JPH11262397A - 複製欠陥組換えレトロウィルス - Google Patents

複製欠陥組換えレトロウィルス

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JPH11262397A
JPH11262397A JP10368260A JP36826098A JPH11262397A JP H11262397 A JPH11262397 A JP H11262397A JP 10368260 A JP10368260 A JP 10368260A JP 36826098 A JP36826098 A JP 36826098A JP H11262397 A JPH11262397 A JP H11262397A
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cell
gene
expression
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イー． グラバー ハリー
Douglas J Jolly
ジェイ． ジョリー ダグラス
James G Respess
ジー． レスペス ジェイムズ
Paul K Laikind
ケー． レイカインド ポール
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Chiron Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防
止し、阻害し、安定化し又は治すことができるベクター
構造物を担持する組換えレトロウィルスを供給するこ
と。 【解決手段】 複製欠陥組換えレトロウィルスであっ
て、該レトロウィルスに感染した標的細胞において抗原
又はその改変形の発現を指図するベクター構造体を有
し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激
し得る、複製欠陥組換えレトロウィルス。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的にレトロウ
ィルス、及びより詳しくは、影響されやすい標的細胞に
ベクター構造体を運ぶことができる組換えレトロウィル
スに関する。これらのベクター構造体は、典型的には、
所望するタンパク質、たとえば免疫原性活性を刺激し、
又は一定の細胞環境下で条件的に活性的であるタンパク
質を標的細胞中で発現するように企画されている。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 細菌性疾病は一般的に、抗生物質により容易に治療でき
るけれども、ほとんど効果的でない処置又は予防が多く
のウィルス性、癌性及び他の非細菌性疾病、たとえば遺
伝的疾病に対して存在する。これらの疾病を治療するた
めの伝統的な試みは、化学的薬物の使用であった。一般
的に、これらの薬物は、特異性を欠いており、高い全体
的な毒性を示し、そして従って治療的に無効果であっ
た。
【０００３】多くの非細菌性疾病を治療するためのもう
１つの伝統的な技法は、病原体の非感染形、たとえば殺
害されたウィルスの投与を通してその病原体、たとえば
ウィルスに対する免疫応答を誘導し、それによって免疫
刺激物として作用する病原体から抗原を供給することを
包含する。
【０００４】ウィルス性疾病、たとえば後天性免疫不全
症候群（ＡＩＤＳ）及び関連する障害の治療のための最
近のアプローチは、ウィルスエンベロープタンパク質と
の複合体を受ける又は形成することからＨＩＶによる感
染に敏感な細胞上の受容体を阻止することを包含する。
たとえば、Ｌｉｆｓｏｎなど．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
２ ： １１２３〜１１２７、１９８６）は、ＣＤ４
（Ｔ４）受容体に対する抗体が感染された及び感染され
ていないＣＤ４存在細胞の間の細胞融合（シンシチウ
ム）を生体外で阻止することを示した。モノクローナル
抗体を用いての類似するＣＤ４阻止効果が、ＭｃＤｏｕ
ｇａｌなど．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１ ：３８２〜３
８５， １９８６）により提案された。他方、Ｐｅｒｔ
など．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：９２５４〜９２５８、１９８６）は、Ｔ４受
容体を結合し、そしてヒトＴ細胞のＨＩＶ感染を阻止す
る合成ペプチドの使用を報告しており、そしてＬｉｆｓ
ｏｎなど．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６４：２１０
１、１９８６）は、ウィルスエンベロープ糖タンパク質
と相互作用するレクチンを用い、それによってそれがＣ
Ｄ４受容体により受容されることを阻止することによっ
て、シンシチウム及びウィルス／Ｔ４細胞融合の両者を
阻止することを報告した。
【０００５】四番目に、ＲＮＡを転写する病原体、たと
えばウィルスを阻止するための最近提案された技法は、
翻訳を阻止するために、転写されたＲＮＡの少なくとも
一部を補足し、そしてそれらに結合するアンチセンスＲ
ＮＡを供給することである（Ｔｏなど．， Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：７５８、１９８６）。
【０００６】しかしながら、上記技法の主な欠点は、そ
れらは、薬物、抗体、ブロッキング剤又はアンチセンス
ＲＮＡが利用される時間、位置又は程度に関しての制御
に容易に役立たないことである。特に、上記技法は処理
剤の外因性適用（すなわち生体外情況においてサンプル
に対して外因性である）を必要とするので、それらは病
原体の存在に直接応答しにくい。たとえば、病原体によ
る感染のすぐ後、高い量で発現される免疫刺激物を有す
ることが所望される。さらに、アンチセンスＲＮＡの場
合、動物における有用な治療のためには多量が必要とさ
れ、これは、現在の技法下では、それが実際必要とされ
る位置、すなわち病原体により感染された細胞位置に無
関係に投与される。
【０００７】外因性適用の代用として、治療物質を内因
的に生成するための技法が提案された。より詳しくは、
ＤＮＡウィルス、たとえばアデノウィルス、ＳＶ４０、
ウシ乳頭腫ウィルス及びワクシニアウィルスに基づくウ
ィルスベクターから発現されたタンパク質が調べられ
た。例により、Ｐａｎｉｃａｌｉなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：５３６４、
１９８３）は、インフルエンザウィルス赤血球凝集素及
びＢ型肝炎表面抗原をワクシニアゲノム中に導入し、そ
してそのような組換え遺伝子から生成されたウィルス粒
子により動物を感染せしめた。感染の後、動物はワクシ
ニアウィルス及びＢ型肝炎抗原の両者に対する免疫性を
得た。
【０００８】しかしながら、多くの困難が、ＤＮＡウィ
ルスに基づくウィルスベクターに関して、今日までに経
験されて来た。これらの困難は、（ａ）病因又は所望す
るタンパク質の抑制を導くことができる他のウィルスタ
ンパク質の生成；（ｂ）宿主において未制御的に複製す
るベクターの能力及びそのような未制御された複製の病
原性効果；（ｃ）ウィルス血症を導くことができる野生
型ウィルスの存在；及び（ｄ）他の非細菌性疾病、たと
えば遺伝的疾病を包含する。
【０００９】感染された標的細胞におけるそれらの発現
の非一時的な性質により、レトロウィルスは、遺伝的疾
病の治療のための有用なビークルとして提供されて来た
（たとえば、Ｆ．Ｌｅｄｌｅｙ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１０：１、１９
８７を参照のこと）。しかしながら、多くの問題の観点
において、遺伝的疾病の治療におけるレトロウィルスの
使用が試みられて来ていない。そのような問題は、
（ａ）入手しにくい組織（たとえば脳）における多量の
細胞を感染するための明らかな必要性；（ｂ）非常に制
御された及び永久的な態様でこれらのベクターの発現を
引き起こす必要性；（ｃ）クローン化された遺伝子の欠
乏；（ｄ）代謝の異常性による組織及び器官への取り返
しのできない損傷；及び（ｅ）ある実例における他の部
分的に有効な治療の利用性に関係する。
【００１０】遺伝的疾病の他に、他の研究者は、非遺伝
的疾病を治療するためにレトロウィルスベクターを用い
ることに集中して来た（たとえば、ＥＰ２４３，２０４
−Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｔａｎｆｏ
ｒｄ， Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏ１． １３０；４６
９、１９８８；Ｔｅｌｌｉｅｒなど．， Ｎａｔｕｒｅ
３１８：４１４、１９８５；及びＢｏｌｏｇｎｅｓｉな
ど．， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ， ４５：４７００、１９
８５を参照のこと）。
【００１１】Ｔｅｌｌｉｅｒなどは、ＨＩＶ ＲＮＡに
アンチセンスＲＮＡを発現することができるゲノムを有
する「不完全な」ＨＩＶにより幹細胞を明らかに感染す
ることによるＴ細胞クローンの保護を示唆した。Ｂｏｌ
ｏｇｎｅｓｉなどは、幹細胞から生成されるＴ４細胞が
ウィルスの非ビルレント形の妨害を行ない、そしてそれ
によって、ビルレントＨＩＶによる感染からこれらの細
胞を保護するように幹細胞を感染するための非ビルレン
トＨＩＶ株の生成の概念を示唆した。しかしながら、前
記文献の両者に使用される「弱められた」又は「不完全
な」ＨＩＶウィルスは、得られるウィルスが、前に存在
するＨＩＶ又は他の配列との組換えの高められた危険性
の可能性を伴って他の細胞を感染し、アテニュエーショ
ンの損失を導くように生殖することができる（すなわ
ち、不完全な複製でない）ことは明らかであろう。非−
非複製形は、ＨＩＶのための不完全なヘルパー又はパッ
ケージング系を必要とするであろう。しかしながら、Ｈ
ＩＶ遺伝子の発現の制御は複雑であるので、そのような
細胞は、今日まで構成されていない。さらに、感染性の
弱められた又は不完全なウィルスはキメラ性（「非キメ
ラ性」レトロウィルスは、同じレトロウィルス種からの
そのベクターの実質的にすべてを有するものである）で
あるので、たとえそれらが、不可欠な成分のそれらのゲ
ノムからの欠失により複製を不完全にする場合でさえ、
感染性ウィルス粒子の得られる生成により宿主細胞内で
の組換えのための有意な可能性が存在する。
【００１２】Ｓａｎｆｏｒｄ（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏ
１． １３０：４６９、１９８８）はまた、ＨＩＶのた
めの遺伝的治療の使用を提案したが、抗−ＨＩＶ遺伝子
を担持する治療用レトロウィルスベクターと天然のＡＩ
ＤＳウィルスとの間の遺伝子組換えを通して新規のウル
レントウィルスを創造するために存在する可能性によ
り、ＡＩＤＳのためのレトロウィルス遺伝子療法は実際
的でないかも知れないことを彼は示唆する。同様に、Ｍ
ｃＣｏｒｍｉｃ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ（ＥＰ２４３，２
０４Ａ２）はタンパク質、たとえば腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）のための遺伝子を運搬するためにレトロウィルスベ
クターの使用を提案したが、彼らが記載する技法は多く
の欠点を有する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】感染性で癌性の自己−
免疫又は免疫疾患を防止し、阻害し、安定化し又は治す
ことができるベクター構造物を担持する組換えレトロウ
ィルスを供給すること。
【００１４】
【課題を解決するための手段】簡単に言えば、本発明
は、感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防止し、
阻害し、安定化し又は治すことができるベクター構造物
を担持する組換えレトロウィルスを供給する。そのよう
な疾病は、ＨＩＶ感染、黒色腫、糖尿病、ＧＶＨ反応、
アルツハイマー病及び心臓疾患を包含する。
【００１５】本発明は、（ａ）抗原又は病原性抗原に対
する体液性又は細胞介在のいづれかの特異的免疫応答を
刺激し；（ｂ）病原体、たとえばウィルスの機能を阻害
し；そして（ｃ）組換えレトロウィルスの使用を通し
て、宿主細胞受容体と病原体との相互作用を阻害するた
めの方法に一部向けられる。
【００１６】より詳しくは、本発明の１つの観点におい
ては、感染された標的細胞において抗原又はその変性さ
れた形の発現を指図するベクター構造物を担持する組換
えレトロウィルスにより感応性の標的細胞を感染せしめ
ることを含んで成る、特異的免疫応答を刺激するための
方法が提供される。免疫応答が病原性抗原に対して刺激
される場合、組換えレトロウィルスは好ましくは、免疫
応答を刺激し、そして天然の抗原に対する病原性を減じ
ている抗原の変性された形を発現するように企画されて
いる。免疫応答はまた、適切なＭＨＣ分子の情況下で対
象の抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体又は対象の抗原
を認識する免疫グロブリンのための遺伝子を、適切な免
疫細胞（たとえばＴリンパ球）にトランスファーするこ
とによっても達成され得る。
【００１７】ＨＩＶ感染により引き起こされる疾病の特
別な場合において、免疫刺激が所望される場合、組換え
レトロウィルスゲノムから生成される抗原は、ＨＬＡク
ラスＩ−又はクラスＩＩ−制限性免疫応答のいづれか又
は両者を誘発するであろう形のものである。ＨＩＶエン
ベロープ抗原の場合、抗原は好ましくは、それらの病原
性を減じるために変性されたｇｐ１６０、ｇｐ１２０及
びｇｐ４１から選択される。特に、その選択される抗原
は、シンシチアの可能性を減じるように変性される。他
のＨＩＶ遺伝子、たとえばｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎ
ｅｔ、等からの抗原もまた、特定の場合において保護を
提供することができる。
【００１８】本発明のもう１つの観点においては、疾
病、たとえばウィルス感染、癌又は免疫異常性により引
き起こされる疾病のために必要な病原体の機能を阻止す
るための方法が開示されている。そのような阻止は、疾
患細胞に対して毒性である緩和物を発現し、病原性遺伝
子の発現又は効果を選択的に阻止する緩和物を発現し、
アンチセンスＲＮＡを発現し、又はその機能を崩壊する
ために病原性ゲノム中に配列を挿入することにより達成
される。
【００１９】より詳しくは、本発明は、病原体の集合の
阻止を導く病原体の欠陥構造タンパク質を発現する、た
とえばウィルス粒子の集合の阻止を導くウィルス粒子の
欠陥構造タンパク質を発現する組換えレトロウィルスゲ
ノムを供給する。
【００２０】毒性緩和物が組換えウィルスゲノムを含む
細胞により生成される場合、それは細胞内に存在する前
駆体から生成され得又はさらに、毒性物質に前駆体を外
因的に供給することにより生成され得る。後者の場合、
そのウィルス構造体は、毒性物質に前駆体を転換する生
成物をコードする。両者の場合、毒性物質は、病原性条
件に関係するウィルス構造体及び他の物質を含む細胞に
単に位置するであろう。たとえば他の物は、細胞に存在
する病原性ウィルスゲノムの転写及び翻訳を通して生成
されるタンパク質であり得る。病原性条件に対する特異
性はまた、その病原性条件により影響される細胞への組
換えレトロウィルスの侵入の標的を通して達成され、又
はさらに増強され得る。細胞においていづれかの物質を
「発現する」又は「生成する」ウィルス構造物が言及さ
れる場合、これは実際、細胞におけるウィルスＲＮＡの
逆転写に続くその得られるプロウィルスの作用を言及す
る。
【００２１】関連する観点において、本発明はまた、所
望されない又は有害な免疫応答を減じ又は排除するため
の方法も提供する。適切な場合、免疫抑制が、免疫抑制
性遺伝子、たとえばアデノウィルスのウィルス起源Ｅ３
遺伝子の標的発現により達成され得る。
【００２２】本発明のもう１つの観点においては、ウィ
ルス粒子と細胞、細胞と細胞又は細胞と因子との相互作
用を阻止するための方法が開示される。その方法は一般
的に、感染された阻止成分の発現を指図する組換え体複
製欠陥レトロウィルスにより敏感な細胞を感染せしめる
ことを含んで成り、ここで前記阻止成分は、細胞受容体
が細胞間又は細胞表面上に存在する場合、その受容体
（好ましくは、宿主細胞受容体）と結合することができ
る。
【００２３】組換えレトロウィルスが上記のように免疫
原性又は阻害作用に影響を及ぼす手段にもかかわらず、
そのレトロウィルスのゲノムは「複製欠陥」である（す
なわち、それにより感染された細胞において生殖するこ
とができない）ことが好ましい。従って、インビトロ又
はインビボ適用においては、一段階の感染のみが存在
し、これによって挿入突然変異形成の可能性を実質的に
減じる。好ましくは、この末端において助けるために、
組換えレトロウィルスは少なくとも１種のｇａｇ、ｐｏ
ｌ又はｅｎｖ遺伝子を欠く。さらに、組換えウィルスベ
クターは、好ましくは、キメラである（すなわち、所望
する結果を生成する遺伝子はレトロウィルスの残りの物
よりも他の異なった源からのものである）。キメラ構造
体は、組換えレトロウィルスにより感染された細胞内で
の組換えの可能性をさらに減じ、これはウィルス粒子を
生成することができるゲノムを生成することができる。
【００２４】本発明のもう１つの観点においては、上記
方法を実施し、そして他の治療遺伝子を担持することに
おいて有用である組換えレトロウィルスが開示される。
本発明はまた、レトロウィルスのゲノムがカプシド及び
エンベロープ、好ましくはパッケージング細胞の使用に
よりパッケージされるような組換えレトロウィルスを生
成するための方法を提供する。そのパッケージング細胞
は、生存するレトロウィルス粒子の生成のために必要な
すべての細胞を生成するウィルスタンパク質−コード配
列、すなわちレトロウィルス粒子へのＲＮＡのパッケー
ジングを向けるであろうパッケージングシグナルと共に
所望する遺伝子を担持するであろうＲＮＡウィルス構造
物を、所望により２種のプラスミドの形で供給される。
【００２５】本発明はさらに、下記のことを促進するこ
とができる組換えレトロウィルスを生成するための多く
の技法を供給する： ｉ）パッケージング細胞から高い力価の生成； ｉｉ）パッケージング細胞の使用を含まない手段による
ベクター構造体のパッケージング； ｉｉｉ）前もって選択された細胞系のために標的を決定
され得る組換えレトロウィルスの生成；及び ｉｖ）細胞のゲノムにおける前もって選択された部位又
は複数の部位中へのプロウィルス構造体の組込み。
【００２６】パッケージング細胞から高い力価を生成す
るための１つの技法は、パッケージング細胞からの力価
を制限することができる多くの要因の発現を利用し、こ
こで前記最大の制限の１つは、パッケージングタンパク
質、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質の発
現のレベル及びプロウィルスベクターからのレトロウィ
ルスベクターＲＮＡの発現のレベルである。この技法
は、前記パッケージングタンパク質及びベクター構造体
ＲＮＡの高レベルの発現を有する（すなわち高い濃度を
生成する）パッケージング細胞の選択を可能にする。よ
り詳しくは、この技法は、パッケージングタンパク質
（たとえばｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖタンパク質）又は
標的細胞のゲノム中に担持される対象の遺伝子（典型的
にはベクター構造物）のいづれかである「一次物質」と
して本発明に言及される高レベルのものを生成するパッ
ケージング細胞の選択を可能にする。これは、パッケー
ジング細胞に一次物質を発現する遺伝子（「一次遺伝
子」）及び選択可能な遺伝子、好ましくは一次遺伝子か
ら下流の遺伝子を担持するゲノムをパッケージング細胞
に供給することによって達成される。選択可能な遺伝子
は、パッケージング細胞において選択可能なタンパク
質、好ましくは細胞毒性薬物に対する耐性を運ぶタンパ
