CN113862286B - 编码sars-cov-2病毒c.37突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种编码SARS‑COV‑2病毒C.37突变株抗原的DNA分子、DNA疫苗及应用。本发明提供的SEQ ID NO：1核酸序列在真核表达系统中能够高效转录和表达，而且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，以此作为活性成分的核酸疫苗同样具有良好的免疫原性。

Description

编码SARS-COV-2病毒C.37突变株抗原的DNA分子、DNA疫苗及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子、DNA疫苗及应用。
背景技术
SARS-CoV-2是具有包膜结构的单股正链RNA病毒，极易发生突变。其中，SARS-COV-2病毒C.37 突变株 （即拉姆达Lambda毒株）有5个主要突变，RSYLTPGD246-253N、L452Q、F490S、T76I和L452Q突变。因而，需要开发出针对突变株更为有效的疫苗。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供包括上述DNA分子的生物材料。
本发明的目的之三在于提供上述生物材料的应用。
本发明的目的之四在于提供包括上述DNA分子的SARS-COV-2病毒C.37 突变株DNA疫苗。
本发明的目的之五在于提供上述DNA疫苗的制备方法。
本发明的目的之六在于提供上述DNA疫苗的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子，所述DNA分子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料包括：
（a）重组表达载体，包括上述的DNA分子；
（b）细胞，包括上述的DNA分子或（a）所述的重组表达载体；
（c）多肽，由上述的DNA分子编码。
进一步的，所述重组表达载体包括真核表达载体，所述真核表达载体包括pVAX1。
优选地，所述细胞包括HEK293、CHO、COS-7等细胞。
本发明还提供了上述的DNA分子或生物材料在如下（A）或（B）中的应用：
（A）制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒感染的疫苗；
（B）制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的药物。
进一步的，所述SARS-COV-2病毒包括 C.37 突变株、野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.526突变株或B.1.617突变株。
本发明还提供了SARS-COV-2病毒C.37 突变株DNA疫苗，包括上述的DNA分子。
进一步的，所述DNA分子存在于重组表达载体中，所述重组表达载体包括pVAX1。
进一步的，所述DNA疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂；
和/或，至少一种对SARS-COV-2病毒有治疗作用的药物。
优选地，所述佐剂包括铝佐剂和/或TLRs 配体和/或金属离子如Mn2+、Zn2+和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。
本发明还提供了上述的DNA疫苗的制备方法，将包括上述的DNA分子的重组载体导入宿主细胞并进行培养，提取宿主细胞中的重组载体，得到DNA疫苗。
此外，本发明还提供了上述的DNA疫苗的应用，包括如下（i）-（iii）：
（i）调整机体的免疫功能；
（ii）抗SARS-COV-2病毒感染；
（iii）防止免疫病理损伤；
所述SARS-COV-2病毒包括 C.37 突变株、野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.526突变株或B.1.617突变株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用不同优化算法对SARS-COV-2病毒C.37 突变株Spike蛋白的编码DNA序列进行优化，得到具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子能够高效转录并表达SARS-COV-2病毒C.37 突变株Spike抗原，并且具有免疫原性，能够诱导特定的体液免疫和细胞免疫应答。
基于上述编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子的有益效果，本发明还提供了包括上述DNA分子的DNA疫苗。该DNA疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达，同样也具有良好的免疫原性，对于体液免疫应答，该DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，该DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应，而且能够诱导抗原特异性CD8IFNγ T细胞亚群的产生。
基于此，本发明提供的DNA疫苗能够调整机体的免疫功能，有效预防SARS-COV-2病毒及其突变株，尤其是C.37 突变株的感染，同时也能干治疗由SARS-COV-2病毒及其突变株，尤其是C.37 突变株引发的疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为C.37突变株Spike蛋白的编码DNA序列密码子优化指数评分结果图；
图2为C.37 突变株Spike蛋白的编码DNA序列优化后的GC含量评分结果图；
图3为C.37突变株Spike蛋白的编码DNA序列优化后的负调控元件数量评分结果图；
图4为C.37突变株Spike蛋白的编码DNA序列优化后的qPCR表达倍数结果图；
图5为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗qPCR表达结果；
图6为本发明实施例提供的新冠野生株、突变株候选DNA疫苗Western Blot检测抗原蛋白结果；
图7为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗初次免疫后第14天抗原特异性抗体结果；
图8为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天抗原特异性抗体结果；
图9为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天抗原特异性IFN-γ ELISOPT结果；
图10为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天抗原特异性IL-4 ELISOPT结果；
图11为本发明实施例提供的新冠野生株、C.37 突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天抗原特异性CD8IFNγ T细胞亚群结果。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明利用不同优化算法对SARS-COV-2病毒C.37 突变株Spike蛋白的编码DNA序列进行优化，得到具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子能够高效转录、更有利于与在真核表达系统中高效表达SARS-COV-2病毒C.37 突变株Spike抗原，并且具有良好的免疫原性，能够诱导特定的体液免疫和细胞免疫应答。
可以理解的是，在本发明中，“一致性”指的是核苷酸序列之间的相似性，包括与本发明所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%（例如可以为，但不限于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高）一致性的核苷酸序列。
可选地，优化还包括将SARS-COV-2病毒C.37 突变株基因信号肽替换为高效表达信号肽，以此提高该DNA序列在宿主内的表达效率。
本发明还提供了与上述DNA分子相关的生物材料：
