JP2008511291A - アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられる抗体、および該抗体を用いる方法 - Google Patents

アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられる抗体、および該抗体を用いる方法 Download PDF

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Abstract

アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体９ＴＬおよび９ＴＬに由来する抗体、ならびにアルツハイマー病およびＡβペプチド関連疾患の診断および治療に該抗体を使用する方法を記載する。アルツハイマー病およびＡβペプチド関連疾患の治療のため、損なわれたエフェクター機能を有する、アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられる抗体を用いる方法もまた、記載する。

Description

発明の詳細な説明
関連出願に関するクロス・リファレンス
［０００１］本出願は、すべて完全に本明細書に援用される、米国仮出願第６０／５９２，４９４号、２００４年７月３０日出願；第６０／６５３，１９７号、２００５年２月１４日出願；および第６０／６７６，０９３号、２００５年４月２９日出願の優先権の恩典を請求する。
発明の分野
［０００２］本発明は、アミロイド−ベータ・ペプチドに対する抗体に関する。本発明はさらに、アルツハイマー病などの疾患の治療および／または予防におけるこうした抗体の使用に関する。
連邦政府が資金援助した研究または開発に関する記載
［０００３］該当なし。
発明の背景
［０００４］アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の記憶欠損、錯乱、漸進性身体的悪化、および最終的な死によって臨床的に特徴付けられる、変性脳障害である。世界中でおよそ１５００万人の人々がアルツハイマー病に罹患し、そして寿命が増加するにつれて、この数字が劇的に増加すると予測される。組織学的に、この疾患は、連合皮質、辺縁系、および基底核に主に見られる老人斑によって特徴付けられる。これらの斑の主な構成要素はアミロイド・ベータ・ペプチド（Ａβ）であり、このペプチドは、ベータ・アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰまたはＡＰＰ）の切断産物である。ＡＰＰは、巨大な異所性（ｅｃｔｏｐｉｃ）Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および小さい細胞質Ｃ末端テールを含有する、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。染色体２１上の単一ＡＰＰ遺伝子の転写物の選択的スプライシングは、アミノ酸数が異なる、いくつかのアイソフォームを生じる。
［０００５］Ａβは、アルツハイマー病の神経病理において中心的な役割を有する。この疾患の家族型は、ＡＰＰおよびプレセニリン遺伝子における突然変異に結び付けられてきている（Ｔａｎｚｉら， １９９６， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ３：１５９−１６８； Ｈａｒｄｙ， １９９６， Ａｎｎ． Ｍｅｄ． ２８：２５５−２５８）。これらの遺伝子における疾患関連突然変異の結果、アミロイド斑に見られる主な型である、Ａβの４２アミノ酸型の産生が増加する。さらに、ＡＰＰの疾患関連突然変異体を過剰発現するトランスジェニックマウスをヒトＡβで免疫すると、斑負荷および関連病理が減少し（Ｓｃｈｅｎｋら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−１７７； ＷＯ ９９／２７９４４）、そしてまた、Ａβに対して向けられる抗体を末梢投与しても、脳における斑負荷が減少する（Ｂａｒｄら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（８）：９１６−９１９； ＷＯ ２００４／０３２８６８； ＷＯ ００／７２８８０）。
［０００６］ミクログリア細胞および／またはマクロファージによるＦｃ仲介性食作用が、ｉｎ ｖｉｖｏの斑クリアランスのプロセスに重要であることが報告されてきている。Ｂａｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００， ２０２３−２０２８（２００３）。しかし、免疫療法による、ｉｎ ｖｉｖｏのアミロイド−βのクリアランスでは、Ｆｃが仲介しない機構が関与することもまた報告されてきている。Ｂａｃｓｋａｉら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２２：７８７３−７８７８（２００２）；Ｄａｓら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：８５３２−８５３８（２００３）。
［０００７］ したがって、抗体療法は、アルツハイマー病の治療および予防に対する有望なアプローチを提供する。しかし、Ａβ１−４２を含むワクチンを用いたヒト臨床試験は、患者サブセットに髄膜脳炎（ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｔｉｓ）が生じたため、中止された。Ｏｒｇｏｇｏｚｏら， Ｎｅｒｕｏｌｏｇｙ ６１：７−８（２００３）； Ｆｅｒｒｅｒら， Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ． １４：１１−２０（２００４）。ヒトＡＤ脳で観察されるものと類似の、アミロイド斑および神経変性の年齢に関連する発展、ならびに脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を示すトランスジェニックマウスにおいて、Ｎ末端特異的抗Ａβ抗体で受動免疫すると、主にびまん性のアミロイドの有意な減少が生じるが、脳微量出血（ｍｉｃｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）頻度の増加が誘導されることが報告されてきている。Ｐｆｅｉｆｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１３７９（２００２）。ベータ−アミロイドに対して向けられる抗体で受動免疫することによって、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に関連する微量出血が増悪するのは、アミロイド・ベータ・ペプチドの沈着型が抗体に認識されることに依存すると示唆されてきている。Ｒａｃｋｅら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５：６２９−６３６（２００５）。炎症リスクを減少させるため、抗体がＦｃ領域を欠いている、アミロイド沈着物のペプチド構成要素に対する抗体で受動免疫することが示唆されている。ＷＯ ０３／０８６３１０。有効性および安全性プロフィールが改善され、そしてヒト患者で使用するのに適している、Ａβに対して向けられる抗体および他の免疫療法剤に関する必要性が依然としてある。
［０００８］本出願全体に渡って、多様な刊行物（特許および特許出願を含む）が引用されている。これらの刊行物の開示は、その全体が、本明細書に援用される。
発明の簡単な概要
セクションＩ
［０００９］本発明は、被験者の脳における、タンパク質の異常な沈着によって特徴付けられる疾患を治療するための方法を提供する。該方法は、タンパク質またはタンパク質沈着物に特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の薬剤組成物を被験者に投与することを含み、ここで該抗体は損なわれた（ｉｍｐａｉｒｅｄ）エフェクター機能を持つ。
［００１０］本発明はまた、被験者におけるＡβのアミロイド沈着物（例えば脳組織および脳血管系における沈着物）に関連する疾患、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、および脳アミロイド血管症を治療するかまたは予防するための方法も提供する。該方法は、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の薬剤組成物を被験者に投与することを含み、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。
［００１１］本発明はまた、アルツハイマー病などの、被験者におけるＡβのアミロイド沈着物と関連する疾患に関連する症状の発展を遅延させる方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法を提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。
［００１２］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑の形成および／またはアミロイド集積を抑制する方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。いくつかの態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００１３］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑および／またはアミロイド集積を減少させる方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。いくつかの態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００１４］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑および／またはアミロイド集積を除去するかまたは一掃する（ｃｌｅａｒｉｎｇ）方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。いくつかの態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００１５］本発明はまた、組織におけるＡβペプチドの集積を阻害するための方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体を該組織と接触させることを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。
［００１６］本発明はまた、被験者におけるＡβペプチド（可溶性型、オリゴマー型、および沈着型など）を減少させる方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドの有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、Ａβペプチドの集積が、脳において、阻害され、そして／または減少する。いくつかの態様において、Ａβペプチドの毒性効果が阻害され、そして／または減少する。したがって、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、および多発脳梗塞性痴呆などの、Ａβペプチドの集積が存在するかまたは存在すると推測されるいずれかの疾患を治療することも可能である。
［００１７］本発明はまた、アルツハイマー病などの、被験者におけるＡβのアミロイド沈着物と関連する疾患に関連して、認識を改善するかまたは認識衰退を逆転させる方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は損なわれたエフェクター機能を有する。
［００１８］本発明はまた、Ａβのアミロイド沈着物に関連する疾患を治療するかまたは予防するための方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体を含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供し、ここで該抗体は天然存在Ｆｃ領域からの変異を含むＦｃ領域を含み、該変異は損なわれたエフェクター機能を生じる。いくつかの態様において、抗体の投与は、変異を含まない抗体の投与より少ない脳微量出血を引き起こす。
［００１９］Ａβペプチドまたは凝集型のＡβペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する重鎖定常領域を含むポリペプチドもまた、本明細書記載の方法のいずれにも使用可能である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体由来の配列（例えば１以上のＣＤＲ）を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体６Ｇ由来の配列（例えば１以上のＣＤＲ）を含む。
［００２０］本発明の方法に使用する抗体およびポリペプチドは、Ａβペプチドまたは凝集型のＡβペプチドに特異的に結合するが、損なわれたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドはＦ（ａｂ’）２断片ではない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドはＦａｂ断片ではない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは一本鎖抗体ｓｃＦｖではない。
［００２１］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、損なわれたエフェクター機能を有する重鎖定常領域を含み、ここで重鎖定常領域はＦｃ領域を含む。いくつかの態様において、Ｆｃ領域におけるＮグリコシル化は除去されている。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、Ｎグリコシル化認識配列内に突然変異を含み、それによって、抗体またはポリペプチドのＦｃ領域はＮグリコシル化されない。いくつかの態様において、Ｆｃ領域はＰＥＧ化されている。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドの重鎖定常領域は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するアミノ酸番号付け）を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域である。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、以下の突然変異：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５を含むＩｇＧ４の定常領域を含む。
［００２２］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβペプチドの残基１−１６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＡβペプチドのＮ末端に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβペプチドの残基１６−２８内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ＡβペプチドのＣ末端側のエピトープ、例えばアミノ酸２５以降から始まるエピトープに特異的に結合する。抗体は、Ｃ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａβペプチド、例えばＡβ１−３７、１−３８、１−３９、１−４０、１−４１、１−４２、１−４３の未結合（ｆｒｅｅ）Ｃ末端アミノ酸に特異的に結合することも可能である。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０ペプチドの残基２８−４０内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４２ペプチドの残基２８−４２内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４３ペプチドの残基２８−４３内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、全長アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合することなく、Ａβペプチドに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの可溶性型に結合することなく、凝集型に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの凝集型に結合することなく、可溶性型に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの凝集型および可溶性型の両方に特異的に結合する。
［００２３］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０のＣ末端ペプチド３３−４０に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３５−４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３６−４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３９および／または４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０に特異的に結合するが、Ａβ１−４２および／またはＡβ１−４３には特異的に結合しない。いくつかの態様において、抗体は、本明細書記載の抗体９ＴＬまたは９ＴＬ由来の抗体の可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、抗体９ＴＬおよび／または９ＴＬ由来の抗体もしくはポリペプチドの、Ａβ１−４０への結合を競合的に阻害する。
［００２４］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３に対する結合より高い親和性でＡβ１−４０に結合する。いくつかの態様において、抗体は、アミノ酸２５−３４および４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体は、本明細書記載の抗体６Ｇまたは６Ｇに由来する抗体の可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、抗体６Ｇおよび／または６Ｇ由来の抗体もしくはポリペプチドの、Ａβへの結合を競合的に阻害する。
［００２５］Ａβペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する抗体またはポリペプチドの投与は、当該技術分野に知られるいかなる手段によることも可能であり、この手段には：静脈内、皮下、吸入を介する、動脈内、筋内、心臓内、脳室内、非経口、クモ膜下内、および腹腔内が含まれる。投与は全身性、例えば静脈内であることも可能であるし、また限局性であることも可能である。これはまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに一般的に当てはまる。
［００２６］本発明はまた、Ａβペプチドまたは凝集型のＡβペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する抗体またはポリペプチド、あるいは該抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかの有効量、および薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
［００２７］本発明はまた、Ａβペプチドまたは凝集型のＡβペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する抗体またはポリペプチド、あるいは該抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかの有効量を含む、１以上の組成物いずれかを含むキットおよび組成物も提供する。これらのキットは、一般的には適切なパッケージング中にあり、そして適切な使用説明書とともに提供され、本明細書記載の方法のいずれかに有用である。
［００２８］本発明はまた、ヒト被験者における、Ａβペプチドのアミロイド沈着物に関連する疾患の治療のため、療法的ヒト化抗体を産生する方法であって、Ａβペプチドに特異的に結合する第一のヒト化抗体を選択し；そして第一のヒト化抗体に比較して、損なわれたエフェクター機能を有する、療法的ヒト化抗体を提供するように、抗体のＦｃ領域を改変することを含む、前記方法も提供する。
セクションＩＩ
［００２９］本明細書に開示する本発明は、Ａβ１−４０ペプチド（表４に示す配列番号１５）のＣ末端に結合する抗体に関する。したがって、１つの側面において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１２４およびＰＴＡ−６１２５を有する発現ベクターによって産生される、抗体９ＴＬ（交換可能に「９ＴＬ」と称される）である。９ＴＬの重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を図１に示す。抗体９ＴＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）もまた、図１に示す。９ＴＬのいずれかの一部または全領域に対する言及は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１２４およびＰＴＡ−６１２５、および／または図１に示す配列を有する発現ベクターによって産生される配列を含む。
［００３０］別の側面において、本発明はまた、表３に示すアミノ酸配列を含む９ＴＬの抗体変異体も提供する。
［００３１］別の側面において、本発明は、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の断片または領域を含む抗体である。１つの態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖である。別の態様において、断片は、抗体９ＴＬの重鎖である。さらに別の態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域を含有する。さらに別の態様において、断片は、図１に示す軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域を含有する。さらに別の態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖および／または重鎖由来の１以上のＣＤＲを含有する。
［００３２］別の側面において、本発明は、１以上の以下のいずれかを含むポリペプチド（抗体であっても、またなくてもよい）を提供する：ａ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の１以上のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３；ｃ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３；ｄ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｆ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ。本発明はさらに、１以上の以下のいずれかを含むポリペプチド（抗体であっても、またなくてもよい）を提供する：ａ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体由来の１以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）抗体９ＴＬの重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３由来のＣＤＲ；および／またはｃ）抗体９ＴＬの軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３由来のＣＤＲ。いくつかの態様において、ＣＤＲは図１に示すＣＤＲである。いくつかの態様において、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体由来の１以上のＣＤＲは、９ＴＬまたはその変異体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＣＤＲに、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、同一である。
［００３３］いくつかの態様において、ＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲである。他の態様において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。他の態様において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせである（「組み合わせＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも称される）。言い換えると、１より多いＣＤＲを含有する所定の態様いずれに関しても、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、および／または組み合わせのいずれであることも可能である。
［００３４］いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体など）は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、ここでＬ１はＬ、Ｖ、またはＩであり；Ｙ２はＹまたはＷであり；Ｓ３はＳ、Ｔ、またはＧであり；Ｌ４はＬ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＥであり；Ｖ６はＶ、Ｉ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、またはＦであり；そしてＹ７はＹ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｉ、Ｖ、またはＡである。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、重鎖可変領域中のＣＤＲ３である。本明細書において、便宜上、「である（ｉｓ）」は、アミノ酸のこの関連で、またはアミノ酸に準拠して、配列番号の位に準拠する所定の位のアミノ酸（単数または複数）選択を指す。例えば、「Ｌ１はＬ、Ｖ、またはＩである」は、配列番号５において１位のアミノ酸Ｌを、ＶまたはＩで置換することも可能であることを指す。
［００３５］いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体など）は、配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、ここでＹ８はＹ、Ａ、またはＨであり；そしてＡ１１はＡまたはＳであり；そしてＫ１２はＫまたはＡである。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１である。
［００３６］いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体など）は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含み、ここでＬ１はＬ、Ｍ、Ｎ、Ｃ、Ｆ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、Ｓであり；Ｇ３はＧ、Ｓ、またはＴであり；Ｔ４はＴまたはＳであり；Ｈ５はＨまたはＬであり；Ｙ６はＹ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、またはＥであり；Ｖ８はＶ、Ｌ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｅ、またはＭであり；そしてＬ９はＬ、Ｉ、Ｔ、Ｓ、またはＶである。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、軽鎖可変領域のＣＤＲ３である。
［００３７］いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体など）は、（ａ）配列番号３に示すＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号４に示すＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号５に示すＣＤＲ３領域、ここでＬ１はＬ、Ｖ、またはＩであり；Ｙ２はＹまたはＷであり；Ｓ３はＳ、Ｔ、またはＧであり；Ｌ４はＬ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＥであり；Ｖ６はＶ、Ｉ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、またはＦであり；そしてＹ７はＹ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｉ、Ｖ、またはＡである、を含む重鎖可変領域を含む。
［００３８］いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体など）は、（ａ）配列番号６に示すＣＤＲ１領域、ここでＹ８はＹ、Ａ、またはＨであり；Ａ１１はＡまたはＳであり；そしてＫ１２はＫまたはＡである；（ｂ）配列番号７に示すＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号８に示すＣＤＲ３領域、ここでＬ１はＬ、Ｍ、Ｎ、Ｃ、Ｆ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、Ｓであり；Ｇ３はＧ、Ｓ、またはＴであり；Ｔ４はＴまたはＳであり；Ｈ５はＨまたはＬであり；Ｙ６はＹ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、またはＥであり；Ｖ８はＶ、Ｌ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｅ、またはＭであり；そしてＬ９はＬ、Ｉ、Ｔ、Ｓ、またはＶである、を含む軽鎖可変領域を含む。
［００３９］いくつかの態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。他の態様において、本発明の抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナルである。いくつかの態様において、抗体（またはポリペプチド）は単離されている。いくつかの態様において、抗体（またはポリペプチド）は実質的に純粋である。
［００４０］抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥなどの定常領域のいずれかの種類；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのいずれかのアイソタイプ由来であることも可能である。
［００４１］いくつかの態様において、抗体は、免疫学的に不活性である（部分的に免疫学的に不活性であるものを含み、そして用語「損なわれたエフェクター機能を有する（ｈａｖｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏ）」と交換可能に用いられる）、例えば補体仲介性溶解を誘発しないか、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しないか、またはミクログリアを活性化しない定常領域などの、修飾定常領域を含む。いくつかの態様において、定常領域は、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されるように修飾される。他の態様において、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するアミノ酸番号付け）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。いくつかの態様において、抗体は、以下の突然変異：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５を含むＩｇＧ４の定常領域を含む。さらに他の態様において、定常領域は、Ｎ連結グリコシル化に関して、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。いくつかの態様において、定常領域は、定常領域における、オリゴ糖付着残基（Ａｓｎ２９７など）、および／またはＮグリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、Ｎ連結グリコシル化に関して、非グリコシル化されている。いくつかの態様において、定常領域は、Ｎ連結グリコシル化に関して、非グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ連結グリコシル化に関して、酵素的に非グリコシル化されるか、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現によって非グリコシル化されることも可能である。
［００４２］別の側面において、本発明は、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の断片または領域をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（単離されていてもよい）を提供する。１つの態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖である。別の態様において、断片は抗体９ＴＬの重鎖である。さらに別の態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域を含有する。さらに別の態様において、断片は、抗体９ＴＬの軽鎖および／または重鎖由来の１以上（すなわち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
［００４３］別の側面において、本発明は、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（単離されていてもよい）である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
［００４４］別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体（抗体断片を含む）またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
［００４５］別の側面において、本発明は、本明細書に開示するポリヌクレオチドのいずれかを含む、ベクター（発現ベクターおよびクローニング・ベクターを含む）および宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６１２４を有するｐＤｂ．９ＴＬ．ｈＦｃ２ａである。他の態様において、ベクターは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６１２５を有するｐＥｂ．９ＴＬ．ｈＫである。
［００４６］別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
［００４７］別の側面において、本発明は、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体が結合している、Ａβ１−４０の複合体である。
［００４８］別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体またはポリペプチドのいずれかが結合している、Ａβ１−４０の複合体である。
［００４９］別の側面において、本発明は、本明細書記載のポリペプチド（抗体９ＴＬの１以上のＣＤＲを含む抗体などの、抗体を含む）またはポリヌクレオチドのいずれかの有効量、および薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物である。
［００５０］別の側面において、本発明は、抗体９ＴＬを生成する方法であって、抗体９ＴＬの産生を可能にする条件下で、宿主細胞またはその子孫を培養し、ここで宿主細胞は、抗体９ＴＬをコードする発現ベクターを含む；そしていくつかの態様において、抗体９ＴＬを精製することを含む、前記方法である。いくつかの態様において、発現ベクターは、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチド配列の一方または両方を含む。
［００５１］別の側面において、本発明は、適切な細胞において、抗体（単一の軽鎖または重鎖として別個に発現されることも可能であるし、あるいは１つのベクターから軽鎖および重鎖の両方が発現される）またはポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを発現させ、一般的には、その後、目的の抗体またはポリペプチドを回収し、そして／または単離することによって、本明細書記載の抗体またはポリペプチドのいずれかを生成する方法を提供する。
［００５２］本発明はまた、アルツハイマー病、ならびに改変されたＡβまたはβＡＰＰ発現、あるいはＡβペプチドの集積に関連する他の疾患、例えばダウン症候群、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、およびＡＩＤＳの発展を予防するか、治療するか、阻害するか、または遅延させるための方法も提供する。該方法は、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を、被験者に投与することを含む。
［００５３］本発明はまた、被験者において、アルツハイマー病、またはＡβペプチドの集積と関連する他の疾患に関連する症状の発展を遅延させる方法であって、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。
［００５４］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑の形成および／またはアミロイド集積を抑制する方法であって、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。他の態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００５５］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑および／またはアミロイド集積を減少させる方法であって、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。他の態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００５６］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑および／またはアミロイド集積を除去するか（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）または一掃する（ｃｌｅａｒｉｎｇ）方法であって、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳（脳組織）にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は脳血管系にある。他の態様において、アミロイド集積は循環系にある。
［００５７］さらに、本発明は、組織におけるＡβの集積を阻害するための方法であって、本発明の抗体またはポリペプチドと該組織を接触させることを含む、前記方法を提供する。
