CN113186204B - 新型冠状病毒巴西株p．1突变株rbd的基因及其应用 - Google Patents

新型冠状病毒巴西株p．1突变株rbd的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因及其应用。本发明的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示。本发明通过优化野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因序列，并结合筛选确定了相对最佳序列，优化后序列产生的克隆表达效率比野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD序列表达效率大幅提高，从而，本发明的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因更有利于用于制备新型冠状病毒疫苗以应对新冠病毒巴西突变株的感染。

Description

新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因及其应用。
背景技术
发现于2019年底的新型冠状病毒（Severe acute respiratorysyndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2），引发了新型冠状病毒肺炎COVID-19，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、引发重症急性呼吸综合征的SARS-CoV和引发中东呼吸综合征的MERS-CoV。
冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒粒子呈不规则形状，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60-220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白（S，Spike Protein）；小包膜糖蛋白（E，Envelope Protein）；膜糖蛋白（M，Membrane Protein）。刺突糖蛋白（S）通过受体结合位点（RBD）结合宿主的血管紧张素转化酶2（ACE-2）进入细胞。S蛋白是病毒进入人体的关键，是疫苗和治疗性中和抗体的主要靶点。S蛋白的受体结合（RBD）结构域可与宿主ACE2受体结合，介导病毒入侵宿主细胞。
冠状病毒的核酸为非节段正链单股RNA，基因组为27-31kb，其遗传物质是RNA病毒中最长的，突变可以说是新冠病毒这类RNA病毒的最大特性。病毒入侵宿主细胞后，会大量复制自己来实现感染传播。在复制过程中，RNA病毒并没有校正机制，出现复制错误无法自行纠正，在大量的复制中就容易出现新的变异，而新的变异的结果是导致疫苗有效性降低或者失效的主要原因。
据世界卫生组织官网显示，目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，巴西突变株最早于2021年1月在抵达日本的巴西旅行者身上发现，并在该国快速传播和流行，目前已扩散到至少25个国家。巴西株P．1突变基因组含有至少16个特定的位点突变，其中Spike蛋白含有11个突变，包括引起疫苗传染性增强的N501Y突变，以及具有抗体抵抗的E484K突变。具体突变例如：L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，K417T，E484K，N501Y，H655Y，T1027I，V1176F。巴西出现了令人担心的情况，2020年底起，新病例开始激增，新增数量远超此前高峰期的数量。甚至以前感染过新冠已经康复的人们也重新受到变异病毒的侵袭。P．1突变体RBD区K417T，E484K，N501Y的组合可引起RBD构象的巨大变化，可能引起P．1的感染性和抗原性变化，从而影响自然感染或疫苗接种产生的抗体对病毒识别和中和的能力。总之，各地出现的多种变异病毒出现了传染性提高、逃避免疫的特点。1月27日，《柳叶刀》发表一篇研究报告称不排除变异病毒株P．1具有能够逃逸人类免疫反应的能力，而导致新冠肺炎患者的二次感染。
突变株名称 P．1突变株的特征
别称 501Y.V3
突变位点数量 17
Spike蛋白突变数量 10
RBD/Spike主要突变位点 N501Y、E484K、K417N/T
其它突变位点，包含N蛋白 ORF1b del、L18F、T20N、P26S
传染性 没有增强的证据
致病力 没有增强的证据
免疫逃逸 可能性较大，但需证据
发现时间及地点 2021年1月日本机场的巴西游客
主要传播地区 巴西、北欧、美国、韩国等
作为重组疫苗抗原组成，利用CHO、293T等细胞真核表达系统制备疫苗抗原是保证其免疫原性和正确高级结构的最佳途径之一。然而，突变株野生型病毒序列，即原始序列在真核表达系统一般来说表达水平很低，但作为疫苗研发而言，高表达水平是首要前提，其受多个环节的影响，例如，抗原编码的核苷酸序列，载体选择、宿主细胞选择，发酵工艺、培养工艺优化等等，在这些因素中，首要需解决问题的是蛋白基因编码序列。
因此，如何提供一种经过设计可高效表达的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD核苷酸序列，并对其进行表达应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的设计优化后的基因。
本发明的再一目的在于提供一种新型冠状病毒巴西株P．1突变株的表达蛋白。
本发明的再一目的在于提供编码的前述表达蛋白的基因。
本发明的再一目的在于提供编码的新型冠状病毒巴西株P．1突变株的表达基因。
本发明的再一目的在于提供含有前述基因或前述表达蛋白的基因的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有前述基因或前述表达蛋白的基因或前述表达基因或前述重组表达载体的宿主细胞。
本发明的再一目的在于提供利用前述基因制备新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的方法。
本发明的再一目的在于提供前述基因或前述表达蛋白的基因或前述表达基因或前述重组表达载体或前述宿主细胞在制备新型冠状病毒疫苗方面的应用。
根据本发明具体实施方式的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的设计优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示。
其中，SEQ ID NO.1：
AGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAACAATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACATACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTC
该序列是根据成熟的新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD蛋白序列优化而来，所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
SEQ ID NO.6：
GCTAGC CCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAACAATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACATACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC
其中，斜体“GCTAGC”和“GCGGCCGC”为酶切位点，下划线部分“CCACC”为KOZAK序列。
为了在宿主细胞特异性高表达，本发明选择人血清白蛋白信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO .11所示：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，优化后宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO .5所示：
ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGA
包含人血清白蛋白信号肽以及新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD基因的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
上述酶全长247个氨基酸，N端24个氨基酸为信号肽序列如SEQ ID NO .11所示：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR。
因此，成熟的新型冠状病毒巴西株P．1的RBD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
本发明还提供了新型冠状病毒巴西株P．1突变株的表达蛋白，所述表达蛋白包含信号肽序列和新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的氨基酸序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR；所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.10的第1-223位所示。
本发明还提供了编码前述新型冠状病毒巴西株P．1突变株的表达蛋白的基因或核苷酸序列，其中，所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1-669位所示。优选地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。进一步优选地，还包含KOZAK序列、酶切位点和/或终止子序列，所述KOZAK序列的核苷酸序列为CCACC；所述酶切位点选自：GCTAGC或GCGGCCGC。再进一步优选地，所述表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的表达基因，所述表达基因包含信号肽序列和新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因序列，所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1-669位所示。优选地，所述信号肽的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示。进一步优选地，还包含KOZAK序列、酶切位点和/或终止子序列，所述KOZAK序列的核苷酸序列为CCACC；所述酶切位点选自：GCTAGC或GCGGCCGC。再进一步优选地，所述表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了包含前述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的重组载体，其包含前述的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或前述任意一种的编码表达蛋白的基因或前述任意一种的表达基因的重组表达载体。优选为pcDNA3.1+、pcDNA3.3。将本发明的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因插入到质粒pcDNA3.1+的Nhel/Notl双酶切限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达载体。
本发明还提供新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的宿主细胞，其包含前述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因，或包含前述任意一种的编码表达蛋白的基因或前述任意一种的表达基因或包含前述任意一种的重组表达载体。宿主细胞优选为中国仓鼠CHO细胞、293细胞。中国仓鼠CHO细胞易实现大规模高密度培养、完整的蛋白糖基化修饰。宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽序列为人血清白蛋白信号肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR。
本发明还提供制备新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用含有前述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或前述任意一种的编码表达蛋白的基因或前述任意一种的表达基因的重组表达载体转化宿主细胞；
（2）培养宿主细胞，诱导新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的表达；
（3）回收并纯化所表达的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因。
本发明还提供了前述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或前述任意一种的表达蛋白或前述任意一种的编码表达蛋白的基因或前述任意一种的表达基因或前述任意一种的重组表达载体或前述任意一种的宿主细胞在制备新冠病毒疫苗方面的应用。优选的，新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示。运用基因工程手段产业化生产新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD蛋白，并配以合适的药学佐剂，将其应用于新型冠状病毒疫苗中。
本发明的有益效果：
本发明通过优化野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因序列，并结合筛选确定了相对最佳序列，优化后序列产生的克隆表达效率比野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD序列提高了约6倍，比经软件优化序列的克隆表达效率提高了约2-4倍。本发明的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD可诱导小鼠产生高滴度病毒中和抗体。本发明的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因可用于新型冠状病毒疫苗的生产中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示含有信号肽的如SEQ ID NO.6所示的优化后的RBD基因片段的电泳结果；
图2显示4种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较情况；
图3为RBD纯化样品SDS-PAGE图；
图4显示二免14天后小鼠血清抗RBD抗体滴度（RBD糖蛋白）；
图5显示假病毒中和试验结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1优化野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD序列
在野生型新型冠状病毒RBD氨基酸序列的基础上做如下优化，得到初步优化的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD核苷酸序列：
本发明按照中国仓鼠遗传密码子偏爱性，对编码序列中编码氨基酸序列的密码子进行优化，共获得3条候选优化序列。
根据密码子的偏爱性、实验室以往的蛋白高效表达经验、mRNA二级结构等因素考虑，优化获得SEQ ID NO.1：
AGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAACAATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACATACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTC
软件优化序列获得SEQ ID NO.2：
AGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGCGCTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCTTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGAATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTCTACAACTCCGCTTCCTTCTCGACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCTGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAAGTCCGTCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGAACAATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGTTGCGTCATCGCTTGGAACTCCAACAACCTCGACAGTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTGTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACACCATGCAACGGAGTGAAGGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCTACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTCTCCTTCGAGCTCTTGCACGCCCCTGCTACCGTGTGTGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTC
软件优化序列获得SEQ ID NO.3：
CGTGTTCAGCCTACCGAATCTATTGTTCGTTTTCCTAATATTACCAACCTGTGTCCTTTTGGTGAAGTCTTTAATGCTACCCGTTTTGCTTCAGTTTATGCATGGAATCGTAAACGTATTAGTAACTGTGTTGCAGATTATAGCGTTCTGTATAACAGCGCCAGCTTTAGTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACTAAACTGAATGATCTGTGTTTTACCAATGTTTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGCCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAcaATTGCCGATTATAATTATAAACTGCCGGATGATTTTACCGGTTGTGTGATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGCAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTTCTACCGAAATTTATCAGGCGGGCAGCACACCGTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAACTGTTATTTTCCTCTGCAGTCTTATGGTTTTCAGCCGACCTATGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGCGTTGTGGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCAACGGTTTGTGGTCCTAAAAAGTCAACCAATCTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC
其中，新型冠状病毒巴西株P．1突变株的野生型RBD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示：
AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTCACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAACGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC
本发明进一步在优化序列前插入信号肽序列、KOZAK序列CCACC和酶切位点GCTAGC，在优化序列末端加入终止密码子taa和酶切位点GCGGCCGC。
选取宿主细胞特异性高表达的人血清白蛋白信号肽序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示：
ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGA。
含有信号肽的优化后的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示：
SEQ ID NO.6：
GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAACAATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACATACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC
SEQ ID NO. 7：
GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGCGCTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCTTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGAATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTCTACAACTCCGCTTCCTTCTCGACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCTGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAAGTCCGTCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGAACAATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGTTGCGTCATCGCTTGGAACTCCAACAACCTCGACAGTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTGTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACACCATGCAACGGAGTGAAGGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCTACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTCTCCTTCGAGCTCTTGCACGCCCCTGCTACCGTGTGTGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC
SEQ ID NO. 8：
GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGACGTGTTCAGCCTACCGAATCTATTGTTCGTTTTCCTAATATTACCAACCTGTGTCCTTTTGGTGAAGTCTTTAATGCTACCCGTTTTGCTTCAGTTTATGCATGGAATCGTAAACGTATTAGTAACTGTGTTGCAGATTATAGCGTTCTGTATAACAGCGCCAGCTTTAGTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACTAAACTGAATGATCTGTGTTTTACCAATGTTTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGCCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAcaATTGCCGATTATAATTATAAACTGCCGGATGATTTTACCGGTTGTGTGATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGCAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTTCTACCGAAATTTATCAGGCGGGCAGCACACCGTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAACTGTTATTTTCCTCTGCAGTCTTATGGTTTTCAGCCGACCTATGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGCGTTGTGGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCAACGGTTTGTGGTCCTAAAAAGTCAACCAATCTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC
实施例2重组RBD蛋白的表达与纯化
将SEQ ID NO.6所示的完整目的基因（其电泳结果如图1所示），将该基因进行Nhel/Notl双酶切，之后连接到经过同样酶切的pcDNA3.1+真核表达载体中，得到重组载体；
将重组载体分别转化大肠杆菌，按常规方法进行质粒扩增，之后用天根生物有限公司试剂盒提取质粒。
转染中国仓鼠CHO细胞：按照Lipofectin试剂盒手册配制，得到DNA-脂质体混合物，并加入DMEM培养基培养的中国仓鼠CHO细胞中，37℃温育2h；换液成含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48h。
Neomycin抗性克隆筛选：把转染后的细胞从培养瓶中分离，按1×105细胞/孔加到96孔板中，以含500 μg/mL Neomycin的DMEM培养基(加10% BSF)继续培养转染后的细胞，经7d后，选取形成克隆的细胞，扩增培养到6孔板。
表达RBD克隆分析：NEO抗性克隆经培养后，以1.5×105/mL细胞密度接种到T25 培养瓶，在含5% CO2培养箱中37℃培养72h，取上清得到RBD蛋白。
以同样的方式构建含信号肽序列的野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株序列、及其优化株SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的表达载体，并进行转化、表达。
对获得的上清液进行鉴定，并分析RBD蛋白含量。
通过鉴定野生株序列、及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8均可表达新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD蛋白，对前述四种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较，结果见表1、图2。
包含人血清白蛋白信号肽以及新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
成熟的新型冠状病毒巴西株P．1突变株的RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
表1 4种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较（μg/mL）
Figure 499050DEST_PATH_IMAGE001
结果如表1所示，SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8表达的蛋白浓度分别为9.54μg/mL、3.61μg/mL、2.32μg/mL，均高于野生型序列所表达的蛋白浓度（1.44μg/mL），同时，SEQ ID NO.6表达的蛋白浓度显著高于SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所表达的蛋白浓度。
优化后序列SEQ ID NO.6产生的克隆表达效率是野生型新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD序列表达效率的约6.625倍，是经软件优化序列SEQ ID NO.7克隆表达效率的约2.64倍，是经软件优化序列SEQ ID NO.8克隆表达效率的约4.11倍。
通过10 kDa膜包对SEQ ID NO.6表达蛋白进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10 kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩液稀释后，通过离子交换层析进行纯化，备用。如图3所示，纯化获得的4μg和2μg RBD蛋白分子量在34kD左右，SDS-PAGE图显示4μg和2μg RBD蛋白条带均一，纯度较好。
实施例3小鼠免疫实验
取20只6～8周龄大的雌性BALB/c小鼠，随机分为以下各组：
免疫1组（10μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100μL疫苗。所用疫苗为10μg RBD+100 μg Al(OH)3，其中，RBD即为实施例2制备得到的CHO细胞表达的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD糖蛋白。按100 μL体积含有10 μg RBD和100μg Al(OH)3用生理盐水配伍疫苗。
免疫2组（5μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100 μL疫苗。所用疫苗为5 μg RBD+100μg Al(OH)3，其中，其中，RBD即为实施例2制备得到的CHO细胞表达的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD糖蛋白，按100μL体积含有5μg RBD和100μg Al(OH)3用生理盐水配伍疫苗。
佐剂对照组：第0、14天分别肌肉注射100μL疫苗，所用佐剂为100μg Al(OH)3。
生理盐水对照组：第0、14天分别肌肉注射100μL生理盐水。
以上各组均在第28天取血。
用ELISA法测各组小鼠血清中抗RBD的抗体滴度。操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M]. 科学出版社, 2008.。
结果如图4所示，二免两周10μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×106.13，5μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×105.39，而佐剂组为1×101.63，生理盐水组为1×101.74。免疫组（10μg或者5μg组）的抗体滴度远高于生理盐水对照组或佐剂对照组的抗体滴度。
实施例4假病毒中和试验
按照常规方法进行假病毒中和试验，假病毒购自北京天坛药物生物技术开发公司，产品号80045，具体操作方法参照其产品说明书。中和抗体在体外与假病毒中和，使得假病毒丧失感染细胞的能力，进入细胞的假病毒会表达fluc蛋白，与发光底物反应后，通过机器检测其发光值，通过与假病毒对照组发光值比较，计算其抑制百分比，通过计算公式可以计算出当假病毒50%被抑制时抗体的稀释倍数，来计算其ED50，用ED50来表示抗体对假病毒中和活性大小。
计算中和抑制率：
Figure 353874DEST_PATH_IMAGE002
其中，VC-病毒对照VC，CC-细胞对照CC。
中和抗体滴度被表示为抑制率为50%时对应的血清稀释度的倒数或者抑制率为50%时对应的抗体浓度。
阳性判断值：中和实验过程中需要设置阴性对照，阳性对照，作为参照，来判断实验是否成立，阴性对照ED50小于30，阳性ED50大于30作为判断值。
结果如图5所示，二免两周高剂量10 μg免疫组小鼠病毒中和抗体滴度可达1×102.44，低剂量5 μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×102.14，而佐剂组为1：10，生理盐水组未检测到中和抗体。高剂量10 μg免疫组（10 μg RBD+100 μg Al(OH)3）和低剂量5 μg免疫组（5 μg RBD+100 μg Al(OH)3）的病毒中和抗体滴度＞1：100，明显高于佐剂对照组和生理盐水对照组。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京华芢生物技术有限公司
<120> 新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD的基因及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtgcagc caacagagag catcgtgagg ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60
ggcgaggtgt tcaacgcaac aaggttcgcc agcgtgtacg cctggaacag aaaaaggatc 120
agcaactgcg tggcagacta cagtgtgctg tacaactccg cctccttctc caccttcaaa 180
tgctatggcg tgtcccccac caagctgaac gatctgtgtt ttaccaacgt gtacgccgac 240
tccttcgtga ttaggggcga cgaggtgcgc cagatcgctc ctggacagac aggaacaatc 300
gccgactata actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgattgc ttggaactcc 360
aacaacctgg acagtaaagt gggcggcaac tacaattacc tgtacagact gttcaggaag 420
agcaacctga aacccttcga aagagacatc tccacagaga tctaccaggc cggcagcacc 480
ccatgtaacg gagtgaaggg atttaactgc tacttccccc tgcagtccta cggcttccag 540
ccaacatacg gcgtgggcta ccagccttac agggtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg 600
cacgcccccg ctacagtgtg tggacctaag aagtccacca acctggtgaa aaacaaatgt 660
gtcaatttc 669
<210> 2
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtgcagc caacagagag catcgtgcgc ttccccaaca tcacaaacct gtgccccttc 60
ggcgaggtgt tcaacgctac caggttcgct tccgtgtacg cctggaacag gaagagaatc 120
tccaactgcg tggctgacta ctccgtcctc tacaactccg cttccttctc gaccttcaag 180
tgctacggtg tgtcccctac caagctgaac gacctctgct tcaccaacgt ctacgctgac 240
tccttcgtga tccgcggcga cgaagtccgt caaatcgctc ctggtcagac cggaacaatc 300
gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggtt gcgtcatcgc ttggaactcc 360
aacaacctcg acagtaaggt gggtggtaac tacaactacc tgtaccgcct gttccgcaag 420
agcaacctga agcccttcga aagggacatc tccaccgaga tctaccaggc cggctccaca 480
ccatgcaacg gagtgaaggg tttcaactgc tacttccccc tgcaatccta cggtttccag 540
cccacctacg gtgtgggata ccagccttac cgcgtggtgg tgctctcctt cgagctcttg 600
cacgcccctg ctaccgtgtg tggtcctaag aagtccacca acctcgtgaa aaacaaatgt 660
gtcaatttc 669
<210> 3
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtgttcagc ctaccgaatc tattgttcgt tttcctaata ttaccaacct gtgtcctttt 60
ggtgaagtct ttaatgctac ccgttttgct tcagtttatg catggaatcg taaacgtatt 120
agtaactgtg ttgcagatta tagcgttctg tataacagcg ccagctttag tacctttaaa 180
tgttatggtg tgagtccgac taaactgaat gatctgtgtt ttaccaatgt ttatgcagat 240
agctttgtta ttcgtggtga tgaagttcgc cagattgcac cgggtcagac cggtacaatt 300
gccgattata attataaact gccggatgat tttaccggtt gtgtgattgc ctggaattca 360
aataatctgg atagcaaagt gggtggtaat tataattatc tgtatcgtct gtttcgcaaa 420
agcaatctga aaccgtttga acgtgatatt tctaccgaaa tttatcaggc gggcagcaca 480
ccgtgtaatg gtgttaaagg ttttaactgt tattttcctc tgcagtctta tggttttcag 540
ccgacctatg gtgttggtta tcagccgtat cgcgttgtgg ttctgagttt tgaactgctg 600
catgccccgg caacggtttg tggtcctaaa aagtcaacca atctggttaa aaacaaatgt 660
gtcaatttc 669
<210> 4
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60
ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120
agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180
tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct tcactaatgt ctatgcagat 240
tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaacgatt 300
gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360
aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420
tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480
ccttgtaatg gtgttaaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540
cccacttatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600
catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660
gtcaatttc 669
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60
gtgtttcgtc ga 72
<210> 6
<211> 763
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60
attccagggg tgtgtttcgt cgaagagtgc agccaacaga gagcatcgtg aggttcccca 120
acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc aacaaggttc gccagcgtgt 180
acgcctggaa cagaaaaagg atcagcaact gcgtggcaga ctacagtgtg ctgtacaact 240
ccgcctcctt ctccaccttc aaatgctatg gcgtgtcccc caccaagctg aacgatctgt 300
gttttaccaa cgtgtacgcc gactccttcg tgattagggg cgacgaggtg cgccagatcg 360
ctcctggaca gacaggaaca atcgccgact ataactacaa gctgcccgac gacttcaccg 420
gctgcgtgat tgcttggaac tccaacaacc tggacagtaa agtgggcggc aactacaatt 480
acctgtacag actgttcagg aagagcaacc tgaaaccctt cgaaagagac atctccacag 540
agatctacca ggccggcagc accccatgta acggagtgaa gggatttaac tgctacttcc 600
ccctgcagtc ctacggcttc cagccaacat acggcgtggg ctaccagcct tacagggtgg 660
tggtgctgtc ttttgagctg ctgcacgccc ccgctacagt gtgtggacct aagaagtcca 720
ccaacctggt gaaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763
<210> 7
<211> 763
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60
attccagggg tgtgtttcgt cgaagagtgc agccaacaga gagcatcgtg cgcttcccca 120
acatcacaaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc taccaggttc gcttccgtgt 180
acgcctggaa caggaagaga atctccaact gcgtggctga ctactccgtc ctctacaact 240
ccgcttcctt ctcgaccttc aagtgctacg gtgtgtcccc taccaagctg aacgacctct 300
gcttcaccaa cgtctacgct gactccttcg tgatccgcgg cgacgaagtc cgtcaaatcg 360
ctcctggtca gaccggaaca atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg 420
gttgcgtcat cgcttggaac tccaacaacc tcgacagtaa ggtgggtggt aactacaact 480
acctgtaccg cctgttccgc aagagcaacc tgaagccctt cgaaagggac atctccaccg 540
agatctacca ggccggctcc acaccatgca acggagtgaa gggtttcaac tgctacttcc 600
