CN112877351A - 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用，属于抗病毒药物技术领域。本发明通过密码子优化新冠病毒S1蛋白中的RBD区域蛋白的编码序列插入载体中，再利用乳酸杆菌安全高效地表达，得到重组表达S1蛋白，使其能作为粘膜感染阻断喷剂，与人体呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面特异性受体(ACE2)结合，从而使得新冠病毒与机体黏膜表面结合的位点被S1蛋白优先占位封闭，进而高效阻断和干扰新冠病毒与人粘膜特异性受体结合，预防新冠肺炎发生，减少新冠肺炎感染人群数量，快速阻遏其全球漫延。

Description

一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达 系统及其应用

本申请要求于2020年04月14日提交中国专利局、申请号为202010288793.7、发明名称为“一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于抗病毒药物技术领域，具体涉及一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用。

背景技术

新冠肺炎(COVID-19)是由一种新型冠状病毒(世界卫生组织将其命名为2019-nCOV；国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2)感染所致。冠状病毒(CoV)为直径80～120nm的正链单股RNA病毒，分为α、β、δ和γ等四个类型。其中，2003年非典(SARS-CoV)和2012年中东呼吸综合征(MERS-CoV)和2019年新冠肺炎病毒都属于β-冠状病毒，均引发了全球的严重的急性呼吸道感染疫病。新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)经中国科学家的研究证实，其基因组包括29891个核苷酸，包含两端非翻译区(untranslated regions，UTR)基因和一个完整的开放阅读框基因(open reading frame，ORF)，至少可以编码四种结构蛋白：刺突糖蛋白(spike，S)、小包膜糖蛋白(envelope，E)、膜糖蛋白(membrane，M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)，其基因组序列与MERS-CoV具有较高的同源性。

SARS-CoV-2的传播方式主要是以呼吸道飞沫传播为主，极少数是通过气溶胶、粪便等途径传播。如何快速遏制SARS-CoV-2在全球的传播和漫延，一是目前采取的各种生物安全措施，如居家隔离、减少人员流动以及各种消毒措施等，但其难度大，漏洞多，全社会付出的代价巨大，全世界除了中国，到目前为止还没有阻止病毒的快速漫延；二是加快疫苗研制，但疫苗研制周期长，生产工艺技术较复杂，成本较高，注射需要专业技术人员，很难在短时间内达到群体免疫效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其在制备预防新冠病毒感染的药物中的应用，通过阻断和干扰新冠病毒与粘膜特异性受体结合，从而预防和减少新冠肺炎，快速阻遏其全球漫延。

本发明提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组载体，包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列；所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

优选的，所述重组载体的基础载体包括乳酸杆菌分泌型表达载体。

优选的，所述乳酸杆菌分泌型表达载体包括pVE5523。

优选的，所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点为SalI和EcoRV。

本发明提供了一种包含所述重组载体的重组乳酸杆菌表达系统。

本发明提供了由所述重组乳酸杆菌表达系统中分泌表达的重组S1蛋白。

本发明提供了所述重组S1蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将所述重组乳酸杆菌表达系统在无菌环境下接种至乳酸杆菌专用培养基，在28～35℃条件下发酵68～75h，得到的发酵液中含重组S1蛋白。

本发明提供了所述重组载体、所述重组乳酸杆菌表达系统、权利要求6所述重组S1蛋白或所述制备方法制备的发酵液在制备防治新冠病毒感染的药物中的应用。

本发明提供了一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂，包括所述重组S1蛋白或所述制备方法得到的重组S1蛋白。

优选的，所述粘膜阻断剂包括口、鼻喷剂或滴眼液。

本发明提供的用于防治新冠病毒感染的重组载体和重组乳酸杆菌表达系统，是通过密码子优化新冠病毒S1蛋白中的RBD区域蛋白的编码序列插入载体中，再利用乳酸杆菌安全高效地表达，得到重组表达S1蛋白，使其能作为粘膜感染阻断喷剂，与人体呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面特异性受体(ACE2)结合，从而新冠病毒与机体黏膜表面结合的位点被S1蛋白优先占位封闭，进而高效阻断和干扰新冠病毒与人粘膜特异性受体(ACE2)结合，从而预防新冠肺炎发生，减少新冠肺炎感染人群数量，快速阻遏其全球漫延。

