NO314596B1

NO314596B1 - Fremgangsmåter for fremstilling av en farmasöytisk blanding omfattende et retrovirus, samt anvendelse av den farmasöytiske blandingen

Info

Publication number: NO314596B1
Application number: NO19904103A
Authority: NO
Inventors: Harry Edward Gruber; Douglas J Jolly; James G Respess; Paul K Laikind
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1990-09-20
Publication date: 2003-04-14
Also published as: GB2236753A; JP2004008227A; IL89701A0; GB2255777B; EP0334301A1; AU651311B2; ATE174960T1; DE68929122T2; CA1341585C; DK226890A; EP0334301B1; FI904647A0; NO904103D0; JPH11262397A; ATE187983T1; EP0702084A1; GB2236753B; WO1989009271A1; JP2002306188A; CH684094A5

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt fremgangsmåter for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus som er i stand til å overføre vektorkonstruksjonertil mottakelige humanmålceller. Disse vektorkonstruksjoner er typisk laget for å uttrykke ønskede proteiner i målceller, f.eks. proteiner som stimulerer immunogen aktivitet eller som er betinget aktive i definerte celleomgivelser. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en farmasøytisk blanding fremstilt ved hjelp av de nevnte fremgangsmåter for infisering av celler ex vivo.

Skjønt bakteriesykdommer er generelt lett å behandle med antibiotika, eksisterer det meget få effektive behandlingsformer eller profylaktiske tiltak for mange virale, cancerfremkallende, eller andre ikke-bakterielle sykdommer, inklusive genetiske sykdommer. Tradisjonelle forsøk på å behandle disse sykdommene har benyttet kjemiske legemidler. Generelt, har disse legemidlene manglet spesifisitet, vist høy total toksisitet (giftighet), og således har vært terapeutisk ineffektive.

En annen klassisk fremgangsmåte for å behandle mange ikke-bakterielle sykdommer inkluderer stimuleringen av en immunrespons mot et sykdomsfremkallende middel, slik som et virus, gjennom tilførselen av en ikke-infeksiøs form av midlet, slik som et drept virus, og derved oppnå antigener fra det patogene midlet som ville fungere som en immunstimulator.

En nyere fremgangsmåte for å behandle virale sykdommer, slik som ervervet immundefektsyndrom (AIDS) og beslektede sykdommer, inkluderer blokkering av reseptorer på celler som er følsomme overfor infeksjon med HIV ved å motta eller å danne et kompleks med viruskappeproteiner. F. eks., Lifson et al.

(Science 232:1123-1127,1986) viste at antistoffer mot CD4 (T4) reseptorer hemmet cellefusjon (syncytium) mellom infiserte og ikke-infiserte CD4 presenterende celler in vitro. En lignende CD4 blokkerende effekt ved bruk av monoklonale antistoffer er blitt foreslått av McDougal et al. (Science 231:382-385, 1986). Pert et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:9254-9258, 1986) har rapportert den alternative bruk av syntetiske peptider til å binde T4-reseptorer og blokkere HIV-infeksjon av humane T-celler, mens Lifson et al. (J. Exp. Med. 164:2101,1986) har rapportert blokkering av både syncytium og virus/T4-cellefusjon ved bruk av en leetin som reagerer med et viruskappeglukoprotein,

og derved blokkere det mot å bli bundet til CD4-reseptorer.

En fjerde nylig antydet fremgangsmåte for å hemme et patogen, slik som et virus, som transkriberer RNA, er å gi antisens RNA som komplementerer i det minste med en del av det transkriberte RNA, og binder til det, slik at translasjonen hemmes (To et al., Mol. Cell. Biol. 6:758,1986).

Imidlertid, er en hovedulempe med fremgangsmåtene beskrevet ovenfor at de ikke lar seg kontrollere med hensyn til tiden, lokaliseringen eller i hvilken grad legemidlet, antigenet, det blokkerende middel eller antisens RNA blir benyttet. Mer spesielt, siden de ovenfor nevnte fremgangsmåter krever en utvendig tilførsel av det behandlende middel (dvs. utvendig i forhold til prøven i en in vitro-situasjon), kan de ikke direkte reagere på nærværet av det sykdomsfremkallende middel. F.eks., kan det være ønskelig å ha en immunstimulator uttrykt i økende mengder rett etter infeksjon av det patogene midlet. I tillegg, vil i tilfellet med antisens-RNA store mengder bli krevet for effektiv terapi i et dyr, som med de eksisterende fremgangsmåter vil bli tilført uten hensyn til stedet hvor det i virkeligheten trengs, det betyr, i cellene som er infisert av den sykdomsfremkallende faktor.

Som et alternativ til ekstern tilførsel, har fremgangsmåter blitt antydet for å produsere hjelpemidler innvendig (endogent). Mer presist, har proteiner som er uttrykt fra virale vektorer basert på DNA-virus, slik som adenovirus, simianvirus 40, bovinpapillomavirus og vacciniavirus, blitt undersøkt. Som eksempel, Panicali et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:5364,1983) innførte influensavirus hemag-glutinin og hepatititt B overflateantigener inn i vacciniagenomet og infiserte dyr med viruspartiklene som var laget fra slike rekombinante gener. Etter infeksjon, fikk dyrene immunitet mot både vacciniavirus og hepatitt B-antigenet.

Imidlertid har flere vanskeligheter meldt seg pr. i dag med virale vektorer basert på DNA-virus. Disse vanskelighetene inkluderer (a) produksjon av andre virale proteiner som kan føre til sykdom eller til undertrykkelse av det ønskede proteinet; (b) egenskapen til vektoren å formere seg (replikere) ukontrollert i vertscellen, og den sykdomsfremkallende effekt av slik ukontrollert replikasjon; (c) nærvær av vill-typevirussom kan føre til viremi; og (d) den forbigående form av produksjon i disse systemene. Disse vanskelighetene har faktisk hindret bruken av virale vektorer basert på DNA-virus i behandlingen av virale, kreftfremkallende, og andre ikke-bakterielle sykdommer, deriblant genetiske sykdommer.

P.g.a. den ikke-forbigående form på deres produksjon i infiserte målceller, har retrovirus blitt foreslått som en anvendbar form for behandlingen av genetiske sykdommer (f.eks. se F. Ledley, The Journal of Pediatrics 110:1,1987). Imidlertid, lys av flere problemer, har bruken av retrovirus i behandlingen av genetiske sykdommer ikke blitt forsøkt. Slike problemer vedrører (a) det tilsynelatende behov for å infisere et stort tall celler i ikke-tilgjengelige vev (f.eks. hjernen);

(b) behovet for å lage disse vektorene slik at de produserer på en meget kontrollert og permanent måte; (c) mangelen på klonede gener; (d) den irreversible ødeleggelse på vev og organer p.g.a. metabolske skader; og (e) tilgjengeligheten av andre delvis effektive behandlinger i visse tilfeller. I tillegg til genetiske sykdommer, har andre forskere overveid å bruke retrovirale vektorer til å behandle ikke-genetiske sykdommer se f.eks. EP 243,204 - Cetus Corporation; Sanford, J. Theor. Biol. 130:469,1988; Tellier et al., Nature 318:414,1985; og Bolognesi et al., Cancer Res. 45:4700,1985).

Tellier et al. foreslo å beskytte T-cellekloner ved tilsynelatende å infisere stamcellene med "defekte" HIV som har et genom som kunne uttrykke antisens-RNA til HIV RNA. Bolognesi et al. har foreslått ideen med å danne en ikke-sykdomsfremkallende HIV-stamme for å infisere stamceller slik at T4-cellene som dannes fra disse ville bære blokkerende, ikke-sykdomsfremkallende former av virus og derved beskytte disse cellene fra infeksjon med sykdomsfremkallende (virulent) HIV. Imidlertid synes det som om de "svekkede" eller "defekte" HIV virus som ble benyttet i begge de foran nevnte artiklene kunne reprodusere seg (det betyr, er ikke reproduksjonsdefekte) slik at de resulterende virus kunne infisere andre celler, med den mulighet for en øket risiko for rekombinasjon med tidligere tilstedeværende HIV eller andre sekvenser, og derved føre til at svekkelsen tapes. Ikke-nonreplikerende former ville nødvendiggjøre en defekt hjelper eller pakke-stamme for HIV. Imidlertid siden kontrollen av HIV-genaktiveringen (ekspresjonen) er kompleks, gjenstår det i dag å konstruere slike celler. Videre, siden den infiserende svekkede eller defekte virus ikke er chimer (en "ikke-chimer" retrovirus har mesteparten av sin vektor fra de samme retro-virusarter), vil endog hvis de ble gjort replikasjonsdefekte, f.eks., ved å fjerne fra deres genom et essensielt element, det fremdeles eksistere en betydelig mulighet for rekombinasjon innenfor vertscellene med resulterende produksjon av infeksiøse viruspartikler.

Skjønt Sanfjord (J. Theor. Biol. 130:469,1988) også har foreslått å benytte en genkur for HIV, bemerker han at p.g.a. den mulighet som eksisterer for å lage nye virulente virus via genetisk rekombinasjon mellom naturlig AIDS-virus og terapeutiske retrovirusvektorer som bærer anti-HIV-gener, kan retrovirus genterapi for AIDS ikke være praktisk mulig. På samme måte, mens McCormick & Kriegler (EP 243,204 A2) har foreslått å bruke retrovirusvektorer til å forsyne gener for proteiner, slik som tumornekrosefaktor (TNF), lider fremgangsmåtene som de beskriver fra en rekke ulemper.

Kort fortalt, omfatter den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus som bærer en vektorkonstruksjon som er i stand til å forhindre, hemme, stabilisere eller reversere infeksiøse, cancerfremkallende, auto-immune eller immune sykdommer. Slike sykdommer inkluderer HIV-infeksjon, melanom, diabetes, transplantat vs. vertssykdom, Alzheimers sykdom og hjertesykdom.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet delvis mot fremgangsmåter som involverer fremstilling av farmasøytiske blandinger omfattende retrovirus som bærer en vektorkonstruksjon for (a) stimulering av en spesifikk immunrespons mot et antigen eller patogent antigen; (b) hemming av en funksjon av et patogent middel, slik som et virus; og (c) hemming av reaksjonen mellom en substans med en vertscellereseptor, ved bruk av rekombinante retrovirus.

Mer spesifikt, blir innenfor én del av den foreliggende oppfinnelse beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus med evne til å infisere humane celler, hvilken bærer en vektorkonstruksjon i stand til å forhindre, inhibere, stabilisere eller reversere infeksjons-, kreft- eller autoimmun-sykdommer, hvori vektor-konstruksjonen styrer ekspresjonen av et sykdomsantigen som er fra et patogent agens eller er et kreftantigen eller en modifisert form derav, i målceller infisert med retroviruset, hvilket antigen eller modifisert form derav er i stand til å stimulere en cellemediert immunrespons hos et menneske; kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter kombinasjon av nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer hvor retroviruset er fremstilt i en cellelinje som komplementerer replikasjonsdefekten slik at det fremstilles en farmasøytisk blanding som har et titer på 10<7> til 1011 infektive enheter av nevnte retrovirus per ml av bærer. Der hvor en immunrespons skal stimuleres mot et patogent antigen, blir den rekombinante retrovirus fortrinnsvis laget for å uttrykke en modifisert form av antigenet som vil stimulere en immunrespons og som har redusert sykdomsfremkallende virkning relativt til det naturlige antigenet. En immunrespons kan også bli oppnådd ved å overføre til en passende immuncelle (slik som en T-lymfocytt) genet for den spesifikke T-cellereseptoren som gjenkjenner antigenet av interesse i sammenheng med et passende MHC-molekyl eller for et immunglobulin som gjenkjenner antigenet av interesse.

I det spesielle sykdomstilfellet forårsaket av HIV-infeksjon, hvor immunstimulering er ønskelig, blir antigenet dannet fra det rekombinante retrovirale genomet i en form som vil utløse enten eller både en HLA klasse I- eller klasse II-begrenset immunrespons. I tilfellet med HIV kapselantigen, blir f.eks. antigenet fortrinnsvis valgt fra gp 160, gp 120, og gp 41, som er blitt modifisert for å redusere deres sykdomsfremkallende virkning (patogenisitet). Antigenet som blir valgt blir spesielt modifisert for å redusere muligheten av syncytiumdannelse. Antigener fra andre HIV-gener, slik som gag, pol, vif, nef, etc, kan også gi beskyttelse i spesielle tilfeller.

I et annet område av den foreliggende oppfinnelse, blir det beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus, i stand til å infisere humane celler, hvor nevnte retrovirus bærer en vektorkonstruksjon i stand til å forhindre, inhibere, stabilisere eller reversere infeksjons-, kreft- eller autoimmun-sykdommer, hvor vektor-konstruksjonen, når den er i humane celler infektert med nevnte retrovirus, er i stand til å dirigere ekspresjon av et enzym som normalt ikke uttrykkes i nevnte celler og som konverterer en forbindelse med liten eller ingen cytotoksisitet til en cytotoksisk forbindelse i stand til å inhibere funksjonen til et patogent agens nødvendig for patogenisiteten, kjennetegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter kombinasjon av nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer hvor retroviruset er fremstilt i en cellelinje som komplementerer replikasjonsdefekten slik at det fremstilles en farmasøytisk blanding som har et titer på 10<7> til 10<11> infektive enheter av nevnte retrovirus per ml bærer. Slik hemming blir ledsaget av fremgangsmåter som inkluderer produksjon av et hjelpemiddel som er toksisk for en syk celle, produksjon av et hjelpemiddel som selektivt hemmer produksjonen eller effektene av patogene gener, uttrykke antisens RNA eller ved å sette inn en sekvens inn i et patogent genom på en slik måte at dens funksjon ødelegges.

Mer spesifikt, involverer den foreliggende oppfinnelse rekombinante retrovirale genomer som produserer et defekt strukturelt protein fra en sykdomsfremkallende forbindelse, som leder til hemming av sammensetningen av den patogene forbindelse, f.eks. produksjon av et defekt strukturelt protein fra viruspartikler, som leder til hemming av viruspartikkelsammensetningen.

Hvor et toksisk hjelpemiddel skal lages av celler som inneholder det rekombinante virale genomet, enten det kan bli laget fra forstadier som eksisterer i cellene eller, i tillegg, via omgivelsene som gir opphav til en forløper av en toksisk forbindelse. I det siste tilfellet, koder viruskonstruksjonen for et produkt som overfører forløperen til en giftig forbindelse. I begge tilfeller, ville den giftige forbindelse bare bli lokalisert på celler som inneholder viruskonstruksjonen og en annen forbindelse som er forbundet med den sykelige tilstanden. F.eks., den andre forbindelsen kan være et protein som er produsert via transkripsjon og translasjon av et patogent viralt genom tilstede i cellen. Spesifisitet for den sykelige tilstanden kan også bli oppnådd eller videre fremmet ved å målbestemme opptaket av de rekombinante retrovirus til cellene som er angrepet av den sykelige tilstanden. Det bør bli forstått i fra denne diskusjonen, og gjennom denne søknaden, at når henvisning blir gjort til viruskonstruksjon "uttrykke" eller "produsere" enhver substans i en celle, e.l., refererer dette faktisk til virkningen av den resulterende provirus etter revers (omvendt) transkripsjon av virus RNA i cellen.

I en foretrukket utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er nevnte vektorkonstruksjon i stand til å dirigere ekspresjon av et enzym valgt fra gruppen: a) et ikke-pattedyrprotein som ikke er cytotoksisk, men som i en menneskecelle er i stand til å overføre en forbindelse med liten eller ingen cytotoksisitet til en sådan som er cytotoksisk; b) et protein som er i stand til å fosforylere et purin- eller pyrimidinbasert legemiddel som krever intracellulær fosforylering for å bli et cytotoksisk agens; eller c) et protein som ikke er cytotoksisk, men som er i stand til å overføre et ikke-toksisk legemiddel som ikke er en purin- eller pyrimidinanalog til et som er cytotoksisk i en menneskecelle.

