JP2021106599A - Liv−1に対するヒト化抗体および癌治療のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は非仮出願であり、2010年12月6日付け出願の61/420,291および2011年2月25日付け出願の61/446,990(あらゆる目的においてそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の利益を主張するものである。
本発明は、H27位がLにより占有されており、H29位がIにより占有されており、H30位がEにより占有されており、H94位がVにより占有されている、配列番号53に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、L36位がYにより占有されており、L46位がPにより占有されている、配列番号60に対して少なくとも90%同一である成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体を提供する。場合によっては、該ヒト化抗体は配列番号53の3つのCDRと配列番号60の3つのCDRとを含む。それらのCDRは図16に示されている。場合によっては、H76位はNにより占有されている。場合によっては、該ヒト化抗体は、配列番号53に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号60に対して少なくとも95%同一である成熟軽鎖可変領域とを含む。場合によっては、該成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域に融合しており、該成熟軽鎖定常領域は軽鎖定常領域に融合している。場合によっては、該重鎖定常領域は、天然ヒト定常領域と比較して低下した、Fcガンマ受容体への結合を示す、該天然ヒト定常領域の突然変異形態である。場合によっては、該重鎖定常領域はIgG1イソタイプのものである。場合によっては、該重鎖定常領域は、配列番号44を含むアミノ酸配列を有し、該軽鎖定常領域は、配列番号42を含むアミノ酸配列を有する。場合によっては、該重鎖定常領域は、配列番号46(S239C)を含むアミノ酸配列を有し、該軽鎖定常領域は、配列番号42を含むアミノ酸配列を有する。幾つかのそのようなヒト化抗体においては、それぞれ配列番号52および60からの、該成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のCDRにおけるいずれかの相違が、H60〜H65位に存在する。幾つかのそのようなヒト化抗体においては、該成熟重鎖可変領域は、配列番号52または53で示されるアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、配列番号59または60で示されるアミノ酸配列を有する。幾つかのそのようなヒト化抗体においては、該成熟重鎖可変領域は、配列番号53で示されるアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、配列番号60で示されるアミノ酸配列を有する。幾つかのそのようなヒト化抗体は細胞毒性または静細胞物質にコンジュゲート化(結合)されうる。幾つかのそのようなヒト化抗体は、0.5〜2×109 M-1の、ヒトまたはカニクイザル(cynomolgus monkey)LIV-1に対する会合定数を有する。
モノクローナル抗体は、典型的には、単離された形態で提供される。このことは、抗体が、典型的には、阻害タンパク質およびその製造または精製に起因する他の混入物から少なくとも50%(w/w)純粋であることを意味し、該モノクローナル抗体が、その使用を促進するように意図された過剰の製薬上許容される担体または他のビヒクルと組合される可能性を除外するものではない。時には、モノクローナル抗体は、阻害タンパク質および製造または精製からの混入物から少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または99%(w/w)純粋である。
I.概括
本発明は、LIV-1に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。該抗体は種々の癌の治療および診断ならびにLIV-1の検出に有用である。
特に示されていない限り、LIV-1はヒトLIV-1を意味する。典型的なヒト配列にはSwiss Protアクセッション番号Q13433が割り当てられている。Q13433は本明細書中には配列番号83として含まれる。3つの変異体アイソフォームおよび1つの多形が公知である。ヒトLIV-1タンパク質の第2の形態であるアクセッション番号AAA96258.2は本明細書中には配列番号84として含まれる。4つの細胞外ドメインは、Q13433のそれぞれ残基29-325、377-423、679-686および746-755により、境界が定められる。
A.結合特異性および機能特性
本発明は、2つのマウス抗体BR2-14aおよびBR2-22aから誘導されたヒト化抗体を提供する。特に示されていない限り、本開示は両方の抗体に関するものである。それらの2つのマウス抗体は、成熟重鎖および軽鎖可変領域において、お互いに対して94%および91%の配列同一性を示す。それらの2つの抗体はヒトLIV-1上の同一または重複エピトープに結合する。しかし、図22に示されているとおり、BR2-22a抗体は、BR2-14aより、ヒトLIV-1に対する約10倍高いアフィニティ、およびカニクイザルLIV-1に対する約3倍高いアフィニティを有する。