本发明的一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂。由于SARS-CoV-2的传播方式主要是以呼吸道飞沫传播为主，极少数是通过气溶胶、粪便等传播，切断新冠病毒表面的S1蛋白与呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面ACE2受体的结合，阻断病毒感染路径就可有效降低新冠病毒感染，具有以下特点：

1)相比于疫苗，重组新冠病毒S1蛋白，只包含病毒功能性蛋白，无病毒感染基因存在，不会导致病毒变异，且是外用制剂，安全性高；

2)重组S1蛋白分泌到胞外，属于可溶性的表达产物，同时乳酸杆菌是人体内常见的益生菌，被公认为最安全的食品级微生物，用乳酸菌表达的S1蛋白无需提取纯化，省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程，大大降低了粘膜阻断剂的生产成本，利于快速工业化生产；

3)所述粘膜阻断剂可多次重复使用，不仅无毒、无害，而且可诱导粘膜免疫，进一步减少病毒感染风险，可用于专业医务人员上岗前使用，或乘坐密闭交通工具和办公场所使用，或社区、家庭预防感染使用。

附图说明

图1为重组载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1载体图谱；

图2为重组载体的测序结果与插入的核苷酸片段进行序列比对结果；

图3为重组载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1的荧光定量PCR扩增曲线；

图4-1为重组S1蛋白WesternBlot鉴定；其中M：Marker 26616；1：重组乳酸杆菌上清20μl；2：重组乳酸杆菌沉淀20μl；

图4-2为重组S1蛋白考马斯亮蓝染色分析结果；其中，M:Marker 26616；1：重组乳酸杆菌上清20μl；2：重组乳酸杆菌沉淀20μl；3：BCA标准品8.8ng/μl；4：BCA标准品17.59ng/μl；5：BCA标准品35.19ng/μl；6：BCA标准品70.375ng/μl；7：BCA标准品140.75ng/μl；8：BCA标准品281.5ng/μl；9：BCA标准品563ng/μl。

具体实施方式

本发明提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组载体，包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列；所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

在本发明中，所述重组载体的基础载体优选包括乳酸杆菌分泌型表达载体。本发明对所述乳酸杆菌分泌型表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的乳酸杆菌分泌型表达载体即可。为了举例说明重组载体的种类，在本发明实施例中，所述乳酸杆菌分泌型表达载体为pVE5523。所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点优选为SalI和EcoRV。

在本发明中，所述编码序列是新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白按照乳酸杆菌密码子偏好进行优化得到的，同时进行两次重复，有利于提高蛋白表达量，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示(gtcgacatgtacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagatattgcttaaacaagatgcggtcgacgtcgacatgtacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccatgatatc)，便于后续插入到乳酸杆菌分泌型表达载体中高效表达。以新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白作为人体粘膜表面ACE2(AngiotensinConverting Enzyme 2，血管紧张素转换酶2)受体结合的新冠病毒特异性蛋白，能够有效竞争新冠病毒的结合位点，同时使用安全，防止新冠病毒的感染。

在本发明中，所述重组载体的构建方法，优选包括以下步骤：

A.将编码序列和基础载体采用相同的限制性内切酶酶切，分别得到带有粘性末端的编码序列和基础载体；

B.将所述带有粘性末端的编码序列和基础载体连接，筛选，得到重组载体。

在本发明中，所述限制性内切酶酶切的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切方法即可。当所述基础载体为pVE5523时，所述限制性内切酶的种类优选为SalI和EcoR，重组载体的图谱见图1。

在本发明中，所述连接的方法优选采用T4连接酶连接。

在本发明中，所述筛选方法优选将重组载体导入大肠杆菌中，经培养后提取质粒，将质粒进行测序、比对，与插入的编码序列一致的重组载体为重组载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1(序列为SEQ ID No.2)，用于后续操作。

本发明提供了一种包含所述重组载体的重组乳酸杆菌表达系统。

在本发明中，所述重组乳酸杆菌表达系统中乳酸杆菌的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的乳酸杆菌即可。为了举例说明重组乳酸杆菌表达系统的组成，本发明实施例中，所述乳酸杆菌的种类采用ATCC393干酪乳杆菌进行实验。

在本发明中，所述重组乳酸杆菌表达系统的制备方法，优选将所述重组载体转化乳酸杆菌感受态中，筛选，得到重组乳酸杆菌表达系统。所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。在本发明实施例中，所述转化采用电转化方法。

所述筛选方法优选将大肠杆菌涂布在含红霉素的MRS固体培养板上，静置培养；挑取阳性克隆，接种到含红霉素的MRS液体培养基中静置培养；提取重组质粒质粒，采用荧光定量PCR进行鉴定。荧光定量PCR的引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。荧光定量PCR反应的扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID No.5。阳性重组质粒具有典型的扩增曲线，ATCC393感受态对照没有扩增曲线，表明pVE5523-SARS-CoV-2-S1质粒成功转化到了ATCC393感受态细胞中。

本发明提供了由所述重组乳酸杆菌表达系统中分泌表达的重组S1蛋白。

本发明提供了所述重组S1蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将所述重组乳酸杆菌表达系统在无菌环境下接种至乳酸杆菌液体培养基，在28～35℃条件下发酵68～75h，将得到的发酵液在5000～6000rpm离心15～30min，取上清液得到重组S1蛋白。

本发明对所述乳酸杆菌液体培养基的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养乳酸杆菌的培养基即可。在本发明实施例中，所述乳酸杆菌液体培养基为MRS液体培养。所述重组乳酸杆菌表达系统的培养温度为34～36℃，所述发酵的时间优选为72h。所述离心的温度优选为4℃。

在本发明中，经检测，所述重组S1蛋白的质量占乳酸杆菌总蛋白质量的10％。

本发明提供了所述重组载体、所述重组乳酸杆菌表达系统、所述重组S1蛋白或所述制备方法制备的发酵液在制备防治新冠病毒感染的药物中的应用。

本发明提供了一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂，包括所述重组S1蛋白或所述制备方法制备得到的重组S1蛋白。所述粘膜阻断剂优选包括口、鼻喷剂和滴眼液。在粘膜阻断剂中，所述S1蛋白浓度范围优选为10ng/ml～50ng/ml。所述粘膜阻断剂的人用剂量优选为0.2ml/人/次，每天2次，其中喷鼻剂量优选为0.1ml/人/次，滴眼剂量优选为0.1ml/人/次。本发明对所述口、鼻喷剂和/或滴眼液的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

密码子优化的新型冠状病毒SARS-CoV-2的S1基因(SARS-CoV-2-S1)

新型冠状病毒SARS-CoV-2的S1蛋白是病毒与宿主表面ACE2受体结合、介导病毒进入宿主细胞的关键表面蛋白。筛选SARS-CoV-2的S1蛋白中与ACE2特异性结合区域的基因序列，并对序列进行乳酸杆菌密码子优化，改造后序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行人工合成，SARS-CoV-2-S的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

重组表达载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1的构建方法

1材料与方法

1.1材料及来源

限制性内切酶SalI、EcoRV均购自NEB公司；Taq酶、dNTP、DNAMarker DL2000、DL15000、Agarose Gel DNA Purification Kit、Mini BEST Plasmid PurificationKit购自大连宝生物公司。克隆载体pVE5523由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

克隆载体pVE5523以SalI/EcoRV双酶切后的小片段，与用同样双酶切的SARS-CoV-2-S1基因片段连接，经连接产物转化入大肠杆菌中，经培养，采用试剂盒提取质粒，将提取的质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序验证。

2试验结果

重组质粒测序结果：重组质粒经基因测序后与插入的S1基因片段(单个重复序列)进行序列比对(见图2)，测序结果与预期相符，说明合成的SARS-CoV-2-S1基因片段成功插入到乳酸杆菌分泌型载体pVE5523中，重组质粒构建成功，阳性质粒命名为pVE5523-SARS-CoV-2-S1。

实施例3

重组乳酸杆菌表达系统的制备及检测方法

1材料与方法

1.1材料及来源

红霉素(Emr)购自拜尔迪生物技术有限公司。

1.2试验方法

将pVE5523-SARS-CoV-2-S1重组载体经电转化进入乳酸杆菌ATCC393感受态中，电转化后的乳酸杆菌ATCC393涂布于含5μg/ml红霉素的MRS固体培养板上，在30℃培养箱中培养72h，将平板上的菌落挑斑后接种到含5μg/ml红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养72h；提取细菌中的质粒，以ATCC393感受态为对照，采用荧光定量PCR进行鉴定，鉴定引物及扩增序列如下：

上游引物：ccaaccatacagagtagtagta(SEQ ID No.3)

下游引物：gttagactcagtaagaacacct(SEQ ID No.4)；

荧光定量PCR的反应体系共计25μl：

荧光定量PCR的反应程序：预变性95℃5min；循环反应95℃10s，60℃30s，40循环；融解曲线95℃15s，60℃60s，95℃15s；按以上参数在荧光定量PCR仪上测试。

扩增序列如下：

ccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaac(SEQ ID No.5)。

2试验结果

采用荧光定量PCR对扩增的重组质粒进行检测，结果如图3所示。由扩增曲线可以看出，阳性重组质粒具有典型的扩增曲线，CT值在19～22范围内变化，而ATCC393感受态对照没有扩增曲线。结果表明pVE5523-SARS-CoV-2-S1质粒成功转化到了ATCC393感受态细胞中。

实施例4

重组乳酸杆菌表达系统的培养方法及重组S1蛋白的分离

将重组乳酸杆菌表达系统以1％比例接种乳酸杆菌MRS液体培养基，35℃，72h后收获发酵液。

重组S1蛋白的分离及检测：将上述收获的发酵液在4℃，8000rpm条件下离心15min，收获上清液。将上清液分别进行4℃透析和冷冻干燥以50倍浓缩蛋白，浓缩后加入1×SDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸10min，1000g离心10min，取上清10μl上样进行SDS-PAGE电泳分析。

重组S1蛋白含量检测：乳酸杆菌平板表面散布法活菌技术，然后计算，S1蛋白含量占乳酸杆菌总蛋白含量的10％。

重组S1蛋白定性分析：利用S1蛋白特异性抗体(北京义翘神州SARS-Cov-2 SpikeNeutralizing antibody,Cat:40592-R001)对聚丙烯酰胺凝胶进行Westernblot分析。

结果如图4-1所示，重组S1蛋白不能产生明显的条带，说明重组S1蛋白在上清液中不表达或表达含量较低。

进一步对重组S1蛋白定量分析：将聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色脱色，脱色后的凝胶用蛋白凝胶成像仪进行拍摄。

结果如图4-2所示，通过结合Westernblot图中目的蛋白条带，在脱色后的聚丙烯酰胺凝胶中上清样本未发现相应条带。进一步证实重组S1蛋白在上清液中不表达或表达含量较低。

实施例5

将实施例4制备的重组S1蛋白稀释至10ng/ml的溶液。将稀释S1蛋白溶液以喷剂的形式对SPF新西兰兔和SD大鼠给药，同时设置阴性对照组A喷雾同体积的生理盐水、对照组B喷雾同体积的MRS培养液，每组新西兰兔子和SD大鼠各4只，观察2周，24只动物均没有出现体温异常、过敏以及呼吸道感染等异常不良现象。这表明本发明制备的重组S1蛋白安全、无副作用。

实施例6

采用实施例4的方法进行重组乳酸杆菌表达系统发酵，收获的发酵液在4℃，8000rpm条件下离心15min，收获菌体。向菌体中加入500μl细胞裂解液重悬菌体并使用超声破碎仪进行裂解；在菌体裂解液中加入1ⅹSDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，同时将标准品蛋白(已知浓度)进行倍比稀释，加入1ⅹSDS凝胶加样缓冲液(含DTT)；将上述所以蛋白样品充分混匀，煮沸10min，1000g离心10min，取上清20μl上样进行SDS-PAGE电泳，分别做考马斯亮蓝染色和Westernblot分析。

重组S1蛋白定性分析：利用S1蛋白特异性抗体(北京义翘神州SARS-Cov-2 SpikeNeutralizing antibody,Cat:40592-R001)对聚丙烯酰胺凝胶进行Westernblot分析。

结果如图4-1所示，重组S1蛋白在重组乳酸杆菌中成功表达，蛋白主要存在于重组乳酸杆菌菌体蛋白中。

本实施例对重组S1蛋白定量分析：将聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色脱色，脱色后的凝胶用蛋白凝胶成像仪进行拍摄。

结果如图4-2所示，通过结合Westernblot图中目的蛋白条带，在脱色后的聚丙烯酰胺凝胶中对应位置找到目的条带。

利用ImageJ软件对聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白条带进行灰度分析，以标准品蛋白浓度为参照，对重组S1蛋白进行定量分析，结果如下表1所示，按照公式A计算重组S1蛋白在重组乳酸杆菌的表达量。

表1蛋白灰度分析

样品	标准品1	标准品2	标准品3	标准品4	标准品5	标准品6	目的条带
								灰度值	1.464	3.916	7.028	15.16	25.346	50.192	15.19
浓度(ng/μl)	17.6	35.2	70.4	140.75	281.5	563	141.03

重组S1蛋白浓度(μg/ml)＝目的条带浓度×500μl÷20ml 式A

经计算所述重组S1蛋白的浓度为3.53μg/ml，说明所述重组S1蛋白实现在乳酸杆菌表达系统中高效表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 文利新；董伟

<120> 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgacatgt acctgtatag attgtttagg aagtctaatc tcaaaccttt tgagagagat 60

atttcaactg aaatctatca ggccggtagc acaccttgta atggtgttga aggttttaat 120

tgttactttc ctttacaatc atatggtttc caacccacta atggtgttgg ttaccaacca 180

tacagagtag tagtactttc ttttgaactt ctacatgcac cagcaactgt ttgtggacct 240

aaaaagtcta ctaatttggt taaaaacaaa tgtgtcaatt tcaacttcaa tggtttaaca 300

ggcacaggtg ttcttactga gtctaacaaa aagtttctgc ctttccaaca atttggcaga 360

gatattgctt aaacaagatg cggtcgacgt cgacatgtac ctgtatagat tgtttaggaa 420

gtctaatctc aaaccttttg agagagatat ttcaactgaa atctatcagg ccggtagcac 480

accttgtaat ggtgttgaag gttttaattg ttactttcct ttacaatcat atggtttcca 540

acccactaat ggtgttggtt accaaccata cagagtagta gtactttctt ttgaacttct 600

acatgcacca gcaactgttt gtggacctaa aaagtctact aatttggtta aaaacaaatg 660

tgtcaatttc aacttcaatg gtttaacagg cacaggtgtt cttactgagt ctaacaaaaa 720

gtttctgcct ttccaacaat ttggcagaga cattgctgac actactgatg ctgtccgtga 780

tccacagaca cttgagattc ttgacattac accatgttct tttggtggtg tcagtgttat 840

aacaccatga tatc 854

<210> 2

<211> 8797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 60

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 120

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 180

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 240

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 300

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 360

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 420

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 480

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 540

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 600

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 660

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 720

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 780

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 840

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 900

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 960

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 1020

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 1080

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 1140

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 1200

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 1260

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 1320

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 1380

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 1440

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 1500

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 1560

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 1620

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 1680

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 1740

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 1800

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 1860

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 1920

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 1980

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 2040

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 2100

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag ctcgaaatta accctcacta aagggaacaa 2160

aagctggtac cgggcccccc ctcgacggta tcgatagccc gcctaatgag cgggcttttt 2220

tttgatcccc taaccaaaga agcgcgtaat atcagggttt aagagacaat aagaaaaaaa 2280

gattgaaaaa gtgacattaa attcttgaca gggagagata ggtttgatag aatataatag 2340

gggtaccgag ctcgaattcc tgcagcccaa atcgcgaaac cgaacttaat gggaggaaaa 2400

attaaaaaag aacagttatg aaaaaaaaga ttatctcagc tattttaatg tctacagtga 2460

tactttctgc tgcagccccg ttgtcaggtg tttacgctga cacaaactca gatattgcta 2520

aacaagatgc ggtcgacgtc gacatgtacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca 2580

aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg 2640

gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg 2700

gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag 2760

caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt gtcaatttca 2820

acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag tttctgcctt 2880

tccaacaatt tggcagagat attgcttaaa caagatgcgg tcgacgtcga catgtacctg 2940

tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc 3000

tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt gttgaaggtt ttaattgtta ctttccttta 3060

caatcatatg gtttccaacc cactaatggt gttggttacc aaccatacag agtagtagta 3120

ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat 3180

ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcaac ttcaatggtt taacaggcac aggtgttctt 3240

actgagtcta acaaaaagtt tctgcctttc caacaatttg gcagagacat tgctgacact 3300

actgatgctg tccgtgatcc acagacactt gagattcttg acattacacc atgttctttt 3360

ggtggtgtca gtgttataac accatgatat cgatatcgct agttctagat tgaggcatca 3420

aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt 3480

gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gctctagcta agcagaaggc catcctgacg 3540

gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt gttggggatc cgcctgcagc caagcttatc 3600

gattctagac tcgagagctc tcgagtctag aatcgatacg attttgaagt ggcaacagat 3660

aaaaaaaagc agtttaaaat tgttgctgaa cttttaaaac aagcaaatac aatcattgtc 3720

gcaacagata gcgacagaga aggcgaaaac attgcctggt cgatcattca taaagcaaat 3780

gccttttcta aagataaaac gtataaaaga ctatggatca atagtttaga aaaagatgtg 3840

atccgtagcg gttttcaaaa tttgcaacca ggaatgaatt actatccctt ttatcaagaa 3900

gcgcacaaaa agaaaaacga aatgatacac caatcagtgc aaaaaaagat ataatgggag 3960

ataagacggt tcgtgttcgt gctgacttgc accatatcat aaaaatcgaa acagcaaaga 4020

atggcggaaa cgtaaaagaa gttatggaaa taagacttag aagcaaactt aagagtgtgt 4080

tgatagtgca gtatcttaaa attttgtata ataggaattg aagttaaatt agatgctaaa 4140

aatttgtaat taagaaggag tgattacatg aacaaaaata taaaatattc tcaaaacttt 4200

ttaacgagtg aaaaagtact caaccaaata ataaaacaat tgaatttaaa agaaaccgat 4260

accgtttacg aaattggaac aggtaaaggg catttaacga cgaaactggc taaaataagt 4320

aaacaggtaa cgtctattga attagacagt catctattca acttatcgtc agaaaaatta 4380

aaactgaata ctcgtgtcac tttaattcac caagatattc tacagtttca attccctaac 4440

aaacagaggt ataaaattgt tgggagtatt ccttaccatt taagcacaca aattattaaa 4500

aaagtggttt ttgaaagcca tgcgtctgac atctatctga ttgttgaaga aggattctac 4560

aagcgtacct tggatattca ccgaacacta gggttgctct tgcacactca agtctcgatt 4620

cagcaattgc ttaagctgcc agcggaatgc tttcatccta aaccaaaagt aaacagtgtc 4680

ttaataaaac ttacccgcca taccacagat gttccagata aatattggaa gctatatacg 4740

tactttgttt caaaatgggt caatcgagaa tatcgtcaac tgtttactaa aaatcagttt 4800

catcaagcaa tgaaacacgc caaagtaaac aatttaagta ccgttactta tgagcaagta 4860

ttgtctattt ttaatagtta tctattattt aacgggagga aataattcta tgagtcgctt 4920

ttgtaaattt ggaaagttac acgttactaa agggaatgta gataaattat taggtatact 4980

actgacagct tccaaggagc taaagaggtc cctagcgctt agaatcgctt taggaaacac 5040

gatccagtcc aataatcgtc gataaaaact tttgaaaaag gttggtgaaa ttacctactt 5100

ttggaataat cacaaatcac aagtgattaa tcacaaatca caagtgatta atcacttgtt 5160

tattaagata ttaaaagcta taatttaaat aaagcgtgaa ttttattaca caaaaagagg 5220

ggggagaaac ttggaactag catttagaga aagcttaaaa aagatgagag gtaccaaatc 5280

aaaagaaaaa ttctcccaag aattagaaat gagtagatca aattattcac gaatagaatc 5340

aggaaaatca gatccaacca taaaaacact agaacaaatt gcaaagttaa ctaactcaac 5400

gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc aacagaacca gaaccagaaa cagaatcaga 5460

acaagtaaca ttggatttag aaatggaaga agaaaaaagc aatgacttcg tgtgaataat 5520

gcacgaaatc gttgcttatt ttttttaaaa gcggtatact agatataacg aaacaacgaa 5580

ctgaatagaa acgaaaaaag agccatgaca catttataaa atgtttgacg acattttata 5640

aatgcatagc ccgataagat tgccaaacca acgcttatca gttagtcaga tgaactcttc 5700

cctcgtaaga agttatttaa ttaactttgt ttgaagacgg tatataaccg tactatcatt 5760

atatagggaa atcagagagt tttcaagtat ctaagctact gaatttaaga attgttaagc 5820

aatcaatcgg aaatcgtttg attgcttttt ttgtattcat ttatagaagg tggagtttgt 5880

atgaatcatg atgaatgtaa aacttatata aaaaatagtt tattggagat aagaaaatta 5940

gcaaatatct atacactaga aacgtttaag aaagagttag aaaagagaaa tatctactta 6000

gaaacaaaat cagataagta tttttcttcg gagggggaag attatatata taagttaata 6060

gaaaataaca aaataattta ttcgattagt ggaaaaaaat tgacttataa aggaaaaaaa 6120

tctttttcaa aacatgcaat attgaaacag ttgaatgaaa aagcaaacca agttaattaa 6180

acaacctatt ttataggatt tataggaaag gagaacagct gaatgaatat cccttttgtt 6240

gtagaaactg tgcttcatga cggcttgtta aagtacaaat ttaaaaatag taaaattcgc 6300

tcaatcacta ccaagccagg taaaagcaaa ggggctattt ttgcgtatcg ctcaaaatca 6360

agcatgattg gcggtcgtgg tgttgttctg acttccgagg aagcgattca agaaaatcaa 6420

gatacattta cacattggac acccaacgtt tatcgttatg gaacgtatgc agacgaaaac 6480

cgttcataca cgaaaggaca ttctgaaaac aatttaagac aaatcaatac cttctttatt 6540

gattttgata ttcacacggc aaaagaaact atttcagcaa gcgatatttt aacaaccgct 6600

attgatttag gttttatgcc tactatgatt atcaaatctg ataaaggtta tcaagcatat 6660

tttgttttag aaacgccagt ctatgtgact tcaaaatcag aatttaaatc tgtcaaagca 6720

gccaaaataa tttcgcaaaa tatccgagaa tattttggaa agtctttgcc agttgatcta 6780

acgtgtaatc attttggtat tgctcgcata ccaagaacgg acaatgtaga attttttgat 6840

cctaattacc gttattcttt caaagaatgg caagattggt ctttcaaaca aacagataat 6900

aagggcttta ctcgttcaag tctaacggtt ttaagcggta cagaaggcaa aaaacaagta 6960

gatgaaccct ggtttaatct cttattgcac gaaacgaaat tttcaggaga aaagggttta 7020

atagggcgta ataacgtcat gtttaccctc tctttagcct actttagttc aggctattca 7080

atcgaaacgt gcgaatataa tatgtttgag tttaataatc gattagatca acccttagaa 7140

gaaaaagaag taatcaaaat tgttagaagt gcctattcag aaaactatca aggggctaat 7200

agggaataca ttaccattct ttgcaaagct tgggtatcaa gtgatttaac cagtaaagat 7260

ttatttgtcc gtcaagggtg gtttaaattc aagaaaaaaa gaagcgaacg tcaacgtgtt 7320

catttgtcag aatggaaaga agatttaatg gcttatatta gcgaaaaaag cgatgtatac 7380

aagccttatt tagtgacgac caaaaaagag attagagaag tgctaggcat tcctgaacgg 7440

acattagata aattgctgaa ggtactgaag gcgaatcagg aaattttctt taagattaaa 7500

ccaggaagaa atggtggcat tcaacttgct agtgttaaat cattgttgct atcgatcatt 7560

aaagtaaaaa aagaagaaaa agaaagctat ataaaggcgc tgacaaattc ttttgactta 7620

gagcatacat tcattcaaga gactttaaac aagctagcag aacgccctaa aacggacaca 7680

caactcgatt tgtttagcta tgatacaggc tgaaaataaa acccgcacta tgccattaca 7740

tttatatcta tgatacgtgt ttgttttttc tttgctgttt agcgaatgat tagcagaaat 7800

atacagagta agattttaat taattattag ggggagaagg agagagtagc ccgaaaactt 7860

ttagttggct tggactgaac gaagtgaggg aaaggctact aaaacgtcga ggggcagtga 7920

gagcgaagcg aacacttgat tttttaattt tctatctttt ataggtcatt agagtatact 7980

tatttgtcct ataaactatt tagcagcata atagatttat tgaataggtc atttaagttg 8040

agcatattag aggaggaaaa tcttggagaa atatttgaag aacccgatta catggattgg 8100

attagttctt gtggttacgt ggtttttaac taaaagtagt gaatttttga tttttggtgt 8160

gtgtgtcttg ttgttagtat ttgctagtca aagtgattaa atagaattca ctggccgtcg 8220

ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 8280

atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 8340

agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 8400

gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 8460

taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 8520

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 8580

caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 8640

ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 8700

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 8760

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaag 8797

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaccatac agagtagtag ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttagactca gtaagaacac ct 22

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag caactgtttg 60

tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt gtcaatttca acttcaatgg 120

tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taac 154

<210> 6

<211> 460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 60

actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 120

tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 180

gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag 240

tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact tcaatggttt aacaggcaca 300

ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt 360

gctgacacta ctgatgctgt ccgtgatcca cagacacttg agattcttga cattacacca 420

tgttcttttg gtggtgtcag tgttataaca ccatgatatc 460

<210> 7

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgacgtcg acatgtacct gtatagattg tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag 60

agagatattt caactgaaat ctatcaggcc ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt 120

tttaattgtt actttccttt acaatcatat ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac 180

caaccataca gagtagtagt actttctttt gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt 240

ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt 300

ttaacaggca caggtgttct tactgagtct aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt 360

ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct gtccgtgatc cacagacact tgagattctt 420

gacattacac catgttcttt tggtggtgtc agtgttataa caccatgata tcgatatc 478

Claims (10)

1.一种用于防治新冠病毒感染的重组载体，其特征在于，包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列；所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括乳酸杆菌分泌型表达载体。

3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述乳酸杆菌分泌型表达载体包括pVE5523。

4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点为SalI和EcoRV。

5.一种包含权利要求1～4任意一项所述重组载体的重组乳酸杆菌表达系统。

6.权利要求5所述重组乳酸杆菌表达系统中分泌表达的重组S1蛋白。

7.权利要求6所述重组S1蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求5所述重组乳酸杆菌表达系统在无菌环境下接种至乳酸杆菌液体培养基中，在28～35℃条件下发酵68～75h，得到的发酵液中含重组S1蛋白。

8.权利要求1～4任意一项所述重组载体、权利要求5所述重组乳酸杆菌表达系统、权利要求6所述重组S1蛋白或权利要求7所述制备方法制备的发酵液在制备防治新冠病毒感染的药物中的应用。

9.一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂，其特征在于，包括权利要求6所述重组S1蛋白或权利要求7所述制备方法得到的重组S1蛋白。

10.根据权利要求9所述粘膜阻断剂，其特征在于，所述粘膜阻断剂包括口、鼻喷剂或滴眼液。

Images