CN117442712A - 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117442712A
CN117442712A CN202210874878.2A CN202210874878A CN117442712A CN 117442712 A CN117442712 A CN 117442712A CN 202210874878 A CN202210874878 A CN 202210874878A CN 117442712 A CN117442712 A CN 117442712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coronavirus
antigen
dna vaccine
seq
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210874878.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵干
张志宇
侯佳望
丁媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Advaccine Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Advaccine Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advaccine Suzhou Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Advaccine Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202210874878.2A priority Critical patent/CN117442712A/zh
Publication of CN117442712A publication Critical patent/CN117442712A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于实现冠状病毒初免‑加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用，涉及疫苗技术领域。该试剂盒包含分别独立包装的初免试剂和加强免疫试剂，初免试剂和加强免疫试剂分别独立选自新型冠状病毒DNA疫苗和冠状病毒重组DNA疫苗，且为不同成分的DNA疫苗。新型冠状病毒DNA疫苗含有编码新冠SARS‑CoV‑2野生型病毒刺突蛋白抗原的核酸片段，冠状病毒重组DNA疫苗含有编码SARS‑CoV‑1和新冠SARS‑CoV‑2Beta突变株病毒刺突蛋白受体结合区的核酸片段。该试剂盒能够实现新型冠状病毒DNA疫苗和冠状病毒重组DNA疫苗的联合免疫方案，缓解了单一成分的新冠疫苗针对突变株免疫原性不足、不能同时激发强的细胞免疫及体液免疫的技术问题。

Description

用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)，包括α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒四个属，现阶段流行的新型冠状病毒(Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)属于β属的冠状病毒，主要经呼吸道飞沫传播，也可通过接触传播引起肺炎(Novel Coronavirus-infected Pneumonia，NCP),人群普遍易感。2019年12月以来，SARS-CoV-2已在世界各地相继发生大规模爆发，该疫情已造成难以估量的社会压力和经济负担。2020年1月30日，世界卫生组织已宣布本次疫情定义为“国际关注的突发公共卫生事件”(Public Health Emergency of International Concern,PHEIC)，至今为止由于各种变异株病毒的出现，使得这种公共卫生危害还不断在延续弥漫。
目前世界卫生组织在新冠病毒突变株的分级中，主要分为两类，一类是令人担忧的突变株(Variant of concern,VOC),另一类是值得关注的突变株(Variant ofinterest,VOI)。截止到目前已有的5个VOC突变株，分别为阿尔法(Alpha，编号B.1.1.7)、贝塔(Beta，编号B.1.351)、伽马(Gamma，编号P.1)、德尔塔(Delta，编号B.1.617.2)以及奥密克戎(Omicron，编号B.1.1.529)变异株；8个VOI突变株分别为伊普西龙(Epsilon，编号B.1.427/429)、泽塔(Zeta，编号P.2)、西塔(Theta，编号P.3)、艾塔(Eta，编号B.1.525)、约塔(Iota，编号B.1.526)、卡帕(Kappa，编号B.1.617.1)、拉姆达(Lambda，编号C.37)以及缪(Mu，编号B.1.621)。尤其是近期爆发的Omicron变异株由于在主要保护性抗原Spike区段发生了30余处突变，在受体结合域(RBD)有15个突变位点，其中11个在受体结合基序(RBM)区域，包括之前在Beta以及Gamma突变株中出现的三处突变：417，484以及501，其中N501Y在Alpha突变株中也存在。目前的研究发现，大部分RBD抗体结合在RBM区域，在RBM区域发生突变时，结合在这些区域的抗体很容易受到影响而发生逃逸。值得一提的是，另外4个不在RBM区域的突变位点分布在S单体的相互作用界面，可能会影响三聚体的稳定性。另外，15个突变中，9个位点在SARS-CoV-2S与SARS-CoV-1S之间不保守，突变还是大部分发生在不保守区。同时氨基末端域(NTD)的突变位点集中在四处：A67V/Del69-70；T95I；G142D/Del143-145；Del211/L212I，这四处在结构上集中在NTD表面，也是新冠NTD抗体常见的识别位点；因此这些位点同时突变，也会影响NTD抗体的亲和力和中和活性。基于现有对突变位点的了解，该变异株突破了大部分中和抗体的保护，部分前期数据表明该变异株使得新冠疫苗的中和抗体比野生型降低了约40倍，基于各种频出变异株，开发“以不变应万变”的广谱疫苗以及合适的免疫策略是应对变异株频出的有效手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒，以缓解目前单一成分的新冠疫苗针对突变株免疫原性不足、不能同时激发较强的细胞免疫及体液免疫的技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒，包含独立包装的初免试剂和独立包装的加强免疫试剂；
所述初免试剂为新型冠状病毒DNA疫苗，且所述加强免疫试剂为冠状病毒重组DNA疫苗；或，所述初免试剂为冠状病毒重组DNA疫苗，且所述加强免疫试剂为新型冠状病毒DNA疫苗；
所述冠状病毒重组DNA疫苗含有第一抗原；所述新型冠状病毒DNA疫苗含有编码第二抗原的DNA片段；
所述第一抗原和所述第二抗原分别独立的为冠状病毒重组抗原和新型冠状病毒抗原；或其抗原表位。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括：
(a)制备冠状病毒重组DNA疫苗并独立包装；
(b)制备新型冠状病毒DNA疫苗并独立包装；
(c)将分别独立包装的冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗分别独立的标识为初免试剂或加强免疫试剂，组装成试剂盒。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒在制备预防和/或治疗冠状病毒感染和/或冠状病毒感染引发的疾病SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2的药物或产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2感染和/或SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2感染引发的疾病的方法，该方法包括向受试者施用上述用于实现冠状病毒初免-加强免疫的和/或试剂盒中的疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒包含独立包装的初免试剂和独立包装的加强免疫试剂。该试剂盒使用时，初免试剂用于初免，加强免疫试剂用于加强免疫。初免试剂和加强免疫试剂分别独立的选自冠状病毒重组DNA疫苗或者新型冠状病毒DNA疫苗，且初免试剂和加强免疫试剂所使用的DNA疫苗成分不同，能够实现冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗的联合免疫方案。