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのCDRがヒト「アクセプター」抗体配列内にグラフティングされている、遺伝的に操作された抗体である(例えば、Queen, US 5,530,101および5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; ならびにFoote, US 6,881,557を参照されたい)。該アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列でありうる。重鎖の場合には、好ましいアクセプター配列は、生殖系列VHエキソンVH1-2(該文献においてはHV 1-2とも称される)(Shinら, 1991, EMBO J. 10:3641-3645)、そしてヒンジ領域(JH)の場合にはエキソンJH-6(Mattilaら, 1995, Eur. J. Immunol. 25:2578-2582)である。軽鎖の場合には、好ましいアクセプター配列はエキソンVK2-30(該文献においてはKV2-30とも称される)、そしてヒンジ領域の場合にはエキソンJκ-4(Hieterら, 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522)である。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体に完全または実質的に由来する一部または全部のCDRと、ヒト抗体配列に完全または実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域(存在する場合)とを有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖に完全または実質的に由来する少なくとも1個、2個、および通常は全3個のCDRと、ヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域(存在する場合)とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、ドナー抗体軽鎖に完全または実質的に由来する少なくとも1個、2個、および通常は全3個のCDRと、ヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域(存在する場合)とを有する。ナノボディおよびdAbとは異なり、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるCDRが非ヒト抗体における対応CDRに実質的に由来すると言えるのは、(Kabatにより定められた場合に)対応残基の少なくとも60%、85%、90%、95%または100%がそれぞれのCDR間で同一である場合である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域がそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来すると言えるのは、Kabatにより定められた場合に対応残基の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一である場合である。
(1)抗原に直接的に非共有結合する、
(2)CDR領域に隣接している、
(3)以下の置換をしなければ、CDR領域と相互作用する(例えば、CDR領域から約6オングストローム以内である)、または
(4)重鎖と軽鎖との間の相互作用を引き起こす、と合理的に予想される場合には、該ヒトフレームワークアミノ酸はマウス抗体からの同等なフレームワークアミノ酸により置換されうる。
ヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域はヒト定常領域の少なくとも一部に連結されうる。定常領域の選択は、1つには、抗体依存性細胞性細胞傷害、抗体依存性細胞性食作用および/または補体依存性細胞傷害のいずれが望まれるのかに左右される。例えば、ヒトイソタイプIgG1およびIgG3は強力な補体依存性細胞傷害を示し、ヒトイソタイプIgG2は弱い補体依存性細胞傷害を示し、ヒトIgG4は補体依存性細胞傷害を欠いている。ヒトIgG1およびIgG3はまた、ヒトIgG2およびIgG4より強力な細胞性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパでありうる。抗体は、2本の軽鎖と2本の重鎖とを含有する四量体として、または分離した重鎖、軽鎖として、またはFab、Fab'、F(ab)2およびFvとして、または重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結されている一本鎖抗体として発現されうる。
ヒト化抗体は、典型的には、組換え発現により製造される。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然で結合している又は異種プロモーター領域を含む、抗体鎖のコード配列に機能的に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、該発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトしうるベクターにおける真核プロモーター系である。該ベクターが適当な宿主内に組込まれたら、該宿主は、該ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応性抗体の収集および精製に適した条件下に維持される。
本発明は更に、前記のヒト化重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、該核酸は、成熟重鎖および軽鎖に融合したシグナルペプチドをもコードしている。核酸上のコード配列は、該コード配列の発現を保証するための調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどに機能的に連結されうる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在することが可能であり、あるいは1以上のベクター内にクローニングされうる。該核酸は、例えば重複オリゴヌクレオチドのPCRまたは固相合成により合成されうる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、1つの連続的核酸として連結されることが可能であり、あるいは分離していることが可能である(例えば、それぞれが、それ自身の発現ベクター内にクローニングされうる)。
抗LIV-1抗体は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)を得るために、細胞毒性または静細胞部分(その製薬上許容される塩を含む)にコンジュゲート化されうる。抗体へのコンジュゲート化のための特に適した部分は細胞毒性物質(例えば、化学療法剤)、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物または毒素(これらの部分は治療用物質と総称される)である。例えば、抗LIV-1抗体は、細胞毒性物質、例えば化学療法剤、または毒素(例えば、静細胞または殺細胞物質、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素)にコンジュゲート化されうる。
-A-は伸長単位である;
