CN100473663C - 奈瑟球菌蛋白质的异源表达 - Google Patents

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Abstract

异源表达脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌蛋白质的其它和改进的方法。这些方法通常影响表达的水平、纯化的简易性、细胞的定位和/或所表达的蛋白质的免疫特性。

Description

奈瑟球菌蛋白质的异源表达
本申请是题为《奈瑟球菌蛋白质的异源表达》的原中国专利申请01808750.7的分案申请。
技术领域
本发明涉及蛋白质表达的领域。具体说，本发明涉及奈瑟球菌(如淋病奈瑟球菌或较佳地为脑膜炎奈瑟球菌)的蛋白质的异源表达。
背景技术
国际专利申请WO 99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO 00/22430公开了脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)的蛋白质。这些蛋白质一般是以N-未端GST-融合体或C-未端His-标记融合体在大肠杆菌中表达的(即异源表达)，虽然也公开了其它表达系统(包括在天然的奈瑟球菌中的表达)。
本发明的目的是提供这些蛋白质的异源表达的其它或改进方法。这些方法通常影响表达的水平、纯化的简易程度、表达在细胞内定位和/或表达的蛋白质的免疫学特性。
发明内容
本文的命名
本文参考在WO 99/24578、WO 99/36544和WO 99/57280中公开的2166个蛋白质序列，并将它们编号为如下的SEQ#：
 
申请 蛋白质序列 本文的SEQ#
WO 99/24578 偶SEQ ID 2-892 SEQ#1-446
WO 99/36544 偶SEQ ID 2-90 SEQ#447-491
WO 99/57280 偶SEQ ID 2-3020 SEQ#492-2001
 
偶SEQ ID 3040-3114SEQ ID 3115-3241   SEQ#2002-2039SEQ#2040-2166
除了这种的SEQ#编号外，本文还使用了WO 99/24578、WO 99/36544和WO99/27280中的命名约定(如WO99/24578和WO 99/36544中用的‘ORF4’、‘ORF40’、‘OFR40-1’等；WO 99/57280中用的‘m919’、‘g919’和‘a919’等)。
在本文中将Tettelin等[Science(2000)287：1809-1815]中的从NMB0001到NMB2160的2160个蛋白质称为SEQ#2167-4326[参见WO00/66791]。
本文采用的术语“本发明的蛋白质”指包含以下的蛋白质：
(a)SEQ#1-4326中的一个序列；或
(b)与SEQ#1-4326中的一个序列相同的序列；或
(c)SEQ#1-4326中的一个序列的片段。
(b)中的“序列相同性”的程度最好大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更大)。其包括突变体和等位基因变体[如，参见WO 00/66741]。相同性宜用Smith-Waterman同源性搜寻算法确定，如在MPSRCH程序(OxfordMolecular)中执行的，采用参数“缺口罚分(gap open penalty)”为12，“缺口延伸罚分(gap extension penalty)”为1进行缺口仿射搜索。通常，将两种蛋白质之间50％或更高的相同性视为功能等效的指示。
(c)中的“片段”应包含SEQ#1-4326中一个序列的至少n个连续的氨基酸，且根据具体的序列n为7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更高)。较佳地，片段包含SEQ#1-4326中一个序列的表位。优选的片段是在WO 00/71574和WO 01/04316中公开的那些。
本发明优选的蛋白质是在脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的。
根据本发明使用的优选蛋白质是血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株2996或菌株394/98(新西兰菌株)。除非特别指出，本文所述的蛋白质是脑膜炎奈瑟球菌菌株2996的蛋白质。但是，应该理解通常本发明并不受菌株的限制。参考具体的蛋白质(如‘287’、‘919’等)可以包括任何菌株的该蛋白质。
非融合表达
在异源表达的第一步骤中，没有使用融合配体，而是使用了天然前导肽(如果存在)。这通常防止了来自融合配体的任何“干扰”，并可能改变异源宿主中的细胞定位和/或翻译后的修饰和/或折叠。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，在该方法中(a)没有使用融合配体，并(b)使用了蛋白质的天然前导肽(如果存在)。
该方法通常包括制备表达本发明蛋白质的载体的步骤，这样第一个表达的氨基酸是该蛋白质的第一个氨基酸(甲硫氨酸)，且最后一个表达的氨基酸是该蛋白质的最后一个氨基酸(即，在天然STOP密码子前的密码子)。
最好将该方法用于表达使用天然前导肽的如下蛋白质：111、149、206、225-1、235、247-1、274、283、286、292、401、406、502-1、503、519-1、525-1、552、556、557、570、576-1、580、583、664、759、907、913、920-1、936-1、953、961、983、989、Orf4、Orf7-1、Orf9-1、Orf23、Orf25、Orf37、Orf38、Orf40、Orf40.1、Orf40.2、Orf72-1、Orf76-1、Orf85-2、Orf91、Orf97-1、Orf119、Orf143.1、NMB0109和NMB2050。本文蛋白质命名中所用的后缀“L”指用天然前导肽按这种方式的表达。
最好用该方法(不使用融合配体，且不含天然前导肽)表达的蛋白质包括：008、105、117-1、121-1、122-1、128-1、148、216、243、308、593、652、726、926、982、Orf83-1和Orf143-1。
有利地，用这种方法来表达ORF25或ORF40，形成的蛋白质诱导的抗细菌抗体比GST-或His融合体诱导得更好。
这种方法特别适用于表达脂蛋白。
前导肽的替代
在异源表达的第二步骤中，用不同蛋白质的天然前导肽替代本发明蛋白质的天然前导肽。另外，最好不使用融合配体。在异源宿主中使用蛋白质自身的前导肽通常会将蛋白质定位于其‘天然’细胞位置，有时异源宿主不能有效地识别该前导序列。在这种情况下，则可改为使用已知能有效地驱动蛋白质靶向的前导肽。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中(a)用不同蛋白质的前导肽替代该蛋白质的前导肽，和任选地(b)不使用融合配体。
该方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去编码所述蛋白质前导肽的核苷酸，并引入编码不同蛋白质的前导肽的核苷酸。可以将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。表达的蛋白质包含N-未端的替代前导肽，其后为本发明减去前导肽的蛋白质。
前导肽最好为本发明另一蛋白质(如SEQ#1-4326中的一种)的，但也可以是大肠杆菌的蛋白质(如，OmpA前导肽)或胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的蛋白质(如PelB前导肽)。
特别有用的置换前导肽是ORF4的前导肽。该前导肽能指导大肠杆菌中的脂质化(lipidation)、改善细胞定位，且其特别适用于表达蛋白质287，919和△G287。961的前导肽和N-未端区域也特别有用。
另一种可用的置换前导肽是大肠杆菌OmpA的。该前导肽能指导在大肠杆菌中的膜定位。其特别有利于ORF1的表达，形成的蛋白质比从其自身前导肽融合和表达的蛋白质能诱导更好的抗细菌抗体。
另一种可用的置换前导肽是MKKYLFSAA。它能直接分泌到培养基中，是非常短和有活性。这种前导肽的使用不限于奈瑟球菌蛋白质的表达-可用它来指导任何蛋白质(尤其是细菌蛋白质)的表达。
前导肽的缺失
在异源表达的第三步骤中，删除本发明蛋白质的天然前导肽。另外，不宜使用任何融合配体。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白的方法，其中(a)删除蛋白质的前导肽，和任选地(b)不使用任何融合配体。
该方法通常还包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去编码所述蛋白质前导肽的核苷酸。可以将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。表达的蛋白质的第一氨基酸是成熟的天然蛋白质的第一氨基酸。
该方法可以提高表达的水平。例如，对蛋白质919而言，删除前导肽时，大肠杆菌中的表达水平高许多。没有前导肽时，表达的提高是由于定位的改变。
该方法还优先用于919、ORF46、961、050-1、760和287的表达。
基于区域的表达
在异源表达的第四步骤中，该蛋白质以结构域表达。这可以与融合系统(如6ST或His-标记的融合)联合使用。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中(a)删除蛋白质的至少一个结构域，和任选地(b)不使用融合配体。
该方法通常还包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去蛋白质中的至少一个结构域。可以将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。不使用融合配体，表达的蛋白质的第一氨基酸是该蛋白质结构域的第一氨基酸。
通常，用数据库中已知的序列将蛋白质排序，然后确定该蛋白质中显示彼此不同的排序模式的区域，从而将该蛋白质分成概念上的结构域。
最好将该方法用于表达蛋白质287。概念上可以将该蛋白质分成3个结构域，称为A、B和C(见图5)。结构域B与IgA蛋白酶排序很接近，结构域C与运铁蛋白结合的蛋白质排序很接近，而结构域A显示与数据库列不接近。WO00/66741公开了287的多聚体形式的排序。
一旦将蛋白质分区成结构域，就可将它们(a)单独表达(b)以蛋白质的缺失形式表达(如蛋白质ABCD→ABD、ACD、BCD等)、或(c)重排表达(如蛋白质ABC→ACB、CAB等)。这三种策略可与所需的融合配体联合。
还将ORF46分为2个结构域-第一结构域(氨基酸1-433)(在品种和血清群之间很好保守的)和第二结构域(氨基酸433-608)(非很好保守的)。最好删除第二结构域。WO 00/66741公开了ORF46的多聚体形式的排序。
还将蛋白质564分成结构域(图8)如具有蛋白质961(图12)和蛋白质502(MC58蛋白质的氨基酸28-167)。
杂交蛋白质
在异源表达的第五步骤中，将本发明的2种或多种(如3、4、5、6或更多)蛋白质表达为单杂交蛋白质。不宜使用非奈瑟球菌融合配体(如GST或聚-His)。
这能提供2个优点。其一，该蛋白质自身可能不稳定或表达很弱，而加入合适的能克服该问题的杂交配体就可协助该蛋白质。其二，简化工业生产-产生两种分开的-有用的蛋白质只需要一次表达和纯化。
因此，本发明提供了同时异源表达两种或多种本发明蛋白质的方法，其中所述的两种或多种本发明的蛋白质是融合的(即，它们是以单多肽链翻译的)。
该方法通常还包括如下步骤：获得编码本发明第一种蛋白质的第一种核酸；制得编码本发明第二种蛋白质的第二种核酸；连接第一和第二核酸。将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。
较佳地，本发明在杂交蛋白质中构成的蛋白质是来源于同一菌株的。
可直接连接杂交体中的融合蛋白；或通过接头肽连接，如通过聚-甘氨酸接头(即，Gn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)；或通过协助克隆的短肽序列连接。显然，不宜将△G蛋白质连接于聚-甘氨酸接头的C-未端。
融合的蛋白质可能缺少天然前导肽，或可能包含N-未端融合配体的前导肽序列。
这种方法适用于表达蛋白质orf1，orf25，orf40，Orf46/46.1，orf83,233,287,564,687,741,907,919,953,961和983。
由式NH2-A-B-COOH在下表中以‘X’表示的42个杂交体是优选的：
 
↓AB→ ORF46.1 287 741 919 953 961 983
ORF46.1 X X X X X X
287 X X X X X X
741 X X X X X X
919 X X X X X X
953 X X X X X X
961 X X X X X X
983 X X X X X X
因此，优选的以杂交体表达的蛋白质是ORF46.1,287,741,919,961和983。它们可以全长形式或聚-甘氨酸缺失(△G)形式使用(如△G-287、△GTbp2、△G741、△G983等)，或以截短形式使用(如△1-287、△2-287等)，或以结构域缺失的形式使用(如287B、287C、287BC、ORF461-433、ORF46433-608、ORF46、961c等)。
特别优选的是：(a)含919和287的杂交蛋白；(b)含953和287的杂交蛋白；(c)含287和ORF46.1的杂交蛋白；(d)含ORF1和ORF46.1的杂交蛋白；(e)含919和ORF46.1的杂交蛋白；(f)含ORF46.1和919的杂交蛋白；(g)含ORF46.1、287和919的杂交蛋白；(h)含919和519的杂交蛋白；和(i)含ORF97和225的杂交蛋白。图14显示了其它实施例。
当使用287时，其优先位于杂交体的C-未端；如果在N-未端使用它，则优先使用287的△G形式(如与ORF46.1、919、953或961杂交的杂交体的N-未端)。
当使用287时，其优先为菌株2996或菌株394/98的。
当使用961时，其宜在N-端。可使用961的结构域形式。
WO 99/66741公开了ORF46、287、919和953的多聚体形式排序。本发明可以使用这些多聚体形式中的任一形式。
温度
在异源表达的第六个步骤中，低温表达本发明的蛋白质。
表达的奈瑟球菌蛋白(如919)可能对大肠杆菌有毒性，这可以通过在不显现蛋白质毒性的温度时表达该蛋白来避免。
因此，本发明提供了异源表达本发明蛋白质的方法，其中在不显现该蛋白质毒性的温度时进行本发明蛋白质的表达。
优选的温度为约30℃。这特别适用于919的表达。
突变
如上所述，表达的奈瑟球菌蛋白质对大肠杆菌可能有毒性的。通过突变该蛋白以降低或消除毒性来避免这种毒性。特别是，可以使用降低或消除毒性酶活性的突变，较佳地使用定位诱变。
因此在异源表达的第七个步骤中，表达的蛋白质是突变的，以减少或消除毒性。
因此，本发明提供了异源表达本发明蛋白质的方法，其中蛋白质是突变的以降低或消除毒性。
较佳地，该方法适用于蛋白质907、919或922的表达。在907中的优选突变是在Glu-117(如Glu→Gly)；在919中的优选突变是在Glu-255(如Glu→Gly)和/或在Glu-323(如Glu→Gly)；在922中的优选突变是在Glu-164(如Glu→Gly)、Ser-213(如Ser→Gly)和/或Asn-348(如Asn→Gly)。
其它载体
在异源表达的第八个步骤中，用其它载体表达蛋白质。这可以改进表达收率，例如，或使用已验证用于GMP的质粒。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中使用其它载体。所述的其它载体最好为pSM214，其无融合配体。可以包含或不包含无前导肽。
这种方法特别适用于蛋白质953。用从pSM214表达的953天然前导肽对953的表达和定位比从pET载体的好得多。
也可将pSM214与以下一起使用：△G287、△2—287，△3—287，△4—287，Orf46.1，961L，961，961(MC58)，961c—L，919，953和△G287—Orf46.1。
其它适合的载体是pET-24b(Novagen；用卡那霉素抗性)，而且也不使用融合配体。pET-24b宜与以下一起使用：△G287K，△2—287K，△3—287K，△4—287K，Orf46.1，Orf46A-K，961—K(MC58)，961a—K，961b—K，961c—K，961c—L—K，961d—K，△G287—919—K，△G287—Orf46.1—K和△G287—961—K。
多聚体形式
在异源表达的第九步中，表达或纯化蛋白质使其接受一种特定的多聚体形式。
这种方法尤其适用于蛋白质953。953的一种特定的多聚体形式(单体形式)的纯化使蛋白质比其它形式(二体形式)具有更大的杀菌活性。
可将蛋白质287和919以二体的形式纯化。
可将蛋白质961以180kDa寡聚形式(如四体)纯化。
脂质化
在异源表达的第十步中，将蛋白质以脂质化的蛋白质表达。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中蛋白质是以脂化的蛋白质表达的。
这尤其适用于919、287、ORF4、406、576-1和ORF25的表达。WO00/66741公开了919、287和ORF4的多聚体形式。
该方法通常包括使用合适的前导肽而不用N-未端融合配体。
C-未端缺失
在异源表达的第十一步中，使本发明蛋白质的C-未端突变。另外，不宜使用融合配体。
因此，本发明提供了异源表达本发明蛋白质的方法，其中(a)使该蛋白质的C-未端区域突变，并任选地(b)不使用融合配体。
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作所述的核酸从而使编码蛋白质C-未端部分的核苷酸突变。将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。表达的蛋白质的第一氨基酸为成熟天然蛋白质的第一氨基酸。
这种突变可以是取代、插入或较佳地为缺失。
这种方法能增加表达水平，尤其是蛋白质730、ORF29和ORF46的表达水平。对蛋白质730而言，可以删除约65-214氨基酸的C-未端区域；对ORF46而言，可以删除约175氨基酸的C-未端区域；对ORF29而言，可以删除C-未端以留下约230-370N-未端氨基酸。
前导肽突变
在异源表达的第十二步中，使蛋白质的前导肽突变。这尤其适用于蛋白质919的表达。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中使蛋白质前导肽突变。
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；并操作所述的核酸使前导肽中的核苷酸突变。可将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。
聚-甘氨酸缺失
在异源表达的第十三步中，使野生型序列的聚-甘氨酸段突变。以此提高蛋白质的表达。
聚-甘氨酸段包括序列(Gly)n，其中n≥4(如5、6、7、8、9或更多)。让该段突变以破坏或除去(Gly)n。这可以通过删除(如，CGGGGS→CGGGS、CGGS、CGS或CS)，通过替代(如CGGGGS→CGXGGS、CGXXGS→CGXGXS等)，和/或缺失(如CGGGGS→CGGXGGS、CGXGGGS等)。
这种方法不局限于奈瑟球菌蛋白-其可用于任何蛋白质(尤其是细菌蛋白)以提高异源表达。然而，对奈瑟球菌蛋白质而言，它特别适用于表达287、741、983和Tbp2。WO 00/66741公开了287的多聚体形式的排序。
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中(a)使蛋白质中的聚-甘氨酸段突变。
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；和操作所述的核酸使编码蛋白质序列中的聚-甘氨酸段的核苷酸突变。可将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分。
相反，可用相反的方法(即引入聚-甘氨酸段)抑制或减少特定异源蛋白质的表达。
异源宿主
虽然本发明蛋白质的表达可以在天然宿主(即天然表达蛋白质的生物)中发生，但本发明用异源宿主。异源宿主可以是原核细胞或真核细胞。最好是大肠杆菌，其它合适的宿主包括枯草杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonenna typhimurium)、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、酵母等。
载体等
如上所述的方法，本发明提供了(a)用于这些方法的核酸和载体；(b)含所述载体的宿主细胞；(c)可用这些方法表达的或可表达的蛋白质；(d)包含这些蛋白质的组合物，其可能适用于疫苗、或例如诊断剂或免疫原性组合物；(e)用作药物(如疫苗)或诊断剂的组合物；(f)这些组合物用于生产(1)治疗或预防奈瑟球菌引起的感染的药物(2)检测奈瑟球菌或由奈瑟球菌引起的抗体存在与否的诊断剂，和/或(3)能产生抗奈瑟球菌抗体的药物；和(g)治疗患者的方法，其包括对该患者施用治疗有效量的这些组合物。
序列
本发明还提供了具有以下实施例中所列出的任何序列的蛋白质或核酸。本发明还提供了具有与这些序列是序列相同性的的蛋白质和核酸。如上所述，“序列相同性”的程度最好大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。
另外，本发明还提供了能与实施例中公开的核酸杂交的核酸，较佳地在“高度严谨”条件下(如在65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液中)。
本发明还提供了编码本发明蛋白质的核酸。
还应理解，本发明提供了核酸，所述核酸含有与上述序列互补的序列(例如用于反义或探测目的)。
当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从基因组或cDNA文库、或从生物体本身制得等)，并可以是各种形式(例如单链、双链、载体、探针等)。
此外，术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。
附图说明
图1和2显示用于以异源前导肽表达蛋白质的构建物。
图3显示ORF1的表达数据，图4显示蛋白质961的类似数据。
图5显示蛋白质287的结构域，图6和7显示结构域A中的缺失。
图8显示蛋白质564的结构域。
图9显示由919前导肽驱动的PhoC报道基因，图10显示用前导肽的突变体得到的结果。
图11显示蛋白质730的插入突变体(A：730-C1；B：730-C2)。
图12显示蛋白质961的结构域。
图13显示△G蛋白质的SDS-PAGE。点显示主要重组产物。
图14显示本发明的26杂交蛋白。
  具体实施方式
实施例1-919及其前导肽
脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株2996)的蛋白质919具有如下序列：
1    MKKYLFRAAL YGIAAAILAA CQSKSIQTFP QPDTSVINGP DRPVGIPDPA
51   GTTVGGGGAV YTVVPHLSLP HWAAQDFAKS LQSFRLGCAN LKNRQGWQDV
101  CAQAFQTPVH SFQAKQFFER YFTPWQVAGN GSLAGTVTGY YEPVLKGDDR
151  RTAQARFPIY GIPDDFISVP LPAGLRSGKA LVRIRQTGKN SGTIDNTGGT
201  HTADLSRFPI TARTTAIKGR FEGSRFLPYH TRNQINGGAL DGKAPILGYA
251  EDPVELFFMH IQGSGRLKTP SGKTIRIGYA DKNEHPYVSI GRYMADKGYL
301  KLGQTSMQGI KAYMRQNPQR LAEVLGQNPS YIFFRELAGS SNDGPVGGALG
351  TPLMGEYAGA VDRHYITLGA PLFVATAHPV TRKALNRLIM AQDTGSAIKG
401  AVRVDYFWGY GDEAGELAGK QKTTGYVWQL LPNGMKKPEYR P＊
在前导肽下加下划线。
可以在WO 00/66741的图7和18中发现其它菌株的919序列。
WO 99/57280的实施例2公开了在大肠杆菌中作为His-融合体的蛋白质919的表达。该蛋白质是优良的外露表面免疫原。
将另三种表达方法用于919：
1)919没有其前导肽(且没有成熟的N-未端半胱氨酸)且无任何融合配体(′919未标记的)：
1      QSKSIQTFP QPDTSVINGP DRPVGIPDPA GTTVGGGGAV YTVVPHLSLP
50    HWAAQDFAKS LQSFRLGCAN LKNRQGWQDV CAQAFQTPVH SFQAKQFFER
100   YFTPWQVAGN GSLAGTVTGY YEPVLKGDDR RTAQARFPIY GIPDDFISVP
150   LPAGLRSGKA LVRIQTGKN  SGTIDNTGGT HTADLSRFPI TARTTAIKGR
200   FEGSRFLPYH TRNQINGGAL DGKAPILGYA EDFVELFFMH IQGSGRLKTP
250   SGKYIRIGYA DKNEHPYVSI GRYMADKGYL KLGQTSMQGI KAYMRQNPQR
300   LAEVLGQNPS YIFFRELAGS SNDGPVGALG TPLMGEYAGA VDRHYITLGA
350   PLFVATAHPV TRKALNRLIM AQDTGSAIKG AVRVDYFWGY GDEAGELAGK
400   QKTGYVWQL  LPNGMKPEYR P＊
通过设计从预定的前导序列的5′-端扩增引物下游除去前导肽和半胱氨酸。
2)包含其前导肽但无任何融合配体的919(‘919L′)；和
3)包含ORF4的前导肽(MKTFFKTLSAAALALILAA)的919(‘919Orf4′)。
1     MKTFFKTLS AAALALILAA CQSKSIQTPP QPDTSVINGP DRPVGIPDPA
50   GTTVGGGGAV YTVVPHLSLP HWAAQDFAKS LQSFRLGCAN LKNRQGWQDV
100  CAQAFQTPVH SFQAKQFFER YFTPWQVAGN GSLAGTVTGY YEPVLKQDDR
150  RTAQAEFPIY GIPDDFISVP LPAGLRSGKA LVRIRQTGKN SGTIDNTGGT
200  HTADLSRFPI TARTTAIKGR FEGSRFLPYH TRNQINGGAL DGKAPILGYA
250  EDPVELFFMH IQGSGRLKTP SGKYIRIGYA DKNEHPYVSI GRYMADKGYL
300  KLGQTSMQGI KSYMRQNPQR LAEVLGQNPS YIFFRELAGS SNDGPVGALG
350  TPLMGRYAGA VDRHYITLGA PLFVATAHPV TRKALNRLIM AQDTGSAIKG
400  AVRRVDYFWGY GDEAGELAGK QKTTGYVWQL LPNGMKPEYR P＊
为了制备此构建物，编码ORF4前导肽的整个序列作为尾部包括于5′-引物(引物919L或f4For)。用编码ORF4前导序列的序列中的双核苷酸改变产生NheI限制酶切位点(无氨基酸改变)，使不同的基因融合于ORF4前导肽序列。在所有的3′-端引物序列中包括终止密码子。
蛋白质的所有三种形式都被表达且可以纯化。
如所示的[3H]-棕榈酸标记的掺入，将‘919L′和‘919Orf4′表达产物脂化。919未标记的不掺入3H标记，且是在细胞内定位的。
与919L相比，919Lorf4更易纯化。将其纯化并用于免疫接种小鼠。得到的血清在FACS和ELISA测试以及杀菌试验中产生极佳的结果。该脂蛋白显示位于外膜。
919未标记的具有极佳的ELISA滴定度和高血清杀菌活性。FACS证明了其细胞表明的定位。
实施例2-919和表达温度
于37℃，表达919LOrf4蛋白质的大肠杆菌的生长导致细菌裂解。为了克服这个问题，重组细菌在30℃生长。防止了裂解，而不会制止表达。
实施例3-907、919和922的突变
假设蛋白质907、919和922是胞壁质水解酶和具体说是裂解性转糖基酶。胞壁质裂解酶位于外膜，且参与肽聚糖的降解。
因此测试纯化的蛋白质919未标记的、919Lorf4、919-His(即，包含C-未端His-标记)和922His的胞壁质水解酶活性[Ursinus & Holtje(1994)J.Bact.176：338-343]。使用两种不同的试验，一种用于确定不难溶性胞壁质小囊降解为可溶性胞壁肽的，另一种则是测定聚(MurNAc-GlcNAc)n>30聚糖链的断裂。
第一种试验使用由内消旋-2，6-二氨基-3，4，5-[3H]庚二酸放射标记的胞壁质小囊作为底物。于37℃，在总体积为100μl(包括10mM Tris-马来酸盐(pH5.5)、10mM MgCl2、0.2％v/v Triton X-100和[3H]A2pm标记的胞壁质小囊(约10000cpm))中培养酶(总共3-10μg)45分钟。将试验混合物置于冰上15分钟，在100μl1％w/v N-乙酰基-N，N，N-三甲铵上15分钟，从10000g离心15分钟沉淀物质。用液体闪烁计数测定上清液中的放射活性。用大肠杆菌可溶性裂解性转糖基酶Slt70作为试验的阳性对照；阴性对照包括不含酶的上述试验溶液。
在第一个试验中，除919-His以外所有蛋白质都产生阳性结果。
第二种试验监测聚(MurNAc-GlcNAc)聚糖链的水解。于37℃，在10mMTris-马来酸盐(pH5.5)、10mM MgCl2和0.2％v/v Triton X-100中，将N-乙酰基-D-1-[3H]葡糖胺标记的纯化的链聚(MurNAc-GlcNAc)n>30与3μg 919L一起培育。煮沸5分钟终止反应，加入10μl 20％v/v磷酸将样品的pH调节至约3.5。如Harz等[Anal.Biochem.(1990)190：120-128]所述，在Nucleosil 300 C18柱上通过反相HPLC将底物与产物分开。在本试验中将大肠杆菌裂解性转糖基酶Mlt A作为阳性对照。无酶进行的试验作为阴性对照。
当用HPLC将无水双糖亚基从寡糖中分开时，用这种试验证明了919LOrf4水解分离的聚糖链的能力。
选择蛋白质919Lorf4用于动力学分析。在试验缓冲液中添加的0.2％v/vTriton X-100使919Lorf4的活性提高3.7倍。Triton X-100的存在对919未标记的活性没有影响。在范围为5.0-8.0的Tris-马来酸盐缓冲液中测定了pH对酶活性的影响。反应的最适pH为5.5。在18℃到42℃的温度范围中，在37℃观察到最大活性。在终浓度为10mM的各种离子的存在下进行反应，以测定各种离子对胞壁质水解酶活性的影响。发现存在Mg2+时活性最高，其刺激活性2.1倍。Mn2+和Ca2+还刺激酶活性至类似程度，而添加Ni2+和EDTA没有明显作用。相反，Fe2+和Zn2+显著抑制酶活性。
如Glauner[Anal.Biochem.(1988)172：451-464]所述，用反相HPLC分析由消化未标记的大肠杆菌胞壁质小囊得到的反应产物的结构。用由溶菌酶Cellosyl消化的胞壁质小囊来校准和标定Hypersil ODS柱。主要的反应产物是1，6-脱水双糖四和三肽，表明1，6-无水胞壁质酸(muraminic)分子内键的形成。
这些结果从实验角度表明，919是胞壁质水解酶，尤其是裂解性转糖基酶家族的成员。另外，922-His裂解胞壁质小囊的能力表明该蛋白质也是裂解性转糖基酶。
这种活性可有助于解释919在大肠杆菌内表达时的毒性作用。
为了消除酶促活性，使用合理的诱变。907、919和922显示对大肠杆菌的三种膜-结合的、脂化的胞壁质裂解性转糖基酶的相当低的同源性：
919(441aa)与大肠杆菌ML TA(P46885)为27.3％相同，超过440aa重叠；
922(369aa)与大肠杆菌ML TB(P41052)为38.7％相同，超过310aa重叠；和
907-2(207aa)与大肠杆菌MLTC(P52066)为26.8％相同，超过149aa重叠。
907-2还与大肠杆菌MLTD(P23913)和Slt70(P03810)具有同源性，它是一种位于周质间隙中的可溶性裂解性转糖基酶。在919、922和907-2之间没有测出明显的序列同源性，且在相应的MLTA、MLTB和MLTC蛋白质之间的情况也同样如此。
Slt70([1QTEA；1QTEB；Thunnissen等(1995)Biochemistry 34：12729-12737]和Slt35[1LTM；1QUS；1QUT；van Asselt等(1999)Structure Fold Des7：1167-80](40kDa MLTB的可溶形式)可有晶体结构。
已鉴定了Slt70和MLTB的催化残基一种(谷氨酸)。
对Slt70而言，诱变研究表明即使用谷氨酰胺保守性地替代催化Glu505也会导致酶活性的完全丧失。虽然Slt35与Slt70没有明显的序列相似性，但它们的催化区域却显示出令人惊讶的相似性。MLTB中相应的催化残基是Glu162。
另一个被认为在酶裂缝的正确折叠中起重要作用的残基是谷氨酸的保守良好的甘氨酸(Gly)下游。最近，Terrak等[Mol.Microbiol.(1999)34：350-64]提出存在另一种重要的残基，它是位于催化性谷氨酸约70-75残基下游的芳族氨基酸。
进行Slt70与907-2的序列对比和MLTB与922的序列对比，以鉴定MenB抗原中相应的催化性残基。
催化区域的两个序列对比报道如下：
907-2/Slt70：
922/MLTB
Figure C200310102845D00182
从这些对比得出907-2中相应的催化谷氨酸盐是Glu117，而922中为Glu164。这两种抗原都有下游甘氨酸(在酶裂缝(粗体)折叠中起结构作用)，922在约70aa下游(粗体)具有保守的芳族残基。
对蛋白质919而言，对大肠杆菌的同源MLTA没有3D结构，且对可能的催化性残基的了解为零。然而，通过与MLTA的序列对比，预计919中的三个氨基酸为催化残基：
919/MLTA
Figure C200310102845D00183
Figure C200310102845D00191
用符号
Figure C200310102845D00192
显示三个可能的催化残基：
1)Glu225(MLTA中的Asp)，其后为三个保守性甘氨酸(Gly263、Gly265和Gly272)和三个保守性芳族残基(位于约75-77残基下游)。这些下游残基以□显示。
2)Glu323(在MLTA中保守的)，其后为2个保守的甘氨酸(Gly347和Gly355)和两个保守的芳族氨基酸(位于84-85残基下游)(Tyr406或Phe407)。用◇显示这些下游残基。
3)Asp362(替代预计的Glu)，其后为一个甘氨酸(Gly369)和一个保守的芳族残基(Trp428)。用o显示这些下游残基。
WO00/66741中公开了919的多聚体形式的排序。
基于对催化残基的预测，已产生了919的三种突变体和907的一种突变体，各包含单个氨基取代。用基于PCR的SDM，以甘氨酸残基替代919蛋白质的255位和323位的谷氨酸、362位的天冬氨酸和907蛋白质的117位的谷氨酸。为了达到该目的，设计了包含从Glu或Asp变为Gly密码子的内部引物：
 
