抗体は、上記の「抗体」のセクションでさらに記載されたように、ヒトＬＡＭＰ１に特異的に結合し、非腫瘍組織から腫瘍組織を識別する、本出願人により開発された抗ＬＡＭＰ１抗体（いわゆる抗体「ＭＡｂ１」、「ＭＡｂ２」、「ＭＡｂ３」、ｈｕＭＡｂ１＿１およびｈｕＭＡｂ１＿２、ｈｕＭＡｂ１＿３）の１つである。
診断的使用
本発明による抗体は、いくらかのＬＡＭＰ１発現が非腫瘍細胞の膜で生じるが、胃上皮細胞、食道上皮細胞、乳房上皮細胞、前立腺上皮細胞、精巣上皮細胞およびほんの数種の細胞に限定されることを示した。それにも拘わらず、非腫瘍試料の膜でのＬＡＭＰ１発現の罹患率および平均強度は、腫瘍中に認められるものよりも低かった。
その代わりに、ＬＡＭＰ１は、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、胃、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍を含む結腸腺癌、例えば、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍以外にも様々な癌腫の表面に高度に発現される。従って、ＬＡＭＰ１は、ある特定のがんのマーカーであり、従って、抗がん療法の有効性または疾患の再発の検出を示すために用いられる能力を有する。
特に、ＬＡＭＰ１は、結腸、直腸、肺扁平上皮癌、胃、浸潤性乳管癌および浸潤性小葉癌および前立腺癌細胞、より特には、結腸、直腸、肺扁平上皮癌、浸潤性乳管癌および浸潤性小葉癌および前立腺癌細胞からなる群から選択される癌腫の表面に高度に発現される。
「抗体」の章で上述した通り、本発明者らは、細胞外で発現されたＬＡＭＰ１を検出し、かくして、凍結ＯＣＴ（最適切削温度の）標本およびＡＦＡ（アルコールホルマリン酢酸固定）上でのＩＨＣ分析を実施することを初めて可能にする抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３およびＦＦＰＥ形式でのＬＡＭＰ１強化を可能にし、かくして、非がん組織からがん組織を識別するのを可能にするＭＡｂ４を開発した。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、治療剤に対する患者の感受性を決定するため、抗がん療法の有効性をモニタリングするため、または処置後の疾患の再発を検出するために、ＬＡＭＰ１発現腫瘍を標的とする療法の文脈におけるアッセイの成分として用いられる。特に、本発明の同じ抗体は、治療剤の成分および診断アッセイの成分の両方として用いられる。
かくして、本発明のさらなる目的は、対象におけるＬＡＭＰ１発現をｉｎ ｖｉｖｏで検出するための使用のため、または対象の生物試料中でのＬＡＭＰ１発現をｅｘ ｖｉｖｏで検出するための使用のための本発明による抗体に関する。前記検出は、特に、腫瘍細胞上での表面タンパク質ＬＡＭＰ１の発現を検出することにより、
ａ）対象におけるがんの存在を診断すること、または
ｂ）ＬＡＭＰ１を標的とする治療剤、特に、本発明によるイムノコンジュゲートに対する、がんを有する患者の感受性を決定すること、または
ｃ）抗ＬＡＭＰ１がん療法の有効性をモニタリングすること、もしくは抗ＬＡＭＰ１がん療法、特に、本発明によるイムノコンジュゲートを用いる療法後のがんの再発を検出すること
を意図してもよい。
ある実施形態において、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用を意図される。例えば、ＬＡＭＰ１を、本発明の抗体を用いて、対象から得られた生物試料中、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出することができる。本発明による使用はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用であってもよい。例えば、本発明による抗体を、対象に投与し、抗体−細胞複合体を検出および／または定量し、それによって前記複合体の検出ががんを示す。
本発明はさらに、対象におけるがんの存在を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、抗体が前記生物試料との複合体を形成するのに十分な条件で接触させること、
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを対照と比較することによってがんの存在を検出し、対照と比較した結合した抗体のレベルの増加ががんを示すこと
からなる工程を含む方法に関する。
本発明はまた、ＬＡＭＰ１を標的とする治療剤、特に、本発明によるイムノコンジュゲートに対する、がんを有する患者の感受性を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）がんを有する患者の生物試料を、本発明による抗体と、特に、抗体が前記生物試料との複合体を形成するのに十分な条件で接触させること、
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）前記生物試料に結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること、
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加が、患者がＬＡＭＰ１を標的とする治療剤に感受性であることを示す方法に関する。
上記方法において、前記対照は、同じ型の正常な、非がん性、生物試料、または同じ型の正常な生物試料中での抗体結合レベルを表すとして決定された参照値であってもよい。ある実施形態において、本発明の抗体は、結腸腺癌、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍のような、ＬＡＭＰ１を発現するがんを診断するのに有用である。
本発明はさらに、抗ＬＡＭＰ１がん療法の有効性をモニタリングするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）抗ＬＡＭＰ１がん療法を受けている対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、該抗体が前記生物試料と複合体を形成するのに十分な条件で接触させること、
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの低下が、前記抗ＬＡＭＰ１がん療法の有効性を示す方法に関する。
前記方法において、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加は、前記抗ＬＡＭＰ１がん療法の無効性を示す。
前記対照は、特に、分析にかけられた生物試料と同じ型の生物試料であるが、抗ＬＡＭＰ１がん療法の経過中に、時間において以前に対象から得られた生物試料である。
本発明はさらに、抗ＬＡＭＰ１がん療法後のがんの再発を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）抗ＬＡＭＰ１がん療法を完了した対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、該抗体が前記生物試料と複合体を形成するのに十分な条件で接触させること、
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること、
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加が、抗ＬＡＭＰ１がん療法後のがんの再発を示す方法に関する。
前記対照は、特に、分析にかけられた生物試料と同じ型の生物試料であるが、抗ＬＡＭＰ１がん療法の完了時に、またはその後に、時間において以前に対象から得られた生物試料である。
前記抗ＬＡＭＰ１がん療法は、特に、本発明による抗体またはイムノコンジュゲートを用いる療法である。前記抗ＬＡＭＰ１がん療法は、ＬＡＭＰ１を発現するがん、特に、結腸腺癌、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓、胃および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍を標的とする。
ある実施形態において、本発明の抗体を、蛍光分子、放射性分子またはシグナルを提供する（直接的もしくは間接的に）当業界で公知の任意の他の標識のような、検出可能な分子または物質で標識することができる。
本発明による抗体に関する、本明細書で用いられる用語「標識された」とは、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはフィコエリトリン（ＰＥ）もしくはインドシアニン（Ｃｙ５））のような検出可能物質をポリペプチドにカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識化、ならびに検出可能物質との反応性によるポリペプチドの間接的標識化を包含することが意図される。
本発明の抗体を、当業界で公知の任意の方法によって放射性分子で標識することができる。例えば、放射性分子としては、限定されるものではないが、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｔｃ９９のようなシンチグラフィー試験のための放射性原子、およびＺｒ８９、Ｉ１２４、Ｇａ６８またはＣｕ６４のようなポジトロン放出断層撮影のための同位体が挙げられる。
「生物試料」は、対象から得られる様々な試料の型を包含し、診断またはモニタリングアッセイにおいて用いることができる。生物試料としては、限定されるものではないが、血液および生物起源の他の液体試料、生検標本のような固形組織試料または組織培養物もしくはそれから誘導される細胞、およびその子孫が挙げられる。従って、生物試料は、臨床試料、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織試料、特に、腫瘍試料を包含する。
特に、生物組織を、凍結ＯＣＴ（最適切削温度）またはＡＦＡ（酢酸ホルマリンアルコール）試料として製造することができる。実際、本発明による抗体は、組織試料を収集、保管するために病院で用いられる形式であるＡＦＡ試料上で有利に用いることができる。
前記生物試料に結合した抗体のレベルの測定または決定を、例えば、ＦＡＣＳまたはＩＨＣのような当業界で公知の任意の好適な方法によって実施することができる。
本発明はまた、
ａ）検出可能に標識された本発明による抗体を患者に投与すること、
ｂ）画像化によって患者における前記検出可能に標識された抗体の局在化を検出すること
からなる工程を含む、対象におけるがんの存在を検出するｉｎ ｖｉｖｏでの方法に関する。
本発明の抗体は、がんの段階評価（例えば、放射性イメージングにおける）にとって有用であってよい。それらを単独で、または他のがんマーカーと組み合わせて用いることができる。
本明細書で用いられる用語「検出」または「検出された」は、対照に対する参照を用いるか、または用いない定性的および／または定量的検出（レベルの測定）を含む。
本発明の内容において、本明細書で用いられる用語「診断すること」は、いくつかの収集されたデータから対象に影響する病理を同定することを意図される医学的状態の性質の決定を意味する。
前記方法において、がんは、ＬＡＭＰ１を発現するがん、特に、結腸腺癌、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、膵臓および腎臓）、生殖器腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍である。
がんを有する患者を選択する方法
本発明は、がんを有する患者を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）がん細胞を含むがんを有する患者の生物試料中で、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加があるかどうかを決定すること；および
ｂ）ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加の存在に基づいて患者を選択すること
を含む方法に関する。
ある実施形態において、前記方法は、抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いがんを有する患者を選択するためのものであり、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある場合、抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いとして前記患者は選択される。腫瘍細胞の表面でのＬＡＭＰ１の発現または過剰発現はＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加以外の原因を有し得るため、前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がない場合、それにも拘わらず患者を、例えば、ＬＡＭＰ１の細胞表面発現の検出に基づいて抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いとして選択することができる。
ＬＡＭＰ１遺伝子増加は、限局性体細胞増加または増幅、１３ｑ上の体細胞大領域増加または増幅、体細胞染色体複製、体細胞染色体３倍性または倍数性と関連し得る。ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加または増幅は、より大きいアンプリコン中に含まれる。本明細書で用いられる用語「アンプリコン」とは、複数の線状コピーを形成するゲノムのセグメントを指す。本発明によれば、ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加をもたらすコピー数変化を受け得るアンプリコンを、本明細書ではＬＡＭＰ１アンプリコンと呼ぶ。
前記「ＬＡＭＰ１増幅」は、３７８ｋｂ〜３４．２ＭＢの間で測定することができる。前記「ＬＡＭＰ１増加」は、５２３ｋｂ〜９５．８ＭＢの間で測定することができるＤＮＡ領域を含む。
一実施形態において、ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加を、ヒト第１３染色体（ＮＣ＿００００１３）上で塩基１１３７８５３８７〜塩基１１４２４０３１４の少なくとも４５４ｋｂを含む結腸ＰＤＸ中のＬＡＭＰ１アンプリコンのＣＮＶにより表すことができる。前記最小ＬＡＭＰ１アンプリコンは、ＬＡＭＰ１以外の他の遺伝子、例えば、遺伝子ＡＤＰＲＨＬ１、ＣＵＬ４Ａ、ＤＣＵＮＩＤ２、ＧＲＴＰ１、ＬＡＭＰ１、ＬＯＣ１００１３０４６３、ＰＣＩＤ２、ＰＲＯ７、ＴＦＤＰ１、ＴＭＣＯ３およびＦ１０を含有する。
別の実施形態において、前記ＬＡＭＰ１アンプリコンは、少なくとも遺伝子：ＡＤＰＲＨＬ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＡＴＰ４Ｂ、ＣＵＬ４Ａ、ＤＣＵＮ１Ｄ２、Ｆ１０、Ｆ７、ＦＡＭ７０Ｂ、ＦＬＪ４１４８４、ＦＬＪ４４０５４、ＧＡＳ６、ＧＲＫ１、ＧＲＴＰ１、ＬＡＭＰ１、ＬＩＮＣ００５５２、ＬＯＣ１００１２８４３０、ＬＯＣ１００１３０４６３、ＬＯＣ１００５０６０６３、ＬＯＣ１００５０６３９４、ＭＣＦ２Ｌ、ＭＣＦ２Ｌ−ＡＳ１、ＰＣＩＤ２、ＰＲＯＺ、ＲＡＳＡ３、ＴＦＤＰ１およびＴＭＣＯ３Ｃ１３ｏｒｆ３５を含む。
さらなる実施形態において、ＬＡＭＰ１アンプリコンは、ヒト第１３染色体（ＮＣ＿００００１３）上の塩基１９，２９６，５４４〜塩基１１５，１０７，２４５の９５．８Ｍｂを含む。
本発明の文脈において、ヌクレオチドの位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列（Ｂｕｉｌｄ３７、Ｆｅｂ ２００９）に従って示される。ゲノム配列は個体間で変化してもよいことが当業者には公知である。従って、ＬＡＭＰ１アンプリコンに関して本明細書で定義される位置は、用いられるヒトゲノム配列に従ってわずかに変化してもよい。しかしながら、ゲノム配列およびヌクレオチド位置を比較するための方法は、当業者には周知である。
当業者には周知である生物試料中のＬＡＭＰ１遺伝子コピー数変化の存在を決定を可能にする多数の方法が存在する。これらの方法としては、限定されることなく、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、マトリックス−ＣＧＨ、アレイ−ＣＧＨ、オリゴヌクレオチドアレイ、リプリゼンテーショナルオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＲＯＭＡ）、ＳＮＰ遺伝子型決定のためのハイスループット技術、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップのようなマーカー配列に特異的なＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション方法、および定量的ＰＣＲのような増幅方法が挙げられる。
特に、前記マーカーＬＡＭＰ１遺伝子コピー数変化の存在は、増幅によるか、またはＬＡＭＰ１遺伝子もしくはＬＡＭＰ１アンプリコン中に含まれる遺伝子に特異的なＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより決定される。ある実施形態において、本発明の方法は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、新世代配列決定（ＮＧＳ）および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実行される。
従って、本発明は、ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がＦＩＳＨ、ＣＧＨ、ＮＧＳおよび／またはＰＣＲからなる群から選択される方法を用いて決定される方法に関する。
定量的ＰＣＲの方法は当業界で周知であり、リアルタイムＰＣＲ、競合的ＰＣＲおよび放射性ＰＣＲを含む。例えば、ＤＮＡコピー数を数えるための定量的ＰＣＴ法が、米国特許第６，１８０，３４９号に記載されている。
本明細書で用いられる用語「プライマー」とは、標的配列にアニーリングし、前記標的配列と相補的であるプライマー伸長生成物の増幅にとって好適な条件下でのＤＮＡ合成の開始点として役立つことができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、典型的には、増幅における最大効率のために一本鎖である。特に、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの長さは、温度およびプライマーの配列などのいくつかの因子に依存するが、増幅生成物の合成を開始するのに十分に長いものでなければならない。ある実施形態において、プライマーは、１５〜３５ヌクレオチドの長さである。プライマーは、増幅された生成物の検出、固定、または操作を可能にするさらなる特徴をさらに含んでもよい。プライマーは、プライマーおよび標的配列または蛍光特性を変化させるために二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡと相互作用することができる非共有結合蛍光染料からなるハイブリッドに対して特定の蛍光特性を付与する、共有結合蛍光染料をさらに含んでもよい。用いることができる蛍光染料は、例えば、ＳＹＢＲ−グリーンまたは臭化エチジウムである。
本明細書で用いられる「プライマーの対」または「プライマー対」とは、ＰＣＲ増幅のようなＤＮＡ増幅の業界で一般的に用いられるような１つのフォワードおよび１つのリバースプライマーを指す。
本明細書で用いられる場合、「プローブ」とは、核酸の相補鎖に塩基特異的様式で結合することができるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、検出可能な部分で標識することができる。様々な標識部分が当業界で公知である。前記部分は、例えば、放射性化合物、検出可能な酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））または熱量測定、蛍光、化学発光もしくは電気化学発光シグナルのような検出可能なシグナルを生成することができる任意の他の部分であってもよい。検出可能な部分を、公知の方法を用いて検出することができる。プローブは、約５〜１００ヌクレオチド、例えば、約１０〜５０ヌクレオチド、または約２０〜４０ヌクレオチドの長さで変化してもよい。ある実施形態において、プローブは３３ヌクレオチドを含む。
用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」とは、当業者には公知であるように、好適な条件下、すなわち、ストリンジェントな条件下での、特定のヌクレオチド配列へのある核酸分子の結合を指す。
本明細書で用いられる用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、所定のレベルの相補性を有する核酸間での結合対を生成するのに好適であるが、前記所定のレベルより低い相補性を示す核酸間での結合対の形成にとっては好適ではない条件に対応する。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションと洗浄条件との両方の組合せであり、配列依存的である。これらの条件は、当業者には公知の方法に従って改変することができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２ 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一般に、高ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように、例えば、完全に塩基対形成した二重鎖のＴｍに近い温度となるように選択される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９９、５４頁）。ハイブリダイゼーション手順は当業界で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．、Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．（編）（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖ．Ｂ． Ｃｈａｎｄａ（シリーズ編）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに記載されている。
高ストリンジェンシー条件は、典型的には、５ｘＳＳＣ／５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ液／１．０％ＳＤＳ中、約５０℃〜約６８℃でのハイブリダイズ、および０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約６０℃〜約６８℃での洗浄を含む。
一実施形態において、本発明は、がん細胞中での平均ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数が２．５以上である方法に関する。特に、がん細胞中での平均ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数は、２．５以上かつ５未満であってもよい。
一実施形態において、本発明は、がん細胞中での平均ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数が５以上である方法に関する。
本発明の方法は、ＬＡＭＰ１が患者のがん細胞の表面で発現されるかどうかを決定することをさらに含んでもよく、ｉ）前記患者にＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加がある場合、および患者の前記がん細胞がその表面にＬＡＭＰ１を発現する場合、前記患者は抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が高いとして選択されるか、またはｉｉ）患者の前記がん細胞がその表面にＬＡＭＰ１を発現しない場合、前記患者は抗ＬＡＭＰ１療法に応答する可能性が低いとして選択される。
ＬＡＭＰ１が、がん細胞の表面に発現されるか、または同じ組織起源の正常細胞（すなわち、非腫瘍細胞）と比較して過剰発現されるかどうかを決定することを可能にする多数の方法が存在し、これらは当業者には周知である。これらの方法としては、例えば、限定されることなく、ＩＨＣ、ウェスタンブロット（ＷＢ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光（ＩＦ）、免疫沈降（ＩＰ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
ある実施形態において、ＬＡＭＰ１ががん細胞の表面に発現されるか、または過剰発現されるかどうかを決定するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）が用いられる。
がん細胞によるＬＡＭＰ１の発現を、例えば、実施例３に記載の抗ＬＡＭＰ１抗体を用いることによって容易にアッセイすることができる。
本発明者らは、ＬＡＭＰ１増加が、結腸直腸腺癌、胃、肝臓、肺（腺癌および扁平上皮）、乳房（基底、ＢＲＣＡ、ＬＵＭＡ、ＬＵＭＢおよびＨＥＲ２）、卵巣、頭頸部、腎臓（腎臓嫌色素性、腎明細胞癌、腎乳頭）、細胞癌腫、子宮頸部扁平上皮細胞、膵臓、前立腺、膀胱尿路上皮、グリオーマ（低悪性度グリオーマおよび多形成膠芽腫）、子宮、甲状腺、白血病、リンパ腫、食道、黒色腫および軟部組織肉腫を含む２８の腫瘍型において検出されることを示した。高い増加または増幅は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、グリア芽腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、グリオーマ、卵巣がん、胃がんおよび子宮がんにおいて検出される。
従って、本発明の方法のある実施形態において、患者は、結腸直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、グリオーマ、膀胱がん、甲状腺がんならびに白血病、リンパ腫、食道がん、黒色腫および軟部肉腫からなる群から選択されるがん、例えば、結腸直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、頭頸部がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、グリオーマ、膀胱がん、甲状腺がんならびに白血病、リンパ腫、食道がん、黒色腫および軟部肉腫を有している。
さらなる実施形態において、患者は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、グリア芽腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、グリオーマ、卵巣がん、胃がん、および子宮がんからなる群から選択されるがん；または特に、子宮頸がん、結腸直腸がん、グリア芽腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、グリオーマ、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、および子宮がんからなる群から選択されるがん；またはさらにより特には、結腸がんおよび肺がんからなる群から選択されるがんを有している。
ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加およびＬＡＭＰ１の高発現を、結腸がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がんからなる群から選択されるがんの表面で検出することができる。
かくして、一実施形態において、がんを、結腸がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、例えば、結腸がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がんから選択することができる。
さらに、ＬＡＭＰ１遺伝子コピー増加は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、肺がん、胃がんおよび卵巣がんにおけるＬＡＭＰ１ ｍＲＮＡ発現と相関する。有意な関係は、ＬＡＭＰ１遺伝子コピー数増加／増幅と、結腸、胃および肺腫瘍ＰＤＸの腫瘍細胞の細胞質膜でのＬＡＭＰ１の発現との間で示される。
従って、本発明の方法のさらなる実施形態において、患者は、乳がん、結腸がん、肺がん、胃がん、および卵巣がんからなる群から選択されるがんを有している。別の実施形態において、患者は、結腸がん、肺がん、胃がんおよび卵巣がんからなる群から選択されるがんを有している。
「抗ＬＡＭＰ１療法」は、ＬＡＭＰ１を標的化する治療剤を含む療法である。一実施形態において、そのような抗ＬＡＭＰ１療法は、抗ＬＡＭＰ１抗体またはイムノコンジュゲートである。抗ＬＡＭＰ１療法は、本明細書の以後でさらに詳細に説明される。
がんは、特に、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、グリア芽腫、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、グリオーマ、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、甲状腺がん、および子宮がんであってもよい。別の例において、がんは、特に、結腸直腸がんまたは肺がんである。
キット
最後に、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗体またはイムノコンジュゲートを含むキットも提供する。本発明の抗体を含有するキットは、表面タンパク質ＬＡＭＰ１の検出、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて有用である。本発明のキットは、固相支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされたポリペプチドまたは抗体を含有してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおける表面タンパク質ＬＡＭＰ１の検出および定量のための抗体を含有するキットを提供することができる。検出にとって有用なそのような抗体を、蛍光または放射性標識のような標識と共に提供することができる。
以下の図面および実施例によって本発明をさらに例示する。
配列の簡単な説明
配列番号１は、「ＭＡｂ１」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号２〜４は、「ＭＡｂ１」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈの配列を示す。
配列番号５は、「ＭＡｂ１」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号６〜７は、「ＭＡｂ１」抗体のＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号８は、「ＭＡｂ２」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号９〜１１は、「ＭＡｂ２」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈの配列を示す。
配列番号１２は、「ＭＡｂ２」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号１３〜１４は、「ＭＡｂ２」抗体のＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号１５は、いわゆる「ＭＡｂ２Ｃａｎ」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号１６は、いわゆる「ＭＡｂ２Ｃａｎ」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号１７は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ１」抗体の重鎖の配列を示す。
配列番号１８は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ１」抗体の軽鎖の配列を示す。
配列番号１９は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ２」抗体の重鎖の配列を示す。
配列番号２０は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ２」抗体の軽鎖の配列を示す。
配列番号２１は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ２Ｃａｎ」抗体の重鎖の配列を示す。
配列番号２２は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ２Ｃａｎ」抗体の軽鎖の配列を示す。
配列番号２３は、受託番号ＮＭ＿００５５６１．３の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長ヒトＬＡＭＰ１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４は、ＮＰ＿００５５５２．３の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長ヒトＬＡＭＰ１のタンパク質配列を示す。
配列番号２５は、ＮＰ＿０３４８１４の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長マウスＬＡＭＰ１のタンパク質配列を示す。
配列番号２６は、ＮＰ＿０３６９８９の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長ラットＬＡＭＰ１のタンパク質配列を示す。