［００５８］本発明はまた、個体の脳におけるＡβペプチド（可溶性型、オリゴマー型および沈着型など）を減少させる方法であって、本発明の抗体またはポリペプチドの有効量を該個体に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、Ａβペプチドの集積が、脳において、阻害され、そして／または減少する。いくつかの態様において、Ａβペプチドの毒性効果が阻害され、そして／または減少する。したがって、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、および脳アミロイド血管症などの、Ａβペプチドの集積が存在するか存在すると推測される、いかなる疾患を治療することも可能である。
［００５９］本発明はまた、アルツハイマー病などの、個体の脳におけるＡβのアミロイド沈着物と関連する疾患に関連して、認識を改善するかまたは認識衰退を逆転させる方法であって、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む、有効投薬量の薬剤組成物を該個体に投与することを含む方法を提供する。
［００６０］本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドのいずれも、本発明の方法に使用可能である。いくつかの態様において、抗体は抗体９ＴＬである。
［００６１］本発明の抗体およびポリペプチドをさらに、アルツハイマー病、ならびにダウン症候群およびＡＩＤＳなどの、改変されたＡβまたはβＡＰＰ発現と関連する他の疾患の検出、診断および監視に用いることも可能である。該方法は、改変されたＡβまたはβＡＰＰ発現を有すると推測される患者の検体を、本発明の抗体と接触させ、そしてＡβまたはβＡＰＰのレベルが、対照検体または比較検体のものと異なるかどうかを決定することを含む。いくつかの態様において、Ａβの血清レベルを、抗Ａβ抗体の投与前および投与後に測定し；そしてＡβの血清レベルのいかなる増加も評価する。
［００６２］本発明の抗体またはポリペプチドいずれの投与も、当該技術分野に知られるいかなる手段によることも可能であり、この手段には：静脈内、皮下、吸入を介する、動脈内、筋内、心臓内、脳室内、非経口、クモ膜下内、および腹腔内が含まれる。投与は全身性、例えば静脈内であることも可能であるし、また限局性であることも可能である。これはまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに一般的に当てはまる。
［００６３］別の側面において、本発明は、本明細書記載の１以上の組成物いずれかを含むキットおよび組成物を提供する。これらのキットは、一般的には適切なパッケージング中にあり、そして適切な使用説明書とともに提供され、本明細書記載の方法のいずれかに有用である。
発明の詳細な説明
［００７８］本明細書に開示する本発明は、Ａβ１−４０のＣ末端に結合する抗体およびポリペプチドを提供する。これらの抗体およびポリペプチドは、９ＴＬまたは表３に示すその変異体に由来する。本発明はまた、これらの抗体を作成し、そして用いる方法も提供する。いくつかの態様において、本発明は、抗体９ＴＬ、およびこの抗体を作成し、そして用いる方法を提供する。本発明はまた、Ａβ１−４０に結合する９ＴＬポリペプチド（抗体を含む）、および９ＴＬ抗体および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
［００７９］本明細書に開示する本発明はまた、療法的有効量の抗体９ＴＬ、あるいは９ＴＬ由来の抗体またはポリペプチドの投与によって、個体において、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、血管におけるＡβペプチドの沈着物によって引き起こされる血管障害である脳アミロイド血管症（脳卒中およびＨＣＨＷＡ−Ｄなど）などの、Ａβ関連疾患を予防し、そして／または治療するための方法も提供する。
［００８０］本発明はまた、β−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のＡβペプチドに特異的に結合する抗体またはポリペプチド、あるいは該抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の薬剤組成物を個体に投与することによって、アルツハイマー病、ダウン症候群、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、および脳アミロイド血管症などの、個体におけるβ−アミロイド沈着物と関連する疾患を治療するかまたは予防するための方法も提供し、ここで抗体またはポリペプチドは、損なわれたエフェクター機能を有する。
一般的な技術
［００８１］本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技術を使用するであろう。こうした技術は：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ監修， １９８４）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ． Ｃｅｌｌｉｓ監修， １９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修， １９８７）； Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ． ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， １９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ． Ｄｏｙｌｅ， Ｊ．Ｂ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，およびＤ．Ｇ． Ｎｅｗｅｌｌ監修， １９９３−１９９８）Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ監修， １９８７）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修， １９８７）； ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， （Ｍｕｌｌｉｓら監修， １９９４）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら監修， １９９１）； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９９）； Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ． ＪａｎｅｗａｙおよびＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， １９９７）； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ． Ｆｉｎｃｈ， １９９７）； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ． Ｃａｔｔｙ監修， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８８−１９８９）； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ． ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ． Ｄｅａｎ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００）； Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９）； Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ． ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ． Ｃａｐｒａら監修， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９５）などの文献に完全に説明されている。
定義
［００８２］「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のターゲットに特異的に結合可能な免疫グロブリン分子である。本明細書において、該用語は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾立体配置いずれも含む。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの、いかなるクラスの抗体も含み、そして抗体は、特定のクラスいずれかのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることも可能である。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかを、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることも可能である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置が周知である。
［００８３］本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体集団から得た抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在しうる、ありうる天然存在突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して向けられているため、非常に特異的である。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして特定の方法いずれかによる抗体の産生が必要であるとは見なされないものとする。例えば、本発明にしたがって用いようとするモノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法によって、作成することも可能であるし、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作成することも可能である。また、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４に記載される技術を用いて生成されたファージ・ライブラリーから、モノクローナル抗体を単離することもまた可能である。
［００８４］本明細書において、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合性サブ配列）である、非ヒト（例えばネズミ）抗体の型を指す。ヒト化抗体は、大部分、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられている。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体、あるいは移入するＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されないが、抗体性能をさらに精緻化し、そして最適化するために含まれる残基を含むことも可能である。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろうし、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適にはまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように修飾されたＦｃ領域を有することも可能である。ヒト化抗体の他の型は、元来の抗体に関して改変されており、また、元来の抗体由来の１以上のＣＤＲに「由来する」１以上のＣＤＲとも称される、１以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有する。
［００８５］本明細書において、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有し、そして／または当該技術分野に知られるか、または本明細書に開示する、ヒト抗体を作成する技術のいずれかを用いて作成されている、抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。１つのこうした例は、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。当該技術分野に知られる多様な技術を用いて、ヒト抗体を産生することも可能である。１つの態様において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージ・ライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：３０９−３１４； Ｓｈｅｅｔｓら， １９９８， ＰＮＡＳ， （ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２； ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１； Ｍａｒｋｓら， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１）。ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的に、または完全に不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってもまた、作成可能である。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ターゲット抗原に対して向けられる抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによってヒト抗体を調製することも可能である（こうしたＢリンパ球は個体から回収可能であるし、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫されていることも可能である）。例えば、Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ．７７（１９８５）； Ｂｏｅｒｎｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（ｌ）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
［００８６］本明細書において、用語「９ＴＬ」および「抗体９ＴＬ」は、交換可能に用いられ、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６１２４およびＡＴＣＣ ＰＴＡ−６１２５の寄託番号を有する発現ベクターによって産生される抗体を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を図１に示す。抗体９ＴＬのＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）を図１に図式的に示す。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを、配列番号９および配列番号１０に示す。９ＴＬの性質決定を実施例に示す。
［００８７］用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、いかなる長さのアミノ酸のポリマーも指す。ポリマーは、直鎖であることもまたは分枝していることも可能であり、修飾アミノ酸を含むことも可能であり、そして非アミノ酸によって中断されていることも可能である。該用語はまた、天然に、または介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含み；修飾には、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾いずれか、例えば標識構成要素を用いたコンジュゲート化がある。この定義内にやはり含まれるのは、例えば、１以上のアミノ酸類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、抗体に基づくため、ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在することも可能であることが理解される。
［００８８］本明細書において交換可能に用いられるような「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、いかなる長さのヌクレオチドのポリマーも指し、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはその類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込まれることも可能な基質いずれであることも可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことも可能である。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーの組み立て前または後に与えることも可能である。非ヌクレオチド構成要素によって、ヌクレオチドの配列を中断することも可能である。標識構成要素とのコンジュゲート化によるなど、ポリヌクレオチドを重合後にさらに修飾することも可能である。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ」、１以上の天然存在ヌクレオチドの類似体での置換、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメートなど）および荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）を用いるなどのヌクレオチド間修飾、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジンなど）などのペンダント部分を含有する修飾、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えばアクリジン、ソラレンなど）を用いる修飾、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾連結を用いる修飾（例えばアルファ・アノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチド（単数または複数）の非修飾型を用いる修飾が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホネート基、リン酸基によって置換するか、標準的保護基によって保護するか、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結に備えるため、活性化するか、あるいは固体支持体にコンジュゲート化することも可能である。５’および３’末端のＯＨをリン酸化するか、あるいはアミンまたは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基で置換することも可能である。他のヒドロキシルを標準的保護基に誘導体化することもまた可能である。ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野に一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖の類似の型を含有することも可能であり、こうした型には、例えば、２’−−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシドなどの脱塩基性ヌクレオシド類似体が含まれる。１以上のホスホジエステル連結を、代替連結基によって置換することも可能である。これらの代替連結基には、限定されるわけではないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、“（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセチル」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立にＨであるか、または場合によってエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有する、置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である）に置換されている態様が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めて、本明細書に言及するすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
［００８９］抗体の「可変領域」は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としてもまた知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって近接してともに保持され、そして他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するには、少なくとも２つの技術がある：（１）種間配列変動に基づくアプローチ（すなわちＫａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， （第５版， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， メリーランド州ベセスダ））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７−９４８））。本明細書において、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによるか、または両方のアプローチの組み合わせによって定義されるＣＤＲを指すことも可能である。
［００９０］抗体の「定常領域」は、単独または組み合わせいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
［００９１］抗体またはポリペプチドに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において交換可能に用いられる）エピトープは、当該技術分野によく理解される用語であり、そしてこうした特異的結合または優先的結合を決定する方法もまた、当該技術分野に周知である。分子が、別の細胞または物質と反応するかまたは会合するよりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性で反応するかまたは会合する場合、分子は「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言う。抗体が、他の物質に結合するよりも、より高い親和性で、より高いアビディティーで、より容易に、および／またはより長い期間、結合する場合、抗体は、ターゲットに「特異的に結合する」かまたは「優先的に結合する」。例えば、Ａβ１−４０エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、他のＡβ１−４０エピトープまたは非Ａβ１−４０エピトープに結合するよりも、より高い親和性で、より高いアビディティーで、より容易に、および／またはより長い期間、このエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第一のターゲットに特異的にまたは優先的に結合する抗体（あるいは部分またはエピトープ）は、第二のターゲットに特異的にまたは優先的に結合しても、またはしなくてもよいこともまた理解される。こうしたものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも（含むことも可能であるが）排他的な結合を必要としない。必ずしもではないが、一般的に、結合への言及は優先的な結合を意味する。
［００９２］本明細書において、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち混入物質不含）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
［００９３］「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を取り込むベクター（単数または複数）のレシピエントであることが可能であるか、またはレシピエントであったことがある、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、そして天然の、偶発的な、または故意の突然変異のため、子孫は、必ずしも、元来の親細胞に（形態において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）で、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞が含まれる。
［００９４］用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するよう用いられる。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であることも可能である。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は多様であることも可能であるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位、またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に広がると定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようにＥＵ指標のものである。Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， メリーランド州ベセスダ， １９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
［００９５］本明細書において、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、そしてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは主に細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ， １９９１， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９：４５７−９２； Ｃａｐｅｌら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ， ４：２５−３４；およびｄｅ Ｈａａｓら， １９９５， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．， １２６：３３０−４１に概説される。「ＦｃＲ」には、胎児への母性ＩｇＧのトランスファーに関与する新生児受容体、ＦｃＲｎもまた含まれる（Ｇｕｙｅｒら， １９７６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１７：５８７；およびＫｉｍら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４：２４９）。
［００９６］「補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下のターゲットの溶解を指す。補体活性化経路は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原と複合体化した分子（例えば抗体）への補体系の第一の構成要素（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０２：１６３（１９９６）に記載されるような、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。
［００９７］「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を所持する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。こうしたエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が結合性ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、そしてこうした抗体エフェクター機能を評価するために当該技術分野に知られる多様なアッセイを用いて評価可能である。
［００９８］「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のため、天然配列Ｆｃ領域のものと異なるが、なお天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する、アミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域に比較して、または親ポリペプチドのＦｃ領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を、例えば、天然配列Ｆｃ領域において、または親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１〜約１０のアミノ酸置換を、そして好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドＦｃ領域と、少なくとも約８０％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を所持するであろう。
［００９９］本明細書において、「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、ターゲット細胞上に結合した抗体を認識し、そして続いて、ターゲット細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性反応を指す。米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるものなどの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを用いて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価することも可能である。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら， １９９８， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ９５：６５２−６５６に開示されるものなどの動物モデルにおいて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価することも可能である。
［０１００］本明細書において、薬剤、化合物、または薬剤組成物の「有効投薬量」または「有効量」は、有益な結果または望ましい結果を達成するのに十分な量である。予防的使用に関して、有益な結果または望ましい結果には、リスクを除去するかまたは減少させること、重症度を減少させること、あるいは疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状、その合併症、および疾患発展中に提示される中間の病的表現型を含めて、疾患の発生を遅延させることなどの結果が含まれる。療法的使用に関して、有益な結果または望ましい結果には、アミロイド斑の形成を阻害するか、抑制するか、または減少させること、アミロイド斑を減少させ、除去し、一掃すること、認識を改善すること、認識衰退を逆転させるかまたは遅延させること、体液中に循環する可溶性Ａβペプチドを隔離するかまたは増加させること、その合併症、および疾患発展中に提示される中間の病的表現型を含めて、疾患から生じる１以上の症状（生化学的、組織学的および／または行動的症状）を減少させること、疾患に罹患した対象の生活の質を増加させること、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量を減少させること、別の薬剤の効果を増進すること、疾患の進行を遅延させること、および／または患者の生存を延長することなどの臨床的結果が含まれる。１以上の投与で、有効投薬量を投与することも可能である。本発明の目的のため、薬剤、化合物、または薬剤組成物の有効投薬量は、直接または間接的のいずれかで、予防的治療または療法的治療を達成するのに十分な量である。臨床的関連で理解されるように、薬剤、化合物、または薬剤組成物の有効投薬量は、別の薬剤、化合物、または薬剤組成物と組み合わせて達成してもよいし、また組み合わせなくてもよい。したがって、「有効投薬量」は、１以上の療法剤の投与と関連して見なされることも可能であり、そして１以上の他の剤と組み合わせて、望ましい結果が達成可能であるかまたは達成される場合、単一の剤が、有効量で投与されたと見なすことも可能である。
［０１０１］本明細書において、「治療」または「治療する」は、臨床的結果を含む有益な結果または望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益な臨床的結果または望ましい臨床的結果には、限定されるわけではないが、１以上の以下が含まれる：アミロイド斑の形成を阻害するか、抑制するか、または減少させること、アミロイド斑を減少させ、除去し、一掃すること、認識を改善すること、認識衰退を逆転させるかまたは遅延させること、体液中に循環する可溶性Ａβペプチドを隔離すること、組織（脳など）中の（可溶性、オリゴマー性および沈着した）Ａβペプチドを減少させること、脳中のＡβペプチドの集積を阻害し、遅延させ、そして／または減少させること、組織（脳など）中のＡβペプチドの毒性効果を阻害し、遅延させ、そして／または減少させること、疾患から生じる症状を減少させること、疾患に罹患した対象の生活の質を増加させること、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、および／または患者の生存を延長すること。
［０１０２］本明細書において、アルツハイマー病の発展を「遅延させること」は、疾患の発展を延期し、妨害し、減速し、遅らせ、固定し、そして／または先送りにすることを意味する。この遅延は、治療中の疾患および／または個体の病歴に応じて、多様な長さの時間であることも可能である。当業者に明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発展させない、予防を含むことも可能である。アルツハイマー病の発展を「遅延させる」方法は、該方法を用いない場合に比較して、所定の時間枠で、疾患が発展する可能性を減少させ、そして／または所定の時間枠で、疾患の度合いを減少させる方法である。こうした比較は、典型的には、統計的に有意な数の被験者を用いた、臨床的研究に基づく。
［０１０３］アルツハイマー病の「発展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」は、個体内のアルツハイマー病の開始および／または進行を意味する。アルツハイマー病の発展は、本明細書に記載するような標準的な臨床的技術を用いて、検出可能でありうる。しかし、発展はまた、最初には検出不能であることも可能な疾患進行も指す。本発明の目的のため、進行は、疾患状態の生物学的経過を指し、この場合、標準的神経学的検査、患者インタビューによって決定されるようなものであり、またはより特殊化された試験によって決定されることも可能である。これらの多様な診断試験には、限定されるわけではないが、神経画像化、血清または脳脊髄液中の特定のタンパク質（例えばアミロイド・ペプチドおよびＴａｕ）レベルの改変の検出、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）が含まれる。「発展」には、発生、再発、および開始が含まれる。本明細書において、アルツハイマー病の「開始」または「発生」には、最初の開始および／または再発が含まれる。
［０１０４］本明細書において、「組み合わせて」には、同時投与および／または異なる時点の投与が含まれる。組み合わせ投与はまた、共配合物としての投与または別個の組成物の投与も含む。本明細書において、組み合わせ投与は、同時に、そして／または別個に起こることも可能である、抗Ａβ抗体および別の剤を個体に投与する、いかなる状況を含むことも意味する。本明細書においてさらに論じるように、抗Ａβ抗体および他の剤を、異なる投薬頻度または間隔で、投与することも可能であることが理解される。例えば、抗Ａβ抗体を毎週投与し、一方、他の剤をより低頻度で投与することも可能である。同じ投与経路または異なる投与経路を用いて、抗Ａβ抗体および他の剤を投与することも可能であることが理解される。
［０１０５］「生物学的試料」は、個体から得られる多様な試料種を含み、そして診断アッセイまたは監視アッセイにおいて使用可能である。この定義は、血液および生物学的起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば生検検体または組織培養物またはそれに由来する細胞、およびその子孫を含む。この定義にはまた、獲得後、試薬での処理、可溶化、あるいはタンパク質またはポリヌクレオチドなどの特定の構成要素に関する濃縮、あるいは切片作成目的のための半固体または固体マトリックス中の包埋によるなどの、いかなる方法で操作されている試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床的試料を含み、そしてまた、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織試料も含む。
［０１０６］「個体」（あるいは「被験者」とも称される）は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定されるわけではないが、農場動物（ウシなど）、スポーツ用動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットもまた含まれる。
［０１０７］本明細書において、「ベクター」は、宿主細胞において、１以上の目的の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を送達し、そして好ましくは発現することが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）などの特定の真核細胞が含まれる。
［０１０８］本明細書において、「発現調節配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現調節配列は、恒常性または誘導性プロモーターなどのプロモーター、あるいはエンハンサーであることも可能である。発現調節配列は、転写しようとする核酸配列に機能可能であるように連結されている。
［０１０９］本明細書において、「薬学的に許容しうるキャリアー」には、活性成分と組み合わせた際、該成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、そして被験者の免疫系と非反応性であるいかなる物質も含まれる。例には、限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および多様な種類の湿潤剤などの標準的な薬剤キャリアーがいずれも含まれる。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または正常（０．９％）生理食塩水である。周知の慣用的方法によって、こうしたキャリアーを含む組成物を配合する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版, Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修, Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ペンシルバニア州イーストン， １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００を参照されたい）。
［０１１０］用語「ｋｏｎ」は、本明細書において、抗体の抗原への会合に関する、結合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を指すよう意図される。
［０１１１］用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書において、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する、解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を指すよう意図される。
［０１１２］用語「ＫＤ」は、本明細書において、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すよう意図される。
組成物および組成物を作成する方法
抗体９ＴＬならびに９ＴＬ由来抗体およびポリペプチド
［０１１３］本発明は、抗体９ＴＬおよび表３に示すその変異体、または抗体９ＴＬおよび表３に示すその変異体由来のポリペプチド；ならびに９ＴＬ抗体およびその変異体またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、薬剤組成物を含めた組成物を含む。本明細書において、組成物は、Ａβ１−４０のＣ末端に結合する１以上の抗体またはポリペプチド（抗体であってもまたはなくてもよい）、および／またはＡβ１−４０のＣ末端に結合する１以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む１以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野に周知の、緩衝剤を含む薬学的に許容しうる賦形剤などの、適切な賦形剤をさらに含むことも可能である。
［０１１４］本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特性のいずれか（１以上）によって特徴付けられる：（ａ）Ａβ１−４０のＣ末端ペプチド２８−４０に結合するが、Ａβ１−４２またはＡβ１−４３には有意には結合しない；（ｂ）Ａβ１−４０のＣ末端ペプチド３３−４０に結合する；（ｃ）被験者におけるアミロイド斑の形成を抑制する；（ｄ）被験者におけるアミロイド斑を減少させる；（ｅ）アルツハイマー病の１以上の症状を治療するか、予防するか、改善する；（ｆ）認識機能を改善する。本発明の抗体およびポリペプチドはまた、他の報告される抗Ａβ抗体と対照的に、望ましい安全性プロフィールを示すことも可能である。例えば、本発明の組成物は、有意なまたは許容しえないレベルの：脳血管系における出血（脳出血）；髄膜脳炎（磁気共鳴スキャンの変化を含む）；脳脊髄液中の上昇した白血球数；中枢神経系炎症のいずれか１以上を引き起こさないことも可能である。
［０１１５］したがって、本発明は、以下のいずれか、または以下のいずれかを含む組成物（薬剤組成物を含む）を提供する：（ａ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体；（ｂ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の断片または領域；（ｃ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖；（ｄ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖；（ｅ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域（単数または複数）；（ｆ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の１以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）；（ｇ）抗体９ＴＬの重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３；（ｈ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３；（ｉ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｊ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｋ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の、軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；および（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のいずれか１つを含む抗体。本発明はまた、上記のいずれか１以上を含むポリペプチドも提供する。
［０１１６］抗体９ＴＬのＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）を図１に図式的に示す。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当該技術分野の技術範囲内である。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせであることも可能である（「組み合わせＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも称される）。いくつかの態様において、ＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲである。他の態様において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。言い換えると、１より多いＣＤＲを含む態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組み合わせＣＤＲ、またはこれらの組み合わせのいずれであることも可能である。
［０１１７］いくつかの態様において、本発明は、９ＴＬまたは表３に示すその変異体の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてのＣＤＲに実質的に同一である、少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてのＣＤＲを含む、ポリペプチド（抗体であってもまたはなくてもよい）を提供する。他の態様には、９ＴＬの、または９ＴＬに由来する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲに実質的に同一である、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（単数または複数）を有する抗体が含まれる。いくつかの態様において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（単数または複数）は、９ＴＬまたは表３に示すその変異体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲに、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。本発明の目的のため、９ＴＬまたは表３に示すその変異体に比較して、活性の度合いは多様であることも可能である（より高くてもまたは低くてもよい）が、結合特異性および／または全体的な活性は、一般的に保持される。
［０１１８］本発明はまた、以下のいずれかを有する、９ＴＬまたは表３に示すその変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体であってもまたなくてもよい）も提供する：９ＴＬまたは表３に示すその変異体の配列の少なくとも５つの隣接アミノ酸、少なくとも８つの隣接アミノ酸、少なくとも約１０の隣接アミノ酸、少なくとも約１５の隣接アミノ酸、少なくとも約２０の隣接アミノ酸、少なくとも約２５の隣接アミノ酸、少なくとも約３０の隣接アミノ酸、ここで、アミノ酸の少なくとも３つは、９ＴＬ（図１）または表３に示すその変異体の可変領域由来である。１つの態様において、可変領域は、９ＴＬの軽鎖由来である。別の態様において、可変領域は９ＴＬの重鎖由来である。典型的なポリペプチドは、９ＴＬの重鎖および軽鎖の可変領域両方に由来する隣接アミノ酸（上述の長さ）を有する。別の態様において、５つ（以上）の隣接アミノ酸は、図１に示す９ＴＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。いくつかの態様において、隣接アミノ酸は、９ＴＬの可変領域由来である。
［０１１９］本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性は多様であることも可能であり、そして以下に記載する典型的な態様のように、特定の値または範囲である必要はない（が、こうした値または範囲であることも可能である）。Ａβ１−４０への本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性は、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭおよび約０．１８〜約０．７２ｎＭであることも可能である。いくつかの態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。１つの態様において、結合親和性は、約２ｐＭ−２２ｐＭの間である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭ未満である。いくつかの態様において、結合親和性は、約１０ｎＭである。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約５ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約１ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の態様において、結合親和性は約０．１ｎＭ未満または約０．０７ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかである。さらに他の態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。
［０１２０］本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作成する方法も提供する。本発明の抗体は、当該技術分野に知られる方法によって作成可能である。抗体のタンパク質分解的分解または他の分解によって、上述のような組換え法（すなわち単一または融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって、ポリペプチドを産生することも可能である。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までの、より短いポリペプチドは、好適に、化学合成によって作成される。化学合成の方法は、当該技術分野に知られ、そして商業的に利用可能である。例えば、固相法を使用した自動化ポリペプチド合成装置によって、抗体を産生することも可能である。米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第６，３３１，４１５号もまた、参照されたい。
［０１２１］別の代替法において、当該技術分野に周知の方法を用いて、抗体を組換え的に産生することも可能である。１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示す抗体９ＴＬの重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする配列を含む。別の態様において、配列番号９および配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、発現または増殖のため、１以上のベクターにクローニングする。目的の抗体をコードする配列を、宿主細胞においてベクター中で維持することも可能であるし、そして次いで、宿主細胞を増殖させ、そして将来の使用のために凍結することも可能である。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞を、本明細書にさらに記載する。
［０１２２］本発明はまた、９ＴＬなどの本発明の抗体の一本鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も含む。一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることによって、軽鎖および／または重鎖の可変領域を連結することにより、作成される。Ｂｉｒｄら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの例は、一方の可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端間の、およそ３．５ｎｍを架橋する、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号４０）である。他の配列のリンカーが設計され、そして用いられてきている。Ｂｉｒｄら（１９８８）。次に、薬剤の付着または固体支持体への付着などの、さらなる機能のため、リンカーを修飾することも可能である。組換え的または合成的のいずれかで、一本鎖変異体を産生することも可能である。ｓｃＦｖの合成的産生のため、自動化合成装置を使用してもよい。ｓｃＦｖの組換え産生のため、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの原核細胞いずれかの、適切な宿主細胞に導入することも可能である。ポリヌクレオチドの連結などのルーチンの操作によって、目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを作成することも可能である。当該技術分野に知られる標準的タンパク質精製技術を用いて、生じたｓｃＦｖを単離することも可能である。
［０１２３］一本鎖抗体の他の型、例えばディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）もまた含まれる。ディアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーが用いられ、それによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成するように強いられて、そして２つの抗原結合部位が生成される、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８； Ｐｏｌｊａｋ， Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
［０１２４］例えば、本明細書に開示する抗体を用いて、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクローナル抗体を調製することも可能である。二重特異性抗体を作成する方法が、当該技術分野に知られる（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照されたい）。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、異なる特異性を有する２つの重鎖と、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５， ５３７−５３９）。
［０１２５］二重特異性抗体を作成するための１つのアプローチにしたがって、望ましい結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を持つ抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２領域およびＣＤ３領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。軽鎖結合に必要な部位を含有する、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体の少なくとも一方に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター内に挿入し、そして適切な宿主生物に、同時トランスフェクションする。これは、構築物中に用いられる３つのポリペプチド鎖が等しくない比である場合に最適な収量が提供される態様において、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際に高い柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が等しい比である場合に高い収量を生じるか、または比率が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に２つまたは３つすべてのポリペプチドのコード配列を挿入することが可能である。
［０１２６］１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体は、一方のアームにおける、第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおける、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を含む、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから、望ましい二重特異性化合物を分離するのを容易にする。このアプローチは、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／０４６９０号、１９９４年３月３日公表に記載される。
［０１２７］２つの共有結合抗体を含む、へテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内にある。こうした抗体は、望ましくない細胞に、免疫系の細胞をターゲティングするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の治療のため（ＰＣＴ出願第ＷＯ ９１／００３６０号および第ＷＯ ９２／２００３７３号； ＥＰ ０３０８９）、用いられてきている。好適な架橋法いずれを用いて、ヘテロコンジュゲート抗体を作成することも可能である。適切な架橋剤および技術が、当該技術分野に周知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号に記載される。
［０１２８］架橋剤を伴うものを含めて、合成タンパク質化学反応の既知の方法を用いて、キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することも可能である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することも可能である。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
［０１２９］当該技術分野に知られる方法いずれを用いて、抗体９ＴＬの１以上のＣＤＲ、または抗体９ＴＬ由来の１以上のＣＤＲを含むヒト化抗体を作成することも可能である。例えば、４つの一般的な工程を用いて、モノクローナル抗体をヒト化することも可能である。これらは：（１）出発抗体軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列の決定、（２）ヒト化抗体の設計、すなわちヒト化プロセス中、どの抗体フレームワーク領域を用いるかの決定、（３）実際のヒト化方法論／技術、および（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第６，１８０，３７０号；第５，２２５，５３９号；第６，５４８，６４０号を参照されたい。
［０１３０］組換えヒト化型において、Ｆｃ部分を修飾して、Ｆｃγ受容体および補体免疫系の相互作用を回避することも可能である。この種の修飾は、ケンブリッジ大学病理学部のＭｉｋｅ Ｃｌａｒｋ博士によって設計され、そしてこうした抗体を調製するための技術は、ＷＯ ９９／５８５７２、１９９９年１１月１８日公表に記載される。
［０１３１］例えば、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療に用いる場合、免疫応答を回避するため、ヒト定常領域に、より似るように、定常領域を操作することも可能である。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
［０１３２］本発明は、抗体９ＴＬへの修飾を含み、これには、その特性に有意に影響を及ぼさない、機能的に同等な抗体、および増進したかまたは減少した活性および／または親和性を有する変異体が含まれる。例えば、抗体９ＴＬのアミノ酸配列を突然変異させて、Ａβ１−４０ペプチドに対する望ましい結合親和性を持つ抗体を得ることも可能である。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野においてルーチンで実行され、そして本明細書に詳細に記載する必要はない。ポリペプチドの修飾を実施例に例示する。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換を持つポリペプチド、機能的活性を有意に有害に変化させない、アミノ酸の１以上の欠失または付加、あるいは化学的類似体の使用が含まれる。
［０１３３］アミノ酸配列挿入には、１残基から百以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端への、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの融合が含まれる。
［０１３４］置換変異体では、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして異なる残基がその代わりに挿入されている。置換突然変異誘発に最も関心が持たれる部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変もまた意図される。「保存的置換」の見出し下、表１に保存的置換を示す。こうした置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表１に「典型的な置換」と名づけるか、またはアミノ酸クラスに関して、以下にさらに言及するような、より実質的な変化を導入し、そして産物をスクリーニングすることも可能である。
表１．アミノ酸置換
Figure 2008511291
［０１３５］抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての、置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位の分子の荷電または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対する影響が有意に異なる置換を選択することによって、達成される。共通の側鎖特性に基づいて、天然存在残基をグループに分ける：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）非荷電極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
［０１３６］非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することによって作成される。
［０１３７］抗体の適切なコンホメーションを維持するのに関与しない、いかなるシステイン残基も、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な架橋を妨げることも可能である。逆に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、抗体にシステイン結合（単数または複数）を添加して、安定性を改善することも可能である。
［０１３８］アミノ酸修飾は、１以上のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計の範囲に渡ることも可能である。可変領域中の変化は、結合親和性および／または特異性を改変することも可能である。いくつかの態様において、ＣＤＲドメイン内で、１〜５以下の保存的アミノ酸置換を作成する。他の態様において、ＣＤＲドメイン内で、１〜３以下の保存的アミノ酸置換を作成する。さらに他の態様において、ＣＤＲドメインはＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
［０１３９］修飾にはまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに例えば異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの、他の翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。抗体は、定常領域中の保存される位でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ， １９９７， Ｃｈｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６５：１１１−１２８； ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら， １９９６， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：１３１１−１３１８； ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９：４１７５−４１８０）、ならびに、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示される三次元表面に影響を及ぼす可能性もある、糖タンパク質部分間の分子内相互作用（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記； ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ， １９９６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７：４０９−４１６）に影響を及ぼす。オリゴ糖はまた、特異的認識構造に基づいて、特定の分子に所定の糖タンパク質をターゲティングするようにも働きうる。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすとも報告されてきている。特に、２つに分かれたＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を、テトラサイクリン制御性に発現するＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Ｕｍａｎａら， １９９９， Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６−１８０）。
［０１４０］抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。３ペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸いずれかである）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらの３ペプチド配列いずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ連結グリコシル化は、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用可能である。
［０１４１］抗体へのグリコシル化部位の付加は、１以上の上述の３ペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）を含有するように、アミノ酸配列を改変することによって、好適に達成される。改変はまた、元来の抗体の配列に１以上のセリンまたはスレオニン残基を付加するか、または元来の配列をこれらの残基で置換することによっても実行可能である（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）。
［０１４２］抗体のグリコシル化パターンはまた、根底にあるヌクレオチド配列を改変することなく、改変することも可能である。グリコシル化は、主に、抗体を発現させるのに用いる宿主細胞に依存する。潜在的な療法剤として、組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現に用いる細胞種が、天然細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変動は予測可能である（例えばＨｓｅら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：９０６２−９０７０を参照されたい）。
［０１４３］宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地配合、培養密度、酸化、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。特定の宿主生物で達成されるグリコシル化パターンを改変する、多様な方法が提唱されてきており、こうした方法には、オリゴ糖産生に関与する特定の酵素の導入または過剰発現が含まれる（米国特許第５，０４７，３３５号；第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。例えば、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）、実施例３に記載するようなＮ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、グリコシル化または特定の種類のグリコシル化を、糖タンパク質から酵素的に除去することも可能である。さらに、組換え宿主細胞を遺伝子操作して、特定の種類の多糖のプロセシングが不全になるようにしてもよい。これらの技術および類似の技術が当該技術分野に周知である。
［０１４４］修飾の他の方法には、当該技術分野に知られるカップリング技術を用いる工程が含まれ、これには、限定されるわけではないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が含まれる。修飾は、例えば、イムノアッセイのための標識の付着を使用することも可能である。当該技術分野において確立された方法を用いて、修飾９ＴＬポリペプチドを作成し、そして当該技術分野に知られる標準的アッセイを用いて、該ポリペプチドをスクリーニングすることも可能であり、こうしたアッセイのいくつかを、以下に、そして実施例に記載する。
［０１４５］本発明のいくつかの態様において、抗体は、修飾定常領域、例えば免疫学的に不活性であるかまたは部分的に不活性である、例えば補体仲介性溶解を誘発しないか、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しないか、またはミクログリアを活性化しないか；あるいは以下：補体仲介性溶解誘発、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）刺激、またはミクログリア活性化のいずれか１以上において、減少した活性（非修飾抗体に比較して）を有する、定常領域を含む。定常領域の異なる修飾を用いて、最適なレベルおよび／または最適な組み合わせのエフェクター機能を達成することも可能である。例えば、Ｍｏｒｇａｎら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４（１９９５）； Ｌｕｎｄら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３−９ １５７：４９６３−４９６９（１９９６）； Ｉｄｕｓｏｇｉｅら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８−４１８４（２０００）； Ｔａｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５−２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９−７６（１９９８）を参照されたい。いくつかの態様において、定常領域は、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４； ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されるように修飾される。他の態様において、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸番号付けは、野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠する）を含む、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。さらに他の態様において、定常領域は、Ｎ連結グリコシル化に関して非グリコシル化される。いくつかの態様において、定常領域は、定常領域中のグリコシル化アミノ酸残基、またはＮグリコシル化認識配列の一部である隣接残基が突然変異することによって、Ｎ連結グリコシル化に関して非グリコシル化される。例えば、Ｎグリコシル化部位、Ｎ２９７を、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させることも可能である。Ｔａｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５−２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９−７６（１９９８）を参照されたい。いくつかの態様において、定常領域は、Ｎ連結グリコシル化に関して非グリコシル化される。酵素的に（例えば、酵素ＰＮＧアーゼによって、炭水化物を除去するなど）、またはグリコシル化不全宿主細胞における発現によって、定常領域を非グリコシル化することも可能である。
［０１４６］他の抗体修飾には、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９９／５８５７２号、１９９９年１１月１８日公表に記載されるように修飾されている抗体が含まれる。これらの抗体は、ターゲット分子に向けられる結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有する、エフェクタードメインを含む。これらの抗体は、ターゲットの有意な補体依存性溶解、または細胞仲介性分解を誘発することなく、ターゲット分子に結合可能である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合可能である。これらは、典型的には、２以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメイン由来のキメラドメインに基づく。この方式で修飾される抗体は、長期の抗体療法における使用に特に適しており、慣用的な抗体療法に対する炎症性反応および他の不都合な反応を回避する。
［０１４７］本発明には、親和性成熟態様が含まれる。例えば、当該技術分野に知られる方法によって、親和性成熟抗体を産生することも可能である（Ｍａｒｋｓら， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３； Ｂａｒｂａｓら， １９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３； Ｓｃｈｉｅｒら， １９９５， Ｇｅｎｅ， １６９：１４７−１５５； Ｙｅｌｔｏｎら， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５５：１９９４−２００４； Ｊａｃｋｓｏｎら， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５４（７）：３３１０−９； Ｈａｗｋｉｎｓら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２６：８８９−８９６；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。
［０１４８］抗体の親和性を調整し、そしてＣＤＲを性質決定するため、以下の方法が使用可能である。抗体のＣＤＲを性質決定し、そして／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を改変する（例えば改善する）１つの方法は、「ライブラリー・スキャニング突然変異誘発」と称される。一般的に、ライブラリー・スキャニング突然変異誘発は、以下のように働く。ＣＤＲ中の１以上のアミノ酸位を、当該技術分野に認められる方法を用いて、２以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０など）のアミノ酸で置換する。これは、各々が２以上のメンバーの複雑性を持つ（すべての位で、２以上のアミノ酸で置換される場合）、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様において、分析するすべてのアミノ酸位について１つ）を生じる。一般的に、ライブラリーはまた、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリー由来の少数のクローン、例えば約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑性に応じる）を、ターゲットポリペプチド（または他の結合性ターゲット）に対する結合親和性に関してスクリーニングし、そして結合が増加したか、結合が同じか、結合が減少したか、または結合しない候補を同定する。結合親和性を決定するための方法は、当該技術分野に周知である。約２倍以上の結合親和性の相違を検出する、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いて、結合親和性を決定することも可能である。ＢＩＡｃｏｒｅは、出発抗体が、すでに比較的高い親和性で、例えば約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合、特に有用である。ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いたスクリーニングを、本明細書の実施例に記載する。
［０１４９］Ｋｉｎｅｘａ Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮイムノアッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを用いて、結合親和性を決定することも可能である。適切なバイオアッセイを用いて、結合親和性をスクリーニングすることもまた可能である。
［０１５０］いくつかの態様において、当該技術分野に認められる突然変異誘発法（このうちいくつかを本明細書に記載する）を用いて、ＣＤＲ中のすべてのアミノ酸位を、２０の天然アミノ酸すべてで置換する（いくつかの態様において、１つずつ）。これは、各々が２０のメンバーの複雑性を持つ（すべての位で、２０のアミノ酸すべてで置換される場合）、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様において、分析するすべてのアミノ酸位について１つ）を生じる。
［０１５１］いくつかの態様において、スクリーニングされるべきライブラリーは、同じＣＤＲ中でも、また２以上のＣＤＲ中でもよい、２以上の位での置換を含む。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２以上の位での置換を含むことも可能である。ライブラリーは、２以上のＣＤＲ中の２以上の位での置換を含むことも可能である。ライブラリーは、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲで見られる、３、４、５またはそれより多い位での置換を含むことも可能である。重複性が低いコドンを用いて、置換を調製することも可能である。例えば、Ｂａｌｉｎｔら， （１９９３）Ｇｅｎｅ １３７（ｌ）：１０９−１８）の表２を参照されたい。
［０１５２］ＣＤＲは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であることも可能である。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３の１以上であることも可能である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであることも可能である。
［０１５３］結合が改善された候補を配列決定し、それによって、親和性改善を生じるＣＤＲ置換突然変異体を同定することも可能である（「改善」置換とも称される）。結合する候補を配列決定し、それによって、結合を保持するＣＤＲ置換を同定することもまた可能である。
［０１５４］多数の周期のスクリーニングを行うことも可能である。例えば、結合が改善された候補（各々、１以上のＣＤＲの１以上の位でのアミノ酸置換を含む）はまた、各々、改善されたＣＤＲ位（すなわち置換突然変異体が結合改善を示したＣＤＲのアミノ酸位）で、少なくとも元来のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第二のライブラリーを設計するためにも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択を、以下にさらに論じる。
［０１５５］ライブラリー・スキャニング突然変異誘発はまた、結合が改善されたか、結合が同じか、結合が減少したか、または結合しないクローンの頻度がまた、抗体−抗原複合体の安定性に関して、各アミノ酸位の重要性に関する情報も提供する範囲で、ＣＤＲを性質決定するための手段も提供する。例えば、ＣＤＲの位を２０のアミノ酸すべてに変化させても、結合が保持されるならば、その位は、抗原結合に必要とされる可能性が低いと同定される。逆に、ＣＤＲの位が、置換のわずかな割合でしか結合を保持しないならば、その位は、ＣＤＲ機能に重要な位と同定される。したがって、ライブラリー・スキャニング突然変異誘発法は、多くの異なるアミノ酸（２０のアミノ酸すべてを含む）に変化させることが可能なＣＤＲ中の位、および変化させることが不能であるか、またはいくつかのアミノ酸にのみ変化させることが可能であるＣＤＲ中の位に関する情報を生成する。
［０１５６］第二のライブラリーにおいて、親和性が改善された候補を組み合わせることも可能であり、第二のライブラリーは、改善されたアミノ酸、その位の元来のアミノ酸を含み、そして望ましいライブラリーの複雑性に応じて、あるいは望ましいスクリーニング法または選択法を用いて許容される、その位でのさらなる置換をさらに含むことも可能である。さらに、望ましい場合、隣接するアミノ酸位を、少なくとも２以上のアミノ酸にランダム化することも可能である。隣接するアミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲにおいて、さらなるコンホメーション柔軟性を許容することも可能であり、これは次に、より多数の改善突然変異の導入を許容するかまたは容易にすることも可能である。ライブラリーはまた、第一の周期のスクリーニングにおいて、親和性改善を示さなかった位の置換も含むことも可能である。
［０１５７］ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む、選択に関して当該技術分野に知られる方法いずれかを用いた選択を含む、当該技術分野に知られる方法いずれかを用いて、結合親和性が改善され、そして／または改変されたライブラリーメンバーに関して、第二のライブラリーをスクリーニングするかまたは選択する。
［０１５８］本発明はまた、本発明の抗体（９ＴＬなど）またはポリペプチド由来の１以上の断片または領域を含む融合タンパク質も含む。１つの態様において、配列番号２（図１）に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０の隣接アミノ酸および／または配列番号１（図１）に示す可変重鎖領域の少なくとも１０のアミノ酸を含む、融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、配列番号２（図１）に示す可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０の隣接アミノ酸、および／または配列番号１（図１）に示す可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０の隣接アミノ酸を含む、融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、融合ポリペプチドは、図１の配列番号２および配列番号１に示すような、９ＴＬの軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは、９ＴＬの１以上のＣＤＲ（単数または複数）を含む。さらに他の態様において、融合ポリペプチドは、抗体９ＴＬのＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３を含む。本発明の目的のため、９ＴＬ融合タンパク質は、１以上の９ＴＬ抗体、および天然分子では付着していない別のアミノ酸配列、例えば異種配列または別の領域由来の相同配列を含有する。典型的な異種配列には、限定されるわけではないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。タグは当該技術分野に周知である。
［０１５９］９ＴＬ融合ポリペプチドは、当該技術分野に知られる方法によって、例えば合成的または組換え的に、生成することも可能である。典型的には、本発明の９ＴＬ融合タンパク質は、本明細書記載の組換え法を用いて、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、そして発現させることによって、作成されるが、例えば化学合成を含む、当該技術分野に知られる他の手段によって、調製することもまた可能である。
［０１６０］本発明はまた、固体支持体へのカップリングを促進する剤（ビオチンまたはアビジンなど）にコンジュゲート化された（例えば連結された）９ＴＬ抗体またはポリペプチドを含む組成物もまた提供する。簡単にするために、これらの方法が、本明細書記載のＡβ１−４０結合性態様のいずれにも適用されることを理解しつつ、一般的に９ＴＬまたは抗体への言及を行う。コンジュゲート化は、一般的に、本明細書に記載するようなこれらの構成要素の連結を指す。いかなる方法によって連結（一般的に、少なくとも投与のため、これらの構成要素を近接した関係に固定する）を達成することも可能である。例えば、剤および抗体各々が、互いと反応することが可能な置換基を所持する場合、剤および抗体間の直接の反応が可能である。例えば、一方の上のアミノ基またはスルフィドリル基などの求核基は、他方の上の、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、あるいは優れた脱離基（例えばハロゲン化物）を含有するアルキル基と、反応可能でありうる。
［０１６１］本発明の抗体またはポリペプチドを、蛍光分子、放射性分子または当該技術分野に知られる他の標識いずれかなどの標識剤（あるいは「標識」と称される）に連結することも可能である。標識は、当該技術分野に知られ、一般的に（直接または間接的のいずれかで）シグナルを提供する。
［０１６２］本発明はまた、抗体９ＴＬ、および本開示が明らかにするように、本明細書記載のあらゆる抗体および／またはポリペプチドを含む組成物（薬剤組成物を含む）およびキットも提供する。
損なわれたエフェクター機能を有する、抗Ａβペプチド抗体およびポリペプチド
［０１６３］本発明の方法は、ベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する、抗体またはポリペプチド（抗体またはポリペプチドを含む薬剤組成物を含む）を用いる。抗体およびポリペプチドは、以下の特性のいずれか（１以上）によってさらに特徴付けられる：（ａ）被験者において、アミロイド斑の形成を抑制する；（ｂ）被験者において、アミロイド斑を減少させる；（ｃ）アルツハイマー病の１以上の症状を治療するか、予防するか、改善する；（ｄ）認識機能を改善する。本明細書記載の抗体およびポリペプチドは、所望の安全性プロフィールを示すことも可能であり、例えば本発明の組成物は：脳血管系における出血（脳出血）；髄膜脳炎（磁気共鳴スキャンの変化を含む）；脳脊髄液中の上昇した白血球数；中枢神経系炎症のいずれか１以上を、有意なまたは許容し得ないレベルで引き起こさず、あるいはこれらの減少したレベルを有する。実施例４に示すように、アルツハイマー病の動物モデルにおいて、Ｆｃ領域中のＮ連結グリコシル化が除去された抗Ａβ抗体は、脳中のアミロイド斑を除去し、そして認識機能を改善するのに有効であり、微量出血は、損なわれていない抗体より、有意により少なかった。
［０１６４］本明細書において、「損なわれたエフェクター機能」を有する抗体またはポリペプチド（「免疫学的に不活性」または「部分的に免疫学的に不活性」と交換可能に用いられる）は、（非修飾または天然存在定常領域を有する抗体またはポリペプチドに比較して）いかなるエフェクター機能も持たないか、あるいはエフェクター機能の単数または複数の減少した活性を有する抗体またはポリペプチドを指し、例えば、以下：ａ）補体仲介性溶解誘発；ｂ）抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）刺激；およびｃ）ミクログリア活性化のいずれか１以上において、活性を持たないか、または減少した活性を有する。エフェクター機能活性は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、および１００％のいずれかが減少することも可能である。いくつかの態様において、抗体は、ターゲットの有意な補体依存性溶解、または細胞仲介性分解を誘発することなく、ベータ−アミロイド・ペプチドに結合する。例えば、定常領域上のＦｃ受容体結合部位を、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＩＩなどの特定のＦｃ受容体への結合親和性を除去するかまたは減少させるように修飾するかまたは突然変異させることも可能である。簡単にするために、この態様が、ポリペプチドにも適用されることを理解しつつ、抗体への言及を行う。定常領域（例えばＩｇＧ抗体のもの）のアミノ酸残基（単数または複数）を改変するか、または突然変異させることを示すため、ＥＵ番号付け体系（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ； 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ， メリーランド州ベセスダ， １９９１）を用いる。抗体および種の種類に渡って、類似の変化を行うことも可能であることを理解しつつ、特定の種類の抗体（例えばＩｇＧ１）または種（例えばヒト）に関して、この番号付けを用いることも可能である。
［０１６５］いくつかの態様において、Ａβペプチドに特異的に結合する抗体は、損なわれたエフェクター機能を有する重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、天然存在配列を有することも可能であるし、または変異体である。いくつかの態様において、天然存在重鎖定常領域のアミノ酸配列を、例えばアミノ酸置換、挿入および／または欠失によって突然変異させ、これによって、定常領域のエフェクター機能が損なわれる。いくつかの態様において、重鎖定常領域のＦｃ領域のＮグリコシル化もまた、変化させることも可能であり、例えば完全にまたは部分的に除去することも可能であり、これによって、定常領域のエフェクター機能が損なわれる。
［０１６６］いくつかの態様において、抗ＡβペプチドのＦｃ領域（例えばＩｇＧのＣＨ２ドメイン中）のＮグリコシル化を除去することによって、エフェクター機能が損なわれる。いくつかの態様において、Ｆｃ領域のＮグリコシル化は、定常領域中のグリコシル化アミノ酸残基、またはグリコシル化認識配列の一部である隣接残基が突然変異することによって、除去される。３ペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン（Ｎ−Ｘ−Ｓ）、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｎ−Ｘ−Ｔ）およびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｎ−Ｘ−Ｃ）（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸いずれかである）は、Ｎグリコシル化のため、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。３ペプチド配列中のアミノ酸いずれの突然変異も、非グリコシル化ＩｇＧを生じる。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＮグリコシル化部位、Ｎ２９７を、Ａ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させることも可能である。Ｔａｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５−２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９−７６（１９９８）を参照されたい。Ａｓｎ−２９７をＧｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓに置換したヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＦｃγＲＩに結合せず、そして補体を活性化せず、ＩｇＧ１に関しては、Ｃ１ｑ結合能が完全に失われ、そしてＩｇＧ３に関しては劇的に減少することが報告されてきている。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｎを、アミノ酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙのいずれか１つに突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｎを、保存的置換に突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｘをプロリンに突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｓを、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｔを、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチド配列中のアミノ酸Ｃを、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異させる。いくつかの態様において、３ペプチドに続くアミノ酸をＰに突然変異させる。いくつかの態様において、定常領域中のＮグリコシル化を、酵素的に（実施例３に記載するようなＮ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３、およびエンドグリコシダーゼＨなど）除去する。Ｎグリコシル化に関して欠損を有する細胞株において、抗体を産生することによって、Ｎグリコシル化の除去を達成することも可能である。Ｗｒｉｇｈｔら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０（７）：３３９３−４０２（１９９８）。
［０１６７］いくつかの態様において、定常領域のＮグリコシル化部位に付着したオリゴ糖と相互作用するアミノ酸残基を突然変異させて、ＦｃγＲＩへの結合親和性を減少させる。例えば、ヒトＩｇＧ３のＦ２４１、Ｖ２６４、Ｄ２６５を突然変異させることも可能である。Ｌｕｎｄら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３−４９６９（１９９６）を参照されたい。
［０１６８］いくつかの態様において、ＰＣＴ ＷＯ ９９／５８５７２およびＡｒｍｏｕｒら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５−５９３（２００３）； Ｒｅｄｄｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：１９２５−１９３３（２０００）に記載されるようなヒトＩｇＧの２３３−２３６、２９７、および／または３２７−３３１などの領域を修飾することによって、エフェクター機能が損なわれる。ＰＣＴ ＷＯ ９９／５８５７２およびＡｒｍｏｕｒらに記載される抗体は、ターゲット分子に向けられる結合性ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、ターゲットの有意な補体依存性溶解、または細胞仲介性分解を誘発することなく、ターゲット分子に結合可能である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩに対して減少した親和性を有する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合可能である。これらは、典型的には、２以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメイン由来のキメラドメインに基づく。この方式で修飾される抗体は、長期の抗体療法における使用に特に適しており、慣用的な抗体療法に対する炎症性反応および他の不都合な反応を回避する。いくつかの態様において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異のいずれかを含むヒト重鎖ＩｇＧ１である：１）Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＧ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１；２）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５、Ｇ２３６は欠失；３）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５；４）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１、Ｇ２３６は欠失；５）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１；および６）Ｎ２９７からＡ２９７またはＮを除く他のアミノ酸いずれか。いくつかの態様において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異を含む、ヒト重鎖ＩｇＧ２である：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１。いくつかの態様において、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異のいずれかを含む、ヒト重鎖ＩｇＧ４である：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５、Ｇ２３６は欠失；Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５；およびＳ２２８Ｌ２３５からＰ２２８Ｅ２３５。
［０１６９］抗体の定常領域を修飾して、補体活性化を損なうこともまた可能である。例えば、Ｃ１結合モチーフ（例えばＣ１ｑ結合モチーフ）において、定常領域中のアミノ酸残基を突然変異させることによって、補体のＣ１構成要素の結合後のＩｇＧ抗体の補体活性化を減少させることも可能である。ヒトＩｇＧ１のＤ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１の各々をＡｌａに突然変異させると、抗体がＣ１ｑに結合し、そして補体を活性化する能力が有意に減少すると報告されてきている。ネズミＩｇＧ２ｂに関しては、Ｃ１ｑ結合モチーフは、残基Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２で構成される。Ｉｄｕｓｏｇｉｅら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８−４１８４（２０００）； Ｄｕｎｃａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−７４０（１９８８）。
［０１７０］ネズミＩｇＧ２ｂに関して同定されたＣ１ｑ結合モチーフ、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２は、他の抗体アイソタイプに共通すると考えられる。Ｄｕｎｃａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−７４０（１９８８）。３つの明記された残基のいずれか１つを、側鎖上に不適切な官能性を有する残基で置換することによって、ＩｇＧ２ｂのＣ１ｑ結合活性を無効にすることも可能である。Ｃ１ｑ結合を無効にするには、Ａｌａでイオン性残基を置換することのみが必要とされるわけではない。Ｃ１ｑ結合を無効にするため、３つの残基のいずれか１つの代わりに、ＧＩｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌなどの他のアルキル置換非イオン性残基、あるいはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏなどの芳香族非極性残基を用いることもまた可能である。さらに、Ｃ１ｑ結合活性を無効にするため、残基３２０および３２２の代わりに、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔなどの極性非イオン性残基を用いることもまた可能であるが、３１８の代わりにこれらを用いることは不能である。
［０１７１］本発明はまた、抗体が修飾ヒンジ領域を有する、損なわれたエフェクター機能を有する抗体も提供する。ヒンジ領域を修飾することによって、Ｆｃ受容体へのヒトＩｇＧの結合親和性を調節することも可能である。Ｃａｎｆｉｅｌｄら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１４８３−１４９１（１９９１）； Ｈｅｚａｒｅｈら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１２１６１−１２１６８（２００１）； Ｒｅｄｐａｔｈら， Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９：７２０−７２７（１９９８）。特定のアミノ酸残基を突然変異させるかまたは欠失させることも可能である。修飾ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なる抗体種またはサブクラスの抗体に由来する、完全ヒンジ領域を含むことも可能である。例えば、クラスＩｇＧ抗体の定常ドメイン（ＣＨ１）を、クラスＩｇＧ４抗体のヒンジ領域に付着させることも可能である。あるいは、新規ヒンジ領域は、天然ヒンジの一部、またはリピート中の各単位が天然ヒンジ領域に由来するリピート単位を含むことも可能である。いくつかの態様において、天然ヒンジ領域は、１以上のシステイン残基を、アラニンなどの中性残基に変換することによって、または適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって、改変される。米国特許第５，６７７，４２５号。当該技術分野に認められるタンパク質化学、そして好ましくは遺伝子操作技術を用いて、そして本明細書に記載するように、こうした改変を行う。
［０１７２］本明細書に記載する方法のため、Ａβペプチドに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する重鎖定常領域に融合されたポリペプチドを用いることもまた可能である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体に由来する配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Ａβペプチドに結合する単一ドメイン抗体に由来する。当該技術分野に知られる方法を用いて、単一ドメイン抗体を生成することも可能である。Ｏｍｉｄｆａｒら， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ． ２５：２９６−３０５（２００４）； Ｈｅｒｒｉｎｇら， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４−４８９（２００３）。
［０１７３］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ｆ（ａｂ’）２断片ではない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ｆａｂ断片ではない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、一本鎖抗体ｓｃＦｖではない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）２断片である。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＰＥＧ化Ｆａｂ断片である。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＰＥＧ化一本鎖抗体ｓｃＦｖである。
［０１７４］当該技術分野に知られる、損なわれたエフェクター機能を有する抗体を作成する他の方法もまた、使用可能である。
［０１７５］１以上のアッセイにおいて、修飾定常領域を持つ抗体およびポリペプチドを試験して、出発抗体に比較した、生物学的活性におけるエフェクター機能減少のレベルを評価することも可能である。例えば、改変されたＦｃ領域または改変されたヒンジ領域を持つ抗体またはポリペプチドが、補体またはＦｃ受容体（例えばミクログリア上のＦｃ受容体）に結合する能力を、本明細書に開示するアッセイ、ならびに当該技術分野に認められるアッセイいずれかを用いて評価することも可能である。ＰＣＴ ＷＯ ９９／５８５７２； Ａｒｍｏｕｒら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５−５９３（２００３）； Ｒｅｄｄｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：１９２５−１９３３（２０００）； Ｓｏｎｇら， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：５１７７−５１８４（２００２）。
［０１７６］いくつかの態様において、ベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は、霊長類化抗体である。例えば、Ｙｏｃｕｍら， Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２５：１２５７−６２（１９９８）； Ｂｕｇｅｌｓｋｉら， Ｈｕｍａｎ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｙ １９：２３０−２４３（２０００）を参照されたい。いくつかの態様において、抗体は、ヒト免疫系を活性化しないような突然変異によって、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）されている。例えば、Ｎａｎｕｓら， Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １７０：Ｓ８４−Ｓ８９（２００３）を参照されたい。
［０１７７］本明細書において、Ａβペプチドには、アミロイド前駆体タンパク質の酵素的切断産物の断片がいずれも含まれる。例えば、Ａβペプチドには、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ１−４３の断片いずれか；およびＡβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ１−４３のＮ末端またはＣ末端の多様な数のアミノ酸が一部切除されているペプチドが含まれる。本明細書に用いられるアミノ酸番号付けは、Ａβ１−４３（配列番号１７）に関する番号付けに基づく。
［０１７８］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβペプチドの残基１−１６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβペプチドの残基１６−２８内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０ペプチドの残基２８−４０内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４２ペプチドの残基２８−４２内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４３ペプチドの残基２８−４３内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、全長アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合することなく、Ａβペプチドに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの可溶性型に結合することなく、凝集型に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの凝集型に結合することなく、可溶性型に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβの凝集型および可溶性型の両方に特異的に結合する。Ａβの多様な凝集型に結合する抗体が当該技術分野に知られ、例えば、アミロイド・ベータ由来の拡散性リガンド（ＡＤＤＬ）に結合する抗体；アミロイド原線維および／または沈着物に結合する抗体がある。ＷＯ ０３／１０４４３７；米国公報第２００３／０１４７８８７号；米国公報第２００４／０２１９１４６号。
［０１７９］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、３Ｄ６免疫グロブリン軽鎖（米国公報第２００３／０１６５４９６号、または第２００４／００８７７７７号の配列番号２）由来の１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、および／または３Ｄ６免疫グロブリン重鎖（米国公報第２００３／０１６５４９６号、または第２００４／００８７７７７号の配列番号４）由来の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、米国公報第２００３／０１６５４９６号における配列番号８に示すような可変重鎖領域、および米国公報第２００３／０１６５４９６号における配列番号５に示すような可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、米国公報第２００３／０１６５４９６号における配列番号１２に示すような可変重鎖領域、および米国公報第２００３／０１６５４９６号における配列番号１１に示すような可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、１０Ｄ５免疫グロブリン軽鎖（米国公報第２００３／０１６５４９６号、または第２００４／００８７７７７号の配列番号１４）由来の１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、および／または１０Ｄ５免疫グロブリン重鎖（米国公報第２００３／０１６５４９６号、または第２００４／００８７７７７号の配列番号１６）由来の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
［０１８０］いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０の残基３３−４０内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３５−４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３６−４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸３９および／または４０を含む、Ａβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、Ａβ１−４０に特異的に結合するが、Ａβ１−４２および／またはＡβ１−４３には特異的に結合しない。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、本明細書記載の抗体９ＴＬまたは９ＴＬ由来の抗体もしくはポリペプチドである。いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、抗体９ＴＬおよび／または９ＴＬ由来の抗体もしくはポリペプチドの、Ａβ１−４０への結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、抗体は、ＰＣＴ ＷＯ ２００４／０３２８６８に記載される抗体２２８６ではない。
［０１８１］本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性は多様であることも可能であり、そして以下に記載する典型的な態様のように、特定の値または範囲である必要はない（が、こうした値または範囲であることも可能である）。Ａβ１−４０、Ａβ１−４０、またはＡβ１−４０への本発明の抗体およびポリペプチドの結合親和性は、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭおよび約０．１８〜約０．７２ｎＭであることも可能である。いくつかの態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。１つのの態様において、結合親和性は、約２ｐＭ〜２２ｐＭの間である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭ未満である。いくつかの態様において、結合親和性は、約１０ｎＭである。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約５ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約１ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の態様において、結合親和性は、約０．１ｎＭ未満または約０．０７ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかである。さらに他の態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。
［０１８２］抗体およびポリペプチドを作成する方法が当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載される。
［０１８３］競合アッセイを用いて、同一のまたは立体的に重複するエピトープを認識することによって、２つの抗体が同じエピトープに結合するのか、あるいは１つの抗体が、抗原への別の抗体の結合を競合的に阻害するのかを決定することも可能である。これらのアッセイが、当該技術分野に知られる。典型的には、抗原をマルチウェルプレート上に固定し、そして未標識抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。こうした競合アッセイのための一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。
［０１８４］アミロイド沈着物を除去する際の有効性、および認識を改善するなどの他の有益な効果に関して、Ａβに特異的に結合する抗体およびポリペプチドをスクリーニングすることも可能である。例えば抗体またはポリペプチドを、アルツハイマーの病変を有する動物に投与することも可能である。アルツハイマー病の多様な動物モデルが当該技術分野に知られる。投与後、当該技術分野に知られ、そして実施例２に詳細に記載する方法を用いて、コンパクトなアミロイド斑および拡散性のアミロイド斑のレベル、認識に関する行動分析、ならびにミクログリア活性化および微量出血を試験することも可能である。ＰＣＴ ＷＯ ２００４／０３２８６８； Ｗｉｌｃｏｃｋら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：３７４５−３７５１（２００３）； Ｗｉｌｃｏｃｋら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １：２４（２００４）。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
［０１８５］本発明はまた、本発明の抗体およびポリペプチド（図１に示す軽鎖および重鎖の可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む）をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
［０１８６］したがって、本発明は、以下のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（または薬剤組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体；（ｂ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の断片または領域；（ｃ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖；（ｄ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖；（ｅ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域（単数または複数）；（ｆ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の１以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）；（ｇ）抗体９ＴＬの重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３；（ｈ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３；（ｉ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｊ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の重鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｋ）抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体の、軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；および（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のいずれか１つを含む抗体。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。
［０１８７］別の側面において、本発明は、損なわれたエフェクター機能を有する抗体およびポリペプチドなどの、本明細書記載の抗体（抗体断片を含む）およびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。当該技術分野に知られる方法によって、ポリヌクレオチドを作成することも可能である。
［０１８８］別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（薬剤組成物など）を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載するような９ＴＬ抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の態様において、組成物は、本明細書記載の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の態様において、組成物は、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与をさらに本明細書に記載する。
［０１８９］別の側面において、本発明は、本明細書記載のポリヌクレオチドいずれかを作成する方法を提供する。
［０１９０］こうした配列いずれかに相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であることも可能であるし、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であることも可能である。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、そして一対一方式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在することも可能であるが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または固体支持体に連結されていることも可能であるが、連結されている必要はない。
［０１９１］ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち抗体またはその一部をコードする内因性配列）を含むことも可能であるし、またはこうした配列の変異体を含むことも可能である。ポリヌクレオチド変異体は、天然免疫反応性分子と比較して、コードされるポリペプチドの免疫反応性が減少しないように、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般的に、本明細書に記載するように評価可能である。変異体は、天然抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
［０１９２］２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、以下に記載するように最大に対応するように並列させた際、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同一であるならば、「同一である」と言う。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウに渡って配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、そして比較することによって、行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、少なくとも約２０の隣接する位、通常３０〜約７５の隣接する位、４０〜約５０の隣接する位のセグメントであって、２つの配列を最適に並列させた後、このセグメント中の配列を、隣接する位の同数の参照配列に比較することが可能である、前記セグメントを指す。
［０１９３］デフォルト・パラメータを用い、バイオインフォマティクス・ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、比較のための配列の最適並列を行うことも可能である。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの並列スキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ −Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ． Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（監修） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ．５， Ｓｕｐｐｌ．３， ｐｐ．３４５−３５８； Ｈｅｉｎ Ｊ．， １９９０， Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６−６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， カリフォルニア州サンディエゴ； Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ．， １９８９， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３； Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ．， １９７１， Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ． １１：１０５； Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ．， Ｎｅｓ， Ｍ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４：４０６−４２５； Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ．， １９７３， Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンフランシスコ； Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
［０１９４］好ましくは、「配列同一性パーセント」は、少なくとも２０位の比較ウィンドウに渡って、２つの最適に並列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適並列のため、参照配列（付加または欠失を含まない）に比較した際、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことも可能である。両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位の数を決定して、マッチした位の数を得て、参照配列中の位の総数（すなわちウィンドウサイズ）によってマッチした位の数を割り、そして結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントを得ることによって、パーセントを計算する。
［０１９５］変異体はまた、またはあるいは、天然遺伝子またはその一部または相補体に実質的に相同であることも可能である。こうしたポリヌクレオチド変異体は、天然抗体をコードする天然存在ＤＮＡ配列（または相補配列）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能である。
［０１９６］適切な「中程度にストリンジェントな条件」には、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で前洗浄し；５０℃〜６５℃、５ｘＳＳＣ、一晩ハイブリダイズし；その後、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ、０．５ｘＳＳＣおよび０．２ｘＳＳＣ各々で、６５℃２０分間で、２回洗浄することが含まれる。
［０１９７］本明細書において、「非常にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は：（１）洗浄に、低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用し；（２）ハイブリダイゼーション中に、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．５とともに、変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、４２℃で使用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを、４２℃で使用し、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、４２℃で、そして５０％ホルムアミドで、５５℃で洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる、５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を使用する。当業者は、プローブ長などの要因に適応するのに必要であるように、どのように温度、イオン強度を調整するかを認識するであろう。
［０１９８］遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載するようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが、一般の当業者によって認識されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、天然の遺伝子いずれかのヌクレオチド配列に、最小限の相同性を所持する。にもかかわらず、コドン使用の相違のため、異なるポリヌクレオチドが、本発明に特異的に意図される。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは、本発明の範囲内にある。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１以上の突然変異の結果として改変されている、内因性遺伝子である。生じたｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有することも可能であるが、そうである必要はない。標準的技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、アレルを同定することも可能である。
［０１９９］化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて、本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該技術分野に周知であり、そして本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供する配列および商業的ＤＮＡ合成装置を用いて、所望のＤＮＡ配列を産生することも可能である。
［０２００］本明細書にさらに論じるように、組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するため、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入して、そして続いて、複製および増幅のため、適切な宿主細胞内にベクターを導入することも可能である。当該技術分野に知られるいかなる手段によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することも可能である。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、細胞を形質転換する。ひとたび導入されたら、外因性ポリヌクレオチドを、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持することも可能であるし、また宿主細胞ゲノムに組み込むことも可能である。当該技術分野内で周知の方法によって、こうして増幅したポリヌクレオチドを宿主細胞から単離することも可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。
［０２０１］あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該技術分野に周知であり、そして米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， Ｍｕｌｌｉｓら監修， Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ， ボストン（１９９４）に記載される。
［０２０２］適切なベクター中で単離ＤＮＡを用いて、そして適切な宿主細胞に挿入することによって、ＲＮＡを得ることも可能である。細胞が複製し、そしてＤＮＡがＲＮＡに転写された際、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に示されるような、当業者に周知の方法を用いて、ＲＮＡを単離することも可能である。
［０２０３］標準的技術にしたがって、適切なクローニングベクターを構築することも可能であるし、または当該技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することも可能である。選択されるクローニングベクターは、使用しようと意図する宿主細胞にしたがって、多様であることも可能である一方、有用なクローニングベクターは、一般的に、自己複製能を有するであろうし、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一のターゲットを所持することも可能であり、そして／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用可能なマーカーの遺伝子を所持することも可能である。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えばｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらのクローニングベクターおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的業者から入手可能である。
［０２０４］発現ベクターは、一般的に、本発明にしたがったポリヌクレオチドを含有する複製可能ポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターが、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの内在性（ｉｎｔｅｇｒａｌ）部分としてのいずれかで、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターには、限定されるわけではないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０４４６２号に開示される発現ベクター（単数または複数）が含まれる。ベクター構成要素は、一般的に、限定されるわけではないが、１以上の以下を含むことも可能である：シグナル配列；複製起点；１以上のマーカー遺伝子；適切な転写調節要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち翻訳）のため、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどの１以上の翻訳調節要素もまた、通常、必要である。
［０２０５］エレクトロポレーションや、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えばベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合）を含む、いくつかの適切な手段のいずれによって、目的のポリヌクレオチドを含有するベクターを宿主細胞に導入することも可能である。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、しばしば、宿主細胞の特徴次第であろう。
［０２０６］本発明はまた、本明細書記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現することが可能な、いかなる宿主細胞を用いることも可能である。哺乳動物宿主細胞の限定されない例には、限定されるわけではないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０４４６２号もまた参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ））および酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）；またはＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。目的の抗体またはタンパク質に対応する内因性のものが宿主細胞において存在する場合、好ましくは、宿主細胞は、これらのものより、約５倍高く、より好ましくは１０倍高く、さらにより好ましくは２０倍高いレベルで、ｃＤＮＡを発現する。Ａβ１−４０への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって達成される。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することも可能である。
損なわれたエフェクター機能を有する９ＴＬ由来抗体および抗Ａβ抗体の診断的使用
［０２０７］Ａβ１−４０のＣ末端に結合する抗体９ＴＬを用いて、Ａβ１−４０の存在または非存在を同定するかまたは検出することも可能である。簡単にするために、これらの方法が、本明細書記載のＡβ１−４０結合性態様（ポリペプチドなど）のいずれにも適用されることを理解しつつ、一般的に９ＴＬまたは抗体への言及を行う。検出は、一般的に、Ａβ１−４０に結合する本明細書記載の抗体と生物学的試料を接触させ、そしてＡβ１−４０、およびＡβ１−４０に特異的に結合する抗体（例えば９ＴＬ）間の複合体を形成させることを伴う。こうした複合体の形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであることも可能である。用語「検出」は、本明細書において、対照を参照した、または参照しない、定性的および／または定量的検出（レベル測定）を含む。
［０２０８］限定されるわけではないが、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等による、ポリペプチドに結合する抗体を用いたイムノアッセイ；およびコードされるポリペプチドに関する機能アッセイ、例えば結合活性または酵素アッセイを含む、多様な既知の方法のいずれを検出のために用いてもよい。いくつかの態様において、抗体を検出可能に標識する。他の態様が当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載される。
［０２０９］本発明の抗体およびポリペプチドを、改変されたかまたは異常なＡβまたはβＡＰＰ発現に関連する疾患、状態、または障害、例えばアルツハイマー病およびダウン症候群の検出、診断および監視に用いることも可能である。したがって、いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドと、改変されたかまたは異常なＡβ発現を有すると推測される個体の検体（試料）を接触させ、そしてＡβ１−４０のレベルが、対照検体または比較検体のものと異なるかどうかを決定することを含む。他の態様において、本発明は、個体の検体（試料）を接触させ、そしてＡβ１−４０発現のレベルを決定することを含む方法を提供する。
［０２１０］診断適用のため、限定されるわけではないが、放射性同位体、蛍光標識、および多様な酵素−基質標識を含む、検出可能部分で、抗体を標識することも可能である。抗体に標識をコンジュゲート化する方法が当該技術分野に知られる。本発明の他の態様において、本発明の抗体は、標識されている必要はなく、そしてその存在を、本発明の抗体に結合する標識抗体を用いて検出することも可能である。
［０２１１］競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの、既知のアッセイ法いずれにおいて、本発明の抗体を使用することも可能である。Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）。
［０２１２］抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイ、例えばｉｎ ｖｉｖｏ画像化にもまた使用可能である。一般的に、免疫シンチグラフィーを用いて、目的の細胞または組織を位置決定可能であるように、抗体を放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈ）で標識する。
［０２１３］当該技術分野に周知の技術にしたがって、病理学における染色試薬として、抗体を使用することもまた可能である。
［０２１４］ＡＤのリスクがあるかまたはＡＤと診断された被験者の診断のために、脳アミロイド負荷を測定し、そして治療いずれかの進行および疾患段階を評価するため、損なわれたエフェクター機能を有する抗Ａβ抗体を用いてもよい。モノクローナル抗Ａβ抗体を末梢投与すると、血漿Ａβの迅速な増加が生じ、そしてこの増加の度合いは、海馬および皮質におけるアミロイド負荷と非常に相関することが報告されてきている。ＤｅＭａｔｔｏｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：２２６４−２２６７（２００２）。いくつかの態様において、損なわれたエフェクター機能を有する抗Ａβ抗体を被験者に投与し、そして血漿中のＡβのレベルを測定し、それによって、血漿Ａβが増加していると、被験者における脳アミロイド負荷の存在および／またはレベルの指標となる。これらの方法を用いて、治療の有効性および疾患段階を監視して、そして将来の投薬および頻度を決定することも可能である。損なわれたエフェクター機能を有する抗体は、より優れた安全性プロフィールを有し、そしてこれらの診断使用のため、利点を提供することも可能である。
療法目的のため、抗Ａβ抗体を用いる方法
［０２１５］本明細書記載の抗体（ポリペプチドを含む）、ポリヌクレオチド、および薬剤組成物を、被験者の脳におけるタンパク質の異常な沈着によって特徴付けられる疾患の発展を治療し、予防し、そして阻害するための方法において、使用することも可能である。該方法は、タンパク質またはタンパク質沈着物に特異的に結合する抗体、あるいは該抗体をコードするポリヌクレオチドの有効量を、被験者に投与することを含み、ここで、抗体は、損なわれたエフェクター機能を有する。例えば、プリオン・タンパク質または凝集型のプリオン・タンパク質に特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する抗体を、プリオン病の予防的治療および／または療法的治療のため、被験者に投与することも可能であり；シヌクレイン（例えばアルファ−シヌクレイン）または凝集型のシヌクレインに特異的に結合し、そして損なわれたエフェクター機能を有する抗体を、パーキンソン病の予防的治療および／または療法的治療のため、被験者に投与することも可能である。
［０２１６］本明細書記載の抗体（ポリペプチドを含む）、ポリヌクレオチド、および薬剤組成物を、アルツハイマー病、ならびに改変されたＡβもしくはβＡＰＰ発現と、またはＡβペプチドの集積もしくは沈着物と関連する他の疾患（集合的に、「Ａβ関連疾患」と称される）、例えばダウン症候群、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、血管におけるＡβペプチドの沈着物によって引き起こされる血管障害の発展（脳卒中およびＨＣＨＷＡ−Ｄなど）を治療し、予防し、そして阻害するための方法において用いることもまた可能である。こうした方法は、抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド、あるいは薬剤組成物を被験者に投与することを含む。予防的適用において、アルツハイマー病（または他のＡβ関連疾患）に感受性であるか、または別の方式でそのリスクがある患者に、疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状、その合併症、および疾患の発展中に提示される中間の病的表現型を含めて、疾患のリスクを除去するかまたは減少させ、重症度を低下させ、あるいは疾患の開始を遅延させるのに十分な量で、薬剤組成物または薬剤を投与する。療法的適用において、疾患の合併症、および疾患の発展中の中間の病的表現型を含む、疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動的）を治癒させるか、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で、組成物または薬剤を、こうした疾患に罹患したと推測されるか、または既に罹患している患者に投与する。
［０２１７］本発明はまた、被験者において、アルツハイマー病（または他のＡβ関連疾患）と関連する症状の発展を遅延させる方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。アルツハイマー病に関連する症状には、限定されるわけではないが、記憶、問題の解決、語学、計算、視空間知覚、判断、および行動の異常が含まれる。
［０２１８］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑の形成および／またはＡβ集積を阻害するかまたは抑制する方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効用量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳血管系にある。他の態様において、Ａβ集積は、被験者の循環系にある。
［０２１９］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑を減少させ、そして／またはＡβ集積を減少させるかもしくは遅延させる方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効用量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳血管系にある。他の態様において、Ａβ集積は、被験者の循環系にある。
［０２２０］本発明はまた、被験者におけるアミロイド斑および／またはＡβ集積を除去するかまたは一掃する方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効用量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳にある。いくつかの態様において、アミロイド斑は、被験者の脳血管系にある。他の態様において、Ａβ集積は、被験者の循環系にある。
［０２２１］本発明はまた、被験者において、組織（脳など）中のＡβペプチドを減少させ、組織（脳など）中のＡβペプチドの集積を阻害し、そして／または減少させ、そして組織（脳など）中のＡβペプチドの毒性効果を阻害し、そして／または減少させる方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効用量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。Ａβポリペプチドは、可溶性型、オリゴマー型、または沈着型であることも可能である。Ａβのオリゴマー型は、２−５０ Ａβポリペプチドで構成されることも可能であり、これは、全長１−４０および１−４２ペプチドおよび／またはこれらのペプチドの一部切除型いずれかの混合物であることも可能である。
［０２２２］本発明はまた、アルツハイマー病などの、被験者におけるＡβのアミロイド沈着物と関連する疾患に関連して、認識を改善するかまたは認識衰退を逆転させる方法であって、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の有効投薬量を、該被験者に投与することを含む、前記方法も提供する。
［０２２３］本発明はまた、Ａβのアミロイド沈着物に関連する疾患を治療するかまたは予防するための方法であって、ベータ−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のベータ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する抗体を含む、有効投薬量の薬剤組成物を該被験者に投与することを含む方法を提供し、ここで該抗体は天然存在Ｆｃ領域からの変異を含むＦｃ領域を含み、該変異は損なわれたエフェクター機能を生じ、それによって該抗体の投与は、該変異を含まない抗体の投与より少ない脳微量出血を引き起こす。
［０２２４］脳中のタンパク質の異常な沈着は、いくつかの障害と関連し、このうちいくつかは、アミロイド形成タンパク質が同時に沈着するため、アミロイド疾患またはアミロイドーシスとして特徴付けることも可能である。
［０２２５］アミロイドーシスは、アミロイド沈着物を形成するタンパク質原線維の細胞外沈着によって特徴付けられる障害である。これらの状態の大部分は、末梢におけるアミロイド沈着と関連する一方、中枢神経系原線維沈着が主であるアミロイドーシスもいくつかある。ＷＯ ００／７２８７６は、いくつかの中枢および末梢アミロイドーシスを記載する。
［０２２６］アルツハイマー病は、中枢神経系の最もよく知られ、そしておそらく最も一般的なアミロイド疾患である。この状態は、別の箇所に要約されるように、Ａ−ベータ含有斑および神経原線維の（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｏｒｙ）もつれによって特徴付けられる。多様な型の老人性痴呆もまた、ダウン症候群におけるように、類似の、しかしより進行性でないＡ−ベータ斑形成と関連付けられている。
［０２２７］エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａ Ｃ末端断片）の異常な沈着が、アルツハイマー病患者の脳で観察されてきており、この場合、エンドスタチンは、アミロイド−ベータ（１−４０）と共局在する。Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ， Ｍ．Ｈ．ら， （２００３）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２（２４）：１０６２１−１０６２６。
［０２２８］アミロイド生成タンパク質であるシスタチンＣの変異体、Ｌ６８ＱシスタチンＣは、アミロイド血管症の遺伝型において、成人早期の脳出血および死につながる、大規模な脳アミロイドーシスと関連付けられている（遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症）。シスタチンＣの正常変異体（ｗｔ１シスタチンＣ）は、アルツハイマー病におけるアミロイド斑の構成要素としてのＡ−ベータ・ペプチドと関連して見出されうる。
［０２２９］外因性剤が、シスタチンＣ（Ｌ６８Ｑまたはｗｔ１シスタチンＣいずれか）の二量体の形成を抑制可能であるかどうかを決定する研究において、Ｎｉｌｓｓｏｎおよび同僚は、２つの変異体タンパク質の単量体型と一緒に、ｗｔ１シスタチンＣに対して向けられる抗体をインキュベーションし、そしてタンパク質二量体化が減少することを観察した。Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｍ．ら（２００４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（３）：２４２３６−４５。
［０２３０］ダウン症候群は、部分的に、すべてダウン遺伝子座内に位置するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および他のタンパク質（スーパーオキシド・ジスムターゼＩ、およびＳ１００−ベータ）を含む遺伝子の発現が恒常的に増加することによる、Ａ−ベータ・ペプチド斑沈着、アポトーシス性細胞死および異常な樹状分岐によって特徴付けられる。また、ダウン遺伝子座（染色体２１のセグメント内の遺伝子）に連鎖していない遺伝子、ＧＡＰ−４３、一酸化窒素シンターゼ３、神経糸状（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｈｒｅａｄ）タンパク質、アポトーシス促進性遺伝子、例えばｐ５３、ＢａｘおよびＬＩ−１ベータ変換酵素の異常な発現もまたある。これらの非ダウン遺伝子座遺伝子の発現は、ジストロフィー性神経炎およびアポトーシス細胞死の蔓延と相関する。ｄｅ ｌａ Ｍｏｎｔｅ， Ｓ．Ｍ． １９９９．， Ｊ． Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ． Ｓｕｐｐｌ． ５７：１−１９。
［０２３１］Ａ−ベータ・ペプチドから形成されるアミロイド斑の脳沈着はまた、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ患者に一般的な病的特徴でもある。Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ａ．ら（２００５）ＡＩＤＳ １９（４）：４０７−１１。同様に、Ａ−ベータ・ペプチド含有斑の沈着はまた、ヒトにおける外傷性脳傷害の少し後にも観察されてきており、この場合、Ａ−ベータは、腫脹した軸索において、ＡＰＰおよび神経線維タンパク質と共局在する。Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｈ．ら（２００３）：９８（５）：１０７２−７。末期後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者の脳が、ユビキチン染色点状沈着（Ｕｂドット）レベルの増加を有することもまた示された。Ｇｅｌｍａｎ， Ｂ．Ｂ．およびＳｃｈｕｅｎｋｅ， Ｋ．（２００４）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ １０（２）：９８−１０８。
［０２３２］アミロイドーマは、ＣＮＳアミロイドーシスの比較的稀な型であり、通常は脈絡叢において、アミロイド腫瘍の型を提示し、白質内に続発性に拡張する。脳実質の原発性アミロイドーマは、アミロイドＡＬラムダ軽鎖で構成される病変を含む。Ｔａｂａｔｂａｉ， Ｇ．ら（２００５）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ． ６２（３）：４７７−８０。
［０２３３］家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）のトランスサイレチンＴｙｒ７７の遺伝子（単数または複数）変異を所持する患者（Ｔｙｒ７７ ＦＡＰ）において、脳ＭＲＩで、多病巣白質病変が観察されてきている。Ｌｏｓｓｏｓ， Ａ．ら Ｅｕｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２００５． ５３（２）：５５−９。
［０２３４］家族性軟髄膜アミロイドーシスは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）変異体Ａｓｐ１８Ｇｌｙ（Ｄ１８Ｇ）の遺伝子異常と関連付けられる。Ｊｉｎ， Ｋ．ら Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２００４）７５（１０）：１４６３−６６。ＴＴＲのＤ１８Ｇ変異体型はまた、ハンガリー人患者において、ＣＮＳアミロイドーシスを導くこともまた示されてきている。１つの報告によれば、タンパク質の四量体型の小分子安定化剤は、アミロイド生成を防止することも可能である。Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ， Ｐ．ら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（２２）：６６５６−６３。
［０２３５］アルファ−シヌクレインをコードする遺伝子における突然変異が、パーキンソン病の少なくともいくつかの家族性型に関与することが見出されてきており、この場合、アルファ−シヌクレインは、異常に誘導体化され、そして神経およびグリア封入体を形成することが示されてきている。アルファ・シヌクレインはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで原線維も形成し、パーキンソン病を脳アミロイドーシスと分類することにつながる。Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ， Ｊ．Ｑ．およびＬｅｅ， Ｖ．Ｍ．（２００３）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９９１：１０７−１１０。
［０２３６］オリゴデンドログリアにおけるアルファ−シヌクレイン封入体は、多発性多系統萎縮症（ＭＳＡ）を特徴付ける。Ｋａｈｌｅ， Ｐ．Ｍ．ら ２００２． ＥＭＢＯ ｒｅｐ． ３（６）：５８３−８。
［０２３７］ＰｒＰＳｃは、ニューロンおよび他の細胞の細胞膜に付着する銅結合性糖タンパク質である、細胞性プリオン・タンパク質（ＰｒＰＣ）の異常型である。ＰｒＰアミロイド集積は、ＰｒＰ脳アミロイド血管症（ＰｒＰ−ＣＡＡ）と一般的に関連し、この場合、集積は、神経原線維のもつれおよび血管アミロイド中に存在し、そしてＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病では、神経原線維のもつれの海綿状変性と関連して、実質アミロイドーシスが存在することも可能である。Ｇｈｅｔｔｉ， Ｂ．ら Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ．（２００３）２３（１）：６５−８５。ＰｒＰＳｃ沈着はまた、ヒト海綿状脳症（変異型クロイツフェルト−ヤコブ病）にも見られる。抗ＰｒＰ一本鎖Ｆｖミニ抗体によるプリオン増殖のパラクリン阻害が報告されてきている。Ｈｅｐｐｎｅｒら， Ｊ． Ｖｉｏｌ． ７９：８３３０−８；２００５。
［０２３８］以下の表は、異常な脳タンパク質沈着と関連する疾患の例および沈着物のタンパク質構成要素の要約を提供する。当該技術分野に知られる方法および本明細書に記載する方法、または当該技術分野に知られる抗体を用いて、これらの構成要素に対する抗体を生成することも可能である。
Figure 2008511291
［０２３９］単一部位または多数の部位への、単一の時点または多数の時点での、単一の直接注射によって、本明細書記載の方法（予防または療法を含む）を達成することも可能である。投与はまた、多数の部位に対してほぼ同時であることも可能である。投与頻度を決定し、そして療法経過に渡って調整することも可能であり、そして投与頻度は、望ましい結果を達成することに基づく。いくつかの場合、本発明の抗体（ポリペプチドを含む）、ポリヌクレオチド、および薬剤組成物の持続性連続放出配合物が適切でありうる。持続性放出を達成するための多様な配合物およびデバイスが当該技術分野に知られる。
［０２４０］患者、被験者、または個体には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジ動物などの哺乳動物が含まれる。被験者は、好ましくはヒトであり、そして疾患に罹患していてもしていなくても、また現在症状を示していても示していなくてもよい。アルツハイマー病の場合、十分に長く生存したならば、実質的に誰もが、アルツハイマー病を患うリスクがある。したがって、対象患者のリスクの評価のいずれも必要とせずに、一般的な集団に、本方法を予防的に投与することも可能である。本方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的リスクを有する個体に有用である。こうした個体には、この疾患を経験した親戚を有する個体、および遺伝的マーカーまたは生化学的マーカーの分析によって、リスクがあると決定された個体が含まれる。アルツハイマー病に向かうリスクの遺伝子マーカーには、ＡＰＰ遺伝子中の突然変異、特に、それぞれＨａｒｄｙ突然変異およびスウェーデン突然変異と称される、７１７位の突然変異、ならびに６７０位および６７１位の突然変異が含まれる（Ｈａｒｄｙ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０：１５４−９を参照されたい）。他のリスクマーカーは、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２、ならびにＡｐｏＥ４における突然変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症である。現在アルツハイマー病を患う個体は、特徴的な痴呆ならびに上述のリスク要因の存在から認識可能である。さらに、ＡＤを有する個体を同定するため、いくつかの診断試験が利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ４２レベルの測定が含まれる。上昇したタウおよび減少したＡβ４２レベルが、ＡＤの存在を示す。ＡＤＲＤＡ（アルツハイマー病および関連障害関連）基準によって、アルツハイマー病を患う個体を診断することもまた可能である。無症状患者において、どの年齢で治療を開始することも可能である（例えば１０歳、２０歳、３０歳）。しかし、通常、患者が４０歳、５０歳、６０歳または７０歳に到達するまで、治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、ある期間に渡って、多数の投薬量を必要とする。長期に渡って、当該技術分野に知られる多様な方法によって、治療を監視することも可能である。潜在的なダウン症候群患者の場合、療法剤を母親に投与することによって出生前に、または生後間もなく、治療を開始することも可能である。
［０２４１］上述の方法で使用可能である薬剤組成物には、本明細書記載の抗体、ポリペプチド、および／またはポリヌクレオチドのいずれも含まれる。いくつかの態様において、抗体は、抗体９ＴＬまたは表３に示すその変異体である。いくつかの態様において、抗体は、Ａβペプチドに特異的に結合する抗体であり、そして損なわれたエフェクター機能を有する定常領域を含む。
投与および投薬量
［０２４２］抗体は、好ましくは、キャリアー；好ましくは薬学的に許容しうるキャリアー中で、哺乳動物に投与される。適切なキャリアーおよびその配合が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ペンシルバニア州イーストン， １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００に記載される。典型的には、配合物中に、適切な量の薬学的に許容しうる塩を用いて、配合物を等張性にする。キャリアーの例には、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、そしてより好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアーには、持続性放出調製物、例えば抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形物品の形、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子である。当業者には、例えば投与経路および投与される抗体の濃度に応じて、特定のキャリアーがより好ましい可能性もあることが明らかであろう。
［０２４３］注射（例えば全身性、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、門脈内、脳内、脳室内、および鼻内）によって、または有効な型で血流に送達されることを確実にする注入などの他の方法によって、抗体を哺乳動物に投与することも可能である。単離灌流（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）技術、例えば単離組織灌流によって、抗体を投与して、限局性療法効果を発揮することもまた可能である。静脈内注射が好ましい。
［０２４４］抗体投与に関する有効投薬量および投与スケジュールを経験的に決定することも可能であり、そしてこうした決定は当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなければならない抗体の投薬量は、例えば、抗体を投与される哺乳動物、投与経路、用いる抗体の特定の種類および哺乳動物に投与される他の薬剤に応じて多様であろうことを理解するであろう。抗体の適切な用量を選択する際の指針が、抗体の療法的使用に関する文献、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｆｅｒｒｏｎｅら監修， Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ニュージャージー州パークリッジ， １９８５， ２２章およびｐｐ．３０３−３５７； Ｓｍｉｔｈら， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｈａｂｅｒら監修， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９７７， ｐｐ．３６５−３８９に見られる。単独で用いる抗体の典型的な一日投薬量は、上述の要因に応じて、１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重まで、またはそれより多いことも可能である。一般的に、以下の用量のいずれかを用いることも可能である：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重の用量またはそれより多くを、投与する。一時的脳アミロイド血症（ＣＡＡ）などの潜在的な副作用を回避するため、治療開始時に、より低い用量またはより低い頻度で、抗体を投与することも可能である。
［０２４５］いくつかの態様において、１より多い抗体が存在することも可能である。こうした組成物は、本発明の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体（ポリペプチドを含む）を含有することも可能である。
［０２４６］１以上の他の療法剤の有効量と組み合わせて、哺乳動物に抗体を投与することもまた可能である。抗体を、１以上の他の療法剤と連続してまたは同時に投与することも可能である。抗体および療法剤の量は、例えば、用いる薬剤の種類、治療する病的状態、ならびに投与のスケジューリングおよび経路に応じるが、一般的に、各々を個々に用いる場合より少ないであろう。
［０２４７］哺乳動物に抗体を投与した後、当業者に周知の多様な方法で、哺乳動物の生理学的状態を監視することも可能である。
［０２４８］投与および投薬量の上記原理を、本明細書記載のポリペプチドに適応させることも可能である。
［０２４９］本明細書記載の抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望の細胞における抗体またはポリペプチドの送達および発現に用いることもまた可能である。発現ベクターを用いて、抗体の発現を導くことも可能であることが明らかである。発現ベクターを、全身性、腹腔内、静脈内、筋内、皮下、クモ膜下内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻内、皮膚投与するか、または吸入によって投与することも可能である。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、微粒子銃、またはカテーテル化投与、および局所投与を含む、限局性投与または全身性投与が含まれる。当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏで、外因性タンパク質の発現を得るための、発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；第６，４１３，９４２号；および第６，３７６，４７１号を参照されたい。
［０２５０］本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む療法組成物のターゲティング送達を用いることもまた可能である。受容体仲介性ＤＮＡ送達技術が、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２； Ｃｈｉｏｕら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ． Ｗｏｌｆｆ監修）（１９９４）； Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１； Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２； Ｚｅｎｋｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５； Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載される。遺伝子治療プロトコルにおいて、限局性投与のため、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で、ポリヌクレオチドを含有する療法組成物を投与する。遺伝子治療プロトコル中、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡを用いることも可能である。遺伝子送達ビヒクルを用いて、本発明の療法ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達することも可能である。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であることも可能である（一般的に、Ｊｏｌｌｙ， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１； Ｋｉｍｕｒａ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５； Ｃｏｎｎｅｌｌｙ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照されたい）。内因性哺乳動物または異種プロモーターを用いて、こうしたコード配列の発現を誘導することも可能である。コード配列の発現は、恒常性であっても、または制御されていても、いずれでもよい。
［０２５１］所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のための、ウイルスに基づくベクターが当該技術分野に周知である。ウイルスに基づく典型的なビヒクルには、限定されるわけではないが、組換えレトロウイルス（例えばＰＣＴ公報第ＷＯ ９０／０７９３６号；第ＷＯ ９４／０３６２２号；第ＷＯ ９３／２５６９８号；第ＷＯ ９３／２５２３４号；第ＷＯ ９３／１１２３０号；第ＷＯ ９３／１０２１８号；第ＷＯ ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号；第４，７７７，１２７号； ＧＢ特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ ０ ３４５ ２４２を参照されたい）、アルファウイルスに基づくベクター（例えばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７； ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３； ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３； ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０； ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９； ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１２６４９号；第ＷＯ ９３／０３７６９号；第ＷＯ ９３／１９１９１号；第ＷＯ ９４／２８９３８号；第ＷＯ ９５／１１９８４号および第ＷＯ ９５／００６５５号）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されるような、死んだアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた使用可能である。
［０２５２］非ウイルス送達ビヒクルおよび方法を使用することもまた可能であり、これには限定されるわけではないが、死んだアデノウイルスのみに連結されたまたは連結されないポリカチオン性凝集ＤＮＡ（例えばＣｕｒｉｅｌ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （１９９２）３：１４７を参照されたい）；リガンド連結ＤＮＡ（例えばＷｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照されたい）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば米国特許第５，８１４，４８２号； ＰＣＴ公報第ＷＯ ９５／０７９９４号；第ＷＯ ９６／１７０７２号；第ＷＯ ９５／３０７６３号；および第ＷＯ ９７／４２３３８号を参照されたい）および核酸電荷中和または細胞膜との融合が含まれる。裸のＤＮＡを使用することもまた可能である。典型的な裸のＤＮＡ導入法が、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。遺伝子送達ビヒクルとして作用可能なリポソームが、米国特許第５，４２２，１２０号； ＰＣＴ公報第ＷＯ ９５／１３７９６号；第ＷＯ ９４／２３６９７号；第ＷＯ ９１／１４４４５号；およびＥＰ ０ ５２４ ９６８に記載される。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９４）１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
キット
［０２５３］本発明はまた、アルツハイマー病または他のＡβ関連疾患（ダウン症候群、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、血管におけるＡβペプチドの沈着物によって引き起こされる血管障害（脳卒中およびＨＣＨＷＡ−Ｄなど））などの、本明細書記載の病的状態を治療するか、あるいはＡβまたはβＡＰＰを検出するかまたは精製するのに有用な物質を含有する、製品およびキットも提供する。製品は、ラベルがついた容器を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、および試験管が含まれる。ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から、容器を形成することも可能である。容器は、病的状態を治療するか、あるいはＡβまたはβＡＰＰを検出するかまたは精製するのに有効な活性剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性剤は抗体であり、そして好ましくは、ＡβまたはβＡＰＰに特異的なモノクローナル抗体を含む。いくつかの態様において、活性剤は、抗体９ＴＬ、あるいは抗体９ＴＬ由来の抗体またはポリペプチドいずれかを含む。いくつかの態様において、活性剤は、損なわれたエフェクター機能を有する、抗Ａβ抗体またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、抗Ａβ抗体またはポリペプチドは、損なわれたエフェクター機能を有する重鎖定常領域を含む。容器上のラベルは、アルツハイマー病などの病的状態を治療するか、あるいはＡβまたはβＡＰＰを検出するかまたは精製するのに用いられ、そしてまた、上述のものなどの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のいずれかに関する使用法を示すことも可能である。
［０２５４］本発明はまた、本明細書記載の抗体（９ＴＬなど）、ポリペプチド、ポリヌクレオチドのいずれかを含むキットも提供する。いくつかの態様において、本発明のキットは、上述の容器を含む。他の態様において、本発明のキットは、上述の容器、および緩衝剤を含む第二の容器を含む。商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質がさらに含まれることも可能であり、これらには、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書記載の方法いずれか（アルツハイマー病を治療するための方法、および脳中のＡβペプチドの集積を阻害するかまたは減少させる方法など）を実行するための使用説明を記した添付文書が含まれる。ＡβまたはβＡＰＰを検出するかまたは精製するために用いようとするキットにおいて、抗体は典型的には検出可能マーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識されている。
［０２５５］いくつかの態様において、本発明は、薬剤としての使用および／または薬剤製造のための使用いずれかの関連で、本明細書記載の方法のいずれかで使用するための組成物（本明細書記載）を提供する。
［０２５６］以下の実施例は本発明を例示するために提供するが、限定するためではない。
（実施例１）
抗体９ＴＬおよびその変異体の結合親和性決定
Ａ．一般的な方法
［０２５７］本実施例では、以下の一般的な方法を用いた。
クローン性質決定に用いた発現ベクター
［０２５８］抗体のＦａｂ断片の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ｐｇ ２．１０、ベクターｐＣｏｍｂ３Ｘに記載されるものと類似の、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの調節下にあったが、以下のさらなるドメインの付加および発現の修飾を含んだ：ヒト・カッパ軽鎖定常ドメインおよびＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンのＣＨ１定常ドメイン、Ｉｇガンマ−２鎖Ｃ領域、タンパク質寄託番号Ｐ０１８５９；免疫グロブリン・カッパ軽鎖（ヒト（ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ））、タンパク質寄託番号ＣＡＡ０９１８１。
小規模Ｆａｂ調製
［０２５９］９６ウェルプレート中のＦａｂの小規模発現を以下のように行った。Ｆａｂライブラリーで形質転換した大腸菌から出発して、コロニーを摘み取って、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコース）および作業プレート（２ｍｌ／ウェル、１．５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有する９６ウェル／プレート）の両方に接種した。両方のプレートを３０℃で８〜１２時間増殖させた。マスタープレートを４℃で保存し、そして作業プレート由来の細胞を５０００ｒｐｍでペレットにし、そして１ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ ＩＰＴＧに再懸濁して、Ｆａｂの発現を誘導した。３０℃で５時間発現させた後、遠心分離によって細胞を採取し、次いで、５００μｌの緩衝剤ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｐ２０）に再懸濁した。凍結（−８０℃）後、３７℃の溶解の１周期によって、ＨＢＳ−Ｐ再懸濁細胞の溶解を達成した。細胞溶解物を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、Ｆａｂを含有する上清から細胞破片を分離した。次いで、上清をＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴装置に注入して、各Ｆａｂの親和性情報を得た。ＤＮＡ配列決定するため、そして大規模Ｆａｂ産生および以下に記載するような詳細な性質決定のため、マスタープレートからＦａｂを発現するクローンをレスキューした。
大規模Ｆａｂ調製
［０２６０］詳細な動力学パラメータを得るため、Ｆａｂを発現させ、そして大規模培養から精製した。２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有する三角フラスコに、選択したＦａｂ発現大腸菌クローン由来の一晩培養物５ｍｌを接種した。１．０のＯＤ５５０ｎｍが達成されるまで、クローンを３０℃でインキュベーションし、そして次いで、培地を２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ ＩＰＴＧに交換することによって、誘導した。３０℃で５時間発現させた後、遠心分離によって細胞をペレットにし、次いで、１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁した。２周期の凍結／融解（それぞれ−８０℃および３７℃）によって、細胞の溶解を得た。ＰＢＳ、ｐＨ８で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー・セファロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）カラム上に細胞溶解物の上清を装填し、次いで５カラム体積のＰＢＳ、ｐＨ８で洗浄した。ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭイミダゾールを含む異なる分画中に個々のＦａｂが溶出された。Ｆａｂを含有する分画をプールし、そしてＰＢＳ中で透析し、次いで親和性性質決定前に、ＥＬＩＳＡによって定量化した。
完全抗体調製
［０２６１］完全抗体を発現するため、哺乳動物発現ベクター中に重鎖および軽鎖の可変領域をクローニングし、そして一過性発現のため、リポフェクタミンを用いて、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションした。標準法を用い、プロテインＡを用いて、抗体を精製した。
［０２６２］ベクターｐＤｂ．９ＴＬ．ｈＦｃ２ａは、９ＴＬ抗体の重鎖を含む発現ベクターであり、そして重鎖の一過性発現または安定発現に適している。ベクターｐＤｂ．９ＴＬ．ｈＦｃ２ａは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列を有する：ネズミ・サイトメガロウイルス・プロモーター領域（ヌクレオチド１−６１２）；合成イントロン（ヌクレオチド６１９−１５０７）；ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド７０７−１２６７）；ヒト成長ホルモン・シグナルペプチド（ヌクレオチド１５２５−１６０２）；９ＴＬの重鎖可変領域（ヌクレオチド１６０３−１９５１）；以下の突然変異を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するアミノ酸番号付け； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照されたい）； ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２９６０−３２０３）； ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド３２０４−３４４９）；ファージｆｌ領域（ヌクレオチド３５３７−４９９２）およびベータ・ラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４４２９−５２８６）。ベクターｐＤｂ．９ＴＬ．ｈＦｃ２ａは、２００４年７月２０日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１２４を割り当てられた。
［０２６３］ベクターｐＥｂ．９ＴＬ．ｈＫは、９ＴＬ抗体の軽鎖を含む発現ベクターであり、そして軽鎖の一過性発現に適している。ベクターｐＥｂ．９ＴＬ．ｈＫは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列を有する：ネズミ・サイトメガロウイルス・プロモーター領域（ヌクレオチド１−６１２）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９−１１４２）；ヒト成長ホルモン・シグナルペプチド（ヌクレオチド１１７３−１１５０）；抗体９ＴＬ軽鎖可変領域（ヌクレオチド１２５１−１５９３）；ヒト・カッパ軽鎖定常領域（ヌクレオチド１５９４−１９１４）； ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１９３２−２１７５）； ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２１７６−２４２１）；ファージｆｌ領域（ヌクレオチド２５０９−２９６４）およびベータ・ラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド３４０１−４２５８）。ベクターｐＥｂ．９ＴＬ．ｈＫは２００４年７月２０日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１２５を割り当てられた。
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
［０２６４］ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ， ＩＮＣ． ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、９ＴＬモノクローナル抗体の親和性を決定した。親和性を決定する１つの方法は、ＣＭ５チップ上に９ＴＬを固定して、そして抗体に対するＡβ１−４０ペプチドの結合動力学を測定することであった。供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でＣＭ５チップを活性化した。抗体９ＴＬまたはその変異体を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０または５．０で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る、多様な流動時間を用いて、ある範囲の抗体密度を達成した：１０００〜２０００または２０００〜３０００応答単位（ＲＵ）。チップをエタノールアミンでブロッキングした。再生研究によって、２体積のＰＩＥＲＣＥ溶出緩衝液および１体積の４Ｍ ＮａＣｌを含有する溶液が、２００回の注入に渡って、チップ上の９ＴＬの活性を維持しつつ、結合したＡβ１−４０ペプチドを有効に除去することが示された。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０）を流動緩衝液として用いた。精製Ａβ１−４０合成ペプチド試料の連続希釈（０．１〜１０ｘ概算ＫＤ）を、１００μｌ／分で１分間注入し、そして１０分間の解離時間を許容した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって、動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６． ９９−１１０）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして、平衡解離定数（ＫＤ）値を計算した。
［０２６５］あるいは、ＳＡチップ上にＡβ１−４０ペプチドを固定し、そして固定されたＡβ１−４０ペプチドに対する９ＴＬ Ｆａｂおよび９ＴＬ変異体のＦａｂの結合動力学を測定することによって、親和性を決定した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ、ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって、９ＴＬ Ｆａｂ断片およびその変異体Ｆａｂ断片の親和性を決定した。供給者の指示にしたがって、ＳＡチップ（ストレプトアビジン）を用いた。ビオチン化Ａβペプチド１−４０を、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ２０）で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で、チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る、多様な流動時間を用いて、２つの範囲の抗原密度を達成した：詳細な動力学研究のための１０〜２００応答単位（ＲＵ）、ならびに濃度研究およびスクリーニングのための５００〜６００ＲＵ。再生研究によって、１００ｍＭリン酸（また、２体積の５０ｍＭ ＮａＯＨおよび１体積の７０％エタノールを含有する溶液が続いてもよい）が、２００回の注入に渡って、チップ上のＡβペプチドの活性を維持しつつ、結合したＦａｂを有効に除去することが示された。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流動緩衝液として用いた。精製Ｆａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０ｘ概算ＫＤ）を、１００μｌ／分で２分間注入し、そして１０分間の解離時間を許容した。既知の濃度の標準Ｆａｂ（アミノ酸分析によって決定）を用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、Ｆａｂタンパク質の濃度を決定した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって、動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６． ９９−１１０）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして、平衡解離定数（ＫＤ）値を計算した。
Ｂ．Ａβ １−４０ への抗体９ＴＬおよびその変異体の結合親和性
［０２６６］抗体９ＴＬの重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を図１に示す。上述のＢｉａｃｏｒｅの両方の方法を用いて決定した、Ａβ１−４０への９ＴＬ抗体の結合親和性を、以下の表２に示す。
表２．抗体９ＴＬおよびＦａｂ断片の結合親和性
Figure 2008511291
［０２６７］９ＴＬの変異体のアミノ酸配列を以下の表３に示す。表３に示す変異体すべてのアミノ酸置換は、９ＴＬの配列に比較して記載される。９ＴＬ変異体のＦａｂ断片の結合親和性もまた、表３に示す。ＳＡチップ上に固定されたＡβ１−４０を用いた、上述のＢＩＡｃｏｒｅ分析によって、ＫＤおよび他の動力学パラメータを決定した。
表３．抗体９ＴＬ変異体に関するアミノ酸配列および動力学データ
Figure 2008511291
Figure 2008511291
Figure 2008511291
１＝すべてのＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲを含む拡張ＣＤＲである。アミノ酸残基は連続して番号付けされる。
２＝下線を引いたｋｏｎは実験的に決定された。他のものは、９ＴＬと同じであると概算された。
３＝ ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＫＤ値を計算した。
（実施例２）
抗体９ＴＬが結合するＡβ１−４０ペプチド上のエピトープの性質決定
［０２６８］抗体９ＴＬによって認識されるＡβポリペプチド上のエピトープを決定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００）結合分析を用いた。ビオチンにカップリングしたＡβ１−４０ポリペプチド（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、コロラド州）を、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ（ＳＡチップ）上に固定した。Ａβペプチドの異なる可溶性断片（１０μＭ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）の非存在下または存在下の、固定されたＡβ１−４０へのＡβ抗体Ｆａｂ断片（５０ｎＭ）の結合。Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、およびＡβ１−４３のアミノ酸配列を以下の表４に示す。Ａβ１−４０への抗体９ＴＬ Ｆａｂ断片の結合を置換したＡβペプチドは、それぞれ、Ａβ２８−４０、Ａβ１−４０、Ａβ３３−４０、およびＡβ１７−４０であった（図２）。したがって、抗体９ＴＬはＡβ１−４０のＣ末端ペプチド（３３−４０）に結合する。図２に示すように、Ａβ１−２８、Ａβ２８−４２、Ａβ２２−３５、Ａβ１−１６、Ａβ１−４３、およびＡβ１−３８ペプチドは、抗体９ＴＬ Ｆａｂ断片の結合を阻害せず、抗体９ＴＬがＡβ１−４０ペプチドのＣ末端に結合することが示唆された。
［０２６９］さらに、Ａβ２８−４２およびＡβ１−４３ペプチドは、Ａβ１−４０の１６−２８に結合する対照抗体（抗体２２８９、この抗体は、米国出願第２００４／０１４６５１２号およびＷＯ０４／０３２８６８に記載される）へのＡβ１−４０結合を容易に阻害可能であったが、Ａβ１−４０への抗体９ＴＬの結合を阻害しなかった。これらの結果は、抗体９ＴＬがＡβ１−４０に優先的に結合するが、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３に結合しないことを示す。
表４．ベータ・アミロイド・ペプチドのアミノ酸配列
Figure 2008511291
（実施例３）
モノクローナル抗体２Ｈ６および脱グリコシル化２Ｈ６の生成
Ａ．モノクローナル抗体２Ｈ６の生成および性質決定
［０２７０］Ｇｅｅｒｌｉｇｓ ＨＪら， １９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２４：９５−１０２； Ｋｅｎｎｅｙ ＪＳら， １９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１：１５７−１６６；およびＷｉｃｈｅｒ Ｋら， １９８９， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８９：１２８−１３５に記載されるように、連続約１６週間間隔で、アジュバント中、ＫＬＨにコンジュゲート化したペプチド（Ａβ１−４０のアミノ酸２８−４０）２５〜１００μｇを用いて、マウスを免疫した（足蹠あたり５０μｌ、マウスあたり総量１００μｌ）。マウスをまず、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）中の５０μｇのペプチドで免疫した。２１日後、マウスを次に、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）中の２５μｇのペプチドで免疫した。第二の免疫の２３日後、ＩＦＡ中の２５μｇのペプチドで、第三の免疫を行った。１０日後、ＥＬＩＳＡを用いて、抗体力価を試験した。第三の免疫の３４日後、ＩＦＡ中の２５μｇのペプチドで、第四の免疫を行った。第四の免疫の３２日後、１００μｇの可溶性ペプチドで、最後の追加免疫を行った。
［０２７１］免疫したマウスから、脾臓細胞を得て、そしてポリエチレングリコール１５００とともに、１０：１の比でＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させた。２０％ウマ血清および２−オキサロ酢酸／ピルビン酸／インスリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ中、９６ウェルプレート内に、ハイブリッドを蒔き、そしてヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン選択を開始した。第８日、２０％ウマ血清を含有するＤＭＥＭ １００μｌを、すべてのウェルに添加した。抗体捕捉イムノアッセイを用いることによって、ハイブリッドの上清をスクリーニングした。クラス特異的二次抗体を用いて、抗体クラスの決定を行った。
［０２７２］性質決定のため、一団のモノクローナル抗体産生細胞株を選択した。選択した１つの細胞株は、２Ｈ６と称する抗体を産生する。この抗体は、ＩｇＧ２ｂ重鎖を有すると決定された。
［０２７３］Ａβ１−４０への抗体２Ｈ６の親和性を決定した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ハイブリドーマ培養上清からモノクローナル抗体２Ｈ６を精製した。上清をｐＨ８に平衡化した。次いで、ＰＢＳでｐＨ８に平衡化したプロテインＡカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１７−５１９９−０２）に、上清を装填した。５カラム体積のＰＢＳ、ｐＨ８でカラムを洗浄した。５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ３で抗体を溶出した。溶出した抗体を１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８で中和した。精製抗体をＰＢＳで透析した。ネズミｍＡｂ標準曲線を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、抗体濃度を決定した。
［０２７４］Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｆａｂキット（ｐｉｅｒｃｅ ＃４４８８５）を用いて、２Ｈ６完全抗体のパパイン・タンパク質分解によって、２Ｈ６ Ｆａｂを調製し、そして製造者の指示にしたがって、プロテインＡクロマトグラフィーを通じた流動によって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および１ＯＤ＝０．６ｍｇ／ｍｌを用いてＡ２８０によって、濃度を決定した。
［０２７５］ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ， ＩＮＣ， ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、２Ｈ６モノクローナル抗体の親和性を決定した。親和性を決定する１つの方法は、ＣＭ５チップ上に２Ｈ６抗体を固定し、そして抗体へのＡβ１−４０ペプチドの結合動力学を測定することであった。供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でＣＭ５チップを活性化した。２Ｈ６モノクローナル抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０または５．０で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る、多様な流動時間を用いて、ある範囲の抗体密度を達成した：１０００〜２０００または２０００〜３０００応答単位（ＲＵ）。チップをエタノールアミンでブロッキングした。再生研究によって、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌの混合物（２：１）が、２００回の注入に渡って、チップ上の２Ｈ６抗体の活性を維持しつつ、結合したＡβ１−４０ペプチドを有効に除去することが示された。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０）を流動緩衝液として用いた。精製Ａβ１−４０合成ペプチド試料の連続希釈（０．１〜１０ｘ概算ＫＤ）を、１００μｌ／分で１分間注入し、そして１０分間の解離時間を許容した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって、動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６． ９９−１１０）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして、平衡解離定数（ＫＤ）値を計算した。
［０２７６］あるいは、ＳＡチップ上にＡβ１−４０ペプチドを固定し、そして固定されたＡβ１−４０への２Ｈ６ Ｆａｂの結合動力学を測定することによって、親和性を決定した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ、ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって、２Ｈ６ Ｆａｂ断片の親和性を決定した。供給者の指示にしたがって、ＳＡチップ（ストレプトアビジン）を用いた。ビオチン化Ａβペプチド１−４０（配列番号１５）を、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ２０）で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で、チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る、多様な流動時間を用いて、２つの範囲の抗原密度を達成した：詳細な動力学研究のための１０〜２００応答単位（ＲＵ）、および濃度研究のための５００〜６００ＲＵ。再生研究によって、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液および４Ｍ ＮａＣｌの混合物（２：１）が、２００回の注入に渡って、チップ上のＡβペプチドの活性を維持しつつ、結合したＦａｂを有効に除去することが示された。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流動緩衝液として用いた。精製Ｆａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０ｘ概算ＫＤ）を、１００μｌ／分で２分間注入し、そして１０分間の解離時間を許容した。既知の濃度の標準Ｆａｂ（アミノ酸分析によって決定）を用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、Ｆａｂタンパク質の濃度を決定した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって、動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６． ９９−１１０）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして、平衡解離定数（ＫＤ）値を計算した。上述のように両方の方法を用いて決定した２Ｈ６抗体の親和性を、以下の表５に示す。
［０２７７］Ａβ１−４０のアミノ酸２８−４０のペプチドに結合する、ネズミ抗体２２８６に対する親和性を上述のように試験した。抗体２２８６は、米国出願第１０／６８３，８１５号およびＰＣＴ／ＵＳ０３／３２０８０に記載される。
表５．抗体２Ｈ６および２２８６の結合親和性
Figure 2008511291
［０２７８］抗体２Ｈ６によって認識されるＡβポリペプチド上のエピトープを決定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００）結合分析を用いた。ビオチンにカップリングしたＡβ１−４０ポリペプチド（配列番号１５）（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、コロラド州）を、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ（ＳＡチップ）上に固定した。Ａβペプチドの異なる可溶性断片（１６μＭ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）の非存在下または存在下の、固定されたＡβ１−４０へのＡβ抗体（１００ｎＭ）の結合。Ａβ１−４０への抗体２Ｈ６の結合を置換したＡβペプチドは、それぞれ、Ａβ１７−４０、Ａβ３３−４０、およびＡβ１−４０であった（図３）。したがって、抗体２Ｈ６は、Ａβ１−４０のＣ末端ペプチド（３３−４０）に結合する。しかし、Ａβ１−４０のこのＣ末端ペプチド（３３−４０）は、試験した濃度では、Ａβ１−４０への抗体２２８６の結合を置換しなかった。図３に示すように、Ａβ１−３８ペプチドは、Ａβ１−４０への抗体２Ｈ６または抗体２２８６の結合を阻害せず、抗体２２８６同様、抗体２Ｈ６が結合するエピトープには、Ａβ１−４０ペプチドのアミノ酸３９および／または４０が含まれることが示唆された（図３）。
［０２７９］さらに、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３ペプチドは、Ａβ１−４０の１６−２８に結合する対照抗体（抗体２２８９、この抗体は、米国出願第１０／６８３，８１５号およびＰＣＴ／ＵＳ０３／３２０８０に記載される）へのＡβ１−４０の結合を容易に阻害可能であったが、Ａβ１−４０への抗体２Ｈ６の結合を阻害しなかった（図３）。これらの結果は、抗体２Ｈ６がＡβ１−４０に優先的に結合するが、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３に結合しないことを示す。
［０２８０］抗体２Ｈ６が結合するβ−アミロイド・ペプチドの別個のアミノ酸残基の関与をさらに評価するため、最後の６アミノ酸（Ａβ１−４０アミノ酸残基、３５−４０）の各々がアラニンによって個々に置換されている（アラニン・スキャニング突然変異誘発）、異なるＡβ１−４０変異体を、部位特異的突然変異誘発によって生成した。これらのＡβ１−４０変異体（表６に示す配列）を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として、大腸菌で発現させ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、その後、グルタチオン−アガロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、米国ミズーリ州セントルイス）上でアフィニティー精製した。対照として、野生型（ＷＴ）Ａβ１−４０、ならびにＡβ１−４１、Ａβ１−４２、およびＡβ１−３９もまた、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。次いで、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、Ａβ１−３９、ならびに６つの異なる変異体（表６に示すＭ３５Ａ（ｌ−４０）、Ｖ３６Ａ（ｌ−４０）、Ｇ３７Ａ（ｌ−４０）、Ｇ３８Ａ（ｌ−４０）、Ｖ３９Ａ（ｌ−４０）、Ｖ４０Ａ（ｌ−４０））をＥＬＩＳＡアッセイプレート上に固定し（ウェルあたり１００μｌの０．０２５μｇ／μｌのＧＳＴ−ペプチド）、そして０．３ｎＭから下降する連続希釈で、ｍＡｂ ２２８６、２２８９、および２Ｈ６のいずれかとインキュベーションした（０．３ｎＭ ｍＡｂを用いたデータを図４に示す）。１０回連続して洗浄した後、アッセイプレートを、ウェルあたり１００μｌの０．０３μｇ／ｍｌのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ベクター＃ＢＡ−９２００、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）とインキュベーションし、その後、ウェルあたり１００μｌの０．０２５μｇ／ｍｌのＨＲＰ−コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、＃ＲＰＮ４４０１Ｖ、米国ニュージャージー州）とインキュベーションした。プレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
表６．ベータ・アミロイド・ペプチドおよび変異体のアミノ酸配列
Figure 2008511291
［０２８１］図４に示すように、Ａβのアミノ酸１６−２８に対して向けられるＭａｂ ２２８９は、すべての変異体を同じ強度で認識し、そしてプレート上のタンパク質濃度およびタンパク質完全性の内部陽性対照として働いた。抗体２Ｈ６は、図４に示すように、Ａβ１−４１、Ａβ１−３９、またはＡβ１−４２を認識しなかった。Ａβ１−４０変異体Ｖ４０Ａ、Ｖ３９Ａ、Ｇ３８Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｖ３６Ａ、およびＭ３５Ａは、抗体２Ｈ６への結合の減少を示し、抗体２Ｈ６エピトープが、Ａβ１−４０のＣ末端の少なくとも６アミノ酸に渡ることが立証された。ＶおよびＧからＡへの突然変異は、非常に保存的であり、そしてタンパク質における重要なコンホメーション変化を生じる可能性が低く、したがって、抗体２Ｈ６に対するこれらの突然変異の大きな影響は、抗体が、Ａβに関連して、言及したアミノ酸間を識別する能力のためである可能性があり、そしてこれらのデータは、この抗体に対する非常に高い度合いの特異性を立証した。
［０２８２］２Ｈ６および９ＴＬが、Ａβ１−４０への結合に関して競合するかどうかを決定するため、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、競合実験を行った。抗体２Ｈ６、９ＴＬおよび２２８９をＣＭ５チップの異なるチャネル上に固定した。供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でＣＭ５チップチャネルを活性化した。抗体２Ｈ６、９ＴＬ、および２２８９を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化チップ上に注入した。抗体密度は、２Ｈ６では１６２５応答単位（ＲＵ）；９ＴＬでは４０００ＲＵ；および２２８９では２２００ＲＵであった。各チャネルをエタノールアミンでブロッキングした。Ａβ１−４０ペプチド（１５０μＭ）をチップ上に２分間流した。次いで、０．６μＭの抗体２Ｈ６（結合の競合に関して試験しようとするもの）をチップ上に１分間流した。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０）を流動緩衝液として用いた。Ａβ１−４０の結合を測定した後、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌの混合物（２：１）で６秒間、２回洗浄することによって、チップのすべてのチャネルを再生した。次いで、抗体９ＴＬに関して、そして次いで抗体２２８９に関して、競合結合を行った。Ａβ１−４０への結合に関して、９ＴＬおよび２Ｈ６間の競合が観察されたが、９ＴＬおよび２２８９間または２Ｈ６および２２８９間に、競合は観察されなかった。固定された抗体およびチップ上を流れる同じ抗体間の競合の観察は、陽性対照として働いた。
Ｂ．抗体２Ｈ６はＡＰＰには結合しない
［０２８３］２Ｈ６が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合するかどうか決定するため、野生型ＡＰＰでトランスフェクションした細胞への２Ｈ６の結合を決定した。野生型ヒト・アミロイド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡで、２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、モノクローナル抗体抗Ａβ１−１６、抗Ａβ１６−２８、または２Ｈ６（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、５μｇ／ｍｌ）とともに、細胞を氷上で４５分間インキュベーションした。次いで、細胞を、ＰＢＳ中で５分間３回洗浄し、４％ＰＦＡで固定した。細胞を、再び、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈの二次Ｃｙ３−コンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体（１：５００の希釈）を用いて、抗体結合を検出した。
［０２８４］ＡβのＮ末端または中央部のエピトープを認識する、抗Ａβ１−１６抗体および抗Ａβ１６−２８抗体は、どちらも、細胞上に発現されたＡＰＰ前駆体タンパク質に対する有意な結合を示した。対照的に、２Ｈ６は、ＡＰＰ発現細胞に結合しなかった。
Ｃ．脱グリコシル化抗体２Ｈ６の生成
［０２８５］脱グリコシル化抗体２Ｈ６を生成するため、精製抗体２Ｈ６を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０中、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、抗体ｍｇあたり、０．０５Ｕ）と３７℃で７日間インキュベーションした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびタンパク質ゲル電気泳動によって、脱グリコシル化の完全性を検証した。プロテインＡクロマトグラフィーによって、脱グリコシル化抗体を精製し、そしてＱ−セファロースによって、内毒素を除去した。上述のＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、グリコシル化２Ｈ６の、Ａβ１−４０への結合親和性を試験し、そして脱グリコシル化２Ｈ６のＡβ１−４０への結合親和性が、損なわれていない抗体２Ｈ６のものと同一であることが見出された。
（実施例４）
脱グリコシル化２Ｈ６の投与による、アルツハイマー病の動物モデルにおける、より少ない微量出血を伴う認識障害および組織学的症状の逆転
Ａ．実験プロトコル
［０２８６］抗体の投与。「スウェーデン」突然変異体アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１を持つＡＰＰ Ｔｇ２５７６； Ｈｓｉａｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２（１９９６））を実験に用いた。これらのマウスに存在するアルツハイマー様表現型は、よく性質決定されてきている。Ｈｏｌｃｏｍｂら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：９７−１００（１９９８）； Ｈｏｌｃｏｍｂら， Ｂｅｈａｖ． Ｇｅｎ． ２９：１７７−１８５（１９９９）；およびＭｃＧｏｗａｎ Ｅ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ６：２３１−２４４（１９９９）。１６週間処置研究のため、２０ヶ月齢のＡＰＰトランスジェニックマウスを、４つの群の１つに割り当てた。第一の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内抗Ａβ抗体２Ｈ６（実施例３に記載するマウス・モノクローナル抗ヒトＡβ２８−４０ＩｇＧ２ｂ）注射を投与した（ｎ＝４）。第二の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内脱グリコシル化抗Ａβ抗体２Ｈ６（実施例３に記載するように産生）注射を投与した（ｎ＝５）。第三の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内抗ＡＭＮ抗体（２９０６；マウス−モノクローナル抗ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）記憶喪失タンパク質ＩｇＧ１）注射を投与した（ｎ＝６）。非トランスジェニック同腹仔を、１６週間、抗ＡＭＮ抗体（ｎ＝４）または２Ｈ６（ｎ＝２）のいずれかで、処置した。
［０２８７］行動分析。１６週間の抗体処置後、研究中のマウスを、先に記載されるように、２日間放射状アーム水迷路パラダイムに供した。Ｗｉｌｃｏｃｋら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １：２４（２００４）。装置は、先に記載されるような６アーム迷路であった。Ｇｏｒｄｏｎら， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ ２２：３７７−３８５（２００１）。第１日、５回３ブロックで１５回の試験を行った。４匹のマウスのコホートを、各ブロックに関して連続して試験した（すなわち４匹のマウスが試験１を受けた場合、次いで同じマウスが試験２を受けた）。各５回１ブロックの後、マウスの第二のコホートが試験を受け、マウスが第二ブロックの５回の試験に供される前に、長い休息期間を許した。においの手がかりを最小限にするため、コホート中の各マウスに関して、ゴール・アームは異なった。出発アームは、各トライアルに関して多様であり、どちらの日も、所定の個体に関して、ゴール・アームは一定のままだった。最初の１１回の試験では、プラットホームは交互に、可視であり、その後、隠された（最後の４回の試験では隠した）。第２日、すべての試験に関して、プラットホームが隠されている以外、第１日と正確に同じ方式で、マウスを試験した。１分間の時間枠で、エラー（正しくないアームへの進入）の数を測定した。２０秒以内のアーム選択に失敗したマウスは１回のエラーに割り当てたが、この研究ではこの方式でエラーに割り当てなければならないマウスはいなかった。研究中はマウス番号を使用するため、試験者は、各マウスの処置群の同一性を知らない。放射状アーム水迷路タスクにおける依存性測定値は定量的であって、評価的ではないため、試験者のバイアスの見込みは減少した。個々の試験のばらつきの影響を最小限にするため、３回の連続試験に関する各マウスのエラーを平均して、各日５つのデータポイントを生じ、これを、ＳｔａｔＶｉｅｗ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州）を用いたＡＮＯＶＡによって、統計的に分析した。
［０２８８］組織学的分析。屠殺の日、マウスの体重を測定し、１００ｍｇ／ｋｇネンブタール（Ａｂｂｏｔｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ）を過剰投与し、そして次いで、２５ｍｌの０．９％塩化ナトリウムで心臓内灌流した。脳を迅速に取り除き、そして組織病理のため、１００ｍＭ ＫＰＯ４（ｐＨ７．２）中の４％パラホルムアルデヒドを新鮮に調製し、その中で、脳の左半分を２４時間、液浸固定した。次いで、凍結保護のため、半分の脳を１０％、２０％および３０％スクロース中、連続して２４時間インキュベーションした。スライド式ミクロトームを用いて、２５μ厚の水平切片を収集し、そしてアジ化ナトリウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中、４℃で保存して、微生物増殖を妨げた。６００μ離れて等間隔である一連の８つの組織切片を、脳全体に渡って、無作為に選択し、そして先に記載されるように、総Ａβに関して、自由流動（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ）免疫組織化学を用いて染色した（ウサギ・ポリクローナル抗汎Ａβ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ、１：１０，０００）。Ｇｏｒｄｏｎら， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １７３：１８３−１９５（２００２）； Ｗｉｌｃｏｃｋら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２４：６１４４−６１５１（２００４）。ＮａＣｌ飽和８０％エタノール中の０．２％コンゴーレッドを用いて、６００μｍ離れた、第二の一連の組織切片を染色した。別の組の切片もまたマウントし、そして２％塩酸中の２％フェロシアン化カリウムを１５分間用いて、ヘモシデリンに関して染色し、その後、１％中性レッド溶液中で１０分間対比染色した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）を用いて、コンゴーレッド染色およびＡβ免疫組織化学の定量化を行って、陽性染色によって占められる面積の割合を分析した。前頭葉の１つの領域および海馬の３つの領域を分析した（海馬の値に局所的なバイアスがないことを確実にするため）。コンゴーレッドの最初の分析を行って、全体の値を得た。実質アミロイド沈着物のすべてを手動で削除した後、第二の分析を行って、血管コンゴーレッド染色に限定された面積パーセントを得た。コンゴーレッドの実質面積を概算するため、全体の割合から、血管アミロイド値を引いた。ヘモシデリン染色のため、すべての切片上で、プルシアンブルー陽性部位の数を計数し、そして切片あたりの部位の平均数を計算した。低倍率の切片で、動物間の定性的な相違を観察した。等間隔をおいた８つの切片を調べ、そして陽性プロフィールの数を決定し、そして平均して切片あたりの値とした。処置に関連する、ありうる相違を評価するため、一方向ＡＮＯＶＡ、その後、フィッシャーのＬＳＤ平均比較によって、各処置群に関する値を分析した。
［０２８９］ＥＬＩＳＡを用いたＡβペプチドの血清レベルの測定。抗体の最後の投薬の１日後に収集した血清を希釈し、そしてＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中、５μｇ／ｍｌの抗体６Ｅ１０（Ａβ１−１７に結合する、抗ベータ・アミロイド抗体；Ｓｉｇｎｅｔ、マサチューセッツ州デダム）であらかじめコーティングした、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ、デンマーク・ロスクライド）中でインキュベーションした。二次抗体は、１：５０００希釈のビオチン化４Ｇ８（Ａβ１７−２４に結合する抗ベータ・アミロイド抗体；Ｓｉｇｎｅｔ）であった。ストレプトアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、その後、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、検出を行った。６〜４００ｐＭのスケーリングのＡβ１−４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を標準曲線に用いた。
Ｂ．結果
［０２９０］脱グリコシル化抗体の投与による、認識欠損の逆転。放射状アーム水迷路タスクは、トランスジェニックマウスモデルにおける空間学習および記憶欠損を検出する。Ｇｏｒｄｏｎら， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ． ２２：３７７−３８５（２００１）； Ｍｏｒｇａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：９８２−９８５（２０００）。抗体２Ｈ６、脱グリコシル化２Ｈ６、または抗ＡＭＮで１６週間処置した動物を、放射状アーム水迷路の２日型において、空間ナビゲーション学習に関して試験した。非トランスジェニック正常マウス（２Ｈ６抗体で処置した２匹のマウスおよび抗ＡＭＮ抗体で処置した４匹のマウスを含む；行動上の相違が観察されなかったため、これらの２群を合わせた）もまた、放射状アーム水迷路の２日型で試験した。図５に示すように、対照抗体（抗ＡＭＮ）で処置したＡＰＰトランスジェニックマウスは、試験の２日間に渡って、プラットホームの位置を学習するのに失敗し、そして先に記載されるように、非トランスジェニックマウスに比較して、有意に損なわれていた。Ｗｉｌｃｏｃｋら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １：２４（２００４）。しかし、抗Ａβ抗体２Ｈ６および脱グリコシル化２Ｈ６を投与したＡＰＰトランスジェニックマウスは、対照処置ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて観察された損傷の、有意な逆転を示し、第２日の終わりには、平均パフォーマンスは、試験あたりほぼ１回のエラーであった（図５）。対照処置ＡＰＰトランスジェニックマウスでは、第２日の終わりに、平均パフォーマンスが試験あたりほぼ３回のエラーであった（図５）。図５に示すデータは、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける認識欠損の逆転に関して、損なわれていない抗体と同様に、脱グリコシル化抗体が働くことを示す。
［０２９１］微量出血増加を伴わない、Ａβ沈着物の減少。以下の表７に示すように、海馬中の総Ａβ免疫染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約５６％減少、ｐ＝０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約５８％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。以下の表８に示すように、前頭葉中の総Ａβ免疫染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約５０％減少、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約５１％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。
表７．１６週間の抗体処置後の海馬に関する総Ａβ負荷。海馬に関する、Ａβに関して陽性の免疫組織化学染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
表８．１６週間の抗体処置後の前頭葉に関する総Ａβ負荷。前頭葉に関する、Ａβに関して陽性の免疫組織化学染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
［０２９２］表９に示すように、海馬中の総コンゴーレッド染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約７７％減少、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約５３％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。表１０に示すように、前頭葉中の総コンゴーレッド染色もまた、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約７９％減少、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約６８％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。
表９．１６週間の抗体処置後の海馬に関する総コンゴーレッド染色。海馬に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
表１０．１６週間の抗体処置後の前頭葉に関する総コンゴーレッド染色。前頭葉に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
［０２９３］前頭葉および海馬の両方に関して、実質（表１１および１２；ならびに図６）および血管（表１３および１４；図７）のコンゴーレッド染色を別個に分析した。表１１および図６Ａに示すように、前頭葉中の実質コンゴーレッド染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約９８％減少、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約７７％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。表１２および図６Ｂに示すように、海馬中の実質コンゴーレッド染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約９６％減少、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約６３％減少、ｐ＜０．０００１）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に減少した。前頭葉および海馬において、コンゴーレッド負荷の減少に際して、脱グリコシル化２Ｈ６は、損なわれていない２Ｈ６抗体よりも、より有効でなかった。
表１１．１６週間の抗体処置後の前頭葉に関する実質コンゴーレッド染色。前頭葉に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
表１２．１６週間の抗体処置後の海馬に関する実質コンゴーレッド染色。海馬に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
［０２９４］表１３および図７Ａに示すように、海馬中の血管コンゴーレッド染色は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約２．７倍、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約１．７倍、ｐ＝０．０１８５）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に増加した。表１４および図７Ｂに示すように、前頭葉中の血管コンゴーレッド染色もまた、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、抗体２Ｈ６（約３．５倍、ｐ＜０．０００１）および脱グリコシル化２Ｈ６（約１．８倍、ｐ＝０．００４８）を用いた１６週間の免疫療法後、有意に増加した。海馬（ｐ＝０．００２５）および前頭葉（ｐ＜０．０００１）の両方に関して、脱グリコシル化２Ｈ６処置群における血管コンゴーレッド染色の増加は、損なわれていない２Ｈ６抗体処置群におけるよりも、有意に少なかった。
表１３．１６週間の抗体処置後の海馬に関する血管コンゴーレッド染色。海馬に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
表１４．１６週間の抗体処置後の前頭葉に関する血管コンゴーレッド染色。前頭葉に関する、Ａβに関して陽性のコンゴーレッド染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
［０２９５］プルシアンブルー組織学染色を用いて、ヘモグロビン分解で産生される酸化鉄物質であるヘモシデリンを標識した。脳中の血管外（ｅｘｔｒａｖｅｎｏｕｓ）血液は、赤血球のミクログリア食作用および赤血球内部のヘモグロビンの分解を導く。したがって、酸化鉄含有ミクログリアは、過去の出血のマーカーである。抗体処置した動物におけるプルシアンブルー陽性プロフィールの数を計数した。表１５および図８に示すように、抗体２Ｈ６での処置は、対照抗体処置群（抗ＡＭＮ）に比較した際、プルシアンブルー染色を、約５．５倍、有意に増加させた（ｐ＜０．０００１）。脱グリコシル化２Ｈ６抗体での処置は、対照抗体処置群に比較した際、プルシアンブルー染色を、約１．８倍、増加させただけであった（ｐ＝０．０３６４）。
表１５．１６週間の抗体処置後の切片全体に関するプルシアンブルー染色。切片全体に関する、陽性プルシアンブルー染色が占める平均面積パーセント、ならびに平均の標準偏差および標準誤差を示す。
Figure 2008511291
［０２９６］脱グリコシル化２Ｈ６抗体投与後のＡβの血清レベル。図９に示すように、ＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスへの抗体２Ｈ６および脱グリコシル化２Ｈ６のどちらの投与もベータ−アミロイド・ペプチドの血清レベルを有意に増加させた。しかし、抗ＡＭＮ抗体投与後のＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスにおいて、あるいは抗ＡＭＮ抗体または抗体２Ｈ６投与後の野生型マウスにおいて、ベータ−アミロイド・ペプチドの血清レベルの有意な増加はまったく観察されなかった。これは、ベータ−アミロイド・ペプチドの血清レベルの増加を用いて、ＡＤの診断を補助し、そして免疫療法などのＡＤ療法に対する応答を監視することも可能であることを示す。
Ｃ．結論
［０２９７］上記データは、１）脱グリコシル化抗体２Ｈ６が、ＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスにおける学習および記憶欠損を逆転させる際に、損なわれていない抗体２Ｈ６と同程度に有効であり；２）コンゴーレッド染色によって測定した場合、脱グリコシル化抗体２Ｈ６は、海馬および前頭葉中のＡβ沈着物の枯渇において、損なわれていない抗体２Ｈ６よりわずかにより有効でないが、Ａβ免疫染色によって測定した場合、海馬および前頭葉中のＡβ負荷の枯渇において、同程度に有効であり；３）脱グリコシル化抗体２Ｈ６による海馬および前頭葉の血管系におけるＡβ沈着物の増加（コンゴーレッド染色によって測定した場合）は、損なわれていない２Ｈ６抗体よりはるかにより少なく；そして４）脱グリコシル化２Ｈ６抗体で処置したＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスにおけるプルシアンブルー染色によって測定した場合の微量出血は、損なわれていない２Ｈ６抗体で処置したマウスよりはるかにより低かった。これらのデータは、ＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスにおいて、脱グリコシル化抗体がアルツハイマー病の徴候を改善するのに同程度に有効であり、微量出血のリスクがより低かったことを示唆する。
（実施例５）
ネズミおよびヒトのＦｃγ受容体および補体への、多様な抗体Ｆｃ領域の結合親和性
［０２９８］上述のように、Ｆｃγ受容体または補体への、抗体Ｆｃ領域の結合親和性を測定した。簡潔には、精製したヒトまたはネズミのＦｃγ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＣ１ｑ（Ｑｕｉｄｅｌ）を、アミン化学反応によって、ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定した。モノクローナル抗体の連続希釈（２ｎＭから表１６および表１７に示すような最大濃度までの範囲）を注入した。ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０）を流動緩衝液および試料緩衝液として用いた。高親和性相互作用に関しては、１：１ラングミュア相互作用モデルを、または低親和性相互作用に関しては定常状態親和性モデルを用いて、結合データを分析した。
［０２９９］以下の表１６は、ＫＤ（ｎＭ）によって測定されるような、ネズミＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびヒトＣ１ｑ（ｈＣ１ｑ）への抗β−アミロイド抗体の結合親和性を示す。脱グリコシル化抗体は、Ｎグリコシル化が除去された定常領域を有する。９ＴＬ（ｈＩｇＧ１）および９ＴＬ（ｈＩｇＧ２Δａ）は、同一可変領域（配列番号１および配列番号２に示す）を有するが、異なる定常領域を有する。９ＴＬ（ｈＩｇＧ１）は、ヒトＩｇＧ１定常領域を有し；そして９ＴＬ（ｈＩｇＧ２Δａ）は、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するＫａｂａｔのアミノ酸番号付け）への突然変異を持つヒトＩｇＧ２ａを有する。表１６に示すように、脱グリコシル化２Ｈ６、２２９４、および２２８６は、Ｎグリコシル化を除去していない対応する抗体各々に比較した際、試験したネズミＦｃγ受容体すべてに対して、減少した親和性を有した。脱グリコシル化２Ｈ６はまた、２Ｈ６に比較した際、ヒト補体に対しても減少した親和性を有した。９ＴＬ（ｈＩｇＧ１）は、ｍＦｃγＲＩＩｂまたはｍＦｃγＲＩＩＩに対して有意な結合を持たず；そして９ＴＬ（ｈＩｇＧ２Δａ）は、ネズミＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、またはｈＣ１ｑのいずれに対しても、有意な結合を持たなかった。
［０３００］表１７は、ＫＤ（ｎＭ）によって測定した場合の、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、およびｈＣ１ｑへの抗β−アミロイド抗体の結合親和性を示す。表１７に示すように、９ＴＬ（ｈＩｇＧ２Δａ）は、ヒトＦｃγＲＩまたはｈＣ１ｑへの有意な結合を持たず；そしてヒトＩｇＧ１定常領域を含む抗体のヒトＦｃγＲＩＩｂ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの親和性に比較した場合、これらの分子への有意により低い親和性を有した。
表１６．Ｋ Ｄ （ｎＭ）によって測定した際の、ネズミＦｃγ受容体およびヒト補体への抗体の結合親和性
Figure 2008511291
ＮＢ：試験した最大濃度で抗体を用いた場合、有意な結合がない
ｈＣ１ｑへの結合に関して試験した最大抗体濃度は、３０，０００ｎＭであった。
表１７．Ｋ Ｄ （ｎＭ）によって測定した際の、ヒトＦｃγ受容体およびヒト補体への抗体の結合親和性
Figure 2008511291
ＮＢ：３０μＭ濃度で抗体を用いた場合、有意な結合がない
結合に関して試験した最大抗体濃度は、３０，０００ｎＭであった。
（実施例６）
頭蓋内投与後の、ミクログリア活性化、Ｆｃγ受容体結合、およびアミロイド・クリアランスに対する脱グリコシル化２Ｈ６抗体の効果
［０３０１］外科的処置および抗体の頭蓋内投与。１９．５ヶ月齢のＴｇ２５７６トランスジェニックマウスを、３つの群の１つに割り当て、これらの群すべての前頭葉および海馬に頭蓋内注射を投与した。第一の群には、各領域２μｇ／２μｌの濃度で抗Ａβ抗体２Ｈ６を投与した。第二の群には、各領域２μｇ／２μｌで脱グリコシル化２Ｈ６抗体を投与した。第三の群には、損なわれていないＩｇＧ注射の非特異的側面に関する対照として、ショウジョウバエ記憶喪失タンパク質に対して向けられるＩｇＧを投与した。すべてのマウスは、手術後、７２時間生存した。
［０３０２］手術の日、マウス（Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウス）の重量を測定し、イソフルランで麻酔し、そして定位固定装置（５１６０３デュアル・マニピュレーター実験室スタンダード、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、イリノイ州ウッドデール）に入れた。正中矢状（ｍｉｄｓａｇｉｔｔａｌ）切開を行って、頭蓋を暴露し、そして、右前頭葉および海馬上に、以下の座標まで、歯科用ドリルを用いて、掘削器具（ｂｕｒｒ）の穴を２つ開けた：皮質：ＡＰ＋１．５ｍｍ、Ｌ−２．０ｍｍ、海馬：ＡＰ−２．７ｍｍ、Ｌ−２．５ｍｍ、いずれも十字縫合から。１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ（ネバダ州リノ）シリンジに取り付けた２６ゲージの針を十字縫合に対して３ｍｍ腹部に下げ、そして２分間の期間に渡って、２μｌの注射を行った。生理食塩水で切開部を清浄にし、そして外科用ホチキスで閉鎖した。
［０３０３］組織調製。マウスを屠殺する日に、重量を測定し、１００ｍｇ／ｋｇペントバルビタール（ネンブタール・ナトリウム溶液、Ａｂｂｏｔｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ）を過剰投与し、そして２５ｍｌの０．９％塩化ナトリウムで心臓内灌流し、その後、新鮮に調製した４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ＝７．４）５０ｍｌで灌流した。脳を迅速に取り除き、そして新鮮に調製した４％パラホルムアルデヒド中、２４時間、液浸固定した。次いで、凍結保護のため、脳を１０％、２０％および３０％スクロース中、連続して２４時間インキュベーションした。次いで、スライド式ミクロトームを用いて、２５μｍ厚の水平切片を収集し、そしてアジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ緩衝液中、４℃で保存して、微生物増殖を妨げた。
［０３０４］注入部位に渡っておよそ１００μｍ離れた６〜８の切片を選択し、そして総Ａβ（Ａβ１−４０およびＡβ１−４２と反応するウサギ抗血清；１：１０，０００の希釈を用いた）、抗ＣＤ４５抗体（カタログ番号ＭＣＡ１０３１Ｇ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、ノースカロライナ州ローリー；１：５０００の希釈を用いた）、および抗Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６／ＣＤ３２）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３１４１；１：１，０００希釈として用いた）に関して、自由流動免疫組織化学法を用いて染色した。抗ＣＤ４５およびＦｃγ受容体抗体染色のため、１：３，０００希釈のビオチン化ヤギ抗ラットを二次抗体として用いた。免疫染色のため、一次抗体からいくつかの切片を除いて、非特異的免疫組織化学反応を評価した。隣接する切片をスライド上にマウントし、そして４％チオフラビン−Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、１０分間染色した。注入体積を含む切片は、限定される数しかなかったことに注目すべきである。
［０３０５］データ分析。皮質および海馬の注入領域および脳の対側の対応する領域において、画像計量（ｖｉｄｅｏｍｅｔｒｉｃ）Ｖ１５０画像分析システム（Ｏｎｃｏｒ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、すべての染色された切片上の免疫組織化学反応産物を測定した。データを、Ａβ染色、チオフラビン−Ｓ染色、ＣＤ４５染色、およびＦｃγ受容体染色に関して、注入側対非注入側の比として提示した。対応する対側部位に対して、各注入部位を標準化すると、動物間変動の影響が減少し、そしてより少数のマウスで薬剤効果の信頼しうる測定が可能になる。処置に関連する、ありうる相違を評価するため、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア、バージョン５．０．１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州）を用いたＡＮＯＶＡ、その後、フィッシャーのＬＳＤ平均比較によって、各処置群に関する比の値を分析した。
結果
［０３０６］図１０に示すように、前頭葉および海馬におけるＣＤ４５染色は、脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、対照抗体とほぼ同じであった。対照的に、２Ｈ６抗体を頭蓋内投与した後、前頭葉におけるＣＤ４５染色は、対照抗体よりも有意により高く（ｐ＜０．０１）、そして海馬において、一般的により高かった。これは、抗体２Ｈ６とは異なり、脱グリコシル化２Ｈ６の投与が、投与７２時間後、前頭葉および海馬において、ミクログリアを活性化しなかったことを示す。
［０３０７］図１１に示すように、前頭葉および海馬におけるＦｃγＩＩおよびＦｃγＩＩＩ受容体染色は、脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、対照抗体とほぼ同じであった。対照的に、２Ｈ６抗体を頭蓋内投与した後、前頭葉および海馬におけるＦｃγ受容体染色は、対照抗体よりも有意により高かった（ｐ＜０．０１）。これは、抗体２Ｈ６とは異なり、脱グリコシル化２Ｈ６の投与が、投与７２時間後、前頭葉および海馬において、ミクログリアを活性化しなかったことを示す。
［０３０８］図１２に示すように、２Ｈ６抗体または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与の７２時間後、Ａβ染色は、対照抗体に比較した際、前頭葉および海馬において、より低かった。図１３に示すように、チオフラビン−Ｓに染色されたコンパクトな斑もまた、２Ｈ６抗体または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与の７２時間後、対照抗体に比較した際、前頭葉および海馬において、より低かった。
［０３０９］これらのデータは、脱グリコシル化２Ｈ６抗体が、ミクログリア活性化および炎症応答を誘導することなく、前頭葉および海馬において、Ａβおよびコンパクトな斑を減少させることが可能であったことを示す。
（実施例７）
抗体２２９４が結合するＡβペプチド上のエピトープの性質決定
［０３１０］抗体２２９４は、Ａβ１−４０でマウスを免疫することによって作成されたネズミ抗体である。この抗体は、ＵＳ ２００４／０１４６５１２およびＷＯ ０４／０３２８６８に記載される。
［０３１１］Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ２２−３７への抗体２２９４の結合親和性を測定した。以下の表１８は、多様なＡβペプチドへの抗体２２９４ Ｆａｂ断片の親和性を示す。
表１８．抗体２２９４ Ｆａｂ断片の結合親和性
Figure 2008511291
［０３１２］ＥＬＩＳＡアッセイによって、抗体２２９４のエピトープマッピングを行った。多様なＡβペプチド（これらのペプチドは、Ｃ末端に付加されたグリシンを有する）のビオチン化１５量体または１０量体を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート上に固定した。ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の６μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、２１１２２）を用いて、１時間を超えて、４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の１％ＢＳＡでブロッキングした。洗浄後、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のビオチン化Ａβペプチドを、室温で１時間インキュベーションした。固定されたＡβペプチドと抗体２２９４（２．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）を室温で１時間インキュベーションした。洗浄後、二次抗体である、１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト・カッパ鎖抗体（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、５５２３３）と、プレートをインキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ、５０−７６−０２、５０−６５−０２）を添加することによって、結合した二次抗体を測定した。１Ｍリン酸を添加することによってＨＲＰ反応を停止し、そして４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１４に示すように、抗体２２９４は、Ｃ末端にグリシンを含む、アミノ酸２０−３４、２１−３５、２２−３６、２３−３７、２４−３８、２５−３９、２６−４０、および２５−３４を含むＡβペプチドに結合する；が、アミノ酸１９−３３、２７−４１、２４−３３、および２７−３５を含み、これらのペプチドのＣ末端にグリシンを有するＡβペプチドには結合しない。これは、抗体２２９４が結合するエピトープには、２６−３４のアミノ酸が含まれることを示唆する。
［０３１３］抗体２２９４に認識されるＡβペプチド上のエピトープをさらに決定するため、ＥＬＩＳＡ結合分析を用いた。多様なＡβペプチド（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、コロラド州）をＥＬＩＳＡプレート上に固定した。上述のようなＥＬＩＳＡによって、固定Ａβへの２２９４完全抗体（２０ｎＭ）の結合を決定した。抗体２２９４は、Ａβペプチド１７−４０、１７−４２、２８−４０、１−３８、１−４０、１−４２、および１−４３に結合する。抗体２２９４は、Ａβペプチド１−１６、１−２８、２８−４２、２２−３５、および３３−４０には結合しない。したがって、抗体２２９４は、多様な一部切除Ａβペプチド、例えば１−３８、１−４０、１−４２、および１−４３のＣ末端に結合する。
［０３１４］以下の表１９は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによって測定した際の、Ａβ１−４０への２２９４の結合を、他のＡβペプチドに対して比較したものを示す。抗体２２９４（完全抗体）は、他のペプチドに比較した際、Ａβ１−４０に最強の結合を有し、一部切除Ａβ１−４０（１−３６、１−３７、１−３８、および１−３９など）、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３への結合は有意により低かった。これは、Ａβのアミノ酸４０（バリン）の側鎖または主鎖が、Ａβ１−４０への２２９４の結合に関与することを示し；そしてこのアミノ酸が存在しないと、結合は有意に減少する。
表１９
Figure 2008511291
「−」は結合なしを示し；「＋」は非常に低い結合を示し；「＋＋」は中程度の結合を示し；「＋＋＋」は強い結合を示し；そして「＋＋＋＋」は非常に強い結合を示す。
［０３１５］上に示すデータに基づいて、抗体２２９４が結合するエピトープには、アミノ酸２６−３４および４０が含まれるようである。抗体２２９４は、米国仮出願第６０／６７６，０９３号に記載される抗体６Ｇ（この抗体のアミノ酸および核酸配列を配列番号３６〜３９に示す；６Ｇをコードするベクターは、寄託番号ＰＴＡ−６７８６およびＰＴＡ−６７８７で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、２００５年６月１５日に寄託されている）に非常によく似たエピトープに結合する。抗体６Ｇが結合するエピトープには、アミノ酸２５−３４、および４０が含まれる。抗体２２９４および６Ｇのエピトープ比較を図１４に示す。
［０３１６］Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ２２−３７への抗体６Ｇ Ｆａｂ断片の結合親和性を測定した。ビオチン化Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ２２−３７を、ストレプトアビジン・チップ上に固定し、そして６Ｇ Ｆａｂをその上に流した。抗体６Ｇ Ｆａｂ断片は、３．０ｘ１０５のｋｏｎ（１／Ｍｓ）、７．０ｘ１０−４のｋｏｆｆ（１／ｓ）、および２ｎＭのＫＤで、Ａβ１−４０に結合する。抗体６Ｇ Ｆａｂ断片は、１．８ｘ１０４のｋｏｎ（１／Ｍｓ）、１．６ｘ１０−３のｋｏｆｆ（１／ｓ）、および８０ｎＭのＫＤで、Ａβ１−４２に結合する。抗体６Ｇ Ｆａｂ断片は、３．６ｘ１０５のｋｏｎ（１／Ｍｓ）、３．９ｘ１０−３のｋｏｆｆ（１／ｓ）、および１１ｎＭのＫＤで、Ａβ２２−３７に結合する。抗体６Ｇは、抗体２２９４よりも、Ａβ１−４２およびＡβ２２−３７に、有意により高い親和性を有する。データは、抗体６Ｇの結合が、抗体２２９４よりも、アミノ酸４０により依存しないことを示す。
［０３１７］実施例３に記載するように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いた、２２９４、６Ｇ、２Ｈ６、および２２８９間の抗体競合実験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、競合実験を行った。抗体２２９４、６Ｇ、２Ｈ６、および２２８９をＣＭ５チップの異なるチャネル上に固定した。供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でＣＭ５チップチャネルを活性化した。抗体２２９４、６Ｇ、２Ｈ６、および２２８９を、各々、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌで活性化チップ上に注入した。各チャネルをエタノールアミンでブロッキングした。Ａβ１−４０ペプチド（１５０μＭ）をチップ上に２分間流した。次いで、０．６μＭの抗体２２９４（結合の競合に関して試験しようとするもの）をチップ上に１分間流した。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０）を流動緩衝液として用いた。Ａβ１−４０の結合を測定した後、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌの混合物（２：１）で６秒間、２回洗浄することによって、チップのすべてのチャネルを再生した。次いで、抗体６Ｇ、２Ｈ６に関して、そして次いで抗体２２８９に関して、競合結合を行った。Ａβ１−４０への結合に関して、２２９４および６Ｇ間、ならびに２２９４および２Ｈ６間の競合が観察されたが、２２９４および２２８９間、または６Ｇおよび２２８９間に、競合は観察されなかった。固定された抗体およびチップ上を流れる同じ抗体間の競合の観察は、陽性対照として働いた。データは、抗体２２９４が、Ａβ１−４０への結合に関して、２Ｈ６および６Ｇと競合することを示す。
（実施例８）
アルツハイマー病の動物モデルにおいて、Ａβ沈着物減少および認識における、抗体２２９４および脱グリコシル化抗体２２９４の効果
［０３１８］２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０中、精製抗体２２９４を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、抗体ｍｇあたり０．０５Ｕ）で、３７℃で７日間インキュベーションすることによって、脱グリコシル化抗体２２９４を調製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびタンパク質ゲル電気泳動によって、脱グリコシル化の完全性を検証した。プロテインＡクロマトグラフィーによって、脱グリコシル化抗体を精製し、そしてＱ−セファロースによって内毒素を除去した。上述のＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、Ａβ１−４０への脱グリコシル化２２９４の結合親和性を試験し、そしてＡβ１−４０への脱グリコシル化２２９４の結合親和性が、損なわれていない抗体２２９４と同一であることが見出された。
［０３１９］実施例４に記載するように、認識欠損、組織学的症状、および微量出血の逆転に対する効果に関して、トランスジェニックマウスＡＰＰ Ｔｇ２５７６において、抗体２２９４および脱グリコシル化２２９４を試験した。１６週間の処置研究のため、トランスジェニックマウス（２０ヶ月齢）を４つの群の１つに割り当てた。第一の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内抗Ａβ抗体２２９４注射を投与した（ｎ＝４）。第二の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内脱グリコシル化抗Ａβ抗体２２９４注射を投与した（ｎ＝５）。第三の群には、１６週間の期間、毎週、腹腔内抗ＡＭＮ抗体（２９０６；マウス・モノクローナル抗ショウジョウバエ記憶喪失タンパク質ＩｇＧ１）注射を投与した（ｎ＝６）。非トランスジェニック同腹仔を、１６週間、抗ＡＭＮ抗体（ｎ＝４）または２２９４（ｎ＝２）のいずれかで、処置した。
［０３２０］実施例４に記載するように、組織学的分析および行動的分析を行う。
［０３２１］本明細書記載の実施例および態様は、例示目的のみのためであり、そして当業者には、その見地で、多様な修飾または変化が示唆されるであろうし、そしてこれらは、本出願の精神および範囲内に含まれるものとする。本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的にそして個々に本明細書に援用されると示されたのと同じ度合いに、すべての目的のため、全体として、本明細書に援用される。
生物学的物質の寄託
［０３２２］以下の物質をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
Figure 2008511291
［０３２３］ベクターｐＥｂ．９ＴＬ．ｈＫは、９ＴＬ軽鎖可変領域および軽鎖カッパ定常領域をコードするポリヌクレオチドであり；そしてベクターｐＤｂ．９ＴＬ．ｈＦｃ２ａは、９ＴＬ重鎖可変領域、および以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するアミノ酸番号付け； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照されたい）を含有する重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域をコードするポリヌクレオチドである。
［０３２４］ベクターｐＥｂ．６Ｇ．ｈＫは、６Ｇ軽鎖可変領域および軽鎖カッパ定常領域をコードするポリヌクレオチドであり；そしてベクターｐＤｂ．６Ｇ．ｈＦｃ２ａは、６Ｇ重鎖可変領域、および以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するアミノ酸番号付け； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照されたい）を含有する重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域をコードするポリヌクレオチドである。
［０３２５］これらの寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約およびそれに基づく条例（ブダペスト条約）の規定のもとに行われた。これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存培養物の維持を保証する。この寄託は、ブダペスト条約の条件下で、ＡＴＣＣによって入手可能になり、そしてＲｉｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．およびＡＴＣＣ間の取り決めの対象であり、これは、適正な米国特許の発行、あるいは米国または他の外国特許出願いずれかの公開開始の、いずれか早い方に際して、公共に、この寄託物の培養物の子孫が永続的に、そして無制限に利用可能になることを確実にし、そして米国特許商標庁長官が、３５ＵＳＣセクション１２２およびそれに準ずる長官命令（３７ＣＦＲセクション１．１４を含み、特に８８６ ＯＧ ６３８に関する）にしたがって、資格があると決定したものに対して、子孫の入手可能性を確実にする。
［０３２６］本出願の譲受人は、寄託に際して、物質培養物が、適切な条件下で培養された際に、死ぬかまたは失われるかまたは破壊された場合、届出に際して、物質が、同じ別のものと遅滞なく交換されるであろうことに合意している。寄託物質が入手可能であっても、特許法にしたがって、いずれかの政府の権威のもとに許諾された権利に違反して、本発明を実施するライセンスと見なしてはならない。
Figure 2008511291
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［００６４］図１は、９ＴＬ抗体の重鎖可変領域（配列番号１）および軽鎖可変領域（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ ＣＤＲは太字テキストであり、そしてＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲを下線で示す。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基を連続して番号付けしている。 ［００６５］図２は、ペプチド競合による抗体９ＴＬのエピトープマッピングを示す。Ａβ１−４０ペプチドをＳＡチップ上に固定した。モノクローナル抗体２２８９および９ＴＬ Ｆａｂ断片（各５０ｎＭ）を各々、１０μＭの多様なペプチド（Ａβのアミノ酸２８−４０、１−４０、１−２８、２８−４２、２２−３５、１−１６、１−４３、３３−４０、１−３８、または１７−４０）とともに、またはペプチドなしで、１時間プレインキュベーションし、そして次いでチップ上に流した。固定Ａβ１−４０ペプチドへの抗体Ｆａｂ断片の結合を測定した。 ［００６６］図３は、ペプチド競合による抗体２Ｈ６のエピトープマッピングを示すグラフである。Ａβ１−４０ペプチドをＳＡチップ上に固定した。モノクローナル抗体２２８９、２２８６、または２Ｈ６（各１００ｎＭ）を各々、１６μＭの多様なペプチド（Ａβのアミノ酸１−１６、１−２８、１−３８、１−４０、１−４２、１−４３、１７−４０、１７−４２、２２−３５、２５−３５、または３３−４０）とともに、またはペプチドなしで、１時間プレインキュベーションし、チップ上に流した。固定Ａβ１−４０ペプチドへの抗体の結合を測定した。 ［００６７］図４は、異なるＡβペプチドＣ末端変異体への抗体２Ｈ６、２２８６、および２２８９の結合を示すグラフである。ＧＳＴ−Ａβ変異体（Ｍ３５Ａ、Ｖ３６Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｇ３８Ａ、Ｖ３９Ａ、またはＶ４０Ａ）、またはＧＳＴ−Ａβペプチド１−３９、１−４１、１−４０、１−４２をＥＬＩＳＡプレート上に固定した。モノクローナル抗体２２８６、２Ｈ６、または２２８９（各ｍＡｂ ０．３ｎＭ）を、固定したペプチド各々とインキュベーションし、そしてビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とさらにインキュベーションし、そしてその後、ストレプトアビジン−ＨＲＰとインキュベーションすることによって、その結合を検出した。 ［００６８］図５は、２Ｈ６および脱グリコシル化２Ｈ６で１６週間抗体処置した後、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける空間的学習欠損が逆転したことを示すグラフである。放射状アーム水迷路の２日間型で、マウスを試験した。Ｙ軸は、２日間の試験期間に渡って生じたエラーの平均数に相当する。ブロック番号１〜５は、第１日の試験に相当し、そしてブロック番号６〜１０は、第２日の試験に相当する。「＊」は、抗ＡＭＮ抗体処置マウス（Ａ−ＡＭＮ）に比較した際、２Ｈ６（Ａ−２Ｈ６）および脱グリコシル化２Ｈ６（Ａ−Ｄｅ−２Ｈ６）処置マウスの両方に関してｐ＜０．０５であることを示す。「＊＊」は、抗ＡＭＮ抗体処置マウス（Ａ−ＡＭＮ）に比較した際、２Ｈ６（Ａ−２Ｈ６）および脱グリコシル化２Ｈ６（Ａ−Ｄｅ−２Ｈ６）処置マウスの両方に関してｐ＜０．０１であることを示す。 ［００６９］図６Ａおよび６Ｂは、２Ｈ６、抗ＡＭＮ（ＡＭＮと称する）、および脱グリコシル化２Ｈ６（Ｄ−２Ｈ６と称する）抗体で１６週間抗体処置した後の、海馬（図６Ｂ）および前頭葉（図６Ａ）における実質コンゴーレッド染色アミロイド−ベータ・ペプチドの減少を示すグラフである。図６Ａおよび６ＢのＹ軸は、コンゴーレッド染色に関して陽性である面積パーセントの平均に相当する。図６Ａおよび６ＢのＸ軸は、投与した抗体の種類に相当する。 ［００７０］図７Ａおよび７Ｂは、２Ｈ６、抗ＡＭＮ（ＡＭＮと称する）、および脱グリコシル化２Ｈ６（Ｄ−２Ｈ６と称する）抗体で１６週間抗体処置した後の、海馬（図７Ａ）および前頭葉（図７Ｂ）における血管コンゴーレッド染色アミロイド−ベータ・ペプチドの増加を示すグラフである。図７Ａおよび７ＢのＹ軸は、コンゴーレッド染色に関して陽性である面積パーセントの平均に相当する。図７Ａおよび７ＢのＸ軸は、投与した抗体の種類に相当する。 ［００７１］図８は、２Ｈ６、抗ＡＭＮ（ＡＭＮと称する）、および脱グリコシル化２Ｈ６（Ｄ−２Ｈ６と称する）抗体で１６週間抗体処置した後の、プルシアンブルー陽性プロフィールの数を示すグラフである。Ｙ軸は、切片あたりの陽性プロフィールに相当する。Ｘ軸は、投与した抗体の種類に相当する。 ［００７２］図９は、ＡＰＰ Ｔｇ２５７６マウスにおける、抗ＡＭＮ抗体（ＡＭＮと称する）、抗体２Ｈ６（２Ｈ６と称する）、脱グリコシル化２Ｈ６（２Ｈ６−Ｄと称する）抗体の投与後、ならびに野生型（ＷＴ）マウスにおける、抗ＡＭＮ抗体および抗体２Ｈ６の投与後の、Ａβペプチドの血清レベルを示すグラフである。 ［００７３］図１０は、２Ｈ６抗体（Ａ）または脱グリコシル化２Ｈ６抗体（Ｂ）の頭蓋内投与後の、マウスの海馬におけるＣＤ４５の免疫染色を示す。下部のパネルは、対照抗体、２Ｈ６抗体、または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、前頭葉および海馬における、未注入側を超える、注入側のＣＤ４５陽性染色が占める平均面積の比を示す。「＊＊」は、対照抗体と比較した際、Ｐ＜０．０１であることを示す。 ［００７４］図１１は、２Ｈ６抗体（Ａ）または脱グリコシル化２Ｈ６抗体（Ｂ）の頭蓋内投与後の、マウスの海馬におけるＦｃγ受容体の免疫染色を示す。下部のパネルは、対照抗体、２Ｈ６抗体、または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、前頭葉および海馬における、未注入側を超える、注入側のＦｃγ受容体陽性染色が占める平均面積の比を示す。「＊＊」は、対照抗体と比較した際、Ｐ＜０．０１であることを示す。 ［００７５］図１２は、２Ｈ６抗体（Ａ）または脱グリコシル化２Ｈ６抗体（Ｂ）の頭蓋内投与後の、マウスの海馬におけるＡβペプチドの免疫染色を示す。下部のパネルは、対照抗体、２Ｈ６抗体、または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、前頭葉および海馬における、未注入側を超える、注入側のＡβペプチド陽性染色が占める平均面積の比を示す。「＊＊」は、対照抗体と比較した際、Ｐ＜０．０１であることを示す。「＊」は、対照抗体と比較した際、Ｐ＜０．０５であることを示す。 ［００７６］図１３は、２Ｈ６抗体（Ａ）または脱グリコシル化２Ｈ６抗体（Ｂ）の頭蓋内投与後の、マウスの海馬におけるチオフラビン−Ｓを示す。下部のパネルは、対照抗体、２Ｈ６抗体、または脱グリコシル化２Ｈ６抗体の頭蓋内投与後、前頭葉および海馬における、未注入側を超える、注入側のチオフラビン−Ｓ陽性染色が占める平均面積の比を示す。「＊」は、対照抗体と比較した際、Ｐ＜０．０５であることを示す。 ［００７７］図１４は、ＥＬＩＳＡによる抗体２２９４および６Ｇのエピトープマッピングを示す。多様なＡβペプチドをＥＬＩＳＡプレート上に固定した。抗体を多様な固定ペプチドと１時間インキュベーションした。ヤギ抗ヒト・カッパＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を用いて、固定Ａβペプチドに結合した抗体６Ｇを測定した。重鎖および軽鎖の両方に結合し、そしてＨＲＰコンジュゲート化二次抗体である、ヤギ抗マウスを用いて、固定Ａβペプチドに結合した抗体２２９４を測定した。「ＮＢ」は結合が検出されないことを指す。「２２９４」および「６Ｇ」下の列中の数字は、４５０ｎｍでの吸光度に相当する。

Claims (76)

  1. 被験者におけるβ−アミロイドの異常な沈着によって特徴付けられる疾患を治療するための方法であって、β−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のβ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する有効量の抗体を該被験者に投与することを含み、該抗体が、損なわれたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む、前記方法。
  2. 被験者がヒトである、請求項１の方法。
  3. 疾患がアルツハイマー病である、請求項１の方法。
  4. 疾患がダウン症候群である、請求項１の方法。
  5. 疾患が脳アミロイド血管症である、請求項１の方法。
  6. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１の方法。
  7. 抗体がヒト化抗体である、請求項１の方法。
  8. 抗体がヒト抗体である、請求項１の方法。
  9. 抗体が、約１００ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項１の方法。
  10. 抗体が、約２０ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項１の方法。
  11. 抗体が、約２ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項１の方法。
  12. 抗体がＡβペプチドのＣ末端に結合する、請求項１の方法。
  13. 抗体が、Ａβ１−４０の残基２８−４０、Ａβ１−４２の２８−４２、またはＡβ１−４３の２８−４３内のエピトープに特異的に結合する、請求項１の方法。
  14. 抗体が、Ａβ１−３６、Ａβ１−３７、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、およびＡβ１−４３からなる群より選択されるＡβペプチドのＣ末端に特異的に結合する、請求項１の方法。
  15. 抗体が、アミノ酸３９および／または４０を含むＡβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する、請求項１の方法。
  16. 抗体が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１５の方法。
  17. 抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４３に対するより高い親和性でＡβ１−４０に結合する、請求項１の方法。
  18. 抗体が、アミノ酸２５−３４および４０を含むＡβ１−４０上のエピトープに結合する、請求項１の方法。
  19. 抗体が、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１８の方法。
  20. 抗体が、Ａβペプチドの残基１−１６内のエピトープに特異的に結合する、請求項１の方法。
  21. 抗体がＡβペプチドのＮ末端に特異的に結合する、請求項１の方法。
  22. 抗体が、Ａβペプチドの残基１６−２８内のエピトープに特異的に結合する、請求項１の方法。
  23. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化されていないか、または天然Ｆｃ領域に対して改変されたＮグリコシル化パターンを有する、請求項１の方法。
  24. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化認識配列内に突然変異を含み、これによってＦｃ領域がＮグリコシル化されない、請求項１の方法。
  25. 抗体のＦｃ領域が、３３０位でアラニンからセリンへのアミノ酸突然変異を、そして３３１位でプロリンからセリンへのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸位が、ヒト野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するＫａｂａｔ番号付けに基づく、請求項１の方法。
  26. 被験者におけるβ−アミロイドの異常な沈着に関連する疾患を治療するための方法であって、β−アミロイド・ペプチドまたは凝集型のβ−アミロイド・ペプチドに特異的に結合する有効量の抗体を該被験者に投与することを含み、該抗体が、天然存在Ｆｃ領域からの変異を含むＦｃ領域を含み、該変異が、損なわれたエフェクター機能を生じる、前記方法。
  27. Ｆｃ領域における変異を持つ抗体の投与が、変異を持たない抗体の投与より、より少ない脳微量出血（ｍｉｃｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）を引き起こす、請求項２６の方法。
  28. 被験者がヒトである、請求項２６の方法。
  29. 疾患がアルツハイマー病である、請求項２６の方法。
  30. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６の方法。
  31. 抗体がヒト化抗体である、請求項２６の方法。
  32. 抗体がヒト抗体である、請求項２６の方法。
  33. 抗体が、約１００ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項２６の方法。
  34. 抗体が、約２０ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項２６の方法。
  35. 抗体が、約２ｎＭ以下のＫＤでＡβペプチドに結合する、請求項２６の方法。
  36. 抗体が、Ａβ１−４０の残基２８−４０、Ａβ１−４２の２８−４２、またはＡβ１−４３の２８−４３内のエピトープに特異的に結合する、請求項２６の方法。
  37. 抗体が、Ａβ１−３６、Ａβ１−３７、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ１−４３からなる群より選択されるＡβペプチドのＣ末端に特異的に結合する、請求項２６の方法。
  38. 抗体が、アミノ酸３９および／または４０を含むＡβ１−４０上のエピトープに特異的に結合する、請求項２６の方法。
  39. 抗体が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３８の方法。
  40. 抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４３に対するより高い親和性でＡβ１−４０に結合する、請求項２６の方法。
  41. 抗体が、アミノ酸２５−３４および４０を含むＡβ１−４０上のエピトープに結合する、請求項２６の方法。
  42. 抗体が、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４１の方法。
  43. 抗体が、Ａβペプチドの残基１−１６内のエピトープに特異的に結合する、請求項２６の方法。
  44. 抗体がＡβペプチドのＮ末端に特異的に結合する、請求項２６の方法。
  45. 抗体が、Ａβペプチドの残基１６−２８内のエピトープに特異的に結合する、請求項２６の方法。
  46. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化されていないか、または天然Ｆｃ領域に対して改変されたＮグリコシル化パターンを有する、請求項２６の方法。
  47. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化認識配列内に突然変異を含み、これによってＦｃ領域がＮグリコシル化されない、請求項２６の方法。
  48. 抗体のＦｃ領域が、３３０位でアラニンからセリンへのアミノ酸突然変異を、そして３３１位でプロリンからセリンへのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸位が、ヒト野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するＫａｂａｔ番号付けに基づく、請求項２６の方法。
  49. （ａ）配列番号３に示すＣＤＲ１領域；
    （ｂ）配列番号４に示すＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列番号５に示すＣＤＲ３領域、ここでＬ１はＬ、Ｖ、またはＩであり；Ｙ２はＹまたはＷであり；Ｓ３はＳ、Ｔ、またはＧであり；Ｌ４はＬ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＥであり；Ｖ６はＶ、Ｉ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、またはＦであり；そしてＹ７はＹ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｉ、Ｖ、またはＡである
    を含む重鎖可変領域を含む抗体であって、Ａβペプチドに特異的に結合する、前記抗体。
  50. 重鎖可変領域が：
    （ａ）配列番号３に示すＣＤＲ１領域；
    （ｂ）配列番号４に示すＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列番号５に示すＣＤＲ３領域
    を含む、請求項４９の抗体。
  51. 軽鎖可変領域をさらに含む、請求項４９の抗体。
  52. ヒト化抗体である、請求項４９の抗体。
  53. （ａ）配列番号６に示すＣＤＲ１領域、ここでＹ８はＹ、Ａ、またはＨであり；Ａ１１はＡまたはＳであり；そしてＫ１２はＫまたはＡである；
    （ｂ）配列番号７に示すＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列番号８に示すＣＤＲ３領域、ここでＬ１はＬ、Ｍ、Ｎ、Ｃ、Ｆ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、Ｓであり；Ｇ３はＧ、Ｓ、またはＴであり；Ｔ４はＴまたはＳであり；Ｈ５はＨまたはＬであり；Ｙ６はＹ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、またはＥであり；Ｖ８はＶ、Ｌ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｅ、またはＭであり；そしてＬ９はＬ、Ｉ、Ｔ、Ｓ、またはＶである
    を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって；
    Ａβペプチドに特異的に結合する、前記抗体。
  54. ヒト化抗体である、請求項５３の抗体。
  55. 軽鎖可変領域が：
    （ａ）配列番号６に示すＣＤＲ１領域；
    （ｂ）配列番号７に示すＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列番号８に示すＣＤＲ３領域
    を含む、請求項５３の抗体。
  56. 重鎖可変領域をさらに含む、請求項５３の抗体。
  57. （ａ）配列番号３に示すＣＤＲ１領域；
    （ｂ）配列番号４に示すＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列番号５に示すＣＤＲ３領域
    を含む重鎖可変領域をさらに含む、請求項５５の抗体。
  58. 重鎖可変領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項５７の抗体。
  59. 軽鎖可変領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項５７の抗体。
  60. 重鎖可変領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項５９の抗体。
  61. 重鎖が配列番号１１に示すアミノ酸配列を含み；そして軽鎖が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む、請求項６０の抗体。
  62. 損なわれたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む、請求項４９の抗体。
  63. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化されていないか、または天然Ｆｃ領域に対して改変されたＮグリコシル化パターンを有する、請求項６２の抗体。
  64. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化認識配列内に突然変異を含み、これによってＦｃ領域がＮグリコシル化されない、請求項６２の抗体。
  65. 抗体のＦｃ領域が、３３０位でアラニンからセリンへのアミノ酸突然変異を、そして３３１位でプロリンからセリンへのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸位が、ヒト野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するＫａｂａｔ番号付けに基づく、請求項６２の抗体。
  66. 損なわれたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む、請求項５３の抗体。
  67. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化されていないか、または天然Ｆｃ領域に対して改変されたＮグリコシル化パターンを有する、請求項６６の抗体。
  68. 抗体のＦｃ領域が、Ｎグリコシル化認識配列内に突然変異を含み、これによってＦｃ領域がＮグリコシル化されない、請求項６６の抗体。
  69. 抗体のＦｃ領域が、３３０位でアラニンからセリンへのアミノ酸突然変異を、そして３３１位でプロリンからセリンへのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸位が、ヒト野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠するＫａｂａｔ番号付けに基づく、請求項６６の抗体。
  70. 請求項４９〜６９のいずれかの抗体をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
  71. 請求項７０のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  72. 請求項７０のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  73. （ａ）請求項４９〜６９のいずれかの抗体、および（ｂ）薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物。
  74. 請求項４９〜６９のいずれかの抗体を含む、キット。
  75. Ａβペプチドに特異的に結合する抗体を作成する方法であって、抗体が産生される条件下で、請求項７０のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  76. 産生された抗体を単離することをさらに含む、請求項７５の方法。
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