本发明提供的试剂盒中新型冠状病毒DNA疫苗含有编码新冠SARS-CoV-2野生型病毒刺突蛋白抗原的核酸片段，冠状病毒重组DNA疫苗含有编码SARS-CoV-1和新冠SARS-CoV-2Beta突变株病毒刺突蛋白受体结合区的核酸片段。冠状病毒重组DNA疫苗采取亲缘关系较远的SARS-CoV-1和SARS-CoV-2双抗原设计，尽可能地使针对β-冠状病毒属的保守抗原表位得到免疫效果的放大，从而避免SARS-CoV-2亲缘内的不断突变带来的抗原漂变，从而实现“以不变应万变”的广谱免疫效果。新型冠状病毒DNA疫苗和冠状病毒重组DNA疫苗作为初免试剂或加强免疫试剂，使得免疫效果进一步放大，免疫效果更优。
本发明提供的试剂盒采用初免-加强免疫策略，能够激发出更为高效的免疫反应，能够克服现有单一成分疫苗的不足，从而更好地发挥冠状病毒疫苗的免疫效果。经本发明实验证实，这种不同成分的初免-加强免疫策略高于单个成分的初免-加强的免疫策略。不同成分的初免-加强免疫策略对靶抗原的免疫反应具有加强协同作用，这种协同作用表现在活化的抗原特异性的细胞毒性T细胞、加强的细胞免疫和体液免疫，以及较为广谱的免疫反应。尤其是广谱的细胞免疫应答水平。因此本发明提供的用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒诱发的保护性免疫应答要优于单独施用单个成分所诱发的免疫应答，能够提供针对SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2病毒突变株的保护作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的DNA序列密码子优化指数评分结果图；
图2为本发明实施例1提供的DNA序列优化后的GC含量评分结果图；
图3为本发明实施例1提供的DNA序列优化后的负调控元件数量评分结果图；
图4为本发明实施例1提供的DNA序列优化后的qPCR转录倍数结果图；
图5为本发明实施例1提供的结合蛋白结构解析图；
图6为本发明实施例3提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗qPCR转录结果；
图7为本发明实施例4提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗Western Blot检测抗原蛋白表达结果；
图8为本发明实施例提供5的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗ELISA法检测分泌性抗原蛋白结果；
图9为本发明实施例6提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗初次免疫后第14天抗原特异性抗体结果；
图10为本发明实施例6提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗加强免疫后第7天抗原特异性抗体结果；
图11为本发明实施例6提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗加强免疫后第10天抗原特异性IFN-γELISpot结果；
图12为本发明实施例6提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗加强免疫后第10天抗原特异性ELISpot结果直观图；
图13为本发明实施例6提供的冠状病毒重组DNA疫苗、新型冠状病毒DNA疫苗加强免疫后第10天抗原特异性体内CTL结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒，该试剂盒包含独立包装的初免试剂和独立包装的加强免疫试剂。该试剂盒使用时，初免试剂用于初免，加强免疫试剂用于加强免疫，初免试剂和加强免疫试剂所使用的DNA疫苗成分不同，并按照如下(A)或(B)的方式设置：
(A)初免试剂为冠状病毒重组DNA疫苗，加强免疫试剂为新型冠状病毒DNA疫苗；
(B)初免试剂为新型冠状病毒DNA疫苗，加强免疫试剂为冠状病毒重组DNA疫苗。
其中，冠状病毒重组DNA疫苗含有第一抗原；新型冠状病毒DNA疫苗含有编码第二抗原的DNA片段；第一抗原和所述第二抗原分别独立的为冠状病毒重组抗原和新型冠状病毒抗原；或其抗原表位。
在一些可选的实施方式中，所述冠状病毒重组抗原或新型冠状病毒抗原或其抗原表位的氨基酸序列部分或全部来源于冠状病毒或冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区。
在一些可选的实施方式中，所述第一抗原的氨基酸序列含有SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2中的一种或多种的组合。
在一些优选的实施方式中，所述第一抗原的氨基酸序列含有由SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的氨基酸序列直接串联得到的序列；或，含有由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列直接串联得到的序列。
相应的，第二抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
在一些可选的实施方式中，所述编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
在一些可选的实施方式中，所述编码第一抗原的DNA片段的核苷酸序列含有由SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列直接串联得到的序列，或含有由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列直接串联得到的序列。
在一些优选的实施方式中，编码所述第一抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，或者与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少70％一致性；
在一些可选的实施方式中，所述编码第二抗原的DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，或者与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少70％一致性。
在一些可选的实施方式中，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗包含质粒，所述质粒由表达载体，和插入所述表达载体的外源序列部分组成，所述外源序列部分含有编码第一抗原的DNA片段或第二抗原的DNA片段。所述外源序列还可选地包括其他本领域可接受的用于编码功能元件的序列，例如可以为但不限于为用于编码启动子、增强子、标记基因和疫苗佐剂等的核酸片段。
在一些可选的实施方式中，所述表达载体包括真核表达载体，所述真核表达载体优选为pVAX1载体。
在一些可选的实施方式中，所述质粒溶于缓冲液中，所述缓冲液优选为SSC缓冲液。
在一个优选的实施方式中，试剂盒中的冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗如下：冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗含有质粒，所述质粒由pVAX1载体和插入所述表达载体的外源序列部分组成，所述外源序列部分含有核苷酸序列如SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.7所示的所述编码第一抗原的DNA片段或第二抗原的DNA片段。
本发明提供的试剂盒中独立包装的初免试剂和独立包装的加强免疫试剂的包装，可采用本领域可接受的任何用于贮存DNA疫苗的容器，本发明对此不做限制，具体的实例例如可以为但不限于为安瓿瓶或西林瓶。
在一些可选的实施方式中，所述初免试剂和所述加强免疫试剂分别独立的为针剂，或所述初免试剂和所述加强免疫试剂分别独立的为贴剂。
在一些可选的实施方式中，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗中DNA的含量为0.1～10mg，例如可以为但不限于为0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg。
在一些可选的实施方式中，所述初免试剂和所述加强免疫试剂的数量比为1～2：1～2，例如可以为但不限于为1:1、1:2或2:2。
以针剂为例，具体的施用/接种方式例如可以为但不限于为：向受试者施用/接种1针剂初免试剂，然后向受试者施用/接种1针剂加强免疫试剂；或，向受试者施用/接种2针剂初免试剂，然后向受试者施用/接种1针剂加强免疫试剂；或，向受试者施用/接种2针剂初免试剂，然后向受试者施用/接种2针剂加强免疫试剂。
在一些可选的实施方式中，初免试剂和加强免疫试剂每次施用/接种的间隔时间可选地为7-180天，优选14-90天，更优选28-60天。
