JP4041535B2 - 標的細胞にベクター構造体を運搬する組換レトロウィルス - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は一般的にレトロウイルスに関し、より詳しくは、感受性標的細胞にベクター構造体を運搬可能な組換レトロウイルスに関する。これらのベクター構造体は標的細胞において所望するタンパク質、例えば免疫活性を刺激せしめるタンパク質又は一定の細胞環境において条件的に活性であるタンパク質を発現せしめるために典型的にデザインされている。このような観点において、該ベクター構造物を有するレトロウイルスは標的細胞に対して免疫又は毒性反応を誘導せしめることが可能である。
発明の背景
細菌性の疾病が一般的に抗生物質により容易に治療できるにもかかわらず、多数のウイルス性、癌性及び遺伝性疾病を含むその他の非細菌性疾病のための有効な治療又は予防的測定を非常にわずかしか存在しない。このような疾病を治療する古典的な試みは化学薬剤の利用を採用してきた。一般に、このような薬剤は特異性がなく、全体的に高い毒性を示し、それ故治療には有効ではなかった。
多数の非細菌性疾病を治療するためのその他の古典的な技術は、病原性物質、例えばウイルスに対する免疫応答を、該物質の非感染的な形、例えば殺傷せしめたウイルスの形の投与を介して誘発せしめ、これによって免疫刺激剤として働くであろう、該病原性物質に由来する抗原を提供すること、を含む。
ウイルス性疾病、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連する疾患の治療のためのより最近の手法には、ＨＩＶによる感染に感受性の細胞上のリセプターが、ウイルスエンベロープタンパク質を受容せしめること又はそれらと複合体を形成せしめることをブロックすることを含む。例えばLifsonら（Sicence 232:1123-1127,1986）は、ＣＤ４（Ｔ４）リセプターに対する抗体がインビトロにおいて、感染された及び感染されていないＣＤ４含有細胞との間の細胞融合（シンシチア）を阻止することを示した。モノクローナル抗体を利用する類似のＣＤ４ブロッキング効果がMcDougalらにより提案されている（Science 231:382-385,1986）。他方、Pertら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9254-9258,1986）は、Ｔ４リセプターに結合し、そしてヒトＴ−細胞のＨＩＶ感染をブロックせしめる合成ペプチドの利用を報告し、そしてLifsonら（J.Exp.Med. 164:2101,1986）は、シンシチア及びウイルス／Ｔ４細胞の両方を、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質と相互作用するレクチンによってブロックせしめ、これによりそれらがＣＤ４リセプターにより受容されることをブロックせしめることを報告している。
病原性物質、例えばＲＮＡを転写するウイルスを阻害する近年提案されている第４の技術は、転写されたＲＮＡの少なくとも一部に相補し、そしてこれに結合して翻訳を阻止するアンチセンスＲＮＡを提供することである（Toら、Mol.Cell.Biol. ６：758,1986）。
しかしながら、上記の技術の主たる欠点は、即ち、それらが時間、位置又は薬剤、抗原、ブロッキング剤もしくはアンチセンスＲＮＡを利用せしめる程度をコントロールするのに容易でないことにある。特に、上記の技術は治療薬の外因性適用（即ち、インビトロ状態において、サンプルに対して外因性）を必要とするため、それらは病原性物質の存在に対して直接的に応答しない。例えば、この病原性物質により感染された直後に高い量において発現される免疫刺激物質が所望されている。更に、アンチセンスＲＮＡの場合、動物における有用な治療のためには大量に必要とされるであろう。現在の技術のもとでは、それを実際に必要とする部分、即ち、病原性物質によって感染された細胞に無関係に投与されうる。
外因性適用に対して、内因的な治療薬を提供するための技術が考えられている。より詳しくは、ＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、シミアンウイルス４０、ウシパピロマ及びワクチンウイルスに基づくウイルス性ベクターから発現されるタンパク質が研究されている。例えばPanicaliら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：5364,1983）は、インフレンザウイルス血液凝集素及びＢ型肝炎ウイルス表層抗原をワクチンゲノムに導入せしめ、そしてこのような組換遺伝子から作製したウイルス粒子を動物に感染せしめている。感染の後、この動物はワクチンウイルス及びＢ型肝炎ウイルス抗原の両方に対する免疫を獲得した。
しかしながら、ＤＮＡウイルスに基づくウイルスベクターによる多数の困難性を今日迄経験している。このような困難性には、（ａ）病原性又は所望するタンパク質の抑制をもたしうるその他のウイルス性タンパク質の製造；（ｂ）宿主において非調節的に複製を行うベクターの能力及びこのような非調節的複製の病原性効果；（ｃ）ウイルス血症をもたらしうる野性型ウイルスの存在；並びに（ｄ）これらの系における発現の一過性、を含む。このような困難性はウイルス性、癌性及び遺伝的疾病を含むその他の非細菌性疾病の治療における、ＤＮＡウイルスに基づくウイルス性ベクターの利用を妨害する。
感染標的細胞における一過性でないこれらの発現に基づき、レトロウイルスは遺伝病の治療のための有用な媒体として考えられている（例えば、F.Ledley, The Journal of Pediatrics 110：１，1987、参照）。しかしながら、多数の問題点の見地のため、遺伝病の治療におけるレトロウイルスの利用は試みられていなかった。このような問題点は、（ａ）受け入れにくい組織（例えば脳）における大量の細胞を感染せしめるための明白な必要性；（ｂ）非常に調節された且つ永久的な状態においてこれらのベクターが発現することを引き起こす必要性；（ｃ）クローン化遺伝子の欠失；（ｄ）代謝異常に起因する組織及び器管への不可逆的な損傷；及び（ｅ）ある場合におけるその他の部分的に有効な治療の利用性に関する。
遺伝病に加えて、その他の研究者は非遺伝的疾病を治療するためのレトロウイルスベクターの利用を考えた（例えば、ヨーロッパ特許EP 243,204号-Cetus Corporation ; SanfordのJ.Theor.Biol. 130:469,1989;TellierらのNature 318:414,1985;及びBolognesiらCancer Res. 45:4700,1985、を参照のこと）。
Tellierらは、ＨＩＶ ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現できるゲノムを有す「欠陥」ＨＩＶにより幹細胞を有効に感染せしめることによって、Ｔ−細胞クローンを保護することを考えた。Bolognesiらは、幹細胞に感染せしめるための無毒性のＨＩＶ株を作製し、これによって発生したＴ４細胞が干渉するウイルスの無毒性の型を有し、従ってこれらの細胞を毒性ＨＩＶによる感染から防御せしめる概念を考えた。しかしながら、上記の論文両方において利用されている「減衰（attenuation）」又は「欠陥」ＨＩＶは再生され（即ち、複製欠陥ではない）、従ってもたらされるウイルスは既に存在しているＨＩＶを有す高い組換の危険性又はその他の追随する危険性を伴って、他の細胞に感染することがあり、減衰の損失をもたらしうる。非複製型でなくなることは、ＨＩＶのための欠陥ヘルパー又はパッケージングラインの必要性をもたらしうる。しかしながら、ＨＩＶ遺伝子の発現性の調節は困難であるため、このような細胞は今日迄作製されていない。更に、感染せしめる減衰又は欠陥ウイルスはキメラでないため（同一のレトロウイルス種に由来する実質的に全てのベクターを有す「非キメラ」レトロウイルス）、たとえそれらをそれらのゲノムから本質的な要素を欠損せしめることにより複製欠陥として作ったとしても、感染性ウイルス粒子の結果として製造に伴う、宿主細胞における組換の可能性が未だ明らかに存在する。
Sanford（J.Theor.Biol. 130:469,1988）はまた、ＨＩＶについての遺伝子的な治療の利用も考え出した。彼は、天然のＡＩＤＳウイルスと、抗−ＨＩＶ遺伝子を有す治療用レトロウイルスベクターとの遺伝子組換を介する新規な毒性ウイルスに存在する能力に原因して、ＡＩＤＳのためのレトロウイルス遺伝子治療は実用的でないであろうと述べている。同様に、McCormickとKriegler（ヨーロッパ特許243,204 A2号）は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなタンパク質についての遺伝子を運搬するためのレトロウイルスベクターを利用することを考えたが、彼らが詳述する技術は多数の欠点を有する。
発明の概略
簡潔に述べると、本発明は、感染性、癌性、自己免疫性又は免疫性疾病を予防、阻止、安定化又は回復せしめることが可能なベクター構造体を有する組換レトロウイルスを提供する。このような疾病には、感染症、黒色症、糖尿病、移植細胞対宿主病、アルツハイマー病及び心臓病を含む。
本発明はある程度、組換レトロウイルスの利用を介して、（ａ）抗原もしくは病原性抗原に対する、体液性又は細胞中介性のいづれかである特異的な免疫応答を刺激せしめ；（ｂ）病原性物質例えばウイルスの機能を阻害せしめ；そして（ｃ）物質と宿主リセプターとの相互作用を阻害せしめる方法に関する。
より詳しくは、本発明の１つの態様において、感受性標的細胞を、組換レトロウイルスであって該標的細胞において抗原又はその改質された型の発現をもたらすベクター構造体を有するものにより感染せしめることを含んで成る、特異的な免疫応答を刺激せしめる方法を提供する。本発明の目的のため、「感染」なる語は、ウイルスベクター、トランスフェクション又はその他の手段、例えばマイクロインジェクション、プロトプラスト融合等を介しての核酸配列の導入を含む。この導入せしめた核酸配列は該標的細胞の核酸の中に組込まれうる。このベクターの核酸がコードするタンパク質の発現は、一過性であるか又は時間に安定でありうる。免疫応答が病原性抗原に対して誘発されるものである場合、この組換レトロウイルスは、免疫応答を刺激し且つ天然の抗原よりも低められた病原性を有す抗原の改良型を発現せしめるように好適にデザインされている。この免疫応答性は細胞が抗原を正常な状態において提供する場合、即ち、ＭＨＣクラスＩ及び／もしくはII分子に関するアクセサリー分子例えばＣＤ３，ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＬＦＡ−１又はその類似体を伴う場合に達成される（例えば、Altmannら、Nature 338:512,1989）。レトロウイルスベクターにより感染された細胞はその有効性が期待され、なぜならそれらは真のウイルス感染によく擬態するからである。
本発明のこの観点は、同様の方法において働くものと期待されているその他の系よりも更なる利点を有し、即ち、該提供細胞は完全に生育可能且つ健状であり、そして何らその他のウイルス性抗原（イムノドミナントでありうるもの）を発現せしめない。このことは、明確な利点を提供し、その理由は、発現される抗原性エピトープが、該組換レトロウイルスの中への該抗原についての遺伝子のサブフラグメントの選択的なクローニングにより変化されることができ、これによってイムノドミナントエピトープにより減少することがある、免疫原エピトープに対する応答をもたらしうる。このような手法は、複数のエピトープ（１又は複数のエピトープは異なるタンパク質に由来する）を有するペプチドの発現性に迄及ぶことができうる。更に、本発明のこの観点は、ＭＨＣクラスＩ分子を有するこれらのペプチドフラグメントの細胞内合成及び組立てを介して、抗原エピトープ、及び遺伝子のサブフラグメントによりコード化される抗原のペプチドフラグメントに特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の有効な刺激が可能である。この手法はＣＴＬのための主要なイムノドミナントエピトープを地図化するのに利用されうる。更に本発明は、抗原提供細胞において提供されるアクセサリータンパク質（例えば、ＭＨＣＩ，ＩＣＡＭ−１等）の発現の増大又は改良を介して、抗原のより有効的な提供について提供する。このような手法は、Ｔリンパ球に有効な抗原（又はその一部）を提供することができる、抗原（例えば腫瘍抗原）及びＭＨＣタンパク質（例えばクラスＩもしくはII）両方の発現性をもたらすベクター構造体を有す組換レトロウイルスを包含しうる。このことは、低レベルのＭＨＣタンパク質及び免疫応答を刺激せしめる低い能力を有す細胞（例えば腫瘍細胞）において、抗原の提供が増大される利点をもたらしうる。この手法は、抗原及びタンパク質であって細胞においてＭＨＣタンパク質の高い発現性を誘発するもの（例えばインターフェロン）の両方の発現をもたらすベクター構造体を有す組換レトロウイルスを更に含みうる。このレトロウイルスの感染された細胞は免疫刺激剤（イムノスチムレーター）、イムノモジュレーター又はワクチン等に利用されうる。
免疫応答は適切な免疫細胞（例えばＴリンパ球）に、対象の抗原（必要ならば適当なＭＨＣ分子に関する）を認識する特異的Ｔ−細胞リセプターについての遺伝子、対象の抗原を認識するイムノグロブリンについての遺伝子、又はＭＨＣ関係の非存下においてＣＴＬ応答を提供するこの二種のハイブリドについての遺伝子を導入せしめることによっても達成されうる。
免疫刺激を所望する、ＨＩＶ感染により引き起こされた疾病の特定の場合において、この組換レトロウイルスゲノムから作られた抗原は、ＨＬＡクラスＩ−もしくはクラスII−制御免疫応答のいづれか又は両方を誘発するであろう型にある。ＨＩＶエンベレロープ抗原の場合において、例えば、この抗原はｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１から好適に選ばれる。それらは、その病原性が低められるように改良されたものである。特に、選んだ抗原は、シンシチアの可能性を下げるため、免疫応答性を高める疾病をもたらすエピトープの発現を回避するため、イムノドミナントを除去するため、しかしながら株−特異性エピトープ又は複数の株−特異性エピトープを提供せしめ、そしてＨＩＶのほとんどもしくは全ての株による細胞の感染をなくすことができる応答性のために改良される。この系−特異性エピトープは、動物における免疫応答性の刺激を促進せしめるために更に選別されうる（これらはＨＩＶのその他の株に交差反応性である）。その他のＨＩＶ遺伝子又は遺伝子の組合せ、例えばｇａｇ，ｐｏｌ，ｒｅｖ，ｖｉｆ，ｎｅｆ，ｐｒｏｔ，ｇａｇｐｏｌ，ｇａｇｐｒｏｔ、等も特定の場合において予防を提供せしめうる。
本発明の他の観点において、ウイルス性感染症、癌又は免疫異常により引き起こされるような疾病に必要な、病原性物質の機能を阻害せしめる方法を開示する。病原性物質がウイルスの場合、阻害される機能は、吸着、複製、遺伝子発現、集成、及び感染細胞からの該ウイルスの退出より成る群から選ばれうる。この病原性物質が癌細胞又は癌−促進成長因子の場合、この阻害される機能はその生存、細胞複製、外部信号に対する感受性の変化、及び抗−オンコジーンの製造の欠失又は抗−オンコジーンの突然変異型の製造より成る群から選ばれうる。このような阻害は、「阻害緩和剤」例えば（ａ）アンチセンスＲＮＡ；（ｂ）病原性の状態の発現を妨害する、病原性タンパク質に類似する突然変異タンパク質；（ｃ）不活性な先駆体を活性化せしめるタンパク質；（ｄ）欠陥干渉構造タンパク質；（ｅ）ウイルスプロテアーゼもしくは酵素のペプチド阻害剤；（ｆ）腫瘍サップレッサー遺伝子；又は（ｇ）病原性状態に関連するＲＮＡ分子を特異的に切断及び分解できるＲＮＡリボザイム；を有する組換レトロウイルスを介して提供されうる。他方、このような阻害は、病原性遺伝子の中に位置特異的に一体化することによってそれを分裂することができる組換レトロウイルスにより達成される。
このような阻害は、疾病を及ぼす細胞に毒性である緩和物の発現を介して達成されることもできる。毒性緩和物がこの組換ウイルスゲノムを含む細胞によって製造される場合、重要なことはこの組換レトロウイルスが標的細胞にのみ感染するのか、もしくは標的細胞においてのみこの緩和物が発現されるかのいづれであるか、又はその両方であるかである。いづれの場合においても、この最終毒性物は病原性状態において細胞に局在する。発現性を標的にする場合、この毒性緩和物の発現性をコントロールする病原性物質は、例えば細胞に存在する病原性ウイルスゲノムの転写及び翻訳を介して製造されるタンパク質である。
本明細書全体において、細胞において任意の物質を「発現する」又は「製造」するウイルス構造体等と表現する場合、このことは事実上、該細胞におけるウイルスＲＮＡの逆転写に引き続いて得られるプロウイルスの作用に関連することと理解されるべきである。毒性緩和物に関して、結果として起こる殺傷作用は宿主ゲノムの中への組換ウイルスゲノムの永久的な一体化を必ずしも必要としないが、ある程度長期的な時間（数日から１ケ月）にわたって所望する形における毒性緩和物遺伝子のある程度長期的な発現は必要である。従って、その他の一体化されていないウイルス性ベクター、例えばアデノウイルスベクター（但しこれに限定しない）が本目的のために利用されうる。条件により毒性の緩和物の例には、（ａ）細胞周期−特異性プロモーター、組織特異的プロモーター又はその両方のコントロール下の毒性遺伝子生成物；（ｂ）条件的に発現し、そしてそれ自体は毒性ではないが標的細胞内で非毒素先駆体を活性化毒素型へと化合物又は薬剤をプロセスせしめる遺伝子生成物；（ｃ）それ自体は毒性ではないが、タンパク質例えばウイルス性又はその他の病原に対して特異的なプロテアーゼによって処理された場合に毒素型へと変換する遺伝子生成物；（ｄ）例えば免疫毒素による攻撃に対して病原性細胞を識別する細胞表層上の条件的に発現されるリポーター遺伝子生成物；（ｅ）細胞外因子との相互作用による毒性効果をもたらす、細胞表層上の条件的に発現される遺伝子生成物；及び（ｆ）生存のために重要なＲＮＡ分子に特異的な条件的に発現されるリボザイムをコード化する組換レトロウイルスを含む。
関連する観点において、本発明は望ましくない又は有害な免疫応答を削減もしくは削除するための方法も提供する。免疫抑制（必要な場合）は免疫抑制遺伝子、例えばウイルスに由来する、アデノウイルスのＥ３遺伝子の発現を標的にすることによって達成されうる。
本発明の他の観点において、ウイルス粒子と細胞、細胞と細胞、又は細胞と因子の相互作用を阻害する方法を開示する。
この方法は一般に、組換複製欠陥レトロウイルスであって感染細胞にブロッキング要素の発現をもたらすものを感受性細胞に感染せしめることを含んで成り、該ブロッキング要素は、細胞のリセプター（好ましくは宿主細胞リセプター）に、そのリセプターが細胞内もしくは細胞表層上のいづれであろうと結合できるか、又は一方該病原性物質と結合することによって結合できる。
前記した該組換レトロウイルスが及ぼす免疫原又は阻害的な作用による方法にもかかわらず、該レトロウイルスゲノムが「複製欠陥」（即ち、これにより感染された細胞において再生できない）となることが好適である。従って、インビトロ又はインビボ適用のいづれにおいても感染は単一段階のみであり、これにより挿入性の突然変異の可能性は実質的に低められるであろう。好ましくはこれに加えて、該組換レトロウイルスはｇａｇ，ｐｏｌ又はｅｎｖ遺伝子の少なくとも１つを欠損する。更に、該組換ウイルスベクターはキメラであることが好ましい（即ち、所望する結果を提供する該遺伝子は該レトロウイルスの残余物以外の起源に由来する）。キメラ構造体は、ウイルス粒子を発生できるゲノムを製造できる、該組換レトロウイルスにより感染された細胞内における組換現象の可能性を更に引き下げる。
本発明の他の態様において、上記の方法の実施及びその他の治療的な遺伝子を運搬するのに有用な組換レトロウイルスを開示する。本発明はこのようなレトロウイルスを製造するための方法も提供し、ここで該レトロウイルスゲノムはパッケージング細胞の利用にわたり、好ましくはカプシド及びエンベロープにパッケージされている。該パッケージング細胞には、好ましくは２種のプラスミドの形においてウイルスタンパク質コード化配列が提供されており、これらは生存できるレトロウイルス粒子の製造に必要な全てタンパク質、所望する遺伝子及びパッケージングシグナル（該ＲＮＡをレトロウイルス粒子へとパッケージングせしめることをもたらす）を有するであろうＲＮＡウイルス構造体を提供せしめる。
本発明は以下の事項を促進できる組換レトロウイルスを製造するための多数の技術を更に提供する。
ｉ）パーケージング細胞に由来する高力価の提供、
ii）パッケージング細胞の利用を含まない手段によるベクター構造体のパッケージング、
iii）予備選択した細胞系のために選ぶ組換レトロウイルスの製造、
iv）組織特異性（例えば腫瘍）プロモーターを有するレトロウイルスベクターの作製、及び
ｖ）プロウイルス構造体の、細胞ゲノムにおける予備選択した位置又は複数の位置の中への一体化。
パッケージング細胞からより高い力価を提供するための１つの技術は我々の発見を利用しパッケージング細胞由来の力価を制限する多数の因子の中で、最も制限されるものはパッケージングタンパク質、一般にはｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質の発現レベル及びプロウイルスベクター由来のレトロウイルスベクターＲＮＡの発現レベルである。この技術は前記のパッケージングタンパク質及びベクター構造体ＲＮＡのより高い発現レベル（即ち、より高濃度の製造）を有するパッケージング細胞の選別を可能とする。より詳しくは、この技術は、パッケージングタンパク質（例えば、ｇａｇ，ｐｏｌもしくはｅｎｖタンパク質）又は標的細胞のゲノムの中に運搬される対象の遺伝子（一般にはベクター構造体として）のいづれかである、本明細書で「プライマリー物質」として称されているものを高いレベルで製造するパッケージング細胞の選別を可能にする。このことは、パッケージング細胞に、該パッケージング細胞においてプライマリー物質を発現せしめる遺伝子（「プライマリー遺伝子」）を運ぶゲノム及び選別可能な遺伝子（好ましくはプライマリー遺伝子の下流）を提供せしめることにより達成される。この選別可能な遺伝子は該パッケージング細胞に選別可能なタンパク質、好ましくはその他の細胞毒素性薬剤に対する耐性をもたらすものを発現させる。次に該細胞を選別薬剤、好ましくは細胞毒性薬剤に暴露せしめ、臨界レベルで選別可能なタンパク質を発現するこれらの細胞の同定を可能にする（即ち、細胞毒性薬剤の場合においては、生存のために必要なレベルの耐性タンパク質を製造しない細胞を殺傷することによる）。
好ましくは、簡潔に上記した技術において、選別可能及びプライマリー遺伝子の両方の発現は同一のプロモーターによりコントロールされている。この観点において、レトロウイルス５′ＬＴＲを利用することが好ましいであろう。パッケージング細胞に再来する組換レトロウイルスの力価を最大にするため、この技術はまず必要とする全てのパッケージングタンパク質を高レベルで発現するパッケージング細胞の選別に用いられ、次に該組換レトロウイルスの最も高い力価を提供する、所望するプロウイルス構造体によりトランスフェクションされた後のこれらの細胞の選別に用いられる。
パッケージング細胞の利用を含まない手段による、ベクター構造体のパッケージングについての技術も提供する。このような技術は、その他の無関係なレトロウイルス、バクロウイルス、アデノウイルス又はワクチンウイルス、好ましくはアデノウイルスのようなウイルスに基づくその他のベクター系を利用する。これらのウイルスは、それに提供される外因性遺伝子に由来する比較的高レベルのタンパク質を発現することで知られる。このようなＤＮＡウイルスベクターのため、組換ＤＮＡウイルスは組織培養における、ウイルスＤＮＡとレトロウイルス又はレトロウイルスベクター遺伝子を有するプラスミドとのインビボ組換により製造できる。レトロウイルスタンパク質又はレトロウイルスベクターＲＮＡについてコード化する配列のいづれかを有す、得られるＤＮＡウイルスベクターを高力価ストックへと精製する。他方、該構造体をインビトロで作製し、そしてその後細胞に感染せしめることができ、これは該ＤＮＡベクターのトランスウイルス機能を失わせる。この製造方法にもかかわらず、高力価（１０7〜１０11ユニット／ml）ストックが製造されることができ、これは感受性細胞の感染に基づき、高レベルのレトロウイルスタンパク質（例えばｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ）もしくはＲＮＡレトロウイルスゲノム、又はその両方の発現を引き起こすであろう。これらのストック（単一又は組合せた）との培養における細胞の感染は、もしこのストックがウイルスタンパク質及びウイルスベクター遺伝子を運ぶならば、高レベルのレトロウイルスベクターの提供をもたらすであろう。これらの技術は、アデノウイルス又はその他の哺乳動物ベクターと利用した場合、組換レトロウイルスベクターを製造するためプライマリー細胞（例えば、組織外植片又はワクチンの製造において利用されるＷＩ３８の細胞）の利用を可能にする。
上記の技術の他においては、適当な組換ＤＮＡウイルスにより感染せしめた細胞系に由来するｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質を、先の技術と類似する方法ではあるが、但し該細胞系がベクター構造を有すＤＮＡウイルスにより感染されていない方法においてまず作製することによって提供される。その後、該タンパク質を精製し、そしてインビトロで作製した所望のウイルスベクターＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リポソーム及び細胞抽出物を接触せしめて該ｅｎｖタンパク質がリポソーム中でプロセスされるようにし、これによって該ウイルスベクターＲＮＡを有す組換レトロウイルスが提供される。この技術において、ｅｎｖタンパク質をリポソーム中でプロセスせしめることは、それらを前記の混合物の残りのものと接触させる前に行うことが必要である。ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質は、真核細胞、酵母又は細菌におけるプラスミド中介トランスフェクションの後にも作られうる。
予備選定した細胞を標的とできる組換レトロウイルスを製造するための技術は、１もしくは複数の以下のものを有する組換レトロウイルスを利用する：