ク質を発現する。次に、その細胞が、臨界レベルで選択
可能なタンパク質を発現するこれらの細胞の同定を可能
にする選択物質、好ましくは細胞毒性薬物に暴露される
（すなわち、細胞毒性薬物の場合、生存のために必要と
されるレベルの耐性タンパク質を生成しないこれらの細
胞を殺害することにより）。
【００２７】好ましくは、上記に簡単に記載された技法
においては、選択可能な遺伝子及び一次遺伝子の両者の
発現が同じプロモーターにより制御される。この事につ
いては、レトロウィルス５’ ＬＴＲを使用することが
好ましい。パッケージング細胞からの組換えレトロウィ
ルスの力価を最大にするためには、まずこの技法を用い
て、必要とされるすべてのパッケージングタンパク質を
高レベルで発現するパッケージング細胞を選択し、そし
て所望するプロウィルス構造体によるトランスフェクシ
ョンの後、組換えレトロウィルスの最高力価を生成する
これらの細胞を選択する。
【００２８】パッケージング細胞の使用を包含しない手
段によるベクター構造物のパッケージングのための技法
がまた提供される。これらの技法は、ＤＮＡウィルス、
たとえばバキュロウィルス、アデノウィルス又はワクシ
ニアウィルス、好ましくはアデノウィルスを使用する。
これらのウィルスは、その中に供給される外因性遺伝子
からタンパク質を、比較的高レベルで発現することが知
られている。そのようなＤＮＡウィルスベクターのため
には、組換えＤＮＡウィルスが、ウィルスＤＮＡとレト
ロウィルス又はレトロウィルスのベクター遺伝子を担持
するプラスミドとの間の組織培養におけるインビボ組換
えにより生成され得る。レトロウィルスタンパク質又は
レトロウィルスベクターＲＮＡをコードするいづれかの
配列を担持するその得られたＤＮＡウィルスベクター
は、高い力価の原液に精製される。他方、その構造物
は、インビトロで構成され、そして続いて、ＤＮＡベク
ターに欠失するトランスウィルス機能を提供する細胞中
にトランスフェクトされる。その生成方法にもかかわら
ず、高い力価（１０7〜１０11単位／ｍｌ）の原液が調
製され、これは、敏感な細胞の感染に基づいて、レトロ
ウィルスタンパク質（たとえばｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ
ｖ）又はＲＮＡレトロウィルスベクターゲノムもしくは
両者の高レベルの発現を引き起こす。これらの原液のみ
又は組合して含む培養における細胞の感染は、その原液
がウィルスタンパク質及びウィルスベクター遺伝子を担
持する場合、レトロウィルスベクターの高レベルの生成
を導くであろう。アデノウィルス又は他の哺乳類ベクタ
ーと共に使用される場合、この技法は、組換えレトロウ
ィルスベクターを生成するために一次細胞（たとえば組
織片又は細胞、たとえばワクチンの生成に使用されるＷ
Ｉ３８からの）の使用を可能にする。
【００２９】前記技法に代わる技法においては、組換え
レトロウィルスが、まず、前記技法に類似する態様で適
切な組換えＤＮＡウィルスにより感染された細胞系から
ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質を生成することに
よって生成される（但し、前記細胞系は、ベクター構造
物を担持するＤＮＡウィルスにより感染されていな
い）。続いて、そのタンパク質は精製され、そしてイン
ビトロで製造された所望するウィルスベクターＲＮＡ、
トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リポソーム、及び
ｅｎｖタンパク質をリポソーム中において処理するため
の細胞抽出物と接触せしめ、その結果、ウィルスベクタ
ーＲＮＡを担持する組換えレトロウィルスが生成され
る。この技法においては、前記混合物の残留物とそれら
とを接触する前、リポソーム中にｅｎＶタンパク質を処
理することが必要である。
【００３０】ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質はま
た、真核細胞、酵母又は細菌中におけるプラスミド介在
トランスフェクションの後、製造され得る。
【００３１】前もって選択された細胞系のために標的を
定めされ得る組換えレトロウィルスを生成するための技
法は、第１レトロウィルス表現型の細胞質セグメント及
び前記第１レトロウィルス表現型に対して外因性の細胞
外結合セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝を有する組換
えレトロウィルスを利用する。前記結合セグメントは、
第２ウィルス表現型又は所望する標的に結合するであろ
うペプチドとして発現されるように選択される所望する
結合性質を有する他のタンパク質からである。
【００３２】標的細胞のＤＮＡにおける特異的部位でレ
トロウィルスゲノムを組込むための技法は、相同組換え
の使用又は標的細胞ゲノム上での特異的部位を認識する
であろう変性されたインテグラーゼ酵素の使用を包含す
る。そのような部位特異的挿入は、挿入突然変異の機会
を最少にし、ＤＮＡ上の他の配列からの妨害を最少に
し、そして標的細胞のＤＮＡにおける所望しない遺伝子
（たとえばウィルス遺伝子）の発現を減じ又は排除する
ために特異的な標的部位での配列の挿入を可能にするで
あろう標的細胞のＤＮＡ上での部位で遺伝子の挿入を可
能にする。
【００３３】適切には、上記技法のいづれかが、特別な
情況下で単独で使用され、又は１又は複数の残る技法と
一緒に使用され得る。
【００３４】本発明は、組換えレトロウィルスであっ
て、感染性、癌性、自己免疫又は免疫疾患を、妨げ、阻
害し、安定化し、又は反転することができるベクター構
造体を担持するレトロウィルスを提供する。
【００３５】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞にお
いてそのタンパク質又はその一部の発現を指図する。
【００３６】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞にお
いてその抗原又は変性された形の発現を指図し、上記抗
原又はその変性された形が動物内で免疫応答を刺激する
ことができる。
【００３７】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞にお
いて病原性抗原の変性された形の発現を指図し、上記変
性された抗原は動物内で免疫応答を刺激することがで
き、そして病原性抗原に対する低められた病原性を有す
る。
【００３８】好ましい実施態様では、上記発現された抗
原は細胞介在の免疫応答を誘発する。
【００３９】好ましい実施態様では、上記発現された抗
原はＨＬＡクラスＩ−及び／又はクラスＩＩ−制限免疫
応答を誘発する。
【００４０】好ましい実施態様では、上記発現された抗
原は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｐｇ４１又はその変
性された形から成る群から選択されたＨＩＶタンパク質
である。
【００４１】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、対象の抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体又は免疫
グロブリンの発現を指図する。
【００４２】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において
緩和剤の発現を指図し、上記緩和剤は病原性のために必
要な病原体の機能を阻害することができる。
【００４３】好ましい実施態様では、上記病原体はウィ
ルスであり、そして上記阻害された機能は感染された細
胞からのウィルスの吸着、複製、遺伝子発現、集合及び
退去から成る群から選択される。
【００４４】好ましい実施態様では、上記病原体は癌細
胞又は癌促進性成長因子であり、そして上記阻害された
機能は細胞複製、外部シグナルに対する感受性及び抗腫
瘍遺伝子の産生の欠乏から成る群から選択される。
【００４５】好ましい実施態様では、上記ベクター構造
体は上記病原体に関係する生物の上記細胞における存在
に応答して感染された標的細胞に毒性緩和剤の発現を指
図する。
【００４６】好ましい実施態様では、上記緩和剤は病原
性遺伝子の発現又は効果を選択的に阻害することができ
る。
【００４７】さらに好ましい実施態様では、上記緩和剤
はウィルスプロテアーゼに対して特異的な阻害ペプチド
を含んで成る。
【００４８】好ましい実施態様では、上記緩和剤は病原
性のために必要なＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスＲ
ＮＡを含んで成る。
【００４９】好ましい実施態様では、上記緩和剤は、病
原性ゲノム中への組換え又は組込みを、その機能を破壊
するために促進する。
【００５０】好ましい実施態様では、上記緩和剤は、病
原体の欠陥構造タンパク質を含んで成り、上記タンパク
質は病原体の集合を阻害することができる。
【００５１】好ましい実施態様では、上記ベクター構造
体は、不活性前駆体を病原体の活性インヒビターに活性
化することができるＨＳＶＴＫ遺伝子生成物又は他の遺
伝子生成物の発現を指図する。
【００５２】好ましい実施態様では、上記ベクター構造
体は腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を指図する。
【００５３】好ましい実施態様では、上記ベクター構造
体は、病原体の存在下で毒性生成物に、ほとんど又はま
ったく細胞毒性でない化合物を活性化し、それによって
病原体に対して局在された治療をもたらすタンパク質の
発現を指図する。
【００５４】より好ましい実施態様では、上記タンパク
質はヘルペスチミジンキナーゼである。
【００５５】より好ましい実施態様では、上記タンパク
質はＣＤ４である。
【００５６】より好ましい実施態様では、上記ベクター
構造体は、病原体に由来するタンパク質によるプロセッ
シング又は変性に基づいて毒性であるタンパク質の発現
を指図する。
【００５７】好ましい実施態様では、上記ベクター構造
体は、レトロウィルスにより感染され、そして病変体を
含む標的細胞の表面上にレポーター生成物を発現する。
【００５８】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞にお
いて免疫システムを抑制することができる遺伝子の発現
を指図する。
【００５９】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において
阻害成分の発現を指図し、上記阻害成分は、受容体／病
原体の相互反応が阻害されうるように受容体又は病原体
のいづれかに結合することができる。
【００６０】１つの実施態様では、上記ベクター構造体
は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において
阻害成分の発現を指図し、上記阻害成分は、受容体／エ
ンベロープタンパク質の相互反応が阻害されるように受
容体又はエンベロープタンパク質に結合することができ
る。
【００６１】好ましい実施態様では、上記阻害成分は感
染された細胞から分泌される。
【００６２】１つの実施態様では、上記レトロウィルス
は複製欠陥である。
【００６３】本発明は、組換えレトロウィルスを生成す
るための方法であって：上記の複製欠陥組換えレトロウ
ィルスが生成されるようにベクター構造体をカプシド及
びエンベロープにパッケージングすることを含んで成る
方法を提供する。
【００６４】本発明は、上記のいづれかの組換えレトロ
ウィルスにより感染されたＥＸ ｖｉｖｏ細胞を提供す
る。
【００６５】本発明は、上記のいづれかの組換えレトロ
ウィルスにより感染された真核細胞であって、上記細胞
が上記ベクター構造体のいづれか１つを含む感染性粒子
を生成することができる真核細胞を提供する。
【００６６】本発明は、上記のいづれかのレトロウィル
ス及び生理学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含
んで成る医薬組成物を提供する。１つの実施態様では、
この医薬組成物は、活性治療物質として使用される。
【００６７】本発明は、特定の遺伝子を担持するウィル
スの存在についてサンプルを試験するための方法であっ
て、ここで上記遺伝子が（１）マーカー生成物を発現す
ることができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と
非発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えること
により同定タンパク質の存在に応答する制御配列を有す
る指示細胞において同定タンパク質を発現することがで
き；指示細胞とサンプルとを接触し、そしてマーカー生
成物の存在について試験することを含んで成る方法を提
供する。
【００６８】本発明は、細胞サンプルにおける特定の遺
伝子の存在について試験するための方法（上記遺伝子は
同定タンパク質を発現することができる）であって：
（１）細胞サンプルにおいてマーカー生成物を発現する
ことができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非
発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることに
よりサンプル内の細胞において同定タンパク質の存在に
応答する制御配列をコードするベクター構造体を含んで
成る組換えレトロウィルスによりサンプル内の細胞を感
染せしめ；そしてマーカー生成物の存在について試験す
ることを含んで成る方法を提供する。１つの実施態様で
は、上記制御配列は、転写状態と非転写状態との間にマ
ーカー遺伝子を変えることによりそのマーカー生成物の
発現を変える。
【００６９】本発明は、指示細胞において同定タンパク
質を発現することができる特定の遺伝子を担持するウィ
ルスの存在について試験するために適切な指示細胞であ
って、その指示細胞が、（１）指示細胞においてマーカ
ー生成物を発現することができるマーカー遺伝子；及び
（２）発現状態と非発現状態との間にマーカー遺伝子の
発現を変えることにより指示細胞において同定タンパク
質の存在に応答する制御配列をコードするゲノムを有す
ることを特徴とする指示細胞を提供する。
【００７０】本発明は、細胞を感染せしめ、そして同定
タンパク質を生成する特定の遺伝子の存在について試験
するために適切な組換えレトロウィルスであって、
（１）上記細胞においてマーカー生成物を発現すること
ができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非発現
状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることによ
り、細胞における同定タンパク質の存在に応答する制御
配列をコードするゲノムを有する組換えレトロウィルス
を提供する。
【００７１】本発明は、パッケージングタンパク質及び
対象の遺伝子生成物から選択された高レベルの一次物質
を生成するパッケージング細胞を選択するための方法で
あって：（ａ）一次物質を発現する一次遺伝子及び上記
一次物質よりも低いレベルで選択可能なタンパク質を発
現する選択可能な遺伝子を含んで成るゲノムをパッケー
ジング細胞に供給し（ここで上記一次遺伝子及び選択可
能な遺伝子の発現レベルは比例する）；（ｂ）臨界レベ
ルで選択可能なタンパク質を発現するこれらの細胞の同
定を可能にする選択物質に上記パッケージング細胞を暴
露し；そして（ｃ）高レベルの一次物質を発現するこれ
らのパッケージング細胞を検出することを含んで成る方
法を提供する。
【００７２】本発明は、組換えレトロウィルスを生成す
るための方法であって：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタン
パク質を生成することができる組換えウィルスにより感
染された細胞系から上記タンパク質を生成せしめ；そし
てウィルスベクターＲＮＡを担持する組換えレトロウィ
ルスを生成するために、粒子集合のための機能の不足を
補足するウィルスベクターＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リポソー
ム及び細胞抽出物と上記タンパク質とを接触せしめるこ
とを含んで成る方法を提供する。
【００７３】本発明は、組換えレトロウィルスを生成す
るための方法であって：（ａ）別々に、又は一緒に、ｇ
ａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウィルスベクターゲノ
ムをコードする組換えウィルスベクターを生成し；
（ｂ）上記ベクターの高い力価の原液を生成し；そして
（ｃ）組換えレトロウィルスベクターを生成するために
一次細胞又は他の細胞を同時感染せしめることを含んで
成る方法を提供する。
【００７４】本発明は、レトロウィルスの生成方法であ
って：（ａ）対象の遺伝子及び第一レトロウィルス表現
型のパッケージングシグナル；（ｂ）パッケージングシ
グナルのない上記第一レトロウィルス表現型のｇａｇ及
びｐｏｌ遺伝子；（ｃ）パッケージングシグナルを欠く
ハイブリッドｅｎｖ遺伝子（該ハイブリッドｅｎｖ遺伝
子の生成物は、第一レトロウィルス表現型の細胞質セグ
メント及び第一レトロウィルス表現型に対して外因性の
結合セグメントを含んで成る）を含んで成るゲノムを有
する生産体細胞を増殖せしめることを含んで成る方法を
提供する。
【００７５】本発明は、標的細胞に対象の遺伝子を選択
的に担持することができるレトロウィルスを調製するた
めに有用なハイブリッドｅｎｖ遺伝子であって、（ａ）
第一レトロウィルス表現型の細胞質セグメント；及び
（ｂ）上記第一レトロウィルス表現型に対して外因性の
結合セグメント（該結合セグメントは、標的細胞に選択
的に結合することができる）をコードするｅｎｖ遺伝子
を提供する。
【００７６】本発明は、ベクター構造体を担持する組換
えレトロウィルスであって：（ａ）標的細胞のゲノム上
の予備選択された部位に挿入されるべき外因性遺伝子；
及び（ｂ）上記予備選択された部位に隣接する標的細胞
のゲノムの対応する配列に実質的に相同なセグメント
（上記配列は、相同性組換えが予備選択された部位で標
的細胞のゲノムと上記ベクター構造体との間で生じるよ
うに十分な長さのものである）を含んで成る組換えレト
ロウィルスを提供する。
【００７７】本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択
された部位中に外因性遺伝子を挿入する方法であって、
（ａ）外来性遺伝子；（ｂ）上記予備選択された部位に
隣接する標的細胞のゲノムの対応する配列に実質的相同
なセグメント（上記配列は、予備選択された部位で標的
細胞のゲノムとベクター構造体との間での相同性組換え
を促進するために十分な長さである）を含んで成るゲノ
ムを有する組換えレトロウィルスに上記標的細胞を暴露
することを含んで成る方法を提供する。
【００７８】本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択
された部位中にそのゲノムを組込むことができる組換え
レトロウィルスを生成するための方法であって：ベクタ
ーをカプシド及びエンベロープにパッケージングし、そ
して上記予備選択された部位中にレトロウィルスのゲノ
ムを組込むことができるインテグラーゼの変性された形
をウィルス粒子に含むことを含んで成る方法を提供す
る。
【００７９】本発明は、組換えレトロウィルスの生成方
法であって：ｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖウィルス構造体を
含むトランスジニック動物又は昆虫とプロモーターを含
むベクター構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫
とを交配し；上記トランスジニック動物又は昆虫の子孫
を分離し；上記子孫から選択された細胞を分離し；上記
細胞を適切な培地中で増殖せしめ；そしてその細胞から
組換えレトロウィルスを分離することを含んで成る方法
を提供する。
【００８０】本発明は、トランスジニックパッケージン
グ動物又は昆虫を生成するための方法であって；パッケ
ージングのために必要な（いくつかの、但しすべてでは
