CN113528548A - 新型冠状病毒dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种新型冠状病毒DNA疫苗。本发明提供的DNA分子组合中SEQ ID NO.1‑4可以分别表达四种新冠突变株的S蛋白，优势在于在真核表达系统中可以高效转录和表达，同时具有良好的免疫原性。制备的疫苗可以有效预防和/或治疗新型冠状病毒感染和感染的相关疾病。

Description

新型冠状病毒DNA疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒DNA疫苗。

背景技术

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是具有包膜结构的单股正链RNA病毒，极易发生突变。目前根据GISAID数据库公布的新冠病毒谱系信息，突变株包括B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.617突变株。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病，新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡，具有高传染性和高隐蔽性。综上，急需开发出针对突变株有效的疫苗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种DNA分子组合。

本发明的第二目的在于提供一种重组载体组合。

本发明的第三目的在于提供一种重组细胞组合。

本发明的第四目的在于提供上述DNA分子组合、重组载体组合和重组细胞组合的应用。

本发明的第五目的在于提供一种DNA疫苗。

本发明的第六目的在于提供DNA疫苗的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种DNA分子组合，包括编码B.1.351突变株S蛋白的SEQ ID NO.1、编码P.1突变株S蛋白的SEQ ID NO.2、编码B.1.1.7突变株S蛋白的SEQ ID NO.3和编码B.1.617.1突变株S蛋白的SEQ ID NO.4。

需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的氨基酸序列或蛋白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的氨基酸序列或蛋白序列。例如，提及SEQ ID NO.1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本申请中的基因序列包括RNA形式或DNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

一种重组载体组合，所述重组载体组合为将上述的DNA分子组合中序列如SEQ IDNO.1-4所示的DNA分子分别与骨架载体重组得到。

进一步地，所述骨架载体为真核表达载体，所述骨架载体优选为pVAX1，进一步优选地，所述重组载体包括pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1。

一种重组细胞组合，所述重组细胞组合为将上述的重组载体组合分别导入宿主细胞得到。

本发明提供的重组载体组合以及重组细胞组合均是与本发明的DNA分子组合相关的生物材料，均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中，避免从头生产的繁琐。其中，重组细胞组合的宿主细胞可以为HEK293、CHO、COS-7、DH5a、Top10、BL21、DH10B等感受态细胞。

上述DNA分子组合、重组载体组合或重组细胞组合在（a）或（b）中的应用：

（a）制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗；

（b）制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物；

新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株中的至少一种。

一种DNA疫苗，含有本发明的DNA分子组合或重组载体组合。

进一步地，DNA疫苗含有重组载体pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1。

进一步地，DNA疫苗具有如下（1）-（3）至少一种功能：

（1）调整机体的免疫功能；

（2）抗新型冠状病毒感染；

（3）防止免疫病理损伤；

新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株中的至少一种。

进一步地，所述DNA疫苗还包括佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

在优选的实施方式中，所述佐剂包括铝佐剂和/或TLRs 配体和/或金属离子如Mn^{2 +}、Zn²⁺和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。

进一步地，所述DNA疫苗还包括至少一种对新型冠状病毒有治疗作用的药物。

上述DNA疫苗的制备方法简单，将分别含有SEQ ID NO.1-4所示的DNA分子的重组载体分别导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，即得到DNA疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的DNA分子组合中SEQ ID NO.1-4，是发明人分别针对B.1.351突变株S蛋白、P.1突变株S蛋白、B.1.1.7突变株S蛋白和B.1.617.1突变株S蛋白的编码进行优化，包括将野生型基因信号肽替换为高效表达信号肽，得到。该DNA分子组合可以分别表达四种新冠突变株的S蛋白，优势在于在真核表达系统中可以高效转录和表达，同时具有良好的免疫原性。

以此DNA分子组合作为活性功能成分制备的DNA疫苗有效激活机体免疫应答，对于体液免疫应答，在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生（SARS-CoV-2）、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.617.1突变株等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应、抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。

本发明提供的DNA分子组合、DNA疫苗等均可在机体内激活体液免疫应答产生的抗体可以预防新型冠状病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受新型冠状病毒感染的细胞，以及调节由于抗体依赖性增强的潜在副作用引发的不良反应。所以，本发明提供的DNA分子组合、重组载体组合、重组细胞组合等均可预防和/或治疗新型冠状病毒（野生型和突变型）感染，也可以预防和/或治疗新型冠状病毒感染的相关疾病，具有良好的广谱性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为实施例2中pWT和pB.1.351抗原蛋白表达检测结果；

图1B为实施例2中pWT和pP.1抗原蛋白表达检测结果；

图1C为实施例2中pWT和pB.1.1.7抗原蛋白表达检测结果；

图1D为实施例2中pWT和pB.1.617.1抗原蛋白表达检测结果；

图2为实施例3中pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）初次免疫后第14天抗原特异性抗体结果；

图3为实施例3中pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性抗体结果；

图4为实施例3中pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天中和抗体结果；

图5为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）初次免疫后第14天抗原特异性ELISOPT结果；

图6为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性ELISOPT结果；

图7为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性CD4TNFa T细胞亚群结果；

图8为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性CD8TFNa T细胞亚群结果；

图9为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性CD8IFNγT细胞亚群结果；

图10为实施例3 pWT和DNA疫苗（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7和pB.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性体内CTL结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1：DNA疫苗的构建过程

1.新冠病毒DNA疫苗的制备方法

1.1.质粒的构建

根据B.1.351突变株序列（EPI_ISL_860630，GISAID），结合经验优化获得SEQ IDNO.1所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.1 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pB.1.351）。

根据P.1突变株序列（EPI_ISL_811149，GISAID），结合经验优化获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.2 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pP.1）。

根据B.1.1.7突变株序列（EPI_ISL_683466，GISAID），结合经验优化获得SEQ IDNO.3所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.3 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pB.1.1.7）。

根据B.1.617.1突变株序列（EPI_ISL_1669767，GISAID），结合经验优化获得SEQID NO.4所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.4 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pB.1.617.1）。

根据新冠野生型SARS-CoV-2序列（MN908947.3，NCBI），优化获得SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I 位点间，得到新冠病毒野生株质粒（命名为pWT）。pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。

