CH684094A5

CH684094A5 - Rekombinante Retroviren.

Info

Publication number: CH684094A5
Application number: CH4290/89A
Authority: CH
Inventors: Harry E Gruber; Douglas J Jolly; James G Respess; Paul K Laikind
Original assignee: Viagene Inc
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1989-03-20
Publication date: 1994-07-15
Also published as: JP2002306188A; DK175857B1; IL89701A0; FI904647A0; NO904103L; GB9020586D0; GR3032940T3; EP0702084B1; DE68929122T2; EP0334301A1; DK226890A; AU3364089A; NO904103D0; DE68928884D1; CN1038306A; JP2007289206A; GB2236753B; GB2255777B; WO1989009271A1; CA1341585C

Description

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CH 684 094 A5

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Beschreibung

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Retroviren und spezifischer auf rekom-binante Retroviren, die fähig sind, Vektorkonstruktionen in empfindliche Zielzellen zu übertragen. Diese Vektorkonstruktionen sind typischerweise zur Expression von gewünschten Proteinen in Zielzellen konstruiert, beispielsweise für Proteine, welche die immunogene Aktivität stimulieren oder welche in definierten, cellulären Umgebungen bedingt aktiv sind.

Stand der Technik

Obschon bakterielle Leiden im allgemeinen leicht mit Antibiotika behandelt werden können, existieren sehr wenige wirksame Behandlungen oder prophylaktische Massnahmen für viele virale, krebsartige oder andere nicht-bakterielle Leiden, einschliesslich genetischer Leiden. Traditionelle Versuche zur Behandlung dieser Leiden umfassen die Verwendung von chemischen Mitteln. Im allgemeinen fehlt diesen Mitteln die Spezifität, sie zeigen eine hohe Gesamttoxizität und sind demzufolge therapeutisch unwirksam.

Eine andere klassische Technik für die Behandlung einer Anzahl von nicht-bakteriellen Leiden um-fasst die Hervorrufung einer Immunantwort auf ein pathogenes Mittel, wie einem Virus, indem das Mittel in nicht-infektiöser Weise verabreicht wird, beispielsweise als abgetötetes Virus, wobei Antigene für das pathogene Mittel erzeugt werden, welche als Immunostimulantien wirken sollen.

Ein neuerer Versuch für die Behandlung von viralen Leiden, wie das erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS) und ähnliche Störungen, umfasst die Blockierung von Rezeptoren auf HIV-infektions-empfindlichen Zellen, vor der Aufnahme oder Bildung eines Komplexes mit viralen Hüllproteinen. Zum Beispiel zeigten Lifson et al. (Science 232: 1123-1127, 1986), dass Antikörper gegen CD4 (T4) Rezeptoren die Zellfusion (Syncytia) zwischen infizierten und nicht-infiszierten CD4-aufweisenden Zellen in vitro hemmten. Ein ähnlicher CD4-blockieren-der Effekt, unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, wurde von McDougal et al. vorgeschlagen (Science 231: 382-385, 1986). Alternativ haben Pert et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83: 9254-9258, 1986) die Verwendung von synthetischen Peptiden zur Bindung der T4-Rezeptoren und die Blockierung der HIV-Infektion an humanen T-Zellen geschildert, während Lifson et al. (J. Exp. Med. 164: 2101, 1986) die Blockierung der Syncytia und Virus/T4-ZeIlfusion durch Verwendung eines Lectins, das mit einem viralen Hüllglykoprotein in Wechselwirkung tritt, wobei es von der Aufnahme durch CD4-Rezeptoren blockiert wird, geschildert.

Eine vierte, kürzlich vorgeschlagene Technik für die Hemmung eines pathogenen Mittels, wie eines Virus, das RNA transkribiert, besteht in der Zugabe einer gegenläufigen RNA, welche mindestens einen Teil der transkribierten RNA komplementiert und sich daran bindet, um die Translation zu hemmen (To et al., Mol. Cell. Biol. 6: 758, 1986).

Ein Mangel der beschriebenen Techniken besteht jedoch darin, dass sie sich nicht leicht kontrollieren lassen bezüglich der Zeit, des Ortes und des Aus-masses, in welchem der Wirkstoff, das Antigen, das Blockierungsmittel oder die Gegensinn-RNA zu verwendet sind. Da insbesondere die obigen Techniken eine exogene Anwendung des Behandlungsmittels erfordern (d.h. exogen der Probe in einer in vitro Situation) können sie nicht direkt auf die Gegenwart des pathogenen Wirkstoffes antworten. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, ein Immunostimulans zu haben, das in erhöhten Mengen unmittelbar nach der Infektion durch den pathogenen Wirkstoff exprimiert wird. Zusätzlich sollten im Falle der gegenläufigen RNA grosse Mengen für eine wirkungsvolle Therapie am Tier zur Verfügung stehen, welche unter normalen Techniken ungeachtet dem Ort, an welchem sie tatsächlich nötig sind, verabreicht werden, d.h. an den durch den pathogenen Wirkstoff infizierten Zellen.

Als Alternative zu exogenen Anwendungstechniken ist vorgeschlagen worden, die Behandlungswirkstoffe endogen zu produzieren. Insbesondere wurden Proteine, die von viralen Vektoren auf Basis von DNA-Viren exprimiert werden, untersucht, wie z.B. das Adenovirus, der Affenvirus 40, das bovine Papillom und Vaccinaviren. Beispielsweise führte Panicali et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 80: 5364, 1983) Influenzavirus-Hemagglutinin und Hepatitis B-Oberflächenantigene in das Vacciniagenom ein und infizierten Tiere mit den hergestellten Viruspartikeln aus solchen rekombinanten Genen. Die darauffolgende Infektion verlieh den Tieren Immmunität ge-•gen das Vacciniavirus wie auch gegen das Hepatitis B-Antigen.

Es zeigte sich jedoch bis heute eine Anzahl Schwierigkeiten mit viralen Vektoren auf Basis von DNA-Viren. Diese Schwierigkeiten umfassen (a) die Produktion von anderen viralen Proteinen, welche zu Pathogenese oder Unterdrückung des gewünschten Proteins führen; (b) die Kapazität des Vektors zur unkontrollierbaren Replikation im Wirt und der pathogene Effekt einer solchen unkontrollierbaren Replikation; (c) die Gegenwart eines Wildtypvirus, was zu Virämie führen kann; (d) die transi-torische Natur der Expression in diesen Systemen. Diese Schwierigkeiten haben die Verwendung von viralen Vektoren auf Basis von DNA-Viren für die Behandlung von viralen, krebsartigen und anderen nicht-bakteriellen Leiden, einschliesslich genetischer Leiden im wesentlichen ausgeschlossen.

Wegen der nicht-transitorischen Natur ihrer Expression in infizierten Zielzellen sind Retroviren als nützliche Vehikel für die Behandlung von genetischen Leiden vorgeschlagen worden (vgl. z.B. F. Ledley, The Journal of Pediatrics 110: 1, 1987). in Anbetracht der Anzahl Probleme wurde die Verwendung der Retroviren bei der Behandlung von genetischen Leiden nicht versucht. Solche Probleme beziehen sich auf (a) den offensichtlichen Bedarf, eine grosse Anzahl Zellen in nicht-zugänglichen Geweben zu infiszieren (beispielsweise im Hirn); (b) den Bedarf, diese Vektoren zu veranlassen, in einer

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sehr kontrollierten und permanenten Art zu produzieren; (c) den Mangel an klonierten Genen; (d) den irreversiblen Schaden an Geweben und Organen, wegen metabolischen Abnormalitäten; und (e) die Zugänglichkeit von anderen, partiell wirksamen Therapien in gewissen Fällen

Zusätzlich zu den genetischen Leiden haben es andere Forscher in Betracht gezogen, retrovirale Vektoren zur Behandlung von nicht-genetischen Leiden beizuziehen (vgl EP 243, 204 - Cetus Corporation; Sanford, J. Theor. Biol 130: 469, 1988; Tellier et al. Nature 318: 414, 1985; und Bolognesi et al. Cancer Res. 45: 4700, 1985).

Tellier et al. schlugen vor, T-Zellklone zu schützen, indem sie Stammzellen scheinbar mit «defektem» HIV infizierten, welches ein Genom aufweist, welche die gegenläufige RNA gegen HIV-RNA ex-primieren konnte. Bolognesi et al. schlugen das Konzept für die Bildung eines nicht-virulenten HIV-Stammes vor, um Stammzellen so zu infizieren, dass T4-Zellen davon gebildet wurden, welche in Wechselwirkung tretende nicht-virulente Formen des Virus tragen, wobei diese Zellen durch Infektion durch virulentes HIV geschützt sind. Es scheint jedoch, dass die «gedämpften» oder «defekten» HIV-Viren, welche in den beiden vorgenannten Publikationen verwendet wurden, sich in solcher Weise reproduzieren können (d.h. sie sind nicht replikations-defekt), dass die resultierenden Viren andere Zellen infizieren können, mit der Möglichkeit eines erhöhten Risikos der Rekombination mit vorher vorhandenem HIV oder anderen Sequenzen, was zum Verlust der Dämpfung führt. Nicht reproduzierbare Formen würden eine defektive Hilfs- oder Packlinie für HIV erfordern. Da jedoch die Steuerung der HIV-Genexpression komplex ist, konnten solche Zellen bis jetzt noch nicht konstruiert werden. Da im weiteren das infizierende oder gedämpfte Virus nicht chimer ist (ein «nicht-chimeres» Retrovirus ist eines mit im wesentlichen allen seinen Vektoren der gleichen Retrovirus-Spezies) sogar wenn es replikati-onsdefekt gemacht worden ist, beispielsweise durch eine Deletion eines wesentlichen Elements eines seiner Genome, existiert immer noch eine signifikante Möglichkeit für eine Rekombination innerhalb der Wirtszellen, was zu einer Produktion von infektiösen, viralen Partikeln führt

Obschon Sanford (J. Theor. Biol. 130: 469, 1988) ebenfalls die Verwendung einer genetischen Kur für HIV vorgeschlagen hat, bemerkte er, dass wegen dem Potential, welches für die Schaffung von neuen virulenten Viren durch die genetische Rekombination zwischen natürlichen AIDS-Viren und therapeutischen retroviralen Vektoren, welche Anti-HIV-Gene tragen, die retrovirale Gentherapie für AIDS nicht praktizierbar sein könnte. Obschon McCormick & Kriegler (EP 243, 204 A2) in ähnlicher Weise vorgeschlagen haben, retrovirale Vektoren zur Befreiung von Genen für Proteine, wie Tumornecrosefak-tor (TNF) zu verwenden, leiden die Techniken, die sie beschreiben, an einer Anzahl Nachteile.

Darstellung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Retrovirus, das eine Vektorkonstruktion trägt, welche die Expression auf ein Antigen in mit dem Retrovirus infizierten Zielzellen richtet, wobei das genannte Antigen fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier zu stimulieren. Durch die erfin-dungsgemässen rekombinanten Retroviren können infektiöse, krebsartige, autoimmune oder immune Leiden verhütet, gehemmt, stabilisiert oder gelindert werden. Solche Leiden umfassen die HIV-Infektion, Melanom, Diabetes, Transplantat gegen Wirtsleiden, Alzheimersche Krankheit und Herzleiden.

Das erfindungsgemässe Retrovirus erlaubt (a) die Stimulierung einer spezifischen Immunantwort, entweder humoral oder zellvermittelt, auf ein Antigen oder pathogenes Antigen; (b) die Hemmung einer Funktion eines pathogenen Wirkstoffes, wie einem Virus; und (c) die Hemmung der Wechselwirkung eines Wirkstoffes mit einem Wirtszellrezeptor unter Verwendung von rekombinanten Retroviren.

Eine Stimulierung einer spezifischen Immunantwort vorgesehen, umfasst die Infektion von empfindlichen Zielzellen mit derartigen rekombinanten Retroviren, die eine Vektorkonstruktion tragen, welche die Expression eines Antigens oder einer modifizierten Form davon in die infizierten Zielzellen richtet. Falls eine Immunantwort auf ein pathogenes Antigen stimuliert werden muss, wird das Retrovirus vorzugsweise so konstruiert, dass es eine modifizierte Form des Antigens exprimieren kann, welches eine Immunantwort stimuliert und welches eine reduzierte Pathogenität bezüglich des nativen Antigens aufweist. Eine Immunantwort kann ebenfalls erzielt werden, indem das Gen für den spezifischen T-Zellrezeptor, der das Antigen von Interesse erkennt, im Zusammenhang mit einem zweckmässigen MHC-Molekül oder für ein Immunglobulin, das das interessierende Antigen erkennt, auf eine zweckmässige Immunzelle (wie eine T-Lymphocyte) übertragen wird.

Im besonderen Fall von Leiden, die durch die HIV-Infektion erzeugt werden, wo die Immunostimulation erwünscht wird, ist das vom rekombinanten, retroviralen Genom gebildete Antigen in einer Form, welche entweder eine eingeschränkte Immunantwort der H LA Klasse I- oder der Klasse II oder beide, hervorruft. Im Fall des HIV-Hüllantigens ist das Antigen vorzugsweise z.B. ausgewählt aus gp 160, gp 120 und gp 41, welche zur Reduktion ihrer Pathogenität modifiziert worden sind. Insbesondere wird das ausgewählte Antigen modifiziert, um die Möglichkeit einer Syncytie zu reduzieren. Antigene von anderen HIV-Genen, wie gag, pol, vif, nef usw. können in besonderen Fällen ebenfalls Schutz verleihen.

Mit einem rekombinativen Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung kann eine Hemmung einer Funktion eines pathogenen Wirkstoffes, der für ein Leiden nötig ist, bewirkt werden, z.B. für Leiden, die durch virale Infektionen verursacht werden, Krebs und immunologische Abnormitäten sind umfasst. Eine solche Hemmung wird mit Mitteln durchgeführt, welche die Expression eines lindernden Mittel einschliessen, welches für die Krankheitszelle toxisch ist, Expression eines Heilmittels, welches die Expression oder die Effekte von pathogenen

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Genen selektiv hemmt, die Expression von gegenläufiger RNA oder durch Insertion einer Sequenz in ein pathogenes Genom, damit seine Funktion unterbrochen wird.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung retrovirale Genome zur Verfügung, die ein defektes Strukturprotein eines pathogenen Mittels exprimie-ren, zur Hemmung des Aufbaus des pathogenen Mitteis führen, d.h. Expression eines defekten Strukturproteins eines viralen Partikels führt zur Hemmung des Aufbaus von viralen Partikeln.

Wenn ein toxisches Palliativ durch Zellen, welche das rekombinante, virale Genom enthalten, produziert werden muss, kann es entweder von in den Zellen existierenden Vorläufern produziert werden oder durch exogene Zugabe eines Vorläufers in ein toxisches Agens. Im letzten Fall codiert die virale Konstruktion ein Produkt, welches den Vorläufer in das toxische Agens umwandelt. In beiden Fällen würde das toxische Agens nur an Zellen lokalisiert, welche die virale Konstruktion und ein anderes Agens enthalten, welches mit der pathogenen Bedingung verknüpft ist. Beispielsweise könnte das andere Agens ein Protein sein, das durch Transkription und Translation eines pathogenen, viralen Genoms erzeugt wird, welches in der Zelle vorhanden ist. Spezifität für die pathogene Bedingung kann ebenfalls erzielt oder weiter erhöht werden, indem die rekombinanten Retroviren zielgerichtet in die Zellen eindringen können, welche durch die pathogene Bedingung geschädigt sind. Es wird darauf hingewiesen, dass wenn in der vorhergehenden Diskussion und in der gesamten Beschreibung auf eine virale Konstruktion Bezug genommen wird, «Exprimieren» oder «Produzieren» irgendeiner Substanz in einer Zeile oder dergleichen tatsächlich in Wirklichkeit die Handlung des resultierenden Provirus bedeuten, im Anschluss an die umgekehrte Transkription der viralen RNA in der Zelle.

Die rekombinanten Retroviren gemäss der vorliegenden Erfindung ermöglichen ebenfalls die Verminderung oder Elimination einer unerwünschten oder störenden Immunantwort. Erforderlichenfalls kann eine Immunantwort durch eine zielgerichtete Expression eines immunosuppressiven Gens erzielt werden, wie durch das viral-abgeieitete E3-Gen des Adenovirus.

Die rekombinanten Retroviren ermöglichen weitere Verfahren für die Hemmung einer Wechselwirkung von viralen Partikeln mit Zellen, Zellen mit Zellen oder Zellen mit Faktoren offenbart. Die Verfahren umfassen im allgemeinen die Infektion von empfindlichen Zellen mit einem rekombinanten repli-kationsdefekten Retrovirus, das die Expression eines blockierenden Elementes in die infizierten Zellen richtet, wobei das blockierende Element fähig ist, sich mit einem Zellrezeptor (vorzugsweise dem Wirtszellrezeptor) zu verbinden, wobei der Rezeptor entweder intracellulär oder an der Zelloberfläche vorliegt oder alternativ durch Verbindung mit dem Mittel. In beiden Fällen wird die Wechselwirkung blockiert.

Ungeachtet des Mittels, durch welches das rekombinante Retrovirus seine immunogene oder hemmende Wirkung wie oben beschrieben ausübt,

wird bevorzugt, dass das retrovirale Genom «repli-kationsdefekt» ist (d.h. es ist unfähig, sich in den infizierten Zellen zu reproduzieren). Es ist demzufolge nur eine einzige Stufe der Infektion vorgesehen, entweder in vitro oder eine in vivo-Anwenduno. wobei die Möglichkeit der insertionalen Mutagenese wesentlich reduziert wird. Vorzugsweise fehlt dem rekombinanten Retrovirus zu diesem Zweck mindestens eines der gag-, pol- oder env-Gene. Weiter ist der rekombinante, virale Vektor vorzugsweise chimär (d.h. das Gen, welches das gewünschte Resultat erzeugt, ist von einer anderen Quelle, als der Rest des Retrovirus). Eine Chimäre Konstruktion reduziert weiter die Möglichkeit von Rekombinationsereignissen innerhalb von mit dem rekombinanten Retrovirus infizierten Zellen, was ein Genom produzieren könnte, welches fähig ist, virale Partikel zu bilden.

Rekombiante Retroviren der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Durchführung der obigen Verfahren, ebenso wie für die Erzeugung von anderen therapeutischen Genen. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von solchen rekombinanten Retroviren zur Verfügung, worin das retrovirale Genom in ein Capsid und eine Hülle gepackt wird, vorzugsweise durch die Verwendung einer Packungszelle. Die Pak-kungszellen werden durch virale, proteincodierende Sequenzen zur Verfügung gestellt, vorzugsweise in Form von zwei Plasmiden, welche alle für die Produktion von lebensfähigen, retroviralen Partikeln nötigen Proteine erzeugen, eine RNA-virale Konstruktion trägt das gewünschte Gen zusammen mit einem Packungssignal, welches die Packung der RNA in die retroviralen Partikel steuert.