在一些可选的实施方式中，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗还包含药学上可接受的赋形剂；所述药学上可接受的赋形剂包括载体、稀释剂、助悬剂、转染促进剂、佐剂和编码佐剂的核苷酸中的一种或几种。
在一些可选的实施方式中，所述佐剂例如可以为但不限于为铝佐剂、TLR配体类佐剂、细胞因子类佐剂中的一种或多种，优选为铝佐剂。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还包括疫苗递送装置，以实现将冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗分别独立的接种或施用于受试者，所述递送装置可直接作为初免试剂或加强免疫试剂的包装，例如注射装置，将冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗分别独立的预包装于注射装置中以实现在接种时直接注射，简化操作的目的；或者所述递送装置可独立于初免试剂或加强免疫试剂，例如将注射装置独立的预包装于试剂盒中。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA疫苗递送装置，所述DNA疫苗递送装置优选为电脉冲装置。
在一些可选的实施方式中，所述电脉冲装置工作时由两组具有0.2Amp恒定电流的脉冲组成；第二脉冲组被延迟3秒；在每个组中，有两个52ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198ms。
本发明提供的用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒能够实现冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗的联合免疫方案。本发明初免试剂和加强免疫试剂采用不同成分的DNA疫苗，其目的是实现不同成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略，本发明实验证实了不同成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略所产生的免疫原性高于单一成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略。不同成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略对靶抗原的免疫反应具有加强协同作用，这种协同作用表现在活化的抗原特异性的细胞毒性T细胞、加强的细胞免疫和体液免疫，以及较为广谱的免疫反应。相比于接种/施用单一成分疫苗，不同成分初免-加强免疫策略能够激发出更为高效地免疫反应，能够克服现有单一成分疫苗的不足，从而更好地发挥冠状病毒疫苗的免疫效果，该试剂盒诱发的保护性免疫应答要优于单独施用单个成分所诱发的免疫应答，能够提供针对SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2病毒突变株的保护作用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述新型冠状病毒疫苗试剂盒的制备方法，包括：
(a)制备冠状病毒重组DNA疫苗并独立包装；
(b)制备新型冠状病毒DNA疫苗并独立包装；
(c)将分别独立包装的冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗分别独立的标识为初免试剂或加强免疫试剂，组装成试剂盒。
在一些可选的实施方式中，步骤(a)或(b)包括制备质粒，所述制备质粒包括将所述编码第一抗原的DNA片段或编码第二抗原的DNA片段插入表达载体中；表达载体优选包括真核表达载体，更优选包括pVAX1载体。
在一些可选的实施方式中，步骤(a)或(b)包括将编码所述第一抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到所述第一抗原或第二抗原。
在一些可选的实施方式中，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一些可选的实施方式中，编码所述第一抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些可选的实施方式中，编码所述第二抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些可选的实施方式中，步骤(a)或(b)还包括将所述第一抗原或第二抗原吸附于佐剂。
在一些可选的实施方式中，所述表达系统的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，其中哺乳动物细胞可选地包括293T细胞或CHO细胞；细菌细胞可选地包括大肠杆菌细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒在制备预防和/或治疗冠状病毒感染和/或冠状病毒感染引发的疾病SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2的药物或产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2感染引发的疾病的方法，该方法包括向受试者施用上述用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒中的疫苗。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1：编码S蛋白RBD区蛋白的核酸优化筛选
为了增加靶蛋白在宿主细胞中的蛋白表达，需要对靶基因的核酸序列进行优化，核酸序列优化一般原理为：(1)根据宿主细胞对于核酸密码子的偏好性对简并密码子进行优化，使优化后的序列含有更多利于宿主细胞识别的核酸密码子；(2)在密码子偏好优化的基础上进一步优化核酸序列中的GC含量，使GC含量优化后的序列能够表达出更多的靶蛋白；(3)优化核酸序列使其能够转录出更加稳定的mRNA，利于靶蛋白的翻译；(4)改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI指数(密码子适应指数)。本发明通过对冠状病毒重组DNA疫苗，即编码的SARS-CoV-1S蛋白RBD区的核苷酸序列和编码新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列进行优化，调整其中核苷酸序列中的GC含量；同时改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI(密码子适应指数)指数；减少形成RNA二级结构自由能，减少NegativeCIS元件比例，降低序列中重复序列比例，此外进行信号肽的优化，并结合发明人该领域多年的经验形成的本公司特有的算法，从而能够进一步提高其表达量，得到优化后的核苷酸序列，并将其制成核酸疫苗。
优化过程：选取优化前野生SARS-CoV-1S蛋白RBD区的核苷酸序列(AY278488，GenBank)根据本发明的优化策略进行优化得到如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，以及选取优化前野生新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列(EPI_ISL_860630，GISAID)根据本发明的优化策略进行优化得到如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，将SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4直接串联后，并在SEQ ID NO.3的前端N端加上如SEQ ID No.8所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ ID NO.4的末尾C端加上TGATAA终止密码子，最终得到如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，而采用常规商业化数据库(Integrated DNA Technologies,IDT)优化策略最终得到SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。对本发明中优化前野生序列、优化后SEQ ID NO.5以及常规商业化优化得到的SEQ ID NO.10的核苷酸序列进行评分；在DNA序列优化增加表达方面，优化效果与DNA优化的关键指标如：密码子优化指数成正相关，GC含量成正相关，与负调控元件的数量成负相关。如图1～图3所示，发现本发明采用的优化策略在关键指标上与常规商业化优化策略相比有着明显的提升，可以预示本发明采用的优化策略能够增加优化基因的表达效率。