1.2.质粒的转化

从-80 ℃冰箱中取100 µl DH10B感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒DNA溶液（体积不超过10 µl）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5min。向管中加入0.9ml的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100µL涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。

1.3.质粒的提取

将上述菌液按照1：1000加入到200-400ml 含有卡那霉素（50mg/mL母液，1：1000使用）的LB选择培养基中，37℃ 200rpm培养12-16h。用EndoFreen Plasmid Maxi kit（QIAGEN，德国）进行质粒提取：将上述培养12-16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml Buffer P1重悬菌液后加入10ml Buffer P2轻轻颠倒4-6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml Buffer P3, 轻轻颠倒4-6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml Buffer ER，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10ml Buffer QBT平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml Buffer QC洗涤2次，再用15ml Buffer QN进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500µl无内毒素水进行重悬质粒，得到DNA质粒（pB.1.351、pP.1、pB.1.1.7、pB.1.617.1和pWT）。

实施例2：新冠病毒DNA疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定

为了验证实施例1构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，Western Blot方法进行鉴定。

1.蛋白提取

将新冠野生株质粒(pWT）、变异株质粒(pB.1.351)、变异株质粒（pP.1）、变异株质粒（pB.1.1.7）、变异株质粒（pB.1.617.1）分别转染到HEK293T细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入150µl裂解液（使用前按1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5 分钟。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出50µl上清液，加入12.5µl 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。

2.样品上样及SDS-PAGE电泳

将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5µl 于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压200V，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1x转膜平衡液中1min。

3.转膜

以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1× TBST+5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1X TBST中清洗3次，每次 10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液（S-ECD/RBD monoclonalantibody(1), 1:2000 稀释）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中（BDPharmingen HRP Anti hµman IgG，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3ml和B液3ml以1：1比例混合后加入到 PVDF膜孵育1-2min，拍照。

结论：如图1A-1D所示，新冠野生株、B.1.351变异株（图1A）、P.1变异株（图1B）、B.1.1.7变异株（图1C）、B.1.617.1变异株（图1D）DNA疫苗在体外转染48小时后与空载体（pVAX1）相比能够在细胞内高水平地表达抗原Spike蛋白。

实施例3：新冠候选DNA疫苗免疫原性验证

为了评估实施例1制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄C57BL/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣Advaccine 实验室（苏州）的动物设施中。对于DNA疫苗的接种：将实施例1所述DNA疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（EP）。电脉冲（EP）装置由两组具有0.2 Amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pVAX1-25µg；（2）实验组野生型毒株pWT-25 µg；（3）实验组变异株pB.1.351-2.5µg+变异株pP.1-2.5µg +变异株pB.1.1.7-2.5 µg +变异株pB.1.617.1-2.5 µg（Mix-2.5µg）；（4）实验组变异株pB.1.351-10 µg+变异株pP.1-10µg+变异株pB.1.1.7-10µg +变异株pB.1.617.1-10µg（Mix-10µg）；第14，21天采集小鼠血液样品，用ELISA法测定血清的特异性抗体滴度。在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞的免疫反应。

1.评估DNA疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答

1.1.ELISA检测抗体浓度

使用基于ELISA方法评估针对SARS-CoV-2 RBD蛋白结合抗体。将Nunc 96孔ELISA平板在4°C下用1 µg / mL SARS-Cov-2 RBD蛋白（Acro Biosystems，DE，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（含0.05％Tween 20，即PBST缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37°C下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37°C加入1：8000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP（GenScript，NJ，CN）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用TMB底物使板显影，并用50μl/孔2MH₂SO₄终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍。(判定标准：实验组：对照组（阴性）OD450-620值≧2.1，判定该OD值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。

结论：结果如图2和图3所示，新冠Mix变异株和野生株候选DNA疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述ELISA试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的新冠Mix变异株 DNA疫苗无论是2.5µg还是10µg的剂量均取得了明显更优的技术效果，如前所述，pWT是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

1.2．假病毒中和抗体检测

将 1x10⁴ /孔的 Huh-7 细胞接种在含有 10% FBS 的 DMEM 中的 96 孔板中。在感染前将接种的细胞培养八小时。为了检测中和抗体滴度，将小鼠血清（从 1:40 稀释开始）在 DMEM 培养基中按 1:2 连续稀释，总共稀释九个稀释度。随后，将稀释的血清样品与SARS-CoV-2 各变异假病毒在 37℃下孵育 30分钟后将混合物加入到Huh-7细胞中进行感染。进一步孵育12小时后，用新鲜的 DMEM 培养基（含2% FBS）替换上清液。再培养48小时后去除细胞上清液，使用萤火虫荧光素酶测定试剂盒（Promega）和酶标仪检测裂解后细胞内的绝对荧光素发光值，并通过将与同板中的病毒对照孔进行标准化来计算相对值。中和抗体滴度使用 GraphPad Prism 9计算，并定义为血清稀释度的倒数（减去细胞对照孔中的背景RLU后，RLU 与病毒对照孔中的RLU相比减少了50%）。

结论：结果如图4所示，新冠Mix变异株候选DNA疫苗加强免疫后第7天，对野生、B.1.351、P.1、B.1.617.1等病毒均能够有较好的中和活性，说明新冠Mix变异株候选DNA疫苗有广谱保护的潜力。

2.进一步评估DNA疫苗引发的抗原特异性细胞应答

预测并合成了S抗原特异性表位肽的多肽库（S peptide），并用该肽库刺激疫苗免疫后的小鼠脾细胞。

2.1.免疫细胞特异性刺激检测细胞免疫反应

我们通过ELISpot分析，研究DNA疫苗是否可以促进细胞免疫。分别在初次免疫后14天和加强免疫后7天分离脾细胞，进行IFN-γ 阳性细胞ELISpot实验。

2.2分离脾细胞

在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。

2.3 IFN-γ ELISpot实验

通过使用小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒（Dakewe，SZ，CN）进行IFN-γELISpot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO₂培养箱中用SARS-CoV-2 RBD肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/mL（终浓度）（溶于RPMI + 10％FBS）。根据产品说明书进行操作。培养基和PMA /Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader（AID，德国Straßberg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（SFU）。

