WO2014084432A1 - 헬리코박터 파일로리 발현 벡터 - Google Patents

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WO2014084432A1
WO2014084432A1 PCT/KR2012/010352 KR2012010352W WO2014084432A1 WO 2014084432 A1 WO2014084432 A1 WO 2014084432A1 KR 2012010352 W KR2012010352 W KR 2012010352W WO 2014084432 A1 WO2014084432 A1 WO 2014084432A1
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helicobacter pylori
gst
expression vector
pylori
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PCT/KR2012/010352
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이광호
윤희상
조명제
이우곤
백승철
강형련
송재영
조영아
조진성
권순욱
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경상대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag

Definitions

  • the present invention relates to a Helicobacter expression vector, and more particularly to a Helicobacter pylori expression vector for the expression and purification of Helicobacter pylori protein.
  • H. pylori is an aerobic gram-negative bacterium of size 1.87-7.4 X 1,2 um. H. pylori is widespread worldwide, of which about 80% of the population is infected with this organism. It is known that the infection rate of Koreans is about 50% when they are 5-6 years old, and about 80-90% after 8 years of age. Infection with H. pylori causes gastritis and peptic ulcer disease and further causes gastric cancer. In 1994, the International Health Organization defined H. pylori as the first carcinogen of human gastric cancer. These results suggest that the highest rate of gastric cancer among Koreans is also correlated with H. pylori infection.
  • H. pylori Although treatment for H. pylori is very important, there are some difficulties with treatment. First of all, in order to accurately diagnose H. pylori infection, the gastric mucosa should be removed and examined through gastroscopy. In vitro, this bacterium is extremely resistant to ordinary antimicrobial agents. It is difficult to treat because it avoids direct attack of antimicrobial agent because it is inhabited. In addition, H. pylori cannot develop viable vaccines due to the difficulty of artificial culture, and even if successful, the vaccine is difficult to function because it lives in the mucous layer on the surface of gastric mucosa and not in the body where the immune system can operate.
  • H. pylori gene products to study the properties and structure of the protein is very important for the study of the bacteriological properties of the bacteria or to inhibit the gastroduodenal disease.
  • approximately one-third of the H. pylori gene cloned into E. coli is not protein-expressed, or the expressed protein forms most of the insoluble inclusion bodies, making further analysis and research impossible.
  • H. pylori DNA is difficult to clone using the E. coli system.
  • the present invention is to solve various problems, including the above problems, and to provide a vector for the expression and purification of H. pylori protein.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • Helicobacter pylori (Helicobacter pylori) gene, histidine tag (Histidine-tag, His-tag ) encryption nucleotides, a first antibiotic resistance gene gst gene and the host cell does not have an enable sequentially operated
  • An expression vector for expression of a fusion protein comprising said Helicobacter pylori gene, comprising linked gene constructs, is provided.
  • the Helicobacter pylori gene is cloned only about 400 to 600 nucleotides long at the 3 'end. Only 400 to 600 nucleotides in length of the 3 'end of the gene was cloned because the expression vector is sufficient to cross over into the genome of Helicobacter.
  • the vector into the H. pylori Heath tag fused to the protein and the protein encoded by the H. pylori gene under the influence of H. pylori H. pylori gene and its promoter, while the cross-over (cross over) (His -tag), gst and the first antibiotic resistance gene are expressed in series.
  • the first antibiotic resistance gene may be chloramphenicol acetyltransferase, which is an antibiotic resistance gene currently used mainly in vectors of Helicobacter.
  • the Helicobacter pylori gene may be cagA, clpB, dnaK, groEL, flaA, frdB, or porG, and genes known to encode proteins of Helicobacter may be used without limitation.
  • the flaA and clpB genes may be polynucleotides having nucleic acid sequences of Genebank ID 899977 and Genebank ID 899187.
  • the gst gene may be a polynucleotide having a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • the gst gene facilitates the purification of the recombinant protein prepared using the expression vector according to an embodiment of the present invention, for example, GSH affinity chromatography can be used.
  • the purified Helicobacter pylori protein can be easily obtained protein of H. pylori by separating the protein and gst using a thrombin enzyme (thrombin) enzyme.
  • thrombin thrombin enzyme
  • Helicobacter expression vector according to an embodiment of the present invention by using a GST tag and his-tag (His-tag), provides the effect of increasing the purity of the protein after purification.
  • the Helicobacter pylori (Helicobacter pylori) gene, Heath tag (His-tag), gst gene and the host cell does not have one antibiotic resistance gene gene was coupled to sequentially operate construct
  • a transgenic host cell transformed with a host cell with an expression vector for expression of a fusion protein comprising said Helicobacter pylori gene.
  • the first antibiotic resistance gene may be chloramphenicol acetyltransferase.
  • the host cell may be a Helicobacter pylori and the gene construct may be inserted into the genomic DNA of the Helicobacter pylori.
  • Helicobacter pylori (Helicobacter pylori) gene, Heath tag (His-tag), gst gene and the gene construct is a host cell a first antibiotic resistance gene that does not have coupled to sequentially operate agent
  • Selecting a recombinant Helicobacter pylori comprising the step of selecting a recombinant Helicobacter pylori in which the gene construct is inserted into genomic DNA of the transformed Helicobacter pylori;
  • the first antibiotic resistance gene may be chloramphenicol acetyltransferase.
  • the method for producing a protein in the method for producing a protein, the method for producing a protein expressed by the Helicobacter pylori gene from Helicobacter pylori further comprising the step of removing the GST tag by the GST affinity chromatography after the thrombin treatment of the fusion protein. This is provided.
  • FIG. 1 is a view schematically showing the structure of the backbone vector of the Helicobacter pylori expression vector (FIG. 1A) and the structure of the expression vector (FIG. 1B) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the operation of the Helicobacter pylori expression vector according to an embodiment of the present invention and a method for separating and purifying products produced from the vector.
  • FIG. 3 is a PCR of his tag cloning (FIG. 3A), cloning of cat gene (FIG. 3B), and his tag and cat gene inserted into the expression vector constituting the Helicobacter pylori expression vector according to an embodiment of the present invention. The result is a photo.
  • Figure 4 is a photograph of a Helicobacter pylori gene dnaK, clpB, groEL, flaA, porG, frdB amplified by PCR using agarose electrophoresis electrophoresis is inserted into the Helicobacter pylori expression vector according to an embodiment of the present invention (M: 500 bp DNA marker; 1: dnaK; 2: clpB; 3: groEL; 4: flaA; 5: porG; 6: frdB).
  • FIG. 5 is a diagram confirming the transformation of H. pylori transformants transformed with the Helicobacter pylori expression vector using SDS-PAG according to an embodiment of the present invention
  • M protein marker
  • 1 H. pylori 1061 wild type: 2: pBKHGC_groEL transformant; 3: pBKHGC_flaA transformant; 4: pBKHGC_clpB transformant).
  • FIG. 6 is a diagram confirming the expression of recombinant proteins from pBKHGC_flaA and pBKHGC_clpB transformants prepared using the Helicobacter pylori expression vector according to an embodiment of the present invention using GSH affinity chromatography
  • M protein marker
  • 1 FlaA_gst recombinant protein
  • 2 FlaA_gst recombinant protein + thrombin treatment
  • 3 Thrombin treated FlaA_gst recombinant protein purified using GST affinity chromatography
  • 4 ClpB_gst recombinant protein
  • 5 ClpB_gst recombinant protein + thrombin treatment
  • 6 protein purified from thrombin treated ClpB_gst recombinant protein using GST affinity chromatography
  • 7 purified GST
  • FlaA_gst recombinant protein obtained from the pBKHGC_flaA transformant prepared using the Helicobacter pylori expression vector according to an embodiment of the present invention using Western blot (M: protein marker; 1, 4: FlaA_gst recombinant protein; 2,4: FlaA_gst recombinant protein + thrombin treatment; 3,6: Thrombin-treated FlaA_gst recombinant protein purified using GST affinity chromatography).
  • M protein marker
  • 1, 4 FlaA_gst recombinant protein
  • 2,4 FlaA_gst recombinant protein + thrombin treatment
  • 3,6 Thrombin-treated FlaA_gst recombinant protein purified using GST affinity chromatography
  • the basic framework of the vector for expression vector production was the pBK vector (Amersham, pUC4K) consisting of the origin of replication in Escherichia coli and the kanamycin resistance gene acting as an antibiotic marker in Escherichia coli and H. pylori .
  • the expression vector consists of chloramphenicol acetyltransferase, an antibiotic reporter that confirms expression when the kanamycin gene, an antibiotic marker that operates in E. coli and H. pylori , and the inserted Helicobacter pylori gene are expressed.
  • Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene and expressed protein were composed of His-tag and gst, which are double tags that can be used for affinity chromatography.
  • Helicobacter pylori is the working principle of the vector into the cloning vector to the H. pylori gene without promoter transformed to H. pylori H. pylori gene and cross over as H. pylori own promoter Switching to prevent changing an insoluble protein when overexpressed
  • the vector is operated by a system in which genes, His-tag, gst, and chloramphenicol are expressed in series (see FIG. 2).
  • the pBK vector was digested with EcoRI and SmaI (Takara, Japan) and subjected to electrophoresis on 1% agarose gel to confirm the cleavage, and then the cleaved pBK was determined using the ExpinTM PCR SV Kit (GeneAll, Korea). Purified. Then, His-tag included in the vector was used oligomeric pair (SEQ ID NO: 1, 2) of the nucleotide sequence modified the tag portion of the pET15b vector, gst is a pair of two pairs to remove the rare codon of H. pylori Amplification was performed by overlapping polymerase chain reaction using primers (SEQ ID NOs: 3 to 6).
  • the Helicobacter pylori protein introduced into the vector is a gene whose expression is confirmed in the produced expression vector, and should not make a multimer, and select a protein having no specific function at the C-terminal, groEL, clpB, Or the gene of flaA was inserted into the vector.
  • His-tag was mixed with 5 ⁇ l of a 100 pmole / ⁇ l polymer pair (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) having a nucleotide sequence of the His-tag portion of the pET15b vector (Novagen, USA), followed by 5 min at 99 ° C. It was prepared by heating, reacting for 5 minutes at room temperature and cooling for 5 minutes on ice (see Table 1).
  • the pBK vector was digested with EcoRI and SmaI (Takara, Japan) and subjected to electrophoresis on 1% agarose gel to confirm the cleavage.
  • the cleaved pBK was purified using ExpinTM PCR SV Kit (GeneAll, Korea).
  • the purified pBK plasmid and His-tag gene were mixed so that the molecular ratio was 1: 3, and added thereto in 10 ⁇ ligase buffer [300 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl 2 , 100 1 ⁇ l of mM DTT, 10 mM ATP] and 1 ⁇ l of ligase were added to adjust the final volume to 10 ⁇ l, followed by reaction at 16 ° C. overnight.
  • the ligated reaction solution was mixed in E. coli DH10B / r competent cells prepared by CaCl 2 method, and then placed on ice for 15 minutes, at 42 ° C. for 2 minutes, and again on ice for 10 minutes, and then 1 ml of LB medium was added.
  • the transformation was performed by shaking culture at 37 ° C. for one hour. Thereafter, the supernatant was discarded by centrifugation and resuspended in 200 ⁇ l of the remaining supernatant, which was then plated in LB agar medium to which kanamycin was added and incubated overnight at 37 ° C.
  • the colonies formed were inoculated in LB liquid medium to which the same antibiotics were added and shaken for about 15 hours to separate plasmids.
  • the purified plasmid was treated with PstI and subjected to electrophoresis to confirm the insertion of His-tag into the pBK vector.
  • PBK vector without His-tag inserted was cleaved while His-tag inserted plasmid was not cleaved with PstI to confirm his-tag insertion (FIG. 3A).
  • the primers were prepared to be a mutant gst gene by overlapping polymerase chain reaction using two pairs of primers (SEQ ID NOs: 3 to 6).
  • SEQ ID NOs: 3 to 6 primers for overlapping polymerase chain reaction.
  • nucleotides 217 to 225 were changed from CGTTATATA (SEQ ID NO: 15) to AGATATATC (SEQ ID NO: 16) without changing the amino acid sequence.
  • the pGEX4T-1 plasmid (Amersham, USA) was used as a template to amplify the gst gene by the overlapping polymerase chain reaction method.
  • the number of times of amplification was 30 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 56 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds, and further extended at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the amplified polymerase chain reaction product was confirmed by developing on 1% agarose gel, purified using a kit, and digested with EcoRI.
  • the pBK_His tag_gst vector (hereinafter referred to as pBKH vector) prepared in Example 1-2 was digested with EcoRI, purified, and purified by 10X CIP dephosphatase buffer [10 mM ZnCl 2 , 10 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-HCl, pH 8.3] 1 ⁇ l and deunitase 1 unit were added to adjust the final volume to 10 ⁇ l and then dephosphorylation was induced at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the kit was purified using DNA.
  • the purified pBKH vector and gst are mixed so that the molecular ratio is 1: 3, and 1 ⁇ l of 10 ⁇ ligase buffer and 1 ⁇ l of ligase are added thereto, and the final volume is 10 ⁇ l. After adjusting so as to react at 16 ° C. overnight.
  • the ligated reaction solution was mixed in E. coli DH10B / r competent cells prepared by CaCl 2 method, and then placed on ice for 15 minutes, at 42 ° C. for 2 minutes, and again on ice for 10 minutes, and then 1 ml of LB medium was added.
  • the transformation was performed by shaking culture at 37 ° C. for one hour.
  • the plasmid was purified from the transformant, digested with EcoRI, and electrophoresed to confirm the insertion of gst into the pBKH vector (FIG. 3B).
  • Cat promoters without promoters were amplified by overlapping polymerase chain reaction using two pairs of primers to modify the rare codons of H. pylori and pBC SK (+) plasmid (Agilent Technologies, USA) as a template. 1). The number of times of amplification was reacted 30 times at 94 ° C for 30 seconds, at 58 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds, followed by further extension of 72 ° C for 2 minutes. The amplified polymerase chain reaction product was identified and purified on 1% agarose gel, which was then digested with HindIII and NheI. pBKHG was also cleaved with the same enzyme and subjected to dephosphorylation. The dephosphorylation reaction was carried out under the same conditions as described in Example 1-2.
  • pBKHGC plasmid the purified pBK-His-tag-gst vector (hereinafter referred to as pBKHGC plasmid) and the cat gene are mixed so that the molecular ratio is 1: 3, and 1 ⁇ l of 10X ligase buffer is added thereto. 1 ⁇ l of ligase was added to adjust the final volume to 10 ⁇ l, followed by reaction at 16 ° C. overnight.
  • the ligated reaction solution was mixed with E. coli DH10B / r competent cells prepared by CaCl 2 method, and then placed on ice for 15 minutes, at 42 ° C. for 2 minutes, and again on ice for 10 minutes, followed by kanamycine.
  • 1 ml of the added LB medium was added and shake cultured at 37 ° C. for one hour to carry out transformation. Colonies obtained from the culture were inoculated into LB liquid medium to which the same antibiotics were added and shaken for about 15 hours.
  • pBKHGC plasmid was purified and used as a template to reconfirm the insertion of gst and cat genes by polymerase chain reaction using primers of gst and CAT (SEQ ID NOs: 3 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 10). ).
  • the H. pylori gene to be cloned in the expression vector is a gene whose expression has been identified and should not be made into multimers. Using the base sequence of each gene, remove the last stop codon from the base sequence about 150 ⁇ 250 bp from the upper part so that each corresponding gene is produced without a promoter, and restriction enzyme SmaI at the N terminus and XbaI at the C terminus. Primers were prepared to include (see Table 1).
  • Each gene was amplified by polymerase chain reaction using genomic DNA of Helicobacter pylori 26695 as a template. The number of times of amplification was extended 30 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 56 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 1 minute, and further extended at 72 ° C. for 5 minutes.
  • Amplified polymerase chain reaction clpB (Genebank ID HP0264), dnaK (Genebank ID HP0109), flaA (Genebank ID HP0601), frdB (Genebank ID HP0191), and the groEL gene (Genebank ID HP0010) were digested with XbaI and SmaI.
  • the expression vector prepared in Example 1 was cleaved using the same XbaI, SmaI restriction enzyme as the gene, subjected to dephosphorylation, and purified. Thereafter, the cloned H. pylori gene was mixed with a molecular ratio of 1: 3, and then ligation was performed at 16 ° C. overnight. Then, the ligated reaction solution was mixed in an E. coli DH10B R competent cell prepared by CaCl 2 method, placed on ice for 15 minutes, at 42 ° C. for 2 minutes, and again on ice for 10 minutes, and then 1 ml of LB medium was added. Transformation was performed by shaking culture at 37 ° C. for one hour.
  • the plasmid was purified from the transformant and digested with restriction enzymes XbaI and SmaI to confirm the insertion of H. pylori gene through electrophoresis.
  • Gst and cat primers were used to determine whether there is a problem such as a gene deletion or mutation by determining the nucleotide sequence using the gst and cat primers used in the vectors prepared through the procedures of Examples 1-1 to 1-3. Was used for sequencing.
  • the base sequences of the expression vectors (SEQ ID NO: 18) and gst1 primer (SEQ ID NO: 3) confirmed the base sequences 2,805 ⁇ 3,799nt.
  • the entire sequence of the expression vector prepared in Examples 1-1 to 1-3 is the same as SEQ ID NO: 18, looking at the configuration position of the expression vector according to an embodiment of the present invention is kanamycin 1419-2211 Nucleic acid position, XbaI is 2479 ⁇ 2484 nucleic acid position, SamI is 2497 ⁇ 2502 nucleic acid position, EcoRI is 2554 ⁇ 2559, 3240 ⁇ 3245 nucleic acid position, HindIII is 3234 ⁇ 3239 nucleic acid position, His-tag is 22-76 nucleic acid position, The GST gene was found to be located at the 82-756 nucleic acid position, and the CAT gene was located at the 763-1386 nucleic acid position.
  • H. pylori 1061 was distributed from Helicobacter pylori Korean Type C ⁇ ture Collection (HpKTCC, Gyeongsang National University).
  • the preparative H. pylori 1061 was prepared in 10% bovine serum, 10 ⁇ g / ml vancomycin, 25 ⁇ g / ml nalidixic acid, and 1 ⁇ g / ml amphotericin.
  • brucella was inoculated in agar medium and incubated for 3 days in a 37 °C thermostat maintained 10% CO2, 100% humidity. Thereafter, it was passaged in Brucella agar medium to which 10% of bovine serum was added and incubated for 5 hours under the same conditions. Thereafter, the cells were collected in platinum in the middle of the medium, and 10 ⁇ l of recombinant plasmid (0.2 ug / ⁇ l) was added thereto. This was allowed to stand for 15 to 20 minutes in a thermostat and plated to spread the bacteria throughout the medium and incubated for about 17 hours. The cultured cells were passaged on brucella agar medium to which kanamycin was added, and cultured for 5-10 days to observe colony formation. The cells were collected to confirm the protein expressed by SDS-PAGE. At this time, H. pylori 1061 was not used as a control was not introduced into the expression vector according to an embodiment of the present invention.
  • the recombinant protein was expressed using pBKHGC_flaA and pBKHGC_clpB transformants obtained by transforming the expression vector into which the groEL, flaA or clpB gene was introduced into H. pylori . It was confirmed.
  • the two kinds of transformants were enriched in brucella agar medium to which kanamycin was added, and about 30 mg of cells recovered with platinum were suspended in 1 ml of PBS.
  • the bacterial suspension was crushed using an ultrasonic crusher (Sonic & Materials, Danbury, CN, USA). Crushing was performed for 15 minutes at 38% amplitude, pulse on 2 seconds, and pulse off 4 seconds.
  • the crushed sample was centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C to recover the supernatant.
  • the recovered supernatant was subjected to GST affinity chromatography on a column filled with glutathione-agarose resin (Invitrogen, USA, linked through s ⁇ lfur).
  • the gst recombinant protein was separated into 58 kDa FlaA, 96 kDa ClpB, and 29 kDa gst by thrombin treatment (lane 2 and lane 6).
  • Lanes 3 and 6 of FIG. 6 show the results of purification of the protein separated by treatment with thrombin through GST affinity chromatography.
  • pBKHGC_flaA transformants obtained by transforming H. pylori were used to confirm the expression of the recombinant protein by Western blot.
  • FlaA_gst recombinant protein obtained from the pBKHGC_flaA transformant, a protein treated with thrombin, and the protein purified from thrombin treated using GSH affinity chromatography were subjected to Western blot using FlaA monoclonal antibody and GST antibody, respectively. It was.
  • a delivery buffer [20 mM Tris-HCl, 144 mM glycine, 25% methanol, 0.01% SDS]
  • the protein was delivered to filter paper for 50 minutes at 100 mA in an electrotransmitter (Semi-dry transfer cell, Bio-Rad, USA).
  • the nitrocellulose filter paper was then reacted with TBST buffer [10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0] for 30 minutes at 37 ° C. and washed three times with TBST buffer for 5 minutes each. It was. After washing, Fla.
  • H. pylori Monoclonal antibody of H. pylori (HpKTCC, Gyeongsang National University) was reacted at 37 ° C for 30 minutes, and then washed with TBST buffer three times for 5 minutes, and mixed with 1% BSA-TBST in a 1: 1000 ratio. After reacting with mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) for 30 minutes at 37 °C and washed three times with TBST buffer for 5 minutes. It was then reacted with goat anti-mouse IgG-AP (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) mixed in TBST buffer at a ratio of 1: 7,000 for 30 minutes at 37 ° C and 5 with TBST buffer.
  • Expression vector according to an embodiment of the present invention is easy to express and purify the Helicobacter pylori protein, it can be useful for the study of diseases caused by bacteriological properties or Helicobacter pylori.

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리 단백질의 특성을 연구하기 위하여, 상기 단백질의 발현 및 정제를 용이하게 하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스 태그(His-tag), gst 유전자 및 클로람페니콜(chloramphenicol)이 작동가능하게 연결된, 헬리코박터 파일로리 발현 벡터를 제공한다.

Description

헬리코박터 파일로리 발현 벡터
본 발명은 헬리코박터 발현벡터에 관한 것으로서, 더 상세하게는 헬리코박터 파일로리 단백질의 발현 및 분리정제를 위한 헬리코박터 파일로리 발현벡터에 관한 것이다.
Helicobacter pylori는 1.87-7.4 X 1,2 um 크기의 미호기성 그람 음성균으로 나선형의 모양을 가진 박테리아이다. H. pylori는 전 세계적으로 널리 감염되어 있으며 이 중 한국인은 전체 인구의 약 80% 이상이 이 균에 감염되어 있다. 한국인의 감염양상은 5~6세경일 때 이미 감염율이 50%에 이르며 8세 이후로는 약 80~90%가 감염된다고 알려져 있다. H. pylori의 감염은 위염과 소화성궤양을 유발하며 더 나아가 위암을 일으키는 요인이 된다. 1994년 국제보건기구에서는 H. pylori를 인체위암의 제1종 발암원으로 규정하였다. 이러한 결과는 한국인에게 유발되는 암 중 위암이 가장 높은 비율을 보이는 것 또한 H. pylori의 감염과 상관관계가 있다는 것을 시사한다.
H. pylori에 대한 치료는 매우 중요함에도 불구하고 치료에 대한 몇 가지 어려움이 있다. 먼저 H. pylori의 감염 여부를 정확하게 진단하기 위해서는 위내시경술을 통하여 위점막을 생검으로 떼어내어 조사해야 한다는 난점이 있으며 시험관 내에서 이 세균은 보통의 항균제에는 극히 잘 죽는 세균이지만, 인체의 위 점막에 서식하고 있기 때문에 항균제의 직접적인 공격을 피하므로 치료하기가 어렵다는 난점이 있다. 또한 H. pylori는 인공배양이 까다로워 생균백신을 개발할 수 없으며, 개발에 성공했다하더라도 면역기구가 작동할 수 있는 체내가 아닌 위점막 표면의 점액층에서 서식하기 때문에 백신이 작용하기 어렵다.
이러한 문제점들을 해결하기 위해 이 세균의 발병인자를 포함한 포괄적인 생물학적 특성을 이해할 필요가 있으며 질환과 관련된 유전자를 찾아내려는 시도가 이루어지고 있지만, 현재의 유전체 정보로는 이 세균을 제어하는데 필요한 생물학적 정보를 얻기에 아직 충분하지 않다. 때문에 전체 유전자의 30~40%에 이르는 가상 단백의 역할을 규명할 필요성이 있으며, 이러한 연구를 위해 H. pylori 의 유전자 산물을 분리 정제하여 특성을 규명하는 연구가 용이해져야 한다.
하지만 H. pylori의 유전자 산물을 얻는 데에도 몇 가지 난점이 있다. H. pylori의 유전자 산물을 얻기 위해서는 E. coli에서 발현을 유도하는 방법이 적용된다. 경상대학교 의학전문대학원 미생물학교실에서 수행한 연구결과를 살펴보면 H. pylori 단백질을 E. coli에서 발현 시켰을 때 전체 36개의 단백질 중 39%가 발현 되지 않았고, 발현이 된다 하더라도 44%는 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하여 더 이상의 분석이나 연구가 불가능 하였으며, 오직 17% 만이 수용성 단백질로 얻을 수 있었다. 이는 H. pylori와 E. coli 간의 ‘코돈 편향’이라는 문제점이 크기 때문이다.
H. pylori의 유전자 산물을 분리 정제하여 단백질의 특성이나 구조를 연구하는 것은 이 세균의 세균학적 성상을 규명하는 연구나 위십이지장 질환을 억제하기 위한 연구에 매우 중요하다. 그러나 대장균에 클로닝 된 H. pylori 유전자의 대략 1/3 정도는 단백질 발현이 되지 않거나 발현이 된 단백질도 대부분 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하여 더 이상의 분석이나 연구가 불가능하다. 또한, H. pylori DNA는 대장균 체계를 이용하여 클로닝하기가 어렵다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, H. pylori의 단백질의 발현 및 정제를 위한 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스티딘 태그(Histidine-tag, His-tag) 암호화 뉴클레오티드, gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현 벡터가 제공된다.
상기 발현 벡터에 있어서, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자는 3‘ 말단의 약 400 내지 600 뉴클레오타이드 길이 정도만 클로닝한다. 상기 발현벡터가 헬리코박터의 유전체내로 크로스 오버되기 위해서는 400 내지 600 뉴클레오타이드 정도만 있으면 충분하기 때문에 유전자의 3‘ 말단의 400 내지 600 뉴클레오타이드 길이만 클로닝하였다. 상기 벡터를 H. pylori 에 형질전환 시키면 H. pylori 유전자와 크로스 오버(cross over)되면서 H. pylori 자신의 프로모터의 영향 하에 H. pylori 유전자에 의해 암호화되는 단백질과 상기 단백질에 융합된 히스 태그(His-tag), gst 및 제1항생제 내성 유전자가 연쇄적으로 발현된다.
상기 발현 벡터에 있어서, 상기 제1항생제 내성 유전자는 현재 헬리코박터의 벡터에서 주로 사용되는 항생제 내성 유전자인 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase)일 수 있다.
상기 발현 벡터에 있어서, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자는 cagA, clpB, dnaK, groEL, flaA, frdB, 또는 porG 일 수 있으며, 헬리코박터의 단백질을 암호화한다고 알려진 유전자를 제한없이 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 flaA, clpB 유전자는 Genebank ID 899977 및 Genebank ID 899187의 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 gst 유전자는 서열번호 17로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 gst 유전자는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 단백질의 정제를 용이하게 해주며, 예를 들어 GSH 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 또한, 상기 정제된 헬리코박터 파일로리 단백질은 트롬빈(thrombin) 효소를 이용하여 단백질과 gst를 분리하여 H. pylori의 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 발현벡터는 GST태그와 히스 태그(His-tag)를 함께 이용함으로써, 정제후 단백질의 순도를 높이는 효과를 제공한다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스 태그(His-tag), gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다.
상기 숙주세포에 있어서, 상기 제1항생제 내성 유전자는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase)일 수 있다.
상기 숙주세포는 헬리코박터 파일로리일 수 있으며, 상기 유전자 컨스트럭트가 상기 헬리코박터 파일로리의 게놈 DNA에 삽입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스 태그(His-tag), gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비 단계; 상기 발현벡터로 헬리코박터 파일로리를 형질전환시키는 형질전환 헬리코박터 파일로리 제조 단계; 상기 형질전환 헬리코박터 파일로리 중 게놈 DNA 내부에 상기 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 헬리코박터 파일로리를 선별하는 단계를 포함하는 재조합 헬리코박터 파일로리 제조 단계; 및 상기 재조합 헬리코박터 파일로리를 배양한 후 배양물을 파쇄하고 GST 친화크로마토그래피를 이용하여 상기 융합단백질을 정제하는 융합단백질 정제단계를 포함하는 헬리코박터 파일로리로부터 상기 헬리코박터 파일로리 유전자에 의해 발현된 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
상기 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 제1항생제 내성 유전자는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 일 수 있다.
상기 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 융합단백질에 트롬빈을 처리한 후 상기 GST 친화크로마토그래피로 GST 태그를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 헬리코박터 파일로리로부터 상기 헬리코박터 파일로리 유전자에 의해 발현된 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, H. pylori 단백질의 발현 및 정제를 위한 발현벡터를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터의 백본 벡터의 구조(도 1a) 및 상기 발현벡터의 구조(도 1b)를 개략적으로 도시하는 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터의 작동원리 및 상기 벡터로부터 생산되는 산물의 분리 및 정제 방법을 개략적으로 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터를 구성하는 His tag 클로닝(도 3a), cat 유전자의 클로닝(도 3b), 및 발현벡터 내에 삽입된 His tag과 cat 유전자를 학인한 PCR 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터 내에 삽입되는 헬리코박터 파일로리 유전자 dnaK, clpB, groEL, flaA, porG, frdB을 PCR을 이용하여 증폭한 산물을 아가로즈 전기영동을 통하여 확인한 사진이다(M: 500bp DNA 마커; 1: dnaK; 2: clpB; 3: groEL; 4: flaA; 5: porG; 6: frdB).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터로 형질전환된 H. pylori 형질전환체의 형질전환 여부를 SDS-PAG를 이용하여 확인한 도이다(M: 단백질 마커; 1: H. pylori 1061 야생형: 2: pBKHGC_groEL 형질전환체; 3: pBKHGC_flaA 형질전환체; 4: pBKHGC_clpB 형질전환체).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터를 이용하여 제조한 pBKHGC_flaA, 및 pBKHGC_clpB 형질전환체로부터 재조합 단백질의 발현여부를 GSH 친화 크로마토그래피를 이용하여 확인한 도이다(M: 단백질 마커; 1: FlaA_gst 재조합 단백질; 2: FlaA_gst 재조합 단백질+트롬빈 처리; 3: 트롬빈 처리된 FlaA_gst 재조합 단백질을 GST 친화크로마토 그래프를 이용하여 정제한 단백질; 4: ClpB_gst 재조합 단백질; 5: ClpB_gst 재조합 단백질+트롬빈 처리; 6: 트롬빈 처리된 ClpB_gst 재조합 단백질을 GST 친화크로마토 그래프를 이용하여 정제한 단백질; 7: 정제된 GST)
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 헬리코박터 파일로리 발현벡터를 이용하여 제조한 pBKHGC_flaA 형질전환체로부터 수득한 FlaA_gst 재조합 단백질의 발현여부를 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 사진이다(M: 단백질 마커; 1,4: FlaA_gst 재조합 단백질; 2,4: FlaA_gst 재조합 단백질+트롬빈 처리; 3,6: 트롬빈 처리된 FlaA_gst 재조합 단백질을 GST 친화크로마토 그래프를 이용하여 정제한 단백질).
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 발현 벡터의 제작
발현벡터제작을 위한 벡터의 기본골격은 대장균에서 작동하는 복제원점과, 대장균과 H. pylori에서 항생제 마커로 작동하는 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자로 구성되어 있는 pBK 벡터(Amersham, pUC4K)를 사용하였다. 발현벡터의 구성은 E. coli와 H. pylori에 서 작동하는 항생제 마커인 카나마이신(kanamycin)유전자와 삽입된 헬리코박터 파일로리 유전자가 발현될 때 동시발현되어 발현을 확인시켜주는 항생제 리포터인 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT) 유전자, 및 발현된 단백질을 정제할 때 친화크로마토그래피를 사용할 수 있는 이중태그인 His-tag과 gst로 구성하였다. 상기 벡터의 작동원리는 과발현 시 불용성 단백으로 변하는 것을 방지하기 위해서 헬리코박터 파일로리 유전자를 프로모터 없이 벡터에 클로닝하여 H. pylori에 형질전환 시키면 H. pylori 유전자와 cross over되면서 H. pylori 자신의 프로모터로 헬리코박터 파일로리 유전자와 His-tag, gst, 클로람페니콜(chloramphenicol)이 연쇄적으로 발현되는 시스템으로 벡터가 작동하게 된다(도 2 참조).
간략히 설명하면, 우선 pBK 벡터를 EcoRI과 SmaI(Takara, Japan)으로 절단하고 1% 아가로스겔에서 전기영동을 하여 절단여부를 확인한 후 절단된 pBK를 ExpinTM PCR SV Kit(GeneAll, Korea)를 사용하여 정제하였다. 그 후, 상기 벡터에 포함되는 His-tag은 pET15b 벡터의 태그 부분을 변형한 염기서열의 올리고머 쌍(서열번호 1, 2)을 이용하였으며, gst는 H. pylori의 rare 코돈을 없애기 위해서 두 쌍의 프라이머(서열번호 3 내지 6)를 이용한 overlapping 중합효소연쇄반응법으로 증폭하였다. 또한, 상기 벡터에 도입되는 헬리코박터 파일로리 단백질은 제작된 발현벡터 내에 발현이 확인된 유전자이며, 멀티머(multimer)를 만들지 않아야 하고, C-말단에 특정기능이 없는 단백질을 선정하였으며, groEL, clpB, 또는 flaA의 유전자를 상기 벡터에 삽입하였다.
1-1: His-tag의 삽입
His-tag은 pET15b 벡터(Novagen, USA)의 His-tag 부분을 변형한 염기서열을 갖는 100 pmole/㎕ 중합체 쌍(서열번호 1, 서열번호 2)을 5 ㎕씩 혼합한 후 99℃에서 5분간 가열, 상온에서 5분 반응, 얼음에서 5분간 냉각시켜 제조하였다(표 1 참조).
pBK 벡터를 EcoRI과 SmaI(Takara, Japan)으로 절단하고 1% 아가로스겔에서 전기영동을 하여 절단여부를 확인한 후 절단된 pBK를 ExpinTM PCR SV Kit(GeneAll, Korea)를 사용하여 정제하였다.
그 후, 상기 정제된 pBK 플라스미드와 His-tag 유전자를 분자비가 1:3이 되도록 혼합하고, 여기에 10X 라이게이즈(ligase) 완충액[300 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP] 1 ㎕와 라이게이즈(ligase) 1 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 조정한 후 16℃에서 하룻밤동안 반응시켰다.
그 후, 상기 라이게이즈 된 반응액을 CaCl2 방법으로 준비한 E. coli DH10B/r competent cell에 혼합한 후 얼음위에 15분, 42℃에서 2분, 다시 얼음위에 10분 두었다가 LB배지 1 ㎖ 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 진탕 배양시켜 형질전환을 수행하였다. 그 후, 원심분리(centrifugation)하여 상청액을 버리고 남은 상청액 200 ㎕에 재부유시킨 후, 이를 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 형성된 집락을 동일한 항생제가 첨가된 LB 액체배지에 접종하고 이를 약 15시간 동안 진탕 배양하여 플라스미드를 분리하였다. 정제된 플라스미드를 PstI을 처리한 후 전기영동을 하여 pBK 벡터에 His-tag의 삽입을 확인하였다. His-tag이 삽입되지 않은 pBK 벡터는 절단되는 반면 His-tag이 삽입된 플라스미드는 PstI으로 절단되지 않음으로써 His-tag의 삽입을 확인하였다(도 3a).
1-2: gst의 삽입
gst는 H. pylori의 rare 코돈을 없애기 위해서 두 쌍의 프라이머(서열번호 3 내지 6)를 이용하여 overlapping 중합효소연쇄반응 방법으로 돌연변이 gst 유전자가 되도록 프라이머를 제작하였다. 상기 돌연변이된 gst 유전자는 217번부터 225번째 뉴클레오티드가 아미노산 서열의 변화 없이 CGTTATATA(서열번호 15)에서 AGATATATC(서열번호 16)로 변하였다.
pGEX4T-1 플라스미드(Amersham, USA)를 주형으로 사용하여 overlapping 중합효소연쇄반응 방법으로 gst 유전자를 증폭하였다. 증폭 횟수는 30회로 94℃에 서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초간 반응시키고, 72℃에서 5분간 추가 연장반응을 시켰다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물을 1% 아가로스겔에 전개하여 확인하고 키트를 이용하여 이를 정제한 뒤 EcoRI으로 절단하였다.
상기 실시예 1-2에서 제조한 pBK_His tag_gst 벡터 (이하 pBKH 벡터라 칭함)를 EcoRI으로 절단 후 정제하고, 10X CIP 탈인산화효소 완충액[10 mM ZnCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3] 1 ㎕, 및 탈인산화효소 1 unit를 첨가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 조정한 뒤 37℃에서 1시간동안 탈인산화 반응을 유도하였다. 반응 후 키트를 이용하여 DNA를 정제하였다.
그 후, 상기 정제된 pBKH 벡터와 gst를 분자비가 1:3이 되도록 혼합하고, 여기에 10X 라이게이즈(ligase) 완충액 1 ㎕와 라이게이즈(ligase) 1 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 조정한 후 16℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
그 후, 상기 라이게이즈 된 반응액을 CaCl2 방법으로 준비한 E. coli DH10B/r competent cell에 혼합한 후 얼음위에 15분, 42℃에서 2분, 다시 얼음위에 10분 두었다가 LB배지 1 ㎖ 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 진탕 배양시켜 형질전환을 수행하였다.
그 후, 상기 형질전환체에서 플라스미드를 정제하여 EcoRI으로 절단한 후 전기영동을 하여　pBKH 벡터에 gst의 삽입을 확인하였다(도 3b).
1-3: cat의 삽입
프로모터가 없는 cat 유전자는 H. pylori의 rare 코돈이 변형되도록 두 쌍의 프라이머를 제작하여 pBC SK(+) 플라스미드(Agilent Technologies, USA)를 주형으로 사용하여 overlapping 중합효소연쇄반응 방법으로 증폭하였다(표 1 참조). 증폭 횟수는 30회로 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응시켰고, 72℃ 2분간 추가 연장을 실시하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물을 1% 아가로스겔에서 확인하고 정제한 뒤, 이를 HindⅢ와 NheI으로 절단하였다. pBKHG도 동일한 효소로 절단하고 탈인산화 반응을 실시하였다. 상기 탈인산화 반응은 실시예 1-2에 기재된 바와 동일한 조건으로 수행하였다.
그 후, 상기 정제된 pBK-His-tag-gst 벡터(이하, pBKHGC 플라스미드라 칭함)와 cat 유전자를 분자비가 1:3이 되도록 혼합하고, 여기에 10X 라이게이즈(ligase) 완충액 1 ㎕와 라이게이즈(ligase) 1 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 조정한 후 16℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
그 후, 상기 라이게이즈 된 반응액을 CaCl2 방법으로 준비한 E. coli DH10B/r competent cell에 혼합한 후 얼음위에 15분, 42℃에서 2분, 다시 얼음위에 10분 두었다가 카나마이신(kanamycine)이 첨가된 LB배지 1 ㎖ 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 진탕 배양시켜 형질전환을 수행하였다. 상기 배양액으로부터 수득한 콜로니를 동일한 항생제가 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 약 15시간 동안 진탕 배양하였다.
상기 세균 배양액 10 ㎕를 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤, 상등액을 제거하고 침전된 세균체에 2 X 로딩버퍼(loading buffer)[10% glycerol, 0.1% bromophenol blue] 10 ㎕를 첨가시켜 부유시켰다. 동량의 2 X 크래킹 버퍼(Cracking buffer)[0.2 M NaOH, 0.5% SDS, 20% Sucrose]를 첨가한 후 조심히 혼합하고 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 전기 영동하여 cat 유전자가 삽입된 pBKHGC 플라스미드를 확인하였다. 또한, pBKHGC 플라스미드를 정제하고 이를 주형으로 하여 gst와 CAT의 프라이머(서열번호 3과 6, 서열번호 7과 10))를 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 gst와 cat 유전자의 삽입을 재확인하였다(도 3c).
표 1
name sequence 서열번호
Histag1 GGGATGCTTGTTCCGCGTGGATCTAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCG 1
Histag2 AATTCGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTAGATCCACGCGGAACAAGCATCCC 2
GST1 AAACAGAATTCATGTCCCCTATACTAG 3
GST2 AGCAATATATCTAATGATGGCCATAGACTG 4
GST3 CATCATTAGATATATTGCTGACAAGCACAAC 5
GST4 GCGACTGAATTCAAGCTTCAACGCGGAACCAAATCCGATTTTGG 6
CAT1 ATGCAAGCTTGATGCAATTCACAAAGATTG 7
CAT2 TTAAAGCCTTCAAAGCTGGTCCACGGTATCATAGA 8
CAT3 AAACTGCTAGCTTATTTATTCAGCAAGTCT 9
CAT4 TCTATGATACCGTGGACCAGCTTTGAAGGCTTTAA 10
clpB-F TCTAGACAACATCGCTGAGATCGTGAGC 11
clpB-R CCCGGGCTTAATCTTAGGCACAATCT 12
flaA-F TCTAGACCGCTTCTGGAGATATTAGCT 13
flaA-R CCCGGGAGTTAAAAGCCTTAAGATATTG 14
1-4: H. pylori 유전자의 클로닝
발현벡터의 성능을 확인하기 위하여 클로닝 할 유전자로 H. pylori의 clpB, flaA를 선정하였다.
발현벡터 내에 클로닝 할 H. pylori 유전자는 발현이 확인된 유전자이며, 멀티머(multimer)를 만들지 않아야 하고, C-말단에 특정 기능이 없는 단백질로 선택하였다. 각 유전자의 염기서열을 이용하여 각각의 해당 유전자가 프로모터 없이 제작되도록 상위부분에서 약 150~250 bp 떨어진 곳의 염기서열에서부터 마지막의 종결코돈을 제거하여 N 말단에 제한효소 SmaI, C말단에는 XbaI을 포함하도록 프라이머를 제작하였다(표 1 참조).
각 유전자는 헬리코박터 파이로리 26695의 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다. 증폭 횟수는 30회로 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분간 연장반응을 실시하였고, 72℃에서 5분간 추가 연장을 실시하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응 clpB(Genebank ID HP0264), dnaK(Genebank ID HP0109), flaA(Genebank ID HP0601), frdB(Genebank ID HP0191), groEL 유전자(Genebank ID HP0010)산물을 XbaI, SmaI으로 절단한 후 1% 아가로스겔에서 확인 후 정제하였다(도 4a 참조, 1번 레인: dnaK, 2번 레인: clpB, 3번 레인: groEL, 4번 레인: flaA, 5번 레인: porG, 6번 레인: frdB).
상기 실시예 1을 통하여 제조된 발현벡터는 상기 유전자와 동일한 XbaI, SmaI 제한효소를 이용하여 절단하고, 탈인산화 반응을 수행한 후, 정제하였다. 그 후, 상기 클로닝한 각각의 H. pylori 유전자와 분자비가 1:3이 되도록 혼합한 후 16℃에서 하룻밤동안 라이게이션(ligation) 하였다. 그 후, 상기 라이게이즈 된 반응액을 CaCl2 방법으로 준비한 E. coli DH10B R competent cell에 혼합한 후 얼음위에 15분, 42℃에서 2분, 다시 얼음위에 10분 두었다가 LB배지 1 ㎖ 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 진탕 배양시켜 형질전환을 수행하였다.
그 후, 상기 형질전환체에서 플라스미드를 정제하고 제한효소 XbaI, SmaI로 절단하여 전기영동을 통해　H. pylori 유전자의 삽입 유무를 확인하였다.
실험예 1: 발현벡터의 확인
상기 실시예 1-1 내지 1-3의 과정을 통하여 제조된 벡터에 사용된 gst와 cat 프라이머를 이용한 염기서열 결정으로 유전자의 결손이나, 돌연변이 등의 문제가 없는지를 확인하기 위해 gst, cat 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 하였다. 발현벡터의 염기서열(서열번호 18)과 gst1 프라이머(서열번호 3)로 발현벡터의 염기서열 2,805~3,799nt를 확인하였다. gst3 프라이머(서열번호 5)로 2,495~2,752nt, cat1 프라이머(서열번호 7)로 3,281~3,870nt, cat2 프라이머(서열번호 8)로 3,701~3,870nt, cat3 프라이머(서열번호 9)로 2,564~3,644nt, cat4 프라이머(서열번호 10)로 2,714~3,831nt를 확인한 결과, 유전적 변이 없이 벡터가 제작되었음을 확인하였고(Macrogen, Korea), 이를 pBKHGC로 명명하였다.
상기 실시예 1-1 내지 1-3을 통하여 제조된 발현벡터의 전체 서열은 서열번호 18과 같으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터의 구성 위치를 살펴보면 카나마이신(kanymycin)은 1419-2211번 핵산위치, XbaI은 2479~2484 핵산위치, SamI은 2497~2502 핵산위치, EcoRI은 2554~2559, 3240~3245 핵산위치, HindⅢ는 3234~3239 핵산위치, His-tag은 22-76 핵산위치, GST 유전자는 82-756 핵산위치, 및 CAT 유전자는 763-1386 핵산위치에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: H. pylori 유전자가 도입된 발현벡터의 단백질 발현 확인
2-1: H. pylori 유전자가 도입된 발현벡터의 형질전환
상기 실험예 2-1에서 제조한 형질전환체 가운데, flaA 또는 clpB 유전자가 도입된 발현벡터를 H. pylori 1061에 형질전환시켜 수득한 pBKHGC_flaA 및 pBKHGC_clpB 형질전환체를 이용하여, 형질전환 여부를 확인하였다. 상기 H. pylori 1061은 Helicobacter pylori Korean Type C㎕ture Collection (HpKTCC, 경상대학교)에서 분양받았다. 상기 분양받은 H. pylori 1061은 10% 우혈청, 10 ㎍/㎖ 반코마이신(vancomycin), 25 ㎍/㎖ 날리딕스산(nalidixic acid), 및 1 ㎍/㎖ 암포테리신(amphotericin)을 첨가한 브루셀라(brucella) 한천배지에 접종하여 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 37℃ 항온기에서 3일 간 배양하였다. 그 후, 우혈청 10%가 첨가된 브루셀라(brucella) 한천배지에 계대하여 동일한 조건으로 5시간 배양하였다. 그 후, 백금이로 균체를 배지의 가운데로 모은 후 10 ㎕의 재조합플라스미드(0.2 ug/㎕)를 첨가하였다. 이를 항온기에서 15~20분 간 둔 뒤 배지 전체로 균이 퍼지도록 도말하여 약 17시간 동안 배양하였다. 배양된 균체를 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 브루셀라(brucella) 한천배지에 계대하여 5~10일 동안 배양하면서 집락형성을 관찰하였으며, 상기 균체를 모아 SDS-PAGE로 발현된 단백질을 확인하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터가 도입되지 않은 H. pylori 1061을 사용하였다.
상기 형질전환체와 대조군 30 mg을 각각 1 ㎖의 PBS에 부유시키고 동량의 2X 시료완충액[10% glycerol, 0.1% bromophenol blue]과 혼합하여 99℃에서 5분 간 가열한 후 12% SDS-PAGE을 이용하여 25 mA에서 1시간 동안 전기영동하였다. 이 후 쿠마시 브릴리어트 블루(Coomassie brilliant blue) R-250 염색액으로 20분 간 염색한 후 탈색용액(물:에탄올:아세트산=6:3:1 부피비율로 하룻밤동안 탈색하여 발현된 단백질의 유무를 대조군과 비교분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 H. pyori 1061균주와 형질전환체의 전체 단백의 SDS-PAGE 전개양상에 있어서 pBKHGC_groEL에서 약 80 kDa, pBKHGC_flaA 약 68 kDa, 그리고 pBKHGC_clpB 120 kDa 위치에서 원 균주에서는 보이지 않았던 크기의 단백질이 발현되었다(도 5 참조).
2-2: GSH-친화 크로마토그래피를 이용한 재조합 단백질의 확인
상기 실험예 2-1에서 제조한 형질전환체 가운데, groEL, flaA 또는 clpB 유전자가 도입된 발현벡터를 H. pylori에 형질전환시켜 수득한 pBKHGC_flaA, 및 pBKHGC_clpB 형질전환체를 이용하여, 재조합 단백질의 발현여부를 확인하였다. 상기 2가지 종류의 형질전환체를 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 브루셀라(brucella) 한천배지에서 증균하여 백금이로 회수된 약 30 mg의 균체를 1 ㎖의 PBS에 부유시켰다. 세균 부유액을 초음파파쇄기(Sonic & Materials, Danbury, CN, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄는 38% amplitude, pulse on 2초, pulse off 4초 조건에서 15분 간 시행하였다. 파쇄된 시료를 13,000 rpm에서 15분 간 4℃에서 원침하여 상청액을 회수하였다. 회수된 상청액을 글루타티온-아가로즈(glutathione-agarose) 레진을 충진한 컬럼으로 GST 친화 크로마토그래피를 실시하였다(Invitrogen, USA, linked through s㎕fur).
우선, 컬럼에 레진을 500 ㎕ 충진한 후 1% Triton X100 이 첨가된 PBS 3 ㎖로 평형화시켰다. 상기 회수한 상청액을 컬럼에 적용한 후 세척액 20 ㎕를 1X Bradford 용액 60 ㎕에 반응시켜 단백질이 확인되지 않을 때까지 PBS 용액으로 세척하였다(Biorad, Herc㎕es, CA, USA). 이후 용출용액[50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM glutathione]으로 재조합 단백질을 용출하였다. 상기 회수된 재조합 단백질을 Sephadex-G50(Sigma Aldrich, St. Louis, MD, USA)을 컬럼에 충진한 후 재조합 단백질을 컬럼에 적용하여 3000 rpm에서 10초 간 원심분리(centrifugation)하여 재조합단백에 포함된 이미다졸(imidazole)을 제거하였다. 그 후, 트롬빈(Roche, Swiss) 1 unit을 첨가하고 18℃에서 17시간 처리한 뒤 상술한 조건으로 GST 친화크로마토그래피를 하여 H. pylori 단백질과 gst를 각각 분리하여 정제하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 트롬빈 처리에 의하여 gst 재조합 단백질이 58 kDa의 FlaA, 96 kDa의 ClpB와 29 kDa의 gst로 분리되었다(레인 2 및 레인 6). 도 6의 레인 3 및 레인 6은 트롬빈을 처리하여 분리된 상기 단백질을 GST 친화 크로마토그래피를 통하여 정제한 결과이다.
2-3: Western blot을 통한 확인
상기 실험예 2-1에서 제조한 형질전환체 가운데, H. pylori에 형질전환시켜 수득한 pBKHGC_flaA 형질전환체를 이용하여, 재조합 단백질의 발현여부를 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여 확인하였다. 상기 pBKHGC_flaA 형질전환체로부터 수득한 FlaA_gst 재조합 단백질, 이를 트롬빈으로 처리한 단백질 및 상기 트롬빈 처리한 단백질을 GSH 친화크로마토그래피를 이용하여 정제한 단백질을 FlaA 단클론 항체와 GST 항체를 이용하여 각각 웨스턴 블랏을 실시하였다.
전기영동한 겔과 나이트로셀룰로즈 여과지, 3M paper를 전달완충액[20 mM Tris-HCl, 144 mM glycine, 25% methanol, 0.01% SDS]에 충분히 적신 후 나이트로셀룰로즈 여과지 사이에 겔이 부착되도록 한 뒤 전기전달기(Semi-dry transfer cell, Bio-Rad, USA)에서 100 mA로 50분 간 단백을 여과지에 전달시켰다. 이후 나이트로셀룰로즈 여과지를 1% BSA가 첨가된 TBST 완충액[10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0]으로 37℃에서 30분 간 반응시키고 TBST 완충액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척 후 H. pylori의 FlaA 단클론항체(HpKTCC, 경상대학교)를 37℃에 서 30분 간 반응시킨 뒤 TBST 완충액을 5분간 3회 세척하고, 1% BSA-TBST에 1:1000 비율로 혼합한 Gst 마우스 단일항체 IgG1(mouse monoclonal IgG1)(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로 37℃에서 30분 간 반응시킨 뒤 TBST 완충액으로 5분간 3회 세척하였다. 이를 다시 TBST 완충액에 1:7,000 비율로 혼합한 염소-항 마우스 IgG-AP(goat anti-mouse IgG-AP)(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로 37℃에서 30분 간 반응시키고 TBST 완충액으로 5분 간 5회 세척한 후 기질용액에 넣어 발색반응을 유도하였다. NBT(Nitroblue tetrazolium)와 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate)로 이루어진 기질용액에 나이트로셀룰로즈 여과지를 담가 발색이 될 때까지 관찰한 후 증류수로 세척하여 발색반응을 중지시켰다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, FlaA_gst 재조합 단백질을 로딩한 1번과 4번 레인에서는 두 단백질이 결합된 크기인 86 kDa이 밴드가 관찰되었다. 또한, FlaA_gst 재조합 단백질을 트롬빈으로 처리한 경우에는, FlaA 단백질과 Gst 단백질이 FlaA 항체 및 Gst 항체와 각각 반응하여 57 kDa, 29 kDa의 밴드가 레인 2 및 레인 5에서 관찰되었다. 상기 FlaA_gst 재조합 단백질을 GSH 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였을 때에는 FlaA 단백질은 57 kDa에서 밴드가 관찰되었다(도 7 참조).
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터는 헬리코박터 파일로리 단백질의 발현 및 정제가 용이하여, 세균학적 성상 또는 헬리코박터 파일로리로 인하여 유발되는 질환의 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스티딘 태그(Histidine-tag) 암호화 뉴클레오티드, gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트 외부에 숙주세포가 가지고 있지 않은 제2항생제 내성유전자를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 헬리코박터 파일로리 유전자는 clpB, dnaK, groEL, flaA, frdB, 또는 porG인, 헬리코박터 파일로리 발현벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 gst 유전자는 서열번호 17로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인, 헬리코박터 파일로리 발현벡터.
  5. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스 태그(His-tag), gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 숙주세포는 헬리코박터 파일로리인, 형질전환 숙주세포.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트가 상기 헬리코박터 파일로리의 게놈 DNA에 삽입되는, 형질전환 숙주세포.
  8. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 히스 태그(His-tag), gst 유전자 및 숙주세포가 가지고 있지 않은 제1항생제 내성 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 상기 헬리코박터 파일로리 유전자를 포함하는 융합단백질의 발현용 발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비 단계;
    상기 발현벡터로 헬리코박터 파일로리를 형질전환시키는 형질전환 헬리코박터 파일로리 제조 단계;
    상기 형질전환 헬리코박터 파일로리 중 게놈 DNA 내부에 상기 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 헬리코박터 파일로리를 선별하는 단계를 포함하는 재조합 헬리코박터 파일로리 제조 단계; 및
    상기 재조합 헬리코박터 파일로리를 배양한 후 배양물을 파쇄하고 GST 친화크로마토그래피를 이용하여 상기 융합단백질을 정제하는 융합단백질 정제단계를 포함하는, 헬리코박터 파일로리로부터 상기 헬리코박터 파일로리 유전자에 의해 발현된 단백질을 생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 융합단백질에 트롬빈을 처리한 후 상기 GST 친화크로마토그래피로 GST 태그를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는, 헬리코박터 파일로리로부터 상기 헬리코박터 파일로리 유전자에 의해 발현된 단백질을 생산하는 방법.
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