aは0または1である;
各-W-は、独立して、アミノ酸単位である;
Wは、独立して、0〜12の範囲の整数である;
-Y-はスペーサー単位である;および
yは0、1または2である)を有する。
前記のBR2-14aおよびBR2-22a抗体のヒト化形態だけでなく、LIV-1の細胞外ドメインに結合する他の抗体も、本発明の方法の幾つかにおいて、特に、三重陰性乳癌の治療において使用されうる。LIV-1に対するマウス抗体群がUS20080175839に記載されている。これらの抗体には、1.1F10、1.7A4、BR2-10b、BR2-11a、BR2-13a、BR2-14a、BR2-15a、BR2-16a、BR2-17a、BR2-18a、BR2-19a、BR2-20a、BR2-21a、BR2-22a、BR2-23a、BR2-24aおよびBR2-25aが含まれ、これらのうち、BR2-14aおよびBR2-22aに加えて、ハイブリドーマATCCアクセッション番号PTA-5706により産生されるBR2-19aまたはハイブリドーマATCCアクセッション番号PTA-5707により産生されるBR2-23aが好ましい。これらの抗体のヒト化、キメラまたはベニア化(veneered)形態は、以下に要約する通常の方法により製造されうる。
本発明のヒト化抗体は、単独で、またはそのLIV-1抗体薬物コンジュゲートとして、癌を治療するために使用されうる。幾つかのそのような癌は、タンパク質(例えば、例示されている抗体の1つを使用するイムノアッセイにより)またはmRNAレベルで測定される検出可能なレベルのLIV-1を示す。幾つかのそのような癌は、好ましくは同一患者からの、同じ型の非癌性組織と比較して上昇したレベルのLIV-1を示す。治療に適した癌細胞上のLIV-1の典型的レベルは細胞1個当たりLIV-1分子5000〜150000個であるが、より高い又はより低いレベルも治療可能である。場合によっては、癌におけるLIV-1のレベルは、治療を行う前に測定される。
該抗LIV-1ヒト化抗体は、臨床診断または治療または研究の場合にLIV-1を検出するために使用されうる。癌上のLIV-1の発現は、該癌が本発明の抗体での治療に適しているという指標を提供する。該抗体は、LIV-1を含有する細胞および種々の刺激に対するそれらの応答を検出する際の実験室研究用の研究用試薬として販売されうる。そのような用途においては、モノクローナル抗体は蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位体で標識されることが可能であり、LIV-1に関するアッセイを行うための必要な試薬の全てを含むキットの形態で提供されうる。本明細書に記載されている抗体BR2-14a、BR2-22a、ならびにそれらのヒト化形態、例えばhLIV14およびhLIV22は、LIV-1タンパク質発現を検出するために、および癌がLIV-1 ADCでの治療に適しているかどうかを判定するために使用されうる。一例として、BR2-14a、BR2-22a、ならびにそれらのヒト化形態、例えばhLIV14およびhLIV22は、乳癌細胞、メラノーマ細胞、子宮頸癌細胞または前立腺癌細胞上のLIV-1発現を検出するために使用されうる。該抗体は、LIV-1を例えばアフィニティクロマトグラフィにより精製するためにも使用されうる。
本発明は更に、シグナルペプチド(これは配列番号85の残基約1-28を占有する)を伴う又は伴わない、配列番号85におけるカニクイザル由来のLIV-1(CY LIV-1)のアミノ酸配列、およびそのアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。1、2、3、4または5個までの置換、欠失または挿入により異なる変異体も含まれる。ただし、CY変異体は天然ヒトLIV-1配列を含まない。ヒトLIV-1と同様に、CY-LIV-1に対する言及は、該タンパク質の少なくとも細胞外ドメイン、通常は、切断可能なシグナルペプチド(アミノ酸1-28)以外の完全タンパク質を意味する。本発明は更に、ヒトLIV-1への特異的な結合を伴う又は伴わない(すなわち、陰性対照無関連抗体のレベルでのヒトLIV-1への結合)、配列番号85に特異的に結合する抗体を提供する。本発明は更に、ヒトLIV-1に対してよりもCY-LIV-1に対して優先的に(またはその逆)結合する抗体を提供する。優先的な結合は、実験誤差より高い、好ましくは少なくとも2、3または4倍高い結合を意味する。本発明は更に、例示されている後記抗体のいずれかと実験誤差内で同じ、ヒトおよびCY LIV-1への結合プロファイルを示す抗体を提供する。本発明は更に、CY LIV-1に対する抗体の結合を分析する方法を提供する。そのような方法は、抗体をCY LIV-1と接触させ、該抗体がCY LIV-1に特異的に結合するかどうかを決定し、場合によっては、結合強度の尺度、例えば会合定数を決定することを含む。
本発明は以下の実施形態を包含する:
1.配列番号52または53のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号59または60のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、ヒトLIV-1に特異的に結合するヒト化抗体。
2.該成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合しており、該成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合している、実施形態1記載のヒト化抗体。
3.該重鎖定常領域が、天然ヒト定常領域と比較して低下した、Fcガンマ受容体への結合を示す、該天然ヒト定常領域の突然変異形態である、実施形態2記載のヒト化抗体。
4.該重鎖定常領域がIgG1イソタイプのものである、実施形態2記載のヒト化抗体。
5.該重鎖定常領域が、配列番号44を含むアミノ酸配列を有し、該軽鎖定常領域が、配列番号42を含むアミノ酸配列を有する、実施形態2記載のヒト化抗体。
6.該重鎖定常領域が、配列番号46を含むアミノ酸配列を有し、該軽鎖定常領域が、配列番号42を含むアミノ酸配列を有する、実施形態2記載のヒト化抗体。
7.該成熟重鎖可変領域が、配列番号53で示されるアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域が、配列番号60で示されるアミノ酸配列を有する、実施形態1〜6のいずれか記載のヒト化抗体。
8.該抗体が細胞毒性または静細胞物質にコンジュゲート化されている、実施形態1〜7のいずれか記載のヒト化抗体。
