CN115975053A - 靶向新型冠状病毒的疫苗 - Google Patents
靶向新型冠状病毒的疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115975053A CN115975053A CN202211562525.5A CN202211562525A CN115975053A CN 115975053 A CN115975053 A CN 115975053A CN 202211562525 A CN202211562525 A CN 202211562525A CN 115975053 A CN115975053 A CN 115975053A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- seq
- recombinant
- protein
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 47
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 104
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 46
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 101000854520 Homo sapiens Fractalkine Proteins 0.000 claims description 31
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000014464 Chemokine CX3CL1 Human genes 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 13
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 102100020997 Fractalkine Human genes 0.000 description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 19
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 14
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 12
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 9
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 9
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 9
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 6
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 5
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 101000953880 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 102000057105 human CX3CL1 Human genes 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 101800000504 3C-like protease Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101000806383 Fowlpox virus (strain NVSL) Uncharacterized protein FPV009/FPV252 Proteins 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000982327 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF4a Proteins 0.000 description 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 101710091700 Non-structural protein ORF4b Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091007493 Papain-like protease two domains Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002394 glycogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向新型冠状病毒的疫苗。本发明涉及一种精准防治新型冠状病毒的疫苗，其将SARS‑COV‑2的S\M\N蛋白的B细胞抗原表位与趋化因子CX3CL1进行了重组融合。实验结果表明：这种重组疫苗可以在体内高效诱导特异性体液免疫和细胞免疫反应，使得免疫系统对病毒进行大量杀伤，可以有效预防或治疗新型冠状病毒的感染。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗研发领域，具体涉及靶向新型冠状病毒的疫苗。
背景技术
冠状病毒（Coronaviridae）是一类单股正链RNA病毒，基因组大小为27～32kb。在所有已知的RNA病毒（例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV等）中，冠状病毒的基因组是最大的。因病毒囊膜上含有刺突（spike）状的包膜蛋白S，在电镜结构中类似于皇冠上镶嵌的珍珠，病毒由此而得名。按照系统发育的不同，冠状病毒可以被分成α/β/γ/δ四个属，每个属有不同的毒株，α/β属冠状病毒感染哺乳动物，而γ/δ属冠状病毒感染鸟类。
最新序列研究分析表明，从临床病人分离的SARS-CoV-2和SARS冠状病毒有79.3%的同一性。冠状基因组结构较为保守，包含11个功能性开放阅读框，依次为ORF1a、ORF1b、S、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5、E、M、ORF8b和N。其中ORF1a和ORF1b分别编码在所有冠状病毒中均保守的两种复制酶PL2pro和3CLpro。ORF3、4a、4b、5和8b分别编码了病毒的5种附属蛋白。ORFs S、E、M和N编码了的4种主要结构蛋白—刺突蛋白（Spike Protein,S）、包膜蛋白（EnvelopeProtein ,E）、膜蛋白（Membrane Protein,M）和核衣壳蛋白（NucleocapsidProtein,N）。其中，E蛋白为在病毒表面形成离子通道的一种跨膜蛋白，与病毒毒力相关。N蛋白是病毒基因组RNA复制复合物的主要组成部分，并与M蛋白的C端结构域结合。M蛋白是构成冠状病毒粒子形状的蛋白，参与病毒组分在病毒粒子中的整合。S蛋白突出于病毒粒子表面，为I型跨膜糖蛋白，与病毒颗粒吸附和膜融合相关，根据相关研究报道，S蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要免疫原，S蛋白在之后成为中东呼吸综合症病毒MERS疫苗和基因工程药物开发的重要靶点。鉴于以往工作经验，S蛋白成为针对SARS-COV-2的首选抗原。然而大量的相关病毒防御研究也揭示，针对核衣壳蛋白的抗体也可以保护机体免于病毒的攻击，例如一些针对核衣壳蛋白的乙肝疫苗。