将上述优化前野生序列、本发明优化后SEQ ID NO.5以及常规商业化数据库得到的SEQ ID NO.10的3个核苷酸序列分别转化构建入pVAX1载体(ThermoFisher，货号：V26020)中，得到3种质粒DNA:pSARS-Beta Dimer-野生、pSARS-Beta Dimer和pSARS-BetaDimer-常规优化。将3种质粒分别转染至HEK293T细胞株48h后提取RNA，采用qPCR的方法鉴定不同优化方式得到的质粒DNA的转录水平。结果如图4所示，本发明优化后的DNA序列在RNA转录水平相比于优化前野生序列可以增加100多倍，而且在RNA转录水平相比于商业化数据库常规优化的分子可以增加2倍多，进一步的说明本发明的优化得到的核酸分子优于常规商业化数据库得到的分子。DNA疫苗转录水平的提高可以使得蛋白表达量得到提高，从而提高DNA疫苗的免疫效果，本发明设计获得的序列在转录水平取得了非常显著的提高，其蛋白表达量也得到显著的改善，从而获得显著的更优的免疫效果。
在设计优化核苷酸序列时，首先考虑的是采用β属的冠状病毒来进行核酸序列的串联设计，β属的冠状病毒包括严重呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，由于MERS-CoV感染宿主时的结合受体为CD26(DPP4)，而SARS-CoV-1和SARS-CoV-2结合受体为ACE2，从病毒学、免疫学预测受体结构差异较大时，预期对新型冠状病毒的免疫效果较弱，因此采用的是SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的S蛋白的RBD串联设计，还考虑到不同蛋白结构域串联策略会影响抗原结构域的暴露程度，而抗原结构域暴露程度越充分，则其激发的相应抗体反应谱会更完整，免疫效果会更优。因此，我们对SARS-CoV-1S蛋白RBD区(SARS RBD)与新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD区(Beta RBD)的串联顺序通过人工智能结合蛋白结构解析等生物信息学手段进行了分析；如图5所示，分析结果表明SARS-Beta RBD的串联顺序(A图)相较于Beta-SARS RBD(B图)的串联顺序使得SARS RBD和Beta RBD两个抗原结构域相互远离，且相应结构域能够充分暴露出来，因此也表明本发明中SARS-Beta RBD的串联策略具有更优的免疫效果。
实施例2：DNA疫苗的构建过程
1.冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗的制备方法
1.1.质粒的构建
冠状病毒重组DNA疫苗：设计编码SARS-CoV-1S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于AY278488，GenBank)如SEQ ID NO.3所示，和编码新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于EPI_ISL_860630，GISAID)如SEQ ID NO.4所示。将SEQ ID NO.3和SEQID NO.4直接串联后，并在SEQ ID NO.3的前端N端加上如SEQ ID NO.8所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ ID NO.4的末尾C端加上TGATAA终止密码子，最终得到如SEQ IDNO.5所示核苷酸序列，将SEQ ID NO.5插入pVAX1载体的BamH I与Xho I位点间，得到重组表达质粒pSARS-Beta Dimer。
新型冠状病毒DNA疫苗：根据新冠SARS-CoV-2野生型序列(MN908947.3，NCBI)，优化获得SEQ ID NO.7所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BamH I与Xho I位点间，得到新型冠状病毒野生株质粒(pWT)。pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前已进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。
1.2.DNA疫苗序列转化
从-80℃冰箱中取100μl DH10B感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒DNA溶液(体积不超过10μl)轻轻摇匀，冰上放置30min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5min。向管中加入0.9ml的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml含有50mg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。
1.3.DNA疫苗质粒提取
将上述菌液按照1:1000加入到200～400ml含有卡那霉素(50mg/mL母液，1:1000使用)的LB选择培养基中，37℃200rpm培养12～16h。用EndoFreen Plasmid Maxi kit(QIAGEN，德国)进行质粒提取：将上述培养12～16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml P1 Buffer重悬菌液后加入10ml P2 Buffer轻轻颠倒4～6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml P3 Buffer，轻轻颠倒4～6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml ER Buffer，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10ml QBT Buffer平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml QC Buffer洗涤2次，再用15ml QN Buffer进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70％乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500μl无内毒素水进行重悬质粒，得到用于制备DNA疫苗的重组表达质粒。
实施例3：DNA疫苗哺乳动物细胞转录鉴定
为了验证实施例2构建的质粒在哺乳动物细胞内是否能够有效转录，通过DNA体外转染、提取RNA、qPCR的方法进行鉴定。
1.DNA疫苗体外转染
从液氮中取出冻存的HEK293T细胞株，37℃水浴后1000rpm离心5分钟除去DMSO。加入无血清的DMEM培养液洗涤一次，于含10％小牛血清的DMEM培养液5ml中，37℃，5％CO2培养2-3代备用。37℃胰酶(含0.25％的EDTA)消化细胞1min并用完全培养基终止后，以2-4×106细胞/孔的密度平铺于60mm培养皿，加5ml生长培养基(不含1％双抗)于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
将4μg pSARS-Beta Dimer和4μg pWT两种无菌质粒分别加入至500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，同时将24μl的阳离子脂质体(上海翌圣，40802ES03)于500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min，将上述两种质粒分别和脂质体1:1混合，室温放置20min，得到质粒DNA/脂质体复合物。
将上述质粒DNA/脂质体复合物按1ml/皿加入至上述培养24h的60mm培养皿中，于37℃，5％CO2培养箱分别孵育至48小时进行后续实验。
2.转染后RNA提取
消化收集上述分别转染至48小时的细胞，用1ml完全培养基重悬后，吸取100μl用于RNA提取，剩余重悬液进行后续WB样品制备。
将吸取的100μl细胞悬液4000rpm离心5分钟，弃上清，每样加入350μl TRK LysisSolution(含20％的β-巯基乙醇)进行裂解。每样再加入350μl的70％的乙醇(使用DEPC水配制)进行终止裂解，用枪吹打混匀。
将上述混合液转移至HiBind RNAColumn柱内，10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl Wash Buffer I,10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl Wash BufferII洗涤2次，每次均用10000g离心1min，弃滤液。将离心机转速调整至最高转速(17000g)离心2min以使柱内的乙醇挥发。将柱子转移至干净的无DNA和RNA酶的1.5ml离心管中，室温放置3-5min，彻底挥发乙醇后，每样加入50μl的RNase-Free Water，室温孵育5min,17000g离心1min。将滤液吸出再次加入到柱子中，室温孵育5min,17000g离心1min收集RNA，-80℃保存。