9.細胞毒性物質であるオーリスタチンにコンジュゲート化されている、実施形態8記載のヒト化抗体。
10.該細胞毒性物質が、モノメチルオーリスタチンF(MMAF)である、実施形態8記載のヒト化抗体。
11.該細胞毒性または静細胞物質が、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である、実施形態8記載のヒト化抗体。
12.実施形態1〜11のいずれか記載の成熟重鎖可変領域および/または成熟軽鎖可変領域をコードする核酸。
13.LIV-1を発現する癌の治療において使用するための、実施形態1〜11のいずれか記載のヒト化抗体を含む医薬組成物。
14.該癌が三重陰性乳癌である、実施形態13記載の医薬組成物。
15.該癌が乳癌、前立腺癌、子宮頸癌またはメラノーマである、実施形態13記載の医薬組成物。
I.BR2-14aのヒト化
材料
以下の実施例に記載する細胞系を、American Type Culture Collection (ATCC)、National Cancer Institute (NCI)またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany (DMSZ)により特定されている条件に従い、培養内で維持した。細胞培養試薬は、Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA.)または他の供給業者から入手した。
飽和結合アッセイ
1×105個の抗原発現細胞(ヒトLIV-1を発現するMCF7細胞(ATCC)、ヒトLIV-1を発現するトランスフェクト化CHO細胞系、またはシノLIV-1を発現するトランスフェクト化CHO細胞系)を96ウェルv底プレートのウェルごとにアリコート化した。AlexaFluor-647標識マウスLIV-1 mAb、例えばBR2-14aを0.66pM〜690nMの範囲の濃度で加え、氷上で30分間インキュベートした。細胞をペレット化し、PBS/BSAで3回洗浄した。ついで該細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁させた。飽和蛍光シグナルに対する百分率を用いて、蛍光をフローサイトメトリーにより分析して、結合率を決定し、ついで見掛けKdを計算した。
組換えヒトLIV-1を発現する、PBS/BSA中のCHO細胞1×105個を氷上の96ウェルV底プレートの各ウェル内にアリコート化した。5 nM AlexaFluor-647 (AF)標識親マウスLIV-1 mAbおよび次第に増加する濃度(0.038 nMから600 nMまで)の未標識ヒト化LIV-1 mAb、ヒト化軽鎖LA-LFとヒト化重鎖HA-HEとの組合せと共に、該細胞を1時間インキュベートした。細胞をペレット化し、PBS/BSAで3回洗浄した。該細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁させた。飽和蛍光シグナルに対する百分率を用いて、蛍光をフローサイトメトリーにより分析して、結合した標識マウスLIV-1 mAbの百分率を決定し、ついで該データを種々の勾配でS字状用量-反応曲線に当てはめることによりEC50を外挿した。
一次抗体としてのマウスLIV-1 mAbおよびDAKO QiFiKitフローサイトメトリー間接アッセイを製造業者(DAKO A/S, Glostrup, Denmark)の説明に従い使用して、細胞表面上のLIV-1コピー数の定量を決定し、Becton Dickinson FACS(登録商標)canフローサイトメーターを使用して評価した。
腫瘍細胞をLIV-1抗体薬物コンジュゲートと共に37℃で96〜144時間インキュベートした。陰性対照として非結合性(H00)ADCを使用した。最終濃度50μMのレサズリン(Sigma)細胞により生存度を測定した。細胞を37℃で4〜6時間インキュベートした。Fusion HT蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer, Waltham, MA)で蛍光シグナルを測定した。結果は、ビヒクル処理細胞(対照=100%)と比較した場合に生存度における50%の減少をもたらすのに必要な化合物の濃度であるIC50で表されている。
該LIV-1抗体の抗体薬物コンジュゲートを、US20050238649に記載されているとおりに製造した。薬物リンカーvcMMAE(1006とも称される)およびmcMMAF(1269と称される)は共にUS20050238649に記載されている。IgG1抗体のシステイン突然変異体の製造はUS20100158919に全般的に記載されている。US20050238649およびUS20100158919を全ての目的において参照により本明細書に組み入れることとする。
ヒト化IgG1抗LIV-1モノクローナル抗体HBLB mAb(hLIV-14)を産生するCHO DG44細胞系を、125mL振とうフラスコ内で100RPMで振とうしながら、30mLのCHO培地内で37℃、5% CO2で3.0×105細胞/mLで培養した。培地をインスリン様増殖因子(IGF)、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび65μM 2-フルオロフコースペルアセタート(SGD-2084)(US20090317869を参照されたい)で補足した。第3日に培養に2%容量のフィード培地を供給した。第4日に、該培養を新鮮な培地内に1:4で分割した。第5、7、9および10日に、培養に6%容量の生産フィード培地を供給した。第13日に、該培養を0.2μmフィルターに通過させることにより、馴らし培地を集めた。1×リン酸緩衝食塩水(PBS)(pH 7.4)で前平衡化されたプロテインAカラムに該馴らし培地を適用することにより、抗体精製を行った。
標準的な51Cr遊離アッセイを用いて、ADCC活性を測定した。簡潔に説明すると、該MCF-7標的腫瘍細胞を100μCiのNa51CrO4で標識し、洗浄し、エフェクター(ナチュラルキラー, NK)細胞の添加前に試験抗体と共にプレインキュベートした。免疫磁気ビーズ(EasySep, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)を使用して、正常FcγRIIIA 158V/Vドナー(Lifeblood, Memphis, TN)から得られた非接着性末梢血単核細胞(PBMC)からNK(CD16+ CD56+)細胞を調製した。生存可能なNK細胞を標的細胞に、10:1のエフェクター対標的細胞比で加えた。このアッセイにおける陰性対照として、ヒトIgG1κ(Ancell, Bayport, MN)を使用した。4時間のインキュベーションの後、上清を集め、Lumaプレート上で一晩乾燥させた。ついで、細胞溶解されたMCF-7細胞から放出されたガンマ線を、TopCount Microplate ScintillationおよびLuminescence Counter(Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts)を使用して検出した。ADCC活性は%特異的細胞溶解として示されている。