ccctgcaatc ctacggtttc cagcccacct acggtgtggg ataccagcct taccgcgtgg 660
tggtgctctc cttcgagctc ttgcacgccc ctgctaccgt gtgtggtcct aagaagtcca 720
ccaacctcgt gaaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763
<210> 8
<211> 763
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60
attccagggg tgtgtttcgt cgacgtgttc agcctaccga atctattgtt cgttttccta 120
atattaccaa cctgtgtcct tttggtgaag tctttaatgc tacccgtttt gcttcagttt 180
atgcatggaa tcgtaaacgt attagtaact gtgttgcaga ttatagcgtt ctgtataaca 240
gcgccagctt tagtaccttt aaatgttatg gtgtgagtcc gactaaactg aatgatctgt 300
gttttaccaa tgtttatgca gatagctttg ttattcgtgg tgatgaagtt cgccagattg 360
caccgggtca gaccggtaca attgccgatt ataattataa actgccggat gattttaccg 420
gttgtgtgat tgcctggaat tcaaataatc tggatagcaa agtgggtggt aattataatt 480
atctgtatcg tctgtttcgc aaaagcaatc tgaaaccgtt tgaacgtgat atttctaccg 540
aaatttatca ggcgggcagc acaccgtgta atggtgttaa aggttttaac tgttattttc 600
ctctgcagtc ttatggtttt cagccgacct atggtgttgg ttatcagccg tatcgcgttg 660
tggttctgag ttttgaactg ctgcatgccc cggcaacggt ttgtggtcct aaaaagtcaa 720
ccaatctggt taaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763
<210> 9
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile
20 25 30
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe
65 70 75 80
Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu
100 105 110
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn
115 120 125
Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser
130 135 140
Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg
145 150 155 160
Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr
165 170 175
Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe
180 185 190
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly
195 200 205
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
210 215 220
His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val
225 230 235 240
Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
245
<210> 10
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
20

Claims (9)

1.新型冠状病毒巴西株P．1突变株受体结合结构域（RBD）基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-669位所示。
2.编码新型冠状病毒巴西株P．1突变株的表达蛋白的基因，其特征在于：所述表达蛋白包含信号肽序列和新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的氨基酸序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.10的第1-223位所示；所述新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1-669位所示，和所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述的表达蛋白的基因，其特征在于：还包含KOZAK序列、酶切位点和/或终止子序列，
所述KOZAK序列的核苷酸序列为：CCACC；
所述酶切位点选自：GCTAGC或GCGGCCGC。
4.根据权利要求3所述的表达蛋白的基因，其特征在于：所述表达蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或包含权利要求2-4任意一项所述的编码所述表达蛋白的基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体选自：pcDNA3.1+、pcDNA3.3。
7.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求1所述的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因，或包含权利要求2-4任意一项所述的编码所述表达蛋白的基因，或包含权利要求5-6任意一项所述的重组表达载体。
8.一种制备新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）用含有权利要求1所述的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或权利要求2-4任意一项所述的编码所述表达蛋白的基因的重组表达载体转化宿主细胞；
（2）培养宿主细胞，诱导新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的表达；
（3）回收并纯化所表达的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因的蛋白。
9.权利要求1所述的新型冠状病毒巴西株P．1突变株RBD基因或权利要求2-4任意一项所述的编码所述表达蛋白的基因或权利要求5-6任意一项所述的重组表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒疫苗的应用。
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