3.RNA反转录、qPCR反应
使用酶标仪定量RNA浓度(使用OD260/280进行读值)，根据所需PCR数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)配置溶液，每样先配置10μl反应体系(2μl 5×gDNAdigester Buffer、1μl gDNA digester、100ng的RNA，用RNase free ddH2O将体积调至10μl)，用枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。向每样中加入10μl 2×Hifair II SuperMix plus，用枪轻轻吹打混匀后，按照25℃5min，42℃30min，85℃5min进行孵育。收取的cDNA放于-20℃备用。
将反转录得到的cDNA产物按照qPCR试剂盒进行反应。反应体系如下：qPCRSYBR Green Master Mix(No Rox)10μl，目的正、反向引物各0.4μl，cDNA模板1μl，无菌超纯水补足总体积为20μl。PCR反应条件：95℃、5min，95℃、10s，56℃、30s，72℃、30s共40个循环。目的基因的表达水平与内参相比后采用2-△△C方法计算。
结论：如图6所示，新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT和冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer在体外转染48小时后较空载体(pVAX1)均能高水平地促使抗原RNA的转录，且冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer组RNA的转录水平明显高于pWT组。
实施例4：DNA疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定
为了进一步验证实施例2构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，利用Western Blot方法进行鉴定。
1.蛋白提取
将质粒pSARS-Beta Dimer、pWT分别转染到HEK293T细胞株中，转染48小时后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入150μl裂解液(使用前按1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂)混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5分钟。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出50μl上清液，加入12.5μl 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。
2.样品上样及SDS-PAGE电泳
将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5μl于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压200V，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1×转膜平衡液中1min。
3.转膜
以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1×TBST+5％脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液(S-ECD/RBD monoclonalantibody(1),1:2000稀释加有1ug/ml XG014 antibody)反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中(BD Pharmingen HRP Conjugated Anti human IgG，1:5000稀释)反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3ml和B液3ml以1：1比例混合后加入到PVDF膜孵育1-2min，拍照。
结论：如图7所示，新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT和冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer在体外转染48小时后与空载体(pVAX1)相比能够在细胞内表达抗原蛋白,且从图可以看出pSARS-Beta Dimer组在本次实验中检测出来的信号较弱，根据以往实验经验，我们认为野生株pWT在转染48小时后表达的抗原蛋白存在于胞内，因此更容易检测到，而pSARS-Beta Dimer在转染48小时后表达的抗原由于大部分已经分泌到胞外而检测出来较弱，因此收集转染后的细胞上清液，开展了实施例5的实验验证。
实施例5：DNA疫苗体外抗原蛋白表达验证
将质粒pSARS-Beta Dimer、pWT分别转染到HEK293T细胞株中，转染48小时后，收集上清，定量ELISA法检测上清中分泌的抗原蛋白。
将MonoRabTM SARS-CoV-2Neutralizing Antibody(BS-R2B2),mAb,Rabbit用包被缓冲液稀释成0.5ug/ml,按100ul/孔，加入到ELISA板中，用封板膜覆盖后，2-8℃孵育过夜。1×PBST洗涤3次。使用5％BSA(溶于PBST)作为封闭液，按100ul/孔，加样完毕后，用封板膜覆盖后，37℃孵育1h。1×PBST洗涤3次。将标曲抗原RBD(N501Y)蛋白用3％BSA稀释至100ng/ml后，进行3倍梯度稀释，共设置7个稀释梯度，另外设置1个“0”孔。样品抗原(培养基上清)共设置4个梯度：原液、10倍稀释、100倍稀释及1000倍。将所有抗原按照100ul/孔加入板内后，用封板膜覆盖后，37℃孵育1h。1×PBST洗涤5次。将S-ECD/RBD monoclonal antibody(2)用3％BSA按照1:80000稀释后，按照100ul/孔加入板内后，用封板膜覆盖后，37℃孵育1h。1×PBST洗涤5次，250ul/孔，拍干孔内剩余液体。将HRP Conjugated Anti-Human IgG用3％BSA按照1:5000稀释后，按照100ul/孔加入板内后，用封板膜覆盖后，37℃孵育1h。1×PBST洗涤5次。TMB两组分按照1:1混合后，按照100ul/孔，室温避光孵育10min。取2M H2SO4，按50ul/孔进行终止。将ELISA按照规定放置于酶标仪内，检测OD450和OD620处双波长的光吸收值。
结论：结果如图8所示，冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer和新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT均能表达抗原蛋白，且pSARS-Beta Dimer组明显高于pWT组，进一步验证了实施例4我们认为的pSARS-Beta Dimer组在转染48小时后表达的抗原蛋白大部分已经分泌到胞外，通过实施例5的ELISA法可以检测到其高水平表达；上述实验进一步说明了冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer组和新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT均能高水平的表达抗原蛋白。
实施例6：冠状病毒重组DNA疫苗联合新型冠状病毒野生株DNA疫苗不同初免-加强免疫策略体内免疫原性验证