结论：IFN-γELISPOT结果如图5-6所示，新冠Mix变异株和野生株候选DNA疫苗初次免疫后第14天、加强免疫后第7天均能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应。上述试验ELIspot试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的新冠Mix变异株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，在初次免疫后第14天无论是2.5µg还是10µg的剂量组，加强免疫后第7天10µg剂量组均较pWT野生型DNA疫苗取得了明显更优的技术效果，如前所述，pWT是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是CD4和CD8 T细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。

分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。

流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％CO₂下用SARS-CoV-2 RBD肽库或PMA /Iono刺激，同时利用1μg/ ml的Brefedlin A阻断（BD，CA，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用FVD-eFlµor780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠CD4，CD8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠IFN-γ和抗小鼠TNF-α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200µL PBS重悬，然后使用流式细胞仪（ThermoFisher，MA，美国）进行采集，然后用FlowJo软件（BD，CA, 美国）进行分析。

结论：结果如图7-9所示，新冠Mix变异株和野生株候选DNA疫苗加强免疫后第7天,能够显著诱导抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生。上述试验FACS试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的新冠Mix变异株DNA疫苗取得了相当的显著的技术效果，如前所述，pWT是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

4.免疫细胞特异性刺激检测体内CTL反应

由于CTL反应在抵抗病毒感染和消除病毒感染细胞方面起着关键作用，为了探索实施例1对细胞毒性T细胞功能的影响，在加强免疫后的第7天进行体内CTL检测。

取空白C57BL/6小鼠脾脏细胞（1.5x10⁸）与10µg S peptide pool共孵育，另取空白 C57BL/6小鼠脾脏细胞（1.5x10⁸）不孵育多肽。37℃ 5% CO₂培养4h。用eflour450标记细胞，多肽孵育组（1x10⁷细胞/ml+5µM，高染）,无多肽孵育对照组（1x10⁷细胞/ml+0.5µM，低染）。高染细胞与低染细胞按照1:1的比例混合，最终总细胞浓度为2x10⁷细胞 /ml。通过尾静脉注射，将4x10⁶混合细胞注射免疫组小鼠体内，4h后取脾脏细胞，流式上机，收集样本。体内杀伤率计算公式如下。

其中T代表Targets群，NT代表Non Targets群。

结论：结果如图10所示，新冠Mix变异株和野生株候选DNA疫苗加强免疫后第7天能够诱导了相当的高活性的抗原特异性CTL反应。

综上，由实施例1-4的结果可知，本发明的变异株DNA疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达；而且B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617.1变异株混合后的变异株具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，Mix变异株DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生、B.1.351、P.1、B.1.617.1等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，Mix变异株DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应、抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。

值得注意的是，pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如ELISA、ELIspot和FACS的检测中，试验均采用的是新冠野生型 SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原或者体外刺激肽，该条件均是对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的新冠Mix变异株DNA疫苗也取得了显著的，甚至明显更优的技术效果，尤其是抗体水平，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序 列 表

<110> 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司

<120> 新型冠状病毒DNA疫苗

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3840

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctcgcagt gcgtgaacct gaccacacgg acccagctgc ctccagctta cacaaatagc 120

ttcaccagag gcgtgtacta cccggacaag gtgttccggt cctctgtgct gcacagcacc 180

caggacctct tcctgccctt tttcagcaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 240

ggcacaaacg gaaccaaaag attcgctaac cccgtgctgc ctttcaatga tggagtctac 300

ttcgcctcta ccgaaaagag caacatcatc cgcggctgga tcttcggcac caccctggac 360

agtaagaccc agagcctgct catcgtgaac aacgccacga acgtggtgat caaggtgtgt 420

gaattccaat tttgcaacga cccctttctc ggcgtgtact accacaagaa caataaatct 480

tggatggaaa gcgagtttag agtgtacagc tctgctaaca actgcacttt cgagtacgtg 540

tcccagccat tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca atttcaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctacttc aaaatctatt ctaagcacac cccaatcaac 660

ctggtccggg gcctgccaca aggcttcagc gccctggaac ctctggtgga cctgcctatc 720

ggaatcaaca tcacccggtt ccagaccctg catatcagct acctgacacc tggcgacagc 780

agctctggct ggaccgccgg cgctgccgca tattacgtcg gctacttgca acctaggacc 840

ttcctgctga aatacaacga gaacggcacc atcacagatg ccgttgattg cgccctggac 900

cccctgagcg aaaccaagtg taccctgaaa tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag 960

accagcaact ttagagtaca gcctacagaa tctatcgttc ggtttccaaa cattaccaac 1020

ctgtgtcctt tcggcgaggt gtttaacgcc acacggttcg ccagcgtgta tgcctggaat 1080

agaaagcgga tcagcaactg tgtggccgac tactccgtgc tgtacaatag cgccagcttc 1140

tctacattta agtgctacgg cgtgtcccct acaaagctga acgacctgtg cttcacaaac 1200

gtgtatgccg atagcttcgt gatccggggc gatgaggtcc ggcagatcgc tcctggccag 1260

acaggcaaca ttgccgacta caactacaag ctgcccgatg acttcaccgg atgtgtgata 1320

gcctggaaca gcaacaacct ggatagcaag gtgggcggca actacaacta cctgtaccga 1380

ctgtttagaa agagcaacct gaaacctttt gagcgggaca tcagcacaga gatctaccaa 1440

gccggctcta ccccttgtaa cggcgtgaag ggcttcaact gttacttccc tctgcagtct 1500

tacggattcc agcctacata cggcgtggga taccagccct atagagtggt ggtgctgtca 1560

ttcgagctgc tacatgcccc tgccaccgtg tgcggcccta agaagtctac caacctcgtg 1620

aagaacaagt gcgtgaattt taacttcaat ggactgacag gcacaggcgt gctgacagag 1680

agcaacaaaa agttcctgcc cttccagcag tttggcagag atatcgctga caccacagac 1740

gccgtgcgcg atcctcagac cctggagatc ctggacatca ccccttgctc ctttggagga 1800

gtgtccgtga tcacacctgg aacgaacacc agcaaccagg ttgccgtgct gtaccagggc 1860

gtgaactgca cagaagttcc tgtggccatc catgccgatc agctgacgcc cacgtggcgg 1920

gtgtactcta ccggcagcaa tgtgttccag accagagccg gctgccttat tggcgctgag 1980

cacgtgaata atagctatga atgcgatatc ccaatcggag ccggcatttg cgccagctac 2040

cagacccaga caaatagtcc tagaagagcc agatctgtgg cctcccagag catcatcgca 2100

tataccatga gcctaggagt ggaaaacagc gtcgcctatt ccaacaatag catcgccatc 2160

ccgacaaact tcaccatcag cgtgaccacc gaaatcctgc ccgtgagcat gaccaagaca 2220

agcgtggact gtacaatgta catctgtgga gactccaccg agtgcagcaa cctgctgctg 2280

cagtacggca gcttctgcac ccagctgaac agagccctga cagggatcgc cgtggaacag 2340

gataagaaca cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaga tctataagac tccacctatt 2400