另外，抗原蛋白经抗原提呈细胞摄取后会经蛋白酶体或者溶酶体降解成可以结合MHCII或者MHCI的多肽序列，称之为抗原表位。与全长蛋白相比，直接选择抗原表位理论上可以增强被呈递的可能性。例如，在肿瘤疫苗的研发中就经历了从使用全肿瘤细胞到单个肿瘤过表达蛋白以及生物信息学手段预测多个抗原表位的历程。初始的B细胞仅存在于淋巴结等次级淋巴组织中，淋巴结等次级淋巴组织是免疫应答发生的重要场所。外源性抗原只有被专职抗原提呈细胞摄取、加工，才能有效地提呈至细胞表面，活化初始B细胞。尽管已发现树突状细胞(DC)是强大的抗原提呈细胞，但不同亚群DC具有不同的诱导抗原特异免疫应答能力。近年来，大量研究认为，在小鼠体内，CD8α+DC是主要将抗原提呈给Th1型CD4 T细胞，Th1型CD4 T细胞可以分泌IFNr促进B细胞分泌IgG2型抗体，这类抗体是主要的中和抗体组成部分，而其他群DC细胞提呈抗原给Th2型CD4 T细胞，主要分泌IL-10介导免疫抑制性IgG1产生。故而在抗病毒的抗原递送过程中，将抗原递送次级淋巴结可以一方面给CD8α+DC细胞摄取促进辅助性Th1型CD4 T发育，一方面直接被B细胞吞噬开启免疫，二者结合可以高效的产生针对病毒的中和型抗体。在人体内也存在一群与之类似的细胞，即CD141+DC(又称为BDCA3+DC)。然而，这些细胞也主要存在于次级淋巴组织，难以直接从外周组织中摄取抗原物质。位于外周组织中的少量抗原即使通过引流淋巴管进入局部引流淋巴结内，由于淋巴结解剖结构的致密性，也难以与位于淋巴结内部的副皮质区内的CD8α+DC细胞接触而被摄取。因此，目前尚缺乏如何将病毒蛋白免疫原主动传送到CD8α+DC细胞的方式而诱导出针对抗原的T和B细胞免疫。
CX3CL1是一种最早于1997年在人体基因组中发现的免疫细胞趋化因子(Bazan,Bacon et al. 1997)。该趋化因子的家族分类非常独特，和其他常规CC家族及CXC家族趋化因子的蛋白质结构具有一定的序列差异。CX3CL1最早发现是一种全长序列中含有跨膜区的类似细胞膜糖蛋白的跨膜蛋白，这种蛋白后来被证明在人体组织分布中存在两种不同的结构模式。一种是全长的分布于细胞膜表面的糖蛋白形式，含有其N端头部的趋化结构，中间的糖茎结构以及C端的细胞膜锚定结构。另一种形式为被酶切仅含有趋化结构与糖茎结构的分泌蛋白形式。现已证明，后者的分泌蛋白形式是CX3CL1作为趋化因子在组织中分布中的主要形式，这种形式可以和其他CC家族或CXC家族的普通趋化因子一样，行驶免疫细胞的趋化能力。在很多已有研究中已经证明，CX3CL1的趋化形式具备非常高效的T细胞B细胞等单核细胞趋化能力，且并不对中性粒细胞发生反应。推测这可能与其独特的糖茎结构有关，使得其可以发挥更强的趋化因子能力。
由于SARS-COV-2对于人类而言是全新的病毒，人类机体对SARS-COV-2的保护性免疫应答过程仍不清楚，故而无法判断哪一种疫苗类型会取得最好的保护效果。行之有效的策略为多种疫苗平台多种免疫方法同时平行开发，以便尽快获得安全有效的疫苗。目前的研究还未将CX3CL1趋化因子与新型冠状病毒抗原结合用于新型冠状病毒应用的案例，其是否能显著提高新型冠状病毒抗原性能也未得而知。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供靶向新型冠状病毒的疫苗。
本发明提供了重组抗原，其包括CX3CL1趋化因子和新型冠状病毒B细胞抗原。其中，新型冠状病毒B细胞抗原，简称抗原(或S/M/N抗原)，其包括S抗原表位、N抗原表位和M抗原表位；
所述S抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述N抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述M抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
所述S抗原表位、N抗原表位和M抗原表位之间独立的用连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
进一步的，本发明中，所述的重组抗原中，
所述新型冠状病毒B细胞抗原具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
所述CX3CL1趋化因子具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列。
本发明所述的新型冠状病毒B细胞抗原是对B细胞表位通过生物信息学预测后得到，是国际公认的表位，其分布不仅存在于新冠病毒RBD区域，还包括了S蛋白的其他位置以及M和N蛋白，因此扩展性和泛用性强于其它新型冠状病毒专属性抗原。
本发明所述的重组抗原中，CX3CL1趋化因子与新型冠状病毒B细胞抗原之间通过linker连接，所述linker为(G5S)n，其中n为1～10。在本发明的一些具体实施例中，所述linker为GGGGGSGGGGG(如SEQ ID NO:8所示)。
进一步的，本发明所述的重组抗原还包括IgE信号肽和/或C端的Flag标签。所述IgE信号肽的氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS，如SEQ IDNO:7所示，其在重组蛋白N端的添加促使融合蛋白分泌到胞外；所述Flag标签的氨基酸序列为DYKDDDDK，如SEQ ID NO:9所示，该序列只为鉴定蛋白表达的标签不影响序列的免疫效果。
在一些具体的实施例中，本发明所述的重组抗原的组成可以包括如下a)～e)所示中的任意一种：
a)、抗原；
b)、CX3CL1趋化因子和抗原；
c)、IgE信号肽、CX3CL1趋化因子和抗原；
d)、CX3CL1趋化因子、抗原和Flag标签；
e)、IgE信号肽、CX3CL1趋化因子、抗原和Flag标签。
进一步的，本发明所述的重组抗原具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明中，CX3CL1是趋化因子，行使免疫细胞的趋化能力。本发明对CX3CL1蛋白结构及序列分析后，进行了CX3CL1趋化因子重构。结果表明，在重构的CX3CL1趋化因子变体中CX3CL1-b具有较高的趋化活性，可显著提高细胞抗原分子交叉呈递效果，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明所述的重组抗原，CX3CL1-b趋化因子的融合表达提高了S\M\N抗原表位进入次级淋巴结的效率以及被免疫细胞、B细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了诱导特异性抗体反应的效果。实验结果表明，本发明所述的抗原及重组抗原均有较高的蛋白表达，将其注射于小鼠后能有效地在血清中诱导出针对S\M\N的抗体，说明融合基因免疫的效果显著有效；且其免疫来源的血清对新型冠状病毒有较强的防治能力，其中CX3CL1-S/M/N重组抗原来源的血清效果显著高于S/M/N抗原来源的血清。