（a）重组表达载体，包括本发明提供的DNA分子。其中载体可以为真核表达载体，通过细胞转录和翻译机制生成该DNA分子编码的蛋白。可选地，载体可具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间距离的调节，以及转录终止序列和PTIS的插入。优选地，所述真核表达载体包括pVAX1，但不限于其他能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
（b）细胞，将本发明提供的DNA分子或（a）所述的重组表达载体导入宿主细胞中得到。其中，宿主细胞可以为真核细胞，典型的可以为昆虫细胞、酵母、禽类细胞或哺乳动物细胞，以及其他适宜的宿主细胞。所述细胞包括HEK293、CHO、COS-7等细胞。
（c）多肽，由本发明提供的DNA分子编码。基于该多肽，也可以提供能够与其特异性结合的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。
可以理解的是，本发明提供的生物材料均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了上述的DNA分子或生物材料在制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒感染的疫苗，和/或，在制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的药物中的应用，相关疾病例如肺部损伤、大脑损伤，肝肾损伤、心脏损伤。
优选地，所述SARS-COV-2病毒包括 C.37 突变株、野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.526突变株或B.1.617突变株。
基于上述编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子的有益效果，本发明还提供了包括上述DNA分子的DNA疫苗。
该DNA疫苗在哺乳动物细胞内能够有效转录并表达SARS-COV-2病毒C.37 突变株Spike抗原，激发出更为高效地免疫反应，对于体液免疫应答，该DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，该DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应，而且能够诱导抗原特异性CD8IFNγ T细胞亚群的产生。
在一些实施方式中，所述DNA疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，以增加其活性成分DNA分子在受试者体内产生免疫应答的能力。其中药学上可接受的佐剂可以选自铝佐剂和/或TLRs配体和/或金属离子如Mn2+、Zn2+和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。
在另一些实施方式中，所述DNA疫苗还包括至少一种对SARS-COV-2病毒有治疗作用的药物，以加强该疫苗对SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的治疗作用。
本发明提供的DNA疫苗其作用机理为：将SARS-COV-2病毒C.37 突变株表面抗原Spike抗原编码DNA首先利用不同优化算法对DNA序列进行优化，其次将其野生型基因信号肽替换为高效表达信号肽后、插入真核表达载体，将其导入宿主细胞内，使其在宿主细胞高效表达病毒Spike抗原，经过抗原提呈过程系统地激活抗病毒体液免疫应答及细胞免疫应答。激活的体液免疫应答所产生的抗体可以预防病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受病毒感染的细胞，以及调节由于ADE的潜在副作用引发的不良反应。
基于上述作用机理，本发明还提供了上述的DNA疫苗的应用，包括：
（i）调整机体的免疫功能；
（ii）抗SARS-COV-2病毒感染；
（iii）防止免疫病理损伤。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1：编码S蛋白的核酸优化筛选
为了增加靶蛋白在宿主细胞中的蛋白表达，需要对靶基因的核酸序列进行优化，核酸序列优化原理为：（1）根据宿主细胞对于核酸密码子的偏好性对简并密码子进行优化，使优化后的序列含有更多利于宿主细胞识别的核酸密码子；（2）在密码子偏好优化的基础上进一步优化核酸序列中的GC含量，使GC含量优化后的序列能够表达出更多的靶蛋白；（3）优化核酸序列使其能够转录出更加稳定的mRNA，利于靶蛋白的翻译；（4）改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI指数（密码子适应指数）。本申请通过对野生型SARS-COV-2病毒C.37突变株表面蛋白Spike的编码核苷酸序列进行优化，调整其中核苷酸序列中的GC含量；同时改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI(密码子适应指数)指数；减少形成RNA二级结构自由能，减少Negative CIS元件比例，降低序列中重复序列比例，此外进行信号肽优化，并结合发明人该领域多年的经验形成的本公司特有的算法，从而能够进一步提高其表达量，得到优化后的核苷酸序列，并将其制成核酸疫苗。
优化过程：选取优化前野生C.37突变株Spike（S蛋白）序列（EPI_ISL_2791490，GISAID）作为抗原序列，根据优化策略得到本发明当中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，采用常规商业化数据库优化策略得到SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。对本申请中优化前野生C.37序列、优化后SEQ ID NO：1以及常规商业化优化得到的SEQ ID NO：3的核苷酸序列进行评分；在DNA序列优化增加表达方面，优化效果与DNA优化的关键指标如：密码子优化指数成正相关，GC含量成正相关，与负调控元件的数量成负相关。如图1-图3所示，结果表明对C.37 突变株Spike序列进行优化后，发现本发明采用的优化策略在关键指标上与常规商业化优化策略相比有着明显的提升，可以预示本发明采用的优化策略能够增加优化基因的表达效率。
将上述优化前野生序列、优化后本申请中SEQ ID NO：1以及常规商业化数据库优化得到的SEQ ID NO：3的3个核苷酸序列分别转化构建入pVAX1载体（ThermoFisher，货号：V26020）中，得到3种质粒DNA: pC.37-野生、pC.37和pC.37-常规优化。将3种质粒分别转染至HEK293T细胞株48h后提取RNA，采用qPCR的方法鉴定不同优化方式得到的质粒DNA的转录水平。结果如图4所示，本发明C.37突变株DNA序列优化后RNA 转录水平相比于优化前野生序列增加200多倍，而且相比于常规商业化数据库优化后的RNA转录水平可以增加5倍多，进一步的说明本发明的优化获得的核酸分子优于常规商业化数据库优化的核酸分子。DNA疫苗转录水平的提高可以使得蛋白表达量得到提高，从而提高DNA疫苗的免疫效果，本发明设计获得的序列在转录水平取得了非常显著的提高，其蛋白表达量也得到显著的改善，从而获得显著的更优的免疫效果。
实施例2：DNA疫苗的构建过程
1.新冠病毒候选DNA疫苗的制备方法
1.1.质粒的构建
如实施例1所述，根据C.37 突变株序列（EPI_ISL_2791490，GISAID），优化获得SEQID NO：1所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO：1 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I位点间，得到新冠病毒C.37 突变株质粒（pC.37）。
根据新冠野生型序列（MN908947.3，NCBI），优化获得SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I位点间，得到新冠病毒野生株质粒（pWT）。pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。
1.2.DNA疫苗序列转化
从-80℃冰箱中取100 μl DH10B感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒DNA溶液（体积不超过10 μl）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5min。向管中加入0.9ml的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。