aaggactttg gcggcttcaa cttcagccaa atcctgcccg atcctagcaa gccaagcaag 2460

cggtccttca tcgaggacct gctgttcaac aaggtgaccc tggccgacgc cggcttcatc 2520

aagcagtatg gcgactgtct gggcgatatc gccgctagag acctgatctg cgcccagaag 2580

ttcaatggcc tgaccgtgct cccacctctg ctcaccgacg agatgatcgc ccagtacacc 2640

tctgccctgc tggccggcac catcaccagc gggtggacat tcggggctgg agctgctctg 2700

caaatcccct tcgccatgca gatggcctac agattcaacg gcatcggcgt tacccagaat 2760

gtgctgtatg aaaaccagaa actgatagct aaccagttca acagcgccat aggcaaaatc 2820

caggatagtc tgagctctac agccagcgcc ctgggaaaac tgcaggatgt ggtgaatcag 2880

aacgcccagg ccctgaatac actggtgaaa caactgagca gcaatttcgg cgccatcagc 2940

agcgtgctga atgatatcct gtctagactg gacccccccg aggccgaggt gcagatcgat 3000

agactgatca ccggcagact gcagtccctg cagacatacg tgactcaaca gctgatcaga 3060

gccgctgaga tcagagcttc tgctaatttg gctgccacaa agatgagcga gtgcgtgctg 3120

ggccagagca aaagagtgga cttctgcggc aagggctacc acctgatgag cttcccccag 3180

agcgcccctc acggcgtcgt gttcctgcac gtgacttacg tgcctgccca agagaagaac 3240

ttcaccaccg cccctgccat ctgccacgac ggcaaggccc acttcccccg ggagggcgtg 3300

ttcgtgagca atggcaccca ctggttcgtg acccaaagaa acttttacga gccccagatt 3360

atcaccaccg acaacacctt cgtgtcaggc aactgcgacg tggtgatcgg catcgtgaac 3420

aacactgtgt acgaccctct gcagcctgag ctggacagct tcaaggagga actggacaag 3480

tacttcaaaa accacacatc tcctgacgtg gacctgggcg atatcagcgg cattaacgcc 3540

tctgtggtga acatccagaa ggaaatcgac agactgaacg aggtggccaa gaacctgaat 3600

gagagcctga tcgacctgca ggagctgggc aagtacgagc agtacatcaa gtggccttgg 3660

tacatctggc tgggctttat cgccggcctg atcgccatcg tgatggtcac catcatgctg 3720

tgctgcatga ccagctgttg cagctgcctg aaaggctgtt gcagctgcgg aagttgctgc 3780

aagtttgacg aggacgactc tgagcctgtg ctgaagggcg tcaagctgca ctacacatga 3840

<210> 2

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtggtgga gactgtggtg gctgttgttg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtctgg 60

gcctctcagt gtgtgaactt taccaacaga acccaactgc ctagcgctta taccaactca 120

tttacacggg gcgtttacta ccccgataag gtgtttcgga gcagcgtgct gcacagcaca 180

caggacctgt tcctgccctt cttcagcaac gtgacatggt tccatgctat ccacgtgagc 240

ggcaccaacg ggaccaaacg gttcgacaat cctgtgctgc ccttcaacga cggcgtgtac 300

tttgcctcta ccgaaaagag caacatcatt agaggctgga tcttcggcac caccctggat 360

tctaagacgc agagcctgct gatcgtgaac aatgccacga acgtggtgat caaggtctgc 420

gagttccagt tctgcaacta cccctttcta ggagtgtact accacaaaaa caacaagagc 480

tggatggaaa gcgagttcag agtgtacagc agcgctaata actgtacctt tgagtacgtg 540

agccagcctt ttctgatgga cctggaaggc aaacagggca atttcaagaa cctgagcgag 600

ttcgtgttca agaacatcga tggctatttc aaaatctaca gcaagcacac ccctatcaac 660

ctggtcagag atctgcctca aggcttcagc gctctggaac ctctggtgga cctcccaatc 720

ggaattaaca tcaccagatt ccagaccctg cttgcccttc atagatccta cctgacacct 780

ggcgacagca gctctggctg gacagccggc gccgctgcct actacgtggg atatctgcag 840

cctagaacat tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacaa tcacggatgc ggtggactgc 900

gccctggacc ctctttctga gacaaaatgc acactgaagt ccttcaccgt cgaaaaaggc 960

atatatcaga catcgaactt ccgggtgcag cctacagaat ctatcgtgcg gttccccaac 1020

atcaccaacc tctgtccttt cggagaagtt tttaacgcca caagattcgc ctctgtttac 1080

gcttggaaca gaaagcggat cagcaattgc gtggccgatt actccgtgct gtacaacagc 1140

gcctctttca gcaccttcaa gtgctacggc gtaagcccaa caaagctgaa cgacctgtgc 1200

ttcaccaacg tgtacgccga tagcttcgtt atccgaggcg acgaagttag acagatcgcc 1260

cccggccaga caggcacaat cgccgactac aattacaagc tgcctgacga cttcaccggc 1320

tgtgtgatcg cctggaacag caacaacctg gacagcaagg tgggaggcaa ctataactac 1380

ctgtatcggc tgttccgcaa atctaacttg aagcctttcg aacgggatat cagcaccgag 1440

atctaccagg ccgggagcac cccttgtaat ggcgtgaagg gctttaactg ttactttcca 1500

ctgcagagct atggcttcca acctacctac ggcgttggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgagct tcgagctgct gcacgcccct gcaaccgtgt gcggacctaa gaagagcacc 1620

aacttagtga agaacaagtg tgtgaacttc aatttcaacg gcctgaccgg aaccggcgtg 1680

ctgacagaga gcaacaagaa gtttctgcct ttccagcagt ttggcagaga catcgccgac 1740

accaccgatg ccgtgcgcga cccacaaacc ctggaaatcc tggacatcac accatgctca 1800

ttcggcggcg tgtcagtgat caccccagga acgaacacat ctaaccaggt cgccgtgctg 1860

taccagggcg tgaactgcac cgaagtgcca gtggccatcc acgccgatca gctgacccct 1920

acatggcggg tgtacagcac cggctccaac gtgttccaga ccagagccgg ctgcctgatc 1980

ggcgccgagt acgtgaacaa cagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc cggcatctgt 2040

gcctcctacc aaacccagac caacagtcct cggagggcca gaagcgtggc tagccagtcc 2100

atcatcgcct acacaatgtc cctgggagct gagaatagcg tggcctacag caataacagc 2160

atcgccatcc ctaccaactt cacgatcagc gtgaccacag agatcctgcc agtgagcatg 2220

accaagacca gcgtagactg caccatgtac atctgcggcg acagcacaga gtgcagcaac 2280

ctactgctgc aatacggcag cttctgcacc caactgaaca gagccctgac aggaatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac tcaggaggtc ttcgcccagg tcaagcagat ctacaaaacc 2400

ccacctatca aggatttcgg cggcttcaac ttctcccaaa tactgcctga cccctctaag 2460

cccagcaagc gaagcttcat cgaggatctg ctgttcaaca aggtgaccct ggctgacgcc 2520

ggatttatca agcagtacgg cgattgcctg ggcgatatcg ctgctagaga cttgatttgt 2580

gcccaaaaat tcaatggact gacagtgctg ccgcctctgc tgaccgacga aatgatcgct 2640

cagtacacca gcgccttact ggcgggcaca atcaccagcg gatggacctt tggcgctggc 2700

gccgcactgc agatcccctt tgccatgcag atggcctacc ggtttaatgg cattggggtg 2760

acacagaatg tgctgtacga aaatcagaag ctgattgcta accagttcaa ctcggccatc 2820

ggcaagatcc aggacagcct gagcagcacc gccagcgccc tgggcaagct gcaggacgtg 2880

gtgaatcaaa acgcccaggc cctgaacacc ctggtgaagc agctatcgag caacttcggc 2940

gctatcagct ctgtgctgaa tgacatcctg tctagactgg accctcctga ggccgaagtg 3000

cagatcgata gactgatcac cggaagactc caatctctgc agacatatgt gacccagcag 3060

ctgatccggg ccgccgagat ccgtgctagc gcaaacctgg ccgccatcaa gatgagcgaa 3120

tgcgtgctcg gccagagcaa aagagttgat ttttgtggca aaggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaga gcgcccccca cggcgtggtg tttctgcacg tgacctacgt gcccgcccag 3240

gagaagaact ttaccaccgc ccctgctatc tgccacgacg gcaaggccca cttcccccgg 3300

gaaggcgtgt tcgtgtccaa cggcacccac tggttcgtga cgcagcggaa cttctacgag 3360

ccccagatca tcacaaccga caacaccttc gtgagtggga actgcgatgt ggtgatcggt 3420

attgtgaaca acaccgtgta tgaccctctg cagcccgagc tggacagttt caaggaggaa 3480

ctcgataagt acttcaaaaa ccacacatct cctgacgtgg acctgggcga catcagcgga 3540

atcaacgcct ctttcgttaa tatccagaag gaaatcgaca gacttaatga ggtggccaag 3600

aacctgaacg agtccctgat cgacctgcag gagctgggca aatacgagca gtacattaaa 3660

tggccttggt acatctggct ggggttcatc gccggcctga tcgccatcgt gatggtgaca 3720

atcatgctgt gctgtatgac ctcctgctgt agctgtctga agggatgctg cagctgcggc 3780

tcttgctgca agttcgatga ggacgattct gagcctgtgc tgaaaggcgt gaagctgcac 3840

tacacctga 3849

<210> 3

<211> 3840

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctcgcagt gcgtgaacct gaccacacgg acccagctgc ctccagctta cacaaatagc 120

ttcaccagag gcgtgtacta cccggacaag gtgttccggt cctctgtgct gcacagcacc 180

caggacctct tcctgccctt tttcagcaac gtgacctggt tccacgctat ctctggcaca 240

aacggaacca aaagattcga taaccccgtg ctgcctttca atgatggagt ctacttcgcc 300

tctaccgaaa agagcaacat catccgcggc tggatcttcg gcaccaccct ggacagtaag 360

acccagagcc tgctcatcgt gaacaacgcc acgaacgtgg tgatcaaggt gtgtgaattc 420

caattttgca acgacccctt tctcggcgtg taccacaaga acaataaatc ttggatggaa 480

agcgagttta gagtgtacag ctctgctaac aactgcactt tcgagtacgt gtcccagcca 540

ttcctgatgg acctggaagg caagcagggc aatttcaaga acctgagaga attcgtgttt 600

aagaacatcg acggctactt caaaatctat tctaagcaca ccccaatcaa cctggtccgg 660

gacctgccac aaggcttcag cgccctggaa cctctggtgg acctgcctat cggaatcaac 720

atcacccggt tccagaccct gctggccctg catagaagct acctgacacc tggcgacagc 780

agctctggct ggaccgccgg cgctgccgca tattacgtcg gctacttgca acctaggacc 840

ttcctgctga aatacaacga gaacggcacc atcacagatg ccgttgattg cgccctggac 900

cccctgagcg aaaccaagtg taccctgaaa tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag 960