第１レトロウイルス表現型の細胞質セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝子、及び該第１レトロウイルス表現に外因性の細胞外結合セグメント（この結合セグメントは第２ウイルス表現型又はその他のタンパク質であって所望の結合特性を有するものに由来し、これは所望の標的に結合できうるペプチドとして発現されるよう選択される）；その他のウイルスエンベロープタンパク質；正常エンベロープタンパク質に代るその他のリガンド分子；あるいは該標的細胞への感染をもたらさないエンベロープタンパク質を伴うその他のリガンド分子。好ましくは、簡潔に述べた上記の技術において、レトロウイルス表現型の細胞質セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝子をリセプター−結合ドメインを有すタンパク質をコード化する外因性遺伝子と結合させ、該組換レトロウイルスが標的とする細胞タイプ、例えば腫瘍細胞に特異的に結合する能力を高めている。この観点において、該標的細胞の表層上に高レベルで発現されるリセプター（例えば、腫瘍細胞における成長因子リセプター）に結合するリセプター−結合性ドメイン、又は他に、ある組織細胞タイプ（例えば脳腫瘍における上皮細胞、管上皮細胞、等）において比較的高レベルで発現されるリセプターに結合するリセプター−結合性ドメインを好適に利用しうる。この技術において、一定の腫瘍に対する特異性を有す組換レトロウイルスを、腫瘍細胞における組換レトロウイルスの複製の反復継代により、又は該ベクター構造体を薬剤耐性遺伝子と連結せしめ、そして薬剤耐性について選別することにより、改良並びに遺伝子的に変化せしめることが可能である。
組織（例えば腫瘍）−特異性プロモーターを有すレトロウイルスベクターの作製のための技術は、対象の組織において作動する制御コントロール要素（例えば網状赤血球において発現性をもたらす骨髄におけるベクターグロブリン遺伝子プロモーター、Ｂ細胞におけるイムノグロブリンプロモーター、他）；組織−特異性制御コントロール要素であって、該コントロール要素が作動する標的細胞において致死剤をコード化する遺伝子の発現性を誘発することができるもの；を有す組換レトロウイルスを利用する。異なる組織における該制御コントロール要素の作動性は、この技術において利用するのに特定組織に対して絶体−特異性であることは必ずしも必要でなく、なぜなら、作動性における量的な相違は実質的なレベルの組織特異性を、該要素のコントロール下にある該薬剤の致死性に授けるのに十分であるからである。
レトロウイルスゲノムを標的細胞のＤＮＡにおける特定の位置に組入れることは、相同的組換の利用、又は他に該標的細胞ゲノムにおける特異的な位置を認識するであろう改質せしめたインテグラーザ酵素の利用を包含する。このような位置−特異的挿入は、標的細胞におけるＤＮＡにおいて、望ましくない遺伝子（例えばウイルス遺伝子）の発現性を低める又はなくすよう、挿入的突然変異誘発の確率を最小にし、該ＤＮＡ上のその他の配列への干渉を最小にし、そして特定の標的位置で配列の挿入を可能にせしめうる、該標的細胞のＤＮＡ上の位置への遺伝子の挿入を可能にする。
上記の技術のいづれもが特定の状況において、他と独立して利用できること、又は１もしくは複数のその他の技術と一緒に利用できることが理解されるであろう。
本発明のこれらの観点及び地の観点は、以降の詳細なる説明及び添付図面を参照することによって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＩＶ ｅｎｖを製造するために利用する３種のベクターを図解し、そしてそれらは挿入された選別を可能とするＳＶ−Ｎｅｏカセットを有すか有さない。
図２は、示すベクターにより感染されたヒトＳｕｐＴ１細胞の抽出物の、ＨＩＶ ｅｎｖ−特異的放射性免疫沈殿物のポリアクリルアミド電気泳動において見られるＨＩＶ ｅｎｖ発現性レベルを図示する。マーカーはキロダルトン単位であり、ｇｐ１６０及びｇｐ１２０は適切なタンパク質を示し、そして５１７＋ｔａｔは陽性コントロールである（ｔａｔの存在下においてｅｎｖを作動せしめるＨＩＶ ＬＴＲ）。
図３は、ＨＩＶ ｅｎｖを発現する同系の腫瘍細胞の注入されたマウスにおいて誘発されるＴ−細胞殺傷を試験するプロトコールを示す（このベクターはｐＡＦ／Ｅｎｖr／ＳＶ２ｎｅｏである）。
図４Ａは図３における実験方法の結果を図解する。特異的な殺傷は、上方のグラフにおける殺傷されるＢＣ１０ＭＥｅｎｖ−２９に見られ、しかしＨＩＶ ｅｎｖ−発現性の欠損するＢ／Ｃ１０ＭＥコントロール細胞では見られなかった。
図４ＢはＨＩＶエンベロープ抗原に対するＣＴＬの特異性を示す。
図４Ｃは、図３の実験方法において発生するエフェクター細胞集団の表現型を示す。このエフェクター細胞集団はＬ３Ｔ４-ｌｙｔ２+（ＣＤ４-ＣＤ８+）Ｔリンパ球のそれである。
図４Ｄは、Ｂａｌｂ／ｃ抗−ＢｃｅｎｖＣＴＬ応答のためのＭＨＣ制限要件を示す。
図４Ｅは、ＣＴＬが照射を受けた非増殖スチムレーター細胞により、インビボで誘発されることを示す。
図４Ｃは、ＢＣｅｎｖスチムレーター細胞によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫の、投与量−応答性の関係を示す。
図４Ｇは、ＢＣｅｎｖ標的細胞に対する、異なるＨ−２dマウス種及びＦ１ハイブリドマウスのＣＴＬ応答性の発生を示す。
図４Ｈは、ウイルスのＨＩＶIIIＢ株のエンベロープに（Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ）に対して誘発されたＣＴＬが、ＨＩＶｅｎｖ−発現性標的細胞、及び非−標的Ｂ／Ｃ１０ＭＥ細胞（ＢＣ）であってもしそれらがウイルス（ＲＰ１３５）のＨＩＶIIIＢ株に類似のペプチドにより被覆されているならば殺傷されることを示す。この結果は、これらＣＴＬが交差反応して、ＨＩＶのＭＮ株のエンベロープ（ＲＰ１４２）と類似のペプチドにより被覆されたいくつかの細胞を殺傷せしめることも示す。
図４Ｉは、組換ベクター構造体であってそのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターがＨＩＶIIIｂエンベロープの一過性発現をもたらすものを有するプラスミドＤＮＡにより感染せしめたＢＣ細胞１０7個の腹膜腔内注射の後の、ＨＩＶエンベロープ特異性ネズミＣＴＬ（Ｅｎｖ−特異的−ＣＴＬ）の誘発を示す。これは、ＨＩＶ ｅｎｖを一過性発現せしめるＢＣｐＣＭＶｅｎｖIIIｂ標的細胞（ＢＣｐＣＭＶｅｎｖIIIｂ標的）及びクローン化安的−ＨＩＶ ｅｎｖ発現性ＢＣ２９標的細胞（ＢＣ２９標的）を特異的に殺傷せしめるが、非感染化ＢＣ細胞（ＢＣ１０ＭＥ標的）は殺傷せしめないＣＴＬの特異性により証明される。
図４Ｊは、Ｃｍｖ又はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターのコントロール下でそれぞれＨ２−Ｄｄをコード化するＣＭＶＨ２−Ｄｄ又はＲＳＶ−Ｄｄの導入により、利用する２日前に感染せしめたネズミＢＣ標的細胞が、Ｂａｌｂ／ｃ細胞（Ｈ２−Ｄｄ）に免疫化されたＣ５７ＢＬ１６幽閉ＣＴＬ（Ｃ５７ＢＬ１６ｍｕｒｉｎｇ ＣＴＬ）により殺傷される標的細胞として働くことを示す。
図４Ｋは、図３のそれと類似の実験プロトコールの結果を図示し、ここでは、マウスはＨＩＶを発現する細胞の代りにｇａｇ／ｐｏｌ（ＢＣ−１−１６Ｈ）又はｇａｇ／ｐｒｏｔ（ＢＣ−１）を発現する細胞を注射されている。ｇａｇ／ｐｏｌ又はｇａｇ／ｐｒｏｔ免疫化マウスに由来するＣＴＬはそれぞれの標的細胞、ＢＣ−１又はＢＣ−１−１６Ｈ標的細胞のそれぞれを殺傷せしめたが、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ細胞は殺傷せしめなかった。
図４Ｌは、ｇａｇ／ｐｏｌスチムレーター細胞（ＢＣ−１−１５Ｈ；１−１５Ｈと表示）により誘発されるＣＴＬがｇａｇ／ｐｏｌ（１−１５Ｈ）及びｇａｇ／ｐｒｏｔ（ＢＣ−１）標的細胞の両方を殺傷せしめることを示す。
図４Ｍは、ｇａｇ／ｐｒｏｔスチムレーター細胞（ＢＣ−１）により誘発されるＣＴＬが、ｇａｇ／ｐｒｏｔ（ＢＣ−１）及びｇａｇ／ｐｏｌ（１−１５Ｈ）標的細胞の両方を殺傷せしめることを示す。
図４Ｎは、腹膜腔内注射（Ｉ．Ｐ．）又は筋肉内注射（Ｉ．Ｍ．）による二通り（２Ｘ）のＨＩＶコード化レトロウイルスの直接注射が、ＢＣ１０ＭＥｅｎｖ−２９細胞は殺傷するがＢ／Ｃ１０ＭＥコントロール細胞（ＢＣ）は殺傷しない特異的な殺傷の可能なＣＴＬの発生を刺激せしめた。
図４Ｏはヒト提供者＃９９ＰＢＬのインビトロ免疫を示す。これは９９−ＥＢＶ−ＨＩＶ ｅｎｖ標的細胞は殺傷するが陰性コントロール自己細胞、即ち、ＰＢＬにより刺激された９９−ＰＨＡ（９９ＰＨＡ芽細胞）は殺傷しないＣＴＬの誘発を及ぼすために、ＨＩＶ ｅｎｖをコード化する組換レトロウイルスベクター（９９−ＥＢＬ−ＨＩＶｅｎｖ）によりインビトロ感染された提供者＃９９（９９−ＥＢＶ）由来の自己ＥＢＶ−形質転換スチムレーター細胞を利用している。提供者＃９９はＥＢＶに対する天然免疫を発現し、これは陽性コントロール９９−ＥＢＶ標的細胞の低レベル殺傷により証明される。
図Ｐは、ネズミＭＨＣＨ2−Ｄｄ及びＨＩＶ ｅｎｖ抗原（ＨＴ１０８０＋Ｄｄ＋ｅｎｖ）の両方により感染されたヒトＨＴ１０８０細胞が、両方の遺伝子生成物を機能的活性型において発現することを示す。これはＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ネズミＣＴＬによるこれらの細胞溶解によって証明される。これらＨＩＶ ｅｎｖ免疫ＣＴＬはコントロールＨＴ１０８０（ＨＴ１０８０）細胞又はＨ２−Ｄｄ発現ＢＣ細胞（ＢＣ−Ｄｄ）のいづれの有意な溶解を引き起こさなかった。
図４Ｑは、ＨＩＶエンベロープタンパク質発現性ＢＣ細胞（ＢＣｅｎｖIIIｂ）及びＲＰ１３５「Ｖ３ループ」（「ループ」）合成ペプチドにより被覆されたＢＣ細胞の、ＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ＣＴＬによる溶解をパネルＡにおいて示し；パネルＢにおいては、「ル−プレス」ＢＣｅｎｖΔＶ３細胞により免疫されたＣＴＬによる、ｇｐ１２０超可変性エンベロープループ（即ち、ループレス）を欠くＢＣｅｎｖΔＶ３細胞の溶解を示す。「ループレス」ＢＣｅｎｖΔＶ３により免疫されたＣＴＬは特異的、即ち、それらはＨＩＶｅｎｖを欠くＢＣ細胞を溶解せず（ＢＣ）、そしてそれらは「ループ」ＲＰ１３５ペプチドにより被覆された細胞を溶解しなかった（ＢＣ−ＲＰ１３５）。
図４Ｒは、パネルＡにおいて、ＢＣｅｎｖIIIｂ２９−免疫ネズミＣＴＬによる、組換ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子由来の短いエンベロープタンパク質を発現するＢＣ細胞（ＢＣｐｃｍｖチャンク１標的；「チャンク１」と称す（実施例１Ｆ２を参照））、及びＨＩＶｅｎｖIIIｂ発現性のクローン化、感染化ＢＣ細胞（ＢＣｅｎｖIIIｂ２９標的）の特異的溶解も；そしてパネルＢにおいて、ＢＣｐＣＭＶチャンク１標的細胞及びＢＣｅｎｖIIIｂ−１４Ｈ標的細胞を特異的に殺傷し、非感染化ＢＣ細胞（ＢＣ１０ＭＥ標的）を殺傷しない、ＢＣｐＣＭＶチャンク１細胞により免疫されたマウスにおける免疫ＣＴＬの誘発を示す。
図５はｓＣＤ４を発現するようデザインされたベクターを示す。
図６は、ベクターＴＫ１（ＳＶ−Ｎｅｏを伴わず）及びＴＫ３（＋ＳＶ−Ｎｅｏ）を有すプラスミドの作製を示す。
図７はベクターＫＴＶＩＨＡＸを有すプラスミドの作製を示す。
図８はベクターＫＴＶＩＨ５（ＳＶ−Ｎｅｏを伴わず）及びＫＴＶＩＨＮｅｏ（ＳＶ−Ｎｅｏを伴う）を有すプラスミドの作製を示す。
図９はベクターＭＨＭＴＫ−Ｎｅｏを有すプラスミドの作製を示す。
図１０はベクターＲＲＫＴＶＩＨを有すプラスミドの作製を示す。
図１１はｔａｔ−ｈｉｓ（ｔａｔは正常な方向）又はαｔａｔ（ｔａｔがアンチセンス方向）ベクターを有すプラスミドの作製を示す。
図１２は、示した３種の条件的致死性ベクターの感染及びアシクロビル（ＡＣＶ）の処理に基づく、コントロールＰＡ３１７と比較した、ｔａｔｈｉｓベクター（５種のクローン、ＴＨ１〜５）により感染せしめたＰＡ３１７細胞の優先的殺傷を示す。
図１３はベクター４ＴＶＩＨＡＸを有すプラスミドの作成を示す。
図１４はＨＩＶ誘発性マーカー／リポーター遺伝子、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を有すウイルスベクターの作製を示す。
図１５は細胞の中に導入されうるプラスミド上に保有されるＨＩＶ誘発性マーカー／リポーター遺伝子の構造を示す。
図１６は、図１５におけるＡＰマーカーを有すＳｕｐＴ１細胞とＨＩＶの、種々のＡＺＴ濃度でのＨＩＶ感染の経時変化を示す。ＨＩＶ感染のレベルは上清液と少量のアリコートを採取することにより測定した。
図１７は図１６と同様実験であるが、但しＨＩＶ阻害剤としてｄｄＣを用い結果を示す。
図１８は、プロモーターから直接フレモイシン（phlemoycin）耐性遺伝子（ＰＲＧ）を発現せしめるプラスミド（右側、実線）、及びＰＲＧを発現する他のプラスミドであってそのコード配列がそれとプロモーターの間にて干渉されているもの（左側、点線）による、細胞のトランスフェクションに基づく、フレオマイシン選別後の生存細胞数を図示する。
図１９は哺乳細胞においてレトロウイルスタンパク質を発現するようにデザインされた４種のプラスミドを示す。ｐＳＶｇｐ及びｐＲＳＶｅｎｖは選別可能マーカーを共導入され、ｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲ及びｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏはウイルスタンパク質−コード化領域の下流に位置する選別可能マーカーを有す同等なプラスミドである。
図２０は、位置−特異的突然変異誘発後のＨＩＶ ｅｎｖ及びＭｏＭＬＶｅｎｖの３ケ所融合を示す。トランスメンブラン領域の細胞外境界での接点をＡと示し、Ｂ及びＣはトランスメンブラン領域及び細胞質境界それぞれの中央の位置を示す。番号はヌクレオチド番号に相当する（RNA Tumor Viruses,Vol.II.Cold Spring Harbor,1985）。ＳＴ，ＳＲ，ＳＥはｔａｔ，ｒｅｖ及びｅｎｖの起点であり、ＴＴ，ＴＲ及びＴＥはそれぞれの停止部位である。
図２１は、５′ＬＴＲにおけるＵ３の、ＳａｃＩ，ＢｓｓｈII又はこの領域におけるその他の部位と融合可能な異種プロモーター／エンハンサーによる置換を示す。
図２２は、ウイルスタンパク質又はベクターＲＮＡを発現する遺伝子導入マウスの交配についての代表的な方法を示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．免疫刺激
異種の病原体に対する認識及び防御の能力は、免疫系の機能の中心である。免疫認識を介するこの系は、「非自己」（異種）から「自己」を区別することが可能でなければならず、このことは即ち、防御のメカニズムが宿主組織に対してではなく、侵入物に対して向けられていることを確実にするための本質である。この免疫系の基本的な特徴は、高い多型性細胞表層認識構造体（リセプター）の存在並びに侵入病原体の破壊のためのエフェクターメカニズム（抗体及び細胞溶解性細胞）にある。
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は通常、ＭＨＣクラスＩ又はクラスIIの細胞表層タンパク質に関連してプロセスされる病原−特異性ペプチドの出現により誘発される。このタイプの抗原の提供により刺激されるものとして、抗体、ヘルパー細胞及び記憶細胞もある。本発明の１つの態様において、適切なＭＨＣ分子に関連しての免疫原ウイルス決定基の提供は、患者を病原体にさらすことなく最適なＣＴＬ応答を効率的にに誘発する。免疫刺激のためのこのベクター手法は、潜在的なクラスＩの制限された、予防的及び治療的ＣＴＬ応答をより効率的に誘発する手段を提供する。その理由は、このベクターにより誘発されるこのタイプの免疫性は、天然の感染への暴露により誘発されたものと非常に似ているからである。複数のウイルス系の現在の知識に基づき、体外的に供給された非複製ウイルス抗原、例えばペプチド及び精製組換タンパク質はクラスＩの制限された最適なＣＴＬ応答性を誘発せしめるための十分な刺激を提供しないであろう。他方、選択したウイルスタンパク質又は本発明の中で記載する標的細胞における、病原症状例えば癌に関連するその他の抗原の、ベクター運搬された発現はこのような刺激を提供する。
実施例の方法により、ＨＩＶ−１感染のケースにおいて、患者は種々のウイルス性エンベロープ−領域決定基に特異的な抗体を発生せしめ、それらのうちのいくつかはインビトロウイルス中和が可能である。にもかかわらず、疾病の進行は続き、患者は事実上この疾病に侵される。感染された患者細胞（Plataら、Nature 328:348-351,1987）及び標的細胞であって、ＨＩＶｇａｇ，ｐｏｌ又はｅｎｖを発現する組換ワクチンベクター（Walkerら、Nature 328:345-348,1987;Walkerら、（Science 240:64-66,1988）により感染されたものに対する低レベルのＣＴＬ応答がいくつかのＨＩＶ−１陽性血清患者において検出された。更に、ネズミ及びヒトＣＴＬはトランスフェクションを介して、ＨＩＶｇｐ１２０を発現する自己スチムレーター細胞により誘発されうることが近年見い出されている（Langlade-Demoyanら、J.Immunol. 141:1949,1989）。改善せしめたＣＴＬ誘発は感染患者のための有利な治療となることができ、そして非感染性症状のもとでは個体のための有効な予防的治療を提供する。ＨＩＶ感染自体は適切なＣＴＬ応答を提供しないであろう。その理由は、ＨＩＶ感染に関連するその他の要素が適切な免疫刺激を妨げるからである。更に、感染細胞によるＴ−細胞の刺激は、刺激されたＴ−細胞の感染をもたらす相互作用である。
ＨＩＶ−１は１つの例にすぎない。この手法は、例えばＨＰＶ及び頸管癌腫、ＨＴＬＶ−１−誘発白血病、前立腺−特異的抗原（ＰＳＡ）と前立腺癌、突然変異ｐ５３と結腸癌腫、ＧＤ２抗原と黒色腫等のように、特徴的な抗原（これは膜タンパク質である必要はない）が発現される、ウイルスに関連する疾病又は癌に対して有効であろう。実施例１はパッケージング細胞においてレトロウイルスベクターを発生できるプラスミドの作製のための方法を詳細し、これはＨＩＶウイルス抗原の発現をもたらす。
実施例１
ＨＩＶ抗原を発現するベクター
Ａ．Ｅｎｖ発現ベクター（図１参照）：
２．７kbのＫｐｎ−ＸｈｏＩＤＮＡフラグメントをＨＩＶプロウイルスクローンＢＨ１０−Ｒ３（配列については、Ratneら、Nature 313:277,1985を参照のこと）から単離し、そしてIIIｅｘＨ７ｄｅｌｔａ ｅｎｖ（ｎｔ．５４９６迄Ｂａ１３１欠損）由来の
Figure 0004041535
のＳａｌ−ＫｐｎＩＤＮＡフラグメントをプラスミドＳＫ+におけるＳａｌＩ部位にリゲートせしめた。このクローンから、ｅｎｖ発現のために本質的な、ｒｅｖをもコード化する３．１kbのｅｎｖ ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）を単離し、そしてｐＡＦＶＸＭと呼ぶレトロウイルスベクター（Kriegleら、Cell 38:483,1984参照）にリゲートせしめた。このベクターは改良されており、ＨＩＶ ｅｎｖコード化ＤＮＡフラグメントのクローニングを促進せしめるため、ＢａｌII部位はリンカー挿入によってＸｈｏＩ部へと変えられている。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を作動せしめるＳＶ４０初期プロモーターを含んで成る優性選別マーカー遺伝子をこのベクターのＣｌａＩ部位に挿入せしめ、感染及びトランスフェクトされた細胞系の単離を促進せしめた。このベクターをｐＡＦ／Ｅｎｖr／ＳＶ２ｎｅｏと呼ぶ（図１参照）。
このベクターのＥＮＶ遺伝子から上流のＸｈｏＩ部位は、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、ＣＭＶ即初期（immediate early:IE）プロモーター、ヒトベーターアクチンプロモーター、及びモロニーネズミＭＬＶ ＳＬ３−３プロモーターのような重なるプロモーターのこのベクター構造体への挿入に好都合な部位を提供する。
このようなプロモーターの１つ、ＣＭＶ即初期遺伝子プロモーター（図１参照）、即ち、６７３bpのＤＮＡフラグメントＨｉｎIIからＥａｇＩは、ＳｕｐＴ１と称されるヒトＴ−細胞系におけるＥＮＶの発現を、親構造体ｐＡＦ／Ｅｎｖr／ＳＶ２ｎｅｏと比較して１０倍高めることをもたらす（図２参照）。
このベクターの力価を高めるため、Ｎ２に基づく組換レトロウイルスを利用できる（Armentatoら、J.Virol. 61:1647-1650,1987;EglitasらScience 230:1395-1398,1985）。このベクターはＮ２由来のパッケージング配列及び細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の両方を有する。上記のＨＩＶ ｅｎｖ構造体を以下の通り、Ｎ２における固有ＸｈｏＩ部位に挿入せしめた。
Ｎ２に出来する、ＧＡＧ配列を含むMoMuLV５′LTRフラグメント（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）をプラスミドＳＫ+にリゲートせしめ、Ｎ２Ｒ５と呼ぶ構造体を得た。このＮ２Ｒ５構造体を、ＧＡＧ，ＡＴＧをＡＴＴへと変化せしめるため、位置特異的インビトロ突然変異誘発によって突然変異せしめた。この突然変異部位はＰｓｔＩ部から２００bp離れて位置する。この２００bp突然変異フラグメントを単離し、そしてプラスミドｐＵＣ３１におけるＮ２ＭｏＭｕＬＶ５′ＬＴＲの同一のＰｓｔＩ部位に挿入せしめた（突然変異されていない２００bpのフラグメントと交換するため）。得られる構造体をｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇMと呼ぶ。（ｐＵＣ３１はｐＵＣ１９に由来し、これはＸｈｏＩ，ＢａｌII，ＢｓｓＨII及びＮｃｏＩ部位がポリリンカーのＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に更に挿入されている）。Ｎ２に由来する１．０kbのＭｏＭｕＬＶ３′ＬＴＲフラグメントをプラスミドＳＫ+にクローンせしめ、Ｎ２Ｒ３（−）と呼ぶ構造体が得られた。
ベクターｐＡＦ／ＥｎｖrＳＶ２ｎｅｏから、ｅｎｖ発現に本質的な、ｒｅｖもコード化する３．１kbのｅｎｖ ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）を単離した。プラスミドＮ２Ｒ３（−）から、１．０kbのＭｏＭｕＬＶ３′ＬＴＲフラグメント（ＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII）を単離した。
Ｎ２を基礎とするｅｎｖ発現性ベクターを３つの部分リゲーションにより製造し、ここで３．１kbのｅｎｖフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）及び１．０kbのＭｏＭｕＬＶ３′ＬＴＲフラグメント（ＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII）をｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇMのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位に挿入せしめた。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を作動せしめるＳＶ４０初期プロモーターを含んで成る優性選別マーカー遺伝子をＮ２を基礎とするｅｎｖ発現ベクターにＣｌａＩ部位にて挿入せしめ、感染及びトランスフェクトされた細胞系の単離を促進せしめた。このベクターをＫＴ−１と呼ぶ。
Ｂ．Ｇａｇ発現ベクター：
レトロウイルスベクターにおいてＨＩＶｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子生成物を効率的に発現せしめるためには、二つの条件が満足されねばならない：
１）ｇａｇ及びｐｏｌに埋めれている制御要素を無効にするため、このベクターにＲＥＶ応答性要素（ＲＲＥ）を加えなければならないこと；及び２）ＲＥＶはこのベクターに挿入されたＲＲＥと相互作用するために効率的に発現されなければならず、これによってウイルスメッセンジャーＲＮＡの細胞質の中への適切な輸送が可能となること。
２．５kbのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントをｐＢＨ１０Ｒ３から単離し（Ratnerら（前記）を参照）、そしてｐＵＣ３１のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位に、ユニバーサル翻訳停止コドンをコードするリンカーを伴ってリゲートせしめた。ｐＵＣ３１はｐＵＣ１９に由来し、ＸｈｏＩ，ＢａｌII，ＢｓｓＨII及びＮｃｏＩ部位がこのポリリンカーのＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部拉の間に挿入されている。しかしながら、この構造体はＨＩＶに由来する主要スプライスドナー（ＳＤ）部位を含み、それ故ウイルスの発生における問題となりうる。このＳＤ部位は、７０bpのＲｓａＩ−ＣｌａＩフラグメントを２．１kbのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントと共に、ＳＫ+のＨｉｎｃII−ＢａｍＨＩ部位の中にサブクローン化せしめることによって除去できる。このＢａｍＨＩ部位をリンカー挿入によってＣｌａＩ部位へと変換せしめた。この構造体をＳＫ+ｇａｇプロテアーゼＳＤデルターと命名する。
ｇａｇ／ｐｏｌ ＳＤ欠損完成構造体を、３つの部分のリゲーション反応により製造し、ここでＳＫ+ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタ由来の７５７bpのＸｈｏ−ＳｐｅＩフラグメント及びＢＨ１０Ｒ３由来の４．３kbのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩフラグメントをＳＫ+ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩに挿入せしめた。ＳＫ+におけるＸｂａＩ部位を、その反応を促進せしめるためにＮｃｏＩへと変換せしめた。