ヌード(nu/nu)マウス(7〜8匹/群)に、培養内で増殖させた以下の腫瘍細胞を移植した:NCIからのMCF-7(25%マトリゲル中の5×106 細胞)、ATCCからのPC3(25%マトリゲル中の2.5×106 細胞)およびDSMZからのPC3(25%マトリゲル中の5×105 細胞)。また、MCF-7細胞のin vivo増殖のために、徐放エストロゲンペレット(90日間放出)を移植することにより、雌マウスにエストロゲン補充を行った。腫瘍が100 mm3に達したら、キメラもしくはヒト化LIV-1 ADCまたは非結合性対照ADC(3 mg/kg)の投与を開始した(q4d×4腹腔内注射)。カリパスを使用して腫瘍体積をモニターし、腫瘍体積が〜800 mm3に達したら、動物を安楽死させた。1以上の動物を安楽死させるまで、各群に関して腫瘍体積中央値プロットを継続した。全ての動物の取り扱いは、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careにより認められた施設において、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い行った。
方法
腫瘍マイクロアレイ(TMA)および個々の腫瘍サンプルを商業的入手源から入手した。正常または腫瘍ホルマリン固定およびパラフィン包埋(FFPE)組織からの組織マイクロアレイはUS Biomax Inc.またはCybrdiから購入した。凍結アレイはBioChainから購入した。単一切片はNDRI、Asterand, Tissue SolutionまたはCHTNから購入した。転移性ホルモン治療抵抗性前立腺癌(対応する骨および軟組織転移部位)のパラフィン包埋サンプル25個の一式はR. Vessella博士(University of Washington, Genitourinary Cancer Department)により提供された。全てのサンプルはBond-Max(商標)自動染色装置(Leica)で加工された。
FFPEスライドまたはガラススライド上で切片化されたTMAを、72℃でBond(商標)Dewax溶液(Leica, cat # AR9222)を使用して脱パラフィン化し、再水和させた。一次マウスLIV-1 mAb(1〜2μg/ml)とのインキュベーション(25℃で30〜45分間)の前に、95〜100℃で20分間、EDTA系Bond(商標)Epitope Retrieval Solution 2(Leica, cat # AR9640)を使用して、抗原回収を行った。イソタイプ合致マウスIgG1(Sigma; cat # M5284)をバックグラウンド染色に関する陰性対照として使用した。自動IHC染色のために、Refine DABキットまたはアルカリホスファターゼ系検出キット:Bond(商標)Polymer AP Red Detectionキット(Leica, cat # DS9305)を使用した。スライドを、予備的な30分間のタンパク質ブロック(DAKO cat #X0909)を伴って、マウスLIV-1 mAbに対するマウスモノクローナル一次抗体(1μg/ml)と共に45分間インキュベートした。色素源の現像の後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスで覆った。病理学者によりスライドが評価され、スコア化された。Zeiss Axiovert 200M顕微鏡(Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)を使用して、イメージを撮影した。
凍結/OCTサンプルの5μm切片を10分間にわたってアセトン固定し、30分間にわたって空気乾燥させ、室温で20分間にわたって1×Morphosaveで前処理した。該スライドをBond-Max(商標)自動染色装置(Leica)内にローディングし、予備的な30分間のタンパク質ブロック(DAKO cat# X0909)を伴って、一次抗体で45分間染色した。マウスIgG1(BD Pharmingen cat #550878)を陰性対照として使用した。検出のために、DAB系Bond Polymer Refineキット(Leica, cat # DS9800)を使用した。色素源の現像の後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスで覆った。病理学者によりスライドが評価され、スコア化された。
1.マウス抗体の結合
マウスLIV-1モノクローナル抗体BR2-14a抗体(US2004141983)のKDを、ヒト乳癌細胞系において内因性タンパク質として又はCHO細胞系において組換えタンパク質として発現されたヒトLIV-1に対して決定した。マウスLIV-1抗体BR2-14aのKDを、CHO細胞系において組換えタンパク質として発現されたシノLIV-1に対しても決定した。MCF7はヒト乳癌細胞系である。293Fはヒト胚腎細胞系である。表1は、該抗体が、ヒト細胞系から発現された非組換えLIV-1に対しては、組換えLIV-1に対する場合より約5倍低い解離定数を、ヒト由来(hLIV-1)の場合にもカニクイザル由来(cyLIV-1)の場合にも有していたことを示している。
この実施例におけるヒト化のための出発点、すなわち、ドナー抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-5705Aを有するハイブリドーマにより製造されるマウス抗体BR2-14aであり、US2004141983に記載されている。適当なヒトアクセプター配列は、重鎖に関してはVH1-02およびJH5により、そして軽鎖に関してはVK2-30およびJk4により提供されるゲノム配列である。該ヒトアクセプター配列は可変領域フレームワークにおけるドナー配列に対して68および85%の同一性を示す。ヒトアクセプター配列の軽鎖CDRは、ドナー配列のCDRと同じカノニカル型(canonical)のものである。これとは対照的に、ヒトアクセプター配列の重鎖CDRは、それらのカノニカル型において異なっていた(該生殖系列は1〜3であったが、マウスドナーでは1〜2であった)。
