JPH06500923A - パッケージング細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２４、　ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖのための遺伝子を別々のオペロン上に担持し く前記オペロンはレトロウィルスＬＴＲ配列を欠き）、そしてＮ２型ベクター構 成体の導入に基づいて、少なくとも２０日間の培養継代の後、実質的にヘルパー ウィルスを生成しない非マウスパッケージング細胞系。

２５、前記細胞系が真向性パッケージング細胞系である請求の範囲第２４項記載 の細胞系。

２６、前記細胞系が多回性パッケージング細胞系である請求の範囲第２４項記載 の細胞系。

２７、前記細胞系が異種向性パッケージング細胞系である請求の範囲第２４項記 載の細胞系。

２８、組換えレトロウィルスの生成方法であって：ａ）レトロウィルスベクター システムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウィルスを実質的 に有さない細胞系中にレトロウィルスベクターシステムからのパンケージング遺 伝子を導入し；そして ｂ）標準のマウス両同性パッケージング細胞系に比較して、ウィルスパッケージ ングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成し、そしてベクター構成体の 導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ベクタ ー力価において少なくとも１０倍高く生成する細胞について選択することを含ん で成る方法。

２９、　＆ｌｉ換えレトロウィルスの生成方法であって：ａ）レトロウィルスベ クターシステムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウィルスを 実質的に有さない細胞系中に、ヒト細胞を感染できるレトロウィルスベクターシ ステムからのパフケージング遺伝子を導入し；そして ｂ）ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞 系の力価に少なくとも等しいベクター力価を生成し、そしてヒト細胞を感染でき るベクター粒子を生成する細胞について選択することを含んで成る方法。

３０、　ＣＡ、　２Ａ、　ＤＡ、　ＣＡ２．　ＯＫ、　０１７　ＸＥｌｆＯ，Ｋ ｘ、　Ｋ丁１０８０　ＸＥＮＯ，ｆｆＰ及びＨＴ１０８０　ＰＯＬＹから成る群 から選択された細胞系。

３１、選択された細胞型を感染できるベクターの生成方法であって：ａ）ウィル スが遺伝子的に変異誘発し、そして卓越して早く増殖する株が生成するまで、選 択された細胞型の細胞においてウィルスを連続的に継代し； ｂ）前記変異誘発され、そして早く増殖する株を単離し；Ｃ）前記変異誘発され たウィルスの選択的増殖を担当できる前記変異誘発された株の成分を同定し、そ して単離し；ｄ）連続した継代の前、前記ウィルスに基づかれる生成体細胞にお ける対応する成分のための置換体として前記同定され、そして単離された成分を 、挿入し、そして、 ｅ）前記ベクターを生成せしめるために前記生成体細胞を培養することを含んで 成る方法。

浄書（内容に変更なし） 明細書 パッケージング細胞 及止分！ 本発明は一般にレトロウィルス、そしてより詳しくは、感受性標的細胞にベクタ ー構造体を搬送することのできる組換えレトロウィルスに関する。これらのベク ター構造体は典型的には標的細胞において所望のタンパク質を発現するようにデ ザインされており、このタンパク質には、数多くの手段における治療的作用を有 することがあり、それ故、細胞の中へのタンパク質（又はＲＮＡ）の輸送を可能 とする「薬荊」輸送系を構成するタンパク質が含まれる。酵素反応、細胞成分と の結合性、免疫学的作用又はその他の生物学的作用に関するタンパク質（又はＲ ＮＡ）の特異性は、もしこのタンパク質又はＲＮＡ分子が細胞の中に輸送されう るなら、標的細胞に関連の特異的作用を及ぼすことを可能とする。かかる作用に は遺伝的欠陥の修復、細胞プロセスをブロックするためのアンチセンスＲＮＡの 生産、プロドラッグの酵素的潜在化、及び細胞免疫系の刺激、並びにタンパク質 の細胞内生産に基づくその他のあらゆる治療が含まれる。

衾更生！見 レトロウィルスは複製し、そしてＤＮＡ中間体を介して宿主細胞のゲノムの中に 組込まれることのできるＲＮＡウィルスである。このＤＮＡ中間体又はプロウィ ルスは、宿主の細胞ＤＮＡの中に安定に組込まれうる。宿主細胞の中へのそれら の組込まれる効率性に基づき、レトロウィルスは人遺伝子治療における利用にと って最も有望とされるベクターのうちの一つである。これらのベクターは、それ らが疾患の遺伝的治療にとって最も有望である技術の一つであると考えられるよ うにするいくつかの特徴を有している。これには：　（Ｉ）細胞の中への遺伝子 物質（ベクターゲノム）の効率的な侵入；　（２）標的細胞の核への侵入に現実 的に有効なプロセス；　（３）比較的高いレベルの遺伝子発現；　（４）標的細 胞に及ぼす最小の病理学的作用；及び（５）特定の細胞サブタイプを標的にする 能力が含まれ、これらはベクター−標的細胞結合のコントロール及び遺伝子発現 の組織特異的コントロールを介する０例えば、対象の外来遺伝子を、正常のレト ロウィルスＲＮＡと置き換えてレトロウィルスの中に組込むことができる。レト ロウィルスがそのＲＮＡを細胞の中に注入すると、この外来遺伝子も細胞の中に 導入され、そしてそれらがあたかもレトロウィルス自体であるかのように宿主の 細胞ＤＮＡの中に組込まれうる。宿主内でのこの外来遺伝子の発現は宿主細胞に よる外来タンパク質の発現をもたらす。

遺伝子治療のために開発されてきたほとんどのレトロウィルスはネズミのレトロ ウィルスである。簡単に述べると、これらのレトロウィルスは二つの型、即ち、 宿主の細胞ＤＮＡの中に組込まれるプロウィルスとして、又は遊離ピリオンとし て存在する。ピリオンは、レトロウィルスの構造及び酵素タンパク質（逆転写酵 素を含む）、ウィルスゲノムの２つのＲＮＡコピー、並びにウィルスのエンベロ ープ糖タンパク質が埋まっている細胞の形質膜の部分を含むウィルスを形成する 。このゲノムは４つの主要領域：長い末端反復（ＬｏｎｇＴｅｒｍｉｎａｌ　Ｒ ｅｐｅａｔ　：　ＬＴＲ）、並びにｇａｇ＋　Ｐ”及びｅｎｖ遺伝子を編制する 。　ＬＴＲはプロウィルスゲノムの両端に見い出せることができ、ＲＮＡゲノム の５′及び３′末端の構成成分であり、そして転写の開始及び終結にとって必須 なシス作用因子を含む、３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは末端のＬＴＩ ？の間に位１する＊　ｇａｇ及びｐａｌ遺伝子はそれぞれ内部ウィルス構造及び 酵素タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコー ドし、これはウィルスに感染はこの概念に合うように開発されている。Ｎ単に述 べると、この方法論は２つの成分、即ち、レトロウィルスベクターとパッケージ ング細胞の利用を採用する。レトロウィルスベクターは長い末端反復（ＬＴＲ） 、転移させるべき外来［ＩＮＡ及びパッケージング配列（ψ）を含む、このレト ロウィルスベクターはそれ自体によって再生することはなく、その理由は構造及 びエンベレロープタンパク質をコードする遺伝子がこのベクターの中に含まれて いないからである。このパッケージング細胞はｇａｇ、　ｐｏｌ及びｅｎｖタン パク質をコードする遺伝子を含むが、しかしパンケージングシグナル「ψ」は含 まない。

従って、バフケージング細胞はそれ自体によっては空のピリオン粒を作り上げて いる。この生産細胞はレトロウィルスベクター（外来）の口にＡのみを含むピリ オン粒子を製造し、従って治療的利用にとっ性レトロウィルス）の発生が含まれ る。レトロウィルスで汚染された人の治療のための調製物は、人の治療における 利用に適切でないと現状考えられている０例えば、イメージング及び治療のため のモノクローナル抗体のレトロウィルス汚染の排除のためにかなりの手段が取ら れている。生存ウィルスは、（１）ベクターゲノムとヘルパーゲノムが互いに組 換えし合うとき；　（２）ベクターゲノム又は所望のベクター配列の転移と匹敵 する頻度にて標的処理細胞に伝達Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＬＩＳＡ　８　：　６４６０−６４６４．１９８８を参照のこヘルパー細胞 系は大細胞及び広域のその他の哺乳動物細胞に感染で更に関連の利点を提供する 。

胞の利用を介してカスビド及びエンベロープの中にパッケージされている組換え レトロウィルスを生産するための方法を提供する。このパッケージング細胞には 、生存レトロウィルス粒子の生産に必要な全てのタンパク質を生産する細胞のゲ ノムの中に組込まれる、好ましくは２つのプラスミドの形態におけるウィルスタ ンパク質コード化配列、所望の遺伝子を保有するであろうＲＮＡをコードするＤ ＮＡウィルス構造体が、レトロウィルス粒子へとＲＮＡのパンケージングを誘発 するであろうパンケージングシグナルと共に傭っている。

本発明は更に組換えレトロウィルスを生産するためのいくつかの技術を提供し、 このレトロウィルスは：ｉ）パッケージング細胞からのより高力価物の生産；ｌ ｉ）非ネズミ系であり（組換え体又は内因的に活性化されたレトロウィルスの生 産を回避するため、及び欠陥ネズミレトロウィルス配列のパッケージングを回避 するため）、且つ大細胞に感染するであろうパフケージング細胞系からの高力価 の無ヘルパー組換え体の生るため、及び細胞のタイプの感染性の特異性を可能と するため）による、高力価を有する無ヘルパー組換えレトロウィルスの生産；ｉ ｖ）パッケージング細胞の利用を含まない手段によるベクター構造体のパッケー ジング； ■）予備選択細胞系を標的とすることのできる組換えレトロウィルスの生産； ｖｉ）！Ｉｆ＠特異性（例えば腫瘍）プロモーターを有するレトロウィルスベク ターの作製；並びに ｖｉ）細胞ゲノムの中の予備選択した（複数の）部位の中へのプロウィルス構造 体の組込み； を促進することができる。

パンケージング細胞からの高力価物の生産のための一技術はパフケージング細胞 からの力価を制限することのできる数多くの要因の発見を利用している（最も制 限されるものはパッケージングタンパク質、即ち、ｇａｇ＋　ｐｏｌ及びｅｎｖ タンパク質の発現レベル、並びにプロウィルスベクターからのレトロウィルスベ クターＲＮＡの発現レベルである）、この技術は、上記のパンケージングタンパ ク質及びベクター構造体１７ＮＡの高レベルな発現性（即ち、高濃度で生産ンを 有するパフケージング細胞の選別を可能にする。より詳しくは、この技術は、パ ッケージングタンパク質（例えば、ｇａｇ、　ｐｏｔ及びｅｎｖタンパク質）又 は標的細胞のゲノムの中に搬送すべき対象の遺伝子（典型的にはベクター構造体 として）のいづれかである、本明細書で［主要因子」として称するものを高レベ ルで生産するパンケージング細胞の選択を可能にする。このことは、パフケージ ング細胞において主要因子を発現せしめる遺伝子（「主要遺伝子」）を好ましく はこの主要遺伝子の下流の選択遺伝子と共に保有するゲノムをパッケージング細 胞に付与することによって達成される。この選択遺伝子はパッケージング細胞に おいて選択タンパク質、好ましくは何らかの細胞毒性薬剤に対する耐性を授ける ものを発現させる０次にこの細胞を好ましくは細胞毒性薬剤である選択試薬に暴 露する。これは選択タンパク譬を臨界レベルで発現する細胞の同定を可能にする （即ち、細胞毒性薬剤の場合、生存のために必要とされる耐性タンパク質を一定 しヘルで生産しない細胞を殺すこ七による）。

好ましくは、簡単に上述した技術において、選択及び主要遺伝子の両方の発現は 同一のプロモーターによりコントロールされる。この観点において、非−ＭＬＶ レトロウィルス５　’　ＬＴＲを利用することが好ましいことがある。パフケー ジング細胞からの組換えレトロウィルスの力価を最大とするため、この技術はま ず要望される全てのパッケージングタンパク質を高レベルで発現するパンケージ ング細胞の選択のために用いられ、次に所望のプロウィルス構造体による感染の 後に、最も高力価の組換えレトロウィルスを生産する細胞の選択のために用いら れる。

非ネズミ細胞において高力価の無ヘルパーＡｌｌ換えレトロウィルスを生産する 細胞を選択する技術も提供する。かかる細胞系は効率的に大細胞に感染すること のできる組換えレトロウィルスを生産する。

これらの技術は、複製ウィルスの存在下において組換えレトロウィルスを生産で きる有効な親細胞のスクリーニングを包括する０次に、上記の手順により選んだ 候補の細胞系の未感染培養物に、レトロウィルスｇａｇ／ｐｏｔを発現するベク ターを感染させ、そして高レベルのｇａｇ／ｐｏｔを合成するクローンを同定す る。このタイプのクローンを次にｅｎｖを発現するベクターにより再感染させ、 そして高レベルのｅｎｖ（及びｇａｇ／ｐｏｌ）を発現するクローンを同定する ０本発明の範囲において、「高レベル」はウェスタンプロット分析により標準の マウスパッケージング系、ＰＡ３１７において見い出せるものよりも有意に高い ことを意味する。数多くの非マウス細胞系、例えば人又はイヌは、自発的にコン ピテントレトロウィルスを作ることが知られておらず、組換えネズミレトロウィ ルスパッケージング又は遺伝子配列のための可能な組換えパートナ−を保有せず 、そしてＭＬＶ系によりパンケージされうるＲＮＡを作る遺伝子を保有していな い、上記したものと’１１４Ｑの技術による、異種向性又は多部性のようなエン ベロープを択一的に用いる高力価の組換えレトロウィルスを生産する細胞系を作 る技術を提供する。かかるレトロウィルスは、両回性耐性細胞（異種向性エンベ ロープ）を感染せしめるのに、又はサブセットの細胞（多回性）のみを感染せし めるのに用いることができる。