1.3.DNA疫苗质粒提取
将上述菌液按照1:1000加入到200-400ml含有卡那霉素（50mg/mL母液，1:1000使用）的LB选择培养基中，37℃ 200rpm培养12-16h。用EndoFreen Plasmid Maxi kit（QIAGEN，德国）进行质粒提取：将上述培养12-16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml Buffer P1重悬菌液后加入10ml Buffer P2轻轻颠倒4-6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml Buffer P3，轻轻颠倒4-6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml Buffer ER，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10ml Buffer QBT平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml Buffer QC洗涤2次，再用15ml Buffer QN进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500μl无内毒素水进行重悬质粒，得到DNA疫苗质粒。
实施例3：新冠病毒候选DNA疫苗哺乳动物细胞转录鉴定
为了验证实施例2构建的质粒在哺乳动物细胞内是否能够有效转录，通过DNA体外转染、提取RNA、qPCR的方法进行鉴定。
1. DNA疫苗体外转染
从液氮中取出冻存的HEK293T细胞株，37℃水浴后1000rpm离心5分钟除去DMSO。加入无血清的DMEM培养液洗涤一次，于含10%小牛血清的DMEM培养液5ml中，37℃，5% CO2培养2-3代备用。37℃胰酶（含0.25%的EDTA）消化细胞1min并用完全培养基终止后，以2-4×106细胞/孔的密度平铺于60mm培养皿，加5ml生长培养基（不含1%双抗）于37℃、5% CO2培养箱中培养24h。
将4μg pWT 、4μg pC.37两种无菌质粒分别加入至500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，同时将24μl的阳离子脂质体于500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min，将上述两种质粒分别和脂质体1:1混合，室温放置20min，得到质粒DNA/脂质体复合物。
将上述质粒DNA/脂质体复合物按1ml/皿加入至上述培养24h的60mm培养皿中，于37℃，5% CO2培养箱分别孵育至48小时进行后续实验。
2. 转染后RNA提取
消化收集上述分别转染至48小时的细胞，用1ml完全培养基重悬后，吸取100μl用于RNA提取，剩余重悬液进行后续WB样品制备。
将吸取的100μl细胞悬液4000rpm离心5分钟，弃上清，每样加入350μl TRK LysisSolution(含20%的β-巯基乙醇)进行裂解。每样再加入350μl的70%的乙醇（使用DEPC水配制）进行终止裂解，用枪吹打混匀。
将上述混合液转移至HiBind RNA Column柱内，10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl Wash Buffer I, 10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl WashBuffer II洗涤2次，每次均用10000g离心1min，弃滤液。将离心机转速调整至最高转速（17000g）离心2min以使柱内的乙醇挥发。将柱子转移至干净的无DNA和RNA酶的1.5ml离心管中，室温放置3-5min，彻底挥发乙醇后，每样加入50μl的RNase-Free Water，室温孵育5min, 17000g离心1min。将滤液吸出再次加入到柱子中，室温孵育5min, 17000g离心1min收集RNA，-80℃保存。
3.RNA反转录、qPCR反应
使用酶标仪定量RNA浓度（使用OD260/280进行读值），根据所需PCR数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照）配置溶液，每样先配置10μl反应体系（2μl 5×gDNAdigester Buffer、1μl gDNA digester、100ng的RNA，用RNase free ddH2O将体积调至10μl），用枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。向每样中加入10μl 2×Hifair II SuperMix plus，用枪轻轻吹打混匀后，按照25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min进行孵育。收取的cDNA放于-20℃备用。
将反转录得到的cDNA产物按照qPCR试剂盒进行反应。反应体系如下：Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)10μl，目的正、反向引物各0.4μl，cDNA模板1μl，无菌超纯水补足总体积为20μl。PCR反应条件：95 ℃、5 min，95℃、10 s，56℃、30s，72℃、30s共40个循环。目的基因的表达水平与内参相比后采用2-△△C方法计算。
结论：如图5所示，新冠野生株pWT、pC.37突变株候选DNA疫苗在体外转染48小时后较空载体（pVAX1）均能高水平地促使抗原RNA的转录。
实施例4：新冠病毒候选DNA疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定
为了进一步验证实施例2构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，Western Blot方法进行鉴定。
1.蛋白提取
将新冠质粒pWT、pC.37 分别转染到HEK293T细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入150μl裂解液（使用前按1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5分钟。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出50μl上清液，加入12.5μl 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。
2.样品上样及SDS-PAGE电泳
将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5μl于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压200V，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1×转膜平衡液中1min。
3.转膜
以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1×TBST+5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液（Rabbit anti S proteinpolyclonal antibody,1:4000）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中（BDPharmingen HRP Anti human IgG，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3ml和B液3ml以1：1比例混合后加入到PVDF膜孵育1-2min，拍照。
结论：如图6所示，新冠野生株pWT、pC.37 突变株候选DNA疫苗在体外转染48小时后与空载体（pVAX1）相比能够在细胞内高水平表达抗原蛋白。
实施例5：新冠候选DNA疫苗免疫原性验证