本发明提供了编码所述重组抗原的核酸。
进一步的，编码所述重组抗原的核酸中，
编码CX3CL1趋化因子的核酸如SEQ ID NO:4所示；
编码新型冠状病毒B细胞抗原的核酸如SEQ ID NO:1所示。
本发明的一些具体实施例中，所述的核酸可以为CX3CL1-抗原；
本发明的另一些实施例中，本发明所述的核酸可以为CX3CL1-linker-抗原；
本发明的另一些实施例中，本发明所述的核酸可以为IgE信号肽-CX3CL1-linker-抗原；
本发明的另一些实施例中，本发明所述的核酸可以为CX3CL1-linker-抗原-Flag标签；
本发明的另一些实施例中，本发明所述的核酸可以为IgE信号肽-CX3CL1-linker-抗原-Flag标签。
本发明中，所述的核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
本发明所述的编码重组抗原的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA或RNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
在本发明中，对编码所述重组抗原的DNA序列进行了优化，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。
本发明中还提供了所述重组抗原的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。
本发明提供了重组载体，其包括载体骨架和本发明所述的核酸。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式动物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。例如，其骨架载体可以是pVR系列载体(参见中国专利ZL202110624820.8)。
进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的重组载体可以包括如下所示的任意一种：
pVR-CX3CL1-抗原；
pVR-抗原。
本发明提供了转化或转染所述重组载体的宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞，这样转化的宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
进一步的，所述的宿主包括模式动物或哺乳动物细胞。所述的模式动物包括小鼠、大鼠、兔子等生物医学领域常用的实验动物，本发明对此不做限定。所述的哺乳动物细胞包括CHO细胞、BHK细胞、Sp2/0、HEK293、HEK293T。
本发明提供了所述重组抗原的制备方法，其培养本发明所述的宿主，获得含有所述重组抗原的培养物。
本发明提供了如下I)～V)所示中至少一种在制备防治新型冠状病毒的疫苗中的应用:
I)、本发明所述的重组抗原；
II)、本发明所述的核酸；
III)、本发明所述的重组载体；
IV)、本发明所述的宿主；
V)、本发明所述的制备方法制得的含有重组抗原的培养物。
本发明提供了新型冠状病毒疫苗，其原料包括如下i)～v中的任意一种或多种：
i)、本发明所述的重组抗原；
ii)、本发明所述的核酸；
iii)、本发明所述的重组载体；
iv)、本发明所述的宿主；
v)、本发明所述的制备方法制得的含有重组抗原的培养物。
本发明所述的疫苗，可以为DNA疫苗、RNA疫苗或蛋白质疫苗，本发明对此不做限定。
进一步的，本发明所述的疫苗还包括辅料或缓冲液；所述辅料用于维持所述疫苗的活性或帮助所述疫苗发挥作用。所述辅料包括但不限于载体、表面活性剂和还原剂等；所述的载体包括慢病毒辅助载体、腺病毒辅助载体等起到辅助装配或辅助整合的载体；所述的表面活性剂包括但不限于triton；所述的还原剂包括但不限于DTT或β-巯基乙醇等。本发明所述的缓冲液包括PBS缓冲液、KCl缓冲液、NaCl缓冲液、Tris缓冲液等。
更进一步的，本发明所述的疫苗还包括所述的核酸的转录mRNA或翻译起始产物等，本发明对此不做限定。
更进一步的，所述的疫苗还包括含有所述核酸或mRNA的脂质纳米颗粒。所述的脂质纳米颗粒的制备过程包括利用动物体内转染试剂对所述的核酸或mRNA进行包裹，形成含有所述核酸或mRNA脂质纳米颗粒形式的疫苗用于新型冠状病毒的防治。
本发明提供了一种新型冠状病毒的防治的方法，其为给予本发明所述的疫苗。其给予方式可以包括注射。
本发明涉及一种精准防治新型冠状病毒的核酸疫苗。这种疫苗利用趋化因子CX3CL1经序列优化后的功能活性变体作为辅助，利用一种新型冠状病毒的特有S\M\N蛋白的B细胞表位作为靶向抗原。结果表明：这种新型疫苗可以在体内诱导高效的特异性体液免疫和细胞免疫反应，并使得免疫系统最终对病毒进行大量杀伤，可以有效预防或治疗新型冠状病毒的感染。
附图说明
图1示CX3CL1及其各种功能活性变体趋化各类专职抗原提呈细胞能力分析比较；
图2示pVR-CX3CL1-S/M/N和pVR-S/M/N的质粒图谱；
图3示质粒pVR-CX3CL1-S/M/N和pVR-S/M/N中目的基因的表达情况；
图4示pVR-CX3CL1-S/M/N和pVR-S/M/N两种质粒免疫小鼠后小鼠产生的中和抗体的情况；
图5示不同融合基因对小鼠进行免疫后的血清用于中和新冠病毒的效果，其中纵坐标表示各种不同血清能够完全中和病毒感染的最高稀释倍数。
具体实施方式
本发明提供了靶向新型冠状病毒的疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
抗原表位(antigenic epitope)，又称“抗原决定簇”或“抗原决定族位点”。抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残基被称为免疫显性基团。
本发明中提供了新型冠状病毒SARS-COV-2的刺突蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白的抗原表位。本发明中，所述S蛋白、刺突蛋白、SARS-COV-2S蛋白、SARS-COV-2刺突蛋白具有相同的意义，在本文中可以互换使用。所述M蛋白、包膜蛋白、SARS-COV-2M蛋白或包膜蛋白具有相同的意义，在本文中可以互换使用。所述N蛋白、核衣壳蛋白、SARS-COV-2N蛋白或SARS-COV-2核衣壳蛋白具有相同的意义，在本文中可以互换使用。在本发明中，SARS-COV-2的刺突蛋白的抗原表位也被称为SARS-COV-2的S蛋白的抗原表位或S蛋白的抗原表位或S表位；SARS-COV-2的包膜蛋白的抗原表位也被称为SARS-COV-2的M蛋白的抗原表位或M蛋白的抗原表位或M表位；SARS-COV-2的核衣壳蛋白的抗原表位也被称为SARS-COV-2的N蛋白的抗原表位或N蛋白的抗原表位或N表位。