引物 序列 密码子变化
 
919-E255for919-E255rev CGAAGACCCCGTC<u>Ggt</u>CTTTTTTTTATGGTGCATAAAAAAAAGacCGACGGGGTCT GAA→Ggt
919-E323for919-E323rev AACGCCTCGCC<u>Ggt</u>GTTTTGGGTCATTTGACCCAAAACacCGGCGAGGCG GAA→Ggt
919-D362for919-D362rev TGCCGGCGCAGTC<u>Ggt</u>CGGCACTACATAATGTAGTGCCGacCGACTGCGCCG GAC→Ggt
907-E117for907-E117rev TGATTGAGGTG<u>Ggt</u>AGCGCGGTTCCGGGCGGAACGCGCTacCCACCTCAAT GAA→Ggt
有下划线的核苷酸密码是甘氨酸的，突变的核苷酸为小写字母。
为了产生919-E255、919-E323和919-E362突变体，用20ng pET-LOrf4DNA作为模板和以下的引物对进行PCR：
1)Orf4L正向/919-E255反向
2)919-E255正向/919L反向
3)Orf4L正向/919-E323反向
4)919-E323正向/919L反向
5)Orf4L正向/919-D362反向
6)919-D362正向/919L反向
用PCR1-2、3-4或5-6的产物作为模板和正向引物以及反向引物(“Orf4L正向”和“919L反向”)，进行第二轮PCR。
对于突变体907-E117，用200ng 2996菌株的染色体DNA作为模板和以下的引物对进行PCR：
7)907L正向/907-E117反向
8)907-E117正向/907L反向
用PCR7和8的产物作为模板和寡“907L正向”和“907L反向”作为引物，进行第二轮PCR。
用以下的标准方法加工包含各突变的PCR片段，用NdeI和XhoI限制酶消化并克隆入pET-21b+载体中。用序列分析验证各突变的存在情况。
类似地进行907中的Glu117向Gly的突变，以及922中的残基Glu164、Ser213和Asn348的突变。
919的E255G的突变体显示活性低降50％；E323G突变体显示活性降低70％；E362G突变体显示活性没有降低。
实施例4-多聚体形式
将287-GST、919未标记的和953-His进行凝胶过滤以分析四级结构或制备性目的。用FPLC Superose12(H/R10/30)或Superdex 75凝胶过滤柱(Pharmacia)计算天然蛋白质的分子量。用于287、919和953层析的缓冲液分别是50mMTris-HCl(pH8.0)、20mM Bicine(pH8.5)和50mM Bicine(pH8.0)。
另外，各缓冲液包含150-200mM NaCl和10％v/v甘油。用适合的缓冲液透析蛋白质并以200μl体积施用。以0.5-2.0ml/分钟的流速进行凝胶过滤，在280nm监测洗脱物。收集组分，用SDS-PAGE分析。用蓝色葡聚糖2000和分子量标准核糖核酸酶A、胰凝乳蛋白酶A卵清蛋白、白蛋白(Pharmacia)校准柱。由标准的Kav与log Mr的校准曲线计算样品的分子量。凝胶过滤之前，用凝血酶消化287-GST以切割GST组成成分。
287、919和953-His的估计分子量分别为73kDa、47kDa和43kDa。这些结果表明919是单体而287和953主要是天然二聚的。对953-His而言，在凝胶过滤的过程中观察到两个高峰。主峰(80％)代表953的二聚形式，而次峰(20％)则为单体预计的大小。发现953单体形式比二聚形式具有更大的杀菌活性。
实施例5-pSM214和pET-24b载体
由pET载体和pSM214表达了包含天然前导肽而无融合配体的953蛋白质[Velati Bellini等，(1991)J.Biotechnol.18，177-192]。
用大肠杆菌MM294-1菌株作为宿主，以全长基因将953序列克隆入pSM214中。为了实现此目的，用如下引物通过PCR扩增953基因的整个DNA序列(从ATG到终止密码子)：
953Lfor/2 CCGGAATTCTTATGAAAAAAATCATCTTCGCCGC    Eco RI
953L rev/2 GCCCAAGCTTTTATTGTTTGGCTGCCTCGATT     Hind III
其分别包含EcoRI和HindIII限制酶切位点。用EcoRI和HindIII消化扩增的片段，并将其与用这两种酶消化的pSM214载体接连。将连接的质粒转化入大肠杆菌MM294-1细胞中(通过37℃，在冰上培育65分钟)，并将细菌细胞涂布于包含20μg/ml氯霉素的LB琼脂上。
于37℃，在包含20μg/ml氯霉素的4ml LB肉汤中使重组菌落生长过夜；将细菌细胞离心，提取质粒DNA，并用EcoRI和HindIII限制进行分析。为了分析重组集落表达蛋白质的能力，将它们在包含20μg/ml氯霉素的LB肉汤中培育，并使它们在37℃生长16小时。离心细菌细胞，悬浮于PBS中。用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析蛋白质的表达。
pSM214质粒的表达水平出人意料的高。
用于将序列克隆入pSM-214载体中的寡(核苷酸)如下：
Figure C200310102845D00221
如对953L所述，操作、克隆和表达这些序列。
对pET-24载体而言，如以下对pET21所述，克隆这些序列并在pET-24中表达这些蛋白质。pET2具有与pET-21相同的序列，但其具有卡那霉素抗性盒替代氨苄青霉素盒。
用于将序列克隆入pET-24b中的寡核苷酸是：
Figure C200310102845D00231
*将该引物用作所有287形式的反向引物。
§与△G278 K反向引物联用的正向引物。
实施例6-ORF1及其前导肽
预计脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株MC58)的ORF1是用作外膜或分泌的蛋白质。其具有如下序列：
1   MKTTDKRTTE THRKAPKTGR IRFSPAYLAI CLSFGILPQA WAGHTYFGIN
51     YQYYRDFAEN KGKFAVGAKD IEVYNKKGEL VGKSMTKAPM IDFSVVSRNG
101    VAALVGDQYI VSVAHNGGYN NVDFGAEGRN PDQHRFTYKI VKRNNYKAGT
151    KGHPYGGDYH MPRLHKPVTD AEPVEMTSYM DGRKYIDQN  YPDRVRIGAG
201    RQYWRSDEDE PNNRESSYHI ASAYSWLVGG NTFAQNGSGG GTVNLGSEKI
251    KHSPYGFLPT GGSFGDSGSP MFIYDAQKQK WLINGVLQTG NPYIGKSNGF
301    QLVRKDWFYD EIFAGDTHSV FYEPRQNGKY SFNDDNNGTG KINAKHEHNS
351    LPNRLKTRTV QLFNVSLSET AREPVYHAAG GVNSYRPRLN NGENISFIDE
401    GKGELILTSN LNQGAGGLYF QGDFTVSPEN NETWQGAGVH ISKDSTVTWK
451    VNGVANDRLS KIGKGTLHVQ AKGENQGSIS VGDGTVILDQ QADDKGKKQA
501    FSEIGLVSGR GTVQLNADNQ FNPDKLYFGF RGGRLDLNGH SLSFHRIQNT
551    DEGAMIVNHN QDKESTVTIT GNKDIATTGN NNSLDSKKEI AYNGWFGEKD
601    TTKTNGRLNL VYQPAAEDRT LLLSGGTNLN GNITQTNGKL FFSGRPTPHA
651    YNHLNDHWSQ KEGIPRGEIV WDNDWINRTF KAENFQIKGG QAVVSRNVAK
701    VKGDWHLSNH AQAVFGVAPH QSHTICTRSD WTGLTNCVEK TITDDKVIAS
751    LTKTDISGNV DLADHAHLNL TGLATLNGNL SANGDTRYTV SHNATQNGNL
801    SLVGNAQATF NQATLNGNTS ASGNASFNLS DHAVQNGSLT LSGNAKANVS
851    HSALNNGNVSLADKAVFHFES SRFTGQISGG KDTALHLKDS EWTLPSGTEL
901    GNLNLDNATI TLNSAYRHDA AGAQTGSATD APRRRSRRS  RSLSVTPPT
951    SVESRFNTLT VNGKLNGQGT FRFMSELFGY RSDKLKLAES SEGTYTLAVN
1001   NTGNEPASLE QLTVVKGKLN KPLSENLNFT LQNEHVDAGA WRYQLIRKDG
1051   EFRLHNPVKE QELSDKLGKA EAKKQAEKDN AQSLDALIAA GRDAVEKTES
1101   VAEPARQAGG ENVGIMQAEE EKKRVQADKD TALAKQREAE TRPATTAFPR
1151   ARRARRDLPQ LQPQPQPQPQ RDLISRYANS GLSEFSATLN SVFAVQDELD
1201   RVFAEDRRNA VWTSGIRDTK HYRSQDFRAY RQQTDLRQIG MQKNLGSGRV
1251   GILFSHNRTE NTFDGIGNS  ARLAHGAVFG QYGIDRFYIG ISAGAGFSSG
1301   SLSDGIGGKI RRRVLHYGIQ ARYRAGFGGF GIEPHIGATR YFVQKADYRY
1351   ENVNIATPGL AFNRYRAGIK ADYSFKPAQH ISITPYLSLS YTDAASGKVR
1401   TRVNTAVLAQ DFGKTRSAEW GVNAEIKGFT LSHAAAAKG  PQLEAQHSAG
1451   IKLGYRW＊
前导肽是加下划线的。
WO99/55873公开了ORF1的多聚体形式。
已将三种表达策略用于ORF1：
1)使用His标记的ORF1，按照WO99/24578(ORF1-His)；
2)包含自身前导肽但无任何融合配体的ORF1(‘ORF1L′)；和
3)包含大肠杆菌OmpA的前导肽(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)的ORF1(‘Orf1LOmpA′)：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASAGHTYFGINYQYYRDFAENKGKFAVGAKDIEVYNKKGELVGKSMTKAPMIDFSV
VSRNGVAALVGDQYIVSVAHNGGYNNVDFGAEGRNPDQHRFTYKIVKRNNYKAGTKGHPYGGDYHMPRLHKFVTDAE
PVEMTSYMDGRKYIDQNNYPDRVRIGAGRQYWRSDEDEPNNRESSYHIASAYSWLVGGNTFAQNGSGGGTVNLGSEK
IKHSPYGFLPTGGSFGDSGSPMFIYDAQKQKWLINGVLQTGNPYIGKSNGFQLVRKDWFYDEIFAGDTHSVFYEPRQ
NGKYSFNDDNNGTGKINAKHEHNSLPNRLKTRTVQLFNVSLSETAREPVYHAAGGVNSYRPRLNNGENISFIDEGKG
ELILTSNINQGAGGLYFQGDFTVSPENNETWQGAGVHISESTVTWKVNGVANDRLSKIGKGTLHVQAKGENQGSIS
VGDGTVILDQQADDKGKKQAFSEIGLVSGRGTVQLNADNGFNPDKLYFGFRGGRLDLNGHSLSFHRIQNTDEGANIV
NHNQDKESTVTITGNKDIATTGNNNSLDSKKEIAYNGWFGEKDTTKTNGRLNLVYQPAAEDRTLLLSGGTNLNGNIT
QTNGKLFFSGRPTPHAYNHLNDHWSQKEGIPRGEIVWDNDWINRTFKAENFQIKGGQAVVSRNVAKVKGDWHLSNHA
QAVFGVAPHQSHTICTRSDWTGLTNCVEKTITDDKVIASLTKTDISGNVDLADHAHLNLTGLATLGNLSANGDTRY
TVSHNATQNGNLSLVGNAQATFNQATLNGNTSSGNASFNLSDHAVQNGSLTLSGNAKANVSHSALNGNVSLADKAV
FHFESSRFTGQISGGKDTALHLKDSEWTLPSGTELGNLNLDNATITTLNSAYRHDAAGAQTGSATDAPRRRSRRSRRS
LLSVTPPTSVESRFNTLTVNGKLNGQGTFRFMSELFGYRSDKKLAESSEGTYTLAVNNTGNEPASLEQLTVVEGKD
NKPLSENLNFTLQNEHVDAGAWRYQLIRKDGEFRLHNPVKEQELSDKLGKAEAKKQAEKDNAQSLDALIAAGRDAVE
KTESVAEPARQAGGENVGIMQAEEKKKRVQADKDTALAKQREAETRPATTAFPRARRARRDPQLQPQPQPQPQRDL
ISRYANSGLSEFSATLNSVFAVQDELDRVFAAEDRRNAVWTSGIRDTKHYRSQDFRAYRQQTDLRQIGMQKNLGSGRV
GILFSHNRTENTFDDGIGNSARLAHGAVFGQYGIDRFYIGISAGAGFSSGSLSDGIGGKIRRRVLHYGIQARYRAGF
GGFGIEPHIGATRYFVQKADYRYENVNIATPGLAFNRYRAGIKADYSFKPAQHISITPYLSSYTDAASGKVRTRVN
TAVLAQDFGKTRSAEWGVNAEIKGFTLSLHAAAAKGPQLEAQHSAGIKLGYRW＊
为了制备此构建物，用NheI和XhoI限制酶消化克隆pET911LOmpA(见如下)，并纯化相应于携带OmpA前导序列的载体的片段(pETLOmpA)。用寡核苷酸ORF1-正向和ORF1-反向(分别包括NheI和XhoI限制性酶切位点)扩增编码成熟蛋白质的ORF1基因，用NheI和XhoI消化并连接到纯化的pETOmpA片段(参见图1)。由NheI位点引入另一AS二肽。
该蛋白质的所有三种形式都被表达。可纯化His-标记的蛋白质，并确证其为表面外露的且可能分泌的(参见图3)。用这种蛋白质免疫接种小鼠，得到的血清在杀菌试验中有极佳的结果。
将ORF1LOmpA作为完整膜纯化，并固定于内膜和外膜。出人意料地，针对ORF1LOmpA产生的血清比那些针对His-标记的蛋白质产生的血清显示更好的ELISA和抗杀菌特性。
在其定位的地方将ORFI1作为外膜纯化。
实施例7-蛋白质911及其前导肽
脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株MC58)的蛋白质911具有如下序列：
1    MKKNILEFWV GLFVLIGAA AVAFLAFRVAG GAAFGGSDKT YAVYADFGDI
51   GGLKVNAPVK SAGVLVGRVG AIGLDPKSYQ ARVRLDLDGK YQFSSDVSAQ
101  ILTSGLLGEQ YIGLQQGGDT ENLAAGDTIS VTSSAMVLEN LIGKFMTSFA
151  EKNADGGNAE KAAE＊
前导肽是加下划线的。
将三种表达策略用于911：
1)包含其自身前导肽但无任何融合配体的911(‘911L′)；
2)包含大肠杆菌OmpA的前导肽的911(‘911LOmpA′)。
为了制备该构建物，在5′-引物中包括编码OmpA前导肽的完整序列作为尾(引物911OmpA正向)。在编码OmpA前导肽的序列和编码预计的成熟蛋白质的911基因之间插入NheI限制酶切位点(插入一个氨基酸，一个丝氨酸)，使该构建物用于克隆不同的基因下游OmpA前导肽序列。
3)包含胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)PelB的前导肽(MKYLLPTAAAGLLLAAQPAMA)的911(‘911LpelB)。
为了制备该构建物，将5′-端PCR引物设计为前导序列的下游，并包括NcoI限制酶切位点，从而使911直接融合于PelB前导序列；3′-端引物包括终止密码子。所用的表达载体是pET22b+(Novagen)，其携带编码PelB前导肽的序列。NcoI位点在PelB序列后引入另一甲硫氨酸。
表达该蛋白质的所有三种形式。用911L的ELISA滴定度最高，919LOmpA也有良好的结果。
实施例8-ORF46
脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株2996)的完整ORF46蛋白质具有如下序列：
1     LGISRKISLI LSILAVCLPM HAHASDLAND SFIRQVLDRQ HFEPDGKYHL
51    FGSRGELAER SGHIGLGKIQ SHQLQNLMIQ QAAIKGNIGY IVRFSDHGHE
101   VHSPFDNHAS HSDSDEAGSP VDGFSLYRIH WDGYEHHPAD GYDGPQGGGY
151   PAPKGARDIY SYDIKGVAQN IRLNLTDNRS TQRLADRPH  NAGSMLTQGV
201   GDGFKRATRY SPELDRSGNA AEFNGTADI  VKNIIGAAGE IVGAGDAVQG
251   ISEGSNIAVM HGLGLLSTEN KMARINDLAD MAQLKDYAAA AIRDWAVQNP
301   NAAQGIEAVS NIFMAAIPIK GIGAVRGKYG LGGITAHPIK RSQMGAIALP
351   KGKSAVSDNF ADAAYAKYPS PYHSRNIRSN LEQRYGKENI TSSTVPPSNG
401   KNVKLADQRH PKTGVPFDGK GFPNFEKHVK YDTKLDIQEL SGGQIPKAKP
451   VSDAKPRWEV DRKLNKLTTR EQVEKNVQEI RNGNKNSNFS QHAQLEREIN
501   KLKSADEINF ADGMGKFTDS MNDKAFSRLV KSVKENGFTN PVVEYVEING
551   KAYIVRGNNR VFAAEYLGRI HELKFKKVDF PVPNTSWKNP TDVLNESGNV
601   KRPRYRSK＊
前导肽是加下划线的。
在WO00/66741中发现有其它菌株的ORF46序列。
已将三种表达策略用于ORF46：
1)包含自身前导肽但无任何融合配体的ORF46(‘ORF46-2L′)；
2)不含自身前导肽且无任何融合配体的ORF46(‘ORF46-2′)，通过从预计的前导序列设计5′-端扩增引物下游除去前导肽：
1   SDLANDSFIR QVLDRQHFEP DGKYHLFGSR GELAERSGHI GLGKIQSHQL
51  GNLMIQQAAI KGNIGYIVRF SDHGHEVHSP FDNHASHSDS DEAGSPVDGF
101 SLYRIHWDGY EHHPADGYDG PQGGGYPAPK GARDIYSYDI KGVAQNIRLN
151 LTDNRSTGQR LADRFHNAGS MLTQGVGDGF KRATRYSPEL DRSGNAAEAF
201 NGTADIVKNI IGAAGEIVGA GDAVQGISEG SNIAVMHGLG LLSTENKMAR
251 INDLADMAQL KDYAAAAIRD WAVQNPNAAQ GIEAVSNIFM AAIPIKGIGA
301 VRGKYGLGGI TAHPIKRSQM GAIALPKGKS AVSDNFADAA YAKYPSPYHS
351 RNIRSNLEQR YGKENITSST VPPSNGKNVK LADQRHPKTG VPFDGKGFPN
401 FEKHVKYDTK LDIQELSGGG IPKAKPVSDA KPRWEVDRKL NKLTTREQVE
451 ENVQEIRNGN KNSNFSQHAQ LERRINKLKS ADEINFADGM GKFTDSMNDK
501 AFSRLVKSVK ENGFTNPVVE YVEINKGKAYIVRGNNRVFAA EYLGRIHELK
551 FKKVDFPVPN TSWKNPTDVL NESGNVKRPR YRSK＊
3)作为一种截短的蛋白质的ORF46，由前433氨基酸构成(‘ORF461L′)，通过设计PCR引物以扩增相应于aa1-433的部分序列构建。
在3′-端引物序列中包括终止密码子。
对大肠杆菌，ORF46-2L以很低的水平表达。除去它的前导肽(ORF46-2)也不能解决这个问题。然而，截短的ORF46.1L形式(前433个氨基酸，在血清群和品种中很好保守的)能很好地表达，且在ELISA和杀菌试验中得到极佳的结果。
也将ORF46.1用作杂交蛋白的基础。将其与287、919和ORF1融合。通常杂交蛋白是不溶的，但能得到一些良好的ELISA和杀菌(针对同源2996菌株)结果。
 
蛋白质 ELISA 杀菌Ab
Orf1-Orf46.1-His 850 256
919-Orf46.1-His 12900 512
919-287-Orf46-His n.d. n.d.
Orf46.1-287His 150 8192
Orf46.1-919His 2800 2048
Orf46.1-287-919His 3200 16384
为了比较，构建ORF46.1、287(作为GST融合或以△G287形式)的‘三′杂交体，针对各种菌株(包括同源2996菌株)与三种抗原的简单混合物测试。FCA用作佐剂：
 
2996 BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133
混合物 8192 256 512 1024 >2048 >2048
ORF46.1-287-919his 16384 256 4096 8192 8192 8192
ΔG287-919-ORF46.1his 8192 64 4096 8192 8192 16384
ΔG287-ORF46.1-919his 4096 128 256 8192 512 1024
另外，杂交体显示相等的或更佳的免疫活性。
针对各种异源菌株，将两种蛋白质(菌株2996)的杂交体与单种蛋白质进行比较：
 
1000 MC58 F6124(MenA)
ORF46.1-His <4 4096 <4
ORF1-His 8 256 128
ORF1—ORF46.1-His 1024 512 1024
杂交体再一次显示相等的或更佳的免疫活性。
实施例9-蛋白质961
脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株MC58)的完整961蛋白质具有如下序列：
1     MSMKHFPAKV LTTAILATFC SGALAATSDD DVKKAATVAI VAAYNNGQEI
51    NGFKAGETIY DIGEDGTITQ KDATAADVEA DDFKGLGLKK VVTNLTKTVN
101   ENKQNVDAKV KAAESEIEKL TTKLADTDAA IADTDAALDE TTNALNKLGE
151   NITTFAEETK TNIVKIDEKL EAVADTVDKH AEAFNDIADS LDETNTKADE
201   AVKTANEAKQ TAEETKQNVD AKVKAAETAA GKAEAAAGTA NTAADKAEAV
251   AAKVTDIKAD IATNKADIAK NSARIDSLDK NVANLRKETR QGLAEQAALS
301   GLFQPYNVGR FNVTAAVGGY KSESAVAIGT GFRFTENFAA KAGVAVGTSS
351   GSSAAYHVGV NYEW＊
前导肽是加下划线的。
对961的表达采用如下三种方法：
1)使用GST融合体的961，按照WO99/57280(‘GST961′)；
2)包含其自身前导肽但无融合配体的961(‘961L′)；和
3)无自身前导肽且不含任何融合配体的961(‘961未标记的′)，通过设计从预计的前导序列的5′-端PCR引物下游除去前导肽。
该蛋白质的所有三种形式都被表达。可以纯化GST-融合蛋白，其抗体表明961是表面外露的(图4)。用该蛋白质免疫接种小鼠，得到的血清在杀菌试验中有极佳的结果。也可纯化961L，它产生非常高的ELISA滴定度。
蛋白质961似乎是为相变量。另外，在脑膜炎奈瑟球菌的所有菌株中都没有它。
实施例10-蛋白质287
脑膜炎奈瑟球菌(血清群B，菌株2996)的蛋白质287具有如下序列：
1     MFERSVIAMA CIFALSACGG GGGGSPDVKS ADTLSKPAAP VVAEKETEVK
51    EDAPQAGSQG QGAPSTQGSQ DMAAVSAENT GNGGAATTDK PKNEDEGPQN
101   DMPQNSAESA NQTGNNQPAD SSDSAPASNP APANGGSNFG RVDLANGVLI
151   DGPSQNITTLT HCKGDSCNGD NLLDEEAPSK SEFENLNESE RIEKYKKDGK
201   SDKFTNLVAT AVQANGTNKY VIIYKDKSAS SSSARFRRSA RSRRSLPAEM
251   PLIPVNQADT LIVDGEAVSL TGHSGNIFAP EGNYRYLTYG AEKLPGGSYA
301   LRVQGEPAKG EMLAGTAVYN GEVLHFHTEN GRPYPTRGRF AAKVDFGSKS
351   VDGIIDSGDD LHMGTQKFKA AIDGNGFKGT WTENGGGDVS GRFYGPAGEE
401   VAGKYSYRPT DAEKGGFGVF AGKKEQD＊
前导肽是加下划线显示的。
在WO00/66741的图5和15中可以发现其它菌株的287序列。
WO99/57280的实施例9公开了在大肠杆菌中作为GST-融合蛋白的287的表达。
已使用许多其它方法在大肠杆菌中表达287，包括：
1)作为His-标记的融合蛋白的287(‘287-His′)；
2)包含其自身前导肽但无任何融合配体的287(‘287L′)；
3)包含ORF4前导肽且无任何融合配体的287(‘287LOrf4′)；和
4)不含其自身前导肽且无任何融合配体的287(‘287未标记的′)：
1     CGGGGGGSPD VKSADTLSKP AAPVVAEKET EVKEDAPQAG SQGQGAPSTQ
51    GSQDMAAVSA ENTGNGGAAT TDKPENDEG  PQNDMPQNSA ESANQTGNNQ
101   PADSSDSAPA SNPAPANGGS NFGRVDLANG VLIDGPSQNI TLTHCKGDSC
151   NGDNLLDEEA PSKSEFENLN ESERIEKYKK DGKSDKFTNL VATAVQANGT
201   NKYVIIYKDK SASSSSARFR RSARSRRSLP AEMPLIPVNQ ADTLIVDGEA
251   VSLTGHSGNI FAPEGNYRYL TYGAEKLPGG SYALRVQGEP AKGEMLAGTA
301   VYNGEVLHFH TENGRPYPTR GRFAAKVDFG SKSVDGIIDS GDDLHMGTQK
351   FKAAIDGNGF KGTWTENGGG DVSGRFYGPA GEEVAGKYSY RPTDAEKGGF
401   GVFAGKKEQD ＊
所有这些蛋白质都被表达和纯化。
证明‘287L′和‘287LOrf4′是脂蛋白。
如图2所示，通过用NheI和XhoI消化919LOrf4构建‘287LOrf4′。在5′-端引物(287LOrf正向)(融合于287编码序列)添加编码遗漏氨基酸的DNA序列(作为尾)，恢复完整的ORF4前导肽。用寡核苷酸287LOrf4正向和反向(分别包含NheI和XhoI位点)扩增编码成熟蛋白质的287基因，用NheI和XhoI消化并连接于纯化的pETOrf4片段。
实施例11-包含/不含天然前导肽的其它非融合蛋白质
一种类似的方法适用于大肠杆菌表达WO99/24578、WO99/36544和WO99/57280的其它蛋白质。
以下是未用融合配体表达的：008、105、117-1、121-1、122-1、128-1、148、216、243、308、593、652、726、982和Orf143-1。FACS表明蛋白质117-1是表面外露的，且产生高ELISA滴定度。
以下是由天然前导肽但无融合配体表达的：111、149、206、225-1、235、247-1、274、283、286、292、401、406、502-1、503、519-1、525-1、552、556、557、570、576-1、580、583、664、759、907、913、920-1、926、936-1、953、961、983、989、Orf4、Orf7-1、Orf9-1、Orf23、Orf25、Orf37、Orf38、Orf40、Orf40.1、Orf40.2、Orf72-1、Orf76-1、Orf85-2、Orf91、Orf97-1、Orf119、Orf143.1。这些蛋白质都有后缀‘L′。
用或不用其前导肽表达His标记的蛋白质760。信号肽的缺失大大地增加了表达水平。使用2M尿素(用于增溶)最易纯化该蛋白质。
用其自身的信号肽能很好地表达His-标记的蛋白质264，且30kDa蛋白质得到阳性Western印迹结果。
所有蛋白质都成功地表达。
验证了593、121-1、128-1、593、726和982在细胞质中的定位。
验证了920-1L、953L、ORF9-1L、ORF85-2L、ORF97-1L、570L、580L和664L在周质中的定位。
验证了ORF40L在外膜中的定位，和008和519-1L在内膜中的定位。验证了ORF25L、ORF4L、406L、576-1L都是在膜中定位的。
发现蛋白质206不是脂蛋白。
用其天然前导肽但无融合配体表达的ORF25和ORF40，以及未用其天然前导肽和融合配体表达的蛋白质593，都产生良好的抗杀菌血清。令人惊讶地，未用融合配体而使用其前导肽(即‘ORF25L′和‘ORF40L′)表达的ORF25和ORF40形式比融合蛋白在杀菌试验中产生更好的结果。
将蛋白质920L和953L进行N-未端测序，结果分别为HRVWVETAH和ATYKVDEYHANARFAF。此测序结果表明切除了预计的前导肽，且当与周质定位联合时表明：当由它们的天然前导肽表达时，大肠杆菌正确地加工和定位这些蛋白质。
定位于内膜的蛋白质519.1L的N-未端序列是MEFFIILLA，表明未切除前导序列。因此，它可作为未切割的前导序列和跨膜锚(以与淋病奈瑟球菌的PBP1的前导肽类似的方式)[Ropp & Nicholas(1997)J.Bact.179：2783-2787.]。事实上，N-未端区域表现出强疏水性，且由Tmpred.程序预计为跨膜的。
实施例12-脂蛋白
用Kraft等[J.Bact.(1998)180：3441-3447.]的方法验证重组脂蛋白中棕榈酸盐的掺入。于37℃，在20ml LB/Amp(100μg/ml)的液体培养基中使携带感兴趣质粒的单集落生长过夜。在5.0ml含有5μC/ml[3H]棕榈酸盐(Amersham)的新鲜培养基LB/Amp培养基中，将培养物稀释至OD550为0.1。当培养物的OD550达到0.4-0.8时，用IPTG(终浓度为1.0mM)诱导重组脂蛋白1小时。用台式离心机以2700g离心15分钟收获细菌，用1.0ml冷PBS洗涤2次。将细胞悬浮于120μl20mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、1.0％w/v SDS中，并煮沸10分钟裂解。以13000g离心10分钟后，收集上清液，加入1.2ml冷丙酮沉淀蛋白质，在-20℃静置1小时。以13000g离心10分钟沉淀蛋白质，重悬浮于20-50μl(以培养物终O.D值校准负载量计算的)1.0％w/v SDS。将15μl等份与5μlSDS-PAGE样品缓冲液煮沸，用SDS-PAGE分析。电泳凝胶在10％v/v乙酸中固定1小时后，在扩增溶液(Amersham)中浸泡30分钟。加热真空干燥凝胶，-80℃暴露在Hyperfilm(Kodak)中过夜。
在以下蛋白质中发现[3H]棕榈酸盐标记的掺入(表明脂化)：Orf4L、Orf25L、287L、287LOrf4、406L、576L、926L、919L和919LOrf4。
实施例13-287中的结构域
根据287中不同的结构域与隶属不同功能类别的蛋白质的同源性，如图5所示将其分为3个“结构域”。第二个结构显示与IgA蛋白酶同源，第三结构域显示与结合转铁蛋白的蛋白质同源。
在脑膜炎奈瑟球菌之间这三个“结构域”各表现出不同程度的序列保守性-结构域C为98％相同，结构域A为83％相同，而结构域B仅为71％相同。注意到菌株MC58中的蛋白质287比菌株2996的长61个氨基酸。图7显示了这两个序列的序列对比，WO00/66741(图5和15)公开了各种菌株的序列对比。
将这三个结构域分别表达成C-未端His-标记的蛋白质。用以下构建物对MC58和2996菌株进行处理：
287a-MC58(aa1-202)，287b-MC58(aa203-288)，287c-MC58(aa311-488)。
287a-2996(aa1-139)，287b-2996(aa140-225)，287c-2996(aa250-427)。
为了制备这些构建物，除去3′-端引物序列中的终止密码子序列。5′引物包括NheI限制酶切位点，3′引物包括作为尾部的XhoI，从而用NdeI-XhoI、NheI-XhoI或NdeI-HindIII限制酶切位点指导将各扩增片段克隆入表达载体pET21b+中。
所有六种构建物都可以表达，但287b-MC8需要变性和重折叠以增溶。
以下描述了结构域A的缺失(‘△4 287-His′)。
用菌株2996的各种结构域还获得了针对同源和异源MenB菌株以及MenA(F6124菌株)和MenC(BZ133菌株)的免疫学数据(血清杀菌试验)：
 
2996 BZ232 MC58 NGH38 394/98 MenA MenC
287-His 32000 16 4096 4096 512 8000 16000
287(B)-His 256 - - - - 16 -
287(C)-His 256 - 32 512 32 2048 >2048
287(B-C)-His 64000 128 4096 64000 1024 64000 32000
用菌株MC58的结构域获得以下结果：
 
MC58 2996 BZ232 NGH38 394/98 MenA MenC
287-His 4096 32000 16 4096 512 8000 16000
287(B)-His 128 128 - - - - 128
287(C)-His - 16 - 1024 - 512 -
287(B-C)-His 16000 64000 128 64000 512 64000 >8000
实施例14-287中的缺失
与表达单一结构域一样，通过在第一结构域中的渐进缺失还表达了287(以C-未端His-标记的蛋白质)。使用菌株2996的蛋白质287的四缺失突变体(图6)：
1)‘287-His′，由氨基酸18-427构成(即缺失前导肽)；
2)‘△1 287-His′，由氨基酸26-427构成；
3)‘△2 287-His′，由氨基酸70-427构成；
4)‘△3 287-His′，由氨基酸107-427构成；和
5)‘△4 287-His′，由氨基酸140-427构成(＝287-bc)。
还为菌株MC58制备了‘△4′蛋白质(‘△4 287MC58-His′，aa203-488)。
如上所述，用与287a/b/c相同的方法制备这些构建物。
可以表达所有六种构建物，并可纯化蛋白质。然而287-His的表达很差。
当除去C-未端His-标记物时，表达也很高。
用缺失突变体也获得了针对同源(2996)和异源MenB菌株以及MenA(F6124菌株)和MenC(BZ133菌株)的免疫学数据(血清杀菌试验)：
 
2996 BZ232 MC58 NGH38 394/98 MenA MenC
287-his 32000 16 4096 4096 512 8000 16000
Δ1 287-His 16000 128 4096 4096 1024 8000 16000
Δ2 287-His 16000 128 4096 >2048 512 16000 >8000
Δ3 287-His 16000 128 4096 >2048 512 16000 >8000
Δ4 287-His 64000 128 4096 64000 1024 64000 32000
用菌株MC58的序列观察到△4缺失的相同高的活性。同样显示极佳的表达特性，因此突变体是免疫学相等的或更佳的。
实施例15-聚甘氨酸缺失
前实施例的‘△1 287-His′构建物与287-His和′287未标记的′的不同仅在于短的N-未端缺失(GGGGGGS)。然而使用一种以Nhe克隆位点中存在的密码子替代缺失的丝氨酸的表达载体，缺失仅为(Gly)6。因此，该(Gly)6序列的缺失显示对蛋白质表达有明显影响。
将缺失多达GGGGGG的N-未端氨基酸的蛋白质称为‘△G 287′。在菌株MC58中，其序列(前导序列加下划线)为：
           
