KR20070040824A

KR20070040824A - 아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체 및 이의 사용방법

Info

Publication number: KR20070040824A
Application number: KR1020077004986A
Authority: KR
Inventors: 아논 로젠탈; 자우메 폰즈; 웨이-시엔 호; 얀 마르쿠스 그림
Original assignee: 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2007-04-17
Also published as: JP2012197292A; AP2007003890A0; AU2005290250A1; US7927594B2; KR101068289B1; MA28757B1; EP1781704A2; TNSN07031A1; BRPI0513959A; KR20090046974A; US8268593B2; CA2575663C; TW200617023A; NO20066058L; MX2007000998A; JP5042828B2; WO2006036291A3; EP2298807A2; US20060057702A1; GEP20115195B

Abstract

아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체 9TL 및 9TL로부터 유래된 항체, 및 알쯔하이머병 및 Aβ 펩티드 관련 질병의 진단 및 치료를 위한 이것의 사용 방법이 기재되어 있다. 알쯔하이머병 및 Aβ 펩티드 관련 질병의 치료를 위해, 손상된 이펙터 기능을 갖는 아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체의 사용 방법이 또한 기재되어 있다.

아밀로이드-베타 펩티드, 모노클로날 항체, 알쯔하이머병, Aβ 펩티드 관련 질병, 이펙터 기능

Description

아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체 및 이의 사용 방법 {ANTIBODIES DIRECTED AGAINST AMYLOID-BETA PEPTIDE AND METHODS USING SAME}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 미국 임시출원 일련번호 60/592,494호 (2004년 7월 30일); 60/653,197호 (2005년 2월 14일); 및 60/676,093호 (2005년 4월 29일) (이들은 모두 그 전체내용이 참고문헌으로 포함된다)의 우선권주장을 청구한다.

본 발명은 아밀로이드-베타 펩티드에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알쯔하이머병과 같은 질병의 치료 및/또는 예방에서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

연방 후원 연구 또는 개발에 관한 언급

적용되지 않음

알쯔하이머병(AD)은 임상적으로 진행성 기억 결핍, 혼돈, 점진적인 신체 황폐 및 궁극적으로 사망을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 질환이다. 전세계적으로 대략 천오백만 명의 사람이 알쯔하이머병을 앓고 있으며, 그 수는 수명 증가에 따라 극적으로 증가할 것으로 예상된다. 조직학적으로, 질병은 주로 연합 피질, 변연계 및 기저 핵에서 발견되는 신경성 플라크를 특징으로 한다. 이러한 플라크의 주 성 분은 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ)이고, 이것은 베타 아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP 또는 APP)의 절단 생성물이다. APP는 커다란 딴곳 N-말단 도메인, 경막 도메인 및 작은 세포질 C-말단 꼬리를 함유하는 유형 I 경막 당단백질이다. 염색체 21에서 단일 APP 유전자의 전사물의 대체 스플라이싱에 의하여, 아미노산의 수가 다른 몇 가지 이소형태가 얻어진다.

Aβ는 알쯔하이머병의 신경병증에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 질병의 가족성 형태는 APP 및 프레제닐린 유전자에서의 돌연변이에 연관된다 [Tanzi 등, 1996, Neurobiol.Dis. 3:159-168; Hardy, 1996, Ann.Med. 28:255-258]. 이러한 유전자에서의 질병-관련 돌연변이는, 아밀로이드 플라크에서 발견되는 주된 형태인 Aβ의 42-아미노산 형태의 생산을 증가시켰다. 또한, APP의 질병-관련 돌연변이 형태를 과다발현하는 트랜스제닉 마우스를 인간 Aβ로 면역화하는 것은 플라크 부하 및 관련된 병변을 감소시키고 [Schenk 등, 1999, Nature 400: 173-177; WO 99/27944], Aβ에 대해 지시된 항체의 말초 투여는 뇌에서의 플라크 부하를 감소시킨다 [bard 등, 2000, Nature Medicine 6(8): 916-919; WO 2004/032868; WO 00/72880].

소교세포 및/또는 포식세포에 의한 Fc-매개 포식작용이 생체내에서 플라크 제거 과정에 중요한 것으로 보고되어 있다. 문헌 [Bard 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 100, 2023-2028 (2003)]. 그러나, 비-Fc-매개 메카니즘이 면역요법에 의해 생체내에서 아밀로이드-β의 정화에 관련되는 것으로 또한 보고되어 있다. 문헌 [Bacskai 등, J.Neurosci.22: 7873-7878 (2002); Das 등, J.Neurosci. 23: 8532- 8538 (2003)].

따라서, 항체 요법은 알쯔하이머병의 치료 및 예방에서 유망한 접근법을 제공한다. 그러나, Aβ1-42를 포함하는 백신으로의 인간 임상 시험은 환자의 부분집단에서의 수막뇌염에 기인하여 중지되었다. 문헌[Orgogozo 등, Neurology 61:7-8 (2003); Ferrer 등, Brain Pathol. 14:1 1-20 (2004)]. N-말단 특이적 항-Aβ 항체로의 수동적 면역화는, 주로 광범위 아밀로이드를 상당히 감소시키지만, 아밀로이드 플라크의 연령-관련 발생 및 신경퇴화 뿐만 아니라 인간 AD 뇌에서 발견되는 것과 유사한 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 나타내는 트랜스제닉 마우스에서 뇌 미세출혈 빈도의 증가를 유도하는 것으로 보고되어 있다. [Pfeifer 등, Science 298: 1379 (2002)]. 베타-아밀로이드에 지시된 항체로의 수동 면역화에 의해 유발되는 APP 트랜스제닉 마우스에서의 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)-관련 미세출혈의 악화는, 아밀로이드 베타 펩티드의 침착된 형태의 항체 인식에 의존되는 것으로 제안되었다. [Racke 등, J.Neurosci. 25: 629-636 (2005)]. 염증 위험을 감소시키기 위하여, 아밀로이드 침착물의 펩티드 성분에 대한 항체 (Fc 영역이 없는 항체)로의 수동 면역화가 제안되었다. WO 03/086310. 개선된 효능 및 안전성 프로파일을 갖고 인간 환자에서 사용하기 위해 적절한, Aβ에 대해 지시된 항체 및 다른 면역요법 약제가 여전히 요구되고 있다.

본 출원에 걸쳐서, 다양한 공보(특허 및 특허출원 포함)가 참조된다. 이러한 공보들의 개시내용은 그 전체내용이 여기서 참고문헌으로 포함된다.

발명의 요약

섹션 I

본 발명은 대상체의 뇌에서 단백질의 이상 침착을 특징으로 하는 질병의 치료 방법을 제공한다. 방법은, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 단백질 또는 단백질 침착물에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 알쯔하이머병, 다운 증후군, 다발경색 치매, 경도 인지 장애 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 같은, 대상체에서 Aβ의 아밀로이드 침착(예를 들어, 뇌 조직 및 대뇌 혈관계에서의 침착)과 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 방법은, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집 형태에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알쯔하이머병과 같이 대상체에서 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 질병과 연관되는 증상 발생을 지연시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상 체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크의 형성 및/또는 아밀로이드 축적을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌(뇌 조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대뇌 혈관계에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 순환 계통에서 일어난다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크 및/또는 아밀로이드 축적을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크가 대상체의 뇌(뇌 조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크가 대뇌 혈관계에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 순환 계통에서 일어난다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크 및/또는 아밀로이드 축적의 제거 또는 정화 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌(뇌조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대뇌 플라크에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 대뇌 계통에서 일어난다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체와 조직을 접촉시키는 것을 포함하는, 조직에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Aβ 펩티드 (예컨대 가용성, 올리고머 및 침착된 형태)의 감소 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, Aβ 펩티드의 축적이 뇌에서 억제되고/되거나 감소된다. 일부 구현양태에서, Aβ 펩티드의 독성 효과가 억제되고/되거나 감소된다. 따라서, Aβ 펩티드의 축적이 존재하거나 의심되는 질병, 예컨대 알쯔하이머병, 다운 증후군, 파킨슨씨 병 및 다발 경색 치매를 치료하기 위하여 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 항체가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알쯔하이머병과 같이 대상체에서 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 질병과 연관된 인지 저하를 반전시키거나 인지를 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 항체가 천연 발생 Fc 영역으로부터의 변형을 갖는 Fc 영역을 포함하고 이 변형에 의해 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, Aβ의 아밀로이드 침착과 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 항체의 투여는 변형을 갖지 않은 항체의 투여에 비하여, 대뇌 미세출혈을 덜 일으킨다.

여기에 기재된 방법을 위하여, Aβ 펩티드 또는 Aβ 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드가 사용될 수도 있다. 일부 구현양태에서, 폴리펩티드는 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체로부터 유래된 서열(예를 들어, 하나 이상의 CDR)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 폴리펩티드는 항체 6G로부터 유래된 서열(예, 하나 이상의 CDR)을 포함한다.

본 발명의 방법을 위해 사용되는 항체 및 폴리펩티드는 Aβ 펩티드 또는 Aβ펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하지만 손상된 이펙터 기능을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 F(ab')₂ 단편이 아니다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Fab 단편이 아니다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 단쇄 항체 scFv가 아니다.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 손상된 이펙터 기능을 갖는 중 쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, Fc 영역에서의 N-글리코실화가 제거된다. 일부 구현양태에서, Fc 영역은 N-글리코실화 인식 서열 내에서 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 항체 또는 폴리펩티드의 Fc 영역은 N-글리코실화되지 않는다. 일부 구현양태에서, Fc 영역은 PEG화된다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역이다: A330P331 내지 S330S331 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김). 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 하기 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다: F233F234L235 내지 P233V234A235.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ펩티드의 잔기 1-16 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ펩티드의 N-말단에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 16-28 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체는 Aβ펩티드의 C-말단 측 위의 에피토프, 예컨대 아미노산 25 또는 그 이후에서 출발한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항체는 C-말단 끝이 잘린 Aβ펩티드의 자유 C-말단 아미노산, 예를 들어 Aβ 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43에 특이적으로 결합할 수도 있다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 잔기 28-40 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드가 Aβ_1-42 펩티드의 잔기 28-42 내의 에피토프 에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-43 펩티드의 잔기 28-43 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 전체-길이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 결합하지 않으면서 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 가용성 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 응집된 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태 및 가용성 형태 양쪽 모두에 특이적으로 결합한다.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40의 C-말단 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 35-40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 36-40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40에 특이적으로 결합하지만 Aβ_1-42 및/또는 Aβ_1-43 에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 구현양태에서, 항체는 항체 9TL 또는 여기에 기재된 9TL로부터 유래된 항체의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40에 대한 항체 9TL 및/또는 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 대한 결합에 비해 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체는 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40위의 에피토프에 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체는 항체 6G 또는 여기에 기재된 6G로부터 유래된 항체의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ에 대한 항체 6G 또는 6G로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다.

Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드의 투여는, 정맥내, 피하내, 흡입, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내, 비경구, 경막내 및 복막내 투여를 포함하여 당 기술분야에 공지된 수단에 의해 수행될 수도 있다. 투여는 전신적, 예를 들어 정맥내일 수 있거나 또는 국소적일 수 있다. 이것은 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본 발명은 또한, Aβ 펩티드 또는 Aβ 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, Aβ 펩티드 또는 Aβ 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 포함하는 하나 이상의 제 약 조성물을 포함하는 키트 및 조성물을 제공한다. 적절한 지시에 따라 제공되는 적절한 포장 내의 키트는 여기에 기재된 방법을 위해 유용하다.

본 발명은 또한, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 첫번째 인간화 항체를 선택하고; 첫번째 인간화 항체에 비해 손상된 이펙터 기능을 갖는 치료적 인간화 항체를 제공하기 위하여, 항체의 Fc 영역을 변경시키는 것을 포함하는, 인간 대상체의 뇌에서 Aβ 펩티드의 아밀로이드 침착과 관련된 질병의 치료를 위하여 치료적 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다.

섹션 II

여기에 개시된 발명은 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합된 항체에 관한 것이다 (표 4에 나타낸 서열 15). 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-6124 및 PTA-6125를 갖는 발현 벡터에 의해 생성된 항체 9TL (바꾸어 "9TL"이라고 명명됨)이다. 9TL의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도 1에 나타낸다. 항체 9TL의 상보성 결정 영역(CDR) 부분 (코티아(Chothia) 및 카뱃(Kabat) CDR 포함)을 도 1에 또한 나타낸다. 9TL의 전체 영역의 일부에 대한 언급은 ATCC 수탁번호 PTA-6124 및 PTA-6125을 갖는 발현 벡터에 의해 생성된 서열 및/또는 도 1에 나타낸 서열을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 9TL의 항체 변형체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 단편 또는 영역을 포함하는 항체이다. 하나의 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄이다. 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 중쇄이다. 또 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 구현양태에서, 단편은 도 1에 나타낸 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 하나 이상의 CDR을 함유한다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음 중의 하나 이상: a) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 하나 이상의 CDR 또는 그의 변형체; b) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 중쇄로부터 CDR H3; c) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 CDR L3; d) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 3개의 CDR; e) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 중쇄로부터 3개의 CDR; f) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 3개의 CDR 및 중쇄로부터 3개의 CDR을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수도 있거나 아닐 수도 있음)를 제공한다. 본 발명은 또한, 다음 중의 하나 이상: a) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체로부터 유래된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개) CDR; b) 항체 9TL의 중쇄로부터의 CDR H3으로부터 유래된 CDR; 및/또는 c) 항체 9TL의 경쇄로부터의 CDR L3로부터 유래된 CDR을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수도 있거나 아닐 수도 있음)를 제공한다. 일부 구현양태에서, CDR은 도 1에 나타낸 CDR이다. 일부 구현양태에서, 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체로부터 유래된 하나 이상의 CDR은, 9TL 또는 그의 변형체의 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4 개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 CDR과 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일하다.

일부 구현양태에서, CDR은 카뱃 CDR이다. 다른 구현양태에서, CDR은 코티아(Chothia) CDR이다. 다른 구현양태에서, CDR은 카뱃 및 코티아 CDR의 조합이다 (또한, "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"이라 명명됨). 다시 말해서, 하나 이상의 CDR을 함유하는 주어진 구현양태에서, CDR은 카뱃, 코티아 및/또는 이들의 조합일 수도 있다.

일부 구현양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 서열 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 L1은 L, V 또는 I이고; Y2는 Y 또는 W이고; S3은 S, T 또는 G이고; L4는 L, R, A, V, S, T, Q 또는 E이고; V6은 V, I, T, P, C, Q, S, N 또는 F이고; Y7은 Y, H, F, W, S, I, V 또는 A이다. 일부 구현양태에서, 아미노산 서열은 중쇄 가변 영역에서 CDR3이다. 편의상, 본 명세서에서 또는 아미노산을 일컬을 때 "이다"는, 서열에서의 위치를 참조하여 주어진 위치를 위한 아미노산(들)의 선택을 가리킨다. 예를 들어 "L1은 L, V 또는 I 이다"는 서열 5에서 위치 1에서의 아미노산 L이 V 또는 I로 치환될 수도 있음을 가리킨다.

일부 구현양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 서열 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Y8은 Y, A 또는 H이고, A11은 A 또는 S이고, K12는 K 또는 A이다. 일부 구현양태에서, 아미노산 서열은 경쇄 가변 영역에서 CDR1이다.

일부 구현양태에서, 폴리펩티드(예컨대 항체)는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 L1은 L, M, N, C, F, V, K, S, Q, G, S이고, G3은 G, S 또는 T이고, 여기서 T4는 T 또는 S이고; H5는 H 또는 L이고; Y6은 Y, P, A, W, Q, M, S 또는 E이고; V8은 V, L, K, H, T, A, E 또는 M이고; L9은 L, I, T, S 또는 V이다. 일부 구현양태에서, 아미노산 서열은 경쇄 가변 영역에서 CDR3이다.

일부 구현양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 (a) 서열 3에 나타낸 CDR1 영역; (b) 서열 4에 나타낸 CDR2 영역; 및 (c) 서열 5에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 L1은 L, V 또는 I이고; Y2는 Y 또는 W이고; S3은 S, T 또는 G이고; 여기서 L4는 L, R, A, V, S, T, Q 또는 E이고; V6는 V, I, T, P, C, Q, S, N 또는 F이고; Y7은 Y, H, F, W, S, I, V 또는 A이다.

일부 구현양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 (a) 서열 6에 나타낸 CDR1 영역 (여기서 Y8은 Y, A 또는 H이고; A11은 A 또는 S이고; K12는 K 또는 A이다); (b) 서열 7에 나타낸 CDR2 영역; 및 (c) 서열 8에 나타낸 CDR3 영역 (여기서 L1은 L, M, N, C, F, V, K, S, Q, G, S이고, 여기서 G3은 G, S 또는 T이고, T4는 T 또는 S이고, H5는 H 또는 L이고, Y6은 Y, P, A, W, Q, M, S 또는 E이고, V8은 V, L, K, H, T, A, E 또는 M이고; L9는 L, I, T, S 또는 V이다)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 모노클로날이다. 일부 구현양태에서, 항체 (또는 폴리펩티드)가 단리된다. 일부 구현양태에서, 항 체(또는 폴리펩티드)가 실질적으로 순수하다.

항체의 중쇄 불변 영역은 임의의 유형의 불변 영역, 예컨대 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE; 및 임의의 이소형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4으로부터의 영역일 수 있다.

일부 구현양태에서, 항체는 개질된 불변 영역, 예컨대 면역학적 불활성 (부분적 면역학적 불활성을 포함하고, 용어 "손상된 이펙터 기능을 갖는"과 서로 바꾸어 사용할 수 있다)인 불변 영역, 예를 들어 보체 매개 용균을 유발하지 않거나, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화시키지 않는 불변 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur.J.Immunol.(1999) 29: 2613-2624; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 9809951.8]에 기재된 바와 변형된다. 다른 구현양태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다. 문헌[Eur.J.Immunol. (1999) 29: 2613-2624]. 일부 구현양태에서, 항체는 하기 돌연변이: E233F234L235 내지 P233V234A235를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위하여 글리코실화된다. 일부 구현양태에서, 불변 영역에서 올리고당 부착 잔기(예컨대 Asn297) 및/또는 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 인접 잔기를 돌연변이시킴으로써 N-연결된 글리코실화를 위해 불변 영역을 글리코실화한다. 일부 구현양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위해 글리코실화된다. 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위하여 효소적으로 또는 글리코실화 결여 숙주 세포에서의 발현에 의하여 글리코실화될 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 단편 또는 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (단리될 수도 있음)를 제공한다. 하나의 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄이다. 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 중쇄이다. 또 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 구현양태에서, 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6개) 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.

다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(단리될 수도 있음)이다. 일부 구현양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 모두를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 항체 (항체 단편 포함) 또는 폴리펩티드의 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(발현 및 클론화 벡터 포함) 및 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현양태에서, 벡터는 ATCC No.PTA-6124를 갖는 pDb.9TL.hFc2a이다. 다른 구현양태에서, 벡터는 ATCC No.PTA-6125를 갖는 pEb.9TL.hK이다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 숙주 세포이다.

다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체에 의해 결합된 Aβ_1-40의 복합체이다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 항체 또는 폴리펩티드에 의해 결합된 Aβ_1-40의 복합체이다.

다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 (항체 9TL의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 같은 항체 포함) 또는 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유효량 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.

다른 측면에서, 본 발명은 항체 9TL를 생산할 수 있는 조건 하에서 숙주 세포 또는 그의 자손을 배양하고 (여기서 숙주 세포는 항체 9TL를 코딩하는 발현 벡터를 포함한다), 일부 구현양태에서 항체 9TL을 정제하는 것을 포함하는 항체 9TL의 생성 방법이다. 일부 구현양태에서 발현 벡터는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열의 하나 또는 양쪽 모두를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 항체 (단일 경쇄 또는 중쇄로서 별도로 발현될 수도 있거나, 또는 하나의 벡터로부터 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두가 발현된다) 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 적절한 세포에서 발현한 다음, 일반적으로 주요 항체 또는 폴리펩티드를 회수하고/하거나 단리함으로써 여기에 기재된 항체 또는 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 알쯔하이머병 및 변경된 Aβ 또는 βAPP 발현, 또는 Aβ펩 티드의 축적과 연관된 다른 질병, 예컨대 다운 증후군, 파킨슨씨 병, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 및 AIDS를 예방하거나, 치료하거나, 억제하거나 또는 그의 발생을 지연시키는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 항체, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 대상체에게 항체, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 알쯔하이머병 또는 Aβ 펩티드의 축적에 관련된 다른 질병과 연관된 증상의 발생을 지연시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크의 형성 및/또는 아밀로이드 축적을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌 (뇌 조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 순환 계통에서 일어난다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크 및/또는 아밀로이드 축적을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌 (뇌 조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 순환 계통에서 일어난다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크 및/또는 아밀로이드 축적을 제거하거나 정화시키는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌 (뇌 조직)에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드 축적은 순환 계통에서 일어난다.

추가로, 본 발명은 조직을 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 조직에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 뇌에서 Aβ 펩티드 (예컨대 가용성 올리고머 및 침착된 형태)의 감소 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, Aβ 펩티드의 축적이 뇌에서 억제되고/되거나 감소한다. 일부 구현양태에서, Aβ 펩티드의 독성 효과가 억제되고/되거나 감소한다. 따라서, Aβ 펩티드의 축적이 존재하거나 의심되는 질병, 예컨대 알쯔하이머병, 다운 증후군, 파킨슨씨 병, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증을 치료하기 위해 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 질병과 연관된 인지를 개선시키거나 인지 저하를 반전시키는 방법을 제공한다.

여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현양태에서, 항체는 항체 9TL이다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 알쯔하이머병 및 변경된 Aβ 또는 βAPP 발현과 연관된 기타 질병, 예컨대 다운 증후군 및 AIDS의 검출, 진단 및 검사에서 사용될 수 있다. 방법은 변경된 Aβ 또는 βAPP 발현을 갖는 것으로 의심되는 환자의 견본을 본 발명의 항체와 접촉시키고, Aβ 또는 βAPP의 수준이 대조 또는 비교 견본의 수준과 다른지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-Aβ항체의 투여 전 및 후에 Aβ의 혈청 수준을 측정하고; Aβ의 혈청 수준의 증가를 평가한다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 투여는 정맥내, 피하내, 흡입, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내, 비경구, 경막내 및 복막내 투여를 포함하여 당 기술분야에 공지된 수단에 의해 수행될 수도 있다. 투여는 전신적, 예를 들어 정맥내일 수 있거나 또는 국소적일 수 있다. 이것은 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트 및 조성물을 제공한다. 일반적으로 적절한 포장으로 존재하고 적절한 지시가 제공된 이러한 키트가 여기에 기재된 방법을 위해 유용하다.

도 1은 9TL 항체의 중쇄 가변 영역(서열 1) 및 경쇄 가변 영역(서열 2)의 아미노산 서열을 나타낸다. 카뱃 CDR은 굵은 문자로 나타내고 코티아 CDR은 밑줄을 긋는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 위한 아미노산 잔기를 연속적으로 번호를 매긴다.

도 2는 펩티드 경쟁에 의한 항체 9TL의 에피토프 지도를 나타낸다. Aβ_1-40 펩티드를 SA 칩 위에 고정화한다. 모노클로날 항체 2289 및 9TL Fab 단편 (각각 50 nM)을 각각 10μM 각종 펩티드 (아미노산 28-40, 1-40, 1-28, 28-42, 22-35, 1-16, 1-43, 33-40, 1-38 또는 17-40의 Aβ) 또는 펩티드 없이 1시간동안 예비배양한 다음, 칩 위에 유동시킨다. 고정화된 Aβ_1-40 펩티드에 대한 항체 Fab 단편의 결합을 측정하였다.

도 3은 펩티드 경쟁에 의한 항체 2H6의 에피토프 지도를 나타내는 그래프이다. Aβ_1-40 펩티드를 SA 칩 위에 고정화하였다. 모노클로날 항체 2289, 2286 또는 2H6 (각각 100nM)는 각각 16μM 각종 펩티드 (아미노산 1-16, 1-28, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43, 17-40, 17-42, 22-35, 25-35 또는 33-40의 Aβ) 또는 펩티드 없이 1시간동안 예비배양한 다음, 칩 위에 유동시킨다. 고정화된 Aβ_1-40 펩티드에 대한 항체의 결합을 측정하였다.

도 4는 상이한 Aβ 펩티드 C-말단 변형체에 대한 항체 2H6, 2286 및 2289의 결합을 나타내는 그래프이다. GST-Aβ 변형체 (M35A, V36A, G37A, G38A, V39A 또는 V40A) 또는 GST-Aβ 펩티드 1-39, 1-41, 1-40, 1-42를 ELISA 플레이트 위에 고정화하였다. 모노클로날 항체 2286, 2H6 또는 2289 (각각 0.3nM의 mAb)를 각각의 고정화된 펩티드와 함께 배양하고, 비오티닐화 항-마우스 IgG (H+L)와 더욱 배양한 다음 스트렙타비딘-HRP와 배양함으로써 그들의 결합을 검출하였다.

도 5는 2H6 및 탈글리코실화 2H6으로의 항체 처리 16주 후에 APP-트랜스제닉 마우스에서의 공간 학습 결손이 반전됨을 나타내는 그래프이다. 마우스를 방사성 수중 미로의 2-일 변형법으로 시험하였다. Y-축은 2-일 시도 기간에 걸쳐 행해진 오류의 평균 횟수를 나타낸다. 블록 번호 1-5는 1일에서의 시험을 나타내고; 블록 번호 6-10은 2일에서의 시험을 나타낸다. "*"는 항-AMN 항체 처리된 마우스 (A-AMN)과 비교할 때 2H6(A-2H6) 및 탈글리코실화 2H6(A-De-2H6) 처리된 마우스의 양쪽 모두에 대해 p<0.05를 나타낸다. "**"는 항-AMN 항체 처리된 마우스 (A-AMN)과 비교할 때 2H6(A-2H6) 및 탈글리코실화 2H6(A-De-2H6) 처리된 마우스의 양쪽 모두에 대해 p<0.01를 나타낸다.

도 6A 및 6B는 2H6, 항-AMN (AMN이라 일컬어짐) 및 탈글리코실화 2H6(D-2H6이라 일컬어짐) 항체로의 처리 16주 후에 해마(도 6B) 및 전두 피질(도 6A)에서 실질내 콩고-레드 염색 아밀로이드-베타 펩티드의 감소를 나타내는 그래프이다. 도 6A 및 6B에서의 Y-축은 콩고-레드 염색에 대해 포지티브인 퍼센트 면적의 평균을 나타낸다. 도 6A 및 6B에서의 X-축은 투여된 항체의 유형을 나타낸다.