本发明中，所述的连接肽或linker是指在融合蛋白中连接两个蛋白片段的连接物，一些实施例中，抗原表位之间的连接通过三肽AAY来实现。而抗原表位与趋化因子蛋白之间通过(GGGGS)n来连接。
本发明中，所述重组抗原是指通过DNA重组技术得到的基因重组后的表达产物。
一些实施例中，本发明提供的重组抗原中，包括SARS-COV-2的S蛋白的抗原表位、SARS-COV-2的N蛋白的抗原表位和SARS-COV-2的M蛋白的抗原表位，记为S\M\N。本发明中，对融合蛋白中S表位、M表位、N表位连接顺序不做限定。在本发明实施例中，由N端至C端，融合蛋白中依次包括S表位、M表位、N表位，其中S表位与M表位之间以连接肽AAY进行连接，M表位与S表位之间以连接肽AAY进行连接。
另一些实施例中，本发明提供的重组抗原中，包括CX3CL1趋化因子蛋白和SARS-COV-2的S蛋白的抗原表位、SARS-COV-2N蛋白的抗原表位和SARS-COV-2M蛋白的抗原表位；记为CX3CL1-S\M\N，对其中CX3CL1蛋白、S表位、N表位、M表位的连接顺序不做限定。本发明的一些实施例中，CX3CL1与S\M\N表位片段以linker进行连接，而表位片段之间以连接肽AAY进行连接。一些具体实施例中，CX3CL1-S\N\M的序列中，由N端至C端依次为CX3CL1蛋白-linker-S表位-AAY-M表位-AAY-N表位，其氨基酸序列如SEQ 3所示，编码该融合蛋白的核酸序列如SEQ 2所示。
S/M/N抗原基因序列(新型冠状病毒B细胞抗原)为：gtggacgctgtggactgcgccctggaccctctgagcgaaaccaagtgcactctgaagagctttaccgtggagaaaggcatttaccagacaagcaacgccgcctatgtgtgcggacctaaaaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaaaaagttcctgcctttccagcagtttggcagggacatcgcagacaccaccgacgccgtgagggaccctcagaccctggagatcctggacattacaccttgcagcttcggcggcgtgagcgtgatcgccgcctacggaaccaacaccagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaactgcacagaagtgcctgtggccatccacgccgaccagctgacccctacctggagggtgtacagcaccggcagcgccgcctacttcagccagattctgcctgaccccagcaaacctagcaaaagaagcttcatcgaagccgcctactttggagccggcgccgccctgcagatccctttcgcaatgcagatggcctaccggttcaacggcatcgccgcctatatggccgactccaacggcaccatcaccgtggaggagctgaagaagctgctggagcagtggaacctggtgatcgccgcttaccccctgctggagtctgagctggtgatcggagccgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccgcttataggcctcagggcctgcctaataacaccgcctcctggttcaccgccctgacccagcacgggaaggccgcttataacaataatgctgccaccgtgctgcagctgccccagggaaccaccctgcctaaaggcttcgccgcatacaacaagcacatcgacgcctacaaaaccttcccccctaccgagcccaagaaagacaagaagaaaaagaccgacgaagcccagcctctgccccagcggcagaaaaagcagcccaccgtgaccctgctgcccgccgctgatatg(如SEQ ID NO:1所示)。
CX3CL1-S/M/N融合基因序列为：cagcaccacggagttaccaagtgtaacattacctgcagtaagatgacatccaagattcccgttgccctgttgattcactatcagcaaaaccaggcctcttgtggaaaaagggctattattctggagactcgacagcacaggctcttttgcgccgacccaaaggagcagtgggtcaaagacgccatgcagcacctggaccgccaggctgccgccctcaccagaaatggggggacattcgagaagcagattggggaagtcaaaccccgcaccacccccgcggccggcggcatggacgaatccgttgtcctcgagggaggaggaggagggagcggaggaggaggcggagtggacgctgtggactgcgccctggaccctctgagcgaaaccaagtgcactctgaagagctttaccgtggagaaaggcatttaccagacaagcaacgccgcctatgtgtgcggacctaaaaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaaaaagttcctgcctttccagcagtttggcagggacatcgcagacaccaccgacgccgtgagggaccctcagaccctggagatcctggacattacaccttgcagcttcggcggcgtgagcgtgatcgccgcctacggaaccaacaccagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaactgcacagaagtgcctgtggccatccacgccgaccagctgacccctacctggagggtgtacagcaccggcagcgccgcctacttcagccagattctgcctgaccccagcaaacctagcaaaagaagcttcatcgaagccgcctactttggagccggcgccgccctgcagatccctttcgcaatgcagatggcctaccggttcaacggcatcgccgcctatatggccgactccaacggcaccatcaccgtggaggagctgaagaagctgctggagcagtggaacctggtgatcgccgcttaccccctgctggagtctgagctggtgatcggagccgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccgcttataggcctcagggcctgcctaataacaccgcctcctggttcaccgccctgacccagcacgggaaggccgcttataacaataatgctgccaccgtgctgcagctgccccagggaaccaccctgcctaaaggcttcgccgcatacaacaagcacatcgacgcctacaaaaccttcccccctaccgagcccaagaaagacaagaagaaaaagaccgacgaagcccagcctctgccccagcggcagaaaaagcagcccaccgtgaccctgctgcccgccgctgatatg(如SEQ ID NO:2所示)。