为了评估实施例2制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄C57BL/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣Advaccine实验室（苏州）的动物设施中。对于DNA疫苗的接种：将实施例1所述DNA疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（EP）。电脉冲（EP）装置由两组具有0.2 Amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pVAX1-25μg；（2）实验组野生型毒株pWT-25 μg；（3）实验组突变株pC.37-25 μg；第14，21天采集小鼠血液样品，用ELISA法测定血清的特异性抗体滴度。在加强免疫后第7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞免疫反应。
1.评估DNA疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答
1.1.ELISA检测抗体浓度
使用基于ELISA方法评估针对SARS-CoV-2 RBD蛋白结合抗体。将Nunc 96孔ELISA平板在4℃下用1 µg / mL SARS-Cov-2 RBD蛋白（Acro Biosystems，DE，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（含0.05％Tween 20，即PBST缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37℃下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37℃加入1：8000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP（GenScript，NJ，CN）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用TMB底物使板显影，并用50µl/孔2MH2SO4终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍(判定标准：实验组：对照组（阴性）OD450-620值≧2.1，判定该OD值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。
结论：结果如图7和图8所示，新冠野生株pWT、pC.37突变株候选DNA疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述ELISA试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pC.37突变株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，且如前所述，pWT 是拥有优秀的免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
2.进一步评估DNA疫苗引发的抗原特异性细胞应答
我们通过ELISpot分析，研究DNA疫苗是否可以促进细胞免疫。在加强免疫后7天分离脾细胞，进行IFN-γ 、IL-4阳性细胞ELISpot实验。
2.1 IFN-γ、IL-4 ELISpot实验
在加强免疫后第7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。通过使用小鼠IL-4、IFN-γ 双色FlouroSpot试剂盒（MabTech，USA）进行IL-4 ELISpot、IFN-γELISpot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IL-4抗体、抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO2培养箱中用SARS-CoV-2 RBD肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/mL（终浓度）（溶于RPMI + 10％FBS）。根据产品说明书进行操作。培养基和PMA/Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader（AID，德国Straßberg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（SFU）。
结论：IFN-γ、IL-4 ELISPOT结果如图9-10所示，新冠野生株pWT、pC.37突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天均能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应。上述试验ELIspot试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pC.37突变株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，如前所述，pWT 是拥有优秀的免疫效果的前期产品，更说明了本发明新冠 pC.37突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。
3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是CD8 T细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。
分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。
流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％ CO2下用SARS-CoV-2 RBD肽库或PMA/Iono刺激，同时利用1μg/ ml的Brefedlin A阻断（BD，CA，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用FVD-eFluor780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠CD4，CD8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠IFN-γ和抗小鼠TNF-α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200µL PBS重悬，然后使用流式细胞仪（ThermoFisher，MA，美国）进行采集，然后用FlowJo软件（BD，CA, 美国）进行分析。
结论：结果如图11所示，新冠野生株pWT、pC.37突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天, 能够显著诱导抗原特异性和CD8IFNγ T细胞亚群的产生。上述试验FACS试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的 pC.37突变株DNA疫苗也取得了相当的显著的技术效果，如前所述，pWT 是拥有优秀的免疫效果的前期产品，更说明了本发明 pC.37突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。
综上，由实施例1-5的结果可知，本发明的pC.37突变株DNA疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达； 而且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，pC.37突变株候选DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，pC.37突变株候选DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应、而且能够诱导抗原特异性CD8IFNγT细胞亚群的产生。
值得注意的是，pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前已进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如ELISA、ELIspot和FACS的检测中，均采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原或者刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pC.37突变株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，更说明了本发明 pC.37突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司