MCF7細胞上のヒトLIV-1に対するHBLBに関するKdは、幾つかの飽和結合曲線の平均から、1.5nMであると決定された。一方、該マウス抗体に関するKdは2.9nMである。換言すれば、HBLB抗体は、該マウス抗体と比較して、天然ヒトLIV-1に対する約2倍のアフィニティを有する。図4に示されている飽和結合曲線は代表例である。
乳癌(MCF-7)および前立腺癌(PC-3)モデルを使用して、LIV-1 ADC(抗体1個当たり平均4個の薬物を有するキメラおよびヒト化(HBLB)mAb)のin vivoでの抗腫瘍活性を測定した(図12〜15)。vcMMAEにコンジュゲート化されたLIV1 ADCは、未処理および対照ADCと比較して有意な腫瘍遅延を示した。LIV-1-vcMMAEを3mg/kgで使用した研究の全てにおいて、少なくとも1つの完全退縮(CR)が観察され、幾つかの動物は、対照と比較して静的な又は遅く成長する腫瘍を有していた。図12に関しては、vcMMAEにコンジュゲート化された親マウス抗体のキメラ形態は7匹中3匹のマウスにおいて完全な退縮を引き起こした。図13に関しては、同じキメラADCは8匹中1匹のマウスにおいて完全な退縮を引き起こした。図14に関しては、vcMMAEにコンジュゲート化されたヒト化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))は8匹中1匹のマウスにおいて完全な退縮を引き起こした。また、HBLB抗体のシステイン突然変異形態(hLIV-14d-vcMMAE(2)と称される、抗体1個当たり薬物リンカー2個の平均薬物負荷を有するコンジュゲートを与えるように、239位において各重鎖にコンジュゲート化されたvcMMAE薬物リンカー)は、該4負荷形態に類似した活性を示した。図15に関しては、vcMMAEにコンジュゲート化されたヒト化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))は前立腺癌モデルで8匹中1匹のマウスにおいて完全な退縮を引き起こした。これとは対照的に、該2負荷システイン突然変異体の活性はこのモデルにおいては顕著ではなかった(hLIV-14-vcMMAE(4)をhLIV-14d-vcMMAE(2)と、そしてhLIV-14-mcMMAF(4)をhLIV-14d-mcMMAF(2)と比較されたい)。要約すると、これらの研究は、LIV-1 ADCが、乳癌および前立腺癌を含むLIV-1発現癌の成長を停止または遅延させうることを示している。
mAb2と称されることもあるBR2-22aはイソタイプIgG1カッパのマウスモノクローナル抗体である。
以下に特に示さない限り、BR2-14aのヒト化および試験に関して記載されている方法がBR2-22にも適用可能である。
1×105個の抗原発現細胞(ヒトLIV-1を発現するMCF7細胞、ヒトLIV-1を発現する293F細胞、ヒトLIV-1を発現するトランスフェクト化CHO細胞系またはシノLIV-1を発現するトランスフェクト化CHO細胞系)を96ウェルv底プレートのウェルごとにアリコート化した。AlexaFluor-647標識マウスBR2-22aを0.66pM〜690nMの範囲の濃度で加え、氷上で30分間インキュベートした。細胞をペレット化し、PBS/BSAで3回洗浄した。ついで該細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁させた。飽和蛍光シグナルに対する百分率を用いて、蛍光をフローサイトメトリーにより分析して、結合率を決定し、ついで見掛けKdを計算した。
組換えLIV-1を発現する、PBS中のCHO細胞1×105個を氷上の96ウェルV底プレートの各ウェル内にアリコート化した。5 nM AlexaFluor-647 (AF)標識親マウスBR2-22aおよび次第に増加する濃度(0.038 nMから600 nMまで)の未標識ヒト化BR2-22a抗体(ヒト化軽鎖LA-LGおよびヒト化重鎖HA-HGの全ての組合せのもの)と共に、該細胞を1時間インキュベートした。細胞をペレット化し、PBSで3回洗浄した。ついで該細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁させた。飽和蛍光シグナルに対する百分率を用いて、蛍光をフローサイトメトリーにより分析して、結合した標識ヒト化BR2-22a抗体の百分率を決定し、ついで該データを種々の勾配でS字状用量-反応曲線に当てはめることによりEC50を外挿した。
ヌード(nu/nu)マウス(7〜8匹/群)に、培養内で増殖させた以下の腫瘍細胞を移植した:MCF-7(NCI)(25%マトリゲル中の5×106 細胞)、ATCCからのPC3(25%マトリゲル中の2.5×106 細胞)およびDSMZからのPC3(25%マトリゲル中の5×105 細胞)。また、MCF-7細胞のin vivo増殖のために、徐放エストロゲンペレット(90日間放出)を移植することにより、雌マウスにエストロゲン補充を行った。腫瘍が100 mm3に達したら、キメラもしくはヒト化LIV-1 ADCまたは非結合性対照ADC(3 mg/kg)の投与を開始した(q4d×4腹腔内注射)。カリパスを使用して腫瘍体積をモニターし、腫瘍体積が〜800 mm3に達したら、動物を安楽死させた。1以上の動物を安楽死させるまで、各群に関して腫瘍体積中央値プロットを継続した。全ての動物の取り扱いは、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careにより認められた施設において、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い行った。
飽和結合
BR2-22aは、成熟重鎖可変領域においてはBR2-14aに対して94%の同一性を、そして成熟軽鎖可変領域においては91%の同一性を示す。BR2-22aのマウスLiv1に関するKD(表5)を、ヒト乳癌細胞系、293F細胞において内因性タンパク質として又はCHO細胞系において組換えタンパク質として発現されたヒトLIV-1に対して決定した。BR2-22aに関するKDも、CHO細胞系において組換えタンパク質として発現されたシノLIV-1に対して決定した。