ない）ウィルスタンパク質をコードするベクター構造体
を含むトランスジニック動物又は昆虫と上記必要なウィ
ルスタンパク質の残りをコードするベクター構造体を含
むトランスジニック動物又は昆虫とを交配し；そして上
記トランスジニック動物又は昆虫の子孫を分離すること
を含んで成る方法を提供する。
【００８１】１つの実施態様では、高力価の組換えレト
ロウィルスを産生することができる一次細胞を産生する
ために、上記子孫とベクター構造体を含むトランスジニ
ック動物又は昆虫とを交配する段階をさらに含んで成
る。
【００８２】１つの実施態様では、高力価の組換えレト
ロウィルスを産生することができる一次細胞を産生する
ために、ベクター構造体を含む組換えレトロウィルスに
より、上記子孫から移植された細胞を感染せしめる段階
をさらに含んで成る。
【００８３】本発明のこれらの及び他の観点は、次の発
明の実施の形態及び添付の図面により明らかになるであ
ろう。
【００８４】
【発明の実施の形態】Ｉ．免疫刺激 外来性病原体を認識し、そして定義する能力は、免疫シ
ステムの機能の中心である。免疫認識を通して、このシ
ステムは、「非自己」（外来性）と「自己」とを区別す
ることができ、これは欠陥機構が宿主組織に対するより
もむしろ侵入する実在物に向けられることを確保するこ
とが不可欠である。免疫システムの基本特徴は、高い多
形性細胞表面認識構造物（受容体）及び侵入する病原体
の破壊のためのエフェクター機構（抗体及び細胞溶解性
細胞）の存在である。
【００８５】細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＭＨ
ＣクラスＩ又はクラスＩＩ細胞表面タンパク質と共に処
理された病原特異的ペプチドの表示により通常誘発され
る。本発明の１つの態様において、適切なＭＨＣ分子に
おける免疫原性ウィルス決定因子の表示は、病原体に患
者を暴露しないで最適なＣＴＬ応答を効果的に誘発す
る。この免疫刺激へのベクターアプローチは、保護的な
及び治療的なＣＴＬ応答を誘発するより効果的な手段を
提供する。なぜならば、ベクターにより誘発される免疫
性の型は、天然の感染への暴露により誘発される型に非
常に似ているからである。いくつかのウィルスシステム
の現在の知識に基づけば、外来的に供給された非複製ウ
ィルス抗原、たとえばペプチド及び精製された組換えタ
ンパク質は、最適なクラスＩ−制限ＣＴＬ応答を誘発す
るのに十分な刺激を供給するであろう見込みはない。他
方、本発明に記載されるような標的細胞内での選択され
たウィルスタンパク質のベクター担持発現は、そのよう
な刺激を供給する。
【００８６】例によれば、ＨＩＶ−１感染の場合、患者
は、種々のウィルスエンベロープ−領域抗原決定基に対
して特異的な抗体を増殖し、これらのいくつかは、イン
ビトロにおいてウィルスを中和することができる。それ
にもかかわらず、疾病の進行は続き、そして患者は、結
果的に疾病に負ける。感染された患者の細胞（Ｐｌａｔ
ａなど．、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３４８〜３５１、１
９８７）及びＨＩＶ、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖを発現
する組換えワクシニアベクターにより感染された標的細
胞（Ｗａｌｋｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３４
５〜３４８、１９８７；Ｗａｌｋｅｒなど．、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４０：６４〜６６、１９８８）に対する低レ
ベルのＣＴＬ応答は、いく人かのＨＩＶ−１血清陽性患
者に検出された。さらに、ネズミ及びヒトＣＴＬが、ト
ランスフェクションを通してＨＩＶ ｇｐ１２０を発現
する同源の刺激細胞により誘発され得る（Ｌａｎｇｌａ
ｄｅ−Ｄｅｍｏｙａｎなど．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４１：１９４９、１９８８）。改良されたＣＴＬ誘発
は、注入された患者に対して治療的に好都合であり、そ
して非感染性条件下で個人に効果的な予防治療を提供す
る。ＨＩＶ感染自体は、ＨＩＶ感染に関係する他の要素
が適切な免疫刺激を妨げないので、適切なＣＴＬ応答を
生成しないかも知れない。さらに、感染された細胞によ
るＴ細胞の刺激は、刺激されたＴ細胞の感染を導く相互
作用であるかも知れない。
【００８７】例１は、パッキング細胞にレトロウィルス
ベクターを生成することができるプラスミドを構成する
ための方法を記載し、ここで前記ベクターは、ＨＩＶウ
ィルス抗原の発現を導く。
【００８８】
【実施例】例１ ＨＩＶ抗原を発現するベクター Ａ．Ｅｎｖ発現ベクター（第１図を参照のこと）：２．
７ＫｂのＫｐｎ−ＸｈｏＩＤＮＡフラグメントを、ＨＩ
ＶプロウィルスクローンＢＨ１Ｏ−Ｒ３（たとえば、Ｒ
ａｔｎｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７、１
９８５）から分離し、そしてＩＩＩｅｘＥ７ｄｅｌｔａ
ｅｎｖ（Ｂａｌ３１欠失−ｎｔ．５４９６）からの約４
００ｂｐのＳａｌ−ＫｐｎＩＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドＳＫ+のＳａｌＩ部位中に連結した。このクロ
ーンから、ｅｎｖ発現のために不可欠なｒｅｖをまたコ
ードする３．１ＫｂのｅｎｖＤＮＡフラグメント（Ｘｈ
ｏＩ−ＣｌａＩ）を精製し、そしてｐＡＦＶＸＭ（Ｋｒ
ｉｅｇｌａｒなど．、Ｃｅｌｌ ３８：４８３、１９８
４を参照のこと）と呼ばれるレトロウィルスベクター中
に連結した。このベクターを変性し、すなわち、Ｂｇｌ
ＩＩ部位が、ＨＩＶ ｅｎｖコードＤＮＡフラグメント
のクローニングを促進するためにＸｈｏＩ部位にリンカ
ーの挿入により変えられた。ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子の発現を誘導するＳＶ４０初期プロ
モータから成る優性の選択可能なマーカー遺伝子を、感
染され、そしてトランスフェクトされた細胞系の単離を
促進するためにＣｌａＩ部位でベクター中に挿入した。
【００８９】ベクターにおけるＥＮＶ遺伝子から上流の
ＸｈｏＩ部位は、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期又
は後期プロモーター、ＣＭＶ即時初期（ＩＥ）プロモー
ター、ヒトβ−バクチンプロモーター及びＭｏｌｏｎｙ
ネズミＭＬＶ ＳＬ３−３プロモーターとしてベクター
構造物中に追加のプロモーターを挿入するための便利な
部位を供給する。
【００９０】１つのそのようなプロモーター、すなわち
ＣＭＶ即時初期遺伝子プロモータ（６７３ｂｐのＨｉｎ
ｃＩＩ〜ＥａｇＩＤＮＡフラグメント）は、親構造物ｐ
ＡＦＥＮＶr ＳＶ2 Ｎｅｏと比較する場合、ＳｕｐＴＩ
と呼ばれるヒトＴ細胞系におけるＥＮＶ発現の１０倍の
上昇をもたらす。
【００９１】Ｂ．Ｇａｇ発現ベクター：２．５ＫｂのＳ
ａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントをｐＢＨ１Ｏ
−Ｒ３（Ｒａｔｎｅｒなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照の
こと）から単離し、そしてｐＵＣ３１のＳａｃＩ−Ｓａ
ｌＩ部位中に連絡した。ｐＵＣ３１は、ポリリンカーの
ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位の間に挿入される追加のＸ
ｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｓｔＩＩ及びＮｃｏＩ部位を
有するｐＵＣ１９に由来する。しかしながら、この構造
物は、ＨＩＶからの主要スプライス供与体（ＳＤ）部位
を含み、そして従ってウィルスの世代において問題を有
する。そのＳＤ部位は、２．１ＫｂのＣｌａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ ＤＮＡフラグメント及び７０ｂｐのＲｓａＩ−Ｃ
ｌａＩフラグメントをＳＫ+のＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ部位中にサブクローンすることによって除去された。
ＢａｍＨＩ部位を、リンカー挿入によりＣｌａＩ部位中
に転換した。この構造物を、ＳＫ+ ｇａｇプロテアーゼ
ＳＤデルタと命名した。
【００９２】ＳＫ+ ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタから
の２．５ＫｂのＸｈｏＩ−ＣｌａＩＤＮＡフラグメント
を、上記のようにしてベクターｐＡＦＶＸＭのＸｈｏＩ
／ＣｌａＩ部位中に挿入した。
【００９３】適切なパッケージング細胞に配置される場
合、これらのプラスミドは、パッケージングシグナルを
含むレトロウィルスベクター構造物を発現した。このパ
ッケージングシグナルは、キャプシド及びエンベロープ
並びに生存するレトロウィルス粒子のために必要とされ
るすべての追加のタンパク質中へのベクター構造物のパ
ッケージングを指図した。キャプシド、エンベロープ及
び他のタンパク質は、好ましくは、パッケージング細胞
に配置される適切なゲノムを含む１又は複数のプラスミ
ドから生成される。そのようなゲノムはプロウィルス構
造物であり、これは、単純な場合、欠失されたパッケー
ジングシグナルを単に有することができる。結果とし
て、単にベクターがパッケージされるであろう。適切な
パッケージング又はパッケージング細胞系、及びそのよ
うなパッケージングを達成するために必要なゲノムは、
Ｍｉｌｌｅｒなど．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．
６：２８９５、１９８６）に記載され、これは引用によ
り本明細書に組込まれる。Ｍｉｌｌｅｒなどにより記載
されるように、複製欠陥でないウィルス粒子の生成をも
たらすことができる、パッケージング細胞系内に生じる
組換え出来事の機会を減じるために、追加の変化が、パ
ッケージングシグナルの単純な欠失以外のプロウィルス
構造物に行なわれることが好ましい。
【００９４】例１は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質
（ｇｐ）又は他のウィルス抗原を生成するための方法の
単なる例示であることが理解されるであろう。少ないＴ
細胞変性効果を伴って、免疫応答を同様に刺激するであ
ろう標的細胞上に変性されたＨＩＶエンベロープｇｐを
発現するプロウィルスベクター構造物を供給することも
また可能である。エンベロープ糖タンパク質は、たとえ
ばＫｏｗａｌｓｋｉなど（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１
３５１、１９８７）（引用により本明細書に組込まれ
る）の論文の開示の使用により、当業者において良く知
られている技法を用いて適切に変性され得る。従って、
プロウィルス構造物は、そのような適切に変性されたｇ
ｐを発現するレトロウィルス構造物を生成する上記技法
により構成され得る。次に、この構造物を、上記のよう
にしてパッケージング細胞に配置する。パッケージング
細胞系から生成されたその得られた組換えレトロウィル
スは、敏感な標的細胞の感染を通して免疫応答を刺激す
るためにインビトロ及びインビボで使用され得る。ＨＩ
Ｖゲノムから発現される他のタンパク質、たとえばｇａ
ｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、等がまた、ＨＩＶ感染の
個人において有益な細胞応答を誘発することができる。
プロウィルスベクター、たとえば下記のものは、臨床的
に有益な免疫応答を促進するために、そのようなタンパ
ク質を発現するように企画されている。ｒｅｖコード配
列及びｒｅｖ応答成分を含むことがあるベクターのため
に必要である（Ｒｏｓｅｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５：２０７１、１９８
８）。
【００９５】次の例は、マウスにおけるＣＴＬ応答を誘
発するためにこのタイプの処理の能力を例示する。
【００９６】例２ レトロウィルスベクターをコードする抗原に対する免疫
応答 ネズミの腫瘍細胞系（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）（Ｈ−２d）
を、ＨＩＶ ｅｎｖをコードするｐＡＦ ｅｎｖr ＳＶ
４０ Ｎｅｏベクター構造物により感染せしめた。次
に、１つのクローン化されたＨＩＶ−ｅｎｖ発現細胞系
（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９）を用いて、同系（すなわちＭ
ＨＣと同一の）のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）マウスにお
けるＨＩＶ−ｅｎｖ−特異的ＣＴＬを刺激した。マウス
を、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９細胞（４×１０7個の細胞）
による腹膜内注射により免疫化し、そして７〜１４日目
に追加免疫した。応答物の脾臓細胞懸濁液をこれらの免
疫化されたマウスから調製し、そしてその細胞を１：５
０の刺激物：応答物細胞の比で、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９
又はＢ／Ｃ１０ＭＥマイトシン−Ｃ−処理細胞のいづれ
かの存在下で４日間インビトロで培養した。そのエフェ
クター細胞をこれらの培養物から収穫し、計数し、そし
て標準の４〜５時間の51Ｃｒ−開放アッセイにおいて、
種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で放射性ラ
ベルされた（51Ｃｒ）標的細胞（すなわちＢ／Ｃ１０Ｍ
Ｅｅｎｖ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥ）と共に混合した。
インキュベーションの後、マイクロタイタープレートを
遠心分離し、培養上清液１００μｌを除き、そして溶解
された細胞から開放された放射性ラベルの量を、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ γ分光計で定量した。標的細胞の溶解率を次
のようにして計算した：％標的溶解率＝ Ｅｘｐ ＣＰ
Ｍ−ＳＰ ＣＰＭ／ＭＲ ＣＰＭ−ＳＲ ＣＰＭ×１０
０、ここで１分当たりの実験的な計数（Ｅｘｐ ＣＰ
Ｍ）はエフェクター＋標的を表わし；自発的な開放（Ｓ
Ｐ）ＣＰＭは標的のみを表わし；そして最大の開放（Ｍ
Ｒ）ＣＰＭは１ＭのＨＣｌの存在下での標的を表わす。
【００９７】その結果（第４図）は、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ標
的よりも一層効果的にＨＩＶ−ｅｎｖ−発現標的細胞
（Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９）を特異的に溶解するＣ
ＴＬエフェクターが誘発されたことを示す。非−ＨＩＶ
−ｅｎｖ−発現対照細胞（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）によりイン
ビトロで再刺激された感作脾臓細胞は、特に低いＥ：Ｔ
細胞比で、Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９又はＢ／Ｃ１０
ＭＥ標的のいづれに対する有意なＣＴＬ活性も示さなか
った。Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９によりインビトロで
再刺激された免疫化されていない実験用Ｂａｌｂ／ｃマ
ウスから得られた脾臓細胞は、ＣＴＬを生成せず、従っ
て、インビボでの感作及び追加免疫化の重要性を示し
た。この実験をくり返し、そして類似する結果を得た。
【００９８】他の実験においては、同じｐＡＦ ｅｎｖ
r ＳＶ４０ Ｎｅｏ（ＨＩＶ−ｅｎｖ）ベクター構造物
により感染された異なったＨ−２d ＨＩＶ−ｅｎｖ−発
現腫瘍細胞クローン（Ｌ３３−４１）により免疫化さ
れ、追加免疫化され、そしてインビトロで再刺激された
Ｂａｌｂ／ｃマウスから得られたエフェクター細胞は、
Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９標的細胞を溶解することが
できた。これは、これらのマウスに生成されたＣＴＬ
は、これらの細胞上でユニークな腫瘍細胞抗原よりもむ
しろＨＩＶ−ｅｎｖの発現形を特異的に認識する追加の
支持を提供する。この結果はまた、ベクター担持抗原が
２種の腫瘍細胞系により類似する態様で与えられること
も示唆する。
【００９９】ヒトにおけるこの免疫刺激適用の手段は、
（１）対照の抗原をコードする遺伝子が細胞に送られ、
（２）抗原が適切な細胞において発現され、そして
（３）ＭＨＣ制限の必要条件、すなわちクラスＩ及びク
ラスＩＩ抗原の相互作用が満たされることを必要とす
る。ベクターの調製は、通常の培地において生成細胞を
増殖し、１０ｍｇ／ｍｌでのＰＢＳ及びヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）溶液により細胞を洗浄し、次にＰＢＳ及
びＨＳＡにおいて８〜１６時間、その細胞を増殖せしめ
ることによって行なわれる。得られた力価は、ベクタ
ー、パッケージング細胞系又は特に生成系のクローンに
依存して、典型的には１０4〜１０6／ｍｌである。ベク
ター上清液を濾過し、細胞を除き、そして１００，００
０又は３００，０００通過Ａｍｉｃｏｎフィルターを通
しての濾過により１００倍に濃縮する（Ｗｏｌｆｆな
ど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８
４：３３４４、１９８７）。これは、１００，０００又
は３００，０００の球状タンパク質の通過を可能にする
が、しかし感染性粒子としてウィルスベクターの９９％
を保持する。原液は貯蔵のために凍結され得る。なぜな
らば、それらは凍結及び融解で感染性単位の約５０％を
失うからである。最も直接的な方法は、適切な遺伝子担
持ベクターの個人への投与及び続いて免疫応答の刺激を
開始することができる、適切な細胞に効果的に標的を定
めるベクターの能力に対する信用性を包含する。その投
与量は、ｋｇ体重当たり１０5〜１０6の感染単位であろ
う。しかしながら、より実用的なアプローチは、それぞ
れの個人から得られた患者の末梢血液リンパ球（ＰＢ
Ｌ）、繊維芽細胞又は他の細胞のベクターによる体外処
理を包含する。ＰＢＬは、マイトジェン（植物凝集素）
又はリンホカイン（たとえばＩＬ−２）の使用により培
養物に維持され得る。このタイプのアプローチは、指図
されたベクター感染、注射の前での抗原を与える細胞集
団の発現及び拡張の調節及びそれぞれの患者へのベクタ
ー発現細胞の返還を可能にする。他のタイプの細胞もま
た、体外培養され、ベクター導入され、そしてその細胞
は患者に返還され得る。単に、適度な数の感染された細
胞（１０5〜１０6個／ｋｇ体重）が、強い免疫応答を誘
発するために必要である。
【０１００】異なった形の投与は、レトロウィルスベク
ター粒子を製造する生成細胞系の移植である。これら
は、免疫学的に相手のいない従来の生成細胞系又は患者
自身の細胞であり、これらは培養基へ移され、処理さ
れ、そして返還される（ＶＩ Ａｌｔｅｒ−ｎａｔｉｖ
ｅ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓを参照のこと）。両タイプの移植
（１０5〜１０6／ｋｇ体重）は、患者における制限され
た寿命期間を有するが、しかし身体中において多量（１
０7〜１０10個）の細胞を感染するレトロウィルスベク
ターを導くであろう。
【０１０１】いづれの場合においても、その処理の成功
は、少量の血液を除き、そしてｅｎｖ発現を導くベクタ
ーにより感染された個人自身の細胞を用いてＣＴＬ応答
を測定することによって試みられ得る。
【０１０２】病原体、たとえばＨＩＶ以外の病原性ウィ
ルスに対するＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ制限免疫応