Die rekombinanten Retroviren gemäss der vorliegenden Erfindung können durch eine Anzahl von Techniken hergestellt werden die:

i) die Herstellung von höheren Titern von Pak-kungszellen;

ii) die Packung von Vektorkonstruktionen durch Mittel, welche nicht in die Verwendung von Pak-kungszellen involviert sind;

iii) die Produktion von rekombinanten Retroviren, die auf vorgewählte Zellinien gerichtet sein können; und iv) die Integration von proviralen Konstruktionen an eine vorgewählte Steile oder Stellen in einem Zellgenom erleichtern. Eine Technik für die Herstellung von höheren Titern aus Packungszellen wird durch die Entdeckung begünstigt, dass von den vielen Faktoren, welche den Titer einer Packungszelle vermindern können, einer der am meisten begrenzenden, der Grad der Expression des Packungsproteins ist, nämlich die gag-, pol- und env-Proteine, ebenso wie der Grad der Expression der retroviralen Vektor-RNA aus dem proviralen Vektor. Diese Technik erlaubt die Selektion von Packungszellen, welche höhere Grade an Expression (d.h. eine Produktion von höheren Konzentrationen) der vorhergehenden Packungsproteine und der Vektorkon-struktions-RNA besitzen. Spezifischer erlaubt diese Technik, die Selektion von Packungszellen, welche höhere Grade von dem erzeugen, was hier als primäres Mittel genannt wird und was entweder ein

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Packungsprotein (z.B. gag-, pol- oder env-Proteine) oder ein interessierendes Gen, welches in das Genom der Zielzelle hinein transportiert werden muss (typischerweise eine Vektorkonstruktion) ist. Dies wird durchgeführt, indem ein Genom, das ein Gen trägt (das «primäre Gen»), das das primäre Mittel in der Packungszelle exprimiert, in die Packungszellen einverleibt wird, zusammen mit selektierbaren Genen, vorzugsweise stromabwärts vom primären Gen. Das selektierbare Gen exprimiert ein selektierbares Protein in der Packungszelle, vorzugsweise in einer, welche Widerstand an ein im übrigen cyto-toxisches Mittel überträgt. Die Zellen werden dann einem Selektionsmittel ausgesetzt, vorzugsweise dem cytotoxischen Mittel, welches die Identifikation dieser Zellen ermöglicht, welche das selektierbare Protein in einem kritischen Grad exprimiert (d.h. im Fall eines cytotoxischen Mittels durch Töten derjenigen Zellen, welche kein solcher für das Überleben erforderlicher Grad an Widerstandsprotein produzieren). Vorzugsweise werden in der oben kurz beschriebenen Technik die Expressionen von beiden, den selektierbaren und den primären Genen durch den gleichen Promotor gesteuert. In dieser Hinsicht ist es vorteilhaft, ein retrovirales 5'LTR zu verwenden. Um maximale Titerwerte eines rekombinanten Retrovirus von Packungszellen zu erhalten, wird diese Technik zuerst zur Auswahl von Packungszellen, die hohe Grade von all den erforderlichen Pak-kungsprotein exprimieren, verwendet und dann wird sie zur Auswahl derjenigen dieser Zellen verwendet, die nach der Transfektion mit der gewünschten proviralen Konstruktion die höchsten Titer des rekombinanten Retrovirus produzieren.

In weiteren Techniken werden die Vektorkonstruktionen durch Mittel gepackt, welche die Verwendung von Packungszellen nicht involvieren. Diese Techniken machen Gebrauch von DNA-Viren, wie Baccul-ovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus, vorzugsweise Adenovirus. Diese Viren sind bekannt dafür, dass sie verhältnismässig hohe Grade an Proteinen von darin vorhandenen exogenen Genen exprimieren. Für solche DNA-Virusvektoren können rekombinante DNA-Viren durch eine in vivo-Rekombination in einer Gewebekultur zwischen viraler DNA und Plasmiden, welche retrovirale Gene oder retrovirale Vektorgene tragen, produziert werden. Die resultierenden, viralen DNA-Vektoren, welche entweder Sequenzen, die retrovirale Proteine oder retrovirale Vektor-RNA codieren, werden in hohen Titermengen gereinigt. Alternativ können die Konstruktionen ebenfalls in vitro konstruiert werden und anschliessend in Zellen transferiert werden, welche transvirale Funktionen aufweisen, welche den DNA-Vektoren fehlen. Ungeachtet des Verfahrens der Produktion des hohen Titers (107 bis 1011 Einheiten/ml) können Vorräte hergestellt werden, welche nach der Infektion von empfindlichen Zellen einen hohen Expressionsgrad von retroviralen Proteinen (wie gag, pol und env) oder retrovirale RNA-Vektorgenome oder beide, exprimieren. Die Infektion von Zellen in Kulturen mit diesen Vorräten, einfach oder in Kombination, führt zu einer hochgradigen Produktion von retroviralen Vektoren, wenn die Vorräte das virale Protein und die viralen Vektorgene tragen. Falls mit Adenovirus oder anderen Säugetiervektoren verwendet, erlaubt diese Technik die Verwendung von primären Zellen (z.B. von Gewebe-Explantaten oder Zellen, wie WI38, die für die Herstellung von Impfstoffen verwendet werden) zur Herstellung von rekombinanten retroviralen Vektoren.

In einer Alternative zur vorhererwähnten Technik werden rekombinante Retroviren zuerst durch Bildung von gag/pol- und env-Proteinen aus mit einem zweckmässigen, rekombinanten DNA-Virus infizierten Zellinie in einer ähnlichen Weise, wie in den vorhergehenden Techniken, gebildet, mit der Ausnahme, dass die Zellinie nicht mit einem die Vektorkonstruktion tragenden DNA-Virus infiziert wird. Anschliessend werden die Proteine gereinigt und mit der gewünschten, viralen Vektor-RNA in vitro hergestellt, Transfer-RNA (tRNA)-Liposomen und einem Zellextrakt in Kontakt gebracht, um das env-Protein in den Liposomen in solcher Weise zu entwickeln, dass die rekombinanten Retroviren mit der viralen Vektor-RNA produziert werden. In dieser Technik kann es erforderlich sein, dass das env-Protein vor dem Kontaktieren mit dem Rest der vorhergehenden Mischung in den Liposomen behandelt wird. Die gag/pol- und env-Proteine können ebenfalls durch die plasmidvermittelte Transfektion in eukaryontischen Zellen, wie in Hefe oder in Bakterien gemacht werden.

Die Technik für die Herstellung von rekombinanten Retroviren, welche auf vorgewählte Zellen gerichtet sein kann, verwendet rekombinante Retroviren, welche ein env-Gen enthalten, enthaltend ein cytoplasmisches Segment eines ersten retroviralen Phenotyps, und ein extracelluläres Bindungssegment, das exogen zum ersten retroviralen Phenotyp ist. Das Bindungssegment ist von einem zweiten viralen Phenotyp oder von einem anderen Protein mit den gewünschten Bindungseigenschaften, das ausgewählt ist, dass es als Peptid, welches das gewünschte Ziel bindet, exprimiert wird.

Die Techniken für die Integration eines retroviralen Genoms an einer spezifischen Stelle in der DNA einer Zielzelle involviert die Verwendung einer homologen Rekombination oder alternativ die Verwendung eines modifizierten Integraseenzyms, welches eine spezifische Stelle auf dem Zielzellengenom erkennen wird. Eine solche stellenspezifische Insertion erlaubt, dass die Gene an Stellen der Zielzellen-DNA insertiert werden, wobei die Chancen von insertionalen Mutagenesen minimal gehalten werden, ebenfalls minimal wird die Interferenz mit anderen Sequenzen an der DNA gehalten, wobei die Insertion von Sequenzen an spezifischen Zielstellen ermöglicht wird, wobei die Expression von unerwünschten Genen (wie viralen Genen) in der DNA der Zielzelle reduziert oder eliminiert wird. Es wird darauf hingewiesen, dass sämtliche der obenbeschriebenen Techniken unabhängig voneinander in besonderen Situationen oder in Verbindung mit einer oder mehreren der übrigen Techniken verwendet werden kann.

Dieser und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung gehen in naheliegender Weise unter Hinweis auf die folgende, detaillierte Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen hervor.

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Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1 zeigt drei verschiedene Familien von Vektoren, welche zur Herstellung von HlV-env verwendet werden, mit oder ohne einer Insertion einer selektierbaren SV-Neo-Kassette.

Fig. 2 erläutert die HIV-env-Expressionsgrade, dargestellt in Polyacrylamidgel-Elektrophorese von HlV-env-spezifischen Radioimmunpräzipitationen von Extrakten von humanen Sup T1 -Zellen, die mit den dargestellten Vektoren transferiert wurden. Die Marker sind in Kilodaltons, gp 160 und gp 120 markieren die geeigneten Proteine und 517 + tat ist die positive Kontrolle (HIV LTR treibt env in Gegenwart von tat).

Fig. 3 zeigt das Schema des Tests für tötende T-Zellen, welche in Mäusen induziert wurden, welchen syngeneische Tumorzellen, die das HlV-env exprimieren, injiziert wurden (der Vektor is pAF/env-SV-Neo).

Fig. 4 zeigt grafisch die Resultate des experimentellen Schemas gemäss Fig. 3. Das spezifische Abtöten ist in der oberen Grafik mit B/C10MEenv-29 ersichtlich. B/C10ME Widerstand gegen Abtöten.

Fig. 5 zeigt einen Vektor, welcher zur Expression von sCD4 konstruiert ist.

Fig. 6 illustriert die Konstruktion eines Plasmids, welches die Vektoren TK1 (ohne SV-Neo) und TK3 (plus SVNeo) trägt.

Fig. 7 illustriert die Konstruktion des Plasmides, welches den Vektor KTVIHAX trägt.

Fig. 8 illustriert die Konstruktion des Plasmides, welches die Vektoren KTVIH5 (ohne SV-Neo) und KTVIH Neo (mit SV-Neo) trägt.

Fig. 9 illustriert die Konstruktion des Plasmides, welches den Vektor MHMTK-Neo trägt.

Fig. 10 illustriert die Konstruktion des Plasmides, das die tat-his (tat in Sinnrichtung) oder a tat (tat in Antisinnrichtung) Vektoren.

Fig. 11 stellt grafisch das bevorzugte Abtöten von PA317-Zellen dar, welche mit tat-his-Vektor (5 Klone, TH1-5) infiziert sind, verglichen mit der Kontrolle PA317, nach der Infektion mit den drei dargestellten, bedingt letalen Vektoren und die Behandlung mit Acyclovir (ACV).

Fig. 12 zeigt die Konstruktion eines viralen Vektors, welcher HlV-induzierbare Marker/Reportergene trägt, wie Alkaline-phosphatase (AP).

Fig. 13 zeigt die Struktur eines HlV-induzierbaren Marker/Reportergens, das von einem Plasmid getragen wird, welches in Zellen transferiert werden kann.

Fig. 14 stellt grafisch eine Zeitkurve einer HIV-Infektion von Sup T1-Zellen dar, die den AP-Marker tragen, in Fig. 13 mit HIV in verschiedenen AZT-Konzentrationen. Der Grad der HIV-Infektion wurde gemessen, indem kleine Aliquote des Überstandes genommen wurden.

Fig. 15 stellt grafisch die Resultate des gleichen Experimentes, wie in Fig. 14 dar, jedoch mit ddC als HIV-Inhibitor.

Fig. 16 stellt schematisch die Anzahl der überlebenden Zellen nach der Phleomycin-Selektion dar, nach der Transfektion von Zellen mit einem Plasmid, das das Phleomycin-Widerstandsgen (PRG) direkt von einem Promotor (rechts) exprimiert und mit einem anderen, welches PRG mit einer codierenden Sequenz zwischen ihm und dem Promotor exprimiert.

Fig. 17 stellt vier Plasmide dar, welche zur Expression von retroviralen Proteinen in Säugetierzel-len konstruiert sind. pSVgp und pRSVenv werden mit einem selektierbaren Marker co-transfektiert, während pSVgp-DHFR und pRSVenv-phleo äquivalente Plasmide mit den selektierbaren Marker, die sich stromabwärts der viralen protein-codierenden Regionen befinden, sind.

Fig. 18 zeigt drei Fusionstellen von HlV-env und MLV-env nach der stellengerichteten Mutagenese von beiden codierenden Sequenzen, um neue kompatible Restriktionsenzymstellen zu kreieren. Die N-terminalen Sequenzen liegen in beiden Fällen auf der linken Seite. Die Numerierung entspricht den Nukleotidnummern. ST, SR, SE sind die Starts von tat, rev und env, während TT, TR und TE die entsprechenden Terminationsstellen sind.

Fig. 19 zeigt die Substitution von U3 in 5-LTR durch einen heterologen Promotor/Enhancer, welcher entweder mit Sac I, Bsst II oder auf der anderen Seite der Region fusioniert sein kann.

Fig. 20 illustriert ein repräsentatives Verfahren für die Kreuzung von transgenischen Mäusen, welche virales Protein oder Vektor RNA exprimieren.

Wene zur Ausführunn der Erfindung I. Immunostimulation

Die Fähigkeit, zu erkennen und sich gegen fremde Pathogene zu verteidigen, ist zentral in der Funktion des Immunsystems. Dieses System durch die Immunoerkennung muss fähig sein, «selbst» von «nicht selbst» (fremd) zu erkennen, was essentiell ist, dass die Verteidigungsmechanismen gegen eindringende Wesen gerichtet sind, statt gegen Wirtsgewebe. Die fundamentalen Merkmale des Immunsystems sind die Gegenwart von hochpolimor-phen Zelloberflächen-Erkenntnisstrukturen (Rezeptoren) und Effektormechanismen (Antikörper und cytolytische Zellen) für die Zerstörung von eindringenden Pathogenen.

Die cytolytischen T-Lymphocyten (CTL) werden normalerweise induziert durch das Auftreten von gebildeten pathogen-spezifischen Peptiden in Konjugation mit Zelloberflächenproteinen der MHC-Klasse I oder Klasse Il-Zelloberflächenproteinen. Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung induziert die Präsentation von immunoge-nen, viralen Determinanten im Zusammenhang von geeigneten MCH-Molekülen effizient optimale CTL-Antworten, ohne dass der Patient dem Pathogen ausgesetzt wird. Dieser Vektorzugang zur Immunostimulation ermöglicht ein wirksameres Mittel für die Induzierung von protektiven und therapeutischen CTL-Antworten, da der Immunitätstyp, der durch den Vektor eingeleitet wird, näher demjenigen gleicht, welcher durch die Aussetzung einer natürlichen Infektion ausgelöst wird. Auf Basis gängiger Kenntnis von verschiedenen viralen Systemen, ist

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es unwahrscheinlich, dass exogen zugeführte, nicht replizierende, virale Antigene, wie Peptide oder gereinigte, rekombinante Proteine eine genügende Stimulation bewirken, um optimale Klasse l-einge-schränkte CTL-Antworten zu induzieren. Alternativ bewirkt eine vektorvermittelte Expression von ausgewählten, viralen Proteinen in den Zielzellen gemäss der Beschreibung der vorliegenden Erfindung einen solchen Stimulus.

Beispielsweise können im Fall von HIV-l-lnfektio-nen Patienten Antikörper entwickeln, welche für eine Auswahl von viralen Determinanten der Hüllregion spezifisch sind, einige von ihnen sind fähig zur in vitro-Virus-Neutralisation. Trotzdem wird die Entwicklung des Leidens fortgesetzt und der Patient unterliegt schliesslich dem Leiden. Niedergradige CTL-Antworten gegen infizierte Patientenzellen (Piata et al. Nature 328: 348-351, 1987) und gegen Zielzellen, infiziert mit rekombinanten Vakzinia-Vek-toren, exprimieren HIV gag, pol oder env (Walker et al. Nature 328: 345-348, 1987; Walker et al., Science 240: 64-66, 1988) wurden in einigen HIV-I seropositiven Patienten entdeckt. Zusätzlich ist kürzlich gezeigt worden, dass CTL von Mäusen wie auch von Menschen durch autologe Stimulatorzel-len, die durch Transfektion HIV gp 120 exprimieren, induziert werden können (Langlade-Demoyan et al., J. Immunol. 141: 1949, 1988). Eine verbesserte CTL-Induktion könnte zur Injektion von Patienten therapeutisch vorteilhaft sein und eine wirksame präventive Therapie für Individuen unter nicht-infektiösen Bedingungen sein. Die HIV-Infektion selbst kann nicht eine zweckmässige CTL-Antwort erzeugen, da andere Elemente im Zusammenhang mit der HIV-Infektion eine klare Immunostimulation verhindern können. Zusätzlich kann es sein, dass die Stimulation von T-Zellen durch infizierte Zellen eine Wechselwirkung ist, welche zur Infektion der stimulierten T-Zellen führt.

Beispiel 1 beschreibt Verfahren für die Konstruktion von Plasmiden, welche fähig sind, retrovirale Vektoren in Packungszellen zu bilden, welche dann zur Expression von viralen HIV-Antigenen führen.

Beispiel 1

Vektoren, die HIV-Antiaene exprimieren A. Env Expressions-Vektor (val. Fia. 1ì:

Ein 2,7 kb Kpn-Xho I DNA-Fragment wurde aus dem HlV-proviralen Klon BH10-R3 (für die Sequenz vergleiche Ratner et al., Nature 313: 277, 1985) isoliert, und eine ca. 400 bp Sai Kpn I DNA-Fragment von lllexE7deltaenv (a Bal31 Deletion nt. 5496) wurde in die Sai I-Stelle im Plasmid SK+ eingebunden. Von diesem Klon wurde ein 3,1 kb-env-DNA-Fragment (Xho l-CIa I), das ebenfalls rev codiert, essentiell für die env-Expression gereinigt und in einen retroviralen Vektor, genannt pAFVXM, eingebunden (vgl. Kriegler et al., Cell 38: 483, 1984). Dieser Vektor wurde so geändert, dass die Bgl II-Stelle durch eine Linker-Insertion in eine Xho I-Stel-le umgewandelt wurde, um die Klonierung des HIV-env-codierenden DNA-Fragments zu erleichtern.

Ein dominantes, selektierbares Marker-Gen, das in einem SV40 frühen Promotor enthalten ist, das die Expression von Neomyzin-Phosphotranferase-Gen exprimiert, wurde in den Vektor an der Stelle a

I insertiert, um die Isolierung von infizierten und transferierten Zelllinien zu erleichtern.

Die Xho-I-Stelle stromaufwärts des ENV-Gens im Vektor stellt eine praktische Stelle zur Insertion von zusätzlichen Promotoren in die Vektorkonstruktion dar, wie der RSV-Promotor, der SV40 frühe oder späte Promotor, der CMV unmittelbare frühe (IE) Promotor, der humane Beta-Bactin-Promotor und der Moloney-murine-MLV SL3-3 Promotor.

Ein solcher Promotor, der CMV unmittelbare frühe Gen-Promotor, ein 673 bp DNA-Fragment Hinc

II von Eag I, führt in eine zehnfache Erhöhung der ENV Expression in einer humanen T-Zellinie, die Sup TI genannt ist im Vergleich zur parentalen Konstruktion pAF ENVr SV2 Neo.

B Gag Expressions-Vektor;

Ein 2,5 kb Sac I-Eco RV DNA-Fragment wurde aus pBH10-R3 (vgl. Ratner et al., op. cit.) isoliert und in die Sac I-Sal I-Stelle von pUC31 eingebunden. pUC31 ist von pUCl9 abgeleitet, mit zusätzlichen Xho I-, Bgl II-, Bsst II- und Nco I-Stellen, die zwischen den Eco R1- und Kpn I-Stellen des Poly-linkers insertiert sind. Diese Konstruktion enthält jedoch die Hauptspleissdonor (SD)-Stelle von HIV und könnte in der Virusbildung problematisch sein. Die SD-Stelle wurde durch Subklonen eine 70 bp Rsa l-CIa I-Fragmentes mit 2,1 kb Cla I-Bam H1 DNA-Fragment an der Hinc Il-Bam H1-Stelle von SK+ entfernt. Die Barn H1-Stelle wurde in eine Cla I-Stelle durch Linkerinsertion umgewandelt. Diese Konstruktion wurde SK+-gag-Protease SD delta bezeichnet.

Das 2,5 kb Xho l-CIa I-DNA-Fragment von SK+ gag-Protease SD delta wurde in die Xho l/CIa I-Stellen des Vektors pAFVXM, genau wie oben beschrieben, insertiert.

Diese Plasmide exprimierten, wenn sie in eine zweckmässige Packungszelle gebracht wurden, eine retrovirale Vektorkonstruktion, welche ein Pak-kungssignal enthält. Das Packungssignal richtete die Packung der Vektorkonstruktion in ein Capsid und eine Hülle zusammen mit allen weiteren Proteinen, welche für lebensfähige, retrovirale Partikel erforderlich sind. Die Capis, die Hülle und andere Proteine werden vorzugsweise von einem oder mehreren Plasmiden erzeugt, welche zweckmässige Genome in der Packungszelle enthalten. Solche Genome können provirale Konstruktionen sein, welche im einfachen Fall nur eine Deletion des Pak-kungssignales besitzen. Als Resultat kann nur der Vektor gepackt werden. Zweckmässige Packungen oder Packungszelllinien und die für eine solche Packung nötigen Genome sind beschrieben in Miller et al. (Mol. Cell. Bio. 6: 2895, 1986), welche durch Verweis eingeschlossen ist. Wie durch Miller et al. beschrieben, werden vorzugsweise weitere Änderungen an der proviralen Konstruktion vorgenommen, die von simplen Deletionen der Pak-kungssignale verschieden sind, um die Chancen

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von rekombinanten Ereignissen zu vermindern, welche in der Packungszellinie vorkommen, was zur Produktion von viralen Partikeln führen kann, welche nicht replikationsdefekt sind.

Es wird darauf hingewiesen, dass Beispiel 1 nur erläuternd für das Verfahren zur Bildung eines HIV-Hüllglykoproteins (gp) oder anderen viralen Antigenen ist. Es ist ebenfalls möglich, eine provirale Vektorkonstruktion zur Verfügung zu stellen, die ein modifiziertes Hüll-gp an den Zielzellen exprimiert, was möglicherweise eine Immunantwort stimuliert, jedoch mit weniger T-zeil-cytopathischen Effekten. Hüllglykoproteine können zweckmässigerweise unter Verwendung von wohlbekannten Techniken auf dem Fachgebiet modifiziert werden, beispielsweise durch die Verwendung der Offenbarung der Artikel, wie von Kowalski et al. (Science 237: 1351, 1987), welcher hier durch Verweis einverleibt ist. Demzufolge kann eine provirale Konstruktion durch die obigen Techniken konstruiert werden, welche retrovirale Konstruktionen bildet, die so ein zweckmässiges, modifiziertes gp exprimieren. Diese Konstruktion wird dann in eine Packungszelle, wie oben beschrieben, gebracht. Die resultierenden, produzierten rekombinanten Retroviren von den Packungs-zellinien können in vitro und in vivo zur Stimulierung einer Immunantwort gebraucht werden, durch die Infektion von empfindlichen Zielzeilen. Es wird darauf hingewiesen, dass andere Proteine aus dem HIV-Genom, wie gag, pol, vif, nef usw. exprimiert werden können, die ebenfalls nützliche Zellantworten in HlV-infizierten Individuen hervorrufen können. Provirale Vektoren, wie diejenigen, die nachstehend beschrieben sind, sind zur Expression von solchen Proteinen konstruiert, so dass eine klinisch gutartige Immunantwort ermutigt wird. Für gewisse Vektoren kann es ebenfalls nötig sein, rev-codierende Sequenzen, wie rev-Antwortelemente einzuverleiben (Rosen et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 85: 2071, 1988).

Das folgende Beispiel demonstriert die Fähigkeit dieses Behandlungstyps in Mäusen CTL-Antworten hervorzurufen.

Beispiel 2

Immunantworten auf retrovirale vektor-codierte Antigene

Eine Mäuse-Tumor-Zellinie (B/C10ME) (H-2d) wurde mit einer pAF envrSV40 Neo-Vektorkonstruktion, die HIV env coiderte, infiziert. Eine geklonte HlV-env-exprimierende Zellinie (B/C10ME-29) wurde dann zur Stimulation des HlV-env-spezifischen CTL in syngenischen (d.h. MHC-identischen) Balb/c (H-2d)-Mäusen verwendet. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion mit B/C1 OME-29-Zel-len (4 x 107 Zellen) und am Tag 7-14 verstärkt. Die Antwort Milzzellen-Suspensionen wurden aus diesen immunisierten Mäusen hergestellt und die Zellen wurden in vitro während 4 Tagen in Gegenwart von B/C10ME-29 oder B/C10ME Mitomycin-C-be-handelten Zellen behandelt, mit einem Stimulator:-Antwort Zellverhältnis von 1:50 kultiviert (Fig. 3). Die Effektorzellen wurden von diesen Kulturen ge-

ernet, gezählt und mit radiomarkierten (51Cr) Zielzellen gemischt (d.h. B/C10MEenv-29 oder B/C10ME) in verschiedenen Effektor:Zielzell-Verhältnissen (E:T) in einem Standard 4-5 h 51Cr-Freisetzungs-test. Nach der Inkubation wurden die Mikrotiterplat-ten zentrifugiert, 100 nl Kulturüberstand wurde entfernt und die Menge des freigesetzten Radiomar-kers von den lysierten Zellen einem Beckman-Gamma-Spektrometer quantifiziert. Die Zielzell-Lyse wurde berechnet als: % Ziel-Lyse = Exp CPM - SR CPM/MR CPM - SF CPM x 100, worin die experimentellen Impulse pro Minute (Exp CPM) die Effektoren plus Ziele darstellen; die spontan freigesetzten (SR) CPM stellen die Ziele allein dar; und die maximale Freisetzung (MR) CPM stellt die Ziele in Gegenwart von 1 M HCL dar.

Die Resultate (Fig. 4) illustrieren, dass die CTL-Effektoren mit spezifisch lysierten HlV-env-exprimie-renden Zielzellen (B/C10MEenv-29) signifikant effizienter sind, als die B/C1 OME-Ziele. Die vorbehandelten Milzzellen, die in vitro mit nicht HIV-env-ex-primierenden Kontrollzellen (B/C10ME) restimuliert wurden, zeigten keine signifikante CTL-Aktivität, weder an B/C10MEenv-29 noch an B/C1 OME-Zielen, insbesondere bei niederen E:T-Zellverhältnissen. Die von naiven immunisierten Balb/c-Mäusen erhaltenen Milzzellen, die in vitro mit B/C1 OMEenv-29 restimuliert wurden, bildeten kein CTL, was die Wichtigkeit der in vivo-Vorbehandlunas- und Verstärkungsereignisse zeigt.

In einem anderen Experiment, waren von Balb/c-Mäusen erhaltene Effektorzellen, die immunisiert, verstärkt und restimuliert waren, in vitro mit einem verschiedenen H-2d-HIV-env-exprimierenden Tu-morzellklon (L33-41) mit der gleichen pAF envr SV40 Neo (HlV-env)-Vektorkonstruktion infiziert wurden, fähig, B/C10MEenv-20) Zielzellen zu lysie-ren. Dies unterstützt die Tatsache, dass die in diesen Mäusen gebildeten CTL spezifisch eine expri-mierte Form von HlV-env erkennen, eher als einfach ein einziges Tumorzell-Antigen auf diesen Zellen. Dieses Resultat führt zum Schluss, dass das durch den Vektor eingeführte Antigen in ähnlicher Weise durch die zwei Tumorzellinien gezeigt wird.

Die Ausführung dieser Immunostimulans-Anwendung im Menschen erfordert, dass: (1) das Gen, welches das interessierende Antigen codiert auf Zellen übertragen wird, (2) das Antigen in zweckmässigen Zellen exprimiert wird und (3) die MHC-Restriktionserfordernisse, d.h. Klasse I- und Klasse ll-Antigen-Wechselwirkungen erfüllt sind. Vektorpräparate werden hergestellt durch Züchtung der Produktionszellen in normalem Medium, Waschen der Zellen mit PBS plus humanem Serumalbumin (HSA) 10 mg/ml, dann Züchten der Zellen während 8-16 h in PBS plus HSA. Die erhaltenen Titer sind typischerweise 104 bis 106/ml je nach dem Vektor, der Packungslinien oder besonderen Produktionsli-nien-Klonen. Die Vektorüberstände werden filtriert, um die Zellen zu entfernen und werden 100-fach konzentriert durch Filtration, durch 100 000 oder 300 000 durchlässigen Amicon-Filter (Wolff et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 84: 3344, 1987). Dies ermöglicht den globulären Proteinen von 100 000 oder

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300 000 den Durchtritt, hält jedoch 99% des viralen Vektors als infektiöse Partikel zurück. Die Vorräte können zur Lagerung eingefroren werden, da sie ungefähr 50% der infektiösen Einheiten beim Einfrieren und Auftauen verlieren. Die direkteste Abgabe schliesst die Verabreichung eines zweckmässigen, gentragenden Vektors in das Indivuum und die Zuverlässigkeit der Fähigkeit des Vektors, sich effizient auf die zweckmässigen Zellen zu richten, welche dann die Stimulation der Immunantwort einleiten. Die Dosis sollte bei 105 bis 106 Infektionseinheiten/kg Körpergewicht liegen. Ein praktischerer Weg kann jedoch die extracorporeale Behandlung der peripheren Blutlymphocyten (PBL) eines Patienten, der Fibroblasten oder andere Zellen, welche von jedem Individuum mit dem Vektor erhalten werden können, darstellen. Die PBL könnten in der Kultur durch die Verwendung von Miogenen (Phyto-hemagglutinin) oder Lymphokinen (z.B. IL-2) aufrechterhalten werden. Diese Art des Vorgehens erlaubt die direkte Vektorinfektion, die Verfolgung der Expression und die Expansion des Antigens, das die Zellpopulation vor der Injektion zeigt und die Rückkehr der vektor-exprimierenden Zellen in den entsprechenden Patienten. Andere Zelltypen könnten ebenfalls explantiert werden, Vektore eingeführt und die Zellen wiederum in den Patienten einverleibt werden. Es ist nur eine bescheidene Anzahl von infizierten Zellen (105 bis 106/kg Körpergewicht) erforderlich, um eine starke Immunantwort hervorzurufen.

Eine unterschiedliche Art der Verabreichung ist die Impiantante von Produktionslinien, welche retrovirale Vektorpartikel machen. Diese können immunologisch unerreichte, klassische Produktionszel-linien oder patienteneigene Zellinien sein, welche explantiert, behandelt und wieder zurückgegeben werden (vgl. VI Alternative, virale Vektor-Packungstechniken, unten). Beide Typen von Implantaten (105 bis 106/kg Körpergewicht) hätten im Patienten eine limierte Lebensdauer, würden jedoch zur retroviralen Vektorinfektion einer grossen Anzahl (107 bis 1010) Zellen in ihrer Nachbarschaft im Körper führen.

In jedem Fall kann die erfolgte Behandlung getestet werden, indem eine kleine Menge Blut genommen wird und die CTL-Reaktion gemessen wird, wobei eigene Zellen des Individuums verwendet werden, die mit dem Vektor, welche zur env-Ex-pression führt, infiziert sind.

Wenn gewünscht wird, eine MHC-Klasse I- oder Klasse ll-eingeschränkte Immunantwort gegen Pathogene, einschliesslich von HIV verschiedene pathogene Viren, zu stimulieren, können zweckmässige Formen von Hüll- oder anderen Antigenen mit solchen Retroviren vereinigt werden, welche eine Immunantwort stimulieren werden, welche von einem Fachmann nachgewiesen werden kann. Im allgemeinen können zweckmässige Formen mit patho-genischen Wirkstoffen vereinigte Antige leicht ausgewählt werden, dass sie eine Immunantwort gegen diese pathogenen Antigene bewirken.

Ein alternativer Zugang zur Schaffung einer gewünschten Immunantwort besteht darin, ein anti-gen-spezifisches T-Zell-Rezeptorgen auf eine zweckmässige Zelle, wie eine T-Zelle, zu übertragen. Ein anderer möglicher Rezipient sind NK-Zel-len, wobei die cytotoxische Immunantwort nicht MHC-beschränkt ist. Ein spezifisches Immunoglobu-lin-Gen könnte in ähnlicher Weise nützlich sein, wenn es an eine B-Zelle übertragen wird.

II, BiocKiervngsmittei

Viele Infektionskrankheiten, Krebs-, Autoimmunleiden und andere Leiden umfassen die Wechselwirkung von viralen Partikeln mit Zellen, Zellen mit Zellen oder Zellen mit Faktoren. In viralen Infektionen dringen gewöhnlicherweise Viren in Zellen ein über Rezeptoren an der Oberfläche von empfindlichen Zellen. Beim Krebs können Zellen unzweckmässig oder überhaupt nicht auf Signale von anderen Zellen oder Faktoren antworten. In Autoimmunkrankheiten besteht eine ungenügende Erkennung des «selbst»-Markers. Gemäss der vorliegenden Erfindung können solche Wechselwirkungen blockiert werden, indem in vivo ein Analoges produziert wird, zu einem der Partner der Wechselwirkung.

Diese Blockierungswirkung kann intracellulär, an der Zellmembrane oder extracellulär vorkommen. Die Blockierungswirkung eines viralen oder insbesondere eines retroviralen Vektors, der ein Gen für ein Blockierungsmittel trägt, kann entweder von innerhalb einer empfindlichen Zellen- oder durch die Ausscheidung einer Art eines Blockierungsprotein vermittelt werden, wobei die pathogene Wechselwirkung lokal blockiert wird.

Im Fall von HIV sind die zwei Mittel der Wechselwirkung das gp 120/gp41-Hüllprotein und das CD4-Rezeptormolekül. Demzufolge könnte ein zweckmässiges Blockierungsmittel eine Vektorkonstruktion sein, die entweder ein HIV-env-Anaioges exprimiert, das das Eindringen des HIV blockiert, ohne pathogene Effekte zu verursachen oder ein CD4-Rezep-tor-Analoges. Das CD4-Analoge könnte ausgeschieden werden und würde funktionieren, um die benachbarten Zellen zu schützen, während das gp 120/gp41 ausgeschieden oder nur intracellulär produziert würde, wobei nur die Vektor-enthaltende Zelle geschützt würde. Es könnte vorteilhaft sein, die schweren Ketten von humanem Immunogloblu-lin oder anderen Komponenten von CD4 zuzugeben, um die Stabilität zu erhöhen. Die Abgabe eines retroviralen Vektors, welcher ein solches hybrid-lösliches CD4 zu einem Wirt produziert, führt zu einer kontinuierlichen Versorgung eines stabilen Hybridmoleküls.

Beispiel 3 sCD4-Vektor

1. Ein 1,7 kb Eco R1-Hind Ill-DNA-Fragment von pMV7.T4 (Maddon et al., Cell 47: 333, 1986) wurde am stumpfen Ende an der Hinc Ii-Stelle vn Sk+ eingebunden.

2. Eine Universal-Translations-Terminations-Se-quenz, die eine Xba I-Stelle enthielt, wurde an der Nhe I-Stelle des CD4-Fragmentes insertiert.

3. Das 1,7 kb Xho l-CIa I-Fragment wurde aus5

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geschnitten und in die Xho l-CIa I-Stelle von pXFVXM kloniert. Diese Vektorpiasmide können, wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Bildung von infektiösen Vektorpartikeln verwendet werden.

Solche infektiösen Blockierungsvektoren können, wenn sie in eine humane T-Zellinien in Kultur gegeben werden, die Ausbreitung von HIV-Infektionen hemmen. Die Herstellung, die Konzentration und Lagerung von infektiösen, retroviralen Vektorzubereitungen ist gleich wie für das Immunostimulans. Der Verabreichungsweg kann der gleiche sein, mit ungefähr 10-fach höheren Dosen. Ein anderer Weg, der verwendet werden kann, ist das Absaugen von Knochenmark, Infektion mit dem retroviralen Vektor und Rückführung dieses infekten Marks (Gruber et al., Science 230: 1057, 1985) an den Patienten. Da die Markreplikation die Vektorexpression durch Zell-replikation verstärken wird, können Dosen in der Grössenordnung von Immunostimulans verwendet werden (105 bis 106/kg Körpergewicht).

In jedem Fall kann die Wirksamkeit der Behandlung durch Messung der üblichen Indikatoren des Krankheitsfortschrittes, einschliesslich des Antikörperspiegels, der viralen Antigenproduktion, des infektiösen HIV-Spiegels oder des Spiegels von nichtspezifischen Infektionen, gemessen werden.

III. Expression von Palliativen

Eine ähnliche Technik, wie oben beschrieben, kann für die Herstellung von rekombinanten Retroviren mit Vektorkonstruktion verwendet werden, welche auf die Expression eines Mittels (oder «Palliativ»), das fähig ist, eine Funktion eines pathogenen Mittels oder Gens zu hemmen. In der vorliegenden Erfindung bedeutet «fähig, eine Funktion zu hemmen», dass das Palliativ entweder die Funktion direkt oder indirekt hemmt, beispielsweise durch Umwandeln eines in den Zellen vorhandenen Mittels von einem, welches normalerweise eine Funktion des pathogenen Mittels nicht hemmt, in ein solches, welches dies tut. Beispiele solcher Funktionen für virale Leiden umfassen Adsorption, Replikation, Genexpression, Zusammenfügen und Austritt des Virus aus den infizierten Zellen. Beispiele solcher Funktionen für krebsartige Leiden schliessen die Zellreplikation, die Empfindlichkeit gegen externe Signale (z.B. Kontakthemmung) und den Mangel der Produktion von anti-oncogenen Proteinen ein.

(i) Inhibitor-Palliative

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Vektorkonstruktion auf die Expression von Antisinn-RNA (oder komplementärer RNA) gegen die RNA eines pathogenen Virus gerichtet, wie gegen HIV (oder ein pathogenes Gen, wie ein On-cogen), wobei seine Replikation oder Pathogenität gehemmt wird. Eine solche Expression kann entweder kontinuierlich oder in Antwort auf die Gegenwart der Zelle eines anderen Mittels sein, welches mit den pathogenischen Bedingungen verbunden ist (ein «identifizierendes Mittel»). Alternativ kann die Expression gewebespezifisch sein, da der Vektoreintritt entweder zielgerichtet einverleibt wird oder wegen der gewebespezifischen Steuerungssequenzen im Vektor.

In einer Ausführungsform können retrovirale Viren, die zu pathogenen Schlüsselgen-Transkriptionen komplementär sind (z.B. ein virales Genprodukt oder ein aktiviertes, celluläres Oncogen) zur Hemmung der Translation dieser Transkription in das Protein verwendet werden, z.B. zur Hemmung der Translation des HlV-tat-Proteins. Da die Expression dieses Proteins für die virale Replikation essentiell ist, können Zellen, die den Vektor enthalten, gegen die HIV-Replikation resistent sein.

In einer zweiten Ausführungsform, worin das pathogene Mittel ein einsträngiger Virus mit einem Packungssignal ist, wird eine RNA, die komplementär zum viralen Packungssignal ist (z.B. einem HIV-Packungssignal, wenn das Palliativ gegen HIV gerichtet ist) exprimiert, so dass die Vereinigung dieser Moleküle mit dem viralen Packungssignal, im Fall von Retroviren, die Stammschlingenbildung oder die tRNA-Primer-Bindung, die für eine richtige Verkapseiung oder Replikation des retroviralen RNA-Genoms erforderlich ist, gehemmt wird.

In einer dritten Ausführungsform kann ein retrovi-raler Vektor eingeführt werden, der ein Protein, welches mit dem pathogenen Zustand in Wechselwirkung tritt, exprimiert. Ein Beispiel ist im Fall von HIV, ein mutantes tat-Protein, welchem die Fähigkeit zur transaktivierten Expression vom HIV-LTR fehlt und (in einer transdominanten Weise) mit der normalen Funktion des tat-Proteins in Wechselwirkung tritt. Ein solcher Mutant wurde als HTLV ll-tat-Protein identifiziert («XII Leu5» Mutant; siehe Wachsmann et al., Science 235: 674, 1987). Ein mutanter Transrepressor tat sollte die Replikation soweit es für inen analogen mutanten Repressor in HSV-1 gezeigt worden ist, hemmen (Friedmann et al., Nature 335: 452, 1988).

Ein solches transkriptionales Repressorprotein kann in einer Gewebekultur ausgewählt werden unter Verwendung von irgendeinem viral-spezifischen, transkriptionalen Promotor, dessen Expression durch ein virus-spezifisches, transaktivierendes Protein stimuliert wird (wie oben beschrieben). Im spezifischen Fall von HIV wird eine HIV-tat-protein-ex-primierende Zellinie und das HSVTK-Gen, das durch den HlV-Promotor getrieben wird, in der Gegenwart von ACV abgetötet. Wenn jedoch eine Serie von mutierten tat-Genen in das System eingeführt wird, kann eine Mutante mit den zweckmässigen Eigenschaften (d.h. die die Transkription des HlV-Promotors in Gegenwart des Wildtypes tat unterdrückt) wachsen und ausgewählt werden. Ein mutantes Gen kann dann aus diesen Zellen reisoliert werden. Es kann eine Zellinie, die mehrfache Kopien des bedingt letalen Vektor/tat-Systems enthält, zur Versicherung verwendet werden, dass die überlebenden Zellklone nicht durch endogene Mutationen in diesen Zellen verursacht werden. Eine Batterie von zufällig mutagenisierten tat-Genen wird dann in diese Zellen unter Verwendung eines «hilfsfähigen» retroviralen Vektors eingeführt (d.h. einer, welcher das mutante tat-Protein exprimiert und einen bakteriellen Ursprung eines replikations-

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und drogenbeständigen Markers für das Wachstum und die Auswahl in Bakterien enthält). Dies erlaubt, dass eine grosse Anzahl von zufälligen Mutationen ausgewertet werden kann und erlaubt anschliessend ein leichtes, molekulares Klonen der gewünschten mutanten Zellinie. Dieses Verfahren kann für die Identifikation verwendet werden und benützt Mutationen in einer Varietät von viralen transkriptionalen Aktivator/viralen Promotorsystemen für potentielle, antivirale Therapien.

In einer vierten Ausführungsform wird das HSVTK-Genprodukt zu einer wirksameren Metaboli-sierung von potentiell antiviralen Nukleosid-Analo-gen, wie AZT oder ddC, verwendet. Das HSVTK-Gen wird unter der Steuerung eines richtungsge-benden Macrophagen oder T-zellspezifischen Promotors exprimiert und in diese Zelltypen eingeführt. AZT (und andere Nukleosid-Antivirale) müssen durch celluläre Mechanismen in die Nukleotid-Tri-phosphat-Form metabolisiert werden, um die retrovirale Umkehrtranskriptase spezifisch zu hemmen und demzufolge ebenfalls die HIV-Replikation (Fur-mam et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83: 8333-8337, 1986). Die richtungsgebende Expression von HSVTK (ein Nukleotid und eine Nukleotid-Phosphat-Kinase mit sehr breiter Substrat-Spezifität) führen zu einem effektiveren Metabolismus dieser Drogen in ihrer biologisch aktive Nukleotid-Triphosphat-Form. Die AZT oder die ddC-Therapie kann dabei wirksamer sein, erlaubt kleinere Dosen, weniger allgemeine Toxizität und zeigt eine höhere Potenz gegen die produktive Infektion. Zusätzliche Nukleosid-Analoge, deren Nukleotid-Triphosphat-Formen eine Selektivität für die retrovirale Umkehr-Transkriptase zeigen, jedoch als Resultat der Substrat-Spezifität des cellulären Nukleosids und der Nukleotid-Kina-sen nicht phosphoryliert werden, können wirksamer gemacht werden.

Eine Beschreibung dieser Methode wird in Beispiel 4 zur Verfügung gestellt.

Beispiel 4

Vektoren, die zur Potenzierung des antiviralen Effektes von AZT und Analogen konstruiert wurden

I. Alle der folgenden retroviralen Vektoren basieren auf dem «N2»-Vektor (siehe Keller et al., Nature 318: 149-154, 1985). Demzufolge wurden die Fragmente 5' und 3' Eco R1 LTR (2,8 bzw. 1,0 kb) am Anfang in Polylinker enthaltende Plasmide sub-geklont (in SK+ unter Bildung von pN2R5[+/=]; in pUC31 unter Bildung p31N2R5[+/-] und p31N2R3[+/ -] zur Erleichterung der Vektorkonstruktion. In einem Fall wurde ein 1,2 kb Cla I/Eco R1 5' LTR-Fragment in den gleichen Stellen eines SK+-Vek-tors subgeklont, wobei pN2C erhalten wurde. In einem anderen Fall wurde 5' LTR, das eine 6 bp-De-letion der Spleiss-Donor-Sequenz enthielt, als 1,8 kb Eco R1-Fragment in pUC31 (P31 N25delta[+]) subgeklont. Die codierende Region und die transkriptionalen Terminationssignale des HSV-1-Thymi-din-Kinase-Gens wurde als 1,8 kb Bgl Il/Pvu ll-Fragment aus dem Plasmid 322TK (3,5 kb Bam H1-Fragment von HSVTK geklont in Barn H1 von pBR322) isoliert und in Bg1 Il/Sma l-verdautes pUC 31 (pUCTK) geklont. Für Konstruktionen, die eine Deletion des Terminatorsignals erfordern, wurde pUCTK mit Sma I und Barn H1 verdaut. Die verbleibenden codierenden Sequenzen und der Bam H1-Überhang mit klebrigem Ende wurde mit einem zwei-strängigen Oligonukleotid, das aus folgenden Oligomeren gemacht war, rekonstituiert:

5' GAG AGA TGG GGG AGG CTA ACT GAG 3' und

5' GAT CCT CAG TTA GCC TCC CCC ATC TCT C 3'

unter Bildung der Konstruktion pTK delta A.

Für diagnostische Zwecke wurden die Oligos so konstruiert, dass sie die Sma I-Stelle zerstörten, während sie ihre Ava I-Stelle ohne Änderung des Translationsproteins aufrechterhielten.

Die 0,6 kb HlV-Promotorsequenzen wurden als Dra I/-Hind Ill-Fragment aus pCV-1 (siehe Arya et al., Science 229: 69-73, 1985) in Hinc Il/Hind lll-cut SK+ (SKHL) kloniert.

A. Konstruktion der retroviralen Vektoren TK-1 und TK-3 (siehe Fig. 6

1. Die 5 kb Xho I/Hind III 5' LTR und Plasmidse-quenzen wurden aus p31 N2R5(+) isoliert.

2. HSVTK-codierende Sequenzen, welchen die transkriptionalen Terminationssequenzen fehlten, wurden als 1,2 kb Xho I/Bam H1-Fragment aus pT-KdeltaA isoliert.

3. 3 LTR-Sequenzen wurden als 1,0 kb Bam H1 / - Hind Ill-Fragment aus pN2R3(-) isoliert.

4. Die Fragmente der Stufen 1 bis 3 wurden gemischt, verbunden, in Bakterien transformiert und individuelle Klone wurden durch die Restriktionsenzym-Analyse identifiziert (TK-1).

5. TK-3 wurde konstruiert durch Linearisierung von TK-1 mit Barn H1, Füllung in den 5-Überhang und Stumpf-End-Verbindung eines 5'-gefüllten Cla I-Fragmentes, das dem bakteriellen lac UV5-Promo-tor, den Frühren SV40-Promotor plus Tn5 Neor-Gen. Die Kanamycin-resistenten Klone wurden isoliert und die individuellen Klone wurden einem Screening auf die korrekte Orientierung auf die Restriktionsenzym-Analyse einem Screening unterworfen.

Die Konstruktionen wurden zur Bildung von infektiösen rekombinanten Vektorpartikeln in Konjunktion mit einer Packungszellinie, wie PA317, wie oben beschrieben, verwendet.

Die Verabreichung dieser retroviralen Vektoren an humane T-Zell- und Macrophagen/Monocyten-Zellinien kann ihre Resistenz gegenüber HIV in Gegenwart von AZT und ddC im Vergleich mit den gleichen Zellen ohne retrovirale Vektrobehandlung erhöhen.

Die Zubereitung, die Konzentration und die Lagerung von retroviralen Vektor-Zubereitungen erfolgt wie oben beschrieben. Die Behandlung kann wie oben beschrieben, jedoch durch ex corpore-Be-

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handlung von Patientenzellen erfolgen, wobei unifizierte, potentiell empfindliche T-Zellen oder Mo-nocyten die Ziele sind. Eine bevorzugte Methode zur Anvisierung der empfindlichen Zellen ist mit Vektoren, die HIV env oder Hybrid-env tragen (vgl. Teil VIII, Zellinienspezifische Retroviren, unten), um die Absorption von Vektorpartikeln auf CD4+-Zellen zu richten. Normale Erwachsene haben ungefähr 5 x 109 T4-Zellen in ihrem gesamten Blut und etwa die gleiche Anzahl Monocyten.

Ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung wäre Leukophorese, wobei ungefähr 20% der PBL eines Indivuums auf einmal entfernt und in vitro manipuliert werden können. Demzufolge würden ungefähr 2 x 109 Zellen behandelt und ersetzt. Da die geläufigen maximalen Titer um 106/ml liegen, würde dies 2 bis 20 I viralen Ausgangsüberstand erfordern. Es wären wiederholte Behandlungen durchzuführen. Alternativ könnte Knochenmark behandelt und die Wirkung, wie oben beschrieben, verstärkt werden. Die Behandlung mit AZT würde niedriger sein, als normale Mengen, um toxische Nebenwirkungen zu vermeiden, würde jedoch immer noch wirkungsvoll die Verbreitung von HIV hemmen. Der Lauf der Behandlung kann analog, wie für den Blocker beschrieben, erfolgen.

Eine fünfte Ausführungsform für die Herstellung von Inhibitor-Palliativen umfasst die Expression von defekten, eingreifenden viralen Strukturproteinen, welche die virale Zusammensetzung hemmen. Die Vektoren codieren defekte gag-, pol-, env- oder andere virale Partikel, Proteine oder Peptide und diese können in dominanter Weise die Zusammensetzung von viralen Partikeln hemmen. Dies findet statt, weil die Wechselwirkung von normalen Untereinheiten von viralen Partikeln durch die Wechselwirkung mit den defekten Untereinheiten gestört wird.

Ein sechste, derartige Ausführungsform umfasst die Expression von hemmenden, auf virale Protease spezifischen Peptide. Die virale Protease spaltet die viralen gag- und gag/pol-Proteine in eine Anzahl kleinerer Peptide. Fehler in dieser Spaltung führen in allen Fällen zu einer vollständigen Hemmung der Produktion der infektiösen, retroviralen Partikel. Die HIV-Protease ist als Aspartyl-Protease bekannt und diese ist bekannt, dass sie durch Peptide aus Aminosäuren von Proteinen oder Analogen gehemmt werden können. Vektoren zur Hemmung von HIV exprimieren eines oder mehrere, fusionierte Kopien solcher Peptidinhibitoren.

Eine siebente Ausführungsform umfasst die Zurverfügungstellung von Suppressorgenen, welche zur Tumorgenese in diesem Zelltyp führen, wenn sie in diesem Zelltyp deletiert oder nicht exprimiert werden. Die Wiedereinführung des deletierten Gens mittels eines viralen Vektors führt zur Regression des Tumorphenotyps in diesen Zellen. Beispiele solcher Krebsarten sind das Retinoblastom und der Wilms-Tumor. Da die Bösartigkeit als Hemmung von cellulärer, terminaler Differenzierung, verglichen mit dem normalen Zellwachstum, betrachtet werden kann, sollte die retrovirale Zurverfügungstellung und Expression von Genprodukten, welche zu einer Differenzierung eines Tumor führen, im allgemeinen ebenfalls zur Regression führen.

In einer achten Ausführungsform verleiht die retrovirale Konstruktion einen therapeutischen Effekt durch eine Selbstinsertion in ein Virus, Oncogen oder pathogenes Gen, wobei eine für die Pathogenese erforderliche Funktion gehemmt wird. Diese Ausführungsform erfordert, dass die retrovirale Integration auf eine spezifische Stelle in Genum gerichtet wird, durch homologe Rekombination, Integrase, Modifikation oder anderen Verfahren (nachstehend beschrieben).

(ii) Bedingt toxische Palliative

Ein anderer Zugang zur Hemmung eines pathogenen Mittels besteht in der Expression eines Palliativs, welches für die Zellexpression der pathogenen Bedingung toxisch ist. In diesem Fall sollte die Expression durch die Gegenwart einiger intracellulä-rer Signale limitiert werden, welche den pathogenen Zustand identifizieren, um die Zerstörung von nicht-pathogenen Zellen zu vermeiden. Diese Zelltyp-Spezifität kann ebenfalls durch den Infektionsgrad verliehen werden, indem ein rekombinanter Retrovirus, welcher den Vektor trägt, in Zellen gebracht wird, welche auf die pathogene Bedingung empfindlich sind oder sie aufweisen. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens trägt ein rekombinantes Retrovirus (vorzugsweise, jedoch nicht erforderlich, ein rekombinantes MLV-Retrovirus), eine Vektorkonstruktion, die ein cytotoxisches Gen (wie Ricin) enthält, das von einem ereignis-spezifischen Promotor exprimiert wird, wie durch einen Promotor, der vom Zellzyklus abhängig ist (z.B. humane celluläre Thymidin-Kinase oder Transferrin-Rezeptor-Promo-toren), welche nur bei schnell proliferierenden Zellen, wie Tumoren, transkriptional aktiv sind. Auf diese Weise werden schnell replizierende Zellen, die Faktoren enthalten, die fähig sind, die Transkription von diesen Promotoren zu aktivieren, vorzugsweise durch das cytotoxische Mittel, welches durch die provirale Konstruktion produziert wird, zerstört.

In einer zweiten Ausführungsform ist das Gen, welches das cytotoxische Mittel produziert, unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, wobei die Gewebespezitität dem Ursprung des Tumors entspricht. Da der virale Vektor vorzugsweise in das Genom von replizierenden Zellen integriert wird (z.B. sind normale Leberzellen nicht replizierend, während es diejenigen eines Hepatokar-zinoms sind), führen diese zwei Grade der Spezifität (virale Integration/Replikation und gewebespezifische, transkriptionale Regulation) zur bevorzugten Tötung von Tumorzellen. Zusätzlich können ereig-nis-spezifische und gewebespezifische Promotorelemente künstlich kombiniert werden, damit das cytotoxische Genprodukt nur in Zelltypen exprimiert wird, welche beide Kriterien erfüllen (im obigen Beispiel funktionieren kombinierte Promotorelemente nur in sich schnell teilenden Leberzellen). Die transkriptionalen Steuerelemente können ebenfalls verstärkt werden, um die Stärke der Zelityp-Spezifität zu verbessern.

Diese transkriptionalen Promotor/Enhancer-Ele-mente brauchen nicht als interne Promotoren (zwischen den viralen LTR liegend) vorhanden zu sein,

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können jedoch zu den transkriptionalen Steuerelementen in den viralen LTR, welche selbst transkrip-tionale Promotoren sind, zugegeben werden oder sie ersetzen, in solcher Weise, dass die bedin-gungs-spezifische, transkriptionale Expression direkt von modifizierten LTR stattfindet. In diesem Fall muss die Bedingung für die maximale Expression in den retroviralen Packungszellinien nachgeahmt werden (z.B. durch geänderte Wachstumsbedingungen, Zugabe von nötigen Transregulatoren der Expression oder unter Verwendung der zweckmässigen Zel-linien als Ursprung für eine Packungslinie) oder die LTR-Modifikation ist auf die 3' LTR U3-Region beschränkt, um maximale, rekombinante, virale Titer zu erhalten. Im letzten Fall ist nach einer Infektions-/Integrationsrunde 3' LTR U3 jetzt ebenfalls das 5' LTR U3, welches die gewünschte gewebespezifische Expression gibt.

In einer dritten Ausführungsform wird die provirale Vektorkonstruktion in ähnlicher Weise aktiviert, exprimiert jedoch ein Protein, das nicht selbst cytotoxi-sch ist, und welches in den Zielzellen eine Verbindung oder ein Mittel mit wenig oder keiner Cytotoxi-zität in einer, welche cytotoxisch ist, entwickelt (ein «bedingt letales» Genprodukt). Spezifisch trägt die provirale Vektorkonstruktion das Herpes-Simplex-Vi-rus-Thymidin-Kinase («HSVTK»)-Gen stromabwärts und unter der transkriptionalen Steuerung eines HlV-Promotors (von welchem bekannt ist, dass er transkriptional still ist, ausgenommen, wenn er durch das HlV-tat-Protein aktiviert wird). Die Expression des tat-Genprodukts in humanen HlV-infizierten Zellen, die die provirale Vektorkonstruktion tragen, verursacht eine verbesserte Produktion von HSVTK. Die Zellen (entweder in vitro oder in vivoi werden dann einem Wirkstoff, wie Acyclovir oder Analogen davon (FIAU, FIAC, DHPG). Es ist bekannt, dass diese Mittel durch HSVTK phosphoryliert werden (jedoch nicht durch celluläre Thymidin-Kinase) in ihre entsprechenden aktiven Nukleotid-Triphosphat-Formen (siehe beispielsweise Schaeffer et al., Nature 272: 583, 1978). Acyclovir und FIAU-Tri-phosphate hemmen im allgemeinen celluläre Polymerasen, führen zur spezifischen Zerstörung von Zellen, die HSVTK in transgenen Mäusen exprimieren (siehe Borrelli et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85: 7572, 1988). Diese Zellen, welche den rekombinanten Vektor enthalten und das HlV-tat-Protein exprimieren, werden selektiv durch die Gegenwart einer spezifischen Dose dieses Wirkstoffes abgetötet. Im weiteren wird ein Zusatzmass an Spezifität erzielt, indem das HIV rev-Protein, welches auf CRS/ CAR-Sequenzen reagiert, in den Vektor eingeschlossen wird. In Gegenwart der CRS-Sequenz wird die Genexpression unterdrückt, mit der Ausnahme der Gegenwart von CAR-Sequenzen und dem rev-Protein. Beispiel 5 stellt eine Erläuterung dieser Technik dar.

Beispiel 5

Vektor zur konditionierten Potentierung der toxischen Wirkung von ACV oder Analogen davon Konstruktion von Vektoren

A. Konstruktion von dKTVIHAX (siehe Fig. 7)

1. ein 9,2 kb Asu Il/Xho I-Fragment wurde aus der Vektor pN2 DNA isoliert.

2. Ein 0,6 kb Xho I/Bam H1-Promotor-Fragment wurde aus dem Plasmid pSKHL isoliert.

3. Ein 0,3 kb Bg Ill/Acc I und ein 1,5 kb Acc I/ Acc I-Fragment wurden aus pUCTK gereinigt.

4. Die Fragmente aus 1, 2 und 3 wurden verbunden, in Bakterien transformiert und zweckmässige Ampr-Klone der gegebenen Struktur durch die Re-striktions-Enzym-Analyse identifiziert.

B, Konstruktion der pKTVIH-5- und dKTVIH5 Neo retroviralen-Vektoren (siehe Fig. 8)

1. 4,5 kb 5' LTR und Vektor wurde als Xho I/ Bahm H1-Fragment aus dem Vektor p31N25del-ta(+) isoliert.

2. Die 1,0 kb 3' LTR wurden als Apa I/Bam H1-Fragment von pN2R3(+)-Fragment isoliert.

3. Das 0,6 kb HIV-Promotor-Element wurde von pSKHL als Apa I/Eco R1-Fragment isoliert.

4. Die HSVTK-codierende Sequenz und die transkriptionalen Terminierungssequenzen wurden als 1,8 kb Eco Rl/Sal I-Fragment aus pUCTK isoliert.

5. Die Fragmente von 1 bis 4 wurden kombiniert, verbunden, in Bakterien transformiert und Klone der gegebenen Struktur wurden durch die Restriktions-Enzym-Analyse (pKTVIH-5) identifiziert.

6. pKTVIH5 Neo wurde durch Linearisierung von pKTVIH5 mit Cla I konstruiert; mit 1,8 kb Cla I-Fragment, das den bakteriellen lac UV5-Promotor, den frühren SV40-Promotor und Tn5 Neor-Marker enthielt, Verbinden, Transformen der Bakterien und Auswahl auf Kanamycin-Resistenz. Die Klone mit der Insertion in der angegeben Orientierung wurden durch die Restriktionsanalyse identifiziert.

C. Konstruktion des retroviralen MHMTK NeoVektors (siehe Fig. 9)

1. Konstruktion des Zwischenplasmids MHM-1 :

a) das Plasmid pN2CR5 wurde durch partielle Verdauung mit Fok I linearisiert, der 5'-Überhang wurde mit Desoxynukleotid-Triphosphaten unter Verwendung der Klenow-DNA-Polymerase ergänzt und die Hind Ill-Linker wurden insertiert. Nach der Transformation in Bakterien wurde ein Klon mit einem Hind Ill-Linker an der MLV LTR Fok I-Stelle durch die Restriktions- Enzym-Analy-se identifiziert (pN2CRSFH).

b) pN2CR5FH wurde mit Nhe I linearisiert, der 5MJberhang, der mit Klenow-Polymerase ergänzt war, wurde mit Hind III verdauut, und das 4,3 kb-Fragment mit den promotorlosen MLV-Sequen-zen wurde isoliert.

c) 0,5 kb Eco RV/Hind III HlV-Promotorsequen-zen wurden aus pSKHL isoliert.

d) b und c wurden gemischt, verbunden, zur Transformation von Bakterien verwendet und die Struktur von MHM-1 wurde durch die Restrik-tions-Enzym-Analyse bestätigt.

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2. Ein 0,7 kb Eco RV/Bal I-Fragment aus MHM-1 isoliert wurde an der Eco Rv-Stelle des Plasmides I30B (ein modifiziertes IBI30-Plasmid, das zusätzlich Bgl II, Bst II, Neo I und Nde I-Stellen am Polylinker enthielt) geklont. Nach der Transformation in Bakterien wurden die Klone mit der zweckmässigen Orientierung durch die Restriktions-Enzym-Analyse identifiziert (pMHMB).

3. pMHMB wurde mit Apa I und Xho I verdauut und gelgereinigt.

4. MHM-1 wurde mit Apa I/Bam H1 verdauut und die 1,8 kb MHMLTR/Leadersequenz wurde gelgereinigt.

5. Ein 2,8 kb Big Il/Sal I-Fragment, das die HSVTK-codierende Region stromabwärts des frühen SV40-Promotors, der Neor antreibt, enthält, wurde von pTK-3 genommen (siehe Fig. 3).

6. 3 bis 5 wurden gemischt, verbunden, zur Transformation von Bakterien verwendet und die zweckmässigen Klone wurden durch Restriktions-Enzym-Analyse identifiziert.

D. Konstruktion des tat- und anti-tat-Expressions-vektors (siehe Fig. 101

Diese Vektoren werden als pseudo-HIV verwendet, um die tat-abhängigen HSVTK-Vektoren zum Test zu aktivieren.

1. Der Hisr-Expressionsvektor pBamHis wurde mit Bam H1 linearisiert und mit intestinaler Kälber-Phosphatase behandelt.

2. Die Sac I-Stelle von pCV-1 wurde an der Bam H1-Stelle mutagenisiert und die 350 bp Bam H1-codierende Sequenz von HlV-tat wurde isoliert.

3. Die in den Stufen 1 und 2 gereinigten Fragmente wurden gemischt, verbunden, zur Transformation von Bakterien verwendet und die Klone mit tat in beiden Orientierungen wurden durch die Restriktions-Enzym-Analyse identifiziert.

Diese Konstruktionen wurden zur Bildung von infektiösen, rekombinanten Vektorpartikeln in Konjugation mit einer Packungszellinie, wie PA317, wie oben beschrieben, verwendet.

Die biologischen Eigenschaften dieser retroviralen Vektoren werden nachstehend beschrieben. Das HIV-tat-Gen («tathis»-Vektor - siehe Fig. 10) wurde in PA317-Mäusezellen transferiert. Fünf einzelne Histidinol-resistente Subklone wurden erhalten (TH 1-5), welche HlV-tat exprimieren. Diese Zellen sind somit das experimentelle Modell für die HIV-Infektion. Die Vektoren KTVIHAX, KTVIH5NEO und MHMTKNEO wurden nacheinander durch Infektion in diese tat-exprimierenden Zellinien eingeführt, ebenso, wie ihre ursprüngliche Zellinie, welcher tat fehlte. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde dann in verschiedenen Konzentrationen der HSVTK-spezifischen cytotoxischen Droge Acyclovir bestimmt. Die Daten sind hier als LD50 angegeben (Drogenkonzentration, bei welcher 50% Toxizität beobachtet wird). Die Stammzellinie, welche den Vektor enthielt, der jedoch tat fehlte (nicht HlV-infi-ziertes Modell) zeigte keine nachweisbare Toxizität durch ACV in den getesteten Konzentrationen (siehe Fig. 11). Diese Zellen benötigen demzufolge 100 jiM ACV oder mehr für die Cytotoxizität. Dies ist ebenfalls für diejenigen Zellen richtig, welchen die Vektoren fehlen. Demzufolge sind die Vektoren alleine, ACV allein oder sogar der Vektor +ACV (feste Boxen) nicht cytotoxisch. Zellinien, welche HlV-tat exprimieren (die experimentelle Verkörperung einer HIV-Infektion) werden jedoch wirksam durch ACV abgetötet. Dies ist richtig für verschiedene Grade für alle drei getesteten Vektoren. Diese Daten zeigen an, dass die HlV-infizierten Zellen in Gegenwart von ACV und «Potentierungs-»Vektoren abgetötet werden.

Ahnlich zeigt die HIV-Infektion von humanen T-Zellinien +/- FIAU eine bevorzugte Hemmung (durch Zelltötung) der HIV-Infektion. Die Kulturen wurden zuerst mit dem Vektor behandelt, dann mit einer HIV-Infektion mit niedriger Multiplizität während 4 Tagen behandelt. Die viralen Überstände wurden unter Venwendung des HIV, wie im Abschnitt IV beschrieben, titriert.

Im Falle der HlV-infizierten Zellen wurde die Expression des bedingt letalen HSVTK-Gens sogar HIV-spezifischer gemacht, indem cis-wirkende Elemente in die Transkripte («CRS/CAR») eingeschlossen, was ein zusätzliches HIV-Genprodukt, rev, für eine optimale Aktivität erfordert (Rosen et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85: 2071, 1988). Allgemeiner hat sich erwiesen, dass die in den mRNA vorhandenen cis-Elemente in einigen Fällen die mRNA-Stabilität oder Translabilität regeln. Sequenzen dieses Typs (d.h. post-transkriptionale Regulierung der Genexpression) können für die ereignis- oder gewebespezifische Regulierung der Vektorgenexpression verwendet werden. Zusätzlich könnte die Multimeri-sierung dieser Sequenzen (d.h. rev-reaktive «CRS/ CAR» oder tat-reaktive «TAR»-Elemente für HIV) sogar zu einer grösseren Spezifität führen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass diese Art von bedingter Aktivierung eines unaktiven Vorläufers in ein aktives Produkt in Zellen ebenso erzielt werden könnte duch andere virale Vektoren mit einer Wirkung in kurzer Zeit, z.B. Adenovirus-Vektoren. Die Produktion, Konzentration und Lagerung von Vektorzubereitungen sind wie vorher beschrieben. Die Verabreichung ist eine direkte in vivo-Verabrei-chung, wie vorher, oder eine ex corpore-Behand-lung von PBL und/oder Knochenmark. Die Dosierungen sind ungefähr in der gleichen Grösse, wie für Beispiel 4. Die Anzielung der viralen Vektorinfektion verläuft nicht durch den CD4-Rezeptor, kann jedoch durch die Herstellung von Vektorpartikeln mit hybriden MLVenv-CD4 «Hüll»-Proteinen (vgl. Abschnitt VII) durchgeführt werden, wobei die gp 120-exprimierenden Zellen das Ziel sind (d.h. diejenigen, welche mit HIV infiziert sind). Diese Inversion der normalen Virus-Rezeptor-Wechselwirkung, um die viral infizierten Zellen zu erreichen, kann mit allen Typen von Viren verwendet werden.

In ähnlicher Weise, wie in der vorhergehenden Ausführungsform kann die retrovirale Vektorkonstruktion ein Gen für die Phosphorylierung, Phos-phoribosylierung, Ribosylierung und andere Metabolismen eines Purin- oder Pyrimidin-basierenden Wirkstoffes tragen. Dieses Gen braucht kein

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Äquivalent in Säugetierzellen zu haben und kann von Organismen stammen, wie ein Virus, Bakterium, Pilz oder Protozoan. Ein Beispiel davon könnte das E. coli Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Ge-nprodukt sein, das in Gegenwart von Thioxanthin letal ist (siehe Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987). Die bedingt letalen Genprodukte dieses Typs haben eine potentielle Anwendung auf viele gegenwärtig bekannte Anti-Krebsmittel auf Purin- oder Pyrimidin-Base, die häufig eine intracellulare Ribosylierung oder Phosphorylierung erfordern, um zu wirkungsvollen cytotoxischen Mitteln zu werden. Das bedingt letale Genprodukt könnte ebenfalls eine nicht-toxische Droge metabolisieren, welche kein Purin- oder Pyrimidin-Analoges ist, in eine cytotoxische Form.

Die Säugetierviren neigen dazu, «unmittelbar frühe» Gene zu haben, welche für eine nachfolgende transkriptionale Aktivierung von anderen viralen Promotorelementen nötig sind. Die Genprodukte dieser Natur sind ausgezeichnete Kandidaten für in-tracelluläre Signale (oder «Identifizierungsmittel») von viraler Infektion. Demzufolge können bedingt letale Gene von transkriptionalen Promotorelementen, welche auf diese viralen «unmittelbar frühen» Genprodukte reagieren, spezifisch Zellen abtöten, die mit irgendeinem besonderen Virus infiziert sind. Weiter, da die humanen a- und ß-Interferon-Promo-torelemente transkriptional aktiviert sind als Reaktion auf die Infektion durch eine grosse Vielzahl von nicht-verwandten Viren, könnte die Einführung von Vektoren, welche ein bedingt letales Genprodukt, wie HSVTK, exprimieren, z.B. von diesen viralreak-tiven Elementen (VRE) in der Zerstörung von Zellen resultieren, die mit einer Vielzahl von verschiedenen Viren infiziert sind.

In einer vierten Ausführungsform trägt das rekombinante Retrovirus ein Gen, das ein Produkt, welches selber nicht toxisch ist, spezifiziert, das jedoch, wenn es durch ein Protease-spezifisches zu einem viralen oder anderen Pathogen entwickelt wird, in eine toxische Form umgewandelt wird.

In einer fünften Ausführungsform kann das schildernde Produkt auf der Oberfläche der Zielzellen als Reaktion auf die Gegenwart eines identifizierenden Mittels in den Zellen (wie HlV-tat-Protein) exprimieren. Dieses Oberflächenprotein kann durch ein cytotoxisches Mittel, wie Antikörper auf das schilderende Protein oder durch cytotoxische T-Zellen erkannt werden. In ähnlicher Weise kann ein solches System als Nachweissystem verwendet werden (siehe unten), um diese Zellen, welche ein bestimmtes Gen besitzen, das ein identifizierendes Protein exprimiert, wie das HIV-tat-Gen, identifizieren.

In ähnlicher Weise kann in einer sechsten Ausführungsform ein Oberflächenprotein exprimiert werden, welches selbst therapeutisch gutartig ist. Im spezifischen Fall von HIV kann die Expression des humanen CD4-Proteins in HlV-infizierten Zellen auf zwei Weisen gutartig sein:

1. Die Bindung von CD4 an HlV-env intracellulär könnte die Bildung von lebensfähigen, viralen Partikeln ebenso, wie das lösliche CD4 es beim freien

Virus tut, jedoch ohne das Problem der systematischen Tilgung und möglichen Immunogenität, da das Protein membran-gebunden bleibt und strukturell identisch mit dem Endogen-CD4 ist (gegen welches der Patient immunologisch tolerant sein sollte).

2. Da der CD4/HIV-env-Komplex in die Ursache des Zelltods verwickelt ist, führt eine zusätzliche Expression von CD4 (in Gegenwart eines Überschusses von HlV-env in HlV-infizierten Zellen) zu einem schnellen Zelltod und hemmt demzufolge die virale Verbreitung. Dies kann insbesondere anwendbar auf Monocyten und Macrophagen sein, welche als Reservoir für die Virusproduktion dienen, als Resultat ihres relativen Brechungsvermögens zu HlV-induzierter Cytotoxizität (was folgerichtig offensichtlich ist, wegen dem relativen Mangel von CD4 an ihren Zelloberflächen).

(iii) Immune Abwärts-Regulierung

Eine spezifische Abwärts-Regulierung von unzweckmässigen oder unerwünschten Immunantworten, wie bei der chronischen Hepatitis oder bei Transplantaten von heterologen Geweben, wie Knochenmark, kann unter Verwendung der anti-MCH Klasse I-Genen, wie immuno-suppressive, virale Gene einem Engineering unterworfen werden. Die Gruppen C-Adenoviren Ad2 und AdS besitzen ein 19 kd Glycoprotein (gp 19), welches die Region E3 des Virus codiert. Dieses gp 19-Molekül bindet sich an die Klasse I MHC-Moleküle im endoplasmischen Retikulum von Zellen und verhütet die terminale Glykosylierung und Translation des Klasse l-MHC an der Zelloberfläche. Zum Beispiel können vor der Knochentransplantation Donor-Knochenmarkzellen mit gp 19-codierenden Vektorkonstruktionen infiziert werden, welche nach der Expression des gp 19 die Oberflächenexpression des MHC-Klasse I-Trans-plantations-Antigen hemmen. Diese Donor-Zellen können mit niederem Risiko der Pfropf-Zurückweisung transplantiert werden und erfordern eine minimale Immuno-Suppressiv-Diät für den Transplantationspatienten. Dies kann die Existenz eines annehmbaren Chimären Zustandes des Donor-Rezipi-enten mit weniger Komplikationen erlauben. Ähnliche Behandlungen können für die Behandlung eines Bereiches der sogenannten Autoimmunleiden verwendet werden, einschliesslich Lupus-Erythro-miatis, Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis oder chronische Hepatitis B-Infektion.

IV. Die Expression von Markern

Die obenbeschriebene Technik für die Expression eines Palliatives in der Zelle als Reaktion gegen gewisse identifizierende Mittel kann ebenfalls so geändert werden, dass ein Nachweis eines besonderen Genes in einer Zelle ermöglicht wird, welches ein identifizierendes Protein exprimiert (z.B. ein Gen, welches durch einen besonderen Virus getragen wird) und ermöglicht demzufolge den Nachweis von Zellen, die das Virus tragen. Zusätzlich ermöglicht diese Technik den Nachweis von Viren (wie HIV) in einer klinischen Probe von Zellen, welche

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ein identifizierendes Protein zusammen mit dem Virus tragen.