配列番号２７は、ＸＰ＿００２７２３５０９の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長アカゲザルＬＡＭＰ１のタンパク質配列を示す。
配列番号２８は、ペプチドシグナルを含まないヒトＬＡＭＰ１細胞外ドメイン、次いで、Ｃ末端６アミノ酸Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号２９は、ペプチドシグナルを含まないカニクイザルＬＡＭＰ１細胞外ドメイン、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ配列を含むＣ末端タグの配列を示す。
配列番号３０は、ペプチドシグナルを含まないＬＡＭＰ１のマウスループ１領域およびＬＡＭＰ１のヒトループ２〜４を含有するヒトおよびマウスＬＡＭＰ１キメラ、次いで、Ｃ末端６アミノ酸Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号３１は、ペプチドシグナルを含まないＬＡＭＰ１のマウスループ１〜２領域およびＬＡＭＰ１のヒトループ３〜４を含有するヒトおよびマウスＬＡＭＰ１キメラ、次いで、Ｃ末端６アミノ酸Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号３２は、ペプチドシグナルを含まないＬＡＭＰ１のヒトループ１〜２領域およびＬＡＭＰ１のマウスループ３〜４を含有するヒトおよびマウスＬＡＭＰ１キメラ、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ配列を含むＣ末端タグの配列を示す。
配列番号３３は、ペプチドシグナルを含まないＬＡＭＰ１のヒトループ１〜３領域およびＬＡＭＰ１のマウスループ４を含有するヒトおよびマウスＬＡＭＰ１キメラ、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ配列を含むＣ末端タグの配列を示す。
配列番号３４は、ペプチドシグナルを含まないマウスＬＡＭＰ１細胞外ドメイン、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ配列を含むＣ末端タグの配列を示す。
配列番号３５は、「ＭＡｂ１」抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号３６は、「ＭＡｂ１」抗体の重鎖配列を示す。
配列番号３７は、「ＭＡｂ２」抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号３８は、「ＭＡｂ２」抗体の重鎖配列を示す。
配列番号３９は、カニクイザルの予測される完全長ＬＡＭＰ１タンパク質配列を示す。
配列番号４０は、ペプチドシグナルを含まないヒトＬＡＭＰ２細胞外ドメイン、次いで、Ｃ末端１０アミノ酸Ｈｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号４１は、ヒトＬＡＭＰ２の完全長タンパク質配列を示す。
配列番号４２は、「ＭＡｂ３」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号４３〜４５は、「ＭＡｂ３」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈの配列を示す。
配列番号４６は、「ＭＡｂ３」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号４７および４８は、「ＭＡｂ３」抗体のＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号４９は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ３」抗体の重鎖の配列を示す。
配列番号５０は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ３」抗体の軽鎖の配列を示す。
配列番号５１は、抗体「ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３」の軽鎖の可変ドメインの配列を示す。
配列番号５２は、抗体「ＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３」のＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号５３は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿１」のＶＨ１配列を示す。
配列番号５４は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿２」のＶＨ２配列を示す。
配列番号５５は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿３」のＶＨ３配列を示す。
配列番号５６は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿１」のＶＬ１配列を示す。
配列番号５７は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿２」のＶＬ２配列を示す。
配列番号５８は、ヒト化抗体「ｈｕＭＡｂ１＿３」のＶＬ３配列を示す。
配列番号５９は、「ｈｕＭＡｂ１＿１」抗体の軽鎖バリアント１配列を示す。
配列番号６０は、「ｈｕＭＡｂ１＿１」抗体の重鎖バリアント１配列を示す。
配列番号６１は、「ｈｕＭＡｂ１＿２」抗体の軽鎖バリアント２配列を示す。
配列番号６２は、「ｈｕＭＡｂ１＿２」抗体の重鎖バリアント２配列を示す。
配列番号６３は、「ｈｕＭＡｂ１＿３」抗体の軽鎖バリアント３配列を示す。
配列番号６４は、「ｈｕＭＡｂ１＿３」抗体の重鎖バリアント３配列を示す。
配列番号６５は、変異３６Ａおよび９５Ａを有する陰性対照「ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡ」抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号６６は、変異１０１Ａを有する陰性対照「ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡ」抗体の重鎖配列を示す。
配列番号６７は、変異２６６Ａを有する陰性対照「ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢ」抗体の重鎖配列を示す。
配列番号６８は、結晶化のための組換えｈｕＭＡｂ１＿１の軽鎖配列を示す。
配列番号６９は、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグを含む結晶化のための組換えｈｕＭＡｂ１＿１の重鎖配列を示す。
配列番号７０は、切断可能なチオレドキシン（ｔｒｘ Ａ）タグ、Ｈｉｓ−Ｔａｇおよびトロンビン切断部位を含むＬＡＭＰ１のヒトループ１〜２領域の配列を示す。
配列番号７１は、非タグ付ｈＬＡＭＰ１−２９−１９５の配列を示す。
配列番号７２は、配列番号２４のアミノ酸１０１〜１１０に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、配列番号２４のアミノ酸１４４〜１５７に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、配列番号２４のアミノ酸１７４〜１８８に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、配列番号２４のアミノ酸２９〜４１に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、配列番号２４のアミノ酸６８〜８０に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、配列番号２４のアミノ酸２９〜１００に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、配列番号２４のアミノ酸９７〜１１０に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、配列番号２４のアミノ酸１７３〜１８９に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、配列番号７０のアミノ酸１３２〜３０２に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、キメラ抗体「ｃｈＭＡｂ３ ＶＬ＿Ｒ２４＿Ｒ９３」の軽鎖の配列を示す。配列番号８２は、配列番号２４のアミノ酸３６０〜３７５に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号８３〜８５は、「ＭＡｂ４」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈの配列を示す。
配列番号８６および８７は、「ＭＡｂ４」抗体のＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号８８は、抗体「ＭＡｂ４」のＶＨ１配列を示す。
配列番号８９は、抗体「ＭＡｂ４」のＶＬ１配列を示す。
配列番号９０は、配列番号２４のアミノ酸４７〜６１に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、配列番号２４のアミノ酸１４０〜１５５に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、配列番号２４のアミノ酸３０７〜３２１に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、結晶解析を用いて標準構造およびかくしてヒトＬＡＭＰ１の結合にとって重要であるとして同定された残基に基づいてＭＡｂ１／ｈｕＭＡｂ１＿１／ｈｕＭＡｂ１＿２／ｈｕＭＡｂ１＿３抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｌのコンセンサス配列を示す。
配列番号９４は、結晶解析を用いて標準構造およびかくしてヒトＬＡＭＰ１の結合にとって重要であるとして同定された残基に基づいてＭＡｂ１／ｈｕＭＡｂ１＿１／ｈｕＭＡｂ１＿２／ｈｕＭＡｂ１＿３抗体ファミリーのＣＤＲ３−Ｌのコンセンサス配列を示す。
配列番号９５は、結晶解析を用いて標準構造およびかくしてヒトＬＡＭＰ１の結合にとって重要であるとして同定された残基に基づいてＭＡｂ１／ｈｕＭＡｂ１＿１／ｈｕＭＡｂ１＿２／ｈｕＭＡｂ１＿３抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｈのコンセンサス配列を示す。
配列番号９６は、結晶解析を用いて標準構造およびかくしてヒトＬＡＭＰ１の結合にとって重要であるとして同定された残基に基づいてＭＡｂ１／ｈｕＭＡｂ１＿１／ｈｕＭＡｂ１＿２／ｈｕＭＡｂ１＿３抗体ファミリーのＣＤＲ３−Ｈのコンセンサス配列を示す。
配列番号９７は、配列番号２４のアミノ酸３５〜８４に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、「ＭＡｂ４」抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号９９は、「ＭＡｂ４」抗体の重鎖配列を示す。
ヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１完全長タンパク質の配列アラインメントを示す図である。 モノクローナルマウス抗体Ｍａｂ１およびＭＡｂ２を用いるＦＡＣＳ分析から誘導されたＬＡＭＰ１の発現プロファイルを示す図である。 ＭＡｂ１と、ヒトＬＡＭＰ１およびカニクイザルＬＡＭＰ１との反応性を示す図である。 ＬＡＭＰ１への結合に関するＭＡｂ２（マウス）とＭＡｂ１（キメラ）との競合の評価を示す図である。２ｎｄ抗ｈＦｃは、二次抗体抗ヒトＦｃであり、２ｎｄ抗ｍＦｃは二次抗体抗マウスＦｃである。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ａ）コピー数変更カテゴリーによるＬＡＭＰ１のＲＮＡ強度発現のボックスプロットである。 ｂ）結腸腫瘍上でのＬＡＭＰ１ ｍＲＮＡ発現によるＬＡＭＰ１コピー数のプロットである。点は個々のｍＲＮＡ発現を表し、バーは平均値に対応する。 ＬＡＭＰ１ ｍＲＮＡとコピー数変化データのＳｐｅｒｍａｎ相関分析を示す図である。 軟部肉腫（ａ）におけるコピー数変化によるＲＮＡ強度発現およびＬＡＭＰ１のボックスプロットである。 子宮体部内膜癌（ｂ）におけるコピー数変化によるＲＮＡ強度発現およびＬＡＭＰ１のボックスプロットである。 浸潤性乳癌（ｃ）におけるコピー数変化によるＲＮＡ強度発現およびＬＡＭＰ１のボックスプロットである。 ａ）結腸腫瘍ＰＤＸに関するＬＡＭＰ１膜発現（ＩＨＣカテゴリースコアリング）によるＬＡＭＰ１コピー数のヒストグラムによるＬＡＭＰ１コピー数のヒストグラムである。 ｂ）肺および胃腫瘍ＰＤＸに関するＬＡＭＰ１膜発現（ＩＨＣカテゴリースコアリング）によるＬＡＭＰ１コピー数のヒストグラムである。 ３つのＰＤＸ（ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ、ＬＵＮ−ＮＩｃ−０１４およびＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９）上でのｏＭＡｂ１、２および３の発現プロファイルを示す図である。 パラトープの一部であるＦａｂ１の残基（すなわち、抗原原子の４Ａ内の原子を有する残基）を示すグラフ表示である。 Ｆａｂ１のエピトープを形成するｈＬＡＭＰ１の残基（すなわち、抗原原子の４Ａ内の原子を有する残基）を示すグラフ表示である。 ｈＬＡＭＰ１の残基およびｃＬＡＭＰ１に対応するＧ１８７Ｅのモデルのオーバーレイを示すグラフ表示である。位置１８７でのグリシンからグルタミンへの変異を提供するのに必要な、ｈＬＡＭＰ１のＬｙｓ１５１およびＦａｂ１−ＬＣのＴｙｒ３２の方向の差異が示される。 Ｆａｂ１の重鎖残基およびＦａｂ１のモデルのオーバーレイを、配列番号５３のその重鎖配列中の変異Ｉ２８ＱおよびＬＡＭＰ１との相互作用と共に示すグラフ表示である。 Ｆａｂ１の重鎖残基およびＦａｂ１のモデルのオーバーレイを、配列番号５３のその重鎖配列中の変異Ｎ５５ＲおよびＬＡＭＰ１との相互作用と共に示すグラフ表示である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿３コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿２コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３ ＶＬＲ２４−Ｒ９３コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおけるヒト原発性浸潤性乳管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００７０に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００７０に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおけるヒト原発性浸潤性乳管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおけるヒト原発性浸潤性乳管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３の抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ｃｈＭＡｂ１、ｃｈＭＡｂ２およびｃｈＭＡｂ３により媒介されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣのグラフ表示である。 ａ）ＨＣＴ ｈｕＬＡＭＰ１クローン８ＬＡＭＰ１抗原密度：１６００００、ｂ）ＨＣＴ ｈｕＬＡＭＰ１クローン４ＬＡＭＰ１抗原密度：２０００およびｃ）ＨＣＴ ｈｕＬＡＭＰ１クローン１２ＬＡＭＰ１抗原密度：５０００でのＬＡＭＰ１抗原密度へのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣ依存性のグラフ表示である。 ｃｈＭＡｂ１とＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１（ａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣの比較を示す図である。 ｃｈＭＡｂ２とＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２（ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣの比較を示す図である。 ｈｕＭＡｂ１＿１により媒介されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣを示す図である。 ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１により媒介されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣを示す図である。 ａ）Ｍａｂ１＿１を用いないマクロファージおよび標的細胞ならびにｂ）マクロファージおよび標的細胞およびＭａｂ１＿１を用いるＡＤＣＰのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＰを示す図である。 ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡに関するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＰの喪失を示す図である。 （２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２コンジュゲートを用いるＳＮＰＰで改変されたｈｕＭＡｂ１＿１コンジュゲートのＨＲＭＳデータを示す図である。 ポリクローナルウサギｒＡｂ４抗体を用いる結腸腺癌患者由来異種移植片ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐおよびヒト乳癌のＦＦＰＥ試料上での免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を示す図である。陰性対照を、一次抗体の省略により実施した。さらに、他の無関係の抗体は陰性であるか、または細胞内免疫染色を示した。 １μｇ／ｍＬのポリクローナルウサギｒＡｂ４抗体を用いるＦＦＰＥ形式での免疫細胞化学（ＩＣＣ）を示す図である。 ハイブリドーマ８８ＬＡＭＰ１−２から得られたＭＡｂ４を用いる腺癌患者由来異種移植片ＣＲ−ＬＲＢ−０１０ＰのＦＦＰＥ試料上での免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を示す図である。陰性対照を、一次抗体の省略により実施した。 ＬＡＭＰ１（黒色）またはＬＡＭＰ２（灰色）に対するＭＡｂ４のＥＬＩＳＡによる結合親和性を示す図である。
〔実施例１〕
患者由来腫瘍異種移植片（ＰＤＸ）の製造
実施例１．１：ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ、ＣＲ−ＬＲＢ−００３Ｐ、およびＣＲ−ＩＧＲ−０３４ＰのＰＤＸの製造
患者の外科手術中に収集された腫瘍試料から直接得られた結腸直腸がんモデルの大規模なコレクションを開発した。３つの医療センター：Ｃｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｇｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＬａｒｉｂｏｉｓｉｅｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で、患者のインフォームドコンセントの後に患者由来結腸直腸がんの腫瘍を収集した。外科手術の直後（平均して切除から１時間後）、２つの断片を、生着させるために、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２００ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、５ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシン、２０ｍｇ／ｍＬのメトロニダゾール、２５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン、および２．５ｍｇ／ｍＬのフンギソンが添加されたＤＭＥＭ、またはナノマイコプリチン（Ｎａｎｏｍｙｃｏｐｕｌｉｔｉｎｅ）（Ａｂｃｙｓ）が添加されたＤＭＥＭを包含する培養培地中に移した。患者の外科手術後２から２４時間に、２匹のＳｗｉｓｓヌードマウスに腫瘍試料を生着させた。小さい断片（５０ｍｍ３）を、麻酔されたマウスの肩甲骨の領域またはわき腹の皮下に生着させた（キシラジン／ケタミンまたはイソフルランプロトコール）。腫瘍増殖を少なくとも週１回測定し、腫瘍が８００から１５００ｍｍ３の体積に達したら、所定の腫瘍それぞれの一連の断片の移植を３匹から５匹のＳｗｉｓｓヌードまたはＣＢ１７−ＳＣＩＤ（３回継代後）マウスに行った。（Ｊｕｌｉｅｎ、Ｓ．２０１２、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（１９）：５３１４〜５３２８）。
実施例１．２：ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４のＰＤＸおよびＬＵＮ−ＮＩＣ−００７０のＰＤＸの製造
ＣＨＵ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｎｉｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で、患者のインフォームドコンセント後に、非小細胞肺癌試料を収集した。外科手術の直後、患者の腫瘍の断片をＡＱＩＸ培地中に移し、Ｓａｎｏｆｉ（Ｖｉｔｒｙ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に送った。患者の外科手術後２４から４８時間に、２匹から５匹のＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスに腫瘍試料を生着させた。小さい断片（５０ｍｍ３）をマウスのわき腹の皮下に生着させた。腫瘍増殖を少なくとも週１回観察し、腫瘍が８００から１５００ｍｍ３の体積に達したら、所定の腫瘍それぞれの一連の断片の移植を、５匹から１０匹のＣＢ１７−ＳＣＩＤ（３回継代後）マウスに行った。
実施例１．３：ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９のＰＤＸの製造
Ｇｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ、Ｆｒａｎｃｅ）で、患者のインフォームドコンセントの後に乳癌試料を収集した。外科手術の直後（平均して切除から１時間後）、４つの断片を、生着させるために、ＤＭＥＭ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンギソンを包含する培養培地中に移した。患者の外科手術から最長で１２時間後に、腫瘍試料（約５０ｍｍ３の断片）を４匹のＢＡＬＢヌードマウスの脂肪体上に生着させた。腫瘍増殖を少なくとも週１回追跡し、Ｓａｎｏｆｉ（Ｖｉｔｒｙ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ）に送った。腫瘍が８００から１５００ｍｍ３の体積に達したら、所定の腫瘍それぞれの一連の断片の移植を、３匹から５匹のＢＡＬＢヌードまたはＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（３回継代後）に行った。
〔実施例２〕
モノクローナルマウスの抗ＬＡＭＰ１抗体の作製および最初のスクリーニング
免疫化、融合およびスクリーニングを、本質的に上述した通りにして、免疫化には実施例１で述べた脱凝集した原発性腫瘍ＣＲ−ＬＲＢ−０１０ＰまたはＣＲ−ＬＲＢ−００３ＰまたはＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４、融合にはＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を使用して行った。Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ Ａ．Ｅら（１９９３、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３（４）：１０５０〜１０５４）によって説明されている古典的な方法を使用して、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓ０８２３４２；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）それぞれは、４１日の期間中に３回の免疫化を受けた。マウスの腹側部位に抗原を腹腔内投与した。最後の注射から３日後、マウスを殺し、脾臓を無菌的に単離し、新しいＲＰＭＩ培地で洗浄した。脾臓からリンパ球を取り出し、単一細胞の懸濁液をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、その後、ポリエチレングリコールを使用してＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞と融合させた。融合後、細胞混合物を、３７℃で１６〜２４時間、インキュベーターでインキュベートした。得られた細胞調製物を選択的な半固形培地に移し、１００ｍｍのペトリ皿に無菌的に塗り広げ、３７℃でインキュベートした。選択開始から１０日後、プレートをハイブリドーマの増殖に関して試験し、目に見えるコロニーをピックアップし、増殖培地２００μＬを含有する９６−ウェルプレートに置いた。９６−ウェルプレートをインキュベーターで３７℃で２から４日保持した。
捕捉抗原として抗マウスカッパ軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ番号Ａ９０−１１９Ａ）を使用した酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＩｇＧ産生のための一次スクリーニングを行った。プレートをマウスカッパ軽鎖抗体でＰＢＳ中０．５μｇ／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの一次抗体をプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ番号３１３４９）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）の１：５００００希釈液１００μＬを各ウェルに添加した。暗所において３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。さらなるスクリーニングのために、マウスＩｇＧ、Ｃカッパアイソタイプを含む抗体を選択した。
〔実施例３〕
免疫組織化学（ＩＨＣ）によるハイブリドーマのスクリーニング
免疫化用の腫瘍（ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ）、ヒト非腫瘍性結腸およびヒト非腫瘍性皮膚の凍結切片を含有するマクロアレイスライド上で、腫瘍組織ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対して生じた個々のハイブリドーマの上清を、ＩＨＣによってスクリーニングした。非腫瘍性結腸および皮膚の凍結ＯＣＴ（最適切削温度の）標本を、外科手術例（Ａｓｔｅｒａｎｄ、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌなどの商業的な供給源）から得た。Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ自動システム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して、自動免疫染色を行った。
凍結した１０μｍの低温保持切片を、一次抗体としてのＩｇＧ培養上清（未知の濃度、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳで３分の１に希釈）と共に３７℃で４０分間インキュベートした。陰性対照として培養培地を使用した。グルタルアルデヒド（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中、０．０５％）を用いて４分間にわたり後固定工程を行った。二次抗体Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅウサギ抗マウスＩｇＧ（３１５−００５＿００８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を４．８μｇ／ｍＬで使用し、３７℃で１２分間インキュベートした。ＵｌｔｒａＭａｐ Ｒｅｄ色素産生検出キットを製造元の推奨に従って用いて８分間免疫染色を行った。続いて低温保持切片を、ヘマトキシリンＩＩ（７９０−２２０８、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で対比染色し、４分間青く染色した（７６０−２０３７）。染色したスライドから水分を取り除き、Ｃｏｖｅｒｑｕｉｃｋ２０００マウンティングメディウム（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｒｅｆ０５５４７５３０）を用いてカバースリップをかけた。
ｍＡｂで免疫染色した切片を顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ４００）で分析した。免疫組織化学的スクリーニング後、対象のクローンを、腫瘍性結腸細胞の場所とは反応性を有するが結腸粘膜の正常上皮細胞とは反応性を有さないものとして同定した。ＭＡｂ１抗体は、腫瘍に関連する反応性の証拠を示し、表皮のヒト非腫瘍性細胞に対して陰性であった。
ＭＡｂ２およびＭＡｂ３を用いて類似の結果を得た。これらのＩＨＣの結果に基づき、ＭＡｂ１に関する非腫瘍性および腫瘍性組織での広範なＩＨＣによる特徴付けなどのさらなる評価のために、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３を精製した。
〔実施例４〕
ｍＡｂの特徴付け
ヒトの脱凝集した原発性結腸腫瘍での細胞表面結合に関して、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用したＦＡＣＳによって、抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３を分析した。
ＥＣ５０値として示される見かけの親和性を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
抗体を発現するマウスハイブリドーマを産生してＴ５００フラスコに入れ、７日間増殖させた後、馴化培地を収集した。馴化培地をプロテイン−Ｇカラムに通して抗体を精製し、１００ｍＭグリシン／ＨＣｌのｐＨ２．７緩衝液で洗浄して溶出させた。溶出液をＰＢＳに対して透析し、その後、濾過滅菌し４℃で保存した。
実施例４．１：フローサイトメトリーによるヒト原発性結腸腫瘍ＰＤＸに対する抗体ＭＡｂ１およびＭＡｂ２の見かけの親和性
進行性のヒト原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐを、マウス中の患者由来異種移植片から得た。ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号１７１０４−０１９）およびデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号１８０４７−０１９）を４℃で１時間使用して、腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐを酵素により解離させた。Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用したＶｉａｃｏｕｎｔアプリケーションによって、細胞の生存率を推定した。見かけの親和性を推定するために、９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上にＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍性細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗体を、２０μｇ／ｍｌから開始して最大１２回のアッセイ用希釈剤（ａｓｓａｙ ｄｉｌｕａｎｔ）での希釈による連続２倍希釈液に４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、Ａｌｅｘａ６４７にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）またはＡｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ１１０１３）を、４℃で４５分間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって抗体結合を評価して、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。表３に、進行性のヒト原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐで得られたＥＣ５０値を列挙する。