accagcaact ttagagtaca gcctacagaa tctatcgttc ggtttccaaa cattaccaac 1020

ctgtgtcctt tcggcgaggt gtttaacgcc acacggttcg ccagcgtgta tgcctggaat 1080

agaaagcgga tcagcaactg tgtggccgac tactccgtgc tgtacaatag cgccagcttc 1140

tctacattta agtgctacgg cgtgtcccct acaaagctga acgacctgtg cttcacaaac 1200

gtgtatgccg atagcttcgt gatccggggc gatgaggtcc ggcagatcgc tcctggccag 1260

acaggcaaga ttgccgacta caactacaag ctgcccgatg acttcaccgg atgtgtgata 1320

gcctggaaca gcaacaacct ggatagcaag gtgggcggca actacaacta cctgtaccga 1380

ctgtttagaa agagcaacct gaaacctttt gagcgggaca tcagcacaga gatctaccaa 1440

gccggctcta ccccttgtaa cggcgtggaa ggcttcaact gttacttccc tctgcagtct 1500

tacggattcc agcctacata cggcgtggga taccagccct atagagtggt ggtgctgtca 1560

ttcgagctgc tacatgcccc tgccaccgtg tgcggcccta agaagtctac caacctcgtg 1620

aagaacaagt gcgtgaattt taacttcaat ggactgacag gcacaggcgt gctgacagag 1680

agcaacaaaa agttcctgcc cttccagcag tttggcagag atatcgacga caccacagac 1740

gccgtgcgcg atcctcagac cctggagatc ctggacatca ccccttgctc ctttggagga 1800

gtgtccgtga tcacacctgg aacgaacacc agcaaccagg ttgccgtgct gtaccagggc 1860

gtgaactgca cagaagttcc tgtggccatc catgccgatc agctgacgcc cacgtggcgg 1920

gtgtactcta ccggcagcaa tgtgttccag accagagccg gctgccttat tggcgctgag 1980

cacgtgaata atagctatga atgcgatatc ccaatcggag ccggcatttg cgccagctac 2040

cagacccaga caaatagtca cagaagagcc agatctgtgg cctcccagag catcatcgca 2100

tataccatga gcctaggagc tgaaaacagc gtcgcctatt ccaacaatag catcgccatc 2160

ccgatcaact tcaccatcag cgtgaccacc gaaatcctgc ccgtgagcat gaccaagaca 2220

agcgtggact gtacaatgta catctgtgga gactccaccg agtgcagcaa cctgctgctg 2280

cagtacggca gcttctgcac ccagctgaac agagccctga cagggatcgc cgtggaacag 2340

gataagaaca cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaga tctataagac tccacctatt 2400

aaggactttg gcggcttcaa cttcagccaa atcctgcccg atcctagcaa gccaagcaag 2460

cggtccttca tcgaggacct gctgttcaac aaggtgaccc tggccgacgc cggcttcatc 2520

aagcagtatg gcgactgtct gggcgatatc gccgctagag acctgatctg cgcccagaag 2580

ttcaatggcc tgaccgtgct cccacctctg ctcaccgacg agatgatcgc ccagtacacc 2640

tctgccctgc tggccggcac catcaccagc gggtggacat tcggggctgg agctgctctg 2700

caaatcccct tcgccatgca gatggcctac agattcaacg gcatcggcgt tacccagaat 2760

gtgctgtatg aaaaccagaa actgatagct aaccagttca acagcgccat aggcaaaatc 2820

caggatagtc tgagctctac agccagcgcc ctgggaaaac tgcaggatgt ggtgaatcag 2880

aacgcccagg ccctgaatac actggtgaaa caactgagca gcaatttcgg cgccatcagc 2940

agcgtgctga atgatatcct ggccagactg gacccccccg aggccgaggt gcagatcgat 3000

agactgatca ccggcagact gcagtccctg cagacatacg tgactcaaca gctgatcaga 3060

gccgctgaga tcagagcttc tgctaatttg gctgccacaa agatgagcga gtgcgtgctg 3120

ggccagagca aaagagtgga cttctgcggc aagggctacc acctgatgag cttcccccag 3180

agcgcccctc acggcgtcgt gttcctgcac gtgacttacg tgcctgccca agagaagaac 3240

ttcaccaccg cccctgccat ctgccacgac ggcaaggccc acttcccccg ggagggcgtg 3300

ttcgtgagca atggcaccca ctggttcgtg acccaaagaa acttttacga gccccagatt 3360

atcaccaccc acaacacctt cgtgtcaggc aactgcgacg tggtgatcgg catcgtgaac 3420

aacactgtgt acgaccctct gcagcctgag ctggacagct tcaaggagga actggacaag 3480

tacttcaaaa accacacatc tcctgacgtg gacctgggcg atatcagcgg cattaacgcc 3540

tctgtggtga acatccagaa ggaaatcgac agactgaacg aggtggccaa gaacctgaat 3600

gagagcctga tcgacctgca ggagctgggc aagtacgagc agtacatcaa gtggccttgg 3660

tacatctggc tgggctttat cgccggcctg atcgccatcg tgatggtcac catcatgctg 3720

tgctgcatga ccagctgttg cagctgcctg aaaggctgtt gcagctgcgg aagttgctgc 3780

aagtttgacg aggacgactc tgagcctgtg ctgaagggcg tcaagctgca ctacacatga 3840

<210> 4

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctcgcagt gcgtgaacct gaccacacgg acccagctgc ctccagctta cacaaatagc 120

ttcaccagag gcgtgtacta cccggacaag gtgttccggt cctctgtgct gcacagcacc 180

caggacctct tcctgccctt tttcagcaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 240

ggcacaaacg gaaccaaaag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaatga tggagtctac 300

ttcgcctcta tcgaaaagag caacatcatc cgcggctgga tcttcggcac caccctggac 360

agtaagaccc agagcctgct catcgtgaac aacgccacga acgtggtgat caaggtgtgt 420

gaattccaat tttgcaacga cccctttctc gacgtgtact accacaagaa caataaatct 480

tggatgaaga gcgagtttag agtgtacagc tctgctaaca actgcacttt cgagtacgtg 540

tcccagccat tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca atttcaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctacttc aaaatctatt ctaagcacac cccaatcaac 660

ctggtccggg acctgccaca aggcttcagc gccctggaac ctctggtgga cctgcctatc 720

ggaatcaaca tcacccggtt ccagaccctg ctggccctgc atcggagcta cctgacacct 780

ggcgacagca gctctggctg gaccgccggc gctgccgcat attacgtcgg ctacttgcaa 840

cctaggacct tcctgctgaa atacaacgag aacggcacca tcacagatgc cgttgattgc 900

gccctggacc ccctgagcga aaccaagtgt accctgaaat ccttcaccgt ggaaaagggc 960

atctaccaga ccagcaactt tagagtacag cctacagaat ctatcgttcg gtttccaaac 1020

attaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg tttaacgcca cacggttcgc cagcgtgtat 1080

gcctggaata gaaagcggat cagcaactgt gtggccgact actccgtgct gtacaatagc 1140

gccagcttct ctacatttaa gtgctacggc gtgtccccta caaagctgaa cgacctgtgc 1200

ttcacaaacg tgtatgccga tagcttcgtg atccggggcg atgaggtccg gcagatcgct 1260

cctggccaga caggcaagat tgccgactac aactacaagc tgcccgatga cttcaccgga 1320

tgtgtgatag cctggaacag caacaacctg gatagcaagg tgggcggcaa ctacaactac 1380

cggtaccgac tgtttagaaa gagcaacctg aaaccttttg agcgggacat cagcacagag 1440

atctaccaag ccggctctac cccttgtaac ggcgtgcagg gcttcaactg ttacttccct 1500

ctgcagtctt acggattcca gcctacaaac ggcgtgggat accagcccta tagagtggtg 1560

gtgctgtcat tcgagctgct acatgcccct gccaccgtgt gcggccctaa gaagtctacc 1620

aacctcgtga agaacaagtg cgtgaatttt aacttcaatg gactgacagg cacaggcgtg 1680

ctgacagaga gcaacaaaaa gttcctgccc ttccagcagt ttggcagaga tatcgctgac 1740

accacagacg ccgtgcgcga tcctcagacc ctggagatcc tggacatcac cccttgctcc 1800

tttggaggag tgtccgtgat cacacctgga acgaacacca gcaaccaggt tgccgtgctg 1860

taccagggcg tgaactgcac agaagttcct gtggccatcc atgccgatca gctgacgccc 1920

acgtggcggg tgtactctac cggcagcaat gtgttccaga ccagagccgg ctgccttatt 1980

ggcgctgagc acgtgaataa tagctatgaa tgcgatatcc caatcggagc cggcatttgc 2040

gccagctacc agacccagac aaatagtcgg agaagagcca gatctgtggc ctcccagagc 2100

atcatcgcat ataccatgag cctaggagcc gaaaacagcg tcgcctattc caacaatagc 2160

atcgccatcc cgacaaactt caccatcagc gtgaccaccg aaatcctgcc cgtgagcatg 2220

accaagacaa gcgtggactg tacaatgtac atctgtggag actccaccga gtgcagcaac 2280

ctgctgctgc agtacggcag cttctgcacc cagctgaaca gagccctgac agggatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat ctataagact 2400

ccacctatta aggactttgg cggcttcaac ttcagccaaa tcctgcccga tcctagcaag 2460

ccaagcaagc ggtccttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtgaccct ggccgacgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgactgtctg ggcgatatcg ccgctagaga cctgatctgc 2580

gcccagaagt tcaatggcct gaccgtgctc ccacctctgc tcaccgacga gatgatcgcc 2640

cagtacacct ctgccctgct ggccggcacc atcaccagcg ggtggacatt cggggctgga 2700

gctgctctgc aaatcccctt cgccatgcag atggcctaca gattcaacgg catcggcgtt 2760

acccagaatg tgctgtatga aaaccagaaa ctgatagcta accagttcaa cagcgccata 2820

ggcaaaatcc aggatagtct gagctctaca gccagcgccc tgggaaaact gcaggatgtg 2880

gtgaatcaga acgcccaggc cctgaataca ctggtgaaac aactgagcag caatttcggc 2940

gccatcagca gcgtgctgaa tgatatcctg tctagactgg acccccccga ggccgaggtg 3000

cagatcgata gactgatcac cggcagactg cagtccctgc agacatacgt gactcaacag 3060

ctgatcagag ccgctgagat cagagcttct gctaatttgg ctgccacaaa gatgagcgag 3120

tgcgtgctgg gccagagcaa aagagtggac ttctgcggca agggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaga gcgcccctca cggcgtcgtg ttcctgcacg tgacttacgt gcctgcccac 3240

gagaagaact tcaccaccgc ccctgccatc tgccacgacg gcaaggccca cttcccccgg 3300

gagggcgtgt tcgtgagcaa tggcacccac tggttcgtga cccaaagaaa cttttacgag 3360

ccccagatta tcaccaccga caacaccttc gtgtcaggca actgcgacgt ggtgatcggc 3420

atcgtgaaca acactgtgta cgaccctctg cagcctgagc tggacagctt caaggaggaa 3480

ctggacaagt acttcaaaaa ccacacatct cctgacgtgg acctgggcga tatcagcggc 3540

attaacgcct ctgtggtgaa catccagaag gaaatcgaca gactgaacga ggtggccaag 3600

aacctgaatg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca agtacgagca gtacatcaag 3660

tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccatcgt gatggtcacc 3720

atcatgctgt gctgcatgac cagctgttgc agctgcctga aaggctgttg cagctgcgga 3780

agttgctgca agtttgacga ggacgactct gagcctgtgc tgaagggcgt caagctgcac 3840

tacacatga 3849

<210> 5

<211> 3852

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc ctcctgctta caccaactcg 120

ttcacacggg gagtgtacta ccccgacaag gtgttcagga gctcagtgct gcatagcacc 180

caagacctgt tcctgccatt cttcagcaac gtcacgtggt tccacgccat ccacgtgtct 240

ggaaccaacg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaacga tggagtgtac 300

ttcgctagca ccgagaagag caacatcatc cggggctgga tcttcggcac cacactggac 360

tccaagacac agagtctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtcgtgat caaggtgtgt 420

gagttccagt tctgcaacga tcctttcctc ggcgtttact accacaagaa caacaagagc 480

tggatggaat cagaatttag ggtatattct tctgccaata actgtacgtt tgaatacgtg 540

tctcagcctt tcctaatgga cctggaaggc aaacagggca actttaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctatttc aagatctaca gtaagcacac ccctatcaac 660

ctggtgcggg acctgcccca ggggttttcc gcccttgaac ctctggtgga cctgcccatt 720

ggcatcaata tcacaagatt ccagaccctg ctggccctgc acagaagcta cctgacccct 780

ggcgacagca gcagcggatg gaccgccggc gccgccgcct actacgtggg atacctgcag 840

cctagaacct tcctactgaa atacaacgaa aacggtacca tcaccgacgc cgtggattgc 900

gctctggacc ctctgagcga aaccaagtgc accctgaaaa gctttaccgt ggagaagggc 960

atttatcaga caagcaactt tcgggtgcag cctaccgaga gcatcgtgag attccctaac 1020

atcaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg ttcaatgcca cacggttcgc cagcgtgtac 1080