このベクターにＲＥＶ及びＲＥＶ応答性要素の両方を導入せしめるため、プラスミドＳＫ+ＨＩＶｅｎにおける１．４kbのＳｓｐＩ欠損を発生せしめた。この欠損はＲＢＶの発現のために重要でないイントロン配列を除去せしめた（ＲＥＶの発現はスプライスせしめたｍＲＮＡから続けられるであろう。）更に、この欠損はｅｎｖに位置するＲＥＶ応答性要素に影響を及ぼさない。真核細胞翻訳開始コドンを含むように操作された、優性選別マーカーＮｅｏをコード化する１．１kbのＤＮＡフラグメントをこの構造体に、ｅｎｖにおけるＢａｌII部位にて挿入せしめた。ｎｅｏの挿入は、継代せしめたウイルスの検出及びウイルスの選別を、継代にわたりスプライスされていない状態において促進せしめる。プロモーター例えばＣＭＶをこの構造体のＸｈｏＩ部に挿入せしめた。この構造体をＳＫ+ＣＭＶ／ＲＥＶ／Ｎｅｏと命名した。最終ウイルス構造体は四つの部分のリゲーション反応により製造されうる。ＳＫ+ｇａｇポリメラーゼＳＤデルタ由来の２．５kbのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡフラグメント、ＳＫ+ＣＭＶ／ＲＥＶ／Ｎｅｏ由来の３．５kbのＳｐｅＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡフラグメント及びＮ２Ｒ３（−）（３′ＬＴＲのみを含むＮ２のサブクローン）由来の１．２kbのＣｌａＩ−ＨｉｎｄIIIＤＮＡフラグメントをｐＵＣＮ２Ｒ５（５′ＬＴＲを含むＮ２のサブクローン）の中に、この構造体のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII部位で挿入せしめた。
Ｃ．Ｎ２を基礎とするベクターを利用するＧａｇ−Ｐｏｌ発現
ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子生成物は、効率的な発現は、ＲＥＶ応答性要素（ＲＲＥ）及びＲＥＶを必要とする（前述した「Ｇａｇ発現性ベクター」を参照のこと）。
ＲＥＶ及びＲＲＥを得るため、２．７kbのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントをＨＩＶプロウイルスクローンＢＨ１０−Ｒ３から単離し（配列については、RatnerらのNature 313:277,1985を参照のこと）、そしてexE7 delta envに由来する４００bpのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ５４９６迄のＢａｌ３１欠損）をプラスミドＳＫ+におけるＳａｌＩ部位にリゲートせしめた。この構造体をＳＫ+ｅｎｖrと呼ぶ。２３９bpの５′ＲＥＶ ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ−ＳｓｐＩ）及びＳＫ+フラグメントにおける４．２kbのＲＲＥ／３′ＲＥＶをＳＫ+ｅｎｖrから単離した。
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を得るため、２．５kbのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントをｐＢＨ１０−Ｒ３（Ratnerら（前記）を参照）から単離し、そしてｐＵＣ３１のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位に、ユニバーサル翻訳停止コドンをコード化するリンカーと一緒にリゲートせしめた。しかしながら、この構造体はＨＩＶに由来する主要なスプライスドナー（ＳＤ）を含み、従ってこれはウイルスの発生における問題となりうる。このＳＤ部位を、７０bpのＲＳＡＩ−ＣｌａＩフラグメントを２．１kbのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントと共にＳＫ+のＨｉｎｄII−ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングせしめることによって除去した。このＢａｍＨＩ部位をリンカー挿入によってＣｌａＩ部位に変換せしめた。この構造体をＳＫ+ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタと命名した。
ｇａｇ−ｐｏｌ ＳＤ欠損完成構造体を３ケ所のリゲーションにより製造し、ここでＳＫ+ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタ由来の７５７bpのＸｈｏＩ−ＳｐｅＩフラグメント及びＢＨ１０−Ｒ３由来の４．３kbのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩフラグメントをＳＫ+ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩに挿入せしめた。ＳＫ+におけるＸｂａＩ部位をその反応を促進せしめるためにＮｃｏＩへと変換せしめた。更に、ｐｏｌにおけるＮｄｅＩ部位をＸｂａＩ部位に変換せしめた。得られる構造体をＳＫ+ｇａｇ−ｐｏｌ ＳＤデルタと呼ぶ。この構造体に由来するＸｂａＩ部位を再び変換せしめてＢａｍＨＩ部位を作り、そして４．２kbのｇａｇ−ｐｏｌ ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ／ブラント−ＢａｍＨＩ）を単離した。
ＳＫ+ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターは３ケ所のリゲーションにより製造し、ここで２３９bpの５′ＲＥＶ ＤＮＡフラグメント（Ｘｈｏ−Ｉ−ＳｓｐＩ）及び４．２kbのｇａｇ−ｐｏｌ ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ／ブラント−ＢａｍＨＩ）をＳＫ+ベクターフラグメントにおけるＸｈｏＩ−ＢｇｌII４．２kbのＲＲＥ／３′ＲＥＶに挿入せしめた。得られる構造体をＳＫ+ｇａｇ−ｐｏｌ／ＲＲＥ／ＲＥＶと呼ぶ。
Ｎ２を基礎とするｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを２ケ所のリゲーションにより製造し、ここでＳＫ+ｇａｇ−ｐｏｌ／ＲＲＥ／ＲＥＶに由来する５．７kbのｇａｇ−ｐｏｌ／ＲＲＥ／ＲＥＶフラグメントをｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇMのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位に挿入せしめた。
Ｎ２（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）由来の優性選別マーカー遺伝子であってネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を作動せしめるＳＶ４０初期プロモーターを含んで成るものをプラスミドＳＫ+の中にクローンせしめた。これより、１．３kbのｎｅｏ遺伝子フラグメント（ＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ）をＮ２を基礎とするｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターのＣｌａＩ部位に挿入せしめ、感染及びトランスフェクトされた細胞系の単離を促進せしめた。このベクターをＫＴ−２と呼ぶ。
Ｄ．Ｎ２を基礎とするベクターを用いたＧａｇ−プロテアーゼ−ＲＴ発現
ｇａｇ−プロテアーゼ逆転写酵素（ｇａｇ−プロテアーゼ−ＲＴ）遺伝子生成物（ｇａｇ／ｐｒｏｔ）の効率的な発現は、ＲＲＥ及びＲＥＶを必要とする（「Ｇａｇ発現性ベクター」を参照のこと）。
ＲＥＶ及びＲＲＥは前記の通りに製造した（「Ｎ２を基礎とするベクターを利用するＧａｇ−ｐｏｌ発現性」を参照のこと）。
このｇａｇ遺伝子は主要のスプライスドナー（ＳＤ）を含み、これはウイルスの発生における問題となりうる。このＳＤ部位は、ｐＳＬＣＡＴｄｅｌＢａｌII（ＨＩＶ株ＨＸＢ２に由来する、ｇａｇ−ｐｏｌ，ｔａｔ、及びｒｅｖを発現するベクター）の位置特異的インビトロ突然変異誘発によるＧＴをＡＣに変えることで除去された。このＳＤデルタ部位の上流にＳａｃＩ部位も作り上げ、従って７８０bpのＳＤデルタ−ｇａｇフラグメント（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ）が精製されうる。１．５kbのｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴフラグメント（ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＶ）及び７８０bpのＳＤデルタｇａｇフラグメント（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ）をｐＵＣ１８（ＳａｃＩ−ＳｍａＩ）に挿入せしめた。得られる２．３kbのＳＤデルタｇａｇ／ｐｒｏｔ−ＲＴフラグメント（ＳａｃＩ／ブラント−ＢａｍＨＩ）をこのｐＵＣ１８ベクターから単離した。
ＳＫ+ｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴ発現ベクターは３ケ所のリゲーションにより製造され、ここで２．３kbのＳＤデルタｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴフラグメント（ＳａｃＩ／ブラント−ＢａｍＨＩ）をＳＫ+ベクターフラグメントにおけるＸｈｏＩ−ＢｇｌII４．２kbのＲＲＥ／３′ＲＥＶに挿入せしめた。得られる構造体をＳＫ+ｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴ／ＲＲＥ／ＲＥＶと呼ぶ。
Ｎ２を基礎とするｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴ発現ベクターを２ケ所のリゲーションにより製造し、ここでＳＫ+ｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴ−ＲＲＥ／ＲＥＶに由来する３．８kbのｇａｇ−ｐｒｏｔ−ＲＴ／ＲＲＥ／ＲＥＶフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）をｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇMのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位に挿入せしめた。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を作動せしめるＳＶ４０初期プロモーターを含んで成る、Ｎ２（ＥｃｏＲＩ−ＨｃｏＲＩ）由来の優性選別マーカー遺伝子フラグメントをプラスミドＳＫ+の中にクローンせしめた。これにより、１．３kbのｎｅｏ遺伝子フラグメント（ＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ）がＮ２を基礎とするｇａｇ−ｐｏｌ−ＲＴ発現ベクターの中に、ＣｌａＩ部位にて挿入され、感染及びトランスフェクトされた細胞系の単離が促進された。
Ｅ．Ｈ２−Ｄｄ発現ベクターの作製
Ｈ２−Ｄｄ遺伝子をコード化するネズミのクラスＩ遺伝子を、このＨ２−Ｄｄ遺伝子の上流に挿入されるＣＭＶプロモーター又はＲＳＶＬＴＲのいづれかを含むブルースクリプト（Bluescript：商標）ＳＫ+プラスミドの中に挿入せしめた。この発現性構造体ＲＳＶ−Ｄｄ及びＣＭＶ−ＤｄをＣａＰＯ４／ポリプレン法を利用し、３Ｔ３細胞に導入せしめた。
この発現性構造体ＣＭＶ−Ｄｄ及びＭＶ７．７４（ヒトＣＤ４及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現するレトロウイルス構造体）をヒトＨＴ１０８０細胞に同時導入せしめた。これらの細胞を、Ｇ４１８により選別し、そして耐性コロニーを拾い、増殖せしめ、そしてラット抗−Ｄｄ抗体を用いるウェスタンブロットによってＨ２−Ｄｄの発現性について試験した。陽性クローンのうちの１つ（Ａ−ａ）をＮ２ｅｎｖ−ｎｅｏ（ＫＴ−１）により感染せしめた。
Ｆ．ＣＴＬエピトープの地図化のためのＨＩＶエンベロープ欠失体の作製
２種類のレトロウイルスベクターを、ＣＴＬと反応性のペプチドエピトープを含むＨＩＶエンベロープタンパク質における領域を地図化するために調製した。第１は、Δループと称し、患者の血清における抗体と反応性のＨＩＶIIIＢエンベロープタンパク質の領域であるｇｐ１２０超可変ループの欠失を含む。第２は、「チャンクＩ」と称し、アミノ末端からｇｐ１２０ループの起点迄のＨＩＶIIIＢエンベロープのエンベロープ領域のみを含み、これはこのエンベロープタンパク質の膜ｇｐ４１「テール」も欠失している。
１．Δループ
ＨＩＶIIＢｅｎｖの６０２塩基対のＨｉｎｃII−ＳｃａＩフラグメントを調製し、そしてプラスミド１３０Ｂの中に挿入せしめた。４３−ｍｅｒオリゴ５′Ｇ ＡＡＣ ＣＡＡ ＴＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＡＧＡ ＧＣＡ ＡＡＡ ＴＧＧ３′を合成した。誤対合プライマーの突然変異誘発をKunkelの方法（Kunkel, T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:448-493,1985）により行い、１０６個のアミノ酸のフレーム欠失を発生せしめた。これはＤＮＡシーケンシングにより確認した。この欠失を含むＳｔｕＩ−ＡｏｃＩフラグメントを次に、ブルースクリプトＳＫ+（Stratagene,La Jolla）において含まれるＨＩＶIIIｂｅｎｖの同一部位に挿入せしめた。これより直ちに、この欠失を含むＨＩＶ ｅｎｖIIIＢのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメントを改良したＮ２レトロウイルスベクターの同一の部位に挿入せしめた。（このベクターはｇａｇＡＴＣ開始コドンを有さない）。最後にＳＶ２ｎｅｏ遺伝子を適切な方向においてＣｌａＩ部位の中に挿入せしめた。
２．チャンクＩ
ＨＩＶIIIＢｅｎｖの１．３０kbのＸｈｏＩ−ＰＶＵIIフラグメントをブルースクリプトＳＫ+ベクター（Stratagene,La Jolla）の中に、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｃII部位にてクローン化せしめた。次にこのフラグメントをＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてこのベクターから再び単離し（ポリリンカー由来のＢａｍＨＩ部位）、そしてＫＴ−１レトロウイルスベクター又はＨＩＶIIIＢを発現するＣＭＶ構造体のいづれかにおいて含まれる、ＨＩＶ ｅｎｖIIIＢのＸｈｏＩ−ＢａｌII部位の中に挿入せしめた。
これらのプラスミドは、適切なパッケージング細胞に入れた場合、パッケージングシグナルを含むレトロウイルスベクター構造体を発現する。このパッケージングシグナルはこのベクター構造体を、生存できるレトロウイルス粒子に必要な全ての更なるタンパク質を伴って、カスピド及びエンベロープの中にパッケージングせしめることをもたらす。このカスピド、エンベロープ及びその他のタンパク質は、パッケージング細胞に位置する適切なゲノムを含む１又は複数のプラスミドから好適に製造される。このようなゲノムはプロウイルス構造体であって、簡単なケースにおいてそれらは単にパッケージングシグナルが欠失していることがある。結果として、このベクターのみがパッケージングされるであろう。適切なパッケージング又はパッケージング細胞系及びこのようなパッケージングを達成せしめるのに必要なゲノムはMillerら（Mol. Cell. Bio. ６:2895,1986）において詳細され、これは本明細書に参考文献として組入れている。Millerらにより詳細の通り、複製欠陥でないウイルス粒子の製造をもたらしうる、パッケージング細胞系において発生する組換現象の確率を低めるためには、このパッケージングシグナルの単純な削除よりもこのプロウイルス構造体に更なる変化を付与せしめることの方が好ましい。
実施例１はＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ）又はその他のウイルス抗原を作り出すための方法の単なる例示であることが理解されるであろう。より小さいＴ細胞細胞変性効果を伴って免疫応答を刺激せしめるであろう、標的細胞上の改良されたＨＩＶエンベロープｇｐを発現せしめるプロウイルスベクター構造体を提供することも可能である。エンベロープ糖タンパク質は当業界においてよく知られる技術、例えばKowalskiら（Science 237:1351,1987）（本明細書に参考文献として組入れている）の開示する論文を利用して適切に改良されうる。従って、プロウイルス構造体は、このように適切に改良されたｇｐを発現せしめるレトロウイルス構造体を発生する上記の技術により作製されうる。次にこの構造体を前記の通りにパッケージング細胞に導入せしめた。感受性標的細胞の感染を介して免疫応答を刺激せしめるため、このパッケージング細胞系から作られる得られた組換レトロウイルスはインビボ及びインビトロで利用されうる。これらの手段によって感受性標的細胞の中に導入せしめた核酸は、この標的細胞の核酸に組込まれるようになる。ＨＩＶゲノムから発現されるその他のタンパク質、例えばｇａｇ，ｐｏｌ，ｖｉｆ，ｎｅｆ、他もＨＩＶ−感染個体における有利な細胞応答を誘発することが理解されるであろう。以降に詳細するプロウイルスベクターは、臨床的に有利な免疫応答性を促すためにこのようなタンパク質を発現せしめるようデザインされている。あるベクターについてはｒｅｖをコード化する配列及びｒｅｖ応答性要素を含むことが必要となりうる（Rosenら、Proc.Natl.Acad.Sci. 85：2071,1988）。
以下の実施例は、マウスにおけるＣＴＬ応答を誘発するためのこのタイプの治療の能力を示す。
実施例２
Ａ．レトロウイルスベクターコード化抗原に対する免疫応答
ネズミ腫瘍細胞系（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）（Ｈ−２d）（Ｐａｔｅｋら、Cell.Immunol. 72:113,1982）を、ＨＩＶ ｅｎｖをコード化するｐＡＦ／Ｅｎｖr／ＳＶ２ｎｅｏベクター構造体を有す組換レトロウイルスにより感染せしめた。１つのクローン化ＨＩＶ−ｅｎｖ発現細胞系（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９）を次に、同族（即ち、ＭＨＣが同一）Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２d）マウス（図３参照）においてＨＩＶ−ｅｎｖ−特異的ＣＴＬを刺激せしめるために利用した。マウスをＢ／Ｃ１０ＭＥ−２９細胞（１×１０7個の細胞）により腹膜腔内注射によって免疫化し、そして７〜１４日増幅せしめた。（増幅は絶体に必要ではない）。応答性の脾臓細胞懸濁物をこれらの免疫マウスから調製し、そしてこの細胞をＢ／Ｃ１０ＭＥ−２９（ＢＣｅｎｖ）又はＢ／Ｃ１０ＭＥ（ＢＣ）マイトマイシン−Ｃ−処理細胞のいづれかの存在下において、スチムレーター：応答性細胞の比が１：５０で、４日間インビトロで培養した（図３）。このエフェクター細胞をこの培養物から回収し、カウントし、そして標準の４〜５時間51Ｃｒ−放出アッセイにおいて、放射性標識（51Ｃｒ）せしめた標的細胞（即ち、Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥ）と種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で混合した。インキューションの後、マイクロタイタープレートを遠心し、溶解細胞から放出された放射標識物の量をベックマンガンマースペクトロメーターにより計測した。標的細胞溶解は、％標的溶解＝（Ｅｘｐ ＣＰＭ−ＳＲ ＣＰＭ／ＭＲ ＣＰＭ−ＳＲ ＣＰＭ）×１００として計算され、ここで分当りの実験計測値（Ｅｘｐ ＣＭＰ）はエフェクター及び標的物を表わし；自発性放出（ＳＲ）ＣＰＭは標的物単独を表わし；そして最大放出（ＭＲ）ＣＰＭは１ＭのＨＣｌの存在下における標的物を表わす。
結果が示すには（図４Ａ）、非ＨＩＶ ｅｎｖ ＢＣ標的細胞よりも有意により効率的に、ＨＩＶ−ｅｎｖ−発現性標的細胞（ＢＣｅｎｖ）を特異的に溶解せしめるＣＴＬエフェクターが誘発された。非−ＨＩＶ−ｅｎｖ−発現性コントロール細胞（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）によりインビロで再刺激せしめたプライム化脾臓細胞は、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ ｅｎｖ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥ標的細胞のいづれにおいても、特に低いＥ：Ｔ細胞比で、有効なＣＴＬ活性を示さなかった。天然の非免疫化Ｂａｌｂ／ＣマウスであってＢ／Ｃ１０ＭＥ ｅｎｖ−２９によりインビトロで刺激せしめたマウスに由来する脾臓細胞はＣＴＬを発生せず（データーは示していない）、従ってインビボでのプライミング及び増幅操作の重要性を示唆する。この実験は繰り返され、そして同様の結果が得られた。
他の実験において、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに由来するエフェクター細胞であって、免疫化され、増幅され、そして同一のｐＡＦ／Ｅｎｖr／ＳＶ２ｎｅｏ（ＨＩＶ−ｅｎｖ）ベクター構造体により感染された異なるＨ−２dＨＩＶ−ｅｎｖ−発現性腫瘍細胞クローン（Ｌ３３−４１）によってインビトロで再刺激せしめたものは、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ ｅｎｖ−２９標的細胞を溶解せしめることができた。このことは、これらのマウスにおいて発生するＣＴＬは、これらの細胞上の固有の腫瘍細胞抗原を単に認識するのでなく、ＨＩＶ−ｅｎｖの発現された型を特異的に認識することを更に支持することを提供する。この結果は、このベクター−運搬抗原は二種の腫瘍細胞系によって、同様の状態において存在することも示唆する。ＣＴＬ応答性の特異性は、ＢＣｅｎｖ免疫化マウスに由来するエフェクター細胞を、ｎｅｏ及びＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子を発現するＢＣｅｎｖ標的細胞、ＢＣ（非−ｎｅｏ、非−ＨＩＶ ｅｎｖ）親標的細胞及びｎｅｏ耐性マーカー遺伝子は発現するがＨＩＶ ｅｎｖを発現しないＢＣ ｎｅｏ標的細胞に基づいて試験することによって更に立証される。
他の実験において、１×１０7個のＢＣ ｅｎｖ細胞により免疫され、増幅され、そしてインビトロで再刺激せしめたマウスに由来するエフェクター細胞を、誘発された細胞障害性エフェクター細胞の表現型を決定するために、Ｔ細胞特異性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）と補体（Ｃ′）によって処理せしめた。このエフェクターを抗−Ｔｈｙ１．２（ＣＤ３）、抗−Ｌ３Ｔ４（ＣＤ４；ＲＬ１７２．４、Ceredigら、Nature 314:98,1985）又は抗−Ｌｙｔ２．２（ＣＤ８）Ｍａｂのいづれかと３０分間４℃で処理し、ハンクの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、低トックス（ｔｏｘ）ラビットＣ′に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この処理細胞をＲＰＭＩ１６４０完全培地において３日洗浄し、カウントし、そして前記の通りＢＣ ｅｎｖ放射性標識標的細胞を溶解せしめるそれらの能力について試験した。図４Ｃが示すには、抗−Ｔｈｙ１．２又は抗−Ｌｙｔ２．２Ｍａｂ＋Ｃ′のいづれかによる処理は細胞障害性活性を無効にするが、抗−Ｌ３Ｔ４ ＭＡｂ＋Ｃ′又はＣ′単独では細胞障害性に有意な影響を及ぼさなかった。これら結果は、この系において発生する細胞障害性エフェクター細胞の大部分が、ＣＤ３+，ＣＤ４-，ＣＤ８+細胞障害性Ｔ−細胞表現型であることを示唆した。
前述したＣＴＬエフェクター細胞のＭＨＣ制御を調べるための実験を行った。ネズミＭＨＣの異なるＨ−２領域に対するポリクローナル抗体（即ち、抗−Ｈ−２d、抗−Ｈ−２Ｄd、抗−Ｈ−２Ｌd、抗−Ｈ−２Ｋd、抗−Ｈ−２Ｉd）を、ＢＣ ｅｎｖ標的細胞に基づくＣＴＬ応答を防止するために用いた。抗−Ｈ−２k抗血清は陰性コントロールとして利用した。このデーター（図４Ｄ）は、Ｂａｌｂ／Ｃ抗−ＢＣｅｎｖＣＴＬ応答が抗−Ｈ−２Ｄd抗血清によって主に阻害されることを示した。このことは、これらのＣＴＬ応答は、Ｈ２複合体のＤ領域においてほとんどコード化されるＭＨＣクラスＩ分子により制御されることを示唆した。
マウスが複製可能（replication comptent）ＨＩＶ ｅｎｖ−発現性腫瘍細胞により免疫化されている実験の他に、ＣＴＬをインビボで誘発せしめるのにスチムレーター細胞を増殖せしめることが必要であるかどうかを調べるための試験を行った。マウスを照射せしめた（１０，００ｒａｄｓ）又は照射せしめていないＢＣ ｅｎｖ細胞により免疫し、そしてプライム化脾臓細胞をその後インビロで前記の通り刺激せしめた。得られるエフェクター細胞を放射性標識せしめたＢＣｅｎｖ及びＢＣ標的細胞に基づいてＣＴＬ活性について試験した。図４が示すには、ＨＩＶ−特異性ＣＴＬはインビボで、照射された又は照射されていないスチムレーター細胞のいづれによっても誘発されうる。これらのデーターが示すには、ＨＩＶ ｅｎｖ−発現性スチムレーター細胞によるＣＴＬ誘発はインビボでのスチムレーター細胞の増殖に依存せず、適切なＭＨＣ情況におけるＨＩＶ ｅｎｖ抗原の存在は効率的なＣＴＬ誘発のために十分である。ホルマリン固定細胞も同等の免疫応答を誘発した。このことは、死滅した細胞又はおそらく細胞膜であって適切なＭＨＣクラスＩ／II分子情況において適切な抗原を発現するものが、効率的なＣＴＬ応答を誘発するのに十分であることを示す。
Ｂａｌｂ／ＣマウスへのＢＣｅｎｖ細胞の最適な注射投与量を調べるための更なる実験を行った。マウスを種々の数のＢＣｅｎｖスチムレーター細胞により免疫し、前記の通りインビトロで再刺激せしめ、そしてＣＴＬ活性について試験した。図４Ｆにおいて示す結果は、５×１０6個のｅｎｖ発現性ＢＣｅｎｖ−２９スチムレーター細胞によるマウスの免疫化が、これらの条件のもとで最適なＣＴＬ応答性を発生せしめたことを示す。宿主の応答性に授けられる遺伝子的制御に関する徴候を提供するため、ベクター感染化ＨＩＶ ｅｎｖ−発現性ＢＣｅｎｖスチムレーター細胞のＢａｌｂ／Ｃ以外その他のＨ−２dマウス種におけるＣＴＬ応答を誘発せしめる能力について調べる更なる実験を行った。Ｈ−２dの異なる系（即ち、Ｂａｌｂ／Ｃ，ＤＢＡ／２，Ｂ１０．Ｄ２）及びＨ−２d×Ｈ−２dＦ１ハイブリドマウス〔即ち、ＣＢ６Ｆ１（Ｂａｌｂ／Ｃ×Ｂ６Ｆ１）；Ｂ６Ｄ２Ｆ１（Ｂ６×ＤＢＡ／２Ｆ１）〕を、ＢＣ ｅｎｖスチムレーター細胞により免疫し、そしてＣＴＬ応答性の誘発について試験した。図４Ｇが示すには、Ｆ１ハイブリドを含む全ての系が、異なる度合いでＢＣｅｎｖ標的細胞に対するＣＴＬ応答性を発生せしめた。ある系は親（即ち、非ＨＩＶ ｅｎｖ）標的細胞に対する応答性をも示したが、これらの応答性はＢＣｅｎｖ標的に対するそれよりも低かった。