Uansett de fremgangsmåter som de rekombinante retrovirus utøver sine immunogene eller hemmende virkninger som beskrevet ovenfor, er det å foretrekke at retrovirusgenomet er "replikasjonsdefekt" (det betyr ikke i stand til å formere seg i celler som er infisert med det). Således, vil det bare være et enkelt trinn i infeksjon i enten en in vitro eller in vivo bruk, og derved redusere vesentlig muligheten for innsettings(insersjon)-mutagenese. For å hjelpe til med dette er det å foretrekke at de rekombinante retrovirus mangler minst én av gag-, pol- eller env-genene. Videre er det å foretrekke at den rekombinante virale vektoren er chimer (dvs. genet som skal produsere det ønskede resultatet er fra en annen kilde enn resten av retroviruset). En chimer konstruksjon reduserer videre muligheten for rekombinasjonshendelser inne i celler som er infisert med det rekombinante retrovirus, som kunne lage et genom som kan danne viruspartikler.

Innenfor en annen del av den foreliggende oppfinnelse, blir det beskrevet anvendelse av en farmasøytisk blanding fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -15, for infisering av celler ex vivo. Den foreliggende oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte som involverer slike rekombinante retrovirus der det retrovirale genom er pakket i et kapsid og hylster, fortrinnsvis ved bruk av en pakkefremmende celle. De pakkefremmende cellene blir utstyrt med virusproteinkodende sekvenser, fortrinnsvis i form av to plasmider, som lager alle proteinene som er nødvendige for produksjon av levedyktige retroviruspartikler, en RNA viruskonstruksjon som vil føre det ønskede genet sammen med et pakkefremmende signal som vil dirigere pakking av RNA inn i retroviruspartikler.

Det omtales et antall fremgangsmåter for å lage rekombinante virus som kan underlette: i) produksjonen av høyere titere fra pakkefremmende celler;

ii) pakking av vektorkonstruksjoner ved hjelp av fremgangsmåter som ikke

benytter pakkefremmende celler;

iii) produksjon av rekombinante retrovirus som kan bli målbestemt for på

forhånd utvalgte cellestammer; og

iv) integrering av proviruskonstruksjonen i forhåndsvalgt(e) sete(r) i en celles genom.

Én teknikk for å gi høyere titere fra pakkefremmende celler tar hensyn til den oppdagelsen at av de mange faktorer som kan begrense titere fra en pakkefremmende celle, én av de mest begrensende er nivået for å uttrykke de

pakkefremmende proteinene, nemlig, gag-, pol- og env-proteiner, så vel som nivået av produksjonen av det retrovirale vektor-RNA fra provirusvektoren. Denne fremgangsmåte tillater seleksjon av pakke-fremmende celler som har høyere produksjonsnivåer (dvs. produserer høyere konsentrasjoner) av de forannevnte pakke-fremmende proteiner og vektorkonstruksjon RNA. Mer spesifikt, tillater denne teknikken seleksjon av pakkefremmende celler som lager høye nivåer av det som henvises herved til som "en primær forbindelse" som er enten et pakkefremmende protein (f.eks. gag-, pol- eller env-proteiner) eller et gen av interesse som skal føres inn i genomet i målcellene (typisk en vektorkonstruksjon). Dette blir utført ved å lage i pakkefremmende celler et genom som bærer et gen (det "primære gen") som uttrykker den primære forbindelse i de pakkefremmende celler, sammen med et seleksjonsgen, fortrinnsvis nedstrøms fra det primære genet. Det valgte genet lager et utvalgt protein i de pakkefremmende celler, fortrinnsvis én som overfører motstand til et på annen måte giftig legemiddel. Cellene blir så utsatt for en seleksjonsforbindelse, fortrinnsvis det giftige legemidlet, som setter en i stand til å identifisere de celler som produserer det ønskede proteinet i en kritisk mengde (dvs. i tilfellet med et giftig legemiddel, ved å drepe de celler som ikke produserer en mengde av motstandsproteinet som kreves for overlevelse).

Det er å foretrekke i fremgangsmåten som er kort beskrevet ovenfor, at ekspresjonene av både det utvalgte og de primære gener blir kontrollert av den samme promotor. Med hensyn til dette kan det være å foretrekke å benytte et retroviralt 5' LTR. For å maksimere titere til et rekombinant retrovirus fra de pakkende celler, blir denne teknikken først benyttet for å velge pakkefremmende celler som uttrykker høye nivåer av alle de nødvendige pakkproteinene, og så blir benyttet for å velge hvilken av disse cellene som produserer de høyeste titere av de rekombinante retrovirus etter transfeksjon med den ønskede provirale konstruksjon.

Fremgangsmåter blir også omtalt for å pakke vektorkonstruksjoner når man ikke benytter pakkefremmende celler. Disse fremgangsmåter gjør bruk av DNA-virus slik som baculovirus, adenovirus, eller vacciniavirus, fortrinnsvis adenovirus. Disse virus er kjent å uttrykke relativt høye nivåer med proteiner fra eksogene gener som føres heri. For slike DNA-virusvektorer, kan rekombinante DNA-virus bli laget ved in vivo rekombinasjon i vevskultur mellom virus DNA og plasmider som bærer retrovirale eller retrovirale vektorgener. De resulterende DNA- virusvektorer som bærer enten sekvenser som koder for retrovirusproteiner eller for retrovirale vektor RNA blir renset i høye titermengder. Alternativt kan konstruksjonene bli laget in vitro og deretter transfektert inn i celler som forsyner transviralfunksjoner som mangler fra DNA-vektorene. Uansett fremgangsmåten for produksjon, kan høye titer- (10<7> til 1011 enheter/ml) lagre bli tillaget som vil, ved infeksjon av følsomme celler, forårsake et høyt produksjonsnivå av retrovirale proteiner (slik som gag, pol og env) eller RNA retrovirale vektorgenomer eller begge. Infeksjon av celler i kultur med disse lagrene, alene eller i kombinasjon, vil føre til høygradig produksjon av retrovirale vektorer, hvis disse lagrene fører virusproteinet og de virale vektorgener. Denne fremgangsmåte, når det blir benyttet med adenovirus eller andre pattedyr-vektorer, tillater å benytte primære celler (f.eks. fra vevskulturer eller celler slik som WI38 benyttet i produksjon av vaksiner) til å lage rekombinante retrovirale vektorer.

Som et alternativ til den forannevnte fremgangsmåte, blir rekombinante retrovirus produsert ved først å lage gag/pol og env-proteinene fra en cellelinje som er infisert med den passende rekombinante DNA-virus på en måte som er lik de forannevnte fremgangsmåtene, bortsett fra at cellelinjen er ikke infisert med en DNA-virus som bærer vektorkonstruksjonen. Deretter, blir proteinene renset og kontaktet med den ønskede virale vektor RNA som er laget in vitro. transport RNA (tRNA), liposomer, og et celleekstrakt for å føre env-proteinet inn i liposomene, slik at rekombinante retrovirus som bærer det virale vektor-RNA blir produsert. Med denne fremgangsmåten, kan det være nødvendig å føre env-proteinet inn i liposomene før disse kommer i kontakt med resten av den forannevnte blandingen. Gag/pol og env-proteinene kan også bli laget etter plasmid-formidlet transfeksjon i eukaryote celler, i gjær, eller i bakterier.

Fremgangsmåten for å lage rekombinante retrovirus som kan bli målbestemt for utvalgte cellelinjer benytter seg av rekombinant retrovirus som har en env-gen karakterisert ved et cytoplasmatisk segment av en første retrovirus fenotype, og et ekstracellulært bindingssegment som er fremmed for den første retrovirale fenotypen. Bindingssegmentet er fra en annen viral fenotype eller fra et annet protein med ønskede bindingsegen-skaper som er valgt til å bli produsert som et peptid som vil binde til det ønskede målet.

Fremgangsmåter for å integrere et retroviralt genom på et spesifikt sete i DNA i en målcelle inkluderer bruken av homolog rekombinasjon, eller alternativt, bruken av et modifisert integrerings(integrase)enzym som vil gjenkjenne et spesifikt sete i målcellegenomet. Slik sete-spesifikk innsetting tillater genene å bli plassert på steder i målcellens DNA, som vil minimalisere mulighetene for innsettings- (insersjon) mutagenese, minimalisere påvirkningen fra andre sekvenser i DNA, og tillate innsetting av sekvenser på spesifikke målsteder for å redusere eller eliminere uttrykkingen (ekspresjonen) av et ikkeønsket gen (slik som et virusgen) i DNA i målcellen.

Det vil bli forstått at enhver av de ovenfor nevnte fremgangsmåtene kan bli benyttet uavhengig av de andre i spesielle situasjoner, eller kan bli benyttet sammen med én eller flere av de gjenværende fremgangsmåtene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstiling av en dose av en farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å kombinere nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer slik at den farmasøytiske blandingen omfattende nevnte retrovirus blir fremstilt, og isolere en mengde av nevnte farmasøytiske blanding tilstrekkelig til å tilveiebringe til en pasient i behov derav en dose omfattende 10<5> til 10<7> infektiøse enheter av retrovirus per kg av pasientens kroppsvekt.

Disse og andre deler av den foreliggende oppfinnelse vil bli tydeliggjort ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelse og tilknyttede figurer.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser tre forskjellige familier vektorer som blir benyttet for å lage HIV env og som kan eller ikke kan ha den valgbare SV-Neo-kassett innsatt. Figur 2 beskriver HIV env-produksjonsnivåer sett i polyakrylamidgel-elektroforese av HIV env-spesifikke radioimmun-presipitasjoner (sedimenteringer) av ekstrakter fra humane Sup T1-celler transfektert med de viste vektorene. Markørene er i kilodalton, gp 160 og gp 120 markerer de riktige proteinene, og 517 + tat er den positive kontroll (HIV LTR uttrykker env i nærvær av tat). Figur 3 viser protokollen for å teste T-celledrap utløst i mus som er injisert med syngene tumorceller som produserer HIV env (vektoren er pAF/env-SV-Neo). Figur 4 viser grafisk resultatene fra den eksperimentelle protokollen i figur 3. Spesifikt drap er sett i den øverste figur med BC10MEenv-29 drap vs. B/C10ME motstand mot drap.

Figur 5 viser en vektor laget for å uttrykke sCD4.

Figur 6 illustrerer konstruksjonen av plasmidene som bærer vektorene TK1 (uten SV-Neo) og TK3 (pluss SV-Neo). Figur 7 beskriver konstruksjonen av plasmidet som bærer vektoren

KTVIHAX.

Figur 8 beskriver konstruksjonen av plasmidene som bærer vektorene KTVIH5 (uten SV-Neo) og KTVIH Neo (med SV-Neo). Figur 9 beskriver konstruksjon av plasmider som bærer vektoren MHMTKNeo. Figur 10 beskriver konstruksjonen av plasmidene som bærer tat-his (tat i riktig (sens) retning) eller åååtat (tat i antisens (omvendt) retning) vektorer. Figur 11 viser grafisk den spesifikke dreping av PA317-celler som er infisert med tathisvektor (5 kloner, TH1-5) sammenlignet med kontroll PA317, ved infekjson med de tre induserbare dødelige vektorene vist og behandling med acyclovir (ACV). Figur 12 viser konstruksjon av en viral vektor som bærer HIV induserbare markør/rapportgener slik som alkalisk fosfatase (AP). Figur 13 viser strukturen til en HIV-induserbar markør/-rapportgen som sitter på et plasmid som kan bli transfektert inn i cellene. Figur 14 viser grafisk et tidsforløp i HIV-infeksjon av Sup T1 celler som bærer AP-markøren i figur 13 med HIV i forskjellige konsentrasjoner med AZT. Nivået av HIV-infeksjon ble målt ved å ta små prøver av supernatanten. Figur 15 viser grafisk resultatene fra det samme eksperiment som i figur 14, men med ddC som HIV-inhibitoren. Figur 16 illustrerer diagrammatisk antall celler som overlever etter phleomycinseleksjon ved transfeksjon av cellene med et plasmid som uttrykker phleomycinresistensgenet (PRG) direkte fra en promotor (høyre) og med en annen som uttrykker PRG med en kodende sekvens satt mellom den og promotoren. Figur 17 viser fire plasmider laget for å uttrykke retrovirale proteiner i pattedyrceller. pSVgp og pRSVenv blir kotransfektert med en valgbar markør, mens pSVgp-DHFR og pRSVenv-phleo er ekvivalente plasmider med seleksjons-markøren plassert nedstrøms for de virusproteinkodende regioner. Figur 18 viser tre seter for fusjon av HIV env og ML env etter sete-spesifikk mutagenese av både kodende sekvenser for å gi nye sammenlignbare restriksjonsenzymseter. De N-terminale sekvensene er til venstre i begge tilfeller. Benevningen er ifølge nukleotidbenevnelse. ST, SR, SE er startpunktene for tat, rev og env mens TT, TR og TE er de korresponderende avslutnings-(terminering) seter. Figur 19 viser erstatningen av U3 i 5' LTR ved en heterolog promotor/- enhancer (forsterker) som kan være koblet til enten Sac I, Bsst II eller et annet i regionen. Figur 20 illustrerer en representativ metode for å krysse transgene mus som uttrykker viralt protein eller vektor RNA.

I. Immunstimulerinq

Evnen til gjenkjennelse og forsvar mot fremmede patogener (sykdomsfremkallende forbindelser) er sentral i funksjonen til immunsystemet. Dette systemet, gjennom immungjenkjennelse, må være i stand til å skille "selv" fra "ikke selv"

(fremmed), som er vesentlig for å sikre at forsvarsmekanismer er rettet mot invaderende organismer i stedet for mot eget vev. De fundamentale egenskapene til immunsystemet er nærværet av sterkt polymorfe celleoverflategjenkjennelses-strukturer (reseptorer) og effektormekanismer (antistoffer og cytolytiske celler) for å destruere invaderende patogener (sykdomsfremkallende forbindelser).

Cytolytiske T-lymfocytter (CTL) blir stimulert normalt ved presentasjonen av behandlede patogene spesifikke peptider sammen med MHC-klasse I eller klasse II celleoverflateproteiner. I én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, vil presentasjon av immunogene virale determinanter inngå som sammen med passende MHC-molekyler indusere effektivt optimal CTL-svar uten å utsette pasienten for patogenet. Denne vektorfremgangsmåten for immunstimulering gir et mer effektivt hjelpemiddel for å lage beskyttelses- og terapeutiske CTL-svar, fordi typen immunitet som dannes av vektoren ligner nærmere på den som utløses ved eksponering for naturlig infeksjon. Basert på nåværende kunnskap fra flere virale systemer, er det usannsynlig at eksogent forsynt, ikke-replikerende virale antigener, slik sompeptider og rensede rekombinante proteiner, vil gi tilstrekkelig stimulering til å forårsake optimal klasse l-begrensede CTL-svar. Alternativt, gir vektor-utløst ekspresjon av utvalgte virale proteiner innenfor målceller som beskrevet i den foreliggende oppfinnelse en slik stimulering.

Ved hjelp av eksempel, i tilfellet med HIV-1-infeksjoner, utvikler pasienter antistoff som er spesifikke for en rekke virale kappe-regiondeterminanter, noen av disse er i stand til in vitro-virusnøvtraliserinq. Ikke desto mindre fortsetter sykdomsprogresjonen og pasientene dør til slutt av sykdommen. Lavt nivå CTL svar mot infiserte pasienters celler (Plata et al., Nature 328:348-351,1987) og mot målceller infisert med rekombinant vaccinia-vektorer som uttrykker HIV gag, pol eller env (Walker et al., Nature 328:345-348,1987; Walker et al., Science 240:64-66,1988) er blitt oppdaget i noen HIV-1 sero-positive pasienter. I tillegg, er det nylig blitt vist at gnager så vel som human CTL kan bli stimulert ved autologe stimulatorceller som utrykker HIV gp 120 via transfeksjon (Langlade-Demoyan et al, J. Immunol. 141:1949,1988). Forbedret CTL-induksjon kunne være terapeutisk fordelaktig for injiserte pasienter og gir effektiv prevensjonsbeskyttelse til individer under ikke-infeksiøse betingelser. HIV-infeksjon selv trenger ikke å lage adekvat CTL-svar fordi andre elementer forbundet med HIV-infeksjon kan forhindre rett immunstimulering. I tillegg, kan det være at stimulering av T-celler ved infiserte celler er en reaksjon som fører til infeksjon av de stimulerte T-cellene.

Eksempel 1 beskriver fremgangsmåter for å konstruere plasmider som er i stand til å lage retrovirale vektorer i pakkefremmende celler, som så fører til produksjon av HIV-virale antigener.