答を刺激することが所望される場合、免疫応答を刺激す
るであろうそのようなレトロウィルスに関係するエンベ
ロープ又は他の抗原の適切な形は、当業者により確かめ
られ得る。一般的に、病原体に関係する抗原の適切な形
（これらの病原体に対する免疫応答を刺激するであろ
う）は、容易に選択され得る。
【０１０３】所望する免疫応答を生ぜしめるための他の
アプローチは、適切な細胞、たとえばＴ細胞に抗原−特
異的Ｔ細胞受容体遺伝子を送ることである。他の可能な
受容体は、細胞毒性免疫応答が制限されたＭＨＣでない
ＮＫ細胞である。特異的な免疫グロブリン遺伝子は、Ｂ
−細胞に送られる場合、同様に有用である。
【０１０４】ＩＩ．阻止剤 多くの感染性疾病、癌、自己免疫疾患、及び他の疾病
は、ウィルス粒子と細胞、細胞と細胞又は細胞と因子と
の相互作用を包含する。ウィルス感染においては、ウィ
ルスは通常、敏感な細胞の表面上の受容体を通して細胞
に侵入する。癌においては、細胞は、他の細胞又は因子
からのシグナルに不適切に応答し、又はまったく応答し
ない。自己免疫疾患においては、「自己」マーカーの不
適切な認識が存在する。本発明においては、そのような
相互作用は、相互作用におけるいづれかのパートナーの
類似体をインビボで生成することによって阻止され得
る。
【０１０５】この阻止作用は、細胞内で、細胞膜上で又
は細胞外で生じる。ウィルス又は特に、阻止剤のための
遺伝子を担持するレトロウィルスベクターの阻止作用
は、敏感な細胞を内部から介在され得又は病原体の相互
作用を局部的に阻止するために阻止タンパク質を分泌す
ることによって介在され得る。
【０１０６】ＨＩＶの場合、相互作用の２種の物質は、
ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質及びＣＤ
４受容体分子である。従って、適切な阻止剤は、病原効
果を引き起こさないでＨＩＶの侵入を阻止するＨＩＶ
ｅｎｖ類似体又はＣＤ４受容体の類似体のいづれかを発
現するベクター構造物であろう。そのＣＤ４類似体は分
泌され、そして隣接する細胞を保護するために機能し、
ところがｇｐ１２０／ｇｐ４１は分泌され、又はベクタ
ー含有細胞のみを保護するために細胞内でのみ生成され
る。安定性を強化するためには、ヒト免疫グロブリンＨ
鎖又は他の成分をＣＤ４に添加することが好都合であ
る。そのようなハイブリッド−可溶性ＣＤ４をコードす
るレトロウィルスベクターの宿主への送出は、適切なハ
イブリッド分子の連続する供給をもたらす。
【０１０７】ＨＩＶ ｅｎｖの発現を導くベクター粒子
は、上記のようにして構成され得る。その一部が、明白
な病原性の副作用を伴わないでウィルス吸着を阻止する
ことができることは当業者に明らかであろう（Ｗｉｌｌ
ｅｙなど．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：１３９、１９８
８；Ｆｉｓｈｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：６
５５、１９８６）。次の例は、感染性ベクター粒子が製
造されるＣＤ４ベクターの構成法を記載する。
【０１０８】例３ ｓＣＤ４ベクター １．ｐＭＶ７．Ｔ４（Ｍａｄｄｏｎなど．、Ｃｅｌｌ
４７：３３３、１９８６）からの１．７ＫｂのＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、ＳＫ+の
ＨｉｎｃＩＩ部位にブラント末端連結した。
【０１０９】２．ＸｂａＩ部位を含む一般的な翻訳終結
配列を、ＣＤ４フラグメントのＮｈｅＩ部位中に挿入し
た。
【０１１０】３．１．７ＫｂのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラ
グメントを切り出し、そしてｐＸＦＶＸＭのＸｈｏＩ−
ＣｌａＩ部位中にクローン化した。これらのベクタープ
ラスミドを用いて、例１に記載されているようにして感
染性ベクター粒子を生成することができる。
【０１１１】そのような感染性阻止ベクターは、培養に
おいてヒトＴ細胞系中に入れられる場合、ＨＩＶ感染の
広がりを阻害することができる。感染性レトロウィルス
ベクター調製物の調製法、濃縮及び貯蔵は、免疫刺激物
に関する通りである。投与路もまた、同じであり、そし
て投与量は約１０倍、多量である。使用され得る他の経
路は、骨髄の吸引、レトロウィルスベクターによる感染
及びこの感染された骨髄の患者への返還である（Ｇｒｕ
ｂｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１０５７、１
９８５）。骨髄の複製は、細胞の複製を通してベクター
発現を増幅するので、免疫刺激物の範囲の量が使用され
得る（１０5〜１０6／ｋｇ体重）。
【０１１２】いづれの場合においても、処置の効果は、
疾病進行の通常の指示物、たとえば抗体レベル、ウィル
ス抗原の産生、感染性ＨＩＶレベル又は非特異的感染の
レベルを測定することによって試験され得る。
【０１１３】ＩＩＩ．緩和剤の発現 上記技法に類似する技法を用いて、病原体又は遺伝子の
機能を阻止することができる物質（又は「緩和剤」）の
発現を指図するベクター構造物を有する組換えレトロウ
ィルスを生成することができる。本発明において、「機
能を阻止することができる」とは、緩和剤が直接的に、
病原体の機能を阻止し、又はたとえば病原体の機能を通
常、阻止しない物質から阻止する物質に、細胞に存在す
る物質を転換することによって、間接的にその機能を阻
止することを意味する。ウィルス疾病についてのそのよ
うな機能の例は、吸着、複製、遺伝子発現、集合及び感
染された細胞からウィルスの退去を包含する。癌性疾病
についてのそのような機能の例は、細胞、複製、外部シ
グナルに対する感受性（たとえば接触阻害）及び抗腫瘍
遺伝子の生成の欠乏を包含する。
【０１１４】（ｉ）緩和性阻害剤 本発明の１つの観点においては、ベクター構造物は、病
原性ウィルス、たとえばＨＩＶ（又は病原性遺伝子、た
とえば腫瘍遺伝子）のＲＮＡに対するアンチセンスＲＮ
Ａの発現を指図し、それによってその複製又は病原を阻
害する。そのような発現は、実質的に連続的であり、又
は病原性条件に関係する他の物質（「同定物質」）の細
胞における存在に応答して連続的であることができる。
他方、その発現は、ベクター侵入の標的の決定により又
はベクターにおける組織特異的制御配列により組織特異
性であることができる。
【０１１５】１つの態様において、重要な病原性遺伝子
転写物（たとえばウィルス遺伝子生成物又は活性化され
た細胞性腫瘍遺伝子）に相補的なＲＮＡを発現するレト
ロウィルスを用いて、その転写物のタンパク質への翻訳
を阻害し、たとえばＨＩＶｔａｔタンパク質の翻訳を阻
害することができる。このタンパク質の発現は、ウィル
ス複製のために不可欠であるので、そのベクターを含む
細胞は、ＨＩＶ複製に対して耐性であろう。
【０１１６】第２の観点においては、病原体がパッケー
ジングシグナルを有する一本鎖ウィルスである場合、ウ
ィルスパッケージングシグナル（たとえば緩和剤がＨＩ
Ｖに対して向けられる場合、ＨＩＶパッケージングシグ
ナル）に相補的なＲＮＡが発現され、その結果、ウィル
スパッケージングシグナルとこれらの分子との会合が、
レトロウィルスの場合、レトロウィルスのＲＮＡゲノム
の正しいキャプシド化又は複製のために必要とされるス
テムループ形成又はｔＲＮＡプライマー結合を阻害す
る。
【０１１７】第３の観点においては、病原性状態を妨害
するタンパク質を発現するレトロウィルスベクターを導
入することができる。ＨＩＶの場合、１つの例は、ＨＩ
ＶＬＴＲからの発現をトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃ
ｔｉｖａｔｅ）する能力を欠乏し、そしてｔａｔタンパ
ク質の正常な機能を妨害する（トランスドミナント態様
で）突然変異体ｔａｔタンパク質である。そのような突
然変異体は、ＨＴＬＶ ＩＩ ｔａｔタンパク質のため
に同定された（「ＸＩＩ Ｌｅｕ5」突然変異体；Ｗａ
ｃｈｓｍａｎなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：６７
４、１９８７を参照のこと）。突然変異体トランスリプ
レッサーｔａｔは、ＨＳＶ−１における相同の突然変異
体リプレッサーのために示されて来たように、複製を阻
害すべきである（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎなど．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３５：４５２、１９８８）。
【０１１８】そのような転写リプレッサータンパク質
は、発現がウィルス特異性トランス活性化タンパク質に
より刺激される（上記のようにして）いづれかのウィル
ス特異性転写プロモーターを用いて、組織培養において
選択され得る。ＨＩＶの特別な場合、ＨＩＶ ｔａｔタ
ンパク質を発現する細胞系及びＨＩＶプロモーターによ
り作動されるＨＳＶＴＫ遺伝子は、ＡＣＶの存在下で死
滅するであろう。しかしながら、一連の突然変異ｔａｔ
遺伝子がそのシステムに導入される場合、適切な性質
（すなわち野生型ｔａｔの存在下でＨＩＶプロモーター
からの転写を抑制する）を有する突然変異体は増殖し、
そして選択されるであろう。次に、その突然変異体の遺
伝子を、これらの細胞から再単離することができる。条
件的に致死のベクター／ｔａｔシステムの複数のコピー
を含む細胞系を用いて、生存する細胞クローンがこれら
の遺伝子における内因性突然変異により引き起こされな
いことを確かめることができる。次に、一式のランダム
に突然変異誘発されたｔａｔ遺伝子は、「求済可能な」
レトロウィルスベクター（すなわち、突然変異体ｔａｔ
タンパク質を発現し、そして複製の細菌性起源及び細菌
における増殖及び選択のための耐薬物性マーカーを含む
もの）を用いて、これらの細胞中に導入される。これ
は、多数のランダム突然変異の評価を可能にし、そして
所望する突然変異細胞系の続く容易な分子クローニング
を可能にする。この方法は、可能性ある抗ウィルス治療
のために種々のウィルス転写活性化物質／ウィルスプロ
モーターシステムにおける突然変異を同定し、そして利
用するために使用され得る。
【０１１９】第４の態様においては、ＨＳＶＴＫ遺伝子
生成物は、潜在的に抗ウィルス性のヌクレオシド類似
体、たとえばＡＺＴ又はｄｄＣをより効果的に代謝する
ために使用される。そのＨＳＶＴＫ遺伝子は、構成マク
ロファージ又はＴ細胞特異的プロモーターの制御下で発
現され、そしてこれらの細胞型中に導入される。ＡＺＴ
（及び他のヌクレオシド抗ウィルス）は、レトロウィル
ス逆転写酵素及び従ってＨＩＶ複製を特異的に阻害する
ために細胞機構によりヌクレオチド三リン酸形に代謝さ
れるべきである（Ｆｕｒｍａｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８３３３〜８
３３７、１９８６）。ＨＳＶＴＫの構成発現（ヌクレオ
チド及び非常に広い基質特異性を有するヌクレオチドホ
スフェートキナーゼ）は、それらの生物学的に活性的な
ヌクレオチド三リン酸形へのこれらの薬物のより効果的
な代謝をもたらす。ＡＺＴ又はｄｄＣ治療は、より効果
的であり、低い投与量を可能にし、ほとんど毒性を生成
せず、そして生産性感染に対して高い可能性を有するで
あろう。ヌクレオチド三リン酸形がレトロウィルスの逆
転写酵素のための選択性を示すが、しかし細胞ヌクレオ
シド及びヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果とし
て、リン酸化されない追加のヌクレオシド類似体が、一
層効果的にされるであろう。この方法の説明は、例４に
示される。
【０１２０】例４ ＡＺＴ及び類似体の抗ウィルス効果を強化するように企
画されたベクター次のレトロウィルスベクターのすべて
は、「Ｎ２」ベクター（Ｋｅｌｌｅｒなど．、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１８：１４９〜１５４、１９８５を参照のこ
と）に基づかれている。従って、５’及び３’ Ｅｃｏ
ＲＩ ＬＴＲフラグメント（それぞれ２．８及び１．０
Ｋｂ）をまず、ポリリンカーを含むプラスミド中にサブ
クローンし（ＳＫ+にサブクローンし、ｐＮ２Ｒ５〔＋
／−〕を得；ｐＵＣ３１中にサブクローンし、ｐ３１Ｎ
２Ｒ５〔＋／−〕及びｐ３１Ｎ２Ｒ３〔＋／−〕を得
る）、ベクター構成を促進した。１つの場合、１．２Ｋ
ｂのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ５’ＬＴＲフラグメントを、
ＳＫ+ベクターの同じ部位中にサブクローンし、ｐＮ２
Ｃを得た。他の場合、スプライス供与体配列の６ｂｐ欠
失を含む５’ＬＴＲを、１．８ＫｂのＥｃｏＲＩフラグ
メントとしてｐＵＣ３１（ｐ３１Ｎ２５ｄｅｌｔａ
〔＋〕）中にサブクローンした。ＨＳＶ−１チミジンキ
ナーゼ遺伝子のコード領域及び転写終結シグナルをプラ
スミド３２２ＴＫ（ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ中にクロ
ーンされたＨＳＶＴＫの３．５ＫｂのＢａｍＨＩフラグ
メント）から１．８ＫｂのＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩフラ
グメントとして単離し、そしてＢｇｌＩＩ／ＳｍａＩに
より消化されたｐＵＣ３１（ｐＵＣＴＫ）中にクローン
した。ターミネーターシグナルの欠失を必要とする構造
体のために、ｐＵＣＴＫをＳｍａＩ及びＢａｍＨＩによ
り消化した。残るコード配列及び付着端のＢａｍＨＩオ
ーバーハングを、次のオリゴマー：５’ＧＡＧ ＡＧＡ
ＴＧＧ ＧＧＧＡＧＧ ＣＴＡ ＡＣＴ ＧＡＧ
３’（配列番号１）及び５’ＧＡＴ ＣＣＴＣＡＧ Ｔ
ＴＡ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＣＴ Ｃ
３’（配列番号２）から製造された二本鎖オリゴヌクレ
オチドと共に再構成し、構造体ｐＴＫｄｅｌｔａＡを形
成した。
【０１２１】診断目的のために、それらのオリゴは、翻
訳されたタンパク質を変えないでそのＡｖａＩ部位を維
持しながら、ＳｍａＩ部位を破壊するように企画され
た。
【０１２２】０．６ＫｂのＨＩＶプロモーター配列を、
ｐＣＶ−１（Ａｒｙａなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：６９〜７３、１９８５を参照のこと）からのＤｒａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＨｉｎｃＩＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されたＳＫ+（ＳＫＨＬ）
中にクローンした。
【０１２３】Ａ．ＴＫ−１及びＴＫ−３レトロウィルス
ベクターの構成（第６図を参照のこと） １．５ＫｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ５’ＬＴＲ及
びプラスミド配列を、ｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）から単離し
た。
【０１２４】２．転写終結配列を欠くＨＳＶＴＫコード
配列を、ｐＴＫｄｅｌｔａＡからの１．２ＫｂのＸｈｏ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１２５】３．３’ＬＴＲ配列を、ｐＮ２Ｒ３（−）
からの１．０ＫｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントとして単離した。
【０１２６】４．段階１〜３からのフラグメントを混合
し、連結し、細菌中に形質転換し、そして個々のクロー
ンを、制限酵素分析（ＴＫ−１）により同定した。
【０１２７】５．ＴＫ−３を、ＢａｍＨＩによりＴＫ−
１を線状化し、５’オーバーハングをフィルインし、そ
して細菌性ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期
プロモーター及びＴｎ５ Ｎｅｏr遺伝子を含む５’−
フィルドＣｌａＩフラグメントをブラント末端連結する
ことによって構成した。耐カナマイシン性クローンを分
離し、そして個々のクローンを制限酵素分析による適切
な配向のためにスクリーンした。
【０１２８】これらの構造体を用いて、上記のようにし
て、パッケージング細胞系及び感染性組換えベクター粒
子を生成した。
【０１２９】ヒトＴ細胞及びマクロファージ／単球細胞
系へのこれらのレトロウィルスベクターの投与は、レト
ロウィルスベクター処理によらない同じ細胞に比べて、
ＡＺＴ及びｄｄＣの存在下でＨＩＶに対するそれらの耐
性を高めることができる。
【０１３０】レトロウィルスベクター調製物の調製法、
濃縮及び貯蔵は、上記の通りである。処理は前に記載さ
れた通りであるが、しかし、患者の細胞のｅｘ ｃｏｒ
ｐｏｒｅ処理が感染されていない潜在的に敏感なＴ細胞
又は単球に向けられる。敏感な細胞に目標を定めるため
の１つの好ましい方法は、ＣＤ４+細胞へのベクター粒
子の吸収を向けるためにＨＩＶ ｅｎｖ又はハイブリッ
ドｅｎｖ（セクションＶＩＩＩの細胞系特異的レトロウ
ィルスを参照のこと）を担持するベクターによるもので
ある。正常な成人は、彼らの血液中に約５×１０9個の
Ｔ４細胞及びほぼ同じ数の単球を有する。
【０１３１】好ましい投与方法は、白血球泳動（ｌｅｕ
ｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）であり、ここで個人のＰＢＬの
約２０％が一度で除かれ、そしてインビトロで操作され
得る。従って、約２×１０9個の細胞が処理され、そし
て交換される。現在の最大の力価は約１０6／ｍｌであ
るので、これは２〜２０ｌの出発ウィルス上清液を必要
とする。反復処理が行なわれる。他方、骨髄を処理し、
そして上記のようにしてその効果の増幅を可能にする。
ＡＺＴによる処理は、毒性副作用を回避するために正常
なレベルよりも低いレベルで存在するが、しかしＨＩＶ
の広がりを効果的に阻害する。その処理の進行は、阻止
剤について記載されているようにして行なわれる。
【０１３２】緩和性阻止剤を製造するための第５の態様
は、ウィルス集合を阻止する欠陥性妨害ウィルス構造タ
ンパク質の発現を包含する。ベクターは、欠陥ｇａｇ、
ｐｏｌ、ｅｎｖ又は他のウィルス粒子タンパク質又はペ
プチドをコードし、そしてこれらはウィルス粒子の集合
を優性態様で阻止する。これは、ウィルス粒子の正常な
サブユニットの相互作用が欠陥サブユニットとの相互作
用により妨害されるので生じる。
【０１３３】第６のそのような態様は、ウィルスプロテ
アーゼに対して特異的な阻害ペプチドの発現を包含す
る。ウィルスプロテアーゼは、ウィルスｇａｇ及びｇａ
ｇ／ｐｏｌタンパク質を多くの小さなペプチドに分解す
る。すべての場合において、この分解の不足は、感染性
レトロウィルス粒子の生成の完全な阻害を導く。ＨＩＶ
プロテアーゼは、アスパルチルプロテアーゼであること
が知られており、そしてこれらはタンパク質又は類似物
からのアミノ酸から製造されたペプチドにより阻害され
ることが知られている。ＨＩＶを阻害するためのベクタ
ーは、そのようなペプチド阻害剤の１又は複数の融合コ
ピーを発現するであろう。
【０１３４】第７の態様は、欠失され又は細胞型で発現
されない場合、その細胞型での腫瘍形成を導くサプレッ
サー遺伝子の送出を包含する。ウィルスベクターによる
欠失遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍表現
型の退化を導く。そのような癌の例は、網膜芽腫及びＷ
ｉｌｍｓ腫瘍である。悪性は、細胞増殖と比べて、細胞
末端分化の阻害であると思われるので、レトロウィルス
の送出及び腫瘍の分化を導く遺伝子生成物の発現が一般
的に、退化を導く。
【０１３５】第８の態様においては、レトロウィルス構
造体は、それ自体をウィルス、腫瘍遺伝子又は病原性遺
伝子中に挿入し、それにより病原のために必要とされる
機能を阻害することによって治療効果を提供する。この
態様は、相同組換え、インテグラーゼによる変性又は他
の方法（下記に説明される）によりゲノムにおける特異
的部位へのレトロウィルスの組込みの指図を必要とす
る。
【０１３６】（ｉｉ）条件毒性緩和剤 病原体を阻害するためのもう１つのアプローチは、病原