为了评估实施例2制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，无特定病原体的6周龄C57BL/6雌性小鼠购于上海斯莱克公司，并将其保存在艾棣维欣Advaccine实验室(苏州)的动物设施中。对于DNA疫苗的免疫：将实施例1所述DNA疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲(EP)。电脉冲(EP)装置由两组具有0.2Amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫(加强免疫)。实验分组及免疫策略：(1)用载体质粒pVAX1免疫小鼠，免疫两次，间隔14天，每次10μg，两次免疫后表示为pVAX1/pVAX1组；(2)用新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT免疫小鼠，免疫两次，间隔14天，每次10μg，两次免疫后表示为pWT/pWT组；(3)用本发明中冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer免疫小鼠，免疫两次，间隔14天，每次10μg，两次免疫后表示为pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组；(4)用新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT进行初免，第14天用冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer进行第二次免疫，每次疫苗用量均为10μg，两次免疫后表示为pWT/pSARS-Beta Dimer组；(5)用冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer进行初免，第14天用新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT进行第二次免疫，每次疫苗用量均为10μg，两次免疫后表示为pSARS-Beta Dimer/pWT组；第14，21天采集小鼠血液，用ELISA法测定血清的特异性抗体滴度。在加强免疫后第10天，牺牲免疫小鼠，以分析细胞免疫反应。
1.评估DNA疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答
1.1.ELISA检测抗体浓度
初次免疫后14天和加强免疫后7天，使用基于ELISA方法评估针对SARS-CoV-2野生株(WT)RBD蛋白结合抗体、SARS-CoV-2Delta突变株RBD蛋白结合抗体、SARS-CoV-2Beta突变株RBD蛋白结合抗体和SARS-CoV-1RBD蛋白结合抗体。将Nunc 96孔ELISA平板在4℃下分别用1μg/mL SARS-CoV-2野生株RBD蛋白、1μg/mL SARS-CoV-2Delta突变株RBD蛋白、1μg/mLSARS-CoV-2Beta突变株RBD蛋白和1μg/mL SARS-CoV-1RBD蛋白(Acro Biosystems，DE，美国)包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(含0.05％Tween 20，即PBST缓冲液)37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37℃下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37℃加入1：8000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript，NJ，CN)孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用TMB底物使板显影，并用50μl/孔2M H2SO4终止反应。在450nm和620nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍(判定标准：实验组：对照组(阴性)OD450-620值≧2.1，判定该OD值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度)。
结论：初次免疫后14天抗体检测结果如图9所示，冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer和新型冠状病毒野生株DNA疫苗pWT初次免疫后第14天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。且上述ELISA试验中，分别采用SARS-CoV-2野生株(WT)RBD蛋白、SARS-CoV-2Delta突变株RBD蛋白作为体外包被抗原，从结果图可以看出，新冠野生株候选DNA疫苗pWT不仅可以产生针对野生型抗原的抗体，还能产生针对Delta突变株抗原的抗体，然而本发明中提供的pSARS-Beta Dimer DNA疫苗也取得了显著的技术效果，且比新冠野生株候选DNA疫苗pWT更优，如前所述，pWT是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而更说明了本发明中pSARS-Beta Dimer DNA疫苗具有更优的免疫原性和广谱性。
加强免疫后7天抗体检测结果如图10所示，pWT/pWT组、pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组加强免疫后7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。且上述ELISA试验中，分别采用SARS-CoV-2野生株(WT)RBD蛋白、SARS-CoV-2Delta突变株RBD蛋白、SARS-CoV-2Beta突变株RBD蛋白和SARS-CoV-1RBD蛋白作为体外包被抗原，从结果图可以看出，免疫策略为pWT/pWT组不仅可以产生针对新冠野生型抗原的抗体，还能产生针对Delta突变株抗原、Beta突变株抗原以及SARS-CoV-1抗原的抗体，然而初免-加强免疫策略为pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组也取得了相当的显著的技术效果，且针对新冠Beta突变株抗原和SARS-CoV-1抗原，本发明中提供的初免-加强免疫策略为pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-BetaDimer/pWT组比pWT/pWT组更优，如前所述，pWT是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而进一步更说明了本发明中提供的pSARS-Beta Dimer DNA疫苗以及免疫策略具有更优的免疫原性和广谱性。
2.进一步评估DNA疫苗引发的抗原特异性细胞应答
2.1IFN-γELISpot实验
我们通过ELISpot分析，研究DNA疫苗是否可以促进细胞免疫。在加强免疫后10天分离脾细胞，进行IFN-γELISpot实验。
在加强免疫后第10天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。通过使用小鼠IFN-γELISpot试剂盒(达科为，CN)进行IFN-γ测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO2培养箱中用SARS-CoV-2RBD肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/mL(终浓度)(溶于RPMI+10％FBS)。根据产品说明书进行操作。培养基和PMA/Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader(AID，德国Straβberg)进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位(SFU)。
结论：IFN-γELISpot结果如图11，图12所示，pWT/pWT组、pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组加强免疫后第10天均能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应。上述ELIspot试验中，采用新冠野生型SARS-CoV-2RBD蛋白作为体外刺激肽，从结果图可以看出，上述条件对免疫策略为pWT/pWT组有利，然而本发明提供的初免-加强免疫策略为pSARS-Beta Dimer/pSARS-BetaDimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组也取得了相当的显著的技术效果，甚至更优，且pSARS-Beta Dimer/pWT组为最优组，如前所述，pWT是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而进一步更说明了本发明中提供的pSARS-BetaDimer DNA疫苗以及免疫策略具有更优的免疫原性和广谱性，特别是针对细胞免疫反应。
2.2免疫细胞特异性刺激检测体内CTL反应
由于CTL反应在抵抗病毒感染和消除病毒感染细胞方面起着关键作用，为了探索实施例2提供的疫苗质粒对细胞毒性T细胞功能的影响，在加强免疫后的第10天进行体内CTL检测。
取空白C57BL/6小鼠脾脏细胞(1.5x108)与10μg S peptide pool共孵育，另取空白C57BL/6小鼠脾脏细胞(1.5x108)不孵育多肽。37℃5％CO2培养4h。用eflour450标记细胞，多肽孵育组(1x107细胞/ml+0.5uM，低染),无多肽孵育对照组(1x107细胞/ml+5μM，高染)。低染细胞与高染细胞按照1:1的比例混合，最终总细胞浓度为2x107细胞/ml。通过尾静脉注射，将4x106混合细胞注射免疫组小鼠体内，4h后取脾脏细胞，流式上机，收集样本。体内杀伤率计算公式如下。
其中T代表Targets群，NT代表Non Targets群。
结论：结果如图13所示，pWT/pWT组、pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组、pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组加强免疫后第10天,均能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。上述试验CTL试验中，采用新冠野生型SARS-CoV-2S蛋白肽库作为体外刺激肽，从结果图可以看出，上述条件对免疫策略为pWT/pWT组有利，然而本发明提供的免疫策略为pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组也取得了相当的显著的技术效果，较pWT/pWT组和pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组明显更优，如前所述，pWT是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而进一步更说明了本发明中提供的pSARS-Beta Dimer DNA疫苗以及初免-加强免疫策略为pWT/pSARS-Beta Dimer以及pSARS-Beta Dimer/pWT具有更优的免疫原性和广谱性，特别是针对细胞免疫反应。
由以上结果可知，本发明中提供的冠状病毒重组DNA疫苗pSARS-Beta Dimer不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录，而且可以有效表达并分泌出相应的抗原蛋白；并且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，pSARS-Beta Dimer候选DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，不仅可以产生针对新冠野生型抗原的抗体，还能产生针对新冠Delta突变株抗原、Beta突变株抗原、Omicron突变株抗原以及SARS-CoV-1抗原的抗体，体现了本发明中pSARS-Beta Dimer DNA疫苗具有的良好免疫原性和广谱性；对于细胞免疫应答，pSARS-BetaDimer DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应、而且能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。并且在细胞免疫实验当中，初免-加强免疫策略为pWT/pSARS-BetaDimer组以及pSARS-Beta Dimer/pWT组取得了较pWT/pWT组和pSARS-Beta Dimer/pSARS-Beta Dimer组明显更优的技术效果。
值得注意的是，pWT野生株疫苗是本公司前期针对SARS-CoV-2野生株的产品，目前已进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如ELISA、ELIspot和FACS的检测中，均采用新冠SARS-CoV-2野生型RBD蛋白作为体外包被抗原或者刺激肽；并且在ELISA实验中，不仅采用了新冠SARS-CoV-2野生株RBD蛋白作为体外包被抗原、还采用了SARS-CoV-2Delta突变株RBD蛋白、SARS-CoV-2Beta突变株RBD蛋白以及SARS-CoV-1RBD蛋白作为体外包被抗原来检测产生的抗原特异性抗体。上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明中提供的pSARS-Beta Dimer DNA疫苗也取得了显著的技术效果，甚至比新冠野生型核酸疫苗pWT更优，且初免-加强免疫策略为pWT/pSARS-Beta Dimer组以及pSARS-BetaDimer/pWT组在提高细胞免疫应答中比初免-加强免疫策略为pWT/pWT组和pSARS-BetaDimer/pSARS-Beta Dimer组取得了更优的技术效果，从而进一步更说明了本发明中提供的pSARS-Beta Dimer DNA疫苗以及初免-加强免疫策略为pWT/pSARS-Beta Dimer以及pSARS-Beta Dimer/pWT具有更优的免疫原性和广谱性，特别是针对细胞免疫反应。
综上，本发明不同成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略所产生的免疫原性高于单一成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略。不同成分的DNA疫苗初免-加强免疫策略对靶抗原的免疫反应具有协同加强作用，这种协同作用表现在活化的抗原特异性的细胞毒性T细胞、加强的细胞免疫和体液免疫，以及较为广谱的免疫反应。
本发明提供的用于实现初免-加强免疫方案的试剂盒能够克服现有单一成分DNA疫苗产品的不足，从而更好地发挥新冠疫苗的免疫效果。相较于单一成分DNA疫苗初免-加强组，不同成分DNA疫苗初免-加强组可以诱发非常显著地增高的细胞免疫水平。本发明提供的试剂盒联合施用冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗所诱发的保护性免疫应答，综合来看，要优于单独施用单个成分DNA疫苗所诱发的免疫应答。本发明用于实现初免-加强免疫方法的冠状病毒疫苗试剂盒能够提供针对SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2病毒突变株的保护作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒，其特征在于，包含独立包装的初免试剂和独立包装的加强免疫试剂；
所述初免试剂为新型冠状病毒DNA疫苗，且所述加强免疫试剂为冠状病毒重组DNA疫苗；或，所述初免试剂为冠状病毒重组DNA疫苗，且所述加强免疫试剂为新型冠状病毒DNA疫苗；
所述冠状病毒重组DNA疫苗含有编码第一抗原的DNA片段；所述新型冠状病毒DNA疫苗含有编码第二抗原的DNA片段；
所述第一抗原和所述第二抗原分别独立的为冠状病毒重组抗原和新型冠状病毒抗原；或其抗原表位。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒重组抗原或新型冠状病毒抗原或其抗原表位的氨基酸序列部分或全部来源于冠状病毒或冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区；
优选地，所述第一抗原的氨基酸序列含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2中的一种或多种的组合；
优选地，所述第一抗原的氨基酸序列含有由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列直接串联得到的序列；或，含有由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列直接串联得到的序列。
3.根据权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原的氨基酸序列含有由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列直接串联得到的序列；或，含有由SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列直接串联得到的序列；
所述第二抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述编码第一抗原的DNA片段的核苷酸序列含有由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列直接串联得到的序列，或含有由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列直接串联得到的序列。
优选地，所述编码第二抗原的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗包含质粒，所述质粒由表达载体，和插入所述表达载体的外源序列部分组成，所述外源序列部分含有所述编码第一抗原的DNA片段或第二抗原的DNA片段；
优选地，所述表达载体包括真核表达载体，所述真核表达载体优选为pVAX1载体；
优选地，所述质粒溶于缓冲液中，所述缓冲液优选为SSC缓冲液。
5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述初免试剂和所述加强免疫试剂的数量比为1～2：1～2；
优选地，所述初免试剂和所述加强免疫试剂分别独立的为针剂或贴剂；
优选地，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗中DNA的含量为0.1～10mg。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒重组DNA疫苗或新型冠状病毒DNA疫苗还包含药学上可接受的赋形剂；所述药学上可接受的赋形剂包括载体、稀释剂、助悬剂、转染促进剂、佐剂和编码佐剂的核苷酸中的一种或几种；
优选地，所述佐剂选自铝佐剂、TLR配体类佐剂、细胞因子类佐剂中的一种或多种；
优选地，所述佐剂为铝佐剂；
优选地，所述试剂盒还包括疫苗递送装置；
优选地，所述试剂盒中还包括DNA疫苗递送装置；
优选地，所述DNA疫苗递送装置为电脉冲装置；
优选地，所述电脉冲装置工作时由两组具有0.2Amp恒定电流的脉冲组成；第二脉冲组被延迟3秒；在每个组中，有两个52ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198ms。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
(a)制备冠状病毒重组DNA疫苗并独立包装；
(b)制备新型冠状病毒DNA疫苗并独立包装；
(c)将分别独立包装的冠状病毒重组DNA疫苗和新型冠状病毒DNA疫苗分别独立的标识为初免试剂或加强免疫试剂，组装成试剂盒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)或(b)包括制备质粒，所述制备质粒包括将所述编码第一抗原的DNA片段或编码第二抗原的DNA片段插入表达载体中；
优选地，所述表达载体包括真核表达载体；
优选地，所述真核表达载体包括pVAX1载体。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)或(b)包括将编码所述第一抗原或第二抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到所述第一抗原或第二抗原；
优选地，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
优选地，编码所述第一抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，或者与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少70％一致性；
优选地，编码所述第二抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少70％一致性；
优选地，步骤(a)或(b)还包括将所述第一抗原或第二抗原吸附于佐剂；
优选地，所述表达系统的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞包括293T细胞或CHO细胞；
优选地，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
10.权利要求1-6任一项所述的用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒在制备预防和/或治疗冠状病毒感染和/或冠状病毒感染引发的疾病SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2的药物或产品中的应用。优选地，所述产品中包含DNA疫苗递送装置。
CN202210874878.2A 2022-07-25 2022-07-25 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用 Pending CN117442712A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210874878.2A CN117442712A (zh) 2022-07-25 2022-07-25 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210874878.2A CN117442712A (zh) 2022-07-25 2022-07-25 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117442712A true CN117442712A (zh) 2024-01-26

Family

ID=89587899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210874878.2A Pending CN117442712A (zh) 2022-07-25 2022-07-25 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117442712A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116143938B (zh) 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN111315407B (zh) 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
AU2020247131A1 (en) Immunogenic compositions and vaccines comprising african swine fever virus peptides and proteins and uses thereof
CN111662389A (zh) 一种SARS-CoV-2的融合蛋白及其疫苗组合物
WO2022144040A1 (zh) 一种编码新型冠状病毒抗原的核苷酸序列及其应用
CN109182380B (zh) 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用
EA030381B1 (ru) Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта
CN113528547B (zh) 新型冠状病毒b.1.617.1突变株dna疫苗
CN113528545B (zh) 编码新型冠状病毒b.1.1.7突变株抗原的核酸序列及其应用
CN113528549B (zh) 编码新型冠状病毒b.1.351突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用
CN113528548B (zh) 新型冠状病毒dna疫苗
CN114574502A (zh) 一种以复制缺陷腺相关病毒为载体的新型冠状病毒疫苗
WO2007093133A1 (fr) Vaccin contre le sars basé sur un vecteur du virus vaccinia réplicatif
JP2021529538A (ja) 重症熱性血小板減少症候群（ｓｆｔｓ）ウイルス感染疾患の予防または治療用ワクチン組成物
CN117551677A (zh) 一种以5型腺病毒为载体的猴痘病毒特异性融合蛋白疫苗
CN113528546B (zh) 编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用
CN107335054B (zh) 一种慢性乙肝治疗性dc疫苗
CN117442712A (zh) 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用
CN115975053A (zh) 靶向新型冠状病毒的疫苗
CN109295014B (zh) 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN113278634A (zh) 一种预防和治疗默克尔细胞癌的新型疫苗
CN117448362A (zh) 编码冠状病毒抗原的重组dna分子、dna疫苗及应用
CN113862285B (zh) Sars-cov-2病毒b.1.617.2突变株dna疫苗及应用
CN114573667B (zh) SARS-CoV-2病毒B.1.1.529突变株DNA疫苗及应用
WO2007093134A1 (fr) Vaccin contre le sida basé sur un vecteur du virus vaccinia réplicatif

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination