CN115058442A - 一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法 - Google Patents

一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，1)将SEQ ID NO:1所示的CagA目的基因连接在表达载体pET28a(+)中，构成重组载体pET28a‑CagA；2)将重组载体pET28a‑CagA转化至外源蛋白表达的宿主细胞E.coli Top 10中进行诱导表达，得到表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10。本发明的重组载体，采用pET28a(+)质粒获得的重组载体表达效果最好，同时pET28a(+)载体序列中除了组氨酸标签序列没有其它的标签或融合蛋白基因序列，获得的CagA蛋白最接近原始蛋白氨基酸序列和蛋白结构，使得外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，获得了单独高效表达的可溶性重组蛋白CagA，实现目的蛋白的可溶性表达，工艺简单，重复性好，对CagA蛋白后续进行更有效深入的研究提供了基础。

Description

一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达 方法
技术领域
本发明涉及生物及生物制药技术领域，具体而言，涉及一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)，作为一种螺旋形、微嗜氧、革兰氏阴性感染性病原体，主要寄生在人体的胃黏膜上。Hp的感染会引起多种胃肠道疾病的发生，如胃炎、消化性溃疡、胃癌。据报道，世界上将近一半的人遭受Hp的感染，免疫接种可预防甚至治疗Hp的感染，Hp疫苗的研究迫在眉睫。
由于Hp抗原相关蛋白在不同地区的同一细菌分离物中的表达率不同，机体对不同抗原蛋白的免疫反应水平也不同，最终都会影响疫苗抗原的选择。因此抗原的编码基因应广泛定位于临床毒株的基因组中。基因序列要保守，自然表达率也要高，表达产物的免疫原性要强。细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)是Hp的最主要毒力因子之一，其主要功能是上调促炎细胞因子，激发炎症反应。研究显示，由于Hp的CagA蛋白具有和人类血小板抗原相类似的共同抗原或类似抗原，抗Hp抗体直接与血小板和巨核细胞表面的糖蛋白发生抗原抗体反应的交叉免疫，导致CagA蛋白与根除Hp感染后血小板数量变化的差异有关。CagA阳性Hp菌株感染比CagA阴性Hp菌株感染更能增加胃癌发生的几率，CagA可通过调控细胞生长和运动相关的信号通路，使胃上皮细胞发生转化而发生癌变，并在胃癌的发生中发挥着双重作用。在消化性溃疡的研究中，无论是胃溃疡或者十二指肠球部溃疡患者，其血清Hp CagA抗体的阳性率均明显高于正常人群。
CagA作为Hp疫苗中最有潜力的候选抗原，而不同的重组载体的选择以及诱导表达方法对其表达量都有着较大的影响。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，获得了单独高效表达的可溶性重组蛋白CagA，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，工艺简单，且重复性好，为后续对CagA蛋白进行更有效和深入的研究提供了基础。
本发明通过下述技术方案实现：
一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体，所述重组载体由CagA基因导入表达载体中构建而成，所述CagA基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，SEQ ID NO:1核苷酸序列如下所示：
CATACCATTCAGCCGCCGATTCCGGATGATAAAGAAAAAGCAGAATTTCTGAAGAGCGCAAAACAGAGCTTTGCCGGTATTATTATTGGCAATCAGATTCGCACCGATCAGAAATTTATGGGCGTGTTTGATGAAAGCCTGAAAGAACGTCAGGAAGCCGAAAAAAATGGTGGCAGCACCGGTGGTGATTGGCTGGATATTTTTCTGAGTTTTATTTTCGACAAGAAGCAGAGCAGCGATGTTAAAGAAGCCATTAATCAGGAACCGGTTCCGCATATTCAGCCGGATATTGCCACCAGCACCACCCATATTCAGGGTCTGCCGCCGGAAAGTCGCGATCTGCTGGATGAACGTGGCAATTTTAGTAAATTTACCCTGGGCGATATGGAAATGCTGGATGTGGAAGGTGTGGCCGATATGGATCCGAATTATAAATTTAATCAGCTGCTGATTCACAACAATACCCTGAGTAGTGTGCTGATTGGCAGCCATGATGGTATTGAACCGGAAAAAGTTAGTCTGCTGTATGCCGGTAATGGTGGCTTTGGTGATAAACATGATTGGAATGCAACCGTGGGCTATAAAGATCAGCAGGGTAATAATGTTGCCACCATTATTAATGTGCATATGAAAAATGGCAGCGGTCTGGTTATTGCCGGTGGTGAAAAAGGCATTAATAATCCGAGCTTTTATCTGTATAAGGAAGATCAGCTGACCGGTAGCCAGCGCGCCCTGAGCCAGGAAGAAATTCTGAATAAAATTGATTTCATGGAGTTCCTGGCACAGAATAATGCCAAACTGGATAATCTGAGCGAAAAAGAAAAAGAAAAGTTCCAGAATGAGATCAAAGATTTTCAGAAAGATAGCAAACCGTATCTGGATGCACTGGGTAATGATCGTATTGCCTTTGTGAGTAAAAAAGATCCGAAACATAGTGCCCTGATTACCGAATTTAATAAAGGTGATCTGAGTTATACCCTGAAAGATTATGGCAAAAAAGCCGATAAAGCACTGGATCGCGAAAAAAATGTGACCCTGCAGGGCAATCTGAAACATGATGGTGTGATGTTTGTTAATTACAGCAATTTTAAGTACACCAACGCCAGCAAAAGTCCGAATAAAGGCGTGGGCGTTACCAATGGCGTTAGTCATCTGGAAGCCGGTTTTAGTAAAGTTGCAGTGTTTAATCTGCCGAATCTGAATAATCTGGCCATTACCAGTGTTGTTCGTCGCGATCTGGAAGATAAACTGATTGCCAAAGGTCTGAGCCCGCAGGAAGCCAATAAACTGGTGAAAGATTTTCTGAGCAGTAATAAAGAACTGGTGGGTAAAGCACTGAATTTTAATAAAGCCGTTGCCGAAGCCAAAAATACCGGCAATTATGATGAAGTTAAGCGTGCCCAGAAAGATCTGGAAAAAAGCCTGAAAAAACGCGAACATCTGGAAAAAGATGTTGCAAAAAATCTGGAAAGCAAAAGTGATAATAAGAACAAAATGGAGGCCAAAAGCCAGGCAAATAGCCAGAAAGATGAAATTTTTGCCCTGATTAATAAAGAGGCCAATCGTGATGCCCGCGCAATTGCATATGCCCAGAATCTGAAAGGTATTAAACGTGAACTGAGTGATAAACTGGAAAATATTAACAAGGACCTGAAAGATTTCAACAAAAGTTTTGATGAGTTCAAGAACGGCAAAAATAAAGATTTTAGCAAGGCCGAAGAAACCCTGAAAGCCCTGAAAGGCAGTGTTAAAGATCTGGGTATTAATCCGGAATGGATTAGCAAATGAGAATTC
另一种具体实施方式，所述表达载体采用原核载体，优选的，所述表达载体采用pET28a(+)。
本发明的重组载体通过筛选得出，采用pET28a(+)质粒获得的重组载体表达效果最好，同时pET28a(+)载体序列中除了组氨酸标签序列没有其它的标签或融合蛋白基因序列，获得的CagA蛋白最接近原始蛋白氨基酸序列和蛋白结构，使得外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，获得了单独高效表达的可溶性重组蛋白CagA，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，工艺简单，且重复性好，为后续对CagA蛋白进行更有效和深入的研究提供了基础。
本发明还提供一种CagA的重组载体的宿主细胞，用于表达所述可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA。
另一种具体实施方式，所述宿主细胞为E.coli Top 10。
本发明还提供一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，包括如下步骤：
1)将SEQ ID NO:1所示的CagA目的基因连接在表达载体pET28a(+)中，构成重组载体pET28a-CagA，具体操作为：根据CagA的氨基酸序列，获得CagA目的基因片段，对CagA目的基因进行全基因合成，然后通过BamHI和XhoI的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，得到重组质粒；
2)将重组载体pET28a-CagA转化至外源蛋白表达的宿主细胞E.coli Top 10中进行诱导表达，得到表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10，具体操作为：取过夜培养的pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm、37℃下培养12-16h；取过夜培养的菌液加入卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm37℃下培养2～3h，二次活化至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5mM，在220rpm、16℃下诱导表达16h。
另一种具体实施方式，步骤1)中的重组载体带有His标签。
另一种具体实施方式，将诱导表达后的菌液离心，收集沉淀，用pH为7.0-7.5的10mM PBS缓冲液重悬混匀，冰水浴高压匀浆破菌，离心，收集上清，进行重组蛋白的可溶性分析。
本发明通过先获得CagA表达基因，再利用pET28a(+)质粒作为重组载体，于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，并进行重组蛋白的可溶性分析，然后对融合蛋白的最佳表达条件进行筛选，从而实现了目的蛋白的可溶性表达。
本发明的具体诱导表达方法如下所示：
1、CagA基因的克隆构建
(1)通过NCBI序列比对发现Hp不同菌株间CagA氨基酸序列高度保守，根据CagA的氨基酸序列，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:1；
(2)对目的基因进行全基因合成，然后通过BamHI和XhoI的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，对重组质粒进行测序，测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变；
(3)将重组质粒转化表达菌株E.coli Top 10，获得可以表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10。
2、CagA蛋白的诱导表达
(1)取平板划线、过夜培养的pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10单菌落于5mL卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm、37℃下培养12-16h。取过夜培养的菌液200μL加入20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2-3h，二次活化至OD600为0.6-0.8时，加入1MIPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm、16℃诱导表达16h；
(2)使用冷冻落地式离心机，将诱导表达后的菌液以6000rpm离心10min，弃去上清，沉淀菌体加入4mL破菌液(pH 9.0的50mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液，0.5M NaCl)混匀，冰浴超声裂解10min(超声3s,停止3s)，4℃、12000rpm离心30min，分离上清及沉淀；
(3)加入4mL破菌液重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(C508320-0010)，100℃金属浴10min，12000g快速离心3min；
(4)将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MPImagingSystem)扫描成像，如图2所示，通过灰度分析结果可以看出，CagA在pET28a(+)/E.coliTop10中为可溶性表达。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，从而实现了目的蛋白的可溶性表达；
2、本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，获得了单独高效表达的可溶性重组蛋白CagA，工艺简单，且重复性好，为后续对CagA蛋白进行更有效和深入的研究提供了基础；
3、本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，采用pET28a(+)质粒作为表达载体，表达效果好，同时pET28a(+)载体序列中除了组氨酸标签序列没有其它的标签或融合蛋白基因序列，获得的CagA蛋白最接近原始蛋白氨基酸序列和蛋白结构；
4、本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体及诱导表达方法，通过先获得CagA表达基因，再利用pET28a(+)质粒作为重组载体，于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，并进行重组蛋白的可溶性分析，然后对融合蛋白的最佳表达条件进行筛选，从而实现了目的蛋白的可溶性表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的pET28a(+)/CagA重组质粒双酶切鉴定结果；
图2为本发明实施例提供的CagA在pET28a(+)/E.coli Top 10中的表达。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体，所述重组载体由CagA基因导入表达载体pET28a(+)中构建而成，所述CagA基因核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
其中，SEQ ID NO:1核苷酸序列如下所示：
CATACCATTCAGCCGCCGATTCCGGATGATAAAGAAAAAGCAGAATTTCTGAAGAGCGCAAAACAGAGCTTTGCCGGTATTATTATTGGCAATCAGATTCGCACCGATCAGAAATTTATGGGCGTGTTTGATGAAAGCCTGAAAGAACGTCAGGAAGCCGAAAAAAATGGTGGCAGCACCGGTGGTGATTGGCTGGATATTTTTCTGAGTTTTATTTTCGACAAGAAGCAGAGCAGCGATGTTAAAGAAGCCATTAATCAGGAACCGGTTCCGCATATTCAGCCGGATATTGCCACCAGCACCACCCATATTCAGGGTCTGCCGCCGGAAAGTCGCGATCTGCTGGATGAACGTGGCAATTTTAGTAAATTTACCCTGGGCGATATGGAAATGCTGGATGTGGAAGGTGTGGCCGATATGGATCCGAATTATAAATTTAATCAGCTGCTGATTCACAACAATACCCTGAGTAGTGTGCTGATTGGCAGCCATGATGGTATTGAACCGGAAAAAGTTAGTCTGCTGTATGCCGGTAATGGTGGCTTTGGTGATAAACATGATTGGAATGCAACCGTGGGCTATAAAGATCAGCAGGGTAATAATGTTGCCACCATTATTAATGTGCATATGAAAAATGGCAGCGGTCTGGTTATTGCCGGTGGTGAAAAAGGCATTAATAATCCGAGCTTTTATCTGTATAAGGAAGATCAGCTGACCGGTAGCCAGCGCGCCCTGAGCCAGGAAGAAATTCTGAATAAAATTGATTTCATGGAGTTCCTGGCACAGAATAATGCCAAACTGGATAATCTGAGCGAAAAAGAAAAAGAAAAGTTCCAGAATGAGATCAAAGATTTTCAGAAAGATAGCAAACCGTATCTGGATGCACTGGGTAATGATCGTATTGCCTTTGTGAGTAAAAAAGATCCGAAACATAGTGCCCTGATTACCGAATTTAATAAAGGTGATCTGAGTTATACCCTGAAAGATTATGGCAAAAAAGCCGATAAAGCACTGGATCGCGAAAAAAATGTGACCCTGCAGGGCAATCTGAAACATGATGGTGTGATGTTTGTTAATTACAGCAATTTTAAGTACACCAACGCCAGCAAAAGTCCGAATAAAGGCGTGGGCGTTACCAATGGCGTTAGTCATCTGGAAGCCGGTTTTAGTAAAGTTGCAGTGTTTAATCTGCCGAATCTGAATAATCTGGCCATTACCAGTGTTGTTCGTCGCGATCTGGAAGATAAACTGATTGCCAAAGGTCTGAGCCCGCAGGAAGCCAATAAACTGGTGAAAGATTTTCTGAGCAGTAATAAAGAACTGGTGGGTAAAGCACTGAATTTTAATAAAGCCGTTGCCGAAGCCAAAAATACCGGCAATTATGATGAAGTTAAGCGTGCCCAGAAAGATCTGGAAAAAAGCCTGAAAAAACGCGAACATCTGGAAAAAGATGTTGCAAAAAATCTGGAAAGCAAAAGTGATAATAAGAACAAAATGGAGGCCAAAAGCCAGGCAAATAGCCAGAAAGATGAAATTTTTGCCCTGATTAATAAAGAGGCCAATCGTGATGCCCGCGCAATTGCATATGCCCAGAATCTGAAAGGTATTAAACGTGAACTGAGTGATAAACTGGAAAATATTAACAAGGACCTGAAAGATTTCAACAAAAGTTTTGATGAGTTCAAGAACGGCAAAAATAAAGATTTTAGCAAGGCCGAAGAAACCCTGAAAGCCCTGAAAGGCAGTGTTAAAGATCTGGGTATTAATCCGGAATGGATTAGCAAATGAGAATTC
本发明还提供一种CagA的重组载体的宿主细胞E.coli Top 10，用于表达所述可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA。
本发明的重组载体通过筛选得出，采用pET28a(+)质粒获得的重组载体表达效果最好，同时pET28a(+)载体序列中除了组氨酸标签序列没有其它的标签或融合蛋白基因序列，获得的CagA蛋白最接近原始蛋白氨基酸序列和蛋白结构，使得外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，获得了单独高效表达的可溶性重组蛋白CagA，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，工艺简单，且重复性好，为后续对CagA蛋白进行更有效和深入的研究提供了基础。
本发明通过先获得CagA表达基因，再利用pET28a(+)质粒作为重组载体，于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，并进行重组蛋白的可溶性分析，然后对融合蛋白的最佳表达条件进行筛选，从而实现了目的蛋白的可溶性表达。
实施例2
本发明实施例提供的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，包括如下步骤：1)将SEQ ID NO:1所示的CagA目的基因连接在表达载体pET28a(+)中，构成重组载体pET28a-CagA，具体操作为：根据CagA的氨基酸序列，获得CagA目的基因片段，对CagA目的基因进行全基因合成，然后通过BamHI和XhoI的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，得到重组质粒；
2)将重组载体pET28a-CagA转化至外源蛋白表达的宿主细胞E.coli Top 10中进行诱导表达，得到表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10，具体操作为：取过夜培养的pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm、37℃下培养12-16h；取过夜培养的菌液加入卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm37℃下培养2～3h，二次活化至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5mM，在220rpm、16℃下诱导表达16h。
本发明通过先获得CagA表达基因，再利用pET28a(+)质粒作为重组载体，于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，并进行重组蛋白的可溶性分析，然后对融合蛋白的最佳表达条件进行筛选，从而实现了目的蛋白的可溶性表达。
本发明的具体诱导表达方法如下所示：
1、CagA基因的克隆构建
(1)通过NCBI序列比对发现Hp不同菌株间CagA氨基酸序列高度保守，根据CagA的氨基酸序列，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:1；
(2)对目的基因进行全基因合成，然后通过BamHI和XhoI的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，对重组质粒进行测序，测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变；
(3)将重组质粒转化表达菌株E.coli Top 10，获得可以表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10；
(4)从重组pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，结果如图1所示，从图1中可以看出与测序结果一致。
2、CagA蛋白的诱导表达
(1)取平板划线、过夜培养的pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10单菌落于5mL卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm、37℃下培养12-16h。取过夜培养的菌液200μL加入20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2-3h，二次活化至OD600为0.6-0.8时，加入1MIPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm、16℃诱导表达16h。
(2)使用冷冻落地式离心机，将诱导表达后的菌液以6000rpm离心10min，弃去上清，沉淀菌体加入4mL破菌液(pH 9.0的50mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液，0.5M NaCl)混匀，冰浴超声裂解10min(超声3s,停止3s)，4℃、12000rpm离心30min，分离上清及沉淀；
(3)加入4mL破菌液重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(C508320-0010)，100℃金属浴10min，12000g快速离心3min；
(4)将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MPImagingSystem)扫描成像，如图2所示，通过灰度分析结果可以看出，CagA在pET28a(+)/E.coliTop10中为可溶性表达。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体，其特征在于，所述重组载体由CagA基因导入表达载体中构建而成，所述CagA基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体，其特征在于，所述表达载体采用原核载体。
3.根据权利要求1所述一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的重组载体，其特征在于，所述表达载体采用pET28a(+)。
4.一种CagA的重组载体的宿主细胞，其特征在于，用于表达权利要求1-3任一所述可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA。
5.根据权利要求4所述一种CagA的重组载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为E.coli Top 10。
6.一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将SEQ ID NO:1所示的CagA目的基因连接在表达载体pET28a(+)中，构成重组载体pET28a-CagA；
2)将重组载体pET28a-CagA转化至外源蛋白表达的宿主细胞E.coli Top 10中进行诱导表达，得到表达CagA的重组大肠杆菌pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10。
7.根据权利要求6所述一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，其特征在于，步骤1)的具体操作为：根据CagA的氨基酸序列，获得CagA目的基因片段，对CagA目的基因进行全基因合成，然后通过BamHI和XhoI的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，得到重组质粒。
8.根据权利要求6所述一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，其特征在于，步骤1)中的重组载体带有His标签。
9.根据权利要求6所述一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，其特征在于，步骤2)中诱导表达的具体操作为：取过夜培养的pET28a(+)/CagA/E.coli Top 10菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm、37℃下培养12-16h；取过夜培养的菌液加入卡那霉素抗性的LB培养基中，在220rpm 37℃下培养2～3h，二次活化至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5mM，在220rpm、16℃下诱导表达16h。
10.根据权利要求9所述的一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原CagA的诱导表达方法，其特征在于，将诱导表达后的菌液离心，收集沉淀，用pH为7.0-7.5的10mM PBS缓冲液重悬混匀，冰水浴高压匀浆破菌，离心，收集上清，进行重组蛋白的可溶性分析。
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