CN103533957B - 抗liv-1的人源化抗体及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与LIV-1特异性结合的人源化抗体。所述抗体对于治疗和诊断各种癌症及检测LIV-1是有用的。

Description

抗LIV-1的人源化抗体及其在治疗癌症中的用途
交叉申请案的交互参照
本申请是非临时专利申请，并主张US61/420,291(2010年12月6日提出申请)及US61/446,990(2011年2月25日提出申请)的优先权，每个优先权均以参照方式并入本申请以符合所有目的。
背景技术
LIV-1是锌转运蛋白类的LZT(LIV-1-ZIP锌转运蛋白)亚家族的一员。Tayloretal.,Biochim.Biophys.Acta1611:16-30(2003)。LIV-1蛋白的计算机分析显示了一个潜在的金属蛋白酶基序(motif)，该基序符合锌金属蛋白酶的酶催化性(catalytic)锌结合位点基序的一致序列。LIV-1mRNA主要表答于乳房、前列腺、脑下垂体及脑组织。
已知该LIV-1蛋白亦与某些癌状况有关，例如乳癌和前列腺癌。检测到LIV-1与雌激素受体阳性乳癌(McClellandetal.,Br.J.Cancer77:1653-1656(1998))及这些癌转移扩散至区域性淋巴结有关。Manningetal.,Eur.J.Cancer30A:675-678(1994)。
发明内容
本发明提供一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与SEQIDNO:53至少90％一致性的氨基酸序列，且其中位点H27被L占据、位点H29被I占据、位点H30被E占据、位点H94被V占据，所述成熟轻链可变区具有与SEQIDNO:60至少90％的一致性的氨基酸序列，且其中位点L36被Y占据、位点L46被P占据。可选地，所述人源化抗体包含SEQIDNO:53的三个CDRs及SEQIDNO:60的三个CDRs。所述CDRs显示于图16中。可选地，位点H76被N占据。可选地，所述人源化抗体包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区具有与SEQIDNO:53至少95％一致性的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有与SEQIDNO:60至少95％一致性的氨基酸序列。可选地，所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。可选地，所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。可选地，所述重链恒定区是IgG1同种型。可选地，所述重链恒定区具有包含SEQIDNO:44的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQIDNO:42的氨基酸序列。可选地，所述重链恒定区具有包含SEQIDNO:46(S239C)的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQIDNO:42的氨基酸序列。在一些这样的人源化抗体中，分别源自SEQIDNO:52和SEQIDNO:60的成熟重链可变区和成熟轻链可变区的CDRs的任何差异位于位点H60至H65。在一些这样的人源化抗体中，所述成熟重链可变区具有被指定为SEQIDNO:52或53的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有被指定为SEQIDNO:59或60的氨基酸序列。在一些这样的人源化抗体中，所述成熟重链可变区具有被指定为SEQIDNO:53的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有被指定为SEQIDNO:60的氨基酸序列。一些这样的人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。一些这样的人源化抗体与人或食蟹猴的LIV-1的结合常数为0.5至2×109M-1。
本发明还提供一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQIDNO:52的三个KabatCDRs，其中位点H27被L占据、位点H29被I占据、位点H30被E占据、位点H76被N占据、位点H94被V占据，所述成熟轻链可变区包含SEQIDNO:60的三个KabatCDRs，其中位点L36被Y占据、位点L46被P占据。本发明还提供一种核酸，其编码任一种上述定义的人源化抗体的成熟重链可变区和/或成熟轻链可变区。
本发明还提供一种治疗患癌症或有患癌风险的病患的方法，包括对所述病患给予任一种上述定义的人源化抗体的有效给药方案。所述癌症是乳癌、前列腺癌、宫颈癌或黑色素瘤。
本发明进一步提供一种药物组合物，其包含以上定义的人源化抗体。
本发明进一步提供治疗患有黑色素瘤(所述黑色素瘤表达LIV-1蛋白)病患的方法，即对所述病患给予LIV-1特异性抗体或LIV-1抗体药物共轭物，而给药剂量对于抑制黑色素瘤癌细胞的生长是足够的。
本发明进一步提供治疗患有宫颈癌(所述宫颈癌表达LIV-1蛋白)病患的方法，即对所述病患给予LIV-1特异性抗体或LIV-1抗体药物共轭物，而给药剂量对于抑制宫颈癌细胞的生长是足够的。
本发明进一步提供一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与HB(SEQIDNO:10)至少90％一致性的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有与LB(SEQIDNO:5)至少90％一致性的氨基酸序列。可选地，所述抗体包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区具有与HB至少95％一致性的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有与LB至少95％一致性的氨基酸序列。可选地，所述抗体中，位点H29、H30和H76被I、E和N占据，且位点L36被Y占据。可选地，所述成熟重链可变区与SEQIDNO:10的可变区框架的任何差异选自以下类型构成的组：由F占据的H27、由N占据的H28、由I占据的H48、由K占据的H66、由A占据的H67、由A占据的H71、由N占据的H76、由N占据的H93、由V占据的H94、由L占据的L37、由K占据的L39、由K占据的L45、或由L占据的L46。可选地，所述成熟重链可变区的3个CDRs是SEQIDNO:10的3个CDRs，且所述成熟轻链可变区的3个CDRs是SEQIDNO:15的3个CDRs。所述CDRs显示于图1。可选地，所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。可选地，所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。可选地，所述重链恒定区是IgG1同种型。可选地，所述重链恒定区具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。可选地，所述重链恒定区具有包含SEQIDNO:8(S239C)的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。可选地，分别源自SEQIDNO:10和SEQIDNO:15的成熟重链可变区和成熟轻链可变区的CDRs的任何差异位于位点H60至H65。可选地，所述成熟重链可变区具有包含SEQIDNO:10的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有包含SEQIDNO:15的氨基酸序列。可选地，所述抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。优选的人源化抗体相比于抗体BR2-14a，对人LIV-1具有更高的亲和性。在另一个实施例中，所述人源化抗体与人或食蟹猴的LIV-1的结合常数为0.5×109M-1至2×109M-1。
本发明进一步提供了一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQIDNO:10的3个CDRs，其中位点H29、H30和H76分别被I、E和N占据，且所述成熟轻链可变区包含SEQIDNO:15的3个CDRs，其中位点L36被Y占据。
本发明进一步提供了一种核酸，其编码任一前述人源化抗体的成熟重链可变区和/或成熟轻链可变区。
本发明进一步提供了一种治疗患癌症或有患癌风险的病患的方法，包括对所述病患给予前述的人源化抗体的有效给药方案。可选地，所述癌症是乳癌、前列腺癌、宫颈癌或黑色素瘤。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含前述的人源化抗体。
本发明进一步提供了一种治疗患三重阴性乳癌或有患三重阴性乳癌风险的病患的方法，包括对所述病患给予特异性结合LIV-1的抗体的有效给药方案。可选地，在此方法中，所述抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂(细胞静止剂cytostaticagent)共轭。
附图说明
图1显示所述母体小鼠mAb(称为BR2-14a)与所述人源化LIV-1重链可变区(上二图)及轻链可变区(下二图)的氨基酸序列比对。
图2显示所述人源化LIV-1mAb与所述母体小鼠抗体(称为BR2-14a)的结合曲线。
图3显示所述人源化LIV-1mAb与所述母体小鼠抗体(称为BR2-14a)的竞争结合试验结果。在每个变异体(variant)后的括号内数字显示回复突变的数目。
图4显示在MCF7细胞上的饱和结合试验结果。BR2-14a-AF指经AF标记的母体小鼠抗体。hLIV-14指经AF标记的HBLB抗体，即为与LIV-1特异性结合的人源化抗体。
图5显示在表达重组LIV-1蛋白的CHO细胞上的竞争结合试验的结果。BR2-14a指所述母体小鼠抗体。hLIV-14HBLBWT指所述HBLB抗体。hLIV-14HBLBS239C指重链各位置的丝氨酸被取代成半胱氨酸的HBLB抗体。
图6显示在乳癌病患样本(经荷尔蒙处理)的上的LIV-1蛋白表达的IHC分析。
图7显示在激素抵抗型转移性前列腺癌病患样本上的LIV-1蛋白表达的IHC分析。
图8显示在三重阴性乳癌病患样本上的LIV-1蛋白表达的IHC分析。
图9显示hLIV-14抗体药物共轭物的细胞毒性试验结果，即与vcMMAE(1006)或mcMMAF(1269)共轭的HBLBmAb，以及对照小鼠(mIgG)及人(hIgG)抗体的轭物。hLIV-14-SEA-1006指非岩藻糖化形式的与vcMMAE(1006)共轭的HBLBmAb。
图10显示在MCF7细胞上使用人NK细胞(供体1；V/V)的活体外(invitro)ADCC试验结果。hLIV-14WT指HBLB单克隆抗体。hLIV-14SEA指非岩藻糖化形式的HBLB单克隆抗体。hLIV-14mcMMAF指与mcMMAF共轭的HBLB单克隆抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14vcMMAE指与vcMMAE共轭的HBLB单克隆抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14SEAvcMMAE指非岩藻糖化形式的HBLBmAb-vcMMAE抗体药物共轭物。
图11显示在MCF7细胞上使用人NK细胞(供体2)的活体外ADCC试验结果。hLIV-14WT指HBLB单克隆抗体。hLIV-14SEA指非岩藻糖化形式的HBLB单克隆抗体。cLIV-14SEA指非岩藻糖化形式的嵌合性母体小鼠抗体。hLIV-14mcF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的HBLB单克隆抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14vcE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的HBLB单克隆抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14vcE(4)SEA指非岩藻糖化形式的每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的HBLB单克隆抗体-vcMMAE抗体药物共轭物。hIgG指对照人IgG。H00-mcF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的非结合抗体的对照抗体药物共轭物。H00-vcE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的非结合抗体的对照抗体药物共轭物。
图12显示异种移植MCF7乳癌细胞系至裸鼠的试验结果。cLIV-14-mcMMAF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的嵌合形式的母体小鼠抗体的抗体药物共轭物。cLIV-14-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的嵌合形式的母体小鼠抗体的抗体药物共轭物。H00-mcMMAF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的非结合对照抗体的抗体药物共轭物。H00-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的非结合对照抗体的抗体药物共轭物。剂量及给药时间如图所示。
图13显示异种移植PC3前列腺癌细胞系至雄性裸鼠的试验结果。cLIV-14-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的嵌合形式的母体小鼠抗体的抗体药物共轭物。hBU12-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的抗CD19抗体的抗体药物共轭物。剂量及给药时间如图所示。
图14显示异种移植MCF7乳癌细胞系至裸鼠的试验结果。hLIV-14-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14d-vcMMAE(2)指每抗体具有平均2个vcMMAE药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物，所述每个vcMMAE共轭连接于每条重链的S239C位置。H00-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的非结合对照抗体的抗体药物共轭物。剂量及给药时间如图所示。
图15显示异种移植PC3前列腺癌细胞系至雄性裸鼠的试验结果。hLIV-14-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14-mcMMAF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物。hLIV-14d-vcMMAE(2)指每抗体具有平均2个vcMMAE药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物，所述每个vcMMAE共轭连接于每条重链的S239C位置。hLIV-14d-mcMMAF(2)指每抗体具有平均2个mcMMAF药物连接器分子的HBLB抗体的抗体药物共轭物，所述每个mcMMAF各共轭连接于每条重链的S239C位置。H00-vcMMAE(4)指每抗体具有平均4个vcMMAE药物连接器分子的非结合对照抗体的抗体药物共轭物。H00-mcMMAF(4)指每抗体具有平均4个mcMMAF药物连接器分子的非结合对照抗体的抗体药物共轭物。剂量及给药时间如图所示。
图16A及16B显示人源化重链(图16A)及轻链(图16B)成熟可变区与小鼠BR2-22a对应重链及轻链成熟可变区的比对。
图17显示源自抗LIV-1小鼠单克隆抗体BR2-22a的人源化重链HA-HF与人源化轻链LA-LF的不同排列组合的竞争结合试验。每条轻链或重链中的小鼠回复突变的总数显示于括号内。只有HELF显示保留足够的结合性。
图18显示HE和LF链的系统化差异以测试各回复突变对抗原结合性的贡献。可能的体细胞超突变(potentialsomatichypermutation)的位点显示于括号内。小鼠残基以画底线表示。其余残基是人种系残基。
图19的上图显示LF变异体的竞争结合。下图显示被测试的回复突变。小鼠残基以画底线表示。其余残基是人种系残基。
图20的上图显示HE变异体的竞争结合。下图显示被测试的回复突变。小鼠残基以画底线表示。其余残基系人种系残基。
图21显示HE、HF、HG和LF及LG的不同排列组合的竞争结合。
图22显示人源化LIV14抗体与人源化LIV22抗体对CHO细胞所表达的人及食蟹猴(cynomolgus)LIV-1的饱和结合。
图23显示在处理144小时后，人源化LIV22-vcMMAE对MCF-7细胞的细胞毒性活性。h00-1006是对照药物共轭抗体(controldrug-conjugatedantibody)。
图24显示在处理144小时后，人源化LIV22-mcMMAF对MCF-7细胞的细胞毒性活性。h00-1269是对照药物共轭抗体。
图25显示hLIV22抗体对雌性裸鼠的PC3(DSMZ)前列腺癌模型的活性。给药日以三角形标示于X轴上。
图26显示hLIV22抗体对裸鼠的MCF7(NCI)乳癌肿瘤的活性。
图27比较hLIV22和hLIV14在如图26所示的相同模型中的活性。
图28显示在黑色素瘤病患样本上的LIV-1蛋白表达的IHC分析。
定义
单克隆抗体通常以分离形式提供。这表示抗体通常具有至少50％w/w的纯度，其不含源自其制备或纯化过程中的干扰蛋白质及其他污染物，但不排除该单克隆抗体与额外的制药上可接受的载体(carrier)或其他媒介(vehicle)组合以利于其使用的可能性。有时单克隆抗体具有至少60％、70％、80％、90％、95或99％w/w不含源自其制备或纯化过程中的干扰蛋白质和污染物的纯度。
单克隆抗体与其标靶抗原的特异性结合是指至少106、107、108、109或1010M-1的亲和性。相比于与至少一种不相关标靶结合的非特异性结合，特异性结合的可在一个更高的数量级上被检测出，并且可与所述的非特异性结合区分。特异性结合可以是特定官能团之间形成键或特定空间契合(例如锁和钥匙类型)的结果，然而非特异性结合通常是范德华力(vanderWaals)的结果。然而，特异性结合不一定表示单克隆抗体与一种且仅与一种标靶结合。
基本的抗体结构单位为亚基的四聚体。每个四聚体包括二对相同的多肽链对，每一对多肽链具有一条“轻链”(约25千道尔顿)及一条“重链”(约50至70千道尔顿)。每一条链的氨基末端部分包括约100-110个或更多氨基酸的可变区，该可变区主要负责识别抗原。此可变区在刚被表达时与一个可切割的信号肽连接(cleavablesignalpeptide)。不具有该信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，举例来说，轻链成熟可变区是指不具有轻链信号肽的轻链可变区。每一条链的羧基末端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。
轻链被分类为为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并定义对应抗体的同种型(isotype)分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过一个约12个或12个以上的氨基酸的“J”区连接，同时重链也包括一个约10个或更多个氨基酸“D”区。(一般见FundamentalImmunology(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.,1989,Ch.7，以参考方式整体纳入以符合所有目的)。