重鎖にはVH1-02 JH5生殖系列アクセプター配列を、そして軽鎖にはVK2-30 JK4アクセプター配列を使用して、BR2-22a抗体をヒト化した。これらのアクセプター配列は、BR2-22A重鎖および軽鎖の成熟可変領域フレームワークに対する最高の配列同一性をそれらが有することに基づいて選択された。まず、5個の変異重鎖を構築した。それぞれはBR2-22aの重鎖からの3個のKabat CDRを含み、それらの鎖は、0個(VA)から11個(VE)までの復帰突然変異を有する点で異なっていた。まず、6個の変異軽鎖を構築した。それぞれはBR2-22aの軽鎖からの3個のKabat CDRおよび0個(LA)から4個(LF)までの復帰突然変異を含んでいた。これらの復帰突然変異は、抗原と直接的に相互作用しCDRコンホメーションに影響を及ぼし又は重鎖と軽鎖との間の境界に影響を及ぼす可能性を有する位置を特定するためのBR2-22A抗体のモデリングの結果として、およびBR2-14aとBR2-22aとの間の高い配列同一性によるBR2-14aのヒト化におけるこれまでの経験に基づいて選択された。実際、重鎖における同じ11個の位置および軽鎖における同じ4個の位置がBR2-14aおよびBR2-22aの両方における復帰突然変異に考慮された(L39はBR2-22aにおいては考慮されなかった。なぜなら、該マウス残基は該ヒト残基と同じだからである)。ヒト化BR2-22aの各変異体に存在する復帰突然変異を以下の表6および7に示す。
in vitroでのhLIV22 ADCの抗腫瘍活性を細胞傷害性アッセイにより測定した。まず、定量的FACS分析により、種々の細胞系におけるLIV-1発現の調査を行った。ATCCからの乳癌細胞系MCF-7は、他の起源からのMCF-7細胞系と比較して最高レベルのLIV-1結合部位/細胞を有していた(データ非表示)。in vitroアッセイに、この細胞系を使用した。種々のhLIV22 ADC(vcMMAE(1006と称される)またはmcMMAF(1269と称される)(共にUS2005-0238649に記載されている小さな分子)にコンジュゲート化されている)は、該in vitro細胞傷害性アッセイによる測定で、MCF-7細胞の殺傷に非常に有効であることを、本発明者らは観察した。図23および24は、1006または1269にコンジュゲート化されたhLIV22を、1006または1269にコンジュゲート化された非結合性対照抗体と比較している。
図25および26に示されているとおり、前立腺癌(PC-3)および乳癌(MCF-7)モデルを使用して、hLIV22 ADC(抗体1個当たり平均4個の薬物を有する)のin vivoでの抗腫瘍活性を測定した。vcMMAEにコンジュゲート化されたhLIV22 ADCは、未処理および対照ADCと比較して有意な腫瘍遅延を示した。hLIV22-vcMMAEを3mg/kgで使用するMCF-7の研究において、複数の完全退縮が観察された。また、全ての研究において、幾つかの動物は、対照と比較して静的な又は遅く成長する腫瘍を有していた。これらの研究は、hLIV22 ADCが、乳癌および前立腺癌を含むLIV-1発現癌の成長を停止または遅延させうることを示している。図27は該MCF-7モデルにおけるhLIV22およびhLIV14 ADCの活性を比較するものである。どちらの抗体も有効であったが、hLIV22のほうが僅かに有効であった。子宮頸癌のモデルにおいても、hLIV22 ADCを試験した。HeLA細胞異種移植片モデルを該アッセイに使用した。腫瘍が適当なサイズに成長した後、vcMMAEにコンジュゲート化されたhLIV22を3mg/kgおよび1mg/kgで動物に投与した。対照抗体コンジュゲートは、3mg/kgで投与した。3mg/kgのhLIV22 vc MMAEコンジュゲートが投与された動物において、完全退縮および部分的退縮が観察された(データ非表示)。このように、LIV-1抗体および抗体薬物コンジュゲートは、LIV-1発現子宮頸癌を治療するために使用されうる。
メラノーマ腫瘍サンプル上のLIV-1タンパク質の発現
患者からのメラノーマサンプルを、IHC染色を用いて、LIV-1発現に関して評価した。FFPEスライドを、72℃でBond(商標)Dewax溶液(Leica, cat # AR9222)を使用して脱パラフィン化した。100℃で20分間、EDTA系Bond(商標)Epitope Retrieval Solution 2(Leica, cat # AR9640)を使用して、抗原回収を行った。IHC染色のために、アルカリホスファターゼ系検出キット:Bond(商標)Polymer Refine Red Detection kit(Leica, cat # DS9390)を使用した。スライドを、予備的な30分間のタンパク質ブロック(DAKO cat #X0909)を伴って、LIV-1に対するマウスモノクローナル一次抗体(1μg/ml)(BR2-14a)と共に45分間インキュベートした。マウスIgG(Sigma, cat # M5284)を陰性対照として使用した。色素源の現像の後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスで覆った。病理学者によりスライドが評価され、スコア化された。
ヌード(nu/nu)マウス(7〜8匹/群)に、培養内で増殖させた10×106個のSK-MEL-5細胞(メラノーマ腫瘍由来細胞系)を移植する。腫瘍を、カリパスを使用する測定でそれが100 mm3になるまで、in vivoで成長させる。ヒト化LIV-1 ADC、例えばhLIV14またはhLIV22を3mg/kgで投与する。薬物コンジュゲートは例えばvcMMAEまたはmcMMAFである。また、対照動物に対照ADCを3mg/kgで投与する。ADCは、q4d×4腹腔内注射として投与する。カリパスを使用して腫瘍体積をモニターし、腫瘍体積が〜800 mm3に達したら、動物を安楽死させる。hLIV14 ADCまたはhLIV22 ADCの投与は、対照ADCが投与された動物と比較して、動物における腫瘍成長を著しく低下させる。
Claims (38)
- 成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域を含む、ヒトLIV-1に特異的に結合するヒト化抗体であって、