Figure C200310102845D00331
ΔG287
1     MFKRSVIAMA CIFALSACGG GGGGSPDVKS ADTLSKPAAP VVSEKETEAK
51    EDAPQAGSQG QGAPSAQGSQ DMAAVSEENT GNGGAVTADN PKNRDEVAQN
101   DMPQNAAGTD SSTPNHTPDP NMLAGNMENQ ATDAGESSQP ANQPDMANAA
151   DGMQGDDPSA GGQNAGNTAA QGANQAGNNQ AAGSSDPIPA SNPAPANGGS
201   NFGRVDLANG VLIDGPSQNI TLTHCKGDSC SGNNFLDEEV QLKSEFEKLS
251   DADKISNYKK DGKNDKFVGL VADSVQMKGI NQYIIFYKPK PTSFARFRRS
301   ARSRRSLPAE MPLIPVNQAD TLIVDGEAVS LTGHSGNIFA PEGNYRYLTY
351   GAEKLPGGSY ALRVQGEPAK GEMLAGAAVY NGEVLHFHTE NGRPYPTRGR
401   FAAKVDFGSK SVDGIIDSGD DLHMGTGKFK AAIDGNGFKG TWTENGSGDV
451   SGKFYGPAGE EVAGKYSYRP TDAEKGGFGV FAGKKKEQD＊
与′287-His′或‘287未标记的′相比，有或无His-标记的△G287(分别为‘△287-His′和′△G287K′)以非常好的水平表达。
以基因变异性数据为基础，许多MenB菌株(尤其是菌株2996、MC58、1000和BZ232)的△G287-His的变体在大肠杆菌中表达。结果也非常好。
假设聚-Gly缺失可能是一种改进表达的常规策略。因此鉴定了含有类似(Gly)n基序(接近N-未端，丝氨酸的下游)的其它MenB脂蛋白，称为Tbp2(NMB0460)、741(NMB1870)和983(NMB1969)：
TBP2                                 
Figure C200310102845D00341
ΔGTbp2
1     MNNPLVNQAA MVLPVFLLSA CLGGGGSFDL DSVDTEAPRP APKYQDVFSE
51    KPQAQKDQGG YGFAMRLKRR NWYPQAKEDE VKLDESDWEA TGLPDEPKEL
101   PKRQKSVIEK VETDSDNNIY SSPYLKPSNH QNGNTGNGIN QPKNQAKDYE
151   NFKYVYSGWF YKHAKREFNL KVEPKSAKNG DDGYIFYHGK EPSRQLPASG
201   KITYKGVWHF ATDTKKGQKF REIIQPSKSQ GDRYSGFSGD DGEEYSNKNK
251   STLTDGQEGY GFTSNLEVDF HNKKLTGKLI RNNANTDNNQ ATTTQYYSLE
301   AQVTGNRFNG KATATDKPQQ NSETKEHPFV SDSSSLSGGF FGPQGEKLGF
351   RFLSDDQKVA VVGSAKTKDK PANGNTAAAS GGTDAAASNG AAGTSSENGK
401   LTTVLDAVEL KLGDKEVQKL DNFSNAAQLV VDGIMIPLLP EASESGNNQA
451   NQGTNGGTAF TRKFDHTPES DKKDAQAGTQ TNGAQTASNT AGDTNGKTKT
501   YEVEVCCSNL NYLKYGMLTR KNSKSAMQAG ESSSQADAKT EQVEQSMFLQ
551   GERTDEKEIP SEQNIVYRGS WYGYIANDKS TSWSGNASNA TSGNRAEFTV
601   NFADKKITGT LTADNRQEAT FTIDGNIKDN GFEGTAKTAE SGFDLDQSNT
651   TRTPKAYITD AKVQGGFYGP KAEELGGWFA YPGDKQTKNA TNASGNSSAT
701   VVFGAKRQQP VR*
741                                   
Figure C200310102845D00342
 ΔG741
1     VNRTAFCCLS LTTALILTAC SSGGGGVAAD IGAGLADALT APLDHKDKGL
51    QSLTLDQSVR KNKKLKLAAQ GAEKTYGNGD SLNTGKLKND KVSRFDFIRQ
101   IEVDGQLITL ESGEFQVYKQ SHSALTAFQT EQIQDSEHSG LMVAKRQFRI
151   GDIAGEHTSF DKLPEGGRAT YRGTAFGSDD AGGKLTYTID FAAKQGNGKI
201   EHLKSPELNV DLAAADIKPD GKRHAVISGS VLYNQAEKGS YSLGIFGGKA
251   QEVAGSAKVK TVNGIRHIGL AAKQ＊
983                                             ΔG983
1     MRTTPTFPTK TFKPTAMALA VATTLSACLG GGGGGTSAPD FNAGGTGIGS
51    NSRATTAKSA AVSYAGIKNE MCKDRSMLCA GRDDVAVTDR DAKINAPPPN
101   LHTGDFPNPN DAYKNLINLK PAIEAGYTGR GVEVGIVDTG ESVGSISFPE
151   LYGRKEHGYN ENYKNYTAYM RKEAPEDGGG KDIEASFDDE AVIETEAKPT
201   DIRHVKEIGH IDLVSHIIGG RSVDGRPAGG IAPDATLHIM NTNDETKNEM
251   MVAAIRNAWV KLGERGVRIV NNSFGTTSRA GTADLFQIAN SEEQYRQALL
301   DYSGGDKTDE GIRIMQQSDY GNLSYHIRNK NMLFIFSTGN DAQAQPNTYA
351   LLPFYEKDAQ KGIITVAGVD RSGEKFKREM YGEPGTEPLE YGSNHCGITA
401   MWCLSAPYEA SVRFTRTNPI QIAGTSFSAP IVTGTAALLL QKYPWMSNDN
451   LRTTLLTTAQ DIGAVGVDSK FGWGLLDAGK AMNGPASFPF GDFTADTKGT
501   SDIAYSFRND ISGTGGLIKK GGSQLQLHGN NTYTGKTIIE GGSLVLYGNN
551   KSDMRVETKG ALIYNGAASG GSLNSDGIVY LADTDQSGAN ETVHIKGSLQ
601   LDGKGTLYTR LGKLLKVDGT AIIGGKLYMS ARGKGAGYLN STGRRVPFLS
651   AAKIGQDYSF FTNIETDGGL LASLDSVEKT AGSEGDTLSY YVRRGNAART
701   ASAAAHSAPA GLKHAVEQGG SNLENLMVEL DASESSATPE TVETAAADRT
751   DMPGIRPYGA TFRAAAAVQH ANAADGVRIF NSLAATVYAD STAAHADMQG
801   RRLKAVSDGL DHNGTGLRVI AQTQQDGGTW EQGGVEGKMR GSTQTVGIAA
851   KTGENTTAAA TLGMGRSTWS ENSANAKTDS ISLFAGIRHD AGDIGYLKGL
901   FSYGRYKNSI SRSTGADEHA EGSVNGTLMQ LGALGGVNVP FAATGDLTVE
951   GGLRYDLLKQ DAFAEKGSAL GWSGNSLTEG TLVGLAGLKL SQPLSDKAVL
1001  FATAGVERDL NGRDYTVTGG FTGATAATGK TGARNMPHTR LVAGLGAADVE
1051  FGNGWNGLAR YSYAGSKQYG NHSGRVGVGY RF＊
Tbp2和741基因本源于菌株MC58；983和287基因来源于菌株2996。将它们克隆入pET载体中，并在大肠杆菌中表达而无编码它们前导肽的序列或以‘△G形式′(都融合于C-端His-标记)。在这每种情况中，发现相同的作用-在携带聚-甘氨酸段缺失的克隆中很好表达，如果在表达的蛋白质中存在甘氨酸则表达很差或不表达：
Figure C200310102845D00351
图13显示了蛋白质的SDS-PAGE。
△G287和杂交体
制备和纯化菌株MC58、1000和BZ232的△G287蛋白质。它们都产生高ELISA滴定度，且血清杀菌滴定度>8192。由pET-24b表达的△G287K在ELISA和血清杀菌试验中的滴定度极佳。也可在pET-24b中表达△G287-ORF46.1K。
还将△G287直接融合于919、953、961和ORF46.1的符合读框的上游(如下显示的序列)：
ΔG287-919
1    ATGGCTAGCC CCGATGTTAA ATCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCGGCCGC
51   TCCTGTTGTT GCTGAAAAAG AGACAGAGGT AAAAGAAGAT GCGCCACAGG
101  CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCA CACAAGGCAG CCAAGATATG
151  GCGGCAGTTT CGGCAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAACAACGGA
201  CAAACCCAAA AATGAAGACG AGGGACCGCA AAATGTTATG CCGCAAAATT
251  CCGCCGAATC CGCAAATCAA ACAGGGAACA ACCAACCCGC CGATTCTTCA
301  GATTCCGCCC CCGCGTCAAA CCCTGCACCT GCGAATGGCG GTAGCAATTT
351  TGGAAGGGTT GATTTGGCTA ATGGCGTTTT GATTGATGGG CCGTCGCAAA
401  ATATAACGTT GACCCACTGT AAAGGCGATT CTTGTAATGG TGATAATTTA
451  TTGGATGAAG AAGCACCGTC AAAATCAGAA TTTGAAAATT TAAATGAGTC
501  TGAACGAATT GAGAAATATA AGAAAGATGG GAAAAGCGAT AAATTTACTA
551  ATTTGGTTGC GACAGCAGTT CAAGCTAATG GAACTAACAA ATATGTCATC
601  ATTTATAAAG ACAAGTCCGC TTCATCTTCA TCTGCGCGAT TCAGGCGTTC
651  TGCACGGTCG AGGAGGTCGC TTCCTGCCGA GATGCCGCTA ATCCCCGTCA
701  ATCAGGCGGA TACGCTGATT GTCGATGGGG AAGCGGTCAG CCTGACGGGG
751  CATTCCGGCA ATATCTTCGC GCCCGAAGGG AATTACCGGT ATCTGACTTA
801  CGGGGCGGAA AAATTGCCCG GCGGATCGTA TGCCCTCCGT GTGCAAGGCG
851  AACCGGCAAA AGGCGAAAG  CTTGCTGGCA CGGCCGTGTA CAACGGCGAA
901  GTGCTGCATT TTCATACGGA AAACGGCCGT CCGTACCCGA CTAGAGGCAG
951  GTTTGCCGCA AAAGTCGATT TCGGCAGCAA ATCTGTGGAC GGCATTATCG
1001 ACAGCGGCGA TGATTTGCAT ATGGGTACGC AAAAATTCAA AGCCGCCATC
1051  GATGGAAACG GCTTTAAGGG GACTTGGACG GAAAATGGCG GCGGGGATGT
1101  TTCCGGAAGG TTTTACGGCC CGGCCGGCGA GGAAGTGGCG GGAAAATACA
1151  GCTATCGCCC GACAGATGCG GAAAAGGGCG GATTCGGCGT GTTTGCCGGC
1201  AAAAAAGAGC AGGATGGATC CGGAGGAGGA GGATGCCAAA GCAAGAGCAT
1251  CCAAACCTTT CCGCAACCCG ACACATCCGT CATCAACGGC CCGGACCGGC
1301  CGGTCGGCAT CCCCGACCCC GCCGGAACGA CGGTCGGCGG CGGCGGGGCC
1351  GTCTATACCG TTGTACCGCA CCTGTCCCTG CCCCACTGGG CGGCGCAGGA
1401  TTTCGCCAAA AGCCTGCAAT CCTTCCGCCT CGGCTGCGCC AATTTGAAAA
1451  ACCGCCAAGG CTGGCAGGAT GTGTGCGCCC AAGCCTTTCA AACCCCCGTC
1501  CATTCCTTTC AGGCAAAACA GTTTTTTGAA CGCTATTTCA CGCCGTGGCA
1551  GGTTGCAGGC AACGGAAGCC TTGCCGGTAC GGTTACCGGC TATTACGAGC
1601  CGGTGCTGAA GGGCGACGAC AGGCGGACGG CACAAGCCCG CTTCCCGATT
1651  TACGGTATTC CCGACGATTT TATCTCCGTC CCCCTGCCTG CCGGTTTGCG
1701  GAGCGGAAAA GCCCTTGTCC GCATCAGGCA GACGGGAAAA AACAGCGGCA
1751  CAATCGACAA TACCGGCGGC ACACATACCG CCGACTCTC  CCGATTCCCC
1801  ATCACCGCGC GCACAACGGC AATCAAAGGC AGGTTTGAAG GAAGCCGCTT
1851  CCTCCCCTAC CACACGCGCA ACCAAATCAA CGGCGGCGCG CTTGACGGCA
1901  AAGCCCCGAT ACTCGGTTAC GCCGAAGACC CCGTCGAACT TTTTTTTATG
1951  CACATCCAAG GCTCGGGCCG TCTGAAAACC CCGTCCGGCA AATACATCCG
2001  CATCGGCTAT GCCGACAAAA ACGAACATCC CTACGTTTCC ATCGGACGCT
2051  ATATGGCGGA CAAAGGCTAC CTCAAGCTCG GGCAGACCTC GATGCAGGGC
2101  ATCAAAGCCT ATATGCGGCA AAATCCGCAA CGCCTCGCCG AAGTTTTGGG
2151  TCAAAACCCC AGCTATATCT TTTTCCGCGA GCTTGCCGGA AGCAGCAATG
2201  ACGGTCCCGT CGGCGCACT  GGCACGCCGT TGATGGGGGA ATATGCCGGC
2251  GCAGTCGACC GGCACTACAT TACCTTGGGC GCGCCCTTAT TTGTCGCCAC
2301  CGCCCATCCG GTTACCCGCA AAGCCCTCAA CCGCCTGATT ATGGCGCAGG
2351  ATACCGGCAG CGCGATTAAA GGCGCGGTGC GCGTGGATTA TTTTTGGGGA
2401  TACGGCGACG AAGCCGGCGA ACTTGCCGGC AAACAGAAAA CCACGGGTTA
2451  CGTCTGGCAG CTCCTACCCA ACGGTATGAA GCCCGAATAC CGCCCGTAAC
2501  TCGAG
1     MASPDVKSAD TLSKPAAPVV AEKETEVKED APQAGSQGQG APSTQGSQDM
51    AAVSAENTGN GGAATTDKPK NEDEGPQNDM PQNSAESANQ TGNNQPADSS
101   DSAPASNPAP ANGGSNFGRV DLANGVLIDG PSQNITLTEC KGDSCNGDNL
151   LDEEAPEKSE FENLNESERI EKYKKDGKSD KFTNLVATAV QANGTNKYVI
201   IYKDKSASSS SARFRRSARS RRSLPAEMPL IPVNQADTLI VDQEAVSLTG
251   HSGNIFAPEG NYRYLTYGAE KLPGGSYALR VQGEPAKGEM LAGTAVYNGE
301   VLHFHTENGR PYPTRGRFAA KVDFGSKSVD GIIDSGDDLH MGTQKFKAAI
351   DGNGFKGTT  KNGGGDVSGR FYGPAGEEVA GKYSYRPTDA EKGGFGVFAG
401   KKEQDGSGGG GCQSKSIQTF PQPDTSVING PDRPVGIPDP AGTTVGGGGA
451   VYTVVPHLSL PHWAAQDFAK SLQSFRIGCA NLKNRQGWQD VCAQAFQTPV
501   HSFQAKQFFE RYFTPWQVAG NGSLAGTVTG YYEPVLKGDD RRTAQARFPI
551   YGIPDDFISV PLPAGLRSGK ALVRIRQTGK NSGTIDNTGG THTADLSRFP
601   ITARTTAIKG RFEGSRFLPY HTRNQINGGA LDGKAPILGY AEDPVELFFM
651   HIQGSGRLKT PSGKYIRIGY ADKNEHPYVS IGRYMADKGY LKLGQTSMQG
701   IKAYMRQNPQ RLAEVLGQNP SYIFFRELAG SSNDGPVGAL GTPLMGEYAG
751   AVDRHYITLG APLFVATAHP VTRKALNRLI MAQDTGSAIK GAVRVDYFWG
801   YGDEAGELAG KQKTTGYVWQ LLPNGMKPEY RP＊
ΔG287-953
1    ATGGCTAGCC CCGATGTTAA ATCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCGGCCGC
51   TCCTGTTGTT GCTGAAAAAG AGACAGAGGT AAAAGNAGAT GCGCCACAGG
101  CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCA CACAAGGCAG CCAAGATATG
151  GCGGCAGTTT CGGCAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAACAACGGA
201  CAAACCCAA  AATGAAGACG AGGGACCGCA AAATGATATG CCGCAAAATT
251  CCGCCGAATC CGCAAATCAA ACAGGGAACA ACCAACCCGC CGATTCTTCA
301  GATTCCGCCC CCGCGTCAAA CCCTGCACCT GCGAATGGCG GTAGCAATTT
351  TGGAAGGGTT GATTTGGCTA ATGGCGTTTT GATTGATGGG CCGTCGCAAA
401  ATATAACGTT GACCCACTGT AAAGGCGATT CTTGTAATGG TGATAATTTA
451  TTGGATGAAG AAGCACCGTC AAAATCAGAA TTTGAAAATT TAAATGAGTC
501  TGAACGAATT GAGAAATATA AGAAAGATGG GAAAAGCGAT AAATTTACTA
551  ATTTGGTTGC GACAGCAGTT CAAGCTAATG GAACTAACAA ATATGTCATC
601  ATTTATAAAG ACAAGTCCGC TTCATCTTCA TCTGCGCGAT TCAGGCGTTC
651  TGCACGGTCG AGGAGGTCGC TTCCTGCCGA GATGCCGCTA ATCCCCGTCA
701  ATCAGGCGGA TACGCTGATT GTCGATGGGG AAGCGGTCAG CCTGACGGGG
751  CATTCCGGCA ATATCTTCGC GCCCGAAGGG AATTACCGGT ATCTGACTTA
801  CGGGGCGGAA AAATTGCCCG GCGGATCGTA TGCCCTCCGT GTGCAAGGCG
851  AACCGGCAAA AGGCGAAATG CTTGCTGGCA CGGCCGTGTA CAACGGCGAA
901  GTGCTGCATT TTCATACGGA AAACGGCCGT CCGTACCCGA CTAGAGGCAG
951  GTTTGCCGCA AAAGTCGATT TCGGCAGCAA ATCTGTGGAC GGCATTATCG
1001 ACAGCGGCGA TGATTTGCAT ATGGGTACGC AAAAATTCAA AGCCGCCATC
1051 GATGGAAACG GCTTTAAGGG GACTTGGACG GAAAATGGCG GCGGGGATGT
1101 TTCCGGAAGG TTTTACGGCC CGGCCGGCGA GGAAGTGGCG GGAAAATACA
1151 GCTATCGCCC GACAGATGCG GAAAAGGGCG GATTCGGCGT GTTTGCCGGC
1201 AAAAAAGAGC AGGATGGATC CGGAGGAGGA GGAGCCACCT ACAAAGTGGA
1251 CGAATATCAC GCCAACGCCC GTTTCGCCAT CGACCATTTC AACACCAGCA
1301 CCAACGTCGG CGGTTTTTAC GGTCTGACCG GTTCCGTCGA GTTCGACCAA
1351 GCAAAACGCG ACGGTAAAAT CGACATCACC ATCCCCGTTG CCAACCTGCA
1401 AAGCGGTTCG CAACACTTTA CCGACCACCT GAAATCAGCC GACATCTTCG
1451 ATGCCGCCCA ATATCCGGAC ATCCGCTTTG TTTCCACCAA ATTCAACTTC
1501 AACGGCAAAA AACTGGTTTC CGTTGACGGC AACCTGACCA TGCACGGCAA
1551 AACCGCCCCC GTCAAACTCA AAGCCGAAAA ATTCAACTGC TACCAAAGCC
1601 CGATGGCGAA AACCGAAGTT TGCGGCGGCG ACTTCAGCAC CACCATCGAC
1651 CGCACCAAAT GGGGCGTGGA CTACCTCGTT AACGTTGGTA TGACCAAAAG
1701 CGTCCGCATC GACATCCAAA TCGAGGCAGC CAAACAATAA CTCGAG
1    MASPDVKSAD TLSKPAAPVV AEKETEVKED APQAGSQGQG APSTQGSQDM
51   AAVSAENTGN GGAATTDKPK NEDEGPQNDM PQNSAESANQ TGNNQPADSS
101  DSAPASNPAP ANGGSNFGRV DLANGVLIDG PSQNITLTHC KGDSCNGDNL
151  LDEEAPSKSE FENLNESERI EKYKKDGKSD KFTNLVATAV QANGTNKYVI
201  IYKDKSASSS SARFRRSARS RRSLPAEMPL IPVNQADTLI VDGEAVSLTG
251  HSGNIFAPEG NYRYLTYGAE KLPGGSYALR VQGEPAKGEM LAGTAVYNGE
301  VLHFHTENGR PYPTRGRFAA KVDFGSKSVD GIIDSGDDLH MGTQKFKAAI
351  DGNGFKGTWT ENGGGDVSGR FYGPAGEEVA GKYSYRPTDA EKGGFGVFAG
401  KKEQDGSGGG GATYKVDEYH ANARFAIDHF NTSTNVGGFY GLTGSVEFDQ
451  AKRDGKIDIT IPVANLQSGS QHFTDHLKSA DIFDAAQYPD IRFVSTKFNF
501  NGKKLVSVDG NLTMHGKTAP VKLKAEKFNC YQSPMAKTEV CGGDFSTTID
551  RTKWGVDYLV NVGMTKSVRI DIQIEAAKQ＊
ΔG287-961
1    ATGGCTAGCC CCGATGTTAA ATCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCGGCCGC
51   TCCTGTTGTT GCTGAAAAAG AGACAGAGGT AAAAGAAGAT GCGCCACAGG
101  CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCA CACAAGGCAG CCAAGATATG
151  GCGGCAGTTT CGGCAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAACAACGGA
201  CAAACCCAAA AATGAAGACG AGGGACCGCA AAATGATATG CCGCAAAATT
251  CCGCCGAATC CGCAAATCAA ACAGGGAACA ACCAACCCGC CGATTCTTCA
301  GATTCCGCCC CCGCGTCAAA CCCTGCACCT GCGAATGGCG GTAGCAATTT
351  TGGAAGGGTT GATTTGGCTA ATGGCGTTTT GATTGATGGG CCGTCGCAAA
401  ATATAACGTT GACCCACTGT AAAGGCGATT CTTGTAATGG TGATAATTTA
451  TTGGATGAAG AAGCACCGTC AAAATCAGAA TTTGAAAATT TAAATGAGTC
501  TGAACGAATT GAGAATATA  AGAAAGATGG GAAAAGCGAT AAATTTACTA
551  ATTTGGTTGC GACAGCAGTT CAAGCTAATG GAACTAACAA ATATGTCATC
601  ATTTATAAAG ACAAGTCCGC TTCATCTTCA TCTGCGCGAT TCAGGCGTTC
651  TGCACGGTCG AGGAGGTCGC TTCCTGCCGA GATGCCGCTA ATCCCCGTCA
701  ATCAGGCGGA TACGCTGATT GTCGATGGGG AAGCGGTCAG CCTGACGGGG
751  CATTCCGGCA ATATCTTCGC GCCCGAAGGG AATTACCGGT ATCTGACTTA
801  CGGGGCGGAA AAATTGCCCG GCGGATCGTA TGCCCTCCGT GTGCAAGGCG
851  AACCGGCAAA AGGCGAAATG CTTGCTGGCA CGGCCGTGTA CAACGGCGAA
901  GTGCTGCATT TTCATACGGA AAACGGCCGT CCGTACCCGA CTAGAGGCAG
951  GTTTGCCGCA AAAGTCGATT TCGGCAGCAA ATCTGTGGAC GGCATTATCG
1001 ACAGCGGCGA TGATTTGCAT ATGGGTACGC AAAAATTCAA AGCCGCCATC
1051 GATGGAAACG GCTTTAAGG  GACTTGGACG GAAAATGGCG GCGGGGATGT
1101 TTCCGGAAGG TTTTACGGCC CGGCCGGCGA GGAAGTGGCG GGAAAATACA
1151 GCTATCGCCC GACAGATGCG GAAAAGGGCG GATTCGGCGT GTTTGCCGGC
1201 AAAAAAGAGC AGGATGGATC CGGAGGAGGA GGAGCCACAA ACGACGACGA
1251 TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC TGCTGCCTAC AACAATGGCC
1301 AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA CCATCTACGA CATTGATGAA
1351 GACGGCACAA TTACCAAAAA AGACGCAACT GCAGCCGATG TTGAAGCCGA
1401 CGACTTTAAA GGTCTGGGTC TGAAAAAAGT CGTGACTAAC CTGACCAAAA
1451 CCGTCAATGA AAACAAACAA AACGTCGATG CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA
1501 TCTGAAATAG AAAAGTTAAC AACCAAGTTA GCAGACACTG ATGCCGCTTT
1551 AGCAGATACT GATGCCGCTC TGGATGCAAC CACCAACGCC TTGAATAAAT
1601  TGGGAGAAAA TATAACGACA TTTGCTGAAG AGACTAAGAC AAATATCGTA
1651  AAAATTGATG AAAAATTAGA AGCCGTGGCT GATACCGTCG ACAAGCATGC
1701  CGAAGCATTC AACGATATCG CCGATTCATT GGATGAAACC AACACTAAGG
1751  CAGACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG CCAAACAGAC GGCCGAAGAA
1801  ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAAGTAAAA GCTGCAGAAA CTGCAGCAGG
1851  CAAAGCCGAA GCTGCCGCTG GCACAGCTAA TACTGCAGCC GACAAGGCCG
1901  AAGCTGTCGC TGCAAAAGTT ACCGACATCA AAGCTGATAT CGCTACGAAC
1951  AAAGATAATA TTGCTAAAAA AGCAAACAGT GCCGACGTGT ACACCAGAGA
2001  AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA TGGTCTGAAC GCTACTACCG
2051  AAAAATTGGA CACACGCTTG GCTTCTGCTG AAAAATCCAT TGCCGATCAC
2101  GATACTCGCC TGAACGGTTT GGATAAAACA GTGTCAGACC TGCGCAAAGA
2151  AACCCGCCAA GGCCTTGCAG AACAAGCCGC GCTCTCCGGT CTGTTCCAAC
2201  CTTACAACGT GGGTCGGTTC AATGTAACGG CTGCAGTCGG CGGCTACAAA
2251  TCCGAATCGG CAGTCGCCAT CGGTACCGGC TTCCGCTTTA CCGAAAACTT
2301  TGCCGCCAAA GCAGGCGTGG CAGTCGGCAC TTCGTCCGGT TCTTCCGCAG
2351  CCTACCATGT CGGCGTCAAT TACGAGTGGT AACTCGAG
1     MASPDVKSAD TLSKPAAPVV AEKETEVKED APQAGSQGQG APSTQGSQDM
51    AAVSAENTGN GGAATTDKPK NEDEGPQNDM PQNSAESANQ TGNNQPADSS
101   DSAPASNPAP ANGGSNFGRV DLANGVLIDG PSQNITLTHC KGDSCNGDNL
151   LDEEAPSKSE FENLNESERI EKYKDGKKSD KFTNLVATAV QANGTNKYVI
201   IYKDKSASSS SARFRRSARS RRGLPAEMPL IPVNQADTLI VDGEAVSLTG
251   HSGNIFAPEG NYRYLTYGAE KLPGGSYALR VQGEPAKGEM LAGTAVYNGE
301   VLHFHTENGR PYPTRGRFAA KVDFGEKSVD GIIDSGDDLH MGTQKFKAAI
351   DGNGFKGTWT ENGGGDVSGR FYGPAGEEVA GKYSYRPTDA EKGGFGVFAG
401   KKEQDGSGGG GATNDDDVKK AATVAIAAAY NNGQEINGFK AGETIYDIDE
451   DGTITKKDAT AADVEADDFK GLGLKKVVTN LTKTVNENKQ NVDAKVKAAE
501   SEIEKLTTKL ADTDAALADT DAALDATTNA LNKLGENITT FAEETKTNIV
551   KIDEKLEAVA DTVDKHAEAF NDIADSLDET NTKADEAVKT ANEAKQTAEE
601   TKQNVDAKVK AAETAAGKAE AAAGTANTAA DKAEAVAAKV TDIKADIATN
651   KDNIAKKANS ADVYTREESD SKFVRIDGLN ATTEKLDTRL ASAEKSIADH
701   DTRLNGLDKT VSDLRKETRQ GLAEQAALSG LFQPYNVGRF NVTAAVGGYK
751   SESAVAIGTG FRFTENFAAK AGVAVGTSSG SSAAYHVGVN YEW＊
 
ELISA 杀菌
ΔG287-953-His 3834 65536
ΔG287-961-His 108627 65536
将抗体针对杂交蛋白产生的杀菌效力(同源菌株)与针对919和ORF46.1的组分抗原(使用287-GST)的简单化合物产生的抗体相比：
 
与287的混合物 与△G287的杂交体
919 32000 128000
ORF46.1 128 16000
还获得了针对异源MenB菌株和血清型A和C的杀菌活性的数据：
因此，在与△G287(在N-未端)的杂交蛋白质比简单的与△G287-ORF46.1的混合物在免疫学上更优良，针对异源菌株尤其有效。也可在pET-24b中表达△G287-ORF46.1。
用新西兰菌株394/98而非2996制备相同的杂交蛋白：
ΔG287NZ-919
1    ATGGCTAGCC CCGATGTCAA GTCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCTGCCGC
51   CCCTGTTGTT TCTGAAAAAG AGACAGAGGC AAAGGAAGAT GCGCCACAGG
101  CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCG CACAAGGCGG TCAAGATATG
151  GCGGCGGTTT CGGAAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAGCAACGGA
201  CAAACCCAAA AATGAAGACG AGGGGGCGCA AAATGATATG CCGCAAAATG
251  CCGCCGATAC AGATAGTTTG ACACCGAATC ACACCCCGGC TTCGAATATG
301  CCGGCCGGAA ATATGGAAAA CCAAGCACCG GATGCCGGGG AATCGGAGCA
351  GCCGGCAAAC CAACCGGATA TGGCAAATAC GGCGGACGGA ATGCAGGGTG
401  ACGATCCGTC GGCAGGCGGG GAAAATGCCG GCAATACGGC TGCCCAAGGT
451  ACAAATCAAG CCGAAAACAA TCAAACCGCC GGTTCTCAAA ATCCTGCCTC
501  TTCAACCAAT CCTAGCGCCA CGAATAGCGG TGGTGATTTT GGAAGGACGA
551  ACGTGGGCAA TTCTGTTGTG ATTGACGGGC CGTCGCAAAA TATAACGTTG
601  ACCCACTGTA AAGGCGATTC TTGTAGTGGC AATAATTTCT TGGATGAAGA
651  AGTACAGCTA AAATCAGAAT TTGAAAAATT AAGTGATGCA GACAAAATAA
701  GTAATTACAA GAAAGATGGG AAGAATGACG GGAAGAATGA TAAATTTGTC
751  GGTTTGGTTG CCGATAGTGT GCAGATGAAG GGAATCAATC AATATATTAT
801  CTTTTATAAA CCTAAACCCA CTTCATTTGC GCGATTTAGG CGTTCTGCAC
851  GGTCGAGGCG GTCGCTTCCG GCCGAGATGC CGCTGATCCC GCTCAATCAG
901  GCGGATACGC TGATTGTCGA TGGGGAAGCG GTCAGCCTGA CGGGGCATTC
951  CGGCAATATC TTCGGCGCCG AAGGGAATTA CCGGTATCTG ACTTACGGGG
1001 CGGAAAAATT GCCCGGCGGA TCGTATGCCC TCCGTGTTCA AGGCGAACCT
1051 TCAAAAGGCG AAATGCTCGC GGGCACGGCA GTGTACAACG GCGAAGTGCT
1101 GCATTTTCAT ACGGAAAACG GCCGTCCGTC CCCGTCCAGA GGCAGGTTTG
1151 CCGCAAAAGT CGATTTCGGC AGCAAATCTG TGGACGGCAT TATCGACAGC
1201 GGCGATGGTT TGCATATGGG TACGCAAAAA TTCAAAGCCG CCATCGATGG
1251 AAACGGCTTT AAGGGGACTT GGACGGAAAA TGCGGGCGGG GATGTTTCCG
1301 GAAAGTTTTA CGGCCCGGCC GGCGAGGAAG TGGCGGGAAA ATACAGCTAT
1351 CGCCCAACAG ATGCGGAAAA GGGCGGATTC GGCGTGTTTG CCGGCAAAAA
1401 AGAGCAGGAT GGATCCGGAG GAGGAGGATG CCAAAGCAAG AGCATCCAAA
1451 CCTTTCCGCA ACCCGACACA TCCGTCATCA ACGGCCCGGA CCGGCCGGTC
1501 GGCATCCCCG ACCCCGCCGG AACGACGGTC GGCGGCGGCG GGGCCGTCTA
1551 TACCGTTGTA CCGCACCTGT CCCTGCCCCA CTGGGCGGCG CAGGATTTCG
1601 CCAAAAGCCT GCAATCCTTC CGCCTCGGCT GCGCCAATTT GAAAAACCGC
1651 CAAGGCTGGC AGGATGTGTG CGCCCAAGCC TTTCAAACCC CCGTCCATTC
1701 CTTTCAGGCA AAACAGTTTT TTGAACGCTA TTTCACGCCG TGGCAGGTTG
1751 CAGGCAACGG AAGCCTTGCC GGTACGGTTA CCGGCTATTA CGAGCCGGTG
1801 CTGAAGGGCG ACGACAGGCG GACGGCACAA GCCCGCTTCC CGATTTACGG
1851 TATTCCCGAC GATTTTATCT CCGTCCCCCT GCCTGCCGGT TTGCGGAGCG
1901 GAAAAGCCCT TGTCCGCATC AGGCAGACGG GAAAAAACAG CGGCACAATC
1951 GACAATACCG GCGGCACACA TACCGCCGAC CTCTCCCGAT TCCCCATCAC
2001 CGCGCGCACA ACGGCAATCA AAGGCAGGTT TGAAGGAAGC CGCTTCCTCC
2051  CCTACCACAC GCGCAACCAA ATCAACGGCG GCGCGCTTGA CGGCAAAGCC
2101  CCGATACTCG GTTACGCCGA AGACCCCGTC GAACTTTTTT TTATGCACAT
2151  CCAAGGCTCG GGCCGTCTGA AAACCCCGTC CGGCAAATAC ATCCGCATCG
2201  GCTATGCCGA CAAAAACGAA CATCCCTACG TTTCCATCGG ACGCTATATG
2251  GCGGACAAAG GCTACCTCAA GCTCGGGCAG ACCTCGATGC AGGGCATCAA
2301  AGCCTATATG CGGCAAAATC CGCAACGCCT CGCCGAAGTT TTGGGTCAAA
2351  ACCCCAGCTA TATCTTTTTC CGCGAGCTTG CCGGAAGCAG CAATGACGGT
2401  CCCGTCGGCG CACTGGGCAC GCCGTTGATG GGGGAATATG CCGGCGCAGT
2451  CGACCGGCAC TACATTACCT TGGGCGCGCC CTTATTTGTC GCCACCGCCC
2501  ATCCGGTTAC CCGCAAAGCC CTCAACCGCC TGATTATGGC GCAGGATACC
2551  GGCAGCGCGA TTAAAGCCGC GGTGCGCGTG GATTATTTTT GGGGATACGG
2601  CGACGAAGCC GGCGAACTTG CCGGCAAACA GAAAACCACG GGTTACGTCT
2651  GGCAGCTCCT ACCCAACGGT ATGAAGCCCG AATACCGCCC GTAAAAGCTT
1     MASPDVKSAD TLSKPAAPVV SEKETEAKED APQAGSQGQG APSAQGGQDM
51    AAVSEENTGN GGAATDKCPK NEDEGAQNDM PQNAADTDSL TPNHTPASNM
101   PAGNMENQAP DAGESEQPAN QPDMANFADG MQGDDPSAGG ENAGNTAAQG
151   TNQAENNQTA GSQNPASSTN PSATNSGGDF GRTNVGNSVV IDGPSQNITL
201   THCKGDSCSG NNFLDEEVQL KSEFEKLSDA DKISNYKKDG KNDGKNDKFV
251   GLVADSVQMK GINQYIIFYK PKPTSFARFR RSARSRRSLP AEMPLIPVNQ
301   ADTLIVDGEA VSLTGHSGNI FAPEGNYRYL TYGAEKLPGG SYALRVQGEP
351   SKGEMLAGTA VYNGEVLHFH TENGRPSPSR GRFAAKVDFG SKSVDGIIDS
401   GDGLHMGTQE FKAAIDGNGF KGTWTENGGG DVSGKFYGPA GEEVAGKYSY
451   RPTDAEKGGF GVFAGKKEQD GSGGGGCQSK SIQTFPQPDT SVINGPDRPV
501   GIPDPAGTTV GGGGAVYTVV PHLSLPHWAA QDFAKSLQSF RLGCANLKNR
551   QGWQDVCAQA FQTPVHSFQA KQFFERYFTP WQVAGNGSLA GTVTGYYEPV
601   LKGDDRRTAQ ARFPIYGIPD DFISVPLPAG LRSGKALVRI RQTGKNSGTI
651   DNTGGTHTAD LSRFPITART TAIKGRFEGS RFLPYHTRNQ INGGALDGKA
701   PILGYAEDPV ELFFMHIQGS GRLKTPSGKY IRIGYADKNE HPYVSIGRYM
751   ADKGYLKLGQ TSMQGIKAYM RQNPQRLAEV LGQNPSYIFF REIAGSSNDG
801   PVGALGTPLM GEYAGAVDRH YITLGAPLFV ATAHPVTRKA LNRLIMAQDT
851   GSAIKGAVRV DYFWGYGDEA GELAGKQKTT GYVWQLLPNG MKPEYRP＊
ΔG287NZ-953
1    ATGGCTAGCC CCGATGTCAA GTCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCTGCCGC
51   CCCTGTTGTT TCTGAAAAAG AGACAGAGGC AAAGGAAGAT GCGCCACAGG
101  CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCG CACAAGGCGG TCAAGATATG
151  GCGGCGGTTT CGGAAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAGCAACGGA
201  CAAACCCAAA AATGAAGACG AGGGGGCGCA AAATGATATG CCGCAAAATG
251  CCGCCGATAC AGATAGTTTG ACACCGAATC ACACCCCGGC TTCGAATATG
301  CCGGCCGGAA ATATGGAAAA CCAAGCACCG GATGCCGGGG AATCGGAGCA
351  GCCGGCAAAC CAACCGGATA TGGCAAATAC GGCGGACGGA ATGCAGGGTG
401  ACGATCCGTC GGCAGGCGGG GAAAATGCCG GCAATACGGC TGACCAAGGT
451  ACAAATCAAG CCGAAAACAA TCAAACCGCC GGTTCTCAAA ATCCTGCCTC
501  TTCAACCAAT CCTAGCGCCA CGAATAGCGG TGTTGATTTT GGAAGGACGA
551  ACGTGGGCAA TTCTGTTGTG ATTGACGGGC CGTCGCAAAA TATAACGTTG
601  ACCCACTGTA AAGGCGATTC TTGTAGTGGC AATAATTTCT TGGATGAAGA
651  AGTACAGCTA AAATCAGAAT TTGAAAAATT AAGTGATGCA GACAAAATAA
701  GTAATTACAA GAAAGATGGG AAGAATGACG GGAAGAATGA TAAATTTGTC
751  GGTTTGGTTG CCGATAGTGT GCAGATGAAG GGAATCAATC AATATATTAT
801  CTTTTATAAA CCTAAACCCA CTTCATTTGC GCGATTTAGG CGTTCTGCAC
851  GGTCGAGGCG GTCGCTTCCG GCCGAGATGC CGCTGATTCC CGTCAATCAG
901  GCGGATACGC TGATTGTCGA TGGGGAAGCG GTCAGCCTGA CGGGGCATTC
951  CGGCAATATC TTCGCGCCCG AAGGGAATTA CCGGTATCTG ACTTACGGGG
1001 CGGAAAAATT GCCCGGCGGA TCGTATGCCC TCCGTGTTCA AGGCGAACCT
1051 TCAAAAGGCG AAATGCTCGC GGGCACGGCA GTGTACAACG GCGAAGTGCT
1101 GCATTTTCAT ACGGAAAACG GCCGTCCGTC CCCGTCCAGA GGCAGGTTTG
1151 CCGCAAAAGT CGATTTCGGC AGCAAATCTG TGGACGGCAT TATCGACAGC
1201 GGCGATGGTT TGCATATGGG TACGCAAAAA TTCAAAGCCG CCATCGATGG
1251 AAACGGCTTT AAGGGGACTT GGACGGAAAA TGGCGGCGGG GATGTTTCCG
1301 GAAAGTTTTA CGGCCCGGCC GGCGAGGAAG TGGCGGGAAA ATACAGCTAT
1351 CGCCCAACAG ATGCGGAAAA GGGCGGATTC GGCGTGTTGC CCGGCAAAAA
1401 AGAGCAGGAT GGATCCGGAG GAGGAGGAGC CACCTACAAA GTGGACGAAT
1451 ATCACGCCAA CGCCCGTTTC GCCATCGACC ATTTCAACAC CAGCACCAAC
1501 GTCGGCGGTT TTTACGGTCT GACCGGTTCC GTCGAGTTCG ACCAAGCAAA
1551 ACGCGACGGT AAAATCGACA TCACCATCCC CGTTGCCAAC CTGCAAAGCG
1601  GTTCGCAACA CTTTACCGAC CACCTGAAAT CAGCCGACAT CTTCGATGCC
1651  GCCCAATATC CGGACATCCG CTTTGTTTCC ACCAAATTCA ACTTCAACGG
1701  CAAAAAACTG GTTTCCGTTG ACGGCAACCT GACCATGCAC GGCAAAACCG
1751  CCCCCGTCAA ACTCAAAGCC GAAAAATTCA ACTGCTACCA AAGCCCGATG
1801  GCGAAAACCG AAGTTTGCGG CGGCGACTTC AGCACCACCA TCGACCGCAC
1851  CAAATGGGGC GTGGACTACC TCGTTAACGT TGGTATGACC AAAAGCGTCC
1901  GCATCGACAT CCAAATCGAG GCAGCCAAAC AATAAAAGCT T
1     MASPDVKSAD TLSKPAAPVV SEKETEAKED APQAGSQGQG APSAQGGQDM
51    AAVSEENTGN GGAAATDKPK NEDEGAQNDM PQNAADTDSL TPNHTPASNM
101   PAGNMBNQAP DAGESEQPAN QPDMANTADG MQGDDPSAGG ENAGNTAAQG
151   TNQAENNQTA GSQNPASSTN PSATNSGGDF GRTNVGNSVV IDGPSQNITL
201   THCKGDSCSG NNFLDEEVQL KSEFEKLSDA DKISNYKKDG KNDGKNDKFV
251   GLVADSVQMK GINQYIIFYK PKPTSFARFR RSARSRRSLP AEMPLIPVNQ
301   ADTLIVDGEA VSLTGHSGNI FAPEGNYRYL TYGAEKLPGG SYALRVQGEP
351   SKGKMLAGTA VYNGEVLHFH TENGRPSPSR GRFAAKVDFG SKSVDGIIDS
401   GDGLHMGTQK FKAAIDGNGF KGTWTENGGG DVSGKFYGPA GEEVAGKYSY
451   RPTDAEKGGF GVFAGKKEQD GSGGGGATYK VDEYHANARF AIDHFNTSTN
501   VGGFYGLTGS VEFDQAKRDG KIDITIPVAN LQSGSQHFTD HLKSADIFDA
551   AQYPDIRFVS TKFNFNGKKL VSVDGNLTMH GKTAPVKLKA EKFNCYQSPM
601   AKTEVCGGDF STTIDRTKWG VDYLVNVGMT KSVRIDIQIE AAKQ＊
ΔG287NZ-961
1     ATGGCTAGCC CCGATGTCAA GTCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCTGCCGC
51    CCCTGTTGTT TCTGAAAAAG AGACAGAGGC AAAGGAAGAT GCGCCACAGG
101   CAGGTTCTCA AGGACAGGGC GCGCCATCCG CACAAGGCGG TCAAGATATG
151   GCGGCGGTTT CGGAAGAAAA TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAGCAACGGA
201   CAAACCCAAA AATGAAGACG AGGGGGCGCA AATGATATGC CCGCAAAATG
251   CCGCCGATAC AGATAGTTTG ACACCGAATC ACACCCCGGC TTCGAATATG
301   CCGGCCGGAA ATATGGAAAA CCAAGCACCG GATGCCGGGG AATCGGAGCA
351   GCCGGCAAAC CAACCGGATA TGGCAAATAC GGCGGACGGA ATGCAGGGTG
401   ACGATCCGTC GGCAGGCGGG GAAAATGCCG GCAATACGGC TGCCCAAGGT
451   ACAAATCAAG CCGAAAACAA TCAAACCGCC GGTTCTCAAA ATCCTGCCTC
501   TTCAACCAAT CCTAGCGCCA CGAATAGCGG TGGTGATTTT GGAAGGACGA
551   ACGTGGGCAA TTCTGTTGTG ATTGACGGGC CGTCGCAAAA TATAACGTTG
601   ACCCACTGTA AAGGCGATTC TTGTAGTGGC AATAATTTCT TGGATGAAGA
651   AGTACAGCTA AAATCAGAAT TTGAAAAATT AAGTGATGCA GACAAAATAA
701   GTAATTACAA GAAAGATGGG AAGAATGACG GGAAGAATGA TAAATTTGTC
751   GGTTTGGTTG CCGATAGTGT GCAGATGAAG GGAATCAATC AATATATTAT
801   CTTTTATAAA CCTAAACCCA CTTCATTTGC GCGATTTAGG CGTTCTGCAC
851   GGTCGAGGCG GTCGCTTCCG GCCGAGATGC CGCTGATTCC CGTCAATCAG
901   GCGGATACGC TGATTGTCGA TGGGGAAGCG GTCAGCCTGA CGGGGCATTC
951   CGGCAATATC TTCGCGCCCG AAGGGAATTA CCGGTATCTG ACTTACGGGG
1001  CGGAAAAATT GCCCGGCGGA TCGTATGCCC TCCGTGTTCA AGGCGAACCT
1051  TCAAAAGGCG AAATGCTCGC GGGCACGGCA GTGTACAACG GCGAAGTGCT
1101  GCATTTTCAT ACGGAAAACG GCCGTCCGTC CCCGTCCAGA GGCAGGTTTG
1151  CCGCAAAAGT CGATTTCGGC AGCAAATCTG TGGACGGCAT TATCGACAGC
1201  GGCGATGGTT TGCATATGGG TACGCAAAAA TTCAAAGCCG CCATCGATGG
1251  AAACGGCTTT AAGGGGACTT GGACGGAAAA TGGCGGCGGG GATGTTTCCG
1301  GAAAGTTTTA CGGCCCGGCC GGCGAGGAAG TGGCGGGAAA ATACAGCTAT
1351  CGCCCAACAG ATGCGGAAAA GGGCGGATTC GGCGTGTTTG CCGGCAAAAA
1401  AGAGCAGGAT GGATCCGGGA GAGGAGGAGC CACAAACGAC GACGATGTTA
1451  AAAAAGCTGC CACTGTGGCC ATTGCTGCTG CCTACAACAA TGGCCAAGAA
1501  ATCAACGGTT TCAAAGCTGG AGAGACCATC TACGACATTG ATGAAGACGG
1551  CACAATTACC AAAAAAGACG CAACTGCAGC CGATGTTGAA GCCGACGACT
1601  TTAAAGGTCT GGGTCTGAAA AAAGTCGTGA CTAACCTGAC CAAAACCGTC
1651  AATGAAAACA AACAAAACGT CGATGCCAAA GTAAAAGCTG CAGAATCTGA
1701  AATAGAAAAG TTAACAACCA AGTTAGCAGA CACTGATGCC GCTTTAGCAG
1751  ATACTGATGC CGCTCTGGAT GCAACCACCA ACGCCTTGAA TAAATTGGGA
1801  GAAAATATAA CGACATTTGC TGAAGAGACT AAGACAAATA TCGTAAAAAT
1851  TGATGAAAAA TTAGAAGCCG TGGCTGATAC CGTCGACAAG CATGCCGAAG
1901  CATTCAACGA TATCGCCGAT TCATTGGATG AAACCAACAC TAAGGCAGAC
1951  GAAGCCGTCA AAACCGCCAA TGAAGCCAAA CAGACGGCCG AAGAAACCAA
2001  ACAAAACGTC GATGCCAAAG TAAAAGCTGC AGAAACTGCA GCAGGCAAAG
2051  CCGAAGCTGC CGCTGGCACA GCTAATACTG CAGCCGACAA GGCCGAAGCT
2101  GTCGCTGCAA AAGTTACCGA CATCAAAGCT GATATCGCTA CGAACAAAGA
2151  TAATATTGCT AAAAAAGCAA ACAGTGCCGA CGTGTACACC AGAGAAGAGT
2201  CTGACAGCAA ATTTGTCAGA ATTGATGGTC TGAACGCTAC TACCGAAAAA
2251  TTGGACACAC GCTTGGCTTC TGCTGAAAAA TCCATTGCCG ATCACGATAC
2301  TCGCCTGAAC GGTTTGGATA AAACAGTGTC AGACCTGCGC AAAGAAACCC
2351  GCCAAGGCCT TGCAGAACAA GCCGCGCTCT CCGGTCTGTT CCAACCTTAC
2401  AACGTGGGTC GGTTCAATGT AACGGCTGCA GTCGGCGGCT ACAAATCCGA
2451  ATCGGCAGTC GCCATCGGTA CCGGCTTCCG CTTTACCGAA AACTTTGCCG
2501  CCAAAGCAGG CGTGGCAGTC GGCACTTCGT CCGGTTCTTC CGCAGCCTAC
2551  CATGTCGGCG TCAATTACGA GTGGTAAAAG CTT
1     MASPDVKSAD TLSKPAAPVV SEKETEAKED APQAGSQGQG APSAQGGQDM
51    AAVSEENTGN GGAAATDKPK NEDEGAQNDM PQNAADTDSL TPNHTPASNM
101   PAGNMENQAP DAGESEQPAN QPDMANTADG MQGDDPSAGG ENAGNTAAQG
151   TNQARNNQTA GSQNPASSTN PSATNSGGDF GRTNVGNSVV IDGPSGNITL
201   THCKGDSCSG NNFLDEEVQL KSEFEKLSDA DKISNYKKDG KNDGKNDKFV
251   GLVADSVQMK GINQYIIFYK PKPTSFARFR RSARSRRSLP AEMPLIPVNQ
301   ADTLIVDGEA VSLTGHSGNI FAPEGNYRYL TYGAEKLPGG SYALRVQGEP
351   SKQEMLAGTA VYNGEVLHFH TENGRPSPSR GRFAAKVDFG SKSVDGIIDS
401   GDGLHMGTQK FKAAIDGNGF KGTWTENGGG DVSGKFYGPA GEEVAGKYSY
451   RPTDAEKGGF GVFAGKKEQD GSGGGGATND DDVKKAATVA IAAAYNNGQE
501   INGFKAGETI YDIDEDGTIT KKDATAADVE ADDFKGLGLK KVVTNLTKTV
551   NENKQNVDAK VKAAESEIEK LTTKLADTDA ALADTDAALD ATTNALNKLG
601   ENITTFAEET KTNIVKIDEK LEAVADTVDK HAEAFNDIAD SLDETNTKAD
651   EAVKTANEAK QTAEETKGNV DAKVKAAETA AGKAEAAAGT ANTAADKAEA
701   VAAKVTDIKA DIATNKDNIA KKANSADVYT REESDSKFVR IDGLNATTEK
751   LDTRLASAEK SIADHDTRIN GLDATVSDLR KETRQGLAEQ AALSGLFQPY
801   NVGRFNVTAA VGGYKSESAV AIGTGFRFTE NFAAKAGVAV GTSSGSSAAY
851   HVGVNYEW＊
△G983和杂交体
测定了针对各种菌株(包括同源2996菌株)应答△G983(His-融合体)产生的杀菌滴定度：
 
2996 NGH38 BZ133
△G983 512 128 128
△G983还可以与ORF46.1、741、961或961C(在其C-未端)杂交的杂交体表达：
ΔG983-ORF46.1
1    ATGACTTCTG CGCCCGACTT CAATGCAGGC GGTACCGGTA TCGGCAGCAA
51   CAGCAGAGCA ACAACAGCGA AATCAGCAGC AGTATCTTAC GCCGGTATCA
101  AGAACGAAAT GTGCAAAGAC AGAAGCATGC TCTGTGCCGG TCGGGATGAC
151  GTTGCGGTTA CAGACAGGGA TGCCAAAATC AATGCCCCCC CCCCGAATCT
201  GCATACCGGA GACTTTCCAA ACCCAAATGA CGCATACAAG AATTTGATCA
251  ACCTCAAACC TGCAATTGAA GCAGGCTATA CAGGACGCGG GGTAGAGGTA
301  GGTATCGTCG ACACAGGCGA ATCCGTCGGC AGCATATCCT TTCCCGAACT
351  GTATGGCAGA AAAGAACACG GCTATAACGA AAATTACAAA AACTATACGG
401  CGTATATGCG GAAGGAAGCG CCTGAAGACG GAGGCGGTAA AGACATTGAA
451  GCTTCTTTCG ACGATGAGGC CGTTATAGAG ACTGAAGCAA AGCCGACGGA
501  TATCCGCCAC GTAAAAGAAA TCGGACACAT CGATTTGGTC TCCCATATTA
551  TTGGCGGGCG TTCCGTGGAC GGCAGACCTG CAGGCGGTAT TGCGCCCGAT
601  GCGACGCTAC ACATAATGAA TACGAATGAT GAAACCAAGA ACGAAATGAT
651  GGTTGCAGCC ATCCGCAATG CATGGGTCAA GCTGGGCGAA CGTGGCGTGC
701  GCATCGTCAA TAACAGTTTT GGAACAACAT CGAGGGCAGG CACTGCCGAC
751  CTTTTCCAAA TAGCCAATTC GGAGGAGCAG TACCGCCAAG CGTTGCTCGA
801  CTATTCCGGC GGTGATAAAA CAGACGAGGG TATCCGCCTG ATGCAACAGA
851  GCGATTACGG CAACCTGTCC TACCACATCC GTAATAAAAA CATGCTTTTC
901  ATCTTTTCGA CAGGCAATCG CGCACAAGCT CAGCCCAACA CATATGCCCT
951  ATTGCCATTT TATGAAAAAG ACGCTCAAAA AGGCATTATC ACAGTCGCAG
1001 GCGTAGACCG CAGTGGAGAA AAGTTCAAAC GGGAAATGTA TGGAGAACCG
1051 GGTACAGAAC CGCTTGAGTA TGGCTCCAAC CATTGCGGAA TTACTGCCAT
1101 GTGGTGCCTG TCGGCACCCT ATGAAGCAAG CGTCCGTTTC ACCCGTACAA
1151  ACCCGATTCA AATTGCCGGA ACATCCTTTT CCGCACCCAT CGTAACCGGC
1201  ACGGCGGCTC TGCTGCTGCA GAAATACCCG TGGATGAGCA ACGACAACCT
1251  GCGTACCACG TTGCTGACGA CGGCTCAGGA CATCGGTGCA GTCGGCGTGG
1301  ACAGCAAGTT CGGCTGGGGA CTGCTGGATG CGGGTAAGGC CATGAACGGA
1351  CCCGCGTCCT TTCCGTTCGG CGACTTTACC GCCGATACGA AAGGTACATC
1401  CGATATTGCC TACTCCTTCC GTAACGACAT TTCAGGCACG GGCGGCCTGA
1451  TCAAAAAAGG CGGCAGCCAA CTGCAACTGC ACGGCAACAA CACCTATACG
1501  GGCAAAACCA TTATCGAAGG CGGTTCGCTG GTGTTGTACG GCAACAACAA
1551  ATCGGATATG CGCGTCGAAA CCAAAGGTGC GCTGATTTAT AACGGGGCGG
1601  CATCCGGCGG CAGCCTGAAC AGCGACGGCA TTGTCTATCT GGCAGATACC
1651  GACCAATCCG CCGCAAACGA AACCGTACAC ATCAAAGGCA GTCTGCAGCT
1701  GGACGGCAAA GGTACGCTGT ACACACGTTT GGGCAAACTG CTGAAAGTGG
1751  ACGGTACGGC GATTATCGGC GGCAAGCTGT ACATGTCGGC ACGCGGCAAG
1801  GGGGCAGGCT ATCTCAACAG TACCGGACGA CGTGTTCCCT TCCTGAGTGC
1851  CGCCAAAATC GGGCAGGATT ATTCTTTCTT CACAAACATC GAAACCGACG
1901  GCGGCCTGCT GGCTTCCCTC GACAGCGTCG AAAAAACAGC GGGCAGTGAA
1951  GGCGACACGC TGTCCTATTA TGTCCGTCGC GGCAATGCGG CACGGACTGC
2001  TTCGGCAGCG GCACARTCCG CGCCCGCCGG TCTGAAACAC GCCGTAGAAC
2051  AGGGCGGCAG CAATCTGGAA AACCTGATGG TCGAACTGGA TGCCTCCGAA
2101  TCATCCGCAA CACCCGAGAC GGTTGAAACT GCGGCAGCCG ACCGCACAGA
2151  TATGCCGGGC ATCCGCCCCT ACGGCGCAAC TTTCCGCGCA GCGGCAGCCG
2201  TACAGCATGC GAATGCCGCC GACGGTGTAC GCATCTTCAA CAGTCTCGCC
2251  GCTACCGTCT ATGCCGACAG TACCGCCGCC CATGCCGATA TGCAGGGACG
2301  CCGCCTGAAA GCCGTATCGG ACGGGTTGGA CCACAACGGC ACGGGTCTGC
2351  GCGTCATCGC GCAAACCCAA CAGGACGGTG GAACGTGGGA ACAGGGCGGT
2401  GTTGAAGGCA AAATGCGCGG CAGTACCCAA ACCGTCGGCA TTGCCGCGAA
2451  AACCGGCGAA AATACGACAG CAGCCGCCAC ACTGGGCATG GGACGCAGCA
2501  CATGGAGCGA AAACAGTGCA AATGCAAAAA CCGACAGCAT TAGTCTGTTT
2551  GCAGGCATAC GGCACGATGC GGGCGATATC GGCTATCTCA AAGGCCTGTT
2601  CTCCTACGGA CGCTACAAAA ACAGCATCAG CCGCAGCACC GGTGCGGACG
2651  AACATGCGGA AGGCAGCGTC AACGGCACGC TGATGCAGCT GGGCGCACTG
2701  GGCGGTGTCA ACGTTCCGTT TGCCGCAACG GGAGATTTGA CGGTCGAAGG
2751  CGGTCTGCGC TACGACCTGC TCAAACAGGA TGCATTCGCC GAAAAAGGCA
2801  GTGCTTTGGG CTGGAGCGGC AACAGCCTCA CTGAAGGCAC GCTGGTCGGA
2851  CTCGCGGGTC TGAAGCTGTC GCAACCCTTG AGCGATAAAG CCGTCCTGTT
2901  TGCAACGGCG GGCGTGGAAC GCGACCTGAA CGGACGCGAC TACACGGTAA
2951  CGGGCGGCTT TACCGGCGCG ACTGCAGCAA CCGGCAAGAC GGGGGCACGC
3001  AATATGCCGC ACACCCGTCT GGTTGCCGGC CTGGGCGCGG ATGTCGAATT
3051  CGGCAACGGC TGGAACGGCT TGGCACGTTA CAGCTACGCC GGTTCCAAAC
3101  AGTACGGCAA CCACAGCGGA CGAGTCGGCG TAGGCTACCG GTTCCTCGAC
3151  GGTGGCGGAG GCACTGGATC CTCAGATTTG GCAAACGATT CTTTTATCCG
3201  GCAGGTTCTC GACCGTCAGC ATTTCGAACC CGACGGGAAA TACCACCTAT
3251  TCGGCAGCAG GGGGGAACTT GCCGAGCGCA GCGGCCATAT CGGATTGGGA
3301  AAAATACAAA GCCATCAGTT GGGCAACCTG ATGATTCAAC AGGCGGCCAT
3351  TAAAGGAAAT ATCGGCTACA TTGTCCGCTT TTCCGATCAC GGGCACGAAG
3401  TCCATTCCCC CTTCGACAAC CATGCCTCAC ATTCCGATTC TGATGAAGCC
3451  GGTAGTCCCG TTGACGGATT TAGCCTTTAC CGCATCCATT GGGACGGATA
3501  CGAACACCAT CCCGCCGACG GCTATGACGG GCCACAGGGC GGCGGCTATC
3551  CCGCTCCCAA AGGCGCGAGG GATATATACA GCTACGACAT AAAAGGCGTT
3601  GCCCAAAATA TCCGCCTCAA CCTGACCGAC AACCGCAGCA CCGGACAACG
3651  GCTTGCCGAC CGTTTCCACA ATGCCGGTAG TATGCTGACG CAAGGAGTAG
3701  GCGACGGATT CAAACGCGCC ACCCGATACA GCCCCGAGCT GGACAGATCG
3751  GGCAATGCCG CCGAAGCCTT CAACGGCACT GCAGATATCG TTAAAAACAT
3801  CATCGGCGCG GCAGGAGAAA TTGTCGGCGC AGGCGATGCC GTGCAGGGCA
3851  TAAGCGAAGG CTCAAACATT GCTGTCATGC ACGGCTTGGG TCTGCTTTCC
3901  ACCGAAAACA AGATGGCGCG CATCAACGAT TTGGCAGATA TGGCGCAACT
3951  CAAAGACTAT GCCGCAGCAG CCATCCGCGA TTGGGCAGTC CAAAACCCCA
4001  ATGCCGCACA AGGCATAGAA GCCGTCAGCA ATATCTTTAT GGCAGCCATC
4051  CCCATCAAAG GGATTGGAGC TGTTCGGGGA AAATACGGCT TGGGCGGCAT
4101  CACGGCACAT CCTATCAAGC GGTCGCAGAT GGGCGCGATC GCATTGCCGA
4151  AAGGGAAATC CGCCGTCAGC GACAATTTTG CCGATGCGGC ATACGCCAAA
4201  TACCCGTCCC CTTACCATTC CCGAAATATC CGTTCAAACT TGGAGCAGCG
4251  TTACGGCAAA GAAAACATCA CCTCCTCAAC CGTGCCGCCG TCAAACGGCA
4301  AAAATGTCAA ACTGGCAGAC CAACGCCACC CGAAGACAGG CGTACCGTTT
4351  GACGGTAAAG GGTTTCCGAA TTTTGAGAAG CACGTGAAAT ATGATACGCT
4401  CGAGCACCAC CACCACCACC ACTGA
1    MTSAPDFNAG GTGIGSNSRA TTAKSAAVSY AGIKNEMCKD RSMLCAGRDD
51   VAVTDRDAKI NAPPPNLHTG DFPNPNDAYK NLINLKPAIE AGYTGRGVEV
101  GIVDTGESVG SISFPELYGR KEHGYNENYK NYTAYNRKEA PEDGGGKDIE
151  ASFDDEAVIE TEAKPTDIRH VKEIGHIDLV SHIIGGRSVD GRPAGGIAPD
201  ATLHIMNTND ETKNEMMVAA IRNAWVKLGE RGVRIVNNSF GTTSRAGTAD
251  IFQIANSEEQ YRQALLDYSG GDKTDEGIRL MQQSDYGNLS YHIRNKNMLF
301  IFSTGNDAQA QPNTYALLPF YEKDAQKGII TVAGVDRSGE KFKREMYGEP
351  GTEPLEYGSN HCGITAMWCL SAPYEASVRF TRTNPIQIAG TSFSAPIVTG
401  TAALLLQKYP WMSNDNLRTT LLTTAQDIGA VGVDSKFGWG ILDAGKAMNG
451  PASFPFGDFT ADTKGTSDIA YSFRNDISGT GGLIKKGGSQ LQLHGNNTYT
501  GKTIIEGGSL VLYGNNKSDM RVETKGALIY NGAASGGSLN SDGIVYLADT
551  DQSGANETVH IKGSLQLDGK GTLYTRLGKL LKVDGTAIIG GKLYMSARGK
601  GAGYLNSTGR RVPFLSAAKI GQDYSFFTNI ETDGGLLASL DSVEKTAGSB
651  GDTLSYYVRR GNAARTASAA AHSAPAGLKH AVEQGGSNLE NLMVELDASE
701  SSATPETVET AAADRTDMPG IRPYGATFRA AAAVQHANAA DGVRIFNSLA
751  ATVYADSTAA HADMQGRRLK AVSDGLDHNG TGLRVIAQTQ QDGGTWEQGG
801  VEGKMRGSTQ TVGIAAKTGE NTTAAATLGM GRSTWSENSA NAKTDSISLF
851  AGIRHDAGDI GYCLKGLFSYGRYKNSISRST GADEHAEGSV NGTLMQLGAL
901  GGVNVPFAAT GDLTVEGGLR YDLLKQDAFA EKGSALGWSG NSLTEGTLVG
951  LAGLKLSQPL SDKAVLFATA GVERDLNGRD YTVTGGFTGA TAATGKTGAR
1001 NMPETRLVAG LGADVEFGNG WNGLARYSYA GSKQYGNHSG RVGVGYRFLD
1051 GGGGTGSSDL ANDSFIRQVL DRQHFEPDGK YHLFGSRGEL AERSGHIGLG
1101 KIQSHQLGNL MIQQAAIKGN IGYIVRFSDH GHEVHSPFDN HASHSDSDEA
1151 GSPVDGFSLY RIHWDGYEHH PADGYDGPQG GGYPAPKGAR DIYSYDIKGV
1201 AQNIRLNLTD NRSTGQRLAD RFHNAGSMLT QGVGDGFKRA TRYSPELDRS
1251 GNAAEAFNGT ADIVKNIIGA AGEIVGAGDA VQGISKGSNI AVMHGLGLLS
1301 TENKMARIND LADMAQLKDY AAAAIRDWAV QNPNAAQGIE AVSNIFMAAI
1351 PIKGIGAVRG KYGLGGITAH PIKRSQMGAI ALPKGKSAVS DNFADAAYAK
1401 YPSPYHSENI RSNLEQRYGK ENITSSTVPP SNGKNVKLAD QRHPKTGVPF
1451 DGKGFPNFEK HVKCYDTLEH HHHHH＊
ΔG983-741
1    ATGACTTCTG CGCCCGACTT CAATGCAGGC GGTACCGGTA TCGGCAGCAA
51   CAGCAGAGCA ACAACAGCGA AATCAGCAGC AGTATCTTAC GCCGGTATCA
101  AGAACGAAAT GTGCAAAGAC AGAAGCATGC TCTGTGCCGG TCGGGATGAC
151  GTTGCGGTTA CAGACAGGGA TGCCAAAATC AATGCCCCCC CCCCGAATCT
201  GCATACCGGA GACTTTCCAA ACCCAAATGA CGCATACAAG AATTTGATCA
251  ACCTCAAACC TGCAATTGAA GCAGGCTATA CAGGACGCGG GGTAGAGGTA
301  GGTATCGTCG ACACAGGCGA ATCCGTCGGC AGCATATCCT TTCCCGAACT
351  GTATGGCAGA AAAGAACACG GCTATAACGA AAATTACAAA AACTATACGG
401  CGTATATGCG GAAGGAAGCG CCTGAAGACG GAGGCGGTAA AGACATTGAA
451  GCTTCTTTCG ACGATGAGGC CGTTATAGAG ACTGAAGCAA AGCCGACGGA
501  TATCCGCCAC GTAAAAGAAA TCGGACACAT CGATTTGGTC TCCCATATTA
551  TTGGCGGGCG TTCCGTGGAC GGCAGACCTG CAGGCGGTAT TGCGCCCGAT
601  GCGACGCTAC ACATAATGAA TACGAATGAT GAAACCAAGA ACGAAATGAT
651  GGTTGCAGCC ATCCGCAATG CATGGGTCAA GCTGGGCGAA CGTGGCGTGC
701  GCATCGTCAA TAACAGTTTT GGAACAACAT CGAGGGCAGG CACTGCCGAC
751  CTTTTCCAAA TAGCCAATTC GGAGGAGCAG TACCGCCAAG CGTTGCTCGA
801  CTATTCCGGC GGTGATAAAA CAGACGAGGG TATCCGCCTG ATGCAACAGA
851  GCGATTACGG CAACCTGTCC TACCACATCC GTAATAAAAA CATGCTTTTC
901  ATCTTTTCGA CAGGCAATGA CGCACAAGCT CAGCCCAACA CATATGCCCT
951  ATTGCCATTT TATGAAAAAG ACGCTCAAAA AGGCATTATC ACAGTCGCAG
1001 GCGTAGACCG CAGTGGAGAA AAGTTCAAAC GGGAAATGTA TGGAGAACCG
1051 GGTACAGAAC CGCTTGAGTA TGGCTCCAAC CATTGCGGAA TTACTGCCAT
1101 GTGGTGCCTG TCGGCACCCT ATGAAGCAAG CGTCCGTTTC ACCCGTACAA
1151 ACCCGATTCA AATTGCCGGA ACATCCTTTT CCGCACCCAT CGTAACCGGC
1201 ACGGCGGCTC TGCTGCTGCA GAAATACCCG TGGATGAGCA ACGACAACCT
1251 GCGTACCACG TTGCTGACGA CGGCTCAGGA CATCGGTGCA GTCGGCGTGG
1301 ACAGCAAGTT CGGCTGGGGA CTGCTGGATG CGGGTAAGGC CATGAACGGA
1351 CCCGCGTCCT TTCCGTTCGG CGACTTTACC GCCGATACGA AAGGTACATC
1401 CGATATTGCC TACTCCTTCC GTAACGACAT TTCAGGCACG GGCGGCCTGA
1451 TCAAAAAAGG CGGCAGCCAA CTGCAACTGC ACGGCAACAA CACCTATACG
1501 GGCAAAACCA TTATCGAAGG CGGTTCGCTG GTGTTGTACG GCAACAACAA
1551 ATCGGATATG CGCGTCGAAA CCAAAGGTGC GCTGATTTAT AACGGGGCGG
1601 CATCCGGCGG CAGCCTGAAC AGCGACGGCA TTGTCTATCT GGCAGATACC
1651 GACCAATCCG GCGCAAACGA AACCGTACAC ATCAAAGGCA GTCTGCAGCT
1701  GGACGGCAAA GGTACGCTGT ACACACGTTT GGGCAAACTG CTGAAAGTGG
1751  ACGGTACGGC GATTATCGGC GGCAAGCTGT ACATGTCGGC ACGCGGCAAG
1801  GGGGCAGGCT ATCTCAACAG TACCGGACGA CGTGTTCCCT TCCTGAGTGC
1851  CGCCAAAATC GGGCAGGATT ATTCTTTCTT CACAAACATC GAAACCGACG
1901  GCGGCCTGCT GGCTTCCCTC GACAGCGTCG AAAAAACAGC GGGCAGTGAA
1951  GGCGACACGC TGTCCTATTA TGTCCGTCGC GGCAATGCGG CACGGACTGC
2001  TTCGGCAGCG GCACATTCCG CGCCCGCCGG TCTGAAACAC GCCGTAGAAC
2051  AGGGCGGCAG CAATCTGGAA AACCTGATGG TCGAACTGGA TGCCTCCGAA
2101  TCATCCGCAA CACCCGAGAC GGTTGAAACT GCGGCAGCCG ACCGCACAGA
2151  TATGCCGGGC ATCCGCCCCT ACGGCGCAAC TTTCCGCGCA GCGGCAGCCG
2201  TACAGCATGC GAATGCCGCC GACGGTGTAC GCATCTTCAA CAGTCTCGCC
2251  GCTACCGTCT ATGCCGACAG TACCGCCGCC CATGCCGATA TGCAGGGACG
2301  CCGCCTGAAA GCCGTATCGG ACGGGTTGGA CCACAACGGC ACGGGTCTGC
2351  GCGTCATCGC GCAAACCCAA CAGGACGGTG GAACGTGGGA ACAGGGCGGT
2401  GTTGAAGGCA AAATGCGCGG CAGTACCCAA ACCGTCGGCA TTGCCGCGAA
2451  AACCGGCGAA AATACGACAG CAGCCGCCAC ACTGGGCATG GGACGCAGCA
2501  CATGGAGCGA AAACAGTGCA AATGCAAAAA CCGACAGCAT TAGTCTGTTT
2551  GCAGGCATAC GGCACGATGC GGGCGATATC GGCTATCTCA AAGGCCTGTT
2601  CTCCTACGGA CGCTACAAAA ACAGCATCAG CCGCAGCACC GGTGCGGACG
2651  AACATGCGGA AGGCAGCGTC AACGGCACGC TGATGCAGCT GGGCGCACTG
2701  GGCGGTGTCA ACGTTCCGTT TGCCGCAACG GGAGATTTGA CGGTCGAAGG
2751  CGGTCTGCGC TACGACCTGC TCAAACAGGA TGCATTCGCC GAAAAAGGCA
2801  GTGCTTTGGG CTGGAGCGGC AACAGCCTCA CTGAAGGCAC GCTGGTCGGA
2851  CTCGCGGGTC TGAAGCTGTC GCAACCCTTG AGCGATAAAG CCGTCCTGTT
2901  TGCAACGGCG GGCGTGGAAC GCGACCTGAA CGGACGCGAC TACACGGTAA
2951  CGGGCGGCTT TACCGGCGCG ACTGCAGCAA CCGGCAAGAC GGGGGCACGC
3001  AATATGCCGC ACACCCGTCT GGTTGCCGGC CTGGGCGCGG ATGTCGAATT
3051  CGGCAACGGC TGGAACGGCT TGGCACGTTA CAGCTACGCC GGTTCCAAAC
3101  AGTACGGCAA CCACAGCGGA CGAGTCGGCG TAGGCTACCG GTTCCTCGAG
3151  GGATCCGGAG GGGGTGGTGT CGCCGCCGAC ATCGGTGCGG GGCTTGCCGA
3201  TGCACTAACC GCACCGCTCG ACCATAAAGA CAAAGGTTTG CAGTCTTTGA
3251  CGCTGGATCA GTCCGTCAGG AAAAACGAGA AACTGAAGCT GGCGGCACAA
3301  GGTGCGGAAA AAACTTATGG AAACGGTGAC AGCCTCAATA CGGGCAAATT
3351  GAAGAACGAC AAGGTCAGCC GTTTCGACTT TATCCGCCAA ATCGAAGTGG
3401  ACGGGCAGCT CATTACCTTG GAGAGTGGAG AGTTCCAAGT ATACAAACAA
3451  AGCCATTCCG CCTTAACCGC CTTTCAGACC GAGCAAATAC AAGATTCGGA
3501  GCATTCCGGG AAGATGGTTG CGAAACGCCA GTTCAGAATC GGCGACATAG
3551  CGGGCGAACA TACATCTTTT GACAAGCTTC CCGAAGGCGG CAGGGCGACA
3601  TATCGCGGGA CGGCGTTCGG TTCAGACGAT GCCGGCGGAA AACTGACCTA
3651  CACCATAGAT TTCGCCGCCA AGCAGGGAAA CGGCAAAATC GAACATTTGA
3701  AATCGCCAGA ACTCAATGTC GACCTGGCCG CCGCCGATAT CAAGCCGGAT
3751  GGAAAACGCC ATGCCGTCAT CAGCGGTTCC GTCCTTTACA ACCAAGCCGA
3801  GAAAGGCAGT TACTCCCTCG GTATCTTTGG CGGAAAAGCC CAGGAAGTTG
3851  CCGGCAGCGC GGAAGTGAAA ACCGTAAACG GCATACGCCA TATCGGCCTT
3901  GCCGCCAAGC AACTCGAGCA CCACCACCAC CACCACTGA
1     MTSAPDFNAG GTGIGSNSRA TTAKSAAVSY AGIKNEMCKD RSMLCAGRDD
51    VAVTDRDAKI NAPPPBNLHTGDFPNPNDAYK NLINLKPAIE AGYTGRGVEV
101   GIVDTGESVG SISFPELYGR KEHGYNENYK NYTAYMRKEA PEDGGGKDIE
151   ASFDDEAVIE TEAKPTDIRH VKEIGHIDLV SHIIGGRSVD GRPAGGIAPD
201   ATLHIMNTND ETKNEMMVAA IRNAWVKLGE RGVRIVNNSF GTTSRAGTAD
251   LFQIANSEEQ YRQALLDYSG GDKTDEGIRL MQQSDYGNLS YHIRNKNMLF
301   IFSTGNDAQA QPNTYALLPF YEKDAQKGII TVAGVDRSGE KFKREMYGEP
351   GTEPLEYGSN HCGITAMWCL SAPYEASVRF TRTNPIQIAG TSFSAPIVTG
401   TAALLLQKYP WMSNDNLRTT LLTTAQDIGA VGVDSKFGWG LLDAGKAMNG
451   PASFPFGDFT ADTKGTSDIA YSFRNDISGT GGLIKKGGSQ LQLHGNNTYT
501   GKTIIEGGSL VLYGNNKSDM RVETKGALIY NGAASGGSLN SDGIVYLADT
551   DQSGANETVH IKGSLQLDGK GTLYTRLGKL LKVDGTAIIG GKLYMSARGK
601   GAGYLNSTGR RVPFLSAAKI GQDYSFFTNI ETDGGLLASL DSVEKTAGSE
651   GDTLSYYVRR GNAARTASAA AHSAPAGLKH AVEQGGSNLE NLMVELDASE
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1251  GKRHAVISGS VLYNQAEKGS YSLGIFGGKA QEVAGSAEVK TVNGIRHIGL
1301  AAKQLEHHHH HH＊
ΔG983-961
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101   GIVDTGESVG SISFPELYGR KEHGYNENYK NYTAYMRKEA PEDGGGKDIE
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ΔG983-961c
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501   GKTIIEGGSL VLYGNNKSDM RVETKGALIY NGAASGGSLN SDGIVYLADT
551   DQSGANETVH IKGSIQLDGK GTLYTRLGKL LKVDGTAIIG GKLYMSARGK
601   GAGYLNSTGR RVPFLSAAKI GQDYSFFTNI ETDGGLLASL DSVEKTAGSE
651   GDTLSYYVRR GNAARTASAA AHSAPAGLKH AVEQGGSNLE NLMVELDASE
701   SSATPETVET AAADRTDMPG IRPYGATFRA AAAVQHANAA DGVRIFNSLA
751   ATVYADSTAA HADMQGRRLK AVSDGLDHNG TGLRVIAQTQ QDGGYWEQGG
801   VEGKMRGSTQ TVGIAAKTGE NTTAAATLGM GRSTWSENSA NAKTDSISLF
851   AGIRHDAGDI GYLKGLFSYG RYKNSISRST GADEHAEGSV NGTLMQLGAL
901   GGVNVPFAAT GDLTVEGGLR YDLLKQDAFA EKGSALGWSG NSLTEGTLVG
951   LAGLKLSQPL SDKAVLFATA GVERDLNGRD YTVTGGFTGA TAATGKTGAR
1001  NMPHTRLVAG LGADVEFGNG WNGLARYSYA GSKQYGNHSG RVGVGYRFLE
1051  GGGGTGSATN DDDVKKAATV AIAAAYNNGQ EINGFKAGET IYDIDEDGTI
1101  TKKDATAADV EADDFKGLGL KKVVTNLTKT VNENKQNVDA KVKAAESEIE
1151  KLTTKLADTD AALADTDAAL DATTNALNKL GENITTFAEE TKTNIVKIDE
1201  KLEAVADTVD KHAEAFNDIA DSLDETNTKA DEAVKTANEA KQTAEETKQN
1251  VDAKVKAAET AAGKAEAAAG TANTAADKAE AVAAKVTDIK ADIATNKDNI
1301  AKKANSADVY TREESDSKFV RIDGLNATTE KLDTRLASAE KSIADHDTRL
1351  NGLDKTVSDL RKETRQGLAE QAALAGLFQP YNVGLEHHHH HH＊
△G741和杂交体
针对各种菌株(包括同源2996菌株)，测定由应答△G741(His-融合)产生的杀菌滴定度：
 
2996 MC58 NGH38 F6124 BZ133
△G741 512 131072 >2048 16384 >2048
可以看出，针对异源菌株MC58，由△G741引发的抗-杀菌滴定度特别高。
还将△G741直接融合于蛋白质961、961c、983和ORF46.1的符合读框的上游：
ΔG741-961
1    ATGGTCGCCG CCGACATCGG TGCGGGGCTT GCCGATGCAC TAACCGCACC
51   GCTCGACCAT AAAGACAAAG GTTTGCAGTC TTTGACGCTG GATCAGTCCG
101  TCAGGAAAAA CGAGAAACTG AAGCTGGCGG CACAAGGTGC GGAAAAAACT
151  TATGGAAACG GTGACAGCCT CAATACGGGC AAATTGAAGA ACGACAAGGT
201  CAGCCGTTTC GACTTTATCC GCCAAATCGA AGTGGACGGG CAGCTCATTA
251  CCTTGGAGAG TGGAGAGTTC CAAGTATACA AACAAAGCCA TTCCGCCTTA
301  ACCGCCTTTC AGACCGAGCA AATACAAGAT TCGGAGCATT CCGGGAAGAT
351  GGTTGCGAAA CGCCAGTTCA GAATCGGCGA CATAGCGGGC GAACATACAT
401  CTTTTGACAA GCTTCCCGAA GGCGGCAGGG CGACATATCG CGGGACGGCG
451  TTCGGTTCAG ACGATGCCGG CGGAAAACTG ACCTACACCA TAGATTTCGC
501  CGCCAAGCAG GGAAACGGCA AAATCGAACA TTTGAAATCG CCAGAACTCA
551  ATGTCGACCT GGCCGCCGCC GATATCAAGC CGGATGGAAA ACGCCATGCC
601  GTCATCAGCG GTTCCGTCCT TTACAACCAA GCCGAGAAAG GCAGTTACTC
651  CCTCGGTATC TTTGGCGGAA AAGCCGCGGA AGTTGCCGGC AGCGCGGAAG
701  TGAAAACCGT AAACGGCATA CGCCATATCG GCCTTGCCGC CAAGCAACTC
751  GAGGGTGGCG GAGGCACTGG ATCCGCCACA AACGACGACG ATGTTAAAAA
801  AGCTGCCACT GTGGCCATTG CTGCTGCCTA CAACAATGGC CAAGAAATCA
851  ACGGTTTCAA AGCTGGAGAG ACCATCTACG ACATTGATGA AGACGGCACA
901  ATTACCAAAA AAGACGCAAC TGCAGCCGAT GTTGAAGCCG ACGACTTTAA
951  AGGTCTGGGT CTGAAAAAAG TCGTGACTAA CCTGACCAAA ACCGTCAATG
1001 AAAACAAACA AAACGTCGAT GCCAAAGTAA AACGTGCAGA ATCTGAAATA
1051 GAAAAGTTAA CAACCAAGTT AGCAGACACT GATGCCGCTT TAGCAGATAC
1101 TGATGCCGCT CTGGATGCAA CCACCAACGC CTTGAATAAA TTGGGAGAAA
1151 ATATAACGAC ATTTGCTGAA GAGACTAAGA CAAATATCGT AAAAATTGAT
1201 GAAAAATTAG AAGCCGTGGC TGATACCGTC GACAAGCATG CCGAAGCATT
1251 CAACGATATC GCCGATTCAT TGGATGAAAC CAACACTAAG GCAGACGAAG
1301 CCGTCAAAAC CGCCAATGAA GCCAAACAGA CGGCCGAAGA AACCAAACAA
1351 AACGTCGATG CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA ACTGCAGCAG GCAAAGCCGA
1401 AGCTGCCGCT GGCACAGCTA ATACTGCAGC CGACAAGGCC GAAGCTGTCG
1451 CTGCAAAAGT TACCGACATC AAAGCTGATA TCGCTACGAA CAAAGATAAT
1501 ATTGCTAAAA AAGCAAACAG TGCCGACGTG TACACCAGAG AAGAGTCTGA
1551 CAGCAAATTT GTCAGAATTG ATGGTCTGAA CGCTACTACC GAAAAATTGG
1601 ACACACGCTT GGCTTCTGCT GAAAAATCCA TTGCCGATCA CGATACTCGC
1651 CTGAACGGTT TGGATAAAAC AGTGTCAGAC CTGCGCAAAG AAACCCGCCA
1701 AGGCCTTGCA GAACAAGCCG CGCTCTCCGG TCTGTTCCAA CCTTACAACG
1751 TGGGTCGGTT CAATGTAACG GCTGCAGTCG GCGGCTACAA ATCCGAATCG
1801 GCAGTCGCCA TCGGTACCGG CTTCCGCTTT ACCGAAAACT TTGCCGCCAA
1851 AGCAGGCGTG GCAGTCGGCA CTTCGTCCGG TTCTTCCGCA GCCTACCATG
1901 TCGGCGTCAA TTACGAGTGG CTCGAGCACC ACCACCACCA CCACTGA
1    MVAADIGAGL ADALTAPLDH KDKGLQSLTL DQSVRKNEKL KLAAQGAEKT
51   YGNGDSLNTG KLKNDKVSRF DFIRQIEVDG QLITLESGEF QVYKQSHSAL
101  TAFQTEQIQD SEHSGKMVAK RQFRIGDIAG EHTSFDKLPE GGRATYRGTA
151  FGSDDAGGKL TYTIDFAAKQ GNGKIEHLKS PELNVDLAAA DIKPDGKRHA
201  VISGSVLYNQ AEKGSYSLGI FGGKAQEVAG SAEVKTVNGI FHIGLAAKQL
251  EGGGGTGSAT NDDDVKKAAT VAIAAAYNNG QEINGFKAGE TIYDIDEDGT
301  ITKKDATAAD VEADDFKGLG LKKVVTNLTK TVNENKQNVD AKVKAAESEI
351  EKLTTKLADT DAALADTDAA LDATTNALNK LGENITTFAE ETKTNIVKID
401  EKLEAVADTV DKHAEAFNDI ADSLDETNTK ADEAVKTANE AKQTAEETKQ
451  NVDAKVKAAE TAAGKAEAAA GTANTAADKA EAVAAKVTDI KADIATNKDN
501  IAKKANSADV YTREESDSKF VRIDGLNATT EKLDTRLASA EKSIADHDTR
551  LNGLDKTVSD LRKETRQGLA EQAALSGLFQ PYNVGRFNVT AAVGGYKSES
601  AVAIGTGFRF TENFAAKAGV AVGTSSGSSA AYHVGVNYEW LEHHHHHH＊
ΔG741-961c
1    ATGGTCGCCG CCGACATCGG TGCGGGGCTT GCCGATGCAC TAACCGCACC
51   GCTCGACCAT AAAGACAAAG GTTTGCAGTC TTTGACGCTG GATCAGTCCG
101  TCAGGAAAAA CGAGAAACTG AAGCTGGCGG CACAAGGTGC GGAAAAAACT
151  TATGGAAACG GTGACAGCCT CAATACGGGC AAATTGAAGA ACGACAACGT
201  CAGCCGTTTC GACTTTATCC GCCAAATCGA AGTGGACGGG CAGCTCATTA
251  CCTTGGAGAG TGGAGAGTTC CAAGTATACA AACAAAGCCA TTCCGCCTTA
301  ACCGCCTTTC AGACCGAGCA AATACAAGAT TCGGAGCATT CCGGGAAGAT
351  GGTTGCGAAA CGCCAGTTCA GAATCGGCGA CATAGCGGGC GAACATACAT
401  CTTTTGACAA GCTTCCCGAA GGCGGCAGGG CGACATATCG CGGGACGGCG
451  TTCGGTTCAG ACGATGCCGG CGGAAAACTG ACCTACACCA TAGATTTCGC
501  CGCCAAGCAG GGAAACGGCA AAATCGAACA TTTGAAATCG CCAGAACTCA
551  ATGTCGACCT GGCCGCCGCC GATATCAAGC CGGATGGAAA ACGCCATGCC
601  GTCATCAGCG GTTCCGTCCT TTACAACCAA GCCGAGAAAG GCAGTTACTC
651  CCTCGGTATC TTTGGCGGAA AAGCCCAGGA AGTTGCCGGC AGCGCGGAAG
701  TGAAAAACCGT AAACGGCATA CGCATATCG GCCTTGCCGC CAAGCAACTC
751  GAGGGTGGCG GAGGCACTGG ATCCGCCACA AACGACGACG ATGTTAAAAA
801  AGCTGCCACT GTGGCCATTG CTGCTGCCTA CAACAATGGC CAAGAAATCA
851  ACGGTTTCAA AGCTGGAGAG ACCATCTACG ACATTGATGA AGACGGCACA
901  ATTACCAAAA AAGACGCAAC TGCAGCCGAT GTTGAAGCCG ACGACTTTAA
951  AGGTCTGGGT CTGAAAAAAG TCGTGACTAA CCTGACCAAA ACCGTCAATG
1001 AAAACAAACA AAACGTCGAT GCCAAAGTAA AAGCTGCAGA ATCTGAAATA
1051 GAAAAGTTAA CAACCAAGTT AGCAGACACT GATGCCGCTT TAGCAGATAC
1101 TGATGCCGCT GTGGATGCAA CCACCAACGC CTTGAATAAA TTGGGAGAAA
1151 ATATAACGAC ATTTGCTGAA GAGACTAAGA CAAATATCGT AAAAATTGAT
1201 GAAAAATTAG AAGCCGTGGC TGATACCGTC GACAAGCATG CCGAAGCATT
1251 CAACGATATC GCCGATTCAT TGGATGAAAC CAACACTAAG GCAGACGAAG
1301 CCGTCAAAAC CGCCAATGAA GCCAAACAGA CGGCCGAAGA AACCAAACAA
1351 AACGTCGATG CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA ACTGCAGCAG GCAAAGCCGA
1401 AGCTGCCGCT GGCACAGCTA ATACTGCAGC CGACAAGGCC GAAGCTGTCG
1451 CTGCAAAAGT TACCGACATC AAAGCTGATA TCGCTACGAA CAAAGATAAT
1501 ATTGCTAAAA AAGCAAACAG TGCCGACGTG TACACCAGAG AAGAGTCTGA
1551 CAGCAAATTT GTCAGAATTG ATGGTCTGAA CGCTACTACC GAAAAATTGG
1601 ACACACGCTT GGCTTCTGCT GAAAAATCCA TTGCCGATCA CGATACTCGC
1651 CTGAACGGTT TGGATAAAAC AGTGTCAGAC CTGCGCAAAG AAACCCGCCA
1701 AGGCCTTGCA GAACAAGCCG CGCTCTCCGG TCTGTTCCAA CCTTACAACG
1751 TGGGTCTCGA GCACCACCAC CACCACCACT GA
1    MVAADIGAGL ADALTAPLDH KDKGLQSLTL DQSVRKNEKL KLAAQGAEKT
51   YGNGDSLNTG KLKNDKVSRF DFIRQIEVDG QLITLESGEF QVYKQSHSAL
101  TAFQTEQIQD SEHSGKMVAK RGFRIGDIAG EHTSFDKLPE GGRATYRGTA
151  FGSDDAGKKL TYTIDFAAKQ GNGKIEHLKS PELNVLLAAA DIKPDGKRHA
201  VISGSVLYNQ AEKGSYSLGI FGGKAQEVAG SAEVKTVNGI RHIGLAAKQL
251  EGGGGTGSAT NDDDVKKAAT VAIAAAYNNG QEINGFKAGE TIYDIDEDGT
301  ITKKDATAAD VEADDFKGLG LKKVVINLTK TVNENKQNVD AKVKAAESEI
351  EKLTTKLADT DAALADTDAA LDATTNALNK LGENITTFAE ETKTNIVKID
401  EKLEAVADTV DKHAEAFNDI ADSLDETNTK ADEAVKTANE AKQTAEETKQ
451  NVDAKVKAAE TAAGKAEAAA GTANTAADKA EAVAAKVTDI KADIATNKDN
501  IAKKANSADV YTREESDSKF VRIDGLNATT EKLDTRLASA EKSIADHDTR
551  LNGLDKTVSD LRKETRQGLA EQAALSGLFQ PYNVGLEHHH HHH＊
ΔG741-983
1    ATGGTCGCCG CCGACATCGG TGCGGGGCTT GCCGATGCAC TAACCGCACC
51   GCTCGACCAT AAAGACAAAG GTTTGCAGTC TTTGACGCTG GATCAGTCCG
101  TCAGGAAAAA CGAGAAACTG AAGCTGGCGG CACAAGGTGC GGAAAAAACT
151  TATGGAACG  GTGACAGCCT CAATACGGGC AAATTGAAGA ACGACAAGGT
201  CAGCCGTTTC GACTTTATCC GCCAAATCGA AGTGGACGGG CAGCTCATTA
251  CCTTGGAGAG TGGAGAGTTC CAAGTATACA AACAAAGCCA TTCCGCCTTA
301  ACCGCCTTTC AGACCGAGCA AATACAAGAT TCGGAGCATT CCGGGAAGAT
351  GGTTGCGAAA CGCCAGTTCA GAATCGGCGA CATAGCGGGC GAACATACAT
401  CTTTTGACAA GCTTCCCGAA GGCGGCAGGG CGACATATCG CGGGACGGCG
451  TTCGGTTCAG ACGATGCCGG CGGAAAACTG ACCTACACCA TAGATTTCGC
501  CGCCAAGCAG GGAAACGGCA AAATCGAACA TTTGAAATCG CCAGAACTCA
551  ATGTCGACCT GGCCGCCGCC GATATCAAGC CGGATGGAAA ACGCCATGCC
601  GTCATCAGCG GTTCCGTCCT TTACAACCAA GCCGAGAAAG GCAGTTACTC
651  CCTCGGTATC TTTGGCGGAA AAGCCCAGGA AGTTGCCGGC AGCGCGGAAG
701  TGAAAACCGT AAACGGCATA CGCCATATCG GCCTTGCCGC CAAGCAACTC
751  GAGGGATCCG GCGGAGGCGG CACTTCTGCG CCCGACTTCA ATGCAGGCGG
801  TACCGGTATC GGCAGCAACA GCAGAGCAAC AACCAGGAAA TCAGCAGCAG
851  TATCTTACGC CGGTATCAAG AACGAAATGT GCAAAGACAG AGCATGGCTC
901  TGTGCCGGTC GGGATGACGT TGCGGTTACA GACAGGGATG CCAAATACAA
951  TGCCCCCCCC CCGAATCTGC ATACCGGAGA CTTTCCAAAC CCAAATGACG
1001 CATACAAGAA TTTGATCAAC CTCAAACCTG CAATTGAAGC AGGCTATACA
1051 GGACGGCGGG TGAGGTAGG  TATCGTCGAC ACAGGCGAAT CCGTCGGCAG
1101 CATATCCTTT CCCGAACTGT ATGGCAGAAA AGAACACGGC TATAACGAAA
1151 ATTACAAAAA CTATACGGCG TATATGCGGA AGGAAGCGCC TGAAGACGGA
1201 GGCGGTAAAG ACATTGAAGC TTCTTTCGAC GATGAGGCCG TTATAGAGAC
1251 TGAAGCAAAG CCGACGGATA TCGCCACGTA AAAAGAAATC GGACACATCG
1301 ATTTGGTCTC CCATATTATT GGCGGGCGTT CCGTGGACGG CAGACCTGCA
1351 GGCGGTATTG CGCCCGATGC GACGCTACAC ATAATGAATA CGAATGATGA
1401 AACCAAGAAC GAAATGATGG TTGCAGCCAT CCGCAATGCA TGGGTCAAGC
1451 TGGGCGAACG TGGCGTGCGC ATCGTCAATA ACAGTTTTGG AACAACATCG
1501 AGGGCAGGCA CTGCCGACCT  TTTCCAAATA GCCAATTCGG AGGAGCAGTA
1551  CCGCCAAGCG TTGCTCGACT ATTCCGGCGG TGATAAAACA GACGAGGGTA
1601  TCCGCCTGAT GCAACAGAGC GATTACGCCA ACCTGTCCTA CCACATCCGT
1651  AATAAAAACA TGCTTTTCAT CTTTTCGACA GGCAATGACG CACAAGCTCA
1701  GCCCAACACA TATGCCCTAT TGCCATTTTA TGAAAAAGAC GCTCAAAAAG
1751  GCATTATCAC AGTCGCAGGC GTAGACCGCA GTGGAGAAAA GTTCAAACGG
1801  GAAATGTATG GAGAACCGGG TACAGAACCG CTTGAGTATG GCTCCAACCA
1851  TTGCGGAATT ACTGCCATGT GGTGCCTGTC GGCACCCTAT GAAGCAAGCG
1901  TCCGTTTCAC CCGTACAAAC CCGATTCAAA TTGCCGGAAC ATCCTTTTCC
1951  GCACCCATCG TAACCGGCAC GGCGGCTCTG CTGCTGCACA AATACCCGTG
2001  GATGAGCAAC GACAACCTGC GTACCACGTT GCTGACGACG GCTCAGGACA
2051  TCGGTGCAGT CGGCGTGGAC AGCAAGTTCG GCTGGGGACT GCTGGATGCG
2101  GGTAAGGCCA TGAACGGACC CGCGTCCTTT CCGTTCGGCG ACTTTACCGC
2151  CGATACGAAA GGTACATCCG ATATTGCCTA CTCCTTCCGT AACACATTT
2201  CAGGCACGGG CGGCCTGATC AAAAAAGGCG GCAGCCAACT GCAACTGCAC
2251  GGCAACAACA CCTATACGGG CAAAACCATT ATCGAAGGCG GTTCGCTGGT
2301  GTTGTACGGC AACAACAAAT CGGATATGCG CGTCGAAACC AAAGGTGCGC
2351  TGATTTATAA CGGGGCGGCA TCCGGCGGCA GCCTGAACAG CGACGGCATT
2401  GTCTATCTGG CAGATACCGA CCAATCCGGC GCAAACGAAA CCGTACACAT
2451  CAAAGGCAGT CTGCAGCTGG ACGGCAAAGG TACGCTGTAC ACACGTTTGG
2501  GCAAACTGCT GAAAGTGGAC GGTACGGCGA TTATCGGCGG CAAGCTGTAC
2551  ATGTCGGCAC GCGGCAAGGG GGCAGGCTAT CTCAACAGTA CCQGACGACG
2601  TGTTCCCTTC CTGAGTGCCG CCAAAATCGG GCAGGATTAT TCTTTCTTCA
2651  CAAACATCGA AACCGACGGC GGCCTGCTGG CTTCCCTCGA CAGCGTCGAA
2701  AAAACAGCGG GCAGTGAAGG CGACACGCTG TCCTATTATG TCCGTCGCGG
2751  CAATGCGGCA CGGACTGCTT CGGCAGCGGC ACATTCCGCG CCCGCCGGTC
2801  TGAAACACGC CGTAGAACAG GGCGGCAGCA ATCTGGAAAA CCTGATGGTC
2851  GAACTGGATG CCTCCGAATC ATCCGCAACA CCCGAGACGG TTGAAACTGC
2901  GGCAGCCGAC CGCACAGATA TGCCGGGCAT CCGCCCCTAC GGCGCAACTT
2951  TCCGCGCAGC GGCAGCCGTA CAGCATGCGA ATGCCGCCGA CGGTGTACGC
3001  ATCTTCAACA GTCTCGCCGC TACCGTCTAT GCCGACAGTA CCGCCGCCCA
3051  TGCCGATATG CAGGGACGCC GCCTGAAAGC CGTATCGGAC GGGTGGACC
3101  ACAACGGCAC GGGTCTGCGC GTCATCGCGC AAACCCAACA GGACGGTGGA
3151  ACGTGGGAAC AGGGCGGTGT TGAAGGCAAA ATGCGCGGCA GTACCCAAAC
3201  CGTCGGCATT GCCGCGAAAA CCGGCGAAAA TACGACAGCA GCCGCCACAC
3251  TGGGCATGGG ACGCAGCACA TGGAGCGAAA ACAGTGCAAA TGCAAAAACC
3301  GACAGCATTA GTCTGTTTGC AGGCATACGG CACGATGCGG GCGATATCGG
3351  CTATCTCAAA GGCCTGTTCT CCTACGGACG CTACAAAAAC AGCATCAGCC
3401  GCAGCACCGG TGCGGACGAA CATGCGGAAG GCAGCGTCAA CGGCACGCTG
3451  ATGCAGCTGG GCGCACTGGG CGGTGTCAAC GTTCCGTTTG CCGCAACGGG
3501  AGATTTGACG GTCGAAGGCG GTCTGCGCTA CGACCTGCTC AAAACAGATG
3551  CATTCGCCGA AAAAGGCAGT GCTTTGGGCT GGAGCGGCAA CAGCCTCACT
3601  GAAGGCACGC TGGTCGGACT CGCGGGTCTG AAGCTGTCGC AACCCTTGAG
3651  CGATAAAGCC GTCCTGTTTG CAACGGCGGG CGTGGAACGC GACCTGAACG
3701  GACGCGACTA CACGGTAACG GGCGGCTTTA CCGGCGCGAC TGCAGCAACC
3751  GGCAAGACGG GGGCACGCAA TATGCCGCAC ACCCGTCTGG TTGCCGGCCT
3801  GGGCGCGGAT GTCGAATTCG GCAACGGCTG GAACGGCTTG GCACGTTACA
3851  GCTACGCCGG TTCCAAACAG TACGGCAACC ACAGCGGACG AGTCGGCGTA
3901  GGCTACCGGT TCCTCGAGCA CCACCACCAC CACCACTGA
1     MVAADIGAGL ADALTAPLDH KDKGLQSLTL DQSVRKNEKL KLAAQGAEKT
51    YGNGDSLNTG KLKNDKVSRF DFIRQIEVDG QLITLESGEF QVYKQSHSAL
101   TAFQTEQIQD SEHSGKMVAK RQFRIGDIAG EHTSFDKLPE GGRATYRGTA
151   FGSDDAGGKL TYTIDFAAKQ GNGKIEHLKS PELNVDLAAA DIKPDGKRHA
201   VISGSVLYNQ AEKGSYSLGI FGGKAQEVAG SAEVKTVNGI RHIGLAAKQL
251   EGSGGGGTSA PDFNAGGTGI GSNSRATTAK SAAVSYAGIK NEMCKDRSML
301   CAGRDDVAVT DRDAKINAPP PNLHTGDFPN PNDAYKNLIN LKPAIEAGYT
351   GRGVEVGIVD TGESVGSISF PELYGRKEEG YNENYKNYTA YMRKEAPEDG
401   GGKDIEASFD DEAVIETEAK PTDIRHVKEI GHIDLVSHII GGRSVDGRPA
451   GGIAPDATLH IMNTNDETKN EMMVAAIRNA WVKLGERGVR IVNNSFGTTS
501   RAGTADLFQI ANSEEQYRQA LLDYSGGDKT DEGIRLMQQS DYGNLSYHIR
551   MKNMLFIFST GNDAQAQPNT YALLPFYEKD AQKGIITVAG VDREGEKFKR
601   EMYGEPGTEP LEYGSNHCGI TAMWCLSAPY EASVRFTRTN PIQIAGTSFS
651   APIVTGTAAL LLQKYPWMSN DNLRTTLLTT AQDIGAVGVD SKFGWGLLDA
701   GKAMNGPASF PFGDFTADTK GTSDIAYSFR NDISGTGGLI KKGGSQLQLH
751   GNNTYTGKTI IEGGSLVLYG NNKSDMRVET KGALIYNGAA SGGSLNSDGI
801   VYLADTDQSG ANETVHIKGS LQLDGKGTLY TRLGKLLKVD GTAIIGGKLY
851   MSARGKGAGY LNSTGRRVPF LSAAKIGQDY SFFTNIETDG GLLASLDSVE
901  KTAGSEGDTL SYYVRRGNAA RTASAAAHSA PAGLKHAVEQ GGSNLENLMV
951  ELDASESSAT PETVETAAAD RTDMPGIRPY GATFRAAAAV QHANAADGVR
1001 IFNSLAATVY ADSTAAHADM QGRRLKAVSD GLDHNGTGLR VIAQTQQDGG
1051 TWEQGGVEGK MRGSTQTVGI AAKTGENTTA AATLGMGRST WSENSANAKT
1101 DSISLFAGIR HDAGDIGYLK GLFSYGRYKN SISRSTGADE HAEGSVNGTL
1151 MQLGALGGVN VPFAATGDLT VEGGLRYDLL KQDAFAEKGS ALGWSGNSLT
1201 EGTLVGLAGL KLSQPLSDKA VLFATAGVER DLNGRDYTVT GGFTGATAAT
1251 GKTGARNMPH TRLVAGLGAD VEFGNGWNGL ARYSYAGSKQ YGNHSGRVGV
1301 GYRFLEHHHHHH＊
ΔG741-ORF46.1
1    ATGGTCGCCG CCGACATCGG TGCGGGGCTT GCCGATGCAC TAACCGCACC
51   GCTCGACCAT AAAGACAAAG GTTTGCAGTC TTTGACGCTG GATCAGTCCG
101  TCAGGAAAAA CGAGAAACTG AAGCTGGCGG CACAAGGTGC GGAAAAAACT
151  TATGGAAACG GTGACAGCCT CAATACGGGC AAATTGAAGA ACGACAAGGT
201  CAGCCGTTTC GACTTTATCC GCCAAATCGA AGTGGACGGG AGCTCATTA
251  CCTTGGAGAG TGGAGAGTTC CAAGTATACA AACAAAGCCA TTCCGCCTTA
301  ACCGCCTTTC AGACCGAGCA AATACAAGAT TCGGAGCATT CCGGGAAGAT
351  GGTTGCGAAA CGCCAGTTCA GAATCGGCGA CATAGCGGGC GAACATACAT
401  CTTTTGACAA GCTTCCCGAA GGCGGCAGGG CGACATATCG CGGGACGGCG
451  TTCGGTTCAG ACGATGCCGG CGGAAAACTG ACCTACACCA TAGATTTCGC
501  CGCCAAGCAG GGAAACGGCA AAATCGAACA TTTGAAATCG CCAGAACTCA
551  ATGTCGACCT GGCCGCCGCC GATATCAAGC CGGATGGAAA ACGCCATGCC
601  GTCATCAGCG GTTCCGTCCT TTACAACCAA GCCGAGAAAG GCAGTTACTC
651  CCTCGGTATC TTTGGCGGAA AAGCCCAGGA AGTTGCCGGC AGCGCGGAAG
701  TGAAAACCGT AAACGGCATA CGCCATATCG GCCTTGCCGC CAAGCAACTC
751  GACGGTGGCG GAGGCACTGG ATCCTCAGAT TTGGCAAACG ATTCTTTTAT
801  CCGGCAGGTT CTCGACCGTC AGCATTTCGA ACCCGACGGG AAATACCACC
851  TATTCGGCAG CAGGGGGGAA CFTGCCGAGC GCAGCGGCCA TATCGGATTG
901  GGAAAAATAC AAAGCCATCA GTTGGGCAAC CTGATGATTC AACAGGCGGC
951  CATTAAAGGA AATATCGGCT ACATTGTCCG CTTTTCCGAT CACGGGCACG
1001 AAGTCCATTC CCCCTTCGAC AACCATGCCT CACATTCCGA TTCTGATGAA
1051 GCCGGTAGTC CCGTTGACGG ATTTAGCCTT TACCGCATCC ATTGGGACGG
1101 ATACGAACAC CATCCCGCCG ACGGCTATGA CGGGCCACAG GGCGGCGGCT
1151 ATCCCGCTCC CAAAGGCGCG AGGGATATAT ACAGCTACGA CATAAAAGGC
1201 GTTGCCCAAA ATATCCGCCT CAACCTGACC GACAACCGCA GCACCGGACA
1251 ACGGCTTGCC GACCGTTTCC ACAATGCCGG TAGTATGCTG ACGCAAGGAG
1301 TAGGCGACGG ATTCAAACGC GCCACCCGAT ACAGCCCCGA GCTGGACAGA
1351 TCGGGCAATG CCGCCGAAGC CTTCAACGGC ACTGCAGATA TCGTTAAAAA
1401 CATCATCGGC GCGGCAGGAG AAATTGTCGG CGCAGGCGAT GCCGTGCAGG
1451 GCATAAGCGA AGGCTCAAAC ATTGCTGTCA TGCACGGCTT GGGTCTGCTT
1501 TCCACCGAAA ACAAGATGGC GCGCATCAAC GATTTGGCAG ATATGGCGCA
1551 ACTCAAAGAC TATGCCGCAG CAGCCATCCG CGATTGGGCA GTCCAAAACC
1601 CCAATGCCGC ACAAGGCATA GAAGCCGTCA GCAATATCTT TATGGCAGCC
1651 ATCCCCATCA AAGGGATTGG AGCTGTTCGG GGAAAATACG GCTTGGGCGG
1701 CATCACGGCA CATCCTATCA AGCGGTCGCA GATGGGCGCG ATCGCATGC
1751 CGAAAGGGAA ATCCGCCGTC AGCGACAATT TTGCCGATGC GGCATACGCC
1801 AAATACCCGT CCCCTTACCA TTCCCGAAAT ATCCGTTCAA ACTTGGAGCA
1851 GCGTTACGGC AAAGAAAACA TCACCTCCTC AACCGTGCCG CCGTCAAACG
1901 GCAAAAATGT CAAACTGGCA GACCAACGCC ACCCGAAGAC AGGCGTACCG
1951 TTTGACGGTA AAGGGTTTCC GAATTTTGAG AAGCACGTGA AATATGATAC
2001 GCTCGAGCAC CACCACCACC ACCACTGA
1    MVAADIGAGL ADALTAAPLD HKDKGLQSLTL DQSVRKNEKL KLAAQGAEKT
51   YGNGDSLNTG KLLNDKVSRF 
Figure C200310102845D0053105403QIETU
 QLITLESGEF GVYKQSHSAL
101  TAFQTEQIQD SEHSGKMVAK RQFRIGDIAG  EHTSFDKLPE GGRATYRGTA
151  FGSDDAGGKL TYTIDFAAKQ GNGKIEHLKS  PELNVDLAAA DIKPDGKRHA
201  VISGSVLYNQ AEKGSYSLGI FGGKAQEVAG  SAEVKTVNGI RHIGLAAKQL
251  DGGGGTGSSD LANDSFIRQV LDRGHFEPDG  KYHLFGSRGE LAERSGHIGL
301  GKIQSHQLGN LMIQQAAIKG NIGYIVRFSD  HGHEVHSPFD NHASHSDSDE
351  AGSPVDGFSL YRIHWDGYEH HPADGYDGPQ  GGGYPAPKGA RDIYSYDIKG
401  VAQNIRLNLT DNRSTGQRLA DRFHNAGSML  TQGVGDGFKR ATRYSPELDR
451  SGNAAKAFNG TADIVKNIIG AAGEIVGAGD  AVQGISEGSN IAVMHGLGLL
501  STENKNARIN DLADMAQLKD YAAAAIRDWA  VQNPNAAQGI EAVSNIFNAA
551  IPIKGIGAVR GKYGLGGITA HPIKRSQMGA  IALPKGKSAV SDNFADAAYA
601  KYPSPYHSRN IRSNLEQRYG KENITSSTVP  PSNGKNVKLA DQRHPKTGVP
651  FDGKGFPNFE KHVKYDTLEH HHHHH＊
实施例16-与287/△G287的C-未端融合(‘杂交体′)
按照本发明，两种蛋白质A和B的杂交体可能是NH2-A-B-COOH或NH2-B-A-COOH。用在919、953和ORF46.1的C-端(以‘287-His′形式)或N-未端(以△G287形式-如上所示的序列)的蛋白质287研究了这种差异的影响。使用一组菌株，包括同源菌株2996。用FCA作为佐剂：
Figure C200310102845D00541
通常用N-未端的297(以△G的形式)观察到较好的杀菌滴定度。
当融合于蛋白质961[NH2-△G287-961-COOH-上述可示序列]时，得到的的蛋白质是不溶的且必须变性和复性以用于纯化。复性后，发现50％蛋白质仍不溶解。比较可溶性和不溶性蛋白质，用可溶性蛋白质获得的杀菌滴定度好得多(FCA作为佐剂)：
 
2996 BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133
可溶性 65536 128 4096 >2048 >2048 4096
难溶性 8192 <4 <4 16 n.d. n.d.
然而，用明矾佐剂替代可以改善难溶形式蛋白质的滴定度：
 
难溶性 32768 128 4096 >2048 >2048 2048
实施例17-N-未端融合(′杂交体′)于287
将蛋白质287以全长、含C-未端His-标记、或无其前导肽但而包含C-未端His-标记表达的水平相当低。用N-未端GST-融合实现较好的表达。
或者将GST用作N-未端融合配体，将287置于蛋白质919的C-未端(‘919-287′)、蛋白质953的C-未端(‘953-287′)和蛋白质ORF46.1的C-未端(‘ORF46.1-287′)。在这两种情况中，除去前导肽，且杂交体是直接的符合读框的融合。
为了产生953-287杂交体，设计各序列的前导肽的正向引物下游以除去这两种蛋白质的前导肽；除去953反向引物中的终止密码子序列，但包含在287反向引物中。对953基因而言，用于扩增的5′和3′引物分别包括NdeI和BamHI限制酶切位点，而对287基因的扩增而言，5′和3′引物分别包括BamHI和XhoI限制酶切位点。在这种方法中，使用NdeI-BamHI(用于克隆第一个基因)和随后的BamHI-XhoI(用于克隆第二基因)可以实现pET21b+中两个基因的顺序定向克隆。
通过将编码287的成熟部分的序列克隆入pET21b+中的919-His克隆的3′端的XhoI位点中，获得919-287杂交体。设计用于扩增287基因的引物，从而在PCR片段的5′端引入SalI限制酶切位点，并在3′端引入XhoI位点。由于由SalI和XhoI限制酶产生的粘性末端是相容的，可以将用SalI-XhoI消化的287PCR扩增产物插入由XhoI切割的pET21b-919克隆中。
类似地获得ORF46.1-287杂交体。
将针对杂交蛋白产生的抗体的杀菌效力(同源菌株)与针对组分抗原的简单混合物产生的抗体的杀菌效力相比较：
 
与287的混合物 与287的杂交体
919 32000 16000
953 8192 8192
ORF46.1 128 8192
还获得了919-287和953-287针对异源MenB菌株和血清型A和C的杀菌活性数据：
Figure C200310102845D00551
还构建了ORF46.1和919的杂交体。最佳的结果(高四倍的滴定度)是用在N-未端的919实现的。
还测试了杂交体919-519His、ORF97-225His和225-ORF97His。它们得到中等ELISA滴定度和杀菌的抗体应答。
实施例18-ORF4的前导肽
如上所示，可以将ORF4的前导肽融合于其它蛋白质(如蛋白质287和919)的成熟序列。其可以指导大肠杆菌中的脂质化。
实施例19-564中的结构域
蛋白质′564′非常大(2073aa)，且其难以克隆并以完整形式表达。为了便于表达，如图8所示(按MC58序列)将该蛋白质分为四个结构域：
 
结构域 A B C D
氨基酸 79-360 361-731 732-2044 2045-2073
这些结构域显示出如下同源性：
·结构域A显示与其它细菌毒素同源：
gb|AAG03431.1|AE004443-9       可能血凝素[绿脓假单胞菌](38％)
gb|AAC31981.1|(139897)         HecA[菊果胶杆菌](45％)
emb|CAA36409.1|(X52156)        丝状血凝素[百日咳博德特氏菌](31％)
gb|AAC79757.1|(AF057695)       大量上清液蛋白质1[杜氏嗜血菌](26％)
gb|AAA25657.1|(M30186)         HpmA前体[奇异变形菌](29％)
·结构域B显示为非同源的，且是对564特异性的。
·结构域C显示为与以下同源：
gb|AAF84995.1|AE004032         HA-样分泌的蛋白质[苛养木杆菌](33％)
gb|AAG05850.1|AE004673         假说蛋白质[铜绿假单胞菌](27％)
gb|AAF68414.1AF237928          推定的FHA[多杀巴斯德氏菌](23％)
gb|AAC79757.1|(AF057695)       大量上清液蛋白质1[杜氏嗜血菌](23％)
pir||S21010                    FHA B前体[百日咳博德特氏菌](20％)
·结构域D显示与前体细菌毒素同源：
gb|AAF84995.1|AE004032_14HA-样分泌的蛋白质[苛养木杆菌](29％)
用MC58菌株序列，以GST-融合(未纯化)和his-标记的蛋白质形式获得564ab良好的细胞内表达；该结构域-对还以脂蛋白形式表达，其表现出在外膜/上清液组分中有中等表达。
当以his-标记的产物(未纯化)表达时，b结构域显示中等细胞内表达，而以GST-融合则表达良好。
以GST-融合表达时c，结构域显示良好的细胞内表达，但是不溶的。以his标记的产物(未纯化)表达时，d结构域显示中等细胞内表达。以GST-融合体表达时，cd蛋白质结构域对表现中等细胞内表达(未纯化)。
用c结构域和bc对观察到良好的杀菌试验滴定度。
实施例20-919前导肽
在以上的实施例1中讨论了919的20mer前导肽：
MKKYLFRAAL YGIAAAILAA
如实施例1所示，该前导肽的缺失改进了异源表达(如用ORF4前导肽替代该前导肽一样)。通过将编码序列融合于摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)的PhoC报道基因研究了919前导肽对表达的影响[Thaller等，(1994)Microbiology 140：1341-1350]。将该构建物克隆入NdeI和XhoI位点间的pET21-b质粒中(图9)：
1    MKKYLFRAAL YGIAAAILAA AIPAGNDATT  KPDLYYLKNE  QAIDSLKLLP
51   PPPEVGSIQF LNDQAMYEKG RMLRNTEAGK  QAQADADLAA  GGVATAFSGA
101  FGYPITEKDS PELYKLLTNM IEDAGDLATR  SAKEHYMRIR  PFAFYGTETC
151  NTKDQKKLST NGSYPSGHTS IGWATALVLA  EVNPANQDAI  LERGYQLGQS
201  RVICGYHWQS DVDAARIVGS AAVATLHSDP  AFQAQLAKAK  QEFAQKSQK＊
该质粒的PhoC的表达水平比相同的但包含天然PhoC信号肽的构建物中发现的低>200倍。即使用大肠杆菌Plac启动子替代T7启动子后也得到相同的结果。这表明919前导序列对表达的影响并非取决于所用的启动子。
为了研究这些结果是否是由于919信号肽核苷酸序列(二级结构形式，对RNA酶等敏感)的某些特性或存在该信号肽引起的蛋白质不稳定性导致的，产生了许多突变体。所用的方法是通过克隆含简并密码子的合成接头替代919信号肽序列的核苷酸。用这种方法获得含核苷酸和/或氨基酸取代的变体。
使用两种不同的接头，设计919信号肽序列的两个不同区域中产生突变，即在第一19碱基对(L1)中和碱基20-36之间(S1)。
L1：5′T ATG AAa/g TAC/t c/tTN TTt/c a/cGC GCC GCC CTGTAC GGC ATC GCC GCC
GCC ATC CTC GCC GCC GCG ATC CC 3′
S1：5′T ATG AAA AAA TAC CTA TTC CGa/g GCN GCN c/tTa/g TAc/t GGc/g ATC GCC
GCC GCC ATC CTC GCC GCC GCG ATC CC 3′
获得的一些突变体的序列排序如下。
L1变体：
9L1-a ATGAAGAAGTACCTTTTCAGCGCCGCC～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
9L1-e ATGAAAAAATACTTTTTCCGCGCCGCC～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
9L1-d ATGAAAAAATACTTTTTCCGCGCCGCC～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
9L1-f ATGAAAAAATATCTCTTTAGCGCCGCCCTGTACGGCATCGCCGCCGCCATCCTCGCCGCC
919sP ATGAAAAAATACTATTCCGCGCCCGCCCTGTACGGCATCGCCGCCGCCATCCTCGCCGCC
9L1a MKKYLFSAA～～～～～～～～～～～～
9L1e MKKYFFRAA～～～～～～～～～～～
9L1d MKKYFFRAA～～～～～～～～～～～
9L1f MKKYLFSAALYGIAAAILAA
919sP pMKKYLFRAALYGIAAAILAA(即，天然信号肽)
S1突变体：
9S1-e ATGAAAAAATACCTATTC..................ATCGCCGCGCCATCCTCGCCGCC
9S1-c ATGAAAAAATACCTATTCCGAGCTGCCCAATACGGCATCGCCGCCGCCATCCTCGCGCC
9S1-b ATGAAAAAATACCTATTCCGCGCCGCCCAATACGGCATCGCCGCCGCCATCCTCGCCGCC
9S1-i ATGAAAAAATACCTATTCCGGGCGGCTTTGTACGGGATCGCCGCCGCCATCCTCQCCGCC
919Sp ATGAAAAAATACCTATTCCGCQCCGCCCTGTACGGCATCGCCGCCGCCATCTCGCCGCC
9S1e MKKKYLF......AAAILAA
9S1c MKKYLFRAAQYGIAAAAILAA
9S1b MKKYLFRAAQYGIAAILAA
9S1i MKKYLFRAAYGIAAAILAA
919sp MKKYLFRAALYGIAAAILAA
如序列排序中所示，分析的的大部分突变体包含由宿主细胞出人意料地产生的符合读框的缺失。
通过用从L1和S1突变的克隆制备的DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行突变体的筛选。通过在包含100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml甲基绿、1mg/mlPDP(酚酞二磷酸)的LB平板上划线，筛选高PhoC活性的单转化体。在该培养基上产生PhoC的细胞变成绿色(图10)。
用pNPP作为PhoC活性的底物，在液体培养基中对这些突变体产生的PhoC进行的定量分析。测定在液体培养基中生长0、30、90、180分钟的实变体的细胞提取物和上清液的比活性为：
细胞提取物
Figure C200310102845D00591
上清液
Figure C200310102845D00592
一些突变体产生大量PhoC，尤其是突变体9L1a可以在培养基中分泌PhoC。这是值得关注的，因为该变体的信号肽序列的长度仅为9个氨基酸。这是至今最短的信号肽。
实施例21-Maf-相关蛋白质的C-端缺失
MafB-相关蛋白质包括703、ORF46和ORF29。
MC58的730蛋白质具有如下序列：
1   VKPLRRLTNLL AACAVAAAA LIQPALAADL AQDPFITDNA QRQHYEPGGK
51  YHLFGDPRGS VSDRTGKINV IQDYTHQMGN LLIQQANING TIGYHTRFSG
101 HGHEEHAPFD NHAADSASEE KGNVDEGFTV YRLNWEGHEH HPADAYDGPK
151 GGNYPKPTGA RDEYTYHVNG TARSIKLANPT DTRSIRQRLIS DNYSNLGSNF
201 SDRADEANRK MFEHNAKLDR WGNSMEFING VAAGALNPFI SAGEALGIGD
251 ILYGTRYALID KAAMRNIAPL PAEGKFAVIG GLGSVAGFEK NTREAVDRWI
301 CQENPNAAETV EAVFNVAAAA KVAKLAKAAK PGKAAVSGDF ADSYKKKLAL
351 SDSARQLYQN AKYREALDIH YEDLIRRKTD GSSKFINGRE IDAVTNDALI
401 QAKRTISAID KPKNFLNQKN RKQIKATIEA ANQQGKRAEF WFKYGVHSQV
451 KSYIESKGGI VKTGLGD＊
前导肽是加下划线的。
730显示与ORF46类似的特性(见以上实施例8)：
-与Orf46一样，730序列在MenB、MenA和淋球菌之间的保守性仅对N-未端部分高(>80％)。C-未端(自～340)是高度趋异的。
-其预计的二级结构包含跨越分子中心区域(aa.227-247)的疏水片段。
-大肠杆菌中全长基因的表达产生产量很低的蛋白质。从标记的或未标记的构建物(除去信号肽序列)的表达对宿主细胞有毒性影响。换言之，细胞质中全长成熟蛋白质的存在对宿主细胞是非常毒的，而当其转位至周质(由信号肽介导)对细胞生存力没有可检测的影响。730的这种“细胞内毒性”特别高，因为只可用recA遗传背景(大肠杆菌菌株：用于克隆的HB101；用于表达的HMS174(DE3))以很低的频率得到用于表达无前导肽的730的克隆。
为了克服这种毒性，将实施例8中用于ORF46的类似方法用于730。得到四种C-未端截短的形式，每种都被很好地表达。它们都是从His-标记的无前导肽730的细胞内表达得到的。
形式A由成熟蛋白质的N-未端疏水区域(aa.28-226)构成。将其纯化性作为可溶性His标记的产物，其具有比预计更高的分子量(MW)。
形式B延伸至血清群之间保守的区域(aa.28-340)的未端。将其纯化为不溶性His标记的产物。
在筛选能在菌株HMS174(DE3)中高水平表达730-His克隆的克隆后，获得命名为C1和C2的C-未端截短的形式。简言之，用含有编码全长成熟730蛋白质的His标记的序列的pET21b质粒转化recA菌株HMS174(DE3)。低频率得到转化体，其显示出两种表型：大集落和非常小的集落。分析了若干大集落和小集落对730-His克隆的表达。只有大集落的细胞超量表达抗730A抗体识别的蛋白质。但是，不同集落中超量表达的蛋白质的分子量各不相同。对其中的两个克隆进行测序表明：这两种情况中，在编码730的C未端区域的序列中发生了大肠杆菌IS序列的整合。这两个整合在C1中产生了与另一个密码子的符合读框的融合，在C2中产生了与另外12个密码子的符合读框的融合(图11)。产生的730“突变体”形式具有如下的序列：
730-C1(IS1插入引起的-图11A)
1    MADLAQDPFI TDNAQRQHYE PGGKYHLFGD PRGSVSDRTG KINVIQDYTH
51   QMGNLLIQGA NINGTIGYHT RFSGHGHEEH APFDNHAADS ASEEKGNVDE
101  GFTVYRNWE  GHEHHPADAY DGPKGGNYPK PTGARDEYTY HVNGTARSIK
151  LNPTDTRSIR QRISDNYSNL GSNFSDRADE ANRKMFEHNA KLDRWGNSME
201  FINGVAAGAL NPFISAGEAL GIGDILYGTR YAIDKAAMRN IAPLPAEGKF
251  AVIGGLGSVA GFEKNTREAV DRWIQENPNA AETVEAVFNV AAAAKVAKLA
301  KAAKPGKAAV SGDFADSYKK KLALSDSARQ LYQNAKYREA LDIHYEDLIR
351  RKTDGSSKFI NGREIDAVTN DALIQAR ＊
由插入产生的其它氨基酸下加下划线。
730-C2(IS5插入引起的-图11B)
1    MADLAQDPFI TDNAQRQHYE PGGKYHLFGD PRGSVSDRTG KINVIQDYTH
51   QMGNLIQQA  NINGTIGYHT RFSGHGHEEH APFDNHAADS ASEEKGNVDE
101  GFTVYRLNWE GHEHHPADAY DGPKGGNYPK PTGARDEYTY HVNGTARSIK
151  LNPTDTRSIR QRISDNYSNL GSNFSDRADR ANRKMFEHNA KLDRWGNSME
201  FINGVAAGAL NPFISAGEAL GIGDILYGTR YAIDKAAMRN IAPLPAEGKF
251  AVIGGLGSVA GFEKNTREAV DRWIQENPNA AETVEAVFNV AAAAKVAKLA
301  KAAKPGKAAV SGDFADSYKK KLALSDSARQ LYQNAKYREA LGKVRISGEI
351  LLG ＊
由插入产生的其它氨基酸下加下划线。
总之，730-C1形式的细胞内表达产生大很高水平的量蛋白质，且对宿主细胞无毒，而天然C-未端的存在则是有毒的。这些数据表明730的“细胞内毒性”与蛋白质的C-未端65氨基酸相关。
用有或无前导肽(氨基酸1-26；缺失得到胞质表达)和有或无His-标记的表达，已进行了ORF29到前231或368氨基酸的相等的截短。
实施例22-961中的结构域
如上实施例9所述，在大肠杆菌中最佳地表达961的GSt融合。为了改进表达，将蛋白质分成结构域(图12)。
以YadA(由耶尔森氏菌产生的粘附素，已证明其是位于细胞表面上的粘附素，其形成产生表面凸起的低聚物[Hoiczyk等(2000)EMBO J 19：5989-99])为基础，设计了916的结构域，它们为：前导肽、头部结构域、卷曲-螺旋区域(茎部)和膜锚着点结构域。
有或无前导肽表达这些结构域，且任选地融合于C-未端His-标记或N-未端GST。用SDS-PAGE和Western印迹，从过夜(o/n)培育或用IPTG诱导3小时后，分析表达961不同结构域的大肠杆菌克隆用于表达的蛋白质的产生和定位。结果如下：
Figure C200310102845D00621
这些结果在大肠杆菌中显示：
·961-L是高度表达的且位于外膜上。用Western印迹分析已检测到2个特异性条带：一条为～45kDa(预计的分子量)，另一条为～180kDa，表明961-L可以形成低聚物。另外，这些聚集体在过夜培养物(无IPTG诱导)中表达得更多。用该克隆的OMV制备物免疫接种小鼠，并获得血清。用过夜培养物(主要为寡聚物形式)的血清是杀菌的；IPTG-诱导的培养物(主要为单体)不是杀菌的。
·961△1-L(在锚区域中部分缺失)是高度表达的，且位于外膜，但不形成低聚物；
·961c-L(无锚区域)以可溶的形式产生，并被在上清液中输出。
使用His-融合的ELISA和血清杀菌试验中的滴定度如下：
Figure C200310102845D00622
 