ベクター感染化ＨＩＶ ｅｎｖ（株IIIＢ）−発現性ＢＣｅｎｖスチムレーター細胞のその他のＨＩＶ株（即ち、ＭＮ）に対する交差反応ＣＴＬ応答性を誘発せしめる能力を評価するための実験も行った。図４Ｈは、ベクター感染化ＢＣスチムレーター細胞のＨＩＶ ｅｎｖIIIＢ株により誘発されたＣＴＬが、IIIＢエンベロープ配列と類似するＲＰ１３５ペプチド（Javaherianら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6768,1989）により被覆されたＢＣ標的細胞を殺傷せしめることを示した。これらＣＴＬは、ＲＰ１４２（即ち、エンベロープタンパク質のＨＩＶ ＭＮ系と類似するペプチド）（Javaherianら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6768,1989）により被覆されたＢＣ標的細胞も殺傷せしめた。
マウスにおいてＣＴＬ応答を誘発せしめる、一過性−ＨＩＶ ｅｎｖ発現性スチムレーター細胞の能力を調べるための更なる実験を行った。これらの細胞は、使用する前にわずか２日でレトロウイルスベクターにより感染され、そしてスチムレーター細胞として利用する（即ち、マウスに注射する前に選別又はクローン化する必要がない）ことにより、前述したＢＣｅｎｖスチムレーター細胞から区別される。図４Ｉに示す結果は、ＨＩＶ ｅｎｖIIIｂベクター構造体を有するプラスミドＤＮＡ（その中でｃｍｖプロモーターはＨＩＶエンベロープタンパク質；ＢＣｐｃｍｖIIIｂの発現を作動せしめる）により、マウスへの注射の２日前に感染されたＢＣ細胞は、特異的なＣＴＬであって、インビトロでＢＣｐｃｍｖIIIｂ細胞により再刺激されることができ、そしてＢＣｐｃｍｖIIIｂ一過性−発現性標的細胞（ＢＣｐｃｍｖｅｎｖIIIＢ標的）及びＨＩＶ ｅｎｖIIIｂの安定な発現性についてクローン化され且つ選別された細胞系由来のレトロウイルス感染化ＢＣ細胞（ＢＣ−２９標的）を殺傷できうるＣＴＬを誘発せしめることを示した。このような特異的免疫ＣＴＬは、ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現せしめないＢＣ１０ＭＥコントロール細胞は殺傷せしめなかった。従って、Ｂ／Ｃ細胞一過性−発現性ＨＩＶエンベロープタンパク質はインビトロでの免疫応答の有効な誘発剤、インビボでの免疫ＣＴＬの再刺激剤（即ち、ＣＴＬアッセイ他における利用のため）、及びインビトロでの免疫ＣＴＬによる溶解についての標的細胞として働きうる。更に、同様の実験の結果を図４Ｊにおいて図示し、これはＢＣ細胞一過性−発現性Ｈ２−ＤｄがＨ２−Ｄｄ同種免疫（alloimmune）ＣＴＬによる溶解についての標的細胞として働くことを示す。
マウスにおける免疫応答性を誘発せしめる、その他のレトロウイルスベクター−コード化ＨＩＶ抗原の能力を評価するため、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｇａｇ／ｐｒｏｔをコード化するレトロウイルス構造体による実験も行った。図４Ｋに示す結果は、ネズミＣＴＬがｇａｇ／ｐｏｌ又はｇａｇ／ｐｒｏｔのいづれかによる免疫によって誘発され、それらはそれぞれの標的細胞、即ち、ＢＣ−１−１６Ｈ細胞（即ち、ｇａｇ／ｐｏｌベクターにより感染）又はＢＣ−１細胞（即ち、ｇａｇ／ｐｒｏｔベクターにより感染）のいづれかを殺傷できることを示す。
ｇａｇ／ｐｏｌ及びｇａｇ／ｐｒｏｔスチムレーター細胞により誘発されるＣＴＬ殺傷の特異性を評価するための更なる実験を行った。図４Ｌ及び４Ｍにおいて示す結果は、ｇａｇ／ｐｏｌ又はｇａｇ／ｐｒｏｔスチムレーター細胞により誘発されたＣＴＬがｇａｇ／ｐｏｌ（即ち、１−１５Ｈ）及びｇａｇ／ｐｒｏｔ（即ち、ＢＣ−１）標的細胞の両方を殺傷することを示した。この場合において、ＣＴＬによるこの殺傷は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｇａｇ／ｐｒｏｔの両方に共通の分散領域に向けられているであろう。
ヒトにおけるこの免疫刺激用途の実施は、（１）対象の抗原をコード化する遺伝子を細胞に運び入れること、（２）該抗原を適切な細胞において発現せしめること、並びに（３）ＭＨＣ制御要件、即ちクラスＩ及びクラスII抗原の相互作用が十分であること、を必要とする。好ましい態様において、ベクターの調製は正常培地中で提供細胞を増殖せしめ、この細胞をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１０mg／mlで加えたＰＢＳにより洗浄し、次いでこの細胞をＨＳＡの加えたＰＢＳで８〜１６時間増殖せしめることにより行われる。得られる力価は、ベクター、パッケージング系又は特定の提供系クローンに依存して一般に１０4〜１０6／mlである。このベクター上清液を細胞を除去するために濾過し、そして１００，０００又は３００，０００パスアミコンフィルター（Wolfら、Proc.Natl.Acad.Sci. 84:3344,1987）又はその等の同等のフィルターを通すことによって１００倍迄濃縮せしめた。これは１００，０００又は３００，０００の球状タンパク質を通過せしめるが、感染性粒子としてのウイルスベクターの９９％は保持せしめる。このストックは保存のために凍結することができ、しかしそれらは凍結融解に基づき約５０％の感染ユニットを失う。他方、このウイルスベクターは常用の技術によって更に精製できる。最も直接的な搬送は、適切な遺伝子運搬ベクターを個体に投与すること、及び適切な細胞を効率的に標的とし、これによって免疫応答の刺激を開始できるこのベクターの能力に基づく信頼性を含む。投与量は一般に体重のkg当り１０5〜１０6感染ユニットである。以下の実施例はマウスにおける免疫応答を刺激するための直接的なベクター注射の能力を示す。
Ｂ．レトロウイルスベクターの直接的な注射によるマウスにおける免疫応答の刺激
ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現を誘発せしめる組換レトロウイルスベクターのマウスにおける直接的な注射後の能力を評価するための実験を行った。ＫＴ−１ベクター構造体を有す約１０4〜１０5コロニー形成単位（ｃｆｕ）の組換レトロウイルスを３週間隔で２回、腹膜腔内注射（１Ｐ）又は筋肉内注射（ＩＭ）せしめた。このレトロウイルスの量はおよそ１００μgのタンパク質以下に相等すると測定され、これは一般的に免疫応答を刺激するには少なすぎる。ベクターの２回目の注射からおよそ７〜１４日後、ＣＴＬについての脾臓細胞を調製し、そしてＣＴＬを前記の通り照射せしめたＢＣ ｅｎｖスチムレーター細胞を用いてインビトロで再刺激せしめた（実施例２Ａ参照）。図４Ｎに示す結果は、Ｉ．Ｐ．及びＩ．Ｍ．ルートによる直接的な注射は、ＢＣｅｎｖ標的細胞（Ｉ．Ｍ．２Ｘ；Ｉ．Ｐ．２Ｘ）を殺傷するが、コントロールＢ／Ｃ細胞（Ｂ／Ｃ）は殺傷しないＣＴＬを発生せしめたことを示す。従って、１０4〜１０5単位のレトロウイルス（通常は免疫応答性を刺激しないタンパク質抗原の量）の注射は、自己の宿主おいて有意なレベルのＨＩＶエンベロープの発現を誘発せしめ、これは特異的なＣＴＬ免疫応答性の誘発をもたらした。
しかしながら、より実用的な手法は、患者の末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）、繊維芽細胞又は各個体に由来するその他の細胞と、該ベクター、提供細胞又はベクタープラスミドＤＮＡによる体外治療を含む。ＰＢＬはマイドジエン（植物凝集素）又はリンホカイン（例えばＩＬ−２）の利用を通じて培地の中に維持できる。以下の実施例は、タンパク質をコード化するベクターの発現を誘発せしめる、霊長類の細胞の体外治療の能力を示す。
Ｃ．タンパク質をコード化するベクターの発現を誘発するためのヒト細胞の体外処理
以下の実験を行った。ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）又は繊維芽細胞及びチンパンジーの真皮繊維芽細胞を、ネズミレトロウイルスベクター構造体（その中のサントメガロウイルス（ｃｍｖ）プロモーターは、レトロウイルス遺伝子発現性についてのマーカー酵素としてのβ−ガラクトシダーゼ（ｃｍｖβ−ｇａｌ）の発現性を作動せしめる）により感染せしめた。（より詳しいこのような「発現性マーカー」の利用の詳細は下記の章Ｖに記載され、そしてβ−ｇａｌマーカーを有すレトロウイルスベクターの操作も下記の実施例７に詳細にされている）。感染は、組換レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡの（ａ）エレクトロポレーション（２５０Ｖ）もしくはトランフェクション（ＣａＰＯ4／ポリブレン）、又は（ｂ）細胞を照射せしめたレトロウイルスベクター提供細胞と一緒に培養する方法を用いることによる、ベクター構造体ＲＮＡを有す組換レトロウイルスによる細胞のウイルス感染、又は（Ｃ）レトロウイルスベクター粒子による細胞の直接感染のいづれかにより達成される。表１に示す結果は組換β−ｇａｌレトロウイルスベクター構造体によるヒト及び霊長類細胞の感染を例示する。この結果は、組織化学染色法、即ち、青色を有す細胞の発生（青色細胞）をもたらすことにより識別化されうるβ−ガラクトシダーゼマーカー酵素の発現性を示す。
Figure 0004041535
このタイプのアプローチは、感染、発現のモニター、注射前の抗原提供細胞数の増大、及び対象の患者にベクター発現性細胞を戻すことを可能にする。その他のタイプの細胞も外植し、ベクターを導入し、そして患者にこの細胞を戻すことができる。中程度の感染細胞の数（１０5〜１０7）のみで、マウスにおける強い免疫応答をもたらすのに十分である。免疫応答を誘発するための投与量はおそらく動物又は患者それぞれ当りほぼ同程であり、そして体のサイズにほとんど依存しないであろう。
他の１の方法において、細胞を前記の通り体外的に感染せしめ、そして照射により不活性化せしめる（図４Ｅ参照）か、固定例えばホルマリンによって殺傷せしめる。ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子を有すベクターと処理せしめた後にＨＩＶ ｅｎｖを発現するベクターと処理せしめた細胞のホルマリン固定はＣＴＬ応答を強く誘発する。
その他の択一的な方法において、複合体としての対象の抗原及び適切なＭＨＣ分子の両方を含むスチムレーター細胞膜フラグメントを利用する。細胞をこのベクターに感染せしめ、遺伝子を発現させ、細胞を破壊し、そしてこの膜を遠心又はこのＭＨＣ−抗原複合体に特異的なアフィニティーカラムによって精製する。
更に他の択一的な方法において、免疫応答を患者の中でなく組織培養物中で刺激せしめ、そしてこの免疫細胞を患者に戻している。以下の実施例は組織培養における免疫ＣＴＬの誘発のための、このタイプの手法の能力を示す。
Ｄ．レトロウイルスベクターのコード化する抗原に対する免疫応答のインビトロ誘発
ヒト末梢血液リンパ球におけるインビトロ免疫応答を誘発する、レトロウイルスベクターがコード化する抗原の能力を評価するための実験を行った。ＰＢＬを、ルーコフェリシス（leukopheresis）及びフィコール−ヒパーク（Ficoll-Hypaqe）密度勾配沈降により提供者＃９９の血液から調製し、そして利用する迄２０％のＦＢＳ及び１０％のジメチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ培地中で、液体窒素において凍結保存した。ＥＢＶ−形質転換細胞系を調製するため、提供者＃９９由来の融解してすぐのＰＢＬを、ＯＫＴ３抗体及び補体を用いてＴリンパ球を除去（又はシクロスポリン処理する）し、そしてＢ９５ＥＢＶ−形質転換リンパ芽球細胞系からのＥＢＶ−含有培養上清液１mlを、２％のヒトＡマイナス血清を含むＲＰＭＩ培地全量５ml中の５×１０6個のＴ−除去ＰＢＬそれぞれに加えた。このＥＢＶ感染化細胞を９６穴丸底組織培養マイクロタイタープレート（２００ml／ウェル）に分配し、そしてウェルの底に識別できる細胞ペレットが観察される迄９５％大気／５％ＣＯ2中、３７℃で組織培養した。その後、この細胞をウェルから取り出し、組織培養皿及びフラスコにおいて増殖せしめ、そして定期的に継代せしめた。インビトロ免疫のためのＥＢＶ−ＨＩＶ ｅｎｖスチムレーター細胞を調製するため、１０7個のＥＢＶ−形質転換ＰＢＬを、ＫＴ−１ ＨＩＶ ｅｎｖレトロウイルスベクターにより生産的−感染化された提供細胞系由来の組織培養上清液（又は精製ウイルス）１０4ｃｆｕ／mlと、１０mlのＲＰＭＩ培地中で処理せしめた。このベクターはＧ４１８（ネオマイシン類似体）への耐性を授けるネオマイシン薬剤耐性遺伝子も含む。組織培養における３７℃での一夜のインキュベーション後、感染せしめたＥＢＶ−形質転換細胞を遠心により集め、そして１０％のＦＢＳも含む１mlのＲＰＭＩ培地に再懸濁せしめた。Ｇ４１８ ６００μg／mlをこの培地に加え、そしてこれを１００μlづつ９６穴丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに分配せしめることにより、ＥＢＶ−形質転換ＨＩＶ ｅｎｖ発現性細胞をネオマイシン耐性について選別した。このプレートを３７℃で組織培養し、識別できる細胞ペレットが観察されたらこの細胞を取り出し、増殖せしめ、そして組織培養において定期的に継代せしめた。ＨＩＶ ｅｎｖ発現性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのニトロセルロースブロット上のｇｐ１６０及びｇｐ１２０を同定するための、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対するモノクローナル抗体又はヤギ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって確認した。他方、ＨＩＶｅｎｖ発現性は、ＥＢＶ−形質転換ＨＩＶｅｎｖ発現性細胞の、多細胞シンシチアを形成するＳｕｐＴ１細胞を誘発せしめる能力、即ち、いくつかのＨＩＶエンベロープタンパク質により誘発されるＳｕｐＴ１細胞の特性をアッセイすることにより確認された。最後に、提供者＃９９、ＥＢＶ−形質転換化、ＨＩＶ−ｅｎｖ発現性リンパ芽球スチムレーター細胞を、細胞複製を阻止するために１０，０００Ｒで照射せしめた。インビトロで免疫化ヒトエフェクターＰＢＬを調製するため、１０7個融解直後の提供者＃９９細胞を、５％の熱不活性化Ａマイナスヒト血清、ピルビン酸及び非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ１６４０中で１０6個のＥＢＶ−形質転換ＨＩＶ ｅｎｖ−発現性スチムレーター細胞と混合せしめ、そしてこの細胞混合物を１〜５×１０6個の細胞／mlの最終密度となる迄組織培養において３７℃で７日間インキュベートした。７日後、このインビトロ免疫化エフェクター細胞を、照射せしめたスチムレーター細胞を再度添加することにより、更に５〜７日にわたり再刺激せしめた（前記と同様の方法において）。ＣＴＬアッセイのための標的細胞を調製するため、照射せしめたＥＢＶ−形質転換ＨＩＶ ｅｎｖスチムレーター細胞を実施例２Ａにおいて前記した通り、51Ｃｒと１時間インキュベートせしめた。51Ｃｒ放出殺傷アッセイも前記の通り（実施例２Ａ）行ったが、但し提供者＃９９のエフェクター細胞及び標的細胞を用いた。
図４Ｏにおいて示す結果は、ＫＴ１レトロウイルスベクターによりコード化されるＨＩＶエンベロープタンパク質（９９−ＥＢＶ−ＨＩＶ ｅｎｖ）を発現する自己ＥＢＶ−形質転換リンパ芽球標的細胞を殺傷せしめる、ヒト提供者＃９９ＰＢＬのインビトロ免疫化を示す。この結果は、ＥＢＶに対する自然の免疫性（提供者＃９９の血清におけるＥＢＶに対する抗体の存在により証明される、ＥＢＶに予めさらされたこと）に由来する、自己ＥＢＶ−形質転換細胞（９９−ＥＢＶ）の殺傷も示した。インビトロ免疫化提供者＃９９エフェクター細胞は低いレベルの正常なＰＨＡ−刺激化リンパ球（ＰＨＡブラスト）の、１００：１のエフェクター；標的細胞の比での殺傷も示し、おそらくこれはインビトロ培養にわたり、これらの細胞に潜伏しているＥＢＶの再活性化に起因する。
このアプローチは、ヒトＭＨＣ分子を発現しない又は低レベルのＭＨＣを発現する細胞の利用を可能にする（例えば、ヒト細胞突然変異体、腫瘍細胞、マウス細胞）。ＭＨＣクラスＩ又はクラスIIのそれぞれの遺伝子をＭＨＣ−細胞に感染させ、特定の細胞系においてそれぞれに関連するＭＨＣタンパク質を発現せしめた。以下の実施例は、免疫ＣＴＬに対する抗原の提供において機能的に活性な特定の細胞系における、ＭＨＣタンパク質の発現を誘発するこのタイプの手法の能力について示す。
Ｅ．ＭＨＣ及び抗原両者による細胞の感染
ネズミＨ−２遺伝子を有す、組換感染性レトロウイルスはＨ−２抗原の発現性及び提供を誘発するものと報され、従ってこのレトロウイルスに感染した細胞は同種免疫ネズミＣＴＬによる溶解についての標的細胞となる（Weis,J.H.ら、Molec. Cell Biol. ５：1379-1384,1985）。このケースにおいて、Ｈ−２抗原及びそのペプチド抗原性フラグメントはこの標的細胞により合成され、そしてこの標的細胞の天然生合成生成物である同種の「自己」ＭＨＣ分子と一体化する。
該細胞の天然生合成生成物でないＭＨＣ分子により提供される抗原を、（ａ）このＭＨＣを細胞に導入する際に、遺伝子の適切な発現、並びにそのタンパク質生成物の合成、折りたたみ、及びプロセッシングが可能となる状態において導入せしめ、従って細胞の中でこれが機能的に作用する場合、そして（ｂ）この抗原遺伝子をまた、抗原タンパク質の合成及びＭＨＣとのこのペプチド抗原性フラグメントとの適切な一体化を伴う遺伝子発現を可能にしうる状態において導入せしめる場合；に有すことができうることがその理由である。抗原及びＭＨＣ遺伝子両方による細胞の感染、並びに両方の遺伝子生成物の同時発現を評価するため、ＭＨＣ遺伝子としてネズミＨ２−Ｄｄ、抗原としてＨＩＶ ｅｎｖ、標的細胞としてヒトＨＴ１０８０、そしてエフェクター細胞としてネズミＨＩＶ ｅｎｖ免疫ＣＴＬを利用して実験を行った。この場合において、このヒト細胞はネズミＨ２−Ｄｄタンパク質及びＨＩＶエンベロープタンパク質を適切に発現しなくてはならず；このＨＩＶ ｅｎｖペプチド抗原フラグメントは機能性ネズミＨ２−Ｄｄタンパク質と一体化しなければならず；そして最後に、このヒト細胞におけるＨ２−Ｄｄペプチド状ＨＩＶ ｅｎｖ−Ｈ２−Ｄｄ複合体はヒト標的細胞が殺傷されるため、この複合体における抗原をＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ネズミＣＴＬに適切に提供しなくてはならない。図４Ｐにおいて示す結果は、ネズミＨ２−Ｄｄが導入され、且つその後ＫＴ−１ ＨＩＶ ｅｎｖベクター構造体（ＨＴ１０８０＋Ｄｄ＋ｅｎｖ）を有すレトロウイルスベクターにより感染せしめたＨＴ１０８０細胞が抗原を提供、そして前記の通りネズミＢＣ１０ｅｎｖ−２９細胞による免疫によりマウスにおいて誘発されたＣＴＬ（実施例２Ａ参照）によって殺傷されることを示す。これらのＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ＣＴＬは抗原特異性状態において殺傷せしめた。即ち、Ｈ−２Ｄｄ（ＢＣ−Ｄｄ）のみを発現し、ＨＩＶ ｅｎｖを発現しないコントロールＨＴ１０８０細胞又はＢＣ細胞の溶解は認められなかった。
同様の方法において、免疫ＣＴＬの誘発又は免疫ＣＴＬによる腫瘍細胞の殺傷のいづれかを促進せしめるため、腫瘍細胞をＭＨＣ遺伝子及び腫瘍抗原に感染せしめることができる。この方法において、自己免疫（即ち、患者由来）、同種免疫（即ち、その他のヒト提供者）又は異種免疫（即ち、動物由来）ＣＴＬを、腫瘍細胞を適切なＭＨＣ分子及び腫瘍抗原の両方により感染せしめることによって、ヒト腫瘍細胞の殺傷を促進せしめるために利用されうる。
異なるＭＨＣクラスに関する抗原を提供できる細胞系のバンクも、細胞をＭＨＣ遺伝子（もしくはそのフラグメント）又はＭＨＣ遺伝子と抗原遺伝子（もしくはそのフラグメントの両方に感染せしめることによって作製することができうる。わずかな種類のこれら（１０〜２０種）は大多数の人をカバー（即ち、合う）するであろう。例えば、ＨＬＡ Ａ２は約３０−６０％の人に存在する。非ヒト細胞の場合においては、それらはヒトＭＨＣ分子を一般的に発現する遺伝子導入動物（例えばマウス）に由来するか又は動物の系における導入遺伝子の存在に起因して特定の組織に由来しうる（Chamberlinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7690-7694,1988）。これらの細胞系は腫瘍細胞抗原又は感染性物質であってＣＴＬもしくは抗体誘発のためのタンパク質の主たるイムノドミナントエピトープを提供するものにおけるペプチド様抗原性フラグメントの地図化に有用でありうる。
上記の状態のいづれにおいても、提供又は提供に対する応答性は、待望又は未だ提供されていない免疫相互作用（例えばβ−ミクログロブリン、ＬＦＡ３，ＣＤ３，ＩＣＡＭ−Ｉ及びその他）に含まれるその他のタンパク質の細胞遺伝子に感染せしめることによっても高まることができる。β−ミクログロブリンは変異性でない、クラスＩＭＨＣの必須なサブユニットであり、ＣＤ３はＭＨＣ相互作用に含まれ、そしてＬＦＡ３及びＩＣＡＭ−Ｉ分子は免疫系の細胞の相互作用を高め（Altmannら、Nature 338:512,1989）、免疫刺激と同等のレベル迄の強い応答性をもたらす。
ヒトＭＨＣを発現する遺伝子導入マウスの場合において、マウスにおける刺激は異種抗原を発現する腹部遺伝子導入マウス細胞を用いることによって行なわれることができ、このため遺伝子はスチムレーターとしてウイルスベクター又はその他の手段により導入される。これにより発生するマウスＣＴＬはヒトＭＨＣに関連するＴ−細胞リセプターを発生せしめ、そして継代細胞免疫又は患者の治療（即ち、患者に注入する）のために利用できうる。
更なる択一性として、患者由来の細胞を利用し、ベクター輸送、又はその他の手段であって、ＭＨＣ発現を刺激せしめるタンパク質（例えばインターフェロン）をコード化する遺伝子の利用もしくはＭＨＣ遺伝子発現をコントロールする制御要素の利用を含む方法によって、適合するＭＨＣ遺伝子を導入せしめることにより、「自己」ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現を増強せしめる。ＭＨＣＩ発現におけるこのような増強は、異種抗原のより効率的な提供を、たとえそれらが既に患者細胞（例えば腫瘍細胞）に存在していようが、又は異種抗原をコード化するウイルスベクターを用いてその後加えようが、引き起こす。このことは、より強力な免疫応答を、たとえ低められたＭＨＣＩ発現性を有す細胞（例えばウイルス感染細胞又はある腫瘍のタイプ）が有効に削除されていたとしてももたらす。本発明のある態様において、感受性標的細胞を、（ａ）クラスＩもしくはクラスIIＭＨＣタンパク質それぞれ又はその組合せ；（ｂ）特定の抗原もしくは免疫応答を刺激できるそれらの改質型；（ｃ）ＭＨＣ及び（複数の）抗原；並びに（ｄ）前述した期待されているもしくは提供されていない免疫相互作用に含まれるその他のタンパク質；をコード化する核酸配列の組合せ、あるいは順序を変更したものにより感染せしめることができる。感染のそれぞれの工程は生体外又は生体内のいづれかで行うことができ、そして特定の細胞のタイプの殺傷は生体外又は生体内で行なわれることができる。
投与の異なる型は、レトロウイルスベクター粒子を作る提供系の内植である。これらは免疫学的に適合しない古典的な提供細胞系又は患者自体の細胞であることがあり、それらは外植し、処理し、そして戻す（ＶＩの択一的なウイルスベクターパッケージング技術（以下）を参照のこと）。両タイプの内植（１０5〜１０6個の細胞／体重kg）は、患者において限定された寿命を有すであろうが、体内においてそれらの周辺に、レトロウイルスの大量な細胞数（１０7〜１０10個）の感染をもたらすであろう。
どのような場合においても、ＨＩＶ免疫刺激治療の成功は、少量の血液を採取し、そしてｅｎｖ発現のもたらされた、ベクターにより感染された個体自身の細胞を標的として利用するＣＴＬ応答を測定することによってアッセイされる。
ＨＩＶ以外の病原性ウイルスを含む病原体に対するＭＨＣクラスＩ又はクラスII制御免疫応答を刺激せしめることを所望する場合、免疫応答を刺激せしめるであろうこのようなレトロウイルスに関連するエンベロープ又はその他の抗原が当業者によって確認されうる。一般に、免疫系の種々の要素（例えばＴH−，ＴC−，Ｂ−細胞）の誘発を引き起こすエピトープの組合せが存在する。更に、いくつかのエピートープは病原性、又は超可変性であるがイムノドミナントでありうる。本発明は所望するエピトープの組合せの「ミックスアンドマッチ」選別及び不要なエピトープの排除を可能にする。例えばＨＩＶにおいて、イムノドミナントＢ−及びＴ−細胞エピトープを有す多数の超変異性ループが、ベクターにより運ばれる遺伝子配列において連っていることがあり、これによってもたらされる免疫刺激は、臨床的に見い出されたＨＩＶ株の圧到に適している。以下の実施例はレトロウイルスベクターを用いる、それらのＣＴＬ−改質型の同定及び地図化のための方法を示す。
Ｆ．免疫応答性の地図化のための、ＨＩＶ抗原エピトープ及びその改質型を発現するベクター
実施例２（前記）において示す結果は、レトロウイルスベクター−コード化ＨＩＶ ｅｎｖにより免疫せしめたマウスは、ＨＩＶ ｅｎｖに特異的なクラスＩＭＨＣ−制御ＣＴＬ応答性を発生せしめることを示す。更に、実施例２において示される結果は、ＨＩＶ ｅｎｖIIIＢが、ＨＩＶ−IIIＢ及びＨＩＶ−ＭＮ変異体の両方のｇｐ１２０超可変性領域に由来する合成ペプチドにより被覆された標的細胞に溶解活性を示すＣＴＬを誘発せしめることを示した。ＣＴＬを誘発及び刺激せしめることにおいて反応性であり、そして免疫ＣＴＬによる標的の溶解を中介するペプチド抗原フラグメントをコード化するＨＩＶエンベロープ遺伝子内の領域の更なる地図化のため、前記の実施例１Ｆに記載の「Δループ」及び「チャンクＩ」組換レトロウイルスベクター構造体によって実験を行った。この「Δループ」は、エンベロープ遺伝子のＶ３ドメインにおいてｇｐ１２０超可変性ループの欠失を有す、ＨＩＶ−IIIＢｅｎｖ−コード化ベクター構造体であり、従ってＨＩＶ ｅｎｖの非ループ部のみを含む短くなったタンパク質（「ループレス」）が製造されうる。
ＣＴＬと反応性のＨＩＶエンベロープタンパク質内のペプチド様抗原性エピトープを地図化するため、ＢＣ細胞を感染するのに「Δループ」ベクター構造体を有すレトロウイルスを用い、これによって「ループレス」エンベロープの短い型を有す（即ち、ｇｐ１２０の超可変性ループのない）エンベロープタンパク質を発現する細胞（ＢＣｅｎｖΔＶ３細胞）を作る実験を行った。これら「ループレス」ＨＩＶ ｅｎｖ細胞を、それらのマウスにおけるＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ＣＴＬを誘発する能力について試験した。図４Ａに示す結果はパネルＡにおいてコントロールアッセイを、そしてパネルＢにおいて実験アッセイを含む。この結果が示すには、ＣＴＬはマウスにおいて「ループレス」ＢＣｅｎｖΔＶ３細胞によって誘発され、そしてこれらＣＴＬはＢＣｅｎｖΔＶ３細胞（パネル１Ｂ、図４Ｑ）及び全長エンベロープタンパク質を発現するＢＣｅｎｖΔＶ３標的細胞の両方を殺傷せしめた。ＣＴＬの特異性は、それらがＢＣ細胞（即ち、ＨＩＶ ｅｎｖを発現しない細胞）又はＲＰ１３５合成「ループ」ペプチドにより被覆されているＢＣ細胞の溶解をもたらさないこと、即ち、ＣＴＬを誘発するのに利用されるＢＣｅｎｖΔＶ３細胞の欠失、によって示された。図４Ｑに示すコントロールアッセイ（パネルＡ）は、ＲＰ１３５ペプチドにより被覆されたＢＣ細胞（ＢＣ−ＲＰ１３５）はＢＣｅｎｖ−「ループ」−免疫ＣＴＬに有効に抗原を提供し（即ち、ＢＣｅｎｖ−免疫ＣＴＬ）、そしてこれらはこのエフェクター細胞により特異的な状態において殺傷せしめられた。即ち、このＢＣｅｎｖ−免疫ＣＴＬはＢＣ細胞は殺傷せしめないが（陰性コントロール）しかしＢＣｅｎｖ標的細胞は殺傷せしめた（陽性コントロール）。従って、レトロウイルス−運搬組換ベクター構造体は、ＣＴＬを誘発し、且つ標的細胞に溶解をもたらしめるＨＩＶエンベロープタンパク質の領域の同定及び地図化のために利用できうる。
ＨＩＶエンベロープにおけるこのペプチド様抗原性領域の更なる地図化のため、ＢＣ細胞を感染せしめるのに「チャンク１」ベクター構造体を用い、これによってｇｐ１２０ループの隣りの領域においペプチド配列の欠損する「ループレス」エンベロープタンパク質を発現せしめる細胞を作製する実験を行った。図４ＲのパネルＡに示す結果は、「チャンク１」を発現する標的細胞（即ち、ＢＣｐＣＭＶチャンク１標的）はＨＩＶ ｅｎｖ−免疫ＣＴＬによって特異的に溶解されることを示した。即ち、これらＣＴＬはＢＣ１０ＭＥ細胞（陰性コントロール）は溶解せしめないが、ＨＩＶ ｅｎｖ発現性ＢＣ細胞（ＢＣｅｎｖIIIＢ標的）は溶解せしめた。図４ＲのパネルＢに示す結果も、ＢＣｐＣＭＶチャンク１標的細胞及びＨＩＶ ｅｎｖ発現性ＢＣ細胞（ＢＣｅｎｖIIIＢ１４Ｈ標的）が溶解されるが、ＢＣ１０ＭＥ細胞（ＢＥ１０ＭＥ標）が溶解されないことを示した。
所望する免疫応答を作り出す択一的な方法は、抗原−特異性Ｔ−細胞リセプター遺伝子を適切な細胞、例えばＴ−細胞へと運搬することである。イムノグロブリン分子の抗原認識部位についての遺伝子情報を、近親のＴ−細胞リセプターサブユニットα及びβの遺伝子における関連する部位の中に分子的に結合せしめることも可能である。このように変化せしめたタンパク質分子はＭＨＣ制御される必要はなく、そしてオリジナルのイムノグロブリンにより決定される抗原に特異的なＴH−及びＴC−細胞として働くことができる。他の手法は、ＮＫにおけるエフェクター分子についての遺伝子をＮＫ細胞に移し、これらの細胞に更なる非ＭＨＣ限定殺傷能力を授けることである。更に、特異的なイムノグロブリン遺伝子は、患者において特定の抗体分子の大量インビボ製造を引き起こすためにＢ細胞に運び入れる場合、同様に有用でありうる。
II．ブロッキング剤
多数の感染疾病、癌、自己免疫疾患及びその他の疾病は、ウイルス粒子と細胞、細胞と細胞、又は細胞と因子の相互作用を含む。ウイルス感染において、ウイルスは一般に感受性細胞の表層上のリセプターを介して細胞の中に入り込む。癌においては、細胞は他の細胞又は因子から信号を不適切に応答するかもしくは全っく応答しない。自己免疫疾患においては、不適切な「自己」マーカーの認識が存在する。本発明において、このような相互作用は、インビボで、相互作用におけるいづれかのパートナーの類似体を提供せしめることによって妨害されうる。
このブロッキング作用は細胞内的に、細胞膜上に、又は細胞外的に起こりうる。ウイルス又は特に、ブロッキングについての遺伝子を有すレトロウイルスベクターのこのブロッキンク作用は、感受性細胞の内側又は病原性の相互作用を局在的にブロックするためにこのブロッキングタンパク質の変形を分泌することにより中介されうる。
ＨＩＶの場合において、相互作用の２つの物質はｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質とＣＤ４リセプター分子である。従って、適切なブロッカーは病原性作用を引き起こさずにＨＩＶの入口をブロックするＨＩＶ ｅｎｖ類似体、又はＣＤ４リセプター類似体のいづれかであろう。ＣＤ４類似体は分泌され、そして隣接する細胞を保護するために働くことができ、そしてｇｐ１２０／ｇｐ４１は細胞内にのみ分泌又は製造され、従ってベクター含有細胞のみを保護するであろう。安定性又は補体溶解を高めるため、ヒトイムノグロブリン重鎖もしくはその他の成分をＣＤ４を加えることが好都合である。このようなハイブリド−可溶性ＣＤ４をコード化するレトロウイルスベクター宿主への運搬は、安定的なハイブリド分子の連続供給をもたらす。
ＨＩＶ ｅｎｖの発現をもたらすベクター粒子も前記の通りに作製されうる。どの部分が明白な病原性副作用を伴うことなくウイルスの収着をブロックできるかは当業者において明白であろう（Willeyら、J.Virol. 62:139,1988;Fisherら、Science 233:655,1986）。以下の実施例はＣＤ４ベクターの作製を詳細し、これにより感染性ベクター粒を作製した（図５）
実施例３
ｓＣＤ４ベクター
１．ｐＭＶ７．Ｔ４由来の１．７kbのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIＤＮＡフラグメント（Maddonら、Cell 47:333,1986）をＳＫ+のＨｉｎｃII部位にブラント末端リゲートせしめた。
２．ＸｂａＩ部を含むユニバーサル翻訳停止配列をＣＤ４フラグメントのＮｈｅＩ部位の中に挿入せしめた。
３．１．７kbのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメントを切り出し、そしてｐＡＦＶＸＭのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位にクローンせしめた。
これらのベクタープラスミドは実施例１に記載の通り、感染性ベクター粒子を作製するために利用できうる。
このような感染性ブロッキングベクターは培養におけるヒトＴ−細胞系に入れた場合、ＨＩＶ感染の広がることを阻止できる。感染性レトロウイルスベクター調製品の調製、濃縮及び保存は免疫刺激についてと同様である。投与の経路も同様であり、投与量は１０倍高い。利用できる他の経路は骨髄のアスピレーション（aspiration of bore marrow）、レトロウイルスベクターによる感染、そして患者へ、この感染化骨髄を戻すこと（Gruberら、Science 230:1057,1985）でありうる。この髄複製は細胞複製を介してこのベクターを増幅せしめうるため、免疫刺激の範囲における投与量が利用できる（１０5〜１０6／kg体重）。
どのような場合においても、この治療の効き目は疾病の進歩の通常の指標であって、抗体レベル、ウイルス性抗原生産、感染性ＨＩＶレベル又は非特異的感染のレベルを測定することによってわかる。
III．緩和剤の発現
病原性物質又は遺伝子の機能を阻害できる物質（又は「緩和剤」）の発現をもたらすベクター構造体を有す組換レトロウイルスを製造するため、前記と同様の技術が利用できうる。本発明において、「機能を阻害できること」は、緩和剤がこの機能を直接的に阻害するか、又は間接的に、例えば細胞の中に存在するある物質であって正常の場合は病原性物質を阻害しないものを阻害するものへと変換せしめることにより阻害することを意味する。ウイルス疾病についてのこのような機能の例には、収着、復製、遺伝子発現、集成及び感染細胞からのウイルスの外出を含む。癌細胞又は癌促進成長因子についてのこのような機能の例には、生存性、細胞複製、外部信号に対する変異した感受性（例えば接触阻害）及び抗−癌遺伝子タンパク質の製造の欠損又は突然変異型の製造を含む。
（ｉ）阻害緩和剤
本発明の１つの態様において、この組換レトロウイルスは、病原物質（例えばウイルス性又は悪性病における）の機能を妨害できる遺伝子の発現をもたらすベクター構造体を有す。このような発現は実質的に連続性であるか、又は病原性症状もしくは特定の細胞のタイプのいづれかに関連するその他の物質の細胞における存在に対する応答（「物質の認識」）のいづれかでありうる。更に、ベクター運搬は所望の細胞タイプ（例えばウイルス感染化又は悪性細胞）へのベクターの特異的な侵入を標的とすることによってコントロールされうる（以下参照）。
投与の好ましい方法は、ルーコホレシス（leukophoresis）であり、ここでは約２０％の個体のＰＢＬを任意の時間に取り出しそしてインビトロで処理せしめる。これにより、およそ２×１０9個の細胞が処理され、そして変換されうる。現状の最高の力価は１０6／ml程度であり、これは２〜２０リットルの出発ウイルス上清液を必要とする。反復治療も行なわれうる。他方、骨髄を処理してよく、そして前記の通りその効果を増幅せしめることができる。
更に、ベクターを生産するパッケージング細胞系を対象に直接注射し、組換ビリオンの連続生産を可能にする。適切な細胞のタイプには単球、好球、又はそれらの前駆体が含まれ、なぜならそれらの細胞は末梢血液の中に存在するが、それらはこの循環系から離れてビリオン生産の治療が必要とされうる血管外組織（特に中枢神経系）におけるウイルスの生産を可能にする。このような細胞系は宿主の免疫系によって異物として最終的に拒絶されうる。この宿主によるこれら異種細胞の最終的な破壊を確実にするため、この細胞系は条件的に致死タンパク質、例えばＨＳＶＴＫについての遺伝子を発現せしめるよう操作されうる。従って、薬剤アシクロビル（Acyclovir）（ACV）（HSVTKを発現する細胞に対して特異的に毒性である薬剤）は十分なベクターがインビボに提供された後にこれらの細胞を排除する。このようなパッケージング細胞系は連続細胞系であるか、又は宿主細胞から直接作られうる。
１つの態様において、対象の病原性遺伝子転写物（例えばウイルス遺伝子生成物又は活性化細胞癌遺伝子）に相補性のＲＮＡを発現するレトロウイルスのウイルスが、この転写物のタンパク質への翻訳の阻止、例えばｔａｔタンパク質の翻訳の阻止のために利用できうる。このタンパク質の発現はウイルスの複製のために必須であるため、このベクターを含む細胞はＨＩＶ複製に対耐であろう。このことを試験するため、このベクターαｔａｔ（図１０）を作製し、組換ビリオンとしてパッケージ化し、複製−コンピテントヘルパーウイルスの非存在下においてヒトＴ−細胞及び単球細胞系に導入せしめた。
第２の態様において、この病原性物質がパッケージングシグナルを有す一本鎖ウイルスである場合（例えば緩和剤がＨＩＶに向けられている場合ＨＩＶパッケージングシグナル）、ウイルスパッケージングシグナルに相補性のＲＮＡを発現させ、これによってこれらの分子とウイルスパッケージングシグナルとの結合は、レトロウイルスの場合において、このレトロウイルスＲＮＡゲノムの適切なエンカプシデーション（encapsidation）又は複製のために必要なステムループ形成もしくはｔＲＮＡプライマー結合を阻害せしめるであろう。
第３の態様において、病原性遺伝子の発現を選択的に阻止できる緩和剤又は病原性物質により生産されるタンパク質の活性を阻害することができる緩和剤を発現するレトロウイルスベクターを導入することができうる。ＨＩＶの場合において、１の例は突然変異ｔａｔタンパク質であってＨＩＶＬＴＲ由来のトランス活性発現の能力を欠損し、そしてｔａｔタンパク質の正状な機能を妨害する（トランスドミナント状態において）ものである。このような突然変異体はＨＩＬＶIIｔａｔタンパク質（「ＸIIＬｅｕ5」突然変異体、Wachsmaら、Science 235:674,1987を参照）と同定されている。突然変異トランスリプレッサーｔａｔはＨＳＶ−１における類似突然変異リプレッサーが示すのと同程度に複製を阻害するであろう（Friedmanら、Nature 335:452,1988）。
このようなトランス作用転写リプレッサータンパク質は組織培養において、任意のウイルス−特異的トランス作用転写プロモーターであってその発現性がウイルス特異的トランス活性化タンパク質（前記）により刺激されうるものを用いて選別される。ＨＩＶの特定の場合において、ＨＩＶｔａｔタンパク質を発現しそしてＨＩＶプロモーターにより作動するＨＳＶＴＫ遺伝子を発現する細胞系はＡＣＶの存在下で死滅するであろう。しかしながら、一連の突然変異ｔａｔ遺伝子をこの系に導入したら、適当な特性を有す突然変異体（即ち、野性型ｔａｔの存在下でＨＩＶプロモーターからの転写を抑制するもの）は増殖し、そして選別される。次にこの突然変異遺伝子をこれらの細胞から再び単離されうる。条件的に致死性のベクター／ｔａｔ系の多数のコピーを含む細胞系を利用することにより、生存している細胞系はこれらの遺伝子における内因性突然変異誘発によって引き起こされるのではないことが確認された。ランダムに突然変異された一連のｔａｔ遺伝子を次に「救出可能」レトロウイルスベクター（即ち、突然変異ｔａｔタンパク質を発現し、そして複製の細菌性起源及び細菌中での増殖及び選別のための薬剤耐性マーカーを含むもの）を利用してこれらの細胞に導入せしめた。このことは多数のランダム突然変異の評価を可能とし、そして所望する突然変異細胞系の容易な逐次的分子クローニングを可能にする。この方法は潜在的な抗ウイルス治療のための種々のウイルストランス転写作用活性体／ウイルスプロモーター系における突然変異の同定及び利用に採用されうる。
第４の態様において、この組換レトロウイルスは不活性な先駆体を病原物質の活性阻害剤へと活性化できる遺伝子生成物の発現をもたらすベクター構造体を運搬する。例えば、ＨＳＶＴＫ遺伝子生成物は、潜在性の抗ウイルスヌクレオシド類似体、例えばＡＺＴ又はｄｄｃをより効率的に代謝せしめるのに利用されうる。このＨＳＶＴＫ遺伝子は構成マクロファージ又はＴ−細胞−特異性プロモーターのコントロール下で発現され、そしてこれらの細胞のタイプへ導入されうる。レトロウイルス逆転写酵素及びこれによるＨＩＶ複製を特異的に阻害するため、ＡＺＴ（及びその他の抗ウイルス剤）はヌクレオチド三リン酸の型へと細胞メカニズムにより代謝されねばならない（Furmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8333-8337,1986）。ＨＳＶＴＫの構成的発現（ヌクレオシド及び広範囲にわたる基質特異性を有すヌクレオシドキナーゼ）は、これらの薬剤の生物学的活性ヌクレオチド三リン酸型へのより効率的な代謝をもたらす。ＡＺＴ又はｄｄｃ治療は従ってより有効となり、低投与量、低い一般的な毒性、及び生産的な感染に対するより高い能力となる。更なるヌクレオシド類似体であってそのヌクレオシド三リン酸型がレトロウイルス逆転写酵素に対する選択性は示すが、細胞の基質特異性の結果としてヌクレオシド及びヌクレオシドキナーゼがリン酸化されていないものは、より有効となりうる。代表的な方法の詳細を実施例４に記載する。
実施例４
ＡＺＴ及び類似体の抗ウイルス作用を潜在するためにデザインしたベクター
Ａ．以下の全てのレトロウイルスベクターは「Ｎ２」ベクターに基づく（Kellerら、Nature 318：149-154,1985）。結果として、最初に５′及び３′ＥｃｏＲＩ ＬＴＲフラグメント（２．８及び１．０kb（それぞれ））を、ベクター作製を促進せしめるためにポリリンカーを含むプラスミドにサブクローンせしめた（ｐＮ２Ｒ５〔＋／−〕を得るためにはＳＫ+へ；ｐ３１Ｎ２Ｒ５〔＋／−〕及びｐ３１Ｎ２Ｒ３〔＋／−〕を得るためにはｐＵＣ３１へ）。ｐＵＣ３１は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に更なる制限部位（ＸｈｏＩ，ＢａｌII，ＢｓｓII、及びＮｃｏＩ）を有すｐＵＣ１９の改質型である。１のケースにおいて１．２kbのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ５′ＬＴＲフラグメントを、ｐＮ２ＣＲ５を得るためにＳＫ+ベクターの同一の部位にサブクローン化せしめた。他のケースにおいては、スプライスドナー配列の６bpの欠損を含む５′ＬＴＲを１．８kbのＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ３１（ｐ３１Ｎ２５ｄｅｌｔａ〔＋〕）にサブクローン化せしめた。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子のコード化領域及び転写終結シグナルをプラスミド３２２ＴＫ（ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩにクローンせしめたＨＳＶＴＫの３．５kbのＢａｍＨＩフラグメント）から１．８kbのＢｇ（II／ＰｖｕIIフラグメントとして単離し、そしてＢｇｌII／ＳｍａＩ消化ｐＵＣ３１にクローンせしめた（ｐＵＣＴＫ）。終結シグナルの欠損を必要とする構造のため、ｐＵＣＴＫをＳｍａＩ及びＢａｍＨＩにより消化せしめた。残ったコード化配列及び接着末端ＢａｍＨＩ突き出しを以下のオリゴマー；
Figure 0004041535
から作った二本鎖オリゴヌクレオチドにより再構成せしめ、構造体ｐＴＫデルタＡを形成せしめた。
検査の目的のため、ＳｍａＩ部位を破壊しながら、翻訳タンパク質を変化させずにそのＡｖａＩ部位を保つようこのオリゴをデザインした。
０．６kbのＨＩＶプロモーター配列を、ｐＣＶ−１由来のＤｒａＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとして（Aryaら、Science 229:69-73,1985）、ＨｉｎｃII／ＨｉｎｄIII切断ＳＫ+にクローンせしめた（ＳＫＨＬ）
Ｂ．ＴＫ１及びＴＫ３レトロウイルスベクターの作製（図６参照）
１．５kbのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄIII５′ＬＴＲ及びプラスミド配列をｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）から単離した。
２．転写終結配列を欠損するＨＳＶＴＫコード化配列をｐＴＫデルタＡから１．２kbのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
３．３′ＬＴＲ配列をｐＮ２Ｒ３（−）から１．０kbのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離した。
４．段階１〜３のフラグメントを混合し、リゲートし、細菌に形質転換せしめ、そしてそれぞれのクローンを制限酵素分析により同定した（ＴＫ−１）。
５．ＴＫ−３は、ＴＫ−１をＢａｍＨＩにより直鎖状にし、５′突き出しを補完し、そしてブラント末端を、細菌性ｌａｃＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＴｎ５ Ｎｅｏr遺伝子を含む５′補完ＣｌａＩフラグメントにリゲートせしめることにより作製した。カナマイシン−耐性クローンを単離し、そして個々のクローンを、制限酵素分析によって適切な方向性についてスクリーンした。
これらの構造体を、パッケージング細胞系、例えば前記のＰＡ３１７と一体化した感染性組換ベクター粒子を作るために利用した。
このようなレトロウイルスベクターのヒトＴ−細胞及びマクロファージ／単球細胞系への投与は、ＡＺＴ及びｄｄＣの存在下で、レトロウイルスベクター処理されていない同一の細胞に比べて、それらのＨＩＶへの耐性が高められうる。ＡＺＴとの処理は通常より低いレベルとなることができ、毒性の副作用を回避でき、しかもＨＩＶの繁殖を有効に阻害する。治療の方法はブロッカーについて前記したものとなるであろう。
このレトロウイルスベクター調製品の調製、濃縮、及び保存は前記した通りでありうる。治療は前記した通りでありうるが、但し患者細胞の体外処理は感染されていない潜在的に感受性のＴ−細胞又は単球に向けられるであろう。感受性細胞を標的にする好ましい方法は、ＣＤ4 +細胞へベクター粒子の吸収をもたらす、ＨＩＶ ｅｎｖ又はハイブリドｅｎｖ（ＶIII章の細胞系特異性レトロウイルス（以下）を参照のこと）を有すベクターによる。
阻害緩和剤を提供する第５の態様は、ウイルスの集成を阻害する欠陥干渉ウイルス構造タンパク質の運搬及び発現を含む。ベクターは欠陥ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖもしくはその他のウイルス粒子タンパク質又はペプチドをコードし、そしてこれらはウイルス粒子の集成を優性な情況において阻害するであろう。このことは、このウイルス粒子の正常なサブユニットの相互作用がこれらの欠陥サブユニットとの相互作用により妨害されることにより起こる。
６番目のこのような態様は、ウイルスプロテアーゼに特異的なペプチド又はタンパク質の阻害の発現である。ウイルスプロテアーゼはウイルスのｇａｇ及びｇａｇ／ｐｏｌタンパク質を多数の小さいペプチドに切断せしめる。全てのケースにおいてこの切断を行えなくすることは、感染性レトロウイルス粒子の製造の完全な阻害をもたらす。ＨＩＶプロテアーゼはアスパルチルプロテアーゼとして知られ、そしてこれらはタンパク質又は類似体からのアミノ酸から作られるペプチドによって阻害されることが知られている。ＨＩＶを阻害するベクターは１又は複数のこのようなペプチドインヒビターの融合コピーを発現するであろう。
第７の態様は、サプレッサー遺伝子の運搬を含み、これらが削除、突然変異又は細胞のタイプにおいて発現されない場合、この細胞のタイプに腫瘍化をもたらす。ウイルスベクターによる欠損遺伝子の再導入はこれらの細胞における腫瘍表現型の退行をもたらす。このような癌の例には、網膜芽腫及びウイルム腫瘍がある。悪性腫瘍は、細胞増殖と比較して細胞終結分化の阻害であると考えられているため、分化をもたらす遺伝子生成物の搬送及び発現も一般に退行をもたらすであろう。
第８の態様において、レトロウイルス構造体（緩和剤の発現性を有す又は有さないもの）はそれ自身をウイルス、癌遺伝子又は病原性遺伝子に挿入せしめることによって治療効果を提供し、従って病原体に必要な機能を阻害する。この態様は、相同性組換、インテグラーゼ改質又はその他の方法（以下に詳細）により、このゲノムにおける特定の部位へのレトロウイルスの一体化の誘導を必要とする。
第９の態様において、このレトロウイルスベクターは、病原性機能に関連するＲＮＡ分子を分解、従って不活性化せしめるであろうリボザイム（ＲＮＡ酵素）（HaseloffとGerlach,Nature 334:585,1989）をコードすることによる治療効果を提供する。リボザイムは標的ＲＮＡにおける特異的な配列を認識することにより機能し、そしてその配列は通常１２〜１７bpであるため、これは特定のＲＮＡ、例えばＲＮＡ又はレトロウイルスゲノムの特定の認識を可能にする。更なる特異性は、これを条件的に毒性の緩和剤にすることによって達成される場合がある（以下参照）。
阻害的な緩和剤の効能を高める１つの方法は、対象のウイルスによる耐性細胞の感染率を高める遺伝子の発現と関連するウイルス性阻害遺伝子の発現である。この結果は生産的な感染現象と競合しうる非生産的な「行き止まり」現象である。ＨＩＶの特定のケースにおいて、ＨＩＶの複製を阻害し（前記のアンチセンスｔａｔ他を発現することにより）且つ感染のために必要なタンパク質、例えばＣＤ４をも過剰発現するベクターを搬送せしめることができる。この方法において、比較的少ない数のベクター感染化ＨＩＶ耐性細胞が、無ウイルス細胞又はウイルス感染細胞による複数の非生産的融合現象のための「シンク（sink）」又は「マグネット」として働く。
（ii）条件的毒性緩和剤
病原性物質を阻害する他の手法は、病原性の症状を発現する細胞に毒性な緩和剤の発現である。この場合において、プロウイルスベクター由来の緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を避けるため、例えば病原性状態を認識する細胞間シグナルのように、病原性物質に関連する要素の存在に限すべきであろう。この細胞−タイプ特異性は、病原性症状を有す、又はそれに感受性な細胞にこのベクターを運搬せしめる組換レトロウイルスを標的とすることにより、感染レベルで授けることもできうる。
本方法の１つの態様において、この組換レトロウイルス（好ましくは組換ＭＬＶレトロウイルス）は、迅速に増殖する細胞、例えば腫瘍においてのみ転写的に活性である、現象特異性プロモーター例えば細胞周期依存型プロモーター（例えばヒト細胞チミジンキナーゼ又はトランスフェリンリセプタープロモーター）により発現する細胞障害性遺伝子（例えばリシン）を含むベクター構造体を運搬する。この状態において、これらのプロモーマーからの転写を活性化できる因子を含む迅速に複製する細胞は、このプロウイルス構造体により生産されるこの細胞障害性物質によって優先的に破壊される。
第２の態様において、細胞障害性物質を生産する遺伝子は組織特異性プロモーターのコントロール下にあり、ここでこの組織特異性は腫瘍の起源に関連する。このウイルスベクターは優先的に複製細胞のゲノムに一体化するため（例えば、正常肝臓細胞は複製しない場合も肝細胞癌は複製する）、この２つのレベルの特異性（ウイルス一体化／複製及び組織−特異性転写制御）は腫瘍細胞の優先的な殺傷をもたらす。更に、現象特異性及び組織特異性プロモーター要素は人工的に組合わせることができ、従ってこの細胞障害性遺伝子生成物はこの両方の条件を満たす細胞タイプにおいてのみ発現されうる（例えば、上記の例においては、組合せたプロモーター要素は肝細胞を迅速に分割せしめることのみに機能的である）。転写コントロール要素も細胞タイプ特異性の緊張を高めるために増幅されうる。
これら転写プロモーター／エンハンサー要素は内在プロモーターとして存在する必要はないが（ウイルスＬＴＲの間にあること）、しかしウイルスのＬＴＲに加える又はウイルスＬＴＲにおける転写コントロール要素であってそれ自体が転写プロモーターであるものと交換せしめることより、条件−特異性転写発現がこの改良ウイルスＬＴＲにより直接的に発生するようにしてもよい。この場合において、最大の組換ウイルス力価を得るために、最大発現のための条件をレトロウイルスパッケージング細胞系において擬態せしめる必要があるか（例えば、増殖条件の変更、発現の必須なトランスレギュレーターを供給する、もしくはパッケージング系の親として適切な細胞系を用いること）、又はＬＴＲの改質を３′ＬＴＲＵ３領域に限定するかのいづれかとする。後者の場合において、１周期の感染／一体化の後、この３′ＬＴＲＵ３は５′ＬＴＲＵ３と共に、所望の組織特異性発現を付与せしめる。
第３の態様において、このプロウイルスベクター構造体は同様に活性化されるが、しかしこれは細胞障害性でないタンパク質を発現せしめ、そして標的細胞内においてわずかに細胞障害性であるか全っくそうでない化合物又は薬剤を細胞障害性のもの（「条件的致死」遺伝子生成物）へとプロセスせしめる。特に、このプロウイルスベクター構造体は、ヘルペス単一ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子をＨＩＶプロモーターの下流及びその転写コントロール下のもとで有す（これはＨＩＶｔａｔタンパク質で活性化されない限り、転写的にサイレントであることが知られている）。ＨＩＶにより感染され、そしてこのプロウイルスベクター構造体を有すヒト細胞におけるこのｔａｔ遺伝子生成物の発現は、ＨＳＶＴＫの生産の上昇を引き起こす。次にこの細胞を（インビトロ又はインビボのいづれかで）アシクロビル（acyclovir）又はその類似体（ＦＩＡＵ，ＦＩＡＣ，ＤＨＰＧ）に暴露せしめた。これらの薬剤はＨＳＶＴＫによりリン酸化された関連する活性ヌクレオチド三リン酸型となること（しかし細胞チミジンキナーゼによってはならない）で知られる（例えば、Schaefferら、Nature, 272:583,1978を参照のこと）。アシロクロビル及びＦＩＡＶ三リン酸は一般に細胞ポリメラーゼを阻害し、遺伝子導入マウスにおけるＨＳＶＴＫを発現する細胞の特異的な破壊をもたらす（Borrelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7572,1988）。この組換ベクターを含みそしてＨＩＶｔａｔタンパク質を発現するこれらの細胞は、これらの薬剤の特定の投与量の存在によって選択的に殺傷される。更に、特別なレベルの特異性が、このベクターにＨＩＶ ｒｅｖタンパク質、応答性ＣＲＳ／ＣＡＲ配列を含ませることによって得られる。このＣＲＳ配列遺伝子の存在下においては発現を抑制される（但し、ＣＡＲ配列及びｒｅｖタンパク質の存在下において）。実施例５はこの技術の例を提供する。
実施例５
ＡＣＶ又はその類似体の毒性作用を条件的に潜在せしめるベクター
ベクターの作製
Ａ．ｐＫＴＶＩＨＡＸの作製（図７参照）
１．９．２kbのＡｓｕII／ＸｈｏＩフラグメントをベクターｐＮ２ＤＮＡから単離した。
２．０．６kbのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩプロモーターフラグメントをプラスミドｐＳＫＨＬから単離した。
３．０．３kbのＢａｌII／ＡｃｃＩ及び１．５kbのＡｃｃＩ／ＡｃｃＩフラグメントをｐＵＣＴＫから単離した。
４．１，２及び３のこれらのフラグメントをリゲートし、細菌に形質転換せしめ、そして得られる適切なＡｍｐrクローンの構造を制限酵素分析によって同定した。
Ｂ．ｐＫＴＶＩＨ−５及びｐＫＴＶＩＨ５ Ｎｅｏレトロウイルスベクターの作製（図８参照）
１．ベクターｐ３１Ｎ２５デルタ（＋）から、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして、４．５kbの５′ＬＴＲ及びベクターフラグメントを単離した。
２．１．０kbの３′ＬＴＲを、ｐＮ２Ｒ３（＋）フラグメントからＡｐａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
３．０．６kbのＨＩＶプロモーター要素を、ｐＳＫＨＬからＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離した。
４．ＨＳＶＴＫコード配列及び転写終結配刷をｐＵＣＴＫから１．８kbのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離した。
５．１〜４のフラグメントを混合し、リゲートせしめ、細菌に形質転換せしめ、そして得られるクローンの構造を制限酵素分析により同定した（ｐＫＴＶＩＨ−５）。
６．プラスミドｐＫＴＶＩＨ５Ｎｅｏを、このｐＫＴＶＩＨ５をＣｌａＩにより直鎖状にし、細菌ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＴｎ５Ｎｅｏrマーカーを含む１．８kbのＣｌａＩフラグメントと混合し、リゲートせしめ、細菌に形質転換せしめ、そしてカナマイシン耐性について選別することによって作製した。
Ｃ．ＭＨＭＴＫ Ｎｅｏレトロウイルスベクターの作製（図９参照）
１．即時型プラスミドＭＨＭ−１ＬＴＲの作製
ａ）プラスミドｐＮ２ＣＲ５をＦｏＫＩにより部分消化により直鎖状にし、クレノウＤＮＡフラグメントを用いてデオキシヌクレオチド三リン酸によってこの５′突出しを補完し、そしてＨｉｎｄIIIリンカーを挿入せしめた。細菌に形質転換せしめた後、このＭＬＶ ＬＴＲ ＦｏＫＩ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカーを有すクローンを制限酵素分析により同定した（ｐＮ２ＣＲ５ＦＨ）。
ｂ）プラスミドｐＮ２ＣＲ５ＦＨをＮｈｅＩにより直鎖状にし、クレノウポリメラーゼによってこの５′突出しを補完し、ＨｉｎｄIIIで消化し、そしてプロモーターを有さないＭＬＶ配列を含む４．３kbのフラグメントを単離した。
ｃ）０．５kbのＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄIII ＨＩＶプロモーター配列をｐＳＫＨＬから単離した。
ｄ）ｂ）とｃ）を混ぜ、リゲートさせ、細菌に形質転換せしめ、そしてＭＨＭ−１の構造を制限酵素分析によって確認した。
２．ＭＨＭ−１から単離した０．７kbのＥｃｏＲＶ／ＢａｌＩフラグメントを、プラスミドＩ３０Ｂ（ポリリンカーにおいてＢｇｌII，ＢｓｔII，ＮｅＯＩ及びＮｄｅＩ部位を更に含む改良ＩＢＩ ３０ プラスミド）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンせしめた。細菌に形質転換せしめた後、適切な方向性を有すクローンを制限酵素分析（ｐＭＨＭＢ）により同定した。
３．プラスミドｐＭＨＢをＡｐａＩとＸｈｏＩにより消化せしめ、そしてゲル精製した。
４．ＭＨＭ−１をＡｐａＩ／ＢａｍＨＩにより消化し、そして１．８kbのＭＨＭＬＴＲ／リーダー配列をゲル精製した。
５．Ｎｅｏrを作動せしめるＳＶ４０初期プロモーターの上流の領域をコード化するＨＳＶＴＫを含む２．８kbのＢｇｌII／ＳａｌＩフラグメントをｐＴＫ−３から取り出した（図３参照）
６．３〜５を混ぜ、リゲートせしめ、細菌の形質転換に用い、そして制限酵素分析によって適切なクローンを同定した。
このベクター及び類似のベクターであってそれらのＬＴＲに誘発性の要素を含むものは、付加された安全性をもたらす。簡潔に述べると、このＬＴＲはＨＩＶの非存在下において不活性であるため、望ましくない宿主遺伝子（例えばプロト−癌遺伝子）の挿入下流活性化が発生しない。しかしながら、パッケージング細胞系におけるｔａｔ発現は、組織培養におけるビリオンの操作性を促進せしめる。
Ｄ．ＲＲＫＴＶＩＨレトロウイルスベクターの作成（図１０参照）
１．９．２kbのＡｓｕII／ＸｈｏＩフラグメントをベクターｐＮ２ＤＮＡから単離した。
２．０．６kbのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ ＨＩＶプロモーターフラグメントをプラスミドｐＳＫＨＬから単離した。
３．このＨＩＶ ｒｅｖ応答性ＨＳＶＴＫ（ＲＲＴＫ）を以下の方法で作製した：
ａ）このＨＳＶＴＫ遺伝子を１．８kbのＨｉｎｃII／ＰｖｕIIフラグメントとして、ベクターＳＫ+（ｐＳＴＫ〔−〕）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンせしめた。
ｂ）ＨＩＶ ｅｎｖに由来するＣＲＳ／ＣＡＲ要素を含む１．８kbのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを修復せしめ、そしてベクター１３０ＢのＳｍａＩ部位にブラント末端リゲートせしめた（ｐＣＲＳ／ＣＡＲ〔＋／−〕）。１３０Ｂは、ｐＶＣ３１と同じ更なる制限部位を含み、そしてＩＢＩ３０ＸｈｏＩ部位の代りにＮｄｅＩ部位を含む改良ＩＢＩ３０である。
ｃ）ベクター及びＨＳＶＴＫポリアデニル化シグナルを含む３．６kbのＢｓｓＨII／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＳＴＫ（−）から単離した。
ｄ）１．８kbのＢａｍＨＩ／ＢｓｓＨII ＣＲＳ／ＣＡＲフラグメントをｐＣＲＳ／ＣＡＲ（−）から単離した。
ｅ）１．２kbのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩコード配列フラグメントをｐＣＲＳ／ＣＡＲ（−）から単離した。
ｆ）Ｃ，Ｄ及びＥをリゲートさせ、そして適切な組換体を制限酵素分析によりスクリーンした。
４．Ｒｅｖ−応答性ＨＳＶＴＫを３．６kbのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントとして単離した。
５．１，２及び４をリゲートさせ、そして適切な組換体を制限酵素分析により同定した。
Ｅ．ｔａｔ及び抗−ｔａｔ発現ベクターの作製（図１１参照）
これらのベクターは、活性化ｔａｔ−依存型ＨＳＶＴＫベクターを試験するための疑似−ＨＩＶとして利用される。
１．Ｈｉｓr発現ベクターｐＢａｍＨｉｓをＢａｍＨＩにより直鎖状にし、そして牛小腸アルカリホスファターゼにより処理した。
２．ｐＣＶ−１のＳａｃＩ部位をＢａｍＨＩ部位へと突然変異させ、そしてＨＩＶ−ｔａｔをコードする３５０bpのＢａｍＨＩを単離した。
３．段階１と２において精製したフラグメントを混合し、リゲートさせ、そして細菌の形質転換に用い、そして両方向性においてｔａｔを有すクローン（ｔａｔ又は「アンチセンス」ｔａｔを発現するもの）を制限酵素分析により同定した。
パッケージング細胞系、例えば前記のＰＡ３１７と一体化する感染性組換ベクター粒子を作るためにこれらの構造体を利用した。これらのベクターは遺伝子的に安定であり、そして個々の感染細胞のクローンに由来する予測されたプロウイルス構造をもたらし、これは制限−酵素−消化−遺伝子ＤＮＡのサザンブロット分析により判定されている（試験クローンのうち３９／４０が予測されたサイズのプロウイルスを有した）。
これらレトロウイルスベクターの生物学的特性は以降に詳細する。このＨＩＶ ｔａｔ遺伝子（「tathis」ベクター：図１１参照）をマウスＰＡ３１７細胞に導入せしめた。５個の独立したヒスチジノール耐性サブクローンが得られ（ＴＨ１−５）、それらはＨＩＶ ｔａｔを発現する。これらの細胞を従ってＨＩＶ感染の実験標品とした。これらのベクターＫＴＶＩＨＡＸ，ＫＴＶＩＨ５ＮＥＯ及びＭＨＭＴＫＮＥＯを、これらｔａｔ発現性細胞系並びにそれられの親細胞であってｔａｔを欠くものの中に感染によって逐次導入せしめた。次に細胞の生存性を種々の濃度のＨＳＶＴＫ−特異性細胞障害薬アシクロビル（ＡＣＶ）において測定した。
データーはＬＤ５０としてここで報造する（５０％の毒性が観察される薬剤濃度）。このベクターを含むがｔａｔの欠く親細胞系（非−ＨＩＶ−感染化標品）は、試験した濃度でＡＣＶによる障害が認められなかった（図１２参照）。これらの細胞は障害されるためには１００μＭ以上のＡＣＶを必要とした。これは、このベクターを欠く細胞も同様であった。従ってベクター単独、ＡＣＶ単独、又はベクタ＋ＡＣＶ（べた塗り枠）は細胞障害性でない。しかしながら、ＨＩＶ ｔａｔを発現する細胞系（ＨＩＶ感染の代表的な実験）はＡＣＶにより効率的に殺傷された。これは試験した３種のベクター全てについての程度の変化において同様であった。これらのデーターが示すには、ＨＩＶ−感染化細胞はＡＣＶ及び「潜在性」ベクターの存在下において殺傷されうることである。
類似の実験において、ベクターＫＴＶＩＨＡＸ及びＫＴＶＩＨ５Ｎｅｏを、ヒトＴ細胞並びに単球細胞系ＳｕｐＴ１，ＨＬ６０及びＵ９３７細胞に感染によって導入せしめた。その後、これらの細胞をｔａｔｈｉｓ又はｄｔａｔベクターにより感染せしめ、ヒスチジノールで選別し、そして種々の濃度のＡＣＶ類似体、ＦＩＡＶで細胞生存率を調べた。表１（以下）に報告するＬＤ５０が示すには、ベクターに依するＦＩＡＶ毒性の上昇がＨＩＶの非存在下において起き、しかしｔａｔが存在すると更に１０〜２０倍上昇することである。このことは、ＨＬ６０細胞以外の全てにおいてＨＳＶＴＫ発現のベースラインが存在するにもかかわらず、ＨＩＶ ｔａｔの存在下で発現は更に大きくなることを示唆する。
Figure 0004041535
同様に、ヒトＴ−細胞系Ｈ９＋／−ＦＩＡＵは、５倍のＨＩＶ感染の優先的阻害（細胞殺傷を通じて）を示した。まず培養物をベクターで処理し、次にＨＩＶに４日間にわたりさらした。次いでウイルス上清液をＩＶ章で詳細にＨＩＶアッセイを用いて検定した。
ＨＩＶ感染化細胞の場合において、条件的致死ＨＳＶＴＫ遺伝性の発現は、転写におけるシス−作用要素（“ＣＲＳ／ＣＡＲ”）を含ませることによってよりＨＩＶ−特異性とすることがき、これは更なるＨＩＶ遺伝子生成物ｒｅｖを最適活性のために必要とす（Rosenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 35：2071,1988）。このようなｔａｔ−及びｒｅｖ応答性ベクター（ＲＲＫＴＶＩＨ）を作製し（図１０参照）、そして両性的ウイルスが作製された。より一般的には、ｍＲＮＡにおけるｃｉｓ要素はｍＲＮＡの安定性又は翻訳能力を調節することを示す場合がある。このタイプの配列（即ち、遺伝子発現の転写後の制御）はベクター遺伝子発現の現象−又は組織−特異性制御に利用されうる。更に、このような配列の複合化（即ち、ＨＩＶのためのｔａｔ−応答性「ＴＡＲ」要素又はｒｅｖ−応答性「ＣＲＳ／ＣＡＲ」）はより高い特異性をもたらしうる。細胞における不活性前駆体の活性化生成物へのこのような種類の条件的活性化は、短い効果を有すその他のウイルスベクター、例えばアデノウイルスを用いることによっても達成されることが理解されるであろう。このようなベクターは、数日から１ケ月位の期間にわたり、細胞の中に効率的に侵入し、且つ該ベクターによりコードされるタンパク質を発現せしめることができる。この時間の長さは、ＨＩＶ及び該組換ウイルスの両者によって感染化された細胞の殺傷を十分に可能にし、該組換ウイルスを運搬する遺伝子の発現性のＨＩＶ依存型活性化をもたらす。次にこの遺伝子発現は不活性な前駆体の活性化（即ち、致死性）生成物への変換を可能にする。
ベクター調製品の調製、濃縮及び保存は前記した通りである。投与は前記と同様に直接的なインビボ投与又はＰＢＬ及び／もしくは骨髄の体外処理による。投与量は実施例４とほぼ同じレベルでありうる。ウイルスベクター感染を標的とすることは、ＣＤ４リセプターを介するではなく、リセプターとしてＨＩＶ ｅｎｖタンパク質（ｇｐ１２０）を用いて細胞を感染せしめるベクター粒子を製造することを介することにより成し遂げられうるであろう。このようなＨＩＶ−トロピックウイルスは、細胞膜に自然に高レベルのＣＤ４タンパク質を有する細胞（例えばＳｕｐＴ１細胞）又はタンパク質を発現する任意の「操作された」細胞タイプから作製されたＭＬＶ−べースパッケージング細胞系から作られうる。得られるビリオン（それ自体の細胞膜から出現することにより形成されるもの）はその膜においてＣＤ４タンパク質を含む。ＣＤ４を含む膜はＨＩＶ ｅｎｖを有す膜と融合するため、これらのビリオンはＨＩＶ ｅｎｖを含む膜と融合し、そして表層にｇｐ１２０を有すＨＩＶ感染化細胞の特異的な感染をもたらすであろう。このようなパッケージング細胞系は、感染性ビリオンをもたらす適切なビリオン集成及び発生を可能とするＭＬＶ ｅｎｖタンパク質の存在を必要としうる。もしそうならば、ヒト細胞に感染しないＭＬＶ ｅｎｖ（例えばエコロトロピック（ecotropic）env）は用いることにより、ウイルスの侵入はＣＤ４／ＨＩＶ ｅｎｖ相互作用を介してのみ起き、そしてＭＬＶ ｅｎｖ細胞リセプターを介しては起きないことにすることができる。これはおそらく感染のためのＨＩＶ−ｅｎｖの存在に依存しないであろう。他方、ＭＬＶ ｅｎｖのための要件はハイブリドエンベロープであって、そのアミノ−末端結合性ドメインがＣＤ４のアミノ−末端ＨＩＶ−ｅｎｖ結合性ドメインに置き代ったものにより満足されうる。正常なウイルス−リセプター相互作用のこの変換は全てのタイプのウイルスであってその細胞リセプターが同定されているものに利用される。
先の態様と類似の方法において、該レトロウイルスベクター構造体リン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化又はその他のプリン−もしくはピリミジンベース薬剤の代謝のための遺伝子を運搬することができる。この遺伝子は哺乳動物細胞において相当するものないであろう。そしてそれらは例えばウイルス、細菌、菌類又はプロトゾーンに由来するであろう。この例には、チオキサンチンの存在下において致死性のＥ．コリ（E. coli）グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子生成物が挙げられる（Besnardら、Mol.Cell.Biol. ７:4139-4141,1987参照）。このタイプの条件的致死遺伝子生成物は、有効な細胞障害剤となるために細胞内リボシル化又はリン酸化をしばしば必要とする、多数の現在知られているプリン又はピリミジンベース抗癌剤に潜在用途を有す。この条件的致死遺伝子生成物は、プリン又はピリミジン類似体でない非毒性剤を細胞障害性の型へと代謝することもできる（Searleら、Brit.J.Cancer 53:377-384,1986を参照）。
一般に哺乳類のウイルスは、その他のウイルスプロモーター要素に由来する逐次的な転写活性に必要な「即時型初期」遺伝子を有す傾向にある。この種の遺伝子生成物はウイルス感染の細胞内シグナル（又は「認識因子」）のための優れた候補である。従って、このようなウイルス「即時型初期」遺伝子生成物に応答性の転写プロモーター要素からの条件的致死遺伝子は、任意の特定のウイルスに感染された細胞を特異的に殺傷せしめる。更に、ヒトα及びβインターフェロンプロモーター要素は広範囲にわたる無関係なウイルスにより感染への応答において転写活性化されるため、例えばこのようなウイルス−応答性要素（ＶＲＥ）由来するＨＳＶＴＫのような条件的致死性遺伝子生成物を発現するベクターの導入は、種々の異なるウイルスにより感染された細胞の破壊をもたらすことができる。
第４の態様において、この組換レトロウイルスは、それ自体は毒性でないが、しかしあるタンパク質、例えばウイルス又はその他の病原体に特異的なプロテアーゼによりプロセスもしくは改質された場合に毒性の型へと変化する生成物を特定する遺伝子を運搬する。例えば、この組換レトロウイルスは、ＨＩＶプロテアーゼによるプロセッシングによって毒性となるリシンＡ鎖のプロタンパク質をコードする遺伝子を有することができる。より詳しくは、この毒性リシン又はジフテリアＡの合成的不活性プロタンパク質の型を切断せしめて活性の型にする。これは認識されるＨＩＶウイルスコードプロテアーゼを用意しそして適当な「プロ」要素を切断することによる。
第５の態様において、このレトロウイルス構造体は細胞における認識因子（例えばＨＩＶ ｔａｔタンパク質）の存在に応答性の、標的細胞の表層において「リポーティング生成物」を発現しうる。この表層タンパク質は細胞障害性因子、例えばリポーティングタンパク質に対する抗体又は細胞障害性Ｔ−細胞によって認識されうる。類似の方法において、このような系は、認識されるタンパク質、例えばＨＩＶ ｔａｔ遺伝子を発現する特定の遺伝子を有す細胞の簡単を同定のための検出系に利用できる（以下参照）。
同様に、第６の態様において、それ自体が治療に有利な表層タンパク質が発現されることができる。ＨＩＶの特定のケースにおいて、特にＨＩＶ感染化細胞におけるヒトＣＤ４タンパク質の発現は２通りの方法において有利でありうる。
１．ＣＤ４のＨＩＶ ｅｎｖへの細胞間結合は、系統的クリアランス及び考えられる免疫原性の問題を伴うことなく、可溶性ＣＤ４が自由ウイルスに対して示すのと同程度に生存ウイルス粒子の形成を阻害することができる。その理由は、このタンパク質は膜結合し続け、そしてこれは内因性ＣＤＴ４（患者は免疫的に耐性である）と構造的に同一であるからである。
２．ＣＤ４／ＨＩＶ ｅｎｖ複合体は細胞死の原因と関連するため、ＣＤ４の更なる発現は（ＨＩＶ−感染化細胞に存在する過剰のＨＩＶ−ｅｎｖの存在下において）より迅速な細胞死をもたらし、従ってウイルスの繁殖を防ぐ。このことは、細胞のＨＩＶ−誘発細胞障害性に対する相対不応性（これは、それらの細胞表層におけるＣＤ４の相対欠損に起因することと理解されている）の結果としてのウイルス生産に対する受容体として働く単球又はマクロファージに特に適用しうる。
実施例６
ｐ４ＴＶＩＨＡＸレトロウイルスベクターの作製（図１３参照）
１．９．４kbのＡｓｕII／ＸｈｏＩフラグメントをｐＮ２から単離した。
２．０．６kbのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ ＨＩＶプロモーターをｐＳＫＨＬから単離した。
３．１．４kbのヒトＣＤ４をコード領域を発現ベクターｐＭＶ７Ｔ４からＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＹ１（ＸｈｏII）フラグメントとして単離した。
４．ＨＳＶＴＫの（Ａ）nシグナルを０．３kbのＡｐａＩ／ＳｍａＩフラグメントとして単離し、Ｔ４ポリメラーゼとｄＮＴＰで３′修復せしめ、そしてｐＵＣ３１のＳｍａＩ部位にクローン化せしめた。細菌への形質転換後、方向性についてクローンを制限酵素分析によってスクリーンした（ｐ３１〔Ａ〕ｎ〔＋／−〕）。次に０．３kbの（Ａ）ｎシグナルを０．３kbのＢｇｌII／ＡｃｃＩフラグメントとして単離した。
５．次に０．３kbの（Ａ）ｎフラグメントを０．３kbのＢｇｌII／ＡｃｃＩフラグメントとして単離した。
５．１〜４のクローンを混合し、リゲートさせ、細菌の形質転換に用い、そしてクローンを制限酵素分析によって同定した。
組換両性（amphotrophic）レトロウイルが製造でき、そしてヒト単球及びＴ−細胞であってＨＩＶ ｔａｔ発現ベクター、tathisを有す又は有さないものに導入せしめた。ＨＩＶｅｎｖ発現マウス繊維芽細胞によるシンシチアアッセイが示すには、単球細胞系ＨＬ６０及びＵ９３７自体はこれらの細胞と融合するための十分なＣＤ４を欠いていることである。しかしながら、ＨＬ６０及びＵ９３７細胞はであってベクター４ＴＶＩＨＡＸを含むものは、ＨＩＶ ｔａｔが存在する場合はリポーター細胞（ＨＩＶ−ｅｎｘ発現細胞）と融合でき、しかし非存在下では融合できない。これらのデーターは、ＣＤ４発現が誘発性であり、そして生物学的に活性（シンシチア形成により判断）であることを示唆する。ヒトＴ細胞系、Ｈ９におけるベクターによる実験は、ＨＩＶ感染に起因する特別に高い毒性及び比較的低いＨＩＶ力価（このベクターを欠くＨ９細胞において提供されるＨＩＶ力価より１／２００以下）を示した。
第７の態様において、このレトロウイルスベクターは、このベクター感染化細胞の生存のために必須なＲＮＡ分子を分解及び不活性化せしめるリボザイムをコード化する。病原性因子、例えばＨＩＶ ｔａｔに関連する細胞内シグナルに依存してリボザイム提供を行うことにより、毒性は病原性因子に特異的になる。
IV．免疫ダウンレギュレーション
前記で簡潔に述べ通り、本発明は該レトロウイルスにより感染された標的細胞における免疫系の１又は複数の要素を抑制できるベクター構造体を運搬する組換レトロウイルスを提供する。
不適切又は不要な免疫応答、例えば慢性肝炎又は異種組織例えば骨髄の移植における免疫応答の特異的なダウンレギュレーションは、移植（ＭＨＣ）抗原の表層発現を抑制する免疫−抑制ウイルス遺伝子生成物を用いることによって操作できる。グループＣアデノウイルスＡｄ２及びＡｄ５はウイルスのＥ３領域においてコード化される１９kdの糖タンパク質（ｇｐ１９）を保有する。このｇｐ１９分子は細胞の小胞体におけるクラスＩＭＨＣ分子と結合し、そして末端グリコシル化及び細胞表層へのクラスＩＭＨＣのトランスロケーションを妨げる。例えば、骨髄移植の前に、提供者の骨髄細胞をｇｐ１９−コード化ベクター構造体により感染せしめることができる。これはｇｐ１９の発現に基づき、ＭＨＣクラスＩ移植抗原の表層発現を阻止する。このような提供者細胞は、移植拒絶の低い危険性を伴って移植されることができ、そしてこの移植患者のために最小なる免疫抑制因子で十分となりうる。このことは、少ない合併症を伴う、有用な提供者−受容者キメラ状態の存在を可能にする。同様の処理は、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、リウマチ様関節炎又は慢性Ｂ型肺炎感染を含む自己免疫疾患と称される範囲の疾病の治療にも利用されうる。
他の方法は、アンチセンス情報、リボザイム又はその他の、自然において自己応答性のＴ細胞クローンに特異的な、特定の遺伝子発現性阻害因子の利用を含む。これらは自己免疫応答に重要な、特に不要なクローンのＴ−細胞リセプターの発現性をブロックする。このアンチセンス、リボザイム又はその他の遺伝子は、ウイルスベクター運搬系を用いて導入されうる。
Ｖ．マーカーの発現
ある認識因子に応答性の、細胞における緩和剤を発現せしめる前記の技術は、認識タンパク質を発現する細胞における特定の遺伝子の検出を可能とするために改良できる（例えば、特定のウイルスにより運搬される遺伝子）。それ故、このウイルスを有する細胞は検出されうる。更に、この技術は、ウイルス（例えばＨＩＴＶ）に一体化した認識タンパク質を有す細胞の臨床サンプル中のウイルスの検出を可能とする。
この改良は、容易に同定されるある生成物をコード化するゲノムを提供し（マーカー生成物）、そしてこのリポーティング生成物の発現性を発現と非発現状態の間でスイッチせしめることによってインディケーター細胞における認識タンパク質の存在に応答するプロモーターを運搬することによって成し遂げられる。例えばＨＩＶは、適当なインディケーター細胞に感染すると、ｔａｔ及びｒｅｖを作り出す。従って、このインディケーター細胞に、マーカー遺伝子例えばアルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子及びこのマーカー遺伝子の発現をコントロールするプロモーター、例えばＨＩＶプロモーターをコードするゲノムを付与せしめることができる（例えば、適切な組換レトロウイルスによる感染による）。このインディケーター細胞を試験すべき臨床サンプルと接触させ、そしてこのサンプルがＨＩＶを含む場合、このインディケーター細胞はＨＩＶにより感染され、その中にｔａｔ及び／又はｒｅｖ発現性がもたらされる。従って、このインディケーター細胞におけるＨＩＶ発現性コントロールは、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ（マーカー生成物）の遺伝子の発現性を通常「オフ」から「オン」にスイッチせしめることにより、ｔａｔ及び／又はｒｅｖタンパク質に応答するであろう。β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼのケースにおいて、この細胞を基質類似体に接触させることは、もしこのサンプルがＨＩＶについて陽性ならば色又は蛍光の変化をもたらす。ルシフェラーゼの場合、サンプルをルシフェリンと接触させることは、もしこのサンプルがＨＩＶについて陽性ならばルミネッセンスをもたらすであろう。細胞内酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼについては、このウイルス力価は着色もしくは蛍光細胞を直接計測することにより、又は細胞抽出物を作製し、そして適切なアッセイを行うことにより測定されうる。膜結合型アルカリホスファターゼについても、ウイルス力価は蛍光基質を用いて細胞表層に基づく酵素アッセイを行うことによっ測定されうる。分泌型酵素、例えば操作せしめたアルカリホスファターゼの型については、活性について少量の培養上清液のサンプルがアッセイされ、これは単一培養物の時間における連続モニターを可能とする。従って、このマーカー系の異なる型は異なる目的のために利用されうる。これらには、活性ウイルスの計測又は培地に散布したウイルスを高感度且つ容易に測定すること、及び種々の薬剤によるこの散布物の阻害を含む。
更なる特異性が先の系に組入れることができる。それはウイルスの存在についての試験をそのウイルスに対する抗体を中和する又は中和しないいづれかによって行うことによる。例えば、試験すべき臨床サンプルの一部はＨＩＶに対する抗体の中和を行い、そして他の一部は抗体の中和を行なわない。抗体の存在するシステムが陰性であり、そして抗体の存在しないものが陽性の場合、これはＨＩＶ存在の確認に役立つであろう。
インビロアッセイのための類似の系において、特定の遺伝子、例えばウイルス遺伝子の存在は細胞サンプルにおいて決定されうる。この場合において、このサンプルの細胞を、対象のウイルスの発現コントロールに結合したリポーター遺伝子を有す適切なレトロウイルスベクターにより感染せしめる。このリポーター遺伝子はこのサンプル細胞に侵入した後、この宿主細胞が適切なウイルスタンパク質を発現せしめる場合にのみ、そのリポーティング生成物（例えばβ−ガラクトシターゼ又はルシフェラーゼ）を発現するであろう。
これらのアッセイはより迅速且つ高感度であり、その理由はこのリポーター遺伝子は存在している認識因子よりも大量のリポーティング生成物を発現するからであり、これは増幅効果をもたらす。実施例７は認識タンパク質を発現する遺伝子を検出するための代表的な技術を詳細する。
実施例７
ＨＩＶ−特異的マーカー系又はアッセイ
Ａ．構造体
ＨＩＶ発現系のコントロール下にあるリポーター構造体を図１４（組換レトロウイルスベクター）及び図１５（トランスフェクションに用いられる単一プラスミド）に示す。このような好適なベクター及びプラスミドリポーターの断片は以下に由来する：
このレトロウイルスの基盤は、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩを用いて直鎖状にせしめた構造体ｐＡＦＶＸＭ（Krieglerら、Cell 38:384,1984）に由来する。ＳＶ２ｎｅｏは１．８kbのＣｌａＩフラグメントの単離により、プラスミドｐＫｏｎｅｏ（Ｈａｎａｈａｎ、未未公開）から得た。
このＨＩＶ ＬＴＲをプラスミドｐＣ１５ＣＡＴ（Ａｒｙａら、Science 229:69,1985）から０．７kbのＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離した。ベクターｇａｌはプラスミドｐＳＰ６５β−ｇａｌ（Ｃｅｐｋｏ，ｐｅｒｓ，ｃｏｍｍ．）から、ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩフラグメントとして得た。ヒト胎盤性アルカリホスファターゼの分泌型は、ユニバーサルターミネーター配列をアルカリホスファターゼの細胞表層型のアミノ酸４８９の後に導入せしめることにより作製した（Bergerら、Gene 66:1,1988による）。この分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子を１．８kbのＨｉｎｄIII〜ＫｐｎＩフラグメントとして単離した。ＨＩＶ．ｅｎｖに由来するＣＲＳ−ＣＡＲ配列は、ＨＴＬＶIIIＢ／ＢＨ１０Ｒ３由来の２．１kbのＫｐｎＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントを単離することによって得られた（Fisherら、Science 233:655,1986）。このフラグメントをＢａｍＨＩにより直鎖状にせしめたｐＵＣ３１に挿入せしめ、そしてＫｐｎＩｐＵＣ３１は、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位の間にＸｈｏＩ、ＢｇｌII，ＢｓｓｈII及びＮｃｏＩ部位を更に有するｐＵＣ１９である（Yanisch-Perronら、Gene 33:103,1985）。得られる構造体のＢａｍＨＩ部位をＮｃｏＩ部位へと変化させ、ＮｃｏＩ消化によるＣＲＳ−ＣＡＲ配列の再区分（resection）を可能にさせた。ＳＶ４０ｔイントロンをｐＳＶＯＬ（de Wetら、Mol.Cell.Biol. ７:725,1987）から、０．８kbのＮｃｏＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントとして得た。
Ｂ．インディケーター細胞及びレトロウイルスベクター
ヒトＴ−細胞（Ｈ−９、ＣＥＭ及びＳｕｐＴ１）及び単球（Ｕ−９３７）細胞系をＡＴＣＣから入手し、そして１０％の牛血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンの添加されたＲＰＭ１１６４０培地に維持せしめた。
非レトロウイルスベクターを細胞系の中に、バイオ−ラッド（Bio-Rad）ジーンパルサーを用いてエレクトロポレーションにより導入せしめた。細胞系を２〜３週間にわたりＧ−４１８（１mg／ml）で選別し、安定的なＧ−４１８R細胞系を得、そして次にクローン細胞系を得るために希釈クローンせしめた。
ｐＡＦベクターをＰＡ３１７パッケージング細胞系の中に、リン酸カルシウム沈殿物として導入せしめた（Wiglerら、Cell 16:777,1979）。このウイルス産生ＰＡ３１７細胞をヒト単球細胞系とポリブレンの存在下において２４時間にわたり共培養し、その後この懸濁細胞を取り出し、そしてＧ−４１８において選別し、前記の通りにサブクローンせしめた。
Ｃ．アッセイ
安定な細胞系をＨＩＶ（ＨＴＬＶIIIＢ）により感染せしめ、そしてこの細胞（β−ｇａｌ）又は媒体（アルカリホスホァターゼを、感染後６日目に通常の方法によりアッセイした。
β−ガラクトシダーゼアッセイ
感染化細胞は以下のいづれかによりアッセイされうる：
（ｉ）MacGregorら（Somatic Cell and Mol.Genetics 13:253,1987）に詳細のインシトウ組織化学染色：又は（ii）基質としてＯＮＰＧを用いる溶液酵素アッセイアにおける細胞抽出物の利用（NortonとCoffin, Mol.Cel.Biol. ５：281,1985）。
溶液アルカリホスファターゼアッセイ
感染化細胞から培地を取り出し、１０秒間遠心し、次いで６８℃で１０分間加熱させて内因性ホスファターゼを破壊せしめた。この培地を次に２分間遠心し、そしてアッセイのためのアリコートを取り出した（１０〜５０μl）。１００μlの緩衝液（１Ｍのジエタノールアミン、pH９．８；０．５mMのＭｇＣｌ2；１０mMのＬーホモアルギニン）を加え、次いで１２０mMのｐ−ニトロフェニルホスフェート（緩衝液中）２０μlを加えた。この反応混合物のＡ４０５を自動プレートリーダーを用いてモニターした。
図１６及び図１７は、種々の抗ウイル剤濃度の存在下におけるアルカリホスファターゼアッセイを用いた、ＳｕｐＴ１細胞の感染の経時変化の典型的な結果である。６日目の「＋」及び「−」はシンシチアの有無を示す。
本発明は前記に採用するレトロウイルスベクター系と一緒に利用することでその性能を高めることができるその他の多くの技術（以下詳細）を提供する。一方、これらの技術はその他の遺伝子−運搬系と一緒に利用することもできる。
VI．パッケージング細胞選別
本発明のこの観点はある程度、パッケージング細胞に由来する組換ウイルスの低力価の主なる原因の発見及びこのような原因を解決する技術に基づいている。一般に、少なくとも５つの要因が低組換ウイルス力価の原因として挙げられる。
１．ウイルスパッケージングタンパク質の限定された利用性；
２．レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムの限定された利用性；
３．該組換レトロウイルスの発生のための細胞膜の限定された利用性；
４．該組換レトロウイルスベクターゲノムの限定された固有パッケージング効率；及び
５．対象のレトロウイルスのエンベロープに特異的なリセプターの密度。
前記した通り、ウイルスパッケージングタンパク質の限定された利用性は、パッケージング細胞からの組換レトロウイルス提供における主な制限要因である。このパッケージング細胞におけるパッケージングタンパク質のレベルが上昇すると、力価はおよそ１０5感染性ユニット／ミリリットル迄上昇するが、この上昇するパッケージングタンパク質レベルは力価に更なる影響を及ぼさない。しかしながら、力価はパッケージングに有用なレトロウイルスベクターゲノムのレベルの上昇によっても更に上昇されうる。従って、本明細書に詳細の通り、パッケージングタンパク質及びレトロウイルスベクターゲノムの最大レベルを生産する提供細胞を選別することが好都合である。「発明の背景」の章のもとで初めに詳細した、パッケージング細胞及び提供細胞を同定及びそれにより選別するための方法は、以下の理由により、低力価を提供する多数の提供細胞の選別をもたらす傾向にあることがわかった。
本発明は、５′ＬＴＲ又はその他のプロモーターの下流にあり、介在遺伝子が置かれている遺伝子の発現レベルが、その介在遺伝子がないものよりも実質的に低いという先の欠点的な事実を利用する。本発明において、選別可能な遺伝子は、パッケージングゲノムの遺伝子又はこのベクター構造体により運搬される対象の遺伝子の下流に位置するが、しかしそれらは未だ、いかなるスプライスドナーもしくはスプライス受容部位を伴うことなく、ウイルス５′ＬＴＲ又はその他のプロモーターのコントロール下で転写される。このことは２つの事を達成せしめる。第１は、パッケージング遺伝子又は対象の遺伝子はそれらとプロモーターとの間に介在遺伝子を有さずに上流にあるため、それらに関連するタンパク質（パッケージングタンパク質又は対象のタンパク質）は選別可能なタンパク質よりも高いレベル（５〜２０倍）で発現されるであろう。第２に、選別可能なタンパク質は、発現のレベルの分布が低レベルへとシフトした、平均的に低いレベルで発現されるであろう。ｐｈｌｅｏrタンパク質の場合において、この分布におけるシフトは図１８において示す破線曲線により示す。しかしながら、フレオマイシン（phleomycin）に対する耐性にについての選別レベルはそのままであり、従って最大発現性細胞のみが生存する。パッケージングタンパク質又は対象のタンパク質のレベルは、高レベルの選別可能タンパク質がより高レベルのパッケージングタンパク質又は対象のタンパク質と一致する場合においてのみ比例し続ける。
好ましくは、先の方法は第１選別可能遺伝子を伴って、プロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子の１つを有するプラスミドを用いて行う。次にこれらの細胞を、ｅｎｖ（又は可能ならｇａｇ／ｐｏｌ）に対する抗体、第２蛍光抗体との反応及びその後蛍光−活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で選別せしめることにより、タンパク質を最高レベルで発現する細胞についてスクリーンした。他方、タンパク質レベルについてのその他の試験も利用できる。その後、この方法及びスクリーニングはそれら選別した細胞及びｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子のその他を利用して繰り返される。この段階において、第２の選別可能な遺伝子（第１のものと異なるもの）がこのパッケージング遺伝子から下流に必要とされ、そして最大量の第２ウイルスタンパク質を生産する細胞が選別される。この方法及びスクリーニングを、対象の遺伝子及び第１又は第２選別可能遺伝子とは異なる第３選別可能遺伝子を抱えるプロウイルスベクター構造体を有すプラスミドを有す生存細胞を用いて繰り返した。この方法の結果、高力価の所望の組換レトロウイルスを生産する細胞が選別されることができ、そしてこれらは組換レトロウイルスの供給を必要とする際にば培養されうる。更に、ｇａｇ及びｐｏｌが独立して導入及び選別できる。実施例８はこれらの方法に用いるためにデザインされた。ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖプラスミドの作製も詳細する。
実施例８
高レベルのパッケージングタンパク質を作るためにデザインされたプラスミド（図１９）
１．両性ｅｎｖセグメントを含むｐＰＡＭ由来の２．７kbのＸｂａＩフラグメント（Millerら、Mol.Cell.Biol. ５：431,1985）をｐＵＣ８１にＸｂａＩにてクローン化せしめ、次いでＨｉｎｄIII及びＳｍａＩにより取り出した。このフラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIで切断せしめたベクターｐＲＳＶｎｅｏ（Gormanら、Mol.Cell.Biol.２:1044,1982;Southernら、J.Mol.Appl.Genet. １：327,1982）の中にクローンせしめ、ｐＲＳＶｅｎｖを付与せしめた。プラスミドｐＵＴ５０７（Mulsantら、Somat Cell.Mol.Genet. 14:243,1988）に由来する、ＢｓｔＥII末端の補完された０．７kbのＢａｍＨＩ〜ＢｓｔＥIIフラグメントはｐｈｌｅｏ耐性コード配列を有す。４．２kbのＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、ＲＳＶｅｎｖ由来の連続的な１．６kbのＸｈｏＩ〜ＸｂａＩ（ＸｂａＩは補完されている）及びｐｈｌｅｏフラグメントをリゲートせしめ、ｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏを得た。
２．MLV（RNA Tumor Viruses,Vol.II, Cold Spring Harbor,1985）の５６３番目のヌクレオチドのＰｓｔＩ部位から５８７０番目のＳｃａＩ部位のフラグメントをｐＭＬＶ−Ｋ（Millerら、1985,op.cit.）から得、そしてＳＶ４０プロモータ、ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性及び複製の起点並びにＳＶ４０ポリＡ部位を有すｐ４ａＡ８（Jollyら、Proc.Natl.Acad. Sci. USA 80:477,1983）由来のＰｓｔＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント（ＢａｍＨＩは補完済み）にクローンせしめた。これによりｐＳＶｇｐが得られた。ｐＳＶｇｐＤＨＦＲは以下のフラグメントを用いて作製した。ＳＶ４０プロモーター及びＭＬＶ並びにいくつかのｐｏｌ配列を含む、３．６kbのＨｉｎｄIII〜ＳａｌＩフラグメント；残りのｐｏｌ遺伝子を有すｐＭＬＶ−Ｋ由来の２．１kbのＳａｌＩ〜ＳｃａＩフラグメント；ＤＨＦＲ遺伝子及びポリＡ部位、ｐＢＲ３２２起源並びにアンピシリン耐性遺伝子の半分を有す、ｐＦ４００由来の３．２kbのＸｂａＩ（ＸｂａＩ補完）〜ＰｓｔＩフラグメント；残り半分のアンピシリン耐性遺伝子を有す、ｐＢＲ３２２由来の０．７kbのＰｓｔＩ〜ＨｉｎｄIIIフラグメント。これによりｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲが得られた。これらの構造体全てを図１９に示す。これらのプラスミドを３Ｔ３細胞又はその他の細胞に導入せしめることによって、高レベルのｇａｇ，ｐｏｌ又はｅｎｖが得られる。
選別を成し遂げるための更なる方法は、最初のラウンドにおいて遺伝子選別を、そしてその次のラウンドにおいてそのアンチセンスを利用することである。例えば、ＨＰＲＴ遺伝子を伴ってＨＰＲＴ欠失細胞の中にｇａｇ／ｐｏｌを導入せしめ、そしてこの媒体であってプリンの再利用のためにＨＰＲＴを必要とするものを用いることにより、この遺伝子の存在について選別することができる。次のラウンドにおいて、ＨＰＲＴに対するこのアンチセンスをｅｎｖの下流に運搬せしめ、そしてこの細胞を６チオグアニンにおいて、ＨＰＲＴ−欠失表現型について選別することがきる。復帰を全っく起こさせずにＨＰＲＴ遺伝子転写を不活性化せしめるためには、大量のアンチセンスＨＰＲＴが必要とされるであろう。
ＭｏＭＬＶの５６３番目のヌクレオチドから開始するｇａｇ／ｐｏｌ発現構造体の他に、上流リード配列を含む複数のその他のものが作製できる。Pratasら（RNA Tumor Viruses Meeting,Cold Spring Harbor, N.Y.,1988）によると、ｇａｇタンパク質のグリコシル化型はヌクレオチド３５７で開始し、そして翻訳エンハンサーはヌクレオチド２００〜２７０の間の領域において位置することがわかっている。従って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構造体は、これら上流要素を含みそしてベクター製造を高めるために、ＢａｌＩ部位（ヌクレオチド２１２）又はＥａｇＩ部位（ヌクレオチド３４６）で始まるように作られうる。
エンベロープ置換
ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ機能を別々に発現せしめる能力はこれらの機能を独立に取り扱うことを可能にする。大量のｇａｇ／ｐｏｌを発現する細胞系は、例えばｅｎｖに関連する力価の問題を解決するのに利用されうる。低力価をもたらす１の要因は標的細胞又は組織上の適切なリセプター分子の密度である。第２の要因はウイルスエンベロープタンパク質に対するリセプターの親和性である。ｅｎｖ発現は独立のユニットに由来するため、種々の起源に由来する種々のエンベロープ遺伝子（異なるリセプタータンパク質を必要とするもの）、例えば異種親和性（xenotropic）、ポリ親和性（polytropic）又は両性親和性（amphotrophic）envを特定の標的組織に基づき、最も高い力価について試験した。更に、非ネズミレトロウイルス起源由来のエンベロープを、ベクターを擬態するために利用できる。擬態（即ち、エンベロープタンパク質が新生ベクター粒子と細胞膜の細胞質側で相互作用して生存ウイルス粒子を提供せしめること（Tata, Virology 88:71,1978）、及びしないこと（Vana,Nature 336:36,1988）の正確な法則はよく特徴付けられていない。しかしながら、ウイルスエンベロープを形成するように細胞膜の断片が発生するため、この膜に正常に存在する分子はこのウイルスエンベロープ上において保有される。従って、多数の異なる潜在的なリガンドを、このベクターが製造される、ｇａｇ及びｐｏｌを作製する細胞系を処理することによってこのウイルスベクターの表層上置くか、又は特定の表層マーカーを有する種々のタイプの細胞系を選ぶことができる。ヘルパー細胞において発現されることができ、且つ有用なベクター−細胞相互作用を提供できる１つのタイプの表層マーカーは、他の潜在的な病原性ウイルスのためのリセプターである。この病原性ウイルスは感染せしめた細胞表層上に、そのウイルス特異タンパク質（例えばｅｎｖ）であってウイルス感染を付与せしめるためにその細胞表層マーカー又はリセプターと通常相互作用するものを表わす。これは、同一のウイルスタンパク質−リセプター相互作用を用いることにより（しかし、ベクター上のリセプター及び細胞上のウイルスタンパク質によってではなく）、潜在的な病原性ウイルスに関するベクターの感染の特異性を復帰せしめる。
無関係なエンベロープタンパク質であって、製造されるベクターによる標的細胞の感染をもたらすことはないが、感染性ウイルス粒子の形成を促進せしめるものについてコードする遺伝子を含むことが望ましい。例えばヘルパー系としてヒトＳｕｐＴ１細胞が利用できる。このヒトＴ−細胞系は高レベルにてその表層上にＣＤ４分子を発現する。これのヘルパー系への転換は、適切な発現ベクターによる発現により成し遂げられ、そしてまた必要ならば、無関係（ヒト細胞に対して）エンベロープタンパク質としてモロニーエコトロピックｅｎｖ遺伝子生成物（このモロニーエコトロピックｅｎｖはマウス細胞の感染のみをもたらす）により成し遂げられる。このようなヘルパー系から作られるベクターはその表層上にＣＤ４分子を有し、そしてＨＩＶ ｅｎｖを発現する細胞、例えばＨＩＶ−感染化細胞のみを感染せしめることができるであろう。
更に、ハイブリドエンベロープ（以下に詳細）を、レトロウイルスベクターの向性（tropism）（及び有効に高められた力価）を仕立てるために同様にこの系に利用できる。大量の対象のエンベロープ遺伝子を発現する細胞系が、ｇａｇ及びｐｏｌに関連する力価の問題の解決に採用されうる。
細胞系
ＭｏＭＬＶベクター系（ｐｓｉ２，ＰＡ１２，ＰＡ３７）のために最も一般的に利用されるパッケージング細胞はネズミ細胞系に由来する。なぜネズミ細胞系がヒト治療用ベクターの製造のために最も適切ではないかの理由は複数ある。
１．それらは内因性レトロウイルスを含むことで知られている。
２．それらは非レトロウイルス又は欠陥レトロウイルス配列であって有効にパッケージ化することで知られるものを含む。
３．それらはネズミ細胞膜成分の存在により起因する有毒因子でありうる。
複数の非ネズミ細胞系は潜在的なパッケージング系である。それらは、ポリオワクチンの製造ためにヨーロッパで利用されているＶｅｒｏ細胞、ワクチンの製造において米国で利用されているＷＩ３８，ＴＰＡの製造のために米国で利用されているＣＨＯ細胞及び内因性ウイルスを有さないその他のイヌ細胞を含む。
レトロウイルスベクターによる特異的な細胞タイプの有効感染をもたらす要因が完全に理解されていないにもかかわらず、それらの比較的高い突然変異率の理由により、初期増殖が劣っている細胞タイプにおけるめざましく改善される増殖のために、単に連続的な再感染及びその細胞タイプ（該アダプター細胞）におけるこのウイルスの増殖によって適合できうることが明白である。これはいくらかのウイルス機能（例えばｅｎｖ）をコードし、そして感染性ベクター粒子（例えばｇａｇ／ｐｏｌ）を放つために該ベクターの機能を補完するのに必要な機能を有するように操作された特定のタイプの細胞に連続的継代されたウイルスベクターを用いることによっても成し遂げられうる。例えば、ネズミ両性親和性ウイルス４０７Ａをヒト細胞もしくは単球に適合せしめることを、プライマリー細胞培養物又は永久細胞系、例えばＳｕｐＴ１（Ｔ−細胞）又はＵ９３７（単球）のいづれかの連続増殖もしくは再感染によりできる。最大増殖が達成されたら（逆転写酵素レベル又はその他のウイルス生成物のアッセイにより）、このウイルスを多数の標準方法のいづれかによりクローン化せしめ、このクローンを活性についてチエックし（即ち、アダプター細胞タイプへのトランスフェクションに基づく同程度の最大増殖特性を提供する能力）、そして欠陥ヘルパーゲノム及び／又はベクターであって適切に製造されたヘルパー又は提供系におけるものの作製に利用されるこのゲノムは、感染し且つ高い効率（１０8〜１０9感染性ユニット／ml）を伴ってアダプター細胞において発現するウイルスベクター粒子の製造をもたらすであろう。
VII．択一的なウイルスベクターパッケージング技術
２つの更なる択一的な系がこのベクター構造体を有す組換レトロウイルスの製造に利用できる。これらの系それぞれは、昆虫ウイルス、バクロウイルス並びに哺乳類ウイルス、ワクチン及びアデノウイルスが、大量の任意の対象タンパク質を作るために、その遺伝子がクローンされるものに適合するという最近の事実を利用する。例えばSmithら（Mol.Cell.Biol.３：12,1983）；Picciniら（Meth.Enzymology, 153:545,1987）；及びMansourら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:1359,1985）を参照のこと。
これらのウイルスベクターは、適切な遺伝子をウイルスベクターの中に挿入せしめ、そしてそれ故レトロウイルスベクター粒子を作製するために適合できうることによって、組織培養細胞においてタンパク質を製造するために利用できる。
アデノウイルスベクターは核複製ウイルスに由来し、それらは欠陥でありうる。遺伝子をベクターの中に挿入せしめ、そしてインビトロ作製（Balleyら、EMBO J. ４：3861,1985）又は細胞における組換（Thummelら、J.Mol.Appl.Genetics １：435,1982）のいづれかによって、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に利用される。
１つの好ましい方法は、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）改良ウイルスベクター構造体を作動せしめるアデノウイルス主要後期プロモーター（Major Late Promoter）（MLP）を用いてプラスミドを作製することである。改良ウイルスベクター作製が可能なのは、ウイルスベクタープロモーターを含む５′ＬＴＲのＵ３領域はその他のプロモーター配列によって置換されうるからである（例えばHartman, Nucl.Acids Res. 16:9345,1988を参照のこと）。この部分は３′ＬＴＲからのＵ３による１ラウンド逆転写酵素の後に交換されうるであろう。
次にこれらのプラスミドは、欠陥アデノウイルスベクターにおいて別々に保有されるｇａｇ／ｐｏｌ，ｅｎｖ及びレトロウイルスベクターの純粋なストックを得るため、インビトロでアデノウイルスゲノムを作るため、そして２９３細胞（アデノウイルスＥ１Ａタンパク質を作るヒト細胞系）（このアデノウイルスベクターは欠陥性である）においてこれらを感染せしめるのに用いられる。このようなベクターの力価は一般に１０7〜１０11／mlであるため、これらのストックは高い多重度で同時に組織培養細胞に感染せしめるために利用されうる。次にこの細胞を、高レベルでレトロウイルスタンパク質及びレトロウイルスベクターゲノムを生産せしめるようにプログラムする。該アデノウイルスベクターは欠陥性であるため、大量の直接的な細胞溶解は起きず、従ってレトロウイルスベクターは細胞上清液から回収されうる。
その他のウイルスベクター、例えば無関係なレトロウイルスベクターに由来するもの（例えばＲＳＶ，ＭＭＴＶ又はＨＩＶ）がプライマリー細胞からベクターを発生せしめるために同一の方法において利用されうる。１つの態様において、これらのアデノウイルスベクターはプライマリー細胞と一緒に利用され、プライマリー細胞からのレトロウイルスベクター調製品が高められる。
択一的な系において（より本当に細胞外的な）、以下の成分が利用される。
１．Smithら（前記）に詳細と同一の方法において、バクロウイルス系において（又はその他のタンパク質製造系、例えば酵母もしくはＥ．コリ）作られるｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質。
２．既知のＴ７もしくはＳＰ６又はその他のＲＮＡ−発生系（例えばFlamantとSorgc,J.Virol. 62:1827,1988を参照）において作られるウイルスベクター。
３．（２）において作られる、又は酵母もしくは哺乳類組織培養細胞から精製したｔＲＮＡ。
４．リポソーム（包埋化ｅｎｖタンパク質を有す）。
５．ｅｎｖプロセッシング及び任意のその他の必須細胞由来機能を提供するための細胞抽出物又は精製必須成分（同定されている場合）（一般にはマウス細胞由来。
この方法において（１），（２）及び（３）を混合し、次いでｅｎｖタンパク質、細胞抽出物及びプレーリポソーム混合物（適切な溶媒中の脂質）を加えた。ところで、ｅｎｖタンパク質をリポソームにまず包埋せしめることを、得られるリポソーム−包埋ｅｎｖを（１），（２）及び（３）の混合物に加える前に行うことが必要でありうる。新生ウイルス粒子の脂質と包埋化ｅｎｖタンパク質による封入（encapsidaticn）を（Gould-Fogeriteら（Anal.Biochem.148:15,1985）に詳細の通り、医薬品のリポソーム封入と同様の方法において）行うためにこの混合物を処理（例えば超音波処理、温度操作又はロータリー透析）せめた。この方法は、病原性レトロウイルス又は複製−コンピテントレトロウイルスの夾雑を伴うことなく、高い力価の複製インコピテント組換レトロウイルスの生産を可能とする。
VIII．細胞系−特異性レトロウイルス−「ハイブリドエンベロープ」
レトロウイルスの宿主細胞範囲特異性はｅｎｖ遺伝子生成物によってある程度測定される。例えばCoffin,J.（RNA Tumor Viruses ２：25-27,Cold Spring Harhor,1985）は、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びラウスサルコマウイルス（ＲＳＶ）由来のタンパク質の細胞外成分は特異的なリセプター結合に重要である。エンベロープタンパク質のこの細胞質ドメインは一方で、ビリオン形成に役立つものと理解されている。擬態（即ち、ウイルスタンパク質又はその他の物質によるある物質由来のウイルスＲＮＡの封入）は低頻度で起こるため、このエンベロープタンパク質は対象のレトロウイルスのビリオン形成に対するある程度の特異性を有す。本発明は、ハイブリドｅｎｖ遺伝子生成物を作ることにより（即ち、特に、細胞質領域及び外因性結合性領域であって、天然において同一タンパク質分子においてでないものを有すｅｎｖタンパク質）、この宿主範囲特異性は細胞質機能に独立して変化されうる。従って、組換レトロウイルスであって、予備選択した標的細胞に特異的に結合するものであろうものが、製造できる。
ハイブリドタンパク質であって、そのリセプター結合成分及びその細胞質成分が異なるレトロウイルスに由来するものを作るためには、組換のための好ましい配置は細胞質成分の膜スパニング領域内にある、実施例９は、ＭＬＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインと結合した、ＨＩＶエンベロープのＣＤ４結合部分を有すタンパク質を発現するハィブリドｅｎｖ遺伝子の作成を詳細する。
実施例９
ハイブリドＨＩＶ−ＭＬＶエンベロープ
ハイブリドエンベロープ遺伝子をインビトロ突然変異誘発（Kunkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492,1985）を用いて調製し、適切な結合の位置に新しい制限部位を導入せしめた。他方、もし２種類のエンベロープ配列が同一のプラスミド上にある場合、それらはインビトロ突然変異誘発を利用して任意の所望する位置で直接的に結合されうる。いづれの場合においてもたらされる末端はＨＩＶｇｐ１６０の５′末端及びＭＬＶｐ１５Ｅの３′末端である。得られる組換遺伝子により発現されるハイブリドタンパク質は図２０において示し、そしてこれはＨＩＶｇｐ１２０ＨＩＶｇｐ４１の細胞外部分（ｇｐ１２０結合性及び融合性（fusigenic）領域）及びＭＬＶｐ１５Ｅの細胞質部分を、この宿主膜内の任意の複数の位置で発生する結合を伴って、含んでいる。細胞質表層での融合接点を有すハイブリド（図２０における接点Ｃ）はＳｕｐＴ１細胞において発現する場合にシンシチアを引き起こす。明らかなシンシチアの数は同一発現性ベクターにおける非ハイブリドＨＩＶエンベロープ遺伝子のおよそ１／５である。ハイブリドによるシンシチアはｒｅｖタンパク質がトランスにおいて共発現された場合にのみ起きる。細胞外表層で融合接点を有すハイブリド（図２０における接点Ａ）はシンシチアを提供せず、そしてハイブリドＢ（トランスメンブラン領域の中央）はハイブリドＣよりもおよそ１／５の少ないＳｕｐＴ１細胞に基づくシンシチアを提供する。
実施例９は二種のレトロウイルスから作られる１つのハイブリドタンパク質を例示しているが、その可能性はレトロウイルス又はその他のウイルスに限定されない。例えば、ヒトインターロイキン−２のベーター−リセプター部分はＭＬＶのエンベロープタンパク質と結合しうる。この場合において、組換はＭＬＶ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ７０部分に好適に局在し、インタクトなｐ１５Ｅタンパク質が残る。更に、上記の技術は抗Ｆｃセグメントを認識するエンベロープタンパク質を有す組換レトロウイルスを作製するためにも利用されうる。予備選択した標的細胞のみを認識するモノクローナル抗体のみがこのようなエンベロープタンパク質を示すこのような組換レトロウイルスに結合するができ、これによってこのレトロウイルスはこれら予備選択した標的細胞に結合且つ感染できうるであろう。
この手法は３種のレベルのレトロウイルスベクター特異性、一般には、細胞侵入、遺伝子発現及び発現するタンパク質の選別を利用することによって腫瘍特異的標的及び殺傷の達成に採用されることもある。レトロウイルスベクターは細胞に侵入し、そして細胞内部位にてそれらの作用を及ぼす。この観点においてそれらの作用は独特である。この特性及び３種のレベルの天然レトロウイルス特異性（前記）を用いることにより、レトロウイルスベクターは腫瘍細胞を標的とし殺傷せしめるために操作されうる。
腫瘍細胞に対するレトロウイルスの全体的な攻撃の目標は二つの主な実験によって成し遂げられる。即ち、ａ）腫瘍細胞中で優先的に増殖するレトロウイルスについての組織培養（もしくは動物において）における選別；又はｂ）インビトロ継代並びに陰性及び陽性薬剤感受性選別により作製される、改良を伴った、組織（腫瘍）−特異的プロモーターを有すレトロウイルスベクターの作製。
少なくとも４つの選別プロトコールが腫瘍細胞において優先的に増殖するレトロウイルスについて選別せしめるのに利用されうる。即ち、１）「インビトロ継代によるＥｎｖ選別」、ここで改善された複製増殖能力を伴うレトロウイルスの選別は腫瘍細胞における繰り返し継代により成し遂げられる；２）「薬剤耐性遺伝子による選別」、ここで腫瘍「特異的」レトロウイルスによる選別は結合した薬剤耐性遺伝子を含むウイルス構造体に基づく；３）「ハイブリド−Ｅｎｖ」、ここで腫瘍「特異性」を有すレトロウイルスの選別（上記のプロトコール＃１又は＃２）は、腫瘍リセプター遺伝子の融合であるハイブリドエンベロープ遺伝子（即ち、ｅｎｖと融合した抗−腫瘍抗体Ｈ−鎖Ｖ−領域遺伝子又はｅｎｖと融合した成長リセプター）を含む構造体から開始される；（この場合において選別は好適な出発点、例えば腫瘍細胞にある程度の特異性を有すｅｎｖにて開始される）；あるいは４）「インビトロでの継代による選別及び正常細胞との共培養によるカウンター選別」、ここで腫瘍細胞における増殖は薬剤耐性腫瘍細胞及び薬剤感受性正常細胞の混合体における繰り返し継代により選別される）。
組織（腫瘍）−特異的プロモーターを有すレトロウイルスベクター構造体に関しては、異なるレベルの組織−特異性を有す生化学マーカーがよく知られ、そして組織−特異的プロモーターを介する遺伝子コントロールは司じ系において理解されている。遺伝子であってその転写プロモーター要素が迅速増殖細胞において比較的活性なもの（即ち、トランスフェリンリセプター、チミジンキナーゼ他）及びその他のものであってプロモーター／エンハンサー要素が組織特異的であるもの（即ち、肝臓についてのＨＢＶエンハンサー前立腺についてのＰＳＡプロモーター）が多数ある。レトロウイルスベクター及び組織−特異的プロモーターは、選択マーカー及び細胞周期遺伝子の発現（即ち、薬剤感受性、Ｅｃｏｇｐｔ；又はＴＫ−細胞におけるＨＳＶＴＫ）を作動せしめることができ、内在プロモーターとして又はＬＴＲ内において存在する。これらの遺伝子の発現性は、マイコフェノール酸（mycophenolic acid）又はＨＡＴのそれぞれを含む培地において選別されうる。この状態において、活性的に薬剤耐性遺伝子を発現せしめる一体化プロウイルスを含む腫瘍細胞は生存するであろう。この系における選別は組織−特異的プロモーター及びウイルスＬＴＲの両方の選別を含む。他方、腫瘍細胞における特異的な発現（正常細胞においてではなく）は、ウイルスを正常細胞において定期的に継代せしめること、そしてそれらの細胞においてＥｃｏ ｇｐｔ又はＨＳＶ ｔｋ（薬剤耐性）を発現するウイルスに対する選別（チオキサンチン又はアシクロビルにより）によってカウンター選別されうる。Ｅｃｏ ｇｐｔ又はｔｋ表現型を発現する一体化ウイルスを含む感染化細胞は死滅し、従ってこのような細胞タイプにおけるウイルスは選別されるであろう。
IX．位置特異的一体化
レトロウイルスベクターを染色体上の予備所定配座に標的せしめることは、遺伝子運搬系の利点を増大せしめる。安全性の尺度は、染色体上の「安全」スポット（即ち、ベクターの挿入に由来する有毒作用を有さないと証明されている部分）に直接一体化せしめることにより増大する。その他の潜在的な利点は染色体の「解放」領域に遺伝子を導く能力であり、ここでその発現性は最大となろう。特定の部位にレトロウイルスを一体化せしめる２つの技術を以下に詳細する。
（ｉ）相同性組換
標的細胞ＤＮＡにおける特定の部位の中への組換レトロウイルスのベクター構造体の外因性遺伝子の一体化のための１つの技術は相同性組換を利用する。ゲノム配列に相同性の、約３００bpより大きいＤＮＡ配則を含むプラスミドは、それらゲノム配列と、このような相同性のない特異的な相互作用よりも１０００倍以上の速度で相互作用（置換又は挿入による）を示すことがわかっている（ThomasとCapecchi, Cell 51:503-512,1987;及びDoetschemanら、Nature 330:576-578,1987）。挿入現象、又は他方交換現象はこのベクターの特定のデザインにより作動されうることが示されている。
位置特異的レトロウイルス一体化における相同性組換を採用するために、次のようにベクター構造体を改質すべきである。（ａ）相同性配列（標的細胞ゲノムに対する）を適切な位置でこの構造体に組入れること；そして（ｂ）一体化物の正常な機構が相同性配列に起因して起こる、標的の妨害をしないこと、である。この観点における好ましい手法は、Ｕ３逆反復（inverted repeat）から下流の３′ＬＴＲにおいて相同性配列（約３００bp以上）を加えることである。この手法において、この構造体は、まずＵ３におけるＮｈｅＩ部位にて３′ＬＴＲに挿入された相同領域により作られる。宿主細胞における逆転写は、逆反復（１Ｒ）の３１bpの末端内の５′ＬＴＲにおける相同領域のデュプリケーションをもたらすであろう。宿主ゲノムへの一体化は正常な一体化機構の存在下又は非存在下において起こるであろう。このベクターにおける遺伝子は、ＬＴＲから又は内在プロモーターのいづれから発現されうる。この手法は、二本鎖レトロウイルスベクターゲノムの潜在性遊離末端付近に相同性の領域を位置せしめる効果を有す。遊離末端は相同性組換の頻度をおよそ１０倍高めることで知られている。この手法において、一体化の正常な機構を壊すこと、又は少なくともそのプロセスを遅らせて相同性ＤＮＡが配置できる時間を与えることが必要であろう。この後者の改良が特定の場合において必要であろうと、それは当業者によって容易に確実にされうる。
（ii）インテグラーゼ改良
ベクター構造体を、特定の標的細胞ゲノムの予備選択部位に一体化せしめる他の技術はインテグラーゼ改良を含む。
レトロウイルスｐｏｌ遺伝子生成物は一般に４つの部分にプロセスされる：（ｉ）ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ生成物を保有するプロテアーゼ；（ii）逆転写酵素；及び（iii）ＲＮａｓｅＨであってＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解するもの；及び（iv）エンドヌクレアーゼ又は「インテグラーゼ」。
一般的なインテグラーゼ構造はJohnsonら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7648-7652,1986）により分析されている。このタンパク質は、亜鉛結合性フィンガーであって、レトロウイルス配列に一体化する前に宿主ＤＮＡと相互反応するものを有すと考えられている。
その他のタンパク質において、このような「フィンガー」は特定の配列にてタンパク質がＤＮＡに結合することを可能にする。ある例はステロイドリセプターである。この場合において、グルココルチコイドに応答するグルココルチコイドリセプターの効果を有す、エストロゲンに応答するエストロゲンリセプターを作ることができる。これは単に、このエストロゲンリセプター遺伝子におけるエステロゲンリセプターフィンガーセグメントの代りにグルココルチコイドリセプター「フィンガー」（即ち、ＤＮＡ結合性セグメント）を置くことによる。この実施例において、このタンパク質が標的とされるこのゲノムにおける位置は変化されていない。このようにした遺伝子をインテグラーゼ遺伝子の中に、存在する亜鉛フィンガーの代りに置換せしめることもできる。例えば、ヒトエストロゲンリセプター遺伝子のＤＮＡ結合性領域をコードするセグメントをパッケージングゲノムにおいて、インテグラーゼのＤＮＡ結合性領域の代りに置くことができうる。主に、特異的な一体化は、インビトロでの一体化系により試験されるであろう（Brownら、Cell 29:347-356,1987）。この特異性がインビボで見られることを確認するため、感染性ベクターを作り、そして培養において比較するエストロゲン−感受性並びにエストロゲン−非感受性細胞への感染及び一体化のためにこのパッケージングゲノムを利用する。
この技術の利用を介して、侵入するウイルスベクターは、インテグラーゼゲノムへとスプライスされた位置−特異的ＤＮＡ−結合性タンパク質セグメントのゲノム−結合特性によって、標的細胞ゲノム上の予備選定部位の中に一体化されるようになりうる。当業者によって、この一体化部位は実際には改良インテグラーゼのフィンガーに対して受容性でなければならないことが理解されうる。例えば、ほとんどの細胞はグルココルチコイドに感受性であり、従ってそれらの染色体はグルココルチコイドリセプターについての部位を有す。それ故、ほとんどの細胞にとって、グルココルチコイドリセプターフィンガーを有す改良インテグラーゼは、プロウイルスベクター構造体をそのグルココルチコイドリセプター−結合性部位にて作製するのに適切であろう。
Ｘ．遺伝子導入動物における組換レトロウイルスベクターの製造
レトロウイルスベクターのヘルパー系発生の前記した２つの問題は（ａ）大量のベクターを発生させる困難性；及び（ｂ）ベクターを作るために、プライマリー細胞の代りに永久細胞を必要とする現状、である。これらの問題は遺伝子導入動物において発生する提供系又はパッケージング系によって解決されうる。これらの動物はパッケージングゲノム及びレトロウイルスベクターゲノムを有するであろう。現状の技術はプライマリー細胞においてパッケージング系及び所望するベクター−提供系の発生を可能とせず、これはその限られた寿命に起因する。現状の技術は、更なる特徴、即ち老衰を利用としプライマリー細胞の利用を排除することを必要とする。しかしながら、遺伝子導入動物の個々の系は、パッケージング機能例えばｇａｇ，ｐｏｌ又はｅｎｖを提供する本明細書が提供する方法によって発生できる。動物のこれらの系は従って、パッケージング機能を転写するためのハウスキーピングもしくは組織−特異的プロモーターの選択的な利用を介して、全動物又は標的とする組織のいづれかにおける発現について特徴付けられる。運搬されるべきベクターは組織−特異的又はハウスキーピングプロモーターを有す遺伝子導入動物の系の中にも挿入せしめる。前記した通り、このベクターは５′ＬＴＲのＵ３領域を置換するこのようなプロモーターを欠くこともできる（図２１）。この導入遺伝子はその発現性において誘発性又は遍在的でありうる。しかしながらこのベクターはパッケージ化されていない。動物のこれらの系は従ってｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ動物に適合し、そしてその後の子孫はパッケージ化ベクターを提供する。実質的に同一であるこの子孫は特徴付けられ、そしてプライマリー提供細胞の無限なる起源を提供する。他方、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖを作り、そして遺伝子導入動物に由来するプライマリー細胞は、プライマリー細胞提供系を作るためにレトロウイルスベクターとバルク中で感染又はトランスフェクトされうる。多数の異なる遺伝子導入動物又は昆虫、例えばマウス、ラット、ニワトリ、ブタ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、魚類及びハエがこのようなベクターを提供できる。このベクター及びパッケージングゲノムは、組織−特異的プロモーター及び異なるエンベロープタンパク質の利用を介して、種感染特異性、及び組織−特異的発現のために仕立てられるであろう。このような方法の例を図２２において例示する。
プライマリーパッケージング系の導入遺伝子製造の以下の例はマウスについてのみ詳細にしているが、これらの方法は当業者にとって実施されるその他の種に迄及ぶことができる。これら遺伝子導入動物はマイクロインジェクション又は遺伝子輸送技術によって作られうる。マウスゲノムにおけるＭＬＶ配列に相同性が付与されているため、最終的に好ましい動物はマウスではないであろう。
実施例１０
遺伝子導入動物において遍在的発現についてのハウスキーピングプロモーターを用いるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の製造
よく特徴付けられているハウスキーピングプロモーターの例はＨＰＲＴプロモーターである。ＨＰＲＴはプリン再生酵素であり、全ての組織において発現される（Patelら、Mol.Cell.Biol. ６：393-403,1986及びMelotonら、Proc.Natl.Acad.Sci. 81:2147-2151,1984、を参照のこと）。このプロモーターは、組換ＤＮＡ技術を用いて（Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Sprinh Harbor,1982）、ブルースクリプトプラスミド（Stratagene,Inc.）にクローン化された種々のｇａｇ／ｐｏｌフラグメント（例えばMoMLVのBalI/SacI;Aat II/ScaI;PstI/ScaI;RNA Tumor Virsuses ２,Cold Spring Harbor Laboratory,1985参照）の前に挿入せしめる。得られるプラスミドを精製（Maniatisら、上記）、そして関連する遺伝子情報をジーンクリーン（Bio lol）又は電気溶離（Hoganら、（出版）、Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1986）を利用して単離した。
このような完全に特徴付けられたＤＮＡを、２μg／mlの濃度で受精マウス卵巣の前核にマイクロ注射せしめた。生存している生まれたマウスをテールブロット分析（Hoganら、前記を参照）によりスクリーンした。遺伝子導入陽性動物を放射性標識化プライマリー細胞、例えば繊維芽細胞の免疫沈殿により、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質の発現レベルについて特徴付けした（Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1988を参照のこと）。次に動物を、特徴的なレベルのｇａｇ−ｐｏｌを提供する動物系の確立のため、ホモ接合度のために繁殖せしめた。
実施例１１
遺伝子導入動物における遍在的発現のためのハウイキーピングプロモーターを用いるｅｎｖタンパク質／ハイブリドエンベロープタンパク質の製造
本例は、エンベロープ又はハイブリドエンベロープタンパク質いづれかの発現のためのＨＰＲＴプロモーターを利用する。このエンベロープタンパク質は関連するｇａｇ−ｐｏｌを補完できる任意のウイルスに由来でき、この場合においてはＭＬＶのそれである。例はエコトロピックＭＬＶ、両性親和性ＭＬＶ、異種親和性ＭＬＶ、ポリ親和性ＭＬＶ又はハイブリドエンベロープである。前記の通り、このエンベロープ遺伝子を組換ＤＮＡ技術（Maniatisら、前記を参照のこと）を利用してＨＰＲＴプロモーターの後にクローンせしめることができる。得られる「ミニ遺伝子」を単離し（Hoganら、前記を参照のこと）、そしてエンベロープタンパク質の発現性を調べた（Harlowら、前記）。この遺伝子導入エンベロープ動物を、よく特徴付けられたエンベロープ動物の確立のため、ホモ接合度のために繁殖せしめた。
実施例１２
遺伝子導入動物における遍在的発現のためのハウスキーピングプロモーターを利用するｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物の製造
これはよく特徴付けられているｇａｇ−ｐｏｌ動物及び永久ｇａｇ−ｐｏｌ／エンベロープ動物系の確立のための動物を利用する。これはホモ接合度のための繁殖及びよく特徴付けられた系の確立を含む。従ってこれらの系は、組織培養においてベクターをパッケージングするために利用できるプライマリーマウス胚芽系の確立のために利用されうる。更に、このレトロウイルスベクターを含む動物をこの系の中に繁殖せしめた。
実施例１３
遺伝子導入動物におけるｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ又はハイブリドエンベロープの組織特異的発現の提供
本例は、特定の組織、例えばＴ−細胞におけるｇａｇ／ｐｏｌ、エンベロープ又はハイブリドエンベロープの高レベル発現を例示する。これはＣＤ２配列（Langら、EMBOJ. ７：1675-1682,1988）であって位置及びコピー数を独立して付与するものを利用する。ＣＤ２遺伝子由来の１．５kbのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを組換ＤＮＡ技術を利用して、ｇａｇ−ｐｏｌ、エンベロープ又はハイブリドエンベロープラグメントの前に挿入せしめた。これらの遺伝子をマイクロ注射によって受精マウス卵巣に挿入した。遺伝子導入動物は前記の通りに特徴付けた。Ｔ細胞における発現が確立され、そして遺伝子導入動物のよく特徴付けられた系を確立せしめるため、ホモ接合度のために繁殖させた。ｇａｇ−ｐｏｌ動物はエンベロープ動物と適合し、Ｔ細胞においてのみ発現されるｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物が確立された。これらの動物のＴ−細胞は従ってレトロウイルスベクターのパッケージング可能な喀Ｔ−細胞の起源である。再び、このベクターを発現せしめるＴ−細胞を確立するために、ベクター動物をこれらｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物の中にて繁殖せしめることができる。
この技術はその他の組織−特異的プロモーター、例えば牛乳−特異的（乳漿）、膵臓（インスリンもしくはエラスターゼ）、又はニコーロン（ミエリンベースタンパク質）プロモーターの利用を可能にする。プロモーター例えば牛乳−特異的プロモーターの利用を介して、組換レトロウイルスはその子孫の生物流体から直接単離されうる。
実施例１４
遺伝子導入動物におけるハウスキーピング又は組織−特異的レトロウイルスベクターのいづれかの製造
遺伝子導入動物の生殖細胞系へのレトロウイルス又はレトロウイルスベクターの挿入はわずか又は全っく発現をもたらさない。Jaenisch（Jahnerら、Nature 298:623-628,1982）により詳細のこの作用は、５′レトロウイルスＬＴＲ配列のメチル化に起因する。この技術は、レトロウイルスベクター／レトロウイルスを発現せしめるためのハウスキーピング又は組織−特異的プロモーターいづれかの置換によって、このメチル化作用を解決するであろう。エンハンサー要素を含む５′ＬＴＲのＵ３領域を、ハウスキーピング又は組織−特異的プロモーター由来の制御配列により置換せしめた（図２０参照）。３′ＬＴＲは完全に保持され、それはウイルスＲＮＡのポリアデニル化及び一体化に必要な配列を含む。レトロウイルス複製の固有の特徴の結果として、この一体化プロウイルスの５′ＬＴＲのＵ３領域は感染ウイルスの３′ＬＴＲのＵ３領域により発生される。従って、３′は必要であるが、５′Ｕ３は除去可能である。プロモーターとの５′ＬＴＲＵ３配列の置換及び遺伝子導入動物の生殖細胞系への挿入は、レトロウイルスベクター転写を提供できる動物の系をもたらす。これらの動物は従ってｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物と適合でき、レトロウイルス提供動物を発生せしめる（図２２参照）。
本発明の特定の態様を詳細してきたが、それらは例示のためであって本発明の範囲を限定することは意図しない。従って本発明は添付する請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (3)

  1. ヒト患者の処置方法に使用するためのベクターを含有する細胞の製造方法であって、ここで該処置方法は該ベクターを含有する細胞を患者に投与する工程を包含し、そして該ベクターは該ヒト患者において免疫応答を誘導し得る外来抗原遺伝子を発現し得るものであって、複製欠陥組換えレトロウイルスに含有され、さらに該細胞はＭＨＣクラスＩ遺伝子またはインターフェロンをコードする遺伝子を発現し得るベクター構築物を含有し、該製造方法は該複製欠陥組換えレトロウイルスを該細胞に感染させる工程を包含する、製造方法。
  2. 前記細胞が処置されるべきヒト患者に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、末梢血白血球、線維芽細胞、単球、または好中球、あるいはそれらの前駆体である、請求項１または２に記載の方法。
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