CX3CL1-S/M/N融合蛋白的氨基酸序列为：QHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQASCGKRAIILETRQHRLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNGGTFEKQIGEVKPRTTPAAGGMDESVVLEGGGGGSGGGGGVDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNAAYVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIAAYGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSAAYFSQILPDPSKPSKRSFIEAAYFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIAAYMADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIAAYPLLESELVIGAVILRGHLRIAAYRPQGLPNNTASWFTALTQHGKAAYNNNAATVLQLPQGTTLPKGFAAYNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADM(如SEQ ID NO:3所示)。
CX3CL1核苷酸序列为：cagcaccacggagttaccaagtgtaacattacctgcagtaagatgacatccaagattcccgttgccctgttgattcactatcagcaaaaccaggcctcttgtggaaaaagggctattattctggagactcgacagcacaggctcttttgcgccgacccaaaggagcagtgggtcaaagacgccatgcagcacctggaccgccaggctgccgccctcaccagaaatggggggacattcgagaagcagattggggaagtcaaaccccgcaccacccccgcggccggcggcatggacgaatccgttgtcctcgag(如SEQ ID NO:4所示)。
S/M/N抗原的氨基酸序列为：VDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNAAYVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIAAYGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSAAYFSQILPDPSKPSKRSFIEAAYFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIAAYMADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIAAYPLLESELVIGAVILRGHLRIAAYRPQGLPNNTASWFTALTQHGKAAYNNNAATVLQLPQGTTLPKGFAAYNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADM(如SEQ ID NO:5所示)。
CX3CL1氨基酸序列为：QHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQASCGKRAIILETRQHRLFCA DPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNGGTFEKQIGEVKPRTTPAAGGMDES VVLE(如SEQ ID NO:6所示)。
IgE氨基酸序列为：MDWTWILFLVAAATRVHS(如SEQ ID NO:7所示)。
Linker氨基酸序列为：GGGGGSGGGGG(如SEQ ID NO:8所示)。
Flag标签氨基酸序列为：DYKDDDDK(如SEQ ID NO:9所示)。
连接肽：AAY(如SEQ ID NO:10所示)。
所述S抗原表位氨基酸序列为：VDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNAAYVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIAAYGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSAAYFSQILPDPSKPSKRSFIEAAYFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGI(SEQ IDNO:11所示)。
所述N抗原表位氨基酸序列为：MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIAAYPLLESELVIGAVILRGHLRI(SEQ IDNO:12所示)。
所述M抗原表位氨基酸序列为：RPQGLPNNTASWFTALTQHGKAAYNNNAATVLQLPQGTTLPKGFAAYNKH IDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADM(SEQ IDNO:13所示)。
本发明实施例中，涉及的片段的氨基酸序列和编码的核酸片段如表1：
表1片段的氨基酸序列和编码的核酸序列
| SEQ ID NO:1 | S/M/N抗原基因序列 |
| SEQ ID NO:2 | CX3CL1-S/M/N融合基因序列 |
| SEQ ID NO:3 | CX3CL1-S/M/N融合蛋白的氨基酸序列 |
| SEQ ID NO:4 | CX3CL1核苷酸序列 |
| SEQ ID NO:5 | S/M/N抗原序列 |
| SEQ ID NO:6 | CX3CL1氨基酸序列 |
| SEQ ID NO:7 | 信号肽IgE的氨基酸序列 |
| SEQ ID NO:8 | Linker |
| SEQ ID NO:9 | Flag标签 |
| SEQ ID NO:10 | 连接肽 |
| SEQ ID NO:11 | S抗原表位 |
| SEQ ID NO:12 | N抗原表位 |
| SEQ ID NO:13 | M抗原表位 |
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1CX3CL1趋化因子蛋白结构分析与筛选