gcctggaacc ggaagcggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtataatagc 1140

gccagcttca gcacattcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa tgatctgtgc 1200

tttaccaacg tgtatgccga tagctttgtg atccgggggg acgaggtaag acagattgcc 1260

ccaggacaga caggcaaaat cgcagattac aactacaaac tgcctgacga cttcaccggc 1320

tgcgttatcg cctggaactc caacaacctg gacagcaagg tgggaggaaa ctacaactac 1380

ctgtaccgac tgttcagaaa gagcaacctg aagccattcg agagagatat ttcgacagag 1440

atctaccagg ccggaagcac accttgcaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttcccc 1500

ctgcagagct acggctttca gcccacaaac ggcgtcggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgagct tcgagctgct gcatgcccct gccaccgtgt gcgggcctaa gaagtccaca 1620

aatctggtaa agaataagtg tgtgaacttc aatttcaatg gcctgaccgg aacgggtgtg 1680

ctgaccgaat ctaataagaa gttcctgcct ttccagcagt tcggccgtga tatcgccgac 1740

accaccgacg ctgtccgcga tcctcaaacc ctggaaatcc tggacattac accttgcagc 1800

ttcggcggcg tgtccgtgat cacaccaggc acaaacacca gcaaccaggt ggctgtgctg 1860

taccaggacg tgaactgtac agaggtgcct gtggccatcc acgccgacca gctgacacct 1920

acatggagag tgtattcaac aggcagcaac gtcttccaga ccagagcagg atgcctgatc 1980

ggcgctgagc atgtgaacaa ctcctacgag tgcgacatcc ctatcggcgc cggcatctgc 2040

gctagttacc agactcaaac caactctcct cggcgggcta gaagcgtcgc ctcccagagc 2100

atcatcgctt ataccatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctacag caacaactcc 2160

atcgccattc ctaccaactt cacgatctca gttaccaccg agatcctgcc tgtgagcatg 2220

acaaagacca gcgtcgactg caccatgtac atctgcggcg attccacaga atgctccaac 2280

ctgctgctcc agtacggctc tttctgtacc cagctgaaca gagccctgac aggcatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac tcaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400

cctccaatca aggactttgg cggctttaat ttcagccaaa tcctcccaga tcctagcaag 2460

cccagcaaga gaagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtcaccct ggctgacgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgactgcctg ggcgatatcg ccgcgaggga tctaatttgt 2580

gctcagaagt tcaacggcct gaccgtgctg ccccccctgc tgacagacga aatgatcgct 2640

cagtacacat ctgccctgct ggccggcacc atcacgagcg gctggacctt cggagccggc 2700

gccgccctgc agatcccctt cgctatgcag atggcctata gattcaacgg catcggcgtg 2760

acccagaacg tgctgtacga gaaccaaaaa ctgattgcca atcaatttaa ttccgcgatc 2820

ggaaagatcc aggactctct gagctctact gccagcgccc tgggcaagct gcaagacgtg 2880

gtgaaccaga atgctcaagc cctgaacacc ctggtgaagc agctgagcag caatttcgga 2940

gcaatcagct ctgtcctcaa cgacattctg tctagactag acaaggtgga agccgaagtg 3000

cagatcgatc ggcttatcac cggaagactg cagagcctgc agacatatgt tacacagcag 3060

ctgatcagag ccgccgagat cagagccagc gccaacctgg cagccacaaa aatgtccgag 3120

tgcgtcctcg gccaatctaa gcgggttgat ttctgtggca aaggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaaa gcgctcctca cggcgtggtg tttctgcacg tcacctacgt gcccgcccaa 3240

gagaagaact tcaccaccgc ccccgctatc tgccacgacg gcaaggccca cttccctcgg 3300

gaaggcgtgt tcgtgagtaa cggtacacac tggtttgtga cccaaagaaa cttctacgag 3360

cctcagatca tcaccaccga taacaccttt gtgagcggca actgcgatgt ggtgatcggc 3420

atcgtgaaca acacagtata cgaccccctg cagcccgagc tggacagctt taaagaggag 3480

ctcgataagt acttcaagaa ccacacatct ccagacgtgg acctgggcga catcagcggc 3540

atcaacgcca gtgttgtgaa catccagaaa gaaatcgata gactgaacga agtggccaag 3600

aatctgaacg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca aatacgagca gtacatcaag 3660

tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccattgt gatggtgaca 3720

atcatgctgt gctgtatgac ctcttgctgc tcctgcctga aaggctgttg tagttgcggc 3780

agctgctgta aattcgatga ggatgactcc gagccggtcc tcaaaggcgt caagctgcac 3840

tacacctgat aa 3852

Claims (10)

1.一种DNA分子组合，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO.1-4所示的DNA分子。

2.一种重组载体组合，其特征在于，所述重组载体组合为将权利要求1中序列如SEQ IDNO.1-4所示的DNA分子分别与骨架载体重组得到。

3.根据权利要求2所述的重组载体组合，其特征在于，所述骨架载体为真核表达载体，所述骨架载体为pVAX1。

4.一种重组细胞组合，其特征在于，所述重组细胞组合为将权利要求2或者3所述的重组载体组合分别导入宿主细胞得到。

5.权利要求1所述的DNA分子组合、权利要求2或3所述的重组载体组合或权利要求4所述的重组细胞组合在（a）或（b）中的应用：

（a）制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗；

（b）制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物；

新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株中的至少一种。

6.一种DNA疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的DNA分子组合或者权利要求2或者3所述的重组载体组合。

7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗具有如下（1）-（3）至少一种功能：

（1）调整机体的免疫功能；

（2）抗新型冠状病毒感染；

（3）防止免疫病理损伤；

新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株中的至少一种。

8.根据权利要求6或7所述的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗还包括佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种；或者至少一种对新型冠状病毒有治疗作用的药物。

9.根据权利要求8所述的DNA疫苗，其特征在于，所述佐剂包括铝佐剂和/或TLRs 配体和/或金属离子和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂。

10.权利要求6-9任一项所述DNA疫苗的制备方法，其特征在于，将分别含有序列如SEQID NO.1-4所示的核酸分子的重组载体分别导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，得到DNA疫苗。

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