条件を発現する細胞に対して毒性である緩和剤を発現す
ることである。この場合、プロウィルスベクターからの
緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を回避するために
病原状態を同定するある細胞内シグナルの存在により制
限される。この細胞タイプの特異性はまた、病原条件を
有する又はその条件に対して敏感な細胞にベクターを担
持する組換えレトロウィルスの標的を決定することによ
って感染のレベルで付与され得る。
【０１３７】この方法の１つの態様においては、組換え
レトロウィルス（好ましくは、但し必ずしも必要ではな
いが、組換えＭＬＶレトロウィルス）は、出来事−特異
的プロモーター、たとえば細胞周期−依存性プロモータ
ー（たとえばヒト細胞チミジンキナーゼ又はトランスフ
ェリン受容体プロモーター）から発現される細胞毒性遺
伝子（たとえばリシン）を含むベクター構造体（急速に
増殖する細胞、たとえば腫瘍においてのみ、転写的に活
性であろう）を担持する。この態様においては、これら
のプロモーターからの転写を活性化することができる因
子を含む、急速に複製する細胞が、プロウィルス構造体
により生成される細胞毒性物質により選択的に破壊され
る。
【０１３８】第２の態様において、細胞毒性物質を生成
する遺伝子は、組織特異的プロモーターの制御下に存在
し、ここで前記組織特異性は腫瘍の起源に対応する。ウ
ィルスベクターは、複製細胞（たとえば正常な肝臓細胞
は複製しないが、しかし肝細胞癌は複製する）のゲノム
中に選択的に組込まれるので、これらの２種の特異性の
レベル（ウィルスの組込み／複製及び組織特異性転写調
節）は、腫瘍細胞の選択的な殺害を導く。さらに、出来
事−特異性及び組織−特異性プロモーター成分は、細胞
毒性遺伝子生成物が両基準を満たす細胞タイプにおいて
のみ発現されるように人工的に組合される（たとえば、
上記例においては、組合されたプロモーター成分は、急
速に分裂する肝細胞においてのみ機能する）。転写的制
御成分はまた、細胞タイプ特異性を増強するために増幅
され得る。
【０１３９】これらの転写プロモーター／エンハンサー
成分は、内部プロモーター（ウィルスＬＴＲ間に存在す
る）として必ずしも存在する必要はないが、しかし条件
−特異的転写発現が変性されたウィルスＬＴＲから直接
的に生じるように、それら自体転写プロモーターであ
る、ウィルスＬＴＲにおける転写制御成分に付加され又
は置換することができる。この場合、最大の発現のため
の条件がレトロウィルスパッケージング細胞系において
模倣される必要があり（たとえば、増殖条件を変え、発
現の必要なトランスレギュレーターを供給し、又はパッ
ケージング細胞系のための親として適切な細胞系を用い
ることによって）、又はＬＴＲ変性が、最大の組換えウ
ィルス力価を得るために３’ＬＴＲ Ｕ３領域に制限さ
れる。後者の場合、１回目の感染／組込みの後、３’Ｌ
ＴＲ Ｕ３がまた、所望する組織特異的発現を付与する
５’ＬＴＲ Ｕ３でもある。
【０１４０】第３の態様においては、プロウィルスベク
ター構造体は、同様に活性化されるが、しかしそれ自体
細胞毒性でなく、そしてほとんど又はまったく細胞毒性
でない化合物又は薬物を標的細胞内で処理するタンパク
質を、細胞毒性であるもの（「条件的に致死性」である
遺伝子生成物）の中に発現する。特に、プロウィルスベ
クター構成体は、ＨＩＶプロモーター（転写的に活動し
ないことが知られているが、但し、ＨＩＶ ｔａｔタン
パク質により活性化される場合を除く）の下流及び転写
制御下に単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ
（「ＨＳＶＴＫ」）を担持する。ＨＩＶにより感染さ
れ、そしてプロウィルスベクター構造体を担持するヒト
細胞におけるｔａｔ遺伝子生成物の発現は、ＨＳＶＴＫ
の高められた生成を引き起こす。次に、その細胞（イン
ビトロ又はインビボのいづれか）を、薬物、たとえばア
シクロビル又はその類似物（ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨ
ＰＧ）に暴露する。これらの薬物は、ＨＳＶＴＫにより
（但し、細胞チミジンキナーゼによってではない）それ
らの対応する活性ヌクレオチド三リン酸塩形にリン酸化
されることが知られている（たとえば、Ｓｃｈａｅｆｆ
ｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ２７２：５８３、１９７８を
参照のこと）。アシクロビル及びＦＩＡＵ三リン酸塩
は、一般的に、トランス遺伝子マウスにＨＳＶＴＫを発
現する細胞の特異的破壊を導く細胞ポリメラーゼを阻害
する（Ｂｏｒｒｅｌｌｉなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７５７２、１９８８
を参照のこと）。組換えベクターを含み、そしてＨＩＶ
ｔａｔタンパク質を発現するこれらの細胞は、これら
の薬物の特定の量の存在により選択的に殺害される。さ
らに、特別なレベルの特異性が、ＨＩＶ ｒｅｖタンパ
ク質、応答性のＣＲＳ／ＣＡＲ配列をベクター中に含む
ことによって達成される。ＣＲＳ配列の存在下で、遺伝
子発現は抑制されるが、但しＣＡＲ配列及びｒｅｖタン
パク質の存在下では除く。例５は、この技法の例示を提
供する。
【０１４１】例５ ＡＣＶ又はその類似体の毒性作用を条件的に強化するた
めのベクター ベクターの構成 Ａ．ｐＫＴＶＩＨＡＸの構成（第７図を参照のこと） １．９．２ＫｂのＡｓｕＩＩ／ＸｈｏＩフラグメント
を、ベクターｐＮ２ ＤＮＡから単離した。
【０１４２】２．０．６ＫｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩプ
ロモーターフラグメントを、プラスミドｐＳＫＨＬから
単離した。
【０１４３】３．０．３ＫｂのＢｇｌＩＩ／ＡｃｃＩ及
び１．５ＫｂのＡｃｃＩ／ＡｃｃＩフラグメントを、ｐ
ＵＣＴＫから精製した。
【０１４４】４．１、２及び３からのフラグメントを連
結し、細菌中に形質転換し、そして一定構造の適切なＡ
ｍｐrクローンを制限酵素分析により同定した。
【０１４５】Ｂ．ｐＫＴＶＩＨ−５及びｐＫＴＶＩＨ５
Ｎｅｏレトロウィルスベクターの構成（第８図を参照
のこと） １．４．５Ｋｂの５’ＬＴＲ及びベクターを、ベクター
ｐ３１Ｎ２５ｄｅｌｔａ（＋）からＸｈｏＩ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとして単離した。
【０１４６】２．１．０Ｋｂの３’ＬＴＲを、ｐＮ２Ｒ
３（＋）フラグメントからＡｐａＩ／ＢａｍＨＩフラグ
メントとして単離した。
【０１４７】３．０．６ＫｂのＨＩＶプロモーター成分
を、ｐＳＫＨＬからＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント
として単離した。
【０１４８】４．ＨＳＶＴＫコード配列及び転写終結配
列を、ｐＵＣＴＫから１．８ＫｂのＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントとして単離した。
【０１４９】５．１〜４からのフラグメントを、組合
し、連結し、細菌中に形質転換し、そして得られた構造
体のクローンを、制限酵素分析により同定した（ｐＫＴ
ＶＩＨ−５）。
【０１５０】６．ｐＫＴＶＩＨ５ Ｎｅｏを、ＣｌａＩ
によりｐＫＴＶＩＨ５を線状化し、細菌性ｌａｃ ＵＶ
５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＴｎ５
Ｎｅｏrマーカーを含む１．８ＫｂのＣｌａＩフラグ
メントと共に混合し、連結し、細菌中に形質転換し、そ
して耐カナマイシン性について選択することによって構
成した。示された配向で挿入体を有するクローンを、制
限分析により同定した。
【０１５１】Ｃ．ＭＨＭＴＫ Ｎｅｏレトロウィルスベ
クターの構成（第９図を参照のこと） １．中間プラスミドＭＨＭ−１の構成： ａ）プラスミドｐＮ２ＣＲ５を、ＦｏＫＩにより部分的
に消化することにより線状化し、５’オーバーハングを
クレノウＤＮＡポリメラーゼを用いてデオキシヌクレオ
チド三リン酸によりフィルインし、そしてＨｉｎｄＩＩ
Ｉリンカーを挿入した。細菌中への形質転換の後、ＭＬ
Ｖ ＬＴＲ ＦｏＫＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩ
リンカーを有するクローンを制限酵素分析により同定し
た（ｐＮ２ＣＲ５ＦＨ）。
【０１５２】ｂ）ｐＮ２ＣＲ５ＦＨをＮｈｅＩにより線
状化し、５’オーバーハングをクレノウポリメラーゼに
よりフィルインし、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、そし
てプロモーターを有さないＭＬＶ配列を有する４．３Ｋ
ｂのフラグメントを単離した。
【０１５３】ｃ）０．５ＫｂのＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ ＨＩＶプロモーター配列をｐＳＫＨＬから単離し
た。
【０１５４】ｄ）ｂ及びｃを混合し、連結し、それを用
いて細菌を形質転換し、そしてＭＨＭ−１の構造体を制
限酵素分析により同定した。
【０１５５】２．ＭＨＭ−１から単離された０．７Ｋｂ
のＥｃｏＲＶ／ＢａｌＩフラグメントを、プラスミドＩ
３０ＢのＥｃｏＲＶ部位中にサブクローンした（変性さ
れたＩＢＩ３０プラスミドは追加のＢｇｌＩＩ、Ｂｓｔ
ＩＩ、ＮｅｏＩ及びＮｄｅＩ部位をポリリンカーに含
む）。細菌を形質転換した後、適切な配向を有するクロ
ーンを、制限酵素分析により同定した（ｐＭＨＭＢ）。
【０１５６】３．ｐＭＨＭＢをＡｐａＩ及びＸｈｏＩに
より消化し、そしてゲル精製した。
【０１５７】４．ＭＨＭ−１をＡｐａＩ／ＢａｍＨＩに
より消化し、そして１．８ＫｂのＭＨＭＬＴＲ／リーダ
ー配列をゲル精製した。
【０１５８】５．Ｎｅｏrを動かすＳＶ４０初期プロモ
ーターの上流にＨＳＶＴＫコード領域を含む２．８Ｋｂ
のＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＴＫ−３か
ら分離した（第３図を参照のこと）。
【０１５９】６．３〜５を混合し、連結し、それを用い
て細菌を形質転換し、そして適切なクローンを制限酵素
分析により同定した。
【０１６０】Ｄ．ｔａｔ及び抗−ｔａｔ発現ベクターの
構成（第１０図を参照のこと）これらのベクターを、ｔ
ａｔ−依存性ＨＳＶＴＫベクターを試験活性化するため
に偽−ＨＩＶとして使用した。
【０１６１】１．Ｈｉｓr発現ベクターｐＢａｍＨｉｓ
を、ＢａｍＨＩにより線状化し、そしてウシの腸のホス
ファターゼにより処理した。
【０１６２】２．ｐＣＶ−１のＳａｃＩ部位をＢａｍＨ
Ｉ部位に突然変異誘発し、そしてＨＩＶ ｔａｔの３５
０ｂｐのＢａｍＨＩコード配列を単離した。
【０１６３】３．第１及び２段階で精製されたフラグメ
ントを、混合し、連結し、それを用いて細菌を形質転換
し、そして両配向にｔａｔを有するクローンを、制限酵
素分析により同定した。
【０１６４】これらの構造体を用いて、上記のようにし
て感染性組換えベクター粒子及びパッケージング細胞
系、たとえばＰＡ３１７を生成した。
【０１６５】これらのレトロウィルスベクターの生物学
的性質は、この後説明される。ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子
（「ｔａｔｈｉｓ」ベクター、第１０図を参照のこと）
をマウスＰＡ３１７細胞中にトランスフェクトした。５
種の個々のヒスチジノール耐性サブクローン（ＴＨ１〜
５）（ＨＩＶ ｔａｔを発現する）を得た。これらの細
胞は、ＨＩＶ感染のための実験モデルである。ベクター
ＫＴＶＩＨＡＸ、ＫＴＶＩＨ５ＮＥＯ及びＭＨＭＴＫＮ
ＥＯを、これらのｔａｔ−発現細胞系及びｔａｔを欠く
それらの親細胞系中に、感染により連続的に導入する。
次に、細胞の生存率を、ＨＳＶＴＫ−特異的細胞毒性薬
物、アシクロビルの種々の濃度で決定した。そのデータ
は、ＬＤ５０（５０％の毒性が観察される薬物濃度）と
して本明細書に報告される。前記ベクターを含むが、し
かしｔａｔを欠く親細胞系（非−ＨＩＶ−感染モデル）
は、試験された濃度でＡＣＶによる検出不可能な毒性を
示した。従って、これらの細胞は、細胞毒性のために１
ＯＯμＭ又はそれ以上のＡＣＶを必要とする。これはま
た、ベクターを欠くこれらの細胞についても真実であ
る。従って、ベクター単独で、ＡＣＶ単独で又はベクタ
ー＋ＡＣＶでさえ、細胞毒性でない。しかしながら、Ｈ
ＩＶ ｔａｔ（ＨＩＶ感染の実験的な表示）を発現する
細胞系は、ＡＣＶにより効果的に殺害される。これは、
試験されるすべての３種のベクターに関して種々の程度
で真実である。これらのデータは、ＨＩＶ感染細胞が、
ＡＣＶ及び「ポテンシエーター（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏ
ｒ）」ベクターの存在下で殺害されるであろうことを指
摘する。
【０１６６】同様に、ヒトＴ細胞系＋／−ＦＩＡＵのＨ
ＩＶ感染は、ＨＩＶ感染の選択的な阻害（細胞殺害を通
して）を付与する。培養物をまず、ベクターにより処理
し、次に低い多重感染ＨＩＶにより４日間、挑戦せしめ
た。ウィルス上清液の力価を、セクションＩＶに記載さ
れるようにして、ＨＩＶを用いて測定した。
【０１６７】ＨＩＶ感染細胞の場合、条件的に致死性の
ＨＳＶＴＫ遺伝子の発現は、最適活性のために追加のＨ
ＩＶ遺伝子生成物、ｒｅｖを必要とする、転写物「ＣＲ
Ｓ／ＣＡＲ」）におけるｃｉｓ−作用成分の含有によ
り、さらに一層、ＨＩＶを特異的にした（Ｒｏｓｅｎな
ど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：２０７１、１９８８）。より一般的には、ｍＲＮ
Ａに存在するｃｉｓ成分は、ある場合、ｍＲＮＡの安定
性又は翻訳能力を調節することが示されている。このタ
イプの配列（すなわち遺伝子発現の転写後調節）は、ベ
クター遺伝子発現の出来事−又は組織や特異的調節のた
めに使用され得る。これらの配列（すなわちＨＩＶのた
めのｒｅｖ−応答性「ＣＲＳ／ＣＡＲ」又はｔａｔ−応
答性「ＴＡＲ」成分）の多重化は、さらに高い特異性を
もたらすことができる。細胞における不活性前駆体の活
性生成物へのこの種の条件活性化は、短い期間の効果を
有する他のウィルスベクター、たとえばアデノウィルス
ベクターを用いて達成され得ることが注目される。
【０１６８】ベクター調製物の調製法、濃縮及び貯蔵
は、これまで記載されている通りである。投与は、これ
までのように直接的なインビボ投与により又はＰＢＬ及
び／又は骨髄のｅｘ ｃｏｒｐｏｒｅ処理による。投与
量は例４における量とほぼ同じレベルであろう。ウィル
スベクター感染の標的決定は、ＣＤ４受容体を通してで
はなく、ｇｐ１２０発現細胞（すなわちＨＩＶにより感
染された細胞）の標的を決定するためにハイブリッドＭ
ＬＶｅｎｖ−ＣＤ４「エンベロープ」タンパク質（セク
ションＶＩＩを参照のこと）を有するベクター粒子を製
造することを通して達成され得る。実際に感染された細
胞の標的を定めるために正常なウィルス−受容体相互作
用のこの転換は、すべてのタイプのウィルスに関して使
用され得る。
【０１６９】前記態様に類似する態様においては、レト
ロウィルスベクター構造体は、プリン−又はピリミジン
−基材薬物のリン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化
又は他の代謝のための遺伝子を担持することができる。
この遺伝子は哺乳類細胞においては等しくなく、そして
ウィルス、細菌、菌類又は原生動物のような生物から生
じる。この例は、チオキサンチンの存在下で致死性であ
る、Ｅ．コリのグアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子生成物であろう（Ｂｅｓｎａｒｄなど．、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７：４１３９〜４１４
１、１９８７を参照のこと）。このタイプの条件的に致
死性の遺伝子生成物は、効果的な細胞毒性物質になるた
めに、細胞内リボシル化又はリン酸化をしばしば必要と
する、多くの現在既知のプリン−又はピリミジン−基材
の抗癌剤への可能性ある適用を有する。条件的に致死性
の遺伝子生成物はまた、プリン又はピリミジン類似体で
ない非毒性薬物を細胞毒性形に代謝する。
【０１７０】哺乳類ウィルスは一般的に、他のウィルス
プロモーター成分からの、続く転写活性化のために必要
である「即時初期」遺伝子を有する傾向がある。この性
質の遺伝子生成物は、ウィルス感染の細胞内シグナル
（又は「同定物質」）のための卓越した候補体である。
従って、これらのウィルス「即時初期」遺伝子生成物に
応答する転写プロモーター成分からの条件的に致死性の
遺伝子は、いづれか特定のウィルスにより感染された細
胞を特異的に殺害することができる。さらに、ヒトα及
びβインターフェロンプロモーター成分は、広範囲の種
類の非関連ウィルスによる感染に応答して転写的に活性
化されるので、たとえばこれらのウィルス応答成分（Ｖ
ＲＥ）からの、ＨＳＶＴＫのような条件的に致死性の遺
伝子生成物を発現するべクターの導入は、種々の異なっ
たウィルスにより感染された細胞の破壊をもたらすこと
ができる。
【０１７１】第５の態様においては、組換えレトロウィ
ルスは、それ自体毒性でないが、しかしウィルス又は他
の病原体に対して特異的であるプロテアーゼにより処理
される場合、毒性形に転換される生成物を特定化する遺
伝子を担持する。
【０１７２】第６の態様においては、レトロウィルス構
造体は、細胞における同定物質（たとえばＨＩＶ ｔａ
ｔタンパク質）の存在に応答して標的細胞の表面上に
「レポーター生成物」を発現することができる。この表
面タンパク質は、細胞毒性物質、たとえばレポータータ
ンパク質に対する抗体により、又は細胞毒性Ｔ細胞によ
り認識され得る。類似する態様において、そのようなシ
ステムは、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子、た
とえばＨＩＶ ｔａｔ遺伝子を有するこれらの細胞を簡
単に同定するために検出システム（下記参照のこと）と
して使用され得る。
【０１７３】同様に、第６の態様においては、それ自
体、治療的に有益である表面タンパク質が発現される。
ＨＩＶの特定の場合、ＨＩＶ−感染細胞におけるヒトＣ
Ｄ４タンパク質の発現は、下記の２つの手段において有
益である： １．ＨＩＶ ｅｎｖへのＣＤ４の細胞内結合は、そのタ
ンパク質は膜に結合したまま存続し、そして内因性ＣＤ
４（これに対して、患者は免疫学的に耐性であるべきで
ある）に構造的に同一であるので、可能性ＣＤ４が遊離
ウィルスの代役をすることが示されているように、但し
系統的なクリアランス及び可能性ある免疫原性の問題を
伴わないで、生存性ウィルス粒子の形成を阻害する。
【０１７４】２．ＣＤ４／ＨＩＶ ｅｎｖ複合体は細胞
の死の原因として含蓄されるので、ＣＤ４の追加の発現
（ＨＩＶ−感染細胞に存在する過剰のＨＩＶ−ｅｎｖの
存在下で）が、より急速な細胞の死を導びき、そして従
ってウィルスの拡散を阻害する。これは特に、単球及び
マクロファージに適用することができ、これはＨＩＶ−
誘発細胞毒性に対するそれらの相対的な免疫性の結果と
してウィルス産生のためのレザーバーとして作用する
（それらの細胞表面上でのＣＤ４の相対的な欠乏により
明らかである）。
【０１７５】（ｉｉｉ）免疫ダウン−レギュレーション たとえば慢性肝炎又は異種組織、たとえば骨髄の移植に
おける不適切な又は所望しない免疫応答の特異的ダウン
−レギュレーションは、抗−ＭＨＣクラスＩ遺伝子、た
とえば免疫抑制ウィルス遺伝子を用いて構成され得る。
グループＣのアデノウィルスＡｄ２及びＡｄ５は、ウィ
ルスのＥ３領域にコードされる１９Ｋｄの糖タンパク質
（ｇｐ１９）を有する。このｇｐ１９分子は、細胞の小
胞体におけるクラスＩＭＨＣ分子に結合し、そして細胞
表面へのクラスＩＭＨＣの末端グリコシル化及び翻訳を
妨害する。たとえば、骨髄移植の前、供与体骨髄細胞
は、ｇｐ１９の発現に基づいて、ＭＨＣクラスＩ移植抗
原の表面発現を阻害するｇｐ１９−コードベクター構造
体により感染され得る。これらの供与体細胞は、移植片
拒絶の低い危険性を伴って移植され得、そして移植患者