도 7A 및 7B는 2H6, 항-AMN (AMN이라 일컬어짐) 및 탈글리코실화 2H6(D-2H6이라 일컬어짐) 항체로의 처리 16주 후에 해마(도 7A) 및 전두 피질(도 7B)에서 혈관내 콩고-레드 염색 아밀로이드-베타 펩티드의 증가를 나타내는 그래프이다. 도 7A 및 7B에서의 Y-축은 콩고-레드 염색에 대해 포지티브인 퍼센트 면적의 평균을 나타낸다. 도 7A 및 7B에서의 X-축은 투여된 항체의 유형을 나타낸다.

도 8은 2H6, 항-AMN (AMN이라 일컬어짐) 및 탈글리코실화 2H6(D-2H6이라 일컬어짐) 항체로의 처리 16주 후에 프루시안 블루 포지티브 프로파일의 수를 나타내는 그래프이다. Y-축은 구획 당 포지티브 프로파일을 나타낸다. X-축은 투여된 항체의 유형을 나타낸다.

도 9는 APP Tg2576 마우스에서 항-AMN 항체 (AMN이라 일컬어짐), 항체 2H6 (2H6이라 일컬어짐), 탈글리코실화 2H6 (2H6-D라 일컬어짐)의 투여 후 및 야생형(WT) 마우스에서 항-AMN 항체 및 항체 2H6의 투여 후에 Aβ 펩티드의 혈청 수준을 나타내는 그래프이다.

도 10은 2H6 항체(A) 또는 탈글리코실화 2H6 항체(B)의 두개골내 투여 후 마우스의 해마에서 CD45의 면역염색을 나타낸다. 하부 패널은, 대조 항체, 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개골내 투여 후에 전두 피질 및 해마에서 주입되지 않은 측면에 비하여 주입된 측면의 CD45 포지티브 염색으로 차지된 평균 면적의 비율을 나타낸다. "**"는 대조 항체에 비하여 P<0.01을 나타낸다.

도 11은 2H6 항체(A) 또는 탈글리코실화 2H6 항체(B)의 두개골내 투여 후 마우스의 해마에서 Fcγ 수용체의 면역염색을 나타낸다. 하부 패널은 대조 항체, 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개골내 투여 후에 전두 피질 및 해마에서 주입되지 않은 측면에 비하여 주입된 측면의 Fcγ 수용체 포지티브 염색으로 차지된 평균 면적의 비율을 나타낸다. "**"는 대조 항체에 비하여 P<0.01을 나타낸다.

도 12는 2H6 항체(A) 또는 탈글리코실화 2H6 항체(B)의 두개골내 투여 후 마 우스의 해마에서 Aβ 펩티드의 면역염색을 나타낸다. 하부 패널은 대조 항체, 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개골내 투여 후에 전두 피질 및 해마에서 주입되지 않은 측면에 비하여 주입된 측면의 Aβ 포지티브 염색으로 차지된 평균 면적의 비율을 나타낸다. "**"는 대조 항체에 비하여 P<0.01을 나타낸다. "*"는 대조 항체에 비하여 P<0.05를 나타낸다.

도 13은 2H6 항체(A) 또는 탈글리코실화 2H6 항체(B)의 두개골내 투여 후 마우스의 해마에서 티오플라빈-S를 나타낸다. 하부 패널은 대조 항체, 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개골내 투여 후에 전두 피질 및 해마에서 주입되지 않은 측면에 비하여 주입된 측면의 티오플라빈-S 포지티브 염색으로 차지된 평균 면적의 비율을 나타낸다. "*"는 대조 항체에 비하여 P<0.05를 나타낸다.

도 14는 ELISA에 의한 항체 2294 및 6G의 에피토프 지도를 나타낸다. 다양한 Aβ 펩티드를 ELISA 플레이트 위에 고정화시켰다. 다양한 고정화 펩티드로 항체를 1시간동안 배양하였다. 염소 항-인간 카파 HRP 접합 2차 항체를 사용하여, 고정화된 Aβ 펩티드에 결합된 항체 6G를 측정하였다. 중쇄 및 경쇄에 결합하는 염소 항-마우스를 사용하여 고정화된 Aβ 펩티드에 결합된 항체 2294를 측정하였으며, 이것은 HRP 접합된 2차 항체이다. "NB"는 결합이 검출되지 않음을 가리킨다. 세로줄에서 "2294" 및 "6G"로 나타낸 숫자는 450nm에서의 흡광도를 나타낸다.

여기에 개시된 본 발명은 Aβ_1-40의 C-말단에 결합된 항체 및 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 항체 및 폴리펩티드는 표 3에 나타낸 9TL 또는 그의 변형체로부터 유래된다. 본 발명은 이러한 항체의 형성 및 사용 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 본 발명은 항체 9TL, 및 이러한 항체의 형성 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 Aβ_1-40에 결합하는 9TL 폴리펩티드 (항체 포함) 및 9TL 항체 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

여기에 개시된 본 발명은, 항체 9TL 또는 9TL로부터 유도된 항체 또는 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여함으로써, 개체에서 알쯔하이머병, 다운 증후군, 파킨슨씨 병, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 같은 Aβ-관련 질병, 혈관에서 Aβ 펩티드의 침착에 의해 유발된 혈관 질환 (예컨대 졸중 및 HCHWAD)의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은, 항체 또는 폴리펩티드가 손상된 이펙터 기능을 갖는 것인, β-아밀로이드 펩티드 또는 Aβ 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩티드, 또는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 개체에게 투여함으로써 개체에서 알쯔하이머병, 다운 증후군, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애, 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 같은, 개체에서의 β-아밀로이드 침착과 관련된 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

일반적 기술

본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 당 분야의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 일반적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (Sambrook 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait,ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I.Freshney,ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather and P.E.Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A.Doyle, J.B.Griffiths, 및 D.G.Newell, eds., 1993-1998) J.Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller and M.P.Calos, eds. 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel 등, eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A.Janeway and P.Travers, 1997); Antibodies (P.Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D.Catty.,ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P.Shepherd and C.Dean,eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E.Harlow and D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M.Zanetti and J.D.Capra,eds., Harwood Academic Publishers, 1995)에 충분히 설명되어 있다.

정의

"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 여기서 사용된 용어들은 원상태 폴리클로날 또는 폴리클로날 항체 뿐만 아니라, 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬(ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 다른 변형 형태를 포함한다. 항체는 임의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위-부류)를 포함하고, 항체는 특정한 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 의존하여, 면역글로불린을 상이한 부류로 지정할 수 있다. 5개 주요 부류의 면역 글로불린: : IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇 가지는 하위 부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 부른다. 다른 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3-차원 형태가 공지되어 있다.

여기서 사용된 바와 같이, "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 가리키며, 다시말해서 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 집단을 구성하는 각각의 항체가 동일하다. 모노클로날 항체는 고 특이성이고, 단일 항원 부위에 대항하여 지시된다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제조와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 위의 단일 결정인자에 대항하여 지시된다. 변경인자 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내고, 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 미국 특허 4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[McCafferty 등, 1990, Nature, 348: 552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

여기서 사용된 "인간화" 항체란, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특정한 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 항체의 기타 항원-결합 서열)인 비-인간(예, 마우스) 항체의 형태를 가리킨다. 대부분, 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)이 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체되어진 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는, 수용체 항체에서도 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 더욱 정련하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하고, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 일치 서열의 것이다. 인간화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인의 적어도 일부(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572호에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수도 있다. 인간화 항체의 다른 형태는 원래 항체에 비해 변경된 하나 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 가지며, 이것은 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR이라 일컬어진다.

여기서 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생성되거나 및/또는 당 기술분야에 공지되거나 여기에 개시되어 있는 인간 항체의 형성 기술을 사용하여 만들어진 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 이러한 한가지 예는 마우스 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되고, 이때 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 [Vaughan 등, 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets 등, 1998, PNAS (USA) 95: 6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J.Mol.Biol., 227: 381; Marks 등, 1991, J.Mol.Biol., 222:581]. 인간 항체는 인간 면역글로불린 좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내에 도입함으로써 형성될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425호 및 5,661,016호에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대항하여 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화될 수도 있다). 예를 들어 문헌[Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p.77 (1985); Boerner 등, 1991, J.Immunol., 147(1): 86-95; 및 미국 특허 5,750,373] 참조.

여기서 사용된 용어 "9TL" 및 "항체 9TL"은, ATCC PTA-6124 및 ATCC PTA-6125의 수탁 번호를 갖는 발현 벡터에 의해 생성되는 항체를 가리키기 위하여 서로 바꾸어 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도 1에 나타낸다. 항체 9TL (코티아 및 카뱃 CDR)의 CDR 부분을 도 1에 개략적으로 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 서열 9 및 서열 10에 나타낸다. 9TL의 특징을 실시예에 기재한다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 어떠한 길이의 아미노산의 중합체를 가리키기 위하여 서로 바꾸어 사용된다. 중합체는 직쇄 또는 분지쇄일 수도 있고, 이것은 변형 아미노산을 포함할 수도 있고 비-아미노산에 의해 단속될 수도 있다. 용어는 자연적으로 또는 간섭, 예를 들어 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형되어진 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어 비자연적 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 당 기술분야에 공지된 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 하기 때문에, 폴리펩티드가 단일 사슬 또는 관련된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.

여기서 서로 바꾸어 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이란, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 가리키고 DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수도 있다. 존재한다면, 중합체의 조립 전 또는 후에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 부여될 수도 있다. 비-뉴클레오티드 성분에 의하여 뉴클레오티드의 서열이 중단될 수도 있다. 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의하여 폴리뉴클레오티드가 더욱 변형될 수도 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 "캡(cap)", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 인터뉴클레오티드 변형, 예를 들어 비하전된 결합 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 잔기를 갖는 것, 예를 들어 단백질 (예, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩티드, ply-L-리신 등), 인터칼레이터를 갖는 것 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이터를 함유하는 것 (예를 들어, 금속, 방사능 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합을 갖는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당에 일상적으로 존재하는 히드록실 기의 어느 것이 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합을 형성하도록 활성화될 수도 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수도 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 포스포릴화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소원자의 유기 캡핑 기 잔기로 치환될 수도 있다. 다른 히드록실기는 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 당 기술분야에 일반적으로 알려진 리보스 또는 데옥시리보스의 유사한 형태, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소고리 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵투로스, 비고리형 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안적인 결합 기로 대체될 수도 있다. 이러한 대안적인 결합 기는 이에 한정되지 않지만 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈")로 대체되는 구현양태를 포함하며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르(-O-) 결합을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 앞의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 여기에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역의 단독 또는 조합을 가리킨다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변으로 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)로 구성된다. 각 사슬에서의 CDR은 FR에 의해 밀접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기술이 존재한다: (1) 교잡 종 서열 가변성을 기초로 한 접근법 (즉, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (제5판, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, MD)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 한 접근법 [Al-lazikani 등 (1997) J.Molec.Biol. 273: 927-948]. 여기서 사용된 바와 같이, CDR은 어느 한쪽 접근법 또는 양쪽 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 가리킬 수 있다.

항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역의 단독 또는 조합을 가리킨다.

항체 또는 폴리펩티드에 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" (서로 바꾸어 사용됨) 에피토프는 당 기술분야에서 잘 이해되는 용어이고, 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 분자는, 이것이 대안적인 세포 또는 물질을 사용할 때에 비하여 더욱 빈번히, 더욱 빠르게, 더욱 큰 지속기간으로 및/또는 더욱 큰 친화성으로 특정한 세포 또는 물질과 반응하거나 결합된다면, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체가 다른 물질에 결합되는 것에 비해 더욱 큰 친화성, 친화력으로, 더욱 쉽게, 및/또는 더욱 큰 지속성으로 결합된다면, 이것이 표적에 "특이적으로 결합"되거나 또는 "우선적으로 결합한다". 예를 들어, Aβ_1-40 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 Aβ_1-40 에피토프 또는 비-Aβ_1-40 에피토프에 결합되는 것에 비하여 더욱 큰 친화력, 친화성으로, 더욱 쉽게 및/또는 더욱 큰 지속성으로 이 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 첫번째 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 잔기 또는 에피토프)가 두번째 표적에는 특이적 또는 우선적으로 결합하지 않을 수도 있다는 것을 이해할 수 있다. 그로써, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 독점적인 결합(을 포함할 수 있긴 하지만)을 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 일반적으로, 결합이라는 언급은 우선적 결합을 의미하지만, 반드시 그러한 것은 아니다.

여기서 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물을 갖지 않는), 더욱 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 가리킨다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위하여 벡터(들)에 대한 수용체일 수 있거나 수용체인 개개의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우연적 또는 고의의 돌연변이에 기인하여 반드시 원래의 모세포와 (형태 또는 게놈 DNA 상보성 면에서) 완전히 동일해야할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내에서 감염된 세포를 포함한다.

면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하기 위하여 용어 "Fc 영역"이 사용된다. "Fc 영역"은 미변성 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수도 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수도 있긴 하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 위치 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단으로의 연신으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 번호매김은, 문헌 [Kabat, 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, 미국 미들랜드주 베데스다, 1991]에서와 같이 EU 인덱스의 번호매김이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다.

여기서 사용된 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 미변성 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)이고, 대립 변형체 및 대안적으로 이러한 수용체의 스플라이스 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이것은 그의 세포질 도메인에서 주로 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann.Rev.Immunol., 9: 457-92; Capel 등, 1994, Immunomethods, 4:25-34; 및 de Haas 등, 1995, J.Lab.Clin.Med., 126:330-41]에서 검토된다. "FcR"은 또한 신생아 수용체, FcRn을 포함하고, 이것은 태아로의 모체 IgGs의 전달의 원인이 된다 [Guyer 등, 1976, J.Immunol., 117:587; 및 Kim 등, 1994, J.Immunol., 24:249].

"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재하에서 표적의 조직분해를 가리킨다. 보체 활성화 경로는 보체 체계의 첫번째 성분을 동족 항원과 착화된 분자(예, 항체)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro 등, J.Immunol.Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 것과 같이 CDC 분석을 수행할 수도 있다.

"작용성 Fc 영역"은 미변성 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 갖는다. 일례의 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향-조절 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 결합 도메인과 조합되는 Fc 영역을 필요로 하고 (예를 들어, 항체 가변 도메인), 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위하여 당 기술분야에 공지된 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

"미변성 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변형체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의하여 미변성 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 미변성 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 여전히 보유한다. 바람직하게는, 변형체 Fc 영역은 미변성 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 미변성 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 여기서 변형체 Fc 영역은 미변성 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다.

여기서 사용된 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (FcRs) (예를 들어, 천연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 위의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용균을 유발하는 세포-매개 반응을 가리킨다. 시험관내 ADCC 분석, 예컨대 미국 특허 5,500,362호 또는 5,821,337호에 기재된 분석을 사용하여, 주요 분자의 ADCC 활성을 평가할 수 있다. 이러한 분석을 위해 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 주요 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes 등, 1998, PNAS (USA), 95: 652-656]에 개시된 것과 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다.

여기서 사용된 바와 같이 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 유리하거나 원하는 결과를 실행하기에 충분한 양이다. 예방적 용도를 위하여, 유리하거나 원하는 결과는 위험을 제거하거나 감소시키거나, 심각성을 저하시키거나, 또는 질병의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적 증상, 그의 합병증, 및 질병의 발병 동안에 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질병의 시작을 지연시키는 것과 같은 결과를 포함한다. 치료적 용도를 위하여, 유리하거나 원하는 결과는 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하거나, 저하시키거나 감소시키고, 아밀로이드 플라크를 감소, 제거, 정화하고, 인지를 개선하고, 인지 저하를 반전시키거나 느리게 하고, 생물학적 유체에서 순환하는 가용성 Aβ 펩티드를 격리시키거나 증가시키고, 질병의 발병 동안에 나타나는 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질병으로부터 생긴 하나 이상의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적)을 저하시키고, 질병을 앓고 있는 환자의 삶의 질을 증가시키고, 질병을 치료하기 위해 필요한 다른 약제의 투여량을 저하시키고, 다른 약제의 효과를 증진시키고, 질병의 진행을 지연시키고 및/또는 환자의 생존을 연장시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 치료를 달성하기에 충분한 양이다. 임상 상황에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성되지 않을 수도 있다. 따라서, 하나 이상의 치료제의 투여 상황에서 "유효량"이 고려될 수도 있고, 하나 이상의 다른 약제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 하나의 약제가 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수도 있다.

여기서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하여 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유리하거나 원하는 임상적 결과는 이에 한정되지 않지만 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하거나, 저지하거나 감소시키고, 아밀로이드 플라크를 감소시키거나 제거하거나 또는 정화시키고, 인지를 개선시키고, 인지 저하를 반전 또는 느리게 하고, 생물학적 유체에서 순환되는 가용성 Aβ 펩티드를 격리시키고, Aβ 펩티드 (가용성, 올리고머 및 침착 포함)를 조직(예컨대 뇌)에서 감소시키고, 뇌에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하거나, 느리게 하거나 및/또는 감소시키고, 조직(예컨대 뇌)에서 Aβ 펩티드의 독성 효과를 억제하거나, 느리게 하거나 및/또는 감소시키고, 질병으로부터 생긴 증상을 감소시키고, 질병을 앓고 있는 환자의 삶의 질을 증가시키고, 질병을 치료하기 위해 필요한 다른 약제의 투여량을 감소시키고, 질병의 진행을 지연시키고 및/또는 환자의 생존을 연장시키는 것의 하나 이상을 포함한다.

여기서 사용된 알쯔하이머병의 발병 "지연"은 질병의 발병을 지연시키거나, 방해하거나, 느리게 하거나, 저지하거나, 안정화하거나 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료되어지는 개체에 의존하여 다양한 길이의 시간일 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분하거나 의미있는 지연은 사실상 개체가 질병을 발병하지 않는 예방을 포함한다. 알쯔하이머병의 발병을 "지연"시키는 방법은, 방법을 사용하지 않을 경우와 비교할 때, 주어진 시간 틀에서 질병 발병 가능성을 감소시키고/시키거나 주어진 시간 틀에서 질병의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계상 의미있는 대상체 수를 사용하는 임상 연구를 기초로 한다.

알쯔하이머병의 "발병"은 개체에서 알쯔하이머병의 개시 및/또는 진행을 의미한다. 알쯔하이머병 발병은 여기에 기재된 표준 임상 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 그러나, 발병이란 초기에 검출되지 못할 수도 있는 질병 진행을 가리킨다. 본 발명의 목적을 위하여, 진행은 질병 상태의 생물학적 과정을 가리키고, 이 경우에 표준 신경학적 시험, 환자 인터뷰에 의해 결정되거나 또는 더욱 전문화된 시험에 의해 결정될 수 있다. 다양한 진단 시험은, 이에 한정되지 않지만 뇌영상, 혈청 또는 뇌척수액(예를 들어, 아밀로이드 펩티드 및 Tau)에서 특정 단백질 수준의 변화 검출, 컴퓨터화 단층촬영법 (CT), 및 자기 공명 영상화(MRI)를 포함한다. "발병"은 발생, 재발 및 개시를 포함한다. 여기서 사용된 알쯔하이머병의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.

여기서 사용된, "조합" 투여는 동시 투여 및/또는 상이한 시간에서의 투여를 포함한다. 조합 투여는 공동-제제로서의 투여 또는 개별 조성물로서의 투여를 포함한다. 여기서 사용된, 조합 투여는 항-Aβ 항체 및 기타 약제를 개체에게 투여하는 상황을 포함함을 의미하고, 이것은 동시에 및/또는 별도로 발생할 수 있다. 여기서 더욱 언급된 바와 같이, 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 항-Aβ 항체 및 기타 약제를 투여할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 항-Aβ 항체는 매주 투여될 수 있는 반면, 다른 약제는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 사용하여 항-Aβ 항체 및 기타 약제가 투여될 수 있는 것으로 이해된다.

"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고, 진단 또는 검사 분석에서 사용될 수 있다. 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액체 샘플, 생검 견본 또는 조직 배양액 또는 그로부터 유래된 세포와 같은 고체 조직 샘플 및 그의 자손을 포함한다. 정의는, 예컨대 시약으로의 처리, 가용화, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특정한 성분의 농축, 또는 구획화 목적을 위해 반-고체 또는 고체 기질에 매입함으로써, 획득 후에 어떠한 방식으로 조작되어진 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 배양액 내의 세포, 세포 상층액, 세포 용균물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 샘플을 포함한다.

"개체" (대안적으로 "대상체"라고도 일컬어짐)은 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 이에 한정되지 않지만 농장 동물(예컨대 소), 운동용 동물, 애완 동물(예컨대 고양이, 개, 말), 영장류, 마우스 및 랫트를 포함한다.

여기서 사용된 "벡터"는 숙주 세포에 주요한 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고 바람직하게는 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 이에 한정되지 않지만 바이러스 벡터, 나 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합 제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정한 진핵 세포, 예컨대 생산체 세포를 포함한다.

여기서 사용된 "발현 조절 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 예컨대 구성 또는 유도 프로모터와 같은 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사되어지는 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.

여기서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합될 때 성분이 생물학적 활성을 유지할 수 있고 대상체의 면역 체계와 비-반응성인 물질을 포함한다. 그의 예는 이에 한정되지 않지만 인산염 완충액 염용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제와 같은 표준 제약 담체를 포함한다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위해 바람직한 희석제는 인산염 완충 염수 또는 표준(0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 당 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 제형된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, A.Gennaro ed., Mack Publishing Co., 미국 펜실바니아주 이스톤, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제20판, Mack Publishing, 2000] 참조).

여기서 사용된 용어 "k_on"은 항원에 대한 항체의 결합을 위한 온(on) 속도 상수를 가리키는 것으로 해석된다.

여기서 사용된 용어 "k_off"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리를 위한 오프(off) 속도 상수를 가리키는 것으로 해석된다.

여기서 사용된 용어 "K_D"는 항체-항원 상호작용의 평형상태 해리 상수를 가리키는 것으로 해석된다.

조성물 및 조성물의 제조 방법

항체 9 TL 및 9 TL 유래된 항체 및 폴리펩티드

본 발명은 표 3에 나타낸 항체 9TL 및 그의 변형체 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL 및 그의 변형체로부터 유래된 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물; 및 9TL 항체 및 그의 변형체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 사용된 바와 같이 조성물은 Aβ_1-40의 C-말단에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드(항체일 수도 있거나 아닐 수도 있음), 및/또는 Aβ_1-40의 C-말단에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 당 기술분야에 공지된 완충액을 포함하는 제약상 허용가능한 부형제와 같은 적절한 부형제를 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 (하나 이상의) 하기 특징: (a) Aβ_1-40의 C-말단 펩티드 28-40에 결합하지만 Aβ1-42 또는 Aβ1-43에 의미있게 결합하지 않고; (b) Aβ_1-40의 C-말단 펩티드 33-40에 결합하고; (c) 대상체에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하고; (d) 대상체에서 아밀로이드 플라크를 감소시키고; (e) 알쯔하이머병의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선시키고; (f) 인지 기능을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 다른 보고된 항-Aβ 항체와 반대로 바람직한 안전성 프로파일을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 뇌 혈관계에서의 출혈 (대뇌 출혈); 수막뇌염 (자기 공명 스캔의 변화 포함); 대뇌 척수액에서 높은 백혈구 수; 중추 신경계 염증의 하나 이상을 상당한 또는 허용될 수 없는 수준으로 유발하지 않을 것이다.

따라서, 본 발명은 다음 중의 어느 것, 또는 이를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다: (a) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체; (b) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 단편 또는 영역; (c) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄; (d) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 중쇄; (e) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 하나 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR); (g) 항체 9TL의 중쇄로부터 CDR H3; (h) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 CDR L3; (i) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 3개의 CDR; (j) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 중쇄로부터 3개의 CDR; (k) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 경쇄로부터 3개의 CDR 및 중쇄로부터 3개의 CDR; 및 (l) (b) 내지 (k)중의 어느 하나를 포함하는 항체. 본 발명은 또한 상기 중의 하나 이상의 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

항체 9TL의 CDR 부분 (코티아 및 카뱃 CDR 포함)을 도 1에 개략적으로 나타낸다. CDR 영역의 결정은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 구현양태에서, CDR이 카뱃 및 코티아 CDR의 조합일 수 있는 것으로 이해된다 (또한, "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"로 일컬어짐). 일부 구현양태에서, CDR이 카뱃 CDR이다. 다른 구현양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다시 말해서, 하나 이상의 CDR을 사용한 구현양태에서, CDR은 카뱃, 코티아, 조합 CDR 또는 이들의 조합 중 어느 하나일 수도 있다.

일부 구현양태에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 9TL의 적어도 하나의 CDR, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 모두 6개 CDR 또는 그의 변형체와 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 모두 6개 CDR을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수도 있거나 아닐 수도 있음)를 제공한다. 다른 구현양태는 9TL의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개와 실질적으로 동일하거나 9TL로부터 유래된 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR을 갖는 항체를 포함한다. 일부 구현양태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR은 표 3에 나타낸 9TL 또는 그의 변형체의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 표 3에 나타낸 9TL 또는 그의 변형체에 비하여 활성의 정도가 변할 수도 있긴 하지만(더욱 크거나 더 적을 수도 있다), 본 발명의 목적을 위하여, 결합 특이성 및/또는 전체 활성이 일반적으로 유지되는 것으로 이해된다.

본 발명은 또한, 표 3에 나타낸 9TL의 서열 또는 그의 변형체의 적어도 5개의 연속 아미노산, 적어도 8개 연속 아미노산, 적어도 약 10개 연속 아미노산, 적어도 약 15개 연속 아미노산, 적어도 약 20개 연속 아미노산, 적어도 약 25개 연속아미노산, 적어도 약 30개 연속 아미노산 중의 어느 하나를 갖는 표 3에 나타낸 9TL의 아미노산 서열 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수도 있거나 아닐 수도 있음)를 제공하고, 여기서 아미노산의 적어도 3개가 표 3에 나타낸 9TL의 가변 영역 (도 1) 또는 그의 변형체로부터 얻어진다. 하나의 구현양태에서, 가변 영역은 9TL의 경쇄로부터의 영역이다. 다른 구현양태에서, 가변 영역은 9TL의 중쇄로부터의 영역이다. 일례의 폴리펩티드는 9TL의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 양쪽으로부터의 연속 아미노산 (상기 기재된 길이)을 갖는다. 다른 구현양태에서, 5개 (또는 그 이상)의 연속 아미노산은 도 1에 나타낸 9TL의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 것이다. 일부 구현양태에서, 연속 아미노산은 9TL의 가변 영역으로부터의 것이다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 결합 친화력은 변할 수도 있고, 하기 기재된 일례의 구현양태와 같이 특정한 값 또는 범위일 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. Aβ_1-40에 대한 본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 결합 친화력은 약 0.10 내지 약 0.80nM, 약 0.15 내지 약 0.75nM, 약 0.18 내지 약 0.72nM일 수 있다. 일부 구현양태에서, 이러한 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10nM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 이상이다. 하나의 구현양태에서, 결합 친화력은 약 2pM 내지 22pM이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM 미만이다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM 미만, 약 50nM 미만, 약 100nM 미만, 약 150nM 미만, 약 200nM 미만, 약 250nM 미만, 약 500nM 미만, 또는 약 1000nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 5nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 1nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 또는 약 0.07nM이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 미만 또는 약 0.07nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM 내지 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 또는 40pM의 어느 것이다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM 중의 어느 것이다. 또 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 이상이다.

본 발명은 또한 이러한 항체 또는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 기타 분해에 의해, 상기 기재된 것과 같은 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하 아미노산의 짧은 폴리펩티드가 화학적 합성에 의해 편리하게 만들어진다. 화학 합성 방법이 당 기술분야에 공지되어 있고 통상적으로 입수가능하다. 예를 들어, 고체상 방법을 사용하는 자동화 폴리펩티드 합성장치에 의해 항체를 제조할 수 있다. 미국 특허 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415호 참조.

다른 대안에서, 항체들은 당 기술분야에 공지된 절차를 사용하여 재조합에 의해 만들 수 있다. 하나의 구현양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 다른 구현양태에서, 서열 9 및 서열 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현 또는 증식을 위해 하나 이상의 벡터 내로 클론화한다. 주요 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포에서 벡터에 유지시킬 수도 있고, 이어서 숙주 세포를 미래의 사용을 위해 확장시키고 동결시킬 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포를 본 명세서에서 더욱 설명한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단일 사슬 가변 영역 단편("scFv"), 예컨대 9TL을 포함한다. 단일 사슬 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 만들어진다. 문헌 [Bird 등, (1988) Science 242:423-426]. 연결 펩티드의 예는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 간에 약 3.5nm에 걸쳐 있는 (GGGGS)₃(서열 40)이다. 다른 서열의 링커를 설계하고 사용하였다. 문헌 [Bird 등 (1988)]. 링커들은 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 변형될 수 있다. 재조합에 의해 또는 합성에 의해 단일 사슬 변형체를 제조할 수 있다. scFv의 합성 생성을 위하여, 자동화 합성장치를 사용할 수 있다. scFv의 재조합체 생성을 위하여, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드를 적절한 숙주 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포 또는 이.콜리와 같은 원핵 세포 내에 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의하여, 주요 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 당 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 얻어지는 scFv를 단리할 수 있다.

단일 사슬 항체, 예컨대 디아바디(diabody)의 다른 형태가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에서 발현되는 2가, 이특이성 항체이지만,동일한 사슬 위의 2개 도메인 사이에서 쌍합을 가능하게 하기에 너무 짧은 링커를 사용하고, 이에 의해 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 강제로 쌍합되어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다 [예를 들어, Holliger,P. 등 (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448; Poljak,R.J., 등, (1994) Structure 2:1121-1123].

예를 들어, 여기에 개시된 항체를 사용하여 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 이특이성 항체, 모노클로날 항체가 제조될 수 있다. 이특이성 항체의 제조 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Suresh 등, 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 전통적으로, 이특이성 항체의 재조합체 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 하고, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539].

이특이성 항체를 제조하기 위한 한가지 접근법에 따르면, 바람직한 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합한다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 의해 일어난다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 첫번째 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적절한 숙주 유기체 내에 동시이입한다. 이것은, 구축에서 사용되는 3개의 폴리펩티드 사슬의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공할 때, 구현양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 공통 부분을 조절함으로써 상당한 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율에서 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고 수율로 얻어지거나 비율이 특별히 중요하지 않을 때, 하나의 발현 벡터에서 2 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬을 위한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

하나의 접근법에서, 이특이성 항체는 하나의 팔에서 첫번째 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 팔에서 (두번째 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성된다. 이특이성 분자의 단지 1/2에서 면역글로불린 경쇄를 갖는 이러한 비대칭 구조는, 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 바람직한 이특이성 화합물의 분리를 촉진한다. 이러한 접근법은 PCT 공개번호 WO 94/04690 (1994년 3월 3일 공개)에 기재되어 있다.

2개의 공유 결합 항체를 포함하는 이종접합 항체가 본 발명의 범위 내에 있다. 면역 체계 세포가 원하지 않는 세포를 표적으로 하기 위해 (미국 특허 4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해 (PCT 출원 공개 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 이러한 항체가 사용되어 왔다. 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합 항체를 만들 수도 있다. 적절한 가교제 및 기술이 당 기술분야에 알려져 있고, 미국 특허 4,676,980호에 기재되어 있다.

가교제의 사용와 관련된 방법을 포함하는 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 사용하여 키메라 또는 하이브리드 항체가 생체내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수도 있다. 이러한 목적을 위해 적절한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.

당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 항체 9TL의 하나 이상의 CDR 또는 항체 9TL로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하는 인간화 항체가 만들어질 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 인간화하기 위하여 4개의 일반적인 단계들이 사용될 수 있다. 이것은 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하고, (2) 인간화 항체를 설계하고, 다시말해서 인간화 과정 동안에 어떠한 항체 프레임워크 영역이 사용되는지를 결정하고, (3) 실제 인간화 방법/기술을 적용하고, (4) 인간화 항체를 이입 및 발현하는 것이다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567호; 5,807,715호; 5,866,692호; 6,331,415호; 5,530,101호; 5,693,761호; 5,693,762호; 5,585,089호; 6,180,370호; 5,225,539호; 6,548,640호 참조.

재조합체 인간화 항체에서, Fcγ 수용체 및 보체 면역 체계와의 상호작용을 피하기 위하여 Fc 부분을 변형시킬 수 있다. 이러한 유형의 변형은 캠브리지 대학 병리학과의 마이크 클락 박사에 의해 설계되었으며, 이러한 항체의 제조 기술은 WO 99/58572호 (1999년 11월 18일 공개)에 기재되어 있다.

예를 들어, 항체가 임상 시험 및 인간에서의 치료를 위해 사용된다면 면역 반응을 피하기 위하여, 불변 영역을 더욱 유사한 인간 불변 영역으로 조작할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 5,997,867호 및 5,866,692호 참조.

본 발명은, 그들의 성질에 상당한 영향을 미치지 않는 기능적으로 균등한 항체 및 증가되거나 감소된 활성 및/또는 친화성을 갖는 변형체를 포함하는, 항체 9TL에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 항체 9TL의 아미노산 서열을 돌연변이시켜, Aβ_1-40 펩티드에 대해 바람직한 결합 친화력을 갖는 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당 기술분야에서 일상적인 실행이고, 여기에 상세히 기재될 필요는 없다. 폴리펩티드의 변형을 실시예에서 예시한다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존 치환, 기능적 활성을 상당히 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 사용을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유한 폴리펩티드까지의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 꼬리에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.

치환 변형체는 제거된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기와 그 자리에 삽입된 다른 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발을 위해 가장 주요한 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 생각된다. 보존적 치환을 표 1에 "보존적 치환"이라는 표제하에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 일으킨다면, 표 1에서 "일례의 치환"으로 명명되거나 하기 아미노산 부류를 참조하여 더욱 설명된 더 많은 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물을 선별할 수 있다.

항체의 생물학적 성질에서의 실질적인 변형은, (a) 치환 부분에서 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선형 형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 있어서 그들의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 일반적인 측쇄 성질을 기초로 하여 여러 군으로 나뉜다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하를 갖지 않은 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성 (음 전하): Asp, Glu;

(4) 염기성 (양 전하): Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 이러한 부류의 하나의 요소를 다른 부류로 바꿈으로써 이루어진다.

분자의 산화 안정성을 향상시키고 이상 가교를 막기 위하여, 항체의 적절한 형태를 유지시키는데 관여하지 않는 시스테인 잔기를 일반적으로 세린으로 치환할 수도 있다. 역으로, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에, 안정성을 향상시키기 위하여 시스테인 결합(들)을 항체에 첨가할 수도 있다.

아미노산 변형은 가변 영역과 같은 영역을 완벽히 재설계하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변화시키거나 변형시키는 것일 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 바꿀 수 있다. 일부 구현양태에서, CDR 도메인 내에서 1 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 이루어진다. 다른 구현양태에서, CDR 도메인에서 1 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 이루어진다. 또 다른 구현양태에서, CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.

변형은 또한 글리코실화 및 탈글리코실화 폴리펩티드 뿐만 아니라 다른 후-번역 변이를 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 포함한다. 항체는 불변 영역에서 보존된 위치에서 글리코실화된다 [Jefferis and Lund, 1997, Chem, Immunol. 65: 111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32]. 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능 [Boyd 등, 1996, Mol.Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem, 29:4175-4180], 및 당단백질의 일부 간에 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 형태 및 3-차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 [Hefferis and Lund, 상동; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416]. 올리고당은 특정한 인식 구조를 기초로 하여 주어진 당단백질을 특정한 분자에 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라사이클린-조절 발현을 갖는 CHO 세포는, 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 [Umana 등, 1999, Mature Biotech, 17: 176-180].

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합이란, 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 가리킨다. 삼펩티드는 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X-시스테인의 서열을 갖고, 여기서 X는 프롤린 이외의 아미노산이고, 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이러한 삼펩티드 서열 중의 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 발생시킨다. O-결합된 글리코실화란, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 또한 사용할 수도 있긴 하지만, 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스의 하나를 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 가리킨다.

항체에 글리코실화 부위의 첨가는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성되고, 그 결과 이것이 하나 이상의 상기 기재된 삼펩티드 서열을 함유한다 (N-결합된 글리코실화 부위를 위하여). 변경은 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나 또는 이에 의해 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-결합된 글리코실화 부위를 위하여).

항체의 글리코실화 패턴은 기초 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수도 있다. 글리코실화는 대부분 항체를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 의존된다. 잠재적인 치료법으로서, 재조합 당단백질의 발현을 위해 사용되는 세포 유형, 예컨대 항체가 거의 미변성 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변형이 기대될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Hse 등, 1997, J.Biol.Chem. 272:9062-9070] 참조).

숙주 세포의 선택에 추가로, 항체의 재조합 생산 동안에 글리코실화에 영향을 미치는 요인은 생육 방식, 배지 형성, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고당 생산에 관련된 특정한 효소를 도입하거나 과다발현하는 것을 포함하여 특정한 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하기 위하여 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299호). 글리코실화 또는 특정한 유형의 글리코실화는 예를 들어 엔도글리코시다제 H(엔도 H), 실시예 3에 기재된 것과 같은 N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3를 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정한 다당류를 처리하는 것이 결여되도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 및 유사한 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하여 당 기술분야에 공지된 결합 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은 예를 들어 면역분석을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 당 기술분야에 확립된 절차를 사용하여 변형된 9TL 폴리펩티드가 형성되고, 당 기술분야에 공지된 표준 분석을 사용하여 선별될 수 있으며, 이의 일부가 이하 및 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 일부 구현양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 불활성이거나 부분적으로 불활성인 불변 영역, 예를 들어 보체 매개 용균을 유발하지 않거나, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화시키지 않거나; 다음 중의 하나 이상: 보체 매개 용균 유발, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 자극, 또는 소교세포 활성화에서 (비변형 항체에 비해) 감소된 활성을 갖는 불변 영역을 포함한다. 최적 수준 및/또는 이펙터 기능의 조합을 달성하기 위하여 불변 영역의 상이한 변형이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Morgan 등, Immunology 86: 319-324 (1995); Lund 등, J.Immunology 157:4963-9 157: 4963-4969 (1996); Idusogie 등, J.Immunology 164: 4178-4184 (2000); Tao 등, J.Immunology 143: 2595-2601 (1989); 및 Jefferis 등, Immunological Reviews 163:59-76 (1998)] 참조. 일부 구현양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur.J.Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허출원 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 다른 구현양태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다. 문헌[Eur.J.Immunol. (1999) 29:2613-2624]. 또 다른 구현양태에서, 불변 영역을 N-결합된 글리코실화를 위해 글리코실화한다. 일부 구현양태에서, 불변 영역에 있는 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화 아미노산 잔기 또는 인접 잔기를 돌연변이함으로써, 불변 영역을 N-결합된 글리코실화를 위해 글리코실화한다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297을 A, Q, K 또는 H로 돌연변이할 수도 있다. 문헌 [Tao 등, J.Immunology 143: 2595-2601 (1989)] 및 [Jefferis 등, Immunological Reviews 163: 59-76].

일부 구현양태에서, 불변 영역을 N-결합된 글리코실화를 위해 글리코실화한다. N-결합된 글리코실화를 위하여 효소적으로 (예컨대 효소 PNG아제에 의한 탄수화물 제거) 또는 글리코실화 결여 숙주 세포에서의 발현에 의해 불변 영역을 글리코실화할 수도 있다.

다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 WO 99/58572 (1999년 11월 18일 공개)에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이러한 항체는, 표적 분자에 지시된 결합 도메인에 추가로, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이러한 항체들은 상당한 보체 의존성 용균 또는 표적의 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합될 수 있다. 일부 구현양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는, 염증 및 통상적인 항체 요법에 대한 기타 부작용을 피하기 위하여, 만성 항체 요법에서 사용하기 위해 특히 적절하다.

본 발명은 친화성 성숙 구현양태를 포함한다. 예를 들어, 친화성 성숙 항체는 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다 [Marks 등, 1992, Bio/Technology, 10: 779-783; Barbas 등, 1994, Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier 등, 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton 등, 1995, J.Immunol., 155: 1994-2004; Jackson 등, 1995, J.Immunol., 154(7): 3310-9; Hawkins 등, 1992, J.Mol.Biol., 226:889-896; 및 WO 2004/058184].

항체의 친화성을 조절하고 CDR을 특징화하기 위하여 하기 방법들을 사용할 수도 있다. 항체의 CDR을 특징화하고/하거나 폴리펩티드의 결합 친화력을 변경(예컨대 향상)시키는 한가지 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"이라 불리운다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 작용된다: CDR에서 하나 이상의 아미노산 위치를 당 기술분야에 인지된 방법을 사용하여 2개 이상(예컨대 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,7,18,19 또는 20)의 아미노산으로 대체한다. 이는 작은 라이브러리의 클론(일부 구현양태에서, 매 아미노산 위치 마다 하나를 분석한다)를 발생시키고, 이들은 각각 2개 이상의 요소의 복잡성을 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환된다면). 일반적으로, 라이브러리는 천연(비치환) 아미노산을 포함하는 클론을 더 포함한다. 표적 폴리펩티드에 대한 결합 친화력에 대하여 각각의 라이브러리로부터 작은 수의 클론, 예를 들어 약 20 내지 80개 클론(라이브러리의 복잡성에 의존하여)을 선별하고, 증가된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합 또는 비-결합을 갖는 후보들을 확인한다. 결합 친화력을 결정하는 방법이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 바이아코어 (BIAcore) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 결합 친화력을 결정할 수도 있으며, 이것은 약 2배 이상의 결합 친화력의 차이를 검출한다. 바이아코어는, 출발 항체가 비교적 높은 친화력, 예를 들어 약 10nM 이하의 K_D로 이미 결합할 때 특히 유용하다. 바이아코어 표면 플라스몬 공명을 사용한 선별이 실시예에 기재되어 있다.

키넥사 바이오센서, 섬광 근접 검색법, ELISA, ORIGEN 면역분석(IGEN), 형광 소멸, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결합 친화력을 결정할 수도 있다. 적절한 생체분석을 사용하여 결합 친화력을 선별할 수도 있다.

일부 구현양태에서, CDR에 있는 모든 아미노산 위치를 당 기술분야에 인식된 돌연변이유발 방법(그의 일부는 본 명세서에 기재됨)을 사용하여 모든 20개 천연 아미노산으로 (일부 구현양태에서, 한번에 하나) 대체한다. 이것은 (모든 위치에서 20개 아미노산 모두가 치환된다면) 각각 20개 요소의 복잡성을 갖는 클론의 작은 라이브러리 (일부 구현양태에서, 분석되어지는 모든 아미노산 위치에 대해 하나)를 생성한다.

일부 구현양태에서, 선별되어지는 라이브러리는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함하고, 이것은 동일한 CDR에서 또는 2개 이상의 CDR에 존재할 수도 있다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR에서 2개 이상의 위치에 치환을 포함할 수도 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR에서 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수도 있다. 라이브러리는 3, 4, 5 또는 그 이상의 위치에서 치환을 포함할 수도 있고, 상기 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR에서 발견된다. 낮은 중복(redundancy) 코돈을 사용하여 치환을 준비할 수도 있다. 예를 들어 문헌 [Balint 등, (1993), Gene 137(1): 109-18]의 표 2 참조.

CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수도 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3의 하나 이상일 수도 있다. CDR은 카뱃 CDR, 코티아 CDR 또는 연장된 CDR일 수도 있다.

개선된 결합을 갖는 후보들을 서열화할 수도 있고, 이에 의해 친화력이 개선되는 CDR 치환 변이체를 확인할 수 있다 ("개선된" 치환이라고도 명명됨). 결합하는 후보들을 서열화하고, 이에 의해 결합을 유지하는 CDR 치환을 확인할 수도 있다.

다수의 선별 순환을 수행할 수도 있다. 예를 들어 개선된 결합을 갖는 후보(각각 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함함)가, 각각의 개선된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR에서의 아미노산 위치)에서 적어도 본래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 두번째 라이브러리를 설계하기 위해 유용하다. 라이브러리의 제조, 선별 또는 선택을 이하에서 더욱 언급한다.

개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합 또는 비-결합을 갖는 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성을 위해 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제 공하는 한, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 CDR을 특징화하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 위치가 모든 20개 아미노산으로 변화될 때 결합을 유지한다면, 이 위치는 항원 결합을 위해 요구될 가능성이 없는 위치로서 판정된다. 역으로, CDR의 위치가 단지 작은 퍼센트의 치환에서 결합을 유지한다면, 이 위치는 CDR 기능에 대해 중요한 위치로서 판정된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은, 많은 상이한 아미노산(모두 20개 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR에서의 위치 및 변화될 수 없거나 단지 몇 개의 아미노산으로 변화될 수 있는 CDR에서의 위치에 관한 정보를 생성한다.

개선된 친화력을 갖는 후보를, 그 위치에서 개선된 아미노산, 원래의 아미노산을 포함하는 두번째 라이브러리와 조합할 수도 있고, 원하는 라이브러리의 복잡성에 의존하여 그 위치에서 추가의 치환을 더 포함할 수도 있거나, 바람직한 선별 또는 선택 방법을 사용하여 치환이 허용될 수 있다. 또한, 원한다면, 인접한 아미노산 위치가 적어도 2개 이상의 아미노산으로 임의 추출될 수 있다. 인접한 아미노산의 임의 추출은 돌연변이체 CDR에서 추가의 형태적 유연성을 허용할 수도 있고, 이것은 다시 다수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진할 수 있다. 라이브러리는 첫번째 선별 순환에서 개선된 친화력을 나타내지 않는 위치에서 치환을 포함할 수도 있다.

바이아코어 표면 플라스몬 공명 분석을 사용한 선별, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함하여 당 기술분야에 공지된 선택 방법을 사용하는 선택을 포함하는 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 개선되고/되거나 변경된 결합 친화력을 갖는 라이브러리 요소에 대하여 두번째 라이브러리를 선별하거나 선택한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체(예컨대 9TL) 또는 폴리펩티드로부터 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구현양태에서, 서열 2 (도 1)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 적어도 10개 연속 아미노산 및/또는 서열 1 (도 1)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 적어도 10개 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구현양태에서, 서열 2 (도 1)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개 연속 아미노산 및/또는 서열 1 (도 1)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개 연속 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구현양태에서, 융합 폴리펩티드는 도 1의 서열 2 및 서열 1에 나타낸 바와 같이 9TL의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현양태에서, 융합 폴리펩티드는 9TL의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 구현양태에서, 융합 폴리펩티드는 항체 9TL의 CDR H3 및/또는 CDR L3을 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 9TL 융합 단백질은 하나 이상의 9TL 항체, 및 미변성 분자, 예를 들어 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 동종 서열에 부착되지 않은 다른 아미노산 서열을 함유한다. 일례의 이종 서열은 이에 한정되지 않지만 플래그(FLAG) 태그 또는 6His 태그와 같은 "태그(tag")를 포함한다. 태그는 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

9TL 융합 폴리펩티드는 당 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 9TL 융합 단백질은, 예를 들어 화학 합성을 포함하여 당 기술분야에 공지된 기타 수단에 의해 제조될 수도 있긴 하지만, 여기에 기재된 재조합 방법을 사용하여 이들을 코딩하는 발현 폴리뉴클레오티드를 제조함으로써 만들어진다.

본 발명은 상기 고체 지지체로의 결합을 촉진하는 인자(예, 비오틴 또는 아비딘)에 접합된(예를 들어 결합된) 9TL 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 단순성을 위하여, 9TL 또는 항체를 일반적으로 언급할 수 있고, 이러한 방법들은 여기에 기재된 Aβ_1-40 결합 구현양태에 적용되는 것으로 이해된다. 접합은 일반적으로 여기에 기재된 성분들을 결합시키는 것을 가리킨다. 결합(일반적으로 투여를 위하여 적어도 근접한 관계로 성분들을 고정시킴)은 다수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 인자와 항체가 각각 다른 것과 반응할 수 있는 치환기를 가질 때, 인자와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들어, 아미노 또는 술프히드릴 기와 같은 친핵 기는, 카르보닐-함유 기, 예컨대 안히드라이드 또는 산 할라이드, 또는 다른 기 위에 양호한 이탈기(예, 할라이드)를 함유하는 알킬기와 반응하는 것이 가능할 수도 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는, 형광 분자, 방사능 분자 또는 당 기술분야에 공지된 다른 표지와 같은 표지 인자(대안적으로 "표지"로 명명)에 결합될 수도 있다. 일반적으로 (직접적으로 또는 간접적으로) 시그날을 제공하는 표지가 당 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명은, 항체 9TL, 및 본 개시내용에서 명백한 바와 같이 여기에 기재된 항체 및/또는 폴리펩티드의 어느 하나 또는 전부를 포함하는 조성물(제약 조성물 포함) 및 키트를 제공한다.

손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 펩티드 항체 및 폴리펩티드

본 발명의 방법은 베타-아밀로이드 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드 (항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물 포함)를 사용한다. 항체 및 폴리펩티드는 하나 이상의 하기 특징: (a) 대상체에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하고; (b) 대상체에서 아밀로이드 플라크를 감소시키고; (c) 알쯔하이머병의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선하고; (d) 인지 기능을 개선하는 것을 특징으로 한다. 여기에 기재된 항체 및 폴리펩티드는 바람직한 안전성 프로파일을 나타낼 수도 있고, 예를 들어 본 발명의 조성물은 뇌 혈관계에서의 출혈 (대뇌 출혈), 수막뇌염 (자기 공명 스캔의 변화 포함); 대뇌 척수액에서 높은 백혈구 수; 중추 신경계 염증의 하나 이상을 상당한 또는 허용될 수 없는 수준으로 유발하지 않거나, 감소된 수준으로 가질 것이다. 실시예 4에 나타낸 것과 같이, Fc 영역에서 제거된 N-결합된 글리코실화를 갖는 항-Aβ 항체는, 뇌에서 아밀로이드 플라크를 제거하고 알쯔하이머병을 위한 동물 모델에서 원상태 항체에 비하여 상당히 낮은 미세출혈과 함께 인지 기능을 개선시키는데 효과적이었다.

여기서 사용된, "손상된 이펙터 기능" ("면역학적으로 불활성" 또는 "부분 면역학적으로 불활성"과 바꾸어 사용가능함)을 갖는 항체 또는 폴리펩티드는, (비변성 또는 천연 발생 불변 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩티드에 비하여) 이펙터 기능을 갖지 않거나 감소된 이펙터 기능의 활성 또는 활성들을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 가리키고, 예를 들어 하기: a) 보체 매개 용균을 유발하고; b) 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하고; c) 소교세포를 활성화시키는 것 중의 하나 이상의 활성을 갖지 않거나 감소된 활성을 갖는다. 이펙터 기능 활성은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 및 100% 만큼 감소될 수도 있다. 일부 구현양태에서, 항체는 보체 의존성 용균, 또는 표적의 세포 매개 파괴를 유발하지 않으면서 베타-아밀로이드 펩티드에 결합한다. 예를 들어, 특정한 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII에 대한 결합 친화력을 제거하거나 감소시키기 위하여, 불변 영역 위의 Fc 수용체 결합 부위를 변형시키거나 변이시킬 수도 있다. 간편함을 위하여 항체를 언급하였으며, 폴리펩티드에도 이 구현양태가 적용되는 것으로 이해된다. 불변 영역의 아미노산 잔기(들) (예를 들어, IgG 항체의 아미노산 잔기)가 변경되거나 변이됨을 나타내기 위하여, EU 번호매김 체계 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest; 제5판, Public Health Service, National Institutes of Healthy, 미들랜드주 베데스다, 1991]를 사용한다. 특정한 유형의 항체(예, IgG1) 또는 종(예, 인간)을 위해 번호매김이 사용될 수도 있으며, 여러 유형의 항체 및 종에 걸쳐서도 유사한 변화를 행할 수 있는 것으로 이해된다.

일부 구현양태에서, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 천연 발생 서열 또는 그의 변형체를 가질 수도 있다. 일부 구현양태에서, 천연 발생 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이, 예를 들어 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 변이되고, 이에 의해 불변 영역의 이펙터 기능이 손상된다. 일부 구현양태에서, 중쇄 불변 영역의 Fc 영역의 N-글리코실화가 변화될 수도 있고, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 제거될 수 있고, 이에 의해 불변 영역의 이펙터 기능이 손상된다.

일부 구현양태에서, 이펙터 기능은 항-Aβ 펩티드의 Fc 영역(예를 들어 IgG의 CH2 도메인에서)의 N-글리코실화를 제거함으로써 손상된다. 일부 구현양태에서, 불변 영역에서 글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화 아미노산 잔기 또는 인접 잔기를 돌연변이함으로써 Fc 영역의 N-글리코실화가 제거된다. 삼펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 (N-X-S), 아스파라긴-X-트레오닌(N-X-T) 및 아스파라긴-X-시스테인(N-X-C) (여기서, X는 프롤린 이외의 아미노산이다)은 N-글리코실화를 위한 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 잔기를 효소적 부착하기 위한 인식 서열이다. 불변 영역에서 삼펩티드 서열의 아미노산을 돌연변이하면 글리코실화 IgG가 얻어진다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3의 N-글리코실화 부위 N297을 A, D, Q, K 또는 H로 돌연변이할 수도 있다. 문헌 [Tao 등, J.Immunology, 143: 2595-2601 (1989); 및 Jefferis 등, Immunological Reviews 163: 59-76 (1998)] 참조. Asn-297을 Gln, His 또는 Lys으로 치환한 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 FcγRI에 결합하지 않고, IgG1에 대해 완전히 소실되고 IgG3에 대해 극적으로 저하된 C1q 결합 능력을 갖는 보체를 활성화하지 못하는 것으로 보고되었다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서 아미노산 N이 아미노산 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y 중의 어느 하나로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서의 아미노산 N이 보존적 치환으로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서 아미노산 X가 프롤린으로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서 아미노산 S가 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서 아미노산 T는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 서열에서 아미노산 C는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 삼펩티드 다음의 아미노산이 P로 돌연변이된다. 일부 구현양태에서, 불변 영역에서 N-글리코실화가 효소적으로 제거된다 (예컨대 실시예 3에 기재된 것과 같이 N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3, 및 엔글리코시다제 H). N-글리코실화의 제거는 또한, N-글리코실화의 결여를 갖는 세포 주에서 항체를 생성함으로써 달성될 수도 있다. 문헌 [Wright 등, J Immunol. 160(7): 3393-402 (1998)].

일부 구현양태에서, 이러한 불변 영역의 N-글리코실화에 부착된 올리고당과 상호작용하는 아미노산 잔기가 돌연변이되어, FcγRI에 대한 결합 친화력을 감소시킨다. 예를 들어, 인간 IgG3의 F241, V264, D265가 돌연변이될 수도 있다. 문헌 [Lund 등, J. Immunology 157:4963-4969 (1996)] 참조.

일부 구현양태에서, PCT WO 99/58572호 및 문헌 [Armour 등, Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy 등, J.Immunology 164: 1925-1933 (2000)]에 기재된 것과 같이 인간 IgG의 233-236, 297 및/또는 327-331과 같은 영역을 변형시킴으로써 이펙터 기능이 손상된다. PCT WO 99/58572 및 Armour 등의 문헌에 기재된 항체는, 표적 분자에서 지시된 결합 도메인에 추가로, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이러한 항체들은 상당한 보체 의존성 용균 또는 표적의 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현양태에서, 이펙터 도메인은 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIII에 대해 낮은 친화력을 갖는다. 일부 구현양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는, 통상적인 항체 요법에서 염증 및 기타 부작용을 피하기 위하여 만성 항체 요법에서 사용하기 위해 특히 적절하다. 일부 구현양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이의 어느 것을 갖는 인간 중쇄 IgG1이다: 1)A327A330P331 내지 G327S330S331; 2) E233L234L235G236 내지 G236이 결실된 P233V234A235; 3) E233L234L235 내지 P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 내지 G236이 결실된 P233V234A235G327S330S331; 5) E233L234L235A327A330P331 내지 P233V234A235G327S330S331; 및 6)N297 내지 A297 또는 N 이외의 다른 아미노산. 일부 구현양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG2이다: A330P331 내지 S330S331. 일부 구현양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG4이다: E233F234L235G236 내지 G236이 결실된 P233V234A235; E233F234L235 내지 P233V234A235; 및 S228L235 내지 P228B235.

보체 활성화를 부여하기 위하여 항체의 불변 영역이 변형될 수도 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 결합 후에 IgG 항체의 보체 활성화는, C1 결합 모티프(예를 들어 C1q 결합 모티프)에서 불변 영역에서의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 감소될 수도 있다. 인간 IgG1의 D270, K322, P329, P331 각각에 대한 Ala 돌연변이는 C1q 및 활성화 보체에 결합하는 항체의 능력을 상당히 감소시키는 것으로 보고되었다. 뮤린 IgG2b를 위하여, C1q 결합 모티프는 잔기 E318, K320 및 K322를 구성한다. 문헌 [Idusogie 등, J.Immunology 164:4178-4184 (2000); Duncan 등, Nature 322: 738-740 (1988)] 참조.

뮤린 IgG2b에 대해 동정된 C1q 결합 모티프 E318, K320 및 K322는 다른 항체 이소형을 위해 일반적인 것으로 생각된다. 문헌 [Duncan 등, Nature 322: 738-740 (1988)]. IgG2b에 대한 C1q 결합 활성은, 3개의 특정한 잔기 중의 어느 하나를 측쇄 위에 부적절한 작용기를 갖는 잔기로 치환함으로써 없어질 수 있다. C1q 결합을 없애기 위하여 이온성 잔기를 단지 Ala 만으로 치환하는 것은 필요하지 않다. C1q 결합을 없애기 위하여 3개 잔기의 어느 하나 대신에 다른 알킬-치환된 비-이온성 잔기, 예컨대 Gly, Ile, Leu 또는 Val 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비-극성 잔기를 사용하는 것이 가능하다. 또한, C1q 결합 활성을 없애기 위하여 잔기 320 및 322 (그러나 318은 아님) 대신에 Ser, Thr, Cys 및 Met와 같은 극성 비-이온성 잔기를 사용하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한, 항체가 변형된 힌지 영역을 갖고 있는 것인, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 제공한다. Fc 수용체에 대한 인간 IgG의 결합 친화력은 힌지 영역을 변형시킴으로써 조절될 수 있다. 문헌 [Canfield 등, J.Exp.Med. 173: 1483-1491 (1991); Hezareh 등, J.Virol. 75: 12161-12168 (2001); Redpath 등, Human Immunology 59:720-727 (1998)] 참조. 특정한 아미노산 잔기가 돌연변이되거나 결실될 수도 있다. 변형된 힌지 영역은 CH1 도메인과 상이한 항체 부류 또는 소부류의 항체로부터 유래된 완전 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 부류 IgG 항체의 불변 도메인(CH1)을 부류 IgG4 항체의 힌지 영역에 부착할 수 있다. 대안적으로, 새로운 힌지 영역은 자연적 힌지 또는 반복 단위의 일부를 포함할 수도 있고, 여기서 반복물에 있는 각각의 단위는 자연적 힌지 영역으로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기를 자연적 잔기, 예컨대 알라닌으로 전환시키거나, 또는 적절히 자리잡은 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써, 천연 힌지 영역이 변경된다. 미국 특허 5,677,425호. 이러한 변경은 단백질 화학 분야에서 인정된 기술, 바람직하게는 여기에 기재된 바와 같이 유전자 공학 기술을 사용하여 수행된다.

Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합된 폴리펩티드가, 본 명세서에 기재된 방법을 위하여 또한 사용될 수도 있다. 일부 구현양태에서, 폴리펩티드는 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 폴리펩티드는 Aβ 펩티드에 결합하는 단일 도메인 항체로부터 유래된다. 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 단일 도메인 항체가 생성될 수 있다. 문헌 [Omidfar 등, Tumour Biol. 25:296-305 (2004); Herring 등, Trends in Biotechnology 21: 484-489 (2003)].

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 F(ab')₂ 단편이 아니다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Fab 단편이 아니다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 단일 사슬 항체 scFv가 아니다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 F(ab')₂ 단편이다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 Fab 단편이다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 단일 사슬 항체 scFv이다.

당 기술분야에 공지된 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 형성하는 다른 방법이 또한 사용될 수도 있다.

출발 항체에 비하여 생물학적 활성에서의 이펙터 기능 감소 수준을 평가하기 위하여, 변형된 불변 영역을 갖는 항체 및 폴리펩티드를 하나 이상의 분석에서 시험할 수 있다. 예를 들어, 변경된 Fc 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩티드가 보체 또는 Fc 수용체(예를 들어, 소교세포 위의 Fc 수용체) 또는 변경된 힌지 영역에 결합하는 능력은, 여기에 개시된 분석 뿐만 아니라 당 기술분야에 인정된 분석을 사용하여 평가될 수 있다. PCT WO 99/58572; 문헌[Armour 등, Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy 등, J.Immunology 164: 1925-1933 (2000); Song 등, Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002)].

일부 구현양태에서, 베타-아밀로이드 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 영장류 항체이다. 예를 들어 [Yocum 등, J.Rheumatol. 25:1257-62 (1998); Bugelski 등, Human & Experimental Toxicology 19: 230-243 (2000)]. 일부 구현양태에서, 항체가 인간 면역 체계를 활성화시키지 않도록 항체를 돌연변이에 의해 탈면역화한다. 예를 들어 문헌[Nanus 등, J.Urology 170:S84-S89 (2003)].

여기서 사용된 바와 같이, Aβ 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질의 효소적 분해 생성물의 단편을 포함한다. 예를 들어, Aβ 펩티드는 Aβ_1-40, Aβ_1-42, 또는 Aβ_1-43의 단편; 및 Aβ_1-40, Aβ_1-42, 또는 Aβ_1-43의 N-말단 또는 C-말단에서 다양한 수의 아미노산으로 끝이 절단된 펩티드를 포함한다. 여기서 사용된 아미노산 번호매김은 Aβ 1-43(서열 17)을 위한 번호매김을 기초로 한다.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 1-16 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 16-28 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 잔기 28-40 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드의 잔기 28-42 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-43 펩티드의 잔기 28-43 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 전체-길이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 결합하지 않으면서 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 가용성 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 응집된 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태 및 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. Aβ의 다양한 응집된 형태에 결합하는 항체가 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 아밀로이드 베타-유래 확산성 리간드(ADDLs)에 결합하는 항체; 아밀로이드 피브릴 및/또는 침착물에 결합하는 항체. WO 03/104437; 미국 공개번호 2003/0147887; 미국 공개번호 2004/0219146.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 3D6 면역글로불린 경쇄 (미국 공개번호 2003/0165496 또는 2004/0087777에 기재된 서열 2)로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR, 및/또는 3D6 면역글로불린 중쇄 (미국 공개번호 2003/0165496 또는 2004/0087777에 기재된 서열 4)로부터의 1, 2 또는 3개 CDR을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 서열 8 (미국 공개번호 2003/0165496)에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 5 (미국 공개번호 2003/0165496)에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 서열 12 (미국 공개번호 2003/0165496)에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 11 (미국 공개번호 2003/0165496)에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 10D5 면역글로불린 경쇄 (미국 공개번호 2003/0165496 또는 2004/0087777에서 서열 14)로부터의 1, 2 또는 3개 CDR, 및/또는 10D5 면역글로불린 중쇄(미국 공개번호 2003/0165496 또는 2004/0087777에서 서열 16)로부터의 1, 2 또는 3개 CDR을 포함한다.

일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40의 잔기 33-40 내에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 35-40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 36-40을 포함하는 Aβ_1-40위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-40위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40에 특이적으로 결합하지만 Aβ_1-42 및/또는 Aβ_1-43에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 항체 9TL 또는 여기에 기재된 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 항체 9TL 및/또는 항체 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드가 Aβ_1-40에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 일부 구현양태에서, 항체는 PCT WO 2004/032868호에 기재된 항체 2286이 아니다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 결합 친화력은 변할 수도 있고, 하기 기재된 일례의 구현양태와 같이 특정한 값 또는 범위(일 수 있지만) 그럴 필요는 없다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 Aβ_1-40, Aβ_1-40, 또는 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력은 약 0.10 내지 약 0.80nM, 약 0.15 내지 약 0.75nM, 및 약 0.18 내지 약 0.72nM일 수 있다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 초과이다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 2pM 내지 22pM이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM 미만이다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM 미만, 약 50nM 미만, 약 100nM 미만, 약 150nM 미만, 약 200nM 미만, 약 250nM 미만, 약 500nM 미만, 또는 약 1000nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 5nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 1nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 또는 약 0.07nM 이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 미만 또는 약 0.07nM 미만이다. 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM의 어느 것 내지 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 또는 약 40pM의 어느 것이다. 일부 구현양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5M, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM의 어느 것이다. 또 다른 구현양태에서, 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 초과이다.

항체 및 폴리펩티드의 제조 방법이 당 기술분야에 알려져 있고 여기에 기재되어 있다.

동일하거나 또는 입체적으로 중복된 에피토프를 인식함으로써 2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부 또는 하나의 항체가 항원에 다른 항체가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는지의 여부를 결정하기 위하여 경쟁 분석을 사용할 수 있다. 이러한 분석들은 당 기술분야에 알려져 있다. 전형적으로, 항원을 다중-웰 플레이트에 고정화시키고, 표지화된 항체의 결합을 차단하는 비표지화 항체의 능력을 측정한다. 이러한 경쟁 분석을 위해 일반적인 표지는 방사능 표지 또는 효소 표지이다.

아밀로이드 침착을 제거하고 인지 향상과 같은 다른 유리한 효과에 효능을 갖는 것에 대하여 Aβ에 특이적으로 결합하는 항체 및 폴리펩티드를 선별할 수 있다. 예를 들어, 알쯔하이머병변을 갖는 동물에 항체 또는 폴리펩티드를 투여할 수도 있다. 알쯔하이머병을 위해 다양한 동물 모델이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 투여 후에, 당 기술분야에 공지되고 실시예 2에 상세히 기재된 방법을 사용하여 밀집 및 확산 아밀로이드 플라크의 수준, 인지를 위한 행동 분석, 및 소교세포 활성화 및 미세출혈을 시험할 수도 있다. PCT WO 2004/032868; 문헌 [Wilcock 등, J.Neurosci. 23: 3745-3751 (2003); Wilcock 등, J.Neuroinflammation 1:24(2004)] 참조.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (도 1에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 포함), 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

따라서, 본 발명은 다음 중의 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 제약 조성물을 포함하는 조성물)를 제공한다: (a) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체; (b) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 단편 또는 영역; (c) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 경쇄 또는 그의 변형체; (d) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 중쇄 또는 그의 변형체; (e) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 변형체로부터 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체의 하나 이상의 CDR(들) (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR); (g) 항체 9TL의 중쇄로부터 CDR H3; (h) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 경쇄 또는 그의 변형체로부터의 CDR L3; (i) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 경쇄 또는 그의 변형체로부터의 3개의 CDR; (j) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 중쇄 또는 그의 변형체로부터의 3개의 CDR; (k) 표 3에 나타낸 항체 9TL의 경쇄 또는 그의 변형체로부터의 3개의 CDR 및 중쇄 또는 그의 변형체로부터의 3개의 CDR; 및 (l) (b) 내지 (k)의 어느 하나를 포함하는 항체. 일부 구현양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드(들)의 어느 하나 또는 양쪽 모두를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 항체(항체 단편 포함) 및 폴리펩티드, 예컨대 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 형성될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(예컨대 제약 조성물)을 제공한다. 일부 구현양태에서, 조성물은 여기에 기재된 9TL 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 구현양태에서, 조성물은 여기에 기재된 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 구현양태에서, 조성물은 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드의 어느 하나 또는 양쪽 모두를 포함한다. 발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여가 여기에 더욱 기재되어 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.

이러한 서열에 상보성인 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의해 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수도 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수도 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자를 포함하고, 이것은 인트론을 함유하며 일-대-일 방식으로 DNA 분자 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA에 상응한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 존재할 수도 있으나 요구되는 것은 아니고, 폴리뉴클레오티드가 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수도 있으나 요구되는 것은 아니다.

폴리뉴클레오티드는 미변성 서열(즉, 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수도 있거나, 또는 이러한 서열의 변형체를 포함할 수도 있다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록, 폴리뉴클레오티드 변형체가 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 미치는 효과를 여기에 기재된 바와 같이 평가할 수도 있다. 변형체는 바람직하게는 미변성 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성을 나타낸다.

하기 기재된 바와 같이 최대 일치를 위해 정렬될 때 2개의 서열에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 동일하다면, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 "동일"한 것으로 언급된다. 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교 윈도우에 비해 서열을 비교함으로써, 2개의 서열 간의 비교를 전형적으로 수행한다. 여기서 사용된 "비교 윈도우"란, 적어도 약 20개 인접한 위치의 단편, 통상 30 내지 약 75, 40 내지 약 50의 인접한 단편을 가리키고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에, 서열을 동일한 수의 인접한 위치의 대조 서열과 비교할 수도 있다.

디폴트 매개변수를 사용하는 바이오인포매틱스 소프트웨어(미국 위스콘신주 매디슨 DNASTAR, INC.)의 레이저진(Lasergene) 슈트에서 메갈린(Megalign) 프로그램을 사용하여, 비교를 위한 서열의 최적 정렬을 수행할 수도 있다. 이 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 몇가지 정렬 체계를 실현한다 [Dayhoff, M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O.(ed) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp345-358; Hein J., 1990. United Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins,D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers,E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson,E.D., 1971, Comb.Theor. 11:105; Santou,N., Nes.M., 1987, Mol.Biol.Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal,R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman,D.J., 1983, Proc Natl Acad.Sci. USA 80:726-730].

바람직하게는, 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 비하여 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 "서열 동일성의 퍼센트"를 결정하며, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 대조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않는 서열)에 비하여, 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실 (즉, 간극)을 포함할 수도 있다. 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생된 위치의 수를 결정하여 정합 위치의 수를 얻고, 정합 위치의 수를 대조 서열에서의 전체 위치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여, 서열 동일성의 퍼센트를 얻음으로써 퍼센트를 계산한다.

변형체는, 또는 선택적으로, 미변성 유전자 또는 그의 일부 또는 보체에 실질적으로 상동성일 수도 있다. 적당히 엄격한 조건 하에서, 이러한 폴리뉴클레오티드 변형체는 미변성 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열(또는 상보성 서열)에 대해 하이브리드화할 수 있다.

적절한 "적당히 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에서 예비세척하고; 50 내지 65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화하고; 이어서 65℃에서 20분동안 0.1% SDS를 함유하는 각각 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 2번 세척하는 것을 포함한다.

여기서 사용된 "매우 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 고온 및 저 이온 강도, 예를 들어 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 하이브리드화 동안에, 42℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 함께, 포름아미드와 같은 변성화제, 예를 들어 0.1% 소혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)를 갖는 50%(v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5x SSC (0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)중에서, 55℃에서 50% 포름아미드 중에서 세척한 다음, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1x SSC로 구성된 고 엄격성 세척을 사용하는 것이다. 당업자라면, 프로브 길이 등과 같은 요인을 조절하기 위해 필요 시에, 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조절하는지를 이해할 것이다.

당업자라면, 유전자 코드의 변성의 결과로서, 여기에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부는 미변성 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이에 기인하여 다양하게 변하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 특이적으로 계획된다. 또한, 여기에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범위 내에 있다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 얻어진 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수도 있지만 그것이 요구되지는 않는다. 표준 기술(예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이타베이스 서열 비교)을 사용하여 대립유전자를 확인할 수도 있다.

화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법이 당 기술분야에 알려져 있으며 여기에 상세히 기재될 필요는 없다. 당업자라면, 원하는 DNA 서열을 생성하기 위해 여기에 제공된 서열 및 상업적인 DNA 합성기를 사용할 수 있다.

재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위하여, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내에 삽입할 수 있고, 이하 더욱 언급되는 바와 같이, 이 벡터는 다시 복제 및 증폭을 위해 적절한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 당 기술분야에 공지된 수단에 의하여 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내에 삽입될 수 있다. 세포는 직접적인 섭취, 엔도시토시스, 트랜스펙션, F-정합 또는 일렉트로포레이션에 의하여 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터(예컨대 플라스미드)로서 유지될 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당 기술분야에 알려진 방법에 의하여 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어 [Sambrook 등 (1989)] 참조.

대안적으로, PCR은 DNA 서열을 재생산할 수 있다. PCR 기술은 당 기술분야에 알려져 있고, 미국 특허 4,683,195호, 4,800,159호, 4,754,065호 및 4,683,202호 뿐만 아니라 PCR에 기재되어 있다: 문헌 [The Polymerase Chain Reaction, Mullis 등, eds., Birkauswer Press, Boston (1994)].

적절한 벡터에서 단리된 DNA를 사용하고 이것을 적절한 숙주 세포 내에 삽입함으로써 RNA를 수득할 수 있다. 세포가 복제하고 DNA가 RNA 내로 전사될 때, 문헌[Sambrook 등, (1989)]에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.

표준 기술에 따라서 적절한 클로닝 벡터가 구축될 수도 있거나, 또는 당 기술분야에서 이용가능한 다수의 클론화 벡터로부터 선택될 수 있다. 사용되어지는 숙주 세포에 따라서 선택되는 클론화 벡터가 다양할 수 있긴 하지만, 유용한 클론화 벡터는 일반적으로 자기-복제에 대한 능력을 가질 것이고, 특정한 제한 엔도뉴클레아제를 위한 단일 표적을 가질 수 있고, 및/또는 벡터를 함유하는 클론을 선택함에 있어서 사용될 수 있는 마커에 대해 유전자를 전달할 수도 있다. 적절한 예는 플라스미드 및 세균 바이러스를 포함하고, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트 (예, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다른 많은 클론화 벡터가 바이오래드, 스트라트진 및 인비트로겐과 같은 판매업체로부터 입수될 수 있다.

발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포 내에서 복제되어야 한다. 적절한 발현 벡터는 이에 한정되지 않지만 PCT 공개번호 WO 87/04462에 개시된 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드 및 발현 벡터를 포함하여, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 이에 한정되지 않지만 다음 중의 하나 이상을 포함할 수도 있다: 시그날 서열; 복제 개시점; 하나 이상의 마커 유전자; 적절한 전사 조절 요인 (예컨대 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현(즉, 번역)을 위하여, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 조절 요소가 통상 요구된다.

일렉트로포레이션, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용한 트랜스펙션; 미세분출 충격; 리포펙틴; 및 감염(예를 들어 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염 인자인 경우)을 포함하여 다수의 적절한 수단에 의해, 주요 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 의존된다.

본 발명은 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드의 어느 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 주요 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 목적으로, 이종 DNA를 과다-발현할 수 있는 숙주 세포가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적인 예는 이에 한정되지 않지만 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다. PCT 공개 번호 WO 87/04462 참조. 적절한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵세포(예컨대 이.콜리 또는 비.섭틸리스) 및 효모 (예컨대 에스.세레비지애, 에스.폼브; 또는 케이.락티스)를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 숙주 세포 내에서 존재한다면 상응하는 주요 내인성 항체 또는 단백질에 비하여, 약 5배 더 높은 수준, 더욱 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 더욱 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 면역분석 또는 FACS에 의하여, Aβ_1-40에 대한 특이적 결합을 위한 숙주 세포를 선별한다. 주요 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포가 동정될 수 있다.

9 TL 유래 항체 및 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체의 진단 용도

Aβ_1-40의 존재 또는 부재를 동정하거나 검출하기 위하여 Aβ_1-40의 C-말단에 결합하는 항체 9TL이 사용될 수도 있다. 간편성을 위하여, 9TL 또는 항체를 일반적으로 언급할 것이며, 이러한 방법들이 여기에 기재된 Aβ_1-40 결합 구현양태(예컨대 폴리펩티드)에도 적용되는 것으로 이해된다. 검출은 일반적으로, 생물학적 샘플을 Aβ_1-40에 결합되는 여기에 기재된 항체와 접촉시키고, Aβ_1-40와 Aβ_1-40에 특이적으로 결합하는 항체(예, 9TL) 간의 복합체를 형성하는 것과 연관된다. 이러한 복합체의 형성은 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 여기서 사용된 용어 "검출"은, 대조를 참조하거나 참조하지 않으면서, 정성적 및/또는 정량적 검출(측정 수준)을 포함한다.

이에 한정되지 않지만, 예를 들어 효소면역측정법(ELISA), 방사능면역분석(RIA) 등; 및 코딩된 폴리펩티드를 위한 기능적 분석, 예를 들어 결합 활성 또는 효소 분석에 의하여, 폴리펩티드에 결합하는 항체를 사용하는 면역분석을 포함하여, 각종 공지된 방법이 검출을 위해 사용될 수 있다.

변경된 또는 이상형 Aβ 또는 βAPP 발현과 연관된 질병, 병 또는 질환, 예컨대 알쯔하이머병 및 다운 증후군을 검출, 진단 및 조사하기 위하여 본 발명의 항체 및 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현양태에서, 본 발명은 변경되거나 이상형 Aβ 발현을 갖는 것으로 의심되는 개체의 견본(샘플)을 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키고, Aβ_1-40의 수준이 대조 또는 비교 견본의 수준과 다른 지의 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 다른 구현양태에서, 본 발명은 개체의 견본(샘플)을 접촉시키고 Aβ_1-40 발현의 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

진단 적용을 위하여, 이에 한정되지 않지만 방사성동위원소, 형광 표지 및 각종 효소-기질 표지를 포함하는 검출가능한 잔기로 항체를 표지화할 수 있다. 표지를 항체에 접합시키는 방법이 당 기술분야에 알려져 있다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 본 발명의 항체는 표지화되는 것이 필요하지 않고, 본 발명의 항체에 결합하는 표지화 항체를 사용하여 그의 존재를 검출할 수 있다.

공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석 및 면역침전 분석과 같은 공지된 분석 방법에서 본 발명의 항체를 사용할 수도 있다. 문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press,Inc. 1987)].

생체내 영상화와 같은 생체내 진단 분석을 위하여 항체를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 면역신티오그래피를 사용하여 주요 세포 또는 조직이 국소화될 수 있도록 항체를 방사성핵 (예컨대 ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I 또는 ³H)으로 항체를 표지화한다.

당 기술분야에 공지된 기술에 따라서, 병리학에서의 염색 시약으로서 항체를 사용할 수도 있다.

AD 위험이 있거나 AD로 진단된 대상체의 진단을 위해 뇌 아밀로이드 적재량을 측정하고 치료 및 질병 상태의 진행을 평가하기 위하여, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체를 사용할 수도 있다. 모노클로날 항-Aβ 항체의 말초 투여에 의해 혈장 Aβ가 급속히 증가되고, 이러한 증가 정도는 해마 및 피질에서 아밀로이드 적재량과 높은 상관관계를 갖는 것으로 보고되어 있다. 문헌 [DeMattos 등, Science 295: 2264-2267 (2002)]. 일부 구현양태에서, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체를 대상체에게 투여하고, 혈장 내에서 Aβ의 수준을 측정하고, 이에 의해 혈장 Aβ에서의 증가는 대상체에서 뇌 아밀로이드 적재량의 존재 및/또는 수준을 표시한다. 치료 유효성 및 질병 상태를 검사하고, 장래의 투여량 및 빈도를 결정하기 위하여 이러한 방법을 사용할 수도 있다. 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체는 양호한 안전성 프로파일을 가질 수도 있고, 이러한 진단 용도를 위해 장점을 제공한다.

치료적 목적을 위하여 항-Aβ 항체의 사용 방법

대상체의 뇌에서 단백질의 이상 침착을 특징으로 하는 질병의 발생을 치료, 예방 및 억제하기 위한 방법에서 여기에 기재된 항체(폴리펩티드 포함), 폴리뉴클레오티드, 및 제약 조성물이 사용될 수 있다. 방법은 단백질 또는 단백질 침착물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체는 손상된 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, 프리온 질병의 예방 및/또는 치료를 위하여 프리온 단백질 또는 프리온 단백질의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 대상체에게 투여할 수도 있고; 파킨슨씨 병의 예방 및/또는 치료를 위하여 사이뉴클레인(예, 알파-사이뉴클레인) 또는 사이뉴클레인의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 대상체에게 투여할 수도 있다.

알쯔하이머병 및 변경된 Aβ 또는 βAPP 발현과 관련된 다른 질병, 또는 Aβ펩티드의 축적 또는 침착 (집합적으로 "Aβ-관련 질병"이라 명명)과 관련된 질병, 예컨대 다운 증후군, 파킨슨씨 병, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈관에서 Aβ펩티드의 침착을 특징으로 하는 혈관 질환 (예컨대 졸중 및 HCHWA-D)의 발생을 치료, 예방 및 억제하기 위한 방법에서, 여기에 기재된 항체(폴리펩티드 포함), 폴리뉴클레오티드 및 제약 조성물을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예방적 적용에서, 질병의 발생 동안에 질병의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적 증상, 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질병의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 심각성을 저하시키거나 개시를 지연시키기 위해 충분한 양으로 제약 조성물 또는 약제를 알쯔하이머병(또는 기타 Aβ-관련 질병)에 걸리거나 또는 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여한다. 치료적 적용에서, 질병의 발생에서 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질병의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적)을 치료하거나 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 이러한 질병이 의심되거나 이미 앓고 있는 대상체에게 조성물 또는 약제를 투여한다.

본 발명은, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 알쯔하이머병(또는 기타 Aβ-관련 질병)과 연관된 증상의 발생을 지연시키는 방법을 제공한다. 알쯔하이머병과 관련된 증상은, 이에 한정되지 않지만 기억, 문제 해결, 언어, 계산, 공간 시각 개념, 판단 및 행동의 이상을 포함한다.

본 발명은, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크의 형성 및/또는 Aβ 축적을 억제하거나 저지시키는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, Aβ 축적은 대상체의 순환계에서 일어난다.

본 발명은, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크를 감소시키고/시키거나 Aβ 축적을 감소 또는 느리게 하는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, Aβ 축적은 대상체의 순환계에서 일어난다.

본 발명은 또한, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 플라크 및/또는 Aβ 축적을 제거 또는 정화하는 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 뇌에 존재한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 플라크는 대상체의 대뇌 혈관계에 존재한다. 다른 구현양태에서, Aβ 축적은 대상체의 순환계에서 일어난다.

본 발명은, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 조직(예컨대 뇌)에서 Aβ 펩티드를 감소시키고, 조직(예컨대 뇌)에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제 및/또는 감소시키고, 조직(예컨대 뇌)에서 Aβ 펩티드의 독성 효과를 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. Aβ 폴리펩티드는 가용성, 올리고머 또는 침착된 형태로 존재할 수도 있다. Aβ의 올리고머 형태는 2 내지 50개 Aβ 폴리펩티드로 구성될 수도 있고, 이것은 1-40 및 1-42 펩티드의 전체 길이의 혼합물 및/또는 이러한 펩티드의 끝이 절단된 변형체일 수 있다.

본 발명은, 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Aβ의 아밀로이드 침착물과 연관된 질병, 예컨대 알쯔하이머병과 연관된 인지 개선 또는 인지 저하의 반전 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 베타-아밀로이드 펩티드 또는 베타-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 항체가 자연 발생 Fc 영역으로부터의 변형을 갖는 Fc 영역을 포함하고, 이러한 변형에 의해 이펙터 기능이 손상되며, 이에 의해 항체의 투여가 변형을 갖지 않은 항체의 투여에 비해 대뇌 미세출혈을 덜 일으키는, Aβ의 아밀로이드 침착과 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

뇌에서 단백질의 침착 이상은 다수의 질병과 관련되고, 이의 일부는 아밀로이드-형성 단백질의 동시 침착에 기인하여 아밀로이드 질병 또는 아밀로이드증으로서 특징화될 수 있다.

아밀로이드증은 단백질 피브릴의 세포외 침착을 특징으로 하는 질병이고, 이것은 아밀로이드 침착을 형성한다. 대다수의 상태가 말초에서 아밀로이드 침착과 관련되지만, 중추 신경계 피브릴 침착이 두드러지는 다수의 아밀로이드증이 존재한다. WO 00/72876호는 다수의 중추 및 말초 아밀로이드증을 기재한다.

알쯔하이머병이 가장 잘 알려져 있고, 아마도 중추 신경계의 가장 일반적인 아밀로이드 질병일 것이다. 이러한 상태는 이하 요약되는 바와 같이 A-베타-함유 플라크 및 신경세동성 매듭을 특징으로 한다. 다운 증후군에서와 마찬가지로, 노인성 치매의 다양한 형태가 유사한, 그러나 덜 진행성인 A-베타 플라크 형성과 관련된다.

엔도스타틴 (콜라겐 XVIII의 20kDa C-말단 단편)의 이상 침착이 알쯔하이머 환자의 뇌에서 관찰되고, 이때 아밀로이드-베타(1-40)과 함께 동시-국소화된다. 문헌[Deininger,M.H., 등 (2003) J.Neurosci 22(24): 10621-10626].

아밀로이드형성 단백질 시스타틴 C의 변형체인 L68Q 시스타틴 C이, 아밀로이드 혈관병증의 유전 형태(유전성 시스타틴 C 아밀로이드 혈관병증)에서 젊은 성인의 뇌 출혈 및 사망을 일으키는 대량 대뇌 아밀로이드증과 연관된다. 알쯔하이머병에서 아밀로이드 플라크의 성분으로서 A-베타 펩티드와 관련되는 시스타틴 C의 일반적인 변형체 (wt¹ 시스타틴 C)가 발견될 수 있다.

외인성 요인이 시스타틴 C(L68Q 또는 wt¹ 시스타틴 C)의 이량체 형성을 억제할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 연구에서, 닐슨 및 그의 공동 작업자들은 용액 중에서 2가지 변형체 단백질의 단량체 형태와 함께 wt¹ 시스타틴 C에 지시된 항체를 배양하였으며, 단백질의 이량화 감소를 관찰하였다. 문헌[Nilsson M. 등,(2004) J.Biol.Chem. 279(3): 24236-45].

다운 증후군은, 부분적으로 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 기타 단백질 (슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 및 S100-베타) - 모두 다운 좌에 위치함 - 을 포함하는 유전자의 구성적인 발현 증가에 기인하여, A-베타 펩티드 플라크 침착, 세포고사 세포 사멸 및 이상 수상 분지를 특징으로 한다. 또한, 다운 좌 (염색체 21의 단편 내 유전자)에 결합되지 않은 유전자의 이상 발현이 존재한다 - GAP-43, 질산 산화물 합성효소 3, 뉴런 thread 단백질, 전-세포고사 유전자, 예컨대 p53, 백스 및 LI-1 베타-전환 효소. 이러한 비-다운 좌 유전자의 발현은 이영양성 신경염 및 세포고사 세포 사멸의 증식과 상관관계를 갖는다. [de la Monte, S.M. 1999, J Neural Transm.Suppl. 57:1-19].

A-베타 펩티드로부터 형성된 아밀로이드 플라크의 뇌 침착은 HIV-AIDS 환자에서 일반적인 병리학적 특징이다. 문헌[Green,D.A. 등, (2005) AIDS 19(4): 407-11]. 유사하게, 인간에서 외상 뇌 손상 직후에 A-베타 펩티드-함유 플라크의 침착이 또한 관찰되었으며, 여기서 A-베타가 팽윤된 축색돌기에서 APP 및 신경필라멘트 단백질과 함께 공동-국소화된다. 문헌[Smith,D.H. 등 (2003): 98(5): 1072-7]. 또한, 말기 단계 후천성 면역결핍증(AIDS)을 갖는 환자의 뇌는 증가된 수준의 유비퀴틴-염색된 도트형태 침착물(Ub-도트)를 갖는 것으로 나타났다. 문헌[Gelman,B.B., 및 Schuenke,K. (2004) J.Neurovirol 10(2): 98-108].

아밀로이드종은 CNS 아밀로이드증의 비교적 희귀한 형태이고, 아밀로이드 종양의 형태, 보통 맥락막총의 형태로 나타나고, 백색 물질로 2차 연장된다. 뇌 실질의 일차 아밀로이드종은 아밀로이드 AL 람다 경쇄로 이루어진 병변을 포함한다. 문헌[Tabatbai,G. 등, (2005) Arch Neurol. 62(3): 477-80].

가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)의 트랜스타이레틴 Tyr77(Tyr77 FAP) 변형체를 위한 유전자(들)를 보유한 환자에서의 뇌 MRI에서 다촛점 백색물질 병변이 관찰되었다. 문헌 [Lossos,A. 등, Eur.Neurol. 2005. 53(2): 55-9].

가족성 연수막 아밀로이드증은 트랜스타이레틴(TTR) 변형체 Asp18Gly(D18G)의 유전적 비정상과 연관된다. 문헌 [Jin,K. 등 J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry (2004) 75(10): 1463-66]. TTR의 D18G 변형체 형태는 헝가리언 환자에서 CNS 아밀로이드증을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 하나의 보고에 따르면, 단백질의 사량체 형태의 소 분자 안정화제가 아밀로이드발생증을 예방할 수 있다. 문헌[Hammarstrom,P. 등 (2003) Biochemistry 42(22): 6656-63].

알파-사이뉴클레인을 코딩하는 유전자에서의 돌연변이는 파킨슨씨 병의 적어도 일부 가족성 형태의 원인이 되는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 알파-사이뉴클레인은 뉴런 및 아교세포 포함물을 형성하도록 비정상적으로 유도체화되는 것으로 밝혀졌다. 알파 사이뉴클레인은 시험관내에서 원섬유를 형성하고, 이것은 뇌 아밀로이드증으로서 파킨슨씨 병의 범주를 유도한다. 문헌[Trojanowski,J.Q. 및 Lee,V.M. (2003) Ann NY Acad.Sci. 991: 107-110].

희소돌기아교세포에서 알파-사이뉴클레인 형태는 다발성 전신 위축증(MSA)을 특징화한다. 문헌[Kahle,P.M. 등, 2002, EMBO rep. 3(6): 583-8].

PrP^sc는 뉴론 및 기타 세포의 세포 막에 부착된 구리-결합 당단백질인 세포 프리온 단백질의 이상 형태이다 (PrP^c). PrP 아밀로이드 축적은 PrP 뇌 아밀로이드 혈관병증(PrP-CAA)과 보통 관련되고, 이때 축적은 신경섬유 매듭 및 혈관 아밀로이드로 존재하고, 게르츠만-스트라우저 쉐잉커 질병에 존재하며, 이때 실질 아밀로이드증이 신경섬유 매듭의 해면상 퇴화와 관련되어 나타날 수도 있다. 문헌[Ghetti,B. 등, Clin.Lab.Med. (2003) 23(1): 65-85]. PrP^sc 침착이 또한 인간 해면상 뇌병증 (변형 크로츠펠트-야콥 질병)에서 발견된다. 항-PrP 단일사슬 Fv 소항체에 의한 프리온 증식의 측분비 억제가 보고되었다. 문헌[Heppner 등, J.Viol. 79:8330-8; 2005].

하기 표는 이상 뇌 단백질 침착 및 침착물의 단백질 성분과 관련된 질병의 예를 요약한 것이다. 당 기술분야에 공지된 방법 및 여기에 기재된 방법 또는 당 기술분야에 공지된 항체를 사용하여 이러한 성분에 대항한 항체를 생성할 수도 있다.

상태	단백질 성분(들)
알쯔하이머병	A-베타 펩티드 wt¹ 시스타틴 C 엔도스타틴
아밀로이드종	A-람다 경쇄
뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)	1. A-베타 펩티드 2. L68Q 시스타틴 C 3. PrP^sc
해면상 뇌병증 (변형 크로츠펠트-야콥 병)	PrP^sc
가족성 아밀로이드 다발신경병증	트랜스타이레틴 변형체 Tyr77
AIDS	1. A-베타 펩티드 2. 유비퀴틴
외상 뇌 손상	A-베타 펩티드
가족성 연수막 아밀로이드증	트랜스타이레틴 변형체 Asp18Gly (D18G)
파킨슨씨 병	알파 사이뉴클레인
게르츠만-스트라우슬러-쉐잉커 병	PrP^sc
다운 증후군	A-베타 펩티드 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 S100-베타 GAP-43 질산 산화물 합성효소 3 뉴론 사상 단백질 P53 Bax LI-1 베타-전환 효소
다발성 전신 위축증	알파-사이뉴클레인

여기에 기재된 방법 (예방 또는 치료 포함)은 단일 시점 또는 다중 시점에서 하나 또는 여러 부위로의 1회 직접 주입에 의해 달성될 수 있다. 투여는 여러 부위에 거의 동시적일 수 있다. 치료 과정에서 투여 빈도를 결정하고 조절할 수 있으며, 원하는 결과를 달성하는 것을 기초로 한다. 일부 경우에, 본 발명의 항체 (폴리펩티드 포함), 폴리뉴클레오티드, 및 제약 조성물의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수도 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당 기술분야에 공지되어 있다.

환자, 대상체 또는 개체는 인간, 소, 말, 개, 고양이, 돼지 및 양 동물과 같은 포유동물을 포함한다. 대상체는 바람직하게는 인간이고, 질병에 걸리거나 걸리지 않을 수도 있거나 현재 증상을 나타낼 수도 있다. 알쯔하이머병의 경우에, 충분히 오래 생존한다면 실제로 누구라도 알쯔하이머병에 걸릴 위험이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상체 환자의 위험을 판단할 필요 없이도 일반적인 집단에게 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명은 알쯔하이머병의 공지된 유전적 위험을 갖는 개체를 위해 유용하다. 이러한 개체들은 이러한 질병을 경험한 친척을 갖는 개체, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정된 위험을 갖는 개체를 포함한다. 알쯔하이머병의 위험의 유전적 마커는 APP 유전자의 돌연변이, 특히 각각 하디 및 스웨디시 돌연변이라 일컬어지는 위치 717, 및 위치 670 및 671에서의 돌연변이를 포함한다 (문헌 [Hardy(1997) Trends Neurosci. 20: 154-9] 참조). 다른 위험 마커는 프레제닐린 유전자, PS1 및 PS2, 및 아포E4에서의 돌연변이, AD의 가족 병력, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성동맥경화증이다. 현재 알쯔하이머병을 앓고 있는 개체는 치매의 특징 뿐만 아니라 상기 기재된 위험 요인의 존재로부터 인식될 수 있다. 또한, AD를 갖는 개체를 동정하기 위하여 다수의 진단 시험을 이용할 수 있다. 이들은 CSF tau 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 높은 tau 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 나타낸다. 알쯔하이머병을 앓고 있는 개체는 ADRDA (알쯔하이머병 및 관련된 질병 연합) 기준에 의해 진단될 수 있다. 무증상 환자에서는 어떠한 연령(예, 10, 20, 30세)에서도 치료를 시작할 수 있다. 그러나, 보통 환자가 40, 50, 60 또는 70세에 이르를 때까지 치료를 시작할 필요는 없다. 치료는 전형적으로 장기간에 걸쳐 다중 투여를 필요로 한다. 치료는 장기간에 걸쳐 당 기술분야에 공지된 여러 방법으로 추적될 수 있다. 잠재적 다운 증후군 환자의 경우에, 치료제를 모체에 투여함으로써 출산 전에 치료를 시작할 수 있거나 출생 직후에 치료를 시작할 수 있다.

상기 방법에서 사용될 수 있는 제약 조성물은 여기에 기재된 항체, 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 표 3에 나타낸 항체 9TL 또는 그의 변형체이다. 일부 구현양태에서, 항체는 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 불변 영역을 포함하는 항체이다.

투여 및 투여량

항체를 담체, 바람직하게는 제약상 허용가능한 담체 중에서 포유동물에 바람직하게 투여한다. 적절한 담체 및 그들의 제형이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, A.Gennaro,ed., Mack Publishing Co., Easton,PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 제20판, Mack Publishing, 2000]에 기재되어 있다. 전형적으로, 제제를 등장성으로 만들기 위하여 적절한 양의 제약상 허용가능한 염이 사용된다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 또한, 담체는 지속 방출 제제, 예컨대 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하고, 이 기질은 성형품의 형태, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 미소입자이다. 당업자라면, 예를 들어 투여 경로 및 투여되어지는 항체의 농도에 의존하여 특정한 담체가 더욱 바람직할 수 있다는 것을 명백히 알 것이다.

항체는 주사 (예를 들어, 전신, 정맥, 복강내, 피하, 근육내, 문맥내, 뇌내, 뇌실내 및 비내)에 의해 또는 주입과 같은 기타 수단에 의해 포유동물에 투여될 수 있고, 이것은 효과적인 형태로 혈류에 전달되는 것을 보장한다. 국소적인 치료 효과를 발휘하기 위하여, 항체는 단리된 관류 기술, 예컨대 단리된 조직 관류에 의해 투여될 수도 있다. 정맥 주사가 바람직하다.

항체를 투여하기 위해 효과적인 투여량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있고, 이러한 결정을 행하는 것은 당 분야의 기술 범위 내에 있다. 당업자라면 투여되어야할 항체의 투여량이 예를 들어 항체를 받는 포유동물, 투여 경로, 사용되는 특정한 유형의 항체, 및 포유동물에 투여되는 기타 약물에 의존하여 변한다는 것을 이해할 것이다. 항체를 위해 적절한 투여량을 선택함에 있어서의 지침은 항체의 치료적 용도에 관한 문헌, 예를 들어 [Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone 등., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch22 및 pp.303-357; Smith 등, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber 등, eds., Raven Press, New York, 1977, pp365-389]에서 찾아볼 수 있다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인에 의존하여 1일당 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg체중 또는 그 이상일 수도 있다. 일반적으로, 하기 투여량이 사용될 수도 있다: 적어도 약 50mg/kg 체중의 투여량; 적어도 약 10mg/kg 체중; 적어도 약 3mg/kg 체중; 적어도 약 1mg/kg 체중; 적어도 약 750㎍/kg 체중; 적어도 약 500㎍/kg 체중; 적어도 약 250㎍/체중; 적어도 약 100㎍/kg 체중; 적어도 약 50㎍/kg 체중; 적어도 약 10㎍/kg 체중; 적어도 약 1㎍/kg 체중 또는 그 이상이 투여된다. 항체는 잠재적인 부작용, 예컨대 일시적인 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 피하기 위해 치료 시작에서 더 낮은 빈도로 또는 더 낮은 투여량으로 투여될 수도 있다.

일부 구현양태에서, 하나 이상의 항체가 존재할 수도 있다. 이러한 조성물은 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 본 발명의 상이한 항체 (폴리펩티드 포함)를 함유할 수도 있다.

항체는 유효량의 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 포유동물에 투여될 수도 있다. 항체는 하나 이상의 다른 치료제와 연속적으로 또는 동시에 투여될 수도 있다. 항체 및 치료제의 양은 예를 들어 사용되는 약물의 유형, 치료되어지는 병리학적 상태, 및 투여 스케쥴 및 경로에 의존되지만, 개별적으로 사용될 때에 비해 일반적으로 더 낮다.

포유동물에 항체를 투여한 후에, 포유동물의 병리학적 상태는 당 기술분야의 개업의에게 공지된 다양한 방식으로 검사될 수 있다.

상기 투여 경로 및 투여량은 여기에 기재된 폴리펩티드를 위해 적합할 수 있다.

바람직한 세포에서 항체 또는 폴리펩티드의 전달 및 발현을 위하여, 여기에 기재된 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 항체의 발현을 지시하기 위하여 발현 벡터가 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 발현 벡터는 전신, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하내, 경막내, 경구, 장관내, 비경구, 비내, 피부를 통해 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 건 또는 카테터 투여, 및 국소 투여를 포함하여 국소 또는 전신 투여를 포함한다. 당업자라면 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 얻기 위해 발현 벡터의 투여와 친숙하다. 예를 들어 미국 특허 6,436,908; 6,413,942 및 6,376,471호 참조.

본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료적 조성물의 표적 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 예를 들어 문헌 [Findeis 등, Trends Biotechnol. (1993) 11-202; Chiou 등, Gene Therapeutics: Methods And Applications of Direct Gene Transfer (J.A.Wolff 등) (1994); Wu 등, J.Biol.Chem. (1988) 263:621; Wu 등, J.Biol.Chem. (1994) 269:542; Zenke 등, Proc.Natl.Acad.Sci., (USA) (1990) 87:3655; Wu 등, J.Biol.Chem. (1991) 266:338]에 기재되어 있다. 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위하여 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물을 약 100ng 내지 약 200mg DNA의 범위로 투여한다. 유전자 요법 프로토콜 동안에 약 500ng 내지 약 50mg, 약 1㎍ 내지 약 2mg, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 및 약 20㎍ 내지 약 100㎍의 DNA의 농도 범위가 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 운반체를 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 운반체는 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다 (일반적으로 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148] 참조). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종성 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 조직적일 수 있거나 조절될 수 있다.

원하는 세포에서 원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 발현을 위한 바이러스-기초 벡터가 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일례의 바이러스-기초 운반체는 이에 한정되지 않지만 재조합체 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 5,219,740호; 4,777,127호; GB 특허번호 2,200,651호; 및 EP 0 345 242), 알파바이러스-기초 벡터 (예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포리스트 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스 (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) 및 베네주엘란 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노-결합 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다 (예를 들어, PCT 공개번호 WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조). 문헌[Curiel,Hum.Gene Ther. (1992) 3:147]에 기재된 바와 같이 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.

이에 한정되지 않지만, 사멸된 아데노바이러스 단독에 결합되거나 결합되지 않은 다가양이온성 축합 DNA (예를 들어, Curiel,Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147 참조); 리간드-결합 DNA (예를 들어, Wu, J.Biol.Chem. (1989) 264: 16985 참조); 진핵 세포 전달 운반체 세포 (예를 들어 미국 특허 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338) 및 핵 전하 중화 또는 세포 막과의 융합을 포함하여, 비-바이러스 전달 운반체 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 나 DNA가 또한 사용될 수 있다. 일례의 나 DNA 도입 방법이 PCT 공개번호 WO 90/11092 및 미국 특허 5,580,859호에 기재되어 있다. 유전자 전달 부형제로서 작용할 수 있는 리포좀이 미국 특허 5,422,120호; PCT 공개번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0 524 968호에 기재되어 있다. 추가의 접근이 문헌[Philip, Mol.Cell.Biol. (1994) 14:2411 및 Woffendin, Proc.Natl.Acad.Sci. (1994) 91:1581]에 기재되어 있다.

키트

본 발명은, 여기에 기재된 병리학적 상태, 예컨대 알쯔하이머병 또는 기타 Aβ-관련 질병 (예컨대 다운 증후군, 파킨슨씨 병, 다발 경색 치매, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈관에서 Aβ 펩티드의 침착에 기인한 혈관 질환 (예컨대 졸중 및 HCHWA-D)를 치료하기 위해, 또는 Aβ 또는 βAPP의 검출 또는 정제를 위해 유용한 물질을 함유하는 키트 및 제품을 제공한다. 제품은 표지를 갖는 용기를 포함한다. 적절한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 형성될 수도 있다. 용기는 병리학적 상태를 치료하거나 Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하기 위해 효과적인 활성 약제를 갖는 조성물을 보유한다. 조성물 중의 활성제는 항체이고 바람직하게는 Aβ 또는 βAPP에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 포함한다. 일부 구현양태에서, 활성제는 항체 9TL 또는 항체 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 활성제는 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-Aβ 항체 또는 폴리펩티드는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 불변 영역은 손상된 이펙터 기능을 갖는다. 용기 위의 표지는, 조성물이 알쯔하이머병과 같은 병리학적 상태를 치료하거나 Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하기 위해 사용되고, 상기 기재된 바와 같이 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지시를 표시할 수도 있다.

본 발명은 여기에 기재된 항체(예컨대 9TL), 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 중의 어느 것을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 키트는 상기 기재된 용기를 포함한다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 키트는 상기 기재된 용기 및 완충액을 포함하는 두번째 용기를 포함한다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 여기에 기재된 방법(예컨대 알쯔하이머병의 치료 방법 및 뇌에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하거나 감소시키기 위한 방법)을 수행하기 위한 지시를 갖는 포장 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 포함할 수도 있다. Aβ 또는 βAPP를 검출하거나 정제하기 위해 사용되는 키트에서, 항체를 검출가능한 마커, 예를 들어 방사성동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광성 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지화한다.

일부 구현양태에서, 본 발명은, 약제로서의 용도이든지 및/또는 약제의 제조를 위한 용도이든지 간에, 여기에 기재된 방법에서 사용하기 위한 조성물(본 명세서에 기재됨)을 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 예증하기 위해 제공된다.

실시예 1. 항체 9 TL 및 그의 변형체의 결합 친화력 결정

A. 일반적 방법.

하기 일반적 방법을 실시예에서 사용하였다.

클론 특징화에서 사용되는 발현 벡터

항체의 Fab 단편의 발현은 문헌 [Barbas (2002) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10]에 기재된 것과 유사한 IPTG 유도성 lacZ 프로모터의 제어하에 있었다. 그러나, 벡터(pComb3X) 변형은 하기 추가의 도메인의 첨가 및 발현을 포함하였다: 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 IgG2a 인간 면역글로불린의 CHI 불변 도메인, Ig 감마-2 사슬 C 영역, 단백질 획득 번호 P01859; 면역글로불린 카파 경쇄(호모사피엔스), 단백질 획득 번호 CAA 09181.

소규모 Fab 제조

96웰 플레이트에서 Fab의 소규모 발현을 다음과 같이 수행하였다. Fab 라이브러리로 형질전환된 이.콜리로부터 출발하여, 마스터 플레이트(한천LB + 암피실린 (50㎍/ml) + 2% 글루코스) 및 작업 플레이트 (2ml/웰, 1.5ml의 LB + 암피실린 (50㎍/ml) + 2% 글루코스를 함유하는 96웰/플레이트) 양쪽 모두를 접종하기 위하여 콜로니를 골랐다. 양쪽 플레이트를 30℃에서 8 내지 12시간동안 생육시켰다. 마스터 플레이트를 4℃에서 보관하고, 작업 플레이트로부터의 세포를 5000rpm에서 펠릿화하고 1mL의 LB + 암피실린 (50㎍/ml) + 1mM IPTG로 재현탁하여 Fab의 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간 발현 시간 후에 원심분리에 의해 세포를 수집한 다음, 500㎕의 완충액 HBS-P (10mM HEPES 완충액 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% P20)에 재현탁하였다. 1회 주기의 동결(-80℃) 다음에 37℃에서 해동함으로써 HBS-P 현탁된 세포의 용균을 달성하였다. 세포 용균액을 5000rpm 에서 30분동안 원심분리하여 Fab를 함유하는 현탁액으로부터 세포 파편을 분리하였다. 상층액을 바이아코어 플라스몬 공명 장치 내에 주입하여, 각각의 Fab에 대한 친화력 정보를 수득하였다. 이하 기재된 바와 같이 대규모 Fab 생성 및 세부 특징화를 위하여 Fab를 발현하는 클론을 마스터 플레이트로부터 구하여 DNA를 서열화하였다.

대규모 Fab 제조

상세한 동역학적 매개변수를 수득하기 위하여, Fab를 발현하고 큰 배양물로부터 정제하였다. 200mL의 LB + 암피실린 (50㎍/ml) + 2% 글루코스를 함유하는 엘렌마이어 플라스크에, 선택된 Fab-발현 이.콜리 클론으로부터의 5mL의 밤새 배양액으로 접종하였다. 1.0의 OD_550nm이 달성될 때까지 클론을 30℃에서 배양하고, 배지를 200ml의 LB + 암피실린(50㎍/ml) + 1mM IPTG로 대체함으로써 유도하였다. 30℃에서 5시간 발현 시간 후에, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한 다음 10mL의 PBS (pH 8)에 재현탁하였다. 2회 주기의 동결/해동 (각각 -80℃ 및 37℃)에 의해 세포의 용균을 수득하였다. 세포 용균액의 상층액을 PBS(pH 8)로 평형화된 Ni-BTA 슈퍼플로우 세파로스(미국 캘리포니아주 발렌시아 퀴아겐) 컬럼 위에 부하한 다음, PBS(pH 8)의 5개 컬럼 부피로 세척하였다. 각각의 Fab를 PBS(pH8) + 300mM 이미다 졸로 상이한 분획으로 용출하였다. Fab를 함유하는 분획을 모으고 PBS에 투석한 다음, 친화력 특징화에 앞서서 ELISA에 의해 정량화하였다.

전체 항체 제조

전체 항체의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포유동물 발현 벡터에 클론화하고, 리포펙타민을 사용하여 일시적인 발현을 위해 HEK 293 세포 내로 이입하였다. 표준 방법을 사용하여 단백질 A를 사용하여 항체를 정제하였다.

벡터 pDb.9TL.hFc2a는 9TL 항체의 중쇄를 포함하는 발현 벡터이고, 중쇄의 일시적인 또는 안정한 발현을 위해 적절하다. 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오티드 1-612); 합성 인트론(뉴클레오티드 619-1507); DHFR 코딩 영역(뉴클레오티드 707-1267); 인간 성장 호르몬 시그날 펩티드 (뉴클레오티드 1525-1602); 9TL의 중쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1603-1951); 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김; 문헌[Eur.J.Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참조)를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역; SV40 후 폴리아데닐화 시그날 (뉴클레오티드 2960-3203); SV40 인핸서 영역(뉴클레오티드 3204-3449); 파지 f1 영역 (뉴클레오티드 3537-4992) 및 베타 락타마제 (AmpR) 코딩 영역 (뉴클레오티드 4429-5286). 벡터 pDb.9TL.hFc2a를 2004년 7월 20일에 ATCC에 기탁하였으며, ATCC 수탁번호 PTA-6124를 부여받았다.

벡터 pEb.9TL.hK는 9TL 항체의 경쇄를 포함하는 발현 벡터이고 경쇄의 일시적인 발현을 위해 적절하다. 벡터 pEb.9TL.hK는 하기 영역: 뮤린 사이토메갈로바 이러스 프로모터 영역(뉴클레오티드 1-612); 인간 EF-1 인트론 (뉴클레오티드 619-1142); 인간 성장 호르몬 시그날 펩티드 (뉴클레오티드 1173-1150); 항체 9TL 경쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1251-1593); 인간 카파 사슬 불변 영역(뉴클레오티드 1594-1914); SV40 후 폴리아데닐화 시그날(뉴클레오티드 1932-2175); SV40 인핸서 영역(뉴클레오티드 2176-2421); 파지 f1 영역 (뉴클레오티드 2509-2964) 및 베타 락타마제 (AmpR) 코딩 영역 (뉴클레오티드 3401-4258)에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 벡터 pEb.9TL.hK는 2004년 7월 20일에 ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-6125를 부여받았다.

바이아코어 분석

바이아코어 3000^TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(바이아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카웨이)을 사용하여 9TL 모노클로날 항체의 친화력을 결정하였다. 친화력을 결정하는 한가지 방법은 CM5 칩 위에서 9TL을 고정화하고 항체에 대한 Aβ_1-40 펩티드의 결합 동역학을 측정하는 것이었다. CM5 칩을 공급업자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항체 9TL 또는 그의 변형체를 10mM 아세트산나트륨 pH 4.0 또는 5.0으로 희석하고, 0.005mg/mL의 농도에서 활성화된 칩 위에 주입하였다. 각각의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 사용하여, 항체 밀도의 범위를 달성하였다: 1000-2000 또는 2000-3000 반응 단위(RU). 에탄올아민으로 칩을 봉쇄하였다. 재생 연구는, 2부피의 PIERCE 용출 완충 액 및 1 부피의 4M NaCl을 함유하는 용액이, 200회 이상의 주입 동안에 칩 위에서 9TL의 활성을 유지하면서, 결합된 Aβ_1-4 펩티드를 효과적으로 제거하였음을 나타내었다. 모든 바이아코어 분석을 위해 주행 완충액으로서 HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하였다. 정제된 Aβ_1-40 합성 펩티드 샘플의 연속 희석 (0.1-10x 산출된 K_D)을 100㎕/분으로 1분동안 주입하고, 10분의 해리 시간이 허용되었다. 바이아 평가 프로그램을 사용하여 1:1 랭무어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H.Fagerstam, L.Petersson,B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 데이타를 맞춤으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on로서 계산하였다.

대안적으로, SA 칩 위에 Aβ_1-40 펩티드를 고정화하고, 고정화 Aβ_1-40 펩티드에 대한 9TL Fab 및 9TL 변형체의 Fab의 결합 동역학을 측정함으로써 친화력을 결정하였다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템 (바이아코어 3000^TM, 바이아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카웨이)에 의하여 9TL Fab 단편 및 그의 변형체 Fab 단편의 친화력을 결정하였다. 공급업자의 지시에 따라서 SA 칩(스트렙타비딘)을 사용하였다. 비오티닐화 Aβ 펩티드 1-40을 HBS-EP (10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20) 내로 희석하고, 0.005mg/mL의 농도로 칩 위에 주입하였다. 각각의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 사용하여, 항원 밀도의 2개 범위를 달성하였다: 상세한 동역학적 연구를 위한 10-200 반응 단위(RU) 및 농도 연구 및 선별을 위한 500-600RU. 재생 연구는, 100mM 인산 (그 다음에, 50mM NaOH 2부피 및 70% 에탄올 1부피를 함유하는 용액일 수도 있다)이 200회 이상의 주입 동안에 칩 위에서 Aβ 펩티드의 활성을 유지하면서, 결합된 Fab를 효과적으로 제거함을 나타내었다. 모든 바이아코어 분석을 위하여 주행 완충액으로서 HBS-EP 완충액을 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석 (0.1-10x 산출된 KD)을 2분동안 100㎕/분으로 주입하고, 10분의 해리 시간이 허용되었다. Fab 단백질의 농도를, 공지된 농도의 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정하였다 (아미노산 분석에 의해 결정됨). 바이아 평가 프로그램을 사용하여 1:1 랭무어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H.Fagerstam, L.Petersson,B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 데이타를 맞춤으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on로서 계산하였다.

B. Aβ _1-40 에 대한 항체 9 TL 및 그의 변형체의 결합 친화력

항체 9TL의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도 1에 나타낸다. 상기 기재된 바이아코어의 방법을 사용하여 결정된 Aβ_1-40에 대한 9TL 항체의 결합 친화력을 하기 표 2에 나타낸다.

항체 9TL 및 Fab 단편의 결합 친화력
	k_on(1/Ms)	K_off(1/s)	K_D(nM)
CM5 칩 위의 9TL mAb, 그 위로 유동하는 Aβ_1-40	4.25 x 10⁵	3.89 x 10^-4	0.9
SA 칩 위의 Aβ_1-40, 그 위로 유동하는 9TL Fab	3.18 x 10⁵	3.59 x 10^-4	1.13

9TL의 변형체의 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 변형체의 모든 아미노산 치환을 9TL의 서열에 대해 기재한다. 9TL 변형체의 Fab 단편의 결합 친화력을 표 3에 나타낸다. K_D 및 기타 동역학적 매개변수를 SA 칩 위에서 고정화된 Aβ_1-40와 함께 상기 기재된 바이아코어 분석에 의해 결정하였다.

1= 모든 CDR은 카뱃 및 코티아 CDR을 모두 포함하는 연장된 CDR이다. 아미노산 잔기를 연속적으로 번호매겼음.

2= 밑줄친 k_on을 실험적으로 결정하였다. 다른 것들은 9TL에서와 동일한 것으로 평가되었음.

3= K_D 값을 K_D = k_off/k_on으로서 계산하였음.

실시예 2: 항체 9 TL 이 결합하는 Aβ1-40 펩티드 위에서 에피토프의 특징화

항체 9TL에 의해 인식되는 Aβ 폴리펩티드 위에서 에피토프를 결정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명(SPR, 바이아코어 3000) 결합 분석을 사용하였다. 비오틴(콜로라도주 글로벌 펩티드 서비스)에 결합된 Aβ_1-40 폴리펩티드를 스트렙타비딘-코팅된 칩 (SA) 칩 위에 고정화하였다. Aβ 펩티드의 상이한 가용성 단편(10 M에서, 캘리포니아주 아메리칸 펩티드 컴퍼니 인코포레이티드로부터)의 존재 또는 부재하에서 고정화된 Aβ_1-40에 대한 Aβ 항체 Fab 단편(50nM에서)의 결합. Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43의 아미노산 서열을 하기 표 4에 나타낸다. Aβ_1-40에 대한 항체 9TL Fab 단편의 결합을 대체하는 Aβ 펩티드는 각각 Aβ_28-40, Aβ_1-40, Aβ_33-40 및 Aβ_17-40이었다 (도 2). 따라서, 항체 9TL이 Aβ_1-40의 C-말단 펩티드(33-40)에 결합한다. 도 2에 나타낸 것과 같이, Aβ_1-28, Aβ_28-42, Aβ_22-35, Aβ_1-16, Aβ_1-43 및 Aβ_1-38 펩티드는 항체 9TL Fab 단편의 결합을 억제하지 않았으며, 이것은 항체 9TL이 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합함을 시사한다.

또한, Aβ_28-42 및 Aβ_1-43 펩티드는, Aβ_1-40의 16-28에 결합하는 대조 항체 (항체 2289, 이 항체는 미국 출원 공개 2004/0146512 및 WO 04/032868호에 기재됨)에 대한 Aβ_1-40 결합을 쉽게 억제할 수 있긴 하지만, Aβ_1-40에 대한 항체 9TL의 결합을 억제하지 않았다. 이러한 결과는 항체 9TL이 Aβ_1-40에 우선적으로 결합하지만 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 모노클로날 항체 2 H6 및 탈글리코실화 2 H6 의 생성

A. 모노클로날 항체 2H6의 생성 및 특징화

문헌[Geerligs HJ 등, 1989, J.Immunol.Methods 124:95-102; Kenney JS 등, 1989, J.Immunol.Methods 121:157-166; 및 Wicher K 등, 1989, Int. Arch.Allergy Appl.Immunol. 89:128-135]에 기재된 바와 같이, 아주반트(족척 당 50㎕, 마우스 당 총 100㎕) 중의 KLH에 접합된 펩티드 (Aβ_1-40의 아미노산 28-40)으로 약 16주 연속 주 간격으로 마우스를 면역화하였다. 마우스를 먼저 CFA (완전 프로이트 아주반트) 중에서 50㎍의 펩티드로 면역화하였다. 21일 후에, 마우스를 IFA (불완전 프로이트 아주반트) 중의 펩티드 25㎍로 두번째로 면역화하였다. 두번째 면역화 후 23일 후에, IFA 중의 25㎍의 펩티드로 세번째 면역화를 수행하였다. 10일 후에, ELISA를 사용하여 항체 적정을 시험하였다. 세번째 면역화 후 34일에 IFA 중에서 25㎍의 펩티드로 네번째 면역화를 수행하였다. 네번째 면역화 후 32일에 100㎍ 가용성 펩티드로 최종 추가면역을 수행하였다.

면역화된 마우스로부터 비장단핵세포를 수득하고, 10:1의 비율로 폴리에틸렌 글리콜 1500과 함께 NSO 골수종 세포와 융합하였다. 하이브리드를 20% 말 혈청 및 2-옥살로아세테이트/피루베이트/인슐린(시그마)을 함유하는 DMEM 중에서 96-웰 플레이트 내에 도말하고, 하이포옥사틴/아미노프테린/티미딘 선택을 시작하였다. 8일 째에, 20% 말 혈청을 함유하는 DMEM 100㎕를 모든 웰에 첨가하였다. 항체 포획 면역분석을 사용함으로써 하이브리드의 상층액을 선별하였다. 부류-특이적 2차 항체를 사용하여 항체 부류의 결정을 수행하였다.

특징화를 위하여 모노클로날 항체-생산 세포 주의 패널을 선택하였다. 선택된 하나의 세포 주는 2H6으로 명명된 항체를 생성한다. 이러한 항체는 IgG2b 중쇄를 갖는 것으로 결정되었다.

Aβ_1-40에 대한 항체 2H6의 친화력을 결정하였다. 단백질 A 친화력 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 배양물의 상층액으로부터 모노클로날 항체 2H6를 정제하였다. 상층액을 pH 8로 평형화하였다. 상층액을 PBS로 pH8까지 평형화된 단백질 A 컬럼 맵셀렉트(MabSelect) (아머샴 바이오사이언시스 # 17-5199-02)에 부하하였다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 PBS, pH8로 세척하였다. 항체를 50mM 시트레이트-포스페이트 완충액, pH3으로 용출하였다. 용출된 항체를 1M 포스페이트 완충액 pH8로 중화하였다. 정제된 항체를 PBS로 투석하였다. 뮤린 mAb 표준 곡선을 사용하여 항체 농도를 SDS-PAGE에 의해 결정하였다.

이뮤노퓨어 Fab 키트(피어스 #44885)를 사용하여 2H6 전체 항체의 파파인 단백질분해에 의해 2H6 Fab를 제조하고, 제조업자의 지시에 따라 단백질 A 크로마토그래피를 통해 유동시킴으로써 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 농도를 결정하고 10D=0.6mg/ml를 사용하여 A280을 결정하였다.

바이아코어 3000^TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(바이아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카웨이)를 사용하여 2H6 모노클로날 항체의 친화력을 결정하였다. 친화력을 결정하는 한가지 방법은, CM5 칩 위에서 2H6 항체를 고정화하고 항체에 대한 Aβ_1-40 펩티드의 결합 동역학을 측정하였다. 공급업자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 CM5 칩을 활성화하였다. 2H6 모노클로날 항체를 10mM 아세트산나트륨 pH 4.0 또는 5.0으로 희석하고, 0.005mg/ml의 농도에서 활성화된 칩 위에 주입하였다. 각각의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 사용하여, 항체 밀도의 범위를 달성하였다: 1000-2000 또는 2000-3000 반응 단위 (RU). 칩을 에탄올아민으로 봉쇄하였다. 재생 연구는, 피어스 용출 완충액 (제품 번호 21004, 피어스 바이오테크놀로지, 미국 일리노이주 록포드) 및 4M NaCl (2:1)의 혼합물이 200회 이상의 주입 동안에 칩 위에서 2H6 항체의 활성을 유지하면서 결합된 Aβ_1-40 펩티드를 효과적으로 제거함을 나타내었다. HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 상층액 P20)을 모든 바이아코어 분석을 위해 주행 완충액으로서 사용하였다. 정제된 Aβ_1-40 합성 펩티드 샘플의 연속 희석(0.1-10x 산출된 K_D)을 1분 동안 100㎕/분으로 주입하고, 10분의 해리 시간이 허용되었다. BIA 평가 프로그램을 사용하여 데이타를 1:1 랭무어 결합 모델 (Karlsson,R. Roos,H.Fagerstam, L.Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 맞춤으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on로서 계산하였다.

대안적으로, SA 칩 위에 Aβ_1-40 펩티드를 고정화하고, 고정화 Aβ_1-40 펩티드에 대한 2H6 Fab의 결합 동역학을 측정함으로써 친화력을 결정하였다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템 (바이아코어 3000^TM, 바이아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카웨이)에 의하여 2H6 Fab 단편의 친화력을 결정하였다. 공급업자의 지시에 따라서 SA 칩(스트렙타비딘)을 사용하였다. 비오티닐화 Aβ 펩티드 1-40(서열 15)을 HBS-EP (10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20) 내로 희석하고, 0.005mg/mL의 농도로 칩 위에 주입하였다. 각각의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 사용하여, 항원 밀도의 2개 범위를 달성하였다: 상세한 동역학적 연구를 위한 10-200 반응 단위(RU) 및 농도 연구를 위한 500-600RU. 재생 연구는, 피어스 용출 완충액 및 4M NaCl(2:1)의 혼합물이 200회 이상의 주입 동안에 칩 위에서 Aβ 펩티드의 활성을 유지하면서, 결합된 Fab를 효과적으로 제거함을 나타내었다. 모든 바이아코어 분석을 위하여 주행 완충액으로서 HBS-EP 완충액을 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석 (0.1-10x 산출된 KD)을 2분동안 100㎕/분으로 주입하고, 10분의 해리 시간이 허용되었다. Fab 단백질의 농도를, 공지된 농도의 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정하였다 (아미노산 분석에 의해 결정됨). 바이아 평가 프로그램을 사용하여 1:1 랭무어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H.Fagerstam, L.Petersson,B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 데이타를 맞춤으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on로서 계산하였다. 상기 기재된 양쪽 방법을 사용하여 결정된 2H6 항체의 친화력을 하기 표 5에 나타낸다.

Aβ_1-40의 아미노산 28-40의 펩티드에 결합하는 뮤린 항체 2286의 친화력을 상기 기재된 바와 같이 시험하였다. 항체 2286은 미국 출원 일련번호 10/683,815호 및 PCT/US03/32080호에 기재되어 있다.

항체 2H6 및 2286의 결합 친화력
	k_on(1/Ms)	K_off(1/s)	K_D(nM)
CM5 칩 위의 2H6 mAb, 그 위에 유동하는 Aβ_1-40	4.67 x 10⁵	3.9 x 10^-3	9
SA 칩 위의 Aβ_1-40O, 그 위에 유동하는 2H6 Fab	6.3 x 10⁵	3.0 x 10^-3	4.7
CM5 칩 위의 2286 mAb, 그 위에 유동하는 Aβ_1-40	1.56 x 10⁵	0.0419	269
SA 칩 위의 Aβ_1-40, 그 위에 유동하는 2286 Fab	1.8 x 10⁵	0.044	245

항체 2H6에 의해 인식되는 Aβ 폴리펩티드 위의 에피토프를 결정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명(SPR, 바이아코어 3000) 결합 분석을 사용하였다. 비오틴(콜로라도주 글로벌 펩티드 서비스)에 결합된 Aβ_1-40 폴리펩티드(서열 15)를 스트렙타비딘-코팅된 칩(SA 칩) 위에 고정화하였다. Aβ 펩티드의 상이한 가용성 단편(16μM, 캘리포니아주 아메리칸 펩티드 컴퍼니 인코포레이티드)의 부재 또는 존재하에, 고정화된 Aβ_1-40에 대한 Aβ 항체(100nM에서)의 결합. Aβ_1-40에 대한 항체 26H의 결합을 대체하는 Aβ 펩티드는 각각 Aβ_17-40, Aβ_33-40 및 Aβ_1-40이었다 (도 3). 따라서, 항체 2H6이 Aβ_1-40의 C-말단 펩티드(33-40)에 결합한다. 그러나, Aβ_1-40의 C-말단 펩티드(33-40)는 시험된 농도에서 Aβ_1-40에 대한 항체 2286의 결합을 대체하지 않았다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Aβ_1-38 펩티드는 Aβ_1-40에 대한 항체 2H6 또는 항체 2286의 결합을 억제하지 않았으며, 이것은 항체 2286과 유사하게 항체 2H6이 결합하는 에피토프가 Aβ_1-40 펩티드의 아미노산 39 및/또는 40을 포함한다는 것을 시사한다 (도 3).

또한, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43 펩티드는, 이들이 Aβ_1-40의 16-28에 결합하는 대조 항체(항체 2289, 이 항체는 미국 출원 일련번호 10/683,815호 및 PCT/US03/32080에 기재되어 있다)에 대한 Aβ_1-40 결합을 쉽게 억제할 수 있긴 하지만, Aβ_1-40에 대한 항체 2H6의 결합을 억제하지 않았다. 이 결과는 항체 2H6이 우선적으로 Aβ_1-40에 결합하지만 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에는 결합하지 않음을 나타낸다.

항체 2H6이 결합하는 β-아밀로이드 펩티드의 별개의 아미노산 잔기의 연관성을 더욱 평가하기 위하여, 각각의 마지막 6개 아미노산 (Aβ_1-40 아미노산 잔기 35-40)이 개별적으로 알라닌(알라닌 스캐닝 돌연변이유발)으로 대체되는 상이한 Aβ_1-40 변형체를, 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 발생시켰다. 이러한 Aβ_1-40 변형체 (표 6에 나타낸 서열)는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질(아머샴 파르마시아 바이오텍, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로서 이.콜리에서 발현된 다음, 글루타티온-아가로스 비드(시그마-알드리치 코포레이션, 미국 미조리주 세인트루이스) 위에서 친화력 정제되었다. 대조로서, 야생형(WT) Aβ_1- ₄₀ 뿐만 아니라 Aβ_1-41, Aβ_1-42 및 Aβ_1-39를 GST 융합 단백질로서 발현하였다. Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42, Aβ_1-39 뿐만 아니라 6개의 상이한 변형체(표 6에 나타낸 M35A (1-40), V36A(1-40), G37A(1-40), G38A(1-40), V39A(1-40), V40A(1-40))를 ELISA 분석 플레이트 위에 고정화하고 (웰 당 0.025㎍/㎕의 GST-펩티드의 100㎕), 아래로 0.3nM 로부터 연속 희석법으로 mAb 2286, 2289 및 2H6의 어느 하나와 함께 배양하였다 (0.3nM mAb를 사용한 데이타를 도 4에 나타낸다). 10회 연속 세척 후에, 분석 플레이트를 비오틴-접합된 염소-항-마우스(H+L) 항체(벡터 래보러토리즈, 벡터 #BA-9200, 미국 캘리포니아 버링게임)의 웰 당 0.03㎍/ml의 100㎕로 배양한 다음, HRP-접합된 스트렙타비딘(아머샴 바이오사이언시스 코포레이션, 미국 뉴저지주 #RPN4401V)의 웰 당 0.025㎍/ml의 100㎕로 배양하였다. 플레이트의 흡광도를 450nm에서 판독하였다.

도 4에 나타낸 것과 같이, Aβ의 아미노산 16 내지 28에 대해 지시된 Mab 2289는 동일한 강도로 모든 변형체를 인식하였으며, 플레이트 위에서 단백질 농도 및 단백질 통합성의 내부 포지티브 대조로서의 역할을 하였다. 항체 2H6은 도 4에 나타내 것과 같은 Aβ_1-41, Aβ_1-39 또는 Aβ_1-42를 인식하지 못하였다. Aβ_1-40 변형체 V40A, V39A, G38A, G37A, V36A 및 M35A는 항체 2H6에 대해 감소된 결합을 나타내었으며, 이것은 항체 2H6 에피토프가 Aβ_1-40의 C 말단에서 적어도 6개 아미노산에 대해 연장됨을 증명하였다. V 및 G의 A로의 돌연변이는 매우 보존적이고, 단백질에서 중요한 형태학적 변화를 일으킬 가능성이 없으며, 따라서 항체 2H6 결합에 미치는 이러한 돌연변이의 큰 효과는 Aβ의 상황에서 언급된 아미노산 간에 항체의 분화 능력에 기인할 수 있으며, 이러한 데이타는 항체에 대해 매우 높은 정도의 특이성을 증명하였다.

2H6 및 9TL이 Aβ_1-40에 대한 결합을 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위하여, 바이아코어 분석을 사용하여 경쟁 실험을 수행하였다. 항체 2H6, 9TL 및 2289를 CM5 칩의 상이한 채널 위에 고정화하였다. CM5 칩 채널을 공급업자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항체 2H6, 9TL 및 2289를 각각 10mM 아세트산나트륨 pH 4.0으로 희석하고, 0.005mg/ml의 농도에서 활성화된 칩 위에 주입하였다. 항체 밀도는 2H6에 대해 1625 반응 단위(RU); 9TL에 대해 4000 RU; 및 2289에 대해 2200RU였다. 각각의 채널을 에탄올아민으로 봉쇄하였다. Aβ_1-40 펩티드(150μM)를 2분동안 칩 위에 유동시켰다. 이어서, 0.6μM에서 항체 2H6 (결합 경쟁을 위해 시험됨)를 1분동안 칩 위에 유동시켰다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 모든 바이아코어 분석을 위한 주행 완충액으로서 사용하였다. Aβ_1-40의 결합을 측정한 후에, 피어스 용출 완충액(제품 번호 21004, 미국 일리노이주 록포드의 피어스 바이오테크놀로지) 및 4M NaCl의 혼합물(2:1)로 6초 동안 2번 세척함으로써 모든 칩의 채널을 재생하였다. 이어서 항체 9TL에 대해, 이어서 항체 2289에 대해 경쟁 결합을 수행하였다. Aβ_1-40에 대한 결합에 관하여 9TL과 2H6 간의 경쟁이 관찰되었으나, 9TL과 2289, 또는 2H6과 2289간에 경쟁이 관찰되지 않았다. 고정화된 항체와 칩 위로 유동된 동일한 항체 간의 경쟁의 관찰을 포지티브 대조로서 사용하였다.

B. 항체 2 H6 은 APP 에 결합하지 않는다

2H6이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, 야생형 APP로 이입된 세포에 대한 2H6의 결합을 결정하였다. 293개 세포를 야생형 인간 아밀로이드 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA로 이입하였다. 이입 후에 48시간에, 세포를 모노클로날 항체 항-Aβ_1-16, 항-Aβ_16-28 또는 2H6 (10% FCS를 갖는 DMEM 중에서 5㎍/ml)와 함께 45분동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 PBS 중에서 5분동안 3회 세척하고 4% PFA 로 고정시켰다. 세포를 PBS 중에서 3번 세척하고, 형광 현미경 하에서 잭슨 이뮤노서치로부터의 2차 Cy3-접합된 염소 항-마우스 항체(1:500의 희석)에 의하여 항체 결합을 검출하였다.

Aβ 위의 N-말단 또는 중심 에피토프를 인식하는 항-Aβ_1-16 및 항-Aβ_16-28 항체는, 세포에서 발현되는 APP 전구체 단백질에 대해 상당한 결합을 나타내었다. 반대로, 2H6은 APP 발현 세포에 결합하지 않았다.

C. 탈글리코실화 항체 2 H6 의 생성

탈글리코실화 항체 2H6를 생성하기 위하여, 정제된 항체 2H6를 20mM 트리스-HCl pH 8.0 중에서 펩티드-N-글리코시다제 F (프로자임, 항체 mg 당 0.05U)와 함께 7일 동안 37℃에서 배양하였다. 탈글리코실화의 완성을 MALDI-TOF-MS 및 단백질 겔 전기영동에 의해 입증하였다. 탈글리코실화 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, Q-세파로스에 의해 내독소를 제거하였다. 상기 기재된 바이아코어 분석을 사용하여 탈글리코실화 2H6의 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력을 시험하였으며, Aβ_1-40에 대한 탈글리코실화 2H6의 결합 친화력이 원래의 항체 2H6과 동일한 것으로 밝혀졌다.

실시예 4. 탈글리코실화 2 H6 의 투여에 의해, 알쯔하이머병의 동물 모델에서 미세출혈이 적은 조직학적 증상 및 인지 결핍의 반전

A. 실험 프로토콜

항체의 투여. 실험을 위하여 "스웨디시(Swedish)" 변이체 아밀로이드 전구체 단백질을 과다-발현하는 트랜스제닉 마우스 (K670N/M671을 갖는 APP Tg2576; Hsiao 등, Science 274:99-102 (1996))를 사용하였다. 이러한 마우스에 존재하는 알쯔하이머-유사 표현형을 특징화하였다. 문헌 [Holcomb 등, Nat.Med. 4:97-100 (1998); Holcomb 등, Behav.Gen. 29:177-185 (1999); 및 McGowan E, Neurobiol.Dis. 6:231-244 (1999)]. 16주 처리 연구를 위하여, 20개월령의 APP-트랜스제닉 마우스를 4개 군의 하나로 지정하였다. 첫번째 군에게 16주 동안 매주 복강내 항-Aβ 항체 2H6 (실시예 3에 기재된 마우스 모노클로날 항-인간 Aβ_28-40 IgG2b)를 주입하였다 (n=4). 두번째 군에게 16주 동안 매주 복강내 탈글리코실화 항-Aβ 항체 2H6 (실시예 3에 기재된 바와 같이 제조됨)를 주입하였다 (n=5). 세번째 군에게 16주 동안 매주 항-AMN 항체 (2906; 마우스-모노클로날 항-드로소필라 기억상실 단백질 IgG1)를 복강내 주입하였다 (n=6). 비-트랜스제닉 동복체를 항-AMN 항체(n=4) 또는 2H6(n=2)으로 16주동안 처리하였다.

행동 분석

항체 처리 16주 후에, 연구로부터의 마우스를 상기 기재된 바와 같이 2-일의 방사성 수중 미로 방법으로 시험하였다. 문헌[Wilcock 등, J Neuroinflammation 1:24(2004)]. 장치는 상기 기재된 바와 같이 6-팔 미로였다. 문헌 [Gordon 등, Neurobiol.Aging 22:377-385 (2001)]. 1일 째에, 5번씩 3회 블록으로 15회 시도를 시행하였다. 4마리 마우스의 무리를 각각의 블록에 대해 연속적으로 주행시켰다 (즉, 각각 4마리 마우스를 첫번째 시도로 주행시킨 다음, 동일한 마우스를 두번째 시도로 주행시키는 등). 각각의 5회 시도 블록 후에, 5회 시도의 두번째 블록에 마우스를 노출시키기 전에, 마우스의 두번째 무리를 연장된 휴식 기간으로 처리하였다. 목표 팔은, 냄새 신호를 최소화하기 위하여 무리에 있는 각각의 마우스에 대해 상이하였다. 각각의 시도마다 출발 팔을 바꾸고, 양 일 동안 주어진 개체에게 목표 팔을 일정하게 유지시켰다. 처음 11회 시도를 위하여, 플랫폼을 교대로 보이게 한 다음 가렸다 (마지막 4회 시도를 위해 가림). 2일 째에, 모든 시도에서 플랫폼을 가리는 것 이외에는 1일째와 실질적으로 동일한 방식으로 마우스를 주행시켰다. 오류 수(부정확한 팔 도입)를 1-분 시간 프레임으로 측정하였다. 20초 내에 팔 선택에 실패한 마우스를 1회 오류로 지적하였으나, 이 연구에서 아무런 마우스도 이러한 방식으로 오류를 지적받아서는 안된다. 연구에서 다수의 마우스에 기인하여, 시험자들은 각각의 마우스의 처리군 정체를 알지 못하였다. 방사상 수중미로 임무에서의 종속적인 측정 기준은 평가가 아니라 정량이기 때문에, 시험자 편견의 가능성이 감소되었다. 개체 시도 변화성의 영향을 최소화하기 위하여, 3회 연속 시도를 위한 각 마우스의 오류를 각각의 날에 5회 데이타 포인트를 생성하여 평균을 내고, 이것을 스타트뷰(SAS 인스티튜트 인코포페이티드, 노쓰캐롤라이나)를 사용하여 아노바(ANOVA)에 의해 통계적으로 분석하였다.

조직학적 분석

희생시키는 날에 마우스의 무게를 재고, 100mg/kg 넴부탈 (미국 일리노이주 노쓰 시카고 아보트 래보러토리즈)로 과다 투여한 다음 25mL의 0.9% 염화나트륨으로 심장내 관류시켰다. 뇌를 급히 제거하고, 조직병리학을 위하여 뇌의 왼쪽 반을 새로 제조된 100mM KPO₄ (pH 7.2)중의 4% 파라포름알데히드 중에서 24시간동안 침지 고정시켰다. 반쪽 뇌를 냉동보관을 위해 연속적으로 10%, 20% 및 30% 슈크로스 중에서 24시간 동안 항온보존시켰다. 슬라이딩 초박절편기를 사용하여 25㎛ 두께의 수평 단편을 수집하고, 미생물 생육을 막기 위해 소듐 아지드(pH 7.2)를 갖는 둘베코 포스페이트-완충 염수에서 4℃에서 보관하였다. 600μ 떨어진 8개의 동일한 간격의 일련의 조직 단편을 전체 뇌에 걸쳐 무작위로 선택하고, 앞서 기재된 바와 같이 전체 Aβ (토끼 폴리클로날 항-팬 Aβ; 바이오소스, 미국 캘리포니아주 카마릴로, 1:10,000)에 대하여 자유-부유 면역조직화학을 사용하여 염색하였다. 문헌[Gordon 등, Exp.Neurol. 173: 183-195 (2002); Wilcock 등, J.Neurosci. 24:6144-6151 (2004)]. 600㎛ 떨어진 두번째 일련의 조직 단편들을 NaCl-포화 80% 에탄올 중의 0.2% 콩고 레드를 사용하여 염색하였다. 다른 일련의 단편들을 또한 장착하고, 2% 염산 중의 2% 포타슘 페로시아나이드를 사용하여 헤모시데린에 대해 15분 동안 염색한 다음, 1% 중성 레드 용액 중에서 10분동안 반대 염색하였다. 이미지-프로 플러스 (미디어 사이버네틱스, 미국 미들랜드주 실버 스프링)을 사용하여 콩고 레드 염색 및 Aβ 면역조직화학의 정량화를 수행하여, 포지티브 염색에 의해 차지된 퍼센트 면적을 분석하였다. 전두 피질의 하나의 영역과 해마의 3개 영역을 분석하였다 (해마상 값에서의 지역적 편차가 존재하지 않도록 하기 위하여). 콩고 레드의 초기 분석을 수행하여 전체 값을 얻었다. 혈관 콩고 레드 염색에 제한된 퍼센트 면적을 얻기 위해 실질 아밀로이드 침착물 전부를 수동으로 삭제한 후에 두번째 분석을 수행하였다. 콩고 레드의 실질 면적을 산출하기 위하여, 전체 퍼센트로부터 혈관 아밀로이드 값을 빼었다. 헤모시데린 염색을 위하여, 모든 단편 위에서 프루시안 블루-포지티브 부위의 수를 세고, 단편 당 부위의 평균 수를 계산하였다. 낮은 배율에서 단편들에서 동물들 간의 정성적 차이를 관찰하였다. 8개의 동일한 간격의 단편들을 시험하고, 포지티브 프로파일의 수를 결정하고 단편당 값으로 평균을 내었다. 가능한 처리-관련 차이점을 평가하기 위하여, 각각의 처리 군에 대한 값을 일방적 아노바(ANOVA)에 의해 분석한 다음 피셔스 LSD 평균 비교에 의해 분석하였다.

ELISA 를 사용하여 Aβ 펩티드의 혈청 수준 측정.

항체의 마지막 투여 후 1일에 수집된 혈청을 희석하고 96-웰 마이크로적정 플레이트(맥시소프; 덴마크 로스클라이드 넝크)에서 배양하고, 이것을 PBS 완충액, pH 7.4 중에서 5㎍/ml에서 항체 6E10(Aβ_1-17에 결합된 안티-베타 아밀로이드 항체; 미국 메사츄세츠주 데드햄 시그네트)으로 예비코팅하였다. 2차 항체는 1:5000희석으로 비오티닐화된 4G8이었다 (Aβ_17-24에 결합된 안티-베타 아밀로이드 항체; 시그네트). 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(아머샴 바이오사이언시스)를 사용하여 검출을 수행한 다음, TMB 기질(KPL, 미국 미들랜드주 게이서버그)을 사용하여 수행하였다. 표준 곡선을 위하여 6-400 pM로부터 단계적인 Aβ_1-40 (아메리칸 펩티드)를 사용하였다.

B. 결과

탈글리코실화 항체의 투여에 의한 인지 결핍의 반전 방사성 수중 미로 임무는 트랜스제닉 마우스 모델에서 공간 학습 및 기억 결손을 검출한다. 문헌[Gordon 등, Neurobiol. Aging. 22:377-385 (2001); Morgan 등, Nature 408: 982-985 (2000)]. 항체 2H6, 탈글리코실화 2H6 또는 항-AMN으로 16주 동안 처리된 동물을 방사성 수중 미로의 2-일 변형법에서 공간 통과 학습에 대해 시험하였다. 비트랜스제닉 정상 마우스(2H6 항체로 처리된 2마리 마우스 및 항-AMN 항체로 처리된 4마리 마우스 포함; 행동 차이가 관찰되지 않기 때문에 이들 2개 군을 조합하였다)를 방사상 수중 미로의 2-일 변형법으로 시험하였다. 도 5에 나타낸 것과 같이, 대조 항체(항-AMN)로 처리된 APP-트랜스제닉 마우스는 2일의 시험에 걸쳐 플랫폼 위치를 학습하지 못하였으며, 앞서 기재된 바와 같이 비트랜스제닉 마우스에 비해 상당히 손상되었다. 문헌 [Wilcock 등, J.Neuroinflammation 1:24 (2004)]. 그러나, 항-Aβ 항체 2H6 및 탈글리코실화 2H6을 투여받은 APP-트랜스제닉 마우스는, 대조-처리된 APP-트랜스제닉 마우스에서 관찰되는 손상의 상당한 반전을 나타내었으며, 마지막 2일에는 시도 당 거의 1회 오류의 평균 성과를 가졌다(도 5). 대조-처리된 APP-트랜스제닉 마우스는 2일의 마지막에서 시도 당 거의 3회 오류의 평균 성과를 가졌다 (도 5). 도 5에 나타낸 데이타는, APP-트랜스제닉 마우스에서 인지 결핍의 반전을 위하여 원상태 항체 뿐만 아니라 탈글리코실화 항체도 작용함을 나타낸다.

미세출혈의 증가없이 Aβ 침착물의 감소 표 7에 나타낸 바와 같이, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 항체 2H6 (약 56% 감소, p=0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 58% 감소, p<0.0001)로의 16주 면역요법 후에 해마에서의 전체 Aβ 면역염색이 상당히 감소되었다. 하기 표 8에 나타낸 것과 같이, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 항체 2H6 (약 50% 감소, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 51% 감소, p<0.0001)로의 16주 면역요법 후에 전두 피질에서의 전체 Aβ 면역염색이 상당히 감소되었다.

항체 처리 16주 후에 해마의 전체 Aβ 부하. 해마에서, Aβ에 대한 포지티브 면역조직화학 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	27.127	4.602	1.879
2H6	4	12.011	5.057	2.529
탈글리코실화 2H6	5	11.344	4.765	2.131

항체 처리 16주 후에 전두 피질의 전체 Aβ 부하. 전두 피질에서 Aβ에 대한 포지티브 면역조직화학 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	47.060	4.667	1.905
2H6	4	23.708	6.355	3.178
탈글리코실화 2H6	5	22.834	1.970	0.881

표 9에 나타낸 바와 같이, 해마에서의 전체 콩고-레드 염색은, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 항체 2H6 (약 77% 감소, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 53% 감소, p<0.0001)으로의 16주 면역요법 후에 상당히 감소되었다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 전두 피질에서 전체 콩고-레드 염색이 항체 2H6 (약 79% 감소, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 68% 감소, p<0.0001)으로의 16주 면역요법 후에 상당히 감소되었다.

항체 처리 16주 후에 해마의 전체 콩고-레드 염색. 해마에서, Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	1.210	0.081	0.033
2H6	4	0.281	0.021	0.010
탈글리코실화 2H6	5	0.573	0.101	0.045

항체 처리 16주 후에 전두 피질의 전체 콩고-레드 염색. 전두 피질에서 Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	2.507	0.691	0.282
2H6	4	0.520	0.047	0.023
탈글리코실화 2H6	5	0.807	0.104	0.046

전두 피질 및 해마 양쪽 모두를 위해 별도로 실질 (표 11 및 표 12; 도 6) 및 혈관(표 13 및 14; 도 7) 콩고-레드 염색을 분석하였다. 표 11 및 도 6A에 나타낸 것과 같이, 대조 항체-처리 군(항-AMN)에 비하여, 전두 피질에서 실질 콩고-레드 염색이 항체 2H6 (약 98% 감소, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 77% 감소, p<0.0001)로의 16주 면역요법 후에 현저히 감소되었다. 표 12 및 도 6B에 나타낸 바와 같이, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 해마에서의 실질 콩고-레드 염색이 항체 2H6(약 96% 감소, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6 (약 63% 감소, p<0.0001)으로의 16주 면역요법 후에 현저히 감소되었다. 탈글리코실화 2H6은 전두 피질 및 해마에서 콩고-레드 부하를 감소시키는데 있어서 원상태 2H6 항체에 비해 훨씬 덜 효과적이었다.

항체 처리 16주 후에 전두 피질의 실질 콩고-레드 염색. 전두 피질에서 Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	2.360	0.676	0.276
2H6	4	0.059	0.047	0.024
탈글리코실화 2H6	5	0.537	0.144	0.064

항체 처리 16주 후에 해마의 실질 콩고-레드 염색. 해마에서 Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	1.117	0.104	0.043
2H6	4	0.040	0.029	0.015
탈글리코실화 2H6	5	0.416	0.078	0.035

표 13 및 도 7A에 나타낸 것과 같이, 대조 항체-처리 군(항-AMN)에 비하여, 항체 2H6(약 2.7배, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6(약 1.7배, p=0.0185)로 16주 면역요법 후에, 해마에서의 혈관 콩고-레드 염색이 상당히 증가하였다. 표 14 및 도 7B에 나타낸 것과 같이, 대조 항체-처리된 군(항-AMN)에 비하여, 항체 2H6 (약 3.5배, p<0.0001) 및 탈글리코실화 2H6(약 1.8배, p=0.0048)로 16주 면역요법 후에 전두 피질에서 혈관 콩고-레드 염색이 상당히 증가하였다. 탈글리코실화 2H6 처리된 군에서 혈관 콩고-레드 염색의 증가는 해마(p=0.0025) 및 전두 피질(p<0.0001) 양쪽 모두에 대해 원상태 2H6 항체 처리 군에서보다 상당히 낮았다.

항체 처리 16주 후에 해마의 혈관 콩고-레드 염색. 해마에서 Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	0.093	0.036	0.015
2H6	4	0.253	0.053	0.027
탈글리코실화 2H6	5	0.157	0.030	0.013

항체 처리 16주 후에 전두 피질의 혈관 콩고-레드 염색. 전두 피질에서 Aβ에 대한 포지티브 콩고-레드 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	6	0.147	0.055	0.023
2H6	4	0.511	0.084	0.042
탈글리코실화 2H6	5	0.269	0.043	0.019

헤모글로빈의 분해에서 생성된 산화철 물질인 헤모시데린을 표지화하기 위하여 프루시안 블루 조직 염색을 사용하였다. 뇌에서의 정맥외 혈액은 적혈구의 소교세포 포식작용 및 그들 내에서 헤모글로빈의 분해를 유도한다. 따라서, 산화철-함유 소교세포가 후 출혈의 마커이다. 항체 처리된 동물에서 프루시안 블루-포지티브 프로파일의 수를 세었다. 표 15 및 도 8에 나타낸 것과 같이, 항체 2H6으로의 처리는 동물 항체 처리 군(항-AMN)에 비하여 약 5.5배 만큼 프루시안 블루 염색을 상당히 (p<0.0001) 증가시켰다. 탈글리코실화 2H6 항체 단독으로의 처리는 대조 항체 처리 군에 비하여 약 1.8배 (p=0.0364) 만큼 프루시안 블루 염색을 증가시켰다.

항체 처리 16주 후에 전체 구획을 위한 프루시안 블루 염색. 전체 구획에서 포지티브 프루시안 블루 염색에 의해 차지되는 평균 퍼센트 면적, 평균의 표준 편차 및 표준 오차를 나타낸다.
투여된 항체	분석된 동물의 수	평균	표준편차	표준오차
항-AMN	7	0.589	0.295	0.112
2H6	4	3.250	0.445	0.222
탈글리코실화 2H6	5	1.050	0.143	0.064

탈글리코실화 2 H6 항체의 투여 후 Aβ의 혈청 수준 도 9에 나타낸 것과 같이, APP Tg2576 마우스에 항체 2H6 및 탈글리코실화 2H6을 투여하면, 베타-아밀로이드 펩티드의 혈청 수준을 상당히 증가시켰다. 그러나, 항-AMN 항체의 투여 후에 APP Tg2576 마우스에서 또는 항-AMN 항체 또는 항체 2H6의 투여 후에 야생형 마우스에서, 베타-아밀로이드 펩티드의 혈청 수준의 상당한 증가는 관찰되지 않았다. 이것은, AD의 진단을 돕고 면역요법과 같은 AD 요법에 대한 반응을 검사하기 위하여, 베타-아밀로이드 펩티드의 혈청 수준의 증가가 사용될 수 있음을 나타낸다.

C. 결론

상기 데이타는 1) APP Tg2576 마우스에서, 탈글리코실화 항체 2H6이 학습 및 기억 결손을 반전시키는데 있어서 원상태 항체 2H6만큼 효과적이고; 2) 탈글리코실화 항체 2H6이, 콩고-레드 염색에 의해 측정되는 바와 같이 해마 및 전두 피질에서 Aβ 침착을 고갈시키는데 있어서 원상태 항체 2H6에서만큼 덜 효과적이지만, Aβ 면역염색에 의해 측정되는 바와 같이 해마 및 전두 피질에서 Aβ 부하를 고갈시키는데는 효과적이고; 3) 탈글리코실화 항체 2H6에 의한 해마 및 전두 피질 혈관계에서 Aβ 침착물(콩고-레드 염색에 의해 측정됨)의 증가는 원상태 2H6 항체에 비해 훨씬 낮고; 4) 탈글리코실화 2H6 항체로 처리된 APP Tg2576 마우스에서 프루시안 블루 염색에 의해 측정되는 바와 같은 미세출혈은 원상태 2H6 항체로 처리된 마우스에 비해 훨씬 낮음을 증명한다. 이러한 데이타는, 탈글리코실화 항체가 APP Tg2576 마우스에서 미세출혈의 위험이 낮은 알쯔하이머병의 징후를 개선시키는데 효과적임을 제안한다.

실시예 5: 마우스 및 인간 Fc γ 수용체 및 보체에 대한 다양한 항체 Fc 영역의 결합 친화력

상기 기재된 바와 같은 바이아코어를 사용하여, Fcγ 수용체 또는 보체에 대한 항체 Fc 영역의 결합 친화력을 측정하였다. 간략하게, 정제된 인간 또는 마우스 Fcγ 수용체 (R&D 시스템스) 및 인간 C1q (퀴델)을 아민 화학에 의하여 바이아코어 CM5 칩 위에 고정화하였다. 모노클로날 항체의 연속 희석 (2nM로부터 표 16 및 17에 나타낸 것과 같은 최대 농도까지의 범위)을 주입하였다. HBS-EP (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 주행 및 샘플 완충액으로 사용하였다. 고 친화력 상호작용을 위해 1:1 랭무어 상호작용 모델을 사용하거나, 저 친화력 상호작용을 위해 정상 상태 친화력 모델을 사용하여 결합 데이타를 분석하였다.

표 16은 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 인간 C1q (hC1q)에 대하여 K_D(nM)에 의해 측정된 바와 같이 항-β-아밀로이드 항체의 결합 친화력을 나타낸다. 탈글리코실화 항체는 N-글리코실화가 제거된 불변 영역을 갖고 있다. 9TL(hIgG1) 및 9TL(hIgG2Δa)는 동일한 가변 영역(서열 1 및 서열 2에 나타냄)을 갖지만 상이한 불변 영역을 갖는다. 9TL(hIgG1)은 인간 IgG1 불변 영역을 갖고; 9TL(hIgG2Δa)는 A330P331 내지 S330S331의 돌연변이를 갖는 인간 IgG2a를 갖는다 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 카뱃 아미노산 번호매김). 표 16에 나타낸 바와 같이, 탈글리코실화 2H6, 2294 및 2286은, 제거된 N-글리코실화를 갖지 않은 상응하는 항체에 비하여, 시험되어지는 모든 마우스 Fcγ 수용체에 대해 감소된 친화력을 가졌다. 탈글리코실화 2H6은 2H6에 비하여 인간 보체에 대해 감소된 친화력을 가졌다. 9TL(hIgG1)은 mFcγRIIb 또는 mFcγRIII에 대해 상당한 결합을 갖지 않고; 9TL(hIgG2Δa)는 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 또는 hC1q 중의 어느 하나에 대해 상당한 결합을 갖지 않았다.

표 17은 인간 FcγRI, FcγRIIb/c, FcγRIIIb 또는 hC1q 에 대하여 K_D(nM)에 의해 측정되는 바와 같이 항-β-아밀로이드 항체의 결합 친화력을 나타낸다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 9TL(hIgG2Δa)는 인간 FcγRI 또는 hC1q에 대해 상당한 결합을 갖지 않았으며; 이러한 분자에 대해 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 항체의 친화력에 비하여 인간 FcγRIIb/c 및 FcγRIIIb에 대해 상당히 낮은 친화력을 가졌다.

실시예 6: 소교세포 활성화, Fc γ 수용체 결합, 및 두개내 투여 후 아밀로이드 정화에 미치는 탈글리코실화 2 H6 항체의 효과

수술 절차 및 항체의 두개내 투여 19.5개월령의 Tg2576 트랜스제닉 마우스를 3개의 군 중의 하나로 지정하였으며, 모든 군에게 전두 피질 및 해마 내에 두개내 주입하였다. 첫번째 군은 각각의 영역에서 2㎍/2㎕의 농도로 항-Aβ 항체 2H6를 받았다. 두번째 군은 각각의 영역에서 2㎍/2㎕의 농도로 탈글리코실화 2H6 항체를 받았다. 세번째 군은, 원상태 IgG 주입의 비특이적 측면을 위한 대조로서, 드로소필라 기억상실 단백질에 대해 지시된 IgG를 받았다. 모든 마우스들은 수술 후 72시간동안 생존하였다.

수술 후 1일 째에 마우스(Tg2576 트랜스제닉 마우스)의 무게를 재고, 이소플루란으로 마취시키고, 정위적 장치 (51603 이중 조종장치 실험 표준, 미국 일리노이주 우드 데일 스토엘팅)에 놓았다. 두개골을 노출시키기 위해 정중시상 절개를 행하고, 하기 좌표에 따라서 치과 드릴을 사용하여 우측 전두 피질 및 해마 위에서 2개의 천두공을 구멍을 뚫었다: 피질: AP+1.5mm, L-2.0mm, 해마: AP-2.7mm, L-2.5mm, 모두 정수리점으로부터 취해짐. 10㎕ 해밀톤(미국 네바다주 레노) 주사기에 부착된 26게이지 바늘을 정수리점에 대해 배쪽으로 3mm 낮추고, 2분에 걸쳐 2㎕ 주입을 수행하였다. 절개부를 염수로 세정하고 수술용 스테이플로 밀폐하였다.

조직 준비 희생시키는 날에 마우스의 무게를 재고, 100mg/kg 펜토바르비탈(넴부탈 소듐 용액, 아보트 래보러토리즈, 미국 일리노이주 노쓰 시카고)을 과다투여하고, 25ml 0.9% 염화나트륨으로 두개내 관류시킨 다음, 50ml의 새로 준비된 4% 파라포름알데히드(pH=7.4)로 관류시켰다. 뇌를 급히 꺼내고, 새로 준비된 4% 파라포름알데히드에 24시간동안 침지 고정시켰다. 이어서, 뇌를 냉동보존하기 위해 연속적으로 10, 20 및 30% 슈크로스에서 24시간동안 뇌를 항온보관하였다. 슬라이딩 초박절편기를 사용하여 25㎛ 두께의 수평 단편을 수집하고, 미생물 생육을 막기 위해 소듐 아지드를 갖는 DPBS 완충액에서 4℃에서 보관하였다.