961b(aa269-405) 7763 64
961c-L 29770 8192
961c(2996) 30774 >65536
961c(MC58) 33437 16384
961d 26069 >65536
用表达不同形式961(961、961-L、961△1-L和961c-L)的大肠杆菌克隆研究了961是否是粘附素(参见YadA)。用(a)人上皮细胞和(b)大肠杆菌克隆(过夜培育或IPTG诱导3小时后)，进行粘附试验。过夜培育的961-L(961△1-L)和IPTG诱导的961c-L(在表面上表达蛋白质的克隆)粘附于人上皮细胞。
也将961c用于杂交蛋白(见上)。由于961和其结构域变体指导高效表达，它们理想地适用于杂交蛋白的N-未端部分。
实施例23-其它杂交体
以下显示了本发明的其它杂交蛋白(同样参见图14)。当与单独蛋白质相比时，它们是有利的：
ORF46.1-741
1       ATGTCAGATT TGGCAAACGA TTCTTTTATC CGGCAGGTTC TCGACCGTCA
51      GCATTTCGAA CCCGACGGGA AATACCACCT ATTCGGCAGC AGGGGGGAAC
101     TTGCCGAGCG CAGCGGCCAT ATCGGATTGG GAAAAATACA AAGCCATCAG
151     TTGGGCAACC TGATGATTCA ACAGGCGGCC ATTAAAGGAA ATATCGGCTA
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ORF46.1-961
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801   HHHHHH＊
ORF46.1-961c
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961-ORF46.1
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2401  CACCACCACC ACCACCACTG A
1     MATNDDDVKK AATVAIAAAY NNGQEINGFK AGETIYDIDE DGTITKKDAT
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501   HHPADGYDGP QGGGYPAPKG ARDIYSYDIK GVAQNIRLNL TDNRSTGQRL
551   ADRFHNAGSM LTQGVGDGFK RATRYSPELD RSGNAAEAFN GTADIVKNII
601   GAAGEIVGAG DAVQGISEGS NIAVMHGLGL LSTENKMARI NDLADMAQLK
651   DYAAAAIRDW AVQNPNAAQG IEAVSNIFMA AIPIKGIGAV RGKYGLGGIT
701   AHPIKRSQMG AIALPKGKSA VSDNFADAAY AKYPSPYHSR NIRSNLEQRY
751   GKENITSSTV PPSNGKNVKL ADQRHPKTGV PFDGKGFPNF EKHVKYDTLE
801   HHHHHH＊
961-741
1     ATGGCCACAA ACGACGACGA TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC
51    TGCTGCCTAC AACAATGGCC AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA
101   CCATCTACGA CATTGATGAA GACGGCACAA TTACCAAAAA AGACGCAACT
151   GCAGCCGATG TTGAAGCCGA CGACTTTAAA GGTCTGGGTC TGAAAAAAGT
201   CGTGACTAAC CTGACCAAAA CCGTCAATGA AAACAAACAA AACGTCGATG
251   CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA TCTGAAATAG AAAAGTTAAC AACCAAGTTA
301   GCAGACACTG ATGCCGCTTT AGCAGATACT GATGCCGCTC TGGATGCAAG
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401   AGACTAGAC  AAATATCGTA AAAATTGATG AAAAATTAGA AGCCGTGGCT
451   GATACCGTCG ACAAGCATGC CGAAGCATTC AACGATATCG CCGATTCATT
501   GGATGAAACC AACACTAAGG CAGACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG
551   CCAAACAGAC GGCCGAAGAA ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAATAAAAA
601   GCTGCAGAAA CTGCAGCAGG CAAAGCCGAA GCTGCCGCTG GCACAGCTAA
651   TACTGCAGCC GACAAGGCCG AAGCTGTCGC TGCAAAAGTT ACCGACATCA
701   AAGCTGATAT CGCTACGAAC AAAGATAATA TTGCTAAAA  AGCAAACAGT
751   GCCGACGTGT ACACCAGAGA AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA
801   TGGTCTGAAC GCTACTACCG AAAAATTGGA CACACGCTTG GCTTCTGCTG
851   AAAAATCCAT TGCCGATCAC GATACTCGCC TGAACGGTTT GGATAAAACA
901   GTGTCAGACC TGCGCAAAGA AACCCGCCAA GGCCTTGCAG AACAAGCCGC
951   GCTCTCCGGT CTGTTCCAAC CTTACAACGT GGGTCGGTTC AATGTACGG
1001  CTGCAGTCGG CGGCTACAAA TCCGAATCGG CAGTCGCCAT CGGTACCGGC
1051  TTCCGCTTTA CCGAAAACTT TGCCGCCAAA GCAGGCGTGG CAGTCGGCAC
1101  TTCGTCCGGT TCTTCCGCAG CCTACCATGT CGGAGTCAAT TACGAGTGGG
1151  GATCCGGAGG GGGTGGTGTC GCCGCCGACA TCGGTGCGGG GCTTGCCGAT
1201  GCACTAACCG CACCGCTCGA CCATAAAGAC AAAGGTTTGC AGTCTTTGAC
1251  GCTGGATCAG TCCGTCAGGA AAAACGAGAA ACTGAAGCTG GCGGCACAAG
1301  GTGCGGAAAA AACTTATGGA AACGGTGACA GCCTCAATAC GGGCAAATTG
1351  AAGAACGACA AGGTCAGCCG TTTCGACTTT ATCCGCCAAA TCGAAGTGGA
1401  CGGGCAGCTC ATTACCTTGG AGAGTGGAGA GTTCCAAGTA TACAAACAAA
1451  GCCATTCCGC CTTAACCGCC TTTCAGACCG AGCAAATACA AGATTCGGAG
1501  CATTCCGGGA AGATGGTTGC GAAACGCCAG TTCAGAATCG GCGACATAGC
1551  GGGCGAACAT ACATCTTTTG ACAAGCTTCC CGAAGGCGGC AGGGCGACAT
1601  ATCGCGGGAC GGCGTTCGGT TCAGACGATG CCGGCGGAAA ACTGACCTAC
1651  ACCATAGATT TCGCCGCCAA GCAGGGAAAC GGCAAAATCG AACATTTGAA
1701  ATCGCCAGAA CTCAATGTCG ACCTGGCCGC CGCCGATATC AAGCCGGATG
1751  GAAAACGCCA TGCCGTCATC AGCGGTTCCG TCCTTTACAA CCAAGCCGAG
1801  AAAGGCAGTT ACTCCCTCGG TATCTTTGGC GGAAAAGCCC AGGAAGTTGC
1851  CGGCAGCGCG GAAGTGAAAA  CCGTAAACGG CATACGCCAT ATCGGCCTTG
1901  CCGCCAAGCA ACTCGAGCAC  CACCACCACC ACCACTGA
1     MATNDDDVKK AATVAIAAAY  NNGQEINGFK AGETIYDIDE DGTITKKDAT
51    AADVEADDFK GLGLKKVVTN  LTKTVNENKQ NVDAKVKAAE SEIEKLTTKL
101   ADTDAALADT DAALDATTNA  LNKLGEMITT FAEETKTNIV KIDEKLEAVA
151   DTVDKHAEAF NDIADSLDET  NTKADEAVKT ANEAKQTAEE TKQNVDAKVK
201   AAETAAGKAE AAAGTANTAA  DKAEAVAAKV TDIKADIATN KDNIAKKANS
251   ADVYTREESD SKFVRIDGLN  ATTEKLDTRL ASAEKSIADH DTRLNGLDKT
301   VSDLRKETRQ GLAEQAALSG  LFQPYNVGRF NVTAAVGGYK SESAVAIGTG
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401   ALTAPLDHKD KGLQSLTLDQ  SVRKNEKLKL AAQGAEKTYG NGDSLNTGKL
451   KNDKCVSRFDF IRQIEVDGQL ITLESGEFQV YKQSHSALTA FQTEQIQDSE
501   HSGKMVAKRQ FRIGDIAGEH  TSFDKLPEGG RATYRGTAFG SDDAGGKLTY
551   TIDFAAKQGN GKIEHLKSPE  LNVDLAAADI KPDGKRHAVI SGSVLYNQAE
601   KGSYSLVGFG GKAQEVAGSA  EVKTVNGIRH IGLAAKQLEH HHHHH＊
961-983
1     ATGGCCACAA ACGACGACGA  TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC
51    TGCTGCCTAC AACAATGGCC  AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA
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501   GGATGAAACC AACACTAAGG  CAGACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG
551   CCAAACAGAC GGCCGAAGAA  ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAAGTAAAA
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651   TACTGCAGCC GACAGGGCCG  AAGCTGTCGC TGCAAAAAGT ACCGACATCA
701   AAGCTGATAT CGCTACGAAC  AAAGATAATA TTGCTAAAAA AGCAAACAGT
751   GCCGACGTGT ACACCAGAGA  AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA
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2551  ACGAAAGGTA CATCCGATAT TGCCTACTCC TTCCGTAACG ACATTTCAGG
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2751  TTATAACGGG GCGGCATCCG GCGGCAGCCT GAACAGCGAC GGCATTGTCT
2801  ATCTGGCAGA TACCGACCAA TCCGGCGCAA ACGAAACCGT ACACATCAAA
2851  GGCAGTCTGC AGCTGGACGG CAAAGGTACG CTGTACACAC GTTTGGGCAA
2901  ACTGCTGAAA GTGGACGGTA CGGCGATTAT CGGCGGCAAG CTGTACATGT
2951  CGGCACGCGG CAAGGGGGCA GGCTATCTCA ACAGTACCGG ACGACGTGTT
3001  CCCTTCCTGA GTGCCGCCAA AATCGGGCAG GATTATTCTT TCTTCACAAA
3051  CATCGAAACC GACGGCGGCC TGCTGGCTTC CCTCGACAGC GTCGAAAAAA
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3301  GCCGACCGCA CAGATATGCC GGGCATCCGC CCCTACGGCG CAACTTTCCG
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3501  CGGCACGGGT CTGCGCGTCA TCGCGCAAAC CCAACAGGAC GGTGGAACGT
3551  GGGAACAGGG CGGTGTTGAA GGCAAAATGC GCGGCAGTAC CCAAACCGTC
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3651  CATGGGACGC AGCACATGGA GCGAAAACAG TGCAAATGCA AAAACCGACA
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3751  CTCAAAGGCC TGTTCTCCTA CGGACGCTAC AAAAACAGCA TCAGCCGCAG
3801  CACCGGTGCG GACGAACATG CGGAAGGCAG CGTCAACGGC ACGCTGATGC
3851  AGCTGGGCGC ACTGGGCGGT GTCAACGTTC CGTTTGCCGC AACGGGAGAT
3901  TTGACGGTCG AAGGCGGTCT GCGCTACGAC CTGCTCAAAC AGGATGCATT
3951  CGCCGAAAAA GGCAGTGCTT TGGGCTGGAG CGGCAACAGC CTCACTGAAG
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4051  AAAGCCGTCC TGTTTGCAAC GGCGGGCGTG GAACGCGACC TGAACGGACG
4101  CGACTACACG GTAACGGGCG GCTTTACCGG CGCGACTGCA GCAACCGGCA
4151  AGACGGGGGC ACGCAATATG CCGCACACCC GTCTGGTTGC CGGCCTGGGC
4201  GCGGATGTCG AATTCGGCAA CGGCTGGAAC GGCTTGGCAC GTTACAGCTA
4251  CGCCGGTTCC AAACAGTACG GCAACCACAG CGGACGAGTC GGCGTAGGCT
4301  ACCGGTTCCT CGAGCACCAC CACCACCACC ACTGA
1     MATNDDDVKK AATVAIAAAY NNQEINGFK  AGETIYDIDE DGTITKKDAT
51    AADVEADDFK GLGLKKVVTN ITKTVNENKQ NVDAKVKAAE SEIEKLTTKL
101   ADTDAALADT DAALDATTNA LNKLGENITT FAEETKTNTV KIDEKLEAVA
151   DTVDKHAEAF NDIADSLDET NTKADEAVKT ANEAKQTAEE TKQNVDAKVK
201   AAETAAGKAE AAAGTANTAA DKAEAVAAKV TDIKADIATN KDNIAKKANS
251   ADVYTREESD SKFVRIDGLN ATTEKLDTRL ASAEKSIADH DTRLNGLDKT
301   VSDLRKETRQ GLAEQAALSG LFQPYNVGRF NVTAAVGGYK SESAVAIGTG
351   FRFTENFAAK AGVAVGTSSG SSAAYHVGVN YEWGSGGGGT SAPDFNAGGT
401   GIGSNSRATT AKSAAVSYAG IKNEMCKDRS MLCAGRDDVA VTDRDAKINA
451   PPPNLHTGDF PNPNDAYKNL INLKPAIEAG YTGRGVEVGI VDTGESVGSI
501   SFPELYGRKE HGYNENYKNY TAYMREEAPE DGGGKDIEAS FDDEAVIETE
551   AKPTDIRHVK EIGHIDLVSH IIGGRSVDGR PAGGIAPDAT LHIMNTNDET
601   KNEMMVAAIR NAWVKLGERG VRIVNNSFGT TSRAGTADLF QIANSEEQYR
651   QALLDYSGGD KTDEGIRLMQ QSDYGNLSYH IRNKNMLFIF STGNDAQAQP
701   NTYALLPFYE KDAQKGIITV AGVDRSGEKF KREMYGEPGT EPLEYGSNHC
751   GITAMWCLSA PYEASVRPTR TNPIQIAGTS FSAPIVTGTA ALLLQKYPWM
801   SNDNLRTTLL TTAQDIGAVG VDSKFGWGLL DAGKAMNGPA SFPFGDFTAD
851   TKGTSDIAYS FRNDISGTGG LIKKGGSQLQ LHGNNTYTGK TIIEGGSLVL
901   YGNNKSDMRV ETKGALIYNG AASGGSLNSD GIVYLADTDQ SGANETVHIK
951   GSLQLDGKGT LYTRLGKLLK VTGTAIIGGK LYMSARGKGA GYLNSTGRRV
1001  PFLSAAKIGQ DYSFFTNIET DGGLLASLDS VEKTAGESGD TLSYYVRRGN
1051  AARTASAAAH SAPAGLKHAV EQGGSNLKNL MVELDASESS ATPETVETAA
1101  ADRTDMPGIR PYGATFRAAA AVQHANAADG VRIFNSLAAT VYADSTAAHA
1151  DMQGERLKAV SDGLDHNGTG LRVIAQTQQD GGTWEQGGVE GKMRGSTQTV
1201  GIAAKTGENT TAAATLGMGR STWSENSANA KTDSISLFAG IRHDAGDIGY
1251  LKGLFSYGRY KNSISRSTGA DEHAEGSVNG TLMQLGALGG VNVPFAATGD
1301  LTVEGGLRYD LLKQDAFAEK GSALGWSGNS LTEGTLVGLA GLKLSQPLSD
1351  KAVLFATAGV ERDLNGRDYT VTGGFTGATA ATGKTGARNM PHTRLVAGLG
1401  ADVEFGNGWN GLARYSYAGS KQYGNHSGRV GVGYRFLEHH HHHH＊
961c-ORF46.1
1    ATGGCCACAA ACGACGACGA TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC
51   TGCTGCCTAC AACAATGGCC AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA
101  CCATCTACGA CATTGATGAA GACGGCACAA TTACCAAAAA AGACGCAACT
151  GCAGCCGATG TTGAAGCCGA CGACCTTAAA GGTCTGGGTC TGAAAAAAGT
201  CGTGACTAAC CTGACCAAAA CCGTCAATGA AAACAAACAA AACGTCGATG
251  CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA TCTGAAATAG AAAAGTTAAC AACCAAGTTA
301  GCAGACACTG ATGCCGCTTT AGCAGATACT GATGCCGCTC TGGATGCAAC
351  CACCAACGCC TTGAATAAAT TGGGAGAAAA TATAACGACA TTTGCTGAAG
401  AGACTAAGAC AAATATCGTA AAAATTGATG AAAAATTAGA AGCCGTGGCT
451  GATACCGTCG ACAAGCATGC CGAAGCATTC AACGATATCG CCGATTCATT
501  GGATGAAACC AACACTAAGG CGAACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG
551  CCAAACAGAC GGCCGAAGAA ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAAGTAAAA
601  GCTGCAGAAA CTGCAGCAGG CAAAGCCGAA GCTGCCGCTG GCACAGCTAA
651  TACTGCAGCC GACAAGGCCG AAGCTGTCGC TGCAAAAGTT ACCGACATCA
701  AAGCTGATAT CGCTACGAAC AAAGATAATA TTGCTAAAAA AGCAAACAGT
751  GCCGACGTGT ACACCAGAGA AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA
801  TGGTCTGAAC GCTACTACCG AAAAATTGGA CACACGCTTG GCTTCTGCTG
851  AAAAATCCAT TGCCGATCAC GATACTCGCC TGAACGGTTT GGATAAAACA
901  GTGTCAGACC TGCGCAAAGA AACCCGCCAA GGCCTTGCAG AACAAGCCGC
951  GCTCTCCGGT CTGTTCCAAC CTTACAACGT GGGTGGATCC GGAGGAGGAG
1001 GATCAGATTT GGCAAACGAT TCTTTTATCC GGCAGGTTCT CGACCGTCAG
1051 CATTTCGAAC CCGACGGGAA ATACCACCTA TTCGGCAGCA GGGGGGAACT
1101 TGCCGAGCGC AGCGGCCATA TCGGATTGGG AAAAATACAA AGCCATCAGT
1151 TGGGCAACCT GATGATTCAA CAGGCGGCCA TTAAAGGAAA TATCGGCTAC
1201 ATTGTCCGCT TTTCCGATCA CGGGCACGAA GTCCATTCCC CCTTCGACAA
1251 CCATGCCTCA CATTCCGATT CTGATGAAGC CGGTAGTCCC GTTGACGGAT
1301 TTAGCCTTTA CCGCATCCAT TGGACGGGAT ACGAACACCA TCCCGCCGAC
1351 GGCTATGACG GGCCACAGGG CGGCGGCTAT CCCGCTCCCA AAGGCGCGAG
1401 GGATATATAC AGCTACGACA TAAAAGGCGT TGCCCAAAAT ATCCGCCTCA
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1501 AATGCCGGTA GTATGCTGAC GCAAGGAGTA GGCGACGGAT TCAAACGCGC
1551 CACCCGATAC AGCCCCGAGC TGGACAGATC GGGCAATGCC GCCGAAGCCT
1601 TCAACGGCAC TGCAGATATC GTTAAAAACA TCATCGGCGC GGCADGAGAA
1651 ATTGTCGGCG CAGGCGATGC CGTGCAGGGC ATAAGCGAAG GCTCAAACAT
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1751 GCATCAACGA TTTGGCAGAT ATGGCGCAAC TCAAAGACTA TGCCGCAGCA
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1851 AGCCGTCAGC AATATCTTTA TGGCAGCCAT CCCCATCAAA GGGATTGGAG
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1951 CGGTCGCAGA TGGGCGCGAT CGCATTGCCG AAAGGGAAAT CCGCCGTCAG
2001 CGACAATTTT GCCGATGCGG CATACGCCAA ATACCCGTCC CCTTACCATT
2051 CCCGAAATAT CCGTTCAAAC TTGGAGCAGC GTTACGGCAA AGAAAACATC
2101 ACCTCCTCAA CCGTGCCGCC GTCAAACGGC AAAAATGTCA AACTGGCAGA
2151 CCAACGCCAC CCGAAGACAG GCGTACCGTT TGACGGTAAA GGGTTTCCGA
2201 ATTTTGAGAA GCACGTGAAA TATGATACGC TCGAGCACCA CCACCACCAC
2251 CACTGA
1    MATNDDDVKK AATVAIAAAY NNGQEINGFK AGETIYDIDE DGTITKKDAT
51   AADVEADDFK GLGLKKVVTN LTKTVNENKQ NVDAKVKAAES EIEKLTTKL
101  ADTDAALADT DAALDATTNA LNKILGENIT FAEETLTMIV KIDEKLRAVA
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201  AAETAAGKAE AAAGTANTAA DKAEAVAAKV TDIKADIATN KDNIAKKANS
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451  GYDGPQGGGY PAPKGARDIY SYDIKGVAQN IRLNLTDNRS TGQRLADRFH
501  NAGSMLTQGV GDFKRATRY  SPELDRSGNA AEAFNGTADI VKNIIGAAGE
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651  RSQMGAIALP KGKSAVSDNF ADAAYAKYPS PYHSRNIRSN LEQRYGKENI
701  TSSTVPPSNG KNVKLADQRH PKTGVPFDGK GFPNFEKHVK YDTLEHHHHH
751   H＊
961c-741
1     ATGGCCACAA ACGACGACGA TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC
51    TGCTGCCTAC AACAATGGCC AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA
101   CCATCTACGA CATTGATGAA GACGGCACAA TTACCAAAAA AGACGCAACT
151   GCAGCCGATG TTGAAGCCGA CGACTTTAAA GGTCTGGGTC TGAAAAAAGT
201   CGTGACTAAC CTGACCAAAA CCGTCAATGA AAACAAACAA AACGTCGATG
251   CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA TCTGAAATAG AAAAGTTAAC AACCAAGTTA
301   GCAGACACTG ATGCCGCTTT AGCAGATACT GATGCCGCTC TGGATGCAAC
351   CACCAACGCC TTGAATAAAT TGGGAGAAAA TATAACGACA TTTGCTGAAG
401   AGACTAAGAC AAATATCGTA AAAATTGATG AAAAATTAGA AGCCGTGGCT
451   GATACCGTCG ACAAGCATGC CGAAGCATTC AACGATATCG CCGATTCATT
501   GGATGAAACC AACACTAAGG CAGACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG
551   CCAAAAGAC  GGCCGAAGAA ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAAGTAAAA
601   GCTGCAGAAA CTGCAGCAGG CAAAGCCGAA GCTGCCGCTG GCACAGCTAA
651   TACTGCAGCC GACAAGGCCG AAGCTGTCGC TGCAAAAGTT ACCGACATCA
701   AAGCTGATAT CGCTACGAAC AAGATAATA  TTGCTAAAAA AGCAAACAGT
751   GCCGACGTGT ACACCAGAGA AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA
801   TGGTCTGAAC GCTACTACCG AAAAATTGGA CACACGCTTG GCTTCTGCTG
851   AAAAATCCAT TGCCGATCAC GATACTCGCC TGAACGGTTT GGATAAAACA
901   GTGTCAGACC TGCGCAAAGA AACCCGCCAA GGCCTTGCAG AACAAGCCGC
951   GCTCTCCGGT CTGTTCCAAC CTTACAACGT GGGTGGATCC GGAGGGGGTG
1001  GTGTCGCCGC CGACATCGGT GCGGGGCTTG CCGATGCACT AACCGCACCG
1051  CTCGACCATA AAGACAAAGG TTTGCAGTCT TTGACGCTGG ATCAGTCCGT
1101  CAGGAAAAAC GAGAAACTGA AGCTGGCGGC ACAAGGTGCG GAAAAAACTT
1151  ATGGAAACGG TGACAGCCTC AATACGGGCA AATTGAAGAA CGACAAGGTC
1201  AGCCGTTTCG ACTTTATCCG CCAAATCGAA GTGGACGGGC AGCTCATTAC
1251  CTTGGAGAGT GGAGAGTTCC AAGTATACAA ACAAAGCCAT TCCGCCTTAA
1301  CCGCCTTTCA GACCGAGCAA ATACAAGATT CGGAGCATTC CGGGAAGATG
1351  GTTGCGAAAC GCCAGTTCAG AATCGGCGAC ATAGCGGGCG AACATACATC
1401  TTTTGACAAG CTTCCCGAG  GCGGCAGGGC GACATATCGC GGGACGGCGT
1451  TCGGTTCAGA CGATGCCGGC GGAAAACTGA CCTACACCAT AGATTTCGCC
1501  GCCAAGCAGG GAAACGGCAA AATCGAACAT TTGAAATCGC CAGAACTCAA
1551  TGTCGACCTG GCCGCCGCCG ATATCAAGCC GGATGGAAAA CGCCATGCCG
1601  TCATCAGCGG TTCCGTCCTT TACAACCAAG CCGAGAAAGG CAGTTACTCC
1651  CTCGGTATCT TTGGCGGAAA AGCCCAGGAA GTTGCCGGCA GCGCGGAAGT
1701  GAAAACCGTA AACGGCATAC GCCATATCGG CCTTGCCGCC AAGCAACTCG
1751  AGCACCACCA CCACCACCAC TGA
1     MATNDDDVKK AATVAIAAAY NNGQEINGFK AGETIYDIDE DGTTTKKDAT
51    AADVEADDFK TLGLKKVVTN LTKTVNENKQ NVDAKVKAAE SEIEKLTTKL
101   ADTDAALADT DAALDATTNA LNKLGENITT FAEETKTNIV KIDEKLEAVA
151   DTVDKHAEAF NDIADSLDET NTKADEAVKT ANEAKQTAEE TKQNVDAKVK
201   AAETAAGKAE AAAGTANTAA DKAEAVAAKV TDIKADIATN KDNIAKKANS
251   ADVYTREESD SKFVRIDGLN ATTEELDTRL ASAEKSIADH DTRLNGLDKT
301   VSDLRKETRQ GLAEQAALSG LFQPYNVGGS GGGGVAADIG AGLADALTAP
351   LDHKDKGLQS LTLDQSVRKN EKLKLAAQGA EKTYGNGDSL NTGKLKNDKV
401   SRFDFIRQIE VDGQLITLES GEFQVYKQSH SALTAFQTEQ IQDSEHSGKM
451   VAKRQFRIGD IAGEHTSFDK LPEGGRATYR GTAFGSDDAG GKLTYTIDFA
501   AKQGNGKIEH LKSPELNVDL AAADIKPDGK RHAVISGSVL YNQAEKGSYS
551   LGIFGGKAQE VAGSAEVKTV NGIRHIGLAA KQLEHHHHHH ＊
961c-983
1     ATGGCCACAA ACGACGACGA TGTTAAAAAA GCTGCCACTG TGGCCATTGC
51    TGCTGCCTAC AACAATGGCC AAGAAATCAA CGGTTTCAAA GCTGGAGAGA
101   CCATCTACGA CATTGATGAA GACGGCACAA TTACCAAAAA AGACGCAACT
151   GCAGCCGATG TTGAAGCCGA CGACTTTAAA GGTCTGGGTC TGAAAAAAGT
201   CGTGACTAAC CTGACCAAAA CCGTCAATGA AAACAAACAA AACGTCGATG
251   CCAAAGTAAA AGCTGCAGAA TCTGAAATAG AAAAGTTAAC AACCAAGTTA
301   GCAGACACTG ATGCCGCTTT AGCAGATACT GATGCCGCTC TGGATGCAAC
351   CACCAACGCC TTGAATAAAT TGGGAGAAAA TATAACGACA TTTGCTGAAG
401   AGACTAAGAC AAATATCGTA AAAATTGATG AAAAATTAGA AGCCGTGGCT
451   GATACCGTCG ACAAGCATGC CGAAGCATTC AACGATATCG CCGATTCATT
501   GGATGAAACC AACACTAAGG CAGACGAAGC CGTCAAAACC GCCAATGAAG
551  CCAAACAGAC GGCCGAAGAA ACCAAACAAA ACGTCGATGC CAAGTAAAAA
601  GCTGCAGAAA CTGCAGCAGG CAAAGCCGAA GCTGCCGCTG GCACAGCTAA
651  TACTGCAGCC GACAAGGCCG AAGCTGTCGC TGCAAAAGTT ACCGACATCA
701  AAGCTGATAT CGCTACGAAC AAAGATAATA TTGCTAAAAA AGCAAACAGT
751  GCCGACGTGT ACACCAGAGA AGAGTCTGAC AGCAAATTTG TCAGAATTGA
801  TGGTCTGAAC GCTACTACCG AAAAATTGGA CACACGCTTG GCTTCTGCTG
851  AAAAATCCAT TGCCGATCAC GATACTCGCC TGAACGGTTT GGATAAAACA
901  GTGTCAGACC TGCGCAAAGA AACCCGCCAA GGCCTTGCAG AACAAGCCGC
951  GCTGTCCGGT CTGTTCCAAC CTTACAACGT GGGTGGATCC GGCGGAGGCG
1001 GCACTTCTGC GCCCGACTTC AATGCAGGCG GTACCGGTAT CGGCAGCAAC
1051 AGCAGAGCAA CAACAGCGAA ATCAGCAGCA GTATCTTACG CCGGTATCAA
1101 GAACGAAATG TGCAAAGACA GAAGCATGCT CTGTGCCGGT CGGGATGACG
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1251 CCTCAAACCT GCAATTGAAG CAGGCTATAC AGGACGCGGG GTAGAGGTAG
1301 GTATCGTCGA CACAGGCGAA TCCGTCGGCA GCATATCCTT TCCCGAACTG
1351 TATGGCAGAA AAGAACACGG CTATAACGAA AATTACAAAA ACTATACGGC
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1451 CTTCTTTCGA CGATGAGGCC GTTATAGAGA CTGAAGCAAA GCCGACGGAT
1501 ATCCGCCACG TAAAAGAAAT CGGACACATC GATTTGGTCT CCCATATTAT
1551 TGGCGGGCGT TCCGTGGACG GCAGACCTGC AGGCGGTATT GCGCCCGATG
1601 CGACGCTACA CATAATGAAT ACGAATGATG AAACCAAGAA CGAAATGATG
1651 GTTGCAGCCA TCCGCAATGC ATGGGTCAAG CTGGGCGAAC GTGGCGTGCG
1701 CATCGTCAAT AACAGTTTTG GAACAACATC GAGGGCAGGC ACTGCCGACC
1751 TTTTCCAAAT AGCCAATTCG GAGGAGCAGT ACCGCCAAGC GTTGCTCGAC
1801 TATTCCGGCG GTGATAAAAC AGACGAGGGT ATCCGCCTGA TGCAACAGAG
1851 CGATTACGGC AACCTGTCCT ACCACATCCG TAATAAAAAC ATGCTTTTCA
1901 TCTTTTCGAC AGGCAATGAC GCACAAGCTC AGCCCAACAC ATATGCCCTA
1951 TTGCCATTTT ATGAAAAAGA CGCTCAAAAA GGCATTATCA CAGTCGCAGG
2001 CGTAGACCGC AGTGGAGAAA AGTTCAAACG GGAAATGTAT GGAGAACCGG
2051 GTACAGAACC GCTTGAGTAT GGCTCCAACC ATTGCGGAAT TACTGCCATG
2101 TGGTGCCTGT CGGCACCCTA TGAAGCAAGC GTCCGTTTCA CCCGTACAAA
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2301 CAGCAAGTTC GGCTGGGGAC TGCTGGATGC GGGTAAGGCC ATGAACGGAC
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2401 GATATTGCCT ACTCCTTCCG TAACGACATT TCAGGCACGG GCGGCCTGAT
2451 CAAAAAAGGC GGCAGCCAAC TGCAACTGCA CGGCAACAAC ACCTATACGG
2501 GCAAAACCAT TATCGAAGGC GGTTCGCTGG TGTTGTACGG CAACAACAAA
2551 TCGGATATGC GCGTCGAAAC CAAAGGTGCG CTGATTTATA ACGGGGCGGC
2601 ATCCGGCGGC AGCCTGAACA GCGACGGCAT TGTCTATCTG GCAGATACCG
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2851 GCCAAAATCG GGCAGGATTA TTCTTTCTTC ACAAACATCG AAACCGACGG
2901 CGGCCTGCTG GCTTCCCTCG ACAGCGTCGA AAAAACAGCG GGCAGTGAAG
2951 GCGAGACGCT GTCCTATTAT GTCCGTCGCG GCAATGCGGC ACGGACTGCT
3001 TCGGCAGCGG CACATTCCGC GCCCGCCGGT CTGAAACACG CCGTAGAACA
3051 GGGCGGCAGC AATCTGGAAA ACCTGATGGT CGAACTGGAT GCCTCCGAAT
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3251 CTACCGTCTA TGCCGACAGT ACCGCCGCCC ATGCCGATAT GCAGGGACGC
3301 CGCCTGAAAG CCGTATCGGA CGGGTTGGAC CACAACGGCA CGGGTCTGCG
3351 CGTCATCGCG CAAACCCAAC AGGACGGTGG TTCGTGGGAA CAGGGCGGTG
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3551 CAGGCATACG GCACGATGCG GGCGATATCG GCTATCTCAA AGGCCTGTTC
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3651 ACATGCGGAA GGCAGCGTCA ACGGCACGCT GATGCAGCTG GGCGCACTGG
3701 GCGGTGTCAA CGTTCCGTTT GCCGCAACGG GAGATTTGAC GGTCGAAGGC
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4001  ATATGCCGCA CACCCGTCTG GTTGCCGGCC TGGGCGCGGA TGTCGAATTC
4051  GGCAACGGCT GGAACGGCTT GGCACGTTAC AGCTACGCCG GTTCCAAACA
4101  GTACGGCAAC CACAGCGGAC GAGTCGGCGT AGGCTACCGG TTCCTCGAGC
4151  ACCACCACCA CCACCACTGA
1     MATNDDDVKK AATVAIAAAY NNGQEINGFK AGETIYDIDE DGTITKKDAT
51    AADVEADDFK GLGLKKVVTN LTKTVNENKQ NVDAKVKAAE SEIEKLTTKL
101   ADTDAALADT DAAIDATTNA LNKLGENITT FAEETKTNIV KIDEKLEAVA
151   DTVDKHAEAF NDIADSLDET NTKADEAVKT ANEAKQTAEE TKQNVDAKVK
201   AAETAAGKAE AAAGTANTAA DKAEAVAAKV TDIKADIATN KDNIAAKKANS
251   ADVYTREESD SKFVRIDGLN ATTEKLDTRL ASAEKSIADH DTRLNGLDKT
301   VSDLRKETRQ GLAEQAALSG LFQPYNVGGS GGGGTSAPDF NAGGTGIGSN
351   SRATTAKSAA VSYAGIKNEM CKDRSMLCAG RDDVAVTDRD AKINAPPPNL
401   HTGDFPNPND AYKNLINLKP AIEAGYTGRG VEVGIVDTGE SVGSISFPEL
451   YGRKEHGYNE NYKNYTAYMR KEAPEDGGGK DIEASFDDEA VIETEAKPTD
501   IRHVKEIGHI DLVSHIIGGR SVDGRPAGGI APDATLHIMN TNDETKNEMM
551   VAAIRNAWVK LGERGVRIVN NSFGTTSRAG TADLFQIANS EEQYRQALLD
601   YSGGDKTDEG IRLMQQSDYG NLSYHIRNKN MLFIFSTGND AQAQPNTYAL
651   LPFYEKDAQK GIITVAGVDR SGELFLREMY GEPGTEPLEY GSNHCGITAM
701   WCLSAPYEAS VRFTRTNPIQ IAGTSFSAPI VTGTAALLLQ KYPWMSNDNL
751   RTTLLTTAQD IGAVGVDSKF GWGLLDAGKA MNGPASFPFG DFTADTKGTS
801   DIAYSFRNDI SGTGGLIKKG GSQLQLHGNN TYTGKTIIEG GSLVLYGNNK
851   SDMRVETKGA LIYNGAASGG SLNSDGIVYL ADTDQSGANE TVHIKGSLQL
901   DGKGTLYTRL GKLLKVDGTA IIGGKLYMSA RGKGAGYLNS TGRRVPFLSA
951   AKIGQDYSFF TNIETDGGLL ASLDSVEKTA GSEGDTLSYY VRRGNAARTA
1001  SAAAHSAPAG LKHAVEQGGS NLENLMVELD ASESSATPET VETAAADRTD
1051  MPGIRPYGAT FRAAAAVQHA NAADGVRIFN SLAATVYADS TAAHADMQGR
1101  RLKAVSDGLD HNGTGLRVIA QTQQDGGTWE QGGVEGKMRG STQTVGIAAK
1151  TGENTTAAAT LGMGRSTWSE NSANAKTDSI SLFAGIRHDA GDIGYIKGLF
1201  SYGRYKNSIS RSTGADEHAE GSVNGTLMQL GALGGVNVPF AATGDLTVEG
1251  GLRYDLLKQD AFAEKGSALG WSGNSLTEGT LVGLAGLKLS QPLSDKAVLF
1301  ATAGVERDLN GRDYTVTGGF TGATAATGKT GARNMPHTRL VAGLGADVEF
1351  GNGWNGLARY SYAGSKQYGN HSGRVGVGYR FLEHHHHHH＊
961cL-ORF46.1
1     ATGAAACACT TTCCATCCAA AGTACTGACC ACAGCCATCC TTGCCACTTT
51    CTGTAGCGGC GCACTGGCAG CCACAAACGA CGACGATGTT AAAAAAGCTG
101   CCACTGTGGC CATTGCTGCT GCCTACAACA ATGGCCAAGA AATCAACGGT
151   TTCAAACGTG GAGAGACCAT CTACGACATT GATGAAGACG GCACAATTAC
201   CAAAAAAGAC GCAACTGCAG CCGATGTTGA AGCCGACGAC TTTAAAGGTC
251   TGGGTCTGAA AAAAGTCGTG ACTAACCTGA CCAAAACCGT CAATGAAAAC
301   AAACAAAACG TCGATGCCAA AGTAAAAGCT GCAGAATCTG AAATAGAAAA
351   GTTAACAACC AAGTTAGCAG ACACTGATGC CGCTTTAGCA GATACTGATG
401   CCGCTCTGGA TGCAACCACC AACGCCTTGA ATAAATTGGG AGAAAATATA
451   ACGACATTTG CTGAAGAGAC TAAGACAAAT ATCGTAAAAA TTGATGAAAA
501   ATTAGAAGCC GTGGCTGATA CCGTCGACAA GCATGCCGAA GCATTCAACG
551   ATATCGCCGA TTCATTGGAT GAAACCAACA CTAAGGCAGA CGAAGCCGTC
601   AAAACCGCCA ATGAAGCCAA ACAGACGGCC GAAGAAACCA AACAAAACGT
651   CGATGCCAAA GTAAAAGCTG CAGAAACTGC AGCAGGCAAA GCCGAAGCTG
701   CCGCTGGCAC AGCTAATACT GCAGCCGACA AGGCCGAAGC TGTCGCTGCA
751   AAAGTTACCG ACATCAAAGC TGATATCGCT ACGAACAAAG ATAATATTGC
801   TAAAAAAGCA AACAGTGCCG ACGTGTACAC CAGAGAAGAG TCTGACAGCA
851   AATTTGTCAG AATTGATGGT CTGAACGCTA CTACCGAAAA ATTGGACACA
901   CGCTTGGCTT CTGCTGAAAA ATCCATTGCC GATCACGATA CTCGCCTGAA
951   CGGTTTGGAT AAAACAGTGT CAGACCTGCG CAAAGAAACC CGCCAAGGCC
1001  TTGCAGAACA AGCCGCGCTC TCCGGTCTGT TCCAACCTTA CAACGTGGGT
1051  GGATCCGGAG GAGGAGGATC AGATTTGGCA AACGATTCTT TTATCCGGCA
1101  GGTTCTCGAC CGTCAGCATT TCGAACCCGA CGGGAAATAC CACCTATTCG
1151  GCAGCAGGGG GGAACTTGCC GAGCGCAGCG GCCATATCGG ATTGGGAAAA
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1301  ATTCCCCCTT CGACAACCAT GCCTCACATT CCGATTCTGA TGAAGCCGGT
1351  AGTCCCGTTG ACGGATTTAG CCTTTACCGC ATCCATTGGG ACGGATACGA
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1701  CGGCGCGGCA GGAGAAATTG TCGGCGCAGG CGATGCCGTG CAGGGCATAA
1751  GCGAAGGCTC AAACATTGCT GTCATGCACG GCTTGGGTCT GCTTTCCACC
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1851  AGACTATGCC GCAGCAGCCA TCCGCGATTG GGCAGTCCAA AACCCCAATG
1901  CCGCACAAGG CATAGAGCC  GTCAGCAATA TCTTTATGGC AGCCATCCCC
1951  ATCAAAGGGA TTGGAGCTG  TCGGGGAAAA TACGGCTTGG GCGGCATCAC
2001  GGCACATCCT ATCAAGCGGT CGCAGATGGG CGCGATCGCA TTGCCGAAAG
2051  GGAAATCCGC CGTCAGCGAC AATTTTGCCG ATGCGGCATA CGCCAAATAC
2101  CCGTCCCCTT ACCATTCCCG AAATATCCGT TCAAACTTGG AGCAGCGTTA
2151  CGGCAAAGAA AACATCACCT CCTCAACCGT GCCGCCGTCA AACGGCAAAA
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2251  GGTAAAGGGT TTCCGAATTT TGAGAAGCAC GTGAAATATG ATACGTAACT
2301  CGAG
1     MKHFPSKVLT TAILATTCSG ALAATNDDDV KKAATVALAA AYNNGQEING
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961cL-741
1    ATGAAACACT TTCCATCCAA AGTACTGACC ACAGCCATCC TTGCCACTTT
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101  CCACTGTGGC CATTGCTGCT GCCTACAACA ATGGCCAAGA AATCAACGGT
151  TTCAAAGCTG GAGAGACCAT CTACGACATT GATGAAGACG GCACAATTAC
201  CAAAAAAGAC GCAACTGCAG CCGATGTTGA AGCCGACGAC TTTAAAGGTC
251  TGGGTCTGAA AAAAGTCGTG ACTAACCTGA CCAAAACCGT CAATGAAAAC
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351  GTTAACAACC AAGTTAGCAG ACACTGATGC CGCTTTAGCA GATACTGATG
401  CCGCTCTGGA TGCAACCACC AACGCCTTGA ATAAATTGGG AGAAAATATA
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551  ATATCGCCGA TTCATTGGAT GAAACCAACA CTAAGGCAGA CGAAGCCGTC
601  AAAACCGCCA ATGAAGCCAA ACAGACGGCC GAAGAAACCA AACAAAACGT
651  CGATGCCAAA GTAAAAGCTG CAGAAACTGC AGCAGGCAAA GCCGAAGCTG
701  CCGCTGGCAC AGCTAATACT GCQGCCGACA AGGCCGAAGC TGTCGCTGCA
751  AAAGTTACCG ACATCAAAGC TGATATCGCT ACGAACAAAG ATAATATTGC
801  TAAAAAAGCA AACAGTGCCG ACGTGTACAC CAGAGAAGAG TCTGACAGCA
851  AATTTGTCAG AATTGATGGT CTGAACGCTA CTACCGAAAA ATTGGACACA
901  CGCTTGGCTT CTGCTGAAA  ATCCATTGCC GATCACGATA CTCGCCTGAA
951  CGGTTTGGAT AAAACAGTGT CAGACCTGCG CAAAGAAACC CGCCAAGGCC
1001 TTGCAGAACA AGCCGCGCTC TCCGGTCTGT TCCAACCTTA CAACGTGGGT
1051 GGATCGGAG  GGGGTGGTGT CGCCGCCGAC ATCGGTGCGG GGCTTGCCGA
1101 TGCACTAACC GCACCGCTCG ACCATAAGA  CAAAGGTTTG CAGTCTTTGA
1151 CGCTGGATCA GTCCGTCAGG AAAAACGAGA AACTGAAGCT GGCGGCACAA
1201 GGTGCGGAAA AAACTTATGG AAACGGTGAC AGCCTCAATA CGGGCAATT
1251 GAAGAACGAC AAGGTCAGCC GTTTCGACTT TATCCGCCAA ATCGAAGTGG
1301 ACGGGCAGCT CATTACCTTG GAGAGTGGAG AQTTCCAAGT ATACAAACAA
1351 AGCCATTCCG CCTTAACCGC CTTTCAGACC GAGCAAATAC AAGATTCGGA
1401 GCATTCCGGG AAGATGGTTG CGAAACGCCA GTTCAGAATC GGCGACATAG
1451  CGGGCGAACA TACATCTTTT GACAAGCTTC CCGAAGGCGG CAGGGCGACA
1501  TATCGCGGGA CGGCGTTCGG TTCAGACGAT GCCGGCGGAA AACTGACCTA
1551  CACCATAGAT TTCGCCGCCA AGCAGGGAAA CGGCAAAATC GAACATTTGA
1601  AATCGCCAGA ACTCAATGTC GACCTGGCCG CCGCCGATAT CAAGCCGGAT
1651  GGAAAACGCC ATGCCGTCAT CAGCGGTTCC GTCCTTTACA ACCAAGCCGA
1701  GAAAGGCAGT TACTCCCTCG GTATCTTTGG CGGAAAAGCC CAGGAAGTTG
1751  CCGGCAGCGC GGAAGTGAAA ACCGTAAACG GCATACGCCA TATCGGCCTT
1801  GCCGCCAAGC AACTCGAGCA CCACCACCAC CACCACTGA
1     MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALAATNDDDV KKAATVAIAA AYNNGQEING
51    FKAGETIYDI DEDGTITKKD ATAADVEADD FKGLGLKKVV TNLTKTVNEN
101   KQNVDAKVKA AESEIEKLTT KLADTDAALA DTDAALDATT NALNKLGENI
151   TTFAETKTN  IVKIDEKLEA VADTVDKHAE AFNDIADSLD ETNTKADEAV
201   KTANEAKQTA EETKQNVDAK VKAAETAAGK AEAAAGTANT AADKAEAVAA
251   KVTDIKADIA TNKDNIAKKA NSADVYTREE SDSKFVRIDG LNATTEKLDT
301   RLASAEKSIA DHDTRLNGLD KTVSDLRKET RQGLAEQAAL SGLFQPYNVG
351   GSGGGGVAAD IGAGLADALT APLDHKDKGL QSLTLDQSVR KNEKLKLAAQ
401   GAEKTYGNGD SLNTGKLKND KVSRFDFIRQ IEVDGQLITL ESGEFQVYKQ
451   SHSALTAFQT EQIQDSEHSG KMVAKRQFRI GDIAGEHTSF DKLPEGGRAT
501   YRGTAFGSDD AGGKLTYTID FAAKQGNGKI EHLKSPELNV DLAAADIKPD
551   GKRHAVISGS VLYNQAEKGS YSLGIFGGKA QEVAGSAEVK TVNGIRHIGL
601   AAKQLEHHHH HH＊
961cL-983
1    ATGAAACACT TTCCATCCAA AGTACTGACC ACAGCCATCC TTGCCACTTT
51   CTGTAGCGGC GCACTGGCAG CCACAAACGA CGACGATGTT AAAAAAGCTG
101  CCACTGTGGC CATTGCTGCT GCCTACAACA ATGGCCAAGA AATCAACGGT
151  TTCAAAGCTG GAGAGACCAT CTACGACATT GATGAAGACG GCACAATTAC
201  CAAAAAAGAC GCAACTGCAG CCGATGTTGA AGCCGACGAC TTTAAAGGTC
251  TGGGTCTGAA AAAAGTCGTG ACTAACCTGA CCAAAACCGT CAATGAAAAC
301  AAACAAAACG TCGATGCCAA AGTAAAAGCT GCAGAATCTG AAATAGAAAA
351  GTTAACAACC AAGTTAGCAG ACACTGATGC CGCTTTAGCA GATACTGATG
401  CCGCTCTGGA TGGAACCACC AACGCCTTGA ATAAATTGGG AGAAAATATA
451  ACGACATTTG CTGAAGAGAC TAAGACAAAT ATCGTAAAAA TTGATGAAAA
501  ATTAGAAGCC GTGGCTGATA CCGTCGACAA GCATGCCGAA GCATTCAACG
551  ATATCGCCGA TTCATTGGAT GAAACCAACA CTAAGGCAGA CGAAGCCGTC
601  AAAACCGCCA ATGAAGCCAA ACAGACGGCC GAAGAAACCA AACAAAACGT
651  CGATGCCAAA GTAAAAGCTG CAGAAACTGC AGCAGGCAAA GCCGAAGCTG
701  CCGCTGGCAC AGCTAATACT GCAGCCGACA AGGCCGAAGC TGTCGCTGCA
751  AAAGTTACCG ACATCAAAGT TGATATCGCT ACGAACAAAG ATAATATTGC
801  TAAAAAAGCA AACAGTGCCG ACGTGTACAC CAGAGAAGAG TCTGACAGCA
851  AATTTGTCAG AATTGATGGT CTGAACGCTA CTACCGAAAA ATTGGACACA
901  CGCTTGGCTT CTGCTGAAAA ATCCATTGCC GATCACGATA CTCGCCTGAA
951  CGGTTTGGAT AAAACAGTGT CAGACCTGCG CAAAAGAAACC CGCCAAGGCC
1001 TTGCAGAACA AGCCGCGCTC TCCGGTCTGT TCCAACCTTA CAACGTGGGT
1051 GGATCCGGCG GAGGCGGCAC TTCTGCGCCC GACTTCAATG CAGGCGGTAC
1101 CGGTATCGGC AGCAACAGCA GAGCAACAAC AGCGAAATCA GCAGCAGTAT
1151 CTTACGCCGG TATCAAGAAC GAAATGTGCA AAGACAGAAG CATGCTCTGT
1201 GCCGGTCGGG ATGACGTTGC GGTTACAGAC AGGGATGCCA AAATCAATGC
1251 CCCCCCCCCG AATCTGCATA CCGGAGACTT TCCAAACCCA AATGACGCAT
1301 ACAAGAATTT GATCAACCTC AAACCTGCAA TAGAAGCAGG CTATACAGGA
1351 CGCGGGGTAG AGGTAGGTAT CGTCGACACA GGCGAATCCG TCGGCAGCCAT
1401 ATCCTTTCCC GAACTGTATG GCAGAAAAGA ACACGGCTAT AACGAAAATT
1451 ACAAAAACTA TACGGCGTAT ATGCGGAAGG AAGCGCCTGA AGACGGAGGC
1501 GGTAAAGACA TTGAAGCTTC TTTCGACGAT GAGGCCGTTA TAGAGACTGA
1551 AGCAAAGCCG ACGGATATCC GCCACGTAAA AGAAATCGGA CACATCGATT
1601 TGGTCACCCA TATTATTGGC GGGCGTTCCG TGGACGGCAG ACCTGCAGGC
1651 GGTATTGCGC CCGATGCGAC GCTACACATA ATGAATACCGA ATGATGAAC
1701 CAAGAACGAA ATGATGGTTG CAGCCATCCG CAATGCATGG GTCAAGCTGG
1751 GCGAACGTGG CGTGCGCATC GTCAATAACA GTTTTGGAAC AACATCGAGG
1801 GCAGGCACTG CCGACCTTTT CCAAATAGCC AATTCGGAGG AGCAGTACCG
1851 CCAAGCGTTG CTCGACTATT CCGGCGGTGA TAAAACAGAC GAGGGTATCC
1901 GCCTGATGCA ACAGAGCGAT TACGGCAACC TGTCCTACCA CATCCGTAAT
1951 AAAAACATGC TTTTCATCTT TTCGACAGGC AATGACCCAC AAGCTCAGCC
2001 CAACACATAT GCCCTATTGC CATTTTATGA AAAAGACGCT CAAAAAGGCA
2051 TTATCACAGT CGCAGGCGTA GACCGCAGTG GAGAAAAGTT CAAACGGGAA
2101  ATGTATGGAG AACCGGGTAC AGAACCGCTT GAGTATGGCT  CCAACCATTG
2151  CGGAATTACT GCCATGTGGT GCCTGTCGGC ACCCTATGAA  GCAAGCGTCC
2201  GTTTCACCCG TACAAACCCG ATTCAAATTG CCGGAACATC  CTTTTCCGCA
2251  CCCATCGTAA CCGGCACGGC GGCTCTGCTG CTGCAGAAAT  ACCCGTGGAT
2301  GAGCAACGAC AACCTGCGTA CCACGTTGCT GACGACGGCT  CAGGACATCG
2351  GTGCAGTCGG CGTGGACAGC AAGTTCGGCT GGGGACTGCT  GGATGCGGGT
2401  AAGGCCATGA ACGGACCCGC GTCCTTTCCG TTCGGCGACT  TTACCGCCGA
2451  TACGAAAGGT ACATCCGATA TTGCCTACTC CTTCCGTAAC  GACATTTCAG
2501  GCACGGGCGG CCTGATCAAA AAAGGCGGCA GCCAACTGCA  ACTGCACGGC
2551  AACAACACCT ATACGGGCAA AACCATTATC GAAGGCGGTT  CGCTGGTGTT
2601  GTACGGCAAC AACAAATCGG ATATGCGCGT CGAAACCAAA  GGTGCGCTGA
2651  TTTATAACGG GGCGGCATCC GGCGGCAGCC TGAACAGCGA  CGGCATTGTC
2701  TATCTGGCAG ATACCGACCA ATCCGGCGCA AACGAAACCG  TACACATCAA
2751  AGGCAGTCTG CAGCTGGACG GCAAAGGTAC GCTGTACACA  CGTTTGGGCA
2801  AACTGCTGAA AGTGGACGGT ACGGCGATTA TCGGCGGCAA  GCTGTACATG
2851  TCGGCACGCG GCAAGGGGGC AGGCTATCTC AACAGTACCG  GACGACGTGT
2901  TCCCTTCCTG AGTGCCGCCA AAATCGGGCA GGATTATTCT  TTCTTCACAA
2951  ACATCGAAAC CGACGGCGGC CTGCTGKGTT CCCTCGACAG  CGTCGAAAAA
3001  ACAGCGGGCA GTGAAGGCGA CACGCTGTCC TATTATGTCC  GTCGCGGCAA
3051  TGCGGCACGG ACTGCTTCGG CAGCGGCACA TTCCGCGCCC  GCCGGTCTGA
3101  AACACGCCGT AGAACAGGGC GGCAGCAATC TGGAAAACCT  GATGGTCGAA
3151  CTGGATGCCT CCGAATCATC CGCAACACCC GAGACGGTTG  AAACTGCGGC
3201  AGCCGACCGC ACAGATATGC CGGGCATCCG CCCCTACGGC  GCAACTTTCC
3251  GCGCAGCGGC AGCCGTACAG CATGCGAATG CCGCCGACGG  TGTACGCATC
3301  TTCAACAGTC TCGCCGCTAC CGTCTATGCC GACAGTACCG  CCGCCCATGC
3351  CGATATGCAG GGACGCCGCC TGAAAGCCGT ATCGGACGGG  TTGGACCACA
3401  ACGGCACGGG TCTGCGCGTC ATCGCGCAAA CCCAACAGGA  CGGTGGAACG
3451  TGGGAACAGG GCGGTGTTGA AGGCAAAATG CGCGGCAGTA  CCCAAACCGT
3501  CGGCATTGCC GCGAAAACCG GCGAAAATAC GACAGCAGCC  GCCACACTGG
3551  GCATGGGACG CAGCACATGG AGCGAAAACA GTGCAAATGC  AAAAACCGAC
3601  AGCATTAGTC TGTTTGCAGG CATACGGCAC GATGCGGGCG  ATATCGGCTA
3651  TCTCAAAGGC CTGTTCTCCT ACGGACGCTA CAAAAACAGC  ATCAGCCGCA
3701  GCACCGGTGC GGACGAACAT GCGGAAGGCA GCGTCAACGG  CACGCTGATG
3751  CAGCTGGGCG CACTGGGCGG TGTCAACGTT CCCTTTGCCG  CAACGGGAGA
3801  TTTGACGGTC GAAGGCGGTC TGCGCTACGA CCTGCTCAAA  CAGGATGCAT
3851  TCGCCGAAAA AGGCAGTGCT TTGGGCYGGA CCGGCAACAG  CCTCACTGAA
3901  GGCACGCTGG TCGGACTCGC GGGTCTGAAG CTGTCGCAAC  CCTTGAGCGA
3951  TAAAGCCGTC CTGTTTGCAA CGGCGGGCGT GGAACGCGAC  CTGAACGGAC
4001  GCGACTACAC GGTAACGGGC GGCTTTACCG GCGCGACTGC  AGCAACCGGC
4051  AAGACGGGGG CACGCAATAT GCCGCACACC CGTCTGGTTG  CCGGCCTGGG
4101  CGCGGATGTC GAATTCGGCA ACGGCTGGAA CGGCTTGGCA  CGTTACAGCT
4151  ACGCCGGTTC CAAACAGTAC GGCAACCACA GCGGACGAGT  CGGCGTAGGC
4201  TACCGGTTCT GACTCGAG
1     MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALAATNDDDV KKAATVAIAA  AYNNGQEING
51    FKAGETIYDI DEDGTITKKD ATAADVEADD FKGLGLKKVV  TNLTKTVNEN
101   KQNVDAKVKA AESEIEKLTT KLADTDAALA DTDAALDATT  NALNKLGENI
151   TTFAEETKTN IVKIDEKLEA VADTVDKHAE AFNDIADSLD  ETNTKADEAV
201   KTANEAKQTA EETKQNVDAK VKAAETAAGK AEAAAGTANT  AADKAEAVAA
251   KVTDIKADIA TNKDNIAKKA NSADVYTREE SDSKFVRIDG  LNAATTEKLDT
301   RLASAEKSIA DHDTRLNGLD KTVSGLRKET RQGLAEQAAL  SGLFQPYNVG
351   GSGGGGTSAP DFNAGGTGIG SNSRATTAKS AAVSYAGIKN  EMCKDRSMLC
401   AGRDDVAVTD RDAKINAPPP NLHTGDFPNP NDAYKNLINL  KPAIEAGYTG
451   RGVEVGIVDT GESVGSISFP ELYGRKEHGY NENYKNYTAY  MRKEAPEDGG
501   GKDIEASFDD EAVIETEAEP TDIREVKEIG HIDLVSHIIG  GRSVDGRPAG
551   GIAPDATLHI MNTNDETKNE MMVAAIRNAW VKLGERGVRI  VNNSFGTTSR
601   AGTADLFQIA NSEEQYRQAL LDYSGGDKTD EGIRLMQQSD  YGNLSYHIRN
651   KNMLFIFSTG NDAQAQPNTY ALLPFYEKDA QKGIITVAGV  DRSGEKFKRE
701   MYGEPGTEPL EYGSNHCGIT AMWCLSAPYE ASVRFTRTNP  IQIAGTSFSA
751   PIVTGTAALL LQKYPWMSND NLRTTLLTTA QDIGAVGVDS  KFGWGLLDAG
801   KAMNGPASFP FGDFTADTKG TSDIAYSFRN DISGTGGLIK  KGGSQLQLHG
851   NNTYTGKTII EGGSLVLYGN NKSDMEVETK GALIYNGAAS  GGSLNSDGIV
901   YLADTDQSGA NETVHIKGSL QLDGKGTLYT RLGKLLKVDG  TAIIGGKLYM
951   SARGKGAGYL NSTGRRVPFL SAAKIGQDYS FTNIETDGG   LLASLDSVEK
1001  TAGSEGDTLS YYVRRGNAAR TASAAAHSAP AGLKHAVEQG  GSNLENLMVE
1051  LDASESSATP ETVETAAADR TDMPGIRPYG ATFRAAAAVQ  HANAADGVRI
1101  FNSLAATVYA DSTAAHADMQ GRRLKAVSDG LDHNGTGLRV  IAQTQQDGGT
1151 WEQGGVEGKM RGSTQTVGIA AKTGENTTAA ATLGMGRSTW SENSAMAKTD
1201 SISLFAGIRH DAGDIGYLKG LFSYGRYKNS ISRSTGAKEH AEGSVNGTLM
1251 QLGALGGVNV PFAATGDLTV EGGLRYDLLK QDAFAEKGSA LGWSGNSLTE
1301 GTLVGLAGLK LSQPLSDKAV LFATAGVERD LNGRDYTVTG GFTGATAATG
1351 KTGARNMPHT RLVAGLGADV EFGNGWNGLA RYSYAGSKQY GNHSGRVGVG
1401 YRF＊
可以理解本发明仅以例子的方式进行描述，在本发明的范围和精神内还可进行改变。例如，设想可以使用其它菌株的蛋白质[如，参见WO00/66741，ORF4、ORF40、ORF46、225、235、287、519、726、919和953的多聚体序列]。
实验详述
FPLC蛋白质纯化
下表总结了所用的FPLC蛋白质纯化：
 
蛋白质 PI 柱 缓冲液 pH 方法
121.1<sup>未标记的</sup> 6.23 单Q Tris 8.0 A
128.1<sup>未标记的</sup> 5.04 单Q Bis-Tris丙烷 6.5 A
406.1L 7.75 单Q 二乙醇胺 9.0 B
576.1L 5.63 单Q Tris 7.5 B
593<sup>未标记的</sup> 8.79 单S Hepes 7.4 A
726<sup>未标记的</sup> 4.95 Hi-trap S Bis-Tris 6.0 A
919<sup>未标记的</sup> 10.5(-前导区) 单S Bicine 8.5 C
919Lorf4 10.4(-前导区) 单S Tris 8.0 B
920L 6.92(-前导区) 单Q 二乙醇胺 8.5 A
953L 7.56(-前导区) 单S MES 6.6 D
982<sup>未标记的</sup> 4.73 单Q Bis-Tris丙烷 6.5 A
919-287 6.58 Hi-trapQ Tris 8.0 A
953-287 4.92 单Q Bis-Tris丙烷 6.2 A
缓冲液包括20-120mM NaCl、5.0mg/ml CHAPS和10％V/V甘油。将透析液以13000g离心20分钟，加样到单Q或单S FPLC离子交换树脂上。按照感兴趣蛋白质的pI和FPLC方法手册[pharmacia：FPLC离子交换和层析聚焦；理论和方法。Pharmacia Publication]选择缓冲液和离子交换树脂。用分步NaCl梯度法脱蛋白质。用SDS-PAGE分析纯化，并用Bradford方法测定蛋白质浓度。
‘方法′栏中的字母为以下含义：
FPLC-A：破碎细胞后从大肠杆菌可溶性组分中纯化克隆121.1、128.1、593、726、982、周质蛋白质920L和杂交蛋白919-287、953-287。于37℃，在20ml LB/Amp(100μg/ml)液体培养基中，使携带感兴趣质粒的单集落生长过夜。用1.0L新鲜培养基以1：30稀释细菌，并在30℃或37℃生长直到OD550到达0.6-0.8。以终浓度1.0mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达。培育3小时后，于4℃以8000离心15分钟收获细菌。必要时将细胞存储于-20℃。随后的所有步骤都是在冰上或4℃进行的。对胞质蛋白质(121.1、128.1、593、726和982)和周质蛋白质920L而言，将细菌重悬浮于25ml含完整蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)的PBS中。用Branson Sonifier450通过超声处理裂解细胞。以8000g离心破碎的细胞30分钟，以沉淀未破碎的细胞和包含体，并加入3.9M(NH4)2SO4使上清液达到35％v/v饱和。以8000g沉积沉淀物30分钟。添加3.9M(NH4)2SO4使上清液达到70％v/v饱和，如上所述收集沉淀物。用SDS-PAGE鉴定含感兴趣蛋白质的沉淀物，并用适合的离子交换缓冲液(见以下)透析6小时或过夜。按Evans等[Infect.Immun.(1974)10：1010-1017]的方法制备表达953L大肠杆菌的周质组分，并用适合的离子交换缓冲液透析。根据感兴趣蛋白的pI和FPLC方法手册[Pharmacia]的推荐选择缓冲液和离子交换树脂。缓冲液包括20mM NaCl和10％(v/v)甘油。以13000g离心透析液20分钟，并加到单Q或单S FPLC离子交换树脂上。根据感兴趣蛋白的pI和FPLC方法手册[Pharmacia]的推荐选择缓冲液和离子交换树脂。用分步或连续NaCl梯度从离子交换树脂洗脱蛋白质。用SDS-PAGE分析纯化，并用Bradford方法测定蛋白质浓度。通过NH2-未端测序(见以下)验证周质蛋白质的前导肽的切割。
FPLC-B：从大肠杆菌的膜组分纯化这些蛋白质。37℃，在20ml LB/Amp(100μg/ml)液液培养基中使携带感兴趣质粒的单集落生长过夜。用1.0L新鲜培养基以1：30稀释细菌。克隆406.1L和919LOrf4在30℃生长，Orf25L和576.1L在37℃生长，直到OD550达到0.6-0.8。对919LOrf4而言，生长必须在30℃，因为重组蛋白质在37℃的表达导致细胞的裂解。以终浓度为1.0mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达。培育3小时后，于4℃以8000g离心15分钟收获细菌。必要时，将细胞存储于-20℃。随后的所有步骤都是在冰上或4℃进行的。将细菌重悬浮于25ml含完整蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)的PBS中，并通过French Press以渗透性冲击2-3代裂解细菌。以5000g离心15分钟除去未破碎的细胞，以100000g(Beckman Ti50，38000rpm)离心45分钟沉淀膜。用Dounce匀浆器将膜沉淀物重悬浮于7.5ml 20mM Tris-HCl(pH8.0)、1.0M NaCl和完整的蛋白酶抑制剂中。混合悬浮液2-4小时，以100000g离心45分钟，并将沉淀物重悬浮于7.5ml 20mM Tris-HCl(pH8.0)、1.0M NaCl、5.0mg/mlCHAPS、10％(v/v)甘油和完整的蛋白酶抑制剂中。将此溶液混合过夜，以100000g离心45分钟，用适当选择的缓冲液透析上清液6小时。对Orf25.L而言，发现在CHAPS提取后得到的沉淀物包含重组蛋白质。无需进一步纯化，可将该组分用于免疫接种小鼠。
FPLC-C：与FPLC-A相同，但从用多粘菌素B渗透大肠杆菌后得到的可溶性组分进行纯化，而不是在细胞破碎后进行的。
FPLC-D：于37℃，使携带感兴趣质粒的单集落在20ml LB/Amp(100μg/ml)液态培养基中生长过夜。用1.0L新鲜培养基以1：30稀释细菌，并在30℃生长直到OD550到达0.6-0.8。以终浓度1.0mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达。培育3小时后，于4℃以8000离心15分钟收获细菌。必要时将细胞存储于-20℃。随后的所有步骤都是在冰上或4℃进行的。将细胞重悬浮于20mM Bicine(pH8.0)、20mM NaCl、10％(v/v)甘油和完整蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)中，并用Branson Sonifier 450破碎细胞。以8000g离心超声处理液30分钟，以沉积未破碎的细胞和包含体。通过添加3.9M(NH4)2SO4，从饱和度为35％v/v到70％v/v之间的溶液中沉淀重组蛋白。以8000g沉积沉淀物30分钟，将其重悬浮于20mM Bicine(pH8.5)、20mM NaCl、10％(v/v)甘油，并用该缓冲液透析6小时或过夜。以13000g离心透析液20分钟，并加到FPLC树脂上。用分步NaCl梯度从该柱洗脱下蛋白质。用SDS-PAGE分析纯化，并用Bradford方法测定蛋白质浓度。
克隆策略和寡核苷酸设计
用以脑膜炎奈瑟球菌B MC58的基因组序列为基础设计的寡核苷酸，通过PCR扩增编码感兴趣抗原的基因。除非特别指出，通常将菌株2996的基因组DNA用作PCR反应的模板，将扩增的片段克隆入表达载体pET21b+(Novagen)，从而以C-未端His标记的产物形式表达该蛋白质，或将其克隆入pET-24b+(Novagen)以‘未标记的′形式(如△G287K)表达该蛋白质。
当蛋白质不用融合配体和用其自身前导肽(如果存在时)表达时，进行开放读框(ATG到终止密码子)的扩增。
当蛋白质以‘未标记的′的形式表达时，通过从预计的前导序列设计5′-端扩增引物下游除去前导肽。
用于PCR的引物的解链温度取决于整个引物中杂交核苷酸的数量和类型，并用以下公式确定：
Tm1＝4(G+C)+2(A+T)(除去尾部的)
Tm2＝64.9+0.41(％GC)-600/N(完整的引物)
对整个寡聚物而言，所选寡核苷酸的解链温度通常为65-70℃，仅针对杂交区域，解链温度为50-60℃。
用Perkin Elmer 394DNA/RNA合成仪合成寡核苷酸，将其从柱上洗脱到2.0ml NH4OH中，在56℃培育5小时以去保护。加入0.3M乙酸钠和2体积的乙醇沉淀寡聚物。将样品离心，将沉淀物重悬浮于水中。
Figure C200310102845D00811
Figure C200310102845D00821
Figure C200310102845D00831
Figure C200310102845D00861
Figure C200310102845D00871
Figure C200310102845D00881
Figure C200310102845D00891
Figure C200310102845D00901
Figure C200310102845D00911
Figure C200310102845D00921
*将该引物用作反向引物，将所有287的C未端融合于His-标记。
§与287-His反向引物联用的正向引物。
NB-所有PCR反应使用菌株2996，除非特别指出(如菌株MC58)。
在所有以ATG起始不跟随唯一NheI位点的构建物中，ATG密码子是用于克隆的NdeI位点的一部分。在5′端用NheI作为克隆位点制备的构建物(如所有那些在N-未端包含287的)另有两个融合于抗原的编码序列的密码子(GCTAGC)。
染色体DNA模板的制备
在100ml GC培养基中使脑膜炎奈瑟球菌菌株2996、MC58、394.98、1000和BZ232(及其它)生长至指数期，离心收获，并重悬浮于5ml缓冲液(20％w/v蔗糖、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、pH8)中。在冰上培育10分钟后，加入10ml裂解液(50mM NaCl、1％十二烷基肌氨酸钠(Na-Sarkosyl)、50μg/ml蛋白酶K)裂解细菌，悬浮液在37℃培育2小时。进行2次苯酚提取(平衡至pH8)和一次CHCl3/异戊醇(24：1)提取。加入0.3M乙酸钠和2体积乙醇沉降DNA，并离心收集。用70％(v/v)乙醇洗涤沉淀物1次，并重溶解于4.0ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)。读取OD260测定DNA浓度。
PCR扩增
标准的PCR过程进行如下：在40μM各寡核苷酸引物、400-800μM dNTP溶液、1x PCR缓冲液(包含1.5mM MgCl2)、2.5单位TaqI DNA聚合酶(用Perkin-Elmer AmpliTaQ，Boerhingher Mannheim ExpandTM长模板)存在时，将200ng2996、MC581000、或BZ232菌株的基因组DNA或10ng重组克隆的质粒DNA制备物用作模板。
将整个混合物在95℃初步培育3分钟后，每份样品进行2-步的扩增：用除去引物(Tm1)的限制酶尾部的杂交温度进行前5轮。然后以按全长？聚物(Tm2)计算的杂交温度进行30轮。根据要扩增的Orf的长度，在68℃或72℃进行的延伸时间各不相同。对Orf1而言，自3分钟开始的延伸时间每轮递增15秒。以在72℃10分钟延伸步骤完成循环。
将扩增的DNA直接加到1％琼脂糖凝胶上。按制造商说明，用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化相应于正确大小条带的DNA片段。
PCR片段和克隆载体的消化
用适合的限制酶消化相应于扩增片段的纯化DNA，从而克隆入pET-21b+、pET22b+、或pET-24b+。用QIAquick PCR纯化试剂盒(按制造商的说明)纯化消化的片段，用H2O或10mM Tris(pH8.5)洗脱。用适合的限制酶消化质粒载体，加到1.0％琼脂糖凝胶上，用Qiagen AIQquick凝胶提取试剂盒纯化相应于消化的载体的条带。
克隆
将预先消化和纯化的、相应于各基因的片段连接到pET21b+、pET22b+或pET-24b+中。将在连接缓冲液(由制造商提供)中的T4DNA连接酶用于摩尔比为3：1的片段/载体。
通过在冰上培育连接酶反应溶液和细菌40分钟，然后在37℃培育3分钟，将重组质粒转化入感受态大肠杆菌DH5或HB101中。
然后添加800μl LB肉汤，并在37℃培育20分钟。在Eppendorf微型离心机中以最高速度离心这些细胞，并重悬浮于约200μl的上清液中，并涂布在到LB氨苄青霉素(100mg/ml)琼脂上。
在4.0ml LB肉汤+100μg/ml氨苄青霉素中培育随机选择的集落过夜，进行重组集落的筛选。使细胞沉淀，并按制造商的说明用Qiagen QIAprep SpinMiniprep试剂盒提取质粒DNA。用适合的限制酶消化约1μg的各微型制备物，将消化物加到1-1.5％琼脂糖凝胶(取决于预计的插入大小)与分子量标记(1kbDNA Ladder，GIBCO)平行。根据插入的大小选择阳性克隆。
表达
各基因克隆入表达载体后，将重组质粒转化入适合表达重组蛋白的大肠杆菌菌株中。如上所述，用1μl各构建物转化大肠杆菌BL21-DE3。将单重组集落接种入2ml LB+Amp(100μg/ml)中，在37℃培育过夜，然后在100ml烧瓶中用20ml LB+Amp(100μg/ml)以1：30稀释，使OD600在0.1-0.2之间。将烧瓶置于旋转式水浴摇床中于30℃或37℃培育，直到OD600显示适合诱导表达的指数生长期(0.4-0.8OD)。加入1.0mM IPTG诱导蛋白质表达。在30℃或37℃培育3小时后，测定OD600并检测表达。用微型离心机离心1.0ml各样品，将沉淀物重悬浮于PBS中，用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析。
Gateway克隆和表达
克隆GATE标记的序列，并用GATEWAY克隆方法(GIBCO-BRL)表达。重组克隆(CR)是根据介节噬菌体整合入大肠杆菌基因组和从大肠杆菌基因组切除噬菌体的重组反应。整合包括在位于细菌基因组attB位点中的噬菌体DNA的attP位点的重组(BP反应)和产生侧翼于attL和attR位点的整合的噬菌体基因组。切除将attL和attR位点重组回attP和attB位点(LR反应)。整合反应需要两种酶[噬菌体蛋白融合酶(Int)和细菌蛋白整合宿主因子(IHF)](BP克隆酶)。切除反应需要Int、IHF和其它噬菌体酶切除酶(Xis)(LR克隆酶)。将25-bp细菌attB重组位点的人工衍生物(涉及B1和B2)加到用于PCR反应的引物的5′端，以扩增奈瑟球菌的ORF。用BP克隆酶，将得到的产物BP克隆入包含噬菌体attP重组位点的互补衍生物的“供体载体”中。得到的“进入克隆”包含侧翼于attL位点的衍生物(L1和L2)的ORF，用LR克隆酶将其亚克隆入包含attL-相容的attR位点的衍生物的表达“目的载体”中。得到“表达克隆”，其中ORF侧翼于B1和B2，且在读框内融合于GST或His N未端标记。
用于GATEWAY表达的大肠杆菌菌株是BL21-SI。通过在含有盐(0.3MNaCl)的培养基中培育，诱导该菌株的细胞表达T7RNA聚合酶。
要注意的是该系统产生N-未端His标记。
膜蛋白的制备
分离主要由内膜、外膜或全膜构成的组分，以获得由膜定位的前导序列表达的重组蛋白。制备膜组分(富含重组蛋白)的方法是采用Filip等[J.Bact.(1973)115：717-722]和Davies等人[J.Innunol.Meth.(1990)143：215-225]的方法。于37℃，在20ml LB/Amp(100μg/ml)液体培养基中使携带感兴趣质粒中的单集落生长过夜。用1.0L新鲜培养基以1：30稀释细菌，让其在30℃或37℃生长直到OD550达到0.6-0.8。用终浓度为1.0mM的IPTG诱导重组蛋白的表达。培育3小时后，在4℃以8000g离心15分钟收获细菌，并重悬浮于20ml20mM Tris-HCl(pH7.5)和完整的蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)中。随后的所有步骤都是在4℃或冰上进行的。
用Branson Sonifier 450进行超声处理破碎细胞，并以5000g离心20分钟以沉积未破碎的细胞和包含体。以50000g(Beckman Ti50，29000rpm)离心包含膜和细胞碎片的上清液75分钟，用20mM Bis-Tris丙烷(pH6.5)、1.0M NaCl、10％(v/v)甘油洗涤，并以50000g再次离心75分钟。将沉淀物重悬浮于20mMTris-HCl(pH7.5)、2.0％(v/v)十二烷基肌氨酸钠、完整的蛋白酶抑制剂(1.0mMEDTA终浓度)，并培育20分钟以溶解内膜。以5000g离心沉淀的细胞碎片10分钟，以75000g离心上清液75分钟(Beckman Ti50，33000rpm)。在上清液中发现蛋白质008L和519L，表明内膜的定位。对这些蛋白质，用内膜和全膜组分(如上所述用NaCl洗涤)免疫接种小鼠。用20mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤从75000g沉淀物得到的外膜小泡，并以75000g离心75分钟或过夜。最后将OMV重悬浮于500μl20mM Tris-HCl(pH7.5)、10％v/v甘油中。Orf1L和Orf40L都定位于且在外膜组分中富含，将其用于免疫接种小鼠。用标准Bradford试验(Bio-Rad)计算蛋白质浓度，用DC蛋白质试验(Bio-Rad)确定内膜组分的蛋白质浓度。用SDS-PAGE分析分离步骤中的各种组分。
His-标记的蛋白质的纯化
从菌株2996和MC58中克隆了287的各种形式。用C-未端His标记的融合体进行构建，其包括成熟形式(aa18-427)、含缺失(△1、△2、△3和△4)的构建物和由B或C结构域组成的克隆。对以His-融合体纯化的各克隆而言，划线接种单集落，并且在37℃LB/Amp(100μg/ml)琼脂板上培育过夜。将从该平板上分离的集落接种到20ml LB/Amp(100μg/ml)的液体培养基中，并在37℃振荡生长过夜。以1∶30将过夜培养物稀释到1.0L LB/Amp(100μg/ml)液体培养基中，让其在最佳温度(30或37℃)生长，直到OD550达到0.6-0.8。添加IPTG(终浓度为1.0mM)诱导重组蛋白的表达，再培育培养物3小时。于4℃，以8000g离心15分钟收获细菌。将细菌沉淀重物悬浮于7.5ml(i)冷缓冲液A(300mMNaCl、50mM磷酸盐缓冲液、10mM咪唑、pH8.0)，用于可溶性蛋白质；或(ii)缓冲液B(10mM Tirs-HCl、100mM磷酸盐缓冲液，pH8.8和任选地8M尿素)，用于不溶性蛋白质。以可溶形式纯化的蛋白质包括287-His、△1、△2、△3和△4287-His、△4287MC58-His、287c-His和287cMC58-His。蛋白质287bMC58-His是不溶的并相应地纯化。用Branson Sonifier450，在冰上以40W、30秒超声处理破坏细胞4次，并于4℃以13000xg离心30分钟。对于不溶蛋白质，将沉淀物重悬浮于2.0ml缓冲液C(6M盐酸胍、100mM磷酸盐缓冲液、10mM Tris-HCl、pH7.5)，并用Dounce匀浆器处理10次。以13000g离心匀浆30分钟并保留上清液。将可溶的和不溶制备物的上清液与150μl Ni2+-树脂(预先用缓冲液A或缓冲液B平衡)混合，并在室温温和振荡培育30分钟。树脂是按制造商说明制备的Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmcia)。于4℃，以700g离心分批制备物5分钟，弃去上清液。用10ml缓冲液A或B洗涤树脂2次(分批)10分钟，重悬浮于1.0ml缓冲液A或B中，加到一次性柱上。用(i)缓冲液A(4℃)或(ii)缓冲液B(室温)持续洗涤树脂，直到流出物的OD280达到0.02-0.01。再用(i)冷缓冲液C(300mM NaCl、50mM磷酸盐缓冲液、20mM咪唑、pH8.0)或(ii)缓冲液D(10mM Tris-HCl、100mM磷酸盐缓冲液、pH6.3和任选地8M尿素)进一步洗涤树脂，直到流出物的OD280达到0.02-0.01。加入700μl(i)冷洗脱缓冲液A(300mM NaCl、50mM磷酸盐缓冲液、250mM咪唑、pH8.0)或(ii)洗脱缓冲液B(10mM Tris-HCl、100mM磷酸盐缓冲液、pH4.5和任选地8M尿素)洗脱His-融合蛋白，收集组分直到OD280显示获得了所有重组蛋白。用SDS-PAGE分析20μl量的各洗脱组分。用Bradford试验计算蛋白质浓度。
变性的His-融合蛋白的复性
需要变性以稳定287bMC8，因此在免疫接种前需要进行复性步骤。将甘油加到上述得到的变性组分中，使终浓度为10％v/v。用透析缓冲液I(10％v/v甘油，0.5M精氨酸、50mM磷酸盐缓冲液、5.0mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、2.0M尿素，pH8.8)将蛋白质稀释至200μg/ml，用相同的缓冲液在4℃透析12-14小时。于4℃，用缓冲液II(10％v/v甘油，0.5M精氨酸、50mM磷酸盐缓冲液、5.0mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、pH8.8)再进行透析12-14小时。用以下公式计算蛋白质的浓度：
蛋白质(mg/ml)＝(1.55×OD280)-(0.76×OD260)
氨基酸序列分析
根据制造商的推荐，用配备在线乙内酰苯硫脲-氨基酸分析仪(System Gold)的Beckman测序仪(LF 3000)进行蛋白质NH2-末端的自动测序分析。
免疫接种
在第0、21和35天，用抗原免疫接种Balb/C小鼠，在第49天分析血清。
血清分析-ELISA
将不包囊的MenB M7和包囊的菌株置于巧克力琼脂板上，在37℃、5％CO2中培育过夜。用无菌Dracon刷从琼脂板上收集细菌菌落，并接种到含有0.25％葡萄糖的Mueller-Hinton肉汤(Difco)中。每30分钟监测一次细菌的生长，随后测定OD620。让细菌生长直到OD达到0.4-0.5。将培养物以4000rpm离心10分钟。弃去上清液，用PBS洗涤细菌2次，重悬浮于含有0.025％甲醛的PBS中，并在37℃培育1小时，然后在4℃搅拌培育过夜。在96孔Greiner板的各孔中添加100μl细菌细胞，并在4℃培育过夜。然后用PBT洗涤缓冲液(0.1％Tween-20的PBS溶液)冲洗这些孔3次。在各孔中加入200μl饱和缓冲液(2.7％聚乙烯吡咯烷酮10的水溶液)，将这些平板在37℃培育2小时。用PBT冲洗这些孔3次。在各孔中加入200μl稀释的血清(稀释缓冲液：1％BSA、0.1％Tween-20、0.1％NaN3的PBS溶液)，将这些平板在37℃培育2小时。用PBT冲洗这些孔3次。在各孔中加入100μl HRP-缀合的兔抗-小鼠(Dako)血清(用稀释缓冲液以1：2000稀释)，将这些平板置于37℃培育90分钟。用PBT缓冲液洗涤这些孔3次。在各孔中加入100μl HRP的底物缓冲液(25ml柠檬酸缓冲液pH5，10mg邻-苯二胺(phenildiamine)和10μl H2O2)，并将平板在室温中静置20分钟。在各孔中加入100μl12.5％H2SO4，随后测定OD490。计算ELISA滴定度，即高于预先免疫血清稀释度的、OD490值为0.4的血清稀释度。当OD490值为0.4的血清稀释度高于1：400时，将ELISA视为阳性。
血清分析-FACS扫描细菌结合分析
将不包囊的MenB M7菌株置于巧克力琼脂板上，在37℃、5％CO2中培育过夜。用无菌Dracon刷从琼脂板上收集菌落，并接种到4支装有0.25％葡萄糖的8ml Mueller-Hinton肉汤(Difco)试管中。每30分钟监测细菌的生长，然后测定OD620。让细菌生长直到OD达到0.35-0.5。将培养物以4000rpm离心10分钟。弃去上清液，用封阻缓冲液(1％BSA的PBS溶液，0.4％NaN3)重悬浮沉淀物，并以4000rpm离心5分钟。将细胞重悬浮于封阻缓冲液，使OD620达到0.05。在96孔Costar板的各孔中添加100μl细菌细胞。在各孔中加入100μl稀释的(1：100、1：200、1：400)血清(以封阻缓冲液配制)，并将这些平板在4℃培育2小时。以4000rpm离心细胞5分钟，吸出上清液，在各孔中加入200μl/孔封阻缓冲液洗涤细胞。在各孔中加入100μl R-Phicoerytrin缀合的F(ab)2山羊抗-小鼠(以1：100稀释)，将平板置于4℃培育1小时。以4000rpm离心5分钟以沉淀细胞，加入200μl/孔封阻缓冲液洗涤细胞。吸出上清液，细胞重悬浮于200μl/孔PBS、0.25％甲醛。将样品转移到FACScan管中并读数。FACScan(Laser Power 15mW)的条件设为：FL2开；FSC-H阈值：92；FSC PMT电压：E01；SSC PMT：474；Amp.Gains 6.1；FL-2PMT：586；补偿值：0。
血清分析-杀菌试验
于37℃、在5％CO2、在巧克力琼脂板(以冷冻原液起始)上培育脑膜炎奈瑟球菌2996过夜。收集菌落，并将其接种到7ml含有0.25％葡萄糖的Mueller-Hinton肉汤中，使OD620达到0.05-0.08。在37℃振荡培育约1.5小时，直到OD620达到0.23-0.24。用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2，含10mM MgCl2、10mM CaCl2和0.5％(w/v)BSA(分析缓冲液))以105CFU/ml工作稀释度稀释细菌。最终反应混合物的总体积为50μl，其中25μl连续2倍稀释的测试血清，12.5μl工作稀释度的细菌，12.5μl幼兔补体(终浓度25％)。
对照包括：用补体血清培育的细菌、用细菌培育并在56℃加热30分钟补充灭活的免疫血清。在加入幼兔补体后，用斜置方法立即将10μl对照置于Mueller-Hinton琼脂板上(0时间)。37℃旋转培育96孔板1小时。将每份样品的7μl涂布在Mueller-Hinton琼脂板上作为斑点，而用斜置方法将10μl对照涂布在Mueller-Hinton琼脂板上(1时间)。37℃培育琼脂板18小时，计算相应于0时间和1时间的菌落数量。
血清分析-Western印迹法
将纯化的蛋白质(500ng/泳道)、外膜小泡(5μg)和MenB菌株2996衍生的全细胞提取物(25μg)加到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到硝基纤维素膜上。用转化缓冲液(0.3％Tris碱，1.14％甘氨酸、20％(v/v)甲醇)在4℃、150mA进行转化2小时。于4℃在饱和缓冲液(10％脱脂乳、0.1％Triton X100的PBS溶液)中培育过夜使膜饱和。用冲洗缓冲液(3％脱脂乳、0.1％Triton X100的PBS溶液)冲洗膜2次，并在37℃与用洗涤缓冲液以1：200稀释的小鼠血清一起培育2小时。冲洗膜2次，与1：2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠Ig一起培育90分钟。用0.1％Triton X100的PBS溶液冲洗膜2次，用Opti-4CN底物试剂盒(Bio-Rad)显色。加入水终止反应。
如下制备OMV：37℃、5％CO2，在5个GC板上让脑膜炎奈瑟球菌2996生长过夜，用接种环收获，并重悬浮于10ml20mM Tris-HCl pH7.5、2mM EDTA中。在56℃热灭活45分钟，在冰上超声处理破碎细胞5分钟(50％负载循环(dutycycle)、50％输出，Branson超声仪3mm微型针头)。以5000g离心10分钟除去未破碎的细胞，回收含有完整细胞包膜组分的上清液，于4℃以50000g进一步离心过夜。将含有膜的沉淀物重悬浮于2％二烷基肌氨酸、20mM Tris-HClpH7.5、2mM EDTA中，在室温培育20分钟以溶解内膜。以10000g离心上清液10分钟除去聚集体，以50000g进一步离心上清液3小时。用PBS冲洗含有外膜的沉积物，并重悬浮于相同的缓冲液中。用BSA作为标准，由D.C.Bio-Rad蛋白分析(改进的Lowry方法)测定蛋白质的浓度。
如下制备全细胞提取物：使脑膜炎奈瑟球菌在GC板上培育过夜，用接种环收获，并重悬浮于1ml 20mM Tris-HCl中。在56℃热灭活30分钟。
961结构域的研究
细胞组分的制备 用过夜培养物或在IPTG培育3小时后的细菌制备表达961不同结构域的大肠杆菌克隆的全裂解物、周质、上清液和OMV。简单地说，获得周质，细菌悬浮于蔗糖25％和Tris 50mM(pH8)(含有polimixine100μg/ml)。1小时后，室温以13000rpm离心细菌15分钟，收集上清液。用0.2μm过滤培养物上清液，在冰中用TCA50％沉淀2小时。离心(13000rp，30分钟)后，用乙醇70％漂洗沉淀物2次，并悬浮于PBS中。如上所述，进行OMV制备。用针对GST-961的多克隆抗血清，在SDS-PAGE或Western印迹中分析各细胞组分。
粘附分析 在补充有10％热灭活的PCS、15mM L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM(Gibco)中维持张氏(Chang)上皮细胞(Wong-Kilbourne衍生物，克隆1-5c-4，人结膜)。
为了进行粘附分析，用PBS漂洗张氏上皮细胞的亚融合培养物，并用胰蛋白酶-EDTA(Giboc)处理，从而从塑性支持体上释放它们。然后将细胞悬浮于PBS中，计数并在PBS中稀释至5×105细胞/ml。
沉淀过夜培育的或用IPTG诱导后的细菌，并用PBS通过以13000离心5分钟洗涤2次。在室温、暗处，在1ml缓冲液(含有50mM NaHCO3和100mM NaClpH8)中将约2-3×108(cfu)与0.5mg/ml FITC(Sigma)一起培育30分钟。洗涤FITC标记的细菌2-3次，并以1-1.5×109/ml悬浮于PBS中。于37℃，将200μl此悬浮液(2-3×108)与200μl(1×105)上皮细胞一起培育30分钟。然后以2000rpm离心细胞5分钟，除去未粘附的细胞，悬浮液200μl PBS中，转移到FACScan管中并读数。

Claims (13)

1.一种异源表达蛋白质ORF46、564、961、502或287的方法，其特征在于，所述的方法中(a)除去蛋白质中的至少一个结构域，和任选地(b)未使用融合配体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的本发明的蛋白质是ORF46。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述的ORF46分成第一结构域，即氨基酸1-433，和第二结构域，即氨基酸433-608。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的本发明的蛋白质是564。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述的蛋白质564分成如图8所示的结构域。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的本发明的蛋白质是961。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述的蛋白质961分成如图12所示的结构域。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的本发明的蛋白质是502，且所述的结构域是氨基酸28-167，其中该氨基酸28-167按MC58序列编号。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的本发明的蛋白质是287。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述(a)中除去蛋白质N-未端区域的一部分。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，将所述的蛋白质287如图5所示分成结构域A、B和C。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，除去(i)所述的结构域A；(ii)所述的结构域A和B；或(iii)所述的结构域A和C。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，除去所述的结构域A的(i)氨基酸1-17；(ii)氨基酸1-25；(iii)氨基酸1-69；或(iv)氨基酸1-106。
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