のために最少の免疫抑制法を要する。これは、許容でき
る供与体−受容体キメラ状態のより少ない複雑性を伴っ
ての存在を可能にすることができる。類似する処置を使
用して、いわゆる自己免疫疾患、たとえばエリテマトー
デス、多発性硬化症、リウマチ様関節炎又は慢性Ｂ型肝
炎の範囲を処理することができる。
【０１７６】ＩＶ．マーカーの発現 ある同定物質に応答して、細胞中に緩和剤を発現する上
記技法はまた、同定タンパク質を発現する細胞中の特定
の遺伝子（たとえば特定のウィルスにより担持される遺
伝子）の検出を可能にし、そして従って、そのウィルス
を担持する細胞の検出を可能にするように変性され得
る。さらに、この技法は、ウィルスに関連する同定タン
パク質を担持する細胞の臨床サンプルにおけるウィルス
（たとえばＨＩＶ）の検出を可能にする。
【０１７７】この変性は、生成物（該生成物の存在は、
容易に同定され得る）（「マーカー生成物」）をコード
し、そしてプロモーターを担持するゲノムを供給するこ
とによって違成され得、ここでプロモーターは、発現及
び非発現状態の間でレポーター生成物の発現を変えるこ
とによって指示細胞における同定タンパク質の存在に応
答する。たとえば、ＨＩＶは、それが適切な指示細胞を
感染する場合、ｔａｔ及びｒｅｖを製造する。従って指
示細胞は、マーカー遺伝子、たとえばβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子又はルシフ
ェラーゼ遺伝子、及びマーカー遺伝子の発現を制御する
プロモーター、たとえばＨＩＶプロモーターをコードす
るゲノム（たとえば、適切な組換えレトロウィルスによ
る感染により）を供給され得る。指示細胞が試験される
べき臨床サンプルに暴露され、そしてそのサンプルがＨ
ＩＶを含む場合、その指示細胞はＨＩＶにより感染さ
れ、その中でｔａｔ及び／又はｒｅｖの発現（同定タン
パク質）をもたらす。次に、指示細胞におけるＨＩＶ発
現の制御は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェリン又は
アルカリホスファターゼ（マーカー生成物）をコードす
る遺伝子の発現を、通常「切り」から「入り」にスイッ
チを変えることによって、ｔａｔ及び／又はｒｅｖタン
パク質に応答するであろう。β−ガラクトシダーゼ又は
アルカリホスファターゼの場合、基質相同体への細胞の
暴露は、サンプルがＨＩＶに対して陽性である場合、色
又は螢光の変化をもたらす。ルシフェラーゼの場合、ル
シフェリンヘのサンプルの暴露は、サンプルがＨＩＶに
対して陽性である場合、発光をもたらすであろう。細胞
内酵素、たとえばβ−ガラクトシダーゼに関しては、ウ
ィルス力価が、着色された又は螢光細胞を計数し、又は
細胞抽出物を製造し、そして適切なアッセイを行なうこ
とによって、直接的に測定され得る。分泌された酵素、
たとえばアルカリホスファターゼの構成された形に関し
ては、培養上清液の少量のサンプルが活性についてアッ
セイされ、その時間にわたっての単一の培養物の連続し
たモニターを可能にする。従って、このマーカーシステ
ムの異なった形が、種々の目的のために使用され得る。
これらは、活性ウィルスの計数又は培養物におけるウィ
ルスの拡散の敏感で且つ簡単な測定及び種々の薬物によ
るこの拡散の阻害を包含する。
【０１７８】追加の特異性は、ウィルスの存在につい
て、そのウィルスに対する中和抗体が存在するか又は存
在しないかにより試験することによって前記システム中
に組込まれ得る。たとえば、試験される臨床サンプルの
一部においては、ＨＩＶに対する中和抗体が存在し；と
ころが他の部分においては、中和抗体が存在しない。こ
の試験が、抗体が存在するシステムにおいて陰性であ
り、そして抗体が存在しないシステムにおいて陽性であ
る場合、これはＨＩＶの存在の確認を助けるであろう。
【０１７９】インビトロアッセイのための類似するシス
テムにおいて、特定の遺伝子、たとえばウィルス遺伝子
の存在は、細胞サンプルにおいて決定され得る。この場
合、サンプルの細胞は、対象のウィルスの発現制御に連
結されるレポーター遺伝子を担持する適切なレトロウィ
ルスベクターにより感染される。サンプル細胞に入った
後、そのレポーター遺伝子は、宿主細胞が適切なウィル
スタンパク質を発現する場合にのみ、そのレポーター生
成物（たとえばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラー
ゼ）を発現するであろう。
【０１８０】これらのアッセイはより敏速且つ敏感であ
る。なぜならば、レポーター遺伝子は、増幅効果をもた
らす、存在する同定物質よりも多量のレポーター生成物
を発現することができるからである。例６は、同定タン
パク質を発現する遺伝子を検出するための代表的な技法
を記載する。
【０１８１】例６ ＨＩＶ−特異的マーカーシステム又はアッセイ Ａ．構造体 ＨＩＶ発現システムの制御下でのレポーター構造体は、
第１２図（組換えレトロウィルスベクター）及び第１３
図（トランスフェクションにより使用される単純なプラ
スミド）に示される。これらの好ましいベクター及びレ
ポータープラスミドの断片は次の通りにして得られた：
レトロウィルス主鎖は、構造体ｐＡＦＶＸＭ（Ｋｒｉｅ
ｇｅｒなど．、Ｃｅｌｌ ３８：３８４、１９８４）に
由来し、これはＸｈｏＩ及びＣｌａＩを用いて線状化さ
れている。ＳＶ2ｎｅｏを、１．８ＫｂのＣｌａＩフラ
グメントの単離により、プラスミドｐＫｏｎｅｏ（Ｈａ
ｎａｈｅｎ、未公開）から得た。
【０１８２】ＨＩＶ ＬＴＲを、プラスミドｐＣ１５Ｃ
ＡＴ（Ａｒｙａなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：６
９、１９８５）から０．７ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントとして単離した。β−ｇａｌを、プラスミドｐＳ
Ｐ６５ β−ｇａｌ（Ｃｅｐｋｏ、ｐｅｒｓ．ｃｏｍ
ｍ．）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｍＩフラグメントとし
て得た。ヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌形を、
アルカリホスファターゼの細胞表面形のアミノ酸４８９
の後に、一般的なターミネーター配列の導入により生成
した（Ｂｅｒｇｅｒなど．，Ｇｅｎｅ ６６：１、１９
８８）。分泌されたアルカリホスファターゼ遺伝子を、
１．８ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントと
して単離した。ＨＩＶ ｅｎｖからのＣＲＳ−ＣＡＲ配
列を、ＨＴＬＶＩＩＩＢ／ＢＨ１０Ｒ3（Ｆｉｓｈｅｒ
など．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：６５５、１９８６）
から２．１ＫｂのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを
単離することによって得た。このフラグメントをＢａｍ
ＨＩ及びＫｐｎＩにより線状化されたｐＵＣ３１中に挿
入した。
【０１８３】ｐＵＣ３１は、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩと
ＫｐｎＩ部位との間に別のＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓ
ｓｈＩＩ及びＮｃｏＩ部位を有するｐＵＣ１９（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど．、Ｇｅｎｅ ３３：１０
３、１９８５）である。得られた構造体のＢａｍＨＩ部
位を、ＮｃｏＩ部位に転換し、ＮｃｏＩによる消化によ
るＣＲＳ−ＣＡＲ配列の再切断を可能にした。ＳＶ４０
ｔイントロンを、ｐＳＶＯＬ（ｄｅＷｅｔなど．、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７：７２５、１９８７）か
らＯ．８ＫｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとし
て得た。 Ｂ．指示細胞及びレトロウィルスベクター ヒトＴ細胞（Ｈ−９、ＣＥＭ及びＳｕｐＩ）及び単球
（Ｕ−９３７）細胞系を、ＡＴＣＣから得、そして１０
％のウシ胎児血清及び１％ぺニシリン／ストレプトマイ
シンにより補足されたＲＰＭＩ １６４０培地に維持し
た。
【０１８４】非レトロウィルスベクターを、Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いてのエレクトロポ
レーションにより細胞系に導入した。その細胞系を、安
定したＧ−４１８R細胞系を得るために２〜３週間、Ｇ
−４１８（１ｍｇ／ｍｌ）において選択し、そしてクロ
ーン性細胞系を得るために希釈クローンした。
【０１８５】ｐＡＦベクターを、リン酸カルシウム沈殿
物としてＰＡ３１７パッケージング細胞系中にトランス
フェクトした（Ｗｉｇｌｅｒなど．、Ｃｅｌｌ １６：
７７７、１９７９）。ウィルス産生ＰＡ３１７細胞を、
ポリブレンの存在下で２４時間、ヒト単球細胞系と共に
同時培養し、この後その懸濁細胞を除き、そしてＧ−４
１８中で選択し、そして上記のようにいてサブクローン
した。
【０１８６】Ｃ．アッセイ 安定細胞系をＨＩＶ（ＨＴＬＶＩＩＩB）により感染せ
しめ、そしてその細胞（β−ｇａｌ）又は培地（アルカ
リホスファターゼ）を、感染の後、６日間、毎日アッセ
イした。
【０１８７】β−ガラクトシダーゼアッセイ 感染された細胞を、次のいづれかによりアッセイした： （ｉ）ＭａｃＧｒｅｇｏｒなど．（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃ
ｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３：２
５３、１９８７）により記載されるような現場組織化学
的染色；又は（ｉｉ）基質としてＯＮＰＧを含む溶液酵
素アッセイにおける細胞抽出物を用いて（Ｎｏｒｔｏｎ
及びＣｏｆｆｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ． ５：
２８１、１９８５）。
【０１８８】可溶性アルカリホスファターゼアッセイ 培地を感染された細胞から除き、１Ｏ秒間、マイクロ遠
心分離し、そして次に６８℃に１０分間加熱し、内因性
ホスファターゼを破壊した。次に、その培地を２分間マ
イクロ遠心分離し、そしてアリコート（１Ｏ〜５０μ
ｌ）をアッセイのために除去した。緩衝液（１Ｍのジエ
タノールアミン、ｐＨ９．８；Ｏ．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2；１０ｍＨのＬ−ホモアルギニン）１００μｌを添
加し、そして次に１２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホス
フェート（緩衝液中）２０μｌを添加した。その反応混
合物のＡ405を、自動プレート読取機を用いてモニター
した。
【０１８９】第１４及び１５図は、種々の濃度の抗ウィ
ルス剤の存在下でアルカリホスファターゼアッセイを用
いてＳｕｐＴＩ細胞の感染の時間進行の典型的な結果を
示す。６日目での「＋」及び「−」は、シンシチアの存
在又は不在を示す。
【０１９０】本発明は、多くの他の技法を提供し、これ
は、それらの性能を高めるために、上記で使用されたレ
トロウィルスベクターシステムと共に使用することがで
きる。他方、これらの技法は、他の遺伝子−送出システ
ムと共に使用され得る。
【０１９１】Ｖ．パッケージングの細胞の選択 本発明のこの観点は、パッケージング細胞から低い組換
えウィルス力価の主要原因及びこれらの原因を修正する
ための技法の発見に一部基づかれる。基本的には、少な
くとも５種の要因が、低い組換えウィルス力価のための
原因として仮定される： １．ウィルスパッケージングタンパク質の制限された利
用性； ２．レトロウィルスベクターＤＮＡゲノムの制限された
利用性； ３．組換えレトロウィルスの発芽のための細胞膜の制限
された利用性； ４．レトロウィルスベクターゲノムの制限された本質的
なパッケージング効力；及び ５．与えられたレトロウィルスのエンベロープに対して
特異的な受容体の密度。
【０１９２】上記のように、ウィルスパッケージングタ
ンパク質の制限された利用性は、パッケージング細胞か
らの組換えレトロウィルス生成における初期の制限因子
である。パッケージング細胞におけるパッケージングタ
ンパク質のレベルが高められる場合、力価は約１０5感
染単位／ｍｍｌに上昇し、この後、上昇するパッケージ
ングタンパク質のレベルは、力価に対してさらに効果を
有さない。しかしながら、パッケージングのために利用
できるレトロウィルスベクターゲノムのレベルを高める
ことによって、力価はさらに増大され得る。従って、こ
こに記載されるように、最大レベルのパッケージングタ
ンパク質及びレトロウィルスベクターゲノムを産生する
生成体細胞を選択することが好都合である。「発明の背
景」のセクション下で記載された、パッケージング細胞
及び生成体細胞の同定及び従って選択の方法は、下記理
由のために低い力価を生成する多くの生成体細胞の選択
を導く傾向があることが発見された。
【０１９３】本発明は、５’ＬＴＲ又は他のプロモータ
ーから下流の遺伝子及び介在遺伝子によりそれらから間
隔を開けられている前記遺伝子のタンパク質発現レベル
は、前記介在遺伝子が不在の場合よりも実質的に低いこ
れまでの欠点事実を利用する。本発明においては、選択
可能な遺伝子は、パッケージングゲノムの遺伝子又はベ
クター構造体により担持される対象の遺伝子から下流に
配置されるが、しかしいづれのスプライス供与体又はス
プライス受容体部位もなしに、ウィルス５’ＬＴＲ又は
他のプロモーターの制御下でなお、転写される。これは
２種の事実を完結せしめる。まず第１に、パッケージン
グ遺伝子又は対象の遺伝子はそれらとプロモーターとの
間に介在遺伝子を伴わないで下流に存在するので、それ
らの対応するタンパク質（パッケージングタンパク質又
は対象のタンパク質）は、選択可能なタンパク質よりも
高レベル（５〜２０倍）で発現されるであろう。第２
に、選択可能なタンパク質は、低レベルの方に移る発現
のレベルの分布を伴って、平均して低レベルで発現され
るであろう。ｐｈｌｅｏrタンパク質の場合、この分布
の移動は、第１６図に示される点線の曲線により示され
る。しかしながら、耐フレオマイシンに対する選択レベ
ルは、同じで存続し、その結果、上部端の発現細胞のみ
が残存する。パッケージングタンパク質又は対照のタン
パク質のレベルは、なお比例し、この場合においての
み、選択可能なタンパク質のレベルが高くなるほど、パ
ッケージングタンパク質又は対照のタンパク質のレベル
はより高くなる。
【０１９４】好ましくは、前記方法は、プロウィルスｇ
ａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子の１つ及
び初めの選択可能な遺伝子を担持するプラスミドを用い
て行なわれる。次に、これらの細胞は、ｅｎｖ（又はた
ぶんｇａｇ／ｐｏｌ）に対する抗体と第２螢光抗体との
反応により最高レベルのタンパク質を生成する細胞につ
いてスクリーンされ、そして次に螢光活性化細胞ソータ
ーにより分類される。他方、タンパク質レベルについて
の他の試験も使用され得る。続いて、前記方法及びスク
リーニングがこれらの選択された細胞及び他のｇａｇ／
ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子を用いてくり返
される。この段階においては、第２の選択可能な遺伝子
（第１のものとは異なる）はパッケージング遺伝子から
下流に必要とされ、そして多量の第２ウィルスタンパク
質を生成する細胞が選択される。次に前記方法及びスク
リーニングが、対象の遺伝子及び第１又は第２の選択可
能な遺伝子とは異なる第３の選択可能な遺伝子を生ぜし
めるプロウィルスベクター構造体を担持するプラスミド
を有する生存細胞を用いてくり返される。この方法の結
果として、高い力価の所望する組換えレトロウィルスを
生成する細胞が選択され、そしてこれらは、組換えレト
ロウィルスを供給する必要がある場合、培養され得る。
さらに、ｇａｇ及びｐｏｌがそれぞれ導入され、そして
選択される。
【０１９５】例７は、これらの方法を使用するように企
画されたｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖプラスミドの構成法
を説明する。
【０１９６】例７ 高レベルのパッケージングタンパク質を製造するように
企画されたプラスミド（第７図） １．アンフォトロープ性ｅｎｖセグメントを含むｐＡＭ
Ａ（Ｍｉｌｌｅｒなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ． ５：４３１、１９８５）からの２．７ＫｂのＸｂ
ａＩフラグメントを、ＸｂａＩ部位でｐＵＣ１８中にク
ローン化し、次にＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩにより除
去した。このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩ及びＰｖｕ
ＩＩにより切断されたベクターｐＲＳＶ ｎｅｏ（Ｇｏ
ｒｍａｎなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：
１０４４、１９８２；Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど．、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． １：３２７、１９８
２）中にクローンし、ｐＲＳＶ ｅｎｖを得た。フィル
インされたＢｓｔＥＩＩ末端を有するプラスミドｐＵＴ
５０７（Ｍｕｌｓａｎｔなど．、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ． １４：２４３、１９８８）
からの０．７ＫｂのＢａｍＨＩ〜ＢｓｔＥＩＩフラグメ
ントは、ｐｈｌｅｏ耐性コード配列を担持する。４．２
ＫｂのＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、ＲＳＶｅｎ
ｖからの隣接する１．６ＫｂのＸｈｏＩ〜ＸｂａＩ（フ
ィルインされたＸｂａＩ）及びｐｈｌｅｏフラグメント
を連結し、ｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏを得た。
【０１９７】２．ＭＬＹ（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、１９８５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）のヌクレオチド５６３でのＰｓｔＩ
部位〜５８７０でのＳｃａＩ部位のフラグメントは、ｐ
ＭＬＶ−Ｋ（Ｍｉｌｌｅｒなど．，１９８５， ｏｐ．
ｃｉｔ）に由来し、そしてＳＶ４０プロモーター、耐ア
ンピシリン性ｐＢＲ３２２及び複製の起点、及びＳＶ４
０ポリＡ部位を有するｐ４ａＡ８（Ｊｏｌｌｙなど．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
０：４７７、１９８８）からのＰｓｔＩ〜ＢａｍＨＩ
（フィルインされたＢａｍＨＩ）フラグメント中にクロ
ーンされた。これはｐＳＶｇｐを付与する。ｐＳＶｇｐ
ＤＨＦＲを次のフラグメントを用いて製造した：ＳＶ４
０プロモーター及びＭＬＹ ｇａｇ並びにいくつかのｐ
ｏｌ配列を含むｐＳＶｇｐからの３．６ＫｂのＨｉｎｄ
ＩＩ〜ＳａｌＩフラグメント；ｐｏｌ遺伝子の残りを有
するｐＭＬＶ−Ｋからの２．１ｋｂのｋｂ ＳａｌＩ〜
ＳｃａＩフラグメント、ＤＨＦＲ遺伝子及及びｐｏｌｙ
Ａ部位、ｐＢＲ３２２起点及び耐アンピシリン遺伝子を
有するｐＦ４００からの３．２ＫｂのＸｂａＩ（フィル
インされたＸｂａＩ）〜ＰｓｔＩフラグメント；耐アン
ピシリン性遺伝子の他の半分を有するｐＢＲ３２２から
のＯ．７ＫｂのＰｓｔＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
ト。これはｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲを付与する。すべての
これらの構造体は第７図に示される。これらのプラスミ
ドは３Ｔ３細胞又は他の細胞中にトランスフェクトされ
得、そして高レベルのｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖが得ら
れる。
【０１９８】選択を完結するための追加の方法は、１段
階での遺伝子選択及び続く段階でのそのアンチセンスを
使用することである。たとえば、ｇａｇ／ｐｏｌが、Ｈ
ＰＲＴ遺伝子を有するＨＰＲＴ−欠失細胞中に導入さ
れ、そしてプリンのサルベージのためにＨＰＲＴを必要
とする培地を用いて、この遺伝子の存在について選択さ
れる。次の段階においては、ＨＰＲＴに対するアンチセ
ンスがｅｎｖの下流に送られ、そして細胞がＨＰＲＴ−
欠失表現型のために６−チオグアニン中において選択さ
れる。多量のアンチセンスＨＰＲＴが、逆戻りが生じな
いなら、ＨＰＲＴ遺伝子転写を不活性化するために必要
とされる。 エンベロープ置換 ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ機能を別々に発現する能力
は、これらの機能の独立した操作を可能にする。十分な
量のｇａｇ ｐｏｌを発現する細胞系が、ｅｎｖに関す
る力価の問題を提供するために使用され得る。低い力価
をもたらす１つの要因は、標的細胞又は組織上での適切
な受容体分子の密度である。ｅｎｖ発現が別の単位から
付与される場合、種々の源からの種々のエンベロープ遺
伝子（異なった受容体タンパク質を必要とする）、たと
えばキセノトロープ性、ポリトロープ性又はアンフォト
ロープ性ｅｎｖが、特定の標的組織に対する最高の力価
について試験され得る。さらに、非ネズミレトロウィル
ス源からのエンベロープが、ベクターを偽型にするため
に使用され得る。さらに、ハイブリッドエンベロープ
（下記に説明される）が、レトロウィルスベクターの同
性を合せ（そして力価を効果的に高める）るために、こ
のシステムにおいて同様に使用され得る。逆に、十分な
量の与えられたエンベロープ遺伝子を発現する細胞系
が、ｇａｇ及びｐｏｌに関する力価の問題を提供するた
めに使用され得る。
【０１９９】ＶＩ．他のウィルスベクターパッケージン
グ技法 ２種の追加の他のシステムがベクター構造体を担持する
組換えレトロウィルスを生成するために使用され得る。
これらのシステムのそれぞれは、昆虫ウィルス、バキュ
ロウィルス及び哺乳類ウィルス、ワクシニア及びアデノ
ウィルスが多量のいづれか一定のタンパク質を製造する
ために最近適合された（このためにはその遺伝子がクロ
ーンされている）事実を利用する。たとえば、Ｓｍｒｉ
ｔｈなど．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ３：１
２、１９８３）；Ｐｉｃｃｉｎｉなど．（Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５、１９８７）；及び
Ｍａｎｓｏｕｒなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３５９、１９８５）を参
照のこと。
【０２００】これらのウィルスベクターは、適切な遺伝
子のウィルスベクター中への挿入により組織培養細胞中
でタンパク質を生成するために使用され得、そして従っ
てレトロウィルスベクター粒子を製造するために適合さ
れ得る。
【０２０１】アデノウィルスは、核複製ウィルスに由来
し、そして欠陥性である。遺伝子は、ベクター中に挿入
され、そしてインビトロ構成（Ｂａｌｌａｙなど．，
ＥＮＢＯ Ｊ． ４：３８６１、１９８５）又は細胞中
での組換え（Ｔｈｕｍｍｅｌなど．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：４３５、１９８２）の
いづれかにより哺乳類細胞中にタンパク質を発現するた
めに使用され得る。
【０２０２】１つの好ましい方法は、（１）ｇａｇ／ｐ
ｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）変性されたウィルスベクタ
ー構造体を操作するアデノウィルスの主要後期プロモー
ター（ＭＬＰ）を用いてプラスミドを構成することであ
る。変性されたウィルスベクター構造体は、ウィルスベ
クタープロモーターを含む、５’ＬＴＲのＵ３領域が他
のプロモーター配列により置換され得るので可能である
（たとえばＨａｒｔｍａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１６：９３４５、１９８８を参照のこと）。この
部分は、１段階の逆転写酵素の後、３’ＬＴＲからのＵ
３により置換されるであろう。
【０２０３】次に、これらのプラスミドは、アデノウィ
ルスゲノムをインビトロで製造するために使用され得
（Ｂａｌｌａｙなど．， ｏｐ．ｃｉｔ．）、そしてこ
れらを２９３細胞（アデノウィルスＥ１Ａタンパク質を
製造するヒト細胞系）にトランスフェクトされ（このた
めにはアデノウィルスベクターは欠陥性であり）、欠陥
アデノウィルスベクターに別々に担持されるｇａｇ、ｐ
ｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウィルスベクターの純粋原液が
得られる。そのようなベクターの力価は典型的には１０
7〜１０11／ｍｌであるので、これらの原液は、組織培
養細胞を高い多重性で同時に感染せしめるために使用さ
れ得る。次に、細胞は、レトロウィルスタンパク質及び
レトロウィルスベクターゲノムを高レベルで生成するた
めにプログラムされるであろう。アデノウィルスベクタ
ーは欠陥性であるので、多量の直接的な細胞溶解は生ぜ
ず、そしてレトロウィルスベクターはその細胞上清液か
ら収穫され得る。
【０２０４】他のシステム（より細胞外性である）にお
いては、次の成分が使用される： １．Ｓｍｒｉｔｈなど．（前記）により記載されたのと
類似する態様でバキュロウィルスシステムにおいて製造
されたｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質（又は他の
タンパク質生成システム、たとえば酵母又はＥ．コリに
おいて）； ２．既知のＴ７又はＳＰ６又は他のインビトロでのＲＮ
Ａ生成システムにおいて製造されたウィルスベクターＲ
ＮＡ（たとえばＦｌａｍａｎｔ及びＳｏｒｇｅ， Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６２：１８２７、１９８８を参照のこ
と）； ３．（２）におけるようにして製造され又は酵母又は哺
乳類組織培養細胞から精製されたｔＲＮＡ； ４．リポソーム（固定されたｅｎｖタンパク質を有す
る）； ５．ｅｎｖプロセッシング及びいづれか又は他の必要な
細胞由来機能を提供する細胞抽出物又は精製された必要
な成分（固定される場合）（典型的にはマウス細胞か
ら）。
【０２０５】この方法においては、（１）、（２）及び
（３）が混合され、そして次に、ｅｎｖタンパク質、細
胞抽出物及びプレリポソーム混合物（適切な溶媒中にお
ける脂質）が添加される。しかしながら、（１）、
（２）及び（３）の混合物にその得られたリポソーム固
定ｅｎｖを添加する前、リポソームにおけるｅｎｖタン
パク質を早めに固定することが必要である。その混合物
は処理され（たとえば音波処理、温度操作又は回転透析
により）、医薬物のリポソームカプシド化に関して、Ｇ
ｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｏなど．， Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． １４８：１５、１９８５）に記載されて
いるのと類似する態様で、脂質＋固定されたｅｎｖタン
パク質による新生ウィルス粒子のカプシド化を可能され
る。この方法は、病原性レトロウィルス又は複製コンピ
テントレトロウィルスによる汚染を伴わないで、高い力
価の複製インコンピテント組換えレトロウィルスの生成
を可能にする。
【０２０６】ＶＩＩ．細胞系−特異的レトロウィルス−
「ハイブリッドエンベロープ」 レトロウィルスの宿主細胞範囲特異性を、ｅｎｖ遺伝子
生成物により一部決定する。たとえば、Ｃｏｆｆｉｎ．
Ｊ．（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ２：２５〜
２７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８
５）は、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）及びＲｏｕｓ
Ｓａｒｃｏｍａウィルス（ＲＳＶ）からのタンパク質
の細胞外成分が特定の受容体結合を担当することを示
す。他方、エンベロープタンパク質の細胞質ドメイン
は、ビリオン形成の役割を演ずることが理解されてい
る。偽型化（すなわち他の種のウィルスタンパク質によ
る１つの種からのウィルスＲＮＡのカプシド化）が、低
い頻度で生じる場合、エンベロープタンパク質は、与え
られたレトロウィルスのビリオン形成のためにある特異
性を有する。本発明は、ハイブリッドｅｎｖ遺伝子生成
物（すなわち、特に、天然において同じタンパク質分子
に存在しない細胞質領域及び外因性結合領域を有するｅ
ｎｖタンパク質）を創造することによって、宿主範囲の
特異性は、細胞質機能かち独立的に変更され得ることを
示す。従って、前もって選択された標的細胞に特異的に
結合するであろう組換えレトロウィルスが生成され得
る。
【０２０７】受容体結合成分及び細胞質成分が異なった
レトロウィルスからであるハイブリッドタンパク質を製
造するためには、組換えのための好ましい位置づけが、
細胞質成分の腹−スパン領域内に存在する。例８は、Ｍ
ＬＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインに結合さ
れるＨＩＶエンベロープタンパク質のＣＤ４結合部分を
有するタンパク質を発現するハイブリッドｅｎｖ遺伝子
の構造体を記載する。
【０２０８】例８ ハイブリッドＨＩＶ−ＭＬＶエンベロープ ハイブリットエンベロープ遺伝子を、連結の適切な点に
新しい制限部位を導入するためにインビトロ突然変異誘
発（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２、１９８５）を
用いて調製する。他方、２種のエンベロープ配列が同じ
プラスミド上に存在する場合、それらは、インビトロ突
然変異誘発を用いていづれか所望する点に直接連結され
得る。いづれの場合でも、最終結果物は、ＨＩＶ ｇｐ
１６０の５’末端及びＭＬＢ ｐ１５Ｅの３’末端を含
むハイブリッド遺伝子である。その得られた組換え遺伝
子により発現されるハイブリッドタンパク質は第１８図
に示され、そしてＨＩＶｇｐ４１の細胞外部分（ｇｐ１
２０結合領域及び融合領域）、ＨＩＶ ｇｐ１２０（Ｃ
Ｄ４受容体結合タンパク質）及びＭＬＶ ｐ１５Ｅの細
胞質部分並びに宿主膜内のいくつかの点のいづれかで存
在する連結部を含む。第１８図に示される新規のＥｃｏ
ＲＩ部位での融合により製造されるハイブリッド遺伝子
は、ヒトＳｕｐＴＩ細胞におけるＣＭＶＩＥ遺伝子の制
御下で発現され、そして真のＨＩＶｅｎｖ遺伝子によく
あることであるが、シンシチアを導く。従って、そのハ
イブリッドは、細胞表面に正しく運ばれ、そしてそこで
表示される。
【０２０９】例８は、２種の異なったレトロウィルスか
ら生成される１つのハイブリッドタンパク質を示すが、
その可能性は、レトロウィルス又は単に他のウィルスに
限定されない。たとえばヒトインターロイキン−２のβ
−受容体部分は、ＭＬＶのエンベロープタンパク質と組
合され得る。この場合、組換えは、好ましくは、損なわ
れていないｐ１５Ｅタンパク質を残して、ＭＬＶ ｅｎ
ｖ遺伝子のｇｐ７０部分に位置する。さらに、前記技法
を用いて、抗体Ｆｃセグメントを認識するエンベロープ
タンパク質を有する組換えレトロウィルスを創造するこ
とができる。次に、前もって選択された標的細胞のみを
認識するモノクローナル抗体は、そのようなエンベロー
プタンパク質を示すそのような組換えレトロウィルスに
結合され、その結果そのレトロウィルスはそれらの前も
って選択された標的細胞に結合し、そしてそれらの細胞
を感染せしめる。
【０２１０】ＶＩＩＩ．部位特異的組込み 染色体上の予定された位置へのレトロウィルスベクター
の目標決定は、遺伝子送出しシステムの利益を高める。
高い安定性が染色体上の「安全な」スポットヘの直接的
な組込みにより得られ、すなわちベクターの挿入から有
害な結果を有さないことが証明された。もう１つの可能
性ある利益は、染色体の「開放」領域に遺伝子を向ける
能力であり、ここでその発現は最大にされる。特定の部
位にレトロウィルスを組込むための２種の技法が下記に
示される。
【０２１１】（ｉ）相同性組換え 標的細胞のＤＮＡにおける特定の部位中に組換えレトロ
ウィルスのベクター構造体の外因性遺伝子を組込むため
の１つの技法は、相同性組換え法を使用する。ゲノム配
列に相同である約３００ｂｐ以上のＤＮＡ配列を含むプ
ラスミドは、そのような相同性の不在下での特定の相互
反応にわたって１０3倍以上の割合で、それらのゲノム
配列と相互作用（置換又は挿入により）することが示さ
れた（Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ
５１：５０３〜１２、１９８７；及びＤｏｅｔｓｃｈ
ｅｍａｎなど．、Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６〜７
８、１９８７を参照のこと）。挿入又は置換は、ベクタ
ーの特定の企画により操作され得ることが示された。
【０２１２】部位特異的レトロウィルス組込みに相同性
組換え法を使用するためには、ベクター構造体は、
（ａ）相同配列（標的の細胞ゲノムに対して）が適切な
位置でその構造体中に組込まれ；そして（ｂ）組込みの
正常な機構が相同配列により生じる目標決定を妨害しな
いように変性されるべきである。これに関する好ましい
アプローチは、Ｕ３逆方向反復体から下流に、３’ＬＴ
Ｒに相同配列（約３００ｂｐ以上の配列）を付加するこ
とである。このアプローチにおいては、構造体は初め、
Ｕ３におけるＮｈｅＩ部位で３’ＬＴＲに挿入された相
同の領域により製造される。宿主細胞中での逆転写は、
挿入された反復体（ＩＲ）の末端の３１ｂｐ内で５’Ｌ
ＴＲにおける相同の領域の重複をもたらすであろう。宿
主ゲノム中への組込みは、正常な組込み機構の存在又は
不在下で生じるであろう。ベクター中の遺伝子は、ＬＴ
Ｒからであろうと、又は内部プロモーターからであろう
と発現され得る。このアプローチは、二本鎖レトロウィ
ルスベクターゲノムの可能性ある自由端近くに相同の領
域を配置する効果を有する。自由端は、約１０倍、相同
性組換えの頻度を高めることが知られている。このアプ
ローチにおいては、組込みの正常な機構を打ち破り、又
はその工程を遅くするためにそれを少なくとも変性し、
相同性ＤＮＡの列挙する時間を考慮する必要がある。こ
の後者の変性が特定の場合に必要とされるかどうかは、
当業者により容易に確められ得る。
【０２１３】（ｉｉ）インテグラーゼ変性 標的細胞のゲノムの前もって選択された特定の部位にベ
クター構造体を組込むためのもう１つの技法は、インテ
グラーゼ変性を包含する。
【０２１４】レトロウィルスｐｏｌ遺伝子生成物は一般
的に４種の部分に処理される：（ｉ）ウィルスｇａｇ及
びｐｏｌ生成物を処理するプロテアーゼ；（ｉｉ）逆転
写酵素；（ｉｉｉ）ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＲＮＡを分
解するＲＮａｓｅ Ｈ；及び（ｉｖ）エンドヌクレアー
ゼ又は「インテグラーゼ」。
【０２１５】一般的なインテグラーゼ構造は、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８３：７６４８〜７６５２、１９８６）に
より分析された。このタンパク質は、レトロウィルス配
列を組込む前、宿主ＤＮＡと相互作用する亜鉛結合フィ
ンガーを有する。
【０２１６】他のタンパク質においては、そのような
「フィンガー」は、特定の配列でＤＮＡへのそのタンパ
ク質への結合を可能にする。１つの代表的な例は、ステ
ロイド受容体である。この場合、エストロゲン受容体遺
伝子におけるエストロゲン受容体フィンガーセグメント
の代わりに、グルココルチコイド受容体「フィンガー」
（すなわちＤＮＡ結合セグメント）を単純に置換するこ
とによって、エストロゲンに応答するエストロゲン受容
体をグルココルチコイドに応答するグルココルチコイド
受容体の効果にすることができる。この例においては、
ゲノムにおける位置（これにタンパク質が目標を定めら
れる）が変えられた。そのような指図配列はまた、存在
する亜鉛フィンガーの代わりにインテグラーゼ遺伝子中
に置換され得る。たとえば、ヒトエストロゲン受容体遺
伝子のＤＮＡ結合領域をコードするセグメントは、パッ
キングゲノムにおけるインテグラーゼのＤＮＡ結合領域
の代わりに置換され得る。最初に、特異的組込みがイン
ビトロ組込みシステム（Ｂｒｏｗｎなど．、Ｃｅｌｌ
２９：３４７〜３５６、１９８７）により試験される。
特異性がインビボで見られることを確かめるために、こ
のパッケージングゲノムを用いて、感染性ベクター粒子
を製造し、そしてエストロゲン−感受性及びエストロゲ
ン−非感受性細胞の感染及びそれらの細胞への組込みを
培養において比較する。
【０２１７】この技法の使用により、得られるウィルス
ベクターは、インテグラーゼゲノム中にスプライスされ
た部位特異性ＤＮＡ結合タンパク質セグメントのゲノム
結合性質により指図される、標的細胞のゲノム上の予備
選沢された部位中への組込みに向けられ得る。組込み部
位は実際、変性されたインテグラーゼのフィンガーを受
け入れるべきであることは当業者により理解されるであ
ろう。たとえば、ほとんどの細胞はグルココルチコイド
に対して感受性であり、そして従って、それらのクロマ
チンはグルココルチコイド受容体のための部位を有す
る。従って、ほとんどの細胞に関しては、グルココルチ
コイド受容体フィンガーを有する変性されたインテグラ
ーゼは、これらのグルココルチコイド受容体結合部位で
プロウィルスベクター構造体を組込むのに適切である。
【０２１８】ＩＸ．トランスジニック動物での組換えレ
トロウィルスベクターの生成 レトロウィルスベクターのヘルパー系生成に関してこれ
まで記載された２つの問題は：（ａ）多量のベクターの
生成の困難性；及び（ｂ）ベクターを製造するために一
次細胞の代わりに永久的な細胞を使用する現在の必要性
である。これらの問題は、トランスジニック動物に生成
される生産体又はパッケージング系により克服され得
る。これらの動物は、パッケージングゲノム及びレトロ
ウィルスベクターゲノムを担持する。現在の技法は、一
次細胞でのパッケージング細胞系及び所望するベクター
産生系の生成をそれらの制限された寿命期間のために可
能としない。現在の技法は、一次細胞の使用を排除する
広範な特徴づけが必要である。しかしながら、トランス
ジニック動物の個々の細胞系は、パッケージング機能、
たとえばｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖを生成する本明細書
に提供される方法により生成され得る。次にこれらの動
物の細胞系は、パッケージング機能を転写するハウスキ
ーピング又は組織特異性プロモーターの選択的な使用を
通して完全な動物又は標的を定められた組織のいづれか
における発現のために特徴づけられる。送出されるべき
ベクターもまた、組織特異的プロモーター又はハウスキ
ーピングプロモーターを有するトランスジニック動物系
に挿入される。上記で論じたように、ベクターは、５’
ＬＴＲのＵ３領域を置換するそのようなプロモーターを
排除され得る（第１９図）。このトランス遺伝子は、そ
の発現において誘発性であり、又は遍在性である。しか
しながら、このベクターはパッケージされない。次にこ
れらの動物系は、ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ動物と交配さ
れ、そして続く子孫がパッケージされたベクターを生成
する。実質的に同一であるそれらの子孫が特徴づけら
れ、そして一次産生細胞の無限な源を提供する。他方、
ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖを製造し、そしてトランスジ
ニック動物に由来する一次細胞は、一次細胞産生系を製
造するためにレトロウィルスベクターにより多量、感染
され又はトランスフェクトされ得る。多くの異なったト
ランスジニック動物又は昆虫、たとえばマウス、ラッ
ト、鶏、豚、ウサギ、牛、羊、魚及びハエは、それらの
ベクターを産生することができる。そのベクター及びパ
ッケージングゲノムは、組織特異性プロモーター及び種
々のエンベロープタンパク質の使用により、種感染特異
性及び組織特異性発現のために適合される。そのような
方法の例は、第２０図に示される。
【０２１９】一次パッケージング系のトランスジニック
生成の次の例はマウスについてのみ記載されているが、
これらの方法は当業者により他の種に拡張され得る。マ
ウスゲノムにおいてＭＬＶ配列に対する相同性が与えら
れる場合、その最終的に好ましい動物はマウスでない。
【０２２０】例９ トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウ
スキーピングプロモーターを用いてのＧａｇ−Ｐｏｌタ
ンパク質の産生 十分に特徴づけられたハウスキーピングプロモーターの
例は、ＨＰＲＴプロモーターである。ＨＰＲＴは、すべ
ての組織において発現するプリンサルベージ酵素である
（Ｐａｔｅｌなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
６：４〜４０３、１９８６及びＭｅｌｔｏｎなど．、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：２１４７
〜２１５１、１９８４を参照のこと）。このプロモータ
ーは、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、１９８２を参照のこと）を用いて、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，
Ｉｎｃ．）でクローンされる種々のｇａｇ／ｐｏｌフラ
グメント（たとえばＢａｌＩ／ＳｃａＩ；ＡａｔＩＩ／
ＳｃａＩ；ＭｏＭＬＶのＰｓｔＩ／ＳｃａＩ；ＲＮＡ
Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２、１９８５ Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、１９８５を参照のこと）の前に挿入される。その得
られたプラスミドを精製し（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．、
ｏｐ．ｃｉｔ．）、そして適切な遺伝子情報をＧｅｎｅ
ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１）又はエレクトロエルーシ
ヨン（Ｈｏｇａｎなど．（出版社）Ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｂｏｒ、１９８６を参照のこと）を用いて
分離する。
【０２２１】これらの十分に特徴づけられたＤＮＡを、
２μｇ／ｍｌの濃度で受精されたマウスの卵子の前核に
マイクロインジェクトする。生存する生まれたマウス
を、テイルブロット分析（Ｈｏｇａｎなど．、ｏｐ．ｃ
ｉｔ．を参照のこと）によりスクリーンする。トランス
ジニック−陽性動物を、放射性ラベルされた一次細胞、
たとえば繊維芽細胞の免疫沈殿法によりｇａｇ−ｐｏｌ
タンパク質の発現レベルについて特徴づける（Ｈａｒｌ
ｏｗなど．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、１９８８を参照のこと）。次に、動物
を、ｇａｇ−ｐｏｌの特徴づけられたレベルを産生する
動物系の確保のために、ホモ接合度に繁殖せしめる。
【０２２２】例１０ トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウ
スキーピングプロモーターを用いてのｅｎｖタンパク質
／ハイブリッドエンベロープタンパク質の産生 この例は、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープ
タンパク質のいづれかの発現のためにＨＰＲＴプロモー
ターを使用する。このエンベロープタンパク質は、ＭＬ
Ｌの場合において、適切なｇａｇ−ｐｏｌを補うことが
できるいづれかのレトロウィルスからである。例は、エ
コトロピックＭＬＶ、アンフォトロピックＭＬＶ、キセ
ノトロピックＭＬＶ、ポリトロピックＭＬＶ又はハイブ
リッドエンベロープである。上記のように、エンベロー
プ遺伝子は、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓな
ど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）を用いて、ＨＰＲ
Ｔプロモーターの後ろにクローンされる。得られた「小
遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）」は単離され（Ｈｏｇａｎ
など．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）、そしてエンベ
ロープタンパク質の発現が決定される（Ｈａｒｌｏｗな
ど．、ｏｐ．ｃｉｔ．）。トランスジニックエンベロー
プ動物を、十分に特徴づけられたエンベロープ動物を得
るために、ホモ接合度に繁殖せしめる。
【０２２３】例１１ トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウ
スキーピングプロモーターを用いてのｇａｇ−ｐｏｌ−
ｅｎｖ動物の産生 これは、十分に特徴づけられたｇａｇ−ｐｏｌ動物及び
永久的なｇａｇ−ｐｏｌ／エンベロープ動物系の確立の
ための動物を使用する。これは、ホモ接合度への繁殖及
び十分に特徴づけられた系統の確立を包含する。次に、
これらの系統は、組織培養においてパッケージングベク
ターのために使用され得る一次マウス胚系を得るために
使用される。さらに、レトロウィルスベクターを含む動
物は、この系統中に繁殖される。
【０２２４】例１２ トランスジニック動物におけるｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ
又はハイブリッドエンベロープの組織特異性発現の産生 この例は、特定の組織、たとえばＴ細胞へのｇａｇ ｐ
ｏｌ、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープの組
織発現を指図することである。これは、位置及びコピー
数を付与されているＣＤ２配列（Ｌａｎｇなど．、ＥＭ
ＢＯ Ｊ． ７：１６７５〜１６８２、１９８８を参照
のこと）の使用を包含する。ＣＤ２遺伝子からの１．５
ＫｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、組
換えＤＮＡ技法を用いてｇａｇ−ｐｏｌ、エンベロープ
又はハイブリッドエンベロープフラグメントの前に挿入
する。これらの遺伝子を、マイクロインジェクションに
より受精されたマウスの卵子中に注入する。トランスジ
ニック動物を前のようにして特徴づける。Ｔ細胞の発現
を確立する。動物をホモ接合度に繁殖し、トランスジニ
ック動物の十分に特徴づけられた系統を確立する。Ｇａ
ｇ−ｐｏｌ動物とエンベロープ動物とを接合し、Ｔ細胞
のみを発現するｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物を得る。次
に、これらの動物のＴ細胞は、レトロウィルスベクター
をパッケージングできるＴ細胞のための源である。再
び、ベクター動物とこれらのｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動
物とを交配し、ベクターを発現するＴ細胞を得る。
【０２２５】この技法は、他の組織特異性プロモータ
ー、たとえばミルク特異性（Ｗｈｅｙ）プロモーター、
膵臓（インシュリン又はエラスターゼ）プロモーター、
又はニューロン（ミエリン基材タンパク質）プロモータ
ーの使用を可能にする。プロモーター、たとえばミルク
特異性プロモーターの使用を通して、組換えレトロウィ
ルスが、その子孫の生物学的流体から直接的に単離され
る。
【０２２６】例１３ トランスジニック動物におけるハウスキーピング又は組
織特異性レトロウィルスベクターのいづれかの産生 トランスジニック動物の生殖系中へのレトロウィルス又
はレトロウィルスベクターの挿入は、ほとんど又はまっ
たく発現をもたらさない。Ｊａｅｎｉｓｃｈ（Ｊａｈｎ
ｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３〜６２８、
１９８２を参照のこと）により記載されるこの結果は、
５’レトロウィルスＬＴＲ配列のメチル化によるもので
ある。
【０２２７】この技法は、レトロウィルスベクター／レ
トロウィルスを発現するハウスキーピング又は組織特異
性プロモーターのいづれかを置換することによってその
メチル化効果を克服する。エンハンサー成分を含む、
５’ＬＴＲのＵ３領域を、ハウスキーピング又は組織特
異性プロモーターからの調節配列により置換する。その
３’ＬＴＲは、ウィルスＲＮＡのポリアデニル化及び組
込みのために必要な配列を含むように、十分に保持され
る。レトロウィルスの複製の一般的な性質の結果とし
て、組込まれたプロウィルスの５’ＬＴＲのＵ３領域
は、感染ウィルスの３’ＬＴＲのＵ３領域により生成さ
れる。従って、３’は必要であるが、しかし５’のＵ３
はなくてもよい。５’ＬＴＲのＵ３配列とプロモーター
との置換及びトランスジニック動物の生殖系中への挿入
は、レトロウィルスベクター転写物を産生できる動物系
をもたらす。次に、これらの動物をｇａｇ−ｐｏｌ−ｅ
ｎｖ動物に交配し、レトロウィルス産生動物を生成する
（第２０図を参照のこと）。
【０２２８】前述の発明は、明確に理解するために例示
的且つ例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
【０２２９】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Chiron Corporation <120> Replication defective recombinant retrovirus
es <130> F1-98811J47 <140> <141> <150> US 170,515 <151> 1988-03-21 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 gagagatggg ggaggctaac tgag 24 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 gatcctcagt tagcctcccc catctctc 28
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ ｅｎｖを生成するために使用
されるベクターの３種の異なった種類を示し、そしてこ
れは挿入される選択可能なＳＶ−Ｎｅｏカセットを有し
ても良く又は有さなくても良い。
【図２】図２は、示されるベクターによりトランスフェ
クトされたヒトＳｕｐＴＩ細胞の抽出物のＨＩＶ ｅｎ
ｖ特異的ラジオイムノ沈殿物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動に見出されるＨＩＶ ｅｎｖ発現レベルを示
す。マーカーはキロドルトンで存在し、ｇｐ１６０及び
ｇｐ１２０は適切なタンパク質を示し、そして５１７＋
ｔａｔは陽性の対照（ｔａｔの存在下でのＨＩＶ ＬＴ
Ｒ推進性ｅｎｖ）である。
【図３】図３は、ＨＩＶ ｅｎｖ（このベクターはｐＡ
Ｆ／ｅｎｖ−ＳＶ−Ｎｅｏである）を発現する有性生殖
性腫瘍細胞により注射されたマウスに誘発されるＴ細胞
殺害を試験するための方法を示す。
【図４】図４は、図３の実験方法の結果を図的に示す。
特異的殺害は、ＢＣ１０ＭＥｅｎｖ−２９殺害ｖｓ．殺
害に対するＢ／Ｃ１０ＭＥ耐性のグラフの上部に見られ
る。
【図５】図５は、ｓＣＤ４を発現するように企画された
ベクターを示す。
【図６】図６は、ベクターＴＫ１（ＳＶ−Ｎｅｏを含ま
ない）及びＴＫ３（ＳＶ−Ｎｅｏを含む）を担持するプ
ラスミドの構成を示す。
【図７】図７は、ベクターＫＴＶＩＨＡＸを担持するプ
ラスミドの構成を示す。
【図８】図８は、ベクターＫＴＶＩＨ５（ＳＶ−Ｎｅｏ
を有さない）及びＫＴＶＩＨＮｅｏ（ＳＶ−Ｎｅｏを有
する）を担持するプラスミドの構成を示す。
【図９】図９は、ベクターＭＨＭＴＫ−Ｎｅｏを担持す
るプラスミドの構成を示す。
【図１０】図１０は、ｔａｔ−ｈｉｓ（センス方向にお
けるｔａｔ）又はαｔａｔ（アンチセンス方向における
ｔａｔ）ベクターを担持するプラスミドの構成を示す。
【図１１】図１１は、３種の条件づけされた致死ベクタ
ーによる感染及びアシクロバー（ＡＣＶ）による処理に
基づいて、対照ＰＡ３１７に比べてのｔａｔｈｉｓベク
ター（５個のクローン、ＴＨ１〜５）により感染された
ＰＡ３１７細胞の選択的な殺害を図的に示す。
【図１２】図１２は、ＨＩＶ誘発性マーカー／レポータ
ー遺伝子、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を
担持するウィルスベクターの構成を示す。
【図１３】図１３は、細胞中にトランスフェクトされ得
るプラスミド上に担持されるＨＩＶ誘発性マーカー／レ
ポーター遺伝子の構造を示す。
【図１４】図１４は、ＡＺＴの種々の濃度で、ＨＩＶを
有する図１３のＡＰマーカーを担持するＳｕｐＴＩ細胞
のＨＩＶ感染の時間経過を図的に示す。ＨＩＶ感染のレ
ベルは、上清液の少量のアリコートを取ることによって
測定された。
【図１５】図１５は、図１４におけるのと同じ実験の結
果を図的に示すが、しかしＨＩＶインヒビターとしてｄ
ｄＣを用いる。
【図１６】図１６は、プロモーター（右）から直接的な
フレオマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミド及びそ
れとプロモーターの間に位置するコード配列を有するＰ
ＲＧを発現するもう１つのプラスミドによる細胞のトラ
ンスフェクションに基づくフレオマイシン選択の後、生
存する細胞の数を図的に示す。
【図１７】図１７は、哺乳類細胞においてレトロウィル
スタンパク質を発現するように企画された４種のプラス
ミドを示す。ｐＳＶｇｐ及びｐＲＳＶｅｎｖは選択可能
なマーカーにより同時トランスフェクトされ、そしてｐ
ＳＶｇｐ−ＤＨＦＲ及びｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏ
は、ウィルスタンパク質−コード領域の下流に位置する
選択可能なマーカーを有する同等のプラスミドである。
【図１８】図１８は、新規の適合する制限酵素部位を創
造するために両コード配列の特定部位を突然変異誘発し
た後のＨＩＶ ｅｎｖ及びＭＬＶ ｅｎｖの融合の３種
の部位を示す。Ｎ末端配列は、両者において左側に存在
する。数字はヌクレオチド数に応じる。ＳＴ、ＳＲ、Ｓ
Ｅはｔａｔ， ｒｅｖ及びｅｎｖの開始であり、ＴＴ、
ＴＲ及びＴＥはその対応する終結部位である。
【図１９】図１９は、領域におけるＳａｃＩ， Ｂｓｓ
ｔＩＩ又は他の部位のいづれかに融合され得る異種プロ
モーター／エンハンサーによる５’ＬＴＲのＵ３の置換
を示す。
【図２０】図２０は、ウィルスタンパク質又はベクター
ＲＮＡを発現するトランス遺伝子性マウスを交差するた
めの代表的な方法を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダグラス ジェイ． ジョリー アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037, ラジョーラ，ビア アリカント ドライブ 30508 (72)発明者 ジェイムズ ジー． レスペス アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，ラモント ストリート 4966 (72)発明者 ポール ケー． レイカインド アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130, サンディエゴ，キャミニトー ミラ デル マー 12433

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複製欠陥組換えレトロウィルスであっ
    て、該レトロウィルスに感染した標的細胞において抗原
    又はその改変形の発現を指図するベクター構造体を有
    し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激
    し得る、複製欠陥組換えレトロウィルス。
  2. 【請求項２】 複製欠陥組換えレトロウィルスであっ
    て、該レトロウィルスに感染した標的細胞において病原
    性抗原の改変形の発現を指図するベクター構造体を有
    し、該改変された抗原は、動物内の免疫応答を刺激し得
    るが、該病原性抗原と比較して減少した病原性を有す
    る、複製欠陥組換えレトロウィルス。
  3. 【請求項３】 前記発現された抗原が、細胞媒介性免疫
    応答を誘発する、請求項１又は２に記載の複製欠陥組換
    えレトロウィルス。
  4. 【請求項４】 前記発現された抗原が、ＨＬＡクラスＩ
    及び／又はクラスＩＩに制限される免疫応答を誘発す
    る、請求項１又は２に記載の複製欠陥組換えレトロウィ
    ルス。
  5. 【請求項５】 前記発現された抗原が、ｇｐ１６０、ｇ
    ｐ１２０、及びｇｐ４１、又はこれらの改変形から成る
    群から選択されるＨＩＶタンパク質である、請求項１〜
    ４のいづれか１項に記載の複製欠陥組換えレトロウィル
    ス。
  6. 【請求項６】 目的の抗原を認識する特定のＴ細胞受容
    体又は免疫グロブリンの発現を指図するベクター構造体
    を有する、複製欠陥組換えレトロウィルス。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいづれか１項に記載の複
    製欠陥組換えレトロウィルスに感染したエクスビボ細
    胞。
  8. 【請求項８】 請求項１〜６のいづれか１項に記載の複
    製欠陥組換えレトロウィルスにインビトロで感染したヒ
    ト細胞。
  9. 【請求項９】 請求項１〜６のいづれか１項に記載の複
    製欠陥組換えレトロウィルスを、生理学的に許容できる
    キャリヤー又は希釈剤とともに含有する、癌性疾患また
    は感染性ウィルス疾患を治療するための医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 活性な治療物質として使用するため
    の、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 複製欠陥組換えレトロウィルスベクタ
    ーを標的細胞に運ぶために有用なハイブリッドｅｎｖ遺
    伝子とともにカプシド化された複製欠陥組換えレトロウ
    ィルスベクターであって、該ｅｎｖ遺伝子は： （ａ）第１のレトロウィルス表現型の細胞質セグメン
    ト；及び（ｂ）該第１のレトロウィルス表現型に対して
    外因性の結合セグメントであって、該標的細胞に選択的
    に結合し得る結合セグメント、をコードする、複製欠陥
    組換えレトロウィルスベクター。
  12. 【請求項１２】 ヒト細胞に感染し得、そしてヒトにお
    いて異種抗原に対する免疫応答を刺激し得る該異種抗原
    を発現し得る、複製欠陥組換えレトロウィルス。
  13. 【請求項１３】 前記免疫応答が細胞媒介性免疫応答で
    ある、請求項１２に記載の複製欠陥組換えレトロウィル
    ス。
  14. 【請求項１４】 前記抗原が、ｇｐ１６０、ｇｐ１２
    ０、及びｇｐ４１から成る群から選択されるＨＩＶタン
    パク質である、請求項１２に記載の複製欠陥組換えレト
    ロウィルス。
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