每个轻/重链对的成熟可变区可形成的抗体结合位点。因此，一个完整的抗体具有2个结合位点。除双功能抗体或双特异性抗体外，所述两个结合位点是相同的。所述的链都表现出相同的通用结构或相对保守的骨架区(FR)，其通过3个高变区连接，所述的高变区也叫互补决定区或CDRs。源自每个轻/重链对的两条链的CDRs是由框架区对准，以结合到特定的抗原表位。从N-末端至C-末端，轻链和重链均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配与Kabat《免疫学重要的蛋白质的序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)(国立卫生研究院,Bethesda,MD,1987和1991)中的定义或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature342:878-883(1989)的定义是一致的。Kabat还提供了一种广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中，不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被分配了相同的编号。
术语“抗体”包括完整的抗体和其所结合的片段。通常情况下，片段与产生它们的完整的抗体竞争结合特定的靶标，包括单独的重链和轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dabs、纳米体和Fv。片段可以产生自重组DNA技术，或完整的免疫球蛋白的酶分离或化学分离。术语“抗体”还包括双特异性抗体(同型二聚体Fv片段)或迷你抗体(minibody)(VL-VH-CH3)、双特异性抗体或类似物。双特异性抗体或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。(参见，例如,SongsivilaiandLachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelnyetal.,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。术语“抗体”包括抗体本身(裸抗体)或与细胞毒性药物或细胞抑制性药物共轭的(conjugated)抗体。
术语“抗原表位”是指位于抗原上的能与抗体结合的位点。抗原表位可由一个或多个蛋白三级折叠的并列的连续的氨基酸或不连续的氨基酸形成。由连续氨基酸形成的抗原表位通常暴露于变性剂后不受影响，而由三级折叠形成的抗原表位通常经变性剂处理后消失。抗原表位的独特空间构象中通常包括至少为3个，更通常为5个或8-10个氨基酸。抗原表位的空间构象的测定方法包括，例如，x-射线结晶学和二维核磁共振，参见，例如EpitopeMappingProtocols,inMethodsinMolecularBiology,Vol.66,GlennE.Morris,Ed.(1996)。
识别相同或重叠抗原表位的抗体可被简单的免疫分析法鉴定，该免疫分析法显示一个抗体相对于另一个抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的对应抗原表位也可以是确定的结合于抗原的抗体的X-射线晶体学(以鉴定接触残基)。或者，如果可减少或消除一种抗体结合的抗原所有氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有相同的抗原表位。如果可减少或消除一种抗体结合的抗原某些氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠的抗原表位。
抗体间的竞争由试验分析来确定，其中被测的抗体抑制参照抗体与共有抗原的特异结合(见，如Junghans等,CancerRes.50:1495,1990)。在竞争性结合试验分析中，若过量的被测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50％，但优选为75％、90％或99％参照抗体的结合，则被测试抗体与参照抗体竞争。由竞争法确定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体具有相同结合抗原表位的抗体，及与毗邻抗原表位(由于空间位阻发生，该毗邻抗原表位充分接近与参照抗体结合的抗原表位)结合的抗体。
术语“患者”包括接受预防或治疗处理的人类和其他哺乳动物测试体。
为了对氨基酸替换的保守性和非保守性进行分类，氨基酸分组如下：组I(疏水性侧链)：甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸亮，氨酸、异亮氨酸；组II(中性亲水性侧链)：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；组III(酸性侧链)：天冬氨酸、谷氨酸；组IV(基本侧链)：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；组V(影响链定位的残基)：甘氨酸、脯氨酸；组VI(芳香侧链)：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替换涉及同一类氨基酸之间的替换，非保守替换由以下情况构成，即一类氨基酸的成员被另一类氨基酸的成员替换。
序列一致性百分率根据Kabat编号法则对抗体序列进行最大比对。如果受试抗体区域(如一条轻链或一条重链的完整的成熟可变区)与一个参照抗体的相同序列比对，比对后，受试抗体与参照抗体相同序列百分率为受试抗体与参照抗体中占据相同位置的氨基酸数量除以两个区域的比对位置的总数，缺口不算在内，乘以100以转换成百分率。
“包括”一个或多个例举元素的组合物或方法还囊括其它没有特别例举的元素。例如，一个包括抗体的组合物，该组合物可以仅含有该抗体，也可与其它成分相结合。
一个范围的数值的指定包括在该范围内的所有整数或定义该范围的所有整数。
抗体效应器功能(antibodyeffectorfunction)是指由免疫球蛋白(Ig)的Fc结构域所贡献的功能。这样的功能可为例如抗体依赖性细胞性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用或补体依赖性细胞毒性。所述功能可由例如Fc效应器结构域与Fc受体结合而引起(所述Fc受体位于具有吞噬细胞活性或细胞溶解活性的免疫细胞上)，或由Fc效应器结构域与补体系统的成分结合引起。通常，由该Fc结合的细胞或补体成分所介导的效应导致该LIV-1标靶的细胞的抑制和/或消除。抗体的Fc区可吸引(recruit)表达Fc受体(FcR)的细胞，使这些细胞与被抗体包覆之标靶细胞并置(juxtapose)。表达IgG的表面FcR(包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD64))的细胞可作为效应细胞以摧毁被IgG包覆的细胞。所述的效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀手(NK)细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞。IgG与FcγR的结合活化了抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞性吞噬作用(ADCP)。ADCC是由CD16+效应细胞经由分泌膜孔形成蛋白及蛋白酶所介导，然而吞噬作用是由CD32+及CD64+效应细胞所介导(见FundamentalImmunology,4thed.,Pauled.,Lippincott-Raven,N.Y.,1997,Chapters3,17and30；Uchidaetal.,2004,J.Exp.Med.199:1659-69；Akewanlopetal.,2001,CancerRes.61:4061-65；Watanabeetal.,1999,BreastCancerRes.Treat.53:199-207)。除了ADCC及ADCP之外，与细胞结合的抗体的Fc区亦可活化补体经典途径以诱发补体依赖性细胞毒性(CDC)。当抗体与抗原结合时，补体系统的C1q与所述抗体的Fc区结合。C1q与和细胞结合的抗体的结合可诱发级联事件，该事件涉及C4和C2的蛋白水解活化作用以产生C3转化酶。由C3转化酶将C3裂解(cleavage)成C3b使得包括C5b、C6、C7、C8和C9的终末补体成份被活化。这些蛋白质一起在所述被抗体包覆的细胞上形成膜攻击复合体孔。这些孔扰乱了细胞膜的完整性并杀死该靶细胞(见Immunobiology,6thed.,Janewayetal.,GarlandScience,N.Y.,2005,Chapter2)。
术语“抗体依赖性细胞性细胞毒性”(antibody-dependentcellularcytotoxicity)，或ADCC，是一种用于诱导细胞死亡的机制，该机制取决于被抗体包覆的靶细胞与具有促细胞溶解活性的(lyticactivity)免疫细胞(亦称为效应细胞)的交互作用。该等效应细胞包括自然杀手细胞、单核细胞/巨噬细胞及中性粒球。所述效应细胞与和Ig的Fc效应器结构域(Ig与靶细胞结合)的依附是通过它们的抗原结合部位(antigen-combiningsites)。被抗体包覆的靶细胞因为效应细胞的活性而死亡。
术语“抗体依赖性细胞性吞噬作用”或ADCP，是指：通过与Ig的Fc效应器结构域结合的吞噬细胞性免疫细胞(例如巨噬細胞、中性粒细胞和树突細胞)，被抗体包覆的细胞被内在化(不论整体或部分)的过程。
术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指一种诱导细胞死亡的机制，其中与标靶结合的抗体的Fc效应结构域(effectordomain(s))活化一系列酶反应以在该标靶细胞膜上形成孔。通常，抗原抗体复合物(诸如被抗体包覆的靶细胞)结合并活化补体成份C1q，转而激活所述补体成分级联反应(complementcascade)，进而导致靶细胞死亡。补体的活化也可导致补体成份在该靶细胞表面上沉积，而这有利于ADCC，其通过将补体受体(例如CR3)结合于白血球上。
“细胞毒性效应”是指除尽(depletion)、消除(elimination)及/或杀死标靶细胞。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性效应的药剂。细胞毒性剂可与抗体共轭(conjugated)或与抗体联合给药(administered)。
“细胞静止(抑制)效应”(cytostaticeffect)指抑制细胞增殖。“细胞抑制剂”(cytostaticagent)指对细胞具有细胞静止(抑制)效应的药剂，从而抑制特定细胞亚群(specificsubsetofcells)的生长(growth)及/或扩张(expansion)。细胞抑制剂可与抗体共轭或与抗体联合给药(administered)。
术语“医药上可接受的”(pharmaceuticallyacceptable)指经美国联邦或州政府管理机关核准或可核准的，或经列示于美国药典或其他公认药典中以使用于动物及特别是人。术语“医药上可相容的成分”(pharmaceuticallycompatibleingredient)指抗LIV-1抗体在医药上可接受得稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
“医药上可接受的盐”指抗LIV-1抗体、抗LIV-1抗体的共轭物或与抗LIV-1抗体一起给药的药剂的医药上可接受的有机或无机盐。示范性盐类包括硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、二酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(即1,1’亚甲基双-(2羟基3萘甲酸盐))。医药上可接受的盐可能涉及纳入另一分子诸如乙酸离子、琥珀酸离子或其他反离子(counterion)。该反离子可为稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机基团。另外，医药上可接受的盐在其结构中可具有超过一个带电原子。例如医药上可接受的盐的一部分是多电荷的原子，其可具有多个反荷离子。因此，医药上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个反离子。
除非在上下文中另有清楚的说明，术语“约”包括在所述数值的标准差之内的数值。
详细说明
I.通则
本发明提供与LIV-1特异性结合的单克隆抗体。所述抗体可被用于治疗及诊断各种癌症及检测LIV-1。
II.靶分子
除非另外说明，否则LIV-1指人LIV-1。示范性的人序列具有SwissProt编号(SwissProtaccessionnumber)Q13433。在此处，Q13433被包括作为SEQIDNO:83。已知有三种不同的亚型(variantisoforms)及一种多态性(polymorphism)。第二种人LIV-1蛋白(编号AAA96258.2)在此处被包括作为SEQIDNO:84。Q13433的四个胞外结构域分别由残基29-325、377-423、679-686及746-755形成。
除非上下文另外清楚说明，LIV-1指所述蛋白的至少一个胞外结构域且通常指完整蛋白，而非可切割(cleavable)的信号肽(Q13433的氨基酸1-28)。
III.本发明的抗体
A.结合特异性及功能特性
本发明提供衍生自小鼠的二种抗体BR2-14a及BR2-22a的人源化(humanizedantibodies)抗体。除非另外清楚说明，本发明公开两种抗体。所述二种小鼠抗体的成熟重链及轻链可变区彼此显示94％及91％的序列一致性。所述二种抗体在人LIV-1上结合相同或相重叠的抗原表位。然而如图22所示，所述BR2-22a抗体对人LIV-1的亲和性(affinity)约为BR2-14a的10倍，对食蟹猴LIV-1的亲和性约为BR2-14a的3倍。
人源化形式的小鼠BR2-14a抗体的亲和性(即Ka)优选地为该小鼠抗体BR2-14a对人LIV-1的亲和性的5倍或2倍之内。人源化的BR2-14a抗体与天然形式的人LIV-1特异性结合，和/或与重组地表达的人LIV-1特异性结合，所述的重组表达是由CHO细胞表达(正如所述的源自CHO细胞的小鼠抗体)。相比于BR2-14a，优选地，人源化BR2-14a抗体对人LIV-1具有相同或较高(即超过测量中的误差幅度)的亲和性(例如为BR2-14a的亲和性的1.1至5倍、1.1至3倍、1.5至3倍、1.7至2.3倍、或1.7至2.1倍，或约为BR2-14a的亲和性的2倍)。对于与人LIV-1的结合，优选的人源化BR2-14a抗体与BR2-14a结合于相同的抗原表位和/或彼此竞争结合。优选的人源化BR2-14a抗体也与LIV-1的食蟹猴同源物(cyno-homologofLIV-1)结合，因此允许在非人灵长动物中进行临床前试验。
人源化形式的小鼠BR2-22a抗体对人LIV-1(天然表达或自CHO细胞表达)的亲和性(即Ka)优选地为该小鼠抗体BR2-22的亲和性的5倍或2倍之内。有些人源化的BR2-22a抗体具有实质上与BR2-22a相同之结合常数(associationconstant)(即在实验误差之内)。有些人源化的BR2-22a抗体具有该BR2-22a抗体的结合常数的0.5-1倍或0.5-1.5倍范围内的结合常数。优选的人源化BR2-22a抗体对CHO细胞所表达的人LIV-1具有高于5×108M-1、或在0.5至2×109M-1或约0.8×109M-1(+/-测量误差)的结合常数。此处及本申请其他处所述的亲和性可根据实施例中的方法测量。对于与人LIV-1的结合，优选的人源化BR2-22a抗体与BR2-22a结合于相同的抗原表位和/或彼此竞争结合。人源化BR2-22a抗体与LIV-1的食蟹猴同源物(cyno-homologofLIV-1)结合，也与人LIV-1结合。优选的人源化BR2-22a抗体以实质上相同的结合常数与人及食蟹猴LIV-1(人及食蟹猴LIV-1均有CHO细胞表达)结合(在实验误差范围内)，这允许及增加了非人灵长动物中的临床前试验的预测准确性。
优选的抗体(人源化BR2-14a及人源化BR2-22a两者)抑制了癌症(例如细胞生长、有机体的转移和/或致死性)，如在培养、动物模型或临床试验中的癌细胞增殖。动物模型可由一下方式形成：将表达LIV-1的人肿瘤细胞系(celllines)植入适当的免疫缺陷的啮齿动物品系(strains)中，例如无胸腺裸鼠或SCID小鼠。这些肿瘤细胞系可被建立于免疫缺陷啮齿动物品宿主中，其作为实体瘤(通过皮下注射)或散播型肿瘤(通过静脉注射)。一旦在宿主体内建立，这些肿瘤模型可被用于评估所述抗LIV-1抗体或其共轭形式的治疗疗效，正如实施例中所述。
B.人源化抗体
人源化抗体是经基因工程改造过的抗体，其中源自非人“供体”抗体的CDRs被嫁接(graftedinto)于人“受体”抗体序列(见例如Queen,US5,530,101及5,585,089；Winter,US5,225,539；Carter,US6,407,213；Adair,US5,859,205；及Foote,US6,881,557)。所述受体抗体序列可为例如成熟人抗体序列、所述序列的组合物、人抗体序列的共有序列(consensussequence)或种系区域序列(germlineregionsequence)。优选的用于重链的受体序列是种系(germline)VH外显子VH1-2(在文献中亦称为HV1-2)(Shinetal.,1991,EMBOJ.10:3641-3645)，对于绞链区(JH)，则为外显子JH-6(Mattilaetal.,1995,Eur.J.Immunol.25:2578-2582)。以轻链而言，优选的受体序列是外显子VK2-30(在文献中亦称为KV2-30)，对于绞链区，则为外显子Jκ-4(Hieteretal.,1982,J.Biol.Chem.257:1516-1522)。因此，人源化抗体是这样一种抗体，其具有完全或实质上源自供体抗体的部分或全部CDRs，和完全或实质上源自人抗体序列的可变区框架序列及恒定区(若存在的话)。类似地，人源化重链具有至少一、二及通常所有三个完全或实质上源自供体抗体重链的CDR，及实质上源自人重链可变区框架及恒定区序列的重链可变区框架序列及重链恒定区(若存在的话)。类似地，人源化轻链具有至少一、二及通常所有三个完全或实质上源自供体抗体轻链的CDR，及实质上源自人轻链可变区框架及恒定区序列的轻链可变区框架序列及轻链恒定区(若存在的话)。不同于奈米抗体(nanobodies)及dAb，人源化抗体包含人源化重链及人源化轻链。当人源化抗体中的CDR与非人抗体中的对应CDR之间的对应残基(如Kabat定义)具有至少60％、85％、90％、95％或100％的一致性时，该人源化抗体中的CDR则实质上源自该非人抗体中的对应CDR。当抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区与由Kabat定义的对应残基具有至少85％、90％、95％或100％的一致性时，则其实质上源自人可变区框架序列或人恒定区。
虽然人源化抗体通常纳入所有六个来自小鼠抗体的CDRs(优选地，由Kabat定义)，其也可以由少于所有源自小鼠抗体的CDR(例如至少3、4或5个CDR)制备(例如Pascalisetal.,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdosetal.,JournalofMolecularBiology,320:415-428,2002；Iwahashietal.,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamuraetal,JournalofImmunology,164:1432-1441,2000)
源自人可变区框架的残基的某些氨基酸可根据其对CDR构象及/或与抗原结合的可能影响经选择加以取代。所述可能影响的研究可以通过以下方式实现：建模、检查在特定位置的氨基酸的特征，或经验性观察特定氨基酸的取代或突变的影响。
举例来说，当小鼠可变区框架残基与经选择的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，该人框架氨基酸可利用源自该小鼠抗体的相等框架氨基酸加以取代，若能合理地预期该氨基酸：
(1)非共价地与抗原直接结合；
(2)毗邻CDR区；
(3)以其他方式与CDR区交互作用(例如位于CDR区之约以内)；或
(4)介导该重链与轻链之间的交互作用。
本发明提供小鼠BR2-14a抗体的人源化形式，其包括5个示范性人源化重链成熟可变区(HA至HE)及六个示范性人源化轻链成熟可变区(LA至LF)。具有最强结合力(最低EC50)的这些链的排列组合为HBLB、HBLF、HCLB、HCLF、HDLB、HDLF、HELE及HELF。在这些排列组合当中，HBLB(又称为hLIV14)是优选的，因为其具有最强的结合力(比所述小鼠捐供体抗体强约2倍)及最少之回复突变(backmutations)(4个)。
本发明提供HBLB人源化抗体的变异体(variants)，其中该人源化重链成熟可变区显示与SEQIDNO:10至少90％、95％或99％一致性，且该人源化轻链成熟可变区显示与SEQIDNO:15至少90％、95％或99％序列一致性。优选地，在所述抗体中，HBLB中的一些或所有回复突变是被保留的。换言之，至少1、2或优选地所有3个重链位置H29、H30及H76分别由I、E及N占据。类似地，位置L36由Y占据。这样的人源化抗体的CDR区优选地与HBLB的CDR区实质上一致，这些区与小鼠供体抗体的对应区相同。所述CDR区可由任何常规的定义(例如柯西亚(Chothia))来定义，但优选由卡巴(Kabat)定义。在一个实施例中，该人源化抗体包含重链，该重链包含SEQIDNO:10的3个CDR及与SEQIDNO:10的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。在另一实施例中，所述人源化抗体包含轻链，该轻链包含SEQIDNO:15的3个CDR及与SEQIDNO:15的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。在另一实施例中，所述人源化抗体包含重链及轻链，所述重链包含SEQIDNO:10的3个CDR及与SEQIDNO:10的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架，且该轻链包含SEQIDNO:15的3个CDR及与SEQIDNO:15的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。
就与示范性HBLB人源化抗体显示任何差异的人源化抗体而言，该额外差异的一种可能性是在该可变区框架中的额外的回复突变。在其他示范性人源化重链或轻链成熟可变区中发生回复突变的任何或所有位置亦可发生回复突变(即1、2、3、4、5、6、7、8或所有9个在该重链中由F占据的H27、由N占据的H28、由I占据的H48、由K占据的H66、由A占据的H67、由A占据的H71、由N占据的H76、由N占据的H93、及由V占据的H94，及1、2、3、4或所有5个在该轻链中由L占据的L37、由K占据的L39、由K占据的L45、及由L占据的L46)。然而，这些额外的回复突变并不是优选的，因为它们通常不改善亲和性，且引入更多小鼠残基可能导致增加免疫原性的风险。
本发明提供人源化形式的小鼠BR2-22a抗体，其包括3个示范性人源化重链成熟可变区(HE、HF及HG)和2个示范性人源化轻链(LF及LG)，它们可经不同排列加以组合以产生适当的结合力(见图21)。在这些排列组合中，HGLG(又名hLIV22)是优选的，因为其是具有最佳结合特性的组合(实验误差内，该结合特性实质上与小鼠BR2-22a抗体相同)及最少的回复突变(7个)。
本发明提供HGLG人源化抗体的变异体(variants)，其中该人源化重链成熟可变区显示与SEQIDNO:53至少90％、95％、98％或99％一致性，且该人源化轻链成熟可变区显示与SEQIDNO:60至少90％、95％、98％或99％序列一致性。优选地，在所述抗体中，HGLG中的一些或所有回复突变被保留。换言之，至少1、2、3、4或优选地所有5个重链位置H27、H29、H30、H76及H94由L、I、E、N及V占据(此处及本说明书他处使用卡巴(Kabat)编号以描述成熟可变区重链及轻链可变区中的位置)。在这些回复突变中，H94对于保留结合亲和性的贡献最大，H76最少。类似地，位置L36及L46分别由Y及P优选地占据。这些人源化抗体的CDR区优选地与HGLG的CDR区实质上一致，这些区与小鼠供体抗体的相应区相同。所述CDR区可由任何常用定义(例如柯西亚(Chothia))来定义，但优选地由卡巴(Kabat)定义。在一实施例中，该人源化抗体包含重链，该重链包含SEQIDNO:53的3个CDR及与SEQIDNO:53的可变区框架具有至少95％一致性之可变区框架。在另一实施例中，该人源化抗体包含轻链，该轻链包含SEQIDNO:60的3个CDR及与SEQIDNO:60的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。在另一实施例中，该人源化抗体包含重链及轻链，该重链包含SEQIDNO:53的3个CDR及与SEQIDNO:53的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架，且该轻链包含SEQIDNO:60的3个CDR及与SEQIDNO:60的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。
就与示范性HGLG人源化抗体显示任何差异的人源化BR2-22a抗体而言，该额外差异的一种可能性是在该可变区框架中的额外的回复突变。在其他示范性人源化重链或轻链成熟可变区中发生回复突变的任何或所有位置亦可发生回复突变(即1、2、3、4、5、或所有6个在该重链中由N占据的H28、由I占据的H48、由K占据的H66、由A占据的H67、由A占据的H71、及由T占据的H93，及1或2个在该轻链中由L占据的L37、及由K占据的L45)。然而，这些额外的回复突变并不是优选的，因为它们通常不改善亲和性，且引入更多小鼠残基可能导致增加免疫原性的风险。
另一可能的变异体是以源自人CDR序列的对应残基取代小鼠抗体的CDR中的某些残基，通常源自用于设计该示范性人源化抗体的该人受体序列的CDR。在一些抗体中，只需所述CDR的一部分(也就是结合所需的CDR残基亚群(subset)，称为SDR)以维持人源化抗体的结合力。不与抗原接触且不位于SDR中的CDR残基可根据先前试验，由分子模型及/或经验或如Gonzalesetal.,Mol.Immunol.41:863(2004)中所述自位于柯西亚超变异环(Chothiahypervariableloops)(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)以外的KabatCDR的区域识别(例如在CDRH2中，残基H60至H65通常不被需要)。在所述人源化抗体的某些位置中，若一个或多个供体CDR残基缺失或整个供体CDR遗漏，则取代该位置的氨基酸可以为占据所述受体抗体序列中的对应位置(Kabat编号)的氨基酸。在CDRs中，用受体氨基酸来取代供体氨基酸的取代数目，反应了竞争平衡的考虑。所述取代可能有利于减少人源化抗体中的小鼠氨基酸的数量，因此减少可能的免疫原性。然而，取代也可造成亲和性的改变，因此优选地，亲和性的显著减少应当被避免。在其他变异体中，在人源化BR2-22a抗体的CDR中的一个或多个残基(否则该CDR将与该小鼠BR2-22a抗体的CDR相同)可由源自小鼠BR2-14a抗体的CDR中的对应残基取代(或反之亦然)。CDR内的取代位置及用于取代的氨基酸也可凭经验选择。
虽然并不是优选的，但其他氨基酸取代可发生于例如不与CDR接触的框架残基中或甚至在CDR内的一些潜在的CDR接触残基氨基酸中。关于经取代的HBLB氨基酸(人源化BR2-14a)或HGLG氨基酸(人源化BR2-22)，通常在变异体人源化序列中发生的取代是保守的。优选地，关于HBLB或HGLG的取代(不论是否为保守性)对该人源化单克隆抗体(mAb)的结合亲和性或效价(也就是其与人LIV-1结合及抑制癌细胞生长的能力)不具实质效应。
变异体通常与HBLB(hLIV14)或HGLG(hLIV22)的重链及轻链成熟可变区序列不同，变异体具有少量(例如在该轻链或重链成熟可变区或二者中通常不超过1、2、3、5或10个)取代、删除或插入。
C.选择恒定区
人源化抗体的重链及轻链可变区可与人恒定区的至少一部份连接。恒定区的选择部分取决于是否希望具备抗体依赖性细胞介导性细胞毒性、抗体依赖性细胞性吞噬作用及/或补体依赖性细胞毒性。举例来说，人同型(isotopes)IgG1及IgG3具有强烈的补体依赖性细胞毒性，人同型IgG2具有微弱的补体依赖性细胞毒性，人IgG4缺乏补体依赖性细胞毒性。相较于人IgG2及IgG4，人IgG1及IgG3诱导更强的细胞介导性的效应功能。轻链恒定区可为λ或κ。抗体可被表达为含有二条轻链及二条重链的四聚体、表达为分开的重链和轻链、表达为Fab、Fab'、F(ab')2和Fv、或表达为其中重链及轻链可变区结构域通过间隔区(spacer)连接的单链抗体
人恒定区显示在不同个体间的同种异型(allotypic)变异及同族同种异型(isoallotypic)变异，也就是不同个体的恒定区在一个或多个多态性位点具有差异。同族同种异型(Isoallotype)与同种异型(allotype)的不同之处在于，辨识一种同族同种异型(isoallotype)的血清与一种或多种其他同种型(isotype)的非多态性区域结合。
轻链及/或重链的氨基端或羧基端的一或多个氨基酸(如重链C端的赖氨酸)可能在所述分子的一部分或全部当中被遗失或衍生化。取代可发生于恒定区以减少或增加效应器功能，例如补体介导性细胞毒性或ADCC(见例如Winteretal.,USPatentNo.5,624,821；Tsoetal.,USPatentNo.5,834,597；及Lazaretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006)或延长在人体中的半衰期(见例如Hintonetal.,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。
示范性取代包括将天然氨基酸取代成半胱胺酸残基，这种取代可以引入于氨基酸位点234、235、237、239、267、298、299、326、330、或332，优选地，在人IgG1同种型中的S239C突变(US20100158909)。额外的半胱胺酸残基的存在允许链间二硫键形成。所述链间二硫键形成可造成空间位阻，从而减少所述Fc区-FcγR结合交互作用的亲和性。被导入或靠近IgG恒定区的Fc区中的半胱胺酸残基也可作为一个这样的位点，该位点与治疗剂共轭(即使用硫醇特定试剂来共轭细胞毒性药物，如药物的顺丁烯二酰亚胺衍生物)。治疗剂的存在可造成空间位阻，从而进一步减少所述Fc区-FcγR结合交互作用的亲和性。其他在234、235、236及/或237任一位置的取代减少对Fcγ受体的亲和性，特别是FcγRI受体(见例如US6,624,821、US5,624,821)。
抗体的活体内半衰期亦可影响其效应器功能。抗体的半衰期可被增加或减少以调整其治疗活性。FcRn是结构类似于MHC第一型抗原(MHCClassIantigen)的受体，该MHC第一型抗原与β2-微球蛋白非共价结合。FcRn调节IgG的分解代谢及其在组织间的转胞吞(transcytosis)作用(GhetieandWard,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739-766；GhetieandWard,2002,Immunol.Res.25:97-113)。IgG-FcRn交互作用发生在pH6.0(胞内囊泡的pH)但不发生于pH7.4(血液的pH)；此交互作用使得IgG能被反向循环(recycledback)到所述循环中(GhetieandWard,2000,Ann.Rev.Immunol.18:739-766；GhetieandWard,2002,Immunol.Res.25:97-113)。人IgG1中与FcRn结合有关的区域已被定位(Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。在人IgG1的位置Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434的丙氨酸取代增进了FcRn结合(Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。具有这些取代的IgG1分子具有较长的血清半衰期。因此，这些经修饰的IgG1分子可能可以发挥其效应器功能，因而相较于未经修饰的IgG1能在较长之时间发挥其治疗疗效。其他用于增加与FcRn结合的示范性取代包括：在位置250的Gln及/或在位置428的Leu。EU编号用于恒定区的所有位置。
与该保守性Asn297共价连接的寡糖跟IgG的Fc区与FcγR结合的能力有关(Lundetal.,1996,J.Immunol.157:4963-69；WrightandMorrison,1997,TrendsBiotechnol.15:26-31)。IgG上的这个糖型(glycoform)的工程化(Engineering)可显著提高IgG介导的ADCC。向这种糖型中添加平分型N-乙酰葡萄糖胺修饰(bisectingN-acetylglucosaminemodifications)(Umanaetal.,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Daviesetal.,2001,Biotech.Bioeng.74:288-94)，或从这种糖型中除去岩藻糖(fucose)是二种改善IgGFc与FcγR之间结合的IgGFc工程化实例，从而增进Ig介导的ADCC活性。
系统性取代以溶剂暴露的人IgG1Fc区的氨基酸产生了IgG变异体，该变异体具有改变了的FcγR结合亲和性(Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。当与母体IgG1比较时，这些涉及在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334、或Ser298/Glu333/Lys334取代成Ala的变异体的亚群显示了对FcγR的结合亲和性及ADCC活性增加(Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604；Okazakietal.,2004,J.Mol.Biol.336:1239-49)。
抗体的补体固定活性(C1q结合及CDC活性二者)可由Lys326及Glu333的取代而改善(Idusogieetal.,2001,J.Immunol.166:2571-2575)。在人IgG2主链上的相同取代可将与C1q结合不良且严重缺乏补体活化活性的抗体同种型转换成可与C1q结合且能介导CDC的抗体同种型(Idusogieetal.,2001,J.Immunol.166:2571-75)。一些其他方法亦可被用于改善抗体的补体固定活性。举例来说，将IgM的18-氨基酸羧基端尾片段植入(graft)IgG的羧基端大幅增强了其CDC活性。这种现象甚至可在IgG4中观察到，IgG4通常不具有可检测到的CDC活性(Smithetal.,1995,J.Immunol.154:2226-36)。同样地，以Cys取代位于靠近IgG1重链的羧基端的Ser444诱发了IgG1的尾对尾(tail-to-tail)二聚化，其CDC活性比单体IgG1增加200倍(Shopesetal.,1992,J.Immunol.148:2918-22)。此外，对C1q具有特异性的双特异性双价抗体建构体(abispecificdiabodyconstruct)也给予CDC活性(Kontermannetal.,1997,Nat.Biotech.15:629-31)。
补体活性可由以下突变减少，重链的氨基酸残基318、320及322中的至少一个突变成具有不同侧链的残基，如Ala。以其他烷基取代的非离子性残基(如Gly、Ile、Leu或Val)或芳香族非极性残基(如Phe、Tyr、Trp及Pro)取代所述三个残基中的任一个也可减少或阻断C1q结合。Ser、Thr、Cys及Met可被用于残基320及322(但非318)以减少或阻断C1q结合活性。以极性残基取代该318(Glu)残基可能调节但不会阻断C1q结合活性。以Ala取代残基297(Asn)导致去除促使细胞溶解的活性(removaloflyticactivity)，但仅轻微减少(大约减少三倍)对C1q的亲和性。此改变破坏该糖基化位点及补体活化所需的碳水化合物的存在。任何在此位点的其他取代亦破坏该糖基化位点。下列突变及其任何组合亦减少C1q结合：D270A、K322A、P329A或P311S(见WO06/036291)。
提及人恒定区，其包括具有任何天然同种异型(allotype)的恒定区，或具有占据天然同种异型的多态性位点的任何排列组合的残基的恒定区。同样地，相对于天然人恒定区，至多1、2、5或10个突变可存在，正如以上指出的可减少Fcgamma受体结合或增加与FcRN结合的类型。
D.重组抗体的表达
人源化抗体通常由重组体表达而制备。重组多核苷酸建构体通常包括与抗体链编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然关联的(naturally-associated)或异源性启动子区。较佳地，所述表达控制序列是能转化(transforming)或转染(transfecting)真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦该载体被纳入适当宿主之后，该宿主被维持在适合高度表达该核苷酸序列、适合收集及纯化该交叉反应性抗体的条件下。
哺乳动物细胞是用于表达核酸片段(该核酸片段编码免疫球蛋白或其片段)的较佳宿主。见Winnacker,FromGenestoClones,(VCHPublishers,NY,1987)。一些可分泌完整异源性蛋白质的适当的宿主细胞系已在本领域中被开发，其包括CHO细胞系(例如DG44)、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞及非抗体产生性骨髓瘤(包括Sp2/0及NS0)。优选地，该些细胞为非人细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子(Queenetal.,Immunol.Rev.89:49(1986))及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、聚腺苷酸化位点及转录终止子序列。优选的表达控制序列是源自内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒及类似物的启动子，见Coetal.,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦表达，抗体可根据本领域的标准程序被纯化，包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳及类似方法(一般见Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,NY,1982))。
IV.核酸
本发明另提供编码上述人源化重链及轻链的任一者的核酸。通常，该核酸也编码与该成熟重链及轻链融合的信号肽。核酸上的编码序列可与调节序列可操作地连接以确保该编码序列的表达，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号及该类似序列。编码重链及轻链的核酸可以分离的形式存在，也可以被克隆进一个或多个载体。所述核酸可由例如固相合成或重叠寡核苷酸的PCR加以合成。编码重链及轻链的核酸可在例如一个表达载体内被接合成一个连续核酸，或可被各自分开克隆进自己的表达载体。
V.抗体药物共轭物
抗LIV-1抗体可与细胞毒性剂部分或细胞抑制剂部分(cytotoxicorcytostaticmoieties)(包括它们的医药上可相容的盐)共轭以形成抗体药物共轭物(ADC)。特别适合用于与抗体共轭的部分(moieties)是细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、前药转换酶(prodrugconvertingenzymes)、放射性同位素、放射性化合物、或毒素(这些部分(moieties)被统称为治疗剂)。举例来说，抗LIV-1抗体可与细胞毒性剂诸如化学治疗剂或毒素共轭(例如细胞抑制剂或杀细胞剂诸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素)。
抗LIV-1抗体可与前药转换酶共轭。该前药转换酶可利用已知方法与抗体重组融合或与其化学共轭。示范性的前药转换酶是羧肽酶G2、β-葡萄糖苷酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡萄糖苷酶、硝基还原酶及羧肽酶A。
用于将治疗剂共轭到蛋白(特别是抗体)的技术是已知的。(见例如Arnonetal.,“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy,”inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy(Reisfeldetal.eds.,AlanR.Liss,Inc.,1985)；Hellstrometal.,“AntibodiesForDrugDelivery,”inControlledDrugDelivery(Robinsonetal.eds.,MarcelDekker,Inc.,2nded.1987)；Thorpe,“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview,”inMonoclonalAntibodies‘84:BiologicalAndClinicalApplications(Pincheraetal.eds.,1985)；“Analysis,Results,andFutureProspectiveoftheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy,”inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy(Baldwinetal.eds.,AcademicPress,1985)；andThorpeetal.,1982,Immunol.Rev.62:119-58.也见例如,PCTpublicationWO89/12624.)。
所述治疗剂可以以减少其活性的方式共轭，除非其自所述抗体被切割(例如通过水解、抗体降解或切割剂)。所述治疗剂系通过可切割的连接器(cleavablelinker)与所述抗体连接，该可切割的连接器在表达LIV-1的癌细胞的胞内环境中对切割(cleavage)具有敏感性，但在胞外环境则实质上不具敏感性，因此该共轭物会在表达LIV-1的癌细胞将其内化后(例如在核内体(endosomal)中或(举例来说由于pH敏感性或蛋白酶敏感性)在溶酶体环境或在胞膜窖(caveolear)环境中)从该抗体上被切割。
通常，该ADC包含介于所述治疗剂与所述抗LIV-1抗体之间的连接器区域(linkerregion)。如上所述，一般来说，该连接器可在胞内环境中被切割，从而在胞内环境中(例如在溶酶体或核内体或胞膜窖之内)，所述连接器的切割将所述治疗剂从所述抗体中释放出来。所述连接器可为，例如肽基连接器(peptidyllinker)，其由胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体的或核内体的蛋白酶)切割。通常，该肽基连接器为至少二个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶D及纤维蛋白溶酶(见例如DubowchikandWalker,1999,Pharm.Therapeutics83:67-123)。最典型的是可被存在于表达LIV-1细胞中的酶所切割的肽基连接器。举例来说，可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B(其高度表达于癌组织中)切割的肽基连接器可被使用(例如包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽的连接器)。其他这样的连接器描述于例如美国专利第6,214,345号。在特定实施例中，所述可被胞内蛋白酶切割的肽基连接器包含Val-Cit连接器或Phe-Lys二肽(见例如美国专利第6,214,345号，其描述用所述Val-Cit连接器来合成多柔比星(doxorubicin))。利用胞内蛋白水解释放治疗剂的一项优点在于所述药剂在共轭时通常被减弱，且该共轭物的血清稳定性通常很高。
所述可切割的连接其可为pH敏感，即在特定pH值下对水解敏感。通常，该pH敏感性连接器可在酸性条件下被水解。举例来说，可以使用酸不稳定的连接器(acid-labilelinkert)(例如腙、半卡巴腙、硫半卡巴腙、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮或该类似物)，其在溶酶体中被水解。(见例如美国专利第5,122,368、5,824,805、5,622,929号、DubowchikandWalker,1999,Pharm.Therapeutics83:67-123、Nevilleetal.,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。)，这样的连接器在中性pH条件下(诸如在血液中)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0下(约为溶酶体的pH)不稳定。在某些实施例中，所述可水解的连接器是硫醚连接器(thioetherlinker)(见例如，通过酰腙键与治疗剂连接的硫醚(见例如美国专利第5,622,929号))。
其他连接器可在还原条件下被切割(例如双硫连接器disulfidelinker)。双硫连接器包括那些可利用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)、SPDB和SMPT形成者。(见例如Thorpeetal.,1987,CancerRes.47:5924-5931；Wawrzynczaketal.,InImmunoconjugates:AntibodyConjugatesinRadioimageryandTherapyofCancer(C.W.Vogeled.,OxfordU.Press,1987。亦见美国专利第4,880,935号。)
该连接器亦可为丙二酸酯连接器(malonatelinker)(Johnsonetal.,1995,AnticancerRes.15:1387-93)、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基连接器(maleimidobenzoyllinker)(Lauetal.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)、或3’-N-酰胺类似物(Lauetal.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
该连接器也可为不可切割的连接器，如与治疗剂(例如药物)直接连接的顺丁烯二酰亚胺基-亚烃基-或顺丁烯二酰亚胺-芳基连接器。活性药物-连接器由抗体的降解而释放。
通常，对胞外环境实质上不敏感的连接器意味着：当ADC存在于胞外环境(例如血浆)中时，在该ADC样本中不超过约20％、通常不超过约15％、更常不超过约10％、甚至更常不超过约5％、不超过约3％、或不超过约1％的连接器被切割。可测定该连接器是否对胞外环境实质上不敏感，例如使(a)所述ADC(“ADC样本”)及(b)等摩尔量的未共轭抗体或治疗剂(“对照样本”)与血浆独立培养一段预定的时间(例如2、4、8、16或24小时)，接着以例如高效液相色谱法测量，并比较存在于该ADC样本中与存在于对照样本中的未经共轭的抗体或治疗剂的量。
所述连接器亦可促进细胞内化(cellularinternalization)。当与治疗剂共轭时，所述连接器可促进细胞内化(即在此处所述的ADC或ADC衍生物的连接器-治疗剂部分(linker-therapeuticagentmoietyoftheADCorADCderivative)的环境中)。或者，当与治疗剂及抗LIV-1抗体二者共轭时，所述连接器可促进细胞内化(即在此处所述的ADC的环境中)。
可被用于本组合物的各种连接器被描述于WO2004-010957，且具有下式
其中：
-A-为延伸单位(stretcherunit)；
a为0或1；
各-W-独立地为氨基酸单位；
w独立地为介于0至12之间的整数；
-Y-为间隔区单位(spacerunit)；且
y为0、1或2。
代表性的延伸单位被描述于式(Ia)及式(Ib；见下)中的方形括号内，其中A-、-W-、-Y-、-D、w及y如上定义，且R1选自-C1-C10亚烃基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烃基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烃基-、-C1-C10亚烃基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烃基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烃基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烃基-、-(CH2CH2O)r-、和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r是介于1至10之间的整数。Ab为抗体。
药物装载由p表示，即每个抗体的药物-连接器分子数。根据上下文，p可代表每个抗体的药物-连接器分子的平均数，亦称为平均药物装载。P介于1至20之间，且优选介于1至8之间。在一些优选的实施例中，当p代表平均药物装载时，p介于约2至约5之间。在一些实施例中，p为约2、约3、约4、或约5。在制剂中的每个抗体的药物的平均数可由常用的装置如质谱仪、ELISA试验及HPLC测定。氨基酸单位(-W-)(若存在时)，在间隔区单位存在的情况下，其连接所述延伸单位至间隔区单位；在间隔区单位不存在的情况下，其连接所述延伸单位至细胞毒性剂或细胞静止剂(药物单位；D)。
若存在的话，-Ww-优选是双肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单位。
所述间隔区单位(-Y-)，当存在时，将氨基酸单位连接到所述药物单位。间隔区单位通常呈现二种类型：自毁型(self-immolative)及非自毁型(nonself-immolative)。非自毁型间隔区单位指：当酶从所述抗LIV-1抗体-连接器-药物共轭物或所述药物-连接器化合物切割氨基酸单位后，所述间隔区单位的部分或全部仍与所述药物单位维持连接。非自毁型间隔区单位的实例包括(甘氨酸-甘氨酸)间隔区单位及甘胺酸间隔区单位。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔区单位或甘氨酸间隔区单位的抗LIV-1抗体-连接器-药物共轭物由肿瘤细胞相关性蛋白酶、癌细胞相关性蛋白酶或淋巴细胞相关性蛋白酶进行酶切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物部分或甘氨酸-药物部分自Ab-Aa-Ww-切割。为了释放该药物，应在靶细胞内发生独立的水解反应以切割所述甘氨酸-药物单位键。
另外，含有自毁型间隔区单位的抗LIV-1抗体药物共轭物不需单独的水解步骤即可释放所述药物(D)。在该些实施例中，-Y-为p-胺基苯甲基醇(PAB)单位，其通过该PAB基团的氮原子与-Ww-连接，并通过碳酸盐、氨基甲酸酯或醚基团与-D直接连接。其他自毁型间隔子的例子包括带电性相当于PAB基团的芳香族化合物诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(2-aminoimidazol-5-methanolderivatives)(例如见Hayetal.,1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)及邻或对-氨基苯甲基缩醛(orthoorpara-aminobenzylacetals)。当酰胺键水解时快速环化的间隔区(spacers)可被使用，例如经取代及未经取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodriguesetal.,1995,ChemistryBiology2:223)、经适当取代的双环[2.2.1]及双环[2.2.2]环系统(Stormetal.,1972,J.Amer.Chem.Soc.94:5815)及2-氨基苯基丙酸酰胺(2-aminophenylpropionicacidamides)(Amsberryetal.,1990,J.Org.Chem.55:5867)。消除在甘氨酸的α-位上经取代的含胺药物(Kingsbury,etal.,1984,J.Med.Chem.27:1447)也为可被应用于抗LIV-1抗体-连接器-药物共轭物的自毁型间隔区策略的实施例。或者，所述间隔区单位是分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单位，其可被用于纳结合额外的药物。
可用于与抗LIV-1抗体共轭的细胞毒性剂类型包括，例如，抗微管蛋白剂、DNA小沟区结合剂(DNAminorgroovebindingagents)、DNA复制抑制剂、化学治疗致敏剂或其类似物。其他细胞毒性剂的示范性类别包括：蒽环类、auristatins、喜树碱、双联霉素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、美登木素生物碱(maytansinoid)及长春花生物碱。一些示范性细胞毒性剂包括auristatins(例如auristatinsE、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟区结合剂(例如烯二炔及莱克西托素(lexitropsin))、双联霉素(duocarmycin)、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(docetaxel))、长春花生物碱、多柔比星(doxorubicin)、吗啉基-多柔比星及氰基吗啉基-多柔比星。
所述细胞毒性剂可为化学治疗剂，如举例来说多柔比星(doxorubicin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、美法仑(melphalan)、长春花生物碱、甲氨喋呤(methotrexate)、丝裂霉素C或依扥泊苷(etoposide)。所述细胞毒性剂也可为CC-1065类似物、卡利奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、尾海兔素10(dolastatin10)的类似物、利索新(rhizoxin)或沙海葵毒素(palytoxin)。
所述细胞毒性剂也可为auristatin。该auristatin可为auristatinE衍生物，例如在auristatinE和酮酸(ketoacid)之间形成的酯。举例来说，ketoacidE可与对乙酰基苯甲酸(paraacetylbenzoicacid)或苯甲酰戊酸(benzoylvalericacid)反应以分别产生AEB及AEVB。其他典型auristatin包括AFP、MMAF及MMAE。各种auristatin的合成及结构描述于例如US2005-0238649及US2006-0074008。
所述细胞毒性剂可为DNA小沟区结合剂(DNAminorgroovebindingagents)。(见例如美国专利第6,130,237号。)举例来说，该DNA小沟区结合剂可为CBI化合物或烯二炔(例如卡利奇霉素(calicheamicin))。
所述细胞毒性剂或细胞抑制剂可为抗微管蛋白剂(anti-tubulinagent)。抗微管蛋白剂的实例包括紫杉烷类(例如(太平洋紫杉醇(paclitaxel))、(多西紫杉醇(docetaxel))、T67(Tularik公司)、长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、及长春瑞滨(vinorelbine))、及auristatins(例如auristatinsE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。(示范性auristatins亦以下式III至XIII显示)。其他适当的抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素(baccatin)衍生物、紫杉烷类似物(例如埃博霉素(epothilone)A及B)、噻氨酯哒唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicine)及秋水仙酰胺(colcimid)、雌二醇氮芥(estramustine)、念珠藻素(cryptophysin)、西马多丁(cemadotin)、美登素类(maytansinoid)、考布他丁(combretastatin)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、及艾榴塞洛素(eleutherobin)。
所述细胞毒性剂可为另一类抗微管蛋白剂美登素类(maytansinoid)。举例来说，所述美登素类可为美登素(maytansine)或含连药物接器的美登素，所述连接器诸如DM-1或DM-4(免疫基因(ImmunoGen)公司；也见Charietal.,1992,CancerRes.52:127-131)。
示范性的抗体药物共轭物包括如下描述的vcMMAE及mcMMAF抗体药物共轭物，其中p及Ab如此处前述：
或它们医药上可接受的盐。
VI.其他抗LIV-1抗体
除了上述人源化形式的BR2-14a及BR2-22a抗体之外，其他与LIV-1的胞外域结合的抗体可被用于本发明的一些方法，特别是三阴性乳癌(triplenegativebreastcancers)的治疗。一些抗LIV-1的小鼠抗体描述于US20080175839。这些抗体包括1.1F10、1.7A4、BR2-10b、BR2-11a、BR2-13a、BR2-14a、BR2-15a、BR2-16a、BR2-17a、BR2-18a、BR2-19a、BR2-20a、BR2-21a、BR2-22a、BR2-23a、BR2-24a、及BR2-25a，除之BR2-14a及BR2-22a外，其中由杂交瘤ATCC编号PTA-5706所产生的BR2-19a或由杂交瘤ATCC编号PTA-5707所产生的BR2-23a是优选的。这些抗体的人源化的、嵌合的(chimeric)或饰面的(veneered)形式可由下述常用方法制备。
其他抗LIV-1抗体可用LIV-1或其一个或多个胞外域免疫加以从头制备。其他非人单克隆抗体的制备，如小鼠、天竺鼠(guineapig)、灵长动物、兔或大鼠，(所述抗体是抗免疫原的)，可由Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(CSHPNY,1988)描述的方法加以实施(以参照方式纳入以符合所有目的)。所述免疫原(immunogen)可自天然来源获得、由肽合成或由重组表达。
非人抗体的人源化、嵌合或饰面形式可被制备。用于制备人源化抗体的一般方法被描述于Queen,US5,530,101及5,585,089、Winter,US5,225,539、Carter,US6,407,213、Adair,US5,859,205、及Foote,US6,881,557。嵌合抗体是这样的抗体，其中非人抗体(例如小鼠)的轻链及重链的成熟可变区与人轻链及重链恒定区组合(combined)。该抗体实质上或完全保留该小鼠抗体的结合特异性，且具有大约三分之二的人序列。饰面抗体(veneeredantibody)是一种人源化抗体的类型，其保留非人抗体的一些及通常所有的CDR及一些非人可变区框架残基，但用源自人抗体序列对应位置的残基来取代其他可能贡献B-或T-细胞表位(例如暴露的残基)的可变区框架残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果是这样一种抗体，其CDR完全或实质上源自非人抗体，而该非人抗体的可变区框架由于所述取代而更似人。
抗LIV-1的人抗体(Humanantibodies)可由下述各种技术提供。用于制备人抗体的方法包括三源杂交瘤方法(Oestbergetal.,Hybridoma2:361-367(1983)、Oestberg之美国专利第4,634,664号、及Engleman等人之美国专利第4,634,666号)、使用转基因小鼠(该小鼠含有人免疫球蛋白基因)(见例如Lonbergetal.,WO93/12227(1993)；US5,877,397,US5,874,299,US5,814,318,US5,789,650,US5,770,429,US5,661,016,US5,633,425,US5,625,126,US5,569,825,US5,545,806,Nature148,1547-1553(1994),NatureBiotechnology14,826(1996),Kucherlapati,WO91/10741(1991))及噬菌体展示方法(见例如Doweretal.,WO91/17271及McCaffertyetal.,WO92/01047,US5,877,218,US5,871,907,US5,858,657,US5,837,242,US5,733,743及US5,565,332)。
任一抗体可由竞争性结合试验或其他方式选择以具有和示范抗体(如BR2-14a)相同或重叠的抗原表位特异性。
VII.治疗应用
本发明的人源化抗体(单独或作为LIV-1抗体药物共轭物)可被用于治疗癌症。一些癌症显示可检测的量的LIV-1，其以蛋白质(例如使用示范性抗体之一的免疫试验)或mRNA的量被测量。相比于该相同类型的非癌组织(优选地源自相同患者)，一些癌症显示增加量的LIV-1。应接受治疗的癌细胞其示范性LIV-1的量为每细胞5000至150000LIV-1分子，尽管更高或更低量也可被治疗。可任意选择地，癌症中的LIV-1的量在实施治疗前被测量。
与LIV-1表达有关且应接受治疗的癌症实例包括乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌、胃癌、肾癌、鳞状细胞癌(例如膀胱、头、颈及肺)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、小细胞肺癌(smalllungcellcarcinoma)或肺类癌(lungcarcinoid)。该治疗可应用于具有这些种类的原发性或转移性肿瘤的病患。该治疗也可被应用于对常规治疗(例如荷尔蒙、它莫西芬(tamoxifen)、贺癌平)反应不佳的病患，或对该治疗出现反应后又复发的病患。所述方法也可被用于三阴性乳癌。三阴性乳癌是一种癌术语，指当以任何下列受体的抗体染色时，其缺乏可检测到的雌激素受体及黄体酮受体，并缺乏过度表达的HER2/neu，如实施例中所述。染色可相对于不相关的对照抗体实施，缺乏表达(lackofexpression)是由以下现象显示，即自背景染色水平中显示与对照染色水平相同或类似(在实验误差内)。同样地，缺乏过度表达(lackofoverexpression)是由以下现象显示，即染色水平(在实验误差内)和非癌性乳房组织(优选源自相同病患)显示相同或类似。另外或额外地，三阴性乳癌的特征是：对与这些受体交互反应的荷尔蒙无反应性、侵略性行为及独特的转移模式。hLIV14抗体可被用于治疗表达LIV-1的癌症。在一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性乳癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性前列腺癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性黑色素瘤的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性卵巢癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性子宫内膜癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性子宫颈癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性肝癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性胃癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性肾癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性鳞状细胞癌(例如膀胱癌、头癌、颈癌及肺癌)的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性乳癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性皮肤癌的个体。在另一实施例中，hLIV14抗体被用于治疗LIV-1表达性小细胞肺癌或肺类癌的个体。hLIV22抗体可被用于治疗表达LIV-1的癌症。在一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性乳癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性前列腺癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性黑色素瘤的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性卵巢癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性子宫内膜癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性子宫颈癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性肝癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性胃癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性肾癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性鳞状细胞癌(例如膀胱癌、头癌、颈癌及肺癌)的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性鳞状细胞癌(例如膀胱癌、头癌、颈癌及肺癌)的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性乳癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性皮肤癌的个体。在另一实施例中，hLIV22抗体被用于治疗LIV-1表达性小细胞肺癌或肺类癌的个体。本申请首次揭示LIV-1蛋白表达于黑色素瘤细胞的表面。因此，与LIV-1结合的抗体可被用于治疗这样的病患，其遭受表达LIV-1的黑色素瘤。所述抗体包括此处公开的抗体，例如hLIV14及hLIV22，但不限于此处所公开的抗体。
单独或呈共轭物形式的人源化抗体以有效方案给药(dministeredinaneffectiveregime)，此表示推迟癌症的发生、减少癌症的严重性、抑制癌症的进一步恶化、及/或改善癌的至少一种征候或症状(signorsymptom)的剂量、给药途径及给药频率。若病患已经遭受癌症，该方案可指治疗性有效方案。若该病患相比于一般大众具有较高的幻癌症风险但尚未出现症状，则该方案可指预防性有效方案。在一些实例中，治疗性或预防性的疗效可相比历史对照或过去经验(相同患者)而被观察。在其他实例中，治疗性或预防性的疗效可对经受治疗的患者在临床前或临床试验中证明(相比于未经治疗的对照群体)。
单克隆抗体的示范性剂量为0.1mg/kg至50mg.kg(每公斤病患体重)、更典型为1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg、或3mg/kg至10mg/kg。单克隆抗体或抗体药物共轭物的示范性剂量为1mg/kg至7.5mg/kg,或2mg/kg至7.5mg/kg或3mg/kg至7.5mg/kg(每公斤个体体重)，或0.1-20,或0.5-5mg/kg(每公斤体重)(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)、或10至1500或200至1500mg的固定剂量。在一些方法中，所述病患被给药至少1.5mg/kg、至少2mg/kg或至少3mg/kg的剂量，每三周或等多给药一次。该剂量取决于给药频率、病患状态、对先前治疗的反应(若有的话)、是预防性的还是治疗性的治疗、是急性的还是慢性的疾病等其他因素。
给药可为非经肠、经静脉、经口、皮下、动脉内、颅内、脊椎鞘内(intrathecal)、腹膜内、外用(topical)、鼻内或肌肉内。给药也可被直接集中至肿瘤内。由静脉内或皮下给药至系统性循环内是优选的。静脉内给药可由例如在30至90分钟期间输注或由单次快速浓注(singlebolusinjection)。
给药频率取决于所述抗体或共轭物在循环中之半衰期、病患的状况及给药途径等其他因素。该频率可为每天、每周、每月、每季或根据患者状况的改变或被治疗的癌症的进展而在不规则的间隔给药。示范性静脉给药的频率是在一个连续治疗疗程中介于每周二次至每季一次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。其他示范性静脉给药的频率是在一个连续治疗疗程中介于每周一次至每四周三次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。以皮下给药而言，示范性给药频率是每天至每月一次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。
给药的剂量数(numberofdosagesadministered)取决于所述癌症的特性(例如是否出现急性或慢性症状)及对于治疗的失调反应。以急性疾病或慢性疾病的急性发作而言，介于1至10个剂量通常足够。有时单次快速浓注(可任意选择地，以分开的形式)足以用于急性疾病或慢性疾病的急性发作。治疗可重复用于急性疾病或急性发作的复发。以慢性疾病而言，抗体可以规律的间隔给药，例如每周、隔周、每月、每季、每六个月一次至少1、5或10年或患者终生。
用于非经肠给药的药物组合物优选地无菌、实质上等渗性，且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂量形式提供(即用于单次给药的剂量)。药物组合物可利用一或多种生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂被配方(beformulated)。所述剂型(formulation)取决于所选择的给药途径。以注射而言，抗体可被配方于水性溶液，优选地，生理上可相容的缓冲液，如汉氏(Hanks’s)溶液、林格氏(Ringer’s)液或生理盐水或醋酸缓冲液(以减少注射部位的不适)。所述溶液可包含配方剂(formulatoryagents)诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。选择性地，抗体可呈冻干形式，以供其使用前与适当载体例如无菌的无热原水(sterilepyrogen-freewater)构造。抗体于液体剂型中的浓度可为例如1至100mg/ml，如10mg/ml。
本发明的抗体治疗可与化学疗法、放射线、干细胞治疗、手术及其他能有效对抗该被治疗疾病的治疗组合使用。其他可与抗LIV-1人源化抗体一起被给药的药剂的有用类别包括：例如与癌性细胞上表达的其他受体结合的抗体、抗微管蛋白剂(例如auristatins)、DNA小沟区结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如铂复合物，如顺铂(cisplatin)、单(铂)、二(铂)及三核铂复合物(tri-nuclearplatinumcomplexes)及卡铂(carboplatin))、蒽环类(anthracycline)、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法致敏剂、双联霉素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、离子载体、莱克西托素(lexitropsin)、亚硝基尿素、普拉汀诺(platinol)、预先形成化合物(pre-formingcompounds)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、放射致敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱及类似物。
使用所述人源化抗LIV-1抗体来治疗(任选地，与上述其他药剂或方案的任何一种单独组合或作为抗体药物共轭物)，相比较于给予相同治疗(例如化学治疗)却不单独给予抗LIV-1抗体或其共轭物，可增加肿瘤(例如乳癌、前列腺癌、黑色素瘤)患者特别是复发或顽固性患者的中位无进展存活期(medianprogression-freesurvivaltine)或整体存活期(overallsurvivaltime)至少30％或40％，但优选地50％、60％至70％或甚至100％或更久。此外或选择性地，使用包括以单独或作为共轭物形式的抗LIV-1抗体来治疗(例如标准化学治疗)，相比较于不包括该抗LIV-1抗体的相同治疗(例如化学治疗)，可增加至少30％或40％但优选地50％、60％至70％或甚至100％的肿瘤患者的完全反应率、部分反应率、或客观反应率(完全+部分)。
通常，在临床试验中(例如第II、II/III或III期试验)，前述使用标准治疗加上人源化抗LIV-1抗体治疗的病患的中位无进展存活期和/或反应率的增加，相比较于单独接受标准治疗的对照组患者(或加上安慰剂)，在统计上是显著的，例如p＝0.05或0.01或甚至0.001。完全及部分反应率由惯用于癌症临床试验中的客观标准决定，例如由美国国家癌症研究所和/或食品药物管理局列示或接受的标准。
VIII.其他应用
所述抗LIV-1人源化抗体可在临床诊断、临床治疗或研究中被用于检测LIV-1。在癌症中LIV-1的表达显示该癌症可由本发明的抗体来治疗。所述抗体亦可被出售作为实验室研究的研究试剂以检测带有LIV-1的细胞及其对各种刺激的反应。在所述用途中，单克隆抗体可以被荧光分子、自旋标记分子(spin-labeledmolecules)、酶或放射性同位素标记，且可以试剂盒的形式提供(其还含有其他执行LIV-1分析所需的所有必要试剂)此处所描述的抗体，BR2-14a、BR2-22a及它们的人源化形式(例如hLIV14及hLIV22)可被用于检测LIV-1蛋白质的表达及决定癌症是否可利用LIV-1抗体药物共轭物(LIV-1ADCs)治疗。举例来说，BR2-14a、BR2-22a及它们的人源化形式(例如hLIV14及hLIV22)可被用于检测LIV-1在乳癌细胞、黑色素瘤细胞、子宫颈癌细胞或前列腺癌细胞上的表达。该抗体也可被用于纯化LIV-1，例如在亲和性层析中。
IX.食蟹猴(cynomolgusmonkey)LIV-1
本发明另提供源自食蟹猴的含有信号肽或不含信号肽的LIV-1氨基酸序列(CYLIV-1)为SEQIDNO:85，该信号肽占据SEQIDNO:85的大约1-28残基，以及编码该氨基酸序列的核酸。本发明还包括至多1、2、3、4或5个取代、删除或插入差异的变异体，惟其CY变异体不包括天然人LIV-1序列。与人LIV-1类似的是，所指的CY-LIV-1是指该蛋白的至少一个胞外结构域，且通常指不含可切割信号肽(氨基酸1-28)的完整蛋白。本发明另提供与SEQIDNO:85特异性结合的抗体，不论是否与人LIV-1特异性结合(即与人LIV-1以阴性对照不相关抗体的程度结合)。本发明另提供与CY-LIV-1优先结合而不与人LIV-1优先结合之的体及反之亦然的抗体。优先结合是指高于实验误差的、且优选至少高出2、3或4倍的结合(association)。本发明另提供一种抗体，其在实验误差范围内，显示与下述任一示范性抗体相同的对人和CYLIV-1的结合特性。本发明另提供分析抗体与CYLIV-1的结合性的方法。所述方法涉及将抗体与CYLIV-1接触，测定该抗体是否与CYLIV-1特异性结合，并可任意选择地，测定结合强度，如结合常数。
所有以上和以下引用的专利申请、网站、其出版物、注册号等以全文引用的方式并入，其引用程度就如同将每一项特定且个别地以全文引用的方式并入。如果不同版本的序列在不同时期结合了不同注册号，则所述版本及其注册号以本申请的有效申请日为准。如果适用，关于所述的注册号，有效申请日意味着比实际申请日更早或优先申请的申请日。同样，如果不同版本的公开文本、网站等公开于不同时间，则以最接近本申请有效申请时间的版本为准，除非另有说明。本发明的任何功能，步骤，元件，实施例可以结合任何其他使用，除非另有说明。虽然本发明已经通过图示和实施例描述了本发明的一些细节，以便于清楚和理解，很明显某些实施某些变化和修改也是在权利要求保护范围之内的。
实施例
I.BR2-14a的人源化
材料
下列实施例中描述的细胞系维持于培养状态(maintainedinculture)，根据美国菌种保存中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)、美国国家癌症研究所(NCI)或德国布朗斯威克德国微生物菌种保藏中心(DMSZ)所指明的条件。细胞培养试剂源自Invitrogen公司(加州卡斯巴德市)或其他供应商。
方法
饱和结合试验
将1×105抗原表达细胞(表达人LIV-1的MCF7细胞(ATCC)、或表达人LIV-1的转染的CHO细胞系、或表达食蟹猴LIV-1的转染的CHO细胞系)等分置于96孔v底孔盘的每孔中。经AlexaFluor-647标记的鼠(murine)LIV-1单克隆抗体(例如BR2-14a)以0.66pM-690nM的浓度添加，于冰上培养30分钟。细胞经离心形成团块，以PBS/BSA清洗三次。该细胞接着再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定结合百分比，接着计算表观Kd。
竞争结合试验
将PBS/BSA中的1×105个表达重组人LIV-1的CHO细胞等分置于冰上的96孔v底孔盘的每孔中。该些细胞与5nM经AlexaFluor-647(AF)标记的小鼠(murine)LIV-1母体单克隆抗体及渐增浓度(从0.038nM至600nM)的未经标记的人源化LIV-1单克隆抗体(人源化轻链LA-LF与人源化重链HA-HE的组合)培养1小时。细胞经离心形成团块，以PBS/BSA清洗三次。该细胞再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定被结合的带标记小鼠LIV-1单克隆抗体百分比，接着将该数据带入不同斜率的S形剂量反应曲线(sigmoidaldose-responsecurve)以推断出EC50。
将PBS/BSA中的1×105个表达LIV-1的MCF7细胞等分置于冰上的96孔v底孔盘的每孔中。该些细胞与5nM经AlexaFluor-647标记的小鼠LIV-1单克隆抗体及渐增浓度(从0.038nM至600nM)的未经标记的人源化LIV-1单克隆抗体(人源化轻链LA至LF与人源化重链HA至HE的组合)培养1小时。细胞经离心形成团块，以PBS清洗三次。该细胞再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定被结合的带标记小鼠LIV-1单克隆抗体百分比，接着将该数据带入不同斜率的S形剂量反应曲线(sigmoidaldose-responsecurve)以推断出EC50。
将PBS中的1×105个表达重组食蟹猴LIV-1(cynoLIV-1)的CHO细胞等分置于冰上的96孔v底孔盘的每孔中。该些细胞与5nM经AlexaFluor-647标记的小鼠LIV-1单克隆抗体及渐增浓度(从0.038nM至600nM)的未经标记的人源化LIV-1单克隆抗体(人源化轻链LA至LF与人源化重链HA至HE的组合)培养1小时。细胞经离心形成团块，以PBS清洗三次。该细胞再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定被结合的带标记小鼠LIV-1单克隆抗体百分比，接着将该数据带入不同斜率的S形剂量反应曲线(sigmoidaldose-responsecurve)以推断出EC50。
定量流式细胞分析
定量测定LIV-1在细胞表面上的表达数，使用小鼠LIV-1单克隆抗体作为一级抗体(primaryantibody)，根据厂商(DAKOA/S,Glostrup,Denmark)说明进行DAKOQiFiKit流式细胞间接试验，并利用BectonDickinson公司的流式细胞仪评估。
细胞毒性试验
使肿瘤细胞与LIV-1抗体药物共轭物于37℃中一起培养96至144小时。非结合性(H00)ADC被用来作为阴性对照。细胞存活性(cellviability)由终浓度为50μM的刃天青(西格玛(Sigma)公司)测量。细胞系于37℃环境中培养4至6小时。荧光信号由FusionHT荧光孔盘读取仪(珀金埃尔默(PerkinElmer)公司，麻州瓦尔珊(Waltham,MA))上测量。结果以IC50报告，即相比于经载体处理的细胞(对照＝100％)要产生存活性减少50％所需的化合物的浓度。
制备抗体药物共轭物
LIV-1抗体的抗体药物共轭物的制备如US20050238649中所述。药物连接器vcMMAE(亦称为1006)和mcMMAF(称为1269)均于US20050238649中描述。IgG1抗体的半胱氨酸突变体的制备通常于US20100158919中描述。US20050238649及US20100158919以参照方式并入此处以符合所有目的。
制备非岩藻糖化的(non-fucosylated)抗LIV-1单克隆抗体
产生人源化IgG1抗LIV-1单克隆抗体HBLB单克隆抗体(hLIV-14)的CHODG44细胞系系以每毫升3.0×105细胞，培养于30mLCHO培养基中，培养条件：37℃、5％CO2、以100RPM转速振荡125mL的振荡培养瓶(shakeflask)。在培养基中补充胰岛素样生长因子(IGF)、青霉素、链霉素及65μM2-氟基岩藻糖全乙酸酯(2-fluorofucoseperacetate)(SGD-2084)(见US20090317869)。第3天在培养中加入2％体积的喂养培养基(feedmedia)。第4天，将该培养物分成1:4至新鲜培养基。在第5、7、9及10天，用6％体积的产制喂养培养基(productionfeedmedia)喂饲该培养物。在第13天，将所述培养基通过0.2μm过滤器以收集条件培养基(conditionedmedia)。抗体纯化的实施：将所述条件培养基施于蛋白A管柱(proteinAcolumn)，所述柱用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4预先平衡。
以20倍管柱体积的1XPBS清洗管柱后，用5倍管柱体积的ImmunopureIgG洗脱液(皮尔斯生技(PierceBiotechnology)公司，伊利诺伊州罗克福市(Rockford,IL))洗脱抗体。添加10％体积的1MTrispH8.0至洗脱组分。样本经隔夜透析至1xPBS中。
抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)
ADCC活性是利用标准51Cr释放试验测量。简言之，MCF-7标靶肿瘤细胞被100μCiNa51CrO4标记、清洗，并在添加效应器(自然杀手(NK))细胞之前与测试抗体预先培养。NK(CD16+CD56+)细胞是由非黏附性外围血液单核细胞(PBMC)制备，而所述PBMC得自正常FcγRIIIA158V/V供体(Lifeblood,Memphis,TN)，使用免疫磁珠(EasySep,StemCellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)加以制备。存活的NK细胞被加入靶细胞，其中，效应器与靶细胞的比例为10:1。人IgG1κ(Ancell,Bayport,MN)被用来作为此试验中的阴性对照。在培养4小时后，收集上清液并于Luma板上隔夜干燥。接着利用TopCount微量盘闪烁发光计数器(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts)检测溶解的(lysed)MCF-7细胞所发射的伽玛射线。ADCC活性以特异性溶胞％表示。
活体内(InVivo)活性试验
裸(nu/nu)小鼠(7至8只动物/组)被植入培养生长的肿瘤细胞：来自NCI的MCF-7(5×106细胞于25％基质胶)、来自ATCC的PC3(2.5×106细胞于25％基质胶)及来自DSMZ的PC3(5×105于25％基质胶)。为了使MCF-7细胞在活体内生长，母小鼠被补充雌激素(通过植入缓释型雌激素丸(释放90天))。当肿瘤生长至100mm3时，开始给药嵌合性或人源化LIV-1ADC或非结合性的对照ADC(3mg/kg)(q4dx4次腹膜内注射)。利用卡尺测量肿瘤体积，当肿瘤体积到达约800mm3时安乐死动物。持续作图以了解各组的中位数肿瘤体积，直到一或多只动物被安乐死。所有动物试验根据获得实验动物管理评鉴及认证协会认可的机构中的实验动物照顾及使用委员会所核准的程序实施。
LIV-1免疫组织化学(IHC)染色
方法
肿瘤微阵列(TMA)及个别肿瘤样本源于商业来源。源自福尔马林固定及石蜡包埋(FFPE)的正常或肿瘤组织的组织微阵列购自美国Biomax公司或Cybrdi公司。冷冻阵列(frozenarray)系购自BioChain公司。单一切片系购自NDRI公司、Asterand公司、TissueSolution公司或CHTN公司。一组25个转移性激素抵抗型前列腺癌(metastatichormonerefractoryprostatecancer)(对应骨及软组织转移部位)的石蜡包埋样本由华盛顿大学泌尿生殖系统癌症系的R.Vessella博士提供。所有样本于Bond-MaxTM自动染色机(徕卡(Leica)公司)上处理。
FFPE组织的IHC染色：
FFPE切片或横切在玻片上的TMA于72℃利用BondTMDewax溶液(Leica，产品编号AR9222)去石蜡化及复水化。抗原修复利用基于EDTA的BondTM抗原表位修复溶液2(Leica，产品编号AR9640)于95-100℃进行20分钟，之后与小鼠LIV-1一级单克隆抗体(1至2μg/ml，30-45分钟，25℃)一起培养。同种型匹配的小鼠IgG1(Sigma，产品编号M5284)被用来作为背景染色的阴性对照。对于自动化IHC染色，我们利用RefineDAB试剂盒或是基于碱性磷酸酶的检测试剂盒：BondTMPolymerAPRedDetection试剂盒(Leica，产品编号DS9305)。玻片与1μg/ml的抗小鼠LIV-1之小鼠单克隆一级抗体一起培养45分钟，且预先经30分钟的蛋白质封片(DAKO产品编号X0909)。在色原体发色之后，该切片用苏木精对比染色(counterstained)并盖上盖玻片。玻片由病理学家评估及计分，利用ZeissAxiovert200M显微镜(CarlZeiss,Inc.,Thornwood,NY)摄像。
冷冻组织的IHC：
5μm的冷冻/OCT样本切片以丙酮固定10分钟，风干30分钟，并于室温中以1xMorphosave预处理20分钟。该些切片被装上Bond-MaxTM自动染色机(Leica)，以一级抗体染色45分钟，且预先经30分钟的蛋白质封片(DAKO产品编号X0909)。小鼠IgG1(BDPharmingen，产品编号550878)被用来作为阴性对照。在检测方面，我们使用基于DAB的BondPolymerRefine试剂盒(Leica，产品编号DS9800)。在色原体发色之后，该切片用苏木精对比染色并盖上盖玻片。切片由病理学家评估及计分。
结果
1.小鼠抗体的结合
小鼠LIV-1单克隆抗体(BR2-14a抗体)(US2004141983)对人LIV-1的KD被测定，所述人LIV-1以内源性蛋白表达于人乳癌细胞系或以重组蛋白表达于CHO细胞系。小鼠LIV-1抗体BR2-14a对食蟹猴LIV-1(cynoLIV-1)的KD也被测定，所述食蟹猴LIV-1以重组蛋白表达于CHO细胞系。MCF7为人乳癌细胞系。239F为人胚胎肾细胞系。表1显示：所述抗体对人细胞系所表达的非重组LIV-1的解离常数(dissociationconstant)比重组LIV-1(不论为人(hLIV-1)或食蟹猴(cyLIV-1))的解离常数低约5倍。
表1
细胞系 抗原 Kd(nM)
MCF-7(ATCC) hLIV-1 2.4
293F(hLIV-1) hLIV-1 2.7
CHO(hLIV-1) hLIV-1 12.5
CHO(cyLIV-1) cLIV-1 14.0
2.设计及测试人源化抗体
此实施例中，用于人源化的起始点或供体抗体为小鼠抗体BR2-14a，其产自美国菌种保存中心(ATCC)寄存编号PTA-5705A的杂交瘤，并被描述于US2004141983。适当的人受体序列为：由VH1-02和JH5提供的重链的基因组序列及由VK2-30和Jk4提供的轻链的基因组序列。在可变区框架，所述人受体序列显示与所述供体序列具有68％和85％的一致性。所述人受体序列的轻链CDR与所述供体序列的CDR具有相同典型结构类型(samecanonicaltype)。相反地，所述人受体序列的重链CDR在其典型结构类型上不同(种系(germline)为1-3，小鼠供体为1-2)。
经比对(alignment)，在供体序列中识别出重链中的11个位置(H27、H28、H29、H30、H48、H66、H67、H71、H76、H93及H94)及轻链中的5个位置(L36、L37、L45、L46及L39)是所述人受体序列与所述供体序列之间的不同位点，这种差异可能因为直接与抗原接触、影响CDR构象或影响重链与轻链间的包装而改变抗体的结合。5个人源化重链及6个人源化轻链被制备，在这些位置的不同排列组合中纳入回复突变(图1(序列比对)及表2)。
表2.回复突变
人源化抗体接着被表达，以代表所述人源化重链及轻链的各种排列组合(30种可能性)。自CHO细胞所表达的重组人LIV-1的结合曲线显示于图2。EC50的结果总结于下表3。
表3源自BR2-14a的人源化LIV-1单克隆抗体对CHO细胞上所表达的人LIV-1的EC50
DNB表示“无结合”
这些数据显示这30个被测试的人源化抗体具有差异极大的EC50，其中HBLB及HELE的结合性优于次佳的人源化抗体HBLF至少2倍且高出其他人源化抗体更多倍。图2的结合曲线显示HBLB及HELE具有比原始小鼠抗体更强的结合。
所述HBLB抗体被选为最佳的人源化抗体，因为其具有(和HELE一样)最强的结合，但其回复突变比HELE还少，即HBLB有4个回复突变而HELE有12个。
该些与CHO细胞上表达的人LIV-1结合的人源化LIV-1单克隆抗体对MCF7细胞系上所表达的天然人LIV-1蛋白的EC50被测定(图3)。同样地，LIV-1单克隆抗体HBLB及HELE是具有最强结合的单克隆抗体。
HBLB对MCF7细胞系上的人LIV-1的Kd(从多个饱和结合曲线的平均值得出)为1.5nM，然而小鼠抗体的对应值为2.9nM。换言之，所述HBLB抗体对天然人LIV-1的亲和性为该小鼠抗体的约2倍。图4显示的饱和结合曲线是一个代表性的实例。
比较二种形式的HBLB对CHO细胞所重组表达的人LIV-1的结合。一种形式表达为具有野生型人IgG1及κ恒定区。另一种形式相同，除了在IgG1重链中有S239C突变(EU编号)(被称为LIV-14d或HBLBS239C)，其减少了该抗体与Fcγ受体的结合。这些抗体与小鼠供体抗体比较的结合曲线及EC50显示于图5。二种形式的HBLB的EC50彼此类似(在试验误差范围内)，二者均强过所述小鼠抗体。
人源化LIV-1单克隆抗体HBLB及HBLBS239C对食蟹猴LIV-1(cynoLIV-1)的EC50也被测定，所述食蟹猴LIV-1以重组蛋白质表达于CHO细胞系。二种抗体的结合亲和性相同(优于小鼠LIV-1mAb)。
LIV-1的表达数据
小鼠LIV-1单克隆抗体(至少2种以求一致性)被用于多种肿瘤类型的免疫组织化学试分析，使用以福尔马林固定石蜡包埋的组织。
表4.肿瘤样本中的LIV-1表达概要
我们发现，相比于使用大组织切片，进行组织微阵列试验可以观察到更低的LIV-1IHC阳性。这种表达差异具有高度显著性，显示在较大组织切片中分析LIV-1表达是优选的。使用至少2种不同的抗LIV-1单克隆抗体显示了良好的表达一致性。图6及7显示在荷尔蒙(它莫西芬(tamoxifen)或芳香酶抑制剂)治疗后的乳癌及前列腺肿瘤中的高量LIV-1表达，这表明，使用LIV-1ADC标靶这些肿瘤具有有力的理论基础。图8显示在三重阴性(ER-、PgR-、Her2-)乳癌组织中可检测的LIV-1表达。在三重阴性乳癌中由免疫组织化学染色所检测的LIV-1表达量与PC3动物模型中的量可相比，其中我们证实了LIV-1ADC的抗肿瘤活性。因此三重阴性乳癌是可能的目标族群，尤其是被发现表达LIV-1的三重阴性乳癌。
hLIV-14单克隆抗体作为ADC及效应器功能增强性单克隆抗体(SEA)的活体外抗肿瘤活性
利用细胞毒性试验(图9)及抗体依赖性细胞性细胞毒性试验(ADCC)(图10及11)来测量LIV-1ADC在活体外(invitro)的抗肿瘤活性。首先，我们通过定量FACS分析来测量各种细胞系中的LIV-1表达。来自ATCC的乳癌细胞系MCF-7相比于来自其他来源的MCF-7细胞系具有最高量的LIV-1结合部位/细胞(数据未显示)。因此我们使用这种细胞系进行这两种活体外试验。参见图9，各种hLIV-14ADC(所述HBLB抗体与vcMMAE共轭(称为1006)或与mcMMAF共轭(称为1269)(二者皆为在US20050238649中描述的小分子及/或连接器))均能高度有效地杀灭MCF-7细胞，相比较于非结合的及小鼠对照共轭物(mIgG-1006、mIgG-1269、hIgG-1006及hIgG-1269)。此外，每抗体具有平均二个药物连接器的半胱氨酸突变体LIV-14dADC也能高效地在细胞毒性试验中杀灭MCF-7细胞。参见图10及11，在ADCC试验中比较所述岩藻糖化/野生型(WT)单克隆抗体及ADCs与所述效应器功能增强版本(非岩藻糖化单克隆抗体及ADCs，称为SEA)的活性。结果显示，相比于非效应器功能增强版本的单克隆抗体或ADCs，效应器功能增强版本的LIV-1单克隆抗体及ADCs对MCF-7细胞具有良好的ADCC活性(例如，比较图10的hLIV-1SEAvcMMAE与hLIV-1vcMMAE)。再参照图9，效应器功能增强的LIV-1ADC(以SEA表示)也和野生型(非岩藻糖化)ADC具有类似的细胞毒性活性(比较hLIV-1SEA1006(vcMMAE)与hLIV-11006(vcMMAE))。因此细胞毒性可受到效应其功能及共轭作用二者的影响。
hLIV-14ADC的活体内抗肿瘤活性
利用乳癌(MCF-7)及前列腺癌(PC-3)模型，我们测定了LIV-1ADC(嵌合的及人源化(HBLB)单克隆抗体，平均每抗体具有4个药物)在活体内的抗肿瘤活性(图12至15)。与vcMMAE共轭的LIV-1ADC相比较于未处理及对照ADC显示了显著的肿瘤推迟。在所有试验中，使用3mg/kg的LIV-1-vcMMAE造成至少一例完全缓解(CR，completeregression)，其中许多动物的肿瘤相比较于对照组静止或生长缓慢。参照图12，与vcMMAE共轭的嵌合形式的母体小鼠抗体导致7只小鼠中的3只完全缓解。参照图13，所述相同的嵌合的ADC在8只小鼠中的1只产生完全缓解。参照图14，与vcMMAE共轭的人源化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))在8只小鼠中的1只产生完全缓解。此外，在HBLB抗体的半胱胺酸突变形式中vcMMAE药物连接器与各重链位置239共轭而产生的共轭物(每个抗体有2个药物连接器的平均药物装载)(命名为hLIV-14d-vcMMAE(2))，其展现与装载4个药物形式类似的活性。参照图15，与vcMMAE共轭的人源化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))在前列腺癌模型的8只小鼠中的1只产生完全缓解。相反地，所述装载二个药物的半胱氨酸突变体的活性在此模型中并不显著(比较hLIV-14-vcMMAE(4)与hLIV-14d-vcMMAE(2)，及hLIV-14-mcMMAF(4)与hLIV-14d-mcMMAF(2))。总结来说，这些试验显示LIV-1ADC可停止或推迟表达LIV-1的癌的生长，包括乳癌及前列腺癌。
II.BR2-22a的人源化
BR2-22a(有时亦被称为mAb2)是同种型IgG1κ的小鼠单克隆抗体。
方法:
除非在以下另外说明，上述用于人源化及测试BR2-14a的方法也适用于BR2-22。
饱和结合试验
将1×105抗原表达细胞(表达人LIV-1的MCF7细胞、293F细胞、或表达人LIV-1的转染CHO细胞系、或表现食蟹猴LIV-1的转染CHO细胞系)等分置于96孔v底孔盘的每孔中。经AlexaFluor-647标记的小鼠BR2-22a以0.66pM-690nM的浓度添加，于冰上培养30分钟。细胞经离心形成团块，以PBS/BSA清洗三次。该细胞接着再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定结合百分比，接着计算表观Kd。
竞争结合试验
将于PBS中的1×105个表达重组LIV-1的CHO细胞等分置于冰上的96孔v底孔盘的每孔中。这些细胞与5nM经AlexaFluor-647(AF)标记的母体BR2-22a及渐增浓度(0.038nM-600nM)的未经标记的人源化BR2-22a抗体(所有人源化轻链LA-LG与人源化重链HA-HG的组合)培养1小时。细胞经离心形成团块，以PBS清洗三次。该细胞接着再离心形成团块，以125μL的PBS/BSA重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定经结合的标记的人源化BR2-22a抗体百分比，接着将该数据带入不同斜率的S形剂量反应曲线以推测出EC50。
活体内活性试验
裸(nu/nu)小鼠(7至8只动物/组)被植入在培养基中生长的肿瘤细胞：来自NCI的MCF-7(5×106细胞于25％基质胶)、来自ATCC的PC3(2.5×106细胞于25％基质胶)及来自DSMZ的PC3(5×105于25％基质胶)。为了使MCF-7细胞在活体内生长，母小鼠被补充雌激素(通过植入缓释型雌激素丸(释放90天))。当肿瘤生长至100mm3时，开始给药嵌合性或人源化LIV-1ADC或非结合性的对照ADC(3mg/kg)(q4dx4次腹膜内注射)。利用卡尺测量肿瘤体积，当肿瘤体积到达约800mm3时安乐死动物。持续作图以了解各组的中位数肿瘤体积，直到一或多只动物被安乐死。所有动物试验根据获得实验动物管理评鉴及认证协会认可的机构中的实验动物照顾及使用委员会所核准的程序实施。
结果概述及讨论
饱和结合
BR2-22a与BR2-14a显示在成熟重链可变区具有94％一致性，在成熟轻链可变区具有91％一致性。小鼠Liv1抗体BR2-22a对人LIV-1的KD(表5)被测定，所述人LIV-1作为内源性蛋白被表达于人乳癌细胞系、293F细胞或作为重组蛋白被表达于CHO细胞系。BR2-22a对食蟹猴LIV-1的KD也被测定，所述食蟹猴LIV-1作为重组蛋白被表达于CHO细胞系。
表5BR2-22a对人(hLIV-1)及食蟹猴LIV-1(cyLIV-1)的亲和性测定
人源化策略
使用VH1-02JH5种系受体序列将所述BR2-22a抗体重链人源化，使用VK2-30JK4受体序列使轻链人源化。这些受体序列的选择根据是：它们与BR2-22A重链及轻链的成熟可变区框架具有最高的序列一致性。初期建构5种变异体重链。各变异体重链包括源自BR2-22a重链的三个KabatCDRs，这些链的差异在于具有0(VA)-11个(VE)回复突变。初期建构六种变异体轻链。各变异体轻链包括源自BR2-22a轻链的KabatCDRs及0(LA)-4个回复突变(LF)。这些回复突变是根据BR2-22A抗体建模的结果来选择的，以识别有可能与抗原直接交互作用、影响CDR构象或影响重链与轻链之间的接口的位置，并根据先前人源化BR2-14a的经验(因为BR2-14a与BR2-22a之间具有高度序列一致性)。事实上，在BR2-14a及BR2-22a中相同的11个重链位置及相同的4个轻链位置被考虑进行回复突变(BR2-22a中的L39不被考虑，因为该小鼠残基与该人残基相同)。下表6及7中显示了存在于人源化BR2-22a的各变异体中的回复突变。
表6
表7
各变异体的成熟可变区的全长序列显示于图16A及16B。
这五个重链及六个轻链的所有排列组合接着在一个竞争试验中相比较于BR2-22a被测试(见图17)。意外地的是，虽然在BR2-14a抗体的经验中，相对于所述小鼠抗体增强的结合仅得自4个回复突变，额外的回复突变并不一定增加结合亲和性，但对于BR2-22a而言，唯一显示结合亲和性大约等于BR2-22a的人源化链的组合是具有15个回复突变的HELF。其他排列组合显示与LIV-1不良或无显著结合性。该些不同的排列组合的EC50显示于下表8。
表8人源化BR2-22a抗体的EC50
DNB表示无结合
虽然HELF显示令人满意的结合，但该抗体包含总共15个回复突变，就可能的免疫原性而言此数量大于理想数量。因此，HE及LF链被系统性地改变(systematicallyvaried)以测试移除个别回复突变的影响。图18显示所述被测试的变异体。LF-1至LF-4与LF的不同之处在于：它们各缺少一个存在于LF中的不同的回复突变。类似地，HE-1至HE-11各缺少一个存在于HE中的回复突变。图19比较LF-1至LF-4(各与HE配对)。图19显示LF-2及LF-3相较于LF(在图中以HELF历史对照表示)失去实质上的结合亲和性，然而LF-1及LF-4则否。因此结论是：回复突变L36及L46实质上对保留结合亲和性有所贡献，而位置L37及L45的回复突变则可被放弃而不显著影响结合性。图20显示对于HE变异体的类似结合曲线。图20显示HE-11失去大部分的结合，表示在位置H94的回复突变对于所测试的回复突变的结合亲和性具有最大影响。在位置H27、H29及H30丧失回复突变也造成了亲和性的显著丧失。H30的角色可被由于体细胞突变(somaticmutation)导致的小鼠残基合理化解释。失去位置H76的回复突变造成一些亲和性的丧失。其他在位置H28、H48、H66、H67、H71及H93的回复突变可被放弃而很少或不会影响结合亲和性。
由这些实验结果启示，我们建构重链HF及HG与轻链LG。HF包括H27、H29、H30及H94的回复突变，HG包括这些突变及H76的回复突变。LG包含L36及L46的回复突变。一些HF、HG、LE及LF的排列组合被用于竞争结合测试，如图21所示，所有皆显示在小鼠BR2-22a三倍内之结合性。
由这些实验结果启示，选择HGLG以作为结合亲和性与最少回复突变的最佳组合以供进一步测试。此抗体以下称为hLIV22。hLIV22对CHO细胞所表达的人及食蟹猴LIV-1的饱和结合亲和性系显示于图22，并与hLIV14比较。图22显示hLIV22对人LIV-1的亲和性(解离常数之倒数)约为hLIV14的四倍。另外，hLIV22对人LIV-1的亲和性在实验误差内和其对食蟹猴LIV-1的亲和性相同，然而hLIV14对人LIV-1之亲和性是其对食蟹猴LIV-1亲和性的二倍。hLIV22对人LIV-1的亲和性在实验误差内和所述母体小鼠抗体BR2-22a对人LIV-1的亲和性相同。
hLIV22ADC的活体外抗肿瘤活性
hLIV22ADC的活体外抗肿瘤活性利用细胞毒性试验测量。首先，由定量FACS分析测定各种细胞系中的LIV-1表达。来自ATCC的乳癌细胞系MCF-7相较于来自其他来源的MCF-7细胞系具有最高量的LIV-1结合部位/细胞(数据未显示)。因此我们使用此细胞系进行活体外试验。我们在活体外细胞毒性试验中观察到，不同的hLIV22ADC(与vcMMAE共轭(称为1006)或与mcMMAF共轭(称为1269)(二者皆为US2005-0238649中描述的小分子))皆能高度有效地杀灭MCF-7细胞。图23及24比较了1006或1269共轭的hLIV22与1006或1269共轭的非结合性对照抗体。
LIV-1ADC的活体内抗肿瘤活性
利用如图25及26所示的前列腺癌(PC-3)及乳癌(MCF-7)模型，我们测定hLIV22ADC(每抗体平均4个药物)在活体内的抗肿瘤活性。相比于未处理及对照ADC，与vcMMAE共轭的hLIV22ADC显示显著的肿瘤推迟。我们在MCF-7试验中观察到使用3mg/kg的hLIV22-vcMMAE造成多例完全缓解(completeregressions)。此外，在所有试验中，相比于对照组，有许多动物的肿瘤呈现静止或生长缓慢。这些试验证明hLIV22ADC可停止或推迟LIV-1表达性癌的生长，包括乳癌及前列腺癌。图27比较了hLIV22与hLIV14ADC于MCF-7模型中的活性。虽然二种抗体均有效，但hLIV22稍微更有效。hLIV22ADC也在子宫颈癌模型中被测试。海拉(HeLa)细胞异种移植模型被用于该试验。在肿瘤生长至适当大小后，与vcMMAE共轭的hLIV22以3mg/kg及1mg/kg被给药至动物。对照抗体共轭物以3mg/kg给药。完全及部分缓解在接受3mg/kghLIV22vcMMAE共轭物的动物中观察到。(数据未显示)。因此，LIV-1抗体及抗体药物共轭物可被用于治疗表达LIV-1的子宫颈癌。
III.使用抗LIV-1抗体治疗皮肤癌
LIV-1蛋白在黑色素瘤肿瘤样本(MelanomaTumorSamples)上的表达
源自病患的黑色素瘤样本利用IHC染色来评估LIV-1的表达。FFPE玻片利用BondTMDewax溶液(Leica，产品编号AR9222)于72℃去石蜡。抗原修复系利用基于EDTA的BondTM表位修复溶液2(Leica，产品编号AR9640)于100℃进行20分钟。对于IHC染色，我们使用基于碱性磷酸酶的检测试剂盒：BondTMPolymerRefineRedDetection试剂盒(Leica，产品编号DS9390)。玻片与1μg/ml的抗LIV-1的小鼠单克隆一级抗体(primaryantibodies)(BR2-14a)一起培养45分钟，且预先经30分钟的蛋白封片(DAKO产品编号X0909)。小鼠IgG(Sigma，产品编号M5284)被用来作为阴性对照。在色原体发色之后，该切片以苏木精对比染色(counterstained)并盖上盖玻片。切片由病理学家评估及计分。
结果显示于图28。72％的受测黑色素瘤病患样本(21/29)对于LIV-1表现阳性。这表示LIV-1抑制剂例如抗LIV-1抗体可被用于治疗黑色素瘤。
LIV-1ADC的活体内抗黑色素瘤活性
裸(nu/nu)鼠(7至8只动物/组)被植入于培养基中生长的10×106SK-MEL-5细胞(黑色素瘤衍生性细胞系)。使肿瘤在活体内生长至100mm3，利用卡尺测量。给药3mg/kg的人源化LIV-1ADC，例如hLIV14或hLIV22。药物共轭物是例如vcMMAE或mcMMAF。对照ADC也以3mg/kg被给药至对照动物。ADC以q4dx4次腹膜内注射给药。利用卡尺测量肿瘤体积，当肿瘤体积到达约800mm3时安乐死动物。相比于那些接受对照ADC的动物，给药hLIV14ADC或hLIV22ADC大幅减少了动物体内的肿瘤生长。
序列表
SEQIDNO:1<LIV-1mAb轻链前导序列；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MKLPVRLLVLMFWIPVSTS
SEQIDNO:2<LIV-1mAb重链前导序列；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MKCSWVIFFLMAVVLGINS
SEQIDNO:3<替代重链前导序列；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MAWVWTLLFLMAAAQSAQA
SEQIDNO:4<轻链恒定区；PRT/1；人(homosapiens)>
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO:5<CH1-CH3；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO:6<重链CH1–CH3(无c-termK)；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQIDNO:7<S239C重链CH1–CH3；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO:8<S239C重链CH1–CH3(无c-termK)；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQIDNO:9<hLIV-1mAbHA；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPTFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHDAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:10<hLIV-1mAbHB；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPTFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHDAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:11<hLIV-1mAbHC；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPTFQGKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHDAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:12<hLIV-1mAbHD；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPTFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHDAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:13<hLIV-1mAbHE；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIEDYYMHWVRQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYAPTFQGKATMTADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCNVHDAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:14<hLIV-1mAbLA；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:15<hLIV-1mAbLB；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWYQQRPGQSPRRLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:16<hLIV-1mAbLC；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWFLQRPGQSPRRLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:17<hLIV-1mAbLD；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWFQQRPGQSPKRLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:18<hLIV-1mAbLE；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:19<hLIV-1mAbLF；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIRNDGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
DNA序列:
SEQIDNO:20<LIV-1mAb重链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atgaaatgcagctgggtcatcttcttcctgatggcagtggttctaggaatcaattca
SEQIDNO:21<LIV-1mAb轻链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgtttctaccagt
SEQIDNO:22<替代重链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaagca
SEQIDNO:23<轻链恒定区；DNA；小家鼠(musmusculus)>
acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQIDNO:24<CH1-CH3；DNA；人(homosapiens)>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQIDNO:25<CH1-CH3(w/oc-termK)；DNA；人(homosapiens)>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
SEQIDNO:26<S239CCH1-CH3；DNA；人工>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQIDNO:27<S239CCH1-CH3(w/oc-termK)；DNA；人工>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
SEQIDNO:28<hLIV-1mAbHA；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:29<hLIV-1mAbHB；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:30<hLIV-1mAbHC；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcaaggccactatgactgcagacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:31<hLIV-1mAbHD；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggattcaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:32<hLIV-1mAbHE；DNA；人工>
Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggattcaacattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcaaggccactatgactgcagacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtaatgtccatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:33<hLIV-1mAbLA；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:34<hLIV-1mAbLB；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:35<hLIV-1mAbLC；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttctgcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:36<hLIV-1mAbLD；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaagaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:37<hLIV-1mAbLE；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggctcctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:38<hLIV-1mAbLF；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtacctgcagaaaccaggccaatctccaaagctcctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:39<Liv1mAb2轻链前导序列；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MKLPVRLLVLMFWIPVATSS
SEQIDNO:40<Liv1mAb2重链前导序列；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MKCSWVIFFLMAVVIGINS
SEQIDNO:41<替代重链前导序；PRT/1；小家鼠(musmusculus)>
MAWVWTLLFLMAAAQSAQA
SEQIDNO:42<轻链恒定区；PRT/1；人(homosapiens)>
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO:43<CH1-CH3；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQIDNO:44<重链CH1–CH3(无c-termK)；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQIDNO:45<S239C重链CH1–CH3；PRT/1；人(homosapiens)>
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO:46<S239C重链CH1–CH3(无c-termK)；PRT/1；人(homosapiens)>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQIDNO:47<hLiv1mAb2HA；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:48<hLiv1mAb2HB；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:49<hLiv1mAb2HC；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:50<hLiv1mAb2HD；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:51<hLiv1mAb2HE；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYGPKFQGKATMTADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:52<hLiv1mAb2HF；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:53<hLiv1mAb2HG；PRT/1；人工>
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO:54<hLiv1mAb2LA；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:55<hLiv1mAb2LB；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRRLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:56<hLiv1mAb2LC；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWFLQRPGQSPRRLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:57<hLiv1mAb2LD；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWFQQRPGQSPKRLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:58<hLiv1mAb2LE；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:59<hLiv1mAb2LF；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
SEQIDNO:60<hLiv1mAb2LG；PRT/1；人工>
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
DNA序列:
SEQIDNO:61<Liv1mAb2重链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atgaaatgcagctgggtcatcttcttcctgatggcagtggttataggaatcaattca
SEQIDNO:62<Liv1mAb2轻链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgctaccagcagt
SEQIDNO:63<替代重链前导序列；DNA；小家鼠(musmusculus)>
atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaagca
SEQIDNO:64<轻链恒定区；DNA；人(homosapiens)>
acgacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
SEQIDNO:65<CH1-CH3；DNA；人(homosapiens)>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQIDNO:66<CH1-CH3(w/oc-termK)；DNA；人(homosapiens)>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
SEQIDNO:67<S239CCH1-CH3；DNA；人工>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQIDNO:68<S239CCH1-CH3(w/oc-termK)；DNA；人工>
gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
SEQIDNO:69<hLiv1mAb2HA；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:70<hLiv1mAb2HB；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:71<hLiv1mAb2HC；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcaaggccaccatgaccgcagacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:72<hLiv1mAb2HD；DNA；人工>
Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtactgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:73<hLiv1mAb2HE；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaacattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcaaggccaccatgaccgcagacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtactgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:74<hLiv1mAb2HF；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:75<hLiv1mAb2HG；DNA；人工>
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca
SEQIDNO:76<hLiv1mAb2LA；DNA；人工>
gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg
SEQIDNO:77<hLiv1mAb2LB；DNA；人工>
gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg
SEQIDNO:78<hLiv1mAb2LC；DNA；人工>
gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttctgcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg
SEQIDNO:79<hLiv1mAb2LD；DNA；人工>
gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaagaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg
SEQIDNO:80<hLiv1mAb2LE；DNA；人工>
gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg
SEQIDNO:81<hLiv1mAb2LF；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtacctgcagaggccaggccaatctccaaagcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:82<hLiv1BR2-22aLG；DNA；人工>
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt
SEQIDNO:83<Q13433；蛋白质
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAI
STRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHS
DHEHHSDHERHSDHEHHSEHEHHSDHDHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHD
SDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTH
FLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKG
FMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDA
RSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMN
RVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKR
GPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDK
KKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQE
PSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQ
SDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVI
MGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKA
GMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYV
ALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIV
FRINF
SEQIDNO:84<AAA96258.2；蛋白质
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAI
STRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHS
DHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGK
DPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTHFLETIE
TPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFMYSRN
TNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIH
TSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKF
LLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSH
LSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKNQK
KPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDS
QQPAVLEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIH
HHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVIMGDGLH
NFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQ
AVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMV
PEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF
SEQIDNO:85>CynoLIV-1
MARKLSVILILTFTLSVTNPLHELKSAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAITTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHEHHSDHEHHSHRNHAASGKNKRKALCPEHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHANGRRNVKDSVSTSEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPKLFPKDVSSSTPPSVTEKSLVSRLAGRKTNESMSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAILEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGIATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF

Claims (27)

1.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区具有被指定为SEQIDNO:52或53的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有被指定为SEQIDNO:59或60的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
3.根据权利要求2所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。
4.根据权利要求2所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是IgG1同种型。
5.根据权利要求2所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区由SEQIDNO:44的氨基酸序列组成，且所述轻链恒定区由SEQIDNO:42的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求2所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区由SEQIDNO:46的氨基酸序列组成，且所述轻链恒定区由SEQIDNO:42的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区由SEQIDNO:53的氨基酸序列组成，且所述成熟轻链可变区由SEQIDNO:60的氨基酸序列组成。
8.一种抗体药物共轭物，其包含根据权利要求1所述的人源化抗体和与所述人源化抗体共轭的细胞毒性剂或细胞抑制剂。
9.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQIDNO:52的三个KabatCDRs，其中位点H27被L占据、位点H29被I占据、位点H30被E占据、位点H76被N占据、位点H94被V占据，所述成熟轻链可变区包含SEQIDNO:60的三个KabatCDRs，其中位点L36被Y占据、位点L46被P占据。
10.一种核酸，其编码权利要求1-9中任一项定义的成熟重链可变区和/或成熟轻链可变区。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的人源化抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述癌症是乳癌、前列腺癌、宫颈癌或黑色素瘤。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症是三重阴性乳癌。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的人源化抗体。
15.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区由SEQIDNO:10的氨基酸序列组成，且所述成熟轻链可变区由SEQIDNO:15的氨基酸序列组成。
16.根据权利要求15所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
17.根据权利要求16所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。
18.根据权利要求16所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是IgG1同种型。
19.根据权利要求16所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区由SEQIDNO:6的氨基酸序列组成，且所述轻链恒定区由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。
20.根据权利要求16所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区由SEQIDNO:8的氨基酸序列组成，且所述轻链恒定区由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。
21.一种抗体药物共轭物，其包含根据权利要求15所述的人源化抗体和与所述人源化抗体共轭的细胞毒性剂或细胞抑制剂。
22.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区及成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQIDNO:10的3个CDRs，其中位点H29、H30和H76分别被I、E和N占据，且所述成熟轻链可变区包含SEQIDNO:15的3个CDRs，其中位点L36被Y占据。
23.一种核酸，其编码权利要求15-22中任一项定义的成熟重链可变区和/或成熟轻链可变区。
24.根据权利要求15-22中任一项所述的人源化抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
25.根据权利要求24所述的应用，其中所述癌症是乳癌、前列腺癌、宫颈癌或黑色素瘤。
26.根据权利要求25所述的应用，其中所述癌症是三重阴性乳癌。
27.一种药物组合物，其包含权利要求15-22中任一项所述的人源化抗体。
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