マウスＩｇＧキャリブレーターキット（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｋｉｔ）（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ番号７２０８）またはヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ番号ＣＰ０１０）を製造元の説明書に従って使用して抗体の抗体結合能力を決定した。抗体ＭＡｂ１およびＭＡｂ２それぞれについて、ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対して２３００００および１８００００の抗体結合能力が測定された。
実施例４．２：抗体は複数のがん細胞に結合する
複数のがん細胞へのＭＡｂ１およびＭＡｂ２抗体の結合および抗体結合能力の決定
実施例４．１で説明した条件を使用したフローサイトメトリーによって、抗体は、複数の腫瘍細胞に結合が可能であることが見出された。腫瘍細胞のパネルは、様々な由来からの患者由来腫瘍異種移植片および腫瘍細胞株を含む。図２は、発現プロファイルを例示し、表４は、抗体結合能力の結果を要約する。
ＭＡｂ３抗体は複数のがん細胞に結合する
実施例１で説明したように、マウスにおける患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から、結腸（ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ）、肺（ＬＵＮ−ＮＩＣ−０１４Ｐおよび乳房（ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９）由来のヒト進行性原発腫瘍の指標を得た。ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号１７１０４−０１９）およびデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号１８０４７−０１９）を４℃で１時間使用して、ＰＤＸを酵素により解離させた。Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用したＶｉａｃｏｕｎｔアプリケーションによって、細胞の生存率を推定した。９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上に腫瘍性細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、抗体１００μＬを、２０μｇ／ｍＬで４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８ １００μＬにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ１１０１３）を、４℃で４５分間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって抗体結合を評価し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。平均蛍光を記録し、図１２に示されるグラフにプロットして、３種のＰＤＸに対する３種のｍＡｂの発現プロファイルを例示した。図１２に示した結果から、ＭＡｂ３は、Ｍａｂ１およびＭａｂ２が結合するのと同様に、結腸、肺および乳房由来からの様々な患者由来異種移植片に結合することが示される。
実施例４．３：ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍマルチスペクトルイメージングフローサイトメーター（Ａｍｎｉｓ ｃｏｒｐ．）による、ＬＡＭＰ１を発現する結腸Ｃｏｌｏ２０５腫瘍性細胞に結合した後のＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３の内在化スコア
６−ウェルプレートのウェルに生存可能なＣｏｌｏ２０５細胞（５×１０５細胞）を植え付け、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した抗体ＭＡｂ１またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した抗体ＭＡｂ２またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した抗体ＭＡｂ３と共に、３７℃／５％ＣＯ２で４時間（または陰性対照の場合は氷上で４℃）インキュベートした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いた４００ｇで５分の遠心分離によって細胞を洗浄した。透過化／固定緩衝液１００μＬを氷上で２０分間使用することにより、細胞を固定して透過化した。透過化／洗浄用細胞緩衝液１ｍＬを用いた４００ｇで５分間の遠心分離によって、細胞を洗浄した。
内在化した抗体がリソソーム中に蓄積するかどうかを試験するために、ｍＡｂおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識したＣＤ１０７ａ（リソソームのマーカー）の同時摂取を実行した。１０μｇ／ｍＬの標識されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ＣＤ１０７ａ抗体を氷上で２０分間インキュベートした。インキュベート後、透過化／洗浄用細胞緩衝液１ｍＬを添加して洗浄し、その後遠心分離した（４００ｇ、５分間）。上清をプレートから払い落とし、その後細胞を１％ホルムアルデヒド２００μＬで氷上で２０分間固定した。内在化特徴を使用したＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍマルチスペクトルイメージングフローサイトメーター（Ａｍｎｉｓ ｃｏｒｐ．）で、細胞の蛍光を分析した。各実験条件で５千の事象を得て、それに対応する画像をＩＤＥＡＳ画像分析ソフトウェアを使用して分析した。
実施例４．４：抗Ａｌｅｘａ４８８抗体の使用によるＡｌｅｘａ４８８のクエンチ、ＭＡｂ１のフローサイトメトリーおよび内在化率の計算
Ａｌｅｘａ４８８で標識したＭＡｂ１（６６ｎＭ）を、６×１０５個のＣｏｌｏ２０５細胞と共に、完全培地中で３７℃または４℃で４時間インキュベートした。冷たい遠心分離機で細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷ＰＢＳで希釈した５００ｎＭの抗Ａｌｅｘａ４８８抗体のクエンチャーに再懸濁した。全てのチューブを氷上で１時間インキュベートした。全ての細胞を、洗浄せずに、２倍量の２％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定した。ＰＢＳ中で１回洗浄することでパラホルムアルデヒドを除去し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴフローサイトメトリーシステム）で分析した。
Ａｌｅｘａ４８８で標識したトランスフェリン（６００ｎＭ）と平行して内在化の陽性対照の実験を行った。
全ての計算に、フローサイトメトリーで細胞５×１０４個／チューブの測定値から得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を使用した。内在化は、以下の式で説明されるように、３７℃におけるクエンチされなかった細胞（細胞表面と細胞内区画の両方）のＭＦＩ値で割ったクエンチされた細胞（細胞内区画のみ）のＭＦＩ値として計算された：
４℃でＡｌｅｘａ４８８で標識した化合物と共にインキュベートした細胞は、４℃では抗体の内在化が有意に起こらないために、対照として使用された。
３７℃で４時間後、Ａｌｅｘａ４８８−ＭＡｂ１からの全細胞蛍光の約９７．０％が細胞内であった。それと比較して、Ａｌｅｘａ４８８−トランスフェリンからの全細胞蛍光の約９８．５％が細胞内であった。トランスフェリンは、Ｃｏｌｏ２０５細胞によって極めて効率的に内在化されることが公知である。
クエンチ後、３７℃で標識された細胞（細胞表面と細胞内区画の両方）から測定されたＡｌｅｘａ４８８−ＭＡｂ１の蛍光は、４℃で標識された細胞（細胞表面）の蛍光よりも１０倍高かった。４℃で細胞表面において測定されたＡｌｅｘａ４８８−ＭＡｂ１の蛍光は抗原の密度に比例することから、上記した全ての結果は、総合すると、各ＬＡＭＰ１分子は、実験期間中における細胞膜での再利用を介した数回（平均して１０回）の内在化サイクルに関与することを示す。
本発明者らの結果から初めて、ＬＡＭＰ１は、細胞表面への受容体の再利用を介して極めて効率的に抗体の内在化を媒介する受容体として機能する可能性があることが示され、これは、表６に示されるように、抗体の特異的な内在化が利用できるということは、がん細胞内部に特異的に送達しようとする毒素、薬物またはショートレンジの同位体を標的とする新規の治療方法の開発に役立つと予想されることを示唆している。
実施例４．５：ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３抗体の抗原標的の精製および同定
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｌａｓｓｉｃ ＩＰキット（番号２６１４６）を製造元の説明書に従って使用して、ヒト原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＬＲＢ−０１０ＰまたはＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐによって高濃度化した膜画分から、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３の抗原標的を精製した。
沈下したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質を硝酸銀で染色した。染色されたバンドをゲル中でのトリプシン消化で処理し、ベンチトップ型オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）でのタンデムＭＳ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、溶出したペプチドを分析した。Ｍａｓｃｏｔ（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ）データベースサーチエンジンを用いた未加工のＭＳ／ＭＳデータ分析から、ＬＡＭＰ１の存在が明らかになった。
この標的を、実施例６．２で説明されているような組換えヒトＬＡＭＰ１を用いたＥＬＩＳＡによって確認した（配列番号２８）。表７および表１１に、得られたＥＣ５０を列挙する。
実施例４．６：ＬＡＭＰ１への特異性
ＬＡＭＰ２は、ＬＡＭＰファミリーのなかでもＬＡＭＰ１に対して３５％の配列同一性を有する最も近いメンバーである。ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３抗体のＬＡＭＰ１に対する特異性を評価するために、これまでに説明したのと同じコーティング条件を使用して、Ｃ末端に１０個のＨｉｓ−タグを有する組換えヒトＬＡＭＰ２（配列番号４０）で９６−ウェルプレートをコーティングした（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６２２８−ＬＭ）。プレートに抗ＬＡＭＰ１抗体を添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）を使用することによって検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。ＬＡＭＰ２とＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３抗体との結合は検出されなかった。
実施例４．７：カニクイザルＬＡＭＰ１との交差反応性
抗体ＭＡｂ１が霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質と結合する能力に関して、ＥＬＩＳＡにより抗体ＭＡｂ１を査定した。実施例６．２で説明したように、ヒトのＬＡＭＰ１の細胞外ドメイン（配列番号２４のＡｌａ２９〜Ｍｅｔ３８２）およびカニクイザルＬＡＭＰ１の細胞外ドメイン（配列番号３９のＡｌａ２７〜Ｍｅｔ３８０）を製造した。プレートをカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質（配列番号２９）でコーティングし、プレートに抗体ＭＡｂ１を添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧで検出した（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。図３でＭＡｂ１に関して示した通り、両方のタンパク質とも結合親和性は同程度であった。
抗体ＭＡｂ１が組換えＨＥＫ２９３細胞の表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１および霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質と結合する能力に関して、ＦＡＣＳにより抗体ＭＡｂ１も評価した。ＬＡＭＰ１をコードするＤＮＡ配列、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００５５６１．３（配列番号２３）を内部にクローニングした。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＬＡＭＰ１、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００１０８７８０１（配列番号２７）のＣＤＳも内部にクローニングした。アカゲザルおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）からの成熟ＬＡＭＰ１の予測された配列は９９％同一であり、前記配列は、アカゲザル（配列番号２７）の、すなわちシグナルペプチド中の１１位における１つの追加のロイシンの点で異なっている。アカゲザルおよびカニクイザルの成熟ＬＡＭＰ１タンパク質は同一である。それゆえに、以下の実施例で使用した分泌されたＬＡＭＰ１は、カニクイザルと称される。両方のＣＤＳを、哺乳動物発現プラスミドのＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナル下にクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ｋ９０００−１０．）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ２９３発現系を製造元の説明書に従って使用して、ヒトＬＡＭＰ１またはカニクイザルＬＡＭＰ１プラスミドで一過性トランスフェクトした。ヒトＬＡＭＰ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞およびカニクイザルＬＡＭＰ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上に細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗体ＭＡｂ１を、２０μｇ／ｍｌから開始して最大１２回のアッセイ用希釈剤での希釈による連続２倍希釈液に４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、Ａｌｅｘａ６４７にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）を、４℃で４５分間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって抗体結合を評価して、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。結合親和性は同程度であり、ＥＣ５０は、ＭＡｂ１に関してＨＥＫ２９３の細胞表面で一過性発現されたヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１に対して、それぞれ１４および４４ｎＭであった。
抗体ＭＡｂ１が組換えＨＣＴ１１６安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１および霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質と結合する能力に関して、ＦＡＣＳにより抗体ＭＡｂ１を査定した。ヒトまたはカニクイザルＬＡＭＰ１のＣＤＳを細胞のゲノムＤＮＡに安定して統合させるレンチウイルスベクターで、ＨＣＴ１１６細胞を感染させた。ヒトまたはカニクイザルＬＡＭＰ１の細胞表面における局在化の密度が異なる個々のクローンを、ＨＣＴ１１６に感染した細胞のプールから得た。ヒトまたはカニクイザルＬＡＭＰ１を発現するＨＣＴ１１６細胞を、９６−ウェルプレート中２０００００／ウェルで平板培養し、ＭＡｂ１を、４０μｇ／ｍｌから開始して最大１２回のアッセイ用希釈剤での希釈による連続２倍希釈液に４℃で１時間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ１１０１３）を４℃で１時間添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、固定溶液（ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド）１００μｌ中で抗体結合を評価した。試料を、Ｇａｌａｘｙ（登録商標）フローサイトメトリーシステム（Ｐａｒｔｅｃ）を使用して読み取った。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。抗体ＭＡｂ１は、それぞれ４．９および５．５ｎＭの類似した親和性およびＥＣ５０で組換えＨＣＴ１１６の細胞表面で発現されたヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１に結合した。
抗体ＭＡｂ２が組換えＨＣＴ１１６安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１および霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質と結合するその能力に関して、ＦＡＣＳにより抗体ＭＡｂ２を査定した。９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上に組換えＨＣＴ１１６細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗体ＭＡｂ２を、２０μｇ／ｍｌから開始して最大１２回のアッセイ用希釈剤での希釈による連続２倍希釈液に４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、Ａｌｅｘａ６４７にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）を、４℃で４５分間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって抗体結合を評価し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。抗体ＭＡｂ２は、ＭＡｂ２に対してそれぞれ６．３および６．６ｎＭの類似した親和性およびＥＣ５０で組換えＨＣＴ１１６の細胞表面で発現されたヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１に結合した。
それゆえに、ＭＡｂ１およびＭＡｂ２は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合した。
それぞれＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１および霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質に結合する抗体ＭＡｂ３の能力に関して、抗体ＭＡｂ３をフローサイトメトリーにより査定した。ＨＣＴ１１６安定クローンを上記で説明したようにして得た。ヒトまたはカニクイザルＬＡＭＰ１のＣＤＳを細胞のゲノムＤＮＡに安定して統合させるレンチウイルスベクターで、ＨＥＫ２９３細胞を感染させた。カニクイザルＬＡＭＰ１の細胞表面における局在化の密度が異なる個々のクローンを、ＨＥＫ２９３感染細胞のプールから得た。プロトコールは、上記の実施例で説明した通りであった。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。抗体ＭＡｂ３は、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３の表面で発現されたヒトおよびカニクイザルＬＡＭＰ１に、類似した親和性ならびにそれぞれ７．６および４．０ｎＭのＥＣ５０で結合した。
それゆえにＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合した。
実施例４．８：本発明に係るＭＡｂおよび／または市販の抗ＬＡＭＰ１ Ｈ４Ａ３間の結合の競合
以下の実施例は、ＬＡＭＰ１上のエピトープに対するｍＡｂの競合に関するＥＬＩＳＡによる情報を示す。実施例６で説明したようにエピトープの結合部位で得られたデータを確認し、市販の抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂと比較した。
ＭＡｂ１とＭＡｂ２との結合の競合
ＬＡＭＰ１への結合に関するＭＡｂ２（マウス）とＭＡｂ１（キメラ）との競合をＥＬＩＳＡによりアッセイし、図４に例示した。競合は観察されなかった。
ＭＡｂ１とＭＡｂ２またはＭＡｂ３との結合の競合
プレート上にコーティングした組換えヒトＬＡＭＰ１（実施例６．２で説明した通り）を用いて、２種の抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂとの競合実験をＥＬＩＳＡにより行った。簡単に言えば、２種のｍＡｂを０．０６および１５ｍｇ／Ｌの濃度で同時に添加し、ここで０．０６ｍｇ／Ｌの濃度は、ＥＣ５０に近い濃度であった。２種のｍＡｂが異なるＦｃドメイン（ヒトまたはマウスのいずれか）を有するように、ＭＡｂの様式を選んだ。ｍＡｂ結合の個々の測定は、それら固有のＦｃへの特異的結合によって（Ｆｃγ断片に特異的なペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧのＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−０３５−０９８）を用いて、またはＦｃγ断片に特異的なペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧのＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−１６４）を用いて）特異的に行うことができた。結果は、同じ濃度のｍＡｂ単独から得られた値のパーセンテージとして報告された。表８を参照されたい。
ＭＡｂ１は、ＭＡｂ２またはＭＡｂ３と競合しないことが見出された。したがって、ＭＡｂ１に関するＬＡＭＰ１のエピトープ結合部位は、ＭＡｂ２またはＭＡｂ３に関するエピトープ結合部位と重複しない。
Ｈ４Ａ３とＭＡｂ１またはＭＡｂ２またはＭＡｂ３との結合の競合およびＭＡｂ２とＭＡｂ３との結合の競合
抗ＬＡＭＰ１のＨ４Ａ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３２８６０２）とＭＡｂ１、Ｍａｂ２、またはＭＡｂ３との競合実験、およびＭＡｂ２とＭＡｂ３との競合実験を、上記実施例Ｂ４．８１で説明したようにして行った。結果は、同じ濃度のｍＡｂ単独から得られた値のパーセンテージとして報告された。表９を参照されたい。
Ｈ４Ａ３は、ＬＡＭＰ１への結合に関して、ＭＡｂ３と競合し、Ｍａｂ２と部分的に競合し、ＭＡｂ１と競合しないことが見出された。
ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、ＬＡＭＰ１への結合に関して部分的に競合することが見出された。
〔実施例５〕
ヒト非腫瘍性および腫瘍性組織での精製したＭＡｂ１の免疫組織化学（ＩＨＣ）による特徴付け
さらなる評価ならびに非腫瘍性および腫瘍性組織での広範なＩＨＣによる特徴付けによる抗体の検証のために、モノクローナル抗体ＭＡｂ１を精製した。したがって、市販の組織マイクロアレイからのヒト非腫瘍性および腫瘍性組織の大きいパネルまたは低温保持切片全体を、凍結ＯＣＴ（最適切削温度）または酢酸・ホルマリン・アルコール（ＡＦＡ）またはホルマリン患者由来ヒト異種移植片のいずれかとして、ＬＡＭＰ１の免疫反応性に関して試験した。使用されたＰＤＸ試料は実施例１で説明した通りであった。
ＡＦＡ様式での免疫染色
Ｖｅｎｔａｎａ自動機器（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して古典的なＩＨＣを行った。切片からワックスを除去し、アビジンおよびビオチンブロッキング試薬（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｃｋ、Ｖｅｎｔａｎａ、７６０−０５０）と共にインキュベートし、続いてＳｅｒｕｍ Ｂｌｏｃｋ（Ｖｅｎｔａｎａ ７６０−４２１２）とインキュベートした。次いでマウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１を、４μｇ／ｍＬの最終濃度で３７℃で１時間インキュベートした。グルタルアルデヒド（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中、０．０５％）を用いて４分間にわたり後固定工程を行った。ビオチン化二次ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを３７℃で１２分間インキュベートした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ１０８０−０８、Ｖｅｎｔａｎａの希釈剤で１／２００に希釈）。ＤＡＢ Ｍａｐ色素産生検出キットを製造元の推奨に従って用いて免疫染色を行った。ヘマトキシリンＩＩ（７９０−２２０８、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて対比染色工程を低温保持切片に適用し、青色染色試薬（ｂｌｕｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）を４分間適用した（７６０−２０３７）。染色したスライドから水分を取り除き、Ｃｏｖｅｒｑｕｉｃｋ２０００マウンティングメディウム（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｒｅｆ０５５４７５３０）を用いてカバースリップをかけた。この研究で使用した陰性対照の本質は、一次抗体の不使用およびＩｇＧ２ａアイソタイプの使用（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの最終濃度）にあった。
ＰＦＡ様式での免疫染色
Ｖｅｎｔａｎａ自動機器（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して古典的なＩＨＣを行った。切片からワックスを除去し、抗原賦活化Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ１（ＣＣ１）緩衝液（Ｒｅｆ９５０−１２３ Ｖｅｎｔａｎａ）を５２分間適用した。切片を、アビジンおよびビオチンブロッキング試薬（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｃｋ、Ｖｅｎｔａｎａ、７６０−０５０）と共にインキュベートし、さらにＳｅｒｕｍ Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｖｅｎｔａｎａ、７６０−４２１２）と共にインキュベートした。次いでマウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１を、４μｇ／ｍＬの最終濃度で３７℃で１時間インキュベートした。グルタルアルデヒド（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中、０．０５％）を用いて４分間にわたり後固定工程を行った。ビオチン化二次ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを３７℃で１２分間インキュベートした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ１０８０−０８、Ｖｅｎｔａｎａの希釈剤で１／２００に希釈）。ＤＡＢ Ｍａｐ色素産生検出キットを製造元の推奨に従って用いて免疫染色を行った。ヘマトキシリンＩＩ（７９０−２２０８、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて低温保持切片に対比染色工程を適用し、青色染色試薬を４分間適用した（７６０−２０３７）。染色したスライドから水分を取り除き、Ｃｏｖｅｒｑｕｉｃｋ２０００マウンティングメディウム（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｒｅｆ０５５４７５３０）を用いてカバースリップをかけた。この研究で使用した陰性対照の本質は、一次抗体の不使用およびＩｇＧ２ａアイソタイプの使用（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの最終濃度）にあった。
凍結ＯＣＴ様式での免疫染色
アビジンおよびビオチンでのブロッキング（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｃｋ、Ｖｅｎｔａｎａ、７６０−０５０）の後、凍結切片を、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１（最終濃度は、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ（ヒト試料の場合）、ならびに１および５μｇ／ｍＬ（サル試料の場合））と共に３７℃で３２分間インキュベートした。グルタルアルデヒド（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中、０．０５％）を用いて４分間にわたり後固定工程を行った。ビオチン化二次ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを３７℃で１２分間インキュベートした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ１０８０−０８、Ｖｅｎｔａｎａの希釈剤で１／２００に希釈）。ＤＡＢ Ｍａｐ色素産生検出キットを製造元の推奨に従って用いて免疫染色を行った。ヘマトキシリンＩＩ（７９０−２２０８、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて低温保持切片に対比染色工程を適用し、青色染色試薬を４分間適用した（７６０−２０３７）。染色したスライドから水分を取り除き、Ｃｏｖｅｒｑｕｉｃｋ２０００マウンティングメディウム（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｒｅｆ０５５４７５３０）を用いてカバースリップをかけた。
この研究で使用した陰性対照の本質は、一次抗体の不使用およびＩｇＧ２ａアイソタイプの使用（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの最終濃度）にあった。
データ分析
精製したマウス抗体ＭＡｂ１で免疫染色した切片をスキャンし、Ｓｃａｎ Ｓｃｏｐｅ ＸＴシステム（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ ＣＡ）を使用して２０倍の倍率でデジタル化した。次いでＩｍａｇｅ Ｓｃｏｐｅソフトウェア（ｖ１０．２．２．２３１９ Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してデジタル化した画像を捕捉した。
染色の評価には、数種のパラメーター：反応性の組織学的部位（細胞質、核または膜）、反応性を有する細胞の主要なタイプ、染色強度および細胞染色頻度が含まれていた。陽性試料を１から３の強度のスケールでスコア付けした。強度の範囲は、陰性（０）、弱（１）、中（２）および強（３）と記載された。細胞の頻度は、免疫染色された細胞のパーセンテージであり、組織学者の観察により試料ごとの中央値として推定された。細胞の頻度を、５つのカテゴリー：１（０〜５％）、２（６〜２５％）、３（２６〜５０％）、４（５１〜７５％）および５（７６〜１００％）で順位付けした。
全体的な発現をＡｌｌｒｅｄスコア（ＡＳ）の説明に従って計算した。ＡＳは、強度と比率スコアとを足して０〜８の範囲の総スコアを得ることによって得られた。ＡＳは、最大グローバルスコアのパーセントとして報告され、５種のカテゴリー：極めて低い（０〜２５％）、弱（２６〜５０％）、中（５１〜７５％）および高（７５〜１００％）の範囲であった。出現率は、指標に関して陽性のケースのパーセントと定義された。
マイクロソフト・エクセル２００３を用いて基礎的な記述統計を計算した。指標ごとに、ケース数、陽性のケースの番号、出現率、強度スコア平均、頻度平均およびＡｌｌｒｅｄスコアを記載した。
非腫瘍性組織の分布
全体的に、実験データから、非腫瘍性の成人組織の細胞におけるＬＡＭＰ１のＩＨＣパターンは、大部分は細胞質内であることが示される。
重要器官である胃腸、生殖、尿、内分泌、リンパ、および皮膚、筋肉、目、脊髄などの他の器官を包含する組織の大きいパネルの細胞質中でＬＡＭＰ１を発現させたところ、心臓、肝臓、膵臓、肺および腎臓のような主要な器官では膜の染色は観察されなかった。
しかしながら、膜において多少のＬＡＭＰ１発現が起こったが、胃上皮細胞、食道上皮細胞、乳房上皮細胞、前立腺上皮細胞、精巣上皮細胞（表１０）に限定された。
それにもかかわらず、非腫瘍性試料の膜におけるＬＡＭＰ１発現に関する出現率および平均強度は、腫瘍で見出されるものよりも低かった。
腫瘍性組織の分布
ヒト腫瘍性組織におけるＭＡｂ１またはＭＡｂ２を使用した免疫組織化学的パターンから、抗原は、腫瘍性組織の細胞質および／または膜に位置することが実証される。膜パターンを提示するヒト腫瘍試料に関するタンパク質発現データから、ＬＡＭＰ１抗原は結腸腺癌に限定されないことが示される。様々な他の癌腫としては、消化管腫瘍（小腸、直腸、耳下腺）、重要臓器腫瘍（肺、肝臓、胃、膵臓および腎臓）、生殖器の腫瘍（乳房、卵巣および前立腺）ならびに皮膚、喉頭および軟部組織腫瘍が挙げられる（表１１）。
腫瘍の指標を、５０％より高い膜頻度を提示する試料（陽性細胞）のパーセンテージに基づくＬＡＭＰ１発現レベルに関してランク付けした。
このパラメーターに基づいて、第一の腫瘍指標を、結腸、直腸、肺扁平上皮癌、浸潤性乳管癌および小葉癌、胃腺癌および前立腺腺癌とした。
加えて、小腸腺癌、耳下腺腺癌、肺腺癌、卵巣腺癌、皮膚悪性黒色腫および喉頭扁平上皮癌（表１１）などの、膜において２５〜５０％の陽性細胞を提示する指標も、関連指標とみなすことができる。
さらにＬＡＭＰ１の免疫染色は、以下の腫瘍指標：肺小細胞癌（０／３）、食道扁平上皮癌（０／１１）、子宮頸部扁平上皮癌（０／３）、子宮内膜腺癌（０／３）、外陰扁平上皮癌（０／６）、精巣の精上皮腫（０／４）、胎児性精巣癌（０／１）、膀胱移行上皮癌（０／１）、甲状腺乳頭腺癌（０／３）および口腔のミュラー混合腫瘍（０／５）における膜では検出されなかった。
〔実施例６〕
結合部位の同定
この実施例では、ＬＡＭＰ１に対する抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂの結合部位を特徴付けられるように、分泌され、加えて膜に固定されたＬＡＭＰ１タンパク質を作製するために、ＬＡＭＰ１ドメインを定義して、ヒト−マウスハイブリッドＬＡＭＰ１タンパク質を設計した。
実施例６．１：ＬＡＭＰ１ドメインの定義
ＣＤ１０７ａとも名付けられたＬＡＭＰ１は、リソソーム膜タンパク質１である。リソソーム膜タンパク質１は、およそ１２０ｋＤａの膜貫通Ｉ型タンパク質である。このタンパク質は、１８個のＮ−グリコシル化部位および６個のＯ−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化された単量体である。このタンパク質は、ヒンジで隔てられた２つの内腔ドメインで構成される。各内腔ドメインは、２つのループの形を定める２つのジスルフィド架橋を有する。表１に示されるように、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００５５５２．３（配列番号２４）に従って、ＬＡＭＰ１の様々なドメインがマッピングされている。構造的な情報、特にヒトＬＡＭＰ１とマウスＬＡＭＰ１とのベータ鎖およびアミノ酸の差に基づいて、数種のハイブリッドＬＡＭＰ１分子を設計した。
実施例６．２：ＬＡＭＰ１タンパク質の組換え細胞外ドメインの製造
ＬＡＭＰ１への抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂの結合部位を決定するために、抗原の高レベルのグリコシル化は、特異的な手法を必要とした。ＬＡＭＰ１モノクローナル抗体ＭＡｂ１およびＭＡｂ２は、マウスＬＡＭＰ１タンパク質への結合をまったく示さなかった。この結合の非存在を使用して、ヒト構築物中の１つまたは数個のＬＡＭＰ１ドメイン（ループ１〜ループ４）がマウスにおける対応物で置き換えられた数種のキメラＬＡＭＰ１タンパク質を設計した。抗体の結合部位がマウスにおける対応物で置き換えられたら、結合の非存在によって抗体結合部位の同定が可能になった。
そこで、表１２で概説したように、それぞれのｃＤＮＡの発現が可能なプラスミドを用いたヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞での一過性発現によって、ヒト、カニクイザル（ｃ）およびマウス（ｍ）由来からのＬＡＭＰ１の細胞外タンパク質ドメイン、またはマウスＬＡＭＰ１ドメインとヒトＬＡＭＰ１ドメインとのハイブリッドを製造した。
各発現プラスミドを２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と複合体化し、懸濁培養した２９３−Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３細胞から得られた）でトランスフェクトしてから８日後、対応する可溶性タンパク質をＩＭＡＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製して、タンパク質のバッチを作製した。
実施例６．３：ＥＬＩＳＡによる結合親和性およびエピトープの決定
実施例６．２で説明した分泌されたＬＡＭＰ１タンパク質を使用して、抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂへの結合ドメインをＥＬＩＳＡにより同定した。ＭＡｂ１は、ＬＡＭＰ１のループ２を認識し、ＭＡｂ２は、ＬＡＭＰ１のループ１を認識し、ここでＬＡＭＰ１に対するＥＣ５０は、それぞれおよそ０．２および０．３ｎＭであった。
実施例６．４：ＬＡＭＰ１膜貫通タンパク質の発現
細胞内リソソーム標的モチーフＧＹＱＴＩが欠失しており５−Ａｌａ反復配列で置換されたＬＡＭＰ１の全コード配列をコードする哺乳動物プラスミドから、一過性発現させた後のＨＥＫ２９３細胞の細胞膜で様々なＬＡＭＰ１タンパク質を発現させた。哺乳動物プラスミドは、実施例６．２で説明した組換えＬＡＭＰ１を産生させるのに使用されたプラスミドと類似の発現シグナルを有していた。以下の表１４に、実施例６．３でＥＬＩＳＡにより可溶性ＬＡＭＰ１タンパク質で得られた結果を確認し、さらに抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂの結合ドメインを特徴付けるために設計された全てのプラスミドを列挙した。
実施例６．５：フローサイトメトリーによる結合親和性およびエピトープの決定
実施例６．２で概説したプロトコールの使用と同様にして、懸濁培養した２９３−Ｆ細胞中で、実施例６．４で説明した各発現プラスミドを２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）と複合体化した。トランスフェクトから２日後、実施例４．７で述べたようにして細胞を処理し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ）で分析し、平均蛍光を記録した。この蛍光は、結合の半定量的アセスメントを表す。
表１５に、プラスミドｐＸＬ５６２６、ｐＸＬ５６６８、ｐＸＬ５６６９、ｐＸＬ５７１９およびｐＸＬ５７２０で得られた結果を要約した。
膜に固定されたＬＡＭＰ１タンパク質を用いた親和性データのこの第一のセット（表１５）は、分泌されたＬＡＭＰ１タンパク質を用いた実施例６．３で報告されたＥＬＩＳＡデータに一致した。ＭＡｂ１は、ｈＬＡＭＰ１のＬ２の１０１〜１９５位（配列番号２４）でｈＬＡＭＰ１に結合し、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、ｈＬＡＭＰ１のＬ１の２９〜１００位でｈＬＡＭＰ１に結合した。これらのデータからは、ＭＡｂ１は、Ｎ−グリコシル化部位を有さないようにＬ２を操作したＬＡＭＰ１に結合し、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、Ｎ−グリコシル化部位を有さないようにＬ１を操作したＬＡＭＰ１に結合するために、３種の抗ＬＡＭＰ１はいずれもグリコトープ（ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）に結合しないことも示された。表１６に、プラスミドｐＸＬ５６２６、ｐＸＬ５９８８、ｐＸＬ５６６９、ｐＸＬ５９９０〜ｐＸＬ５９９７で得られた結果を要約した。
表１７に、プラスミドｐＸＬ５６２６、ｐＸＬ６０４１、ｐＸＬ６０４７、ｐＸＬ６０４８、およびｐＸＬ６００９で得られた結果を要約した。
表１８に、プラスミドｐＸＬ５６２６、ｐＸＬ６０１２〜ｐＸＬ６０１５、ｐＸＬ６０１７およびｐＸＬ６００９で得られた結果を要約した。
表１６に記載された膜に固定されたＬＡＭＰ１タンパク質での親和性データから、ＭＡｂ１は、ｈＬＡＭＰ１のＬ２の１０１〜１９５位（配列番号２４）でＬＡＭＰ１に結合する（ｐＸＬ５６２６、ｐＸＬ５９８８およびｐＸＬ５９９７）ことが実証される。より具体的には、９７から１１０位または１７３から１８９位のヒトＬＡＭＰ１の残基がマウスＬＡＭＰ１の残基で置換されている場合、ＭＡｂ１はハイブリッドＬＡＭＰ１タンパク質に結合しないが、Ｌ２における１１０から１７３位または１８９から１９６位のヒトＬＡＭＰ１の残基がマウスＬＡＭＰ１の残基で置換されている場合、ＭＡｂ１はハイブリッドＬＡＭＰ１タンパク質に結合した。注目すべきことに、１４４から１５７位のヒトＬＡＭＰ１の残基がマウスＬＡＭＰ１の残基で置き換えられている場合、いくつかの結合もさらに失われる。加えて表１７の実験番号１で報告されたデータから、９７から１１０位および１７３から１８９位の残基は、結合の一部を回復させるのに同時に必要であることが示された。表１７の実験番号２で報告されたデータから、ループ２の９１から１０４位および１３８から１５１位および１６７から１８３位の残基は、ＭＡｂ１の完全な結合を回復させるのに同時に必要であることが示された。
膜に固定されたＬＡＭＰ１タンパク質を用いたフローサイトメトリーにより得られた親和性データのこれらのセット（表１５、１６、１７および１８）、ならびに実施例６．３で説明した分泌されたＬＡＭＰ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡの結果から、以下の結論を得ることができた：
ＭＡｂ１は、ＬＡＭＰ１のＬ２の１０１〜１９５位に結合し、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、ＬＡＭＰ１のＬ１の２９〜１００位に結合した。
ＭＡｂ１は、Ｎ−グリコシル化部位を有さないようにＬ２を操作したＬＡＭＰ１に結合し、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３は、Ｎ−グリコシル化部位を有さないようにＬ１を操作したＬＡＭＰ１に結合するために、３種の抗ＬＡＭＰ１はいずれもグリコトープに結合しない。
９７から１１０位（配列番号７８）または１７３から１８９位（配列番号７９）のヒトＬＡＭＰ１の残基がマウスＬＡＭＰ１の残基で置換されている場合、ＭＡｂ１は、ハイブリッドＬＡＭＰ１タンパク質に結合しない。ただし、Ｌ２の１１０から１７３位または１８９から１９６位のヒトＬＡＭＰ１の残基がマウスＬＡＭＰ１の残基で置換されている場合、ＭＡｂ１は、ハイブリッドＬＡＭＰ１タンパク質に結合した。
ＭＡｂ１は、Ｌ２内に位置するアミノ酸と相互作用し、より具体的には、ＭＡｂ１は、１０１から１１０位（配列番号７２）および／または１７４から１８８位（配列番号７４）の配列、ならびにある程度は１４４から１５７位（配列番号７３）の配列内に位置するアミノ酸と相互作用した。それゆえに、本発明者らは、これらの結果、およびマウス配列とヒト配列とのアミノ酸の差から、ヒトＬＡＭＰ１の残基、なかでもＲ１４６、Ｄ１５０、Ｋ１５２、Ｒ１０６、Ａ１０８、Ｎ１８１、Ｓ１８２、Ｓ１８３、Ｒ１８６およびＧ１８７が、ＭＡｂ１と相互作用する可能性が高いと推論することが可能である。
ＭＡｂ２は、Ｌ１内に位置するアミノ酸と相互作用し、より具体的には、ＭＡｂ２は、６８から８０位（配列番号７６）の配列およびある程度は２９から４１位（配列番号７５）の配列内に位置するアミノ酸と相互作用した。それゆえに、本発明者らは、これらの結果、およびマウス配列とヒト配列とのアミノ酸の差から、ヒトＬＡＭＰ１の残基、なかでもＡ２９、Ｍ３０、Ｍ３２、Ｇ３６、Ａ４０、Ｓ６９、Ｄ７０、Ｔ７２、Ｖ７４、Ｌ７５、およびＲ７７が、ＭＡｂ２と相互作用する可能性が高いと推論することが可能である。
ＭＡｂ３は、Ｌ１内に位置するアミノ酸と相互作用し、より具体的には、ＭＡｂ３は、２９から４１位（配列番号７５）および／または６８から８０位（配列番号７６）の配列内に位置するアミノ酸と相互作用した。それゆえに、本発明者らは、これらの結果、およびマウス配列とヒト配列とのアミノ酸の差から、ヒトＬＡＭＰ１の残基、なかでもＡ２９、Ｍ３０、Ｍ３２、Ｇ３６、Ａ４０、Ｓ６９、Ｄ７０、Ｔ７２、Ｖ７４、Ｌ７５、およびＲ７７が、ＭＡｂ３と相互作用する可能性が高いと推論することが可能である。
実施例６．６：Ａｌａスキャンによるエピトープ結合に関与する個々のアミノ酸の決定
ｈＬＡＭＰ１＿ΔＧＹＱＴＩから得られ、プラスミドｐＸＬ５６２６にコードされたＬＡＭＰ１配列（実施例６．４）において、実施例６．５で同定されβ鎖構造に関与しない個々の残基を、アラニン残基で個々に置き換えた。ｐＸＬ５６２６から合計２１種のプラスミドを操作し（表１９を参照）、一過性トランスフェクト後のＨＥＫ２９３細胞の細胞膜におけるＬＡＭＰ１発現をアッセイするのに使用した。トランスフェクトから２日後、実施例４．７で述べたようにして細胞を処理して、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ）で分析し、平均蛍光を記録した。この蛍光は、結合の半定量的アセスメントを表す。ｐＸＬ５６２６によりコードされた対照タンパク質と比較して平均蛍光の５０％より多くの減少がみられた場合、表１９に結合の喪失を報告した。
ＬＡＭＰ１タンパク質におけるＡｌａ置換によるＩ１４９、Ｄ１５０およびＲ１８６位におけるＭＡｂ１への結合の喪失は、これらの位置がＬＡＭＰ１へのＭＡｂ１結合に重要であることを示す。
ＬＡＭＰ１タンパク質におけるＡｌａ置換によるＧ３８位およびＤ７０位におけるＭＡｂ３への結合の喪失は、これらの位置がＬＡＭＰ１へのＭＡｂ２結合に重要であることを示す。
〔実施例７〕
ｍＡｂ配列の決定
実施例７．１：ｍＡｂ配列の決定およびキメラｍＡｂの作製。
ハイブリドーマからｍＡｂの可変ドメインの配列を取り出し、発現ベクターにクローニングすることによって、クローニングしたｍＡｂが元のマウスｍＡｂと同じ特徴を有することが確実になった。
モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを以下のようにして得た。ｃＤＮＡを取り出し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩおよびＦｉｎｎｚｙｍｅｓからのポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ）により、１００個のハイブリドーマ細胞および可変領域および定常ドメインをコードするｃＤＮＡの５’末端に位置するオリゴヌクレオチドから配列決定した。
ハイブリドーマの高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）：
Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＴＯＦシステムにおいてエレクトロスプレーポジティブモード（ＥＳ＋）でマススペクトルを得た。クロマトグラフ条件は、以下：カラム：ＵＰＬＣ ＭａｓｓＰｒｅｐ ２０μｍ ２．１×５ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸：Ｂ；ＣＨ３ＣＮ＋０．１％ギ酸；カラム温度：８０℃；流速０．２ｍＬ／分；勾配溶出（１０分）：１０％Ｂ、３０秒；１０から５０％のＢ、７分１０秒；８分：９０％Ｂ；８分３０秒：１０％Ｂ；１０分：１０％Ｂであった。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、６ＭのＧｄｎ．ＨＣＬ／１ＭのＤＴＴ中で３７℃で３０分間、試料を還元した。
得られたアミノ酸配列は、表２０の重鎖および軽鎖（ＬＣ、ＨＣ）のＮ末端配列決定および質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によってハイブリドーマから得られた精製ｍＡｂで得られたデータに一致する情報を提供した。ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔの特許化された配列において同一配列は見出されなかった。
可変ドメインＶＨおよびＶＬの核酸配列を、それぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣカッパ定常ドメインコード配列と融合させて発現ベクターにクローニングし、次いで実施例６．２で説明したような２９３−Ｆ細胞中での一過性発現によってキメラｍＡｂのバッチを作製した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってバッチを精製した。溶出液をＰＢＳに対して透析した後濾過滅菌し、４℃で貯蔵した。
表２１において、ＬＡＭＰ１への親和性は、ＬＡＭＰ１を用いたＥＬＩＳＡにより得られたＥＣ５０によって例示されたマウスおよびキメラｍＡｂの場合と類似したままであった。
上述したデータに基づいて、ＨＣおよびＬＣのアミノ酸配列を検証した。
ＭＡｂ１のＬＣおよびＨＣ配列を、それぞれ配列番号３５および配列番号３６に示す。
ＭＡｂ２のＬＣおよびＨＣ配列を、それぞれ配列番号３７および配列番号３８に示す。
ＩＭＧＴの学術名を使用してタンパク質配列からＣＤＲ領域の配列を推測した。
ｃｈＭＡｂ１のＬＣおよびＨＣ配列は、それぞれ配列番号１８および配列番号１７で示され、ｃｈＭＡｂ２のＬＣおよびＨＣ配列は、それぞれ配列番号２０および配列番号１９で示される。ｃｈＭＡｂ３のＬＣおよびＨＣ配列は、それぞれ配列番号４９および配列番号５０で示される。
注目すべきことに、ＶＬのＡ９、Ｌ５１、Ｌ５８、Ｇ７２およびＬ１０８位、ならびにＶＨ配列のＴ１１６位でクローンＭＡｂ２に標準的な残基を導入して、ＭＡｂ２ｃａｎを作製した。ＭＡｂ２ｃａｎのＶＨおよびＶＬの対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５および配列番号１６である。ｃｈＭＡｂ２ｃａｎのＨＣおよびＬＣ配列は、それぞれ配列番号２１および２２で示される。
クローンｃｈＭＡｂ２ｃａｎのバッチが、クローンｃｈＭＡｂ２に対応するバッチと同じ条件で作製した。これは、ＦＲにおける点変異は、結合にまったく影響を与えることなく作り出すことができるが、それより重要なのは産生プロセスの代りの選択肢を提供することであることを強調している。
クローンｃｈＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３のバッチが、クローンｃｈＭＡｂ３に対応するバッチと同じ条件で作製した。これは、ＣＤＲにおける点変異は、結合にまったく影響を与えることなく作り出すことができることを強調する。
ＳＰＲによるＬＡＭＰ１に対する親和性：
マウス、キメラ体（ｃｈｉｍｅｒ）またはヒト化抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂの結合速度論を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．、Ｕｐｐｓａｌａ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイによって決定した。簡単に言えば、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップを機器にドッキングし、室温で１：１のＮＨＳ／ＥＤＣ ７０μＬで活性化した。全てのフローセル中の活性化チップに、マウス抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１（ＢＩＡｃｏｒｅ番号ＢＲ−１００８−３９）およびウサギ抗αマウスＦｃ ＩｇＧ１（ＢＩＡｃｏｒｅ番号ＢＲ−１００８−３８）（ｐＨ５の１Ｍ酢酸緩衝液中５０μｇ／ｍＬ）を固定化した。１０μＬ／分の流速で飽和するまで固定化を実行した。次いでエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ７０μＬを注入することによりチップをブロッキングし、続いて抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１の場合は３ＭのＭｇＣｌ２で１回洗浄し、抗αマウスＦｃ ＩｇＧ１の場合は１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．７で１回洗浄した。ＬＡＭＰ１への抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂの結合を測定するために、抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）中１〜５μｇ／ｍＬで使用した。抗原（実施例６．２で説明したようにして産生された配列番号２８のタンパク質）を１から２５６ｎＭ注入した。注入期間が完了した後、同じ流速で６００秒間、ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液中で解離をモニターした。抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１の場合は２×５μＬの３ＭのＭｇＣｌ２（２×３０秒）および抗αマウスの Ｆｃ ＩｇＧ１の場合は１×３０μＬの１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７（１８０秒）を使用して、注入の間で表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して個々のセンサーグラムを分析した。
表２２に、マウス、キメラ体またはヒト化ｍＡｂのＬＡＭＰ１に対する親和性を報告する。ＭＡｂの様式とは無関係であることが見出された。
ＭＡｂ１は、４．８から８．２ｎＭの範囲のＫＤでＬＡＭＰ１に結合した。
ＭＡｂ２は、６３．５から６８．８ｎＭの範囲のＫＤでＬＡＭＰ１に結合した。
ＭＡｂ３は、４．７から７．２ｎＭの範囲のＫＤでＬＡＭＰ１に結合した。
市販の抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂ（Ｈ４Ａ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３２８６０２）は、Ｍａｂ１、Ｍａｂ２およびＭＡｂ３より有意に高いＫＤを有し、したがってそれより低い結合効率を有し、Ｋｄは約１００ｎＭである。
実施例７．２：ＭＡｂ１から得られたヒト化バリアントの入手および特徴付け
この実施例において、親マウスＩｇＧ ＭＡｂ１のヒト化バリアントをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。得られたｈｕＭＡｂ１バリアントを産生させたところ、キメラ体ｃｈＭＡｂ１と類似の特徴を示した。
実施例７．２．１：ヒト化抗ＬＡＭＰ１ ｈｕＭＡｂ１の設計
ＣＤＲグラフト化に基づくヒト化
この手法は、親マウスのＭＡｂ１のＣＤＲを関連ヒトＦＲに移植することからなる。マウスＭＡｂ１の可変軽鎖および重鎖領域を、ＩＭＧＴ情報システムからのヒト生殖細胞系配列と比較し（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００９、３７：Ｄ１００６〜Ｄ１０１２）、ヒト化ＭＡｂ１領域（ｈｕＭＡｂ１）の基礎として役立つと予想されるヒト軽鎖および重鎖可変配列を選択した。
マウス軽鎖可変領域は、ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖ＩＧＫＶ１−２７に対してＶ領域にわたり６８．８％の同一性およびＦＲ単独内では７４．７％の同一性を示した。連結領域に関して、マウスＪ領域は、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４に対して９０％の同一性を示した。結果として、７６．４％の包括的な生殖性インデックス（ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）（ＦＲのみで計算された同一性）を示すヒトＪ領域ＩＧＫＪ４に組み合わされたヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−２７が、マウスＭＡｂ１軽鎖をヒト化するためのヒトアクセプター配列として選択された。次いでこれは、マウスＭＡｂ１のＶｋ領域のＣＤＲとヒトＩＧＫＶ１−２７＿ＩＧＫＪ４領域のＦＲとで構成される抗ＬＡＭＰ１ ｍＡｂ１軽鎖のヒト化バリアントの基礎になった。
マウス重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変生殖細胞系ＩＧＨＶ１−６９に対してＶ領域にわたり６５．３％の同一性およびＦＲ単独内では７０．０％の同一性を示した。連結領域に関して、マウスＪ領域は、ヒト重鎖連結生殖細胞系ＩＧＨＪ４に対して７８％の同一性を示した。結果として、７１．４％の包括的な生殖性インデックス（ＦＲのみで計算された同一性）を示すヒト生殖細胞系Ｊ領域ＩＧＨＪ４に組み合わされたヒト生殖細胞系のＶ領域ＩＧＨＶ１−６９が、マウスＭＡｂ１重鎖領域をヒト化するためのヒトアクセプター配列として選択された。次いでこれは、マウスＭＡｂ１ Ｖｈ領域のＣＤＲとヒトＩＧＨＶ１−６９＿ＩＧＨＪ４領域のＦＲとで構成される抗ＬＡＭＰ１ ｍＡｂ１重鎖のヒト化バリアントの基礎になった。
しかしながら、いくつかのＦＲ残基は、ＣＤＲのコンフォメーションに影響を与え、したがって抗原結合にも影響を与える可能性があることから、それらは抗体の生物活性にとっても重要である。親抗体の結合特異性および親和性を保つために、ＦＲグラフト抗体の選択された位置でマウスアミノ酸への復帰変異を導入してもよい。したがって、設計プロセスにおける次の工程は、これらのアミノ酸残基のどれがＣＤＲループのコンフォメーションまたは方向を変更する可能性が高いかどうかを決定するために、ヒト化バリアントのタンパク質配列を研究することであった。Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ製のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ ３．１のモデル抗体フレームワークプロトコールを使用して、マウスおよびヒト化抗体両方の可変領域の３Ｄ相同性モデルを組み立てた。
マウスＭＡｂ１のＶＬおよびＶＨ配列を、タンパク質データベース（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８：２３５〜２４２）と比較した。
ＰＤＢ識別番号２ＡＤＦの抗血栓性モノクローナル抗体８２Ｄ６Ａ３の構造モデルを、軽鎖用のテンプレートとして使用し（軽鎖フレームワークにおいて９６．６％の同一性）、ＰＤＢ識別番号３Ｄ８５の中和ＦＡＢと複合体化したＩＬ−２３の構造モデルを、重鎖用のテンプレートとして使用した（重鎖フレームワークにおいて８３．５％の同一性）。
同じ方式で、ヒト化バリアント（ヒトＦＲおよびマウスＣＤＲ）のＶＬおよびＶＨ配列を、タンパク質データベース（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８：２３５〜２４２）と比較した。ＰＤＢ識別番号３ＡＡＺのモデルを、軽鎖用のテンプレートとして使用し（軽鎖フレームワークにおいて８６．６％の同一性）、ＰＤＢ識別番号３ＫＤＭのモデルを、重鎖用のテンプレートとして使用した（重鎖フレームワークにおいて８４．３％の同一性）（全てのＰＤＢの参照番号は、２０１３年１１月２６日に利用可能になったＰＤＢ識別番号を指す）。
両方の３Ｄ相同性モデル、すなわちマウスＭＡｂ１およびヒト化バージョンを比較して、マウスからヒトバージョンへの各アミノ酸置換を慎重に調べた。ＣＤＲのコンフォメーションに影響を与える可能性がある位置でマウスからヒト残基への置換が行われた場合、マウス残基への復帰変異を行った。
分子動力学的軌道に基づくヒト化（４Ｄヒト化プロトコール）
その後、一般化Ｂｏｒｎインプリシット溶媒（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖｅｎｔ）中で、５００Ｋの温度で１．１ナノ秒（ｎｓ）でタンパク質主鎖への制約を用いて、マウスＭＡｂ１（上記の章でグラフト化プロトコールに関して説明した通り）の３Ｄ相同性モデルの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行った。最後の１ｎｓの間の１００ピコ秒（ｐｓ）ごとに、この第一のＭＤ試行から１０種の多様なコンフォメーションが抽出された。次いでこれらの多様なコンフォメーションをそれぞれ、タンパク質主鎖への制約を用いない３００Ｋの温度、２．３ｎｓでのＭＤシミュレーションに送った。１０回のＭＤ試行のそれぞれにおいて、次いで、ＭＤ軌道からの毎１ｐｓでの最後の２，０００枚のスナップショットを使用して、マウスＭＡｂ１アミノ酸ごとに、参照ミドイド（ｍｅｄｏｉｄ）位置と比較したその根平均二乗変位（ｒｍｓｄ）を計算した。所定のアミノ酸の１０回の別々のＭＤ試行における平均ｒｍｓｄを、全てのＭＡｂ１マウスアミノ酸の総体的な平均ｒｍｓｄと比較することによって、そのアミノ酸が、ＭＤ中に見られるように、Ｂ細胞受容体と相互作用する可能性が高いとみなされる程度に十分フレキシブルであり、免疫応答の活性化に関与するかどうかが決断される。ＣＤＲとその５Å近傍を除いて、２８種のアミノ酸がマウスＭＡｂ１抗体においてフレキシブルであると同定された。
次いで、分子動力学シミュレーションの２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）中での６０種の最もフレキシブルなマウスＭＡｂ１のアミノ酸の動きを、それぞれ同じシミュレーションが試行された４９種のヒト３Ｄ相同性モデルの対応するフレキシブルなアミノ酸の動きと比較した。これらの４９種のヒトモデルは、７種のヒト軽鎖（すなわちｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖラムダ１、ｖラムダ２、ｖラムダ３）の代表的なパネルと、７種のヒト重鎖（すなわちｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）の代表的なパネルとを系統的に組み合わせることによって組み立てられた。
ｖｋ１〜ｖｈ１ｂの組合せは、マウスＭＡｂ１抗体のフレキシブルなアミノ酸と比較して、そのフレキシブルなアミノ酸の最大の４Ｄ類似性を示した；それゆえにこのモデルを使用して、フレキシブルなアミノ酸に的を絞ってＭＡｂ１抗体をヒト化した。マウスＭＡｂ１とｖｋ１〜ｖｈ１ｂアミノ酸との対になったアミノ酸の会合に関して、２つの対応する相同性モデルのアルファ炭素の最適な３Ｄ重ね合わせに基づいて、これら２つの配列を並べた。
加えて、得られたヒト化ＭＡｂ１抗体の安定性を改善するために、ＣＤＲを除いて、それらそれぞれの標準的な配列と比べて低い出現頻度の軽鎖および重鎖のアミノ酸を、最も高頻度で見出されるアミノ酸（ΔΔＧｔｈ＞０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に変異させることが以前から提唱されている（Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６、３６２、５８０〜５９３）。ＬＣおよびＨＣのコンセンサス変異の第一のリストは、最も近いヒトモデルで見出されるアミノ酸（すなわちｖｋ１〜ｖｈ１ｂ）に限定されている。これらの変異のうち「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」ゾーンに位置するものはない（Ｆｏｏｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２、２２４、４８７〜４９９）。これらのコンセンサス変異が抗ＬＡＭＰ１のＭＡｂ１抗体を安定化する可能性について考慮するには、他の基準が考慮される。これらの基準は、表面におけるハイドロパシーの好都合な変化または分子機構に基づき予測された変異の安定化である。文献（Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ，Ｈ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６、３６２、５８０〜５９３；Ｓｔｅｉｐｅ Ｂ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４、２４０、１８８〜１９２）で成功したと報告された変異の安定化を考慮に入れた。
得られたヒト化ＶＬおよびＶＨ領域
両方の手法、すなわちＣＤＲグラフト化および４Ｄプロトコールに基づき、可変軽鎖に関する３つのバージョン（ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３）および可変重鎖に関する３つのバージョン（ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３）が提唱されている。ヒト化ＭＡｂ１のＶＬおよびＶＨバリアントそれぞれにおいて変異したアミノ酸残基の特定の組合せが、それぞれ表２３および表２４に記載されている。ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインの完全なアミノ酸配列が、表２５に記載されている。
可変軽鎖領域の場合：
配列番号５６を有するヒト化ＶＬ１バリアントは、配列番号５を有するマウス配列と比較して合計１２種の変異を提示した。このバリアントは、ｍＡｂ構造、ＣＤＲコンフォメーションに、したがってその標的への結合に負の影響を有する疑いがあるためになされた６つの復帰変異を有するヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−２７＿ＩＧＫＪ４配列のフレームワークから得られた。加えて、４３および８３位におけるアミノ酸に関して、ＩＧＫＶ１生殖細胞系に存在するより高頻出のアミノ酸における変異（Ａ４３およびＦ８３）が好ましかった。
配列番号５７を有するヒト化ＶＬ２バリアントは、マウスＭＡｂ１軽鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸とｖｋ１ヒト軽鎖配列との直接の比較から得られた２つの変異を提示した。
配列番号５８を有するヒト化ＶＬ３バリアントはＶＬ２から得られ、コンセンサス（ｖｋ１配列）であり場合により安定化している６つの新しい変異を包含していた。
ｈｕＭＡｂ１の個々のヒト化軽鎖、したがってｈｕＭａｂ１＿１、ｈｕＭａｂ１＿２およびｈｕＭａｂ１＿３のＶＬにおいて変異したアミノ酸残基の特定の組合せが、表２３に記載されている。
可変重鎖領域の場合：
ＶＨ１バリアント（配列番号５３）は、マウス配列（配列番号１）と比較して合計１５種の残基置換を提示した。このバリアントは、ｍＡｂ構造、ＣＤＲコンフォメーションに、したがってその標的への結合に負の影響を有することが予想されるためになされた９つの復帰変異を有するヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−６９＿ＩＧＨＪ４配列のフレームワークから得られた。加えて、ＣＤＲ近傍の配列番号１のＫ７４をＴに変異させて、コンジュゲーションプロセスによって標的化される場合に起こり得る問題に対処した。
ＶＨ２バリアントは、７種の変異を提示する：６種の変異は、マウスＭＡｂ１重鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸とｖｈ１ｂヒト重鎖配列との直接の比較から得られたものであり、加えて配列番号１のＫ７４のＴへの変異は、コンジュゲーションプロセスによって標的化される場合に起こり得る問題に対処するためのものである。
ＶＨ３バリアントはＶＨ２から得られ、コンセンサス（ｖｈ１ｂ配列）であり、場合により安定化している７種の新しい変異を包含していた。
ｈｕＭＡｂ１の個々のヒト化軽鎖、したがってｈｕＭａｂ１＿１、ｈｕＭａｂ１＿２およびｈｕＭａｂ１＿３のＶＨにおいて変異したアミノ酸残基の特定の組合せが、表２４に記載されている。
得られたヒト化配列を、配列類似性に関して、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）データベース（（ＰＬｏｓ Ｂｉｏｌ（２００５）３（３）ｅ９１）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ；）に対してブラスト処理したところ、上記配列は、そこに列挙された公知のＢ細胞またはＴ細胞エピトープをまったく含有していないことが確実になった。
ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインの完全なアミノ酸配列が、表２５に記載されている。
実施例７．２．２：３種のヒト化抗ＬＡＭＰ１のｈｕＭＡｂ１バリアントの産生および特徴付け
実施例７．２．１で説明したヒト化可変ＶＨおよびＶＬドメインをコードする対応する核酸配列をＧｅｎｅａｒｔで合成し、それぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣカッパ定常ドメインコード配列と融合させて発現ベクターにクローニングし、次いで実施例６．２で説明したような２９３−Ｆ細胞中での一過性発現によってヒト化ｍＡｂのバッチを作製した。３種のｍＡｂは、
− ＬＣ１（ＶＬ１−ｈｕＣｋ）（配列番号５９）およびＨＣ１（ＶＨ１−ｈｕＩｇＧ１）（配列番号６０）を含有するｈｕＭＡｂ１＿１、
− ＬＣ２（ＶＬ２−ｈｕＣｋ）（配列番号６１）およびＨＣ２（ＶＨ２−ｈｕＩｇＧ１）（配列番号６２）を含有するｈｕＭＡｂ１＿２、
− ＬＣ３（ＶＬ３−ｈｕＣｋ）（配列番号６３）およびＨＣ３（ＶＨ３−ｈｕＩｇＧ１）（配列番号６４）を含有するｈｕＭＡｂ１＿３
を指す。
陰性対照を作製し、これを、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡと称した。これは、ＬＣｎｅｇＡ（ＶＬ１＿３６Ａ−９５Ａ−ｈｕＣｋ）（配列番号６５）およびＨＣｎｅｇＡ（ＶＨ１＿１０１Ａ−ｈｕＩｇＧ１）（配列番号６７）を含有する。
別の対照を作製し、これを、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢと称した。これは、ＬＣ１（ＶＬ１−ｈｕＣｋ）（配列番号５９）およびＨＣｎｅｇＢ（ＶＨ１−ｈｕＩｇＧ１＿２６６Ａ）（配列番号６８）を含有する。ｈｕＩｇＧ１における変異２６６Ａは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１によって説明されている学術名に従ってＤ２６５Ａ変異に対応する。これは、ＦｃγＲおよびＡＤＣＣへの結合を有意に減少させることが報告されている（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（１）：６５９１〜６６０４、２００１）。
ＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩへの結合の有意な減少も、組換えタンパク質（組換えヒトＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、参照番号１２５７−ＦＣ−０５０、組換えヒトＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、参照番号１３３０−ＣＤ−０５０／ＣＦ、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａ、参照番号４３２５−ＦＣ−０５０、全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから得られた）を用いたＥＬＩＳＡにより検証された。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってバッチを精製した。溶出液をＰＢＳに対して透析した後濾過滅菌し、４℃で貯蔵した。実施例７で説明したように高分解能質量分析によってバッチを分析した。データは、表２６のアミノ酸配列から取り出したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ値と一致した。
実施例６．２で説明した分泌されたヒトＬＡＭＰ１タンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡによりヒト化抗ＬＡＭＰ１のｍＡｂへの結合ドメインを決定した。表２７においてＬＡＭＰ１を用いたＥＬＩＳＡにより得られたＥＣ５０によって例示されたように、ＬＡＭＰ１に対する親和性は、キメラ体およびヒト化ｍＡｂの場合と類似したままであった。ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡとの結合は検出されなかった。
実施例７．２．３：カニクイザルＬＡＭＰ１とのｈｕＭＡｂ１＿１；ｈｕＭＡｂ１＿２およびｈｕＭＡｂ１＿３の交差反応性
ｈｕＭＡｂ１＿１、ｈｕＭＡｂ１＿２およびｈｕＭＡｂ１＿３抗体が、それぞれＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１またはカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合する能力に関して、それらをフローサイトメトリーにより査定した。実施例４．７で説明したようにしてＨＣＴ１１６安定クローンを得た。実施例４．７で説明したプロトコールに従ってＨＥＫ２９３安定クローンを得た。表２８に、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定されたＥＣ５０を列挙する。
結果から、ｈｕＭＡｂ１＿１は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合し、ＥＣ５０の比率は２であることが示される。ＨｕＭＡｂ１＿１は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。ＨｕＭＡｂ１＿２は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合し、ＥＣ５０の比率は２．０１である。ＨｕＭＡｂ１＿２は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。
ＨｕＭＡｂ１＿３は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合し、ＥＣ５０の比率は１．７１である。ＨｕＭＡｂ１＿３は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。
実施例７．３：結晶解析によるｈｕＭＡｂ１＿１のエピトープ結合部位の同定
実施例７．３．１：Ｆａｂ１／ＬＡＭＰ１複合体の入手
ｈｕＭＡｂ１＿１からのＦａｂの発現および精製
ｈｕＭＡｂ１＿１（Ｆａｂ１）からの組換えＦａｂを、それぞれ配列番号６８および６９を有する軽鎖ＬＣ１またはＨＣ１から得られたＣ末端にＨｉｓ−タグを有する重鎖をコードする２種のプラスミドを使用して、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得た。細胞を浄化した後、固定化された金属親和性樹脂（ＩＭＡＣ）上に増殖上清を適用した。樹脂から溶出させた後、高度に純粋なＦａｂ１を含有する画分をプールし、ＰＢＳに対して十分に透析した。Ｆａｂ１溶液を４℃で保存した。
ヒト非グリコシル化ＬＡＭＰ１−２９−１９５の発現および精製
非グリコシル化ＬＡＭＰ１ドメインを得るために、細菌発現系を使用した。配列番号７０を有するヒトＬＡＭＰ１タンパク質のドメインＬ１−Ｌ２（ＴｒｘＡ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−ＬＡＭＰ１−２９−１９５、ここでＴｈｒはトロンビン切断部位を意味する）を発現させるために、チオレドキシン融合タンパク質を設計した。ｔｒｘＢ−ｇｏｒ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株でＴ７プロモーターを使用して融合タンパク質を発現させた。バイオリアクターで、商標付きの化学組成がわかっている培地中で組換え株の高い細胞密度での培養を行った。細胞ペーストから、フレンチプレス式に溶菌させることによって融合タンパク質を抽出し、超遠心分離法で細胞溶解産物を透明化し、透明化した上清をＩＭＡＣカラムに適用した。樹脂から溶出させた後、組換えタンパク質を含有する画分をプールし、トロンビンプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で１時間使用してＴｒｘＡ−Ｈｉｓを切り離した。次いでこの溶液を、それぞれトロンビンと遊離のＴｒｘＡ−Ｈｉｓ融合パートナーを除去するために、ベンズアミジンセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＩＭＡＣカラムに適用した。精製されたタグのないＬＡＭＰ１−２９−１９５ドメインを、複合体の製造まで４℃で保存した。タグのないＬＡＭＰ１−２９−１９５ドメインの配列は、配列番号７１で示される。
複合体の製造および精製
組換えＦａｂ（Ｆａｂ１）および抗原（タグのないＬＡＭＰ１−２９−１９５ドメイン）を１．５：１のモル比で混合し、室温で３０分間インキュベートし、スーパーデックス２００ＰＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での分取用サイズ排除によって複合体をさらに精製し、ＰＢＳで平衡化した。高度に純粋な複合体を含有する画分をプールし、結晶学アッセイまで４℃で保存した。
実施例７．３．２：Ｆａｂ１／ＬＡＭＰ１の構造決定
結晶化およびデータ収集
ｐＨ７の１０ｍＭのＰＢＳ中の複合体を１２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。シッティングドロップ法を使用して結晶化を行った。複合体は、２０％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭのＮａＦ（化合物１）および２０％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭのｐＨ７のＤＬ−リンゴ酸中で結晶化した（化合物２）。凍結の前に凍結防止剤として２５％エチレングリコールが入れられた。
ビームラインＩＤ２９ ＥＳＲＦで両方の結晶からデータセットを収集した。
結晶は、同じ空間群Ｃ２中、２．３７Å（化合物１）または２．５１Å（化合物２）で回折した。
構造の解明
ＰＤＢ構造を使用して４ＪＧ０で参照することにより、Ｆａｂ１の定常ドメインのモデルを得た。Ｍａｅｓｔｒｏ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ）で可変ドメインのモデルを構築した。
両方のデータセットにおいて、ＣＣＰ４の組（Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６７（２０１１）、２３５〜２４２）のＰｈａｓｅｒ（Ｃｏｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２００７）４０、６５８〜６７４）を使用して分子置換を実行したが、化合物２のみ成功した：最初のリファインメント試行から、非対称単位中に２つのＦａｂの存在が確認された。可変ドメイン上に追加の密度を見ることができたが、部分的であり抗原の位置付けるには不十分であった。
化合物２での以前の試行からの結果を使用して、化合物１で第二の分子置換を実行した。今回は、１つの可変ドメイン上に明確な密度が見ることができる、手作業でのＬａｍｐ１分子の構築が可能になった。次いで、２つの複合体間の非結晶学的な対称性を使用して第二のＬａｍｐ１分子を構築した。
Ｂｕｓｔｅｒ（Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴ ２．１１．５、Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を２．３７Åで使用して、２６．１％のＲフリーおよび２２．６％のＲファクターに構造を洗練させた。
結果
非対称単位中に２つのＦａｂ１／ＬＡＭＰ１複合体があり、総体的な温度因子は有意に異なっている。２つのタンパク質間の相互作用は両方の複合体で同一であり；結果として、最も安定な複合体を分析用の参照として採用した。
配列番号２４のアミノ酸Ａｌａ２９〜Ａｒｇ１９５に対応するＬＡＭＰ１の第一の内腔ドメインは、主としてＦａｂ１の重鎖と相互作用した。図１３に、パラトープの一部（すなわち抗原原子の４Ａ内の原子を有する残基）であるＦａｂ１の残基を示す。パラトープの一部であるアミノ酸は、軽鎖中、より正確には配列番号６８のＡｓｐ３０、Ａｒｇ３１およびＴｙｒ３２を有するＣＤＲ１−Ｌならびに配列番号６８のＡｓｐ５０を有するＣＤＲ２−Ｌ中に局在していた。これらはさらに、重鎖中、より正確にはＣＤＲ１−Ｈ（Ｉｌｅ２８、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｓｎ３３）、ＣＤＲ２−Ｈ（Ｔｙｒ５２、Ａｓｎ５５、Ａｓｐ５７、Ｐｒｏ５９）、ＦＲ３ループ（Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｓｅｒ７７）およびＣＤＲ３−Ｈ（Ａｓｎ１００、Ｔｒｐ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｈｅ１０５）配列番号６９中に局在していた。
Ｆａｂ１のＬＡＭＰ１のエピトープは、Ｆａｂ１原子の４Ａ内の原子を有する残基として決定され、以下の配列において太字／下線で示され、さらに図１４にも示される：
結晶解析によって同定された前記エピトープは、配列番号２４のアミノ酸Ａｓｎ３５、Ｃｙｓ８０、Ｇｌｙ８１、Ｇｌｕ８３、Ａｓｎ８４、Ａｒｇ１０６、Ａｓｎ１０７、Ａｌａ１０８、Ｉｌｅ１４９、Ａｓｐ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｔｙｒ１７８、Ｓｅｒ１８０、Ａｓｎ１８１、Ａｒｇ１８６およびＧｌｙ１８７からなる。
図１に示したアライメントから見ることができるように、カニクイザルとヒトとの間で、エピトープ領域中に１つの残基の差、すなわち：配列番号２４の１８７位におけるＧｌｙ１８７Ｇｌｕの差しかない。この変異モデルを組み立て、最小化した：結果から、図１５に示すように軽鎖Ｔｙｒ３２の側鎖が動き、ＬＡＭＰ１のＬｙｓ１５１がわずかに動くのであれば、Ｆａｂ１への結合が可能なままであることが示される。
ここで得られた結晶構造に基づいて、親和性成熟の領域を示唆することが可能である。２つのホットスポットは、配列番号５３の重鎖配列におけるアミノ酸Ｉｌｅ２８と、配列番号５３の重鎖配列におけるアミノ酸Ａｓｎ５５とである可能性がある。疎水性残基Ｉｌｅ２８をグルタミンに置き換えることにより、ＬＡＭＰ１（配列番号２４）のすぐ近くのＧｌｙ８１およびＡｓｎ３５との相互作用が起こる可能性があり、図１６に示されるように２つのタンパク質間の結合を改善すると予想される。Ａｓｎ５５をアルギニンに変異させることは、図１７に示されるように、ＬＡＭＰ１（配列番号２４）のＡｓｎ８７、Ａｒｇ１０６およびＴｈｒ１０７への相互作用を追加すると予想される。
〔実施例８〕
ＡＤＣの産生および特徴付け
実施例８．１：メイタンシノイドを用いたＡＤＣの産生および特徴付け
ＤＡＲ計算：
コンジュゲートは、一般的に、抗体に共有結合した１から１０分子のメイタンシノイドを含む（いわゆる、「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」）。この数値は、コンジュゲーションに使用される実験条件（例えばメイタンシノイド／抗体比、反応時間、使用される場合は溶媒および共溶媒の性質）と共に使用される抗体およびメイタンシノイドの性質に応じて変更が可能である。したがって、抗体とメイタンシノイドとの接触により、異なる薬物対抗体比によって互いに異なる数種のコンジュゲート；場合により裸の抗体；場合により凝集体を含む混合物が生じる。したがって決定されるＤＡＲは平均値である。
ＤＡＲを決定するのに本明細書で使用される方法は、実質的に精製されたコンジュゲートの溶液の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比率を分光光度法により測定することからなる。特に、前記ＤＡＲは、抗体（εＡ２８０およびεＡ２５２）およびメイタンシノイド（εＤ２８０＝５，１８０Ｍ−１ｃｍ−１およびεＤ２５２＝２６，１５９Ｍ−１ｃｍ−１）に関してそれぞれ２８０および２５２ｎｍで測定された吸光係数を使用して分光光度法により決定できる。計算方法は、Ａｎｔｏｎｙ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編集）、ＬＬＣ、２００９、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、５２５巻、４４５、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅから得られ、以下でより詳細に説明される：
２５２ｎｍ（Ａ２５２）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）におけるコンジュゲートの吸光度を分光光度計装置で測定して、ＤＡＲを計算した。吸光度は、以下のように示すことができる：
Ａ２５２＝（ｃＤ×εＤ２５２）＋（ｃＡ×εＡ２５２）
Ａ２８０＝（ｃＤ×εＤ２８０）＋（ｃＡ×εＡ２８０）
式中：
・ｃＤおよびｃＡはそれぞれ、メイタンシノイドおよび抗体の溶液中の濃度である
・εＤ２５２およびεＤ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるメイタンシノイドのモル吸光係数である
・εＡ２５２およびεＡ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数である。
２つの未知数を含むこれらの２つの方程式の解により、以下の方程式がもたらされる：
ｃＤ＝［（εＡ２８０×Ａ２５２）−（εＡ２５２×Ａ２８０）］／［（εＤ２５２×εＡ２８０）−（εＡ２５２×εＤ２８０）］
ｃＡ＝［Ａ２８０−（ｃＤ×εＤ２８０）］／εＡ２８０
次いで薬物濃度の抗体濃度に対する比率から平均ＤＡＲを計算する：
ＤＡＲ＝ｃＤ／ｃＡ
コンジュゲートの脱グリコシル化および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）
脱グリコシル化とは、グリコシダーゼの手段によって酵素消化する技術である。脱グリコシル化は、コンジュゲート５０μｌと、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ（ＰＮ Ｇａｓｅ Ｆ）酵素（凍結乾燥酵素１００ユニット／水１００μｌ）１０μｌとから作り出した。培地をボルテックス混合し、３７℃で一晩維持した。次いで脱グリコシル化された試料は、ＨＲＭＳですぐに分析できる状態であった。Ｗａｔｅｒｓ ＸＥＶＯ ＱＴｏｆシステムでエレクトロスプレーポジティブモード（ＥＳ＋）により質量スペクトルを得た。クロマトグラフ条件は以下の通りである：カラム：ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ４、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸：Ｂ；ＣＨ３ＣＮ＋０．１％ギ酸；カラム温度：７０℃；流速０．５ｍＬ／分；勾配溶出（１０分）：２０％Ｂを２分５０秒；２０から８０％のＢを２分５秒；８分５０秒：８０％Ｂ；８分５５秒：２０％Ｂ；１０分：２０％Ｂ。
緩衝液の内容物
− 緩衝液Ａ（ｐＨ６．５）：ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、リン酸カリウム 緩衝液（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）
− ＨＧＳ緩衝液（ｐＨ５．５）：ヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース ５％（ｗ／ｖ）、ＨＣｌ（８ｍＭ）
− ＰＢＳ（ｐＨ７．４）：ＫＨ２ＰＯ４（１．０３ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５５．１７ｍＭ）、Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ（２．９７ｍＭ）
使用される略語
ＤＡＲ：薬物抗体比；ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸；ＨＲＭＳ：高分解能質量分光分析；ニトロ−ＳＰＤＢ：ブタン酸、４−［（５−ニトロ−２−ピリジニル）ジチオ］−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルエステル（ＷＯ２００４０１６８０１号特許で説明されているようにして製造可能）；ＲＴ：室温。
実施例８．１．１：抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（キメラ体ｃｈＭＡｂ１）
ＭＡｂ１の裸のキメラ体を製造した。これは、ヒトＩｇＧ１、Ｃｋアイソタイプを含むマウスクローンＭＡｂ１から得られたキメラｍＡｂ（ｃｈＭＡｂ１）であり、ここでＣｋアイソタイプは、配列番号１７の重鎖配列および配列番号１８の軽鎖配列を有する。
この実施例において、切断性コンジュゲート（他と区別して、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１またはｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と呼ばれる）を、実施例７で説明したような裸のｃｈＭＡｂ１から、さらに配列番号１７および１８に対応するキメラｍＡｂのＬＣおよびＨＣ配列を有するＤＭ４から得た。
ＤＭ４は、以下の化学名Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシンを有する。
ｃｈＭＡｂ１の場合、εＡ２８０＝２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝８０，２４０Ｍ−１ｃｍ−１である。
切断性キメラ体ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの製造および分析データ
緩衝液Ａ中８．２３ｍｇ／ｍＬの濃度のｃｈＭＡｂ１抗体の溶液１２．１ｍＬに、１ＮのＨＥＰＥＳ ４６５μＬ、ＤＭＡ １ｍＬおよび５．９倍の過剰モル量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。室温で１時間３０分後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液１７．３ｍＬおよびＤＭＡ １．６４ｍＬで希釈し、その後ＤＭＡ中１５ｍＭのＤＭ４溶液を添加した。
反応混合物を室温で２時間４０分撹拌し、次いでＳｉｕｓ−ＬＳｎ Ｐｒｏｓｔｒｅａｍ ３０ｋＤカセットでのＴＦＦによって精製した。試料をＨＧＳ緩衝液６００ｍＬに対して透析濾過し、濃縮し、収集し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過し、生成物（１１ｍＬ）を得た。
最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり４．５個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（５．７ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図７を参照されたい。
実施例８．１．２：抗体薬物コンジュゲート（ヒト化ｈｕＭＡｂ１＿３）
裸のヒト化ｈｕＭＡｂ１＿３を実施例７．２．２で説明したようにして製造した。これは、ヒトＩｇＧ１およびＣｋアイソタイプを含むマウスクローンＭＡｂ１から得られたヒト化ｍＡｂであり、ここでＣｋアイソタイプは、配列番号６４の重鎖（ＶＨ３−ｈｕＩｇＧ１）の配列および配列番号６３の軽鎖（ＶＬ３−ｈｕＣｋ）配列を有する。
本明細書で述べた吸光係数は、抗体ごとにそれぞれ２８０および２５２ｎｍで測定され、εＡ２８０＝２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝７９，４１３Ｍ−１ｃｍ−１であった。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿３コンジュゲートの製造
ＤＰＢＳ中５．１８ｍｇ／ｍＬの濃度のｈｕＭＡｂ１＿３抗体の溶液３．６ｍＬに、ＤＭＡ ０．３１６ｍＬおよび５．２倍の過剰モル量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。室温で２時間１５分後、０．３当量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を添加した。１時間４５分後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液１．９９ｍＬおよびＤＭＡ ０．１８７ｍＬで希釈し、その後ＤＭＡ中１５ｍＭのＤＭ４溶液を添加した。
反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いでｐＨ＝５．５のＨＧＳ緩衝液で前もって平衡化したゲル濾過（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩用、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。収集した試料をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過して生成物（９．４ｍＬ）を得た。この溶液を、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０．０８ｍＬデバイス（ＣＨＲＦＡ１ＰＤ０９）に注入した。収集した試料をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ＫＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで濃縮し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過し、生成物（４．３ｍＬ）を得た。
最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり３．５個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（１．９ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図１８を参照されたい。
実施例８．１．３：抗体薬物コンジュゲート（ヒト化ｈｕＭＡｂ１＿１）
裸のヒト化ｈｕＭＡｂ１＿１を実施例７．２．２で説明したようにして製造した。これは、ヒトＩｇＧ１およびＣｋアイソタイプを含むマウスクローンＭＡｂ１から得られたヒト化ｍＡｂであり、ここでＣｋアイソタイプは、配列番号６０の重鎖（ＶＨ１−ｈｕＩｇＧ１）の配列および配列番号５９の軽鎖配列（ＶＬ１−ｈｕＣｋ）を有する。
抗体ごとにそれぞれ２８０および２５２ｎｍで吸光係数を測定したところ、εＡ２８０＝２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝８０，０４１Ｍ−１ｃｍ−１であった。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１コンジュゲートの製造
ＤＰＢＳ中４．８１ｍｇ／ｍＬの濃度のｈｕＭＡｂ１＿１抗体の溶液３．６ｍＬに、ＤＭＡ ０．３２１ｍＬおよび５．０倍の過剰モル量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。室温で２時間後、０．３当量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を添加した。１時間３０分後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液１．５９ｍＬおよびＤＭＡ ０．１４７ｍＬで希釈し、その後ＤＭＡ中１５ｍＭのＤＭ４溶液を添加した。
反応混合物を室温で１時間３０分撹拌し、次いでｐＨ＝５．５のＨＧＳ緩衝液で前もって平衡化したゲル濾過（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩用、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。収集した試料をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過して、溶液９．４ｍＬを得た。この溶液を、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０．０８ｍＬデバイス（ＣＨＲＦＡ１ＰＤ０９）に注入した。収集した試料をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ＫＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで濃縮し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過し、生成物（４．９ｍＬ）を得た。
最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり３．４個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（１．４５ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図１９を参照されたい。
実施例８．１．４：抗体薬物コンジュゲート（ヒト化ｈｕＭＡｂ１＿２）
裸のヒト化ｈｕＭＡｂ１＿２を、実施例Ｂ７で説明したようにして製造した。これは、ヒトＩｇＧ１およびＣｋアイソタイプを含むマウスクローンＭＡｂ１から得られたヒト化ｍＡｂであり、ここでＣｋアイソタイプは、配列番号６２の重鎖配列（ＶＨ２−ｈｕＩｇＧ１）および配列番号６１の軽鎖配列（ＶＬ２−ｈｕＣｋ）を有する。
抗体ごとにそれぞれ２８０および２５２ｎｍで吸光係数を測定したところ、εＡ２８０＝２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝７９，４７４Ｍ−１ｃｍ−１であった。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿２コンジュゲートの製造
ｂＤＰＢＳ中５．０６ｍｇ／ｍＬの濃度のｈｕＭＡｂ１＿２抗体の溶液３．６ｍＬに、ＤＭＡ ０．３１７ｍＬおよび５．２倍の過剰モル量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。２時間後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液１．８９ｍＬおよびＤＭＡ ０．１７９ｍＬで希釈し、その後ＤＭＡ中１５ｍＭのＤＭ４溶液を添加した。
反応混合物を室温で１時間３０分撹拌し、次いでｐＨ＝５．５のＨＧＳ緩衝液で前もって平衡化したゲル濾過（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩用、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。収集した試料をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過して生成物（９．７ｍＬ）を得た。
最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり４．０５個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（１．３６ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図２０を参照されたい。
実施例８．１．５：抗体薬物コンジュゲート（キメラ体ｃｈＭＡｂ２ｃａｎ）
裸のキメラ体ｃｈＭＡｂ２ｃａｎを実施例７で説明したようにして製造した。これは、ヒトＩｇＧ１およびＣｋアイソタイプを含むマウスクローンＭＡｂ２から得られたキメラ体ｍＡｂである。Ｃｋアイソタイプは、配列番号２１の重鎖配列および配列番号２２の軽鎖配列を有する。
抗体ごとにそれぞれ２８０および２５２ｎｍにおける吸光係数は、εＡ２８０＝２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝７４，４１７Ｍ−１ｃｍ−１であった。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２ｃａｎコンジュゲートの製造
ＤＰＢＳ中５．２１ｍｇ／ｍＬの濃度のｃｈＭＡｂ２ｃａｎ抗体の溶液９．２ｍＬに、ＤＭＡ ０．８１３ｍＬおよび５．０倍の過剰モル量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。室温で２時間後、０．２当量のＤＭＡ中１５ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を添加した。１時間３０分後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液５．１７ｍＬおよびＤＭＡ ０．４９７ｍＬで希釈し、その後ＤＭＡ中１５ｍＭのＤＭ４溶液を添加した。
反応混合物を室温で１時間３０分撹拌し、次いでｐＨ＝５．５のＨＧＳ緩衝液で前もって平衡化したゲル濾過（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩用、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。収集した試料をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過して、生成物（２３ｍＬ）を得た。
最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり３．７個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（１．５８ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図２１を参照されたい。
実施例８．１．６：抗体薬物コンジュゲート（キメラ体ｃｈＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３）
裸のキメラ体ｃｈＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３を実施例７で説明したようにして製造した。これは、ヒトＩｇＧ１およびＣｋアイソタイプを有するマウスクローンＭＡｂ３から得られたキメラ体ｍＡｂであり、ここでＣｋアイソタイプは、配列番号４９の重鎖配列および配列番号８１の軽鎖配列を有する。
抗体ごとにそれぞれ２８０および２５２ｎｍで吸光係数を測定したところ、εＡ２８０＝２３４５３９Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ２５２＝８５３０３Ｍ−１ｃｍ−１であった。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３ ＶＬＲ２４−Ｒ９３コンジュゲートの製造
ＤＰＢＳ中６．８５ｍｇ／ｍＬの濃度のｃｈＭＡｂ３＿ＶＬＲ２４−Ｒ９３抗体の溶液７．３ｍＬに、ＰＢＳ ７．７ｍＬ、ＤＭＡ １．５ｍＬおよび５．０倍の過剰モル量のＤＭＡ中１０ｍＭのニトロ−ＳＰＤＢ溶液を磁気撹拌下で添加した。３時間３０分後、反応混合物に、Ｌ−ＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５．１ｍＭ）１５５μＬを添加した。反応混合物を室温で１時間３０分撹拌し、次いでｐＨ＝５．５のＨＧＳ緩衝液で前もって平衡化したゲル濾過（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩用、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。収集した試料をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）０．２２μＭ ＰＶＤＦフィルターで濾過し、生成物（２３ｍＬ）を得た。最終的なコンジュゲートを分光光度法によりアッセイした；抗体分子１つ当たり３．７個のＤＭ４の平均ＤＡＲ（２．０ｍｇ／ｍＬ）が決定された。ＨＲＭＳデータ：図２２を参照されたい。
実施例８．１．７：ヒトＬＡＭＰ１／ｃｙｎｏＬＡＭＰ１に対する、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２、およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３の交差反応性
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３が、それぞれＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１またはカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合する能力に関して、それらをフローサイトメトリーにより査定した。実施例４．７のプロトコールで説明したようにして、ＨＣＴ１１６安定クローンおよびＨＥＫ２９３安定クローンを得た。表２９に、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定したＥＣ５０を列挙する。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合した。ＥＣ５０の比率が１であったことから、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合した。ＥＣ５０の比率が２．３であったことから、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合した。ＥＣ５０の比率が０．７であったことから、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。
実施例８．１．８：ヒトＬＡＭＰ１／ｃｙｎｏＬＡＭＰ１に対する、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の交差反応性
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１が、いずれも実施例４．７のプロトコールで説明したようにして得られたそれぞれＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３安定クローンの表面で発現されたヒトＬＡＭＰ１またはカニクイザルＬＡＭＰ１タンパク質に結合する能力に関して、それらをフローサイトメトリーにより査定した。表３０に、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定したＥＣ５０を列挙する。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、類似した親和性でヒトおよびカニクイザル由来のＬＡＭＰ１に結合し、ＥＣ５０の比率は２．６５である。それゆえに、ＤＭ４−ＳＰＤＢｈｕＭＡｂ１＿１は、カニクイザルＬＡＭＰ１と交差反応した。
実施例８．２：トマイマイシン（ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎｅ）二量体を用いたＡＤＣの産生および特徴付け
ＤＡＲの計算：
ＤＡＲの計算は、メイタンシノイドのＡＤＣの場合と同様にして、抗体（εＡ２８０＝
２２３，４００Ｍ−１ｃｍ−１およびεＡ３２２＝０Ｍ−１ｃｍ−１）ならびにトマイマイシン二量体（εＤ２８０＝４，４３６Ｍ−１ｃｍ−１およびεＤ３２２＝７，８４３Ｍ−１ｃｍ−１）ごとにそれぞれ２８０および３２２ｎｍで測定された吸光係数を使用して決定された。
（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）との、ＳＮＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート）で改変されたｈｕＭＡｂ１＿１コンジュゲートの製造
緩衝液Ａ ２．８ｍｌ中のｈｕＭＡｂ１＿１ ５６ｍｇに、撹拌しながらＤＭＡ ６７μＬ中に溶解させたＳＮＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート）０．４８ｍｇを添加した。室温で３時間後、改変された抗体の溶液を２つに分け、０．０５Ｍ濃度のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．０５Ｍ濃度のＮａＣｌおよび２ｍＭ濃度のｐＨ＝８のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む水性緩衝液中で前もって平衡化した２つのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＰＤ−１０ＧＥカラム）で、ゲル濾過により精製した。このようにして得られた２つのろ液を混合してホモジナイズした後、改変された抗体を、ニトロピリジンチオールの吸光係数（ε２８０ｎｍ＝３３４４Ｍ−１ｃｍ−１およびε３２５ｎｍ＝１０９６４Ｍ−１ｃｍ−１）を使用した分光光度法によりアッセイした：抗体分子１つ当たり平均３．３２個のジチオ−ニトロピリジン基が、６．２８ｍｇ／ｍＬの濃度で決定された。
０．０５Ｍ濃度のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．０５Ｍ濃度のＮａＣｌおよび２ｍＭ濃度のｐＨ＝８のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む水性緩衝液１．５ｍｌ中の改変された上記抗体９．４ｍｇに、撹拌しながらジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）０．０６ｍＬ中に溶解させたＤＭＡ ０．５６ｍＬおよび（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）１．１２ｍｇを添加した。３０℃で１７時間後、ｐＨ＝６．６になるまで０．０１ＮのＨＣｌを添加し、得られた混合物を、最初にｐＨ６．５の２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液２ｍＬ、続いてｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液４ｍＬで平衡化したＣＨＴ８０（タイプＩＩ）カラム（内径２０ｍｍ×８ｍｍ）で精製した。最後の１０ｍＭリン酸緩衝液５ｍＬを注入し、洗浄した後、前の２００ｍＭリン酸緩衝液６ｍＬで溶出が達成された。次いで得られたバッチ２．５ｍＬを、１０％スクロースを含有する１０ｍＭ濃度のヒスチジンを含むｐＨ＝６．５の水性緩衝液中で前もって平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＰＤ−１０ＧＥカラム）で濾過した。
（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）の化学構造は、以下の通りである：
得られたコンジュゲート（３．５ｍＬ）を分光光度法によりアッセイした：抗体分子１つ当たり平均２．８５個の（２Ｅ，２’Ｅ，１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（（（４−（２−（２−（２−（（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（オキシ））ビス（２−エチリデン−７−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）が、１．８４ｍｇ／ｍＬの濃度で決定された。ＨＲＭＳデータ：図３７を参照されたい。
〔実施例９〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞毒性
実施例９．１：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１の細胞毒性
ＨＣＴ１１６細胞を、実施例４．７で報告されたように、細胞のゲノムＤＮＡ中でのＬＡＭＰ１のＣＤＳの安定な統合を可能にするレンチウイルスベクターで感染させた。ＨＣＴ１１６に感染した細胞のプールから、ＬＡＭＰ１の細胞表面における局在化の密度が異なる個々のクローンを得た。ＨＣＴ１１６クローン８を使用して、ｃｈＭＡｂ１およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１のＥＣ５０を比較した。細胞を、９６−ウェルプレート中２０００００／ウェルで平板培養し、ＭＡｂ１またはＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を、最大１２回のアッセイ用希釈剤での希釈による連続２倍希釈液に４℃で１時間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ１１０１３）を４℃で１時間かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を遠心分離して再懸濁した後、固定溶液（ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド）１００μｌ中で抗体結合を評価した。Ｇａｌａｘｙ（登録商標）フローサイトメトリーシステム（Ｐａｒｔｅｃ）を使用して試料を読み取った。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。ｃｈＭＡｂ１およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、類似した親和性ならびにそれぞれ６．０および６．６ｎＭのＥＣ５０で結合した。
様々な抗原密度を有する数種のＨＣＴ１１６クローンを使用して、細胞の生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価することにより、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１の細胞毒性を評価した。
ＨＣＴ１１６−ＬＡＭＰ１細胞を、９６−ウェルプレート中で平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気中４時間で接着させた。植え付けた細胞に様々な濃度のＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を各濃度３連で添加した。次いで同じ雰囲気中で細胞を９６時間インキュベートした。次いでＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬をウェルに室温で１０分間かけて添加し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光シグナルを測定した。半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的機能の阻害における化合物の有効性の尺度である。これは、ある特定の曝露時間後に、ベースラインから最大の間の半分の応答で細胞の死をもたらす抗体の濃度と定義される。ＩＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、およそ０．２ｎＭのＩＣ５０で細胞を死滅させた。
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１の細胞毒性ＩＣ５０は、ＬＡＭＰ１が高度に発現されるＨＣＴ１１６のクローンでは、１ｎＭ未満である。
実施例９．２：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１ ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿２、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿３の細胞毒性
実施例９で説明したようなＨＣＴ１１６クローン８を使用して、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿３の細胞毒性を評価した。実施例９で説明したのと同じプロトコールを適用した。
３種の構築物は、同等の有効性で細胞を死滅させた。ＩＣ５０は、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿３それぞれについて０．１０ｎＭ、０．０７ｎＭおよび０．１２ｎＭであった。
実施例９．３：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３の細胞毒性
実施例９で説明したように、ＨＣＴ１１６クローン８を使用して、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３の細胞毒性を比較した。実施例９で説明したのと同じプロトコールを適用した。２種の構築物は、同等の有効性で細胞を死滅させた。ＩＣ５０は、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２およびＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３それぞれについて０．０７ｎＭおよび０．０６ｎＭであった。
実施例９．４：トマイマイシン二量体とのＡＤＣを用いた細胞株ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９の増殖の阻害の評価
ＨＣＴ１１６（それぞれＨＴ２９）細胞をそれらの指数増殖期でトリプシン処理し、それらの培養培地（ＤＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ番号１１９６０＋１０％ＳＶＦ＋２ｍＭグルタミン）に再懸濁した。細胞懸濁液を、血清を含有する全培養培地中のＣｙｔｏｓｔａｒ ９６−ウェルプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ、番号ＲＰＮＱ０１６３）に細胞３０００（それぞれ５０００）個／ウェルの密度まで植え付けた。４時間インキュベート後、ウェルに抗体−細胞傷害剤イムノコンジュゲートの連続希釈液を１０−７Ｍから１０−１２Ｍに濃度を減少させながら（各濃度で２連（それぞれ４連））添加した。抗体−細胞傷害剤イムノコンジュゲートの存在下で、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下において３７℃で３日間、細胞を培養した。４日目、各ウェルに１４Ｃ−チミジン溶液１０μｌ（０．１μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ番号ＮＥＣ５６８２５０００）を添加した。実験開始から９６時間後、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ放射活性計数器（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１４Ｃ−チミジンの取り込みを測定した。データは、イムノコンジュゲートで処置した細胞で得られたアカウントと対照ウェル（培養培地単独で処置した）の細胞で得られたアカウントとの比率を決定することによって生存のパーセンテージの形態で示された。
上記構築物は、同等の有効性でＨＣＴ１１６およびＨＴ２９細胞を死滅させた。ＩＣ５０は、ＨＣＴ１１６細胞については５６ｐＭ、ＨＴ２９細胞については７２ｎＭであった。
〔実施例１０〕
ｉｎ ｖｉｖｏの有効性
実施例１０．１：ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１のｉｎ ｖｉｖｏの有効性
この実施例において、切断性ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏの有効性をもたらすことが示された。
実施例１０．１．１：ヒト原発性結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
コンジュゲートＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ腫瘍に対する３種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１７日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。３日連続して２０％の体重の減少もしくは１５％の体重の減少または１０％もしくはそれより高い薬物死をもたらす投薬量を過剰な毒性投薬量とみなした。動物の体重は腫瘍の重さを包含していた。腫瘍の体積を２次元の腫瘍測定値から推定し、以下の式に従って計算した（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｔ．Ｈ．ら、１９７７、Ｃａｎｃｅｒ ４０：２６６０〜２６８０）：腫瘍の体積（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ２）］／２。主要効能の評価項目は、処置グループと対照グループとのベースラインからの腫瘍の体積変化における変化の比率（ΔＴ／ΔＣ）、退縮のパーセント中央値、部分退縮（ＰＲ）および完全退縮（ＣＲ）である。
１回目の処置の日における腫瘍の体積を特定の観察日における腫瘍の体積から引くことによって、処置（Ｔ）および対照（Ｃ）それぞれの腫瘍の体積変化を各腫瘍で計算した。中央値ΔＣを未処置の対照グループで計算し、中央値ΔＴを処置グループで計算した。次いでΔＴ／ΔＣ比を計算し、前述したようにパーセンテージ：ΔＴ／ΔＣ＝（デルタＴ／デルタＣ）×１００として示した。
用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％よりも低ければ治療活性とみなされ、ΔＴ／ΔＣが１０％よりも低ければ極めて活性とみなされる。ΔＴ／ΔＣが０よりも低い場合、その用量は高度に活性とみなされ、退縮のパーセンテージを記録した（Ｐｌｏｗｍａｎ Ｊ、Ｄｙｋｅｓ ＤＪ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ Ｍ、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ ＬおよびＡｌｌｅｙ ＭＣ．Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ＮＣＩ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ．Ｉｎ：編集者Ｆｅｉｂｉｇ ＨＨ ＢＡ．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ．；１９９９、１０１〜１２５頁）：
％腫瘍退縮：腫瘍の体積の％が、特定の観察日に、１回目の処置の初日におけるその体積と比較して処置グループで減少していることと定義される。
特定のタイムポイントで、動物ごとに退縮％を計算した。次いでグループごとに中央値の退縮％を計算した。
部分退縮（ＰＲ）：退縮は、腫瘍体積が処置開始時の腫瘍体積の５０％に減少する場合、部分的と定義される。
完全退縮（ＣＲ）：完全な退縮は、腫瘍の体積＝０ｍｍ３の場合に達成される（ＣＲは、腫瘍体積が記録できない場合とみなされる）。
結果：
図５および表３２（以下）に結果を示す。１０．０、５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は十分な忍容性を示し、１０ｍｇ／ｋｇで３．７％の最大の体重減少を示した。１０．０および５．０ｍｇ／ｋｇのＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、対照と比較して高度に活性であり、統計学的に有意であり（各用量でｐ＜０．０００１）、ΔＴ／ΔＣ＜０、それぞれ７５％および７％の最初の腫瘍の体積の退縮をもたらし、１０ｍｇ／ｋｇで５／６のＰＲならびに２／６のＣＲおよび５ｍｇ／ｋｇで１／６のＰＲを示した。２．５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は活性であり、ΔＴ／ΔＣ＝３１％を示し、退縮はみられなかった。
実施例１０．１．２：ヒト原発性肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４に対する３種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後２６日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１を、１０．０、５．０および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。３日連続して２０％の体重の減少もしくは１５％の体重の減少または１０％もしくはそれより高い薬物死をもたらす投薬量を過剰な毒性投薬量とみなした。動物の体重は腫瘍の重さを包含していた。
実施例１０−１で報告されたように毒性および効能評価を行った。
結果
１０．０、５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は十分な忍容性を示し、２．５ｍｇ／ｋｇで３．３％の最大の体重減少を示した。１０．０および５．０ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１は、対照と比較して高度に活性であり、ΔＴ／ΔＣ＜０ならびにそれぞれ８１％および６５％の最初の腫瘍の体積の退縮をもたらし、１０ｍｇ／ｋｇで６／６のＣＲおよび５ｍｇ／ｋｇで５／６のＰＲを示した。２．５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は活性であり、ΔＴ／ΔＣ＝３３％を示し、退縮はみられなかった（表３３、図６）。
実施例１０．２：ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１のｉｎ ｖｉｖｏの有効性
実施例１０．２．１：ヒト原発性結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ腫瘍に対する２種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１９日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１を、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は十分な忍容性を示し、２．５ｍｇ／ｋｇで４．４％の最大の体重減少を示した。５．０ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、対照と比較して活性であり統計学的に有意であり（ｐ＜０．０００１）、退縮せずにΔＴ／ΔＣ＝０をもたらした。２．５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は、ΔＴ／ΔＣ＝４７％をもたらした（表３４、図２３）。
実施例１０．２．２：原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９腫瘍に対する４種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１７日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１を、５、２．５、１．２５および０．６２ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は十分な忍容性を示し、活性であり、ΔＴ／ΔＣ＜０をもたらし、最初の腫瘍の退縮は体積の１００％であり、５ｍｇ／ｋｇで６／６のＣＲおよび２．５ｍｇ／ｋｇで４／６のＣＲを示した。１．２５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は活性であり、ΔＴ／ΔＣ＝３０％（ｐ＝０．００１５）を示し、退縮はみられなかった。より低い用量である０．６２ｍｇ／ｋｇは、ΔＴ／ΔＣ＝８６％をもたらした（表３５、図２４）。
実施例１０．２．３：ヒト原発性肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−００７０に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ腫瘍に対する４種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２を、腫瘍埋め込み後１９日目に１０、５、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇ、３５日目に１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇ、４９日目に１．２５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
１０．０；５．０、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、十分な忍容性を示した。１０；５および２．５ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は活性であり、ΔＴ／ΔＣ＜０（（ｐ＜０．０００１）および１００％の完全退縮を示した。１．２５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は活性であり、２．５ｍｇ／ｋｇでΔＴ／ΔＣ＜０（（ｐ＜０．０００１）および４／６のＰＲを示した（表３６ａ）およびｂ）、図２５）。
実施例１０．３：ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２のｉｎ ｖｉｖｏの有効性
実施例１０．３．１：ヒト原発性結腸腺癌ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐに対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐ腫瘍に対する３種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１９日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２を、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
１０．０；５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は、十分な忍容性を示した。１０および５ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は活性であり、それぞれΔＴ／ΔＣ＜０（（ｐ＜０．０００１）および１／６のＰＲを示し、ΔＴ／ΔＣ＝１０（ｐ＜０．０００１）を示し、退縮はみられなかった。２．５ｍｇ／ｋｇ未満の投薬量は、ΔＴ／ΔＣ＝６８％をもたらした（表３７、図２６）。
実施例１０．３．２：ＳＣＩＤ雌マウスにおけるヒト原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２の抗腫瘍活性の評価
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能
な原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９腫瘍に対する３種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１４日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２を、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
１０．０；５．０および２．５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は、十分な忍容性を示した。１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２は活性であり、試験された全ての用量でΔＴ／ΔＣ＜０（（ｐ＜０．０００１）および１００％の完全退縮を示した（表３８、図２７）。
実施例１０．４：ＳＣＩＤ雌マウスにおけるヒト原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９に対するＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３の抗腫瘍活性の有効性
材料および方法
ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３を、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性浸潤性腺管癌ＢＲＥ−ＩＧＲ−０１５９腫瘍に対する３種の用量で評価した。対照グループは未処置のままであった。腫瘍埋め込み後１６日目に、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３を、５．０、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。
実施例１０．１で報告したようにして毒性および有効性の評価を行った。
結果
５．０、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇで与えられたＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３は、十分な忍容性を示した。５．０、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇで単回投与された後、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ３は活性であり、試験された全ての用量でΔＴ／ΔＣ＜０（（ｐ＜０．０００１）および１００％の退縮を示した（表３９、図２８）。
〔実施例１１〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ活性
標的細胞としてＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン８（実施例９で説明した通り）およびエフェクター細胞としてヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用してＡＤＣＣ活性を評価した。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを使用して、細胞溶解を測定した（Ｒ．Ｌ．Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６：６５９１〜６６０４）。
末梢血単核細胞の単離
血液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２〜３倍に希釈した。５０ｍＬのコニカルチューブ中のフィコール−パックプラス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬ上に希釈した血液３５ｍＬを慎重に重ね、４００ｇで４０分間、室温で遠心分離した。境界面から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集し、新しい５０ｍＬのコニカルチューブに移し、ＰＢＳで２回洗浄した。
ＮＫの単離
これは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＮＫ細胞単離キットのプロトコール（１３０−０９２−６５７、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従ってなされた。ＰＢＭＣをＮＫ単離緩衝液（総細胞１０７個当たり４０μｌの緩衝液）中に懸濁し、次いでこの細胞懸濁液にビオチン−抗体カクテル（総細胞１０７個当たり１０μｌ）を添加した。ビオチン−抗体カクテルは、ＮＫ細胞以外の単核細胞に結合するビオチン化抗体を含有していた。この混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いでＮＫ単離緩衝液（総細胞１０７個当たり３０μｌの緩衝液）およびＮＫ細胞マイクロビーズカクテル（総細胞１０７個当たり２０μｌ）を添加した。細胞−抗体混合物を、追加で１０分間、４℃でインキュベートした。次に、細胞をＮＫ単離緩衝液５０ｍＬで１回洗浄した（４００ｇで１０分間の遠心分離）、２．１０Ｅ＋８個の細胞当たり１ｍＬのＮＫ単離緩衝液に懸濁し、ディプリーションプログラムを使用したａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって単離されたものの上にこれをローディングした。収集されプールされた陰性画分（ＮＫ細胞を含有する）を１回洗浄し（４００ｇで１０分間の遠心分離）、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｈｅｐｅｓ、１％ピルビン酸Ｎａおよび１％非必須アミノ酸が補充されたＲＰＭＩ−１６４０に２．５×１０６／ｍＬで懸濁した。
ＡＤＣＣプロトコール
０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の２ｍＭのＨＥＰＥＳが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、ＲＨＢＰ培地と表す）で、試験された抗体、加えてアイソタイプの対照抗体の１．５×１０−７Ｍから１．５×１０−１７Ｍの１０倍の連続希釈液を製造した。３連の各抗体濃度を丸底の９６−ウェルプレートに分配した（５０μＬ／ウェル）。ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン８細胞を、ＲＨＢＰ培地中、細胞０．０７５×１０６個／ｍＬで懸濁し、抗体希釈液を含有する各ウェル（１００μＬ／ウェル）に添加した。標的細胞と抗体希釈液とを含有するプレートを室温で１０分間インキュベートした。ＮＫ細胞を洗浄し、細胞０．７５×１０６個／ｍＬでＲＨＢＰ培地に懸濁し、次いで各ウェルにＮＫ細胞５０μＬを添加して、典型的には１つの標的細胞に対してＮＫ細胞５つの比率になるようにした。対照Ａは、ＮＫ細胞の代わりにＲＨＢＰ培地（５０μＬ／ウェル）を添加した、標的細胞のみを含有するウェル（抗体の添加なし、およびＮＫ細胞の添加なし）からなっていた。対照Ｂは、標的細胞の起こり得る最大ＬＤＨ放出を決定するために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）２０μＬが添加された、標的細胞のみを含有するウェル（抗体の添加なし、およびＮＫ細胞の添加なし）からなっていた。この混合物を３７℃で４時間インキュベートし、次いで１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清１００μＬを新しい平底９６−ウェルプレートに慎重に移した。細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ １１６４４７９３００１）からの新たに製造されたＬＤＨ反応混合物（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、暗所にて、室温で３０分間インキュベートした。
試料の光学密度を４９０ｍｎ（ＯＤ４９０）で測定した。１００％の溶解は、対照ＢのウェルのＯＤ４９０値に相当し、０％の溶解は、対照ＡのウェルのＯＤ４９０値に相当する。各試料の特異的な溶解のパーセントを、以下の式：（試料のＯＤ４９０−対照ＡのＯＤ４９０）／（対照ＢのＯＤ４９０−対照ＡのＯＤ４９０）×１００によって決定した。
ＮＫ細胞のみを含有する試料は、無視できる程度のＯＤ４９０測定値しか示さなかった。
実施例１１．１：ｉｎ ｖｉｔｒｏのｃｈＭＡｂ１、ｃｈＭＡｂ２およびｃｈＭＡｂ３が介在するＡＤＣＣ
ｃｈＭＡｂ１、ｃｈＭＡｂ２およびｃｈＭＡｂ３抗体は、図２９で示されるように、類似の有力なＡＤＣＣ活性を特異的に誘導した。アイソタイプ対照抗体は、有意なＡＤＣＣ活性を有していなかった。
実施例１１．２：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＤＣＣのばらつき
精製されたＮＫの数種のバッチごとのｃｈＭＡｂ１またはｃｈＭＡｂ２のＡＤＣＣ活性を評価し、ここで各バッチは、個々の血液ドナーに対応していた。表４０に表すように、ＡＤＣＣ活性は、ＮＫ細胞のバッチ間で変化していた。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
実施例１１．３：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＬＡＭＰ１抗原の密度へのＡＤＣＣの依存性
同じＮＫバッチを使用して、様々な抗原密度を提示するＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローンに関するＡＤＣＣを分析した。図３０のデータによって例示されたように、顕著なｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＤＣＣ活性をもたらすには、抗原の密度＞２００００が必要であった。
実施例１１．４：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｃｈＭＡｂ１とＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ１との、またはｃｈＭＡｂ２とＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｃｈＭＡｂ２とのＡＤＣＣの比較
ＤＭ４−ＳＰＤＢとのコンジュゲーションは、ｃｈＭＡｂ１またはｃｈＭＡｂ２のＡＤＣＣ活性に有意に影響を与えなかった（図３１ａおよびｂ）。
実施例１１．５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｕＭＡｂ１＿１が介在するＡＤＣＣ
実験において、参照コンパレータにｃｈＭＡｂ１を含めた。図３２に示されるように、ＨｕＭＡｂ１＿１は、ｃｈＭＡｂ１と類似したＡＤＣＣ活性を誘導した。
実施例１１．６：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１が介在するＡＤＣＣ
この実験において、参照コンパレータに、ＨｕＭＡｂ１＿１を含めた。図３３に示されるように、ＤＭ４−ＳＰＤＢ−ｈｕＭＡｂ１＿１は、ｈｕＭＡｂ１と類似したＡＤＣＣ活性を誘導した。
〔実施例１２〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＰ活性
標的細胞として様々なＬＡＭＰ１抗原の密度を有するＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン、およびエフェクター細胞としてヒトマクロファージを使用して、ＡＤＣＰ活性を評価した。ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローンをＰＫＨ６７蛍光色素で標識し、マクロファージをＣＤ１４−ＰＣ７蛍光色素で標識した。
末梢血単核細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を実施例１１で説明したようにして単離した。
単球の単離
これは、単離されたＰＢＭＣから、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの単球細胞単離キットのプロトコール（１３０−０５０−２０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従ってなされた。ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の陽性選択プログラムを使用して、ＣＤ１４−マイクロビーズで標識した細胞を単離した。収集した画分（単球細胞を含有）を、１０％ウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ−１６４０ １３．６ｍＬ中に懸濁し、１回洗浄し（４００ｇで１０分間の遠心分離）、１０％ウシ胎児血清、１％の加熱不活性化されたヒト血清（ＡＢ；番号１４−４９０Ｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ；番号１３０−０９３−８６６）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０ ６４ｍＬ中に、細胞１０６個／ｍＬの最終濃度で懸濁した。
マクロファージの分化
単離された単球６４ｍＬを、Ｔ７５フラスコ（ＮＵＮＣ；番号Ｉ５６４７２）にフラスコ１つ当たり１０ｍＬ添加した。フラスコを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、そこで細胞を８日間で接着させた。４日間インキュベートした後、１０％ウシ胎児血清、１％の加熱不活性化されたヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦが補充されたＲＰＭＩ−１６４０に交換した。
ＡＤＣＰプロトコール
マクロファージをアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｔｅｍｐｒｏ；番号Ａ１１１−０５０１）で懸濁し、１回洗浄し（４００ｇで１０分間の遠心分離）、２％ウシ胎児血清および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地に、６／１の比率として細胞１．５×１０６個／ｍＬの濃度で、または３／１の比率として細胞０．７５×１０６個／ｍＬで懸濁した。懸濁されたマクロファージ１００μＬを丸底の９６−ウェルポリプロピレンプレートに分配した。１０７個の懸濁された標的細胞（ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン４；ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン５；ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン８またはＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン１２）を、供給元の手法に従って（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ；番号ＭＩＤＩ６７−１ＫＴ）ＰＫＨ６７蛍光色素で標識し、次いで２％ウシ胎児血清および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０中に細胞５×１０５個／ｍｌで懸濁した。試験されたｈｕＭＡｂ１＿１、加えてアイソタイプ対照抗体の９×１０−８Ｍから３×１０−１２Ｍの３分の１の連続希釈液を、２％ウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地で製造した。２連の各抗体濃度を丸底の９６−ウェルポリプロピレンプレートに分配した（１５０μＬ／ウェル）。ＰＫＨ６７で標識した標的細胞１５０μＬを、抗体希釈液を含有する各ウェルに添加した。標的細胞と抗体希釈液とを含有するプレートを３７℃で１５分間インキュベートした。混合物（標的細胞＋抗体）１００μＬをマクロファージを含有する９６−ウェルプレートに添加し、次いで３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中に４時間〜１７時間置いた。細胞をアキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｓｔｅｍｐｒｏ；番号Ａ１１１−０５０１）で懸濁し、２回洗浄し（４００ｇで１０分間の遠心分離）、ＣＤ１４−ＰＣ７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；番号ＰＮ Ａ２２３３１）を含有する緩衝液（５％の加熱不活性化されたヒト血清が補充されたＰＢＳ）に懸濁した。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞を１回洗浄し、ＰＢＳ ２５０μＬに懸濁し、１回洗浄し、固定用パラホルムアルデヒド溶液（ＰＢＳ中４％のＰＦＡ、ＵＳＢ；番号１９９４３）５０μＬに懸濁した。試料をサイトメトリー分析まで４℃で保存した。
サイトメトリー分析
ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ装置を使用して試料を分析した。食作用を、二重に標識された細胞（ＰＫＨ６７陽性およびＰＣ７陽性細胞）として決定した。図３４に、得られた典型的なデータを示した。
実施例１２．１：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｕＭＡｂ１＿１が介在するＡＤＣＰ
マクロファージ／ＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローン８の２種の比率を分析した。ＥＣ５０値を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。ＨｕＭＡｂ１＿１は、３／１のマクロファージ／標的細胞の比率で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける有意なＡＤＣＰを誘導した。表４１に示されるように、より高い比率である６／１は、より低いＥＣ５０またはより高い％の食作用をもたらさなかった。
実施例１２．２：ｉｎ ｖｉｔｒｏのＬＡＭＰ１の細胞表面発現に対するＡＤＣＰ依存性
様々な抗原密度を提示するＨＣＴ１１６ ｈｕＬＡＭＰ１クローンに関するＡＤＣＰを分析した。表４２から推測できるように、ＬＡＭＰ１の抗原の密度が減少するにつれて食作用の最大値も減少することから、ｈｕＭＡｂ１＿１により誘導されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＤＣＰのレベルはＬＡＭＰ１の抗原の密度と関連する。
実施例１２．３：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢのＡＤＣＰ
ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢ（実施例７．２で説明した）により誘導されたＡＤＣＰを査定することによって、ＦＣγＲＩＩＩａが介在する食作用を評価した。予想通りに（マクロファージは、活性化に関して、厳密にはＦＣγＲＩＩＩａに依存しない）、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢはｈｕＭＡｂ１＿１よりも低いＡＤＣＰをもたらしたが、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＢが使用されたときにそれでもなおＡＤＣＰが発生した。図３５に、得られた典型的なデータを示す。
実施例１２．４：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡのＡＤＣＰ
抗原特異性が介在する食作用を評価するために、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡが介在するＡＤＣＰ（実施例Ｂ７．２で説明された）を試験した。図３６で示されるように、ｈｕＭＡｂ１＿ｎｅｇＡはＡＤＣＰをまったく誘導しなかったことから、ｈｕＭＡｂ１＿１に関して得られたデータの特異性が検証された。
〔実施例１３〕
ＬＡＭＰ１遺伝子のコピー数の変化
材料および方法：
アレイベースのオリゴヌクレオチド比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）
ヒトゲノムＣＧＨマイクロアレイ４００ｋ−（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを分析した。ヒトＣＧＨの２×４００Ｋマイクロアレイ用のＡｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ Ｂｒａｖｏプラットフォームプロトコールを使用して、消化、標識付けおよびハイブリダイゼーションを行った。全ての実験において、参照ＤＮＡとして、ヒトの十分に特徴付けられた正常な女性（ＮＡ１２８７８）または１人の十分に特徴付けられた正常な男性（ＮＡ１０８５８）からの性別を合わせたＤＮＡを使用した。これらの実験で使用された正常ヒトゲノムＤＮＡは、Ｃｏｒｉｅｌｌの委託により商品化されている。
製造元のプロトコール（バージョン６．２、２００９年１０月；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）で詳述されているようにして、オリゴヌクレオチドａＣＧＨ処理を行った。マイクロアレイは、参照試料および実験試料からのゲノムＤＮＡ ６００ｎｇを必要とした。Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ｇ２５６５ＣＡ）でアレイをスキャンした。
スキャンした画像からデータを抽出し、特徴抽出ソフトウェア（ｖ１０．７．３．１、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して標準化した。
Ａｒｒａｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用してｌｏｇ２比率およびセグメント化を作製したＡｒｒａｙ Ｓｔｕｄｉｏ、Ａｒｒａｙ ＶｉｅｗｅｒおよびＡｒｒａｙ Ｓｅｒｖｅｒならびにその他全てのＯｍｉｃｓｏｆｔ製品またはサービス名は、Ｏｍｉｃｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡの登録商標または商標である。
ｌｏｇ２比率分布の集中を検証し、ＣＢＳアルゴリズム（Ｏｌｓｈｅｎら；Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（２００４）、５（４）：５５７）を使用してセグメント化を行った。各プロファイルで、その内部ノイズ（ゲノム上の連続したプローブ全体にわたるｌｏｇ２比率値の変動）に従って異常な状態の呼び出しが自動的に行われた。全てのゲノム座標をＵＣＳＣのヒトゲノム組み立てｈｇ１９上に確立した（Ｋａｒｏｌｃｈｉｋ Ｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００３、３１：５１）。それに続く分析のために、ｌｏｇ比率値およびコピー数の変化を、各領域または遺伝子ごとに、内部データベースに導入した。
遺伝子発現
発現分析用Ｃｉａプラットフォームを使用したＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３’−増幅試薬キットおよびＵ１３３Ｐｌｕｓ ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、遺伝子発現分析を行った。データベースの管理、品質管理および分析のために、全てのデータをＲｅｓｏｌｖｅｒソフトウェア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）にインポートした。各ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のクォリファイアーで表される。分析のために、患者由来腫瘍異種移植片腫瘍バンクのデータベース（腫瘍バンクデータベース）において、各クォリファイアーからの発現の値をダウンロードした。
動物
コンソーシアムのメンバー間での移動が可能なように標準的な動物の規則および厳密な健康管理に従って、動物を各機関の動物施設で維持した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅ（Ｌｅｓ Ｏｎｃｉｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で、Ｓｗｉｓｓ−ヌードおよびＣＢ１７−ＳＣＩＤ雌マウス、加えてＮＩＨ−ヌードラットを飼育した。実験開始時に、マウスの体重は１８ｇを超えており、ラットの体重は１６０ｇを超えていた。それらのケアおよび住処は、機関のガイドライン、加えて国内および欧州の法律、ならびにＦｒｅｎｃｈ Ｆｏｒｅｓｔ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙによって推進されているような規則、ならびにＵＫＣＣＣＲガイドラインが求める規格に従った。
試料の製造
低温保持装置で凍結した断片を−２０℃で切断し、次いで、組織学的対照および病理学者による腫瘍細胞パーセンテージの評価のために、開始時および終了時の切片をＨＥＳ（ヘマトキシリン−エオシン−サフラン）で染色した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡキットのプロトコールｖ０１（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出Ｑｉａｇｅｎプロトコールｖ０１を使用して、腫瘍試料から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＰＤＸの分子的特徴付け
ＰＤＸの各腫瘍モデルの分子的特徴付け（ＣＧＨ、ＲＮＡ発現およびＩＨＣ）を、同じ異種移植片の継代を使用して行った。
免疫組織化学
ＬＡＭＰ１遺伝子およびその領域（１３ｑ３４）のゲノムコピー数の異常を、ＰＤＸ（凍結Ｏｃｔ）上へのＬＡＭＰ１の膜局在化におけるタンパク質レベルの変化（強、中、弱および陰性）と関連付けるために、ＣＧＨおよびＲＮＡ発現の特徴付けに使用されたのと同じＰＤＸの継代で特異的な染色（ｍＡｂ１）を実行した。
アビジンおよびビオチンでのブロッキング（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｃｋ、Ｖｅｎｔａｎａ、７６０−０５０）の後、凍結切片（凍結ＯＣＴ様式）を、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中、最終濃度１μｇ／ｍＬ（ヒト試料の場合）ならびに１および５μｇ／ｍＬ（サル試料の場合））と共に３７℃で３２分間インキュベートした。グルタルアルデヒド（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中、０．０５％）を用いて４分間にわたり後固定工程を行った。ビオチン化二次ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを３７℃で１２分間インキュベートした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ１０８０−０８、Ｖｅｎｔａｎａの希釈剤で１／２００に希釈）。ＤＡＢ Ｍａｐ色素産生検出キットを製造元の推奨に従って用いて免疫染色を行った。ヘマトキシリンＩＩ（７９０−２２０８、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて低温保持切片に対比染色工程を適用し、青色染色試薬を４分で適用した（７６０−２０３７）。染色したスライドから水分を取り除き、Ｃｏｖｅｒｑｕｉｃｋ２０００マウンティングメディウム（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｒｅｆ０５５４７５３０）を用いてカバースリップをかけた。
この研究で使用した陰性対照は、一次抗体の不使用およびＩｇＧ２ａアイソタイプの使用（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの最終濃度）で構成された。
データ分析のために、精製したマウス抗体ＭＡｂ１で免疫染色した切片をスキャンし、Ｓｃａｎ Ｓｃｏｐｅ ＸＴシステム（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ ＣＡ）を使用して２０倍の倍率でデジタル化した。次いでＩｍａｇｅ Ｓｃｏｐｅソフトウェア（ｖ１０．２．２．２３１９ Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してデジタル化した画像を捕捉した。
陽性試料を１から３の強度のスケールでスコア付けした。強度の範囲は、陰性（０）、弱（１）、中（２）および強（３）と記載された。細胞の頻度は、免疫染色された細胞のパーセンテージであり、組織学者の観察により試料ごとの中央値として推定された。細胞の頻度を、５つのカテゴリー：１（０〜５％）、２（６〜２５％）、３（２６〜５０％）、４（５１〜７５％）および５（７６〜１００％）で順位付けした。
全体的な発現をＡｌｌｒｅｄスコア（ＡＳ）の説明に従って計算した。ＡＳは、強度と比率スコアとを足して０〜８の範囲の総スコアを得ることによって得られた。ＡＳは、最大グローバルスコアのパーセントとして報告され、５種のカテゴリー：極めて低い（０〜２５％）、弱（２６〜５０％）、中（５１〜７５％）および高（７５〜１００％）の範囲であった。出現率は、指標に関して陽性のケースのパーセントと定義された。
マイクロソフト・エクセル２００３を用いて基礎的な記述統計を計算した。指標ごとに、ケース数、陽性のケースの番号、出現率、強度スコア平均、頻度平均およびＡｌｌｒｅｄスコアを表示した。
統計分析
ｍＲＮＡ発現とＬＡＭＰ１遺伝子の変化（増加または増幅）との関係を研究するために、本発明者らはＰＤＸデータにスチューデント検定を適用して、コピー数の変化がある場合またはない場合における腫瘍ＰＤＸのｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本発明者らはまた、ピアソン相関試験によって、ＣＲＣのＰＤＸのｍＲＮＡ発現レベルと、ＬＡＭＰ１遺伝子およびそれらの領域（１３ｑ３４）のそれらそれぞれのゲノムコピー数の変動との相関も決定した。
加えて、スピアマンの相関試験を使用して、ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ））データベースからの結腸直腸患者の組織試料のより大きいセット（ｎ＝５７４）を使用した標準化したｍＲＮＡ発現とコピー数との相関分析を行った。ＩＨＣ分析によって決定されたＰＤＸ腫瘍細胞の細胞質膜におけるＬＡＭＰ１発現または発現なしと、コピー数因子の変化または変化なしとの関連を研究するために、コクラン−マンテル−ヘンツェルの統計を行った。結腸ＰＤＸの場合、コピー数（ＣＮ＜２．５およびＣＮ≧２．５）に対するＩＨＣスコア（陰性から弱、中および強）を使用して試験を行った。肺および胃ＰＤＸの場合、コピー数（ＣＮ＜２．５およびＣＮ≧２．５）に対するＩＨＣスコア（陰性から弱、中〜強）を使用して、階層化したコクラン−マンテル−ヘンツェルの統計を行った。ＳＡＳ９．２；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．およびＥｖｅｒｓｔａｔ Ｖ６（Ｓａｎｏｆｉ、ＳＡＳ９ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．をベースとする）を使用して統計分析を行った。
バイオインフォマティクス分析：ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）におけるコピー数変化
ＧＩＳＴＩＣ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）の方法論を使用してＤＮＡ試料を分析した（Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ，Ｒ．ら；Ｎａｔｕｒｅ ２０１０ ４６３、８９９；Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ，Ｒ．ら；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００７）；１０４、２０００７）。簡単に言えば、データセット全体にわたる限局的な増幅の平均振幅および頻度に従って各マーカーをスコア付けし、ゲノム全体にわたるマーカーのランダム置換により得られたスコア分布を比較することによって有意性の値をコンピューターで計算した。各染色体でｑ値≦０．２５の有意性の閾値を超える新しい領域がなくなるまで、スコアを重複させた（各ピークのスコアに従って重み付けされた）全ピーク中の増幅（または欠失）したセグメントに関連するスコアを分布させる反復ピールオフ法（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｅｅｌ−ｏｆｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用して、増幅（または 欠失）の有意なピーク領域を同定した。最後に、ＧＩＳＴＩＣスコアプロファイル内の自己相関を考慮に入れて、少なくとも９９％の確率で真のドライバー遺伝子または遺伝子（複数）を含有すると予測された各ピーク領域で信頼区間をコンピューターで計算した（ＴＣＧＡ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５５：１０６１）。
ＧＩＳＴＩＣアウトプットからの遺伝子ベースの呼び出しを使用した。遺伝子は、以下に示すような特定の閾値を使用して、深い欠失、浅い欠失、中程度のコピー数、低い増加、および高い増加を有すると定義された。高い増加は、１．３２を超えるｌｏｇ２比率であり；低い増加は、０．３から高い増加の閾値までであり；中程度のセグメントは、−０．５から０．３の間のコピー数を有し；浅い喪失は、−０．５から深い欠失の閾値の間のコピー数を有し；深い欠失は、−０．７３７未満のコピー数を有する。
〔実施例１４〕
ＬＡＭＰ１遺伝子のコピー数の変化
ＣＲＣのＰＤＸ腫瘍試料の使用
全ゲノム高密度ａＣＧＨ ４００Ｋ−オリゴヌクレオチドアレイを使用して、合計６１種の結腸腫瘍ＰＤＸを分析した。表４４に示したように、６１種の結腸直腸がんＰＤＸのうち６種（９．８％）が、高レベルのＬＡＭＰ１遺伝子増幅（すなわち：ＣＮ≧５またはｌｏｇ２比率≧１．３２）を提示し、５７．４％が、ＬＡＭＰ１遺伝子の増加（すなわち：２．５≦ＣＮ＜５または０．３２≦ｌｏｇ２比率＜１．３２）を示した。
肺ＰＤＸ腫瘍試料の使用
全ゲノム高密度ａＣＧＨ ４００Ｋ−オリゴヌクレオチドアレイを使用して、合計３５種の肺腫瘍ＰＤＸを分析した。表４５に示したように；研究された１種の肺腫瘍ＰＤＸ（３％）は、ＬＡＭＰ１遺伝子の高レベルの増幅（ＣＮ＝９．２６）を提示し、２６％は、ＬＡＭＰ１遺伝子の増加（すなわち：２．５≦ＣＮ≦５または０．３２≦ｌｏｇ２比率＜１．３２）を示した。
市販の腫瘍ＤＮＡ組織試料の使用
食道腫瘍ＤＮＡ試料（Ａｓｔｅｒａｎｄ）において全ゲノム高密度ａＣＧＨ ４００Ｋ−オリゴヌクレオチドアレイを使用して、ＣＧＨ分析も行った。表４６に示したように、研究された４６種の食道腫瘍試料のうち２種（４．３％）においてＬＡＭＰ１遺伝子の増加または増幅がみられ、これらのうち１種（２％）は、３９．８１のコピーに等しいＬＡＭＰ１の限局的な増幅を示した。このＬＡＭＰ１の高いレベルで限局的な増幅は、６４歳のアジア系の女性（ＥＳ０１＿Ｆ１２）で検出された；生検は、８０％の腫瘍細胞を含有していた。
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データでの患者の腫瘍試料の使用
コピー数の変化の次の分析を、ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）データを使用して行った。結腸直腸試料のより大きいセット（ｎ＝５７４）を使用したところ；結果は、内部データ（ＣＲＣのＰＤＸ）を使用して得られた結果と極めて類似していた。結腸直腸および直腸ヒト腺癌分析（癌ゲノムアトラス）は、１４．４％の高い増幅（高増幅）を明示した。それに続くＴＣＧＡデータを使用したコピー数変化分析を行い、ＬＡＭＰ１が増幅された他の腫瘍タイプを検索した。まとめると、表４３および図１０Ａにおいて、結腸直腸腺癌、胃、肝臓、肺（腺癌および扁平上皮）、乳房（基底、ＢＲＣＡ、ＬＵＭＡ、ＬＵＭＢおよびＨＥＲ２）、卵巣、頭頸部、腎臓（腎臓色素嫌性、腎明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、子宮頸部扁平上皮細胞、膵臓、前立腺、膀胱尿路上皮、グリオーマ（低悪性度グリオーマおよび多形性膠芽腫）、子宮、甲状腺、白血病、リンパ腫、食道、黒色腫および軟部組織肉腫を包含する２８種の腫瘍タイプで、ＬＡＭＰ１のＤＮＡ遺伝子の低レベルの増加（低増幅；Ｌｏｇ２比率＝０．３＜低増幅＜１．３２）および高い増加（増幅）（高増幅、Ｌｏｇ２比率≧１．３２（論理上、全体で５．０のコピーまたはそれより多く））が検出され、これらの腫瘍タイプのうち、結腸直腸腺癌、胃、肝臓、肺、乳房、卵巣、頭頸部、子宮頸部扁平上皮細胞、膠芽腫、グリオーマ、子宮、甲状腺および軟部組織肉腫を包含する１２種が、ＬＡＭＰ１の高い増加または増幅のデータを示した。
ＰＤＸにおけるＬＡＭＰ１（１３ｑ３４）の変化（増加／増幅）のゲノムの定義
ＬＡＭＰ１遺伝子の増加または増幅は、限局的な体細胞の増加または増幅、体細胞の１３ｑにおける大きい領域の増加または増幅、体細胞の染色体重複、体細胞の染色体の３倍化または他倍数化に関連する可能性がある。
結腸腫瘍ＰＤＸにおいて、ＬＡＭＰ１のＤＮＡ増加または増幅は、ＣＵＬ４Ａ、ＬＡＭＰ１、ＴＦＤＰ１、およびＧＡＳ６を含むより大きいアンプリコンに包含されていた。表４４で示したように、結腸がんＰＤＸに関して、セグメントの平均サイズは、増幅および増加に関してそれぞれ８４８９．５ｋｂおよび４９２９２．７ｋｂであった。最小の領域は４５４ｋｂを含んでおり、この領域は、塩基１１３３１９６８３から始まり塩基１１５１０７２４５で終わっており、ＬＡＭＰ１以外の遺伝子：ＡＤＰＲＨＬ１、ＣＵＬ４Ａ、ＤＣＵＮＩＤ２、ＧＲＴＰ１、ＬＯＣ１００１３０４６３、ＰＣＩＤ２、ＰＲＯ７、ＴＦＤＰ１、ＴＭＣＯ３およびＦ１０を含有していた。ＤＮＡ増加または増幅の多くは、少なくとも以下の遺伝子：ＡＤＰＲＨＬ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＡＴＰ４Ｂ、ＣＵＬ４Ａ、ＤＣＵＮ１Ｄ２、Ｆ１０、Ｆ７、ＦＡＭ７０Ｂ、ＦＬＪ４１４８４、ＦＬＪ４４０５４、ＧＡＳ６、ＧＲＫ１、ＧＲＴＰ１、ＬＡＭＰ１、ＬＩＮＣ００５５２、ＬＯＣ１００１２８４３０、ＬＯＣ１００１３０４６３、ＬＯＣ１００５０６０６３、ＬＯＣ１００５０６３９４、ＭＣＦ２Ｌ、ＭＣＦ２Ｌ−ＡＳ１、ＰＣＩＤ２、ＰＲＯＺ、ＲＡＳＡ３、ＴＦＤＰ１およびＴＭＣＯ３Ｃ１３ｏｒｆ３５を含有していた。最も大きい増加領域は、９５．８Ｍｂ（１９，２９６，５４４〜１１５，１０７，２４５）をカバーしていた。
肺腫瘍ＰＤＸにおいて（表４５）、セグメントの平均サイズは、増加に関して１４９６６．４ｋｂであった。最小の領域は、１１８６ｋｂをカバーしていた。
ヒト食道がんの腫瘍におけるＬＡＭＰ１（１３ｑ３４）の増加のゲノムの定義
食道がんＤＮＡ試料（Ａｓｔｅｒａｎｄ）において、ＬＡＭＰ１の増加または増幅も大きいアンプリコンに包含されており、最も大きい増加領域は、４５２３ｋｂ（１１０５８４０５０−１１５１０７２４５）を含み、最も小さい領域は、３９．８１のコピー数に等しいＬＡＭＰ１増幅（Ｃｈｒ１３ｑ３４）を示した。この限局的なＬＡＭＰ１の増幅は、３７８ｋｂをカバーしており、１０種の遺伝子：ＡＤＰＲＨＬ１、ＣＵＬ４Ａ、Ｆ１０、Ｆ７、ＧＲＴＰ１、ＬＡＭＰ１、ＬＯＣ１００１３０４６３、ＰＣＩＤ２、ＰＲＯＺおよびＭＣＦ２Ｌを包含していた。
〔実施例１５〕
ＬＡＭＰ１遺伝子のコピー数とｍＲＮＡの遺伝子発現との関係
ＬＡＭＰ１領域における遺伝子発現プロファイルおよびコピー数の変化によるｍＲＮＡ発現レベルの分析
ＬＡＭＰ１コピー数の変化（増幅および増加）の分析に加えて、ＣＲＣ腫瘍ＰＤＸを使用して、ＣＧＨ分析によるＬＡＭＰ１増幅とｍＲＮＡの使用（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術）によるＬＡＭＰ１発現との相関を評価した。ピアソンの相関試験（表４７）を使用したｍＲＮＡ分析からの結果は、ＬＡＭＰ１のコピー数とＬＡＭＰ１のｍＲＮＡ発現レベルとの高い相関（（ｒ）＝０．５９；ｐ＜０．０００１）を示した（図８Ａ）。結腸腫瘍ＰＤＸに関して、スチューデント検定を行って、ＬＡＭＰ１遺伝子のコピー数（増加／増幅ありまたはなし）およびＬＡＭＰ１のｍＲＮＡ発現を比較した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術を使用してｍＲＮＡ発現分析を行った（表４８および図８Ｂ）。
ＬＡＭＰ１コピー数変化に関して、ｍＲＮＡ発現は、より有意に高かった（ＣＮ≧２．５）。
ＣＧＨ分析によるＬＡＭＰ１増幅とｍＲＮＡの使用によるＬＡＭＰ１発現とのピアソン試験を使用した相関分析は、研究されたこれらの２つのパラメーター間で有意な相関があることを示した。
図８ａに示されるように、ＬＡＭＰ１の高い増幅（Ａｍｐ）を示すグループは、ＬＡＭＰ１の低い増幅（増加）、二倍体およびヘテロ接合性喪失を示すグループより高いｍＲＮＡ発現レベルを示した。
ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）データからの結腸直腸患者の組織試料のより大きいセット（ｎ＝５７４）を使用した相関分析は、ｍＲＮＡ発現と相関する１４．４％の増幅を明示し（（ｒ）＝０．５７；ｐ＜０．０００１）、この結果は、ＣＲＣのＰＤＸで観察された結果と極めて類似していた。
さらに、同じデータセットを使用したところ、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮細胞（ＬＵＳＣ）および卵巣（ＯＶ）（図９）に関してＬＡＭＰ１コピー数の変化とｍＲＮＡ発現レベルとの有意な相関が証明された。
〔実施例１６〕
ＬＡＭＰ１コピー数の変動およびそのＬＡＭＰ１タンパク質の細胞膜発現レベルへの影響ＬＡＭＰ１コピー数の変化と免疫組織化学（ＩＨＣ）で検出されたタンパク質の細胞膜発現レベルとの関連
ＬＡＭＰ１の増加およびそのＬＡＭＰ１のＲＮＡ発現との関係の分析に加えて、本発明者らは、結腸、肺および胃の腫瘍ＰＤＸに関する抗体ｍＡｂ１を用いたＩＨＣ発現のスコア付け（強、中、弱および陰性）を使用して、ＬＡＭＰ１コピー数の変化（増加または増幅）の細胞膜のＬＡＭＰ１タンパク質局在化への関連も評価した。
以下の表４９および表５０、ならびに図１１で示されるように、結腸、肺および胃ＰＤＸ試料におけるＩＨＣの細胞膜発現の分析から、ＬＡＭＰ１タンパク質は、研究された９５種のＰＤＸモデルのうち３９種（４１．１％）において膜細胞で発現され；これらのＰＤＸ試料のうちＬＡＭＰ１の膜発現に関して陽性の３３種（３９種のうち３３種；８５％）はさらに、ＬＡＭＰ１の増加または増幅も示し、これらのうち多くは、結腸ＰＤＸであることが示された。
ＩＨＣ膜発現とコピー数の変化との関連を、コクラン−マンテル−ヘンツェルの統計を使用して研究した（表５１および５２）。
結腸腫瘍ＰＤＸにおいて、ＬＡＭＰ１のＩＨＣ膜発現とＬＡＭＰ１のコピー数との関連は、有意であった。
腫瘍タイプを調整した後、ＬＡＭＰ１のＩＨＣ膜発現とＬＡＭＰ１のコピー数との関連は、有意であった。
本発明者らは、腫瘍ＰＤＸ試料において、ＬＡＭＰ１の細胞表面における局在化のレベル（強および中）は、コピー数の変化と関連があると結論付けた。ＬＡＭＰ１の細胞表面における局在化のほとんどは、ＬＡＭＰ１の増加または増幅の結果であると考えられる。
実施例１７：ＦＦＰＥ腫瘍組織におけるＬＡＭＰ１の膜での増強を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって検出するための特異的なペプチドおよびｍＡｂ
バイオバンクから、または患者の処置前または処理中の病院からの腫瘍組織のＩＨＣ分析を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を用いて慣例的に行った。市販のｍＡｂおよびこれまでに説明した３種のｍＡｂ（ＭＡｂ１、ＭＡｂ２およびＭＡｂ３）は、凍結ＯＣＴおよびＡＦＡ（アルコール・ホルマリン・酢酸固定剤）試料様式で、ＬＡＭＰ１ならびにＭＡｂ１、２および３を含むそれらの一部、ＬＡＭＰ１の膜での増強の細胞内検出を可能にするが、ＦＦＰＥ様式ではＬＡＭＰ１増強を検出するのは不可能である。その理由の１つは、恐らくタンパク質の複雑さに加えてホルマリン固定剤の作用であると考えられる。病院では、凍結ＯＣＴまたはＡＦＡ中で処理された試料は、慣例的に製造されない。それゆえに、ＦＦＰＥ腫瘍のバイオバンクおよび病院試料の十分かつ迅速なカバーを可能にすると予想されるｍＡｂを提供する必要がある。
以下の実施例で、配列番号２４の３６０〜３７５位における第二の内腔ドメインに位置し、配列番号８２のアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド４）を同定することによって、この問題を克服することが可能であることを示す。前記ペプチドにより、ＦＦＰＥ組織におけるＬＡＭＰ１の膜での増強の検出をもたらすウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体を得ることが可能になった。
実施例１７．１：ＦＦＰＥ腫瘍組織においてＬＡＭＰ１の膜での増強をもたらすウサギポリクローナル抗体の産生
この実施例は、ヒトＬＡＭＰ１内腔ドメインにおけるペプチドの選択、ポリクローナル抗体の作製およびＩＨＣスクリーニングを説明する。配列番号２４のヒトＬＡＭＰ１配列で３６０〜３７５位のアミノ酸に対応する配列番号８２の特定のペプチド（「ペプチド４」）を使用した場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるＬＡＭＰ１の膜での増強の検出を可能にするポリクローナル抗体を得ることが可能であることが実証された。
実施例１７．１．１：ペプチドまたは可溶性ＬＡＭＰ１タンパク質でのウサギの免疫化
ポリクローナル抗体の精製
ペプチドの製造：
Ｎ−グリコシル化部位と内部システインとを有さない２つの内腔ドメイン内の１５〜１６アミノ酸のペプチドを選択した。合計４種のペプチドを化学合成し、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）キャリアータンパク質にカップリングした。必要な場合、システインのチオール基を介したマレイミド活性化ＫＬＨタンパク質へのカップリングが起こるように、ペプチドに末端のシステインを予め付加した。
ポリクローナル抗体の免疫化および入手
合計３種のウサギ免疫化プログラムを行った。第一のプログラムで、配列番号９０のペプチド１および配列番号９１のペプチド２を用いて、第二のプログラムで、配列番号８２のペプチド４および配列番号９２のペプチド３を用いて、第三のプログラムで、実施例６．２で説明したように産生した加熱変性ヒトＬＡＭＰ１：：ｈｉｓｔａｇタンパク質を用いて、ウサギを免疫化した。簡単に言えば、免疫化スケジュールは、４回の注射と２８日後の最終的な出血を含んでいた。ポリクローナル応答を、最終的な出血からの試料でＥＬＩＳＡにより決定した。
ポリクローナル抗体の精製
反応性ＡＦ−アミノＴＯＹＯＰＥＡＲＬを使用して、表５５に記載された各ペプチドをカップリングさせ、４つのアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製した。それぞれのペプチドで免疫化したウサギにおける最終的な出血からの血清を、ペプチドアフィニティークロマトグラフィーで精製した。次いで精製されたポリクローナルのバッチを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡで特徴付けた。
ＬＡＭＰ１タンパク質で免疫化したウサギにおける最終的な出血からの血清を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。次いで精製されたポリクローナルのバッチを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。
実施例１７．１．２：ペプチド４の免疫化により得られたポリクローナルｒＡｂ４（ウサギ抗体４）のＩＨＣスクリーニングおよび同定
実施例１７．１．１で説明したペプチドを用いた作製したウサギポリクローナル抗体を、結腸腺癌患者由来異種移植片ＣＲ−ＬＲＢ−０１０Ｐおよびヒト乳癌のＦＦＰＥ試料におけるＩＨＣによって試験した。抗原賦活化手法および内生植物のビオチンでのブロッキング工程の後、スライドを一次抗抗体と共に２４℃で１時間インキュベートした。一次抗体の不使用により、陰性対照を行った。二次抗体系として、ビオチン非含有の抗ウサギＵｌｔｒａＭａｐ（商標）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（７６０−４３１５、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を製造元の推奨に従って使用した。一次抗体の不使用により、陰性対照を行った。ヘマトキシリン（７６０−２０３７、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて対比染色工程を行い、青色染色試薬を適用した（７６０−２０３７、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）。染色したスライドから水分を取り除き、サイトシールＸＹＬ（８３１２−４、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてカバースリップをかけた。図３８に示されるように、配列番号８２のペプチド４で免疫化した抗体のみが、ＦＦＰＥ試料においてＬＡＭＰ１の膜での増強を示した。
実施例１７．１．３：ポリクローナルウサギ（ｒＡｂ４）のバッチの検証
膜でＬＡＭＰ１を発現する細胞または発現しない細胞を用いたＩＣＣ
ヒト−ＬＡＭＰ１および空のベクターＨＥＫでトランスフェクトした細胞を、ポリクローナルウサギｒＡｂ４抗体を用いて、ＦＦＰＥ様式での免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって試験した。図３９に示されるように、ポリクローナルウサギｒＡｂ４抗体Ａｂを１μｇ／ｍＬで使用したところ、高レベルの細胞内および細胞表面におけるＬＡＭＰ１の免疫染色が得られた。
ＬＡＭＰ１タンパク質に対する親和性
実施例６．２で説明した配列番号２８を有する分泌されたＬＡＭＰ１：：ｈｉｓｔａｇ（２９−３８２）を使用して、実施例６．３で説明したようにＥＬＩＳＡによって、ポリクローナル抗体ポリｒＡｂ４の親和性を決定した。ポリクローナルウサギ抗体ポリｒＡｂ４は、およそ３ｎＭのＥＣ５０でＬＡＭＰ１に結合したが、それに対してＭＡｂ１は、０．１６ｎＭのＥＣ５０で結合した。
実施例１７．２：ＦＦＰＥ腫瘍組織においてＬＡＭＰ１の膜での増強をもたらすマウスモノクローナル抗体の入手および特徴付け
実施例１７．１．１：成熟ＩｇＧのＬＡＭＰ１分泌ハイブリドーマのマウスの免疫化および選択
組換えキメラ体ヒト／マウスＬＡＭＰ１タンパク質、組換え変性ヒトＬＡＭＰ１タンパク質または組換えヒトＬＡＭＰ１タンパク質を包含する多様なタンパク質抗原で免疫化を行ったが、これらの手法は、ＦＦＰＥ腫瘍組織においてＬＡＭＰ１の膜での増強を検出できる抗体の同定において不成功であった。これらの手法では、抗ＬＡＭＰ１モノクローナル抗体を作製するための実施例２で説明した免疫化プロトコールと、実施例６．２で説明したＬＡＭＰ１タンパク質が使用された。それとは逆に、ペプチド４ベースの免疫化方策では、ＦＦＰＥ腫瘍組織においてＬＡＭＰ１の膜での増強を検出するのに望ましい抗体が同定されることが示された。
それゆえに、マウスをペプチド４で免疫化し、以下で説明したようにして抗ＬＡＭＰ１分泌ハイブリドーマを選択した。
抗ＬＡＭＰ１モノクローナル抗体の作製
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら；ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９７：１６巻、４号で説明されているようなＲＩＭＭＳ手法を使用して、約６〜８週齢の５匹のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を配列番号８２のペプチド４ ４０μｇで免疫化した。融合パートナーとしてＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（ＡＴＣＣ、ＲｅｆＣＲＬ−１５８０）を使用したＢ細胞の不死化およびハイブリドーマ選択を、実施例２で説明したようにして行った。
ＥＬＩＳＡによる抗ＬＡＭＰ１抗体の選択
一次スクリーニングは、捕捉抗原として実施例６．２で説明したＬＡＭＰ１：：ｈｉｓｔａｇタンパク質を使用した、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ（抗ＬＡＭＰ１のＩｇＧ産生に関して実施例６．３で説明した）であった。
実施例１７．２．２：ＭＡｂ４のＩＨＣスクリーニングおよび同定
実施例１７．１．２と同じ方式として、ハイブリドーマの上清を用いてＩＨＣスクリーニングを行い、結腸腺癌患者由来異種移植片ＣＲ−ＬＲＢ−０１０ＰのＦＦＰＥ試料においてＬＡＭＰ１の膜での増強を示すマウスモノクローナル抗体を同定した。二次抗体系として、ビオチン非含有の抗マウスＵｌｔｒａＭａｐ（商標）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（７６０−１５２、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を製造元の推奨に従って使用した。
選択されたハイブリドーマ８８ＬＡＭＰ１−２の上清は、結腸腺癌患者由来異種移植片ＣＲ−ＬＲＢ−０１０ＰのＦＦＰＥ試料において膜での増強を示す免疫染色を提示した。他の無関係の抗体は陰性であるか、または図４０に示されるように細胞内免疫染色を示した。
実施例１７．２．３：ハイブリドーマ８８ＬＡＭＰ１−２の検証
ハイブリドーマ８８ＬＡＭＰ１−２から得られたＭａｂ４の精製および特徴付け
ハイブリドーマ８８ＬＡＭＰ１−２を、４００ｍＬのスケールで、５％ＨＣＳ（ＰＡＡ；番号Ｆ０５−００９）が補充された培地ＡであるＣｌｏｎａｃｅｌｌ−Ｈｙ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号０３８０１）中で産生し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製された抗体ＭＡｂ４を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および質量分析で特徴付けた。ＭＡｂ４からの重鎖および軽鎖の質量を、実施例７で報告されたようにして同定し、以下の表５５で報告した。可変ドメインをコードする核酸配列を、実施例７で説明したようにＲＴ−ＰＣＲによってハイブリドーマ細胞から取り出した。重鎖および軽鎖からの対応するアミノ酸から、ＭＡｂ４からのそれぞれの質量に一致する質量を得た。
実施例１７．３：ｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＡｂ４の特徴付け
実施例１７．３．１：ＥＬＩＳＡによるヒトＬＡＭＰ１およびカニクイザルＬＡＭＰ１に対する見かけの親和性
抗体ＭＡｂ４が、霊長類ＬＡＭＰ１タンパク質と結合する能力に関して、実施例４．７で説明したように酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）アッセイによりそれを査定し、実施例６．２で説明したようにしてＥＣ５０値を決定した。抗体ＭＡｂ４は、以下の表５７に示されるように０．２〜０．４ｎＭの範囲で、類似した親和性でヒトＬＡＭＰ１およびカニクイザルＬＡＭＰ１に結合した。
実施例１７．３．２：ＬＡＭＰ１に対する特異性
ＬＡＭＰ２は、ＬＡＭＰファミリーのなかでＬＡＭＰ１に対して３５％の配列同一性を有する最も近いメンバーである。図４１で示されるように、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２可溶性タンパク質のいずれかを用いて、実施例４．６で説明したようなＥＬＩＳＡによってＭＡｂ４の特異性を評価した。ＬＡＭＰ２へのＭＡｂ４の結合は検出されず、ＬＡＭＰ１に対するＭＡｂ４のＥＣ５０とＬＡＭＰ２に対するＭＡｂ４のＥＣ５０との間に１００倍を超える差が観察された。
実施例１７．３．３：複数のがん細胞への抗体ＭＡｂ４の結合およびフローサイトメトリーによる抗体結合能力の決定
実施例４．１で説明した条件を使用したフローサイトメトリーによって、抗体ＭＡｂ４は、複数の腫瘍細胞に結合が可能であることが見出された。腫瘍細胞のパネルは、様々な由来からの患者由来腫瘍異種移植片および腫瘍細胞株を含む。表５８に、フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。表５９は、抗体結合能力の結果を要約する。
実施例１７．３．４：フローサイトメトリーによるヒト原発性結腸腫瘍ＰＤＸ（ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ）に対する抗体ＭＡｂ４の見かけの親和性
実施例４．１で説明した条件を使用したフローサイトメトリーによって、ヒト原発性結腸腫瘍ＰＤＸ ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対する抗体ＭＡｂ４の見かけの親和性を評価した。ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐで得られたＭＡｂ４とのＥＣ５０は、１．３ｎＭであった。
実施例１７．３．５：ＩＨＣでの検証
精製されたバッチで得られた結果は、精製されたＭＡｂ４を用いない実施例１７．２．２で得られた結果と類似していた。

Claims (30)

  1. ヒトＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合する、少なくとも１つの増殖阻害剤に連結またはコンジュゲートされている抗体を含むイムノコンジュゲートであって、抗体が
    （ｉ）配列番号２の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号４の配列のＣＤＲ３−Ｈ、配列番号６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
    （ｉｉ）（ｉ）に定義された６つのＣＤＲの全てを含む抗体の断片
    を含む、前記イムノコンジュゲート。
  2. 抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  3. 抗体は、
    （ｉ）配列番号１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    （ｉｉ）配列番号５３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    （ｉｉｉ）配列番号５４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    （ｉｖ）配列番号５５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン
    を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  4. 抗体は、
    ｉ）配列番号１７の配列の重鎖および配列番号１８の配列の軽鎖；または
    ｉｉ）配列番号６０の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖；または
    ｉｉｉ）配列番号６２の配列の重鎖および配列番号６１の配列の軽鎖；または
    ｉｖ）配列番号６４の配列の重鎖および配列番号６３の配列の軽鎖
    を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  5. 抗体は抗体断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  6. 抗体はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディおよびＶＨＨからなる群から選択される断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  7. 抗体は二重特異的または多重特異的抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  8. 前記少なくとも１つの増殖阻害剤は細胞傷害剤または放射性同位体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  9. 前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、化学療法剤、酵素、抗生物質、毒素、タキソイド、ビンカ、タキサン、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド類似体、トメイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、およびＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  10. 前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、Ａｔ211、Ａｃ225、Ｂｉ212、Ｅｒ169、Ｉ131、Ｉ124、Ｉ125、Ｙ90、Ｉｎ111、Ｐ32、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｓｒ89、Ｚｒ89、Ｔｃ99m、Ｇａ68、Ｃｕ64、Ｌｕの放射性同位体、およびＴｈ227からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  11. 前記少なくとも１つの増殖阻害剤は、
    （ｉ）洋種ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質以外の酵素；ブレオマイシンおよびマイトマイシン以外の抗生物質；その断片および／もしくはバリアントを含む、アブリンおよびリシン以外の細菌、真菌、もしくは動物起源もしくは植物起源の毒素；抗チューブリン剤、メイタンシノイドもしくはメイタンシノイド類似体、パクリタキセル（タキソール）以外のタキソイドもしくはタキサン、ビンデシン、ビンクリスチンおよびビンブラスチン以外のビンカアルカロイド、クリプトフィシン誘導体、オーリスタチンもしくはドラスタチン類似体からなる化合物の薬物もしくはプロドラッグ；ＢＣＮＵおよびシクロホスファミド、トメイマイシンもしくはピロロベンゾジアゼピン誘導体、ＣＣ−１０６５もしくはＣＣ−１０６５類似体以外のＤＮＡアルキル化剤；レプトマイシン誘導体；ドキソルビシン（アドリアマイシン）およびエトポシド以外のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、アルファ−アマニチンからなる群から選択される細胞傷害剤、または
    （ｉｉ）Ａｔ211、Ａｃ225、Ｂｉ213、Ｐｂ212、Ｅｒ169、Ｉ124、Ｉ125、Ｉｎ111、Ｐ32、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｓｒ89、Ｚｒ89、Ｔｃ99m、Ｇａ68、Ｃｕ64およびＬｕ177のようなＬｕの放射性同位体、およびＴｈ227からなる群から選択される放射性同位体
    である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  12. 前記増殖阻害剤はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ2'−デアセチル−Ｎ−2'（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  13. 抗体は切断性または非切断性リンカーにより少なくとも１つの増殖阻害剤に共有結合している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  14. 前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホ−酪酸（スルホ−ＳＰＤＢ）、およびスクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）からなる群から選択される、請求項１３に記載のイムノコンジュゲート。
  15. 前記リンカーはＮ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）であり、増殖阻害剤はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。
  16. 前記リンカーは４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホ−酪酸（スルホ−ＳＰＤＢ）であり、増殖阻害剤はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。
  17. 前記リンカーはスクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）であり、増殖阻害剤はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）である、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。
  18. イムノコンジュゲートは、１〜１０、好ましくは２〜５、より好ましくは３〜４の範囲の薬物抗体比（ＤＡＲ）を特徴とし、ＤＡＲが、薬物濃度と抗体濃度との比：
    ＤＡＲ＝ＣD／ＣA
    （式中、
    ＣD＝［（εA280ｘＡ252）−（εA252ｘＡ280）］／［（εD252ｘεA280）−（εA252ｘεD280）］
    ＣA＝［Ａ280−（ＣDｘεD280）］／εA280
    であり、
    εD252およびεD280は、それぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの薬物のモル吸光係数であり；
    εA252およびεA280は、それぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数であり；
    Ａ252およびＡ280は、それぞれ、古典的な分光光度計装置を用いて測定された、２５２ｎｍ（Ａ252）および２８０ｎｍ（Ａ280）でのコンジュゲートの吸光度である）
    から算出される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  19. 少なくとも２分子の本発明による抗体は、がん細胞の表面に発現される１分子のＬＡＭＰ１により内在化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  20. ヒトＬＡＭＰ１タンパク質に特異的に結合し、そして
    配列番号２の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号４の配列のＣＤＲ３−Ｈ；ならびに
    配列番号６の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列ＤＴＳのＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｌ
    を含む、単離された抗体。
  21. （ｉ）配列番号１の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
    （ｉｉ）配列番号５３の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
    （ｉｉｉ）配列番号５４の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または
    （ｉｖ）配列番号５５の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号５８の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体
    の可変重鎖および軽鎖を含む、請求項２０に記載の単離された抗体。
  22. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項２０および２１のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  23. がんの処置のための使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項２０および２１のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. がんは結腸腺癌、消化管腫瘍、重要臓器腫瘍、生殖器腫瘍、または皮膚、喉頭もしくは軟部組織腫瘍である、請求項２３に記載の使用のためのイムノコンジュゲート、抗体または医薬組成物。
  25. 対象の生物試料におけるＬＡＭＰ１発現をｅｘ ｖｉｖｏで検出するための使用のための、請求項２０および２１のいずれか１項に記載の抗体。
  26. 対象におけるＬＡＭＰ１発現をｉｎ ｖｉｖｏで検出するための使用のための、請求項２０および２１のいずれか１項に記載の抗体。
  27. 検出可能な分子または物質で標識される、請求項２５および２６に記載の使用のための抗体。
  28. 前記使用は、対象におけるがんの存在を診断するため、ＬＡＭＰ１を標的とする治療剤に対する、がんを有する患者の感受性を決定するため、または抗ＬＡＭＰ１がん療法の有効性をモニタリングするため、または抗ＬＡＭＰ１がん療法後のがんの再発を検出するためのものである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
  29. 請求項２０および２１のいずれか１項に記載の抗体をコードする配列を含む単離された核酸。
  30. 請求項２９に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。
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