EKSEMPEL 1

Vektorer som uttrykker HIV- antiqener

A. Env- ekspresionsvektor (Se figur 1):

Et 2,7 kb Kpn-Xho I DNA-fragment ble isolert fra HIV provirusklon BH10-R3 (for sekvens, se Råtner et al., Nature 313:277,1985) og et «400 bp Sal-Kpn I DNA-fragment fra lllexE7deltaenv (et Bal31 delesjon til nt. 5496) ble ligert inn

i Sal l-setet i plasmid SK<+>. Fra denne klon, ble et 3,1 kb env DNA-fragment (Xho I-Cla I) som også koder for rev, og er vesentlig for env produksjon, renset og ligert inn i en retroviral vektor kalt pAFVXM (se Kriegler et al., Cell 38:483,

1984). Denne vektor ble modifisert slik at Bgl ll-setet ble forandret ved linker-innsetning til et Xho I sete for å underlette kloning av HIV env kodende DNA-fragmentet.

En dominant selekterbar markørgen som bestod av en SV40 tidligpromotor som styrte uttrykket av neomycin fosfotrans-ferasegenet ble satt inn i vektoren på Cla-l-setet for å underlette isolering av infiserte og transfekterte cellelinjer.

Xho l-setet oppstrøm fra ENV-genet i vektoren gir et passende sete for å sette inn tilleggspromotorer inn i vektor-konstruksjonen som RSV-promotoren, SV40 tidlig eller sen promotor, CMV øyeblikkelig tidlig (IE) promotor, human beta-bactin-promotor, og Moloney gnager MLV SL3-3-promotor.

En slik promotor, CMV Øyeblikkelig Tidlig genpromotor, et 673 pb DNA-fragment Hine II til Eag I, resulterer i et ti ganger øking i ENV-ekspresjon i en human T-cellelinje kalt Sup Tl ved sammenligning med den parenterale konstruksjon pAF ENV<r> SV2 Neo.