予備選択細胞系を標的とすることのできる組換えレトロウィルスを生産するのに 適切な技術は：第一レトロウィルス表現型の細胞質セグメント、及びこの第一レ トロウィルス表現型に対して外因性の細胞外結合セグメントを含んで成るｅｎｖ 遺伝子（この結合性セグメントは第二ウィルス表現型に由来するか、又は所望の 結合特性を有するその他のタンパク質に由来し、これは所望の標的に結合するで あろうペプチドとして発現されるように選ばれる）；その他のウィルスエンベロ ープタンパク質；正常エンベロープタンパク質に代わるその他のりガント分子； 又は標的細胞タイプの感染をもたらさないエンベロープタンパク質を伴うその他 のリガンド分子；のうちの１又は複数のものを有する組換えレトロウィルスを利 用する。好ましくは、簡単に上述した技術において、レトロウィルス表現型の細 胞質セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝子を、レセプター結合性ドメインを存す るタンパク質をコードする外因遺伝子と組合せて、標的とする細胞タイプ、例え ば腫瘍細胞に特異的に結合する組換えレトロウィルスの能力を向上させる。この 観点において、標的細胞の表層において高レベルで発現されたレセプターに結合 するレセプター結合性ドメインを利用する、又は択一的に、特定の組繊細胞タイ プ（ｇ４えば乳癌における上皮細胞、管上皮細胞、他）において比較的高レベル で発現されたレセプターに結合するレセプター結合性ドメインを利用することが 好ましいことがある。成長因子又は活性化レセプター（例えばＥＧＦ又はＣＤ３ 　レセプター）に特異性を存するバイブリドエンへロープを標的とするある潜在 的な利点は、ベクター自身の結合が、ウィルスの組込み及び発現にとって必須な 細胞周期をもたらしつることにあることがある。この技術において、一定の腫瘍 に対する特異性を有する組換えレトロウィルスを改善及び遺伝子的に変えること が、腫瘍細胞における複製組換えレトロウィルスの反復継代により；又はベクタ ー構造体を薬剤耐性遺伝子に連結させ、次いで薬剤耐性物を選択することによっ て可能となりうる。

標的細胞のＤＮＡの中の特定の部位にレトロウィルスゲノムを組込むための技術 は、相同組換えの利用、又はそうでなければこの標的細胞ゲノム上の特定の部位 をＩｔｓするであろう改質化インテグラーゼ酵素の利用を包括する。かかる部位 特異的挿入は標的細胞のＤＮＡ上の部位に遺伝子が挿入されることを可能とし、 これは挿入突然変異誘発の機会を最小にし、このＤＮＡ上の他の配列による干渉 を最小にし、そして特定の標的部位での配列の挿入を可能として、標的細胞のＤ ＮＡにおける所望されない遺伝子（例えばウィルス遺伝子）の発現を下げる又は なくすことができうる。

上述した任意の技術は特定の状況において他のものと独立して利用されることが でき、又は１又は複数の残りの技術と組合せて利用できることが予想されうる。

本発明のこれら及びその他の観点は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照する ことによって明らかとなるであろう。

皿皿皇呈車星艮里 図ＩＡは哺乳動物細胞においてレトロウィルスタンパク質を発現するようにデザ インされた４種のプラスミドを示す、　ＧＩＳＶｇｆｌ及びｐＲ５Ｖｅｎｖば選 択マーカーによって共トランスフェクトされており、そしてｐｓＶｇＰ−ＤＩ（ ＰＲ及びｐＲ５Ｖｅｎｖ−ｐｈｌｅｏは、ウィルスタンパク質コード領域の下流 に位置する選択マーカーを有する等価のプラスミドでスベクターとしてのＭＬＶ 両向性ｅｎｖ（ｐＬＡＲＮＬ）　、の発現をもたらすベクターを示している。

図ＩＣは、ヘルパーウィルスの存在下においてレトロウィルスベクターを作製す る細胞系の固有能力を評価するスクリーニング手順のクローンの選別、及びｐＡ ３１７と比較したこれらのクローンのｇａｇ生向性ｅｎｖ）におけるＭＣＦ　（ 多量性）　ｅｎｖのレベルを比較したウニスタンドの数に関する（幻燵二Ｔｕｍ ｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓエ　第■巻、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

１９８５）　、　ＳＴ、　Ｓｉ２．　ＳＥは、ｔａｔ　ｒｅｖ及びｅｎｖの起点 であり、そして首。

ＴＲ及びＴＥは対応の終結部位である。

図３は、外来性プロモーター／エンハンサ−による５’ＬＴＲにおけるＵ３の置 換を示し、これはＳａｃ　Ｅ　、　Ｂｓ５ｈＩＩ又はこの領域におけるその他の 部位にて融合されることができる。

図４は、ウィルスタンパク質又はベクター！？ｌｉＡを発現する遺伝子導入マウ スを交配する代表的な方法を例示する。

主玉夏毘鞭星区所 第１の観点において本発明は、パッケージング細胞系（ＰＣＬ）からの低力偏組 換えウィルスの主要原因及びかかる原因を修復するための技術の発見にある程度 基づく、基本的に、少なくとも５つの要因が低力価ｌｌ１ｍえウィルスの原因と して考えられうる：１、ウィルスパッケージングタンパク質の限られた有用性； ２、レトロウィルスベクターＲＮＡゲノムの限られた有用性；３、組換えレトロ ウィルスの発芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）のための細胞膜の限られた有用性； ４、レトロウィルスベクターゲノムの限られた固有パフケージング効率；及び ５、一定のレトロウィルスのエンベロープに対して特異的なレセプターの密度。

６、宿主細胞構成物の限られた有用性（例えばＲＮＡ　、又はミリストイル化、 リン酸化、グリコジル化もしくはタンパク質分解機能）。

上記した通り、ウィルスパッケージングタンパク質の限られた有用性は、パンケ ージング細胞からの組換えレトロウィルスの生産における初期の制限された要因 にある。パフケージング細胞中のパッケージングタンパク質のレベルが上昇する と、力価は約１０’　怒染性単位／ミリリットルにまで上昇するが、引き続きパ ンケージングタンパク質レベルの上昇は力価に更なる影響を及ぼさない。しかし ながら、力価はパンケージングのために有用なレトロウィルスベクターゲノムの レベルを上昇させることによっても更に増大されうる。

従って、最大レベルでパッケージングタンパク質及びレトロウィルスゲノムを製 造する生産細胞を選ぶことがを利である。最初の頃に表題「発明の背景Ｊの章に 記載したパフケージング細胞及び生産細胞を固定する、それ故選択する方法は、 下記の理由のために低力価物を生産する数多くの生産細胞の選択を紹きがちであ ることが発見された。

本発明は、５’ＬＴＲ又はその他のプロモーターより下流にあり、介在配列によ りそれらから隔てられている遺伝子のタンパク質発レベルが、介在遺伝子が存在 していないときよりも実質的に低いという従来の欠点を利用する０本発明におい て、この選択遺伝子はパッケージングゲノムの遺伝子又はベクター構造体により 保有された対象の遺伝子の下流に位置するが、しかしながらウィルス５　’　Ｌ ＴＲ又はその他のプロモーターのコントロール下で、任意のスプライスドナー又 はスプライス受容部位を伴わずに転写され続けられる。このことは２つのことを 成就せしめる。第一に、パッケージング遺伝子又は対象の遺伝子が今、それらと プロモーターとの間に介在遺伝子を有さずに上流にあるため、その関連のタンパ ク質は選択タンパク質よりも高レベル（５〜２０倍）で発現されうる。第二に、 この選択タンパク質は低レベルで平均的に発現され、その発現レベルの分布は低 レベルにシフトしている。しかしながらフレオマイシン耐性に関する選択レベル は同じであり続け、従って最上発現性細胞は生存し続ける。パンケージングタン パク質又は対象のタンパク質のレベルはこの場合においてのみ比例し続け、高い レベルの選択タンパク質がより高いレベルのパフケージングタンパク質又は対象 のタンパク質に対応する。

好ましくは、上記の手順はプロウィルスｇａｇ／ｐａｌ又はｅｎｖパッケージン グ遺伝子のうちのいづれかを、第一選択遺伝子と共に保有するプラスミドを用い て実施する０次にこれらの細胞を、最も高いレベルでこのタンパク質を生産する 細胞について、ｇａｇ／ｐｏｔ　（又は可能としてｅｎｖ）に対する抗体、第二 酵素又は標識抗体との反応によりスクリーンし、次いで蛍光活性化細胞ソーター （ＦＡＣ３）において選別するか又はウェスタンプロットにおいて検定する。他 方、タンパク質レベルに関するその他の試験が利用できる１次に、これらの選択 細胞、並びにｇａｇ、／ρｏｆ又はｅｎｖパッケージング遺伝子のその他のもの を利用してこの手順及びスクリーニングを繰り返す、この工程において、パッケ ージング遺伝子から下流に第二選択遺伝子（第一に異なるもの）が必要とされ、 そしてこの第二ウィルスタンパク質を最大量で生産する細胞を選別する。この細 胞系は任意の有用なベクターと共に用いることができるパフケージング細胞系（ ＰＣＬ）である。

次に、対象の遺伝子を抱えるプロウィルスベクター構造体を保有するプラスミド 及びこの第−又は第二選択遺伝子とは異なる第三選択遺伝子を有する生存細胞を 用いてこの手順及びスクリーニングを繰り返す、この手順の結果、所望の組換え レトロウィルスを高力価で生産する細胞が選ばれ、そしてこれらは岨換えレトロ ウィルスを供給するために必要なだけ培養することができる。更に、ｇａｇ及び ρｏｆを独立して導入して選別することができる。

例１はこの手順を利用するのにデザインされたｇａｇ／ＰＯＩ及びｅｎｖプラス ミドの作製を詳細する。

廻」− レベルのバ　−ジング　ンバク　るよ゛に一゛ザイン　れた−スミ　゛ １、両回性ｅｎｖセグメントを含むｐＰＡＭ由来の２．７ｋｂのＸｂａ　ｒフラ グメント（Ｍｉｌｌｅｒら著、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５　：　 ４３１．１９８５）を、旧ｎｄ［ＩＩ及びＰｖｕ　ＩＩにより切断したベクター ｐＲ５Ｖ　ｎｅｏ　（Ｇｏｒｗａｎら著。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　２　：　１０４４　；　５ｏｕｔｈｅｒ　 ら著、　Ｊ、　Ｍａｔ、　Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ。

土：　３２７．１９８２）にクローンしてｐＲ５Ｖ　ｅｎｖを作った。プラスミ ドｐＨＴ５０７（Ｍｕｌｓａｎｔ　ら著、　Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１１．　Ｍｏ１ ．　Ｇｅｎｅｔ、　１４　：　２４３．１９８８）由来の、Ｂｓｔ　ＩＩ末端が 補完された０、７ｋｂのＢａｍ＋ＨＩ　−Ｂｓｔｌｉ　Ｉｆｌフラグメントｐｈ ｌｅｏ耐性コード配列を保有する。４．２ｋｂのＢａｍＨＩ　−Ｘｈｏ　ｌフラ グメント、隣接のＲＳνｅｎｖに由来する１、６ｋｂのＸｈｏ　Ｉ　〜Ｘｂａ　 ［（Ｘｂａ　１は補完法）及びｐｈｌｅｏフラグメントをリゲートさせて、ｐＲ ５Ｖｅｎｖ−ｐｈｌｅｏを得た。

２、　ＭＬＶ（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｒｒｕｓｅｓ第■巻、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８５）の５６３番目のヌクレオチドでのＰｓｔ 　１部位から５８７０番目のＳｃａ　１部に至るフラグメントはｐＭＬＶ−Ｋ　 （旧１１ｅｒら著、　１９８５．前掲）に由来しており、そしてＳＶ４０プロモ ーター、　ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性及び復製起点、並びにＳＶ４０ポリＡ 部位を有する１）４ａＡ８（Ｊｏｌｌｙら著、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８０　：　４７７、１９８３）に由 来するＰｓｔ　Ｉ−ＢａｗＩ（１（Ｂａｗｌ　Ｉ補完法）フラグメントの中にク ローンした。これによりｐｓｖｇｐが得られた。　ｐｓＶｇｐＤＨＰＲは以下の フラグメントを用いて作った：　ＳＶ４０プロモーターとＭＬＶ　ｇａｇ及びｐ ｏｌ配列の一部を含む、Ｉ）ＳＶｇ＋）に由来する３、６ｋｂの旧ｎｄｌｌ［〜 Ｓａｌ　ｌフラグメント；残りのｐｏｔ遺伝子を存する、ｐＭＬＶ−Ｋに由来す る２、ＬｋｂのＳａｌ　ＩｘＳｃａ　ｌフラグメント、　ＤＨＰＲ遺伝子と、ポ リＡ部位、ｐＢＲ３２２起点及びアンピシリン耐性遺伝子の半分を存する、ｐＦ ４００に由来する３、２ｋｂのＸｂａ　Ｉ　（Ｘｂａ　Ｉは補完ｆｒ）〜Ｐｓｔ 　ｌフラグメント；アンピシリン耐性遺伝子の残りの半分を有する、ｐＢＲ３２ ２に由来の０．７ｋｂのＰｓｔ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ［ｌフラグメント、これはＰＳ Ｖｇρ−ＤＨＦＩＩを提供する。これらの構造体全てを図１に示す、これらのプ ラスミドは３Ｔ３細胞又はその他の細胞の中にトランスフェクトすることができ 、そして高レベルのｇａｇ、　ｐｏｌ又はｅｎｖが得られる。

選択を成就するための他の方法は、第一ラウンドにおいて遺伝子選択を、そして 次のラウンドにおいてそのアンチセンスを用いる。

例えば、ｇａｇ／ｐｏｔをＨＰＲ？遺伝子と共にＨＰＲＴ欠損細胞の中に導入し 、そしてプリンの利用のために）ＩＰＲＴを必要とする培地を利用してこの遺伝 子の存在について選択する０次のラウンドにおいて、ＨＰＲＴに対するアンチセ ンスはｅｎｖの下流に導入することができ、そして細胞はＨＰＲＴ−欠損表現型 について６チオグアニンの中で選択される。逆転写が起きないことを確実にして ＩＩＰＲ？ＩＰＲＴ写体を不活性化するためには、大量のアンチセンスＨＰＩＩ Ｔが必要とされるであろう０選択を成就する更なる方法を以下に詳細する。独立 した選択マーカーよりも１０χの化学量論過剰な発現ベクターの同時トランスフ エフシランは、薬剤耐性細胞クローンにおける発現ベクターの高いコピー数を保 障する０本明細書に記述するほとんどの例において、ｇａｇ／ｐｏｔとエンベロ ープ発現ベクターは独立に（即ち、別々のトランスフェクトぢン）導入しており 、従ってこの２つの構造遺伝子は組換え又はコンカテマー化せず（トランスフェ クト組込みされたＤＮＡがしがちであるように）、ゲノムの中でこれらの遺伝子 が連結しないことを保障する。細胞内のＭＬＶ　ｇａｇ／ｐｏｔ及びｅｎＶの定 常レベルはタンパク質イムノブロッティングにより決定される。比較的容易な、 高感度な、そして再現性のあるイムノプロッティングは、ＭＬＶ構造タンパク質 （特にｇａｇ）ｐａｌ）の過剰発現を同定するために必要である、大量の細胞ク ローンの迅速で定量的な分析を可能とする（例２参照）。

ＭｏＭＬＶの５６３番目のヌクレオチドで出発するｇａｇ／ｐｏ＋発現構造体の 他に、上流リード配列を含むいくつかのその他のものが作製できる。　Ｐｒａｔ ｓ　ら（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　Ｍｅｅｔｉｎ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、Ｙ、　、　１９８８）により、ｇａｇタンパク質のグリコジル化形態は３５ ７番目のヌクレオチドで開始し、そして転写エンノ）ンサー地図は２００−２７ ０番目のヌクレオチドの間の領域にあることが認められた。従って、ｇａｇ／ｐ ａ１発現構造体は、かかる上流因子を含み、且つベクター生産を高めようとする ために、Ｂａｔ　１部位（ヌクレオチド２１２）又はＥａｇ部位（ヌクレオチド ３４６）にて開始するように作製されうる。これを成就する好ましい方法は、核 酸のコード能力に影響を及ぼすことなく、ここで見い出せたパフケージングシグ ナルを不活性化するように変性突然ｆ：異を包含することにある。

エヱニュニ１１遺 ｇａｇ／ｐａｌおよびｅｎｖｍｎを発現する能力はそれぞれ、独立的にそれらの 機能の操作に備える。十分な量のｇａｇ／ｐｏＩを発現する細胞番よ、例えば、 ｅｎｖについての力価の問題を扱うことができる。低力価を生じる１つの要因は 、標的細胞または組織上の適当なレセプター分子の密度である。第二の要因は、 ウイルスエンベローブタンノイク質に対するレセプターの親和力である。　ｅｎ ｖ発現が別個の単位からであるとすれば、種々のエンベロープ遺伝子（異なるレ セプタータンパク質を要求する）、例えば多様な種からの異種向性、多部性また は両回性ｅｎｖを特定の標的組織上で最大力価について試験することができる。

成るレトロウィルスからのエンベローブタンノでり質は、シレヨしＧよ。

別のレトロウィルスのものと、様々な程度で置換することができる。

例えば、マウスウィルス４０７０Ａ、　ＨＴＬＶ　ｒ　、　ＧＡＬＶおよびＢＬ Ｖ（７）エフへローブは、低効率にもかかわらず、各々ＭｏＭＬＶＯものと１換 することができる（ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８１　：　６３４９−５３．１９８４　ＨＷ ｉｌｓｏｎ　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３．２３７４−７８．　１９８９ｊＲ ａｎ　ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７０　：　１９８７−９３．１９８ ９）、　ＭＬＶ系ベクターにより感染せしめることができる細胞の数を増加させ るために、両回性、異種向性または多回性エンベロープのいずれかを個々に発現 するＰＣＬを作製した。それらのＰＣＬのいずれかから生産されたベクターを使 って、対応する個別のレセプターを含む任意の細胞を感染せしめることができる （Ｒｅｉｎおよび５ｃｈｕｌｔｚ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３６　：　１４４− ５２゜１９８４）　、幾つかの細胞型は、例えば、真向性レセプターを欠し）で おり従って雨間性ベクターによる感染に耐性であるが、異種向性レセプターを発 現するので異種向性ベクターにより感染させることができる。１つの報告は、異 種向性ベクターが複製能のある異種向性ウィルスの存在下で、ヒト造血始原細胞 を一層効率的に感染せしめることができると示唆している（Ｅｇｌｉｔｉｓ　ら 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ、　１６９　：　８０−１４．１９９０）　、従って、異種 向性ＰＣＬ　４よそれらの種において獣医学目的に有用であろう、別の例は、エ リスロボイエチンレセブターを含むｗＩＭ！ｉへの標的指向を可能にする膵臓フ ォーカス形成ウィルス（ＳＦＦＶ）エンベロープ遺伝子の利用である（Ｊ、　Ｐ 。

Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３　：　７６２−７６４．１９９０）　。

特定例として、本明細書中に記載の両回性ＰＣ［、の全体（イヌおよびヒト繊維 芽細胞）が異種向性ベクターにより感染され得るが、おそらく「ウィルス干渉」 の現象のため、両回性ベクターによる感染には耐性である（＾、Ｒｅ１ｎ、−ｎ Ｌ劇刃り仁土２０　：　２５１−５７．１９８２を参照のこと）、従って異種向 性ＰＣＬは、それらの両回性ＰＣＬの容易な感染を可能にし、これが次いでベク ターを他の手段により導入したＰＣＬよりも１０−１００倍高い力価を生じる（ Ｍｉｌｌｅｒら、ＳｏｍａＬ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｌ。

複製能のあるレトロウィルスを生産する可能性が両開性ＰＣＬよりもシスエンベ ロープを形成し、通常は細胞膜中の分子がウィルスエンベロープ上に次々に運ば れる。こうして、ベクターが生産されるる。ヘルパー細胞中で発現させることが でき且つ有用なベクター−細胞相互作用を与えることができる表面マーカーの１ つの形は、別の潜在的に病原性のウィルスのレセプターである。病原性ウィルス は、感染した細胞表面上に、通常は細胞表面マーカーまたはレセプターと相互作 用してウィルスを染を提供するウィルス特異的タンパク質（例えばｅｎｖ）を提 示する。これは、同じウィルスタンパク質−レセプター相互作用を使うがベクタ ー上のレセプターと細胞上のウィルスタンパク質を用いることにより、潜在的に 病原性のウィルスに関するベクターの感染の特異性を逆転させる。

生産されるベクターによる標的細胞の感染を引き起こさないが感染性ウィルス粒 子の形成を促進する無関係のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含め ることが望ましいかもしれない６例えば、ヘルパー形としてヒ）ＳｕｐＴ１細胞 を使用することができる。このヒトＴ細胞系は、高レベルで表面上にＣＤ４分子 を発現する。これからヘルパー系中への遺伝子変換は、適当な発現ベクターと、 必要ならば無関係の（ヒト細胞にとって無関係の）エンベロープタンパク質とし てモロニー異所性ｅｎｖ遺伝子産物（モロニー異所性ｅｎｖはマウス細胞の感染 のみを引き起こす）とを使って、ｇａｇ／ｐｏｌを発現せしめることによって達 成することができる。そのようなヘルパー系から生産されたベクターは、それら の表面上にＣＤ４分子を有し、従ってＨＩＶ　ｅｎｖを発現する細胞、例えば旧 ソー感染細胞のみを感染することができるであろう。

加えて、同じくハイブリッドエンベロープ（後述）も、レトロウィルスベクター の同性を適合させる（そして効率的に力価を増加させる）ために、この系におい て使うことができる。十分な量の特定のエンベロープ遺伝子を発現する細胞系は 、ｇａｇおよびｐａ＋に関する力価の問題を扱うために使うことができる。

更に、ウィルス粒子に対して異種のリガンド分子を加えることも可能であり、そ れ自体を脂質エンベロープ中に組み込むかまたは脂質もしくはタンパク質構成物 に化学的に結合させることができる。

豊凶糸 ＭｏＭＬＶベクター系（ｐｓｉ２．　ＰＡ１２．　ＰＡ３１７）に使われる最も 一般的なパンケージング細胞系はマウス細胞系由来である。マウス細胞系がヒト 治療用ベクターの生産に最適でない幾つかの理由がある：ｌ、それらは、その幾 つかがここで使用する？ＩＬＶベクター系に配列とウィルス型が密接に関連する 内因性レトロウィルスを含むことが知られている。

２、それらは、効率的にパッケージングすることが知られている非レトロウィル スまたは欠陥レトロウィルス配列を含む。

３、マウス細胞膜成分の存在下で有害な影響が生じる場合がある。

幾つかの非マウス細胞系はパッケージング系の有用な源である。

それらとしては、ヨーロッパでポリオワクチンを調製するために使われているＶ ｅｒｏ細胞、合衆国でワクチン製造に使われているｄ１３８、合衆国でＴＰＡ調 製に使われているＣＩ（０細胞、内因性ウィルスを持たない０１７または他のイ ヌ細胞、および実施例２に記載の細胞が挙げレトロウィルスベクターの製造の際 の最も重大な安全性への懸念は、ベクター導入後に複製能のあるレトロウィルス を生じるレトロウィルスＰＣＬの固有の性質である（Ｍｕｎｃｈａｕら、■ｒｏ ｌｏ■」川：２６２−６５．１９９０）　、これは少なくとも２つの経過で起こ り得る。１）治療用プロウィルスＤＮＡとＰＣＬ中に存在するＭｏＭＬＶ構造遺 伝子（“ｇａｇ／ρｏ１　”および“ｅｎｖ”）をコードする［１ＩＩＡ　との 間で相互組換えが起こり得る（下記のｒ　ＰＣＬの作製」のところで論しる）； および２）プロウィルスＤＮＡとマウス細胞中に見つかる非常の多数の内因性欠 陥プロウィルスとの相同組換えによる復製能のあるウィルスの生成（Ｓｔｅｆｆ ｅｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、　ＣｅｌユＩＬ：　１００３−１０．１９７８　 ；ＣａｎａａｎｉおよびＡａｒｏｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ 　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７６　：　１６７７後にウィルスを生産し得る（例えば、ヒ ト細胞中で複製することができる異種向性ウィルス、Ａａｒｏｎｓｏｎおよびｐ ｕＨ，Ｊ、　Ｖｉｔｏｌ、　１３　：のためのマウス細胞の使用に伴う別の安全 性の懸念は、マウスゲノにより認識され、そして標的細胞中に輸送されて少なく とも所望のベクターの効率に匹敵する効率で発現されるという知見であるＭｏＭ ＬＶのゲノム配列に相同なゲノム配列を欠くことが知られている（データは示し てない）非マウス細胞系（例えば、イヌおよびヒトだろう。

安全性の問題に加えて、ＰＣＬのための宿主細胞系の選択が重要である。という のは、レトロウィルス粒子の物理学的性質（例えば安定性）および生物学的性質 （例えば力価）の多くが、宿主細胞の性質により規定されるからである０例えば 、宿主細胞はベクターＲＮ＾ゲノムを効率的に発現し、細胞性ＬＲＮＡにより第 −鎖合成に備えてベクターをプライムし、ＭＬＶ構造タンパク質を寛容しそして 共有結合的に修飾しくタンパク質分解、グリコジル化、ミリスチル化およびリン 酸化）、成熟ウィルス粒子を細胞膜から発芽させ、それを使って多数の膜成分を 運ばなければならない０例えば、マウスパッケージング系ＰＡ３１７から生産さ れたベクターは０．３ミクロンフィルターにより保持されるが、一方で本明細書 中に記載のＣＡ系から生産されたベクターは素通りすることがわかった。

２直勇Ｉ パ・　−ジンク　の゛ Ａ、ｊＬｖ゛−ベク　− ＭＬＶプロウィルスベクターＤＮＡとＰＣＬの構造遺伝子との間の遺伝子相互作 用によって複製能を有するウィルスが生じる可能性を減らすために、各々ウィル スＬＴＲを欠く別々のベクターを作製してｇａｇ／ｐｏ＋遺伝子とｅｎν遺伝子 とを独立的に発現せしめた。更にＭＬＶベクターとの相同組換えおよびその結果 としての複製能を有するウィルスの生成の可能性を減らすために、タンパク質コ ード配列以外の最小配列を使った。宿主細胞中で高レベルのＭＬＶ構造構造タン パ金賞現せしめるために、強力な転写プロモーター（Ｃ１ＩＶ初期プロモーター およびＡｄ５主要後期プロモーター）を使った。　ＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐｏ１ 発現ベクター（ｐｓｃＶｌｏ、図ＩＢ、１参照）の作製例は次の通りである：１ 、ヒトシトメガロウィルス（ＣＭＶ）初期転写プロ七９　（Ｂｏｓｈａｒｔら、 Ｃｅ１ｌ　４１　：　５２１−３０．１９８５）を包含する０、　７　ｋｂ　Ｈ ｉｎｃ　■／χ−ａｌｌ断片を単離した。

２、全ｇａｇ／ｐａｌ　コード領域を包含する５、　３ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　（一 部）　／５ｅａＩ断片をＭｏＭＬＶプロウィルスプラシスドＭＬ−Ｋ　（Ｍｉｌ ｌｅｒら、門ｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．５　：　５３１．１９８５）がら単離 した。

３、　ＳＶ４０　ＤＮＡからＳＶ４０後期転写終結シグナルを包含する０、３５ ｋｂＤｒａ　Ｉ断片（残基２７１７−２３６３）を単離した。

４、リンカ−および他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ＣＭＶプロモーター −ＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐｏｌ　−５Ｖ４０終結シグナルをＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔベクターＳＫ’中に連結せしめた。

ｒＩＬＶ両向性両回ベロープ発現ベクター（ｐｃＭＶｅｎｖＡ＊Ｏｒａ、　（ｌ ｌＩＢ、２参照）の作製例は次の通りである： １．４０７０ＡプロウイルスクローンＣＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ、　 Ｖｔｒｏｌ。

３９　：　７７７−９１．１９８１）から両開性エンベロープのコード配列を含 む２、７　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　／Ｎｈｅ　Ｉ断片をｓＨした。

２、リンカ−および他の標準的ＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐａ１発現（ｐＳ Ｃν１０）について上述したＣＦｌＶ初期プロモーターおよびＳＶ４０後期終結 シグナルをＣ）’ＩＶプロモーター−エンベロープ−終結シグナルの順序で連結 せしめた。

ＭＬシ両両回エンベロープ発現ベクター（ｐｃＭＶｅｎｖＡｗＮｈｅ、図ＩＢ、 ３参照）の作製の第二の例は次の通りである。

１、上述の４０７０＾プロウイルスクローンから両開性エンベロープのコード配 列を含む２．７　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　／Ｎｈｅ　Ｉ断片を単離した。

２、リンカ−および他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐａ１発現 （ｐｓｃＶｌｏ）について上述したＣ門ｖ初期プロモーターをプラスミドρＵＣ ｌ３中にＣ１’ｌＶプロモーター−エンベロープの順序で連結せしめた（終結シ グナルは加えなかった）。

ＭＬＶ両同真向ンヘローブ発現ベクター（ｐＭＬＰｅｎｖＡｍｓｐｈ、図ＩＢ、 ４参照）の作製の第三の例は次の通りである。

■、アデノウィルス５左端、主要後期転写プロモーターおよび三分節系リーダー 配列を含む０．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／旧ｎｄ［Ｉｒ断片を単離した。

２、クローンｐＪＤ２０４　（ｎｅ　Ｗｉｔら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ 、　７　：　７２５−３７゜１９８７　）からＳＶ４０スモールｔイントロンと 転写終結シグナルを含む０．８５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩ断片を単離 した。

３、上述の４０７０＾プロウイルスクローンから両開性エンベロープのコード配 列を含む３　ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ　／Ｓ■ａｌ断片を単離した。

４、リンカ−および他の標準的組換えＤＮ＾技術を使って、ＭＬＰ、両開性エン ベロープおよびＳＶ４０終結シグナルをプラスミドＰＢＲ３２２中にＭＬＰ−エ ンベロープ−５Ｖ４０の順序で連結せしめた。

ＭＬＶ異種向性エンベロープ発現ベクター（ｐＣ聞Ｖｘｅｎｏ、図ＩＢ、５参照 ）の作製例は次の通りである。

１、クローンＮＺＢ９−１　（０’　Ｎｅ１ｌｌ　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５ ３　：　１００−１０６゜１９８５）から得られる異種向性エンベロープのコー ド領域を含むＺ２ｋｂ　Ｎａｅ　Ｉ　／Ｎｈｅ　Ｅ断片を単離した。

２、リンカ−および他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐａ１発現 （ｐｓｃＶＩｏ）について上述したＣＭＶ初期プロモーターと５Ｖ４０後期終結 シグナルをＣＦＩＶプロモーター−エンベロープ−終結シグナルの順序で連結せ しめた。

Ｍ［、Ｖ多回性エンヘローブ発現ヘクター＜ｐｃＭＶｌｌｃＦ、図１Ｂ６６参照 ）の作製例は次の通りである。

１、クローンＭＣＰ−２４７ｋｌ　（ＢｏＪＩａｎｄ　ら、Ｊ、　ｖｉｒｏｌ、 　５３　：　１５２−１５７゜２９８５）から得られる多回性エンベロープのコ ード領域を含む２ｋｂＢａｍＨＩ　／Ｎｈｅ　Ｉ断片を単層した。

２、リンカ−および他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／１１０１発 現（ｐｓｃＶｌｏ）について上述したＣＭＶ初期プロモーターとＳＶ４０後期終 結シグナルをＣ１’ｌＶプロモーター−エンベロープ−終結シグナルの順序で連 結せしめた。

ＭＬＶ　ａｇｐｈｏ　ｅｎｖ　Ｎｅｏ”　レトロウィルスベクター（ｐＬＡＲＮ Ｌ、図ＩＢ、７参照）の作製例は次の通りである。

１、ベクターｐＬＡＲＮＬ　（Ｅｍｉ　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、６５　：　１２ ０２−１２０７．　１９９１）をＢａｍＨＩで消化した。

２、レトロウィルス４０７０Ａのエンベロープタンパク質コード領域を含む２． ７ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ断片（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　３９　：　７７７−９１．１９８１）を単離した。

３、手順ｌと２から得られた断片を連結せしめた。

Ｂ−盗土豊鳳生１訳 ｇａｇ／ｐｏＩおよびｅｎν構造遺伝子を産生ずる複製能のあるレトロウィルス （“ＨＡ’ウィルス）を使って、薬剤耐性レトロウィルスベクター（Ａ　ｄ　Ｎ ２）を効率的に（高力価で）救済する能力について宿主ｗｉ胞をスクリーニング した。培地交換の１６時間後の周密約単層から、６ｃ１１の組織培養プレート上 で４ｌｇ／ｘｉのポリブレンの存在下で濾過済上清（０，４５ｔｔｍフィルター ）を５Ｘ１０’個のＮＩ［Ｉ　３Ｔ３　ＴＫ−細胞に添加し次いで６４１Ｂ中で 選別を行うことにより、力価を測定した。

スクリーニング工程のデータを図２に示す、高力価でＭｏＭＬＶ系ベクターをパ ッケージングする能力を示す非マウス細胞系は、ＣＦ２゜ｄ１７．２９３および ＴＨ１０８０である。それらの細胞系を例として本発明において使ったが、任意 の他の細胞をそのような手法により試験することができる。

Ｃ，パ・　−ジンク　の （ｉ　）　ｇａｇ／ｐｏｔ中間体 ＰＣＬ生産用のｇａｇ／Ｉ）Ｏｆ　中間体の作製の例として、０１７．２９３お よび１１Ｔ１０８０を、１ｌｇのメトトレキセート耐性ベクターｐＦＲ４００（ Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　ｕ皿旦■」Ｌ：　４５６−６７、 １９７３）およびＩＯｕｇのＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐａ１発現ベクターｐｓｃＶ ＩＱ　（前記）を用いて、リン酸カルシウム共沈（０１７と８丁１０８０、Ｇｒ ａｈａｓおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　■皿旦■５２　：　４５６−６７、１ ９７３を参照のこと）またはりポフエクシ！ン（２９３、Ｐｅｌｇｎｅｒ　ら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　７４１３ −１７．１９８７を参照のこと）により、同時トランスフェクトせしめた。薬剤 ジビリミドールとメトトレキセートの存在下でのトランスフェクト細胞の選別後 、個々の薬剤耐性細胞コロニーを増殖させ、そして細胞外逆転写酵素ＣＲＴ）活 性によりＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐａ１発現について（Ｇａｆｆら、ントにより細 胞内ｐ３０′Ｊａｇについて分析した。この方法は、各細胞型の個々の細胞クロ ーンが標準的マウス両面性ＰＣＬであるＰＡ３１７のものに比べて１０〜５０倍 高いレベルの両タンパク質を発現することを同定した（図１０および表１）。

表　１ ＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐｏ１発現細胞の性質細胞名　ＲＴ活性（ＣＰ−）　ｐ３ ０”’　ＬＡＲＮＬ力価発現　（ＣＦＵ／ａｄ） ＰＡ３１７　１３５０　＋／−１，２ｘ　１０”０１７　８００　Ｎ、０゜ ０１７　４−１５　５０００　＋＋＋＋＋　１．２　ｘ　１０’０１７　９−２ ０　２０００　＋＋＋　６．Ｏｘ　１０”０１７　９−９　２２００　＋＋　１ ．Ｏｘ　１０”０１７　９−１６　６１００　＋＋＋＋＋　１．５　ｘ　１０’ ０１７８−７　４０００　Ｎ、Ｄ。

ＨＴ１０８０　９０ＯＮ、Ｄ。

ＮＴＳＣｖ２１　１６４００　＋＋＋＋＋　８．２　ｘ　１０’ＨＴＳＣＶ２５ 　７９００　＋＋＋　２．８　ｘ　１０”ＨＴＳＣＶ４２　１１６００　＋＋　 ８．Ｏｘ　１０”ＨＴＳＣＶ２６　４０００　＜　１０ ２９３　６００　Ｎ、０゜ ２９３　２−３　６５００　＋＋＋＋＋　７　ｘ　１０’２９３　５−２　７６ ００　＋＋＋＋＋　Ｎ、Ｄ。

それらのタンパク質の生物学的活性は、両面性エンベロープと薬剤耐性６４１８ に対する耐性を付与するＮｅｏ”マーカーの両方を発現するレトロウィルスベク ターＬＡＲＮＬ（図ＩＢ参照）を導入することによって試験した。どの場合でも 、ベクター由来のｅｎｖと細胞系中のｇａｇ／ｐｏｔ　との同時発現は、３Ｔ３ 細胞への６４１８耐性の無細胞伝達により（力価を）測定すると、ベクターの効 率的パンケージングを可能にした。力価は、培地交換の１６時間後の周密約単層 から、４ｌｇ／ｄのポリブレンの存在下で６ＣＩの組織培養プレート上の５Ｘ１ ０’個のＮＩＨ３Ｔ３　ＴＫ−細胞に濾過済上清（０，４５μｍフィルター）を 添加し次いで６４１日中で選別を行うことにより測定した。有意にも、細胞系か らのへクターカ価が２３Ｏ９ｍ９のレベルと相関関係を有した（表１）。

ｅｎｖのレベルは各クローンで同じであり、ＰＡ３１７において認められるレベ ルと同等であるので（データは示してない）、力価がそれらの細胞（ＰＡ３１７ を含む）中のｇａｇ／ｐｏｌのレベルにより制限されたことを示す、該力価はｌ ？Ｔのレベルよりもｐ３ＱｌｌＩＩのレベルと一層密接な相関関係を存した。

（ｉｉ）両面性パッケージング系へのｇａｇ／ｐａｌ系の転換両面性ＰＣＬの生 成の例として、２９３　（２−３と称する）及び０１７（４−１５と称する）の ためのｇａｇ／ｐｏ＋過剰−発現体が、上記と同じ技法により同時トランスフェ クトされ、但し、耐フレオマイシン性ベクター、すなわちＰＵＴ５０７（Ｍｕｌ ｓａｎｔなど、、５ｏｓａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、　１４　： 　２４３−５２．１９８８）　１ｌｇ及び両面性エンベロープ発現ベクター、す なわちｐＭＬＰｅｎｖＡ＊ｓｐｂ　（２−３）又はｐｃＭＶｅｎｖＡｍＮｈｅ　 （４−１５）　１０９　ｇが使用された。

フレオマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、 個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして抗ｇρ７０（Ｎ、Ｃ，ｒ、からの ヤギ抗血清１７９５０００７７１　）を用いてウェスターンプロットにより細胞 内ｇｐ８Ｑ＃＋ｌ？発現について分析した。比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏｔ及 びａ胃ｐｌｏ　ｅｎｖ　（ＰＣＬ＋　代表的なデータについては図１をｔ［のこ と）を発現するいくつかのクローンを同定した。

ａｍｐｈｏ　ＰＣＬの生成のもう１つの例においては、ＣＦ２細胞を、２ｌｇの 耐７Ｌ／オマイシン性マーカー、ｐＵＴ５０７．１０μｇ　ノｐＳＣＶＩＯ（上 記）及びＩＯμｇのρＣＭＶｅｎｖＡｓＮｈｅ　（上記）によりエレクトロボレ ートした（たとえば、Ｃｈｕなど、、Ｎａｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５ 　：　１３１１〜２６．１９８７を参照のこと）、フレオマイシンの存在下での トランスフェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニー を拡張し、そして特異的抗血清を用いてウェスターンプロットによりＭＬＶ　、 ３Ｑｇａ＊及びｇｐ８０”ｖタンパク譬の細胞内発現について分析した。比較的 高レベルのｇａｇ／ｐａｌ及びａｍｐｈｏ　ｅｎｖを発現するクローンを同定し た（図ＩＥ）。

（ｉｎ）両面性パッケージング細胞系の性能多（のそれらのａｍｐｈｏ　ＰＣＬ を、レトロウィルスベクターの導入後、力価を測定することによってレトロウィ ルスベクターをパッケージするそれらの能力について試験した（［２）、ｉｊｌ 定は、前記系統の平均的性能を計算するために、クローンされていないＰＣＬを 用いて両面性ＰＣＬにおけるベクター力価及びヘルパーウィルス生成丘ＬＬ二カ Ｉ”　Ｃ＋／−ヘルパーウィルスｋｌ細胞型　ｂ−Ｇａｌ　’ＡＴ−Ｉ　Ｎ２Ｐ Ａ３１７　３．５　ｘ　１０”　（Ｎ、Ｄ、）　１．Ｏｘ　１０’　（Ｎ、Ｄ、 ）　３．Ｏｘ　１０’　（＋）’ＣＡ　５．Ｏｘ　１０’　（Ｎ、Ｄ、）　３． Ｏｘ　１０’　（−）’　２．Ｏｘ　１０’　（−）’２Ａ　４．Ｏｘ　１０’ 　（Ｎ、［１，）　２．Ｏｘ　１０’　（−）”　Ｎ、Ｄ。

ＤＡ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ、　２．Ｏｘ　１０’　（−）’Ｄ＾２　Ｎ、Ｄ、　３ ．９　ｘ　１０’　（−）’　Ｎ、Ｄ。

ｂ　正の対照としてＭＡウィルシスよるマーカー救助アッセイにより判断される ような Ｃ培養において２０日後 ｄ　培養において６０日後 ｅ　培養において９０日後 最高の力価は、レトロウィルスベクターが感染によりＰＣＬ中に導入された場合 に得られる（Ｍｉｌｌｅｒなと、、Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１１．　Ｍｏｂ　Ｇｅｎ ｅｔ。

［７１７５〜８３．１９８６）　、　Ｌかしながら、両回性札すベクターは、そ れらの宿主細胞型を感染することが知られているが、ＰＣＬは、それらがａｍｐ ｈｏ　ｅｎｖを発現するので、ａ層ｐｈｏベクターによる感染のために阻止され る（“ウィルス干渉”）、この問題を克服するために、他のエンベロープ（たと えば、ａｍｐｈｏレセプター以外の細胞レセプターに結合する異種向性ｅｎｖ又 はｖｓｖ　ｃタンパクｉ）を含むベクターを次の１！様で生成した。対象のベク ターＤＮＡ　１０ｄｇを、高レベルのＭｏＭＬＶ　ｇａｇ／ｐｏ１．たとえば２ −３細胞（上記を参照のこと）を発現する細胞系上にｘｅｎｏ　ｅｎｖ　（ｐｃ ＭＶｘｅｎｏ、上記）又はＶＳＶ　Ｇタンパク質発現ベクターのいづれかを発現 するＤＮＡ　１０ｄｇにより同時トランスフェクトした。それぞれ異種向性ｅｎ ｖ又はＶＳＶ　Ｇタンパク質を含むその得られたベクターを、前記同時トランス フェクトされた細胞において一時的に生成し、そして２日後、細胞を含まない上 清液を前記可能性あるＰＣＬに添加し、そしてベクター感染された細胞をＧ４１ ８における選択により同定した０両タイプのベクターは、ａｓｐｈｏ阻害された 細胞を効果的に感染し、そして６４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集 密的細胞単層から集め、そして上記のようにしてＮＩＢ３Ｔ３　ＴＫ−細胞に対 して力価定量を行なった。最高の力価を有する細胞クローンをＰＣＬとして選択 し、そしてＤＡ（０１７ａｍｐｈｏ）　、　２Ａ　（２９３ａ＊ｐｈｏ）及びＣ Ａ　（ＣＦ２　ａｍｐｈｏ）としてそれぞれ言及した。高い可能性の生成ヘルパ ーウィルス（Ａｒｓｅｎｔａｎｏなど、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２　：　１６ ４７−５０゜１９８７）を有するレトロウィルスベクター（Ｎ２）がＰＣＬ中に 導入され、そしてその細胞が２力月間もの間（ベクターに丁−３のためには３力 月）、継代される場合でさえ、現在記載されるＰＣＬにはヘルパーウィルスは決 して検出されなかった。他方、ＰＡ３１７細胞系中に導入された同じベクターは 、連続３週間以内の継代でヘルパーウィルスを生成した。

（ｔｖ）異種向性パフケージング細胞系へのｇａｇ／ρｏ１系の転換異種向性Ｐ ＣＬ　（７）生成の例として、Ｉ（Ｔ１０８０　（ＳＣＶ２１）及び０１７（４ −１！Ｍ：称する）のためのｇａｇ／ｐｏｌ過剰−発現体が、上記と同じ技法に より同時トランスフェクトされ、但し、耐フレオマイシン性ベクター、すなわち ｐ［１丁５０７（Ｓ（：Ｖ２１のための又は耐ヒグロマイシンＢマーカー。

９Ｙ３（４−１５＋　Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　（ｌｉｇｇｅｌｍａｎ ｎ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉａ＋、　４　：２９２９−３１．１９８４）及 び異種向性エンベロープ発現ベクター、すなわちｐｃＭＶｘｅｎｏ　（上記）Ｉ Ｏａｇが使用された。フレオマイシン又はヒグロマイシンの存在下でのトランス フェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し 、そして特異的抗血清を用いてウェスターンプロットによりＭＬＶ　ｐ３０”” 及びｇｐ７５”シタンパク質の発現について分析した。比較的高レベルのｇａｇ ／ｐｏｔ及びｘｅｎｏ　ｅｎｖの両者を発現するクローンを選択した（図ＩＦ） 。

（ｖ）異種向性パンケージング細胞系の性能多くのそれらの可能性あるｘｅｎｏ 　ＰＣＬを、レトロウィルスベクターの導入後、力価を測定することによってレ トロウィルスベクターをパッケージするそれらの能力について試験した（表３） 。

表３ 異種向性ＰＣＬに対するベクター力価 細胞りｏ　−７Ｈ↑１０８ｏ細胞に対すルＫＴ−１力価（ＣＦＩＩ／ＭＬ）ＨＴ １０８０　５ＣＶ２１　１．Ｏｘ　１０’ＸＦＩ　１．Ｏｘ　１０’ ＸＦ７　１．Ｏｘ　１０’ ＸＦ１２　（ＨＸ）　４．５　ｘ　１０’Ｎ６　９．Ｏｘ　１０’ ＸＩＯ（ＤＸ）　１．３　ｘ　１０’ Ｘ２３　８．Ｏｘ　１０’ 上記のようにして、ＶＳＶ　Ｇタンパク質を含むベクターを、２−３　ｉｔ胞に おいて一時的に生成した。２日後、細胞を含まない上清液をｘｅｎｏ　ＰＣＬに 添加し、そしてに４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集密的細胞単層か ら集め、そして上記のようにして力価を測定し、但し、Ｘｅｎ０ベクターによる 感染性であるＨｒｘ０８０ｔｉｌ胞を、ｘｅｎｏベクターに対して耐性であるＮ ＩＨ３Ｔ３　ＴＫ−細胞の代わりに使用した。最高の力価を有する細胞クローン をＰＣＬとして選択し、そしてそれぞれＤＸ　（０１７ｘｅｎｏ）及びＨＸ　（ ＨＴ１０８０　ｘｅｎｏ）として言及した。

ヘルパーウィルスを生成するＰＣＬの傾向を、ベクターＮ２を含むａｙａｐｈｏ 及びｘｅｎｏ　ＰＣＬを同時培養することによってさらに一層、厳密に試験した 。　ａｍｐｈｏベクターはｘｅｎｏ　ＰＣＬを感染し、そして逆もまた同様であ るので、これは連続した交叉感染出来事を可能にし、ここで個々の出来事はヘル パーウィルスを生成する可能性を高める。例として、Ｎ２を含む２Ａ細胞を、Ｎ ２を含むＨＸ細胞と共に同時培養した。

２３日後、その培養物は、２９３又はＭｕｓ　ｄｕｎｎｉ細胞に対するベクター 数済アッセイにより判断する場合、ａｍｐｈｏ及びｘｅｎｏウィルスをまだ有さ す、前記両細胞は、ａｍｐｈｏ及びｘｅｎｏウィルスを検出することができる（ 表４）。

表４ ヘルパーウィルス生成するＰＣＬ傾向のための高緊縮分析試験材料　へルバーウ ィルスアッセイ 両同性ウィルス　＋ 異種向性ウィルス　＋ ＰＡ３１７　＋　Ｎ２　（２１ｄ）　＋２Ａ＋ＨＸ＋Ｎ２（２３ｄ） （ｖｉ）多向性パフケージング細胞系へのｇａｇ／ｐｏｔ系の転換多面性ＰＣＬ の生成の例として、ＢＴ１０８Ｑ　（ＳＣＶ２１＞のためのｇａｇ／ｐＱＩ過剰 −発現体が、上記と同じ技法により同時トランスフェクトされ、但し、１ｌｇの 耐フレオマイシン性ベクター、すなわちｐＵ丁５０７及び１０ｄｇの多向性エン ベロープ発現ベクター、すなわちｐｃ？ｌＶＭｃＦ　（上記）が使用された。フ レオマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、個 々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして特異的抗血清を用いてウェスターン プロットによりＭＬＶ　ｇｐ７０”’タンパク質の細胞内発現について分析した 。比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏｔ（示されていない）及び多回性ｅｎｖ（図Ｉ Ｇ）を発現するクローンを同定した。

（ｖｉ）条間性パフケージング細胞系の性能これらの可能性あるポリＰＣＬの１ つを（クローン３）を、レトロウィルスベクターの導入の後、力価を測定するこ とによってレトロウィルスベクターをパンケージする能力について試験した（表 ５）。

表５ ＨＰ細胞からの多口性ベクターの宿主範囲細胞系　種　ｂ−Ｇａｌ力価 ＰＡ３１７　ネズミ　１．０　ｘ　１０’ＭＶ−１−Ｌｕ　ミンク　５．Ｏｘ　 １０’ＦＲｈｌ　短連サル　〈１０ Ｈ丁１０８０　ヒ　ト　〈１０ ＤＥＴＲＯｒＴ　５５７　１？−ト　＜　１０この細胞クローンをＰＣＬとして 選択し、そしてＨＰ　（ＨＴ１０８０　Ｐｏ１ｙ）として言及した。上記のよう にして、ＶＳＶ　Ｇタンパク質を含むベクターを、２−３細胞において一時的に 生成し、そして２６日後、細胞を含まない上清液を条間性ＰＣＬ　（ＨＰ）に添 加した。　Ｇ４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集密的細胞単層から集 め、そして種々の細胞系に対して上記のようにして力価を測定した。ヒト細胞の 感染をひしように制限し、そして試験されたすべての細胞系は陰性であり、但し ２９３　ｗｊ胞を除く。

レトロウィルスベクターにより特定細胞タイプの効果的感染を導びく因子は完全 には理解されていないけれども、それらの比較的に高い成熟速度のために、レト ロウィルスは、その細胞タイプ（アダプター細胞）におけるウィルスの連続した 再感染及び増殖により、初期増殖が良好でない細胞タイプにおいて著しく改良さ れた増殖のために適合され得ることが明白である。これはまた、いくつかのウィ ルス機能（たとえばｅｎｖ）をコードし、そして感染性ベクター粒子（たとえば ｇａｇ／ρｏｌ）を付与するためにベクターの機能を補足する必要がある機能を 有するように構築された特定タイプの細胞において連続的に通されるウィルスベ クターを用いて達成され得る。たとえば、主要細胞培養物又は永久細胞系、たと えばＳｕｐ　Ｔｌ　（Ｔ−細胞）又は０９３７　（単球）のいづれかの連続した 増殖及び再感染によりヒトＴ−細胞又は単球にネズミ真向性ウィルス４０７０Ａ を適合することができる。最大の増殖が達成された後すぐに、逆転写酵素レベル 又はウィルス生成の他のアンセイにより測定される場合、ウィルスは多くの標準 的方法のいづれかによりクローンされ、そのクローンは活性（すなわち、アダプ ター細胞型中へのトランスフェクシ！ンに対して特徴的な同じ最大の増殖を付与 する能力）、及び適切に製造されたヘルパー又は生成体系においては、高い効率 （１０７〜１０’感染単位／Ｗ１）を有するアダプター細胞において感染し、そ して発現するウィルスベクター粒子の生成を導びくであろう欠陥へルバーゲノム 及び／又はベクターを製造するために使用されるこのゲノムについて調べられる 。

■、　のウィルス機能　−バ・　−ソング２種の追加の他のシステムを用いて、 ベクター構成体を担持する組換えレトロウィルスを生成することができる。これ らのシステムの個々は、昆虫ウィルス、バキエロウィルス及び哺乳類ウィルス、 ワクシニア及びアデノウィルスが、遺伝子がクローンされた多量のいづれかの一 定タンパク質を製造するために最近、適合された事実の利点を有する。たとえば 、５ｓｉｔｈなど、（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、：１２、１９８３）　ＨＰ ｉｃｃｊｎｉ　など、（Ｍｅｔｈ、　ＥＩＩＺ　５ｏｌｏ　１３　：　５４５． １９Ｂ？）；及びＭａｎｓｏｕｒなど、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８２　；　１３５９．１９８５）を参照のこと。

このウィルスベクターは、ウィルスベクター中への適切な遺伝子の挿入により組 織培養細胞においてタンパク質を生成するために使用され得、そして従って、レ トロウィルスベクター粒子を製造するために適合され得る。

アデノウィルスベクターは核複製ウィルスに由来し、そして欠陥性であり得る。

遺伝子がベクター中に挿入され、そしてインビトロ構成（Ｂａｌｌａｙなど、、 ＥＭＢＯＪ、　４　：　３８６１．１９８５）により又は細胞における組換え（ Ｔｈｕｍｍｅｌ　など、、Ｊ、阿ｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１　 ：　４３５＋１９８２　）により哺乳類細胞にタンパク質を発現するために使用 され得る。

１つの好ましい方法は、（１）　ｌａｇ／ｐａｌ、　（２）　ｅｎｖ、　（３） 変性されたウィルスベクター構成体を駆動するアデノウィルスのＭａｊｏｒＬａ ｔｅ　Ｐｒｏ■ｏ　ｔｅｒ　（ＭＬＰ）を用いてプラスミドを構成することであ る。変性されたウィルスベクター構成体は、ウィルスベクタープロモーターを含 む、５’ＬＴＲのＩＪ３１域が他のプロモーター配列により置換され得るので可 能である（たとえば、Ｈａｒｔ＋＊ａｎ、　Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１６　：９３４５、１９８８を参照のこと）、コの部分は、３’ＬＴＲからノ Ｕ３ニより１ラウンドの逆転写酵素の後に置換されるであろう。

次に、これらのプラスミドは、３詠１辷Ｌユでアデノウィルスゲノムを製造する ために使用され（Ｂａｌｌａｙなど、、ｏｐ、　ｃｔｔ、）　、そしてこれらは ２９３細胞にトランスフェクトされ（アデノウィルスＥＩＡタンパク質を製造す るヒト細胞系）、このためには、アデノウィルスベクターは、欠陥アデノウィル スベクターにおいて別々に担持されるｇａｇ／ρｏｆ、ｅｎｖ及びレトロウィル スベクターの純粋なストックを生成するために欠陥性である。そのようなベクタ ーの力価は典型的には１０’−１ｏ”／ｄであるので、これらのストックは、高 い多重度で組織培養細胞を同時に感染せしめるために使用され得る６次に、その 細胞は、高レベルでレトロウィルスタンパク質及びレトロウィルスベクターゲノ ムを生成するためにプログラムされるであろう。アデノウィルスベクターは欠陥 性であるので、多量の直接的な細胞溶解物は生ぜず、そしてレトロウィルスベク ターは前記細胞上清液から収穫され得る。

他のウィルスベクター、たとえば無関係なレトロウィルスベクター（たとえばＲ ３Ｖ、　ＭＭ↑Ｖ又は１ｍに由来するベクターが、主要細胞からのベクターを生 成するために同じ１！様で使用され得る。１つのａ様において、これらのアデノ ウィルスベクターは、−次細胞と共に使用され、主要細胞からレトロウィルスベ クター調製物を生ぜしめる。

多くの場合、他のウィルスからの遺伝子生成物は、レトロウィルスパッケージン グシステムの性質を改良するために使用され得る。

たとえば、ＨＩＶ　ｒｅｖタンパク質は、ＨＩＶ　ｅｎｖ又は旧Ｖ　ｇａｇ／ｐ ｏｌ　ＭＬＶベクターのスプライシングを妨ぐために包含され、又はＨｒＶ　ｓ ｏｒは、それがＨＩＶにより高まるように遊離ウィルスによりＴ細胞の感染性を 高めることができる（Ｆｒｓｃｈｅｒなど、、５ｃｔｅｎｃｅ　２３１　：　８ ８８−８９３゜１９８７を参照のこと）。

他のシステム（より実際的に細胞外性である）においては、次の成分が使用され る： １．５ｗ１ｔｈなど、　（前記）に記載されるのに類似するＢ樺でバキ二ロウイ ルスジステム（又は他のタンパク質生成システム、たとえば酵母又は旦、ユＴ） に製造されるｇａｇ／ｐａｌ及びｅｎＶタンパク譬；２、既知のＴｌ又はＳＦ３ 又は他の不Ｚ旦１旦ＲＮＡ−生成システムに製造されるウィルスベクター（たと えば、Ｆｌａｍａｎｔ　ａｎｄ　Ｓｏｒｇｅ＋、Ｌ−ロ工釦ユＪ６　：　１８２ ７．１９８８を参照のこと）；３、（２）におけるようにして製造され、又は酵 母又は哺乳類組織培養細胞から精製されたｔＲＨＡ　；４、リポソーム（固定さ れたｅｎｖタンパク質を有する）：及び５、細胞抽出物又はｅｎｖプロセッシン グを提供するために必要な精製された成分（同定される場合）（典型的にはマウ ス細胞から）、及びいづれか又は他の必要な細胞由来の機能。

この工程的で、（１）、（２）及び（３）が混合され、そして次に、ｅｎｖタン パク質、細胞抽出物及びプレーリポソーム混合物（適切な溶媒における脂質）が 添加される。しかしながら、（１）。

（２）及び（３）の混合物に前記得られたリポソーム固定されたｅｎνを添加す る前、リポソームにｅｎｖタンパク質をより早く固定することがａ・要である。

その混合物は、Ｃｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉ　ｔｅなど、、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８　：　１５．１９８５に記載されているようにして、 医薬のリポソーム　カプシド化のための態様に類似するａｍで脂質及び固定され たｅｎｖタンパク質による新生ウィルス粒子のカプシド化を可能にするために、 処理される（たとえば高波処理、温度操作又は回転透析により）、この方法は、 病原性レトロウィルス又は複製コンピテントレトロウィルスによる汚染を伴わな いで高い力価の複製インコンピテント＆ｌｌ換えレトロウィルスの生成を可能に する。

■、　、−レトロウィルス−°′ハイブリ・ドエンベローブレトロウィルスの宿 主細胞範囲特異性がｅｎｖ遺伝子生成物により一部決定される。たとえば、Ｃｏ ｆｆ１ｎ、　Ｊ、　（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｎｓｅｓ　２　：２５”２７ ．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８５）は、ネズミ白血病ウ ィルス（ＭＬＶ）及びＲｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａウィルス（ＩＩｓＶ）からのタ ンパク質の細胞外成分が特異的レセプター結合を担当することを示す、他方、エ ンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、ピリオン形成において役割を演じる ことが理解される。プソイドタイピング（Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）（すなわ ち他の種のウィルスタンパク質により１つの種がらのウィルスＲＮＡのカプシド 化）は低い頻度で生じるが、エンベロープタンパク質は、一定のレトロウィルス のピリオン形成に対しである特異性を有する０本発明は、ハイブリッドｅｎｖ遺 伝子生成物（すなわち特に、天然においての同じタンパク質分子に存在しない細 胞質領域及び外因性結合領域を有するｅｎｖタンパクｉｔ）を創造することによ って、宿主範囲の特異性が細胞質機能から無関係に変更され得ることを認識する 。従って、予備選択された標的細胞に特異的に結合するであろう組換えレトロウ ィルスが生成され得る。

レセプター結合成分及び細胞質成分が異なったレトロウィルスからであるハイブ リッドタンパク質を製造するためには、組換えのための好ましい位置は、細胞質 成分の膜拡張碩域内に存在する。実施例１０は、ＭＬＶエンベロープタンパク質 の細胞質ドメインに結合されるＨＩＶエンベロープタンパク質のＣ［１ｄ結合部 分を有するタンパク質を発現するハイブリッドｅｎｖ遺伝子の構成を記載する。

天蓋Ａ主 仝ヱ１エヱ上肛り匹しエヱユ旦二１ ハイブリッドエンベロープ遺伝子を、結合の適切な点で新しい制限部位を導入す るためにインビトロ変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ＾８２　：　４８８〜４９２．１９８５ ）を用いて調製する。

他方、２つのエンベロープ配列が同しプラスミド上に存在する場合、それらは４ ｙＹ上ユ変異誘発を用いていづれか所望する点で直接的に結合され得る。いづれ かの場合において、その末端結果物は、ＨＩＶ　ｇｐ１６０　（７）　５　’端 及びＭＬＶ　ｐｔｓＥの３′端を含むハイプリント遺伝子である。その得られる 組換え遺伝子により発現されるハイブリッドタンパク質は、図２に例示され、そ して旧Ｖ　ｇｐ１２０（ＣＤ４　レセプター結合タンパク質）、旧Ｖ　ｇｐ４１ の細胞外部分（ｇｌｌ１２０結合及び融合性領域）及びＭＬＶ　ｐ１５Ｅの細胞 質部分、並びに宿主膜内でのいづれかのいくつかの点で生じる結合を含む、細胞 質表面で融合結合（図２における結合Ｃ）を有するハイブリッドは、Ｓｕｐ　Ｔ ｌ細胞に発現される場合、融合細胞を引き起こす、明らかな融合細胞の数は、同 じ発現ベクターにおける非ハイブリッドＦＩＴＶエンベロープ遺伝子の数の約１ １５である。ハイブリッドを有する融合細胞は、ｒｅｖタンパク質がトランズ型 で同時発現される場合にのみ生じる。細胞外表面で融合結合（図２における結合 Ａ）を有するハイブリッドは融合細胞を付与しないが、ハイブリッｌ’Ｂ（）ラ ンスメンブラン傾城の中央に）は、ハイブリッドＣよりも約５倍低い融合細胞を Ｓｕｐ　Ｔｌ細胞上に付与する。

実施例３は２つの異なったレトロウィルスから生成される１つのハイブリッドタ ンパク質を例示するが、その可能性はレトロウィルス又は他のウィルスに制限さ れない、たとえば、ヒトインターロイキン−２のレセプター結合部分は、ＩＬ− ２レセプターを有する細胞にベクターを向けるためにＭＬＶのエンベロープタン パク質と組合され得る。この場合、組換えは好ましくは、ＭＬＶ　ｅｎｖ遺伝子 のｇｐＴＯ部分に位置し、損なわれていないｐ１５Ｅタンパク質を放す、さらに 、前記技法は、抗体Ｆｃセグメントを認識するエンベロープタンパク質を有する 組換えレトロウィルスを創造するために使用され得る０次に、予備選択された標 的細胞のみを認識するモノクローナル抗体は、レトロウィルスがそれらの予備選 択された標的細胞のみに結合し、そして感染せしめるようなエンベロープタンパ ク質を示すそのような組換えレトロウィルスに結合され得る。他方、アビジンの 結合ドメインを存するハイブリッドエンベローブは、ビオチン化された抗体又は 他のリガンドを存する患者又は動物における細胞の”像”を標的化するために有 用である４者はまず、抗体により満たされ、そして次に、ベクターを投与する前 、非特異的に結合する抗体を患者のシステムから清浄される０次に、ビオチンの ためのアビジン結合部位の高親和性（１０−１Ｓ）が、モノクローナル“像”に より同定される元の組織への正確且つ効果的な標的化を可能にする６そのアプロ ーチはまた、３種のレベルのレトロウィルスベクター特異性、すなわち細胞侵入 、遺伝子発現及び発現されたタンパク質の選択を利用することによって、腫瘍特 異的標的化及び殺害を達成するために使用され得る。レトロウィルスベクターが 細胞に入り、そして細胞内部位でそれらの効果を付与する。この点で、それらの 作用はひじょうにユニークである。この性質及び３種のレベルの天然のレトロウ ィルス特異性（上記）を用いれば、レトロウィルスベクターが、腫瘍細胞を標的 化し、そして殺害するために構築され得る。

腫瘍細胞へのレトロウィルスの標的化の全体の目的は、２つの主な実験的ルート ；すなわちａ）腫瘍細胞において選択的に増殖するレトロウィルスのための組織 培養（又は動物）においての選択；又はｂ）インビトロ継代により製造される改 良点を伴って、組織（腫瘍）−特異的プロモーターによるレトロウィルスベクタ ーの構成、及び陰性及び陽性薬物−悪受性選択により達成され得る。

選択された細胞タイプ、たとえば腫瘍細胞を選択的に感染せしめるために適切な ベクターは一般的に、（ａ）ウィルスが遺伝子的に変異誘発され、そして卓越し た早く増殖する株が生成されるまで、選択された細胞タイプの細胞にウィルスを 連続的に継代し；　（ｂ）変異誘発され、そして早く増殖する株を単層し；　（ Ｃ）変異誘発されたウィルスの好ましい増殖を担当する変異誘発された株の成分 を同定し、そして単離し；　（ｄ）ウィルスに基づいての生成体細胞における対 応成分のための１換体として前記同定され、そして単層された成分を挿入しく連 続的継代のｉ？ｉ７）　：そして（ｅ）ベクターを生成するために前記生成体細 胞を培養することによって調製され得る。

少なくとも次の４種の選択的手段が、腫瘍細胞において選択的に増殖するレトロ ウィルスを選択するために使用され得る；すなわち１）“インビトロ継代による Ｅｎｖ選沢選択、ここで改良された複製増殖能力を有するレトロウィルスの選択 は腫瘍細胞におけるくり返しての継代により達成されるＸ２）　“耐薬物性遺伝 子による選択、ｎここで腫瘍“特異的”レトロウィルスのための遺伝子選択が結 合された耐薬物性遺伝子を含むウィルス構造体に基づかれている；３）“ハイブ リッド−Ｅｎｖ＋“、ここで腫瘍−“特異性”を有するレトロウィルスの選択（ 上記＃１又は１１２手段による）は、腫瘍レセプター遺伝子（すなわちｅｎＶと 融合される抗−腫瘍抗体ＨＭ　Ｖ　ｆｉｌ域遺伝子；又はｅｎｖと融合される増 殖レセプター）の融合であるハイブリッドエンベロープ遺伝子を含む構造体から 開始される；この場合、選択は好ましい開始点、たとえば腫瘍細胞に対しである 特異性を有するｅｎｖで始まる；又は４）“インビトロでの継代による選択及び 正常細胞による同時培養による逆選択”、ここで腫瘍細胞における増殖が耐薬物 性腫瘍細胞及び薬物感受性正常細胞の混合物におけるくり返しての継代により選 択される。

組織（Ｍ瘍）−特異性プロモーターを担持するレトロウィルスベクター構造体に 関して、種々のレベルの組織特異性を有する生化学的マーカーは良く知られてお り、そして組織−特異性プロモーターを通しての遺伝子制御がいくつかのシステ ムにおいて理解される。

転写プロモーター要素（すなわちトランスファーレセプター、チミジンキナーゼ 、等）が急速に増殖する細胞において比較的活性的である多くの遺伝子及びプロ モーター／エンハンサ−要素（すなわち肝臓のための）ＩＢＶエンハンサ−１前 立腺のためのＰＳＡプロモーター）が組織特異性である他の遺伝子が存在する。

レトロウィルスベクター及び組織特異的プロモーター（内部プロモーターとして 又はＬＴＲ内に存在する）は、選択可能マーカー及び細胞サイクル遺伝子（すな わち薬物感受性、Ｅｃｏ　ｇｐｔ　；又はＴＫ−細胞におけるＨ５ＶＴＫ）の発 現を駆動することができる。これらの遺伝子の発現は、それぞれミロフェノール 酸又はＨＡＴを含む培地において選択され得る。このＭ様において、耐薬物性遺 伝子を活性的に発現する組込まれたプロウィルスを含む腫瘍細胞が住存するであ ろう、このシステムにおける選択は、組織−特異的プロモーター及びウィルスＬ ＴＨの両者のための選択を包含する。他方、腫瘍細胞における、及び正常細胞に おいてではない特異的発現は、正常細胞上に定期的にウィルスを継代し、そして それらの細胞においてＥｃｏ　ｇｐｔ又はＨ３Ｖｔｋ（薬物感受性）を発現する ウィルスに対して選択する（チオキサンチン又はアシルクロバーにより）ことに よって逆遺択され得る。　Ｅｃｏ　ｇｐｔ又まｔｋ表現型を発現する組込まれた プロウィルスを含む感染された細胞は死亡し、そして従って、その細胞タイプに おけるウィルスが選択されるであろう。

ＩＸ、ｉ　−・　゛ 染色体上での予定された遺伝子座へのレトロウィルスベクターの標的化は、遺伝 子運搬システムの利益を高める。安全性の測定は、染色体上の“安全”スポット 、すなわちベクターの挿入から有害な効果ををさないことがわかっているスポッ トへの直接的な組込みにより得られる。もう１つの可能性ある利点は、その発現 が最大化される、染色体の“開放”ＷＩ域に遺伝子を向ける能力である。特異的 部位でのレトロウィルスを組込むための２種の技法が下記に説明される。

（１１）工２１ノ−ヒー〔良性 標的細胞のゲノムの予備選択された特異的部位中にベクター構成体を組込むため のもう１つの技法はインテグラーゼ変性を包含する。

レトロウィルスｐｏ＋遺伝子生成物は一般的に、４種の部分：（１）ウィルスｇ ａｇ及びｐｏＪ生成物を処理するプロテアーゼ；（ｉｉ　）逆転写酵素；及び（ ｉｉ）　ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＲＮＡを変性するＩＩＮアーゼＨ；及び（ｉｖ 　）エンドヌクレアーゼ又は“インテグラーゼ”に処理される。

一般的なインテグラーゼ構造は、Ｊｏｈｎｓｏｎなど、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 。

用する亜鉛結合フィンガーを有することが提案されている。

他のタンパク質において、そのような“フィンガー”は、特定な配列でＤＮＡへ の前記タンパク質の結合を可能にする。１つの典型的な例は、ステロイドレセプ ターである。この場合、エストロゲンレセプター遺伝子におけるエストロゲンレ セプターフィンガーセグメントの代わりにグルココルチコイドレ妄ブタ−“フィ ンガー”　（すなわちＤＮＡ結合セグメント）を単純に置換することによって、 エストロゲンに対応するエストロゲンレセプターがグルココルチコイドに対応す るグルココルチコイドレセプターの効果を有するようにすることができる。この 例においては、タンパク質が標的化されるゲノムにおける位置が変更された。そ のような方向づけ配列はまた、存在する亜鉛フィンガーの代わりにインテグラー ゼ遺伝子中に置換され得る。たとえば、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子のＤ ＮＡ結合鏝域をコードするセグメントが、パフケージングゲノムにおいてインテ グラーゼのＤＮＡ結合領域の代わりに置換され得る。初めに、特異的組込みが、 インビトロ組込みシステム（Ｂｒｏｗｎなど、、剋虹Ｌ２９　Ｆ　３４７〜３５ ６．１９８７）により試験される。特異性がインビボに見られることを確保する ために、このパッケージングゲノムが、感染性ベクター粒子を製造するために使 用され、そしてエストロゲン感受性及びエストロゲン非感受性細胞の感染及びそ れらの細胞中への組込みが培養において比較される。

この技法の使用により、到来するウィルスベクターが、インテグラーゼゲノム中 にスプライスされる部位特異的ＤＮＡ−結合タンパク質セグメントのゲノム結合 性質により指図される、標的細胞のゲノム上での予備選択された部位中への組込 みに向けられ得る０組込み部位は、実際、変性されたインテグラーゼのフィンガ ーをよく受け入れるべきであることが当業者により理解されるであろう、たとえ ば、はとんどの細胞は、グルココルチコイドに対して感受性であり、そして従っ て、それらのクロマチンは、グルココルチコイドレセプターのための部位を有す る。従ってほとんどの細胞のためには、グルココルチコイドレセプターフィンガ ーを有する変性されたインテグラーゼは、それらのグルココルチコイドレセプタ ー結合部位でプロウィルスベクター構成体を組込むために適切であろう。

Ｘ、トーンスジェニーク　にお番る　えレトロウィルスベク二Ω生底 レトロウィルスベクターのヘルパー系生成に関してこれまで記載される２つの問 題は次のことである：　（ａ）多量のベクターの生成の困難性；及び（ｂ）ベク ターを製造するために一次細胞の代わりに永久的細胞を使用する現在の必要性、 これらの問題は、トランスジェニック動物に生成される生成体又はパフケージン グ系により克服され得る。これらの動物は、パフケージングゲノム及びレトロウ ィルスベクターゲノムを担持する。現在の技法は、それらの限定された寿命によ り主要細胞におけるパッケージング細胞系及び所望するベクター生成系の生成を 可能にしない、現在の技法は、老衰のために主要細胞の使用を除外する、広範な 特徴づけが必要であるような技法である。しかしながら、トランスジェニック動 物の個々の系統が、パフケージング機能、たとえばｇ”Ｌ　ｐＯ７又はｅｎｖを 生成する本明細書に供給される方法により生成され得る０次に、これらの動物系 は、パンケージング機能を転写するために組織特異的プロモーター又はハウスキ ーピングの選択的使用により完全な動物又は標的化された組織のいづれかにおけ る発現のために特徴づけられる。開放されるべきベクターはまた、組織−特異的 又はハウスキーピングプロモーターを有するトランスジェニック動物の系統中に 挿入される。上記で論じられたように、ベクターは、５’ＬＴＲのｕ３ｓｆｆ域 を置換するそのようなプロモーターを開放され得る（図３）、このトランス遺伝 子は、その発現において誘発性であり、又は遍在性である。

しかしながら、このベクターはパッケージされない０次に、これらの動物系をｇ ａｇ／ｐａｌ／ｅｎｖ動物に対合し、そして続く子孫がパッケージングされたベ クターを生成する。実質的に同一である子孫が特徴づけられ、そして主要生成細 胞の無限の源を提供する。他方、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖを製造し、そしてト ランスジェニック動物に由来する主要細胞が、主要細胞生成体系を製造するため に多量のレトロウィルスベクターにより感染され又はトランスフェクトされ得る 。多くの異なったトランスジェニック動物又は昆虫、たとえばマウス、ラット、 ニワトリ、ブタ、ウサギ、ウシ、羊、魚及びハエは、それらのベクターを生成す る。そのベクター及びパフケージングゲノムが、組織−特異性プロモーター及び 種々のエンベロープタンパク質の使用により種悪染特異性及び組繊−特異性発現 のために構成される。

そのような方法の例は、図４に示される。

主要パッケージング系のトランスジェニック生成の次の例はマウスに関してのみ 記載されているが、それらの方法は当業者により他の種に拡張され得る。それら のトランスジェニック動物は、マイクロインジェクション又は遺伝子トランスフ ァー技法により生成され得る。マウスゲノムにおけるＭＬＶ配列に対しての相同 性を付与する場合、好ましい最終動物はマウスではない。

１ｌ班工 良く特徴づけられたハウスキーピングプロモーターの例はｔｌＰＲＴプロモータ ーである。　ＩＩＰＲＴは、すべての組織において発現するプリンサルベージ酵 素である＊　（Ｐａｔｅｌなど、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６　：　 ３９３〜４０３．１９８６及びＭｅｌｔｏｎなど、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、１　：　２１４７〜２１５１．１９８４を参照のこと）、 このプロモーターは、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｔａｔｉｓなど、＋ｌ’１ｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８２を参照のこと）を用いて、Ｂｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ＋　Ｉｎｃ、）にクローン化さ れる種々のｇａｇ／ｐｏ＋フラグメント（たとえばＢａｌ　Ｉ　／Ｓｃａ　ｒ　 ；Ａａｔ　Ｉｆ／Ｓｃａ　Ｉ　；ＭｏＭＬＶのＰｓｔ　Ｉ　／Ｓｃａ　Ｉ　；　 ｌ？ＮＡ　Ｔｕｔｏｒ　Ｖ亘ｕｓｅｓ　２　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｒｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８５を参照のこと）の前方に挿入される。得 られたプラスミドは、精製され（Ｍａｎｉａｔｉｓなど−ｈｏｐ、　ｃｉｔ、） 　、そして適切な遺伝子情報がＧｅｎｅ　ｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１）又は 電気溶出（Ｈｏｇａｎなど。

Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｗｂｒ　ｏ　：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８ ６を参照のこと）を用いて単層される。

これらの十分に特徴づけられたＤＮＡは、２ｌｇ／ｄの濃度で、受精されたマウ ス卵の前核にマイクロインジェクトされる。生存する生まれたマウスをテイルプ ロット分析（Ｈｏｇａｎなと、＋Ｏｐ、　ｃｉｔ、を参照のこと）によりスクリ ーンする。トランスジェニック−陽性動物を、放射性ラベルされた一次細胞、た とえばｓｕｉ芽細胞の免疫沈殿法によりｇａｇ／ｐｏｔ　タンパク質の発現レベ ルについて特徴づける（Ｈａｒｌｏｗなど、、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　上Ａユａ ｂｏｒａＬｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　１ ９８８を参照のこと）１次に、動物は、特徴づけられたレベルのｇａｇ／ｐ０１ を生成する動物系の確立のためにホモ接合度に繁殖する。

スｍ −ンスジェニ・り　におしる′　のためのハウスキーピングブロモ−−いてのｅ ｎｖ　ンバク　バイブ１ツドエンベローブ　ンパク　の この例は、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープタンパク質のいづれかの 発現のために）ＩＰＲＴプロモーターを使用する。エンベロープタンパク賀は、 ＭＬＶの場合、適切なｇａｇ／Ｉ）０１を補足できるいづれかのレトロウィルス からであり得る９例として、エコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ＭＬＶ、両 回性ＭＬＶ、異種向性？ｊＬＶ、多向性Ｍ［、Ｖ又はハイブリッドエンベロープ を挙げることができる。上記のようにして、エンベロープ遺伝子を、組換えＤＮ Ａ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、＋ｏｐ、　ｃｔｔ、を参照のこと）を用いてＨ ＰＲＴプロモーターの後ろにクローン化する。

その得られる“ミニ遺伝子”を単離しくＨｏｇａｎなと１．ｏｐ、　ｃｉｔ、を 参照のこと）、そしてエンベローブタンバク賞の発現を決定する（Ｈａｒｌｏ− など、、ｏｐ、　ｃｉｔ、）　＊　トランスジェニックエンベロープ動物を、十 分にｖｆ散づけられたエンベロープ動物を確立するためにホモ接合度に繁殖する 。

裏胤医ｌ これは、十分に特徴づけられたｇａｇ／ｐａ＋動物、並びに永久的なｇａｇ／ρ ｏｆ／エンベロープ動物系の確立のための動物を使用する。これは、ホモ接合度 への繁殖及び十分に特徴づけられた系統の確立を包含する０次に、これらの系統 は、組織培養においてベクターをパッケージするために使用され得る主要マウス 胚系を確立するために使用される。さらに、レトロウィルスベクターを含む動物 をこの系統中に繁殖する。

裏旌■工 この例は、特異的組織、たとえばＴ−１１胞におけるｇａｇ／ρｏｌ、エンベロ ープ又はハイブリッドエンベロープの高レベル発現を示す、これは、位置及びコ ピー数独立性を付与するＣＯ２配列（Ｌａｎｚなど、１εＭｈｏ　Ｊ、　７　： 　１６７５〜１６８２．１９８１３を参照のこと）の使用を包含する。

ＣＤ２遺伝子からの１．５　ｋｂのＨａ腸旧／ＨｉｎｄＩＩ［フラグメントを、 組換えＤＮＡ　技法を用いてｇａｇ／ｐｏｔ、エンベロープ又はハイブリッドエ ンベロープフラグメントの前方に挿入する。これらの遺伝子をマイクロインジェ クションにより授精されたマウス卵生に挿入する。トランスジェニック動物を前 記のようにして特徴づける。Ｔ−細胞における発現を確立し、そして動物をトラ ンスジェニック動物の十分に特徴づけられた系統を確立するためにホモ接合性に 繁殖する−　ｇａｇ／ｐｏｌ動物とエンベロープ動物とを交配し、Ｔ−細胞のみ において発現するｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物を確立する１次に、それらの動物 のＴ−細胞はレトロウィルスベクターをパッケージングできるＴ−細胞のための 源である。再び、ベクター動物をそれらのｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物に繁殖し 、前記ベクターを発現するＴ−細胞を確立する。

この技法は、他の組織特異性プロモーター、たとえば乳汁−特異性（乳漿）、膵 臓（インシュリン又はエラスターゼ）又はニューロン（ミニリン塩基性タンパク 質）プロモーターの使用を可能にする。

プロモーター、たとえば乳汁−特異性プロモーターの使用を通して、組換えレト ロウィルスは、その子孫の生物学的流体から直接的に単離され得る。

亥ｍ亀 トランスジェニック　にお番るハウスキーピング　は　・レトロウィルスベタ　 −の トランスジェニック動物の生殖細胞系へのレトロウィルス又はレトロウィルスベ クターの挿入は、はとんど又はまったくの発現をもたらさない、　Ｊａｅｎｊｓ ｃｈ　（Ｊａｈｎｅｒなど、、Ｎａｔｕｒｅ　２９８　：　６２３〜６２８．１ ９８２を参照のこと）により記載されるこの効果は５ルトロウィシスＬＴＲ配列 のメチル化に寄与する。この技法は、レトロウィルスベクター／レトロウィルス を発現するためにハウスキーピング又は組織特異的プロモーターのいづれかを置 換することによってメチル化効果を克服する。エンハンサ−要素を含む、５　’ 　ＬＴＲの０３８１域を、ハウスキーピング又は組織特異的プロモーターからの 調節配列により置換する（図２０を参照のこと）、３’ＬＴＲは、それがウィル スＲＮ＾のポリアデニル化及び組込みのために必要な配列を含むので、十分に保 持される。レトロウィルス復製のユニークな性質の結果として、組込まれたプロ ウィルスの５　’　ＬＴＨのＬＩ３ＴｌＩ域が、ｉ染性ウィルスの３’ＬＴＲの Ｕ３領域により生成される。従って、３′は必要であるが、ところが５′ｕ３は なくても済む、プロモーターと５　’　ＬＴＲＵ３配列との置換及びトランスジ ェニック動物の生殖細胞系中への挿入は、レトロウィルスベクター転写体を生成 できる動物の系統をもたらす。

次に、それらの動物とｇａｇ／ｐｏ［−ｅｎｖ動物とを交配し、レトロウィルス 生成動物を生成する（図４を参照のこと）。

前述から、本発明の特定のａ様を例示目的で記載して来たが、種々の変性が本発 明の範囲内で行なえる。従って、本発明は制限的ではない。

浄書（内容に変更全し） ＦＩ［Ｇ。ＨＡ ＨＩＶ及びＭＬＶ　ＥＮＶ遺伝子上への融合部位の創造５．．４６．、ＯＱ、５ 　７．ｏ　７．．５　１１．ＯＫｂｐ９ｐ７０　ρ１５ε ＦＩＧ。２ 手続補正書（方式） 平成５年３月３７日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．パッケーシングタンパク質及び対象の遺伝子生成物から選択される高レベル の主要因子を生成するパッケーシング細胞を選択する方法であって： （ａ）そこで主要因子を発現する主要遺伝子を含んで成るゲノム、及び前記主要 因子よりも低いレベルでそこで選択可能タンパク質を発現する選択可能遺伝子を パッケーシング細胞に供給し、ここで前記主要遺伝子及び選択可能遺伝子の発現 レベルは比例し；（ｂ）臨界レベルで選択可能タンパク質を発現するそれらの細 胞の同定を可能にする選択因子に前記パッケーシング細胞を暴露し；そして （ｃ）高レベルの主要因子を発現するそれらのパッケ−シング細胞を検出するこ とを含んで成る方法。
2. ２．組換えレトロウイルスの生成方法であって：ｇａｇ，ｐｏｌ，及びｅｎｖ　 タンパク質を生成できる組換えウィルスにより感染された大細胞系から前記タン パク質を生成し；そしてウィルスベクターＲＮＡ　を担持する組換えレトロウイ ルスを生成するために、粒子アセンブリーのための欠失機能を補足するウィルス ベクターＲＮＡ，ｔＲＮＡ，リボソーム及び細胞抽出物と前記タンパク質とを接 触せしめることを含んで成る方法。
3. ３．組換えレトロウイルスの生成方法であって：（ａ）別々に又は組合して、ｇ ａｇ／ｐｏｌ，ｅｎｖ及びレトロウイルスベクターゲノムをコードする組換えウ ィルスベクターを生成し；（ｂ）高い力価のストックを生成し；そして（ｃ）組 換えレトロウイルスベクターを生成するために主要又は他の細胞を同時感染せし めることを含んで成る方法。
4. ４．組換えレトロウイルスの生成方法であって、（ａ）対象の遺伝子及び第１の レトロウイルス表現型のパッケーシングシグナル； （ｂ）パッケーシングシグナルを欠く、前記第１のレトロウイルス表現型のｇａ ｇ及びｐｏ１遺伝子； （ｃ）パッケーシングシグナルを欠くハイブリッドｅｎｖ遺伝子、ここで前記第 １のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント及び前記第１のレトロウイルス表 現型に対して外因性の結合セグメントを含んで成る；を含んで成るゲノムを有す る生成体細胞を増殖することを含んで成る方法。
5. ５．組換えレトロウイルスの生成方法であって、（ａ）対象の遺伝子及び第１の レトロウイルス表現型のパッケーシングシグナル； （ｂ）パッケーシングシグナルを欠く、前記第１のレトロウイルス表現型のｇａ ｇ及びｐｏ１遺伝子； （ｃ）生成体細胞の表面上で発現され、そして続いて、ベクター粒子の表面上に 表わされるリガンドをコードする遺伝子を含んで成るゲノムを有する生成体細胞 を増殖することを含んで成る方法。
6. ６．前記リガンドがＣＤ４である請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．標的細胞に対象の遺伝子を選択的に担持できるレトロウイルスを調製するた めに有用なハイブリッドｅｎｖ遺伝子であって、前記ｅｎｖ遺伝子が： （ａ）第１のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント；及び（ｂ）前記第１の レトロウイルス表現型に対して外因性の結合セグメント、ここで前記結合セグメ ントは標的細胞に選択的に結合できる；をコードすることを特徴とする遺伝子。
8. ８．標的細胞のゲノム上の予備選択された部位中にそのゲノムを組込むことがで きる組換えレトロウイルスの生成方法であって：カプシド及びエンベロープにベ クターをパッケーシングし、そして予備選択された部位中にレトロウイルスゲノ ムを組込むことができる変性形インチダラーゼをウィルス粒子に包含することを 含んで成る方法。
9. ９．組換えレトロウイルスの生成方法であって：ｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖウィル ス構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と、プロモーターを含むベクタ ー構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫とを交配し； 前記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離し；前記子孫から選択された 細胞を単離し；適切な培地において前記細胞を増殖し；そして前記細胞から組換 えレトロウイルスを単離することを含んで成る方法。
10. １０．トランスジェニックパッケーシング動物又は昆虫の生成方法であって： パッケーシングのために必要な、いくらかの（但しすべてではない）ウィルスタ ンパク質をコードするベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と 、前記必要なウィルスタンパク質の残りをコードするベクター構成体を含むトラ ンスジェニック動物又は昆虫とを交配し；そして 前記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離することを含んで成る方法。
11. １１．高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために 、ベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と前記子孫とを交配す る段階をさらに含んで成る請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために 、ベクター構成体を含む組換えレトロウイルスにより、前記子孫から外植された 細胞を感染せしめる段階をさらに含んで成る請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．標準のマウス両向性パッケーシング細胞系に比較して、ウィルスパッケー シングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成する非マウスパッケージン グ細胞系。
14. １４．前記ウィルスパッケーシングタンパク質がｇａｇ／ｐｏｌタソパク質であ る請求の範囲第１３項記載の細胞系。
15. １５．前記細胞系が両向性パッケーシング細胞系である請求の範囲第１３項記載 の細胞系。
16. １６．前記パッケーシング細胞系が、ベクター構成体の導入に基づいて、標準の マウス両向性パッケーシング細胞系に比較してベクター力価において少なくとも １０倍高く生成する請求の範囲第１３〜１５のいづれか１項記載のパッケーシン グ細胞系。
17. １７．前記パッケーシング細胞系が、ベクター構成体の導入に基づいて、ヒト細 胞を感染できるベクター粒子を生成する請求の範囲第１３〜１５のいづれか１項 記載のパッケーシング細胞系。
18. １８．ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンピテントウィルスにより実費 的に汚染されていないベクター粒子を生成できる異種向性パッゲーシング細胞系 。
19. １９．前記細胞系が、ＨＴＩ０８０細胞が感染される場合、標準のマウス両向性 パッケーシング細胞系に比較して、少なくとも同じベクター力価を生成する請求 の範囲第１８項記載のパッケーシング細胞系。
20. ２０．多向性パッケーシング細胞系。
21. ２１．ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンビテントウィルスにより実質 的に汚染されていないベクター粒子を生成できる請求の範囲第２０項記載のパッ ヶーシング細胞系。
22. ２２．前記パッケーシング細胞系が、２９３細胞が感染される場合、ベクター構 成体の導入に基づいて、標凖のマウス両向性パッケーシング細胞系に比較してベ クター力価において少なくとも１０倍高く生成する請求の範囲第２０項記載のパ ッケーシング細胞系。
23. ２３．パッケーシング細胞系が、ベクター構成体の導入に基づいて、腎臟系統の 細胞（但し、線維芽細胞、上皮、Ｔ細胞又は単球系統の細胞ではない）を感染で きるベクター粒子を生放する多向性パッケーシング細胞系。
24. ２４．ｇａｇ／ｐｏ１及びｅｎｖのための遺伝子を別々のオベロソ上に担持し（ 前記オベロンはレトロウイルスＬＴＲ配列を欠き）、そしてＮ２型ベクター構成 体の導入に基づいて、少なくとも２０日間の培養継代の後、実質的にヘルパーウ ィルスを生成しない非マウスパッケーシング細胞系。
25. ２５．前記細胞系が両向性パッケーシング細胞系である請求の範囲第２４項記載 の細胞系。
26. ２６．前記細胞系が多向性パッケーシング細胞系である請求の範囲第２４項記載 の細胞系。
27. ２７．前記細胞系が異種向性パッケーシング細胞系である請求の範囲第２４項記 載の細胞系。
28. ２８．組換えレトロウイルスの生成方法であって：ａ）レトロウイルスベクター システムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウィルスを実質的 に有さない細胞系中にレトロウィルスベクターシステムからのパッケーシング遺 伝子を導入し；そして ｂ）標準のマウス両向性パッケーシング細胞系に比較して、ウィルスパッケーシ ングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成し、そしてベクター構成体の 導入に基づいて、標凖のマウス両向性パッケーシング細胞系に比較して、ベクタ ー力価において少なくとも１０倍高く生辰する細胞について選択することを含ん で成る方法。
29. ２９．組換えレトロウイルスの生成方法であって：ａ）レトロウイルスベクター システムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウィルスを実質的 に有さない細胞系中に、ヒト細胞を感染できるレトロウイルスベクターシステム からのパッケーシング遺伝子を導入し；そして ｂ）ベクター構成体の導入に基づいて、標凖のマウス両向性パッケーシング細胞 系の力価に少なくとも等しいベクター力価を生成し、そしてヒト細胞を感染でき るベクター粒子を生成する細胞について選択することを含んで成る方法。
30. ３０．ＣＡ，２Ａ，ＤＡ，ＤＡ２，ＤＸ，Ｄ１７　ＸＥＮＯ，ＨＸ，ＨＴ１０８ ０　ＸＥＮＯ，ＨＰ及びＨＴ１０８０　ＰＯＬＹ　から成る群から選択された細 胞系。
31. ３１．選択された細胞型を感染できるベクターの生成方法であって：ａ）ウィル スが遺伝子的に変異誘発し、そして卓越して早く増殖する株が生成するまで、選 択された細胞型の細胞においてウィルスを連続的に継代し； ｂ）前記変異誘発され、そして早く増殖する株を単離し；ｃ）前記変異誘発され たウィルスの選択的増殖を担当できる前記変異誘発された株の成分を同定し、そ して単離し；ｄ）連続した継代の前、前記ウィルスに基づかれる生成体細胞にお ける対応する成分のための置換体として前記同定され、そして単離された成分を 、挿入し、そして、 ｅ）前記ベクターを生成せしめるために前記生成体細胞を培養することを含んで 成る方法。