주입 부위에 걸쳐서 대략 100μm 떨어진 6 내지 8개의 단편을 선택하고, 자유-부유 면역조직화학을 사용하여 전체 Aβ (Aβ_1-40 및 Aβ_1-42와 반응하는 토끼 항혈청; 사용된 희석 1:10000), 항-CD45 항체 (목록 번호 MCA 1031G, 세로텍, 미국 노쓰캐롤라이나 랄레이; 사용된 희석 1:5000) 및 항-Fcγ 수용체(CD16/CD32) 항체 (목록 번호 553141, BD 바이오사이언시스, 1:1000 희석으로 사용됨)에 대해 염색하였다. 비오티닐화 염소 항-토끼는 1:3000 희석에서 항-Aβ 항체 염색을 위한 2차 항체로서 사용되었다. 비오티닐화 염소 항-랫트는 1:3000 희석에서 항-CD45 및 Fcγ 수용체 항체 염색을 위한 이차 항체로서 사용되었다. 면역염색을 위하여, 비-특이적 면역조직화학 반응을 평가하기 위하여 1차 항체로부터 일부 단편을 생략하였다. 인접한 단편을 슬라이드 위에 장착하고, 4% 티오플라빈-S (시그마-알드리치, 미국 미조리주 세인트 루이스)를 사용하여 10분동안 염색하였다. 주입 부피를 포함하는 제한된 수의 단편이 존재한다는 것을 주목해야 한다.

데이타 분석 영상측정 V150 영상 분석 시스템(미국 캘리포니아주 샌디에고 온코르)을 사용하여, 피질 및 해마의 주입된 부위 및 뇌의 반대쪽 측면 위의 상응하는 영역에서 모든 염색된 단편 위에서 면역조직화학 반응 생성물을 측정하였다. Aβ 염색, 티오플라빈-S 염색, CD 45 염색 및 Fcγ 수용체 염색에 대하여, 데이타를 주입된 측면 대 비-주입된 측면의 비율로서 나타내었다. 상응하는 반대쪽 부위에 대해 각각의 주입 부위를 표준화하면, 동물간 변동성의 영향이 감소되고 더 적은 수의 마우스에서 약물 효과의 신뢰할 수 있는 측정이 가능하다. 가능한 치료-관련 차이점을 평가하기 위하여, 스타트뷰 소프트웨어 버젼 5.0.1 (SAS 인스티튜트 인코포레이티드, 미국 노쓰캐롤라이나)에 이어서 피셔스 LSD 평균 비교에 의하여 각각의 치료 군에 대한 비율 값을 분석하였다.

결과

도 10에 나타낸 것과 같이, 전두 피질 및 해마에서 염색되는 CD45는 대조 항체로서 탈글리코실화 2H6 항체의 두개내 투여 후와 거의 동일하였다. 반대로, 전두 피질에서 CD45 염색은 상당히 높았으며 (p<0.01), 대조 항체에 비해 2H6 항체의 두개내 투여 후에 해마에서 일반적으로 더 높았다. 이것은, 항체 2H6과 달리, 탈글리코실화 2H6의 투여가 투여 후 72시간에서 전두 피질 및 해마에서 소교세포를 활성화시키지 않음을 나타낸다.

도 11에 나타낸 것과 같이, 전두 피질 및 해마에서 FcγII 및 FcγIII 수용체 염색은 대조 항체로서 탈글리코실화 2H6 항체의 두개내 투여 후와 거의 동일하였다. 반대로, 전두 피질 및 해마에서 Fcγ 수용체 염색은 대조 항체에 비해 2H6 항체의 두개내 투여 후에 상당히 높았다(p<0.01). 이것은, 항체 2H6과 달리, 탈글리코실화 2H6의 투여가 투여 후 72시간에서 전두 피질 및 해마에서 소교세포를 활성화하지 않았음을 나타낸다.

도 12에 나타낸 바와 같이, Aβ 염색은 대조 항체에 비하여 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개내 투여 후 72시간에 전두 피질 및 해마에서 더 낮았다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 티오플라빈-S 염색된 조밀 플라크는 대조 항체에 비하여 2H6 항체 또는 탈글리코실화 2H6 항체의 두개내 투여 후 72시간에 전두 피질 및 해마에서 더 낮았다.

이러한 데이타는, 탈글리코실화 2H6 항체가 소교세포 활성화 및 염증 반응을 유도하지 않으면서 전두 피질 및 해마에서 Aβ를 감소시킬 수 있고 플라크를 조밀화할 수 있음을 나타낸다.

실시예 7. 항체 2294가 결합하는 Aβ 펩티드 위에서 에피토프의 특징화

항체 2294는 Aβ_1-40로 마우스를 면역화함으로써 증가된 마우스 항체이다. 이 항체는 미국 2004/0146512 및 WO 04/032868호에 기재되어 있다.

Aβ_1-40, Aβ_1-42 또는 Aβ_22-37에 대한 항체 2294의 결합 친화력을 상기 기재된 바와 같이 바이아코어를 사용하여 측정하였다. 표 18은 다양한 Aβ 펩티드에 대한 항체 2294 Fab 단편의 친화력을 나타낸다.

항체 2294 Fab 단편의 결합 친화력
	k_on(1/Ms)	K_off(1/s)	K_D(nM)
스트렙타비딘 칩 위에 고정화된 비오티닐화 Aβ_1-40, 그 위에 유동되는 2294 Fab	6.6 x 10⁴	3.95 x 10^-4	6
스트렙타비딘 칩 위에 고정화된 비오티닐화 Aβ_1-42, 그 위에 유동되는 2294 Fab	1.1 x 10⁴	4.87 x 10^-3	400
스트렙타비딘 칩 위에 고정화된 비오티닐화 Aβ_22-37, 그 위에 유동되는 2294 Fab	5 x 10⁵	0.049	10,000

항체 2294의 에피토프 지도작성을 ELISA 분석에 의해 수행하였다. 다양한 Aβ 펩티드 (이 펩티드는 C-말단에 첨가된 글리신을 갖는다)의 비오티닐화 15량체 또는 10량체를 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 위에 고정화하였다. NUNC 맥시소르프 플레이트를 PBS, pH 7.4 중에서 4℃에서 1시간 이상동안 6㎍/ml의 스트렙타비딘(피어스, 21122)으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액 pH 7.4 중에서 1% BSA로 봉쇄하였다. 세척 후에, PBS pH 7.4중에서 비오티닐화 Aβ 펩티드를 실온에서 1시간동안 배양하였다. 항체 2294 (2.5㎍/ml 내지 10㎍/ml)를 실온에서 1시간동안 고정화 Aβ 펩티드로 배양하였다. 세척 후에, 플레이트를 2차 항체, HRP 접합된 염소 항-인간 카파 사슬 항체(MP 바이오메디칼스, 55233)와 함께 1:5000 희석으로 배양하였다. 세척 후에, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)를 첨가함으로써, 결합된 2차 항체를 측정하였다. 1M 인산을 첨가함으로써 HRP 반응을 정지시키고, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 도 14에 나타낸 것과 같이, 항체 2294가 C-말단에 글리신과 함께 아미노산 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39, 26-40 및 25-34을 갖는 Aβ 펩티드에 결합한다; 그러나 이러한 펩티드의 C-말단에서 글리신과 함께 아미노산 19-33, 27-41, 24-33 및 27-35를 갖는 Aβ 펩티드에 결합하지 않는다. 이것은, 항체 2294가 결합하는 에피토프가 26-34의 아미노산을 포함함을 시사한다.

항체 2294에 의해 인식되는 Aβ 펩티드 상의 에피토프를 더욱 결정하기 위하여, ELISA 결합 분석을 사용하였다. ELISA 플레이트 위에 다양한 Aβ 펩티드 (글로벌 펩티드 서비스, 미국 콜로라도주)를 고정하였다. 고정화된 Aβ에 대한 2294 전체 항체(20nM에서)의 결합을 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정하였다. 항체 2294가 Aβ펩티드 17-40, 17-42, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42 및 1-43에 결합한다. 항체 2294가 Aβ 펩티드 1-16, 1-28, 28-42, 22-35 및 33-40에 결합하지 않았다. 따라서, 항체 2294가 끝이 잘린 다양한 Aβ 펩티드, 예를 들어 1-38, 1-40, 1-42 및 1-43의 C-말단에 결합한다.

하기 표 19는 바이아코어 분석에 의해 측정될 때 Aβ_1-40 내지 다른 Aβ 펩티드에 대한 2294의 결합 비교를 나타낸다. 항체 2294 (전체 항체)는 다른 펩티드에 비해 Aβ_1-40에 가장 강력한 결합을 가지며, 끝이 잘린 Aβ_1-40 (예컨대 1-36, 1-37, 1-38 및 1-39), Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 대해 현저히 낮은 결합을 갖는다. 이것은, Aβ의 아미노산 40(발린)의 측쇄 또는 주쇄가 Aβ_1-40에 대한 2294의 결합에 연관되고; 결합이 이 아미노산의 부재 하에 현저히 감소됨을 나타낸다.

Aβ 펩티드 단편	결합
1-28	-
1-43	-
22-35	-
1-36	+
1-37	+
1-38	++
1-39	++
17-42	+++
1-42	+++
17-40	++++
1-40	++++

"-"는 비-결합을 나타내고; "+"는 매우 낮은 결합을 나타내고; "++"는 중간 결합을 나타내고; "+++"는 강한 결합을 나타내고; "++++"는 매우 강한 결합을 나타냄.

상기 나타낸 데이타를 기초로 하여, 항체 2294가 결합하는 에피토프는 아미노산 26-34 및 40을 포함하는 것으로 보인다. 항체 2294가 미국 임시출원 일련번호 60/676,093호 (이 항체의 아미노산 및 핵산 서열은 서열 36-39로 나타내고; 6G를 코딩하는 벡터는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2005년 6월 15일에 수탁번호 PTA-6786 및 PTA-6787로 기탁되어 있다)에 기재된 항체 6G와 매우 유사한 에피토프에 결합된다. 항체 6G가 결합하는 이러한 에피토프는 25 내지 34 및 40의 아미노산을 포함한다. 항체 2294와 6G의 에피토프 비교를 도 14에 나타낸다.

바이아코어를 사용하여, Aβ_1-40, Aβ_1-42 또는 Aβ_22-37에 대한 항체 6G Fab 단편의 결합 친화력을 측정하였다. 비오티닐화 Aβ_1-40, Aβ_1-42 또는 Aβ_22- ₃₇를 스트렙타비딘 칩 위에 고정화하고, 6G Fab를 그 위에 유동시켰다. 항체 6G Fab 단편은 3.0×10⁵의 k_on (1/Ms), 7.0×10^-4의 k_off(1/s) 및 2nM의 K_D로 Aβ_1-40에 결합한다. 항체 6G Fab 단편은 1.8×10⁴의 k_on (1/Ms), 1.6×10^-3의 k_off(1/s) 및 80nM의 K_D로 Aβ_1-42에 결합한다. 항체 6G Fab 단편은 3.6×10⁵의 k_on (1/Ms), 3.9×10^-3의 k_off(1/s) 및 11nM의 K_D로 Aβ_22-37에 결합한다. 항체 6G는 항체 2294에 비하여 Aβ_1-42 및 Aβ_22-37에 대해 상당히 높은 친화력을 갖는다. 데이타는, 항체 6G의 결합이 항체 2294에 비하여 아미노산 40에 덜 의존함을 나타낸다.

바이아코어 분석을 사용하는 2294, 6G, 2H6 및 2289 간의 항체 경쟁 실험을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 경쟁 실험을 바이아코어 분석을 사용하여 실행하였다. 항체 2294, 6G, 2H6 및 2289를 CM5 칩의 상이한 채널 위에 고정화하였다. CM5 칩 채널을 공급업자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)와 활성화하였다. 항체 2294, 6G, 2H6 및 2289를 각각 10mM 소듐 아세테이트 pH 4.0으로 희석하고, 0.005mg/ml의 농도로 활성화 칩 위에 주입하였다. 각각의 채널을 에탄올아민으로 봉쇄하였다. Aβ_1-40 펩티드(150μM)를 2분동안 칩 위에 유동시켰다. 이어서, 0.6μM에서 항체 2294(결합 경쟁을 위해 시험됨)를 1분동안 칩 위에 유동시켰다. 모든 바이아코어 분석을 위해 주행 완충액으로서 HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하였다. Aβ_1-40의 결합을 측정한 후에, 피어스 용출 완충액 (제품 번호 21004, 피어스 바이오테크놀로지, 미국 일리노이주 록포드)와 4M NaCl (2:1)의 혼합물로 6초 동안 2회 세척함으로써, 칩의 모든 채널을 재생하였다. 이어서, 항체 6G, 2H6 및 항체 2289에 대하여 경쟁 결합을 수행하였다. Aβ_1-40에 대한 결합을 위하여 2294와 6G간의 경쟁 및 2294와 2H6간의 경쟁이 관찰되었으나, 2294와 2289간에 또는 6G와 2289간에 경쟁이 관찰되지 않았다. 고정화된 항체와 칩 위에 유동된 동일한 항체 간의 경쟁의 관찰을 포지티브 대조로서 사용하였다. 데이타는, Aβ_1-40에 대한 결합을 위하여 항체 2294가 2H6 및6G와 경쟁함을 나타낸다.

실시예 8. 알쯔하이머병의 동물 모델에서 Aβ 침착 및 인지를 감소시키는데 있어서 항체 2294 및 탈글리코실화 항체 2294의 효과

20mM 트리스-HCl pH 8.0 중에서 펩티드-N-글리코시다제 F (프로자임, 항체 mg 당 0.05U)로 7일 동안 37℃에서 정제된 항체 2294를 배양함으로써 탈글리코실화 항체 2294를 제조하였다. 탈글리코실화의 완성을 MALDI-TOF-MS 및 단백질 겔 전기영동에 의해 입증하였다. 탈글리코실화 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, Q-세파로스에 의해 내독소를 제거하였다. 상기 기재된 바이아코어 분석을 사용하여 탈글리코실화 2294의 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력을 시험하고, Aβ_1-40에 대한 탈글리코실화 2294의 결합 친화력이 원상태 항체 2294와 동일한 것으로 밝혀졌다.

실시예 4에 기재된 바와 같이 인지 결핍, 조직학적 증상 및 미세출혈의 반전에 미치는 효과를 위하여 트랜스제닉 마우스 APP Tg2576에서 항체 2294 및 탈글리코실화 2294를 시험하였다. 16주 치료 연구를 위하여, 트랜스제닉 마우스(20개월령)을 4개 군의 하나로 지정하였다. 첫번째 군은 16주의 기간 동안 매주 복강내 항-Aβ 항체 2294 주입을 받았다 (n=4). 두번째 군은 16주의 기간 동안 매주 복강내 탈글리코실화 항-Aβ 항체 2294 주입을 받았다 (n=5). 세번째 군은 16주의 기간 동안 매주 복강 내 항-AMN 항체 (2906; 마우스-모노클로날 항-드로소필라 기억상실 단백질 IgG1)주입을 받았다 (n=6). 비-트랜스제닉 동복체를 16주 동안 항-AMN 항체(n=4) 또는 2294(n=2)로 처리하였다.

실시예 4에 기재된 바와 같이 조직학적 및 행동학적 분석을 수행하였다.

여기에 기재된 실시예 및 구현양태는 단지 예증 목적을 위한 것이고 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 수 있으며 본 출원의 의도 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 여기에 인용된 모든 공고, 특허 및 특허출원들은, 각각의 공고, 특허 또는 특허출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고문헌으로 포함된 것으로 표시된 것과 마찬가지로, 모든 목적을 위해 그 전체내용이 참고문헌으로 인용된다.

생물학적 물질의 기탁

하기 물질들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801) (ATCC)에 기탁되어 있다:

물질 항체 번호 ATCC 수탁 번호 기탁일

pDb.9TL.hFc2a 9TL 중쇄 PTA-6124 2004년 7월 20일

pEb.9TL.hK 9TL 경쇄 PTA-6125 2004년 7월 20일

pDb.6G.hFc2a 6G 중쇄 PTA-6786 2005년 6월 15일

pEb.6G.hK 6G 경쇄 PTA-6787 2005년 6월 15일

벡터 pEb.9TL.hK는 9TL 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고; 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 9TL 중쇄 가변 영역 및 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331를 함유한 중쇄 IgG2a 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김; 문헌 [Eur.J.Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참조).

벡터 pEb.6G.hK는 6G 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고; 벡터 pDb.6G.hFc2a는 6G 중쇄 가변 영역 및 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331를 함유한 중쇄 IgG2a 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다 (야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 아미노산 번호매김; 문헌 [Eur.J.Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참조).

이러한 기탁물들은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 인정에 관한 부다페스트 조약 및 그의 법규의 규정 하에 있다 (부다페스트 조약). 이것은 기탁일로부터 30년동안 기탁물의 생육가능한 배양물의 유지를 보증한다. 기탁물은 부다페스트 조약 하에 ATCC에 의해 입수될 수 있고, 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션과 ATCC 간의 협약을 거쳐, 어떠한 것이 먼저이든 간에, 적절한 미국 특허의 발포 시에 또는 미국 또는 외국 특허출원을 대중에게 공개할 때, 기탁물 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 대중이 이용할 수 있도록 하였으며, 35USC 122항 및 그에 따른 특허상표청장의 규칙(886 OG 638에 참조로 한 37 CFR 항 1.14 포함)에 따라서 미국 특허상표청장에 의해 결정된 사람에게 그 자손을 이용할 수 있도록 하였다.

본 출원의 양수인은, 적절한 조건 하에서 배양시에 기탁된 물질의 배양물이 사멸되거나 소실되거나 파괴된다면, 이 물질을 동일한 다른 것으로 고지하여 신속히 대체할 것임을 동의하였다. 기탁된 물질의 이용가능성이, 특허법에 따라 어떠한 정부의 권한 하에 승인된 권리를 위반하면서 본 발명을 실행할 수 있는 면허로서 해석되어서는 안된다.

항체 서열

9 TL 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 1)

9 TL 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 2)

9 TL CDR H1 (연장된 CDR ) (서열 3)

9 TL CDR H2 (연장된 CDR ) (서열 4)

9 TL CDR H3 (연장된 CDR ) (서열 5)

9 TL CDR L1 (연장된 CDR ) (서열 6)

9 TL CDR L2 (연장된 CDR ) (서열 7)

9 TL CDR L3 (연장된 CDR ) (서열 8)

9 TL 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 9)

9 TL 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 10)

9 TL 중쇄 전장 항체 아미노산 서열 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 IgG2a 를 포함함) (서열 11)

9 TL 경쇄 전장 항체 아미노산 서열 (서열 12)

9 TL 중쇄 전장 항체 뉴클레오티드 서열 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 IgG2a를 포함함) (서열 13)

9 TL 경쇄 전장 항체 뉴클레오티드 서열 (서열 14)

6G 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 26)

6G 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 27)

6G CDR H1 (연장된 CDR ) (서열 28)

6G CDR H2 (연장된 CDR ) (서열 29)

6G CDR H3 (연장된 CDR ) ( 서열30 )

6G CDR L1 (연장된 CDR ) (서열 31)

6G CDR L2 (연장된 CDR ) (서열 32)

6G CDR L3 (연장된 CDR ) (서열 33)

6G 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 34)

6G 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 35)

6G 중쇄 전장 항체 아미노산 서열 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 IgG2a 를 포함함) (서열 36)

6G 경쇄 전장 항체 아미노산 서열 (서열 37)

6G 중쇄 전장 항체 뉴클레오티드 서열 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 IgG2a를 포함함) (서열 38)

6G 경쇄 전장 항체 뉴클레오티드 서열 (서열 39)

<110> Rinat Neuroscience Corp. ROSENTHAL, Arnon PONS, Jaume HO, Wei-Hsien GRIMM, Jan Markus <120> ANTIBODIES DIRECTED AGAINST AMYLOID-BETA PEPTIDE AND METHODS USING SAME <130> 514712002340 <140> PCT/US2005/027295 <141> 2005-08-02 <150> US 60/676,093 <151> 2005-04-29 <150> US 60/653,197 <151> 2005-02-14 <150> US 60/592,494 <151> 2004-07-30 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Tyr Thr Glu Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Thr Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Arg Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 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gtctggagtg gatgggcttt acttccccct actccggggt gtcgaattac 180 aatcagaagt tcaaaggccg cgtcaccatg acccgcgaca cctccacctc cacagtgtat 240 atggagctgt cctctctgcg ctccgaagac accgccgtgt attactgtgc ccgcttcgac 300 aattacgatc gcggctatgt gcgtgactat tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactggccc catgctcccg cagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480 tcctggaact ctggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgcccccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa g 1341 <210> 39 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 gacatcgtga tgacccagtc cccagactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgcc gcgccagcga atccgtggat aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 ggcgtgcctg accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 tccctgcagg ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 tcctttggcg gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttccctc catctgatga gcagttgaaa tccggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atccacgcga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcc 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga ccctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagttc tccagtcaca aagagcttca accgcggtga gtgc 654 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Gly 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 43 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 44 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 45 Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 46 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 47 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Gly 1 5 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 48 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Gly 1 5 10 15 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 49 Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Gly 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 50 Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Gly 1 5 10 15 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 51 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 52 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 53 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Gly 1 5 10

Claims

β-아밀로이드 펩티드 또는 β-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 손상된 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역을 포함하는 것인, 대상체에서 β-아밀로이드의 이상 침착을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제1항에 있어서, 질병이 알쯔하이머병인 방법.
제1항에 있어서, 질병이 다운 증후군인 방법.
제1항에 있어서, 질병이 대뇌 아밀로이드 혈관병증인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 약 100nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 약 20nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 약 2nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 C-말단에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ_1-40의 잔기 28-40, Aβ_1-42의 잔기 28-42, 또는 Aβ_1-43의 잔기 28-43 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43로 이루어진 군으로부터 선택되는 Aβ 펩티드의 C-말단에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-36위의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 항체가 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ_1-42 또는 Aβ_1-43에 대한 친화력에 비해 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 항체가 서열 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 잔기 1-16 내의 에피토프에 특이적으 로 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 N-말단에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 잔기 16-28 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않거나, 또는 미변성 Fc 영역에 비해 변경된 N-글리코실화 패턴을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화 인식 서열 내에 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 위치 330에서 알라닌으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이 및 위치 331에서 프롤린으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a의 Fc 영역이고, 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 카뱃 번호매김((Kabat numbering)을 기초로 하는 것인 방법.
β-아밀로이드 펩티드 또는 β-아밀로이드 펩티드의 응집된 형태에 특이적으 로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 천연 발생 Fc 영역으로부터의 변형을 갖는 Fc 영역을 포함하고, 상기 변형은 이펙터 기능 손상을 유래하는 것인, 대상체에서 β-아밀로이드의 이상 침착과 연관된 질병의 치료 방법.
제26항에 있어서, Fc 영역에서 변형을 갖는 항체의 투여가, 변형을 갖지 않는 항체의 투여에 비하여, 대뇌 미세출혈을 덜 일으키는 것인 방법.
제26항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제26항에 있어서, 질병이 알쯔하이머병인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 약 100nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 약 20nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 약 2nM 이하의 K_D로 Aβ 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 Aβ_1-40의 잔기 28-40, Aβ_1-42의 28-42, 또는 Aβ_1-43의 28-43 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 항체가 Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43로 이루어진 군으로부터 선택되는 Aβ 펩티드의 C-말단에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-40위의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제38항에 있어서, 항체가 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 Aβ_1-42 또는 Aβ_1-43에 대한 친화력에 비해 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 위의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 항체가 서열 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 잔기 1-16 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 N-말단에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체가 Aβ 펩티드의 잔기 16-28 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않거나, 또는 미변성 Fc 영역에 비해 변경된 N-글리코실화 패턴을 갖는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화 인식 서열 내에 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않는 것인 방법.
제26항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 위치 330에서 알라닌으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이 및 위치 331에서 프롤린으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a의 Fc 영역이고, 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 카뱃 번호매김을 기초로 하는 것인 방법.
(a) 서열 3에 나타낸 CDR1 영역;

(b) 서열 4에 나타낸 CDR2 영역;

(c) 서열 5에 나타낸 CDR3 영역 (여기서 L1은 L, V 또는 I이고; Y2는 Y 또는 W이고; S3은 S, T 또는 G이고; L4는 L, R, A, V, S, T, Q 또는 E이고; V6는 V, I, T, P, C, Q, S, N 또는 F이고; Y7은 Y, H, F, W, S, I, V 또는 A임)

을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
제49항에 있어서, 중쇄 가변 영역이

(a) 서열 3에 나타낸 CDR1 영역;

(b) 서열 4에 나타낸 CDR2 영역;

(c) 서열 5에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 것인 항체.
제49항에 있어서, 경쇄 가변 영역을 더 포함하는 항체.
제49항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
(a) 서열 6에 나타낸 CDR1 영역 (여기서 Y8은 Y, A 또는 H이고, A11은 A 또는 S이고, K12는 K 또는 A임);

(b) 서열 7에 나타낸 CDR2 영역; 및

(c) 서열 8에 나타낸 CDR3 영역 (여기서 L1은 L, M, N, C, F, V, K, S, Q, G, S이고; G3은 G, S 또는 T이고; T4는 T 또는 S이고; H5는 H 또는 L이고; Y6은 Y, P, A, W, Q, M, S 또는 E이고; V8은 V, L, K, H, T, A, E 또는 M이고; L9은 L, I, T, S 또는 V임)

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
제53항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
제53항에 있어서, 경쇄 가변 영역이

(a) 서열 6에 나타낸 CDR1 영역;

(b) 서열 7에 나타낸 CDR2 영역; 및

(c) 서열 8에 나타낸 CDR3 영역

을 포함하는 것인 항체.
제53항에 있어서, 중쇄 가변 영역을 더 포함하는 항체.
제55항에 있어서,

(a) 서열 3에 나타낸 CDR1 영역;

(b) 서열 4에 나타낸 CDR2 영역; 및

(c) 서열 5에 나타낸 CDR3 영역

을 포함하는 중쇄 가변 영역을 더 포함하는 항체.
제57항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제57항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함 하는 것인 항체.
제59항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제60항에 있어서, 중쇄가 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄가 서열 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제49항에 있어서, 손상된 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항체.
제62항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않거나, 또는 미변성 Fc 영역에 비해 변경된 N-글리코실화 패턴을 갖는 것인 항체.
제62항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화 인식 서열 내에 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않는 것인 항체.
제62항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 위치 330에서 알라닌으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이 및 위치 331에서 프롤린으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a의 Fc 영역이고, 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 카뱃 번호매김을 기초로 하는 것인 항체.
제53항에 있어서, 손상된 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항체.
제66항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않거나, 또는 미변성 Fc 영역에 비하여 변경된 N-글리코실화 패턴을 갖는 것인 항체.
제66항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 N-글리코실화 인식 서열 내에 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않는 것인 항체.
제66항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 위치 330에서 알라닌으로부터 세린으로의 아미노산 돌연변이 및 위치 331에서 프롤린으로부터 세린으롱변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a의 Fc 영역이고, 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG2a 서열을 참조로 한 카뱃 번호매김을 기초로 하는 것인 항체.
제49항 내지 제69항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제70항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제70항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
(a) 제49항 내지 제69항 중 어느 한 항의 항체 및 (b) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
제49항 내지 제69항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 키트.
제70항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
제75항에 있어서, 생산된 항체를 단리하는 것을 더 포함하는 방법.