Diese Änderung kann durchgeführt werden, indem ein Genom zur Verfügung gestellt wird, welches ein Produkt codiert, dessen Gegenwart leicht identifiziert werden kann (das «Markerprodukt») und einen Promotor trägt, welcher in der Gegenwart des identifizierenden Proteins in den Indikatorzellen reagiert, indem die Expression des nachzuweisenden Produktes zwischen den exprimierenden und nichtexprimie-renden Zustand umgeschaltet wird. Werden z.B. HIV-zweckmässige Indikatorzellen infiziert, gibt es tat und rev. Die Indikatorzellen können demzufolge mit einem Genom zur Verfügung gestellt werden (wie durch eine Infektion mit einem zweckmässigen, rekombinanten Retrovirus), das ein Markergen codiert, wie das alkalische Phosphatasegen, ß-Ga-lactosidasegen oder das Luciferase-Gen und ein Promotor, wie der HlV-Promotor, welcher die Expression des Markergens steuert. Wenn die Indikatorzellen einer zu testenden klinischen Probe ausgesetzt werden und die Probe HIV enthält, werden die Indikatorzellen mit HIV infiziert, was darin zu einer tat- und/oder rev-Expression (einem identifizierenden Protein) führt. Die HIV-Expression steuert die Indikatorzellen und würde auf tat- und/oder rev-Pro-teine reagieren durch die Umschaltung der Expression der Gene, welche ß-Galactosidase, Luciferase oder alkalische Phosphatase (Markerprodukte) von normal «aus» auf «ein». Im Falle der ß-Galactosidase oder der alkalischen Phosphatase führt die Substrataussetzung an Substrat-Änaloge zu einer Farboder Fluoreszenzänderung, wenn die Probe HIV-po-sitiv ist. Im Falle der Luciferase führt die Luciferin-Aussetzung der Probe zu Lumineszenz, wenn die Probe HIV-positiv ist. Für intracelluläre Enzyme, wie ß-Galactosidase kann der virale Titer gemessen werden, indem direkt die gefärbten Fluoreszenzzellen gezählt werden oder indem Extrakte der Zellen gemacht werden und ein zweckmässiger Test durchgeführt wird. Für ausgeschiedene Enzyme, wie eine manipulierte Form der alkalischen Phosphatase werden kleine Proben des Kulturüberstandes auf Aktivität getestet, was eine zeitlich kontinuierliche Verfolgung einer einzelnen Kultur erlaubt. Demzufolge können verschiedene Formen dieser Markersysteme für verschiedene Zwecke verwendet werden. Diese umfassen die Zählung aktiver Viren oder die Empfindlichkeit und die einfache Messung der viralen Verbreitung in einer Kultur und die Hemmung dieser Verbreitung durch verschiedene Wirkstoffe.

Weiter kann Spezifität in das vorhergehende System eingeführt werden, indem auf die Gegenwart des Virus getestet wird, entweder mit oder ohne neutralisierende Antikörper gegen das Virus. Beispielsweise können in einem Teil der getesteten klinischen Probe neutralisierende Antikörper gegen HIV vorhanden sein; während in einem anderen Teil keine neutralisierenden Antikörper vorhanden wären. Wenn der Test in diesem System negativ ist, wo Antikörper vorhanden sind und positiv, wo keine vorhanden sind, würde dies die Gegenwart von HIV bestätigen.

Innerhalb eines analogen Systems für einen in vitro-Test kann die Gegenwart eines besonderes

Gens, wie ein virales Gen in einer Zellprobe bestimmt werden. In diesem Fall werden die Proben mit einem zweckmässigen, retroviralen Vektor, welcher das Reportergen, das mit der Expressionssteuerung des interessierenden Virus verbunden ist, infiziert. Nach der Zugabe der Probezellen exprimiert das Reportergen sein Schilderungsprodukt (wie ß-Galactosidase oder Luciferase) nur, wenn die Wirtszelle die zweckmässigen viralen Proteine exprimiert.

Diese Tests sind schneller und empfindlicher, da das Reportergen eine grössere Menge Nachweisprodukte exprimieren kann, als Nachweismittel vorhanden ist, was zu einem Verstärkungseffekt führt. Beispiel 6 beschreibt eine repräsentative Technik für den Nachweis eines Gens, das ein identifizierendes Protein exprimiert.

Beispiel 6

HIV-spezifisches Markersystem oder -test A. Konstruktionen

Die Reporter (Nachweis)-Konstruktionen unter der Kontrolle des HIV-Expressionssystems sind in Fig. 12 (rekombinanter, retroviraler Vektor) und in Fig. 13 (einfaches Plasmid, welches bei der Transfektion verwendet wird) dargestellt. Die Stücke dieser bevorzugten Vektor- und Plasmid-Nachweissub-stanzen werden folgendermassen abgeleitet:

das retrovirale Gerüst wurde von der Konstruktion pAFVXM (Krieger et al., Cell 38: 384, 1984) abgeleitet, welche unter Verwendung von Xho I und Cla I linearisiert worden ist. SV2neo wurde aus dem Plasmid pKoneo (Hanahen, unpubliziert) durch Isolierung des 1,8 kb Cla I-Fragmentes erhalten.

Das HIV-LTR wurde als 0,7 kb Hind Ill-Fragment aus dem Plasmid pCISCAT isoliert (Arya et al., Science 229: 69, 1985). Das Beta-gal wurde aus dem Plasmid pSP65 ß-gal erhalten (Cepko, persönliche Mitteilung) als Hind Ill-Sma I-Fragment. Eine ausgeschiedene Form der humanen, placentalen, alkalischen Phosphatase wurde produziert durch die Einführung einer universellen Terminatorsequenz nach der Aminosäure 489 der Zelloberflächenform von alkalischer Phosphatase (wie beschrieben durch Berger et al., Gene 66:1, 1988). Das ausgeschiedene Phosphatasegen wurde als 1,8 kb Hind III zum Kpnl-Fragment isoliert. Die CRS-CAR-Se-quenzen von HlV-env wurden durch Isolierung von 2,1 kb Kpn I gegen das Bam H1-Fragment von HTLVIIIB/BH10R3 (Fisher et al., Science 233: 655, 1986). Dieses Fragment wurde in pUC31, das durch Bam Hl linearisiert worden ist, insertiert und Kpn I pUC31 ist pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gen 33: 103, 1985) mit zusätzlichen Xho I, B-gl II, Bssh II und Neo I-Stellen zwischen den Eco RI und Kpn I-Stellen von pUC19. Die Bam H1 -Stelle der resultierenden Konstruktion wurde in eine Neo I-Stelle umgewandelt, um eine Resektion der CRS-CAR-Sequenzen durch Neo I-Verdauung zu erlauben. Das SV40 t-lntron wurde aus pSVOL (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987) als 0,8 kb Neo I bis Barn H1-Fragment.

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B. Indikatorzellen und retrovirale Vektoren

Humane T-Zellen (H-9, CEM und Sup T1) und Monocyten (U-937)-Zellinien wurden von ATCC erhalten und in einem RPM1 1640-Medium mit 10% fötalem, bovinem Serum und 1% Penicillin/Strep-tomycin aufrechterhalten.

Die nicht-retroviralen Vektoren wurden durch Elektroporation in die Zellinien eingeführt, wobei ein Bio-Rad-Gen-Pulser verwendet wurde. Die Zellinien wurden in G-418 (1 mg/ml) während 2 bis 3 Wochen ausgewählt, wobei stabile G-418R-Zellinien erhalten wurden und dann wurde unter Verdünnung geklont, wobei klonale Zellinien erhalten wurden.

Die pAF-Vektoren wurden in PA317-Packungs-zellinien als Kalziumphosphat-Präzipitat transferiert (Wigler et al., Cell 16: 777, 1979). Die virus-produ-zierenden PA317-Zellen wurden mit humanen Mo-nocyten-Zellinien während 24 Std. in Gegenwart von Polybren kultiviert, wonach die suspendierten Zellen entfernt und in G-418 ausgewählt und wie oben geschildert, subgeklont wurden.

Ç, Tggt

Es wurden stabile Zellinien mit HIV (HTLV IIIb) infiziert und die Zellen (ß-gal) oder Medien (alkalische Phosphatase) wurden täglich während 6 Tagen nach der Infektion getestet.

ß-Galactosidase-Test

Die infizierten Zellen konnten entweder: (i) in situ-histochemisch. wie durch McGregor et al. gefärbt werden (Somatic Cell and Mol. Genetics 13: 253, 1987); oder (ii) durch Verwendung von Zellextrakten in einem enzymatischen Lösungstest mit ONPG als Substrat (Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 5: 281, 1985).

Löslicher, alkalischer Phosphatase-Test

Das Medium wurde von den infizierten Zellen entfernt, während 10 sec mikrozentrifugiert und dann während 10 min auf 68°C erwärmt, um endogene Phosphatasen zu zerstören. Das Medium wurde dann während 2 min mikrozentrifugiert und ein aliquoter Anteil (10 bis 50 (il) wurde zum Test entfernt. 100 nl Puffer (1 M Diethanolamin, pH 9,8; 0,5 Mm MgCl2; 10 mM L-Homoarginin) wurden dann zugegeben und dann wurden 20 jil 120 mM p-Nitro-phenylphosphat (in Puffern) zugegeben. Das A405 der Reaktionsmischung wurde durch einen automatischen Plattenleser angezeigt.

Die Fig. 14 und 15 zeigen typische Resultate eines zeitlichen Ablaufes der Infektion von Sup T1-Zellen unter Verwendung des alkalischen Phospha-tase-Tests in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von antiviralen Wirkstoffen. Das «+» und «-» am Tag 6 zeigt die Gegenwart oder Abwesenheit von Syncytie.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Anzahl von anderen Techniken (unten beschrieben) zur Verfügung, welche mit den obigen retroviralen Vektorsystemen verwendet werden können, so dass ihre

Wirksamkeit erhöht werden kann. Alternativ können diese Techniken mit anderen gen-produzierenden Systemen verwendet werden.

V. Auswahl der Packungszellen

Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der Hauptgründe für niedere rekombinante Virustiter von Packungszellen und auf der Technik zur Korrektur dieser Gründe. Grundsätzlich können mindestens fünf Faktoren als Ursachen für die niederen rekombinanten Virustiter postuliert werden:

1. die beschränkte Zugänglichkeit der viralen Packungsproteine;

2. die beschränkte Zugänglichkeit der retroviralen Vektor-RNA-Genome;

3. die beschränkte Zugänglichkeit der Zellmembrane für die Keimung der rekombinanten Retroviren;

4. die beschränkte intrinsische Packungswirksamkeit des retroviralen Vektorgenoms; und

5. die Dichte des für die Hülle eines vorgegebenen Retrovirus spezifischen Rezeptors.

Wie oben bemerkt, ist die begrenzte Zugänglichkeit des viralen Packungsproteins der vorwiegende einschränkende Faktor bei der rekombinanten Re-trovirus-Produktion von Packungszellen. Wenn die Menge des Packungsproteines in den Packungszellen erhöht wird, wird der Titer auf ungefähr 105 Infektionseinheiten /ml erhöht, wonach zunehmende Packungsproteinmengen keine weitere Wirkung auf die Titer besitzen. Die Titer können jedoch weiter verbessert werden, ebenfalls durch die Erhöhung der Menge des für die Packung zugänglichen retroviralen Vektorgenoms. Demzufolge ist es, wie hier beschrieben, vorteilhaft, Produktionszellen auszuwählen, welche maximale Mengen Packungsproteine und retrovirale Vektorgenome produzieren. Es wurde entdeckt, dass die Verfahren für die Identifikation und demzufolge für die Auswahl von Pak-kungs- und Produktionszellen, wie sie früher unter dem Titel Hintergrund der Erfindung beschrieben worden sind, dazu tendieren, zu einer Auswahl von vielen Produktionszellen zu führen, welche aus den nachstehenden Gründen niedere Titer produzieren.

Die vorliegende Erfindung profitiert von den vorhergehenden nachteiligen Fakten, dass die Protein-Expressionsmenge eines Gens stromabwärts von 5' LTR oder anderen Promotoren und davon durch ein dazwischenliegendes Gen getrennt, im wesentlichen kleiner ist, als wenn die dazwischenliegenden Gene abwesend wären. In der vorliegenden Erfindung befindet sich das auswählbare Gen stromabwärts eines Gens des Packungsgenoms oder des interessierenden Gens, welches durch die Vektorkonstruktion getragen wird, wird jedoch immer unter der Steuerung des viralen 5' LTR oder anderen Promotoren mit einem Spleiss-Donor oder Spleiss-Akzeptor-Stellen transkribiert. Dadurch werden zwei Dinge erreicht. Erstens, da die Packungsgene oder die interessierenden Gene sich nun stromabwärts ohne dazwischenliegendes Gen zwischen ihnen

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und dem Promotor befinden, werden ihre entsprechenden Proteine (Packungsprotein oder Protein von Interesse) in einer höheren Menge (5-20fach) exprimiert, als das auswählbare Protein. Zweitens wird das auswählbare Protein im Durchschnitt in einer kleineren Menge exprimiert, wobei sich die Verteilung der Menge der Expression gegen niedrigere Mengen verschiebt. Im Falle des phleor-Proteins wird dessen Verteilung, wie durch die gebrochene Kurve gemäss Fig. 16 dargestellt, verschoben. Der Auswahlgrad für den Widerstand gegen Phleomycin bleibt der gleiche, so dass nur am oberen Ende ex-primierende Zellen überleben. Die Mengen des Packungsproteins oder der interessierenden Proteine bleibt noch proportional, nur in diesem Fall entspricht eine höhere Menge eines auswählbaren Proteins einer noch höheren Menge Packungsprotein oder Protein von Interesse.

Vorzugsweise wird das vorhergenannte Verfahren durchgeführt, indem ein Plasmid verwendet wird, welches eines der proviralen gag-/pol- oder env-Packungsgene zusammen mit einem ersten auswählbaren Gen trägt. Diese Zellen werden dann auf Zellen, welche die grössten Mengen des Proteins erzeugen, einem Screening unterworfen, indem mit einem Antikörper gegen env (oder möglicherweise gag/pol), einem zweiten fluoreszierenden Antikörper umgesetzt wird und dann auf einem fluo-reszenz-aktivierten Zellsorter (FACS) sortiert wird. Alternativ können andere Tests auf die Proteinmenge verwendet werden. Anschliessend wird das Verfahren und das Auswahlverfahren unter Verwendung dieser ausgewählten Zellen und der anderen der gag/pol- oder env-Packungsgene wiederholt. In diesem Schritt könnte ein zweites auswählbares Gen (verschieden vom ersten) stromabwärts vom Packungsgen erforderlich sein und die Zellen, welche die grösste Menge des zweiten viralen Gens produzieren, ausgewählt werden. Das Verfahren und Screening werden dann unter Verwendung der überlebenden Zellen wiederholt, mit einem Plasmid, welches die provirale Vektorkonstruktion mit dem interessierenden Gen und einem dritten, selektierbaren Gen, das verschieden vom ersten und zweiten selektierbaren Gen ist, trägt. Als Ergebnis dieses Verfahrens werden Zellen, welche hohe Titer des gewünschten rekombinanten Retrovirus produzieren, ausgewählt und diese können dann erforderlichenfalls kultiviert werden zur Bereitstellung des rekombinanten Retrovirus. Zusätzlich können gag und pol unabängig voneinander eingeführt und ausgewählt werden. Beispiel 17 beschreibt die Konstruktion von gag/pol- und env-Plasmiden, welche für diese Verfahren konstruiert worden sind.

Beispiel 7

Plasmide, die zur Erzielung von hohen Mengen Packungsproteinen konstruiert sind (Fig. 17)

1. Das 2,7 kb Xba I-Fragment von pPAM (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5: 431, 1985), welches das amphotrope env-Segment enthält, wurde in pUC18 an der Xba I-Stelle geklont und dann mit Hind III und Sma I entfernt. Dieses Fragment wurde im

Vektor pRSV neo geklont (Gormann et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044, 1982; Southern et al., J. Mol. Appi. Genet. 1: 327, 1982) geschnitten mit Hind III und Pvu II, wobei pRSV-env erhalten wird. Ein 0,7 kb Bam H1 tis BstE Il-Fragment des Plasmids pUT507 (Mulsant et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 14: 243, 1988) mit dem BstE Ii-Ende aufgefüllt, trägt die phleo-widerstands-codierende Sequenz. Das 4,2 kb Bam H1 bis Xho I-Fragment des benachbarten 1,6 kb Xho I bis Xba I (wobei Xba I eingefügt ist) von RSVenv und das phleo-Fragment wurden verbunden, unter Bildung von RSVenv-phleo.

2. Es wurde ein Fragment des Pst I-Stelle beim Nukleotid 563 von MLY (RNA Tumor Viruses, vol. II, 1985, Cold Spring Harbor) bis zur Sca I-Stelle bei 5870 von pMLV-K abgeleitet (Miller et al., 1985, op. cit.) und im Pst I bis Bam H1-Fragment (Bam H1 eingefügt) von p4aA8 geklont (Jolly et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 80: 477, 1983), das den SV40-Promotor, den pBR322 Ampicillin-Widerstand und den Ursprung der Replikation besitzt und an der SV40-Poly A-Stelle geklont. Dies ergibt pSVgp. pSVgpDHFR wurde unter Verwendung folgender Fragmente hergestellt: das 3,6 kb Hind III bis Sai I-Fragment von pSVgp, das den SV40-Promotor plus MLY-gag und einige pol-Sequenzen enthält; das 2,1 kb Sai I bis Sca I-Fragment von pMLV-K mit dem Rest des pol-Gens, das 3,2 kb Xba I (Xba I eingefügt) bis Pst l-Fragment von pF400 mit dem DHFR-Gen plus Poly A-Stelle, pBR322 Ursprung und die Hälfte des Ampicillin-Widerstandsgens; das 0,7 kb Pst I bis Hind Ill-Fragment von pBR322 mit der anderen Hälfte des Ampicillin-Widerstandsgens. Dies ergibt pSVgp-DHFR. Alle diese Konstruktionen sind in Fig. 17 dargestellt. Diese Plasmide können in 3T3-Zellen oder anderen Zellen transferiert werden und es können höhere Mengen von gag, pol oder env erhalten werden.

Ein zusätzliches Verfahren für die Durchführung einer Auswahl ist die Verwendung einer Genselektion in einer Runde und der Antisinn in einer nachfolgenden Runde. Beispielsweise kann gag/pol in eine APRT-defekte Zelle mit dem HPRT-Gen eingeführt werden und auf die Gegenwart dieses Gens selek-tioniert werden, wobei das Medium verwendet wird, welches HPRT für die Rettung der Purine erfordert. In der nächsten Runde könnte der Antisinn zu HPRT stromabwärts von env hingebracht werden und die Zelle in 6-Thioguanin auf den HPRT-defek-ten Phenotyp ausgewählt werden. Grössere Mengen Antiserum HPRT wären erforderlich, um die HPRT-Gentranskription zu inaktivieren, unter der Voraussetzung, dass keine Umkehrung vorkommt.

Hüllsubstitutionen

Die Fähigkeit gag/pol- und env-Funktionen separat zu exprimieren, erlaubt die unabhängige Manipulation dieser Funktionen. Eine Zellinie, die grosse Mengen von gag/pol exprimiert, kann beispielsweise verwendet werden, um Fragen des Titers bezüglich des env zu stellen. Ein Faktor, welcher von niederen Titern stammt, ist die Dichte des zweckmässigen Rezepetormoleküls auf der Zielzelle oder -ge-

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webe. Vorausgesetzt, dass die env-Expression aus einer separaten Einheit kommt, kann eine Vielzahl von Hüllgenen (welche verschiedene Rezeptorproteine erfordern), wie phenotrope, polytrope oder ambotrope env von einer Varietät von Quellen auf die höchsten Titer auf spezifischen Zielgeweben getestet werden. Weiter können Hüllen von nichtmurinen Retrovirusquellen für die Pseudotypisierung eines Vektors verwendet werden. Zusätzlich können Hybridhüllen (wie oben beschrieben) in diesem System ebenso verwendet werden, um den Tropismus (und wirksam den Titer erhöhen) des retroviralen Vektors zuzuschneiden. Umgekehrt kann eine Zellinie, welche grosse Mengen eines gegebenen Hüllgens exprimieren, verwendet werden, um Fragen des Titers bezüglich gag und pol zu stellen.

VI. Alternative virale Vektorpackunastechniken

Zwei zusätzliche alternative Systeme können zur Herstellung von rekombinanten Retroviren verwendet werden, welche die Vektorkonstruktion tragen. Jedes dieser Systeme besitzt den Vorteil der Tatsache, dass ein Insektenvirus, Baculovirus und die Säugetierviren der Vaccinia- und Adenovirus kürzlich angepasst worden sind, um grosse Mengen jedes vorgebenen Proteins, für welches das Gen geklont worden ist, zu produzieren. Siehe beispielsweise Smith et al. (Mol. Cell. Biol. 3: 12, 1983); Piccini et al. (Meth. Enzymology, 153: 545, 1987); und Mansour et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 82: 1359, 1985).

Diese viralen Vektoren können zur Produktion von Proteinen in Gewebekulturen verwendet werden, indem zweckmässige Gene in den viralen Vektor insertiert werden und könnten demzufolge angepasst werden, um retrovirale Vektorpartikel herzustellen.

Die Adenovirus-Vektoren sind von nuklear-repli-zierten Viren abgeleitet und können defekt sein. Gene können in Vektoren insertiert werden und zur Expression von Proteinen in Säugetierzellen, entweder durch eine in vitro-Konstruktion (Bailay et al., EMBO J. 4: 3861, 1985) oder durch Rekombination in Zellen (Thummel et al., J. Mol. Appi. Genetics 1: 435, 1982) verwendet werden.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht in der Konstruktion von Plasmiden unter Verwendung des grösseren, späten Promotors (MLP) des Adenovirus, treibend: (1) gag/pol, (2) env, (3) modifizierte, virale Vektorkonstruktion. Eine modifizierte, virale Vektorkonstruktion ist möglich, da die U3-Region von 5-LTR, enthaltend den viralen Vektorpromotor durch andere Promotorsequenzen ersetzt werden kann (siehe z.B. Hartman, Nucl. Acids. Res. 16: 9345, 1988). Dieser Teil wird nach einer Runde mit Umkehr-Transkriptase durch U3 von 3' LTR ersetzt.

Diese Plasmide können dann verwendet werden, um Adenovirusgenome in vitro herzustellen (Bailay et al., op. cit.) und diese in 293 Zellen (humane Zellinien, welche das Adeno-E1A-Protein herstellen) transferiert werden, wofür die adenoviralen Vektoren defekt sind, wobei ein reiner Vorrat von gag, pol, env erhalten wird und der retrovirale Vektor separat in defekten Adenovirusvektoren getragen wird.

Da die Titer von solchen Vektoren typischerweise 107 bis 1011/ml betragen, können diese Vorräte simultan für die Infektion von Gewebekulturzellen von hoher Multiplizität verwendet werden. Die Zellen werden dann zur Produktion retroviraler Proteine und retroviraler Vektorgenome in hohen Mengen programmiert. Da die Adenovirusvektoren defekt sind, kommen keine grossen Anteile von direkter Zellyse vor und die retroviralen Vektoren können aus den Zellüberständen geerntet werden.

In einem alternativen System (das eher extracellulär ist), werden folgende Komponenten verwendet:

1. gag/pol- und env-Proteine im Baculovirussy-stem in ähnlicher Weise, wie in Smith et al. (supra) hergestellt (oder in anderen Protein-Herstellungssy-stemen, wie in Hefe oder E. coli):

2. Virale Vektor RNA, hergestellt im bekannten T7 oder SP6 oder in anderen in vitro RNA-bilden-den Systemen (siehe z.B. Flamant und Sorge, J. Viral. 62; 1827, 1988);

3. tRNA, hergestellt als (2) oder gereinigt aus Hefe oder Säugetiergewebekulturzellen;

4. Liposome (mit eingebettetem env-Protein); und

5. Zellextrakt oder gereinigte erforderliche Komponenten (wenn identifiziert) (typischerweise von Mäusezellen), um das env-Verfahren und irgendwelche andere nötigen, zellabgeleiteten Funktionen sicherzustellen.

Innerhalb dieser Verfahren werden (1), (2) und (3) gemischt und dann env-Protein, der Zellextrakt und die Präliposomenmischung (Lipid in einem zweckmässigen Lösungsmittel) zugegeben. Es kann jedoch erforderlich sein, dass vorher das env-Protein in die Liposomen eingebettet wird, bevor das resultierende liposomen-eingebettete env zu der Mischung von (1), (2) und (3) zugegeben wird. Die Mischung wird behandelt (z.B. durch Beschallung, Temperaturmanipulation oder Rotationsdyalyse), um eine Einkapselung des naszierenden, viralen Partikel mit Lipid plus eingebettetem env-Protein zu erlauben, in ähnlicher Weise wie diejenige für die Li-posom-Einkapselung von Pharmazeutika, wie beschrieben in Gould-Fogerite et al. Anal. Biochem. 148: 15, 1985). Dieses Verfahren erlaubt die Produktion von hohen Titern von replikations-inkompe-tenten, rekombinanten Retroviren ohne Contamination mit pathogenen Retroviren oder replikations-kompetenten Retroviren.

VII. Zellinien-spezifische Retroviren - «Hvbridhülle»

Die Wirts-Zell-Bereichsspezifität eines Retrovirus wird teilweise durch die env-Genprodukte bestimmt. Beispielsweise bemerken Coffin, J. (RNA Tumor Vi-ruses 2: 25-27, Cold Spring Harbor, 1985), dass die extracellulare Komponente der Proteine des Mäuse-Leukämie-Virus (MLV) und Rous Sarcom-Vi-rus (RSV) verantwortlich für die spezifische Rezeptorbindung sind. Es wird angenommen, dass der cytoplasmische Bereich von Hüllproteinen andererseits eine Rolle in der Virionformation spielt. Während die Pseudotypsierung (d.h. die Einkapselung der viralen RNA eines Spezies durch virale Protei-

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ne eines anderen Spezies) weniger häufig vorkommt, hat das Hüllprotein etwas Spezifität für die Virionbildung eines vorgegebenen Retrovirs. Die vorliegende Erfindung anerkennt, dass durch die Bildung eines Hybrid-env-Genproduktes (d.h. spezifisch an env-Protein mit cytoplasmischen Regionen und exogenen Bindungsregionen, die in der Natur nicht im gleichen Proteinmolekül vorkommen) die Wirts-Bereichs-Spezifität unabhängig von der cytoplasmischen Funktion geändert werden kann. Demzufolge können rekombinante Retroviren produziert werden, welche spezifisch an vorgewählte Zielzellen gebunden werden.

Um ein Hybridprotein zu machen, worin die Rezeptor-Bindungskomponente und die cytoplasmi-sche Komponente von verschiedenen Retroviren sind, ist ein bevorzugter Ort für die Rekombination in der membran-umspannenden Region der cytoplasmischen Komponente. Beispiel 8 beschreibt die Konstruktion eines Hybrid-env-Gens, welches ein Protein mit dem CD4-Bindungsteil des HIV-Hüllpro-teins gekuppelt an den cytoplasmischen Bereich des MLV-Hüllproteins exprimiert.

Beispiel 8

Hybrid HIV-MLV-Hülle

Es wird ein Hybrid-Hüllgen unter Verwendung der in vitro-Mutaaenese hergestellt (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 82: 488-492, 1985), um eine neue Restriktionsstelle an zweckmässiger Stelle der Verbindung einzuführen. Alternativ können sie, wenn die zwei Hüllsequenzen nicht im gleichen Plasmid vorliegen, direkt an irgendeinem Punkt unter Verwendung der in vitro-Mutaaenese verbunden werden. Das Endresultat ist in jedem Fall ein Hybridgen, das das 5'-Ende des HIV-gp160 und das 3'-Ende des MLB pl5E enthält. Das durch das resultierende rekombinante Gen exprimierte hybride Protein ist in Fig. 18 erläutert und enthält das HIV-gp 120 (CD4-Rezeptorbindungsprotein) den extracellu-lären Teil von HIV gp 41 (die gp 120-Bindungs- und Fusiogenen-Regionen) und den cytoplasmischen Teil von MLV p15E mit der Verbindung, welche an jedem der verschiedenen Punkte innerhalb der Wirtsmembrane stattfindet. Ein Hybridgen, gemacht durch Fusion an einer neuen Eco R1-Stelle, dargestellt in Fig. 18, ist unter der Steuerung des CMVIE-Gens in humanen Sup T1-Zellen exprimiert und führt zu Syncytie, wie es ebenfalls der Fall ist bei authentischen HIV-env-Genen. Demzufolge wird das Hybrid korrekt zur Zelloberfläche transportiert und dort angezeigt.

Während Beispiel 8 ein Hybridprotein erläutert, das von zwei verschiedenen Retroviren produziert wird, sind die Möglichkeiten nicht auf Retroviren oder einfach auf andere Viren eingeschränkt. Zum Beispiel kann der Beta-Rezeptorteil des humanen lnterleukin-2 mit dem Hüllprotein von MLV kombiniert werden. In diesem Fall könnte eine Rekombination, vorzugsweise im gp 70-TeiI des MLV-env-Gens, lokalisiert werden, was ein intaktes p15E-Protein zurücklassen würde. Im weiteren kann die vorgenannte Technik verwendet werden, um ein rekombinantes Retrovirus mit einem Hüllprotein herzustellen, welches die Antikörper-Fc-Segmente erkennt. Die monoklonalen Antikörper, welche nur ausgewählte Zielzellen erkennen, können nur dann an einen solchen rekombinanten Retrovirus gebunden werden, der solche Hüllproteine zeigt, so dass das Retrovirus nur diejenigen ausgewählten Zielzellen binden und infizieren würde.

VIII. Stellenspezifische Integration

Die Zielrichtung eines retroviralen Vektors auf einen vorbestimmten Ort am Chromosom verbessert den Nutzen von Gen-Auslieferungssystemen. Ein Mass der Sicherheit wird durch direkte Integration eines «sicheren» Flecks auf dem Chromosom gewonnen, d.h. auf einem von welchem erwiesen ist, dass er keine schädlichen Effekte aus der Insertion eines Vektors aufweist. Ein anderer potentieller Vorteil ist die Fähigkeit, dass ein Gen direkt auf eine «offene» Region eines Chromosoms gerichtet werden kann, wobei seine Expression maximal gehalten würde. Zwei Techniken für die Integrierung von Retroviren an spezifischen Stellen sind nachstehend beschrieben.

(i) Homologe Rekombination

Eine Technik für die Integrierung von exogenen Genen einer Vektorkonstruktion eines rekombinanten Retrovirus an einer spezifischen Stelle ist die DNA einer Zielzelle verwendet die homologe Rekombination. Plasmide, die DNA-Sequenzen enthalten, welche grösser als ungefähr 300 bp sind, die homolog zu genomischen Sequenzen sind, treten, wie gezeigt wurde, in Wechselwirkung (entweder durch Ersatz oder Insertion) mit den genomischen Sequenzen in einem Grad der grösser ist als 103-fach über eine spezifische Wechselwirkung in Abwesenheit einer solchen Homologie (siehe Thomas und Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987; und Doet-scheman et al., Nature 330: 576-78, 1987). Es ist gezeigt worden, dass ein Insertionsereignis oder alternativ ein Ersatzereignis durch spezifisches Konstruieren des Vektors hervorgerufen werden kann.

Um eine homologe Rekombination in einer stellenspezifischen, retroviralen Integration zu verwenden, sollte eine Vektorkonstruktion in solcher Weise modifiziert werden, dass (a) homologe Sequenzen (zum Genom der Zielzelle) in die Konstruktion an zweckmässiger Stelle einverleibt werden; und (b) der normale Integrationsmechanismus nicht mit der auf homologen Sequenzen beruhenden Zielrichtung in Wechselwirkung tritt. Ein bevorzugter Zugang besteht in dieser Hinsicht darin, homologe Sequenzen (grösser als etwa 300 bp) in 3' LTR, stromabwärts von der U3-invertierten Répétition, zugegeben werden. In diesem Zugang wird die Konstruktion ursprünglich mit einer Region von homologen gemacht, die in 3' LTR an der Nhe 1-Stelle in U3 insertiert werden. Die Umkehrtranskription in der Wirtszelle führt zu einer Verdoppelung der homologen Region in 5' LTR innerhalb 31 bp des Endes der invertieren Wiederholung (IR). Die Integration in das Wirtsgenom kommt in Gegenwart oder Abwe-

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senheit von normalen Integrationsmechanismen vor. Das Gen im Vektor kann entweder aus dem LTR oder aus einem internen Promotor exprimiert werden. Dieser Zugang hat die Wirkung einer Plazierung einer homologen Region in der Nähe eines potentiellen, freien Endes eines doppelsträngigen Retrovirus-Vektorgenoms. Von den freien Enden ist bekannt, dass sie die Häufigkeit der homologen Rekombination durch einen Faktor von ungefähr 10 erhöhen. In diesem Zugang kann es erforderlich sein, dass der normale Integrationsmechanismus verteidigt wird oder mindestens so geändert wird, dass er das Verfahren verlangsamt, damit genügend Zeit zur Aufreihung der homologen DNA bleibt. Ob diese letztere Modifikation in einem besonderen Fall erforderlich ist, kann vom Fachmann leicht festgestellt werden.

(ii) Integrase-Modifikation

Eine weitere Technik für die Integrierung einer Vektorkonstruktion an einer spezifischen vorgewählten Stelle eines Genoms einer Zielzelle involviert die Integrase-Modifikation.

Das Retrovirus-pol-Genprodukt wird im allgemeinen in vier Teilen behandelt: (i) eine Protease, die mit den viralen gag- und pol-Produkten reagiert; (ii) die Umkehr-Transkriptase und (iii) RNase H, welche die RNA eines RNA/DNA-Duplexes abbaut; und (iv) die Endonuklease oder «Integrase».

Die allgemeine Integrase-Struktur wurde durch Johnson et al. analysiert (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83: 7648-7652, 1986). Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Proteinen einen Zinkbindungsfinger besitzt, mit welchem es mit der Wirts-DNA vor der Integration der retroviralen Sequenzen in Wechselwirkung tritt.

In anderen Proteinen erlauben solche «Finger» dem Protein die Bindung an DNA bei bestimmten Sequenzen. Ein erläuterndes Beispiel sind die Ste-roidrezeptoren. In diesem Fall kann man den Östrogenrezeptor, der auf Östrogene reagiert eine Wirkung auf einen Glucocorticoid-Rezeptor hat, auf Glucocorticoide reagiert, herstellen, indem einfach der Glucocorticoid-Rezeptor-«Finger» (d.h. das DNA-Bindungssegment) anstelle des Östrogen-Re-zeptor-Fingersegmentes im Östrogen-Rezeptor-Gen ersetzt. In diesem Beispiel ist die Stellung der Genome, auf welche die Proteine gerichtet sind, geändert worden. Solche richtende Sequenzen können ebenfalls im Integrasesgen anstelle der vorhandenen Zink-Finger substituiert werden. Beispielsweise kann das Segment, das die DNA-bindende Region des humanen Östrogen-Rezeptor-Gens codiert, anstelle der DNA-Bindungsregion in der Integrase in einem Packungsgenom substituiert werden. Ursprünglich wurde die spezifische Integration mittels eines in vitro-lntearationssvstem getestet (Brown et al., Cell 29: 347-356, 1987). Zur Bestätigung, dass die Spezifität in vivo gesehen wird, wird dieses Packungsgenom zur Infizierung von Vektorpartikeln verwendet und die Infektion der und Integration in östrogen-empfindliche und östrogen-nichtempfindli-che Zellen in der Kultur verglichen.

Durch die Verwendung dieser Technik können die eindringenden, viralen Vektoren auf die Integration an vorgewählten Stellen des Zielzellgenoms gerichtet werden, diktiert durch die Genom-Bindungseigenschaften von stellenspezifischen DNA-Bindungsproteinsegmenten, welche auf dem Inte-grasegenom gespleisst sind. Die Fachleute werden erkennen, dass die Integrationsstelle in der Tat für die Finger der modifizierten Integrase empfänglich sein muss. Beispielsweise sind die meisten Zellen empfindlich auf Glucocorticoide und demzufolge hat ihr Chromatin Zentren für Glucocorticoid-Rezepto-ren. Demzufolge wäre für die meisten Zellen eine modifizierte Integrase mit einem Glucocorticoid-Re-zeptor-Finger zweckmässig, um die provirale Vektorkonstruktion an diesen Glucocorticoid-Rezeptor-Bindungszentren zu integrieren.

IX. Produktion rekombinanten retroviralen Vektoren in transgenen Tieren

Zwei vorher beschriebene Probleme mit der Helferlinienbildung für retroviralen Vektoren sind: (a) die Schwierigkeit für die Bildung von grossen Mengen von Vektoren und (b) der laufende Bedarf zur permanenten Verwendung anstelle von primären Zellen zur Herstellung von Vektoren. Diese Probleme können überwunden werden durch Produktionsoder Packungslinie, welche in transgenen Tieren gebildet werden. Diese Tiere sollten die Packungsgenome und die retroviralen Vektorgenome tragen. Die gegenwärtige Technologie erlaubt die Bildung von Packungszellinien und die gewünschten vektorerzeugenden Linien in primären Zellen nicht, wegen ihrer begrenzten Lebensspanne. Die gegenwärtige Technologie ist so, dass eine umfassende Charakterisierung erforderlich ist, welche wegen Alterung die Verwendung von primären Zellen eliminiert. Individuelle Linien von transgenen Tieren können durch die hier zugänglich gemachten Verfahren gebildet werden, wobei die Packungsfunktionen, wie gag, pol oder env produziert werden. Diese Linien von Tieren werden dann für die Expression, entweder des gesamten Tiers oder zielgerichteten Geweben charakterisiert, durch die selektive Verwendung von haushalt- oder gewebespezifischen Promotoren, um die Packungsfunktionen zu transkribieren. Der gelieferte Vektor wird auch in eine Linie von transgenischen Tieren mit gewebespezifischen oder Haushaltpromotor insertiert. Wie oben diskutiert, kann der Vektor aus einem solchen Promotor, welcher die U3-Region von 5' LTR (Fig. 19) ersetzt, weggetrieben werden. Dieses Transgen könnte in seiner Expression induzierbar oder ubiquitär sein. Dieser Vektor ist jedoch nicht gepackt. Diese Tierlinien werden dann am gag/pol/env-Tier gereift und die nachfolgenden Nachkommen produzieren den gepackten Vektor. Diese Nachkommen, welche im wesentlichen identisch sind, werden charakterisiert und bieten eine unbeschränkte Quelle von primären produzierenden Zellen an. Alternativ können primäre Zellen, welche gag/pol und env machen und von transgenen Tieren abgeleitet sind, in grossen Mengen mit Retrovirus-Vektoren infiziert oder transfek-tiert werden, um primäre zellproduzierende Linien herzustellen. Viele verschiedene transgene Tiere

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oder Insekten könnten diese Vektoren produzieren, wie Mäuse, Ratten, Hühner, Schweine, Kaninchen, Kühe, Schafe, Fische und Fliegen. Der Vektor und die Packungsgenome würden für spezifische Infekti-onsspezifitäten und gewebespezifische Expression durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren und verschiedenen Hüllproteinen zugeschneidert. Eine Probe von solchen Verfahren ist in Fig. 20 angegeben.

Obschon die folgenden Beispiele der transgenen Produktion von primären Packungslinien nur für Mäuse beschrieben wird, können diese durch Fachleute auf andere Arten ausgedehnt werden. Wenn den MLV-Sequenzen in Mäusegenomen Homologie verliehen wird, wären die finalen bevorzugten Tiere nicht Mäuse.

Beispiel 9

Herstellung von gag-pol-Proteinen unter Verwendung von Haushalt-Promotoren für die ubiquitäre Expression in transgenen Tieren

Eine Probe eines gut-charakterisierten Haushalt-Promotors ist der HPRT-Promotor. HPRT ist ein Purin-Rettungsenzym, welches in allen Geweben exprimiert (vgl. Patel et al., Mol. Cell Biol. 6: 4-403, 1986 und Melton et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 81: 2147-2151, 1984). Dieser Promotor könnte vor verschiedene gag/pol-Fragmente insertiert werden (z.B. Bal l/Sca I; Aat ll/Sca I; Pst l/Sca I von MoMLV; siehe RNA Tumor Viruses 2, 1985, Cold Spring Harbor Laboratory 1985), welche in Blu-escript-Plasmiden (Strategene, Inc.) unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken geklont wurden (siehe Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). Die resultierenden Plasmide werden gereinigt (Maniatis et al. op. cit.) und die relevante genetische Information wurde unter Verwendung von Geneclean (Bio 101) oder Elektroelution (siehe Hogan et al. (Eds.) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1986) geklont.

Diese vollständig charakterisierten DNA könnten dem Pronukleus von befruchteten Mäuseova mit einer Konzentration von 2 ng/ml mikroinjiziert werden. Lebend geborene Mäuse wurden unter Verwendung einer Tail-Blot-Analyse einem Screening unterworfen (siehe Hogang et al., op. cit.). Transgen-positive Tiere würden auf die Expressionsniveaus von gag-pol-Proteinen durch Immunopräzipitation von radiomarkierten, primären Zellen, wie Fibroblasten charakterisiert (siehe Harlow et al., Eds. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1988). Die Tiere könnten dann auf Homozygosität für die Herstellung von Tierlinien, welche charakterisierende Mengen von gag-pol produzieren, gezüchtet werden.

Beispiel 10

Herstellung von env-Proteinen/Hybrid-Hüllproteinen unter Verwendung von Haushalt-Promotoren für die ubiquitäre Expression in transgenen Tieren

Dieses Beisiel verwendet den HPRT-Promotor für die Expression von Hüll- oder Hybrid-Hüllproteinen. Die Hüllproteine könnten von jedem Virus sein, der zum komplementieren des relevanten gag-pol fähig ist, in diesem Fall diejenige von MLV. Beispiele sind ecotropes MLV, amphotropes MLV, xenotropes MLV, polytropes MLV oder hybride Hüllen. Wie oben, könnte das Hüllgen hinter dem HPRT-Promotor unter Verwendung von rekombinanten vo DNA-Techniken geklont werden (siehe Maniatis et al., op. cit.). Das resultierende «Minigen» wurde dann isoliert (siehe Hogan et al., op. cit.) und dann würde die Expression des Hüllproteins bestimmt (Harlow et al., op. cit.). Die transgenen Hülltiere würden dann auf Homozygotie gezüchtet, um ein gut charakterisiertes Hülltier zu schaffen.

Beispiel 11

Herstellung von gag-poI-env-Tieren unter Verwendung von Haushalt-Promotoren für die ubiquitäre Expression in transgenen Tieren

Dies erfordert die gut-charakterisierten gag-pol-Tiere, ebenso wie die Tiere für die Bereitstellung einer permanenten gag-pol/Hülltierlinie. Diese umfasst die Züchtung auf Homozygotie und die Bereitstellung einer gut charakterisierten Linie. Diese Linien würden dann verwendet, um primäre Mäuse-Embryo-Linien bereitzustellen, welche für Pak-kungssektoren in Gewebekulturen verwendet werden können. Weiter könnten in diese Linien Tiere eingezüchtet werden, welche den retroviralen Vektor enthalten.

' Beispiel 12

Produktion der gewebespezifischen Expression von gag-pol-env oder Hybridhüllen in transgenen Tieren

Das hier gegebene Beispiel dient zur Ausrichtung der Gewebeexpression von gag-pol, Hülle oder hybride Hülle auf spezifische Gewebe, wie T-Zellen. Dies schliesst die Verwendung von CD2-Sequenzen ein (siehe Lang et al., EMBO J. 7: 1675-1682, 1988), was die Position angibt und die Abhängigkeit der Nummer der Kopie. Das 1,5 kb Bam H1/Hind Ill-Fragment aus dem CD2-Gen wäre vor der gagpol, der Hülle oder der hybriden Hüllfragmente unter Verwendung der DNA-Techniken zu insertieren. Diese Gene können in ein befruchtetes Mäuseei durch Mikroinjektion einverleibt werden. Die transgenen Tiere wären zu charakterisieren wie vorher. Es wäre dann die Expression in den T-Zellen zu bewerkstelligen. Die Tiere wären zu Homozygotie zu züchten, um gut charakterisierte Linien des transgenen Tieres bereitszustellen. Die gag-pol-Tie-re würden dann zu Hülltieren ausgereift, um gag-pol-env-Tiere, welche nur in T-Zellen exprimieren, bereitzustellen. Die T-Zellen dieser Tiere wären dann eine Quelle für T-Zellen, welche fähig wären, retroviralen Vektoren zu packen. Wiederum könnten die Vektortiere in diese gag-pol-env-Tiere eingezüchtet werden, um zu bewerkstelligen, dass die T-Zellen den Vektor exprimieren.

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Diese Technik erlaubt die Verwendung von anderen gewebespezifischen Promotoren, wie der milchspezifische (Molke), der pankreatische (Insulin oder Elastase), der neuronale (myelin-basisches Protein) Promotor. Durch die Verwendung von Promotoren, wie der milch-spezifische Promotor können rekombinante Retroviren direkt aus biologischen Flüssigkeiten der Nachkommen isoliert werden.

Beispiel 13

Herstellung von haushalt- oder gewebespezifischen, retroviralen Vektoren in transgenen Tieren

Die Insertion von Retroviren oder retroviralen Vektoren in Keimlinien von transgenen Tieren führt zu wenig oder keiner Expression. Dieser durch Jae-nisch beschriebene Effekt (siehe Jahner et al., Nature 298: 623-628, 1982) wird der Methylierung von 5'-LTR-Sequenzen zugeschrieben. Diese Technik überwindet den Methylierungseffekt durch Substituierung eines haushalt- oder gewebespezifischen Promotors, um den retroviralen Vektor/Retrovirus zu exprimieren. Die U3-Region von 5' LTR, welche Verbesserungselemente enthält, wird durch regulatorische Sequenzen des haushalt- oder gewebespezifischen Promotors ersetzt (siehe Fig. 20). 3' LTR wird vollständig zurückgehalten, da es Sequenzen enthält, die für die Polyadenylierung der viralen RNA und die Integration erforderlich sind. Als Resultat der einmaligen Eigenschaften der retroviralen Replikation wird die U3-Region des 5' LTR des integrierten Provirus durch die U3-Region des 3' LTR des infizierten Virus gebildet. Demzufolge ist 3' nötig, während 5' U3 entbehrlich ist. Die Substitution der 5' LTR U3-Sequenzen mit Promotoren und die Insertion in die Keimlinie eines transgenischen Tiers führt zu Tierlinien, welche fähig sind, retrovirale Vektortranskriptionen zu produzieren. Diese Tiere werden dann zu gag-pol-env-Tieren gezüchtet, um retroviral produzierende Tiere zu bilden (siehe Fig. 20).

Aus dem vorhergehenden kann wahrgenommen werden, dass obschon spezifische Ausführungsformen der Erfindung hier zum Zwecke der Erläuterung beschrieben wurden, zahlreiche Änderungen gemacht werden können, ohne dass vom Geist und vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Demzufolge ist die Erfindung nicht eingeschränkt, ausgenommen durch die beiliegenden Ansprüche.

Claims

Patentansprüche

1. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, welche die Expression auf ein Antigen in mit dem Retrovirus infizierten Zielzellen richtet, wobei das genannte Antigen fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier zu stimulieren.

2. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen eine modifizierte Form eines pathogenen Antigens ist, das fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier zu stimulieren, jedoch bezüglich des pathogenen Antigens eine reduzierte Pathogenität besitzt.

3. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das expri-mierte Antigen eine zellvermittelte Immunantwort hervorruft.

4. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das expri-mierte Antigen eine auf eine H LA Klasse I- und/ oder Klasse ll-beschränkte Immunantwort hervorruft.

5. Rekombinantes Retrovirus gemäss den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das exprimierte Antigen ein HIV-Protein ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gp 160, gp 120 und gp 41.

6. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, die die Expression auf einen spezifischen T-Zellrezep-tor oder auf ein Immunoglobulin richtet, welches das Antigen von Interesse erkennt.

7. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, die auf ein Palliativum in mit dem Retrovirus infizierten Zellen gerichtet ist, wobei das genannte Palliativum fähig ist, eine Funktion eines pathogenen Agens, das für die Pathogenität erforderlich ist, zu hemmen.

8. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das pathogene Agens ein Virus ist und die gehemmte Funktion eine Absorption, Replikation, Genexpression, Zusammenfügung oder ein Austritt des Virus von infizierten Zellen ist.

9. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das pathogene Agens eine Krebszelle oder ein krebsfördernder Wachstumsfaktor ist und die gehemmte Funktion eine Zellreplikation, Empfindlichkeit auf äussere Signale oder ein Mangel der Produktion von Anti-On-cogenen ist.

10. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion auf die Expression eines toxischen Palliativum in infizierten Zielzellen gerichtet ist, als Reaktion auf die Gegenwart derjenigen Zellen, welche in einem Zusammenhang mit dem pathogenen Agens stehen.

11. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Palliativum fähig ist, die Expression oder die Wirkungen eines pathogenen Gens selektiv zu hemmen.

12. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Palliativum ein hemmendes Peptid enthält, welches auf virale Protease spezifisch ist.

13. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Palliativum eine Gegensinn-RNA enthält, welche komplementär zu RNA-Sequenzen ist, die für die Pathogenität erforderlich sind.

14. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Palliativum die Rekombination oder Integration in ein pathogenes Genom fördert, so dass seine Funktion unterbrochen wird.

15. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch

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7, dadurch gekennzeichnet, dass das Palliativum ein defektes Strukturprotein eines pathogenen Agens enthält, wobei das genannte Protein fähig ist, die Zusammenfügung des pathogenen Agens zu hemmen.

16. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion auf die Expression des HSVTK-Genpro-duktes oder auf andere Genprodukte, die fähig sind, einen anderweitig inaktiven Vorläufer in einen aktiven Inhibitor des pathogenen Agens umzuwandeln, gerichtet ist.

17. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion auf die Expression eines Tumorsuppres-sorgens gerichtet ist.

18. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion auf die Expression eines Proteins gerichtet ist, welches eine Substanz mit wenig oder ohne Cytotoxizität in Gegenwart eines pathogenen Agens in ein aktives toxisches Produkt umwandelt, wobei eine lokalisierte Therapie gegen das pathogene Mittel bewirkt wird.

19. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Her-pes-Thymidin-Kinase ist.

20. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein CD4 ist.

21. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion auf die Expression eines Proteins gerichtet ist, das toxisch ist bei der Behandlung oder Änderung durch ein von einem pathogenen Agens abgeleiteten Protein.

22. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstruktion ein Anzeigeprodukt auf der Oberfläche der durch den Retrovirus infizierten Zielzellen, welche das pathogene Mittel enthalten, exprimiert.

23. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, die auf die Expression eines Gens gerichtet ist, das fähig ist, das Immunsystem in den Zielzellen, die mit dem genannten Retrovirus infiziert sind, zu unterdrücken.

24. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, die auf die Expression eines blockierenden Elementes in mit dem Retrovirus infizierten Zellen gerichtet ist, wobei das genannte blockierende Element fähig ist, entweder einen Rezeptor oder einen Wirkstoff zu binden, in solcher Weise, dass die Rezeptor/Wirkstoff-Wechselwirkung blockiert wird.

25. Rekombinantes Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vektorkonstruktion trägt, die auf die Expression eines blockierenden Elementes in mit dem genannten Retrovirus infizierenden Zeilen gerichtet ist, wobei das genannte blockierende Element fähig ist, an einen Rezeptor oder ein Hüllprotein gebunden zu werden, in solcher Weise, dass die Rezeptor/Hüllprotein-Wechselwirkung blok-kiert wird.

26. Rekombinantes Retrovirus gemäss Anspruch

24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass das blockierende Element aus den infizierten Zellen ausgeschieden wird.

27. Rekombinantes Retrovirus gemäss einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus einen Replikationsdefekt aufweist.

28. Rekombinantes Retrovirus, das zweckmässig für die Infizierung von Zellen und einen Test auf die Gegenwart eines besonderen, darin enthaltenen Gens ist, welches ein identifizierendes Protein produziert, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Retrovirus ein Genom besitzt, welches:

(1) ein Markergen, das ein Markerprodukt in den Zellen exprimieren kann; und

(2) Steuersequenzen, welche auf die Gegenwart des identifizierenden Proteins in den Zellen reagieren, indem sie die Expression des markergens zwischen dem exprimierenden und nicht-expri-mierenden Zustand umschalten; codiert.

29. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Retrovirus gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass eine entsprechende Vektorkonstruktion in ein Capsid eingeführt wird und es auf solche Weise eingehüllt wird, dass ein replikations-defektes, rekombinantes Retrovirus hergestellt wird.

30. Verfahren zum Testen der Gegenwart eines besonderen Gens in einer Zellprobe, welches Gen fähig ist, ein identifizierendes Protein zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst:

Infizieren der Zellen innerhalb der Probe mit einem rekombinanten Retrovirus nach Anspruch 28 und Testen auf die Gegenwart des Markerproduktes.

31. Verfahren gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontrollsequenzen die Ex-

. pression des Markerproduktes umschalten, indem das Markergen zwischen dem transkribierenden und nicht-transkribierenden Zustand umgeschaltet wird.

32. Ex vivo-Zellen. infiziert mit einem rekombinanten Retrovirus gemäss einem der Ansprüche 1 bis 27.

33. Eukaryontische Zellen, infiziert mit einem rekombinanten Retrovirus gemäss einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen fähig sind, infektiöse Partikel zu bilden, welche eine der genannten Vektorkonstruktionen enthalten.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Retrovirus gemäss einem der Ansprüche 1 bis 27 in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.

35. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Retrovirus gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: Bildung von gag-, pol- und env-Proteinen aus einer mit einem rekombinanten Virus infizierten Zellinie, welche zur Produktion der Proteine fähig ist; und Kontaktierung der Proteine mit viraler Vektor-RNA, tRNA, Liposomen und einem Zellextrakt zur Ergänzung der fehlenden Funktionen zur Partikelzusammenfügung, damit rekombinante Retroviren produziert werden, welche die virale Vektor-RNA tragen.

36. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Retrovirus gemäss Anspruch 1, dadurch

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(a) Bildung von rekombinanten, viralen Vektoren, welche separat oder in Kombination gag/pol, env und ein retrovirales Vektorgenom codieren;

(b) Produktion von hohen Titervorräten des Vektors; und

(c) Co-Infektion von Zellen zur Bildung von rekombinanten, retroviralen Vektoren.

37. Verfahren zur Herstellung eines Retrovirus gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Produktionszelle gezüchtet wird, die ein Genom aufweist, enthaltend:

(a) ein interessierendes Gen zusammen mit einem Packungssignal eines ersten retroviralen Phänotyps;

(b) gag- und pol-Gene des ersten retroviralen Phänotyps, ohne Packungssignal;

(c) hybrides env-Gen ohne Packungssignal, wobei das Produkt des genannten hybriden env-Ge-nes ein cytoplasmisches Segment des ersten retroviralen Phänotyps und ein exogenes Bindungssegment zum ersten retroviralen Phänotyp enthält.

38. Hybrid-env-Gen, als Mittel für die Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 37, für die Herstellung eines Retrovirus, welcher selektiv ein interessierendes Gen enthalten kann, gegen eine Zielzelle, wobei das env-Gen folgendes codiert:

(a) cytoplasmisches Segment eines ersten retroviralen Phänotyps; und

(b) exogenes Bindungssegment gegen einen ersten retroviralen Phänotyp, wobei das Bindungssegment fähig ist, selektiv die Zielzelle zu binden.

39. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Retroviren gemäss Anspruch 1, enthaltend:

Züchten der Zellen von transgenen Tieren, welche eine gag/pol-env-virale Konstruktion und eine entsprechende Vektorkonstruktion mit einem Promotor in einem zweckmässigen Medium enthalten; und Isolierung der rekombinanten Retroviren aus den Zellen.

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