上記成熟重鎖可変領域の3つのCDRが配列番号10の3つのCDRであり、上記成熟軽鎖可変領域の3つのCDRが配列番号15の3つのCDRであるが、H29位、H30位およびH76位がそれぞれI、EおよびNにより占有され、L36位がYにより占有され、アミノ酸の位置がKabatに従って番号付けられる、前記ヒト化抗体。 - 配列番号10および該成熟重鎖可変領域の可変領域フレームワークにおけるいずれかの相違が、Fにより占有されているH27、Nにより占有されているH28、Iにより占有されているH48、Kにより占有されているH66、Aにより占有されているH67、Aにより占有されているH71、Nにより占有されているH76、Nにより占有されているH93、Vにより占有されているH94、Lにより占有されているL37、Kにより占有されているL39、Kにより占有されているL45、およびLにより占有されているL46からなる群から選択され、アミノ酸の位置がKabatに従って番号付けられる、請求項1に記載のヒト化抗体。
- 該成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合しており、該成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合している、請求項1または2に記載のヒト化抗体。
- 該重鎖定常領域が、天然ヒト定常領域と比較して低下した、Fcガンマ受容体への結合を示す、該天然ヒト定常領域の突然変異形態である、請求項3に記載のヒト化抗体。
- 該重鎖定常領域がIgG1イソタイプのものである、請求項3または4に記載のヒト化抗体。
- 該重鎖定常領域が、配列番号6または配列番号8(S239C)を含むアミノ酸配列を有し、該軽鎖定常領域が、配列番号4を含むアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のヒト化抗体。
- 該抗体が細胞毒性または静細胞物質にコンジュゲート化されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 該抗体が、リンカーを介して細胞毒性または静細胞物質にコンジュゲート化されている、請求項7に記載のヒト化抗体。
- リンカーが切断可能なペプチドリンカーである、請求項8に記載のヒト化抗体。
- 切断可能なペプチドリンカーが、式:
−Aa−Ww−Yy−
(式中、
-A-は伸長単位である;
aは0または1である;
各-W-は、独立して、アミノ酸単位である;
wは、独立して、0〜12の範囲の整数である;
-Y-はスペーサー単位である;および
yは0、1または2である)
を有する、請求項9に記載のヒト化抗体。 - リンカーがヒト化抗体のシステイン残基に結合される、請求項8〜10のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 細胞毒性または静細胞物質が抗チューブリン物質である、請求項7〜11のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 細胞毒性または静細胞物質がオーリスタチンである、請求項7〜11のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンFである、請求項13に記載のヒト化抗体。
- オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンEである、請求項13に記載のヒト化抗体。
- 抗体薬物コンジュゲートの集団におけるpの平均値が約4である、請求項16に記載のヒト化抗体。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域をコードする核酸。
- 請求項18に記載の核酸を含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項19に記載のベクター。
- 請求項18に記載の核酸を含む宿主細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項21に記載の宿主細胞。
- 抗LIV-1抗体の製造に適した条件下で請求項21または22に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗LIV-1抗体の製造方法。
- 宿主細胞により産生された抗LIV-1抗体を精製することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 抗LIV-1抗体の製造に適した条件下で請求項21または22に記載の宿主細胞を培養すること、宿主細胞により産生された抗LIV-1抗体を収集すること、抗LIV-1抗体をリンカーを介して細胞毒性または静細胞物質にコンジュゲート化することを含む、抗LIV-1抗体薬物コンジュゲートの製造方法。
- リンカーが切断可能なペプチドリンカーである、請求項25に記載の方法。
- 切断可能なペプチドリンカーが、式:
−Aa−Ww−Yy−
(式中、
-A-は伸長単位である;
aは0または1である;
各-W-は、独立して、アミノ酸単位である;
wは、独立して、0〜12の範囲の整数である;
-Y-はスペーサー単位である;および
yは0、1または2である)
を有する、請求項26に記載の方法。 - リンカーが抗LIV-1抗体のシステイン残基に結合される、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞毒性または静細胞物質が抗チューブリン物質である、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞毒性または静細胞物質がオーリスタチンである、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンFである、請求項30に記載の方法。
- オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンEである、請求項30に記載の方法。
- 抗体薬物コンジュゲートの集団におけるpの平均値が約4である、請求項33に記載の方法。
- LIV-1を発現する癌を有するまたはそのリスクのある患者の治療において使用するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載のヒト化抗体を含む組成物。
- 該癌が乳癌、前立腺癌、子宮頸癌またはメラノーマである、請求項35に記載の組成物。
- 乳癌が三重陰性乳癌である、請求項36に記載の組成物。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のヒト化抗体と、生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および補助剤からなる群より選択される1以上の物質とを含む医薬組成物。
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