对CX3CL1趋化因子进行蛋白结构与序列分析。经分析发现，该分子存在三部分结构域，分别为：N端的趋化因子结构域，中间的糖茎结构域和C端的跨膜结构域。为了摸索出针对各种免疫细胞最为高效的趋化因子序列，对CX3CL1蛋白本身进行多种序列构建并同时测试蛋白分子的趋化能力。由于C端结构域为跨膜结构域，无法将抗原蛋白分子分泌出细胞外，故在不同变体测试中全部删除C端跨膜区，将CX3CL1蛋白的25～338号氨基酸序列定义为全长CX3CL1分子。以此为基础的，结合蛋白质结构学分析，设计如下分子变体构建(括号中示氨基酸序号)：CX3CL1-a(25～100)；CX3CL1-b(25～128)；CX3CL1-c(25～185)；CX3CL1-d(25～265)；CX3CL1-e(25～309)；CX3CL1-f(25～338，全长)和CX3CL1-g(37～388)。针对以上全部分子变体进行序列合成并构建到大肠杆菌pET28a载体中进行蛋白表达纯化，最终获得全部7种蛋白分子的粗纯样品进行后续实验。
从小鼠骨髓以及外周血分别分离单核细胞和T细胞亚群。其中骨髓单核细胞分别加入M-CSF和GM-CSF、IL4诱导分化为巨噬细胞和DC细胞后进行趋化实验。趋化小室(碳酸脂膜Transwell小室：5μm；Costar，Cat：3422)的上室中放入上述分离或诱导分化的细胞，根据实验室前期工作基础加入细胞数量为1×106/100μl/孔。同时设置自发迁移对照组以及CX3CL1细胞因子全部功能变体组，所加入的细胞数目相同。根据实验室前期已有的工作基础，100ng/ml为最佳趋化效率剂量。4小时后收集趋化下室中的细胞，并进行流式分析CX3CL1功能变体对各类免疫细胞的趋化能力。结果显示：CX3CL1不同分子变体能有效的从上室中募集各类免疫细胞到下室中(P＜0.001)，且不同蛋白分子的趋化能力有差别，趋化能力最强的功能活性变体并非传统序列分析理解的趋化因子结构域蛋白，而是相较之下序列更长的分子变体CX3CL1-b(图1)，下述所有CX3CL1功能变体或CX3CL1基因及蛋白均表示CX3CL1-b这一分子变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2抗原设计方案及哺乳动物表达质粒的构建与制备
融合基因或蛋白疫苗的抗原设计方案及哺乳动物表达质粒的构建与制备
构建pVR-CX3CL1-S/M/N质粒：S/M/N特异性BCR抗原序列采用SEQ IDNO:5所示氨基酸序列，人源CX3CL1蛋白采用SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。在融合蛋白CX3CL1-S/M/N的N末端连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽(SEQ ID NO:7)；在融合蛋白CX3CL1-S/M/N的C末端连接一个DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签(如SEQ ID NO:9所示)。
最终得到的融合蛋白，自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CX3CL1蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、S/M/N序列和Flag标签序列。
将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:2将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CX3CL1-S/M/N质粒。如图2中的A所示。
构建pVR-S/M/N质粒：在S/M/N特异性BCR抗原序列之前在连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽，之后连接DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。
使得最终得到的融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、S/M/N特异性BCR蛋白序列、Flag标签序列。如图2中的B所示。
将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:1该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-S/M/N质粒。
实施例3构建质粒的体外细胞转染实验
转染前24小时，在6孔细胞培养板内接种2.5×105个HEK293T细胞，待细胞密度长到60％～70％时开始转染试验。转染时提前在37℃水浴锅中预热细胞培养基、无血清的Opti-MEM培养基。转染时将5微克空载体(Vector)，pVR-CX3CL1-S/M/N表达载体，pVR-S/M/N表达载体和20μL PEI转染试剂先后加入到200μL无血清的Opti-MEM中，混合均匀后，室温下静置20分钟。将需要转染的细胞更换新鲜培养基，轻柔加入上述转染体系，轻轻摇匀。将细胞放回细胞培养箱中培养6小时后换液。转48小时后收取细胞用Western Blot检测融合基因质粒HEK293T细胞中的表达效果。
将收集细胞，加入60μL的含有PMSF或Cocktail蛋白酶抑制剂的0.5％ NP40裂解缓冲液。充分重悬细胞，4℃旋转裂解细胞30分钟。12000rpm，4℃离心裂解液10分钟，收集上清至新的1.5mL EP管中，弃掉沉淀。根据样品实际体积加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混合均匀后将样品放在100℃空气浴中加热10分钟，立即进行Western blot，利用Flag标签抗体(Sigma,F3165)进行检测，结果如图3(利用Western blot检测C端带有Flag标签的融合蛋白表达情况)显示空载体(Vector)无蛋白表达，pVR-CX3CL1-S/M/N表达蛋白大小位置明显高于pVR-S/M/N，说明实验组质粒pVR-CX3CL1-S/M/N和对照组质粒pVR-S/M/N都能够顺利正常在哺乳动物细胞中表达。
实施例4融合蛋白质粒免疫后小鼠血清中针对S\M\N蛋白的抗体检测
将C57B6(购自为通利华)周龄雄性小鼠，分为注射实验组质粒pVR-CX3CL1-S/M/N和对照组质粒pVR-S/M/N和PBS对照的3组，每组10只，利用脱毛膏进行小鼠右侧靠近腹股沟淋巴结处脱毛处理。之后利用电转仪在脱毛处注射质粒，每只50μg，每周一次，共注射四次，分别在第一次注射前，第二次注射后以及第四次注射后的一周进行内眦采血，12000rpm离心20min获得血清冻存于-80℃保存。在最后一次采血后利用ELISA检测各组小鼠血清中针对S\M\N蛋白的抗体情况。结果如图4中所示，免疫注射XCL1-S\M\N质粒能有效地在血清中诱导出针对S\M\N蛋白的抗体。说明融合基因免疫的效果显著有效。
实施例5融合蛋白质粒免疫后小鼠血清中针对新冠活病毒的中和能力检测
抗体中和实验：取小鼠免疫血清20μL,和相同体积的新冠病毒液37℃混合1小时，然后加入12孔板培养的Vero细胞，感染2小时后，去感染细胞培养液，换新鲜细胞培养液并37℃培养。3天之后，通过细胞病变效应CPE确定血清中和能力。通过实验，我们发现pVR-CX3CL1-S/M/N免疫来源的血清，能够极大地降低病毒感染的效率，在抗体中和后，病毒感染细胞的能力显著降低，说明血清中的特异性抗体能阻断S蛋白介导的新冠病毒颗粒进入细胞，如图5所示。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (15)
1.重组抗原，其特征在于，
包括CX3CL1趋化因子和新型冠状病毒B细胞抗原；
所述新型冠状病毒B细胞抗原包括S抗原表位、N抗原表位和M抗原表位；
所述S抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述N抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述M抗原表位氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2.根据权利要求1所述的重组抗原，其特征在于，
所述新型冠状病毒B细胞抗原具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
所述CX3CL1趋化因子具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组抗原，其特征在于，所述CX3CL1趋化因子与新型冠状病毒B细胞抗原之间通过linker连接，所述linker为(G5S)n，其中n为1～10。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组抗原，其特征在于，所述重组抗原还包括IgE信号肽和/或Flag标签。
5.根据权利要求1～4任一项所述的重组抗原，其特征在于，所述重组抗原具有如SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
6.编码权利要求1～5任一项所述重组抗原的核酸。
7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，
编码CX3CL1趋化因子的核酸如SEQ ID NO:4所示；
编码新型冠状病毒B细胞抗原的核酸如SEQ ID NO:1所示。
8.根据权利要求6或7所述的核酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
9.重组载体，其包括载体骨架和权利要求6～8任一项所述的核酸。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述载体骨架包括pVR。
11.转化或转染权利要求9或10所述重组载体的宿主。
12.根据权利要求11所述的宿主，其特征在于，包括模式动物和/或哺乳动物细胞。
13.权利要求1～5任一项所述的重组抗原的制备方法，其特征在于，培养权利要求11或12所述的宿主，获得含有所述重组抗原的培养物。
14.如下I)～V)所示中至少一种在制备防治新型冠状病毒的疫苗中的应用:
I)、权利要求1～5任一项所述的重组抗原；
II)、权利要求6～8任一项所述的核酸；
III)、权利要求9或10所述的重组载体；
IV)、权利要求11或12所述的宿主；
V)、权利要求13所述的制备方法制得的含有重组抗原的培养物。
15.新型冠状病毒疫苗，其原料包括如下i)～v中的任意一种或多种：
i)、权利要求1～5任一项所述的重组抗原；
ii)、权利要求6～8任一项所述的核酸；
iii)、权利要求9或10所述的重组载体；
iv)、权利要求11或12所述的宿主；
v)、权利要求13所述的制备方法制得的含有重组抗原的培养物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211562525.5A CN115975053A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 靶向新型冠状病毒的疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211562525.5A CN115975053A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 靶向新型冠状病毒的疫苗 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115975053A true CN115975053A (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=85973032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211562525.5A Pending CN115975053A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 靶向新型冠状病毒的疫苗 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115975053A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116574195A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-08-11 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种新型冠状病毒抗体及其在无传播风险口腔液检测中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029728A1 (en) * | 1997-12-11 | 1999-06-17 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method and composition to enhance the efficacy of a vaccine using chemokines |
| CN111744003A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-09 | 中国人民解放军总医院第二医学中心 | 趋化因子cx3cl1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗 |
| CN112979829A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-06-18 | 诺未科技（北京）有限公司 | 融合蛋白及其在制备靶向新冠病毒sars-cov-2的疫苗中的应用 |
| WO2021216467A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | The Regents Of The University Of California | A nano-enabled vaccination approach for coronavirus disease (covid-19) and other viral diseases |
-
2022