B. Gag- ekspresjonsvektor:

Et 2,5 kb Sac l-Eco RV DNA-fragment ble isolert fra pBH10-R3 (se Råtner et al., op. eit.) og bundet i sac l-Sal l-setet av pUC31. pUC31 stammer fra pUC19 med tillegg av Xho I, Bgl II, Bsst II og Nco I seter som er satt inn mellom Eco R1 og Kpn I setene i polylinkeren. Imidlertid inneholdt denne konstruksjon hoved-splicedonator (SD) setet (splicingsetet) fra HIV og kunne således bli problematisk i virusdannelsen. SD-setet ble fjernet ved subkloning av et 70 bp Rsa l-CIa I-fragment med en 2,1 kb Cia l-Bam H1 DNA-fragment i Hine ll-Bam H1 sete i SK<+>. Barn H1 -setet ble overført til et Cia I sete ved linkerinnsetting. Denne konstruksjon ble betegnet SK* gag protease SD delta. ;2,5 kb Xho l-CIa I DNA-fragment fra SK<+> gag protease SD delta ble satt inn i Xho l/CIa l-setene til vektoren pAFVXM akkurat som beskrevet ovenfor. Disse plasmidene, når de blir satt inn i en passende pakkefremmende celle, uttrykte en retroviral vektorkonstruksjon som inneholdt et pakkesignal. Pakkesignalet styrte pakkingen av vektorkonstruksjonen inn i en kapsid (hylse) og kapsel sammen med alle andre proteiner som ble krevet for levedyktige retrovirale partikler. Kapsidet, kapselen, og andre proteiner blir fortrinnsvis laget fra én eller flere plasmider som inneholder passende genomer plassert i den pakke-fremmende cellen. Slike genomer kan være provirale konstruksjoner, som ;på en enkel måte kan kun ha pakkesignalet fjernet. Som et resultat, vil bare vektoren bli pakket. Passende pakkesystemer eller pakkefremmende cellelinjer og genomet som er nødvendig for å utføre slik pakking er beskrevet i Miller et al. ;(Mol. Cell. Bio. 6:2895,1986), som er inntatt herved som referanse. Som beskrevet av Miller et al., er det å foretrekke at videre forandringer bør lages i proviruskonstruksjonen heller enn enkel fjernelse av pakkesignalet for å redusere mulighetene for rekombinasjonshendelser som opptrer innenfor den pakke-fremmende cellelinje, som kan resultere i produksjon av viruspartikler som ikke er replikasjonsdefekte. ;Det vil bli forstått at eksempel 1 er bare illustrerende for en fremgangsmåte for å lage en HIV kapsel glykoprotein (gp) eller andre virale antigener. Det er også mulig å gi en proviral vektorkonstruksjon som uttrykker en modifisert HIV kapsel gp på målcellene som vil på samme måte stimulere en immunrespons, men med færre T-cellsykdomsfremkallende effekter. Kapselglykoproteiner kan bli passende modifisert ved bruk av fremgangsmåter som er vel kjent i feltet, f.eks. ved bruk av beskrivelsen i artikler til Kowalski et al. (Science 237:1351,1987), som er herved inkorporert ved referanse. Således kan en proviral konstruksjon bli laget ved hjelp av fremgangsmåtene ovenfor som lager retrovirale konstruksjoner som uttrykker en passende modfisert gp. Denne konstruksjon blir så plassert i en pakke-fremmende celle som beskrevet ovenfor. De resulterende rekombinante retrovirus som blir produsert fra de pakkefremmende cellelinjene kan bli benyttet in vitro og in vivo til å stimulere et immunsvar gjennom infeksjon av følsomme målceller. ;Det vil bli forstått at andre proteiner uttrykt fra HIV-genomet, slik som gag, pol, vif, nef, etc, kan også utløse nyttige cellulære svar i HlV-infiserte individer. Provirale ;vektorer slik som de beskrevet nedenfor er laget for å uttrykke slike proteiner for å oppmuntre en klinisk fordelaktig immunrespons. Det kan være nødvendig for visse vektorer å inkludere rev-kodende sekvenser så vel som et rev-responsivt element (Rosen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 85:2071,1988). ;Det følgende eksempel demonstrerer evnen til denne type behandling å utløse CTL-svar i mus. ;EKSEMPEL 2 ;Immunsvar på retrovirale vektor- kodede antigener ;En mus tumorcellelinje (B/C10ME) (H-2<d>) ble infisert med pAF en/ SV40 Neo-vektor konstruksjon som kodet for HIV-env. Én klonet HlV-env-produserende cellelinje (B/C10ME-29) ble så benyttet for å stimulere HIV-env-spesifikk CTL i syngene (dvs. MHC-identiske) Balb/c (H-2<d>) mus. Mus ble immunisert ved intraperitoneal injeksjon med B/C10ME-29 celler (4 x 10<7> celler) og på nytt på dag 7-14. Mottaker miltcellesuspensjoner ble laget fra disse immuniserte mus og cellene dyrket in vitro i 4 dager i nærvær av enten B/C10ME-29 eller B/C10ME mitomycin-C-behandlede celler med en stimulator.responder celleforhold på ;1:50 (figur 3). Effektorcellene ble høstet fra disse kulturene, telt, og blandet med radiomerket (<51>Cr) målceller (dvs., B/C10MEenv-29 eller B/C10ME) i forskjellige effektontarget (E:T) celleforhold i en standard 4-5 hr <51>Cr-frigjøringsmetode. ;Etter inkubasjon, ble mikrotiterplatene sentrifugert, 100 ul kultursupematant ble fjernet, og mengden radioaktivitet frigjort fra lyserte celler kvantitert i en Beckman gamma spektrometer. Målcellelyset ble beregnet som: % Target Lysis = Exp CPM - SR CPM/MR CPM - SR CPM x 100, hvor eksperimentelle tellinger pr. min. (exp CPM) representerer effektorer pluss mål; spontan frigjøring (SR) CPM representerer målene alene; og maksimum frigjøring (MR) CPM representerer målene i nærvær av 1 M HCL. ;Resultatene (figur 4) illustrerer at CTL effektorene ble stimulert med spesifikt lyserte HIV-env-produserende målceller (B/C1 OMEenv-29) signifikant mer effektivt enn B/C10ME målene. Stimulerte miltceller restimulert in vitro med ikke-HlV-env-uttrykkende kontrollceller (B/C10ME) viste ikke noen signifikant CTL-aktivitet på enten B/C1 OMEenv-29 eller B/C10ME-målene, spesielt ved lavere E:T celleforhold. Miltceller oppnådd fra originale ikkeimmuniserte Balb/c-mus som ble restimulert in vitro med B/C1 OMEenv-29 laget ikke CTL, og dette antydet viktigheten av in vivo stimulering og restimulering. Dette eksperimentet er blitt repetert og lignende resultater oppnådd. ;I et annet eksperiment, var effektorcellene oppnådd fra Balb/c-mus immunisert, igjen immunisert og restimulert in vitro med en forskjellig H-2d HIV-env-produserende tumorcelleklone (L33-41) infisert med den samme pAF env<r >SV40 Neo (HIV-env) vektor konstruksjon i stand til å lysere B/C10MEenv-29 målceller. Dette gir tilleggsstøtte til at CTL laget i disse mus er spesifikke i å gjenkjenne en uttrykt form av HIV-env fremfor simpelthen en unik tumorcelle-antigen på disse cellene. Dette resultat antyder også at det vektorlagede antigen blir presentert på en lignende måte av de to tumorcellelinjene. ;Overføring av denne immunstimulerende fremgangsmåte til mennesker krever at (1) genet koder for antigenet av interesse kan overføres til celler, (2) antigenet må bli uttrykt i de riktige celler, og (3) MHC restriksjonskrav, dvs. klasse I og klasse II antigeninteraksjon, blir tilfredsstilt. Preparater av vektor blir laget ved å kultivere produksjonsceller i normalt medium, vasking av cellene med PBS pluss humant serum-albumin (HSA) med 10 mg/ml, så dyrkes cellene i 8-16 timer i PBS pluss HSA. Titrene som er oppnådd er typisk 10<4> til 106/ml avhengig av vektoren, den pakkefremmende cellelinje eller en spesiell produksjonslinjeklon. Vektorsupernatantene blir filtrert for å fjerne celler og bli konsentrert opp til 100 ganger ved filtrering gjennom 100.000 eller 300.000 pass Amicon-filtere (Wolff et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:3344,1987). Dette lar globulære proteiner på 100.000 eller 300.000 passere, men holder tilbake 99% av den virale vektor som infeksiøse partikler. Stamløsningene kan bli frosset for lagring siden de taper omkring 50% av de infeksiøse enhetene etter frysing og tining. Den mest direkte avlevering innbefatter tilførsel av den passende genbærende vektor inn i det individuelle og pålitelighet med hensyn til vektorens egenskap til å effektivt målbestemme de rette cellene, som kan så starte stimulering av immunresponsen. Dosen ville være 10<5->10<6> infeksiøse enheter/kg kroppsvekt. Imidlertid kan en mer praktisk fremgangsmåte innbefatte ekstrakorporal behandling av pasientens perifere blodlymfocytter (PBL), fibroblaster eller andre celler som oppnås fra hvert individ med vektoren. PBL kunne bli opprettholdt i kulturen ved bruk av mitogener (phytohemagglutinin) eller lymfokiner (f.eks. IL-2). Denne type fremgangsmåte tillater direkte vektorinfeksjon, overvåkning av produksjon og utvidelse av antigen-presenterende cellepopulasjon før injeksjon, og tilbakeføring av vektor-uttrykkende celler til den respektive pasient. Andre typer celler kunne også bli eksplantert, vektorbehandlet, og cellene ført tilbake til pasienten. Bare en moderat dose infiserte celler (10<5->10<6>/kg kroppsvekt) er nødvendig for å utløse sterke immunsvar. ;En forskjellig form for tilførsel er implantasjon av produksjonslinjer som lager retrovirale vektorpartikler. Disse kan være immunologisk ikke-forliket klassiske produksjonscellelinjer eller pasientens egne celler, som var blitt eksplantert, behandlet og ført tilbake (se VI Alternativ Viral Vektor Pakkefrem-gangsmåter, nedenfor). Begge typer implantasjoner (10<5->10<6>/kg kroppsvekt) ville ha en begrenset livslengde i pasienten, men vil føre til at den retrovirale vektor infiserer store mengder (107-10<10>) celler i kroppens nærhet. ;I ethvert tilfelle, kan suksessen av behandlingen bli målt ved å fjerne en liten mengde blod å måle CTL-svaret ved bruk av mål individets egne celler infisert med vektor som fører til env-produksjon. ;Når det er ønsket å stimulere en MHC klasse I eller klasse II begrenset immunsvar til patogener, inklusive patogene virus andre enn HIV, vil passende former for kapsel eller andre antigener forbundet med slike retrovirus som vil stimulere en immunrespons kunne bli vurdert av fagmannen. Generelt, passende former antigener som er forbundet med patogene forbindelser kan lett bli valgt som vil stimulere en immunrespons overfor disse patogene forbindelser. ;En alternativ fremgangsmåte til å lage en ønsket immun-respons er å overføre en antigen-spesifikk T-cellereseptorgen til en passende celle, slik som en T-celle. En annen mulig mottaker er NK-celler hvor den cytotoksiske immunresponsen ikke er MHC-begrenset. Et spesifikt immunglobulingen kunne på samme måte være anvendbar hvis overført til en B-celle. ;II. Blokkerende forbindelser ;Mange infeksjonssykdommer, kreft, autoimmunsykdommer, og andre sykdommer omfatter reaksjonen mellom viruspartikler og celler, mellom celler og celler, eller mellom celler og faktorer. I virusinfeksjoner, kommer virus vanligvis inn i cellene via reseptorer på overflaten av mottakelige celler. I kreft, kan celler svare uriktig eller ikke i det hele tatt på signaler fra andre celler eller faktorer. I autoimmunsykdom, er det en uriktig gjenkjennelse av "selv" markører. Innenfor den foreliggende oppfinnelse, kan slike reaksjoner bli blokkert ved å produsere, ]n vivo, en analog til én av deltagerne i en reaksjon. ;Denne blokkerende virkningen kan opptre intracellulært, på cellemembran-en, eller ekstracellulært. Den blokkerende virkningen av et virus, eller spesielt, en retroviral vektor som har et gen for en blokkerende forbindelse, kan bli formidlet enten fra innsiden av en følsom celle eller ved utskillelse av en form av det blokkerende proteinet for lokalt å blokkere den sykelige reaksjonen. ;i tilfellet med HIV, er de to forbindelsene som reagerer gp 120/gp 41 kapselproteinet og CD4 reseptormolekylet. Således, ville en passende blokker være en vektorkonstruksjon som uttrykker enten en HIV env-analog som blokkerer HIV-inngang uten å forårsake sykelige virkninger, eller en CD4 reseptoranalog. CD4-analogen ville bli utskilt og ville fungere ved å beskytte naboceller, mens gp 1207-gp 41 er utskilt eller produsert bare intracellulært for å beskytte bare den vektor-inneholdende celle. Det kan være fordelaktig å tilsette human immunglobulin tunge kjeder eller andre komponenter til CD4 for å øke stabiliteten. Avlevering av en retroviral vektor som koder for en slik hybridløselig CD4 til en vert resulterer i en sammenhengende tilførsel av et stabilt hybridmolekyl. ;Vektorpartikler som fører til uttrykk av HIV env kan også bli laget som beskrevet ovenfor. Det vil være klart til fagmannen hvilke deler som er i stand til å blokkere virus-adsorpsjon uten synlige sykelige bivirknigner (Willey et al., J. Virol. 62:139,1988; Fisher et al., Science 233:655,1986). Det følgende eksempel beskriver konstruksjonen av en CD4 vektor fra hvilke infeksiøse vektorpartikler ble laget. ;EKSEMPEL 3 ;sCD4- vektor ;1. En 1,7 kb Eco R1 - Hind III DNA-fragment fra pMV7.T4 (Maddon et al., Cell 47:333,1986) ble gjort like-endet og koblet til Hine I l-setet av Sk<+. >2. En universell translasjonsterminerings- (avslutning) sekvens som inneholder et Xba I sete ble satt inn i Nhe I setet til CD4 fragmentet. 3. Det 1,7 kb Xho l-CIa t fragment ble skåret ut og klonet inn i Xho I - Cia I sete til pXFVXM. Disse vektorplasmidene kan bli benyttet for å lage infeksiøse vektorpartikler, som beskrevet i eksempel 1. ;Slike infeksjonsblokkerende vektorer, når de blir satt inn i humane T-celle-injer i kultur kan hemme spredningen av HIV-infeksjoner. Utvikling, konsentrasjon og lagring av infeksiøse retrovirale vektorpreparater er som for immunstimulator-en. Tilførselsvei vil også være den samme, med doser omkring 10 ganger høyere. En annen tilførselsvei som kan bli benyttet er uttaking av benmarg, infeksjon med retroviralvektor og tilbakeføring av denne infiserte marg (Gruber et al., Science 230:1057,1985) til pasienten. Siden margreplikasjonen (formeringen) vil forsterke vektorproduksjonen via cellereplikasjon, kan doser i området av immunstimulator-en bli benyttet (10<5->10<6>/kg kroppsvekt). ;I ethvert tilfelle, kan effektiviteten av behandlingen bli målt ved å undersøke de vanlige indikatorene på sykdomsutvikling, inkludert antistoffnivå, virusantigen-produksjon, infeksiøse HIV-nivåer, eller nivåer med ikke-spesifikke infeksjoner. ;III. Produksjon av hielpeforbindelser ;Fremgangsmåter som er lik de beskrevet ovenfor kan bli benyttet for å produsere rekombinante retrovirus med vektorkonstruksjoner som bestemmer produksjonen av en forbindelse (eller "hjelpeforbindelse") som er i stand til å hemme en funksjon til et sykdomsfremkallende middel eller gen. I den foreliggende oppfinnelse, betyr "i stand til å hemme en funksjon" at hjelpemidlet enten direkte hemmer funksjonen eller indirekte gjør dette, f.eks., ved å overføre en forbindelse tilstede i cellene fra en som ikke ville normalt hemme en funksjon til det sykdomsfremkallende middel til en som gjør dette. Eksempler på slike funksjoner for virussykdommer inkluderer adsorpsjon, replikasjon, genuttrykk, sammensetning, og frigjøring av virus fra infiserte celler. Eksempler på slike funksjoner for kreftsykdommer inkluderer cellereplikasjon, følsomhet overfor ytre signaler (f.eks. kontakthemming), og mangel på produksjon av anti-kreftproteiner. ;(i) Inhibitorhielpeforbindelser ;I én del av den foreliggende oppfinnelse, styrer vektorkonstruksjonen uttrykket av antisens RNA (eller komplementært RNA) til RNA fra et sykdomsfremkallende virus, slik som HIV (eller et sykdomsfremkallende gen, slik som et onkogen), for derved å hemme dens replikasjon eller sykdomsfremkallende effekt. Slik produksjon kan enten være vesentlig kontinuerlig eller som svar på nærværet i cellen av en annen forbindelse forbundet med den sykelige tilstanden (en "identifiserende forbindelse"). Alternativt, produksjonen kan være vevsspesifikk p.g.a. enten målbestemt opptak av vektor eller p.g.a. vevsspesifikke kontrollsekvenser i vektoren. ;I én utførelsesform, kan retrovirus som uttrykker RNA komplementært til nøkkelpatogene gentranskripter (f.eks., et virusgenprodukt elier et aktivert cellulært onkogen) bli benyttet for å hemme translasjon av transkriptet til protein, slik som hemmingen av translasjon av HIV tat-proteinet. Siden produksjon av dette protein er vesentlig for virusreplikasjon, ville cellene som inneholder vektoren være motstandsdyktig til HIV-replikasjon. ;I en annen utførelsesform, der den patogene forbindelse er en enkelttrådet virus som har et pakkesignal, vil RNA komplementær til viruspakkesignalet (f.eks. et HIV-pakkesignal når hjelpeforbindelsen er rettet mot HIV), bli uttrykt, slik at forbindelsen til disse molekylene med viruspakkesignalet vil, i tilfellet med retrovirus, hemme stammesløyfedannelsen eller tRNA "primer" (mal) malbinding som er krevet for riktig inn-kapsling eller replikasjon av retrovirus RNA-genomet. ;I en tredje utførelsesform, kan en retroviral vektor bli innført som produserer et protein som reagerer med den sykelige tilstanden. I tilfellet med HIV, er ett eksempel et mutert tat-protein som mangler evnen til å transaktivere (cytoplasmatisk gen-påvirkning) gen-ekspresjon fra HIV LTR og påvirker (på en transdominerende måte) den normale funksjonen til tat-proteinet. En slik mutant er blitt identifisert for HTLV ll-tat-protein ("XII Leu<5>" mutant; se Wachsman et al., Science 235:674,1987). En mutert transundertrykker (transrepressor) tat burde hemme replikasjon på samme måte som vist for en analog mutert repressor i HSV-1 (Friedmann et al., Nature 335:452,1988). ;Et slikt transkripsjonsrepressorprotein kan bli valgt fra vevskultur ved bruk av enhver virusspesifikk transkripsjons-promotor hvis aktivering er stimulert ved et virusspesifikt transaktiverende protein (som beskrevet ovenfor). I det spesifikke HIV-tilfellet, vil en cellelinje som uttrykker HIV tat-protein og HSVTK-genet uttrykt av HIV-promotoren dø inærværet av ACV. Imidlertid, hvis en rekke muterte tat-gener blir innført i systemet, vil en mutant med de rette egenskapene (dvs. å undertrykke transkripsjon fra HIV-promotoren i nærværet av villtype-tat) gro og bli utvalgt. Det muterte genet kan så bli isolert igjen fra disse cellene. En cellelinje som inneholder mange kopier av det aktiverbare dødelige vektor/tat-systemet kan bli benyttet til å forsikre at overlevende cellekloner ikke blir forårsaket av endogene mutasjoner i disse genene. Et batteri med vilkårlig muterte tat-gener blir så innført i disse cellene ved bruk av en "gjenvinnbar" retroviral-vektor (dvs. en som uttrykker det muterte tat-proteinet og inneholder et bakterieorigo (startsted) for replikasjon og legemiddelmotstandsmarkør for vekst og seleksjon i bakterier). Dette tillater et stort antall av tilfeldige mutasjoner å bli undersøkt og tillater etter-følgende enkel molekylær kloning av den ønskede muterte cellelinje. Denne fremgangsmåten kan bli benyttet for å identifisere og benytte mutasjoner i en rekke av virale transkripsjonsaktivator/virale promotorsystemer for mulig antivirale behandlinger. ;I en fjerde utførelsesform, blir HSVTK-genproduktet benyttet til å metabolisere mer effektivt mulige antivirale nukleosidanaloger slik som AZT eller ddC. HSVTK-genet blir uttrykt under kontroll av en permanent virksom makrofag eller T-cellespesifikk promotor og innført i disse celletypene. AZT (og andre nukleosidantivirale forbindelser) må bli metabolisert ved cellulære mekanismer til nukleotidtrifosfatformen for å spesifikt hemme retrovirusrevers transkriptase og således HIV-replikasjon (Furmam et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:8333-8337,1986). Vedvarende aktiv uttrykk av HSVTK (et nukleotid og nukleotid-fosfatkinase med meget bred substratspesifisitet) resulterer i en mer effektiv metabolisme av disse forbindelser til deres aktive nukelotidtrifosfatform. AZT eller ddC-behandling vil derved være mer effektiv, og tillate lavere doser, mindre generell gifitighet, og høyere virkning (potens) mot pågående infeksjon. Ytterligere nukleosidanaloger hvis nukleotidtrifosfatformer viser selektivitet for retrovirus revers transkriptase, men, som et resultat av substratspesi-fisiteten til cellulært nukleosid og nukleotidkinaser ikke blir fosforylert, vil bli gjort ytterligere effektive. En beskrivelse av denne fremgangsmåten er vist i eksempel 4. ;EKSEMPEL 4 ;Vektorer laget for å potensiere den antivirale effekt av AZT og analoger ;I. Alle følgende retrovirale vektorer er basert på "N2"-vektoren (se Keller et al., Nature 318:149-154,1985). Følgelig, ble 5' og 3' Eco R1 LTR fragmenter (hhv. 2,8 og 1,0 kb) opprinnelig subklonet i plasmider som inneholdt polylinkere (inn i SK+ til å gi pN2R5[+/=]; inn i pUC31 til å gi p31N2R5[+/-] og p31N2R3[+/-] ;for å underlette vektorkonstruksjon. I ett tilfelle, ble et 1,2 kb Cia l/Eco R1 5' LTR-fragment subklonet inn i de samme seter til en SK+ vektor til å gi pN2C. I et annet tilfelle, ble 5' LTR som inneholdt en 6 bp fjernelse (delesjon) av splicingsekvensen (splice donor sekvens) subklonet som et 1,8 kb Eco R1 fragment inn i pUC31 (p31N25delta[+]). Den kodende regionen og transkripsjonstermineringssignaler til HSV-1 thymidinkinasegenet ble isolert som en 1,8 kb Bgl ll/Pvu II fragment fra plasmid 322TK (3,5 kb Barn H1 fragment av HSVTK klonet inn i Barn H1 til pBR322) og klonet inn i Bgl ll/Sma I fordøyet pUC31 (pUCTK). For konstruksjoner ;som krever fjernelse av terminatorsignalene, ble pUCTK fordøyet med Sma I og Barn H1. De gjenværende kodede sekvenser og Barn H1 overhengende ender ble rekonstituert med et dobbelttrådet oligonukleotid laget fra de følgende oligomerer: ;under dannelse av konstruksjonen pTK delta A. ;For diagnostiske formål, ble oligoene laget for å ødelegge Sma l-setet mens AVA l-setet ble beholdt uten å forandre det translaterte proteinet. ;De 0,6 kb HIV promotorsekvensene ble klonet som et Dra I/Hind III-fragment fra pCV-1 {se Arya et al., Science 229:69-73,1985) inn i Hine Il/Hind III-kuttet SK<+> (SKHL). ;A. Konstruksjon av TK- 1 og TK- 3 retrovirale vektorer ( se figur 6) ;1. Det 5 kb Xho I/Hind III 5' LTR og plasmidsekvenser ble isolert fra p31N2R5(+). 2. HSVTK kodende sekvenser som mangler transkripsjonene slutt-sekvenser ble isolert som 1,2 kb Xho l/Bam H1 fragment fra pTKdeltaA. 3. 3" LTR sekvenser ble isolert som et 1,0 kb Barn H1/hind ill-fragment fra pN2R3(-). 4. Fragmentene fra trinn 1-3 ble blandet, bundet sammen, transformert inn i bakterier, og individuelle kloner identifisert ved restriksjonsenzymanalyse (TK-1). 5. TK-3 ble konstruert ved å linearisere TK-1 med Barn H1, utfylling av 5' overhenget og gjort like-endet for kobling til et 5'-utfylt Cia I fragment som inneholdt den bakterielle lac UV5 promotor, SV40 tidlig promotor, pluss Tn5 Neo<r->genet. Kanamycinmotstandsdyktige kloner ble isolert og individuelle kloner ble undersøkt for den riktige orientering ved restriksjonsenzymanalyse. ;Disse konstruksjoner ble benyttet for å lage infeksiøse rekombinante vektorpartikler i samband med en pakkekompetent cellelinje, slik som PA317, som beskrevet ovenfor. ;Tilførsel av disse retrovirale vektorer til human T-celle og makrofag/mono-cyttcellelinjer kan øke deres motstandsdyktighet til HIV i nærværet av AZT og ddc sammenlignet med de samme celler uten retroviral vektorbehandling. ;Utvikling, konsentrasjon og lagring av de retrovirale vektorpreparater vil være som beskrevet ovenfor. Behandling vil være som tidligere beskrevet, men ex corpore (utenfor legemet) behandling av pasientenes celler vil ta sikte på ikkeinfiserte potensielt mottakelige T-celler eller monocytter. Én foretrukket fremgangsmåte for å målbestemme den følsomme cellen er med vektorer som bærer HIV env eller hybrid env (se seksjon VIII cellelinjespesifikke retrovirus, nedenfor) for å dirigere absorpsjon av vektorpartikler til CD<+->celler. Normale voksne har omkring 5 x 10<9> T4-celler i blodet totalt og omkring det samme antall monocytter. ;En foretrukket fremgangsmåte for tilførsel vil være leukoforese, hvor omkring 20% av et individs PBLs kan bli fjernet på én gang og manipulert in vitro. Således, omkring 2 x 10<9> celler ville bli behandlet og erstattet. Siden de vanlige maksimumtitere er rundt 10<6>/ml, ville dette kreve 2 til 20 liter av startvirus-supernatant. Gjentatte behandlinger vil bli foretrukket. Alternativt, vil benmarg bli behandlet og tillatt å forøke effekten som beskrevet ovenfor. Behandling med AZT ville være lavere enn normale nivåer for å unngå giftige bivirkninger, men fremdeles hemme effektivt spredningen av HIV. Tidsforløpet for behandling vil bli fulgt som beskrevet for blokkeren. ;En femte utførelsesform for å produsere hemmende hjelpemidler omhandler produksjonen av defekte blokkerende virale strukturelle proteiner, som hemmer virussammensetningen. Vektorer ville kode for defekt gag, pol, env eller andre viruspartikkelproteiner eller peptider, og disse ville hemme på en dominerende måte sammensetningen av viruspartikler. Dette skjer p.g.a. at reaksjonen mellom normale subenheter av viruspartikkelen blir forstyrret p.g.a. reaksjon med de defekte subenhetene. ;En sjette slik utførelsesform inkluderer produksjonen av hemmende peptider spesifikke for virusprotease. Virusprotease klyver det virale gag og ;gag/pol-proteinene i et antall av mindre peptider. En svikt i denne spaltingen fører i alle tilfeller til fullstendig hemming av produksjon av infeksiøse retroviruspartikler. HIV-proteasen er kjent å være en aspartylprotease, og disse er kjent å bli hemmet av peptider laget fra aminosyrer fra protein eller analoger. Vektorer for å hemme HIV vil uttrykke én eller multiple sammenkoblede kopier av slike peptidinhibitorer (hemmere). ;En syvende utførelsesform omhandler tilførselen av supressorgener som, når fjernet eller ikke uttrykt i en celle-type fører til svulstutvikling i den celletypen. Gjeninnføring av det fjernede genet ved hjelp av en virusvektor fører til tilbake-dannelse av svulstcellene blant disse celler. Eksempler på slike kreftformer er retinoblastoma og Wilms svulst. Siden malignitet (ondartethet) kan bli betraktet å være en hemming av den endelige cellulære differensiering (utvikling) sammenlignet med cellevekst, vil den retrovirale overføring og utrykk av genproduktene som leder til differensiering av en svulst også kunne generelt føre til tilbake-dannelse. ;I en åttende utførelsesform, tilveiebringer retroviruskonstruksjonen en terapeutisk virkning ved å innsette seg selv i et virus, onkogen eller patogent gen, og derved hemme en fuksjon som kreves for sykdomsutvikling. Denne utførelses-form krever overføring av retrovirusintegrering i et spesifikt sete i genomet ved hjelp av homolog rekombinasjon (homolog hybridisering) integrasemodifisering, eller andre fremgangsmåter (beskrevet nedenfor). ;(ii) Kondisjonerte ( aktiverbare) giftige hielpeforbindelser ;En annen strategi for å hemme et sykdomsfremkallende middel er å uttrykke en hjelpeforbindelse som er giftig for cellen som uttrykker den sykelige tilstanden. I dette tilfellet, ekspresjon av hjelpeforbindelsen fra den provirale vektor skulle bli begrenset ved nærværet av bestemte intracellulære signaler som identifiserer sykdomstilstanden for å unngå ødeleggelse av ikke-sykdomsfremkallende celler. Denne celletype-spesifisitet kan også bli overført på nivået av infeksjonen ved å målbestemme rekombinante retrovirus som bærer vektoren til celler som har eller blir følsomme for den sykelige tilstanden. ;I én utførelsesform av denne fremgangsmåten, bærer et rekombinant retrovirus (fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, et rekombinant MLV retrovirus) en vektorkonstruksjon som inneholder et cytotoksisk gen (slik som ricin) uttrykt fra en hendelsesspesifikk promotor, slik som en cellesyklusavhengig promotor (f.eks. human cellulær thymidin kinase eller transferrin-reseptorpromotorer), som vil være transkripsjonsaktive bare i raskt formerende (prolifererende) celler, slik som svulster. På denne måte, blir raskt formerende celler, som inneholder faktorer som er i stand til å aktivere transkripsjon fra disse promotorer, fortrinnsvis ødelagt ved den giftige forbindelsen produsert av den provirale konstruksjonen. ;I en annen utførelsesform, er genet som produserer den cytotoksiske (cellegiftige) forbindelsen under kontroll av en vevsspesifikk promotor, hvor vevsspesifisiteten er overensstemmende med svulstens opprinnelse. Siden virusvektoren fortrinnsvis integrerer i genomettil replikerende (formerende) ;celler (f.eks., normale leverceller replikerer ikke, mens de i et hepatokarsinom gjør), leder disse to nivåer av spesifisitet (virusintegrasjon/replikasjon) og vevsspesifikk transkripsjonsregulering) til fortrinnsvis drap av svulstceller. I tillegg, hendelsesspesrfikke og vevsspesifikke promotorelementer kan bli kunstig kombinert slik at det cytotoksiske genproduktet blir uttrykt bare i celletyper som imøtekommer begge kriterier (f.eks. i eksemplet ovenfor, kombinerte promotorelementer er funksjonelle bare i raskt formerende leverceller). Transkripsjonskontrollelementer kan også bli forsterket for å øke nøyaktigheten med hensyn til celletypespesifisitet. ;Disse transkripsjonspromotor/enhancerelementer må ikke nødvendigvis være tilstede som en intern promotor (ligge mellom de virale LTR'ene), men kan bli satt til eller erstatte transkripsjonskontrollelementene i virus LTR'ene som selv er transkripsjonspromotorer, slik at situasjonsspesifikk transkripsjonsekspresjon vil opptre direkte fra det modifiserte virale LTR. I dette tilfellet, vil det være nødvendig å etterligne enten situasjonen for maksimal ekspresjon i retro-virale pakkekompetente cellelinjer (f.eks. ved å forandre vekstbetingelsene, og forsyne transregulatorer av ekspresjon eller ved bruk av den riktige cellelinje som et utgangspunkt for en pakkefremmende linje), eller LTR modifikasjonen blir begrenset til 3' LTR U3 regionen, for å oppnå maksimale rekombinante virustitere. I det sistnevnte tilfellet, er etter en runde med infeksjon/integrering det 3' LTR U3 nå også 5<1> LTR U3 som gir den ønskede vevsspesifikke ekspresjon. ;I en tredje utførelsesform, blir proviralvektorkonstruksjonen på samme måte aktivert, men uttrykker et protein som ikke selv er cytotoksisk, og som har inne i målcellene en forbindelse eller et legemiddel med liten eller ingen cytotoksisitet inne i én som er cytotoksisk (et "situasjonsbetinget dødelig" genprodukt). Spesifikt, bærer den provirale vektor-konstruksjon herpes simplex virus thymidin kinase ("HSVTK") genet nedstrøms og under transkripsjonskontrollen av en HIV promotor (som er kjent å være transkripsjonsmessig taust bortsett når det blir aktivert av HIV tat-protein). Produksjon av tat-genproduktet i humane celler infisert med HIV og som bærer den provirale vektorkonstruksjonen forårsaker øket produksjon av HSVTK. Cellene (enten in vitro eller in vivo) blir så utsatt for et legemiddel slik som acyclovir eller dens analog (FIAU, FIAC, DHPG). Disse legemidlene er kjent å bli fosforylert av HSVTK (men ikke av cellulært thymidin kinase) til deres korresponderende aktive nukleotidtrifosfatformer (se f.eks. Schaeffer et al., Nature 272:583,1978). Acyclovir og FIAU-trifosfater hemmer cellulære polymeraser generelt, og leder til den spesifikke destruksjon av celler som uttrykker HSVTK i transgene mus (se Borrelli et al., Proe. Nati. Acad. ;Sei. USA 85:7572,1988). Disse cellene som inneholder den rekombinante vektoren og som uttrykker HIV tat-proteinet blir selektivt drept ved nærværet av en spesifikk dose av disse legemidler. I tillegg, blir et ekstra spesifisitetsnivå oppnådd ved å inkludere i vektoren HIV rev-proteinet, responsive CRS/CAR-sekvenser. I nærværet av CRS-sekvensen blir genekspresjon undertrykket, bortsett fra i nærværet av CAR-sekvensene og rev-proteinet. Eksempel 5 gir en illustrasjon på denne fremgangsmåte. ;EKSEMPEL 5 ;Vektor som situasjonsbetinget potensierer den giftige virkningen til ;ACV eller dets analoqer ;Konstruksjon av vektorer ;A. Konstruksjon av pKTVIHAX ( se figur 7). ;1. En 9,2 kb Asu ll/Xho I fragment ble isolert fra vektor pN2 DNA. ;2. En 0,6 kb Xho I/Barn H1 promotorfragment ble isolert fra plasmid pSKHL. 3. Et 0,3 kb Bg 1 ll/Acc I og en 1,5 kb Acc l/Acc I fragment ble renset fra pUCTK. 4. Fragmentene fra 1, 2 og 3 ble bundet sammen, trans-formert inn i bakterier, og passende Amp%r kloner med den gitte strukturen identifisert av restriksjonsenzymanalyse. B. Konstruksjon av pKTVIH- 5 og PKTVIH5 Neo retrovirale vektorer ( se figur 8) 1. 4,5 kb 5' LTR og vektor ble isolert som et Xho l/Bam H1 fragment fra vektor p31N25delta(+). 2. 1,0 kb 3* LTR ble isolert som en Apa l/Bam H1 fragment fra pN2R3(+) fragment.

3. 0,6 kb HIV pramotorelement ble isolert fra pSKHL som

et Apa l/Eco R1 fragment.

4. HSVTK kodende sekvens og transkripsjonstermineringssekvenser ble isolert som 1,8 kb Eco R1/Sal I fragment fra pUCTK. 5. Fragmentene fra 1 -4 ble kombinert, bundet sammen, transformert inn i bakterier og kloner med den gitte strukturen ble identifisert ved restriksjons-enzymanalyse (pKTVIH-5). 6. pKTVIH5 Neo ble konstruert ved å linearisere pKTVIH5 med Cia I; blande sammen med 1,8 kb Cia I fragment som inneholdt den bakterielle lac UV5 promotor, SV40 tidlig promotor, og Tn5 Neo<r->markør, sammenbinding, transformasjon av bakterier og seleksjon for kanamycinmotstandsdyktighet. Kloner med innskuddet i den indikerte orienteringen ble identifisert ved restriksjonsanalyse.

C. Konstruksjon av MHMTK Neo retrovirusvektor ( se figur 9)

1. Konstruksjon av det midlertidige plasmid MHM-1:

a) Plasmid pN2CR5 ble linearisert ved delvis fordøyelse med Fok I, 5' overhengige utfylt med deoksynukleotidtrifosfater ved bruk av Klenow DNA-polymerase, og Hind III linkere (korte oligonukleotider med restriksjonsenzymseter) satt inn. Etter transformasjon inn i bakterier, ble en klon med en Hind III linker satt inn i MLV LTR Fok I setet identifisert ved restriksjonsenzymanalyse (pN2CR5FH). b) pN2CR5FH ble linearisert med Nhe I, 5" overhenget utfylt med Klenow polymerase fordøyet med Hind III, og et 4,3 kb fragment med promotor-manglende MLV sekvenser isolert. c) 0,5 kb Eco RV/Hind III HIV promotorsekvenser ble isolert fra pSKHL. d) b) og c) ble blandet, bundet sammen og benyttet til å transformere

bakterie, og strukturen til MHM-1 ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse.

2. Et 0,7 kb Eco RV/Bal I fragment isolert fra MHM-1 ble subklonet i Eco RV setet til plasmid I30B (et modifisert IBI30 plasmid som inneholder i tillegg Bgl 11, Bst II, Neo I og Nde I seter i polylinkeren). Etter transformasjon i bakterier, ble kloner med den riktig orientering identifisert ved restrik-sjonsenzymanalyse (pMHMB).

3. pMHMB ble fordøyet med Apa I og Xho I og gelrenset.

4. MHM-1 ble fordøyet med Apa l/Bam H1 og det 1,8 kb MHMLTR/- ledersekvens gelrenset. 5. Et 2,8 kb Bgl Il/Sal I fragment som inneholdt HSVTK kodende region oppstrøms for SV40 tidlig promotor som kontrollerte Neo<r> tatt fra pTK-3 (se figur 3). 6. 3-5 ble blandet, bundet sammen og benyttet til å transformere bakterier, og passende kloner ble identifisert ved restriksjonsenzymanalyse.

D. Konstruksjon av tat og anti- tat ekspresjonsvektorer ( se figur 10)

Disse vektorene blir benyttet som pseudo-HIV for å prøveaktivere tat-avhengige HSVTK-vektorer. 1. His<r->ekspresjonsvektor pBamHis ble linearisert med Barn H1 og behandlet med kalvetarmfosfatase. 2. Sac I setet av pCV-1 ble mutert til et Barn H1 sete og 350 bp Barn H1 kodende sekvens fra HIV tat ble isolert. 3. Fragmentene renset i trinn 1 og 2 ble blandet, bundet sammen og benyttet for å transformere baktier, og klonene med tat i begge orienteringene ble identifisert ved restriksjons-enzymanalyse.

Disse konstruksjonene ble benyttet for å lage infeksiøse rekombinante vektorpartikler sammen med en pakkekompetent cellelinje slik som PA317, som beskrevet ovenfor.

De biologiske egenskapene til disse retrovirusvektorene er beskrevet heretter. HIV tat-genet ("tathis" vektor - se figur 10) ble transfektert inn i mus PA317 celler. Fem individuelle histidinol-motstandsdyktige subkloner ble oppnådd (TH 1-5) som uttrykker HIV tat. Disse cellene er således en eksperimentell modell for HIV infeksjon. Vektorene KTVIHAX, KTVIH5NEO og MHMTKNEO, ble deretter innført ved infeksjon inn i disse tat-produserende cellelinjer så vel som deres foreldre-cellelinje som mangler tat. Cellelevedyktighet ble så bestemt for forskjellige konsentrasjoner av HSVTK-spesifikke cytotoksiske legemiddel, acyclovir. Resultatene er referert her som LD50 (legemiddelkonsentrasjon der 50% toksisitet (gifitighet) blir observert). Foreldrecellelinjen som inneholdt vektoren, men manglet tat (ikke-HIV-infisert modell) viste ikke noe målbar toksisitet ved ACV ved de konsentrasjonene som ble prøvet (se figur 11). Disse cellene krever således 100 \ iM ACV eller større for cytotoksisitet. Dette er også sant for disse celler som mangler vektorene. Således vektorene alene, ACV alene, eller endog vektor +ACV (faste symboler) er ikke cytotoksisk. Imidlertid, cellelinjer som uttrykker HIV tat (den eksperimentelle representasjon av en HIV infeksjon) er effektivt drept av ACV. Dette er riktig til varierende grad for alle tre vektorer som ble prøvet. Disse resultater antyder at HIV-infiserte celler vil bli drept i nærvær av ACV og "potensierings"vektorer.

På samme måte, HIV infeksjon av humane T-cellelinjer +/- Fl AU viser en fortrinnsvis hemming (gjennom celledrap) av HIV-infeksjon. Kulturer ble først behandlet med vektor, så utfordret med lav multiplisitets (bredspektret) HIV-infeksjon for 4 dager. Virussupernatanter ble titrert ved bruk av HIV, som beskrevet i seksjon IV.

I tilfellet med HIV-infiserte celler, ble ekspresjon av det situasjonsbetingede dødelige HSVTK-genet gjort endog mer HIV-spesifikk ved å inkludere cis-virkende elementer i tran-skriptet ("CRS/CAR"), som krever et ytterligere HIV genprodukt, rev, for optimal aktivitet (Rosen et al., roe. Nati. Acad. Sei. USA 85:2071,1988). Mer generelt, har cis-elementer tilstede i mRNA blitt vist i visse tilfeller å regulere mRNA-stabilitet eller translaterbarhet. Sekvenser av denne typen (dvs. post-transkripsjonell regulering av genekspresjon) kan bli brukt for hendelses- eller vevsspesifikk regulering av vektor-genekspresjon. I tillegg, multimerdannelse av disse sekvenser (det betyr rev-responsive (følsomme) "CRS/CAR" eller tat-responsive "TAR" elementer for HIV) kunne resultere i endog større spesifisitet. Det bør bemerkes at denne form for situasjonsaktivering av en inaktiv forløper til et aktivt produkt i celler også kan bli oppnådd ved bruk av andre virusvektorer med en kortere tidseffekt, f.eks. adenovirusvektorer.

Produksjon, konsentrasjon og lagring av vektorpreparater er som tidligere beskrevet. Tilførsel er ved direkte in vivo tilførsel som tidligere eller ved ex cor<p>ore behandling av PBL og/eller benmarg. Doser vil være omtrent på samme nivåer som for eksempel 4. Målbestemmelse av virusvektoirnfeksjon vil ikke være gjennom CD4-reseptoren, men kan være utført ved å lage vektorpartiklene med hybrid MLV env-CD4 "kapsel" proteiner (se seksjon VII) målrettet mot gp 120 produserende celler (dvs. de infisert med HIV). Denne omformingen av den normale virusreseptorreaksjon for å målbestemme virusinfiserte celler kan bli benyttet med alle typer virus.

På en lignende måte som i den foregående utførelsesformen, kan den retrovirale vektorkonstruksjon bære et gen for fosforylering, fosforibosylering,

ribosylering eller annen metabolisme av et purin- eller pyrimidin-basert legemiddel. Dette genet kan ikke ha noen tilsvarende ekvivalent i pattedyrceller og kan komme fra organismer slik som et virus, bakterie, svamp eller protozoan. Et eksempel på dette ville være E. coli guaninfosforibosyltransferasegenproduktet, som er dødelig i nærvær av tioxantin (se Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7:4139-4141,1987). Situasjonsbestemte dødelige genprodukter av denne type har mulig anvendelse innenfor mange nåværende kjente purin- eller pyrimidinbaserte antikreftlegemidler, som ofte krever intracellulær ribosylering eller fosforylering for å bli effektive cytotoksiske midler. Det situasjonsbetingede dødelige genproduktet kunne også metabolisere et ikke-giftig legemiddel, som ikke er en pyrin eller pyrimidinanalog, tii en cytotoksisk form.

Pattedyrvirus generelt synes å ha "straks tidlig" gener som er nødvendig for etterfølgende transkripsjonsaktivering fra andre virale promotorelementer. Genprodukter av denne type er utmerkede kandidater for intracellulære signaler (eller "identifiserende forbindelser") i virusinfeksjon. Således situasjonsbetingede dødelige gener fra transkripsjonspromotor-elementer som reagerer på disse virus "straks tidlig" gen-produktene kunne spesifikt drepe celler infisert med ethvert virus. I tillegg, siden de humane a og p interferonpromotor-elementer er transkripsjonsmessig aktivert som svar på infeksjon med en lang rekke ikke-relaterte virus, kunne introduksjonen av vektorer som uttrykker et situasjonsbetinget dødelig genprodukt som HSVTK, f.eks., fra disse virusfølsomme elementer (VRE) resultere i ødeleggelsen av celler infisert med en rekke forskjellige virus.

I en fjerde utførelsesform, bærer det rekombinante virus et gen som koder for et produkt som ikke selv er toksisk, men når det blir behandlet av en protease spesifikt til et virus eller annen patogen blir overført til en toksisk form.

I en femte utførelsesform, kan retroviruskonstruksjonen uttrykke et "rapportprodukt" på overflaten av målcellene som svar på tilstedeværelsen av en identifiserende forbindelse i cellene (slik som HIV tat-protein). Dette overflateprotein kan bli gjenkjent av et cytotoksisk middel, slik som antistoffer for rapport-proteinet eller ved cytotoksiske T-celler. På en lignende måte, kan et slikt system bli benyttet som målsystem (se nedenfor) for enkel identifisering av de celler som

har et spesielt gen som uttrykker et identifisert protein, slik som HIV tat-genet.

På lignende måte, i en sjette utførelsesform, kunne et overflateprotein bli uttrykt som selv kunne være terapeutisk nyttig. I det spesifikke tilfellet med HIV, kan produksjon av det humane CD4 proteinet i HIV-infiserte celler være fordelaktig på to måter: 1. Binding av CD4 til HIV env intracellulær kunne hemme dannelsen av viable virale partikler meget som løselig CD4 har blitt vist å gjøre for fritt virus, men uten problemet med systemutskillelse (virus) og mulig immungenisitet, siden proteinet vil få bli membranbundet og er strukturelt identisk til endogen CD4 (til hvilken pasienten skulle være immunologisk tolerant). 2. Siden CD4/HIV env komplekset er blitt implisert som en årsak til celledød, leder ytterligere produksjon av CD4 (i nærværet av overskudd HIV-env tilstede i HIV-infiserte celler) til en raskere celledød og således hemmer viral spredning. Dette kan være spesielt brukbart med hensyn på monocytter og makrofager, som virker som et reservoar for virusprduksjon som et resultat av deres relative motstandsdyktighet til HIV-formidlet cytotoksisitet (som, i gjengjeld, er tilsynelatende forårsaket av den relative mangel på CD4 på deres celleover-flater).

(iii) Immunnedregulering

Spesifikk nedregulering av unormale eller ikke-ønskede immunsvar, slik som i kronisk hepatitt eller i transplantasjon av heterologt vev slik som benmarg, kan bli tilvirket ved bruk av anti-MHC klasse I gener, slik som immunndertrykkende virale gener. Gruppe C adenoviruser Ad2 og Ad5 besitter en 19 kd glykoprotein (gp 19) kodet for i E3 regionen i virus. Dette gp 19 molekylet binder til klasse I MHC-molekyler i det endoplasmatiske retikulum av cellene og forhindrer terminal glykosylering og translasjon av klasse I MHC til celleoverflaten. F.eks., før benmargtransplantasjon kan donor benmargceller bli infisert med gp 19-kodende vektorkonstruksjoner som etter produksjon av gp 19 hemmer overflateekspresjon av MHC klasse I transplantasjonsantigener. Disse donorcellene kan bli transplantert med mindre risiko for transplatforkastelse og kan kreve en minimal immunundertrykkende behandling med tanke på den transplanterte pasienten. Dette kan tillate en aksepterbar donor-mottaker chimer tilstand å eksistere med færre komplikasjoner. Lignende behandlinger kan bli benyttet for å behandle området av såkalt autoimmunsykdommer, inklusive lupuserythromiatis, multippel sklerose, reumatoid artritt eller kronisk hepatitt B-infeksjon.

IV. Ekspresjon av markører

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten med hensyn til å uttrykke en hjelpeforbindelse i en celle, som svar på en viss identifiserende forbindelse, kan også bli modifisert til å muliggjøre oppdagelse av et bestemt gen i en celle som uttrykker et identifiserende protein (f.eks., et gen båret av en spesielt virus), og derfor tillater påvisning av celler som bærer det virus. I tillegg, tillater denne fremgangsmåte påvisningen av virus (slik som HIV) i en klinisk prøve med celler som bærer et identifiserende protein forbundet med viruset.

Denne modifikasjon kan bli utført ved å lage et genom som koder for et produkt, tilstedeværelsen av dette kan bli lett identifisert ("markørprodukt"), og som bærer en promotor, som reagerer på tilstedeværelsen av det identifiserende proteinet i indikatorceller, ved å forandre ekspresjon av rapportproduktet mellom produksjon og ikke-produksjonstilstander. F.eks. HIV, når det infiserer passende indikatorceller, lager tat og rev. Indikatorcellene kan således bli laget med et genom (slik som ved infeksjon med et passende rekombinant retrovirus) som koder for et markørgen, slik som alkalisk fosfatasegenet, p-galaktosidase-genet eller luciferasegenet, og en promotor, slik som HIV-promotoren, som kontrollerer ekpresjon av markørgenet. Når indikatorcellene blir utsatt for en klinisk prøve som skal testes og prøven inneholder HIV, blir indikatorcellene infisert med HIV, og det resulterer i tat og/eller rev produksjon (et identifiserende protein) i dette. HIV ekspresjonskontroller i indikatorcellene kunne så svare på tat-og/eller rev-proteiner ved å forandre ekspresjon av gener som koder for ååå-galaktosidase, luciferase, eller alkalisk fosfatase (markørprodukter) fra normalt "av" til "på". I tilfellet med p-galaktosidase eller alkalisk fosfatase, vil eksponering av cellene til substrat-analoger resultere i en farge eller fluorescensforandring hvis prøven er positiv for HIV. I tilfellet med luciferase, vil utsetting av prøven for luciferin resultere i luminescens hvis prøven er positiv for HIV. For intracellulære enzymer slik som p-galaktosidase, kan virustitere bli målt direkte ved å telle fargede eller fluorescerende celler, eller ved å lage celle-ekstrakter og utføre en passende måling. For utskilte enzymer, slik som en forandret form av alkalisk fosfatase, blir små prøver av kultursupernatanten målt med hensyn til aktivitet, og tillater kontinuerlig måling av en enkel kultur over tid. Således kan forskjellige former av dette markørsystem bli benyttet for ulike formål. Disse inkluderer telling av aktiv virus eller ved følsom og enkel måling av virusspredning i en kultur og hemmingen av denne spredning ved hjelp av forskjellige legemidler. Videre spesifisitet kan bli innført i det foregående systemet ved å teste for tilstede-værelsen av virus enten med eller uten nøytraliserende antistoffer mot det virus. F.eks. i en del av den kliniske prøven som blir testet, kan nøytraliserende antistoffer til HIV være tilstede; mens i en annen del vil det ikke være noen nøytraliserende antistoffer. Hvis prøvene var negative i systemet hvor det var antistoffer og positive hvor det ikke var noen antistoffer, ville dette tjene til å bekrefte tilstedeværelsen av HIV.

Med et analogt system for en in vitro-metode. kan tilstedeværelsen av et bestemt gen, slik som et virusgen, bli bestemt i en celleprøve. I dette tilfellet, er cellene i prøvene infisert med en passende retrovirusvektor som bærer rapportgenet bundet til ekspresjonskontrollene fra det interessante virus. Rapportgenet, vil etter å bli opptatt i prøvecellene, uttrykke sitt rapportprodukt (slik som p-galaktosidase eller luciferase) bare hvis vertscellen uttrykker de riktige virale proteinene.

Disse metodene er raskere og mer sensitive siden rapportgenet kan uttrykke en større mengde rapportprodukt enn den identifiserende forbindelse tilstede, som resulterer i en forsterkningseffekt. Eksempel 6 beskriver en representativ fremgangsmåte for å oppdage et gen som uttrykker et identifiserende protein.

EKSEMPEL 6

HIV- spesifikt markørs<y>stem eller fremgan gsmåte

A. Konstruksjoner

Rapportkonstruksjoner under kontroll av HIV-ekspresjonssystemet er vist i figur 12 (en rekombinant retrovirusvektor) og i figur 13 (et enkelt plasmid brukt ved transfeksjon). Delene av disse foretrukkede vektor- og plasmid rapportører ble oppnådd som følger: Det retrovirale skjelett ble oppnådd fra konstruksjonen pAFVXM (Krieger et al., Cell 38:384,1984), som hadde blitt linearisert ved bruk av Xho I og Cia I. SV2neo ble oppnådd fra plasmidet pKoneo (Hanahen, unpubl.) ved isolering av 1,8 kb Cia l-fragmentet.

HIV LTR ble isolert som en 0,7 kb Hind III fragment fra plasmid pC15CAT (Arva et al., Science 229:69,1985). Beta-gal ble oppnådd fra plasmidet pSP65 gal (Cepko, pers. comm.) som et Hind Ill-Sma l-fragment. En utskilt form av human placenta alkalisk fosfatase ble laget ved innføring av en universell temrinatorsekvens etter aminosyre 489 i den celleoverflateformen til alkalisk fosfatase (som beskrevet av Berger et al., Gene 66:1,1988). Det utskilte alkaliske fosfatasegen ble isolert som et 1,8 kb Hind III til Kpn I fragment. CRS-CAR-sekvensene fra HIV env ble oppnådd ved å isolere 2,1 kb Kpn I til Barn H1 fragment fra HTLVIIIB/BH10R3 (Fisher et al., Science 233:655,1986). Dette fragment ble satt inn i pUC31 linearisert ved Barn Hl, og Kpn I pUC31 er pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33:103,1985) med ekstra Xho I, B-gl II, Bssh II og Neo I seter mellom Eco R1 og Kpn I seter av pUC19. Barn H1 setet i den resulterende konstruksjon ble overført til et Neo I sete for å tillate fjernelse av CRS-CAR sekvensene ved Neo I fordøyelse. SV401 intranet ble oppnådd fra pSVOL (de Wet et al., Mol. Cell. Biol 7:725,1987) som et 0,8 kb Neo I til Barn H1 fragment.

B. Indikatorceller og retrovirusvektorer

Humane T-celle (H-9, CEM og Sup T1) og monocytt (U-937) cellelinjer ble oppnådd fra ATCC og holdt i RPM1 1640 medium supplert med 10% fetalt bovinserum og 1% penicillin/streptomycin.

De ikke-retrovirale vektorene ble innført i cellelinjene ved elektroporering ved bruk av BioRad genpulser. Cellelinjene ble selektert i G-418 (1 mg/ml) i 2-3 uker for å oppnå stabile G-418R-cellelinjer, og så klonet ved fortynning for å oppnå klonale cellelinjer.

pAF-vektorer ble transfektert inn i PA1317 pakkekompetente cellelinjer som et kalisumfosfatpresipitat (Wigler et al., Cell 16:777,1979). Virusproduserende PA317 celler ble samdyrket med humanmonocyttcellelinjer i 24 timer i nærværet av polybren, etter hvilken cellesuspensjon ble fjernet og selektert i G-418 og subklonet som ovenfor.

C. Metode

Stabile cellelinjer ble infisert med HIV (HTLV lllB) og cellene (p-gal) eller medium (alkalisk fosfatase) mått på daglig basis i 6 dager etter infeksjonen.

B- galaktosidasemetode

Infiserte celler kunne bli målt ved enten:

(i) In situ histokjemisk farging som beskrevet av MacGregor et al. Somatic Cell and Mol Genetics 13:253,1987); eller (ii) ved bruk av ekstrakter i en løsnings-enzymatisk metode med ONPG somet substrat (Norton and Coffin, Mol. Cel. Biol. 5:281,1985).

Løselig alkalisk fosfatasemetode

Medium ble fjernet fra infiserte celler, sentrifugert i 10 sekunder, og så varmet ved 68°C i 10 min. for å ødelegge endogene fosfataser. Mediet ble så sentrifugert i 2 min. og en prøve (10-50 fjernet for måling. 100 ul buffer (1 M dietanolamin, pH 9,8; 0,5 Mm MgCI2; 10 mM L-homoarginin) ble tilsatt og så ble tilsatt 20 \ i\ av 120 mM p-nitrofenylfosfat (i buffere). A450 i reaksjonsblandingen ble avlest ved bruk av automatisk skålleser.

Figurene 14 og 15 viser typiske resultater på et tidsforløp av infeksjon av Sup T1 celler ved bruk av alkalisk fosfatasemetoden i nærvær av forskjellige konsentrasjoner antiviruslege-midler. Den "+" og "-" på dag 6 betyr nærvær eller fravær av syncytium.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver et antall andre metoder (beskrevet nedenfor) som kan bli benyttet med retrovirusvektorsystemer brukt ovenfor, for å øke deres prestasjon. Alternativt, kan disse metodene bli benyttet med andre genleveringssystemer.

V. Seleksjon av pakkekompetente celler

Denne side av den foreliggende oppfinnelse er basert delvis på oppdagelsen av hovedårsakene til lave rekombinante virustitere fra pakkekompetente celler, og på fremgangsmåter for å rette på disse årsakene. I grunnen kan minst fem faktorer bli fremsatt som årsaker for lav rekombinant virustitere: 1. begrenset tilgjengelighet av virale pakkeproteiner; 2. begrenset tilgjengelighet på retrovirale vektor RNA-genomer; 3. begrenset tilgjengelighet på cellemembran for frigjøring av de rekombinante retrovirus;

4. begrensede indre pakkeeffektivitet til retrovirus-vektorgenomet; og

5. tettheten av reseptoren som er spesifikk for kapselen til en gitt retrovirus.

Som bemerket ovenfor, er den begrensede tilgjengelighet på virale pakkeproteiner den første begrensende faktor i rekombinant retrovirusproduksjon i pakkekompetente celler. Når nivået av pakkeprotein i pakkekompetente celler blir øket, øker titere til omkring 10<5> infeksiøse enheter/milliliter, etter dette har økende pakkeproteinnivåer ingen videre effekt på titrene. Imidlertid, titere kan bli videre øket ved også å øke nivået på retrovirusvektorgenomtilgjengelighet for pakking. Således som beskrevet herved er det fordelaktig å velge produksjonsceller

som lager maksimumsmengder pakkeproteiner og retrovirale vektorgenomer. Det er blitt oppdaget at metodene for å identifisere, og således utvelge, pakkekompetente celler og produksjonsceller, beskrevet tidligere under kapitlet "Oppfinnelsens bakgrunn" synes å lede til valg av mange produksjonsceller som lager lave titere for grunnene beskrevet nedenfor.

Den foreliggende oppfinnelse tar fordel av det tidligere uheldige faktum at proteinekspresjonsnivået av et gen nedstrøms fra 5' LTR eller andre promotorer, og skilt fra denne ved et mellomliggende gen, er vesentlig mindre enn hvis det mellomliggende gen var fraværende. I den foreliggende oppfinnelse, er det utvalgte genet plassert nedstrøms fra et gen i pakkegenomet eller genet av interesse båret av vektorkonstruksjonen, men er fremdeles transkribert under kontroll av den virale 5' LTR eller andre promotorer uten tilførsel av noen splicingdonor eller splicingakseptorseter. Derved oppnås to ting. Først siden pakkegenene eller genene av interesse er nå oppstrøms uten mellomliggende gen mellom seg og promotoren, vil deres korresponderende proteiner (pakkeprotein eller protein av interesse) bli uttrykt i høyere grad (5- til 20 ganger) enn det utvalgte proteinet. For det andre, vil det utvalgte proteinet bli uttrykt på et lavere nivå, med fordeling av ekspresjonsnivå som varierer mot lavere nivåer. I tilfellet med phleo<r->proteinet, blir denne forandring i distribusjon illustrert av den stiplede kurven vist i figur 16. Imidlertid, forblir seleksjonsnivået for motstand mot phleomycin det samme, slik at bare de topp effektive produserende celler overlever. Nivåene av pakke-proteinet eller av proteinet av interesse vil fremdeles være proporsjonal, bare i dette tilfellet, korresponderer et høyere nivå av utvalgt protein til meget høyere nivåer av pakkeprotein eller protein av interesse.

Fortrinnsvis, blir den foregående fremgangsmåte utført ved bruk av et plasmid som bærer én av de provirale gag/pol eller env pakkegener, sammen med et første utvelgelsesgen. Disse cellene blir så undersøkt for celler som produserer de høyeste nivåer av protein ved reaksjon med et antistoff mot env (eller mulig gag/pol), et annet fluorescerende antistoff, og så valgt ut på et fluorescensaktivert cellesorteringsinstrument (FACS). Alter-nativt, kan andre undersøkelser for proteinnivå bli benyttet. Deretter, er fremgangsmåten og undersøkelsen gjentatt ved bruk av disse utvalgte celler og den andre av gag/pol eller env pakkegenene.

I første trinn, ville en annen seleksjonsgen (forskjellig fra det første) bli krevet nedstrøms fra pakkegenet og cellene selektert som produserer den største mengde av det andre virale proteinet. Fremgangsmåten og utvelgelsen blir så gjentatt ved bruk av de overlevende cellene, med et plasmid som bærer proviralvektorkonstruksjonen som har genet av interesse og et tredje seleksjonsgen, forskjellig fra det første eller andre seleksjonsgenet. Som et resultat av denne fremgangsmåten, vil celler som produserer høye titere av det ønskede rekombinant retrovirus bli selektert, og disse kan bli dyrket som ønsket for å produsere rekombinant retrovirus. I tillegg, gag og pol kan bli uavhengig innført og selektert for.

Eksempel 7 beskriver konstruksjonen av gag/pol og env plasmidene laget med tanke på å bruke disse fremgangsmåtene.

EKSEMPEL 7

Plasmider konstruert for å lage høye nivåer av pakkeproteiner (figur 7)

1. 2,7 kb Xba I fragment fra pPAM (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431, 1985) som inneholder det amfotrope env-segment, ble klonet i pUC18 i Xba I-setet, så fjernet med Hind Ili og Sma I. Dette fragmentet ble klonet inn i vektor pRSV neo (Gorman et al., Mol. Appl. Genet.1:327,1982) kuttet med Hind III og Pvu II, for å gi pRSV env. Et 0,7 kb Barn H1 til BstE II fragment fra plasmidet pUT507 (Mulsant et al., Somat.Cell. Mol. Genet. 14:243,1988) med BstE II og like-endet bærer den phleoresistenskodende sekvensen. 4,2 kb Barn H1 til Xho I fragment, det kontinuerlige 1,6 kb Xho I til Xba I (Xba I fylt ut) fra RSVenv, og phleofragmentet ble bundet sammen til å gi pRSVenv-phleo. 2. Et fragment fra Pst I setet ved nukleotid 563 til MLY (RNA Tumor Vimses, Vol. II, 1985 Cold Spring Harbor) til Sea I setet ved 5870 ble tatt fra pMLV-K (Miller et al., 185, op. eit.) og klonet i Pst I til Barn H1 (Barn H1 utfylt) fragment fra p4aA8 (Jolly et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:477,1983) som har SV40 promotoren, pBR322 ampicillinresistensen og replikasjonsstart og SV40 poly A sete. Dette gir pSVgp. pSVgpDHFR ble laget ved bruk av de følgende fragmentene: 3,6 kb Hind III til Sal I fragment fra pSVgp som inneholdt SV40 promotoren pluss MLY gag og visse pol sekvenser; 2,1 kb Sal I til Sea I fragmentet fra pMLV-K med resten av pol-genet, 3,2 kb Xba I (Xba I utfylt) til Pst I fragment fra pF400 med DHFR-genet pluss poly A-sete, pBR322 start og halve ampicillinresistensgenet; 0,7 kb Pst I tilHind III fragmentet fra pBR322 med den andre halvdel av ampicillinresistensgenet. Dette gir pSVgp-DHFR. Alle disse konstruksjonene er vist i figur 7. Disse plasmidene kan bli transfektert inn i 3T3 celler eller andre celler og høye nivåer av gag, pol eller env bli oppnådd.

En ytterligere fremgangsmåte for å utføre seleksjon er å benytte en gen-seleksjon i én runde og dens antisens i neste runde. F.eks., gag/pol kan bli innført inn i en HPRT-defekt celle med HPRT-genet og selektert for med hensyn til tilstede-værelsen av dette genet ved bruk av medium som krever HPRT for bruk av puriner. I neste runde, kunne antisens til HPRT bli produsert nedstrøms til env og cellen selektert i 6 tioguanin for den HPRT-defekte fenotypen. Store mengder antisens HPRTville bli krevet for å inaktivere HPRT-gentranskriptene, og en må anta at ingen reversering opptrådte.

Kapselsubstitusjoner

Evnen til å uttrykke gagpol og env-funksjonen separat tillater manipulering av disse funksjoner på en uavhengig måte. En cellelinje som uttrykker store mengder av gagpol kan bli benyttet, f.eks., for å undersøke spørsmål med hensyn til titer når det gjelder env. Én faktor som resulterer i lav titer er tettheten av de riktige reseptormolekylene på målcellen eller vevet. Gitt at env-ekspresjon er fra en adskilt enhet, kan en rekke av kapselgener (som krever forskjellige reseptor-proteiner), slik som xenotrope, polytrope, eller amfotrope envs fra en rekke kilder, bli testet for det høyeste titer på et spesifikt målvev. Videre, kapsler fra ikkegnagerretroviruskilder kan bli benyttet for å pseudotype en vektor. I tillegg, kan hybridkapsler (som beskrevet nedenfor) bli benyttet i dette systemet også, for å følge cellevalget (tropisme) (og effektivt øke titerene) til en retrovirusvektor. Omvendt, kan en cellelinje som uttrykker store mengder av et gitt kapselgen bli benyttet for å undersøke titerspørsel med hensyn til gag og pol.

VI. Alternative virale vektorpakkefremqanqsmåter

To tilleggsalternative systemer kan bli benyttet for å produsere rekombinante retrovirus som bærer vektorkonstruksjonen. Hver av disse systemene tar utgangspunkt i det faktum at insektsvirus, baculovirus, og pattedyrvirus, vaccinia og adenovirus, er blitt nylig tilpasset for å lage store mengder av et gitt protein hvis gen har blitt klonet. F.eks., se Smith et al. (Mol. Cell. Biol. 3:12,1983); Piccini et al. (Meth. Enzymology, 153:545,1987); og Mansour et al.

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1359,1985).

Disse virusvektorer kan bli benyttet for å produsere proteiner i vevskulturceller ved innsetting av riktige gener i virusvektoren og, derfor kunne bli tilpasset å lage retrovirale vektorpartikler.

Adenovirusvektorer kan lages fra nukleære replikerende virus og kan være defekte. Gener kan bli innsatt i vektorer og benyttet til å uttrykke proteiner i pattedyrceller enten ved in vitro konstruksjon (Ballay et al., EMBO J. 4:3861, 1985) eller ved rekombinasjon i celler (Thummel et al., J. Mol. Appl. Genetics 1:435, 1982).

Én foretrukket fremgangsmåte er å lage plasmider ved bruk av adenovirus Major Late Promoter (MLP) som aktiverer (1) gag/pol, (2) env, (3) en modifisert virusvektorkonstruksjon. En modifisert virusvektorkonstruksjon er mulig p.g.a. at U3-regionen til 5" LTR, som inneholder den virale vektorpromotoren, kan bli erstattet ved andre promotorsekvenser (se f.eks. Hartman, Nucl. Acids Res. 16:9345,1988). Denne del vil bli erstattet etter én runde med revers transkriptase av U3 fra 3' LTR.

Disse plasmider kan så bli benyttet for å lage adenovirus-genomer in vitro (Ballay et al., op. eit.), og disse transfekteres inn i 293 celler (en human cellelinje

som lager adenovirus E1A protein), for hvilke adenovirale vektorer er defekte, til å gi rene blandinger av gag, pol, env og retroviral vektor som bæres adskilt i defekte adenovirusvektorer. Siden titrene av slike vektorer er typisk 10<7->10<11>/ml kan disse

blandingene bli benyttet for å infisere vevskulturceller samtidig med stor delings-evne. Cellene vil så bli programmert til å produsere retrovirusproteiner og retrovirale vektorgenomer i store mengder. Siden adenovirusvektorene er defekte, kan ingen store mengder av direkte cellelysis opptre og retrovirusvektorer kan bli høstet fra cellesupematantene.

I et alternativt system (som er riktigere ekstracellulært), er de følgende komponentene benyttet: 1. gag/pol og env-proteiner laget i baculovirussystemet på en lignende måte er beskrevet i Smith et al. (surjra) (eller i andre proteinproduksjonssystemer, slik som gjær eller E. coli): 2. viral vektor RNA laget i den kjente T7 eller SP6 eller andre in vitro RNA-dannende system (se f.eks., Flamant og Sorge, J. Virol. 62:1827,1988); 3. tRNA laget som i (2) eller renset fra gjær eller pattedyrsvevskultur-celler;

4. liposomer (som inneholder env protein);og

5. celleekstrakt eller rensede nødvendige komponenter (når de blir identifisert) (typisk fra museceller) for å gi env-spalting, og enhver eller andre nødvendige cellebundende funksjoner.

Med denne fremgangsmåte blir (1), (2) og (3) blandet, og så blir env-protein, cellekestrakt og preliposomblanding (lipid i en passende løsning) tilsatt. Det kan imidlertid, være nødvendig å innsette tidligere env-proteinet i liposomene før tilsetning av den resulterende liposom-innbygde env til blandingen av (1), (2) og (3). Blandingen blir behandlet (f.eks. ved sonikering, temperaturendring, eller roterende dialyse) til å tillate innkapsling av de nydannede virale partiklene i lipid pluss innstøpning av env-protein på en måte som er lik den som gjelder for liposominnkapsling av farmasøytiske forbindelser, som beskrevet i Gould-Fogerite et al., Anal. Biochem. 148:15,1985). Denne fremgangsmåte tillater produksjonen av høye titere med replikasjonsinkompetente rekom-binante retrovirus uten tilblanding med patogene retrovirus eller replikasjonskompetente retrovirus.

VII. Cellelinie- spesifikke retrovirus - " hvbridkapsel"

Vertscellens områdespesifisitet for en retrovirus er bestemt delvis av env-genproduktene. F.eks. Coffin, J. (RNA Tumor Viruses 2:25-27, Cold Spring

Harbor, 1985) bemerker at den ekstracellulære komponenten av proteinene fra gnagerleukemi-virus (MLV) og Rous Sarcomavirus (RSV) er ansvarlig for spesifikk reseptorbinding. På den annen side er den cytoplasmatiske del av kapselproteiner, forstått å spille en rolle i viriondannelse. Mens pseudotyping (det betyr innkapslingen av viral RNA fra én art av virusproteiner fra andre arter) opptrer med lav hyppighet, har kapselproteinet en viss spesifisitet for viriondannelse av et gitt retrovirus. Den foreliggende oppfinnelse erkjenner at ved å lage et hybrid env genprodukt (dvs. spesifikt en env protein som har cytoplasmatiske regioner og eksogene bindingsregioner som ikke er i det samme proteinmolekylet naturlig) kan vertsområdespesifisiteten bli forandret uavhengig av den cytoplasmatiske funksjonen. Således, kan rekombinante retrovirus bli laget som vil spesifikt bindes til utvalgte målceller.

For å lage et hybridprotein der reseptorbindingskomponenten og den cytoplasmatiske komponenten er fra forskjellige retrovirus, er en foretrukket lokalisering for rekombinasjon innen membrandelen av den cytoplasmatiske komponenten. Eksempel 8 beskriver konstruksjon av et hybrid env gen som uttrykker et protein med CD4 bindingsdelen av HIV kapselproteinet koblet til den cytoplasmatiske delen av MLV kapselproteinet.

EKSEMPEL 8

Hybrid HIV- MLV- kapsler

Et hybridkapselgen blir laget ved bruk av in vitro mutagenese (Kunkel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:488-492,1985) for å introdusere et nytt restriksjonssete på et passende overgangssted. Alternativt, hvis de to kapselsekvensene er på det samme plasmidet, kan de bli bundet direkte sammen på ethvert ønsket punkt ved bruk av in vitro mutagenese. Slutt-resultatet i begge tilfeller er et hybridgen som inneholder 5-enden av HIV gp 160 og 3-enden av MLB p15E. Hybrid-proteinet som er uttrykt av det resulterende rekombinante gen blir illustrert i figur 18 og inneholder HIV gp120 (CD4 reseptor-bindingsproteinet), den ekstracellulære del av HIV gp 41 (gp 120 binding og fusjonsregioner), og den cytoplasmatiske delen av MLV p15E, med overgangen tilstede på et av flere punkter innenfor verts-membranen. Et hybridgen laget ved fusjon ved det nye Eco R1 setet vist i figur 18 blir produsert under kontroll av CMVIE-genet i humane Sup T1 celler og fører til syncytiumdannelse, som er tilfellet med det opprinnelige HIV env genet. Således blir hybridet transportert riktig til celleoverflaten og presentert der.

Mens eksempel 8 illustrerer ett hybridprotein laget fra to forskjellige retrovirus, er mulighetene ikke begrenset til retrovirus eller endog enkelt nok andre virus. F.eks., betareseptordelen av human interleukin-2 kan bli kombinert med kapselproteinet til MLV. I dette tilfellet, ville en rekombinasjon fortrinnsvis bli lokalisert i gp 70 delen av MLV env genet, og derved etterlate et intakt p15E protein. Videre, kan den forannevnte fremgangsmåte bli benyttet for å lage et rekombinant retrovirus med et kapsel protein som gjenkjenner antistoff Fc segmenter. Monoklonale antistoffer som gjenkjenner bare utvalgte målceller kunne bare så bli bundet til slikt et rekombinant retrovirus som viser slike kapselproteiner på en måte slik at retroviruset ville binde til og infisere bare de forhåndsutvalgte målceller.

VIII. Sete- spesifikk integrering

Målføring av en retrovirsvektor til et på forhånd bestemt sted på et kromosom øker fordelene med hensyn til genforsyningssystemer. Et mål på sikkerhet er oppnådd ved direkte integrering til et "sikkert" sted på kromosomet, dvs. ett som er vist å ikke ha noen alvorlige virkninger fra innsettingen av en vektor. En annen mulig fordel er evnen til å styre et gen til en "åpen" region av kromosomet, hvor dets ekspresjon ville bli maksimalt. To fremgangsmåter for å integrere retrovirus på spesifikke seter er beskrevet nedenfor.

(i) Homolog rekombinering

Én fremgangsmåte for å integrere et fremmed gen i en vektorkonstruksjon til et rekombinant retrovirus på et spesifikt sted i målcellens DNA benytter homolog rekombinasjon. Plasmider som inneholder sekvenser av DNA av større enn omkring 300 bp som er homologe til genomiske sekvenser er blitt vist å reagere

med (enten ved erstatning eller ved innsetting) med de genomiske sekvenser med en hastighet som er større enn 10<3> ganger over en spesifikk reaksjon i fraværet av en slik homologi (se Thomas og Capecchi, Cell 51:503-12,1987; og Doetscheman et al, Nature 330:576-78,1987). Det er blitt vist at en innsettingshendelse, eller

alternativ, en erstatningshendelse, kan bli drevet av den spesifikke struktur til vektoren.

For å benytte homolog rekombinasjon i sete-spesifikk retroviral integrering, skulle en vektorkonstruksjon bli modifisert til slik at (a) homologe sekvenser (til . målcellens genom) bli inkorporert inn i konstruksjonen på et passende sted; og (b) den normale mekanismen for integrering må ikke forstyrre målsøkingen som opptrer p.g.a. homologe sekvenser. En foretrukket fremgangsmåte i dette henseende er å tilsette homologe sekvenser (større enn omrent 300 bp) i den 3' LTR, nedstrøms fra U3 omvendte repeterte sekvenser. Med denne fremgangsmåte, blir konstruksjonen først gjort med en homolog region innsatt i 3' LTR ved Nh1 setet i U3. Revers (omvendt) transkripsjon i vertscellen vil resultere i en duplikering av regionen med homologi i 5' LTR innenfor 31 bp fra enden til den omvendte (inverterte) repeterte sekvens (IR). Integrering inn i vertsgenomet vil opptre i nærvær eller fravær av den normale integreringsfremgangsmåte. Genet i vektoren kan bli uttrykt, enten fra LTR eller fra en intern promotor. Denne fremgangsmåten har virkningen av å plassere en region med homologi nær en mulig fri ende av det dobbelttrådede retrovirusvektorgenomet. Frie ender er kjent å øke hyppigheten av homolog rekombinering ved en faktor på omtrent 10. Med denne fremgangsmåten, kan det være nødvendig å slå av den normale mekanismen for integrering, eller i det minste modifisere den for å sinke prosessen, og derved tillate tid for homologe DNA'er å bindes opp. hvorvidt den siste modifikasjon er krevet i et spesielt tilfelle kan bli lett bekreftet av fagmannen.

(ii) Integrasemodifikasion

En annen fremgangsmåte for integrering av en vektorkonstruksjon inn i

spesifikke, utvalgte seter i en målcelles genom omfatter integrasemodifikasjon.

Retrovirus pol genproduktet er generelt delt i fire deler: (i) en protease som spalter de virale gag og pol produktene; (ii) revers transkriptase; og (iii) RNase H, som degraderer RNA fra en RNA/DNA dupleks; og (iv) endonuklease eller "integrase".

Den generelle integrasestrukturen er blitt analysert av Johnson et al. (Proe.

Nati. Acad. Sei. USA 83:7648-7652,1986). Det er blitt foreslått at dette proteinet har en sinkbindingsfinger som reagerer med verts DNA før de retrovirale sekvensene blir integrert.

I andre proteiner, tillater slike "fingrer" at proteinet binder til DNA ved bestemte sekvenser. Ett illustrerende eksempel er steroidreseptorene. I dette tilfellet kan en lage østrogenreseptoren, som svarer på østrogener, til å ha virkningen til en glukokortikoidreseptor, som reagerer på glukokortikoider,

ved enkelt å erstatte glukokortikoidreseptor "finger" (dvs. DNA bindingssegment) i stedet for østrogenreseptorfingersegmentet i østrogenreseptorgenet. I dette eksemplet har posisjonen i genomet der proteinene er målbestemt blitt forandret.

Slike styrende sekvenser kan også bli erstattet i integrasegenet på plassen til den derværende sinkfingeren. F.eks., segmentet som koder for DNA-bindingsregionen til det humane østrogenreseptorgenet kan bli erstattet med en DNA-bindingsregion til integrasen i pakkegenomet. Først, kan spesifikk integrering bli undersøkt ved hjelp av et in vitro integreringssystem (Brown et al., Cell 29:347-356,1987). For å bekrefte at spesifisiteten vil bli observert in vivo, er dette pakkegenomet benyttet for å lage infeksiøse vektorpartikler, og infeksjon av og integrering inn i østrogen-følsomme og østrogen-ufølsomme celler blir sammenlignet i kultur.

Ved bruk av denne fremgangsmåte, kan innkommende virale vektorer bli styrt til å integrere i utvalgte seter i målcellensgenom, diktert av genom-bindingsegenskapene til setespesifikke DNA-bindingsproteinsegmenter skjøtet inn i integrasegenomet. Det vil forstås av fagmannen at integreringssetet må faktisk være mottakelig for fingrene til den modifiserte integrasen. F.eks., er de fleste celler følsomme for glukokortikoider og derfor har deres kromatin seter for glukokortikoidreseptorer. Således for de fleste celler, ville en modifisert integrase som har en glukokortikoidreseptorfinger være passende for å integrere den provirale vektorkonstruksjonen ved disse glukokortikoid-reseptorbindingsseter.

IX. Produksjon av rekombinante retrovirusvektorer i trans<g>ene dvr

To problemer som tidligere er beskrevet med hjelperlinjedannelse av retrovirusvektorer er: (a) vanskeligheter i å lage store mengder med vektorer; og (b) det nåværende behov til å bruke permanente istedenfor primære celler for å lage vektorer. Disse problemene kan bli overkommet med produksjons- eller pakkekompetente linjer som er laget i transgene dyr. Disse dyrene kunne bære pakkegenomene og de retrovirale vektorgenomene. Eksisterende teknologi tillater ikke å danne pakkekompetente cellelinjer og ønskede vektorproduserende linjer i primærceller p.g.a. deres begrensede livslengde. Den eksisterende teknologien er slik at omfattende karakterisering er nødvendig, hvilket eliminerer bruken av primærceller p.g.a. aldring. Imidlertid kan individuelle linjer av transgene dyr bli laget ved hjelp av fremgangsmetoder vist herved som lager pakkefunksjonene, slik som gag, pol eller env. Disse linjene eller dyrene blir så karakterisert for ekspresjon i enten intakte dyr eller målvev via selektiv bruk av vedlikeholds- eller vevsspesifikke promotorer til å transkribere pakkefunksjonene. Vektoren som skal overføres blir også innsatt i en linje med transgene dyr med en vevsspesifikk eller vedlikeholdspromotor. Som diskutert ovenfor, kan vektoren bli styrt av en slik promotor ved å erstatte U3-regionen i 5' LTR (figur 19). Denne transgen kunne bli stimulert eller være generell i sin ekspresjon. Denne vektor, er imidlertid ikke pakket. Disse linjene av dyr blir så paret med gag/pol/env dyr og etterfølgende avkom lager pakket vektor. Avkommet, som er hovedsakelig identiske, blir karakterisert og tilbyr en ubegrenset kilde av primære produserende celler. Alternativt, kan primærceller som lager gag/pol og env og stammer fra transgene dyr bli infisert eller transfektert i større omfang med retrovirusvektor for å lage en primær celleproduksjonslinje. Mange forskjellige transgene dyr eller insekter kunne produsere disse vektorer, slik som mus, rotter, høner, gris, kanin, ku, sau, fisk og fluer. Vektoren og pakkegenomene ville bli spesiallaget for arts-infeksjonsspesifisitet og vevsspesifikk ekspresjon gjennom bruk av vevsspesifikke promotorer og forskjellige kapselproteiner. Et eksempel på en slik prosedyre er vist i figur 20.

Skjønt de følgende eksempler på transgen produksjon av primære pakkekompetente linjer er beskrevet bare for mus, kunne disse fremgangsmåter bli utvidet tii andre arter av fagmannen. Gitt homologi til MLV-sekvenser i muse-genom, ville de endelige foretrukkede dyr ikke være mus.

EKSEMPEL 9

Produksjon av Gag- Pol proteiner ved bruk av struktur ( housekeeping)

<p>romotorer for generell ekspresjon i trans<g>ene dyr

Et eksempel på en godt karakterisert strukturpromotor er HPRT-promotoren. HPRT er en purin redningsenzym som uttrykkes i alle vev. (Se Patel et al., Mol. Cell Biol. 6:4 -403,1986 og Melton et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 81:2147-2151,1984). Denne promotoren kunne bli innsatt foran forskjellige gag/pol-fragmenter (f.eks. Bal l/Sca I; Aat Il/Sea I; Pst l/Sca I fra MoMLV; se RNA Tumor Viruses 2,1985, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985) som er klonet Bluescriptplasmider (Strategene, Inc.) ved bruk av rekombinante DNA teknikker (se Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). De resulterende plasmider blir renset (Maniatis et al., op. eit.) og den relevante genetiske informasjon isolert ved bruk av Geneclean (Bio 101) eller elektroeluering (se Hogan et al. (Eds.) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1986).

Disse fullt karakteriserte DNA'er ville bli mikroinjisert i pronukleus av befruktet museegg i en konsentrasjon på 2 jig/ml. Levende fødte mus ville bli undersøkt ved haleblot-analyse (se Hogan et al., op. eit.). Transgene-positive dyr ville bli karakterisert for produksjonsnivåer av gag-pol proteiner ved immun-presipitering av radioaktivt merkede primære celler, slik som fibroblast (se Harlow et al., eds. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1988). Dyr ville så bli avlet til homozygositet for å etablere dyrelinjer som produserer karakteriserte nivåer av gag-pol.

EKSEMPEL 10

Produksjon av env proteiner/ hybridkapselproteiner ved bruk av struktur ( housekeepinq) promotorer for generell produksjon i transgene dyr

Dette eksempel benytter HPRT-promotoren for å produsere enten kapsel eller hybrid kapselproteiner. Kapselproteinene kunne være fra ethvert retrovirus som er i stand til å komplettere det relevante gag-pol, i dette tilfellet MLV. Eksemplene er ekotropisk MLV, amfotropisk MLV, xenotropisk MLV, polytropisk MLV eller hybridkapsler. Som ovenfor, ville kapselgenet bli klonet bak HPRT-promotoren ved bruk av rekombinante DNA-teknikker (se Maniatis et al., op. eit.). Det resulterende "minigen" ville bli isolert (se Hogan et al., op. eit.) og produksjon av kapselprotein ville bli bestemt (Harlow et al., op.cit.). De transgene kapsel-dyrene ville bli avlet til homozygositet for å etablere et vel-karakterisert kapseldyr.

EKSEMPEL 11

Produksjon av gag- pol- env- dyr ved bruk av strukturpromotorer

for generell ekspresjon i transgene dyr

Dette ville benytte de velkarakteriserte gag-poldyrene, så vel som dyr for etablering av en permanent gag-pol/kapseldyr-linje. Dette ville involvere avling til homozygositet og etablering av en velkarakterisert linje. Disse linjene ville så bli benyttet for å etablere primære museembryolinjer som kunne bli benyttet for pakkevektorer i vevskultur. Videre kunne dyr som inneholder retrovirusvektoren bli avlet inn i denne linje.

EKSEMPEL 12

Produksjon av vevs- spesifikk ekspresjon av gag- pol- env

eller hvbridkapsel i transgene dyr

Eksemplet gitt her vedrører styring av vevsspesifikk ekspresjon av gagpol, kapsel, eller hybridkapsel til spesifikke vev slik som T-celler. Dette involverer bruk av CD2 sekvenser (se Lang et al., EMBO J. 7:1675-1682,1988) som gir plassering og kopitall uavhengighet. 1,5 kb Barn H1/Hind III fragment fra CD2 genet ville bli innsatt foran gag-pol, kapsel, eller hybridkapselfragmenter ved bruk av rekombinant DNA-teknikker. Disse genene ville bli innsatt i befruktede muse ova ved mikroinjeksjon. Transgene dyr ville bli karkaterisert som før. Ekspresjon i T-celler ville bli etablert. Dyr ville bli avlet til homozygositet for å etablere velkarakteriserte linjer med transgene dyr. Gag-pol-dyr ville bli paret til kapseldyr for å etablere gag-pol-env dyr som uttrykker bare i T-celler. T-cellene fra disse dyrene ville så bli en kilde for T-celler som er i stand til å pakke retrovirale vektorer. Igjen, vektordyr kunne bli avlet i disse gag-pol-env-dyr for å etablere T-celler som uttrykker vektoren.

Denne teknikken tillater bruken av andre vevsspesifikke promotorer, slik som melkespesifikk (whey), pankreatisk (insulin eller elastase) eller neuronal (myelin basisk protein) promotorer. Ved bruk av promotorer, slik som melke-spesifikke promotorer, kan rekombinante retrovirus bli isolert direkte fra biologisk væske til avkommet.

EKSEMPEL 13

Produksjon av enten struktur eller vevsspesifikke retrovirusvektorer i transgene dyr

Innsetting av retrovirus eller retrovirale vektorer i germinallinjen i transgene dyr resulterer i lite eller ingen ekspresjon. Denne effekt beskrevet av Jaenisch (se Jahner et al, Nature 298:623-628,1982) er tillagt metylering av 5" retrovirale LTR-sekvenser. Denne teknikk ville overkomme metyleringseffekten ved å substituere enten en struktur eller vevsspesifikk promotor for å uttrykke retrovirale vektor/- retrovirus. U3-regionen i 5' LTR som inneholder forsterker enhancer) elementer, er erstattet med regulatoriske sekvenser fra struktur eller vevs-spesifikke promotorer (se fig. 20). 3' LTR er fullt beholdt, som det inneholder sekvenser som er nødvendige for polyadenylering av viralt RNA og integrering. Som resultatet av unike egenskaper av retroviral replikasjon, blir U3 regionen av 5' LTR i det integrerte provirus dannet av U3-regionen til 3' LTR i det infiserende virus. Derfor, er 3' nødvendig, mens 5' U3 er erstattelig. Utskifting av 5" LTR U3 sekvenser med promotorer og innsetting i germinallinjen til transgene dyr resulterer i linjer med dyr som er i stand til å produsere retrovirale vektortranskrtpter. Disse dyr kunne så bli paret til gag-pol-env-dyr for å lage retrovirus-produserende dyr (se figur 20).

Fra det forannevnte vil det bli forstått at skjønt spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen er blitt beskrevet herved for illustrasjonsformål. Oppfinnelsen er begrenset av de tilhørende krav.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus med evne til å infisere humane celler, hvilken bærer en vektorkonstruksjon i stand til å forhindre, inhibere, stabilisere eller reversere infeksjons-, kreft- eller autoimmun-sykdommer, hvori vektorkonstruksjonen styrer ekspresjonen av et sykdomsantigen som er fra et patogent agens eller er et kreftantigen eller en modifisert form derav, i målceller infisert med retroviruset, hvilket antigen eller modifisert form derav er i stand til å stimulere en cellemediert immunrespons hos et menneske; karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter kombinasjon av nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer hvor retroviruset er fremstilt i en cellelinje som komplementerer replikasjonsdefekten slik at det fremstilles en farmasøytisk blanding som har et titer på 10<7> til 1011 infektive enheter av nevnte retrovirus per ml av bærer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at vektor-konstruksjonen styrer ekspresjonen av en modifisert form av et sykdomsantigen fra et patogent agens i målceller infisert med retroviruset, hvilket modifiserte antigen er i stand til å stimulere en immunreaksjon i et menneske, men med redusert patogen virkning i forhold til det patogene agens.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det uttrykte antigen frembringer en HLA-klasse I- eller II- begrenset immunreaksjon.

4. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-3, karakterisert ved at det uttrykte antigen er et HIV-protein valgt fra gruppen bestående av gp160, gp120 og gp41, eller modifiserte former derav.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding omfattende et replikasjonsdefekt rekombinant retrovirus, i stand til å infisere humane celler, hvor nevnte retrovirus bærer en vektorkonstruksjon i stand til å forhindre, inhibere, stabilisere eller reversere infeksjons-, kreft- eller autoimmun-sykdommer, hvor vektorkonstruksjonen, når den er i humane celler infektert med nevnte retrovirus, er i stand til å dirigere ekspresjon av et enzym som normalt ikke uttrykkes i nevnte celler og som konverterer en forbindelse med liten eller ingen cytotoksisitet til en cytotoksisk forbindelse i stand til å inhibere funksjonen til et patogent agens nødvendig for patogenisiteten, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter kombinasjon av nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer hvor retroviruset er fremstilt i en cellelinje som komplementerer replikasjonsdefekten slik at det fremstilles en farmasøytisk blanding som har et titer på 10<7> til 1011 infektive enheter av nevnte retrovirus per ml bærer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte vektorkonstruksjon er i stand til å dirigere ekspresjon av et enzym valgt fra gruppen: a) et ikke-pattedyrprotein som ikke er cytotoksisk, men som i en menneskecelle er i stand til å overføre en forbindelse med liten eller ingen cytotoksisitet til en sådan som er cytotoksisk; b) et protein som er i stand til å fosforylere et purin- eller pyrimidin-basert legemiddel som krever intracellulær fosforylering for å bli et cytotoksisk agens; eller c) et protein som ikke er cytotoksisk, men som er i stand til å overføre et ikke-toksisk legemiddel som ikke er en purin- eller pyrimidin-analog til et som er cytotoksisk i en menneskecelle.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at vektor-konstuksjonen er i stand til å styre ekspresjonen av et viralt enzym for fosforylering av en pyrimidin-basert forbindelse.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at vektor-konstruksjonen styrer ekspresjonen av Herpes simplex virus tymidin kinase (HSVTK).

9. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at ekspresjonen av nevnte antigen eller enzym med nevnte vektorkonstruksjon er regulerbar ved nærværet av et intracellulært signal i forbindelse med den patogene tilstand av nevnte infeksjons-, kreft- eller autoimmun-sykdom.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9 karakterisert ved at nevnte vektor-konstruksjon videre omfatter en forløpsspesifikk promotor operabelt knyttet til en vektorsekvens som koder for et enzym som definert i krav 5, hvori ekspresjonen av nevnte enzym under kontroll av nevnte promotor er regulerbar med nevnte intracellulære signal.

11. Fremgangmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at sykdommen er en kreftsykdom, og hvori nevnte forløpsspesifikke promotor fortrinnsvis er aktiv i celler som formerer seg.

12. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-11, karakterisert ved at vektorkonstruksjonen videre omfatter en vevspesifikk promotor operabelt knyttet til vektorsekvensene som koder for nevnte antigen eller enzym.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte vevspesifikke promotor svarer til et vev som er malignt.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved atdenvev-spesifikke promotor er en leverspesifikk promotor.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13 eller 14, karakterisert ved at nevnte vektorkonstruksjon videre omfatter en forløpsspesifikk promotor operabelt knyttet til en vektorsekvens som koder for et enzym som definert i krav 5, og hvori ekspresjonen av nevnte enzym er regulerbar med nevnte forløpsspesifikke promotor og nevnte vevspesifikke promotor.

16. Anvendelse av en farmasøytisk blanding fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 1-15, for infisering av celler ex vivo.

17. Fremgangsmåte som krevet ifølge ethvert av kravene 1-15, karakterisert ved at pakkingen forekommer i en pakke celle.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av en dose av en farmasøytisk blanding, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å kombinere nevnte retrovirus med en farmasøytisk akseptabel bærer slik at den farmasøytiske blandingen omfattende nevnte retrovirus blir fremstilt, og isolere en mengde av nevnte farmasøytiske blanding tilstrekkelig til å tilveiebringe til en pasient i behov derav en dose omfattende 10<5> til 10<7> infektiøse enheter av retrovirus per kg av pasientens kroppsvekt.