<120> 编码SARS-COV-2病毒C.37 突变株抗原的DNA分子、DNA疫苗及应用
<130> 20211119
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60
gcctcgcagt gcgtgaacct gaccacacgg acccagctgc ctccagctta cacaaatagc 120
ttcaccagag gcgtgtacta cccggacaag gtgttccggt cctctgtgct gcacagcacc 180
caggacctct tcctgccctt tttcagcaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 240
ggcacaaacg tgatcaaaag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaatga tggagtctac 300
ttcgcctcta ccgaaaagag caacatcatc cgcggctgga tcttcggcac caccctggac 360
agtaagaccc agagcctgct catcgtgaac aacgccacga acgtggtgat caaggtgtgt 420
gaattccaat tttgcaacga cccctttctc ggcgtgtact accacaagaa caataaatct 480
tggatggaga gcgagtttag agtgtacagc tctgctaaca actgcacttt cgagtacgtg 540
tcccagccat tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca atttcaagaa cctgagagaa 600
ttcgtgttta agaacatcga cggctacttc aaaatctatt ctaagcacac cccaatcaac 660
ctggtccggg acctgccaca aggcttcagc gccctggaac ctctggtgga cctgcctatc 720
ggaatcaaca tcacccggtt ccagaccctg ctggccctgc ataacagcag ctctggctgg 780
accgccggcg ctgccgcata ttacgtcggc tacttgcaac ctaggacctt cctgctgaaa 840
tacaacgaga acggcaccat cacagatgcc gttgattgcg ccctggaccc cctgagcgaa 900
accaagtgta ccctgaaatc cttcaccgtg gaaaagggca tctaccagac cagcaacttt 960
agagtacagc ctacagaatc tatcgttcgg tttccaaaca ttaccaacct gtgtcctttc 1020
ggcgaggtgt ttaacgccac acggttcgcc agcgtgtatg cctggaatag aaagcggatc 1080
agcaactgtg tggccgacta ctccgtgctg tacaatagcg ccagcttctc tacatttaag 1140
tgctacggcg tgtcccctac aaagctgaac gacctgtgct tcacaaacgt gtatgccgat 1200
agcttcgtga tccggggcga tgaggtccgg cagatcgctc ctggccagac aggcaagatt 1260
gccgactaca actacaagct gcccgatgac ttcaccggat gtgtgatagc ctggaacagc 1320
aacaacctgg atagcaaggt gggcggcaac tacaactacc agtaccgact gtttagaaag 1380
agcaacctga aaccttttga gcgggacatc agcacagaga tctaccaagc cggctctacc 1440
ccttgtaacg gcgtggaggg cttcaactgt tacagccctc tgcagtctta cggattccag 1500
cctacaaacg gcgtgggata ccagccctat agagtggtgg tgctgtcatt cgagctgcta 1560
catgcccctg ccaccgtgtg cggccctaag aagtctacca acctcgtgaa gaacaagtgc 1620
gtgaatttta acttcaatgg actgacaggc acaggcgtgc tgacagagag caacaaaaag 1680
ttcctgccct tccagcagtt tggcagagat atcgctgaca ccacagacgc cgtgcgcgat 1740
cctcagaccc tggagatcct ggacatcacc ccttgctcct ttggaggagt gtccgtgatc 1800
acacctggaa cgaacaccag caaccaggtt gccgtgctgt accagggcgt gaactgcaca 1860
gaagttcctg tggccatcca tgccgatcag ctgacgccca cgtggcgggt gtactctacc 1920
ggcagcaatg tgttccagac cagagccggc tgccttattg gcgctgagca cgtgaataat 1980
agctatgaat gcgatatccc aatcggagcc ggcatttgcg ccagctacca gacccagaca 2040
aatagtccta gaagagccag atctgtggcc tcccagagca tcatcgcata taccatgagc 2100
ctaggagccg aaaacagcgt cgcctattcc aacaatagca tcgccatccc gacaaacttc 2160
accatcagcg tgaccaccga aatcctgccc gtgagcatga ccaagacaag cgtggactgt 2220
acaatgtaca tctgtggaga ctccaccgag tgcagcaacc tgctgctgca gtacggcagc 2280
ttctgcaccc agctgaacag agccctgaca gggatcgccg tggaacagga taagaacacc 2340
caagaggtgt tcgcccaagt gaagcagatc tataagactc cacctattaa ggactttggc 2400
ggcttcaact tcagccaaat cctgcccgat cctagcaagc caagcaagcg gtccttcatc 2460
gaggacctgc tgttcaacaa ggtgaccctg gccgacgccg gcttcatcaa gcagtatggc 2520
gactgtctgg gcgatatcgc cgctagagac ctgatctgcg cccagaagtt caatggcctg 2580
aacgtgctcc cacctctgct caccgacgag atgatcgccc agtacacctc tgccctgctg 2640
gccggcacca tcaccagcgg gtggacattc ggggctggag ctgctctgca aatccccttc 2700
gccatgcaga tggcctacag attcaacggc atcggcgtta cccagaatgt gctgtatgaa 2760
aaccagaaac tgatagctaa ccagttcaac agcgccatag gcaaaatcca ggatagtctg 2820
agctctacag ccagcgccct gggaaaactg caggatgtgg tgaatcagaa cgcccaggcc 2880
ctgaatacac tggtgaaaca actgagcagc aatttcggcg ccatcagcag cgtgctgaat 2940
gatatcctgt ctagactgga cccccccgag gccgaggtgc agatcgatag actgatcacc 3000
ggcagactgc agtccctgca gacatacgtg actcaacagc tgatcagagc cgctgagatc 3060
agagcttctg ctaatttggc tgccacaaag atgagcgagt gcgtgctggg ccagagcaaa 3120
agagtggact tctgcggcaa gggctaccac ctgatgagct tcccccagag cgcccctcac 3180
ggcgtcgtgt tcctgcacgt gacttacgtg cctgcccagg agaagaactt caccaccgcc 3240
cctgccatct gccacgacgg caaggcccac ttcccccggg agggcgtgtt cgtgagcaat 3300
ggcacccact ggttcgtgac ccaaagaaac ttttacgagc cccagattat caccaccgac 3360
aacaccttcg tgtcaggcaa ctgcgacgtg gtgatcggca tcgtgaacaa cactgtgtac 3420
gaccctctgc agcctgagct ggacagcttc aaggaggaac tggacaagta cttcaaaaac 3480
cacacatctc ctgacgtgga cctgggcgat atcagcggca ttaacgcctc tgtggtgaac 3540
atccagaagg aaatcgacag actgaacgag gtggccaaga acctgaatga gagcctgatc 3600
gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag tacatcaagt ggccttggta catctggctg 3660
ggctttatcg ccggcctgat cgccatcgtg atggtcacca tcatgctgtg ctgcatgacc 3720
agctgttgca gctgcctgaa aggctgttgc agctgcggaa gttgctgcaa gtttgacgag 3780
gacgactctg agcctgtgct gaagggcgtc aagctgcact acacatga 3828
<210> 2
<211> 3852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60
gcctctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc ctcctgctta caccaactcg 120
ttcacacggg gagtgtacta ccccgacaag gtgttcagga gctcagtgct gcatagcacc 180
caagacctgt tcctgccatt cttcagcaac gtcacgtggt tccacgccat ccacgtgtct 240
ggaaccaacg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaacga tggagtgtac 300
ttcgctagca ccgagaagag caacatcatc cggggctgga tcttcggcac cacactggac 360
tccaagacac agagtctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtcgtgat caaggtgtgt 420
gagttccagt tctgcaacga tcctttcctc ggcgtttact accacaagaa caacaagagc 480
tggatggaat cagaatttag ggtatattct tctgccaata actgtacgtt tgaatacgtg 540
tctcagcctt tcctaatgga cctggaaggc aaacagggca actttaagaa cctgagagaa 600
ttcgtgttta agaacatcga cggctatttc aagatctaca gtaagcacac ccctatcaac 660
ctggtgcggg acctgcccca ggggttttcc gcccttgaac ctctggtgga cctgcccatt 720
ggcatcaata tcacaagatt ccagaccctg ctggccctgc acagaagcta cctgacccct 780
ggcgacagca gcagcggatg gaccgccggc gccgccgcct actacgtggg atacctgcag 840
cctagaacct tcctactgaa atacaacgaa aacggtacca tcaccgacgc cgtggattgc 900
gctctggacc ctctgagcga aaccaagtgc accctgaaaa gctttaccgt ggagaagggc 960
atttatcaga caagcaactt tcgggtgcag cctaccgaga gcatcgtgag attccctaac 1020
atcaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg ttcaatgcca cacggttcgc cagcgtgtac 1080
gcctggaacc ggaagcggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtataatagc 1140
gccagcttca gcacattcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa tgatctgtgc 1200
tttaccaacg tgtatgccga tagctttgtg atccgggggg acgaggtaag acagattgcc 1260
ccaggacaga caggcaaaat cgcagattac aactacaaac tgcctgacga cttcaccggc 1320
tgcgttatcg cctggaactc caacaacctg gacagcaagg tgggaggaaa ctacaactac 1380
ctgtaccgac tgttcagaaa gagcaacctg aagccattcg agagagatat ttcgacagag 1440
atctaccagg ccggaagcac accttgcaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttcccc 1500
ctgcagagct acggctttca gcccacaaac ggcgtcggct accagcctta cagagtggtg 1560
gtgctgagct tcgagctgct gcatgcccct gccaccgtgt gcgggcctaa gaagtccaca 1620
aatctggtaa agaataagtg tgtgaacttc aatttcaatg gcctgaccgg aacgggtgtg 1680
ctgaccgaat ctaataagaa gttcctgcct ttccagcagt tcggccgtga tatcgccgac 1740
accaccgacg ctgtccgcga tcctcaaacc ctggaaatcc tggacattac accttgcagc 1800
ttcggcggcg tgtccgtgat cacaccaggc acaaacacca gcaaccaggt ggctgtgctg 1860
taccaggacg tgaactgtac agaggtgcct gtggccatcc acgccgacca gctgacacct 1920
acatggagag tgtattcaac aggcagcaac gtcttccaga ccagagcagg atgcctgatc 1980
ggcgctgagc atgtgaacaa ctcctacgag tgcgacatcc ctatcggcgc cggcatctgc 2040
gctagttacc agactcaaac caactctcct cggcgggcta gaagcgtcgc ctcccagagc 2100
atcatcgctt ataccatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctacag caacaactcc 2160
atcgccattc ctaccaactt cacgatctca gttaccaccg agatcctgcc tgtgagcatg 2220
acaaagacca gcgtcgactg caccatgtac atctgcggcg attccacaga atgctccaac 2280
ctgctgctcc agtacggctc tttctgtacc cagctgaaca gagccctgac aggcatcgcc 2340
gtggaacagg ataagaacac tcaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400
cctccaatca aggactttgg cggctttaat ttcagccaaa tcctcccaga tcctagcaag 2460
cccagcaaga gaagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtcaccct ggctgacgcc 2520
ggcttcatca agcagtatgg cgactgcctg ggcgatatcg ccgcgaggga tctaatttgt 2580
gctcagaagt tcaacggcct gaccgtgctg ccccccctgc tgacagacga aatgatcgct 2640
cagtacacat ctgccctgct ggccggcacc atcacgagcg gctggacctt cggagccggc 2700
gccgccctgc agatcccctt cgctatgcag atggcctata gattcaacgg catcggcgtg 2760
acccagaacg tgctgtacga gaaccaaaaa ctgattgcca atcaatttaa ttccgcgatc 2820
ggaaagatcc aggactctct gagctctact gccagcgccc tgggcaagct gcaagacgtg 2880
gtgaaccaga atgctcaagc cctgaacacc ctggtgaagc agctgagcag caatttcgga 2940
gcaatcagct ctgtcctcaa cgacattctg tctagactag acaaggtgga agccgaagtg 3000
cagatcgatc ggcttatcac cggaagactg cagagcctgc agacatatgt tacacagcag 3060
ctgatcagag ccgccgagat cagagccagc gccaacctgg cagccacaaa aatgtccgag 3120
tgcgtcctcg gccaatctaa gcgggttgat ttctgtggca aaggctacca cctgatgagc 3180
ttcccccaaa gcgctcctca cggcgtggtg tttctgcacg tcacctacgt gcccgcccaa 3240
gagaagaact tcaccaccgc ccccgctatc tgccacgacg gcaaggccca cttccctcgg 3300
gaaggcgtgt tcgtgagtaa cggtacacac tggtttgtga cccaaagaaa cttctacgag 3360
cctcagatca tcaccaccga taacaccttt gtgagcggca actgcgatgt ggtgatcggc 3420
atcgtgaaca acacagtata cgaccccctg cagcccgagc tggacagctt taaagaggag 3480
ctcgataagt acttcaagaa ccacacatct ccagacgtgg acctgggcga catcagcggc 3540
atcaacgcca gtgttgtgaa catccagaaa gaaatcgata gactgaacga agtggccaag 3600
aatctgaacg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca aatacgagca gtacatcaag 3660
tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccattgt gatggtgaca 3720
atcatgctgt gctgtatgac ctcttgctgc tcctgcctga aaggctgttg tagttgcggc 3780
agctgctgta aattcgatga ggatgactcc gagccggtcc tcaaaggcgt caagctgcac 3840
tacacctgat aa 3852
<210> 3
<211> 3828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc gatggtgtgg 60
gcgagccagt gcgtgaacct gaccacccgc acccagctgc cgccggcgta taccaacagc 120
tttacccgcg gcgtgtatta tccggataaa gtgtttcgca gcagcgtgct gcatagcacc 180
caggatctgt ttctgccgtt ttttagcaac gtgacctggt ttcatgcgat tcatgtgagc 240
ggcaccaacg tgattaaacg ctttgataac ccggtgctgc cgtttaacga tggcgtgtat 300
tttgcgagca ccgaaaaaag caacattatt cgcggctgga tttttggcac caccctggat 360
agcaaaaccc agagcctgct gattgtgaac aacgcgacca acgtggtgat taaagtgtgc 420
gaatttcagt tttgcaacga tccgtttctg ggcgtgtatt atcataaaaa caacaaaagc 480
tggatggaaa gcgaatttcg cgtgtatagc agcgcgaaca actgcacctt tgaatatgtg 540
agccagccgt ttctgatgga tctggaaggc aaacagggca actttaaaaa cctgcgcgaa 600
tttgtgttta aaaacattga tggctatttt aaaatttata gcaaacatac cccgattaac 660
ctggtgcgcg atctgccgca gggctttagc gcgctggaac cgctggtgga tctgccgatt 720
ggcattaaca ttacccgctt tcagaccctg ctggcgctgc ataacagcag cagcggctgg 780
accgcgggcg cggcggcgta ttatgtgggc tatctgcagc cgcgcacctt tctgctgaaa 840
tataacgaaa acggcaccat taccgatgcg gtggattgcg cgctggatcc gctgagcgaa 900
accaaatgca ccctgaaaag ctttaccgtg gaaaaaggca tttatcagac cagcaacttt 960
cgcgtgcagc cgaccgaaag cattgtgcgc tttccgaaca ttaccaacct gtgcccgttt 1020
ggcgaagtgt ttaacgcgac ccgctttgcg agcgtgtatg cgtggaaccg caaacgcatt 1080
agcaactgcg tggcggatta tagcgtgctg tataacagcg cgagctttag cacctttaaa 1140
tgctatggcg tgagcccgac caaactgaac gatctgtgct ttaccaacgt gtatgcggat 1200
agctttgtga ttcgcggcga tgaagtgcgc cagattgcgc cgggccagac cggcaaaatt 1260
gcggattata actataaact gccggatgat tttaccggct gcgtgattgc gtggaacagc 1320
aacaacctgg atagcaaagt gggcggcaac tataactatc agtatcgcct gtttcgcaaa 1380
agcaacctga aaccgtttga acgcgatatt agcaccgaaa tttatcaggc gggcagcacc 1440
ccgtgcaacg gcgtggaagg ctttaactgc tatagcccgc tgcagagcta tggctttcag 1500
ccgaccaacg gcgtgggcta tcagccgtat cgcgtggtgg tgctgagctt tgaactgctg 1560
catgcgccgg cgaccgtgtg cggcccgaaa aaaagcacca acctggtgaa aaacaaatgc 1620
gtgaacttta actttaacgg cctgaccggc accggcgtgc tgaccgaaag caacaaaaaa 1680
tttctgccgt ttcagcagtt tggccgcgat attgcggata ccaccgatgc ggtgcgcgat 1740
ccgcagaccc tggaaattct ggatattacc ccgtgcagct ttggcggcgt gagcgtgatt 1800
accccgggca ccaacaccag caaccaggtg gcggtgctgt atcagggcgt gaactgcacc 1860
gaagtgccgg tggcgattca tgcggatcag ctgaccccga cctggcgcgt gtatagcacc 1920
ggcagcaacg tgtttcagac ccgcgcgggc tgcctgattg gcgcggaaca tgtgaacaac 1980
agctatgaat gcgatattcc gattggcgcg ggcatttgcg cgagctatca gacccagacc 2040
aacagcccgc gccgcgcgcg cagcgtggcg agccagagca ttattgcgta taccatgagc 2100
ctgggcgcgg aaaacagcgt ggcgtatagc aacaacagca ttgcgattcc gaccaacttt 2160
accattagcg tgaccaccga aattctgccg gtgagcatga ccaaaaccag cgtggattgc 2220
accatgtata tttgcggcga tagcaccgaa tgcagcaacc tgctgctgca gtatggcagc 2280
ttttgcaccc agctgaaccg cgcgctgacc ggcattgcgg tggaacagga taaaaacacc 2340
caggaagtgt ttgcgcaggt gaaacagatt tataaaaccc cgccgattaa agattttggc 2400
ggctttaact ttagccagat tctgccggat ccgagcaaac cgagcaaacg cagctttatt 2460
gaagatctgc tgtttaacaa agtgaccctg gcggatgcgg gctttattaa acagtatggc 2520
gattgcctgg gcgatattgc ggcgcgcgat ctgatttgcg cgcagaaatt taacggcctg 2580
aacgtgctgc cgccgctgct gaccgatgaa atgattgcgc agtataccag cgcgctgctg 2640
gcgggcacca ttaccagcgg ctggaccttt ggcgcgggcg cggcgctgca gattccgttt 2700
gcgatgcaga tggcgtatcg ctttaacggc attggcgtga cccagaacgt gctgtatgaa 2760
aaccagaaac tgattgcgaa ccagtttaac agcgcgattg gcaaaattca ggatagcctg 2820
agcagcaccg cgagcgcgct gggcaaactg caggatgtgg tgaaccagaa cgcgcaggcg 2880
ctgaacaccc tggtgaaaca gctgagcagc aactttggcg cgattagcag cgtgctgaac 2940
gatattctga gccgcctgga tccgccggaa gcggaagtgc agattgatcg cctgattacc 3000
ggccgcctgc agagcctgca gacctatgtg acccagcagc tgattcgcgc ggcggaaatt 3060
cgcgcgagcg cgaacctggc ggcgaccaaa atgagcgaat gcgtgctggg ccagagcaaa 3120
cgcgtggatt tttgcggcaa aggctatcat ctgatgagct ttccgcagag cgcgccgcat 3180
ggcgtggtgt ttctgcatgt gacctatgtg ccggcgcagg aaaaaaactt taccaccgcg 3240
ccggcgattt gccatgatgg caaagcgcat tttccgcgcg aaggcgtgtt tgtgagcaac 3300
ggcacccatt ggtttgtgac ccagcgcaac ttttatgaac cgcagattat taccaccgat 3360
aacacctttg tgagcggcaa ctgcgatgtg gtgattggca ttgtgaacaa caccgtgtat 3420
gatccgctgc agccggaact ggatagcttt aaagaagaac tggataaata ttttaaaaac 3480
cataccagcc cggatgtgga tctgggcgat attagcggca ttaacgcgag cgtggtgaac 3540
attcagaaag aaattgatcg cctgaacgaa gtggcgaaaa acctgaacga aagcctgatt 3600
gatctgcagg aactgggcaa atatgaacag tatattaaat ggccgtggta tatttggctg 3660
ggctttattg cgggcctgat tgcgattgtg atggtgacca ttatgctgtg ctgcatgacc 3720
agctgctgca gctgcctgaa aggctgctgc agctgcggca gctgctgcaa atttgatgaa 3780
gatgatagcg aaccggtgct gaaaggcgtg aaactgcatt atacctaa 3828

Claims (8)

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括（a）-（b）至少一种：
（a）重组表达载体，包括权利要求1所述的DNA分子；
（b）宿主细胞，包括权利要求1所述的DNA分子或（a）所述的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组表达载体为真核表达载体，所述真核表达载体的载体骨架为pVAX1。
4.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的生物材料在如下（A）或（B）中的应用：
（A）制备预防SARS-COV-2病毒感染的疫苗；
（B）制备预防SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的药物；
所述SARS-COV-2病毒选自C.37 突变株、野生株。
5.一种DNA疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的DNA分子或者权利要求2或3中所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂；
和/或，至少一种对SARS-COV-2病毒有治疗作用的药物。
7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于，所述佐剂包括TLRs配体和/或金属离子和/或细胞因子佐剂。
8.权利要求5-7任一项所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，将包括权利要求1所述的DNA分子的重组载体导入宿主细胞并进行培养，提取宿主细胞中的重组载体，得到DNA疫苗。
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