- 2022-12-07 CN CN202211562525.5A patent/CN115975053A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029728A1 (en) * | 1997-12-11 | 1999-06-17 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method and composition to enhance the efficacy of a vaccine using chemokines |
| WO2021216467A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | The Regents Of The University Of California | A nano-enabled vaccination approach for coronavirus disease (covid-19) and other viral diseases |
| CN111744003A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-09 | 中国人民解放军总医院第二医学中心 | 趋化因子cx3cl1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗 |
| CN112979829A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-06-18 | 诺未科技（北京）有限公司 | 融合蛋白及其在制备靶向新冠病毒sars-cov-2的疫苗中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAILONG QI等: "Immunogenicity of the Xcl1-SARS-CoV-2 Spike Fusion DNA Vaccine for COVID-19", 《VACCINES》, vol. 10, 8 March 2022 (2022-03-08), pages 1 - 13 * |
| 庄素素等: "新型冠状病毒抗原表位融合蛋白的设计制备及免疫特性研究", 《药物生物技术》, vol. 29, no. 01, 28 February 2022 (2022-02-28), pages 1 - 7 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116574195A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-08-11 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种新型冠状病毒抗体及其在无传播风险口腔液检测中的应用 |
| CN116574195B (zh) * | 2023-07-07 | 2023-09-29 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种新型冠状病毒抗体及其在无传播风险口腔液检测中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113943373B (zh) | 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用 | |
| CN110317278B (zh) | Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用 | |
| CN112575008B (zh) | 编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子以及新型冠状病毒疫苗 | |
| WO2022071513A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン | |
| CN115850396A (zh) | 一种rsv纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN112552413A (zh) | 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗 | |
| CN115975053A (zh) | 靶向新型冠状病毒的疫苗 | |
| CN112442514A (zh) | 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒 | |
| CN116284351A (zh) | 一种人工抗体的制备方法 | |
| CN114163505A (zh) | 猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN116284272B (zh) | 一种广谱抗牛科病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用 | |
| CN107335054B (zh) | 一种慢性乙肝治疗性dc疫苗 | |
| CN117940463A (zh) | Ccl26的用途 | |
| US9340815B2 (en) | Spontaneously immortalized avian cell line | |
| CN115322247A (zh) | 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用 | |
| CN113248576A (zh) | 一种针对冠状病毒的核酸疫苗及其制备方法 | |
| CN116904489B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用 | |
| CN109568574B (zh) | sPD1蛋白和/或sPD1基因作为免疫佐剂的应用 | |
| CN112745384A (zh) | 猪pd-l14qn-gf表位多肽及其应用 | |
| CN115845042B (zh) | 重组新型冠状病毒s蛋白三聚体疫苗组合物及其应用 | |
| CN114805600B (zh) | 猪圆环2d型框架嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及其制备方法与应用 | |
| CN110408602B (zh) | Pcv2-prrsv重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗 | |
| CN113186204B (zh) | 新型冠状病毒巴西株p．1突变株rbd的基因及其应用 | |
| CN113461828B (zh) | 针对2019-nCoV的重组蛋白疫苗及其制备方法 | |
| US20230227844A1 (en) | Cell-mediated sars-cov-2 vaccines, and preparation and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |